ES2587742T3

ES2587742T3 - Métodos para diferenciar en una muestra proteína derivada de plasma de proteína recombinante

Info

Publication number: ES2587742T3
Application number: ES08868946.8T
Authority: ES
Inventors: Alfred Weber; Peter Turecek; Hans-Peter Schwarz
Original assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Current assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2028-12-22
Also published as: JP2011508239A; US20090221100A1; JP2015194501A; KR20100117575A; AU2008345558B2; DK2223108T3; NZ585530A; EP2223108B1; US8114633B2; KR101627157B1; WO2009086262A1; AU2008345558A1; JP6212519B2; BRPI0821597A2; JP2018017736A; US20120040379A1; US8828676B2; CA2709073A1; EP2223108A1

Abstract

Un método para cuantificar la cantidad de proteína derivada de plasma (pdP) y proteína recombinante (rP) en una muestra, en el que la proteína derivada de plasma y la proteína recombinante son la misma proteína con diferentes patrones de glicosilación, dando lugar dichos diferentes patrones de glicosilación a diferentes grados de unión a lectina para la proteína derivada de plasma en comparación con la proteína recombinante, en el que la proteína total (tP) en dicha muestra se determina previamente y es igual a la cantidad de proteína derivada de plasma y proteína recombinante (pdP + rP), comprendiendo dicho método las etapas de: (a) calcular una diferencia entre la unión a lectina para dicha muestra y la unión a lectina esperada para una muestra hipotética de volumen igual que tiene una cantidad de proteína igual a tP, en la que la unión a lectina esperada se determina a partir de una curva patrón de unión a lectina frente a cantidades crecientes de proteína recombinante, y (b) representar la diferencia de (a) en una curva de calibración para determinar la cantidad de proteína recombinante (rP) en dicha muestra, en la que la curva de calibración es una representación de la diferencia entre la unión a lectina esperada, calculada al igual que en (a), y la unión a lectina observada para mezclas que contienen cantidades conocidas de pdP y rP, como una función de cantidades crecientes de proteína recombinante (rP) en dichas mezclas, teniendo cada una de dichas mezclas una cantidad constante de pdP.

Description

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multimerización, o cualquier otro dominio identificable conocido en la técnica.

También se conocen bien métodos para preparar análogos de polipéptido. Los análogos pueden ser sustancialmente homólogos o sustancialmente idénticos al polipéptido de origen natural del que se deriva el análogo, 5 y los análogos contemplados por la invención son aquellos que retienen al menos una parte de la actividad biológica del polipéptido de origen natural.

Por lo general, análogos de sustitución intercambian un aminoácido del tipo silvestre por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y se pueden diseñar para que modulen una o más propiedades de polipéptido, tales como estabilidad frente a la escisión proteolítica, sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones de este tipo por lo general son conservativas. Por "sustitución de aminoácido conservativa" se hace referencia a la sustitución de un aminoácido por un aminoácido que tiene una cadena lateral de un carácter químico similar. Aminoácidos similares para hacer sustituciones conservativas incluyen los que tienen una cadena lateral ácida (ácido glutámico, ácido aspártico); una cadena lateral básica (arginina, lisina, histidina); una cadena lateral de amida

15 polar (glutamina, asparagina); una cadena lateral alifática, hidrófoba (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); una cadena lateral aromática (fenilalanina, triptófano, tirosina); una cadena lateral pequeña (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); o una cadena lateral de hidroxilo alifático (serina, treonina).

Un experto en la materia puede generar fácilmente análogos y fragmentos de polinucleótido para codificar fragmentos biológicamente activos, variantes o mutantes de la molécula de origen natural que posee la misma actividad biológica o similar a la de la molécula de origen natural. Métodos practicados de forma rutinaria incluyen técnicas de PCR, digestión enzimática de ADN que codifica la molécula de proteína y ligación a secuencias de polinucleótidos heterólogos, y similares. Por ejemplo, la mutagénesis puntual, usando PCR y otras técnicas bien conocidas en la técnica, se pueden usar para identificar con particularidad qué residuos de aminoácidos son

25 importantes en actividades en particular asociadas con la actividad de la proteína. Por lo tanto, un experto en la materia será capaz de generar cambios de bases individuales en la hebra de ADN para dar como resultado un codón alterado y una mutación de sentido erróneo.

Además se contempla que la proteína o polipéptido se pueden modificar para preparar un análogo que es una proteína de fusión que comprende un segundo agente que es un polipéptido. En una realización, el segundo agente que es un polipéptido es una enzima, un factor de crecimiento, una citoquina, una quimioquina, un receptor de superficie celular, el dominio extracelular de un receptor de superficie celular, una molécula de adhesión celular, o fragmento o dominio activo de una proteína descrita anteriormente o de cualquier otro tipo de proteína conocida en la técnica. En una realización relacionada, el segundo agente es un factor de coagulación sanguínea tal como Factor

35 VIII, Factor VII, Factor IX y factor de von Willebrand. La proteína de fusión contemplada se prepara mediante técnicas químicas o recombinantes bien conocidas en la técnica.

Variantes de proteína contempladas incluyen polipéptidos modificados de manera química con técnicas tales como ubiquitinación, glicosilación, conjugación a agentes terapéuticos o de diagnóstico, etiquetado (por ejemplo, con radionúclidos o diversas enzimas), unión covalente a polímero tal como pegilación (derivatización con polietilenglicol), introducción de enlaces no hidrolizables, e inserción o sustitución mediante síntesis química de aminoácidos tales como ornitina, que no se produce normalmente en proteínas humanas. Las variantes retienen las propiedades de unión de moléculas modificadas de la invención.

45 La preparación de variantes pegiladas de un polipéptido, fragmento o análogos por lo general comprenderá las etapas de (a) hacer reaccionar el polipéptido con polietilenglicol (tal como un éster reactivo o derivado aldehídico de PEG) en condiciones con las que el polipéptido de construcción de unión se llega a unir a uno o más grupos PEG, y

(b) obtener el producto(s) de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinarán basándose en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción de PEG:proteína, mayor será el porcentaje del producto poli-pegilado. En algunas realizaciones, la construcción de unión tendrá un solo residuo de PEG en el extremo N-terminal. El polietilenglicol (PEG) se puede unir a la proteína para proporcionar una semivida más larga in vivo. El grupo PEG puede tener cualquier peso molecular conveniente y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular medio del PEG variará de aproximadamente 2 kiloDalton ("kDa") a aproximadamente 100 kDa, más de aproximadamente 5 kDa a

55 aproximadamente 50 kDa, lo más de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 10 kDa. Los grupos PEG por lo general se unirán al factor de coagulación sanguínea a través de acilación o alquilación reductora a través de un grupo reactivo natural o modificado por ingeniería en el residuo de PEG (por ejemplo, un grupo aldehído, amino, tiol,

o éster) a un grupo reactivo en el factor de coagulación sanguínea (por ejemplo, un grupo aldehído, amino, o éster).

Variantes de polipéptido adicionales útiles en los métodos de la presente invención incluyen polipéptidos que comprenden residuos de polisialilato (PSA). Métodos para preparar polipéptidos polisialilados se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos n.º 20060160948 y Saenko et al., Haemophilia 12: 42-51, 2006.

Glicosilación

65 La glicosilación en proteínas humanas está formada por combinaciones de azúcares sencillos y complejos.

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Lectinas de unión a manosa

Nombre de la lectina: Organismo Especificidad de Unión

Con A: Concanavalina A Canavalia ensiformis estructuras α-manosídicas ramificadas; N-Glicanos de tipo alta manosa, de tipo híbrido y de tipo complejo biantenario

LCH: Lectina de lenteja Lens culinaris Región del núcleo fucosilada de N-Glicanos de tipo complejo bi-y triantenario

GNA: Lectina de campanilla de invierno Galanthus nivalis estructuras de alta manosa unidas en α 1-3 y α 1-6

Lectinas de unión a galactosa / N-acetilgalactosamina

RCA: Ricino común Aglutinina, RCA120 Ricinus communis Galβ1-4GlcNAcβ1-R

PNA: Aglutinina de Cacahuete Arachis hypogaea Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr (Antígeno T)

AIL: Jacalina Artocarpus integrifolia (Sia)Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr (Antígeno T)

VVL: Lectina de veza de vellosa Vicia villosa GalNAcα-Ser/Thr (Antígeno Tn)

Lectinas de unión a ácido siálico / N-acetilglucosamina

WGA: Aglutinina de Germen de Trigo Triticum vulgaris GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc, Neu5Ac (ácido siálico)

SNA: Lectina de saúco Sambucus nigra Neu5Acα2-6Gal(NAc)-R

MAL: Lectina de Maackia amurensis Maackia amurensis Neu5Ac/Gcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-R

Lectinas de unión a fucosa

UEA: Aglutinina de Ulex europaeus Ulex europaeus Fucα1-2Gal-R

AAL: Lectina de Aleuria aurantia Aleuria aurantia Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3/4)Galβ14GlcNAc; R2-GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R1

Nombre de la lectina: Abreviatura Especificidad de Unión

Agaricus bisporus: ABA Fetuína; Galβ1-3GalNAc

Amaranthus caudatus: ACL Galβ 1-3GalNAc, Neu5Acα2-3Galβ 1-3GalNAc; Antígeno T

Griffonia simplicifolia lectina I: GSL I α-N-acetilgalactosamina, α-galactosa

Nombre de la lectina: Abreviatura Especificidad de Unión

Griffonia simplicifolia lectina II: GSL II terminal-α,β-GlcNAc; glucógeno

Griffonia simplicifolia I B4: GSL I B4 residuos de α-D-galactosilo

Bauhinia purpurea alba: BPL Galβ1-3GalNAc

Codium fragile: CFL GalNAc

Datura stramonium: DSL (GlcNAcβ1-4)3GlcNAc = (Glcβ1-4)2GlcNAc > Glcβ-4GlcNAc >> GlcNAc

Dolichos biflorus: DBA FP terminal > GalNAcα1-3GalNAc > GalNAcα1-3Gal; grupo sanguíneo Al (pentasacárido de Forssman: GalNAcα1-3 GalNAcα13Galβ1-4Galβ1-4GlcNAc)

Erythrina coralldendron: ECor A GalNAc/N-acetillactosamina/Lactosa/D-Gal

Euonymos europaeus: EEA Galα1-3(L-Fucα1-2)Galβ1,3/4-β -GlcNAc; Galα1-3Gal; estructuras de grupo sanguíneo H

Glycine max: SBA terminal α,βGalNAc > α,βGal

Helix aspersa: HAA residuos de αGalNAc terminal

Helix pomatia: HPA GalNAcα1-3GalNAc > α-GalNAc > α-GlcNAc >> α-Gal

Hippeastrum hybrid: HHL (α1,3)/(α1,6) manosa; estructuras de polimanosa; galactomananos de levadura

Lotus tetragonolobus: LTL α-L-fucosa

Lycopersicon esculentum: LEL (GlcNAcβ 1-4)3 GlcNAc > (GlcNAcβ1-4)2 GlcNAc > GlcNAcβ14GlcNAc

Maclura pomifera: MPA Galβ1-3GalNAc terminal > GalNAcα 1-6Gal

Narcissus pseudonarcissus: NPA residuos de α-D-manosilo terminal e interno en glicoconjugados, preferentemente oligomanosas que contienen uniones α 1-6

Phaseolus coccineus: PCA la aglutinación no se inhibe con monosacáridos pero se inhibe con fetuína

Phaseolus vulgaris L: PHA-L GlcNAcβ1,2Man, oligosacáridos de complejo triantenario

Nombre de la lectina: Abreviatura Especificidad de Unión

Phaseolus vulgaris E: PHA-E Galβ1,4GlcNAcβ1,2Manα1,6

Phytolacca americana: PWM oligómeros de N-acetil-β-D-glucosamina

Pisum sativum: PSA, PEA α-man ramificada, tipo complejo con núcleo de α-fuc unido a N-acetilquitobiosa

Psophocarpus tetragonolobus I: PTL, WBA α-galactosamina

Solanum tuberosum: STA oligómeros de N-acetil-β-D-glucosamina

Sophora japonica terminal: SJA Galβ1,3GalNAc > Galβ 1,3GlcNAc > αβ,GalNAc > αβ,Gal

Wisteria floribunda: WFA,WFL N-acetilgalactosamina-α-o β-3 o 6-galactosa terminal

*Tablas adaptadas de Galab Technologies GmbH, Alemania, que mencionan a Gabius, H. J.; Gabius, S. (Eds.): Glycosciences -Status and Perspectives. Weinheim: Chapman y Hall, 1997; Goldstein, et al., Sharon, N.; Goldstein, I. J. (Eds.) The Lectins -Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. Orlando: Academic Press, 1986, S. 33-243; Debray et al., Eur. J. Biochem., 117, 41-55, 1981.

5 Las lectinas descritas anteriormente se pueden usar en los métodos de la invención para diferenciar los patrones de glicosilación de dos proteínas diferentes, que pueden depender de la fuente de expresión de la proteína. Por ejemplo, la proteína SNA, como se muestra a modo de ejemplo en los ejemplos que siguen a continuación, es útil para unir de forma específica proteínas que expresan residuos de ácido α2,6 a la vez que la proteína MAA se une

10 específicamente a residuos de ácido α2,3 siálico.

Proteínas recombinantes

En la técnica se conocen bien métodos para preparar proteínas recombinantes. Métodos para producir células,

15 incluyendo células de mamífero, que expresan ADN o ARN que codifica una proteína recombinante se describen en los documentos de Patente de Estados Unidos con números 6.048.729, 5.994.129, y 6.063.630. Las enseñanzas de cada una de estas solicitudes se incorporan de forma expresa en el presente documento por referencia en su totalidad.

20 Una construcción de ácido nucleico usada para expresar un polipéptido o fragmento, variante u análogo del mismo puede ser una que se exprese de forma extracromosómica (de forma episómica) en la célula de mamífero transfectada o una que integre, ya sea de forma aleatoria un sitio diana seleccionado previamente a través de recombinación homóloga, en el genoma de la célula receptora. Una construcción que se expresa de forma extracromosómica comprende, además de secuencias que codifican polipéptidos, secuencias suficientes para

25 expresión de la proteína en las células y, opcionalmente, para replicación de la construcción. Por lo general, incluye un promotor, una secuencia de ADN que codifica polipéptido y un sitio de poliadenilación. El ADN que codifica la proteína se coloca en la construcción de manera tal que su expresión esté bajo el control del promotor. Opcionalmente, la construcción puede contener componentes adicionales tales como uno o más de los siguientes: un sitio de corte y empalme, una secuencia potenciadora, un gen marcador seleccionable bajo el control de un

30 promotor apropiado, y un gen marcador amplificable bajo el control de un promotor adecuado.

En las realizaciones en las que la construcción de ADN se integra en el genoma de la célula, es necesario que incluya solamente las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. Opcionalmente, puede incluir un promotor y una secuencia potenciadora, un sitio o sitios de poliadenilación, un sitio o sitios de corte y empalme,

35 secuencias de ácidos nucleicos que codifican un marcador o marcadores seleccionables, secuencias de ácidos nucleicos que codifican un marcador amplificable y/o ADN homólogo al ADN genómico en la célula receptora para dirigir la integración del ADN en un sitio seleccionado en el genoma (dirección de ADN o secuencias de ADN).

Células hospedadoras usadas para producir proteínas recombinantes son células de bacteria, levadura, insecto, vertebrado no mamífero, o de mamífero; las células de mamífero incluyen, pero no se limitan a, células de hámster, mono, chimpancé, perro, gato, bovino, porcino, ratón, rata, conejo, oveja y ser humano. Las células hospedadoras pueden ser células inmortalizadas (una línea celular) o células no inmortalizadas (primarias o secundarias) y pueden

5 ser cualquiera de una gran diversidad de tipos de células, tales como, pero no limitadas a, fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales mamarias, células epiteliales intestinales), células de ovario (por ejemplo, células de ovario de hámster chino o CHO), células endoteliales, células gliales, células neuronales, elementos formados de la sangre (por ejemplo, linfocitos, células de médula ósea), células musculares, hepatocitos y precursores de estos tipos de células somáticas.

Células hospedadoras usadas normalmente incluyen: células procariotas tales como bacterias gram negativas o gram positivas, es decir, cualquier cepa de E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Salmonella, y similares; células eucariotas tales como células CHO (ovario de hámster chino); células de riñón de cría de hámster (BHK); células 293 de riñón humano; células COS-7; células de insecto tales como D. Mel-2, Sf4, Sf5, Sf9 y Sf21 y High 5;

15 células vegetales y diversas células de levadura tales como Saccharomyces y Pichia.

Las células hospedadoras que contienen el ADN o ARN que codifica polipéptido se cultivan en condiciones apropiadas para el crecimiento de las células y la expresión del ADN o ARN. Esas células que expresan el polipéptido se pueden identificar usando métodos conocidos y la proteína recombinante se puede aislar y purificar, usando métodos conocidos; ya sea con o sin amplificación de la producción del polipéptido. La identificación se puede realizar, por ejemplo, a través de identificación sistemática de células de mamífero modificadas genéticamente que presentan un fenotipo indicativo de la presencia de ADN o ARN que codifica la proteína, tal como identificación sistemática por PCR, identificación sistemática mediante análisis de transferencia de Southern, o identificación sistemática para la expresión de la proteína. La selección de células que tienen ADN que codifica

25 proteína incorporado se puede conseguir mediante la inclusión de un marcador seleccionable en la construcción de ADN y el cultivo de células transfectadas o infectadas que contienen un gen marcador seleccionable en condiciones apropiadas para la supervivencia solamente de aquellas células que expresan el gen marcador seleccionable. La amplificación adicional de la construcción de ADN introducida se puede ver influida por el cultivo de células modificadas genéticamente en condiciones apropiadas para la amplificación (por ejemplo, el cultivo de células modificadas genéticamente que contienen un gen marcador amplificable en presencia de una concentración de un fármaco en el que solamente pueden sobrevivir las células que contienen múltiples copias del gen marcador amplificable).

Proteínas recombinantes que pueden ser proteínas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a, citoquinas, factores

35 de crecimiento, factores de coagulación sanguínea, enzimas, quimioquinas, receptores de superficie celular solubles, moléculas de adhesión celular, anticuerpos, hormonas, proteínas del citoesqueleto, proteínas de la matriz, proteínas chaperonas, proteínas estructurales, proteínas metabólicas, y otras proteínas terapéuticas conocidas por los expertos en la materia. Proteínas recombinantes a modo de ejemplo que se usan o que se pueden usar como agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, Factor VIII, Factor VII, Factor IX y factor de von Willebrand, eritropoyetina, interferones, insulina, CTLA4-Ig, alfa-glucocerebrosidasa, alfa-glucosidasa, hormona estimulante de folículo, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-HER2, anticuerpo anti-CD52, receptor de TNF, y otras conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Physicians Desk Reference, 62ª Edición, 2008, Thomson Healthcare, Montvale, NJ.

Métodos para detectar proteína en una muestra

45 Las proteínas terapéuticas a menudo son difíciles de detectar en muestras de suero debido a su similitud con la proteína de origen natural producida de forma endógena. Sin embargo, a menudo es beneficioso determinar la cantidad de un polipéptido terapéutico, fragmento, variante o análogo del mismo que se ha administrado para evaluar si la proteína terapéutica presenta características deseadas tales como una mayor solubilidad o estabilidad, resistencia a la digestión enzimática, aumento de la semivida biológica, y otras características conocidas por los expertos en la materia. El método también permite la detección de los usos autorizados de proteínas terapéuticas que pueden estar protegidos por derechos de propiedad intelectual.

La presente invención proporciona un método para diferenciar las proteínas de origen natural derivadas de plasma

55 de proteínas recombinantes en una muestra, permitiendo de este modo la cuantificación de cada tipo de proteína en una muestra. La capacidad para identificar la cantidad de proteína recombinante en una muestra en el tiempo ayuda en la determinación del agente terapéutico óptimo basándose en la semivida, absorción, estabilidad, etc. El ensayo de detección puede ser un ensayo de inmunoabsorción asociado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo de centelleo por proximidad (SPA), resonancia de plasma superficial (SPR), u otros ensayos de unión conocidos en la técnica.

Los métodos de detección establecidos en el presente documento utilizan la diferencia de los patrones de glicosilación entre proteínas derivadas de plasma y los de muchas proteínas producidas de forma recombinante, como se ha descrito anteriormente.

65 Para detectar la proteína derivada de plasma en una muestra, la mezcla se pone en contacto con una composición

que comprende una proteína lectina descrita en el presente documento que es específica para un residuo de carbohidrato en la proteína derivada de plasma, y se mide la cantidad de proteína derivada plasma unida a lectina. En un aspecto, la etapa de contacto se realiza en un medio líquido tal como un tampón acuoso, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS), PBS sin magnesio/calcio, u otros tampones apropiados como se conoce en la

5 técnica. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Protein Science, Coligan et al., Eds., 1998, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ. Se contempla que la puesta en contacto en el método de la invención se realiza durante un periodo de tiempo suficiente para que la unión alcance el equilibrio y por lo general durante un periodo de tiempo en el intervalo de 15 minutos a una noche. Por ejemplo, la mezcla se pone en contacto ya sea con un agente de unión o una proteína lectina, durante 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 24 horas, o un período de tiempo apropiado para una unión suficiente del agente de unión o la lectina a la proteína derivada de plasma.

El método incluye opcionalmente al menos una o más etapas de lavado, en las que la composición de lectina:proteína unida se lava antes de medir la unión a proteína para reducir las mediciones de fondo causadas por

15 los polipéptidos sin unir. El lavado de la lectina después de la incubación de la composición de polipéptido y antes de la detección de la unión lectina:proteína se realiza en un tampón apropiado más detergente. Detergentes adecuados incluyen, pero no se limitan a óxidos de alquildimetilamina, alquil glucósidos, alquil maltósidos, sulfatos de alquilo (tales como dodecil sulfato sódico (SDS)), NP-40, alquil tioglucósidos, betaínas, ácidos biliares, serie CHAP, digitonina, glucamidas, lecitinas/lisolecitinas, detergentes no iónicos basados en polioxietileno, incluyendo TRITON-X, polisorbatos, tales como TWEEN® 20 y TWEEN® 80, BRIJ®, GENAPOL® y THESIT®, compuestos de amonio cuaternario, y similares. Véase también Current Protocols in Protein Science, Apéndice 1B, Supl. 11, 1998, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ. Los detergentes adecuados se pueden determinar usando experimentación de rutina (véase Neugebauer, J., A Guide to the Properties and Use of Detergents in Biology and Biochemistry, Calbiochem-Novabiochem Corp. La Jolla, Calif., 1988).

25 Como se ha analizado anteriormente, la proteína lectina se puede unir a un residuo detectable o una etiqueta detectable. Residuo o etiqueta detectable se refiere a una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, o químicos. El residuo detectable a menudo genera una señal que se puede medir, tal como una señal radiactiva, cromogénica, o fluorescente, que se puede usar para cuantificar la cantidad de residuo detectable unido en una muestra. El residuo detectable se puede incorporar en o unir a la proteína, ya sea de forma covalente, o a través de enlaces iónicos, de van der Waals o de hidrogeno, por ejemplo, la incorporación de nucleótidos radiactivos, o nucleótidos biotinilados que son reconocidos por la estreptavidina. El residuo detectable se puede detectar directa o indirectamente. La detección indirecta puede implicar la unión de un segundo residuo detectable directa o indirectamente a la fracción detectable. Por ejemplo, el residuo detectable

35 puede ser el ligando de una pareja de unión, tal como biotina, que es una pareja de unión para la estreptavidina. La pareja de unión puede ser detectable en sí misma, por ejemplo, un anticuerpo se puede etiquetar con una molécula fluorescente. La selección de un método de cuantificación de la señal se consigue, por ejemplo, con recuento de centelleo, densitometría, o citometría de flujo.

Ejemplos de etiquetas adecuadas para uso en los métodos de ensayo de la invención incluyen, marcadores radiactivos, fluoróforos, reactivos con densidad electrónica, enzimas (por ejemplo, como se usan normalmente en un ELISA), biotina, digoxigenina, o haptenos, así como proteínas que se pueden hacer detectables, por ejemplo, mediante la incorporación de una radioetiqueta en el hapteno o péptido, o se pueden usar para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el hapteno o péptido. También se contemplan proteínas para las que hay

45 disponibilidad de antisueros o anticuerpos monoclonales, o moléculas de ácido nucleico con una secuencia complementaria a una diana, una nanoetiqueta, una perla de masa molecular, un agente magnético, una nano-o microperla que contiene un tinte fluorescente, un punto cuántico, una perla cuántica, una proteína fluorescente, dendrímeros con una etiqueta fluorescente, un microtranspondedor, una molécula o estructura molecular dadora de electrones, o una partícula que refleja la luz.

Etiquetas adicionales contempladas para su uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, colorantes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, y similares), radioetiquetas (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras usadas comúnmente en un ELISA), y etiquetas colorimétricas tales como oro coloidal, perlas de vidrio o plástico

55 coloreadas (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.), y etiquetas luminiscentes o quimioluminiscentes (por ejemplo, Europio (Eu), MSD Sulfo-Etiqueta).

La etiqueta se puede acoplar directa o indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. En una realización específica, la etiqueta se une de forma covalente al componente usando un reactivo de éster de isocianato o N-hidroxisuccinimida para la conjugación de un agente activo de acuerdo con la invención. En un aspecto de la invención, los reactivos de isocianato bifuncionales se usan para conjugar una etiqueta a un biopolímero para formar un conjugado de etiqueta y biopolímero conjugado sin un agente activo unido al mismo. El conjugado de etiqueta y biopolímero se puede usar como un compuesto intermedio para la síntesis de un conjugado etiquetado de acuerdo con la invención o se puede usar para detectar el conjugado de 65 biopolímero. Como se ha indicado anteriormente, se puede usar una gran diversidad de etiquetas, con la elección de la etiqueta dependiendo de la sensibilidad requerida, facilidad de conjugación con el componente deseado del

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ser ilustrativos más que limitantes.

Ejemplos

5 Ejemplo 1 Unión de aglutinina de Sambucus Nigra (SNA) de VWF de plasma y VWF derivado de células CHO recombinantes (rVWF)

Las proteínas humanas expresan patrones de glicosilación únicos en comparación con las proteínas producidas en otros organismos, lo que presenta una dificultad cuando se producen proteínas recombinantes en las que la glicosilación es importante en función de la proteína. Una de las líneas celulares más populares para la producción de proteína recombinante humana, las células de ovario de hámster chino (CHO), carece de la enzima α2,6 sialiltransferasa, que confiere la adición de ácido α2,6 siálico en glicoproteínas complejas. Mientras que esta diferencia puede influir de forma mínima con respecto a la interferencia con la actividad de una proteína, esta diferencia en la glicosilación se puede usar para distinguir proteína producida de forma recombinante o proteínas

15 humanas secretadas producidas de forma natural. Las proteínas lectina que distinguen entre los diferentes patrones de glicosilación se pueden usar en ensayos de unión para determinar los niveles de proteína recombinante o de origen natural en una muestra biológica. Por ejemplo, la aglutinina de Sambucus Nigra (SNA) se une al ácido neuramínico unido en α2,6 (ácido siálico) pero no al ácido α2,3 neuramínico.

Para determinar si la unión a SNA podría distinguir las proteínas humanas de origen natural de la proteína producida de forma recombinante en células CHO, se usaron vWF derivado de plasma (pVWF) y vWF producidos de forma recombinante (rVWF) en un ensayo de unión a SNA.

Un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es un método para detectar el antígeno del factor de von

25 Willebrand (vWF:Ag), que mide la cantidad de vWF, independiente de la función vWF, que por lo general constituye vWF formando un complejo con el factor VIII. Sin embargo, este ensayo no puede diferenciar entre proteína derivada de plasma o recombinante. Por lo tanto, una forma modificada de este ensayo se usa para detectar vWF glicosilado.

En resumen, para el ensayo de detección de glicosilación, por lo general, una preparación de anticuerpo anti-vWF humano policlonal o monoclonal se une a microplacas de poliestireno en condiciones ligeramente alcalinas. Después del bloqueo con una solución de proteína no glicosilada inerte, la incubación de las muestras con oxidación con peryodato reduce la capacidad del anticuerpo de revestimiento para unirse a SNA mediante la retirada de residuos de ácido siálico en la proteína del anticuerpo. Entonces se cargan en los pocillos varias diluciones de plasma humano o una preparación de rVWF. Después de una etapa de lavado retirando componentes de la muestra no

35 unidos, se permite que VWF/rVWF unido a anticuerpo reaccione con SNA biotinilado. La lectina unida (SNA) se detecta a continuación por reacción con una preparación de estreptavidina-peroxidasa midiendo la actividad de la peroxidasa con un sustrato apropiado.

Las siguientes condiciones experimentales se usaron para medir cualquiera de vWF derivado de plasma o rVWF en ensayos separados: se incubaron 100 µl de solución de revestimiento (anti-VWF humano, (Dako, Dinamarca), diluidos a 1/500 en tampón de revestimiento de Na2CO3 0,1 M, NaHCO3 0,1 M, pH 9,5; como alternativa, también se puede usar cualquier anticuerpo monoclonal en una dilución apropiada) durante 16 horas a 4 ºC o durante 1 h a 37 ºC en pocillos de una microplaca MAXISORP™ F96 (NUNC, Alemania). Después de lavar en tampón de lavado (NaCl al 0,8 %, KCl al 0,02 %, KH2PO4 al 0,02 %, Na2HPO4 ∙2 H2O al 0,126 %, Tween 20 al 0,05 % [calidad para

45 EIA, Bio-Rad, Hercules, CA], pH 7,0 -7,4) los pocillos se bloquearon mediante incubación con tampón de dilución (gelatina al 0,1 % [Bio-Rad, EIA-grade] o albúmina de suero bovino al 0,1 % [SIGMA, calidad para EIA, St. Louis, MO], clorhidrato de benzamidina 2 mM en tampón de lavado) usando 200 µl/pocillo durante 30 minutos a 37 ºC. Después de lavar, la oxidación con peryodato se realizó mediante incubación de los pocillos con 200 µl/pocillo de solución de peryodato (peryodato sódico 10 mM en acetato sódico 50 mM, pH 5,5) durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA). La placa lavada se incubó a continuación durante 5 minutos a TA con 200 µl/pocillo de solución de etanolamina (etanolamina al 1 % en agua) y se lavó de nuevo.

La diluciones de la muestra se prepararon usando tampón de dilución. Para la combinación de plasma humano, se preparó una dilución en serie que comprendía las diluciones 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200 y 1/6400 correspondientes 55 a concentraciones de VWF:Ag que variaban de 2,88 a 0,18 mU de VWF:Ag/ml. Para las muestras que contenían rVWF, la preparación de rVWF se usó a concentraciones más elevadas (311-19 mU/ml). Se cargaron 100 µl/pocillo por duplicado en los pocillos y se incubaron durante 60 minutos a TA. A continuación, la placa se lavó y se añadieron 100 µl/pocillo de SNA biotinilada (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a una concentración de 2 µg/ml. Las placas se incubaron durante 60 minutos a TA y se lavaron y se añadieron 100 µl/pocillo de estreptavidina-peroxidasa (Dako, diluido a 1/4000) y se incubó durante 30 minutos a TA. La incubación terminó con una etapa de lavado. La peroxidasa unida se detectó con una reacción de color con el sustrato de peroxidasa SUREBLUE™ (KPL, Gaithersburg, MD). Se incubaron 100 µl/pocillo de muestra de 10 a 15 minutos a TA. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 µl/pocillo de H2SO4 1,5 M. Posteriormente, la placa se midió con un lector de ELISA a 450 nm con la longitud de onda de referencia establecida en 620 nm. Para evaluación de datos adicional, se realizó 65 un análisis de regresión lineal usando los valores medios corregidos con el blanco de las densidades ópticas medidas y las concentraciones de VWF:Ag de las diluciones de la combinación de plasma. La curva de calibración

obtenida se usa para calcular la unión a SNA de los valores desconocidos con respecto a los obtenidos para la combinación de plasma, que se estableció en un 100 %.

El análisis de VWF de plasma dio como resultado una clara relación dependiente de la dosis entre la concentración

5 de VWF:Ag y la unión a SNA medida. Esta relación era altamente lineal (R2 = 0,9996) dentro del intervalo definido de 0,2 a 2,9 mU de VWF:Ag/ml lo que permite la construcción de una curva de calibración lineal. Al contrario que el VWF de plasma, el rVWF derivado de células CHO no mostraba unión a SNA incluso cuando se usaban concentraciones 100 veces más elevadas. Por lo tanto, las preparaciones se pueden diferenciar por su diferente reactividad con SNA. Se obtuvieron resultados similares usando un VWF anti-humano monoclonal con un epítopo de unión definido en el dominio A1 del VWF humano. Estas diferencias de reactividad hacia SNA reflejan el hecho de que el rVWF derivado de células CHO no contiene ácido neuramínico unido en α2,6, que es la estructura de glicano requerida de forma específica para la unión a SNA.

Ejemplo 2: Unión a SNA del factor IX (pFIX) de plasma y factor IX derivado de células CHO recombinantes 15 (rFIX)

Para determinar si la reactividad del VWF:Ag derivado de plasma con SNA es única para el VWF de plasma, se analizó un segundo factor de coagulación sanguínea derivado de CHO, Factor IX (FIX), en un ensayo de unión a SNA.

Una preparación de anticuerpo anti-FIX humano policlonal se unió a microplacas de poliestireno como se hizo anteriormente. Para la combinación de plasma humano, una serie de dilución geométrica se preparó en tampón de dilución usando las diluciones 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560 y 1/5120 correspondientes a concentraciones de FIX:Ag que varían de 3,09 a 0,19 mU de FIX:Ag/ml. La preparación de rFIX se investigó a concentraciones más elevadas

25 (78 – 4,9 mU/ml). Se cargaron 100 µl/pocillo a los pocillos por duplicado y se incubaron durante 60 minutos a TA, y el desarrollo se realizó como se describió anteriormente.

De un modo similar al de los resultados con la proteína de VWF de plasma, se produjo una clara relación dependiente de la dosis entre la concentración de FIX:Ag en plasma y la unión a SNA medida. Esta relación era lineal (R2 = 0,9963) dentro del intervalo definido de 0,2 a 3,1 mU de FIX:Ag/ml que permite la construcción de una curva de calibración. Al contrario que el FIX de plasma, el rFIX derivado de células CHO no mostró unión a SNA incluso a las concentraciones 10 veces superiores investigadas. Por lo tanto, ambas preparaciones se pueden diferenciar por su diferente reactividad con SNA.

35 Ejemplo 3: Medida de unión a SNA de VWF de plasma y rVWF derivado de células CHO después de tratamiento con neuraminidasa

Para asegurar que la unión a SNA era específica para SNA, la especificidad de la unión a SNA se investigó usando la enzima neuraminidasa, que retira por escisión o desialila ambos el ácido α2,6 y α2,3 neuramínico de oligosacáridos. Después de incubación de VWF de plasma y rVWF unidos a anticuerpo con niveles crecientes de neuraminidasa en la placa de microtitulación, se midieron los efectos de la desialilación de neuraminidasa en la unión a SNA de pVWF y rVWF.

Las placas de microtitulación anti-VWF se prepararon para análisis, tal y como se ha descrito anteriormente. Tanto la

45 combinación de plasma humano como la preparación de rVWF se diluyeron para obtener concentraciones de VWF:Ag de 5 mU/ml y 2,5 mU/ml. Se cargaron 100 µl/pocillo de estas diluciones a las placas oxidadas con peryodato y revestidas y se incubó durante 60 minutos a TA y se lavaron a continuación. A continuación, se realizó la digestión de neuraminidasa en la placa con el vWF derivado de plasma y rVWF inmovilizados por el anticuerpo unido. La neuraminidasa (Sigma, St. Louis, MO) se usó a las concentraciones de 0,1, 5, 10 y 20 mU/ml, obtenidas por dilución de la enzima con Bis-Tris-Propano 20 mM que contenía 2 mg/ml de albúmina de suero bovino. Se incubaron 100 µl/pocillo de solución de neuraminidasa durante 2 horas a 37 ºC. A continuación, las placas se lavaron y se incubaron con SNA biotinilada (Vector; 2 µg/ml; 100 µl/pocillo) durante 60 minutos a TA. Esta incubación terminó mediante lavado antes de que las placas se incubaran 30 minutos a TA con estreptavidina peroxidasa (Dako, 1/4000). Después de una etapa de lavado final, la actividad de peroxidasa unida se midió con el sustrato de

55 peroxidasa SUREBLUE™ como se ha mencionado anteriormente.

Los resultados muestran que, mientras que el VWF derivado de células CHO no muestra unión a SNA en el ensayo de SNA, esta unión no se ve alterada después del tratamiento con neuraminidasa, sin embargo, la unión a SNA del VWF de plasma se reduce de manera proporcional a la concentración de la neuraminidasa aplicada. Este resultado se observó con ambas concentraciones de VWF:Ag investigadas. A una concentración de neuraminidasa de 20 mU/ml y con las condiciones experimentales aplicadas, la unión a SNA es inferior a un 95 % de la concentración medida inicialmente.

Estos resultados muestran que la proteína de SNA se une de forma específica al ácido α2,6 N-acetilneuramínico,

65 dado que la retirada del ácido neuramínico de la proteína derivada de plasma provocaba una pérdida de unión. El rVWF derivado de células CHO no muestra unión a SNA con y sin tratamiento con neuraminidasa porque el ácido

neuramínico está presente solamente en una unión que no es reconocida por SNA ni hidrolizada con neuraminidasa.

Ejemplo 4: Medida de la unión de VWF de plasma y rVWF derivado de células CHO después de tratamiento con neuraminidasa a la lectina aglutinina de Maackia amurensis (MAA)

5 Dado que rVWF no se unía SNA debido a la falta de ácido neuramínico unido en α2,6, no se esperaba que la retirada del ácido neuramínico alterara la unión de SNA con respecto rVWF. Para confirmar que la proteína recombinante expresaba residuos de ácido siálico, pero en una configuración diferente que el ácido siálico derivado de plasma, se usa un ensayo de unión que mide la unión de la proteína al ácido neuramínico unido en α2,3 para detectar el ácido neuramínico unido en α2,3 expresado de forma recombinante en la proteína recombinante. La lectina, aglutinina de Maackia amurensis (MAA), que se une al ácido neuramínico unido en α2,3, se usó para determinar si la desialilación de rVWF se producía en presencia de neuraminidasa. Después de incubar VWF de plasma y rVWF unido a anticuerpo con niveles crecientes de neuraminidasa, se midió la unión de las proteínas a MAA.

15 Las placas de anti-vWF se prepararon como se ha hecho anteriormente. Tanto la combinación de plasma humano como la preparación de rVWF se diluyeron para obtener concentraciones de VWF:Ag de 5 mU/ml y 2.5 mU/ml. Se cargaron 100 µl/pocillo de las diluciones de la muestra a las placas oxidadas con peryodato, revestidas y se incubó durante 60 minutos a TA y se lavó a continuación. La digestión con neuraminidasa se realizó a continuación en la placa. La neuraminidasa (Sigma) se usó a las concentraciones de 0,1, 5, 10 y 20 mU/ml. A continuación, las placas se lavaron y se incubaron con la MAA biotinilada (Vector, 1 µg/ml) durante 60 minutos a TA. La incubación terminó mediante lavado, tras lo que las placas se incubaron 30 minutos a TA con estreptavidina peroxidasa (DakoCytomation, 1/4000). Después de una etapa de lavado final, la peroxidasa unida se midió como se ha descrito anteriormente.

25 El vWF recombinante se unió mediante la lectina de MAA lo que indica la presencia de ácido siálico en la proteína recombinante. La adición de neuraminidasa a los pocillos de cultivo anuló la unión tanto de VWF de plasma como de rVWF a MAL, que reconoce el ácido neuramínico cuando está presente en una unión en α2,3. Incluso la concentración más baja de enzima sometida a ensayo mostraba una reducción >95 % de la unión a MAL. Se obtuvieron datos similares cuando se usaba VWF a una concentración de 2,5 mU/ml. Por lo tanto, la desialilación eficaz también se produjo para la preparación de rVWF solamente detectable cuando se usa MAL, pero indetectable cuando se aplica SNA lo que indica la especificidad de la unión de SNA a VWF de plasma y no a VWF recombinante.

35 Ejemplo 5: Inhibición de la unión de SNA a VWF de plasma y VWF recombinante derivado de células CHO (rVWF) con 6'-sialillactosa

Las lectinas se unen de forma específica a monosacáridos u oligosacáridos, que pueden estar ya sea libres en solución o como parte de oligosacáridos de mayor tamaño encontrados en glicoproteínas, glicolípidos u otros glicoconjugados. La especificidad de la unión a lectina se puede investigar mediante estudios de inhibición usando estos mono-u oligosacáridos en ensayos de unión de competición. Se sabe que el trisacárido 6'-sialillactosa es un potente inhibidor de la unión de la lectina SNA y se usó para confirmar la especificidad de la unión de SNA a VWF de plasma.

45 Las placas con anti-vWF se revistieron y se prepararon como anteriormente. Las muestras de combinación de plasma humano se diluyeron para obtener una concentración de VWF:Ag de 5 mU/ml. Se cargaron 100 µl/pocillo y se incubaron durante 60 minutos a TA. Se añadieron 50 µl de 6-sialillactosa (Sigma, A-9204) a la placa a concentraciones que variaban de 2,1 a 150 µM y a continuación se añadieron 50 µl de la SNA biotinilada (Vector, 1 µg/ml) y se incubó durante 60 minutos a TA. La incubación terminó mediante lavado, tras lo que las placas se incubaron 30 minutos a TA con estreptavidina peroxidasa (DakoCytomation, 1/4000). Después de una etapa de lavado final, la peroxidasa unida se midió como se ha descrito anteriormente.

El trisacárido 6'-sialillactosa presenta una inhibición dependiente de la concentración de la unión de SNA a VWF de plasma en las condiciones experimentales usadas, lo que demuestra una inhibición de aproximadamente un 25 % a

55 10 µM de 6'-sialillactosa y una inhibición de un 75 % a 100 µM de 6'-sialillactosa. Esta observación confirmaba que la unión medida era dependiente de las estructuras de N-glicano de VWF de plasma y no estaba causada por ninguna otra reacción.

Ejemplo 6: Inhibición de la unión de SNA a VWF de plasma y VWF recombinante derivado de células CHO (rVWF) con 3'-sialillactosa

Sería de esperar que otro trisacárido, 3'-sialillactosa, en el que el ácido neuramínico está unido en α2,3 al residuo de galactosa de la lactosa, no mostrara efectos en la unión de SNA a VWF de plasma ya que el VWF de plasma carece de ácido α2,3 siálico. Para examinar la especificidad de unión, se midieron los efectos de la 3'-sialillactosa en

65 proteína derivada de plasma y proteína recombinante derivada de células CHO.

Las placas específicas de VWF-Ag se prepararon como se ha mostrado anteriormente y el ensayo de inhibición de 3'-sialilactosa se realizó como se ha descrito para el ensayo de 6' sialillactosa en el Ejemplo 5 mencionado anteriormente. Los resultados demostraban que la 3'-sialillactosa no tenía efecto en la unión de SNA a VWF de plasma, lo que confirma que la SNA se une al ácido neuramínico solamente cuando está presente en una unión en

5 α2,6.

Ejemplo 7: Curva de calibración de 4 puntos para la medición de VWF recombinante derivado de células CHO (rVWF) en presencia de VWF de plasma

10 Para determinar si el ensayo de unión a SNA podría permitir la cuantificación de la cantidad de proteína derivada de plasma en comparación con la proteína recombinante en una muestra individual, las muestras de ensayo que comprenden tanto el VWF de plasma como el VWF recombinante se analizaron para la unión a SNA y se desarrolló una curva de calibración para cuantificación de rVWF en las muestras.

15 En resumen, una combinación de plasma normal humano que contenía VWF:Ag a una concentración de aproximadamente 1 U/ml se añadió con 0, 0,2, 0,5, 1,0 y 2,0 U de rVWF. La concentración de VWF:Ag y la unión a SNA de estas muestras se midió en seis unidades de ensayo independientes. La unión a SNA medida para una combinación de plasma humano sin adiciones, separada se usó como base para calcular una unión a SNA hipotética, esperada para las muestras con adiciones bajo la suposición de que el VWF:Ag presente en estas

20 muestras fuera solamente VWF de plasma. Se calculó la diferencia entre estos valores de unión a SNA calculados de forma hipotética y los valores medidos, lo que refleja las cantidades de rVWF en mezcla con el VWF de plasma. Para verificar esta suposición, las diferencias en la unión se representaron a continuación con respecto a la cantidad de rVWF contenido en estas muestras y se realizó un análisis de regresión lineal. Por lo tanto, se obtuvo una curva de calibración que permite la determinación de las concentraciones de rVWF en presencia de VWF de plasma.

25 Las placas de microtitulación de anti-vWF se prepararon como se mencionó anteriormente. Para la curva de calibración, se preparó una serie de muestras de dilución que comprende las diluciones 1/100, 1/200, 1/400,1/800 y 1/1600 usando una combinación de plasma humano. Las muestras se diluyeron para obtener concentraciones de VWF:Ag dentro del intervalo cubierto por esta curva de calibración. Se cargaron 100 µl/pocillo de estas diluciones, se

30 incubó durante 15 minutos a TA antes de añadir 100 µl/pocillo del anticuerpo de detección (anti-VWF humano peroxidasa de conejo, Dako, 1/2000). Esta incubación se realizó durante 60 minutos a TA y terminó con lavado. La actividad de la peroxidasa unida se midió con sustrato de peroxidasa SUREBLUE™. La reacción de color se detuvo usando ácido sulfúrico 1,5 M. Las placas se midieron posteriormente con un lector de ELISA a 450 nm con la longitud de onda de referencia establecida en 650 nm. La concentración de VWF:Ag de estas muestras se obtuvo a

35 continuación en U/ml después de extrapolación en la curva de calibración.

La unión a SNA de las muestras se midió usando placas con anti-vWF preparadas como se ha mencionado anteriormente. Las diluciones de la muestra se prepararon usando tampón de dilución. Para la curva de calibración, se preparó una serie de diluciones que comprendía las diluciones 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200 y 1/6400 usando una

40 combinación de plasma humano. Las muestras se diluyeron para obtener la unión a SNA dentro del intervalo de concentración cubierto por esta curva de calibración. Se cargaron 100 µl/pocillo de cada dilución a las placas oxidadas con peryodato, revestidas y se incubaron durante 60 minutos a TA. A continuación, las placas se lavaron y se incubaron con SNA biotinilada, y la unión a SNA se midió como se ha descrito anteriormente.

45 La Tabla 1 muestra datos obtenidos en las seis unidades de ensayo independientes para la concentración de VWF:Ag y la unión a SNA de estas muestras.

Tabla 1: unión a VWF:Ag y SNA de muestras con adiciones

rVWF derivado de células CHO añadido a plasma humano

VWF:Ag: 0 U 0,2 U 0,5 U 1,0 U 2,0 U

Ensayo 1: 0,93 1,11 1,49 2,07 3,18

Ensayo 2: 0,94 1,11 1,47 1,95 3,21

Ensayo 3: 0,91 0,99 1,26 1,93 2,98

Ensayo 4: 0,92 1,06 1,32 1,99 3,14

Ensayo 5: 0,88 1,05 1,29 1,92 3,06

Ensayo 6: 0,91 1,08 1,30 1,56 3,50

Media: 0,92 1,07 1,36 1,90 3,18

DT: 2,3 4,2 7,3 9,3 5,6

imagen10

Ejemplo 7. La unión a SNA de las muestras se obtuvo después de extrapolación en la curva de calibración y los niveles se expresan con respecto a los de la combinación de plasma humano, definidos como un 100 % de unión a SNA. La Tabla 3 muestra los datos de medida obtenidos en las seis unidades de ensayo independientes para la concentración de VWF:Ag y la unión a SNA de estas muestras.

Tabla 3: Unión a VWF:Ag y SNA de muestras añadidas

rVWF derivado de células CHO añadido a plasma humano

VWF:Ag: 0 0,2 U 0,4 U 0,5 U 0,6 U 0,8 U 1,0 U 1,2 U 1,5

Ensayo 1: 0,85 1,10 1,27 1,35 1,39 1,70 1,90 2,00 2,20

Ensayo 2: 1,09 1,10 1,24 1,32 1,47 1,94 2,24 - -

Ensayo 3: 0,95 1,06 1,22 1,34 1,39 1,80 1,89 2,06 2,15

Ensayo 4: 0,95 1,09 1,20 1,38 1,43 1,62 1,89 2,00 2,07

Ensayo 5: 0,95 1,13 1,22 1,42 1,49 1,68 1,85 1,95 2,09

Ensayo 6: 0,96 1,16 1,40 1,38 1,48 1,62 1,81 2,04 2,13

Media: 0,96 1,11 1,26 1,37 1,44 1,73 1,93 2,01 2,13

DTR: 8,0 3,1 5,8 2,6 3,1 7,2 8,1 2,1 2,4

rVWF derivado de células CHO añadido a plasma humano: imagen11

SNA: 0 0,2 U 0,4 U 0,5 U 0,6 U 0,8 U 1,0 U 1,2 U 1,5

Ensayo 1: 134,6 94,3 80,2 76,4 71,5 62,9 60,8 55,0 56,3

Ensayo 2: 110,0 90,0 81,6 73,7 74,8 n.d. n.d. 43,0 42,6

Ensayo 3: 135,1 92,7 85,7 77,5 73,4 59,8 55,6 56,4 56,0

Ensayo 4: 117,1 90,3 87,8 85,2 76,7 58,8 n.d. 56,0 50,6

Ensayo 5: 113,8 90,7 82,0 76,1 71,9 60,6 53,1 50,6 46,6

Ensayo 6: 130,6 96,0 83,4 85,0 91,1 70,8 67,6 54,5 53,2

Media: 123,5 92,3 83,5 78,9 76,6 62,6 59,3 52,6 50,9

DTR: 9,1 2,6 3,4 6,2 9,6 7,7 10,8 9,8 10,7

El VWF de plasma a una concentración de 0,96 U tenía una unión a SNA media correspondiente a un 123,5 % de la medida para una combinación de plasma de referencia. Usando esta unión a SNA media medida para la muestra de

10 plasma humano que no contenía rVWF derivado de células CHO, la unión a SNA hipotética se calculó para las muestras con adiciones bajo la suposición de que la relación VWF:Ag medida era solamente VWF de plasma. Estos datos se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Cálculo de la unión a SNA hipotética para las muestras de plasma añadidas 15 con rVWF derivado de células CHO

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Al igual que en el ensayo de calibración de 4 puntos descrito anteriormente, la diferencia con respecto a la unión a SNA esperada se correlaciona bien con las concentraciones de rVWF derivado de células CHO añadidas a las muestras de plasma humano incluso cuando se investigaban 8 concentraciones en un intervalo de adiciones más 20 estrecho. Una representación de la curva de calibración de 8 puntos que correlaciona la diferencia en la unión a SNA

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Claims

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