ES2569355T3 - Dispositivo de preparación de una muestra de fluido biológico para un análisis bacteriológico - Google Patents

Abstract

Dispositivo de preparación de una muestra de fluido biológico para su análisis bacteriológico que comprende un recipiente provisto de una cámara (4) dentro de la que se puede desplazar un pistón (5) entre una posición de apertura y una posición de obturación, estando dicho dispositivo caracterizado porque la cámara (4) comprende una zona (7) de separación y un medio (15, 16) de introducción de un fluido dentro de dicha cámara, estando dicho medio de introducción dispuesto en la parte (2) superior de la cámara (4) y porque el pistón (5) comprende un medio (8) de obturación que coopera con la zona (7) de separación de modo que se define un volumen (9) superior y un volumen (10) inferior a ambos lados de dicha zona, comunicando el volumen (9) superior y el volumen (10) inferior entre sí cuando el pistón (5) está en la posición de apertura y quedando aislados uno del otro de forma estanca cuando el pistón (5) está en la posición de obturación, y estando dicho dispositivo caracterizado porque la zona (7) de separación comprende un cuello (18) de botella, extendiéndose el volumen (10) inferior bajo dicho cuello de botella, estando el medio (8) de obturación previsto para taponar dicho cuello cuando el pistón (5) está en la posición de obturación de modo que aísla el volumen (10) inferior del volumen (9) superior.

Description

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DESCRIPCION

Dispositivo de preparacion de una muestra de fluido biologico para un analisis bacteriologico

La presente invencion se refiere al campo de la preparacion de muestras de fluido biologico, de manera mas particular sangre, para su analisis biologico.

La presente invencion se refiere de manera mas particular al campo de la microbiologfa y propone un procedimiento y un dispositivo para muestrear y tratar un volumen de sangre total para un analisis bacteriologico.

El procedimiento y el dispositivo descritos en la presente invencion estan destinados a extraer una muestra de sangre total, a reducir/eliminar las celulas eucariotas/humanas presentes en esta muestra y a aislar/concentrar las celulas procariotas/microorganismos eventualmente presentes en esta muestra para su deteccion y/o identificacion mediante unos metodos espedficos. Entre estos metodos, se pueden citar 1) los metodos de biologfa celular como el cultivo en placa de Petri, las tecnicas de deteccion directa en microscopfa y 2) los metodos de biologfa molecular de analisis del ADN y del ARN con, por ejemplo, la tecnica denominada RFLP (restriction fragment length polymorphisms) y la tecnica de amplificacion de ADN o PCR (polymerase chain reaction) con, en particular, el metodo de PCR en tiempo real.

La sangre normalmente es esteril. Es fundamental poder identificar una eventual bacteriemia, afectando el retraso en la atencion del paciente y, por lo tanto, el retraso en el diagnostico a la frecuencia de muertes. El metodo que permite la deteccion y la identificacion de las bacterias presentes en la sangre es, por lo tanto, esencial. En la actualidad, se utilizan unas tecnicas de microbiologfa clasica que comprenden sucesivamente un hemocultivo, una primera identificacion visual tras una tincion de Gram y a continuacion un subcultivo en un medio solido para una identificacion secundaria y un antibiograma. Los resultados se obtienen, por lo general, en varios dfas. Los otros metodos empleados de tipo biologfa molecular solo permiten identificaciones precisas relacionadas con indicaciones particulares, por ejemplo la deteccion del estreptococo de grupo B durante el embarazo.

Los resultados de las pruebas biologicas realizadas en unas muestras de sangre dependen mucho de las condiciones pre-analtticas. En efecto, el tipo de extraccion realizada (venosa o arterial), el anticoagulante utilizado, el material disponible influyen de forma importante en la calidad de los resultados. Ademas, para un analisis bacteriologico, las condiciones de prueba deben recurrir a unos procedimientos estrictos con el fin de evitar cualquier contaminacion durante la manipulacion, que conduzca a unos resultados llamados “falsos positivos”, por los organismos presentes en el entorno. Estas condiciones deben entonces ser aun mas drasticas para los analisis de biologfa molecular que recurren a reactivos altamente sensibles a las interferencias naturalmente presentes en el entorno. La variabilidad de las condiciones pre-analfticas unida a la multiplicidad de los metodos de deteccion/identificacion hace de la prueba de sangre bacteriologica en biologfa molecular un parametro muy diffcil de estandarizar. En efecto, la preparacion de las muestras para un analisis bacteriologico recurre habitualmente a unas tecnicas “caseras”, no estandarizadas, que hay que realizar en un entorno esteril con material espedfico para esta aplicacion. El dispositivo descrito en la presente invencion es una forma de estandarizacion. Es un sistema cerrado sin riesgo de contaminacion de la muestra. La extraccion se hace directamente en el tubo de extraccion mediante aspiracion sin abrir este y todas las etapas de preparacion se realizan en el interior del dispositivo sin romper la esterilidad.

En el laboratorio, la PCR permite por lo general una deteccion mediante la amplificacion de algunas copias de genoma bacteriano en una muestra. Es un analisis rapido que se lleva a cabo en unas pocas horas y que tambien permite conocer la especie de la bacteria en cuestion. Sin embargo, la utilizacion de los metodos de biologfa molecular esta limitada en parte por la presencia de numerosos factores en la sangre que reducen la eficacia de la amplificacion como las Inmunoglobulinas G cuya concentracion plasmatica es de entre 8 y 18 g/litro, el grupo hemo, la hemoglobina, principal componente de los globulos rojos y la lactoferrina, presente en los leucocitos, las altas concentraciones de aDn eucariota que vienen de las celulas nucleadas sangumeas como los leucocitos. Por ello, los volumenes analizados son pequenos para limitar la cantidad de inhibidores: con los metodos actualmente disponibles en el mercado el volumen de muestra tratable es de 100 |il y raramente sobrepasa los 200 |il en funcion de los kits. En el caso de las bacteriemias sintomaticas o no sintomaticas la carga bacteriana es mas pequena y puede ser inferior a 1 bacteria por mililitro de sangre. En este caso, esta estadfsticamente demostrado que 200 |il es un volumen insuficiente para detectar estas bajas concentraciones. El dispositivo descrito en la presente invencion permite reducir los factores de inhibicion plasmaticos y celulares que hacen posible una extension de volumen hasta 15 ml de sangre total y, por ello, un aumento de la sensibilidad del metodo.

Con el fin de superar los factores de inhibicion celular, los metodos PCR se llevan a cabo tradicionalmente en suero procedente de la centrifugacion de la sangre total. En efecto, durante una centrifugacion, los elementos figurados de la sangre se concentran en el precipitado mientras que los compuestos solubles como el ADN y el ARN libres se mantienen en el sobrenadante que se extrae para el analisis. Este procedimiento no se puede aplicar a las bacterias ya que su densidad es comparable a las de los corpusculos sangumeos y tambien se encuentran en el precipitado celular.

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En la patente US-6 869 769, se describe un dispositivo, un metodo y un kit para separar los corpusculos sangumeos (leucocitos, globulos rojos, plaquetas) de los ARN/ADN virales o ADN bacterianos en un soporte solido para un analisis PCR. Este procedimiento solo se puede aplicar en volumenes de sangre extremadamente reducidos del orden de una gota y no se puede aplicar a la busqueda y/o identificacion de los microorganismos en el caso de bacteriemia en el que la carga de microorganismos es muy pequena.

La patente US-5 958 257 da a conocer un dispositivo de separacion de un compuesto de la sangre que comprende un recipiente provisto de una camara dentro de la que se puede desplazar un piston entre una posicion de apertura y una posicion de obturacion, comprendiendo dicha camara una zona de separacion y un medio de introduccion de un fluido dentro de dicha camara, estando dicho medio de introduccion dispuesto en la parte superior de la camara, y comprendiendo dicho piston un medio de obturacion que coopera con la zona de separacion de modo que define un volumen superior y un volumen inferior a ambos lados de dicha zona.

La invencion pretende resolver los inconvenientes y las carencias del estado de la tecnica proponiendo un dispositivo y un procedimiento que facilita el analisis rapido de una muestra de fluido biologico en el campo de la microbiologfa de modo eficaz, estandarizado y simple, con una exposicion reducida del usuario con respecto a los riesgos biologicos. Este procedimiento y este dispositivo estan especialmente adaptados para una utilizacion rutinaria en el sector hospitalario para la preparacion de una muestra de sangre para un analisis bacteriologico, en particular de biologfa molecular, que permite que el biologo y el medico accedan rapidamente a un resultado.

Para ello y segun un primer aspecto, la invencion se refiere a un dispositivo de preparacion de una muestra de fluido biologico para su analisis bacteriologico que comprende un recipiente provisto de una camara dentro de la que se puede desplazar un piston entre una posicion de apertura y una posicion de obturacion, comprendiendo la camara una zona de separacion y un medio de introduccion de un fluido dentro de dicha camara, estando dicho medio de introduccion dispuesto en la parte superior de la camara y comprendiendo el piston un medio de obturacion que coopera con la zona de separacion de modo que se define un volumen superior y un volumen inferior a ambos lados de dicha zona, comunicando el volumen superior y el volumen inferior entre sf cuando el piston esta en la posicion de apertura y quedando aislados uno del otro de forma estanca cuando el piston esta en la posicion de obturacion, y caracterizandose dicho dispositivo porque la zona de separacion comprende un cuello de botella, extendiendose el volumen inferior bajo dicho cuello de botella, estando el medio de obturacion previsto para taponar dicho cuello cuando el piston esta en la posicion de obturacion de modo que se afsla el volumen inferior del volumen superior.

El dispositivo descrito en la presente invencion es el vinculo entre la muestra de sangre que hay analizar y la plataforma de analisis, forma parte de una solucion global y estandarizada de deteccion rapida de las bacterias en la sangre. El dispositivo comprende diferentes volumenes independientes pero unidos que pueden contener soluciones de reactivos listos para usar.

Durante su utilizacion en el hospital, el dispositivo permite realizar diferentes etapas secuenciales e integradas.

Segun un segundo aspecto, la invencion se refiere a un procedimiento de preparacion de una muestra de fluido biologico para su analisis bacteriologico que utiliza un dispositivo de preparacion como se ha descrito con anterioridad, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:

- introducir el fluido biologico dentro de la camara, estando el piston en la posicion de apertura;

- tras la sedimentacion del fluido biologico, desplazar el piston a su posicion de obturacion de modo que se separa el precipitado de sedimento del sobrenadante, encontrandose dicho precipitado en el volumen inferior y encontrandose dicho sobrenadante en el volumen superior;

- mezclar el sobrenadante con una solucion de reactivos prevista para favorecer el crecimiento de los microorganismos presentes en dicho sobrenadante;

- extraer dicho sobrenadante para su analisis bacteriologico.

De manera mas particular, el dispositivo permite extraer o recibir, de forma esteril, una muestra de entre 1 ml mmimo y 15 ml maximo de sangre total procedente de un tubo de extraccion de sangre estandar extrafdo en anticoagulante.

El dispositivo asociado al tubo de extraccion permite la extraccion de la muestra mediante un sistema de aspiracion (fuelle, pera, piston).

El dispositivo permite una incubacion dentro de la camara durante un tiempo que va de 20 minutos a 60 horas, tiempo durante el que los globulos rojos sedimentan en el precipitado y los microorganismos se desarrollan. Esta camara puede llenarse previamente con una primera solucion de reactivos que aceleran la sedimentacion de los globulos rojos y/o el desarrollo de los microorganismos.

El dispositivo permite extraer o aislar entre 6 y 20 ml del sobrenadante que resulta de la etapa anterior sin extraer el precipitado presente en el volumen inferior.

El dispositivo permite la mezcla de este sobrenadante con una segunda solucion de reactivos dentro de la camara o tras su transferencia a una segunda camara. El conjunto se incuba con agitacion durante entre 30 minutos y 6 horas, tiempo durante el que las plaquetas se agregan y los microorganismos se desarrollan.

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El dispositivo permite la filtracion de la totalidad de la muestra resultante en un filtro de jeringa con una porosidad superior a 5 |im con sistema de conexion “luer” (entrada hembra “luerlock”, salida macho “luer” o “luer-lock”) para retener los agregados/acumulos plaquetarios y los globulos blancos residuales y, en lmea, un soporte de membrana con sistema de conexion de entrada “luer-lock” hembra constituido por dos partes anidadas y desmontables que contienen una membrana de filtro de entre 0,2 |im y 1 |im de porosidad que retiene las bacterias. En la patente US-2004/0208796 se describe un ejemplo de soporte de membrana.

Las bacterias aisladas en esta ultima membrana pueden entonces ser objeto de una preparacion para un analisis de biologfa molecular. Tradicionalmente, se aplica un protocolo de lisis ffsica o qmmica o ffsico-qmmica para romper las celulas y recuperar el material genetico que hay que analizar. La ventaja del tratamiento previo de la muestra por medio del procedimiento y dispositivo descritos en esta invencion es quitar los microorganismos de interes de todos los factores de interferencia de las pruebas, factores solubles plasmaticos o factores celulares. Para ello, las diferentes camaras del dispositivo pueden contener unas soluciones de reactivos listas para usar:

La primera solucion, dentro de la camara, esta compuesta por reactivos que aceleran la sedimentacion de los globulos rojos y el crecimiento de los microorganismos:

- Medio de cultivo para microorganismos;

- Polfmeros;

- Aglutininas;

- Agua osmotizada.

La segunda solucion dentro de otra camara (o anadida a la camara del dispositivo), esta compuesta por reactivos que permiten la agregacion de las plaquetas y el crecimiento de las bacterias:

- Medio de cultivo para microorganismos;

- Agente de agregacion plaquetaria.

Se mostraran otros objetos y ventajas de la invencion durante la descripcion que viene a continuacion, hecha en referencia a los dibujos adjuntos.

La figura 1 es una representacion esquematica de lado del dispositivo de acuerdo con la invencion.

La figura 2 es una representacion esquematica en seccion en el eje A-A de la figura 1.

En referencia a las figuras, se describe un dispositivo 1 de preparacion de una muestra de fluido biologico que consta de tres piezas principales ensambladas que definen un recipiente. La parte 2 superior del dispositivo esta asociada a la parte 3 inferior para formar una camara 4 cerrada en su base mediante un piston 5 que se puede desplazar entre una posicion de apertura y una posicion de obturacion en la parte 3 inferior del dispositivo y que constituye tambien la base 6 del dispositivo. La camara 4 comprende una zona 7 de separacion. El piston 5 comprende un medio 8 de obturacion que coopera con la zona 7 de separacion de modo que define un volumen 9 superior y un volumen 10 inferior a ambos lados de la zona 7. El volumen 9 superior y el volumen 10 inferior comunican entre sf cuando el piston 5 esta en la posicion de apertura y quedan aislados no del otro de forma estanca cuando el piston 5 esta en la posicion de obturacion, como se representa en la figura 2.

El piston 5 comprende una varilla 11 que se extiende dentro del volumen 10 inferior, extendiendose dicho volumen inferior a ambos lados de la varilla 11. La varilla 11 comprende una protuberancia 12 que forma un medio 8 de obturacion prevista en su parte extrema libre.

La parte 2 superior y la parte 3 inferior estan ensambladas por medio de un tornillo 13 o pueden estar pegadas. La parte 3 inferior comprende una ranura 14 de guiado y el piston 5 comprende una pestana 19, estando dicha pestana dispuesta dentro de dicha ranura. El piston 5 se encuentra en la posicion de obturacion cuando la pestana 19 esta dispuesta en una de las partes extremas de la ranura 14, como se representa en las figuras, y en la posicion de apertura cuando la pestana 19 esta dispuesta en la otra parte extrema de la ranura 14.

De manera ventajosa, el dispositivo es de vidrio siliconado o de un material plastico no adherente para las celulas, por ejemplo, de polipropileno o de poliacnlico de tipo polimetacrilato de metilo. El material del dispositivo debe ser compatible con una esterilizacion, de preferencia mediante irradiacion p o y. La protuberancia 12 del obturador 8 es de manera preferente de elastomero de modo que garantiza una obturacion estanca al adaptarse al diametro del dispositivo.

Las diferentes etapas del procedimiento en relacion con la estructura del dispositivo se detallan a continuacion. Durante la primera etapa, la muestra se introduce por la parte 2 superior del dispositivo por medio de unos medios de introduccion del fluido dentro de la camara 4. Los medios de introduccion estan, por ejemplo, formados por una conexion 15 Luer. Un cuerpo de bomba equipado con una aguja protegida capaz de perforar los tapones de caucho de los tubos de extraccion se enrosca sobre la conexion 15 Luer en la parte superior del dispositivo. El cuerpo de bomba se mantiene dentro de un elemento 16 de recepcion asociado a la parte superior del recipiente. El elemento de recepcion esta, por ejemplo, formado por un faldon con un diametro superior al diametro del cuerpo de bomba

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que acoge el tubo. El faldon esta atravesado por dos ventanas 17 que permiten la manipulacion (enroscado - desenroscado) de los objetos que se colocan sobre el Luer 15. El tubo de extraccion que contiene la sangre se coloca con el tapon hacia abajo y se gma sobre la aguja dentro del cuerpo de bomba. Al ejercer una presion vertical sobre el tubo, se atraviesa el tapon de cauco y la aguja se encuentra en contacto con el lfquido biologico. Se crea una aspiracion del contenido del tubo al accionar el piston 5 tirando de la base 6. Este piston 5 tiene un recorrido definido por medio de la pestana que se desliza dentro de la ranura 14 lo que permite la aspiracion del lfquido. Algunas idas y vueltas del piston (movimientos de arriba a abajo) permiten el llenado de la camara 4 y, en el caso de la presencia de una primera solucion de reactivos, la mezcla de la sangre con la primera solucion de reactivos. El piston 5 queda inmovilizado en la posicion de apertura por medio de la pestana 19 retenida en la parte inferior de la ranura 14. El dispositivo se pone entonces sobre la base 6 durante un tiempo que va desde 20 minutos a 60 horas. De manera ventajosa, el dispositivo se pone dentro de un recinto termorregulado entre 30 °C y 37 °C con el fin de facilitar el crecimiento de los microorganismos. Durante este periodo de incubacion, los globulos rojos sedimentan en el volumen 10 inferior. El precipitado es mas compacto e irreversible cuando la sangre se ha mezclado y se ha incubado con la primera solucion de reactivos que contienen aglutininas.

La zona 7 de separacion comprende un cuello 18 de botella cuya forma facilita la sedimentacion antes de su paso al volumen 10 inferior. El volumen 10 inferior se extiende bajo el cuello 18 de botella y el medio 8 de obturacion esta previsto para taponar dicho cuello 18 cuando el piston 5 esta en la posicion de obturacion de modo que afsla el volumen 10 inferior del volumen 11 superior. El cuello 18 presenta, por ejemplo, una forma anular sustancialmente troncoconica que se extiende dentro del volumen 4 superior. Esta forma garantiza una aglutinacion maxima antes de su paso al volumen 10 inferior.

La utilizacion de aglutininas permite obtener un precipitado denso con exclusion de los lfquidos y una menor perdida de bacterias en el interior de la red de globulos rojos sedimentados. Despues de la incubacion, el piston 5 se desbloquea de su posicion de apertura mediante la rotacion de la base 6 y se empuja delicadamente de forma que la pestana 19 se deslice dentro de la ranura 14 hasta su posicion de obturacion. El piston 5 queda inmovilizado en la posicion de obturacion por medio de la pestana 19 retenida en la parte extrema de la ranura 14. El piston 5 arrastra al medio 8 de obturacion que tapona de forma hermetica el cuello 18 aislando en el volumen 10 inferior el precipitado de globulos rojos. El volumen 9 superior contiene la parte plasmatica, las plaquetas de sangre, los globulos blancos y las bacterias. Cuanto mas largo es el tiempo de incubacion mas alta es la concentracion de bacterias. La siguiente etapa se caracteriza por la introduccion de una segunda solucion de reactivos que presentan unas propiedades de agregacion plaquetaria. El cuerpo de bomba situado en la primera etapa sobre el elemento 16 de recepcion se desenrosca manualmente, por medio de las ventanas 17 que permiten un acceso directo al cuerpo de bomba, y se elimina. Una jeringa con conector Luer y que contiene la segunda solucion de reactivos se coloca y se enrosca en su lugar. Se introduce la solucion en el volumen 9 superior. Se aplica una agitacion mediante el vuelco del dispositivo lo que permite que la solucion se mezcle con el sobrenadante procedente de la etapa anterior. El dispositivo 1 se pone entonces horizontalmente sobre un agitador de balanceo, en la perpendicular del eje de agitacion durante entre 30 minutos y 6 horas. De manera ventajosa, el agitador que lleva el dispositivo se coloca dentro de un recinto termorregulado entre 30 °C y 37 °C con el fin de facilitar el crecimiento de los microorganismos. Durante este periodo de incubacion, las plaquetas se agregan dentro del volumen 9 superior. Cuanto mas largo es el tiempo de incubacion, mas alta es la concentracion de bacterias. La siguiente etapa se puede realizar de diferentes formas:

De acuerdo con una primera realizacion, al final de la incubacion, se da la vuelta al dispositivo, con el piston 5 hacia arriba y el faldon hacia abajo, la jeringa en su lugar, y se desenrosca ligeramente un tapon 19 de una toma 20 de aire, y se aspira el contenido del volumen 9 superior dentro de la jeringa, devolviendose al dispositivo a su posicion correcta, con el piston 5 hacia abajo y el faldon hacia arriba, y se desenrosca entonces la jeringa, se coloca un primer filtro con una porosidad superior a 5 |im mediante conexion Luer sobre dicha jeringa conectado a su vez en lmea a un soporte de membrana que contiene una membrana, segundo filtro, de entre 0,2 |im y 1 |im de porosidad, el contenido de la jeringa pasa secuencialmente a traves del primer filtro que retiene los agregados plaquetarios y los globulos blancos, y del segundo filtro que retiene los microorganismos. Se abre el soporte del segundo filtro y se recupera la membrana para el analisis de los microorganismos retenidos. Se da un ejemplo de soporte de filtro en la patente US-2004/0208796.

De acuerdo con una segunda realizacion, al final de la incubacion, se desenrosca la jeringa situada en la anterior etapa y se insertan un primer filtro y un segundo filtro en lmea en su lugar a la altura de la conexion 15 Luer protegida por el faldon, se pone un primer filtro con una porosidad superior a 5 |im directamente en contacto con el faldon y se inserta un segundo filtro de entre 0,2 |im y 1 |im de porosidad dentro de un soporte (ver ejemplo en el documento US-2004/0208796) y se ubica en lmea con el primer filtro, se da la vuelta al dispositivo, con el piston 5 hacia arriba y el faldon hacia abajo, y se conecta el soporte de filtro a una fuente de vacrn, se desenrosca ligeramente el tapon 19 de la toma 20 de aire, se aplica el vacrn, el contenido del volumen 9 superior pasa secuencialmente a traves del primer filtro que retiene los agregados plaquetarios y los globulos blancos, y del segundo filtro que retiene los microorganismos. El dispositivo y el primer filtro se sueltan del soporte de filtro, se abre el soporte del segundo filtro y se recupera la membrana para el analisis de los microorganismos retenidos.

De manera ventajosa, se puede extraer 1 ml de filtrado al final de la etapa de filtracion, para ello, se le da la vuelta al dispositivo, con el piston 5 hacia arriba, el faldon hacia abajo y la jeringa en su sitio, se desenrosca ligeramente el

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tapon 19 de la toma 20 de aire y se aspira una parte del volumen contenido en el volumen 9 superior dentro de la jeringa, se devuelve al dispositivo a su posicion correcta, con el piston 5 hacia abajo y el faldon hacia arriba, y se desenrosca entonces la jeringa y puede llevarse a cabo la etapa de analisis. Este volumen de filtrado contiene los eventuales microorganismos integrados y se podra utilizar como muestra destinada al antibiograma.

El interes del procedimiento y del dispositivo descritos en la presente invencion es aislar y concentrar los microorganismos de una muestra de sangre en unas pocas horas. Se proponen dos protocolos, en el primero, la primera incubacion dura 20 minutos y la segunda incubacion dura 4 horas a 35-37 °C, y en el segundo protocolo, llamado “protocolo noche” la primera incubacion dura mas de 12 horas a 35-37 °C y la segunda incubacion dura 30 minutos. Los microorganismos se afslan y se concentran en un tiempo mmimo de 4 horas y 20 minutos a partir de una muestra de entre 1 y 15 ml de sangre total en una membrana de filtracion. Esta membrana se puede tratar entonces, por ejemplo, para un analisis de biologfa molecular.

Los ejemplos propuestos se han realizado con unas soluciones de reactivos:

Primera solucion: 9 milfmetros dentro de la camara 4, esta compuesta por reactivos que aceleran la sedimentacion de los globulos rojos y el crecimiento de las bacterias:

- TSB, Corazon-Cerebro (25 %, 75 %);

- PEG 35.000 al 1 % (p/v);

- lectina 6,66 |ig/ml;

- agua osmotizada.

Segunda solucion: 1,2 milfmetros anadidos dentro de la camara 4, esta compuesta por reactivos que permiten la agregacion de las plaquetas y el crecimiento de las bacterias:

- TSB, Corazon-Cerebro (25 %, 75 %);

- CD9 45 mg/litro.

Ejemplo 1: Eliminacion de los globulos rojos y de las plaquetas

Se extraen entre 3 y 5 mililitros de sangre total del dispositivo 1 que contiene 9 mililitros de la primera solucion de reactivos como se ha descrito con anterioridad. Se pone el dispositivo 30 minutos sobre su base 6 en la posicion vertical a temperatura ambiente. Se afsla el precipitado de globulos rojos (GR) formado mediante una accion a la altura del piston 5. Se recupera el sobrenadante (SN). Se lleva a cabo un recuento de los globulos rojos y de las plaquetas en el sobrenadante (GR en SN y PLT en SN) con un contador celular (Micros 60, ABX, Francia). Para una de las muestras, el procedimiento prosigue mediante la adicion de la segunda solucion de reactivos, incubacion con agitacion durante la noche (aproximadamente 16 horas) y a continuacion filtracion superior a 5 |im de todo el sobrenadante. Se lleva a cabo un recuento de las plaquetas (PLT) en el filtrado con un contador celular (Micros 60, ABX, Francia).

Se resumen los resultados en la tabla 1. El numero de GR en la muestra (GR en la muestra) se calcula partiendo de una concentracion de GR teorica de 4x106/|il. Del mismo modo, el numero de PLT (PLT en la muestra) se calcula a partir de un valor teorico de 300x103/|il. Despues de la sedimentacion y el aislamiento de los GR, el numero de globulos rojos residuales en el sobrenadante se divide por 50 y 100, y el numero de plaquetas residuales por 5. Despues de la agregacion plaquetaria y la filtracion, este numero se divide por 10.

En este ejemplo, el procedimiento y el dispositivo permiten una reduccion de aproximadamente 2 LOG de globulos rojos y de aproximadamente 1 LOG de plaquetas.

Ejemplo 2: recuperacion de los microorganismos

Se contamina de forma experimental una muestra de sangre total con 4 cepas bacterianas: Staphylococcus epidermidis (SE), Staphylococcus aureus (SA), Escherichia coli (EC) y Pseudomonas aeruginosa (PA) con aproximadamente 100 bacterias/ml. Se introduce un volumen de sangre dentro del dispositivo 1 y se incuba dentro de la camara 4 con 9 ml de la primera solucion de reactivos. Se pone el dispositivo 30 minutos sobre su base 6 en la posicion vertical a temperatura ambiente. Se afsla el precipitado de globulos rojos formado mediante una accion a la altura del piston 5. Se recupera el sobrenadante (SN). El procedimiento prosigue mediante la adicion de la segunda solucion de reactivos y la incubacion con agitacion durante 4 horas dentro de un recinto termorregulado a 35-37 °C. Se realiza un recuento de bacterias en una placa de Petri al comienzo de la incubacion a 35-37 °C, a T0, y despues de 2 horas de incubacion a T2H, y despues de 4 horas de incubacion a T4H. Las colonias en las placas de Petri se cuentan entre 24 y 48 horas despues de su deposito.

Se presentan los resultados en la tabla 2. La incubacion de 4H permite un crecimiento significativo de las bacterias cuyo numero se multiplica por 25 para SE que se conoce como una bacteria de crecimiento lento, hasta 9.000 para EC que se conoce como una bacteria de crecimiento rapido. Estas concentraciones son compatibles con un metodo de deteccion de biologfa molecular.

Tabla 1

Vol. de muestra de sangre (ml) GR en la muestra PLT en la muestra SN (ml) GR en el SN PLT en el SN PLT en el filtrado

4 ToxTo9 12 x 108 7 2,8 x 108 4,3 x 108

4 ^"xlo9 12 x 108 7 2,8 x 108 5,6 x 108

5 2 x 1010 15 x 108 > 7 2 x 108 7,4 x 108

4,5 18 x 109 14 x 108 > 7 2 x 108 6,2 x 108

3 12 x 109 9 x 108 7 2 x 108 1,2 x 108

3,5 14 x 109 11 x 108 7 2 x 108 3,5 x 108 10

4 16 x 109 12 x 108 7 2 x 108 3,3 x 108

Tabla 2

SE SA EC PA

T0

40 60 130 450

T2H

220 350 1.450 1.020

T4H

1.000 6.000 1.190.000 49.000

5 Resultados expresados en numero de colonias/ml de sobrenadante.

Claims (13)

1. 5

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   15

   20

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   30

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   REIVINDICACIONES

   1. Dispositivo de preparacion de una muestra de fluido biologico para su analisis bacteriologico que comprende un recipiente provisto de una camara (4) dentro de la que se puede desplazar un piston (5) entre una posicion de apertura y una posicion de obturacion, estando dicho dispositivo caracterizado porque la camara (4) comprende una zona (7) de separacion y un medio (15, 16) de introduccion de un fluido dentro de dicha camara, estando dicho medio de introduccion dispuesto en la parte (2) superior de la camara (4) y porque el piston (5) comprende un medio (8) de obturacion que coopera con la zona (7) de separacion de modo que se define un volumen (9) superior y un volumen (10) inferior a ambos lados de dicha zona, comunicando el volumen (9) superior y el volumen (10) inferior entre sf cuando el piston (5) esta en la posicion de apertura y quedando aislados uno del otro de forma estanca cuando el piston (5) esta en la posicion de obturacion, y estando dicho dispositivo caracterizado porque la zona (7) de separacion comprende un cuello (18) de botella, extendiendose el volumen (10) inferior bajo dicho cuello de botella, estando el medio (8) de obturacion previsto para taponar dicho cuello cuando el piston (5) esta en la posicion de obturacion de modo que afsla el volumen (10) inferior del volumen (9) superior.
2. 2. Dispositivo de preparacion segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el cuello (18) presenta una forma anular sustancialmente troncoconica que se extiende dentro del volumen (9) superior.
3. 3. Dispositivo de preparacion segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado porque el piston (5) comprende una varilla (11) que se extiende dentro del volumen (10) inferior, extendiendose dicho volumen inferior alrededor de dicha varilla, comprendiendo dicha varilla una protuberancia (12) que forma un medio (8) de obturacion prevista en su parte extrema libre.
4. 4. Dispositivo de preparacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el recipiente comprende una ranura (14) de guiado, comprendiendo el piston (5) una pestana (19), estando dicha pestana dispuesta dentro de dicha ranura, encontrandose el piston (5) en la posicion de obturacion cuando la pestana (19) esta dispuesta en una de las partes extremas de la ranura (14) y en la posicion de apertura cuando la pestana (19) esta dispuesta en la otra parte extrema de la ranura (14).
5. 5. Dispositivo de preparacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el medio de introduccion del fluido esta formado por un conector (15) Luer dispuesto por encima de la camara (4) y destinado a recibir un recipiente que contiene el fluido a introducir dentro de dicha camara.
6. 6. Dispositivo de preparacion segun la reivindicacion 5, caracterizado porque el medio de introduccion del fluido comprende, ademas, un elemento (16) de recepcion del recipiente que contiene el fluido a introducir, estando dicho elemento asociado a la parte (2) superior del recipiente.
7. 7. Dispositivo de preparacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el recipiente comprende una parte (3) inferior y una parte (2) superior, estando la zona (7) de separacion prevista en la parte (3) inferior, estando dichas partes asociadas entre sf de modo que forman la camara (4).
8. 8. Dispositivo de preparacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la camara (4) contiene una primera solucion de reactivos prevista para acelerar la sedimentacion del fluido biologico y el crecimiento de los microorganismos presentes en la muestra de fluido biologico a preparar.
9. 9. Procedimiento de preparacion de una muestra de fluido biologico para su analisis bacteriologico que utiliza un dispositivo (1) de preparacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende las etapas que consisten en:

   - introducir el fluido biologico dentro de la camara (4), estando el piston (5) en la posicion de apertura;

   - tras la sedimentacion del fluido biologico, desplazar el piston (5) a su posicion de obturacion de modo que se separa el precipitado de sedimento del sobrenadante, encontrandose dicho precipitado en el volumen (10) inferior y encontrandose dicho sobrenadante en el volumen (9) superior;

   - mezclar el sobrenadante con una solucion de reactivos prevista para favorecer el crecimiento de los microorganismos presentes en dicho sobrenadante;

   - extraer dicho sobrenadante para su analisis bacteriologico.
10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, caracterizado porque el fluido biologico se mezcla con una primera solucion de reactivos prevista para acelerar la sedimentacion del fluido biologico y el crecimiento de los microorganismos presentes en la muestra de fluido biologico cuando se introduce dentro de la camara (4).
11. 11. Procedimiento segun la reivindicacion 9 o 10, caracterizado porque comprende una etapa de incubacion y de filtracion del sobrenadante despues de la etapa de mezcla con una solucion de reactivos prevista para favorecer el crecimiento de los microorganismos.
12. 12. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque se introduce una cantidad comprendida entre 1 ml y 15 ml de fluido biologico dentro de la camara (4).
13. 13. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque el fluido biologico es sangre total, siendo el precipitado de sedimento globulos rojos.