ES2564656T3

ES2564656T3 - Medios y métodos para el diagnóstico no invasivo de la aneuploidía cromosómica

Info

Publication number: ES2564656T3
Application number: ES10768959.8T
Authority: ES
Inventors: Marcus Benz; Wera Hofmann; Thomas Pohl; Christoph Von Kalle
Original assignee: Lifecodexx AG
Current assignee: Eurofins Lifecodexx GmbH
Priority date: 2009-10-26
Filing date: 2010-10-26
Publication date: 2016-03-28
Anticipated expiration: 2030-10-26
Also published as: CA2778926C; EP2494065B1; WO2011051283A1; EP2494065A1; AU2010311535A1; US20130017958A1; US20170363628A1; US9784742B2; CA2778926A1; AU2010311535B2; EP2824191A3; EP2824191A2

Abstract

Método para la determinación de una aneuploidía cromosómica fetal en una muestra biológica obtenida de un individuo femenino gestante, en el que la muestra biológica incluye moléculas de ácidos nucleicos, comprendiendo el método: a) seleccionar y aislar a partir de una muestra biológica de un individuo hembra gestante una o más secuencias diana de moléculas de ADN contenidas en la muestra biológica, en la que dichas secuencias diana comprenden secuencias de ADN que presentan regiones de unión a nucleosoma de consenso y en la que dichas moléculas de ADN que comprenden las secuencias diana se aíslan y se enriquecen utilizando cromatografía de afinidad o enriquecimiento por lotes utilizando cebos de ácidos nucleicos marcados, los cuales permiten el enriquecimiento y el aislamiento de las moléculas de ADN hibridadas mediante purificación por afinidad, b) amplificar dichas secuencias diana seleccionadas, c) secuenciar dichas secuencias diana seleccionadas y amplificadas y asignarlas a los cromosomas del genoma e identificar las secuencias diana asignadas únicas, d) determinar una primera cantidad de cada uno o más primeros cromosomas identificados basándose en dichas secuencias diana asignadas únicas que se originan a partir de dicho primer o primeros cromosomas, e) determinar una segunda cantidad de cada uno o más segundos cromosomas identificados basándose en dichas secuencias diana asignadas únicas que se originan a partir de dicho segundo o segundos cromosomas, y f) determinar basándose en dicha primera y segunda cantidades una aneuploidía cromosómica fetal de uno o más de dichos primeros cromosomas.

Description

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DESCRIPCION

Medios y metodos para el diagnostico no invasivo de la aneuploid^a cromosomica

La presente invencion se refiere a un metodo de deteccion prenatal no invasivo en una muestra biologica obtenida de una mujer gestante. En particular, la invencion se refiere a un metodo para el diagnostico prenatal no invasivo (DPNI) mediante enriquecimiento y cuantificacion de secuencias seleccionadas de acido desoxirribonucleico libres de celulas en una muestra materna de sangre, con el fin de detectar anormalidades cromosomicas fetales, por ejemplo aneuploid^as cromosomicas fetales.

En muchos pa^ses el diagnostico prenatal de aneuploidfas fetales, as^ como de trastornos mendelianos de genes individuales, tales como la fibrosis qmstica, tfpicamente constituyen una parte de los programas de salud publica. La atencion obstetrica incluye en particular los ensayos prenatales no invasivos, tales como el cribado en el primer trimestre o en el segundo trimestre para estratificar segun riesgo las mujeres gestantes previamente a los procedimientos diagnosticos invasivos. Dichos ensayos de cribado habitualmente incluyen un analisis de sangre que estima algunos marcadores bioqmmicos y un examen de ultrasonidos para medir la translucencia nucal fetal con una precision de hasta 90% (Malone et al., N. Eng. J. Med. 353:2001-2011, 2005). Los procedimientos invasivos, incluyendo la amniocentesis, el muestreo de la vellosidad corionica o la cordocentesis, se utilizan para obtener material genetico fetal directo (y realizar el analisis del cariotipo) y conseguir una precision superior al 99%. Sin embargo, dichos procedimientos invasivos plantean un riesgo potencial de perdida del feto. Actualmente existe un gran interes en el desarrollo de metodos para el diagnostico directo pero no invasivo de las enfermedades geneticas fetales sin riesgo de aborto.

El descubrimiento de los acidos nucleicos fetales libres de celulas en el plasma materno ha abierto nuevas posibilidades para el diagnostico prenatal no invasivo (Lo YMD et al., Lancet 350:485-487, 1997; Lo YMD y Chiu, RWK, Nat. Rev. Genet. 8:71-77, 2007). Durante los ultimos pocos anos, este enfoque se ha aplicado al diagnostico prental de trastornos ligados al sexo (Costa J.M. et al., N. Engl. J. Med. 346:1502, 2002) y determinados trastornos de genes individuales (Lo Y.M.D. et al., N. Eng. J. Med. 339:1734-1738, 1998). Otras aplicaciones implican el enriquecimiento en ADN fetal mediante un metodo que suprime el fondo materno, tal como mediante la adicion de formaldelddo (Dhallan R. et al., JAMA291:1114-1119, 2004) o el reconocimiento de moleculas de acidos nucleicos espedficamente fetales, incluyendo marcadores epigeneticos espedficamente fetales y marcadores de ARNm espedficos de la placenta (Chan K.C. et al., Clin. Chem. 52:2211-8, 2006).

Los ultimos informes han indicado que el desarrollo de metodos cuantitativos altamente discriminatorios para el analisis de dosis cromosomicas utilizando tecnologfa digital de reaccion en cadena de la polimerasa podnan resultar utiles para la deteccion no invasiva de aneuploidfas fetales mediante el analisis de ADN y ARN libre de celulas en el plasma o suero materno (Fan H.C. y Quake S.R., Anal. Chem. 79:7576-7579, 2007; Lo Y.M.D. et al., PNAS 104:13116-13121, 2007). Sin embargo, la fraccion reducida de acidos nucleicos fetales que coexisten en el plasma materno con el elevado fondo de acidos nucleicos de origen materno con frecuencia puede interferir con dichos analisis (Lo Y.M.D. et al., Am. J. Hum. Genet. 62:768-775, 1998).

Con el rapido desarrollo de la tecnologfa de secuenciacion de alto rendimiento, que permite la secuenciacion masiva en paralelo de decenas de millones de etiquetas de secuenciacion cortas, se ha explorado recientemente la posibilidad de detectar la presencia de genomas fetales trisomicos en la muestra de ADN de plasma materno obtenida durante el primer trimestre del embarazo (Fan H.C. et al., PNAS 105:16266-16271, 2008; Chiu R.W. et al., PNAS 105:20458-20463, 2008). Dicha tecnologfa de secuenciacion "shotgun" (pistola genica) permite un muestreo mas profundo del que se consigue mediante PCR digital. Sin embargo, los costes de la secuenciacion del ADN utilizando la secuenciacion "shotgun" son excesivos para que este enfoque se convierta en un ensayo medico rutinario como parte de la atencion prenatal.

Ademas, una desventaja tecnica de la secuenciacion aleatoria con pistola es el riesgo potencial de introduccion de sesgos de secuencia. La secuenciacion aleatoria "shotgun" no puede producir una distribucion de lectura perfectamente uniforme en todo el genoma de interes, por lo que estadfsticamente siempre existiran algunos tramos de ADN que se lean con mayor frecuencia que otros.

El documento n° WO 2009/013496 se refiere a un metodo no invasivo de ensayo diagnostico prenatal de una aneuploidfa cromosomica fetal mediante la determinacion de los desequilibrios entre diferentes secuencias de acidos nucleicos en una muestra materna mediante secuenciacion genomica masiva en paralelo (SGMP).

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, existe una fuerte necesidad de un metodo no invasivo menos costoso y menos laborioso para el diagnostico prenatal de una anormalidad cromosomica fetal, por ejemplo una aneuploidfa cromosomica fetal, en una muestra biologica obtenida de una mujer gestante, el cual presente una sensibilidad y especificidad elevadas y no introduzca ningun sesgo de secuencia adicional.

De esta manera, es un objetivo de la presente invencion proporcionar un metodo mejorado alternativo para llevar a cabo el diagnostico prenatal.

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Mas concretamente, la invencion se refiere a un metodo para la determinacion de una aneuploidfa cromosomica fetal en una muestra biologica obtenida de un individuo hembra gestante, en el que la muestra biologica incluye moleculas de acidos nucleicos, comprendiendo el metodo:

a) seleccionar y aislar a partir de una muestra biologica de un individuo hembra gestante una o mas secuencias diana de moleculas de ADN contenidas en la muestra biologica, en la que dichas secuencias diana comprenden secuencias de ADN que presentan regiones de union a nucleosoma de consenso y en la que dichas moleculas de ADN que comprenden las secuencias diana se afslan y se enriquecen utilizando cromatograffa de afinidad o enriquecimiento por lotes utilizando cebos de acidos nucleicos marcados, los cuales permiten el enriquecimiento y el aislamiento de las moleculas de ADN hibridadas mediante purificacion por afinidad,

b) amplificar dichas secuencias diana seleccionadas,

c) secuenciar dichas secuencias diana seleccionadas y amplificadas y asignarlas a los cromosomas del genoma e identificar las secuencias diana asignadas unicas,

d) determinar una primera cantidad de cada uno de uno o mas primeros cromosomas identificados basandose en dichas secuencias diana asignadas unicas que se originan a partir de dicho primer o primeros cromosomas,

e) determinar una segunda cantidad de cada uno de uno o mas segundos cromosomas identificados basandose en dichas secuencias diana asignadas unicas que se originan a partir de dicho segundo o segundos cromosomas, y

f) determinar basandose en dicha primera y segunda cantidades una aneuploidfa cromosomica fetal de uno o mas de dichos primeros cromosomas.

El metodo anteriormente indicado puede comprender o no etapas adicionales antes, despues o entre las etapas esenciales mencionadas explfcitamente del metodo. Preferentemente, el metodo comprende las etapas de obtener la muestra biologica de un individuo hembra gestante. Ademas, el metodo puede comprender preferentemente etapas de pretratamiento de las muestras que, por ejemplo, estan destinadas a conservar los acidos nucleicos presentes en la muestra o que estan destinadas a liberar o a aislar los acidos nucleicos respecto del material celular presente en la muestra. El metodo puede, preferentemente, estar asistido por automatizacion. Las etapas a) a c) pueden estar asistidas por un dispositivo robotico; las etapas restantes que evaluan los datos de secuencias pueden estar asistidas por un ordenador o dispositivo de procesamiento de datos que presenta tangiblemente incluido un algoritmo para determinar las cantidades de las secuencias y para llevar a cabo la comparacion.

La expresion "aneuploidfa cromosomica fetal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una aberracion cromosomica que se caracteriza por varios cromosomas que difieren del numero fisiologico de cromosomas que se espera que se encuentren presentes en un feto, es decir, un numero anormal de cromosomas. Dicha diferencia en el numero tambien se denomina aberracion numerica. La expresion comprende un numero incrementado de un cromosoma, asf como un numero reducido de un cromosoma presente en el genoma fetal. Una aneuploidfa cromosomica tal como se denomina en el contexto de la presente invencion puede ser: (i) una monosoirna, es decir, la falta de un cromosoma de una pareja de cromosomas, (ii) una disomfa en los casos en los que el individuo que debe examinarse normalmente es triploide, tetraploide o incluso mas, o una disomfa uniparental, (ii) una trisoirna, es decir, la presencia de tres en lugar de dos cromosomas que se encuentran presentes fisiologicamente para cada cromosoma en un organismo diploide, (iv) una tetrasomfa, es decir, la presencia de cuatro cromosomas en lugar de dos cromosomas que son los presentes fisiologicamente para cada cromosoma en un organismo diploide, o incluso (v) una pentasomfa, es decir, la presencia de cinco cromosomas en lugar de los dos cromosomas que se encuentran presentes fisiologicamente para cada cromosoma en un organismo diploide. La aneuploidfa puede afectar tanto a los autosomas como a los gonosomas. En algunos casos, una pareja de cromosomas puede faltar por completo en el genoma. Ademas, una aneuploidfa tal como se utiliza el termino en la presente memoria comprende ademas una aberracion numerica con respecto a una parte de un cromosoma, es decir, un caso en el que una parte de uno de los cromosomas de una pareja de cromosomas ha sido delecionada o se encuentra presente en una o mas copias adicionales. Una parte de un cromosoma puede encontrarse presente en un numero inapropiado de copias como resultado de una aberracion estructural, por ejemplo traslocaciones desequilibradas, smdromes de genes contiguos o smdromes de deleciones cromosomicas. La aneuploidfa cromosomica fetal habitualmente resulta en trastornos o enfermedades graves que afectan al feto y a su desarrollo. Entre las aneuploidfas cromosomicas fetales y enfermedades o trastornos acompanantes que resultan preferentes que pueden determinarse mediante el metodo de la presente invencion se incluyen el smdrome de Turner (monosomfa gonosomica), el smdrome de Klinefelter (gonosomas XXY), el smdrome de la triple X (gonosomas XXX), el smdrome de Down (trisomfa del par 21), el smdrome de Edwards (trisomfa del par 18) o el smdrome de Patau (trisomfa del par 13). La disomfa uniparental es conocida para el cromosoma 15 y se conoce como smdrome de Prader-Willi. En el caso de que una disomfa uniparental de este tipo deba detectarse, el ADN analizado tambien distinguirse tambien en ADN heredado paternamente o ADN heredado maternamente. Las traslocaciones desequilibradas tal como se utiliza la expresion en la presente memoria comprende, preferentemente, las trisomfas de Robertson desequilibradas, rob(13q;14q). Entre otras aberraciones estructurales que pueden determinarse preferentemente mediante el metodo de la invencion se incluyen la delecion de 4q (smdrome de Wolf-Hirschhorn), la delecion de 5q (smdrome de cri du chat) o los smdromes de microdelecion, en particular la delecion 17q11.2 (smdrome de Smith-Magenis) o la delecion 22q11.2 (smdrome de DiGeorge).

La expresion "determinacion de una aneuploidfa cromosomica fetal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a evaluar la probabilidad segun la cual un sujeto sufre o sufrira de una enfermedad o condicion a la que se

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hace referencia en la presente memoria. Tal como entendera el experto en la materia, dicha evaluacion habitualmente no se pretende que sea correcta para 100% de los sujetos que deben ser diagnosticados. Sin embargo, la expresion requiere que una parte estadfsticamente significativa de sujetos pueda diagnosticarse correctamente que sufre de la enfermedad o condicion. Si una parte es estadfsticamente significativa o no puede ser determinado sin hacer ninguna otra referencia por el experto en la materia utilizando diversas herramientas de evaluacion estadfstica bien conocidos, por ejemplo la determinacion de intervalos de confianza, la determinacion del valor de p, la prueba t de Student, la prueba de Mann-Whitney, etc. Se encontrara mas informacion en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Los intervalos de confianza preferentes son por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99%. Los valores de p preferentemente son 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001. Preferentemente, la probabilidad contemplada por la presente invencion permite que el diagnostico sea correcto para por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80% o por lo menos 90% de los sujetos de una cohorte o poblacion dada.

El termino "individuo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un organismo multicelular que es capaz de portar su progenie en el interior de un utero. Mas preferentemente, dicho organismo se refiere a organismos eutericos y, mas preferentemente, a mairnferos. Todavfa mas preferentemente, el individuo es un ser humano. Se entendera que el individuo del que se utiliza una muestra en el metodo de la presente invencion sera una hembra gestante que porta un embrion o feto en el interior de su utero. Durante la gestacion y en particular en las etapas fetales del desarrollo embrionario, se libera ADN genomico fetal al cuerpo del individuo hembra. En particular, se observa dicho ADN genomico fetal en la sangre del individuo hembra.

De esta manera, la expresion "muestra biologica" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una muestra de un individuo, preferentemente a una muestra de un lfquido corporal obtenido de una mujer gestante. Mas preferentemente, dicho lfquido corporal se selecciona de entre el grupo que consiste de una muestra de sangre, una muestra de orina y una muestra de saliva. La muestra de sangre a la que se hace referencia en la presente memoria comprende una muestra de sangre completa, una muestra de plasma o una muestra de suero. Se entendera que la muestra que debe utilizarse en el metodo de la presente invencion comprendera acidos nucleicos y, en particular, moleculas de ADN que son representativas del genoma del feto en desarrollo. Preferentemente, dichas moleculas de ADN derivadas del genoma fetal representan cada cromosoma presente en dicho genoma fetal de una manera estadfstica. De esta manera, cuantas mas copias de un cromosoma dado se encuentren presentes en el genoma fetal, mas moleculas de ADN reflejaran estos cromosomas en la muestra, y viceversa.

Las moleculas de ADN presentes en la muestra, incluyendo las moleculas de ADN derivadas del genoma fetal, se seleccionan espedficamente para las moleculas de ADN que comprenden secuencias diana que permite un analisis de la secuencias significativo y eficiente en el contexto de la presente invencion. Las secuencias diana adecuadas comprenden secuencias de consenso para regiones de union a nucleosoma tal como se indica en otros sitios de la presente memoria o regiones de union a la matriz del ADN cromosomico. La expresion "region de union a nucleosoma de consenso" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a patrones de secuencias de ADN en o en torno a sitios de inicio de transcripcion (SIT) de genes transcritos que estan asociados a nucleosomas bien situados que se encuentran localizados en o proximos a dichos sitios de inicio de transcripcion. Las secuencias de consenso adecuadas son conocidas de la tecnica y se describen en Schones et al. o en Fan et al. (Schones Cell 132(5): 887-898; Fan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 16266-16271, 2008).

La seleccion y aislamiento de dichas moleculas de ADN que comprenden secuencias diana para el analisis de secuencias tal como se utilizan en la presente memoria incluyen la provision de secuencias adecuadas para cebadores utilizados para la amplificacion del ADN. Preferentemente se proporcionan secuencias adecuadas mediante la ligacion de oligonucleotidos adaptadores que comprenden secuencias adecuadas para la amplificacion del ADN a las moleculas de ADN. Preferentemente, los oligonucleotidos adaptadores pueden comprender ademas secuencias adicionales, preferentemente secuencias de etiqueta de codigo de barras o de mdice que permiten la identificacion de un grupo de especies identicas de moleculas de ADN (ver Parameswaran, Nucl. Acids Res. 35(19): e130, 2007). Mediante la utilizacion de dichos oligonucleotidos adaptadores que comprenden secuencias de etiqueta de codigo de barras o de mdice, resulta posible procesar un grupo de moleculas de ADN de diferentes muestras en el metodo de la presente invencion en paralelo. Ademas, el termino comprende ademas procedimientos de aislamiento y enriquecimiento de moleculas de ADN que comprenden dichas secuencias diana utilizando, por ejemplo el enriquecimiento mediante cromatograffa de afinidad o por lotes utilizando cebadores de acidos nucleicos marcados, que permite el enriquecimiento y aislamiento de moleculas de ADN hibridadas mediante purificacion por afinidad, por ejemplo mediante perlas magneticas. En una realizacion preferente del metodo de la presente invencion, las moleculas de ARN cebo biotiniladas se ponen en contacto con las moleculas de ADN comprendidas en la muestra. Las moleculas de ARN cebo estan disenadas espedficamente para presentar una secuencia que es capaz de hibridarse con la secuencia diana de las moleculas de ADN deseadas, en particular presentan secuencias capaces de hibridarse con las secuencias de consenso para regiones de union a nucleosoma tal como se indica en otros sitios de la presente memoria o regiones de union a matriz del ADN cromosomico. Tras la hibridacion, las moleculas hubridas quimericas de ADN/ARN se afslan de la muestra restante mediante captura del marcaje de biotina mediante estreptavidina. Preferentemente pueden aplicarse perlas magneticas con estreptavidina inmovilizada para el aislamiento. Las moleculas de ADN aisladas pueden liberarse de las perlas magneticas. Dependiendo de como se lleva a cabo la liberacion, tambien puede llevarse a cabo el enriquecimiento de las

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moleculas de ADN. Una tecnica adecuada particular para el aislamiento y el enriquecimiento de las moleculas de ADN deseadas es el sistema disponible comercialmente SureSelect Target Enrichment System, de Agilent Technologies, Inc., US. Tambien se proporciona mas informacion en Gnirke, Nat. Biotechnology 27(2): 182-189, 2009. A continuacion, dichas moleculas de ADN aisladas que comprenden la secuencia diana pueden procesarse adicionalmente segun el metodo de la invencion. Otra tecnica particular es la tecnologfa de secuenciacion mediante smtesis del ADN en cuatro colores, de Illumina, Inc., US (ver Johnson, Science 316: 1497-1502, 2007; Robertson, Nature Methods 4: 651-657, 2007; Barski, Cell 129: 823-837, 2007; Mikkelsen, Nature 448: 553-560, 2007; Fields, Science 316: 1441-1442, 2007).

La amplificacion de la secuencia diana que comprende moleculas de ADN puede conseguirse mediante metodos bien conocidos de amplificacion de los acidos nucleicos. Preferentemente la amplificacion se lleva a cabo mediante PCR. La secuenciacion de los productos de amplificacion puede llevarse acabo mediante tecnicas bien conocidas de secuenciacion de acidos nucleicos. La calidad de las muestras analizadas puede garantizarse despues de la amplificacion. Ademas, las moleculas de ADN en la muestra pueden clasificarse en moleculas de ADN con secuencias de origen paterno o materno.

Preferentemente, las secuencias paternas se analizan al analizar los genomas fetales mediante el metodo de la presente invencion. Mediante el analisis de dichas moleculas de ADN de herencia paterna, la fiabilidad del metodo puede mejorarse adicionalmente, ya que estas secuencias se originan inequvocamente del ADN genomico fetal.

Las secuencias identificadas mediante la secuenciacion de las moleculas de ADN amplificadas que comprenden las secuencias diana deseadas pueden asignarse a cromosomas o partes de los mismos por la presencia de secuencias caractensticas de dichos cromosomas. Las secuencias adecuadas que permiten la asignacion son secuencias geneticas marcadoras, por ejemplo marcadores de polimorfismo de secuencia unica, secuencias de marcador de ADN repetitivo tales como repeticiones de secuencias unicas, repeticiones en tandem cortas, repeticiones en tandem de numero variable o secuencias de microsatelite en general. Alternativamente, la asignacion puede llevarse a cabo mediante la comparacion de las secuencias con secuencias de consenso para cromosomas, tales como las secuencias de consenso hg18 o hg19 para el genoma humano. Tras asignar las secuencias diana a un cromosoma, es decir, tras localizar las secuencias diana en los cromosomas, se identifican las secuencias diana asignadas unicas, es decir, las secuencias diana que han sido asignadas unicamente una vez a un cromosoma, de entre las secuencias diana localizadas. Entre los algoritmos adecuados para la comparacion de secuencias y las asignaciones a cromosomas se incluyen la alineacion local eficiente de datos de nucleotidos (ELAND, por sus siglas en ingles, una herramienta de alineacion integrada en el paquete de procesamiento de datos Illumina-Solexa, que permite la alineacion sin huecos para lecturas con tamanos de hasta 32 pb; Cox, no publicado) o el alineador de Burrows-Wheeler (BWA, por sus siglas en ingles; Li y Durbin, Bioinformatics 25:1754-1760, 2009).

En una etapa posterior, se determina una primera cantidad de cada uno de uno o mas primeros cromosomas identificados basandose en dichas secuencias diana asignadas unicas que se originan a partir de dicho primer o primeros cromosomas, Dicha cantidad puede ser cualquier numero o valor que refleje o se correlacione con el numero de secuencias diana unicas que se asignan a un cromosoma que se han obtenido de las moleculas de ADN. La cantidad puede ser una cantidad absoluta o relativa, es decir, una cantidad normalizada, por ejemplo con respecto al numero total de secuencias diana amplificadas y/o la cantidad total de acidos nucleicos observada en la muestra. Simultanea o separadamente, se determina una segunda cantidad de cada uno de uno o mas segundos cromosomas identificados basandose en dichas secuencias diana asignadas unicas que se originan a partir de dicho segundo o segundos cromosomas.

Basandose en dichas primera y segunda cantidades, puede determinarse una aneuploidfa cromosomica fetal de uno o mas de dichos primeros cromosomas. Lo anterior puede llevarse a cabo para, por ejemplo, un individuo diploide mediante la comparacion de una primera cantidad relativa de un primer cromosoma con una segunda cantidad relativa de un segundo cromosoma. En el caso de un individuo diploide, la primera y segunda cantidades relativas son esencialmente identicas. Una primera cantidad relativa incrementada con respecto a la segunda cantidad sera indicativa de un numero incrementado de primer cromosoma y, de esta manera, de una aneuploidfa del primer cromosoma en el genoma fetal. Lo anterior es de aplicacion, mutatis mutandis, a una primera cantidad reducida. Preferentemente, en el ser humano, pueden utilizarse los cromosomas 1, 2, 3, 5 a 15, 18 y 21 para derivar una segunda cantidad tal como se ha indicado anteriormente.

Tambien preferentemente, puede determinarse un parametro basandose en la primera y segunda cantidades. Dicho parametro sera estadfsticamente mas robusto y permitira la comparacion entre diferentes individuos o colectivos de individuos.

De esta manera, en una realizacion preferente del metodo de la presente invencion, dicho metodo comprende ademas:

i) determinar un parametro a partir de dicha primera cantidad respecto a dicha segunda cantidad,

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ii) comparar el parametro con un valor de control de corte correspondiente y, basandose en la comparacion, determinar si existe una diferencia o no que permita la prediccion de una aneuploidfa cromosomica fetal de uno o mas de dichos primeros cromosomas.

El termino "parametro" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un valor numerico que caracteriza un conjunto de datos cuantitativos y/o una relacion numerica entre conjuntos de datos cuantitativos. Mas concretamente, dicho parametro puede calcularse como una proporcion entre la primera cantidad y la segunda cantidad o puede ser un valor derivado a partir de dicha proporcion, tal como un valor de porcentaje. Preferentemente, el parametro refleja la cantidad de un primer cromosoma que debe investigarse con respecto a la cantidad o cantidades de por lo menos otro segundo cromosoma y, preferentemente, con respecto a los cromosomas restantes segun se determinen por las secuencias diana. Ademas, el parametro puede incluso hacerse mas robusto con respecto a las variaciones individuales y, de esta manera, adecuado para la comparacion con parametros de individuos de referencia o grupos de los mismos. Con este fin, puede, preferentemente, restarse un parametro que ha sido calculado tal como se ha indicado anteriormente (parametro de referencia), respecto del parametro determinado y dividirse por la desviacion estandar para el parametro de referencia. El parametro transformado resultante, tambien denominado "puntuacion z" (ver Chiu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(51):20458- 63, 2008), seguidamente puede compararse con un parametro transformado de un individuo de referencia o grupo de individuos que es conocido que muestran la aneuploidfa cromosomica o que es conocido que no muestran dicha aneuploidfa. De esta manera, el parametro de referencia constituye un valor de corte y, basandose en la comparacion, resulta posible determinar si existe una diferencia o no en el numero de cromosomas del genoma fetal, permitiendo la prediccion de una aneuploidfa cromosomica fetal de uno o mas de dichos primeros cromosomas. La expresion "valor de corte" o "valor de control de corte" tal como se utiliza en la presente memoria, preferentemente se refiere a un valor numerico calculado como la proporcion entre dos cantidades de cromosomas uno respecto a otro, es decir, la proporcion entre la cantidad de uno o mas primeros cromosomas y la cantidad de uno o mas segundos cromosomas de una muestra promedio o agrupada de sangre, orina o saliva procedente de uno o mas donantes hembra sanos, y en la que el numero de dichos segundos cromosomas es identico al numero de dichos primeros cromosomas con lo que debe compararse. El valor de corte permite distinguir entre un estado de enfermedad y de no enfermedad de una muestra biologica experimental. Son tecnicas adicionales para determinar parametros y compararlos entre diferentes individuos o grupos de los mismos que pueden aplicarse preferentemente en el metodo de la presente invencion aquellas que han sido descritas en los documentos n° EP 2 183 692 A1, n° EP 2 183 693 A1 o n° WO 2010/033578.

Recientemente ha sido encontrado por Fan et al. (Fan, loc. cit., 2008) que el ADN en plasma libre de celulas es de origen principalmente apoptotico y que comparte caractensticas del ADN nucleosomico. De esta manera, segun la presente invencion, el metodo no invasivo de diagnostico prenatal dado a conocer en el documento n° WO 2009/013496 se desarrollo y mejoro adicionalmente al sugerir la realizacion de una etapa adicional de enriquecimiento antes de la etapa de secuenciacion para capturar y enriquecer espedficamente regiones de ADN seleccionadas que muestran posiciones nucleosomicas de consenso en los cromosomas de interes. Mediante dicha modificacion del metodo del estado de la tecnica, puede mejorarse sustancialmente el coste y eficiencia del procedimiento, y particularmente en comparacion con la secuenciacion genomica masiva en paralelo utilizando la secuenciacion aleatoria "shotgun". El presente procedimiento de enriquecimiento de la diana ofrece un incremento significativo de la velocidad y ventajas adicionales de escalabilidad respecto a las tecnicas actuales de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) en la mayona de los flujos de trabajo de secuenciacion de la siguiente generacion. Se basa en una tecnica eficiente de seleccion de tubridos que mejora el coste y eficiencia del procedimiento del flujo de trabajo denominado de "secuenciacion genomica masivamente en paralelo" (Gnirke A. et al., Nat. Biotechnol. 27:182-189, 2009). El analisis de multiples grupos de loci diana espedficos se utiliza para incrementar la cantidad de datos obtenibles de una muestra sin incrementar el numero de muestreos de PCR (digitales) realizados para la secuenciacion genomica masivamente en paralelo posterior, tal como la alcanzable con la tecnologfa 454 (Roche).

El metodo segun la presente invencion resulta adecuado para determinar en una muestra de sangre procedente de un individuo gestante la aneuploidfa cromosomica de la progenie en desarrollo. En particular, puede determinarse una aneuploidfa cromosomica de un feto en desarrollo, particularmente desde la sexta semana de gestacion en adelante.

Se da a conocer ademas un metodo para la determinacion de una aberracion cromosomica en una muestra biologica obtenida de un individuo, en el que la muestra biologica incluye moleculas de acidos nucleicos, comprendiendo el metodo:

a) seleccionar y aislar a partir de dicha muestra biologica de un individuo una o mas secuencias diana de moleculas de ADN contenidas en la muestra biologica, en la que dichas secuencias diana comprenden secuencias de ADN que presentan regiones de union a nucleosoma de consenso,

b) amplificar dichas secuencias diana seleccionadas,

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e) determinar una segunda cantidad de cada uno de uno mas segundos cromosomas identificados basandose en dichas secuencias diana asignadas unicas que se originan a partir de dicho segundo o segundos cromosomas, y

f) determinar, basandose en dicha primera y segunda cantidades, una aberracion cromosomica.

La expresion "aberracion cromosomica" tal como se utiliza en la presente memoria preferentemente se refiere a aberraciones numericas tal como se definen en otros sitios de la presente memoria.

Preferentemente la etapa f) de dicho metodo comprende ademas:

ii) comparar el parametro con un valor de control de corte correspondiente y, basandose en la comparacion, determinar si existe o no una diferencia en la que la presencia de una diferencia es indicativa de una aberracion cromosomica en uno o mas de dichos primeros cromosomas.

Mas preferentemente, la aberracion cromosomica es indicativa de una predisposicion al cancer.

El termino "predisposicion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un riesgo incrementado de que un individuo desarrolle cancer dentro de una ventana de prediccion en el futuro. Preferentemente, dicha ventana es de hasta 1 ano, de hasta 5 anos, de hasta 10 anos o el periodo de vida entero del individuo.

El termino "cancer" tal como se utiliza en la presente memoria comprende cualquier neoplasma maligno. Son bien conocidos de la tecnica diversos tipos de cancer. Preferentemente el cancer al que se hace referencia segun la presente exposicion se asocia a aberraciones cromosomicas. En particular, los canceres siguientes se ha informado que se asocian frecuentemente a aberraciones cromosomicas, seleccionados de entre el grupo que consiste de: leucemias humanas, tales como la leucemia mieloide aguda o la leucemia mieloide cronica (ver, por ejemplo, Mitelman Database of Chromosome Aberrations and Gene Fusions in Cancer, Mitelman F, Johansson B and Mertens F (eds.), 2010,
http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman).

Preferentemente, dicho individuo en el contexto del metodo anteriormente indicado es un individuo tal como se define en otros sitios de la presente memoria y, mas preferentemente, es un ser humano.

Preferentemente, dicha muestra biologica comprende una celula que se sospecha que es una celula de cancer. Pueden obtenerse muestras adecuadas de lfquidos corporales en el caso de tumores no solidos, por ejemplo sangre en el caso de los canceres hematopoyeticos, o de muestra de biopsia de tejidos. Segun el tipo de cancer, el experto en la materia conocera como obtener una muestra que comprende celulas que se sospecha que son celulas de cancer.

Se da a conocer ademas un producto programa informatico que al ser ejecutado en un ordenador o dispositivo de procesamiento de datos es capaz de llevar a cabo las etapas siguientes:

a) asignar secuencias diana seleccionadas y aisladas que se han amplificado, que presentan regiones de union a nucleosoma de consenso de una muestra biologica de un individuo, a cromosomas del genoma, e identificar las secuencias diana asignadas unicas,

b) determinar una primera cantidad de cada uno de uno o mas primeros cromosomas identificados basandose en dichas secuencias diana asignadas unicas que se originan a partir de dicho primer o primeros cromosomas, y

c) determinar una segunda cantidad de cada uno de uno o mas segundos cromosomas identificados basandose en dichas secuencias diana asignadas unicas que se originan a partir de uno o mas segundos cromosomas, y d) determinar basandose en dicha primera y segunda cantidades de una aneuploidfa cromosomica fetal de uno o mas de entre dichos primeros cromosomas o una aberracion cromosomica.

Una realizacion preferente de dicho producto programa informatico, de dicha determinacion en la etapa d), comprende ademas:

ii) comparar el parametro con un valor de control de corte correspondiente y, basandose en la comparacion, determinar si existe o no una diferencia que permita la prediccion de una aberracion cromosomica en uno o mas de dichos primeros cromosomas o determinar si existe o no una diferencia que permite la prediccion de una aneuploidfa cromosomica fetal de uno o mas de dichos primeros cromosomas.

Se da a conocer ademas un dispositivo para llevar a cabo un metodo tal como se da a conocer en la presente memoria, que comprende:

a) una unidad de analisis que comprende una subunidad capaz de seleccionar y aislar a partir de dicha muestra biologica de un individuo, una o mas secuencias diana de moleculas de ADN contenidas en la muestra biologica, en la que dichas secuencias diana comprenden secuencias de ADN que presentan regiones de union a nucleosoma de

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consenso, una subunidad para la amplificacion de dichas moleculas de ADN diana y una subunidad para secuenciar secuencias diana amplificadas, y

b) una unidad de evaluacion que comprende una subunidad receptora para los datos de secuencias y un ordenador o subunidad de procesamiento de datos que ejecuta el producto programa informatico dado a conocer en la presente memoria.

El termino "dispositivo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un sistema que comprende por lo menos la unidad de analisis anteriormente indicada y la unidad de evaluacion ligada operativamente con ella. El como asociar las unidades del dispositivo de una manera operativa dependera del tipo unidades incluidas en el dispositivo. Por ejemplo, en el caso de que se utilicen unidades para el analisis automatico de una muestra, los datos obtenidos por dicha unidad de analisis de operacion automatica pueden ser procesados por el producto programa informatico de la unidad de evaluacion con el fin de obtener los resultados diagnosticos deseados. Preferentemente, las unidades estan comprendidas en un unico dispositivo en dicho caso. Sin embargo, el dispositivo puede comprender tambien unidades ffsicamente separadas que se encuentran conectadas mediante cables, inalambricamente o a traves de Internet.

FIGURAS

La figura 1 muestra un diagrama de flujo que delinea el principio de flujo de trabajo de un metodo para llevar a cabo el diagnostico prenatal para la determinacion de una aneuploidfa cromosomica fetal en una muestra biologica obtenida de una mujer gestante segun la presente invencion.

La figura 2 (A) muestra un grafico de la representacion en porcentaje de lecturas de localizacion unica sin ningun desapareamiento con el cromosoma 13 en muestras seleccionadas de ADN libres de celulas, segun una realizacion de la presente invencion, (B) muestra un grafico de la representacion en porcentaje de lecturas de localizacion unica sin ningun desapareamiento con el cromosoma 21 en muestras seleccionadas de ADN libres de celulas, segun una realizacion de la presente invencion.

La figura 3 (A) muestra un grafico de la representacion en porcentaje de lecturas de localizacion unica sin ningun desapareamiento con regiones cebo en el cromosoma 13 (150 pb cadena arriba-150 pb cadena abajo) sin ningun desapareamiento en muestras seleccionadas de ADN libre de celulas segun una realizacion de la presente invencion, (B) muestra un grafico de la representacion en porcentaje de lecturas de localizacion unica en regiones cebo en el cromosoma 21 (150 pb cadena arriba-150 pb cadena abajo) sin ningun desapareamiento en muestras seleccionadas de ADN libres de celulas segun una realizacion de la presente invencion.

La figura 4 (A) muestra un grafico de la representacion en porcentaje de lecturas de secuencia de localizacion unica en SIT (500 pb cadena arriba-1.500 pb cadena abajo) en el cromosoma 13 sin ningun desapareamiento en muestras seleccionadas de ADN libres de celulas segun una realizacion de la presente invencion, (B) muestra un grafico de la representacion en porcentaje de lecturas de secuencia de localizacion unica en SIT (500 pb cadena arriba-1.500 pb cadena abajo) en el cromosoma 21 sin ningun desapareamiento en muestras seleccionadas de ADN libres de celulas segun una realizacion de la presente invencion.

La figura 5 muestra un grafico de la representacion en porcentaje de lecturas de secuencia en el cromosoma 13 en muestras seleccionadas de ADN libres de celulas segun resultados anteriores utilizando la estrategia de secuenciacion "shotgun" sin procedimiento de enriquecimiento.

Con el fin de entender mas completamente la invencion descrita en la presente memoria, se proporciona el ejemplo siguiente. Se proporciona meramente con fines ilustrativos y no debe interpretarse como limitativo de la presente invencion en modo alguno.

Se entiende ademas que la presente invencion comprendera ademas variaciones de las realizaciones dadas a conocer expresamente en la medida que senan contempladas por el experto ordinario en la materia. La invencion se define a partir del alcance de las reivindicaciones.

Ejemplo 1: realizacion del diagnostico prenatal para la deteccion de trastornos cromosomicos fetales mediante tecnologia de enriquecimiento de la diana

En primer lugar, se extraen hasta 15 ml de sangre periferica de una mujer gestante y se recogieron en tubos que conteman EDTA. Se obtiene plasma libre de celulas mediante centrifugacion de la muestra de sangre. Se extrajo el ADN del plasma libre de celulas a partir del plasma mediante la utilizacion del minikit QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit (Qiagen) o el microkit QIAamp DNA (Qiagen).

Tras la extraccion del ADN se llevo a cabo una etapa de enriquecimiento de la diana. Mas concretamente, una o mas secuencias de ADN espedficas que comprendfan regiones de union a nucleosoma de consenso en torno a los sitios de inicio de transcripcion de los genes codificantes de protema del cromosoma o cromosomas de interes se enriquecieron selectivamente mediante la tecnica de seleccion de tubridos en solucion. Para dicho enriquecimiento

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espedfico, puede utilizarse el sistema de enriquecimiento de dianas SureSelect (Agilent Technologies) siguiendo el manual del usuario. Para iniciar la preparacion de muestra, se utilizan hasta 10 ng de ADN del plasma libre de celulas para la produccion de bibliotecas preparadas espedfica de la plataforma de secuenciacion utilizada posteriormente, tal como el instrumento de secuenciacion de Illumina. La posterior preparacion de la biblioteca se llevo a cabo siguiendo el protocolo del fabricante correspondiente con la modificacion de que no se realizo fragmentacion mediante nebulizacion o sonicacion de la muestra de ADN del plasma libre de celulas.

En paralelo con la produccion de biblioteca, se creo un kit SureSelect espedfico que contema una mezcla de oligonucleotidos de ARN SureSelect disenados en la herramienta web de diseno de Agilent. La Tabla 1 muestra un ejemplo de un diseno personalizado de kit adecuado para la deteccion de aneuploidfas cromosomicas y enfermedades geneticas ligadas al sexo causadas por una mutacion en el cromosoma X. En detalle, para cada cromosoma de interes incluyendo el cromosoma o cromosomas de interes, se generan las sondas de hibridacion para las regiones en torno a los sitios de inicio de transcripcion (aproximadamente 1,5 kb) de todos los genes codificantes de protema conocidos en el cromosoma respectivo, resultando en una cantidad de ADN enriquecido de aproximadamente 4 Mb.

Tabla 1:

Ejemplo de un diseno personalizado de kit para la deteccion de aneuploidfas cromosomicas y enfermedades geneticas ligadas al X

Cromosoma: Genes codificantes de protema (correspondientes al numero de sondas de hibridacion) (Ensembl version 55 -julio de 2009;
http://www.ensembl.org/index.html) Longitud aproximada en kb enriquecida por cada 1,5 kb en torno al sitio de inicio de transcripcion de genes codificantes de protema Smdrome o trastorno cromosomico

13: 359 520 Smdrome de Patau (trisomfa 13)

16: 1038 1250 Trisomfa 16

18: 315 470 Smdrome de Edwards (trisomfa 18)

21: 265 390 Smdrome de Down (trisomfa 21)

X: 883 1250 Smdrome de Turner, smdrome de la triple X, enfermedades geneticas ligadas al X

Y: 86 120 Smdrome XYY, enfermedades geneticas ligadas al sexo

: 4 Mb

Para llevar a cabo la captura del ADN, se incuba la biblioteca seleccionada segun tamano, con los oligonucleotidos de ARN SureSelect disenados y los dbridos de ARN-ADN generados de esta manera se incuban con perlas magneticas marcadas con estreptavidina para permitir la captura de los dbridos de ARN-ADN mediante la union de los mismos a las perlas. Tras recolectar las perlas cargadas mediante su atraccion hacia un iman, las perlas se lavan y los oligonucleotidos de ARN se digieren, de manera que solo se recolecta el ADN enriquecido de interes restante. Tras la amplificacion final del ADN y la estimacion de la calidad de los productos de PCR utilizando, por ejemplo el instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), el grupo enriquecido de secuencias de aDn diana seguidamente se somete a secuenciacion mediante secuenciacion en paralelo masiva utilizando, por ejemplo, la plataforma 454 (Roche) (Margulies M. et al., Nature 437:376-380, 2005), el analizador genomico de Illumina o el sistema SOLiD (Applied Biosystems), que permite la secuenciacion de muchas moleculas de acidos nucleicos aislados a partir de una muestra de ADN de plasma humano en paralelo.

El procedimiento bioinformatico posterior seguidamente se utiliza para localizar cada una de dichas secuencias de ADN en el genoma humano. Mas concretamente, se recogen las lecturas cortas del instrumento de secuenciacion y se alinean con el genoma de referencia humano (hgI8, NCBI revision 36 (GenBank numeros de acceso: NC_000001 a NC_000024) utilizando varias herramientas bioinformaticas, tales como ELAND (por sus siglas en ingles, alineacion eficiente a gran escala de bases de datos de nucleotidos). Con el fin de garantizar una calidad elevada de los resultados, resulta preferente que solo se consideren aquellas lecturas para el analisis posterior que se encuentran localizadas en regiones genomicas preseleccionadas que comprenden regiones de union a nucleosoma de consenso del cromosoma o cromosomas de interes y que se localizan de manera unica en el genoma humano con solo uno o dos desapareamientos respecto al genoma humano.

La lectura digital resultante de las moleculas de acidos nucleicos se utiliza a continuacion para la deteccion de aneuploidfas cromosomicas fetales, por ejemplo la trisoirna 13, 18 o 21, y de manera similar puede utilizarse para la determinacion del sexo del feto.

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Un desequilibrio, tal como una aneuploidfa cromosomica, en una muestra experimental dada queda revelada por diferencias en el numero o porcentaje de secuencias alineadas con una region cromosomica de interes en comparacion con el numero o porcentaje correspondiente de dichas secuencias esperado o predeterminado para una muestra de genoma humano euploide.

El presente metodo resulta adecuado para la deteccion de una o mas aneuploidfas cromosomicas en una operacion, en la que el cromosoma afectado tipicamente se selecciona de entre el grupo que consiste de cromosoma 21 (trisoirna 21), cromosoma 18 (trisoirna 18), cromosoma 13 (trisoirna 13) y cromosoma X (smdrome de Turner).

El metodo de secuenciacion mediante enriquecimiento selectivo de la diana segun la presente invencion tambien puede resultar aplicable a otras aplicaciones diagnosticas que implican la evaluacion cualitativa y/o cuantitativa del contenido de acidos nucleicos del suero o del plasma, por ejemplo en oncologfa y medicina de los trasplantes. Por ejemplo, la tecnica de secuenciacion mediante enriquecimiento selectivo de la diana indicado anteriormente aplicado sobre ADN libre de celulas tambien puede utilizarse para detectar alteraciones cromosomicas espedficas de tumores asociadas a un cancer espedfico.

El principio de la invencion se describe adicionalmente en la reivindicacion independiente posteriormente en la presente memoria, siendo las diversas realizaciones de la invencion la materia objeto de las reivindicaciones dependientes.

Ejemplo 2: realizacion del diagnostico prenatal para la deteccion de la trisoirna 21 y la trisoirna 13 mediante tecnologia de enriquecimiento de la diana y secuenciacion "barcode" (de codigo de barras) multiplexada

Para el estudio, se seleccionaron muestras de sangre materna procedentes de 4 embarazos simples. Una de las mujeres gestantes portaba un feto masculino euploide y los otros tres portaban un feto con trisoirna 21, trisoirna 13 y trisoirna 18, respectivamente (Tabla 2, posteriormente). Se extrajeron hasta 15 ml de sangre venosa periferica de dichas mujeres gestantes y se recolectaron en tubos con EDTA. Se obtuvo el plasma de las muestras de sangre mediante centrifugacion a 1.600g a 4°C durante 10 minutos. Para separar las celulas residuales, el plasma se centrifugo adicionalmente a 16.000 g a 4°C durante 10 minutos. De las muestras de plasma se extrajo el ADN libre de celulas a partir de 0,8 a 1 ml de plasma mediante la utilizacion del kit de acidos nucleicos circulantes QIAamp (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante.

A continuacion, se utilizaron hasta 10 ng de ADN del plasma libre de celulas para construir bibliotecas de secuenciacion de Illumina. La preparacion de la biblioteca de ADN siguio el protocolo de preparacion estandar de muestras de Illumina para la secuenciacion de extremos apareados con unas cuantas modificaciones. Brevemente, no se llevo a cabo ninguna fragmentacion mediante nebulizacion o sonicacion de las muestras de ADN del plasma libre de celulas. La preparacion de biblioteca se llevo a cabo siguiendo el protocolo de preparacion de muestras beta Chromatin Immunoprecipitarion Sequencing (ChIP-Seq) (Illumina, componente n° 11257047 Rev. A) utilizando enzimas de Fermentas (ADN polimerasa de T4, ADN polimerasa Klenow, polinucleotido quinasa de T4, ADN ligasa), asf como de Finnzymes Oy (polimerasa Phusion*). Se repararon los extremos de los productos y se anadieron A en el extremo 3' no del molde. Para que se encontrase disponible la secuenciacion "barcode" (de codigo de barras) multiplexada, se etiquetaron bibliotecas de ADN con diferentes identificadores (codigos de barra) durante la ligacion de adaptadores de extremos apareados. El primer adaptador contema los sitios de cebador de secuenciacion para la aplicacion lectura 1 y un identificador de 4 pb, asf como una T que resulta necesaria para la ligacion de adaptadores. El segundo adaptador contema los sitios de cebador de secuenciacion para la aplicacion lectura 2 y tambien una 'T'. Las bibliotecas de ADN con muestras con codigo de barras seguidamente se amplificaron adicionalmente utilizando una PCR de 12 ciclos y cebadores que conteman los sitios de union para las celdas de flujo. Los fragmentos de ADN ligados a adaptador se seleccionaron segun tamano en el intervalo de 150 a 300 pb utilizando una electroforesis en gel de agarosa al 2%. Se llevo a cabo un control de calidad y la cuantificacion de las bibliotecas utilizando un kit de ADN de alta sensibilidad en el instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para que la diana fuesen todos los exones humanos y sus regiones genomicas humanas asociadas correspondientes a los sitios de inicio de transcripcion (SIT), se incubaron 500 ng de bibliotecas con el kit SureSelect Human All Exon (Agilent Technologies) y se enriquecieron siguiendo el protocolo del fabricante. Tras la elucion de los fragmentos de ADN capturados, las bibliotecas se amplificaron nuevamente durante 12 a 14 ciclos de PCR con cebadores espedficos de Sure Select Illumina. La amplificacion permite la cuantificacion exacta utilizando el chip de alta sensibilidad del instrumento Bioanalyzer antes de la secuenciacion.

A continuacion, los cuatro muestras diferentes con codigo de barras seguidamente se agruparon en un unico tubo y se generaron agrupaciones clonales utilizando el sistema de amplificacion clonal cBOT con el kit de generacion de agrupaciones con extremos apareados cBOT. Siguiendo el flujo de trabajo de secuenciacion de Illumina, los moldes de ADN de molecula unica amplificados se secuenciaron utilizando la smtesis en paralelo masiva en el analizador genomico Ilx de Illumina.

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El procedimiento bioinformatico posterior inclma analisis de imagenes, identificacion de bases y alineacion mediante la utilizacion del software "en pipeline" de Illumina. Para el analisis individual posterior, una estrategia semiautomatica de clasificacion de etiquetas identifica cada muestra que presenta un codigo de barras unico. Las primeras 32 pb de cada lectura de cada muestra se alinean con la secuencia de referencia genomica humana con repeticiones enmascaradas de NCBI revision 36 (tambien conocido como hg18; GenBank numeros de acceso: NC_000001 to NC_000024) descargado del explorador UCSC Genome Browser utilizando el software de alineacion ELAND (software GAPipeline-1.4.0) proporcionados por Illumina.

Las lecturas digitales resultantes de las moleculas de acidos nucleicos se utiliza a continuacion para la deteccion de aneuploidfas cromosomicas fetales, por ejemplo la trisoirna 13 o 21, y de manera similar puede utilizarse para la determinacion del sexo del feto.

Inicialmente se realizo un recuento del numero de total de lecturas secuenciadas de cada muestra. A continuacion, solo se utilizaron para el analisis posterior las lecturas separadas que habfan sido localizadas en un unico sitio en la secuencia de referencia genomica humana con enmascarado de repeticiones y sin ningun desapareamiento de nucleotidos (ver la Tabla 2, posteriormente).

En primer lugar, se identifico un desequilibrio, tal como la trisomfa 21 o la trisomfa 13, en las muestras experimentales dadas, a partir de las diferencias en el numero o el porcentaje de lecturas de localizacion unica con

enmascarado de las repeticiones sin ningun desapareamiento de interes (originadas en los cromosomas 13 y 21,

respectivamente) en comparacion con el numero o porcentaje correspondiente de dichas secuencias determinado para la muestra del genoma humano euploide. El porcentaje esperado de representacion de cada cromosoma se obtuvo dividiendo el numero de lecturas de localizacion unica con enmascarado de repeticiones sin ningun desapareamiento por cromosoma, por el numero total de lecturas de localizacion unica con enmascarado de repeticiones sin ningun desapareamiento de todos los cromosomas. Tal como se muestra en la figura 2A, el porcentaje de lecturas de localizacion unica en el cromosoma 13 procedentes de la muestra S_T13 era mas elevado que el de la muestra S_euploide con un feto euploide, asf como de la muestra S_T21 que portaba un feto con trisomfa 21. El porcentaje de lecturas de localizacion unica en el cromosoma 21 procedentes de la muestra S_T21 tambien era mas elevado que el de la muestra S_euploide de un feto euploide, asf como de la muestra S_T13 que portaba un feto con trisomfa 13 (figura 2B).

En segundo lugar, se identifico un desequilibrio, tal como la trisomfa 21 o la trisomfa 13, en las muestras

experimentales dadas, a partir de las diferencias en el numero o el porcentaje de lecturas de localizacion unica con

enmascarado de las repeticiones sin ningun desapareamiento alineadas con una region cromosomica dada de interes en comparacion con el numero o porcentaje correspondiente de dichas secuencias determinado para la muestra del genoma humano euploide. La region cromosomica de interes se caracterizo por las regiones cebo de 120 pb predeterminadas (disponibles de la plataforma eArray de Agilent Technologies) del kit SureSelect Human All Exon Kit (Agilent Technologies) mas regiones de 150 pb flanqueantes cadena arriba y cadena abajo de las regiones de cebo. A continuacion, se obtuvo el porcentaje esperado de representacion de cada cromosoma tal como se ha indicado anteriormente. Se observo una sobrerrepresentacion de lecturas de localizacion unica para los cromosomas 13 y 21 en los casos T13 y T21, respectivamente (figuras 3A y 3B).

En tercer lugar, se identifico un desequilibrio, tal como la trisomfa 21 o la trisomfa 13, en las muestras experimentales dadas, a partir de las diferencias en el numero o el porcentaje de lecturas de localizacion unica con enmascarado de las repeticiones sin ningun desapareamiento alineadas con una region de union a nucleosoma de consenso dada en comparacion con el numero o porcentaje correspondiente de dichas secuencias esperado o predeterminado para la muestra del genoma humano euploide. La region de union a nucleosoma de consenso utilizada en la presente memoria inclma regiones de secuencia entre 500 pb cadena arriba del SIT y 1.500 pb cadena abajo del SIT. El porcentaje de lecturas de localizacion unica en el cromosoma 13 de la muestra S_T13 era mas elevado que el de la muestra S_euploide con un feto euploide, asf como el de la muestra S_T13 (figura 4A). El porcentaje de lecturas de localizacion unica en el cromosoma 21 de la muestra S_T21 solo era mas elevado que el de la muestra S_T13 y no era mas elevado que el de la muestra S_euploide con un feto euploide (figura 4B).

El presente metodo resulta adecuado para la deteccion de una o mas aneuploidfas cromosomicas en una operacion, en la que el cromosoma afectado tfpicamente se selecciona de entre el grupo que consiste de cromosoma 21 (trisomna 21), cromosoma 18 (trisomfa 18), cromosoma 13 (trisomfa 13) y cromosoma X (smdrome de Turner).

En comparacion con experimentos anteriores (figura 5 y Tabla 3, posteriormente) en los que se utilizaba unicamente la secuenciacion "shotgun", el presente metodo resulto apropiado incluso para detectar una trisomfa 13.

Ademas, los metodos indicados tienden a resultar en la reduccion de las capacidades de almacenamiento necesarias para los datos en bruto, asf como para el mapeado y la alineacion de las lecturas de secuencia generadas.

Tabla 2:

(i) Resumen de datos clrnicos y numero de lecturas de secuencia del Ejemplo 2 "Realizacion del diagnostico prenatal para la deteccion de la trisoirna 21 y la trisoirna 13 mediante tecnologfa de enriquecimiento de la diana y secuenciacion "barcode" (de codigo de barras) multiplexada

Muestra: Cariotipo Gestacion (semanas+df as) Edad total n° de lecturas de secuencia lectura1 N° total de lecturas de secuencia lectura2

S T13: 47XY+13 13+5 5005094 5005094

S T21: 47XY+21 13+0 6739231 6739231

S euploide: 46XY 16+0 3415786 3415786

(ii) Resumen de numero de lecturas de secuencia del Ejemplo 2

Muestra: N° total de lecturas de localizacion unica sin ningun desapareami ento_lectura1 N° total de lecturas de localizacion unica sin ningun desapareami ento_lectura2 N° total de lecturas de localizacion unica sin ningun desapareami ento con el cromosoma 13 lectura1 N° total de lecturas de localizacion unica sin ningun desapareami ento con el cromosoma 13 lectura1 N° total de lecturas de localizacion unica sin ningun desapareami ento con el cromosoma 21 lectura1 N° total de lecturas de localizacion unica sin ningun desapareami ento con el cromosoma 21 lectura2

S T13: 2856635 2745340 8643 83057 32290 31010

S T21: 3913173 3761195 109842 105110 45647 44115

S euploide: 1959738 1895396 56616 54658 2191 21186

(iii) Resumen del numero de lecturas de secuencia de una region cromosomica de interes (caracterizada por las regiones cebo de 120 pb predeterminadas del kit SureSelect Human All Exon Kit mas regiones de 150 pb flanqueantes cadena arriba y cadena abajo de las regiones cebo) del Ejemplo 2

S T13: 1599317 1530800 42125 40162 17060 16256

S T21: 2215860 2120634 54244 51598 24433 23345

S euploide: 1091265 1051800 27601 26577 11679 11303

(iv) Resumen del numero de lecturas de secuencia alineadas con una region de union a nucleosoma de consenso dada que incluye regiones de secuencia entre las 500 pb cadena arriba del SIT y 1.500 pb cadena abajo del SIT (Ejemplo 2)________________________________________________________________

S T13: 202723 196213 4254 4087 2755 2652

S T21: 282640 273834 5520 5408 3951 3814

S_euploide: 135892 131693 2665 2567 1880 1857

Resumen del numero de lecturas de secuencia de experimentos anteriores utilizando el metodo de secuenciacion "shotgun"

Muestra: N° total de lecturas de secuencia N° total de lecturas de localizacion unica sin ningun N° total de lecturas de localizacion unica sin ningun N° total de lecturas de localizacion unica sin ningun


: desapareamiento desapareamiento con el cromosoma 13 desapareamiento con el cromosoma 21

S T13: 16611762 5992776 215666 73885

S_T21: 26137898 10752119 402319 141130

S euploide: 20289419 7928946 285433 99306

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REIVINDICACIONES

1. Metodo para la determinacion de una aneuploidfa cromosomica fetal en una muestra biologica obtenida de un individuo femenino gestante, en el que la muestra biologica incluye moleculas de acidos nucleicos, comprendiendo el metodo:

a) seleccionar y aislar a partir de una muestra biologica de un individuo hembra gestante una o mas secuencias diana de moleculas de ADN contenidas en la muestra biologica, en la que dichas secuencias diana comprenden secuencias de ADN que presentan regiones de union a nucleosoma de consenso y en la que dichas moleculas de ADN que comprenden las secuencias diana se afslan y se enriquecen utilizando cromatograffa de afinidad o enriquecimiento por lotes utilizando cebos de acidos nucleicos marcados, los cuales permiten el enriquecimiento y el aislamiento de las moleculas de ADN hibridadas mediante purificacion por afinidad,

b) amplificar dichas secuencias diana seleccionadas,

c) secuenciar dichas secuencias diana seleccionadas y amplificadas y asignarlas a los cromosomas del genoma e identificar las secuencias diana asignadas unicas,

d) determinar una primera cantidad de cada uno o mas primeros cromosomas identificados basandose en dichas secuencias diana asignadas unicas que se originan a partir de dicho primer o primeros cromosomas,

e) determinar una segunda cantidad de cada uno o mas segundos cromosomas identificados basandose en dichas secuencias diana asignadas unicas que se originan a partir de dicho segundo o segundos cromosomas, y

f) determinar basandose en dicha primera y segunda cantidades una aneuploidfa cromosomica fetal de uno o mas de dichos primeros cromosomas.
2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa f) comprende ademas:

i) determinar un parametro a partir de dicha primera cantidad respecto a dicha segunda cantidad,

ii) comparar el parametro con un valor de control de corte correspondiente y, basandose en la comparacion, determinar si existe o no una diferencia que permite la prediccion de una aneuploidfa cromosomica fetal de uno o mas de dichos primeros cromosomas.
3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dichos acidos nucleicos cebo son moleculas de ARN cebo biotiniladas.
4. Metodo segun la reivindicacion 3, en el que dichos acidos nucleicos cebo estan disenados espedficamente para presentar una secuencia, que es capaz de hibridarse con las secuencias de consenso para dichas regiones de union a nucleosoma.
5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra biologica es una muestra de sangre materna.
6. Metodo segun la reivindicacion 6, en el que dicha muestra de sangre es una muestra de plasma sangumeo materno o suero sangumeo materno.
7. Metodo segun las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra biologica es una muestra de orina o una muestra de saliva.
8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho primer o primeros cromosomas se seleccionan de entre el grupo que consiste de cromosoma 21, cromosoma 18, cromosoma 13, cromosoma X y cromosoma Y.
9. Dispositivo para llevar a cabo el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende:

a) una unidad de analisis que comprende una subunidad capaz de seleccionar y aislar a partir de dicha muestra biologica una o mas secuencias diana individuales de moleculas de ADN contenidas en la muestra biologica, en la que dichas secuencias diana comprenden secuencias de ADN que presentan regiones de union a nucleosoma de consenso y en la que dichas moleculas de ADN que comprenden las secuencias diana se afslan y se enriquecen mediante cromatograffa de afinidad o enriquecimiento por lotes utilizando acidos nucleicos cebo marcados, los cuales permiten el enriquecimiento y el aislamiento de las moleculas de ADN hibridadas mediante purificacion por afinidad, una subunidad para la amplificacion de dichas moleculas de ADN diana y una subunidad para la secuenciacion de las secuencias diana amplificadas, y

b) una unidad de evaluacion que comprende una subunidad receptora para los datos de secuencias y un ordenador o subunidad de procesamiento de los datos que ejecuta un producto programa informatico que, al ejecutarlo en un ordenador o dispositivo de procesamiento de datos, es capaz de llevar a cabo las etapas siguientes:

a) asignar secuencias diana seleccionadas y aisladas que se han amplificado, que presentan regiones de union a nucleosoma de consenso de una muestra biologica de un individuo, a cromosomas del genoma, e identificar las secuencias diana asignadas unicas,

b) determinar una primera cantidad de cada uno de uno o mas primeros cromosomas identificados basandose en dichas secuencias diana asignadas unicas que se originan a partir de dicho primer o primeros cromosomas, y

c) determinar una segunda cantidad de cada uno de uno o mas segundos cromosomas identificados basandose en dichas secuencias diana asignadas unicas que se originan a partir de uno o mas segundos cromosomas, y d)

5 determinar basandose en dicha primera y segunda cantidades de una aneuploidfa cromosomica fetal de uno o mas de entre dichos primeros cromosomas.
10.Dispositivo segun la reivindicacion 9, en el dicha determinacion en la etapa d) comprende ademas:

10 i) determinar un parametro a partir de dicha primera cantidad respecto a dicha segunda cantidad,

ii) comparar el parametro con un valor de control de corte correspondiente y, basandose en la comparacion, determinar si existe o no una diferencia que permita la prediccion de una aberracion cromosomica en uno o mas de dichos primeros cromosomas o determinar si existe o no una diferencia que permite la prediccion de una aneuploidfa cromosomica fetal de uno o mas de dichos primeros cromosomas.

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