ES2557772T3 - Células madre neuronales - Google Patents

Abstract

Un método para promover la división simétrica de células madre neuronales que comprende cultivar dichas células madre neuronales unidas a un sustrato en un cultivo de monocapa adherente en un medio que contiene: (a) un agonista de un receptor de EGF; o (b) un agonista de un receptor de EGF y un agonista de un receptor de FGF, en donde al menos 80% de dichas células son células madre neuronales con división simétrica y en donde no más del 1% de las células son positivas para la expresión de marcadores para astrocitos, neuronas u oligodendrocitos maduros.

Description

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DESCRIPCION

Celulas madre neuronales

La presente invencion se relaciona con celulas madre neuronales y con condiciones y metodos de cultivo para cultivar celulas madre neuronales (celulas NS o NSCs) con el fin de promover la division simetrica y la autorrenovacion de las celulas madre. Tambien se divulgan composiciones, poblaciones celulares, lineas celulares y celulas madre neuronales individuales.

A la vez que se ha pretendido aislar celulas madre neuronales in vitro a partir de una variedad de fuentes no ha sido posible, hasta la fecha, expandir las celulas en cultivo a gran escala en un estado no diferenciado de division simetrica. La expansion a largo plazo de las celulas en este estado seria altanamente deseable, tanto desde un punto de vista experimental como terapeutico. El disponer de poblaciones de celulas madre neuronales puras permitiria la diferenciacion dirigida hacia los tres tipos celulares de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.

Un metodo conocido para cultivar celulas madre neuronales no obstante como un componente menor en una poblacion heterogenea de celulas, es el sistema de neuroesferas. Este sistema involucra el paso seriado de agregados de celulas heterogeneas de las cuales solo una pequena fraccion son celulas madre neuronales verdaderas. La mayoria de las celulas en las neuroesferas son progenitores comprometidos.

Hay muchos reportes de la heterogeneidad e inestabilidad de las neuroesferas, y su capacidad limitada para generar neuronas (e.g. Morshead et al., 2002). Rappa et al., Neuroscience 2003 reportan un metodo para transfectar celulas en neuroesferas sembrandolas sobre fibronectina durante 1-7 dias y luego reformando las neuroesferas pero no proveen caracterizacion significativa de las celulas madre, si las hay, dentro de las neuroesferas.

Suslov et al., 2002 proveen datos claros de que el sistema de neuroesferas es demasiado heterogenea para permitir una caracterizacion significativa de cualquier celula madre que este dentro de ellas. Las principales conclusiones son que no solamente hay una heterogeneidad dentro de las neuroesfera -“que exhiben una diversidad de linaje celular neuronal intraclonal, esto es, contienen, ademas de NSCs , progenitores neuronales y gliales en diferentes estados de diferenciacion”- sino que tambien Suslov et al. 2002 proveen datos claros de que el sistema de neuroesferas es demasiado heterogenea para permitir una caracterizacion significativa de cualquier celula madre dentro del mismo. Las principales conclusiones es que no solamente hay heterogeneidad con las neuroesferas -“que exhiben diversidad en linaje celular neuronal intraclonal, esto es, contienen ademas de NSCs, progenitores neuronales y gliales en diferentes estados de diferenciacion”- sino que tambien existen grandes diferencias en los perfiles de expresion genetica entre diferentes lineas de neuroesferas clonales. La perfilacion de la expresion genetica de Suslov no constituye una definicion de celulas madre dentro de neuroesferas como se confirmo explicitamente en el articulo: -“los fenotipos moleculares que fueron obtenidos indican que las NSCs clonogenicas en nuestro sistema son heterogeneas, con subconjuntos que reflejan distintos compromisos de desarrollo neuronales”-.

Abundante literatura en este campo describe las propiedades de las celulas gliales. Skogh et al. MCN 2001 describe cultivos de celulas gliales que expresan GFAP y variabilidad en tincion para RC2 y nestina -notese que el GFAP de raton no se expresa en glia radial in vivo (Rakic, 2003). Reportan que sus celulas no expresan Pax6, la marca principal de las glias radiales neurogenicas (Malatesta et al., 2001, 2003), y no examinan otros marcadores gliales radiales. Tienen cultivos heterogeneos y no llevan a cabo analisis clonales.

Otros recuentos de glias radiales in vitro los consideran intermediarios de diferenciacion o productos terminales. Asi Bibel et al (Nat Neurosci, 2004) reportan la generation de neuronas a partir de celulas ES a traves de una celula tipo glia radial transiente, y Gregg y Weiss (J Neurosci, 23: 11587-601, 2003; Publication de Patente de los Estados Unidos 2003/0032181) describen “la diferenciacion” de celulas en neuroesferas en glias radiales. Hartfuss et al (Dev Biol, 2001) muestran que las glias radiales estan presentes en las neuroesferas.

Gregg y Weiss encontraron que las glias radiales son productos de diferenciacion de neuroesferas, concluyendo que “estos resultados sugieren que las celulas madre neuronales pueden dar lugar a RGCs (celulas gliales radiales) y que la migration guiada por RGC puede ser recapitulada en el CNS adulto”. La vision prevalente es que las glias radiales son uno de los tipos celulares diferenciados que surgen de las neuroesferas.

Lior y Yu (Glia, 2003) muestran que la diferenciacion celular de glias radiales puede ser obtenida a partir de celulas ES, pero como sucede con otros reportes en este campo no informa acerca de las expansion de las glias radiales neurogenicas.

Gobbel et al. Brain Res 2003 reportan la propagation de celulas de ratas multipotentes “como aglomeraciones esfericas de celulas que crecen unidas de manera precaria al sustrato”, esto es, no como monocapas uniformes. Adicionalmente, el resumen de este articulo concluye “estas celulas producen celulas postmitoticas en

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aproximadamente dos de tres divisiones, haciendo as! dificil la expansion”. Hay una extensa diferenciacion gliogenica en sus cultivos, pero los autores encuentran “relativamente pocas” (<3%) neuronas. No proveen fenotipos moleculares de sus celulas.

La WO 01/30981 describe cultivos de celulas que pueden diferenciarse en neuronas. Pero estas celulas son positivas para GFAP y nestina, estan descritas como celulas astrogliales y son una poblacion mixta, relativamente impura.

El concepto de que las celulas madre requieren microambientes celulares especlficos, o nichos, es una ortodoxia en la biologla de las celulas madre. Es sabido, aunque no siempre reconocido, que en las neuroesferas las celulas madre constituyen solamente una pequena fraccion de las celulas totales entre los progenitores, celulas blast y progenie diferenciada inmadura. Esta agregacion de tipos celulares mixtos puede constituir un nicho para la pequena proporcion de celulas dentro de las que pueden estar las celulas madre.

No hay reportes en la literatura de la derivacion de poblaciones homogeneas de celulas madre neuronales a partir de celulas ES, derivandose solo celulas precursoras neuroepiteliales que pueden ser expandidas de manera transiente antes de convertirse en celulas restringidas gliales (por ejemplo Brustle et al., Science 1999).

Por lo tanto, existe un cierto numero de problemas en el arte.

Todos los reportes reconocen que sus cultivos son heterogeneos. No ha sido posible utilizar el sistema de neuroesferas para mantener cultivos a gran escala de celulas madre neuronales en un estado de division simetrica y no diferenciado. Otros intentos para cultivar grandes numeros de celulas madre neuronales no han tenido exito mas alla de 5-20 replicaciones, y han sido impedidos tambien por una alta tendencia de las celulas a diferenciarse. Una excepcion es el trabajo sobre celulas madre de hipocampo de rata adulta, pero estas son cariotipicamente anormales y forman neuronas con baja eficiencia.

Mientras que son conocidos los precursores del desarrollo neuronal transiente, no se han aislado ni purificado celulas madre autorrenovables, permanentes o casi permanentes.

Se desea derivar celulas madre neuronales a partir de celulas ES, y luego mantener estas celulas madre neuronales en cultivos puros, pero esto hasta el momento no es posible. Se ha deseado derivar celulas madre neuronales a partir de celulas Es para trasplante pero la persistencia de ES y otras celulas no neuronales en poblaciones celulares derivadas de ES conocidas da lugar a tumores en los animales receptores. Se desea adicionalmente obtener poblaciones de celulas madre neuronales a partir de CNS fetal y postnatal.

Los intentos para producir cultivos puros de celulas madre neuronales no han divulgado o sugerido poblaciones de celulas madre neuronales con suficiente pureza para permitir una replicacion multiple de las celulas a la vez que se mantiene la homogeneidad y pureza (por ejemplo Vescovi et al., 1999; Maric et al., 2003; Ying et al., 2003b; Gritti et al., 1999 US 2004/107454).

Un completo entendimiento de los eventos moleculares y celulares que controlan el comportamiento de las celulas madre neuronales es esencial, no solamente como una ruta para entender la embriogenesis, sino tambien como un marco dentro del cual puedan aislarse las celulas madre neuronales, expandirse y controlarse para futuras aplicaciones terapeuticas. Los metodos de cultivo para las celulas madre neuronales conocidos en el arte son, por las razones descritas mas arriba, inadecuados para el uso en tales investigaciones y aplicaciones terapeuticas. Por lo tanto es deseable desarrollar metodos y condiciones para cultivar grandes cantidades de celulas madre neuronales que permitan que las celulas sean mantenidas en un estado autorrenovador, de division simetrica. Particularmente es deseable tener medios de cultivo definidos, que satisfagan los requerimientos anteriores puesto que el uso de medios definidos es altamente deseable en un entorno cllnico.

La presente invention resuelve uno o mas de los problemas antes mencionados.

En mas detalle, la presente invencion provee un metodo para promover la division simetrica de celulas madre neuronales (NS), que comprende cultivar dichas celulas madre neuronales unidas a un sustrato en un cultivo de monocapa adherente en un medio que contiene:-

(a) un agonista de un receptor de EGF; o

(b) un agonista de un receptor EGF y un agonista de un receptor de FGF, en donde al menos 80% de dichas celulas son celulas madre neuronales que se dividen de manera simetrica y en donde no mas del 1% de las celulas son positivas para la expresion de marcadores para astrocitos, neuronas y oligodendrocitos maduros.

En realizaciones preferidas, las celulas son cultivadas en la ausencia de suero, por ejemplo, en un medio que esta

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libre de suero y libre de extracto de suero. Las celulas son cultivadas unidas a un sustrato, denominado de otra forma como cultivo adherente. Tambien se prefiere que el medio de cultivo contenga insulina u otro agonista de un receptor de insulina sobre las celulas.

En el contexto de la invencion, sera evidente que el termino “promover” incluya el mantenimiento de las celulas madre neuronales en un estado de division simetrica.

De acuerdo con otro aspecto divulgado aqul se proveen medios de cultivo que soportan y preferiblemente promueven la autorrenovacion y division simetrica de celulas madre neuronales en un estado no diferenciado para muchas replicaciones. El medio sustancialmente evita la division asimetrica y la diferenciacion de celulas madre neuronales.

Tambien se divulgan metodos para obtener celulas madre neuronales, y especlficamente como se define en los protocolos aqul, las celulas obtenidas por tales metodos.

Tambien se divulgan poblaciones celulares neurales, composiciones, llneas celulares, llneas celulares clonogenicas, y celulas madre neuronales individuales, que comprenden celulas madre neuronales que se autorrenuevan, y dividen de manera simetrica.

Aspectos adicionales divulgados aqul conciernen a los metodos para promover la diferenciacion de celulas ES no humanas a celulas madre neuronales, y metodos para mantener las celulas madre neuronales obtenidas en un estado sustancialmente no diferenciado, con autorrenovacion y division simetrica.

Seccion de definiciones

“Celulas madre neuronales”

El termino “celulas madre neuronales”, tal como se utiliza en la presente especificacion, describe una celula que es capaz de experimentar mas de 20-30 divisiones celulares a la vez que mantiene la potencia para generar tanto neuronas como glia. Preferiblemente, dichas celulas son capaces de experimentar mas de 40, mas preferiblemente mas de 50, lo mas preferiblemente tales ilimitadas divisiones celulares.

Las celulas madre neuronales son capaces de dividirse bien sea simetrica o asimetricamente. Cuando se dividen simetricamente, las celulas madre neuronales se dividen para formar dos celulas madre neuronales hijas o dos progenitores comprometidos, aunque al menos que se especifique otra cosa por division simetrica se entiende aqul autorrenovacion simetrica; cuando se dividen asimetricamente, las celulas madre neuronales se dividen para formar una celula madre neuronal hija y una progenitora comprometida (por ejemplo, bien sea una neurona o una progenitora glial).

Las celulas madre neuronales de la presente invencion pueden ser descritas como gllas radiales, y han demostrado expresar al menos uno (y preferiblemente todos) de los marcadores gliales radiales RC2, 3CB2, GLAST, BLBP y Pax6. Preferiblemente, las celulas madre neuronales de la invencion expresan RC2, 3CB2 y GLAST. Mas preferiblemente, las celulas expresan RC2, 3CB2, GLAST, y al menos uno de BLBP o Pax-6. Las celulas madre neuronales de la invencion tambien pueden ser caracterizadas porque son positivas para la expresion de al menos uno (preferiblemente todos) de los marcadores precursores neuronales nestina o vimentina, el antlgeno de LewisX, Musashi-1 o prominina, y negativas para la expresion de al menos uno (preferiblemente ambos) de Oct-4 o Nanog (vease tambien Ejemplos 1-3).

Las celulas madre neuronales de la invencion son por definicion multipotentes, esto es son capaces de diferenciarse en un cierto numero de tipos celulares neuronales (por ejemplo neuronas/glia). Los ejemplos a continuacion confirman que las celulas madre neuronales cultivadas de acuerdo con los metodos de la invencion retienen su potencia y son capaces de diferenciarse en todos los tipos celulares esperados.

“Fuentes de celulas madre neuronales”

Es posible derivar celulas madre neuronales de la invencion a partir de una amplia variedad de fuentes. Por ejemplo las celulas madre neuronales pueden ser derivadas directamente de embriones, de tejido adulto, de tejido fetal, o de celulas madre (ES) de embrion (bien sea celulas ES tipo silvestre o modificadas geneticamente). Preferiblemente, las celulas madre neuronales de la invencion son derivadas a partir de celulas ES de raton o son derivadas de celulas fetales de raton o humanas.

Las celulas madre neuronales de la invencion pueden ser derivadas a partir, entre otros, humanos, primates, roedores y aves. Preferiblemente, las celulas madre neuronales son derivadas de mamlferos, especialmente ratones, ratas y humanos. En el caso de las celulas madre neuronales humanas, la invencion no incluye celulas

derivadas de embriones humanos.

“Familia de receptores de EGF”

El termino “familia de receptores de EGF”, tal como se utiliza en la presente especificacion, describe una familia de receptores (usualmente receptores homodimericos o heterodimericos) que pueden ser activados por una familia de 5 factores de senalizacion de EGF. Los receptores estan constituidos de una familia de cuatro glicoprotelnas transmembrana altamente homologas: ErbB-1 (tambien conocida como EGF-R), ErbB-2, ErbB-3 y ErbB-4.

La referencia a un “receptor de EGF” incluye cualquier complejo receptor monomerico o dimerico de la familia de receptores de EGF.

Cada receptor tiene un dominio de enlazamiento aligando extracelular, un dominio de barrido de membrana 10 hidrofobo individual, y un dominio de tiroxina quinasa citoplasmatico, que es responsable por la transduccion a

traves de la actividad del receptor de tiroxina quinasa tipo 1. El enlazamiento aligando de cualquiera de los receptores da como resultado la dimerizacion y la autofosforilacion del receptor, seguidas por la fosforilacion de un cierto numero de sustratos celulares que llevan a una disposicion de efectos biologicos. La dimerizacion del receptor puede ser disparada por diversos estlmulos, incluyendo ligandos del receptor y estlmulos ambientales toxicos tales 15 como radiacion UV. Cada receptor dimerico inicia una ruta de senalizacion distinta reclutando diferentes protelnas efectoras que contienen SH2. Por ejemplo, el dlmero de EGF-R puede complejarse con la protelna adaptadora Grb, acoplada a un factor de liberacion del nucleotido guanina, SOS. El complejo Grb-SOS puede bien enlazarse directamente a los sitios fosfotirosina en el receptor, o indirectamente a traves de Shc. Estas interacciones protelnicas llevan el SOS a proximidad cercana con Ras, permitiendo la activacion de Ras. Esto activa 20 subsecuentemente la ruta de senalizacion de ERK y JNK que a su vez activa los factores de transcripcion, tales

como c-fos, AP-1 y Elk-1, que regulan la expresion genetica. Los receptores de EGF pueden activar tambien la ruta de senalizacion de PLCy.

“Receptor de FGF”

El termino “receptor de FGF”, tal como se utiliza en la presente especificacion, describe cualquier miembro de la 25 familia de tirosina quinasas receptoras de FGF transmembrana. Hay cuatro principales isotipos de estos receptores, FGFR1, 2, 3 y 4, y son conocidos por actuar en asociacion cercana con los sistemas de heparina y sulfato de heparano (HS). La referencia a un receptor de FGF incluye cualquier complejo monomerico o dimerico (homo o heterodlmero) de la familia de receptores de FGF.

Las rutas de senalizacion celular asociadas con los receptores de FGF incluyen la ruta de la MAP quinasa, y la ruta 30 de PLCy.

“Medios de cultivo”

Los medios de cultivo utilizados en la presente invencion comprenden preferiblemente un medio basal, opcionalmente suplementado con componentes adicionales.

El medio basal es un medio que suministra fuentes esenciales de carbono y/o vitaminas y/o minerales a las celulas 35 madre neuronales. El medio basal esta generalmente libre de protelnas y es incapaz por si mismo de soportar la division autorrenovable/simetrica de celulas madre neuronales.

Preferiblemente, los medios de cultivo usados en la invencion no contienen componentes que son indefinidos (por ejemplo, suero y/o celulas alimentadoras), es decir componentes cuyo contenido es desconocido o que pueden contener factores indefinidos o variables que no estan especificados. Una ventaja de utilizar medios definidos 40 completamente, libres de suero y libres de extractos de suero, es que pueden derivarse protocolos eficientes y consistentes para cultivo y manipulacion subsecuente de celulas madre neuronales.

“Superficies de cultivo”

Las superficies tlpicas para cultivo de las celulas madre neuronales en todos los aspectos de la invencion son superficies de cultivo reconocidas en este campo como utiles para el cultivo de celulas, y estas incluyen superficies 45 de plasticos, metal, composiciones, aunque se utiliza comunmente una superficie tal como una placa de cultivo de tejidos plastica, disponible comercialmente de manera amplia. Tales placas tienen frecuentemente unos pocos centlmetros de diametro. Para escalar, este tipo de placa puede ser utilizada en diametros mucho mas grandes y pueden usarse unidades de placa repetidas.

La superficie de cultivo puede comprender adicionalmente una protelna de adhesion celular, usualmente colocada 50 como recubrimiento sobre la superficie. Los receptores u otras moleculas presentes en las celulas madre se enlazan

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a la protelna o a otro sustrato de cultivo celular y esto promueve la adhesion a la superficie y promueve el crecimiento. Se prefieren particularmente placas recubiertas con gelatina.

La presente invencion se basa sobre la observacion de que al cultivar celulas madre neuronales unidas a sustratos en medios que comprenden agonistas del receptor de EGF, o agonistas de ambos receptores EGF y FGF-2, se promueve la division simetrica ilimitada de las celulas madre, y se evita sustancialmente su diferenciacion en neuronas/glia.

Los diversos aspectos de la invencion y la presente divulgacion se discuten ahora en detalle.

Un primer aspecto de la invencion provee un metodo para promover la division simetrica de celulas madre (NS) neuronales, que comprenden cultivar dichas celulas madre unidas a un sustrato en un cultivo de monocapa adherente en un medio que contiene:

(a) un agonista de un receptor EGF; o

(b) un agonista de un receptor de EGF y un agonista de un receptor de FGF, en donde al menos 80% de dichas celulas son celulas madre neurales de division simetrica y en donde no mas de 1% de las celulas son positivas para la expresion de marcadores para astrocitos, neuronas y oligodendrocitos maduros.

Otro metodo divulgado aqul, para obtener celulas madre neuronales comprende:

(1) obtener una poblacion mixta de celulas que contienen una celula madre neuronal;

(2) resembrar las celulas en un medio que comprende (a) un activador de una ruta de senalizacion corriente abajo desde un receptor de la familia EGF; y (b) un activador de una ruta de senalizacion corriente abajo de un receptor de FGF;

(3) cultivar las celulas;

(4) recolectar los agregados de celulas;

(5) resembrar las celulas en un medio que comprende (a) un activador de una ruta de senalizacion corriente abajo para un receptor de la familia de EGF; y (b) un activador de una ruta de senalizacion corriente abajo de un receptor de FGF;

(6) cultivar las celulas;

(7) resembrar las celulas como celulas individuales en un medio que contiene (a) un activador de una ruta de senalizacion corriente abajo de un receptor de la familia de EGF; y (b) un activador de una ruta de senalizacion corriente abajo de un receptor de FGF.

El metodo puede ser suplementado seleccionando celulas que expresen un marcador especlfico de celulas madre neuronales, por ejemplo por expresion de enlazamiento de un marcador tal a un promotor preferencialmente activo en celulas madre neuronales en comparacion con su expresion en progenies diferenciadas de las mismas. Preferiblemente el metodo comprende replicar las celulas a o por debajo de 65% de confluencia, mas preferiblemente a o por debajo de 55% de confluencia, especialmente por debajo de 50% de confluencia.

Otras caracterlsticas preferidas de los metodos de la invencion son como se define en los protocolos de la invencion en el Ejemplo 9.

Los cultivos de la invencion son cultivos adherentes, esto es, las celulas estan unidas a un sustrato.

El sustrato es tlpicamente una superficie en un recipiente de cultivo u otro soporte flsico, por ejemplo, una placa de cultivo, un matraz, una perla u otro portador. Preferiblemente, el sustrato esta recubierto para mejorar la adhesion de las celulas y recubrimientos adecuados incluyen laminina, polilisina, poliornitina y gelatina. Las celulas se hacen crecer en un cultivo de monocapa y no de suspension y no como bolas o racimos de celulas. A densidades mas altas, las celulas pueden empezar a apilarse una sobre otra, pero los cultivos son esencialmente monocapas o comienzan como monocapas, unidas al sustrato.

Una o mas rutas de senalizacion corriente abajo de un receptor de la familia de EGF pueden ser activados preferiblemente utilizando un agonista de un receptor de la familia de EGF. Un agonista de un receptor de la familia de EGF es de manera adecuada un miembro de la familia de EGF de factores de senalizacion, y preferiblemente se

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enlaza al dominio extracelular del receptor de EGF. El termino “agonistas” tambien abarca imitadores, protelnas de fusion, anticuerpos para o quimeras de la familia EGF de factores de senalizacion, y fragmentos, variantes y derivados de los mismos, capaces de activar los receptores de la familia EGF.

Las moleculas que constituyen la familia EGF de factores de senalizacion pueden ser caracterizadas porque contienen al menos un dominio tipo EGF. Este dominio puede ser definido por 6 residuos de cistelna que generan tres bucles de peptidos a traves de la formacion de puentes disulfuro.

Agonistas especlficos capaces de actuar a traves de los receptores de la familia de receptores EGF, y as! de activar las rutas corriente abajo de estos receptores, incluyen EGF, TGF-a, amfirregulina, EGF de enlazamiento a heparina, epirregulina, betacelulina, neurorregulinas 1-4, y Cripto-1. Preferiblemente, el agonista es EGF en si misma.

Una o mas rutas de senalizacion corriente abajo de un receptor de FGF pueden ser activadas utilizando un agonista de un receptor de FGF. Un agonista de un receptor de FGF es adecuadamente un miembro de la familia de FGF de factores de senalizacion. El termino “agonista” tambien pretende abarcar imitadores, protelnas de fusion, anticuerpos para o quimeras de la familia FGF de factores de senalizacion, y fragmentos, variantes y derivados de los mismos, capaces de activar los receptores de FGF.

Preferiblemente, el agonista del receptor de FGF es FGF-2, o laminina-FGF.

Sera evidente que la activacion de una ruta de senalizacion corriente abajo de un receptor de la familia de receptores EGF o de un receptor FGF tambien puede efectuarse mediante receptores constitutivamente activos, o por efectores corriente abajo (por ejemplo, MEK o Bcl2) de las respectivas rutas de transduccion de senal. En una realizacion particularmente preferida de la invencion, las rutas de senalizacion son activadas por moleculas pequenas permeables a las celulas, que pueden sobrepasar los receptores respectivos y activar las rutas de senalizacion directamente. Asl, en la presente invencion, el termino “activador” abarca todas las moleculas capaces de activar una ruta de senalizacion corriente abajo de los receptores de la familia EGF de receptores, o de un receptor FGF.

La efectividad de los activadores en el mantenimiento de los cultivos celulares de celulas madre de la presente invencion esta demostrada en los ejemplos 1-1 y 1-2 mas abajo. Aqul, se mantienen poblaciones voluminosas y clonales de celulas madre neuronales en medios que comprenden EGF y FGF-2 y pueden ser replicados muchas veces. Ademas, hay una diferenciacion despreciable/ninguna de las celulas madre neuronales, como lo demuestra la presencia ubicua de los marcadores de celulas madre neuronales en las poblaciones celulares probadas (veanse Ejemplo 1-3), y retienen su potencia y son capaces de diferenciarse en todos los tipos celulares esperados (veanse Ejemplos 1-4).

Asl, la invencion provee un metodo eficiente para mantener grandes poblaciones de celulas madres neuronales, en un estado no diferenciado, de autorrenovacion, de division simetrica. Las composiciones de la invencion incluyen composiciones que comprenden celulas madre neuronales, en donde las celulas madre neuronales estan en un cultivo adherente y al menos 50%, 70% u 80% de las celulas en la composition son celulas madre neuronales. La proportion de celulas madre neuronales es preferiblemente de manera adicional al menos 90%, mas preferiblemente al menos 95%, muy preferiblemente al menos 97%. Adicionalmente, las celulas madre neuronales de la invencion pueden ser replicadas extensivamente. Es preferible que las celulas madre neuronales hayan sido replicadas al menos 30 veces, mas preferiblemente al menos 60 veces, muy preferiblemente al menos 90 veces. Todavla adicionalmente, en una poblacion de celulas neuronales de la invencion al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, mas preferiblemente al menos 95%, de dichas celulas son celulas madre neuronales de division simetrica. Las celulas en esta composicion pueden ser caracterizadas adicionalmente por cualquiera y o todas las caracterlsticas de la invencion, solas o en combination.

Tambien se divulgan composiciones, que comprenden:

celulas madre neuronales;

un activador de una ruta de senalizacion corriente abajo de un receptor de la familia de EGF; y un activador de una ruta de senalizacion corriente abajo de un receptor de FGF.

Las composiciones comprenden preferiblemente un medio basal. Tambien es preferible que al menos 80%, preferiblemente 90%, mas preferiblemente 95% de las celulas madre neuronales en la composicion sean celulas madre neuronales de division simetrica.

Tanto en las poblaciones como en las composiciones de celulas neuronales descritas mas arriba, las celulas madre neuronales estan preferiblemente libres de material genetico exogeno que codifique un oncogeno, esto es que no

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han sido sometidas a estrategias de inmortalizacion. En realizaciones especlficas, las celulas madre neuronales de las poblaciones/composiciones estan caracterizadas porque son positivas para la expresion de al menos uno de:

Los marcadores de precursor neuronal nestina o vimentina;

Sox-2;

los marcadores especlficos para celulas gliales radiales RC2, 3CB2, GLAST, BLBP o Pax-6; el antlgeno de LewisX;

Musashi-1; y Prominina;

y son negativas para la expresion de al menos uno de:

Oct4, y Nanog.

Preferiblemente, las celulas son positivas para la expresion de RC2, 3CB2 y GLAST. En otras realizaciones, (opcionalmente ademas del perfil marcador precedente) las celulas son positivas para la expresion de al menos uno de BLBP, Pax-6, los marcadores de precursores neuronales nestina o vimentina, el antlgeno de LewisX, Musashi-1 o prominina. En realizaciones particularmente preferidas (y opcionalmente ademas de los perfiles marcadores precedentes) las celulas son negativas para la expresion de al menos uno de Oct4 o Nanog.

En realizaciones adicionales (opcionalmente ademas de los perfiles marcadores anteriores), las celulas son positivas para la expresion de Sox-2, y negativas para la expresion de Sox-1. En ciertas composiciones/poblaciones que comprenden celulas NS derivadas de raton, no mas de 1% de las celulas son positivas para la expresion de GFAP o pIII tubulina, confirmando por lo tanto que hay una diferenciacion despreciable de las celulas a astrocitos o neuronas. En otras composiciones/poblaciones, no mas del 1% de las celulas son positivas para la expresion de marcadores para astrocitos, neuronas u oligodendrocitos maduros.

La invencion tambien ha sido llevada a cabo con celulas de rata. Asl, hemos tomado celulas de CNS de rata y utilizando los metodos de la invencion hemos obtenido un cultivo de celulas madre neuronales de rata que tiene las propiedades de (i) alta pureza, tlpicamente por encima de 80% o 90% de celulas madre neuronales de rata, y (ii) ser celulas con una alta proporcion (un mlnimo de 50%) de las cuales despues de muchas duplicaciones, en exceso de 50, en exceso de 100, incluso en exceso de 200 duplicaciones, retenlan la capacidad de formar neuronas y glias. En las celulas de ratas existentes en el arte, las celulas de las ratas fueron claramente de alta heterogeneidad y solamente del hipocampo de adultos. No hemos obtenido celulas de esta fuente, pero en vez de ello las hemos obtenido de CNS de ratas. Es notable en este aspecto que el metodo fue trabajado a traves de todas las tres especies -rata, raton, humanos. En general se ve que si es una celula individual forma una colonia de celulas madre neuronales siguiendo los metodos de la invencion pueden obtenerse entonces neuronas a partir de las celulas en esa colonia. Esto se mide por ejemplo tinendo separadamente (i) nucleos (esto es, tinendo toda la celulas) y (ii) neuronas (esto es solamente neuronas). Comparando los numeros relativos de las celulas tenidas, puede calcularse la proporcion de celulas que forman neuronas.

Un segundo aspecto divulgado aqul se relaciona con un metodo para la preparacion de una celula madre neuronal, que comprende (i) cultivar celulas madre neuronales de acuerdo con los metodos descritos anteriormente, obteniendo de esa manera un cultivo de celulas madre neuronales, y (ii) aislar una celula madre neuronal a partir de dicho cultivo. Preferiblemente, la celula madre neuronal aislada es una que ha sido acondicionada para dividirse de manera simetrica.

Puede utilizarse un cierto numero de fuentes de celulas a partir de las cuales derivar las celulas madre neuronales. En un metodo, las celulas son obtenidas a partir del tejido nervioso de un animal y cultivadas de acuerdo con la invencion, para obtener un cultivo de celulas madre neuronales de division simetrica. El tejido nervioso puede ser de tejido adulto o fetal. El tejido nervioso puede ser de CNS, y pueden obtenerse poblaciones de celulas madre neuronales de division simetrica a partir de extractos tomados de CNS tanto adulto como fetal, tanto de humano como de raton. El tejido nervioso comprende preferiblemente celulas identificadas por tener un fenotipo glial radial, por ejemplo se han identificado celulas que tienen este fenotipo en extractos de cerebelo y retina, los cuales representan ambos fuentes adicionales adecuadas de celulas. Las celulas madre neuronales pueden ser obtenidas a partir de tejido nervioso enfermo, util para modelar la enfermedad, por ejemplo, pueden obtenerse celulas a partir de tumores cerebrales para este proposito.

Una opcion es utilizar el metodo para derivar celulas madre neuronales a partir de un individuo enfermo y luego (i) usar esas celulas para ensayos, o (ii) llevar a cabo modificaciones geneticas antes del trasplante de las celulas de regreso a ese individuo. Pueden as! obtenerse celulas a partir de un individuo con un trastorno neurodegenerativo, incluyendo los ejemplos enfermedades de Alzheimer y de Parkinson; o con un tumor cerebral.

5 Otro metodo para obtener una celula madre neuronal comprende:

(i) obtener una celula madre multipotente o pluripotente capaz de diferenciarse en una celula madre neuronal,

(ii) cultivar la celula (i) en un medio que es no permisivo para celulas pluripotentes y en la presencia de (a) un agonista de una ruta de senalizacion corriente abajo de un receptor de la familia EGF y (b) un agonista de una ruta de senalizacion corriente abajo de un receptor de la familia FGF.

10 Durante el uso, las celulas ES no humanas potencialmente contaminantes son retiradas por este metodo, o al menos reducidas sustancialmente en numero, dando un cultivo mas puro y uno que probablemente de menos lugar a teratomas por trasplante.

La celula madre es adecuadamente una celula madre pluripotente, especialmente una celula ES o EG no humana. El metodo comprende preferiblemente cultivar las celulas en presencia de un agonista del receptor EGF y un 15 agonista de receptor FGF.

Utilizando celulas NS de la invencion hemos obtenido astrocitos eliminando EGF y FGF y agregando suero o BMP4, hemos obtenido neuronas quitando EGF, y quitando FGF despues de un intervalo de aproximadamente una semana y sembrando las celulas sobre laminina y hemos obtenido oligodendrocitos retirando tanto EGF como FGF. En general, todos los metodos de la invencion utilizados para generar una celula madre neuronal comprenden 20 opcionalmente una etapa adicional para diferenciar la celula madre neuronal en una neurona, un astrocito o un oligodendrocito, y luego opcionalmente de manera adicional utilizar la neurona, el astrocito o el oligodendrocito, por ejemplo, en un ensayo, para trasplante u otros.

Una vez que un cultivo de celulas madre neuronales ha sido aislado, puede ser utilizado para establecer una llnea de celulas madre neuronales. El establecimiento de tal llnea celular incluye preferiblemente las etapas de:

25 (a) obtener una celula madre neuronal individual,

(b) cultivar la celula madre neuronal de acuerdo con cualquiera de los metodos descritos previamente,

y por lo tanto obtener una poblacion clonal de celulas madre neuronales.

En realizaciones especlficas, la celula madre neuronal individual utilizada para establecer la llnea celular es una celula madre neuronal de division simetrica, o una celula madre neuronal que ha sido acondicionada para dividirse 30 de manera simetrica. Preferiblemente, la celula madre neuronal individual es obtenida de acuerdo con el metodo descrito mas arriba para preparar una celula madre neuronal.

En realizaciones preferidas, la llnea de celulas madre neuronales obtenida por el metodo anterior es una poblacion clonal de celulas madre neuronales, esto es, en donde todas las celulas son progenie de una celula madre neuronal individual.

35 Las celulas madre neuronales individuales y llneas de celulas madre (opcionalmente obtenibles por los metodos descritos mas arriba) tambien forman parte de la invencion. En una primera realizacion, se proveen llneas celulares en donde las celulas son mantenidas en la presencia de un activador de una ruta de senalizacion corriente abajo de un receptor de la familia de receptores EGF, y un activador de una ruta de senalizacion corriente abajo de un receptor FGF. En otras realizaciones, las celulas madre neuronales individuales y las celulas de las llneas celulares 40 son caracterizadas porque son positivas para la expresion de al menos uno de:

los marcadores del precursor neuronal nestina o vimentina;

Sox-2;

los marcadores especlficos de celulas radiales RC2, 3CB2, GLAST, BLBP o Pax-6; el antlgeno de LewisX;

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Prominina;

y son negativas para la expresion de al menos uno de:

Oct4, y Nanog.

Preferiblemente, las celulas son positivas para la expresion de RC2, 3CB2 y GLAST. En otras realizaciones, (opcionalmente ademas del perfil de marcador precedente) las celulas son positivas para la expresion de al menos uno de BLBP, Pax-6, los marcadores de precursor neuronales nestina o vimentina, el antlgeno LewisX, Musashi-1 o prominina. En realizaciones particularmente preferidas (y opcionalmente ademas de los perfiles de marcador precedentes) las celulas son negativas para la expresion de al menos uno de Oct4 o Nanog.

En otras realizaciones especificas (opcionalmente ademas de los perfiles de marcador anteriores), las celulas son positivas para la expresion de Sox-2, y negativas para la expresion de Sox-1. En ciertas llneas celulares derivadas de raton, no mas de 1% de las celulas son positivas para la expresion de GFAP o piii tubulina. En otras llneas celulares (por ejemplo humanas), no mas de 1% de las celulas son positivas para la expresion de marcadores para astrocitos, neuronas u oligodendrocitos maduros.

Es preferible que tanto las celulas madre neuronales individuales, como las celulas de las llneas celulares, esten libres de material genetico exogeno que codifique un oncogeno, esto es, que no hayan sido sometidas a estrategias de inmortalizacion. Tambien es preferible que las llneas celulares descritas sean llneas de celulas madre neuronales.

En un tercer aspecto, se divulga un metodo para obtener y mantener una poblacion transfectada de celulas madre neuronales de division simetrica, que comprende:

(a) transfectar celulas ES no humanas con un constructo que codifica un marcador A, seleccionable, en donde en el uso dicho marcador seleccionable se expresa bajo el control de un promotor especlfico de las celulas precursoras neuronales;

(b) promover la diferenciacion de las celulas ES en celulas precursoras neuronales;

(c) seleccionar celulas precursoras neuronales que expresen el marcador A seleccionable; y

(d) cultivar las celulas seleccionadas de acuerdo con cualquiera de los metodos descritos previamente.

El marcador A seleccionable puede codificar resistencia a antibioticos, un marcador de superficie celular u otro marcador seleccionable tal como se describe, por ejemplo, en EP-A-0695351. El promotor especlfico para celulas precursoras neuronales puede ser seleccionado a partir del grupo consistente de Sox-1, Sox-2, Sox-3, BLBP y el potenciador neuronal de nestina. En el ejemplo 1-1 se proveen detalles adicionales de esta estrategia de seleccion.

Las celulas madre neuronales divulgadas aqul (esto es, celulas madre neuronales individuales, y celulas madre neuronales presentes en las composiciones, llneas celulares y poblaciones) pueden ser modificadas geneticamente. Por lo tanto se divulga un metodo para transfectar las celulas madre neuronales de la invention que comprende:

(a) transfectar las celulas madre neuronales con un constructo que codifica un marcador B seleccionable y un polipeptido; y

(b) seleccionar celulas madre neuronales que expresen el marcador B seleccionable.

El marcador B seleccionable puede codificar resistencia a antibioticos o un marcador de superficie celular, y puede ser el mismo que o diferente del marcador A seleccionable. Metodos de transfection adecuados son conocidos, incluyendo electroporation, lipofeccion, necleofeccion y transfeccion retro y lentiviral.

Las celulas madre neuronales modificadas geneticamente tambien forman parte de la presente divulgation, y la divulgation incluye por lo tanto una celula madre neuronal individual, o celulas madre neuronales cuando estan presentes en las composiciones, poblaciones o llneas celulares de la invencion, comprendiendo adicionalmente el constructo. Sera evidente que tales celulas madre neuronales pueden comprender ya el marcador A seleccionable, ademas del marcador B seleccionable.

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Como se menciono previamente, los metodos de la invencion son adecuados para uso con celulas madre neuronales derivadas de cualquier fuente. Se describe aqul un metodo para obtener celulas madre neuronales a partir de una fuente de celulas ES. En el caso de celulas madre neuronales humanas, la invencion no incluye celulas derivadas de embriones humanos. De acuerdo con el metodo, la diferenciacion de las celulas ES en celulas madre neuronales es promovida por la conversion de las celulas ES en progenitores neuronales, por ejemplo, por cultivo en una monocapa o diferenciacion en un cuerpo embrioide, y luego cultivo de los progenitores neuronales en medio NSA. Ademas, se contempla que el medio NSA puede comprender componentes suplementarios, tales como glucosa y HEPES suplementarios. Como alternativa, los medios suplementados (preferiblemente medios basales) con glucosa y HEPES tambien pueden ser utilizados para promover esta diferenciacion.

En la presencia de NSA y/o glucosa y HEPES, las condiciones son tales que la propagacion de las celulas madre neuronales se ve favorecida, con la ventaja agregada de que cualquier celula no neuronal presente en el cultivo preferiblemente muere. Esto da como resultado un cultivo sustancialmente puro de celulas madre neuronales (por ejemplo, al menos 80%, preferiblemente 90%, mas preferiblemente 95% de todas las celulas presentes). Los Ejemplos 1-5 proveen detalles adicionales de este metodo.

En una realizacion preferida, el metodo del Ejemplo 1-5 puede ser utilizado para preparar una poblacion de celulas madre neuronales de division simetrica, las cuales son mantenidas subsecuentemente utilizando cualquiera de los metodos de cultivo de la invencion descritos anteriormente.

El metodo de los Ejemplos 1-5 tambien pueden ser utilizados para probar el efecto de factores sobre la diferenciacion de las celulas ES en celulas madre neuronales. En una realizacion de ensayo preferida, se cultivan celulas ES utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 1-5, en la presencia del factor que se va a probar. El efecto del factor puede ser establecido, por ejemplo, determinando el perfil de marcador de las celulas resultantes, esto es, para mostrar si las celulas tienen un perfil de marcador similar a las celulas de la invencion, o si el perfil de marcador ES es mantenido. Los factores probados pueden ser factores inductivos o bloqueadores.

Hay mucho interes en el uso de celulas madre neuronales en el tratamiento de enfermedades neurologicas y neurodegenerativas, y lesiones cerebrales. En particular en el tratamiento de enfermedades tales como enfermedad de Parkinson y de Alzheimer, esclerosis multiple y esclerosis lateral amiotrofica. Los metodos, y las composiciones, poblaciones celulares, llneas celulares y celulas individuales divulgadas de la presente invencion son todos capaces de ser utilizados en tal tratamiento, as! como en la manufactura de preparaciones para tal tratamiento. Enfermedades neurologicas/neurodegenerativas particulares que pueden ser tratadas utilizando la invencion incluyen: enfermedad de Parkinson, enfermedad neuronal motora, apoplejla, esclerosis multiple y enfermedad de Huntington.

En un quinto aspecto, se divulga por lo tanto el uso de llneas celulares, poblaciones de celulas neuronales, celulas neuronales individuales y composiciones descritas mas arriba para terapia celular y para la manufactura de una preparacion para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y lesiones en el cerebro. Tales preparaciones pueden ser formuladas en solucion salina regulada con fosfato (PBS).

Los metodos de tratamiento de las enfermedades listadas mas arriba pueden comprender el trasplante de celulas individuales, llneas celulares, composiciones, o poblaciones celulares de la invencion a un paciente. Preferiblemente, el paciente es un mamlfero, mas preferiblemente el paciente es humano. Tal trasplante ha demostrado ser exitoso en CNS tanto de embrion como de adulto y se describe en mas detalle en el Ejemplo 1-6.

Las celulas, y en particular las llneas celulares divulgadas aqul, pueden ser utilizadas para probar el efecto de factores inductivos o de bloqueo en la diferenciacion de celulas madre neuronales. Tal ensayo puede comprender poner en contacto una celula madre neuronal (esto es, tal como esta presente en las composiciones, llneas celulares y poblaciones, o una celula madre neuronal individual) con el factor que se va a probar. El efecto del factor sobre la diferenciacion de la celula madre neuronal puede ser establecido de manera adecuada determinando el perfil de marcador de las celulas resultantes, esto es, mostrar si las celulas tienen un perfil de marcador similar a las celulas de la invencion, o si estos marcadores han sido perdidos. Las celulas tambien son adecuadas para probar agentes farmaceuticos.

Para establecer la proporcion de celulas que formaran neuronas o gllas, las celulas son preparadas por via clonal; las celulas son sembradas individuamente y no todas las celulas forman colonias clonales pero aquellas que lo hacen generalmente por encima de 50% haran neuronas (bajo el protocolo apropiado) o gllas (de nuevo, bajo el protocolo apropiado). Las celulas se distinguen del arte pues en tanto el arte reclama la identificacion e incluso la propagacion de celulas que tienen propiedades de celulas madre neuronales las poblaciones fueron altamente heterogeneas. Esta es una importante distincion puesto que las poblaciones impuras incluyen celulas que proveen senalizacion a celulas madre neuronales remanentes lo cual estimula la diferenciacion y la posterior reduccion de la proporcion de celulas madre neuronales. Mientras que los metodos del arte anterior pueden generar neuroesferas a partir de celulas individuales la invencion permite la generacion de poblaciones sustancialmente puras a partir de celulas individuales.

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En realizaciones particulares de la invencion, descritas en mas detalle en un ejemplo mas adelante, todas las colonias de celulas NS producen 15% o mas, preferiblemente al menos 20%, mas preferiblemente al menos 20 a 30% de neuronas positivas a TuJ. En cultivos de alta densidad hemos contado celulas positivas TuJ. El 35% de las celulas NS LC1 adquirieron morfologla neuronal y expresaron la beta Ill-tubulina despues de 115 replicaciones, mas de un ano despues de cultivo continuo. Estas celulas retuvieron un cariotipo diploide en esta etapa. La LC1 es una poblacion no clonada. Por lo tanto los datos indican que hubo una minima presion selectiva para los precursores restringidos gliales o para transformation genetica.

Las celulas de la invencion pueden ser cultivadas sin cocultivo con celulas heterologas y sin medio condicionado indefinido, fracciones de matriz extracelular o suero, una caracterlstica no mostrada previamente por ninguna celula madre de un tipo diferente a las celulas ES. Por lo tanto siguiendo la invencion, las celulas madre neuronales son cultivadas preferiblemente en cultivos homogeneos en condiciones definidas. Incluso una NSC individual aislada en un micropozo puede expandirse, indicando una minima dependencia en senales extracelulares diferente a EGF y FGF y que pueden reducirse senales de autorrenovacion extrinseca esenciales para las NSCs a EGF y FGF in vitro.

En realizaciones adicionales ilustradas en un ejemplo en mas detalle, sustancialmente cada colonia, esto es al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, mas preferiblemente al menos 97% de las colonias que se desarrollan a partir de la siembra de celulas individuales (i) muestran expresion homogenea identica de marcadores de precursores neuronales y ausencia de marcadores de diferenciacion en FGF mas EGF, y (ii) generan neuronas al retirar el factor de crecimiento. En un ejemplo especifico, cada colonia tenia estas propiedades. Esto es evidencia de autorrenovacion simetrica. Adicionalmente, los datos de los ensayos en colonias sobre cultivos celulares de NS no clonados fueron comparables con los datos de la linea NS5 clonal. La formation en serie de colonias no diferenciadas expandibles a partir de NS5 muestra que las celulas clonogenicas son celulas madre y que sus numeros se expanden en proportion con la poblacion de NS. Formalmente un incremento en el numero de celulas madre puede ocurrir a traves de dos mecanismos: generation de novo o divisiones con autorrenovacion simetrica. La primera requiere una fuente de celulas premadre esto es, una celula pluripotente o un anlage fetal, ninguno de los cuales esta presente en los cultivos de celulas NS aqui, de manera que la autorrenovacion simetrica debe funcionar en los cultivos de celulas NS.

Las celulas NS especificas, obtenidas en un ejemplo mas adelante, expresan Sox2, Pax6, Emx2, Olig1, Olig2, Nestina, BLBP, GLAST, Vimentina, y son inmunorreactivas para RC2, 3CB2, SSEA-1, y Prominina. Preferiblemente no expresan Sox1 y son negativas para GFAP y antigenos neuronales. Estas celulas NS carecen de marcadores de pluripotencia y marcadores de otras capas germinales. Nosotros asumimos que el caracter de celulas madre neuronales esta enmascarado durante el desarrollo del CNS y es solamente demostrable de manera verdadera ex vivo, como es en el caso de las celulas ES. El hallazgo de que la expresion de Sox1 no se mantenia en las celulas NS es nuevo, no predicho, e indica que una selection de linaje continuo utilizando Sox1 no seria productiva.

En realizaciones adicionales de la invencion las celulas NS, ejemplificadas por lineas NS no clonadas derivadas de celulas ES (CGR8-NS) y clonadas (NS5) y lineas derivadas de cortex fetal no clonadas (Cor1) y clonadas (Cor1-3), muestran expresion de marcadores gliales radiales 3CB2, BLBP, GLAST, Nestina, RC2 y Vimentina en cultivo. La expresion de GFAP es preferiblemente inferior a 10%, mas preferiblemente inferior a 5% especialmente inferior a 2% de celulas en cualquiera de estos cultivos. En un ejemplo especifico la expresion de GFAP fue vista en menos del 1% de las celulas. Tambien hemos demostrado la expresion uniforme de nestina y RC2 con ausencia de GFAP y plll-tubulina en celulas NS derivadas de celulas ES despues de 115 replicaciones indicando que el fenotipo celular NS es estable. Celulas preferidas de la invencion son diferenciadas de celulas ES no humanas y (1) continuan expresando nestina y RC2 y (2) continuan no expresando GFAP y plll-tubulina despues de 30 replicaciones, preferiblemente despues de 60 replicaciones, mas preferiblemente despues de 100 replicaciones. La no expresion de GFAP y beta lll-tubulina significa que la expresion es observada en menos del 5% de las celulas, preferiblemente menos del 2% de las celulas.

Hemos llevado a cabo analisis a traves de RT-PCR los cuales confirmaron la ausencia de factores de transcription especificos pluripotentes, mesodermicos o endodermicos en celulas NS especificas. Tambien llevamos a cabo la perfilacion de la expresion Affymetrix (RTM) que confirma la ausencia de transcriptos inapropiados del linaje y demuestra una expresion consistente de marcadores gliales neuronales y radiales en tres diferentes cultivos de celulas NS (derivadas de ES, derivadas de cortex fetal y derivadas de cortex fetal clonal).

La obtencion de celulas NS por diferenciacion a partir de celulas ES no humanas comprende preferiblemente mantener las celulas en un cultivo adherente continuo, y mas preferiblemente omitir una etapa de formacion de una neuroesfera. Sin embargo, la obtencion de celulas NS por diferenciacion de celulas a partir de aislados celulares primarios de cerebro fetal o adulto comprende opcionalmente (i) formar primero un agregado en suspension o una neuroesfera, y (ii) mantener subsecuentemente las celulas en cultivo adherente. Hemos encontrado en ejemplos que despues de algunos pocos dias los agregados pueden ser unidos a plastico recubierto con gelatina y entonces las celulas NS creceran.

Determinamos la proporcion de neuronas y astrocitos generados en replicaciones tempranas y tardias de celulas de

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la invencion, especlficamente para las celulas NS LC1 en las replicaciones 8 y 115. Este ultimo cultivo representa 12 meses de expansion con un perlodo de duplicacion de 24 horas. Hay una declinacion modesta en el numero de neuronas obtenido en la replicacion tardla, pero esto todavla totaliza >35%. La llnea clonal NS5, derivada independientemente de celulas ES 46C, muestra un nivel similar de eficiencia en la diferenciacion neuronal en la replicacion 30. La generacion de astrocitos inmunorreactivos GFAP se acerco a 100% en ambos puntos del tiempo para las celulas NS LC1 y tambien para las celulas NS5. Adicionalmente, los datos in vivo, que muestran una diferenciacion extensa de tanto neuronas como astrocitos, fueron obtenidos utilizando celulas NS LC1 cultivadas por replicaciones multiples, luego transducidas con lentivirus GFP y expandidas adicionalmente antes del trasplante. En combinacion con la uniformidad de la expresion del marcador glial radial, los datos sobre el potencial de diferenciacion estable para las celulas NS lC1 no clonadas indica que el cultivo adherente en FGF y EGF favorece la autorrenovacion de celulas madre y suprime el compromiso a destinos gliales o neuronales.

Encontramos que las celulas NS, obtenidas por diferenciacion a partir de celulas ES, podrlan ser trasplantadas sin formacion de tumores durante un perlodo de 5 semanas, siendo as! distintas de las celulas ES las cuales darlan lugar a teratomas macroscopicos al cabo de 4 semanas en el cerebro del raton.

Tambien se divulgan metodos de reprogramacion nuclear y celulas y animales obtenidos a traves de estos metodos.

La reprogramacion nuclear es una tecnica mediante la cual el nucleo de una celula somatica, opcionalmente una celula madre o una celula terminalmente diferenciada, es reprogramada de tal manera que se comporte como un nucleo de una celula de potencia relativamente mayor; finalmente un nucleo reprogramado completamente actua como el nucleo de una celula pluripotente y la reprogramacion se toma frecuentemente para indicar la reprogramacion hasta terminar en la pluripotencia. Los metodos de reprogramacion por transferencia nuclear estan bien establecidos en el arte y se publicaron completamente despues de la invencion descrita en WO 96/07732, algunas veces nominada como la invencion de “Dolly la oveja”. La transferencia nuclear puede ser utilizada as! para clonar animales no humanos.

Los metodos de transferencia nuclear tienen un cierto numero de problemas. Primariamente permanecen con baja eficiencia, puesto que las celulas obtenidas son raramente reprogramadas de tal manera que sean verdaderamente pluripotentes. Tambien es deseable tener la capacidad de llevar a cabo la manipulation genetica sobre el nucleo como parte de la reprogramacion. Pero, actualmente esta manipulacion no es posible o es no confiable debido a la dificultad en obtener poblaciones clonales de nucleos donantes. Incluso con nucleos clonales los metodos de reprogramacion son procedimientos complejos que requieren muchas etapas individuales. Finalmente, las celulas ES de algunas especies siguen siendo diflciles de aislar. Utilizando tecnicas de reprogramacion, si estuviesen disponibles y fuesen confiables, se podrla ofrecer una ruta alternativa a celulas pluripotentes en estas especies.

Aspectos adicionales divulgados aqul tiene como objetivo proveer metodologlas alternativas a los problemas anteriores y proveer soluciones a los mismos.

De acuerdo con lo anterior, se divulga un metodo para reprogramacion nuclear, en donde el nucleo donante es obtenido de una celula madre neuronal de la invencion.

Se ha encontrado que las celulas madre neuronales de la invencion son reprogramables con alta eficiencia, y por lo tanto la invencion provee un metodo de reprogramacion eficiente y tambien facilita la production de celulas reprogramadas modificadas geneticamente, especialmente celulas madre pluripotentes, de muchas especies. Esta capacidad, a traves de la invencion, de propagar celulas madre neuronales individuales por via clonal significa que despues de la manipulacion genetica pueden obtenerse poblaciones clonales de celulas, todas con la misma modification genetica, y utilizarse en metodos de reprogramacion.

Tambien es posible identificar celulas madre neuronales de acuerdo con la presencia de marcadores de superficie celular especlficos y/o la ausencia de otros -esto tiene la ventaja de que la etapa de cultivo de acuerdo con aspectos de la invencion descritos aqul puede ser omitida, puesto que la celula madre neuronal puede ser seleccionada directamente de una poblacion mixta, por ejemplo, un homogenizado de cerebro.

Se divulga por lo tanto un metodo de reprogramacion nuclear, en donde el nucleo donante es de una celula madre neuronal obtenida de acuerdo con cualquier realization o aspecto de la invencion.

Un metodo particular de reprogramacion nuclear, comprende:

- obtener una celula donante;

- obtener una celula receptora;

- transferir el nucleo de la celula donante a la celula receptora, en donde la celula donante es (i) una celula madre

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neuronal, o (ii) una celula obtenida de acuerdo con un metodo de la invencion; y

- cultivar la celula de tal manera que se reprograme el nucleo de la celula donante, obteniendo por lo tanto una celula reprogramada.

El nucleo de la celula receptora podra ser retirado generalmente en una etapa en el proceso de tal manera que la celula resultante sea diploide, lo que se hace opcionalmente antes de transferir el nucleo de la celula donante y opcionalmente despues de transferir el nucleo de la celula donante.

Una de las posibilidades interesantes ofrecidas por las celulas NS de la invencion es introducir lesiones geneticas, por ejemplo, que pueden inducir enfermedad maligna. Una opcion adicional es as! manipular geneticamente el nucleo de la celula donante. Esto puede ser utilizado para introducir mutaciones o genes de interes, por ejemplo, para generar celulas o animales para ensayos u otros propositos de prueba en donde se obtiene una pluralidad de celulas todas con la misma manipulacion. El rango de manipulacion es amplio. Un ejemplo es introducir una secuencia genetica que causa una enfermedad o una secuencia genetica putativa que causa una enfermedad en el nucleo de la celula donante, util para la criba de farmacos. Una opcion adicional es obtener un animal que comprende tejido derivado de la celula reprogramada y llevar a cabo un ensayo utilizando el tejido. Se prefiere que la celula sea reprogramada de nuevo hacia la pluripotencia, por ejemplo, mediante transferencia nuclear en un oocito.

En realizaciones particulares divulgadas aqul, aprovechando el conocimiento de la invencion de los marcadores de superficie celular en las celulas madre neuronales deseadas se permite la omision de etapas de cultivo de otra manera necesarias para aislar una celula madre neuronal a partir de una poblacion mixta. Tal metodo de reprogramacion comprende proveer una poblacion mixta de celulas, aislar una celula madre neuronal de la poblacion mixta con base en su perfil de marcadores de superficie celular y trasferir el nucleo de la celula aislada a una celula receptora.

Como sucede con los otros metodos, la celula aislada puede ser manipulada geneticamente antes de transferir su nucleo a la celula receptora. Tambien, la celula aislada puede ser cultivada para obtener una poblacion clonal de celulas antes de la transferencia del nucleo de una celula en la poblacion a la celula receptora.

En mas detalle, una aplicacion de las celulas de la invencion es en la criba de farmacos de alto rendimiento. Tanto las celulas madre neuronales de la invencion como las neuronas, gllas, etc., obtenidas de la misma pueden ser utilizadas para la criba, por ejemplo, para identificar factores activos sobre cada tipo de celula. Las celulas o la progenie pueden utilizarse en modelos de cancer de cerebro. Las celulas y la progenie pueden ser obtenidas a partir de un tumor del sistema nervioso, especialmente del CNS y las celulas neuronales derivadas del mismo y su progenie pueden ser utilizadas en cribas: la naturaleza de la criba se considera evidente para todos, pero en resumen comprende obtener una celula de la invencion o una progenie diferenciada de la misma, cultivar la celula o progenie en la presencia de un factor de prueba y determinar un efecto del factor sobre la celula o progenie. En un uso de criba particular, se provee una celula, la cual es una celula de la invencion u obtenida por la invencion y que ha sido modificada de tal manera que exprese un receptor EGF o un receptor EGF adicional.

Las celulas pueden ser modificadas antes de ser usadas en una criba. Por ejemplo, las celulas pueden ser modificadas geneticamente para introducir una mutacion en un gen, o para introducir un acido nucleico que codifica un producto genetico conocido por estar, o del que se sospecha que esta implicado en una enfermedad, especialmente una enfermedad de las celulas neuronales incluyendo Parkinsonismo y enfermedad de Alzheimer. La mutacion Parkin puede ser introducida. Un gen que codifica una protelna, por ejemplo APP, implicado en la enfermedad de Alzheimer puede ser expresado o mutado o tener su expresion alterada.

Las celulas de la invencion son de uso como fuente de celulas para la terapia celular. Ofrecen una fuente de celulas madre de un paciente que potencialmente puede ser fuente de nucleos para transferencia nuclear. Pueden ser utilizadas para la administracion de terapia genetica, incluyendo terapia genetica neuroprotectora. En una terapia de ejemplo, una celula de la invencion expresa factor neurotrofico derivado de celulas gliales (GDNF). Estas celulas pueden ser obtenidas siguiendo la invencion y manipulando geneticamente las celulas. Las celulas pueden ser trasplantadas para restaurar circuitos neuronales danados y/o restaurar la funcion cerebral.

Una ventaja de la invencion yace en la pureza de las celulas obtenidas. Una poblacion pura es mas facil de controlar en trasplante o cultivo, puesto que en un cultivo heterogeneo se obtiene un porcentaje reducido de neuronas puesto que mas celulas se han comprometido ya en un destino glial. Algunas terapias necesitaran tanto neuronas como astrocitos. Otras terapias necesitaran celulas gliales (por ejemplo oligodendrocitos para MS, astrocitos, celulas migratorias, para otras aplicaciones).

Tambien se divulgan metodos de clonacion de animales no humanos. Un metodo para clonar un animal no humano, comprende (i) obtener una celula madre neuronal del animal no humano, (ii) obtener un oocito de la misma especie

que el animal no humano, (iii) transferir el nucleo de una celula madre neuronal al oocito, y (iv) implantar la celula obtenida en (iii) en una hembra de la misma especie. La presente divulgacion provee por lo tanto un metodo eficiente de clonacion animal no humana con base en el aislamiento de celulas madre neuronales. Se considera que el metodo de clonacion es de aplicacion a sustancialmente todos los animales no humanos, aunque especialmente 5 animales domesticos incluyendo vacas, cerdos, ovejas, gatos, perros, pollos y otros y tambien animales de laboratorio incluyendo ratones y ratas.

La invention permite, por primera vez, el crecimiento de una poblacion pura de celulas madre de tejido diploide, clonogenicas, transfectables de la misma forma que las celulas ES. Esta es una etapa significativa de avance en la biologla de las celulas madre que abre un rango de nuevas oportunidades experimentales. Por ejemplo, estudios 10 previos sobre la perfilacion de “celulas madre neuronales” estan comprometidos seriamente por la confianza en los cultivos de neuroesferas heterogeneos (por ejemplo Suslov et.). Ademas, las caracterlsticas gliales radiales de las celulas ES definen su contraparte in vivo. La capacidad de cultivar y manipular geneticamente por acciones puras de gllas radiales tambien abre nuevas oportunidades para analizar la biologla celular de estas notables celulas, que puede funcionar tanto como celulas madre as! como celulas de armazon especializadas. Finalmente, la capacidad 15 de propagar las celulas NS en medios simples sin celulas heterologas o extractos celulares establece que la autorrenovacion puede ser guiada por factores de crecimiento solos y que no requiere un nicho microambiental complejo, hasta ahora considerado indispensable por los biologos de celulas madre. La invencion abre nuevas aproximaciones hacia la reprogramacion nuclear y a la manipulation genetica opcional utilizando las celulas.

La invencion provee la generation eficiente de neuronas a partir de celulas NS. En un metodo, fijado en mas detalle 20 en un protocolo aqul, un metodo para la obtencion de neuronas comprende (a) cultivar celulas madre neuronales en la presencia de un agonista de un receptor FGF y en la ausencia de un agonista de un receptor EGF; y (b) despues de esto, cultivar las celulas en ausencia de un agonista de un receptor FGF y en la ausencia de un agonista de un receptor EGF. Se encuentra que el perlodo durante el cual por ejemplo, el EGF esta ausente prima que las celulas se conviertan en neuronas cuando por ejemplo FGF es retirado subsecuentemente. Las celulas madre neuronales 25 son sembradas preferiblemente en un cultivo monocapa. Tlpicamente, las celulas NS son transferidas a medio libre de EGF pero que contiene FGF-2 y cultivadas durante un perlodo, por ejemplo de al menos 2 dlas, o al menos 4 dlas, antes de que se retire tambien el FGF-2 del medio (lo cual incluye que las celulas sean transferidas a un medio que no lo contiene). En un metodo especlfico las celulas son cultivadas en FGF-2 pero no EGF durante una semana y luego se retira el FGF-2. El retiro de FGF lleva a algo de muerte celular en el cultivo, pero un buen porcentaje 30 sobrevive y forma neuronas. Este metodo puede ser utilizado como una adicion opcional a cualquiera de los metodos descritos aqul para derivation de celulas NS.

Sera evidente que los metodos/usos de acuerdo con todos los aspectos de la invencion pueden ser llevados a cabo bien sea in vivo o in vitro.

Los metodos y composiciones de la invencion o descritos aqul se ilustran en los dibujos acompanantes en los 35 cuales:

la figura 1 muestra la generacion de celulas madre neuronales (NS) a partir de celulas ES;

la figura 2 muestra que las celulas NS pueden ser derivadas a partir de diversas llneas celulares ES y cerebro anterior fetal;

la figura 3 muestra que las celulas NS se incorporan y se diferencian dentro del cerebro adulto;

40 la figura 4 muestra celulas ES humanas o celulas NS derivadas de feto; y

la figura 5 muestra actividad electrica bajo condiciones de voltaje y pinza de corriente de celulas NS cultivadas en medio diferenciador.

Con referencia a las figuras en mas detalle, la figura 1 muestra la generacion de celulas madre neuronales (NS) a partir de celulas ES: A. El cultivo de celulas NS adherente (LC1) propagado en EGF y FGF-2 (a) no muestra 45 expresion de antlgenos neuronales (b) o astrocitos (c) y expresion uniforme del marcador precursor RC2 (d) y nestina (no mostrada). Las celulas LC1 se diferencian en astrocitos inmunopositivos (e) por adicion de suero y generan neuronas (f-h) al retirar el factor de crecimiento. La proportion de neuronas obtenida sigue siendo mayor >35% de las celulas totales despues de 115 replicaciones (i). B, se generaron celulas NS-5 clonales a traves de la selection de linaje neuronal Sox1. a y c, imagen de fago de precursores neuronales en las replicaciones 1 y 5 50 respectivamente. b y d fluorescencia de Sox1-GFP correspondiente. e, celula individual 1 hora despues de sembrar en pozo de Terasaki. f, imagen de contrate de fases de llnea celular clonal en la replication 20. C, RT-PCR para celulas ES y marcadores de celulas madre neuronales/celulas gliales radiales (46C, llnea ES progenitora; P5, 5 replicaciones despues de diferenciacion neuronal; NS-5 llnea NS clonal; LC1, poblacion NS (replicacion 17); cerebro (cerebro de raton E12.5/E16.5). D, inmunorreactividad de NS-5 para marcadores de celulas madre

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neuronales/gliales radiales. E, diferenciacion de NS-5 en astrocitos (a, b) y neuronas (d, e) sin perdida de inmunorreactividad a la nestina (c, f) F, colonias de celulas NS-5 (a) generan neuronas al retirar el factor de crecimiento (b) y en la presencia de EGF/FGF retienen expresion homogenea de RC2 y BLBP sin inmunorreactividad para GFAP (c, d). G, dispersion de metafase de NS-5 (replicacion 31).

La figura 2 muestra celulas NS que pueden ser derivadas a partir de diversas llneas celulares ES y cerebro anterior fetal: las celulas NS fueron derivadas de llneas celulares ES independientes (CGR8, E14Tg2a) o tejido cortical primario (Cor-1) y estriatal (Str-1). A, RT-PCR de marcadores de celulas madre/gliales radiales. B, rT-PCR para reguladores transcripcionales. C, la llnea derivada de ES (CGR8-NS) y la llnea derivada de feto (Cor-1) son indistinguibles de LC1 por morfologla (a, f) y por inmunorreactividad de marcadores de celulas madre neuronales/gliales radiales (b, c, g, h), y puede cada una diferenciarse en neuronas (d, i) y astrocitos (e, j).

La figura 3 muestra celulas NS que se incorporan y diferencian dentro de cerebro de adulto: a-h Imagenes confocales de celulas NS LC1, transducidas lentiviralmente con eGFP, cuatro semanas despues del injerto en el hipocampo (a, b) o estriato (c-h). b, d, magnificacion superior de los insertos en paneles a y c, respectivamente. e, f, ejemplos de celulas NS injertadas en eGFP (verde) que muestran la coexpresion (amarillo) de los marcadores neuronales TuJ (e, rojo) o MAP-2 (f, rojo). g, marcador GFAP astroglial (rojo). h, marcador en progenitor neural de nestina (rojo). i, analisis cuantitativo de celulas neuronales derivadas de injerto (MAP2), astrogliales (GFAP), progenitoras (Nestina), y proliferantes (Ki67), cuatro semanas despues del trasplante en estriato de raton adulto. Los datos son media (± desviacion estandar) de al menos 500 eGFP+ celulas de cinco animales independientes. Barras de escala: a, c, 100 hm; b, d ,e, 40 hm.; f-h, 20 hm.

La figura 4 muestra celulas ES humanas o celulas NS derivadas de feto: A, derivacion de celulas ES humanas. a, cultivo primario de ES humanas. b, diferenciacion de celulas ES humanas en estructuras de roseta neuronales. c, replicacion 9 en medio de expansion NS. d, celulas individuales que exhiben morfologla glial radial. e-h, inmunotincion para marcadores de celulas madre neuronales/gliales radiales. B, derivacion a partir de cerebro anterior fetal humano. i, neuroesferas generadas a partir de cortex. j, union y crecimiento. k, replicacion 5 en medio de expansion NS. I, morfologla glial radial. m-p, marcadores de celulas madre neuronales/gliales radiales. C, diferenciacion. q, neuronas inmaduras positivas a TuJ. r, astrogliales positivas GFAP.

La figura 5 muestra: A. rutas actuales de entrada y salida en diferentes potenciales de membrana (entre -70 y +40 mV a partir de un potencial de sostenimiento de -90 mV), de tres diferentes celulas NS despues de la incubacion en medio diferenciador durante seis (a), veinte (b) y treinta (c) dlas. B. Se obtuvieron respuestas a voltaje superimpuesto obtenidas despues de la inyeccion de pulsos de corriente rectangulares despolarizantes en las mismas tres celulas (a, b y c) como en (A) conmutando de pinza voltaje a corriente inmediatamente despues de los registros de corriente mostrados en (A). Las llneas punteadas representan un nivel de voltaje de -60 mV. C. corrientes de Na+ promedio generadas a -20 mV a partir de celulas cultivadas en medio diferenciador incrementando tiempos como se indica mediante las etiquetas. Las barras indican SE. D. corrientes de entrada superpuestas generadas a -40 mV y 0 mV en Ba2+ 10 mM y en la presencia de TTX; el potencial de sostenimiento fue de -90 mV. E. relacion corriente/voltaje de la misma celula como en (D).

La invencion se demuestra en uso mediante los siguientes ejemplos. Debe entenderse que, hasta el nivel en que estos ejemplos se relacionan con el uso de celulas embrionicas humanas, son ejemplos de referencia y no realizaciones de la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1-1.

Aislamiento y cultivo de poblaciones en volumen de celulas NS

Un protocolo de diferenciacion de celulas ES fue establecido recientemente el cual permite la generation eficiente y consistente de entre 50-70% de precursores neuronales positivos Sox1 en cultivos en monocapa adherente. Con el fin de aislar, expandir y caracterizar los precursores neuronales (derivados de raton) dentro de estos cultivos, se utilizo una llnea celular previamente generada (celulas 46C) la cual contenla un casete informador de GFP-IRES- puromicina direccionado al locus Sox1 (Ying et al., 2003b). Se agrego la puromicina a los cultivos de diferenciacion despues de 7 dlas, y al cabo de 3 dlas mas del 95% de las celulas restantes eran precursores neuronales GFP+. En este punto, las celulas fueron resembradas en medio N2B27 suplementado con EGF/FGF-2 (sin puromicina). Estas celulas crecieron rapidamente, al cabo de unas pocas replicaciones tomando una morfologla homogenea.

Estas celulas precursoras neuronales 46C (46C-NP) fueron mantenidas de manera continua en cultivo durante mas de 20 replicaciones reteniendo una morfologla bipolar caracterlstica. Estos cultivos mostraron muy poca muerte celular y no tuvieron una alta eficiencia en siembra duplicando el tiempo de aproximadamente 25 horas.

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Ejemplo 1-2.

Cultivo de llneas celulares

Para aislar llneas celulares clonales, se sembraron celulas individuales de los cultivos en volumen de replicacion 5 de celulas 46C-NP en pozos separados de una placa de micropozos. De las 95 celulas individuales calificadas, 15 crecieron en colonias, y, de estas, 4 llneas fueron mantenidas en crecimiento continuo a lo largo de mas de 10 replicaciones. Una llnea (NP5) mostro las celulas bipolares caracterlsticas con morfologla homogenea identica a la observada en la poblacion en volumen. Esta llnea NP5 habla sido mantenida en cultivo indefinidamente (NP5 replicacion 41; mas de 5 meses).

Ejemplo 1-3.

Caracterizacion de celulas NS

Con el fin de caracterizar tanto la poblacion celular en volumen como las llneas clonales se utilizo inmunocitoqulmica para una variedad de marcadores. Como se esperaba, cada una de las llneas celulares se encontro positiva para los marcadores de precursor neuronal, nestina o vimentina. De manera importante, estas celulas tambien fueron positivas para los marcadores especlficos gliales radiales RC2, 3CB2 y el trasportador de glutamato especlfico para astrocitos (GLAST). Menos de 1% de las celulas fueron positivas para GFAP o piii tubulina sugiriendo que ocurre muy poca diferenciacion espontanea a astrocitos o neuronas durante la replicacion de estas celulas. A diferencia de celulas de primate/humana, las gllas radiales de roedores son negativas para GFAP. Ademas, estas celulas son inmunorreactivas para SSEA-1, un anticuerpo que reconoce el antlgeno de LewisX, usado previamente para enriquecer celulas madre neuronales en adultos.

Se llevo a cabo RT-PCR con un rango de marcadores para confirmar su identidad como gliales radiales. Todas las cuatro llneas clonales as! como la poblacion en volumen fueron negativas para Oct4 o Nanog confirmando que no eran celulas ES, a la vez que expresaban nestina, vimentina y GLAST, en consistencia con la inmunocitoqulmica. Adicionalmente, cada llnea celular mostro expresion de BLBp, un marcador glial radial. Estas celulas tambien expresan Musashi-1 y prominina.

De manera interesante, el cultivo en volumen de 46C-NP perdio gradualmente la expresion de Sox-1 segun se establecio mediante el informador GFP, de tal manera que en la replicacion 5 (~2 semanas) muy pocas celulas permanecieron verdes. Tambien, ninguna de las llneas clonales mostro expresion de GFP guiada por Sox1 y el RT- PCR confirmo que estas celulas no expresan Sox1, sino que a cambio expresan la protelna de clase SoxB1 relacionada, Sox2. Estos resultados juntos sugieren que un rango de precursores neuronales que expresan Sox1 puede ser aislado utilizando una estrategia de seleccion con puromicina, y que las celulas Sox1-. Sox2+ con propiedades de gliales radiales de cerebro anterior fetal pueden ser aisladas y expandidas por clonacion.

Ejemplo 1-4

Diferenciacion de llnea celular NS en neuronas y gllas

Los marcadores moleculares expresados por las llneas celulares NS confirman que son un tipo de celulas precursoras neuronales. Para confirmar que estas celulas eran verdaderas celulas madre multipotentes (esto es capaces de diferenciacion bien sea como neuronas o gllas), se probo un rango de condiciones disenadas para probar la potencia de las celulas.

investigaciones previas de precursores neuronales indujeron diferenciacion a traves de protocolos que involucraban retiro de mitogenos y/o adicion de suero u otras citoquinas. En el caso presente, las EGF, FGF, o ambas fueron retiradas de celulas NP5 y 46C-NP proliferantes cultivadas sobre plastico. La eliminacion simultanea tanto de EGF como de FGF dio como resultado una muerte celular rapida y extendida al cabo de 24 horas. El cultivo con FGF solo, por contraste, llevo a la muerte celular en el transcurso de 3 dlas. El cultivo EGF solo no dio como resultado la muerte o diferenciacion celular, sino que se redujo la proliferacion celular. Asl, el EGF actua claramente como una senal de supervivencia celular esencial (compensada parcialmente por la senalizacion de FGF) para celulas NS cultivadas sobre plastico.

El efecto del suero sobre celulas proliferantes despues de la eliminacion de citoquinas tambien fue probado. Las celulas tratadas de esta manera sobrevivieron, incluso en la ausencia de EGF, y rapidamente se diferenciaron de manera slncrona tal que el 100% de las celulas adquirieron un gran astrocito plano que se tino positivo para GFAP y negativos para nestina. Por lo tanto, todas las celulas NS con una poblacion proliferante son capaces de diferenciacion como astrocitos. Este efecto puede ser imitado por la adicion de BMP4 en ausencia de suero despues de la eliminacion de EGF/FGF sobre plastico. Las CNTF y TGF-b se comportaron de manera similar a BMP4, aunque la morfologla de los astrocitos fue diferente y hubo mas muerte celular inicialmente. BMP, CNTF y LiF han

mostrado cada una la induccion del destino de los astrocitos a partir de progenitores corticales primarios (Gross et al., 1996; Lillien and Raff, 1990; Nakashima et al., 1999). En consistencia con estos estudios, se encontro una rapida induccion de genes Id (>30 veces) con tratamiento con BMP-4 o suero (datos no mostrados).

En un intento para inducir diferenciacion neuronal, se probo la eliminacion de EGF o de placas tratadas con 5 laminina. Para evitar la muerte celular vista en cultivo de celulas sobre plastico, las celulas fueron sembradas sobre un sustrato de laminina en la presencia de FGF, pero sin EGF. La PCD vista en estas condiciones sobre plastico o gelatina no se presento y las celulas sobrevivieron. Hubo un cambio en la morfologla de las celulas a procesos bipolares mas extendidos, con proyecciones caracterlsticas de gliales radiales. Estas celulas mostraron una reduccion drastica en proliferacion (a traves de la incorporacion de BrdU) pero mantuvieron los marcadores gliales 10 radiales (RC2, vimentina, nestina) y no se diferenciaron, puesto que solamente una pequena porcion de neuronas o astrocitos fue vista en regiones de alta densidad. Para inducir la diferenciacion neuronal, despues de 6 dlas el medio fue cambiado de NSA/N2 +FGF2 a NSA/B27 sin FGF2. Este promovio alrededor del 40-60% de diferenciacion celular de las celulas segun se juzga mediante tincion de anticuerpo de MAP2 y pIII tubulina. Estas neuronas fueron GABAergicas segun se establecio mediante inmunorreactividad con GABA, mientras que hubo pocos astrocitos 15 (GFAP). Estos resultados son consistentes con el papel previamente descrito de FGF en la prevencion de la diferenciacion neuronal.

Tambien se encontro que cada llnea celular podrla ser congelada y descongelada con similar exito que las celulas ES.

En pruebas adicionales, las diferenciaciones fueron intentadas partiendo de celulas individuales. Esta expansion y 20 diferenciacion clonal mostro que todas las celulas tienen la capacidad de formar neuronas.

Ejemplo 1-5.

Aislamiento de celulas NS a partir de una llnea celular ES sin uso de estrategias de selection genetica

El medio N2B27 utilizado para aislar NP5 fue optimizado originalmente para la conversion de celulas ES a precursores neuronales y por lo tanto permitio una buena supervivencia de celulas ES y progenitores neuronales. 25 Asl, en la ausencia de seleccion por puromicina, no fue posible expandir eficientemente las celulas 46C-NP con EGF y FGF-2 debido al arrastre de celulas ES y del tipo celular no neural (datos no mostrados). Para superar esto y permitir la generation de celulas gliales radiales a partir de otras llneas ES no direccionadas, se probaron otras combinaciones de medios basales que permitlan la supervivencia y expansion de precursores neuronales pero no de otros tipos de celulas.

30 Utilizando un medio comercialmente disponible, medio NS-A (Euroclone), se encontro que la resiembra de una diferenciacion de monocapa de celulas ES 46C en el dla 7 dio como resultado la formation de aglomerados/esferas de celulas, asl como una muerte celular de celulas no neuronales. Se presento union subsecuente de estas aglomeraciones celulares y crecio una poblacion homogenea de celulas. La caracterizacion posterior de esta poblacion replicable (>75 replicaciones) de celulas revelo un perfil identico de marcadores expresados visto 35 previamente utilizando la estrategia de seleccion con puromicina. Asl, las celulas fueron positivas para marcadores de precursor neuronal (nestina, vimentina) y tambien marcadores gliales radiales (RC2, GLAST, bLbP y Pax6). Las celulas 46C-NP se comportaron de manera similar en medios N2B27 o NSA una vez se establecieron con solo pequenas diferencias en morfologla y sin diferencia en los genes marcadores.

Usando este protocolo, las llneas celulares de otras seis llneas ES fueron aisladas: CGR8, E14T. Oct4-GIP, S11, R1 40 y V6.5. Cada una de estas llneas celulares tienen una morfologla y perfil de expresion similares y pueden ser replicadas extensamente

Ejemplo 1-6.

Trasplante de celulas NS

Para probar el potencial de las celulas NS in vivo, fueron trasplantadas en CNS tanto embrionico como de adulto, asl 45 como en un injerto en capsula renal.

Se probo la electroporation sobre NP5. Se encontro que experimentaban electroporation eficientemente utilizando un electroporador de onda cuadrada. Las celulas tambien son transfectables utilizando lipofectamina mas reactivo. Esta es una ventaja principal puesto que toda la manipulation genetica utilizadas en raton se hacen ahora disponibles.

50 Para permitir una evaluation rapida de las celulas injertadas, las 46C-NP fueron transducidas con partlculas lentivirales que portaban el gen marcador eGFP. La infection fue altamente eficiente y casi el 95% de las celulas

fueron marcadas exitosamente, siendo la senal eGFP fuerte y estable con las replicaciones. El uso de la infeccion lentiviral permitio que el transgen fuera integrado de manera estable y la senal permaneciera estable para analisis a largo plazo de las celulas injertadas.

Se evaluo el comportamiento de las celulas despues del trasplante en el cerebro embrionico (un ambiente que 5 contiene todas las moleculas y factores capaces de sostener y dirigir la diferenciacion de celulas neuronales inmaduras). 100,000 celulas fueron suspendidas en un volumen final de 2 microlitros siguiendo el procedimiento descrito previamente por Magrassi y colega (Magrassi et al., Development 1999) usando embriones de raton E14.5 como receptores. Las celulas sobrevivieron bien despues del trasplante (se hizo una evaluacion aproximada de alrededor de 20000 celulas en el injerto), y la senal eGFP fue facilmente detectable y desplegaron actividad de 10 migracion ya en puntos de tiempo temprano despues del injerto. Se analizaron los destinos que las celulas injertadas adquirieron en diferentes puntos de tiempo (4 dlas, 7 dlas, 2 semanas y 1 mes) despues del injerto. En los puntos de tiempo del dla 4 y semana 1, la mayorla de las celulas eran todavla inmaduras segun lo indicaba la inmunorreactividad a nestina, mientras que el 23% expresaron el marcador neuronal Tuj-1 y 16.3% adquirieron el marcador glial GFAP. Estos datos indican que las NS trasplantadas son capaces de generar tanto neuronas como 15 gllas in vivo segun se esperaba a partir de las celulas NS multipotentes.

Las celulas NS tambien fueron trasplantadas en el estriato de adulto. En estos trasplantes, las celulas sobrevivieron bien (la supervivencia de cualquier manera es inferior que en los injertos embrionicos) y se diferenciaron hacia destinos tanto neuronales como gliales. Los analisis cuantitativos ejecutados 2 semanas despues del trasplante indicaron que el 43.3% de las celulas expresaron el marcador especifico neuronal Tuj-1, mientras que 26.6% 20 desplegaron inmunorreactividad para el marcador glial GFAP. Una pequena fraccion de las celulas (11.1%) retuvo un fenotipo inmaduro segun se indica mediante la expresion de nestina.

Las celulas NP5-GFP en capsula renal no se elevaron a teratomas (n=4, datos no mostrados).

Ejemplo 2

Ejemplo 2-1

25 Metodos

Cultivo y diferenciacion de celulas de raton

Las celulas ES y la diferenciacion neuronal son detalladas por Ying & Smith, 2003. Las celulas NS denominadas LC1 y otras celulas NS derivadas de ES fueron generadas de manera rutinaria resembrando en el dla 7 cultivos en monocapa de diferenciacion neuronal sobre plastico no recubierto en un medio NS-A (Euroclone) suplementado con 30 N2 y 10 ng/ml de EGF y FGF-2 (medio de expansion NS). Las celulas formaron agregados que se unieron subsecuentemente y crecieron celulas NS. Las celulas denominadas celulas 46C-NS fueron generadas despues de la adicion de 0.5 pg/ml de puromicina para diferenciar cultivos adherentes en el dla 7. Las celulas fueron resembradas 3 dlas despues en un matraz T75 sin recubrimiento en medio N2B27 con 10 ng/ml de EGF y FGF-2 (Peprotech) en la ausencia de puromicina. Se genero una llnea clonal, NS-5, sembrando celulas individuales en 35 placas de micropozos de 96 pozos (Nunc) limitando la dilucion (las celulas individuales clasificaron 1 hora despues de la siembra). Se generaron cultivos primarios utilizando protocolos estandar de cortex/estriato de embriones de raton E16.5 y se les permitio unirse sobre matraces tratados con 0.1% de gelatina. Se expandieron entonces las celulas Cor-1 y Str-1 sobre gelatina utilizando medio de expansion NS. Para la diferenciacion de astrocitos, las celulas NS fueron resembradas sobre placas de 4 pozos a 1 x 105 celulas/pozo en medio NS-A suplementado con 40 1% de suero de ternera fetal o 10 ng/ml de BMP4 (Sistema R&D). Para la diferenciacion neuronal se sembraron 5 x

104 celulas NS sobre pozos tratados con poliornitina/laminina en NS-A suplementado con FGF-2 solo. Despues de 7 dlas el medio fue cambiado a NS-A suplementado con B27 (Gibco) sin factor de crecimiento. Para la diferenciacion clonal, cultivos de 1000 celulas de NS-5 o Cor-1 fueron sembrados en placas de 10 cm pretratadas con laminina, se expandieron durante 12 dlas en EGF/FGF-2, y se diferenciaron in situ como se indico anteriormente.

45 Caracterizacion de celulas NS

La inmunocitoqulmica fue llevada a cabo utilizando conjugados secundarios TRITC o FITC y contratincion nuclear con DAPI. Los anticuerpos primarios fueron utilizados en las siguientes diluciones: Nestina (1:10), Vimentina (1:50), Pax6 (1:5), 3CB2 (1:20), RC2 (1:50) (DSHB); TuJ (1:200) (Covance); GFAP (1:300) (poli y mono, Sigma), MAP2 (1:200) (Chemicon and Becton Dickinson); NeuN (1:200), GABA (1:200), Gad65/67 (1:200) (Chemicon); 50 Sinaptofisina (1:200) (Sigma); Olig2 (1:5000) (H. Takebayashi); Emx2 (1:2000) (A. Corte); BLBP (1:500) (N. Heintz); prominina/mAb13A4 (1:200) (W. Huttner). Los controles negativos fueron celulas ES, celulas NS diferenciadas o secundarias solas. Para el RT-PCR, se extrajo el ARN total utilizando el kit RNeasy (Qiagen), y el ADNc fue generado utilizando Superscript II (Invitrogen). El PCR se llevo a cabo durante 30 ciclos para todos los marcadores excepto la p-actina (25 ciclos). Para la metafase se trataron celulas esparcidas con 5 ml de KCl al 0.56% durante 20

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minutos, se fijaron con metanol: acido acetico (3:1) sobre hielo durante 15 minutos, se distribuyeron sobre laminas de vidrio y se tineron con TOPRO-3 (sondas moleculares).

Para referencia solamente:

Cultivos de embrion y feto humanos

La investigacion sobre tejido humano con consentimiento informado fue aprobada por la Research Ethics Committee of Lothian Health Board. Se donaron embriones humanos supernumerarios congelados para investigacion bajo licencia R0132 emitida por el Human Fertilisation and Embryology Authority. Se disecciono cortex humano a partir de un feto en etapa Carnegie 19/20 despues de la terminacion electiva con consentimiento para la investigacion bajo las gulas Polkinghorne.

Trasplantes

La cirugla fetal fue llevada a cabo como lo describe Magrassi et al., 1998. Utilizando un capilar de vidrio, 5x104 celulas en un volumen de 1 pl de HBSS fueron inyectadas en los veslculos telencefalicos de fetos de rata E14.5 Sprague Dawley expuestos bajo transiluminacion. Los fetos inyectados fueron recolocados en la cavidad abdominal para desarrollo hasta su termino. Despues del nacimiento los animales fueron sacrificados a los siete dlas (dla postnatal (P) 1, n=16) y cinco semanas (P30, n=8) despues del trasplante. Para los trasplantes a adultos, ratones 129 o CD1 fueron colocados en un marco de estereotaxia Kopf y recibieron una inyeccion de 2x105 celulas NS suspendidas en 5 pl de HBSS en el estriato (n=22) o el hipocampo (n=21). Los ratones trasplantados fueron sacrificados despues de dos (n=16) y cuatro semanas (n=10) y fueron perfusionados por via transcardlaca con 4% de paraformaldehldo. Se tineron criosecciones (16 pm) con los siguientes anticuerpos: (raton): NeuN (1:100) y Ki67 (1:10) (Chemicon), MAP2 (1:200; Becton Dickinson), Nestina (1:5; Ron McKay); (conejo): piii tubulina (1:500; Covance); GFAP (1:200; Dako); anticuerpos secundarios, Texas Red (Vector) (Jackson ImmunoResearch) y AlexaFluor 488 (Sondas moleculares). Las secciones fueron preservadas en solucion antidecaimiento y analizadas en microscopios confocales Nikon TE2000-S ECLIPSE y Biorad Radiance 2100.

Ejemplo 2-2

Se indujo diferenciacion monocapa de celulas ES durante 7 dlas y luego se resembraron en medio basal (NS-A mas N2) suplementado con EGF y fGF-2. Las celulas que sobrevivieron bajo estas condiciones mlnimas (no permisivas para supervivencia de celulas ES) se asociaron predominantemente en aglomeraciones flotantes. Despues de 3-5 dlas estos agregados fueron recolectados y resembrados en medio fresco. Se unieron al cabo de 2-3 dlas y crecieron en una poblacion morfologicamente homogenea de celulas bipolares, denominadas LC1. Al replicar las celulas LC1 continuaron creciendo como cultivos adherentes, formando frecuentemente redes reticulares. Pueden ser continua y rapidamente propagados con un tiempo de duplicacion de aproximadamente 24 horas. Las celulas LC1 despliegan los marcadores precursores neuronales nestina y RC2 pero la expresion del marcador de diferenciacion en astrocitos GFAP o de antlgenos neuronales es despreciable (figura 1A). Por exposicion a suero o BMP, las celulas LC1 adoptan la morfologla tlpica de los astrocitos al cabo de 48 horas y subsecuentemente expresan de manera uniforme GFAP (figura 1A, e). En contraste, las celulas con procesos neuronales aparecen despues de la resiembra sobre laminina sin EGF durante 5-7 dlas y luego retirando el FGF-2. Estas celulas expresan marcadores neuronales tipo iii p-tubulina, MAP2 (figura 1A, f, g) y neuN (no mostrado). La mayorla de las neuronas muestran tincion para GAD67 (figura 1A, g) y GABA (no mostrado) y a los 7 dlas una subpoblacion muestra la expresion del marcador maduro sinaptofisina (figura 1A, h). Se generan altos numeros de neuronas (>35%) incluso despues de 115 replicaciones (figura 1A, i). Junto con la observacion de que las celulas LC1 retienen un contenido de cromosoma diploide en las ultimas replicaciones (no mostradas), esto confirma la presencia de celulas madre neuronales (NS) autorrenovadoras.

Ejemplo 2-3

Para determinar si la agregacion celular es esencial para la generacion de celulas NS, mantuvimos la union celular a lo largo del proceso de derivacion. Para esto explotamos la seleccion de linaje (Li et al., 1998) usando celulas ES 46C en las cuales el casete informador/de seleccion GFPirespac esta integrado en el gen Sox1, un marcador especifico de la especificacion neuronal (Aubert et al., 2003). La seleccion de puromicina transiente despues de la induccion de la diferenciacion genero una poblacion purificada de precursores neuronales sin celulas ES residuales (Stavridis et al., 2003) (figura 1B, a, b). Se aplicaron entonces FGF-2 y EGF a los precursores neuronales que expresan Sox1 en medio enriquecido. Las celulas siguieron estando adherentes en esta condicion. La heterogeneidad celular se redujo al cabo de 3-4 replicaciones puesto que las celulas bipolares se incrementaron progresivamente en numero y comenzaron a formar redes extensas. De manera intrigante, la expresion de Sox1 se perdio en esta etapa (figura 1b c, d) pero las celulas permanecieron positivas para Sox2 y nestina. Para establecer la presencia de celulas madre neuronales (NS), se aislaron celulas individuales en pozos Terasaki y se expandieron como cultivos adherentes (figura 1B, e, f). inicialmente se derivaron 5 llneas clonales de morfologla y caracterlsticas

de crecimiento similares a la poblacion LC1 en volumen. Estas celulas careclan de expresion detectable de los factores de pluripotencia Oct4 y Nanog, y tambien del marcador neuronal temprano Sox1, pero retenlan los marcadores pan-neuroepiteliales Sox2 y nestina (figura 1C). Las celulas NS fueron generadas as! a traves de un precursor neuroectodermico temprano positivo a Sox1 a traves de cultivo adherente continuo.

5 Ejemplo 2-4

El clon NS-5 fue examinado en mayor detalle y se encontro que expresaba ARNm de Pax6, Glast y BLBP, y por ser inmunopositivo para RC2, vimentina, 3CB2, SSEA1/Lex1 y prominina (figura 1 D). Este conjunto de marcadores se considera diagnostico para gliales radiales neurogenicas, los precursores tanto de neuronas como de astrocitos durante el desarrollo del sistema nervioso (Campbell et al., 2002; Hartfuss et al., 2001). Como sucede con las 10 celulas LC1 no clonadas, las celulas NS-5 fueron competentes para la diferenciacion de astrocitos y neuronas (figura 1E). Las celulas NS-5 sembradas a una densidad clonal en EGF mas FGF-2 dieron lugar a colonias de celulas bipolares. Cada colonia mostro la expresion de RC2 y BLBP en virtualmente todas las celulas y ausencia de GFAP (figura 1 F, c, d). Estos subclones pudieron ser tomados y expandidos de manera continua. Para determinar la frecuencia de celulas dentro de los cultivos NS que son capaces de diferenciacion celular se sembraron de nuevo 15 celulas NS-5 en densidad clonal, se expandieron durante 12 dlas en EGF/FGF-2 seguido por FGF-2 solo durante 5 dlas, y luego 7 dlas adicionales sin factor de crecimiento. Cada colonia (126/126) produjo celulas positivas en TuJ (figura 1F, b). Estos datos indicaron que todas las celulas formadoras de colonias en cultivos NS eran competentes para la diferenciacion neuronal. Finalmente, al igual que LC1, las celulas NS-5 mantuvieron un complemento de cromosoma diploide (figura 1 G) y representaron una llnea de celulas madre (NS) clonales no transformada que se 20 autorrenovaba sin requerir un microambiente celular complejo.

Ejemplo 2-5

Para establecer si el protocolo de induccion en monocapa libre de suero es un prerrequisito para la generacion de celulas NS, se indujeron celulas ES para diferenciarlas por formacion de cuerpo embrioide y exposicion a acido retinoico en un medio con contenido de suero (Bain et al., 1995). Los agregados fueron sometidos a la seleccion de 25 linaje por Sox2 (Li et al., 1998; Billon et al., 2002) con G418 durante 48 horas y luego fueron resembrados en la presencia de fGF-2 y EGF sin suero. Despues de la union, las celulas positivas a Sox2, positivas a nestina proliferaron de tal forma que desplegaron la morfologla bipolar y crecimiento en red tlpico de las celulas NS mas la capacidad para la diferenciacion en astrocitos y neuronas despues de multiples replicaciones (datos no mostrados). As! se derivaron celulas NS a partir de cuerpos embrioides.

30 Ejemplo 2-6

Se derivaron celulas NS utilizando induccion monocapa sin seleccion de linaje tal como se describe para LC1 a partir de tres aislados de celulas ES independientes, E14TG2a, CGR8 y R1. Todas las llneas NS examinadas expresaron nestina y RC2 en al menos el 95% de las celulas. Una inspeccion mas detallada de celulas NS derivadas de CGR8 y E14TG2a mostraron el panel completo de marcadores gliales radiales (figura 2A), los marcadores precursores 35 neuronales Sox2 y Sox3, mas los factores de transcripcion de bHLH Olig2 y Mash1 (figura 2B). La subrregulacion de Sox1 pero con mantenimiento de Sox2 fue una caracterlstica impactante de estas celulas NS, a la vista de la funcion determinativa postulada de estos factores de transcripcion (Pevny et al., 1998). Asl, mientras que Sox1 marca todos los precursores neuroectodermicos, no es retenido en celulas madre donde Sox2 probablemente juegue un papel clave. Estas celulas NS tambien expresaron Emx2 el cual esta implicado en la expansion de las celulas precursoras 40 neuronales (Hein et al., 2001; Galli et al., 2002). Todos los cultivos de NS probados experimentaron diferenciacion en astrocitos y neuronas establecida tanto por morfologla como inmunotincion (figura 2C).

Ejemplo 2-7

A la luz de su relacion aparente con las gliales radiales, examinamos si las celulas NS resultaban de la preadaptacion de las celulas ES a la propagation ex vivo o podrlan ser derivadas de tejido neuronal fetal. Celulas 45 CNS fetales primarias de cerebro fetal de E16.5 se adhirieron pobremente a plastico en medio basal mas factores de crecimiento y espontaneamente formaron agregados. Despues de 6-7 dlas estos agregados se depositaron sobre plastico recubierto con gelatina. Catorce dlas despues, los crecimientos fueron tripsinizados y sembrados sobre plastico recubierto con gelatina. En tres experimentos separados las celulas morfologicamente identificables como celulas NS proliferaron y fueron subsecuentemente expandidas en llneas celulares continuas. Estos derivados de 50 cerebro fetal expresaron los mismos marcadores gliales radiales y neurogenicos que las celulas NS derivadas de celulas ES (figura 2A, B) y mostraron perfiles de ARNm consistentes. Fueron de la misma manera competentes para la diferenciacion en astrocitos y neuronas (figura 2C). Las celulas Cor-1 derivadas de cortex fueron sembradas como celulas individuales y luego las colonias fueron sometidas a elimination secuencial del factor de crecimiento como se describio para NS-5. Cada colonia produjo neuronas positivas a TuJ. Esto indico que todas las celulas clonogenicas 55 en el cultivo de Cor1 eran neurogenicas. Las celulas Cor-1 tambien fueron subclonadas facilmente y se expandieron continuamente a partir de celulas individuales, lo que indica autorrenovacion. Asl las celulas NS fueron derivadas de cerebro fetal y compartieron las propiedades claves de las celulas NS derivadas de celulas ES.

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La mayorla de las celulas NS tenlan la morfologla bipolar elongada, extensiones lameladas en proyeccion y nucleos ovales anticipados para gliales radiales (Rakic, 2003). Las celulas aplanadas y compactas con cortas extensiones tambien estaban presentes. La inmunotincion para la histona H3 fosforilada del marcador de metafase indico que las celulas compactas eran mitoticas. La videomicroscopla de lapso de tiempo confirmo el cambio dinamico en morfologla antes de la division celular. Ademas, el lapso de tiempo revelo que la celula NS experimenta migracion nuclear intercinetica, un rasgo bien caracterizado de las celulas neuroepiteliales y gliales radiales in vivo.

Las celulas NS fueron por lo tanto expandibles de manera continua en analogos in vitro de los gliales radiales neurogenicos.

Ejemplo 2-8

Neuroesferas de raton congeladas/descongeladas en replicacion 40 se dejaron unir a plastico recubierto con gelatina en medio de expansion NS. Crecieron celulas bipolares que son indistinguibles de celulas NS. Estas celulas pueden ser propagadas en serie como poblaciones uniformemente positivas en RC2, negativas en GFAP y luego fueron inducidas para diferenciarse en astrocitos o neuronas.

Ejemplo 2-9

Se investigo el comportamiento de celulas NS por trasplante en cerebro de raton. Las celulas LC1 derivadas de celulas ES transducidas con un vector de expresion eGFP lentiviral fueron introducidas en el cerebro en desarrollo por inyeccion intrauterina en E14.5 (Magrassi et al. 1998). Los animales fueron sacrificados despues del nacimiento y en la presencia de celulas positivas a eGFP examinadas en secciones del cerebro. La progenie de celulas NS habla migrado hacia diversas regiones del cerebro. Los analisis inmunohistoqulmicos revelaron la coexpresion de eGFP con el marcador precursor nestina, marcadores neuronales TuJ, Neun y MAP2, y en numeros menores con GFAP. Las celulas NS tambien fueron inyectadas en el estriato de raton adulto. En este caso las celulas positivas a GFP permanecieron localizadas en la vecindad del sitio de inyeccion. Cuatro semanas despues del injerto, el 44.4±5.7% de las celulas que expresaban GFP tenlan morfologla neuronal y eran inmunopositivas para MAP2, el 37.4±6.1% expresaban GFAP y el 4.2±1.9% retuvieron la expresion de nestina (figura 3). El marcador proliferativo Ki67 fue detectado solamente en 1.0±0.6% de celulas positivas a GFP indicando que las celulas NS se salen del ciclo celular in vivo. En consistencia con esto no se observo evidencia histologica de proliferation no regulada o formation tumoral en un total de 35 cerebros examinados un mes despues del trasplante. Ademas, las celulas NS injertadas a capsulas renales de raton no proliferaron o dieron lugar a teratomas. Estos datos indican que las celulas NS pueden sobrevivir y diferenciarse tanto en ambientes de cerebro fetal como de adulto y a diferencia de las celulas ES (Brustle et al., 1997), no dan lugar a teratomas. Ademas, la frecuencia relativamente alta de diferenciacion neuronal esta en marcado contraste con los injertos de neuroesferas replicadas (Rossi et al., 2002).

Ejemplo de referencia 2-10

Finalmente investigamos si celulas NS similares podrlan ser aisladas a partir de fuentes humanas. En el proceso de derivar celulas ES humanas a partir de embriones supernumerarios donados, observamos despues de 5-6 semanas de cultivo una diferenciacion extensiva en estructuras rosetas tlpicas de celulas neuroepiteliales. Estas celulas fueron transferidas a medio de expansion NS. Despues de 3-4 semanas adicionales emergieron celulas bipolares similares a celulas NS a partir de estos cultivos (figura 4A) y hablan sido cultivadas de manera continua durante 5 meses. Tambien extrajimos cortex fetal humano en etapa 19-20 Carnegie a partir de una termination electiva. Las celulas disociadas inicialmente formaron agregados flotantes que despues de 7 dlas fueron resembrados y se dejaron enlazar a plastico recubierto con gelatina como se hizo para la derivation de celulas NS a partir de cerebro fetal de raton. Se establecio un cultivo proliferante (figura 4B). Los cultivos NS humanos tanto de celulas ES como de tejido fetal fueron caracterizados por la presencia de celulas aplanadas asociadas con las celulas bipolares. Sin embargo, todas las celulas expresaron los marcadores precursores inmaduros nestina, vimectina y 3CB2 (figura 4B). La monitorizacion por lapso de tiempo confirmo que las dos morfologlas celulares son plasticas e interconvertibles. Estas celulas humanas tambien exhibieron bajos niveles de GFAP en consistencia con la actividad del promotor GFAP humano en gliales radiales (Rakic, 2003; Malatesta et al., 2000). Proliferaron mas lentamente que las celulas de raton, con tiempos de duplication de varios dlas. Despues de la elimination secuencial de EGF y FGF-2 parecieron generar celulas neuronales inmaduras (figura 4C). Las celulas de morfologla tlpica de astrocitos con intensa inmunorreactividad a GFAP fueron producidas despues de replicacion en suero (figura 4C).

Ejemplo 3

Las propiedades electrofisiologicas de las celulas NS en cultivo fueron investigadas durante la diferenciacion in vitro empleando la variante de celula entera de la tecnica parche-pinza, con el fin de determinar, si siguiendo tratamientos especlficos, estas celulas podrlan ser transformadas eficientemente en neuronas funcionales y maduras desde un punto de vista electrofisiologico.

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Soluciones para el registro electrofisiologico

Se establecieron sellos entre electrodos y celulas en una solucion de bano que consistla de (en mmoles/l):155 NaCl, 1.0 CaCl2, 1 MgCl2, 3.0 KCI, 10 glucosa, 10 HEPES/NaOH (pH 7.4). Despues de establecer la configuracion de celula entera, para el registro de corriente-pinza y para el registro de corriente total en voltaje-pinza, la solucion para llenado de pipeta contenla (en mmoles/l): 128 KCI, 10 NaCl, 11 EGTA, 4 Mg-ATP, 10 HEPES/KOH (pH 7.4). Para el estudio de los canales de Na+ controlados por voltaje bajo condiciones de voltaje-pinza, la pipeta de parche fue llenada con (en mmoles/l): 130 CsCl, 10 NaCl, 20 TEA-Cl, 10 EGTA, 2 MgCh, 4 Mg-ATP, 10 HEPES/CsOH (pH 7.4) y la solucion extracelular contenla (en mmoles/l): 130 NaCl, 2 CaCl2, 2 MgCh, 10 glucosa, 5 tetraetilamonio-Cl, CdCl2 0.2, 10 HEPES/NaOH (pH 7.4). Para el estudio de los canales de Ca'2+ controlados por voltaje, la pipeta de parche fue llenada con (en mmoles/l): 120 CsCl,, 20 TEA-Cl, 10 EGTA, 2 MgCh, 4 Mg-ATP, 10 HEPES/CsOH (pH 7.4) y la solucion extracelular contenla (en mmoles/I): 130 NaCl, 10 BaCh, 10 glucosa, 5 tetraetilamonio-Cl, 10 4-AP 1, TTX 10‘3, HEPES/NaOH (pH 7.4).

Registro de parche-pinza

Las corrientes ionicas fueron registradas bajo condiciones de voltaje-pinza utilizando la configuracion de celula completa parche-pinza (19) a temperatura ambiente (20-24°C) con un amplificador de parche-pinza Axopatch 200B (Axon Instruments Inc., Burlingame, CA) y se digito en intervalos de muestreo de 26-100 psegundos utilizando un convertidor Digidata 1322A A/D (Axon Instruments Inc., Burlingame, CA) en interfaz con un PC compatible con IBM. La estimulacion, adquisicion y analisis de datos se llevaron a cabo utilizando los siguientes paquetes de software: pClamp 9 (Axon Instruments Inc., Burlingame, CA) y ORIGIN 6 (Microcal Software Inc., Northampton, MA). Para los experimentos voltaje-pinza se redujeron primero los componentes lineales de corrientes de fuga y capacitivas mediante circuitos analogos y luego se cancelaron casi completamente con el metodo P/N. Las pipetas de parche fueron hechas a partir de vidrio de borosilicato y pulidas al fuego. Las pipetas tenlan una resistencia final de 3-4 MQ cuando se llenaron con solucion interna. Las corrientes fueron filtradas a 5 KHz.

La figura 5A muestra registros de corriente obtenidos durante las etapas de voltaje-pinza de celula completa para potenciales de prueba de despolarizacion en tres celulas NS en diferentes etapas de diferenciacion in vitro (cultivadas respectivamente durante 6, 20 y 30 dlas en un medio de diferenciacion), utilizando bano y solucion de llenado de pipeta adecuados para el aislamiento de las corrientes ionicas controladas por voltaje de entrada (Na+) y salida (K+). A partir de una inspeccion simple de los trazados de corriente es evidente que una corriente controlada por voltaje de salida dimensionable ya esta presente en las etapas tempranas de la diferenciacion in vitro (6 dlas, traza a). Esta corriente, bloqueada por la aplicacion de una solucion salina extracelular que contiene tetraetilamonio- Cl 5 mM, tiene las caracterlsticas de una corriente rectificadora retardante de K+. Su amplitud se incrementa solo ligeramente en las etapas posteriores de la diferenciacion (20-30 dlas, trazas b y c respectivamente). En contraste, la amplitud de la corriente de entrada, despreciable despues de 6 dlas, se incrementa dramaticamente incrementando el tiempo de exposicion al medio de diferenciacion. La figura 5B muestra las respuestas de voltaje disparadas despues de la inyeccion intracelular de estlmulo de corriente despolarizante rectangular entre 70 y 300 pA a partir de un potencial de sostenimiento de aproximadamente -80 mV, despues de conmutar del modo voltaje- pinza a corriente-pinza en las mismas celulas mostradas en la figura 5A. En efecto, el incremento en amplitud de la corriente de entrada controlada por voltaje refleja la capacidad de las celulas diferenciadoras para disparar potenciales de accion. En efecto, la celula expuesta durante solamente seis dlas a los agentes de diferenciacion y que muestra una corriente de entrada despreciable no fue capaz de disparar una respuesta en voltaje regenerativa (traza marcada con (a) en la figura 5B). En contraste, un potencial de accion excesivo con una rata de despolarizacion relativamente rapida pudo ser disparado en el cultivo celular en medio de diferenciacion por 30 dlas (traza marcada con (c) en la figura 5b) y desplego una corriente de entrada grande (traza c en la figura A). Una situacion intermedia, con un potencial de accion abortivo, fue encontrada en la celula tratada durante veinte dlas con los agentes diferenciadores (traza marcada con (b) en la figura 5B) y desplegando una corriente de entrada moderada (traza b en la figura A). De este analisis preliminar surge que las propiedades de excitabilidad de estas celulas estan estrictamente correlacionadas con la magnitud de la conductancia de entrada regulada por voltaje. Para un analisis cuantitativo de esta conductancia como funcion del tiempo de exposicion al medio de diferenciacion, las corrientes de entrada fueron disparadas utilizando celulas en diferentes etapas de diferenciacion y aplicando soluciones salinas intra y extracelulares especlficas para el estudio de la actividad de los canales de Na+ controlados por voltaje (vease metodos). En cualquier momento de la diferenciacion celular la corriente de entrada inactivadora rapida fue completamente bloqueada por el bloqueador del canal de Na selectivo tetrodotoxina (1 pM) y alcanzo un pico en un potencial de prueba entre -20 y -10 mV, mostrando las caracterlsticas tlpicas de las corrientes de Na+ controladas por voltaje en neuronas (datos no mostrados). En la figura 5C se muestra el desarrollo de la amplitud de corriente Na+ a -20 mV como funcion del tiempo de exposicion al medio de diferenciacion. De manera interesante, el incremento de la conductancia de Na+ se correlaciona bien con la exposicion creciente de las celulas al medio de diferenciacion. En efecto, en promedio la amplitud de corriente de Na+ se incrementa en un factor de aproximadamente diez al cabo de 30 dlas de tratamiento (desde -55 ± 14 pA (n=17) durante los primeros 5 dlas a -434 ± 135 pA (n=13) por mas de 25 dlas). De la misma manera, el potencial regenerativo (el aV medida entre el umbral y el pico disparado por la corriente Na+ bajo condiciones de corriente-pinza varlo entre 0 y +20 mV durante los primeros 15 dlas de la diferenciacion in vitro (n=6), mientras que despues de mas de 25 dlas de tratamiento

alcanzo valores entre +30 y +70 mV (n=6). En total, las propiedades de excitabilidad y las de conductancia de Na+ controlados por voltaje subyacentes encontradas en las celulas NS tratadas por mas de 25 dlas con el medio de diferenciacion son tlpicas de las neuronas que se desarrollan hacia su fenotipo adulto. Otra caracterlstica que corrobora las conclusiones previas es la presencia de conductancias en el canal de Ca2+ controladas por voltaje en 5 la mayorla de las celulas probadas despues de la exposicion al medio de diferenciacion durante al menos siete dlas o mas. La figura 5D muestra las tasas de muestra obtenidas por despolarizacion de membrana a los potenciales de prueba indicados para las mismas celulas sumergidas en Ba2+ 10 mM. El componente de corriente de activacion rapida e inactivacion relativamente lenta (Th = 21 ms) obtenida a -40 mV es reminiscente de la corriente del canal Ca2+ LVA neuronal (Carbone y Lux, 1987). En contraste, la corriente de Ba2+ obtenida a 0 mV, que despliega una 10 inactivacion lenta e incompleta (Th = 73 ms), tiene las caracterlsticas tlpicas de la corriente del canal de Ca2+ HVA neuronal. La presencia en esta celula de dos conductancias distintas del canal de Ca2+ LVA y HVA esta confirmada por la relacion corriente-voltaje de la figura 5E. En promedio la corriente LVA tiene un pico a -40 mV, mientras que la relacion I/V para la corriente HVA tiene un pico a 0 mV. Una corriente de Ba2+ HVA fue detectable en 19 de 27 celulas, mientras que un componente de corriente LVA fue medido en el 60% de las celulas que ya expresaban una 15 corriente de Ca2+ HVA (n = 13).

Estos datos muestran que las neuronas producidas a partir de celulas madre neuronales de la invencion pueden funcionar: pueden disparar potenciales de accion, la marca caracterlstica de las neuronas activas.

Asl, hemos derivado y propagado de manera homogenea celulas NS definidas como progenie diferenciada de celulas ES y extractos cerebrales de feto. Las celulas NS proliferaron de manera clonal en monocultivo adherente 20 simple y permanecieron diploides. Despues de expansion prolongada, se diferenciaron eficientemente en neuronas y astrocitos tanto in vitro como en trasplante en cerebro adulto. Las celulas NS tambien formaron oligodendrocitos in vitro. Las celulas NS expresaron de manera uniforme caracterlsticas morfologicas y moleculares de gliales radiales, precursores fetales de neuronas y astrocitos. Fuimos capaces de establecer llneas celulares NS adherentes de cerebro fetal de raton y humano.

25 Ejemplo 6

Se obtuvieron celulas NS a partir de celulas ES de raton y cortex fetal utilizando el protocolo a continuacion. Las celulas NS derivadas expresaron uniformemente marcadores gliales radiales. Las celulas NS derivadas especlficamente de celulas CGR8 ES o de cortex fetal E16 (referencia interna: Cor-1 y derivado clonal Cor-1.3) fueron analizadas en cuanto a la expresion de los marcadores indicadores por inmunoqulmica. El examen en 30 potencia alta mostro que los marcadores gliales radiales se expresaron cada uno en casi todas las celulas mientras que eran uniformemente negativos para GFAP.

Ejemplo 7

Las celulas NS fueron derivadas a partir de neuroesferas de cerebro anterior fetal de raton expandidas utilizando el protocolo que sigue. Una llnea NS derivada de un cultivo de neuroesferas fetal a largo plazo (40 replicaciones) 35 exhibio morfologla identica a llneas NS derivadas de ES, expresaron inmunorreactividad al marcador de celulas precursoras neuronales/gliales radiales, y pudieron diferenciarse en neuronas y astrocitos. Esto demuestra que las celulas NS obtenidas de neuroesferas fetales frescas eran las mismas que las neuroesferas congeladas y luego cultivadas como neuroesferas durante un largo tiempo.

Ejemplo 8

40 Celulas NS de raton LC1 fueron trasplantadas en cerebro de rata fetal. Las imagenes confocales de las celulas NS, transducidas lentiviralmente con eGFP, fueron tomadas una semana despues del trasplante en el ventrlculo de ratas E14.5. Las celulas donantes migraron desde el ventrlculo hacia el parenquima en aglomeraciones y como celulas individuales. Las celulas injertadas mostraron colocalizacion de eGFP y el marcador neuronal MAP2, el marcador astroglial GFAP o el marcador de celulas progenitoras nestina. Asl, las celulas NS migraron y se diferenciaron 45 despues del trasplante a cerebro de rata fetal.

Ejemplo 9

Protocolos para la derivacion y manipulacion de llneas celulares NS

Hemos disenado los siguientes protocolos para la derivacion y manipulacion de llneas celulares NS.

Derivacion de llneas celulares NS de raton a partir de celulas ES

50 Las celulas ES pueden ser convertidas eficientemente en progenitores neuronales que expresan Sox1 en cultivo de monocapa adherente [P1]. Protocolos detallados y problemas para esta diferenciacion de celulas ES estan descritos

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abundantemente [P2]. En resumen, las celulas ES son cultivadas de manera rutinaria bajo condiciones libres de alimentacion en medio suplementado con suero de ternera fetal al 10% y factor inhibidor de leucemia recombinante a 100 U/ml (LIF) sobre plastico para cultivo de tejido recubierto con gelatina [P3]. Las celulas ES no diferenciadas se expandes a ~80% de confluencia en un matraz T75 (Iwaki), se tripsinizan y resucitan en medio N2B27 [P2]. Las celulas son sembradas sobre placas de 9 centlmetros (Iwaki) que hablan sido recubiertas con una solucion de gelatina al 0.1% (Sigma) durante al menos 10 minutos y luego se dejaron secar. Puesto que la densidad de siembra inicial es un parametro crucial para la induccion neuronal eficiente, y puede variar entre llneas de celulas ES, hemos sembrado de rutina diferentes densidades celulares (0.8 x 106, 1 x 106 y 1.2 x 106) por placa. El medio de cultivo se cambia cada dla, retirando en el proceso celulas desprendidas o muertas. Bajo estas condiciones el 50-80% de las celulas experimental especificacion de linaje neuronal al cabo de 4-5 dlas y expresara diferenciacion neuronal detectable del dla 5 en adelante.

La conversion de cultivos progenitores heterogeneos a llneas celulares NS homogeneas puede alcanzarse como sigue. Los cultivos diferenciados en el dla 7 son tripsinizados y se resiembran 2-3 x 10 celulas en un matraz T75 no cubierto en medio de expansion NS, que comprende medio NS-A (Euroclone) suplementado con L-glutamina 2 mM final (Gibco), suplemento N2 modificado (recien preparado internamente) [P2] y 10 ng/ml de EGF de raton (Peprotech) y FGF-2 humano (Peprotech). Los medios de expansion pueden ser almacenados a 4°C por hasta 4 semanas. Al cabo de 2-3 dlas el matraz contendra muchos miles de agregados flotantes en cultivo en suspension (el numero absoluto varla de acuerdo con la eficiencia de la diferenciacion de las celulas ES inicial). Los agregados celulares son recolectados por centrifugacion moderada o se dejan decantar por gravedad en un tubo universal de 30 ml durante 10 minutos. Esta etapa elimina residuos y celulas muertas, enriqueciendo as! las celulas NS de inicio, y asegura un intercambio completo de medio. Las celulas son resembradas en 10 ml de medio de expansion NS fresco sobre un matraz T75 recubierto con gelatina (Iwaki). Despues de 3-7 dlas adicionales, los agregados celulares se uniran al matraz y prontamente despues de esto las celulas creceran con morfologla bipolar caracterlstica de celulas NS. Despues del crecimiento extenso de las celulas (3-4 dlas adicionales) la poblacion completa es tripsinizada y resembrada como celulas individuales sobre un matraz T75 recubierto con gelatina en medio de expansion. Las celulas crecen muy rapidamente (tiempo de duplicacion ~25 horas) y permanecen adherentes. Al cabo de varias replicaciones se eliminan las celulas diferenciales y explotadas residuales (monitorizadas por tincion con GFPA y TuJ1) y los cultivos son uniformemente positivos para los marcadores de celulas NS.

Para celulas 46C ES (Sox1-GFP-IRES-pac anulacion) [P4] puede utilizarse una seleccion transiente con puromicina (0.5 pg/ml) para eliminar celulas no neuronales y derivar celulas NS a traves de cultivo adherente continuo. Las celulas 46C ES (1 x 106) son sembradas en medio N2B27 sobre una placa de 9 cm recubierta con gelatina para inducir el compromiso neuronal. Seis dlas despues se agrega puromicina durante 48 horas. La poblacion celular que expresa Sox1 enriquecida (~3-5 x 106) es resembrada entonces en medio N2B27 que contiene EGF (10 ng/ml) y FGF-2 (10 ng/ml) sobre placas de 9 cm recubiertas con gelatina. La poblacion que expresa Sox1 inicialmente heterogenea morfologicamente adquiere progresivamente un caracter negativo a Sox1 y despues de 3-4 replicaciones una expresion de morfologla y marcadores de celulas NS uniforme.

Derivacion de llneas de celulas NS de raton a partir de CNS y neuroesferas fetales

Los aglomerados celulares se forman en suspension por disociacion de cortex fetal de E16.5 y cultivo primario en medio de expansion para celulas NS. Estos agregados primarios pueden ser convertidos facilmente en llneas celulares NS adherentes sembrandolos sobre sustrato recubierto con gelatina en medio de expansion. Con el fin de promover el enlace, es importante que los residuos/celulas muertas sean retirados efectivamente primero por sedimentation y se cambie el medio completamente. Los agregados celulares se uniran y creceran al cabo de 2-5 dlas. Las celulas en crecimiento pueden ser tripsinizadas subsecuentemente a celulas individuales, resembradas y propagadas en medio de expansion para celulas NS. A partir de neuroesferas fetales replicadas [P5], las celulas NS pueden ser establecidas convenientemente por disociacion y sembrarse directamente sobre plastico recubierto con gelatina en medio de expansion para NS. Durante las pocas replicaciones iniciales las llneas derivadas de NS tienen una tendencia a agregarse, desprenderse del matraz y reconstituir neuroesferas, particularmente si la densidad celular se hace alta. Los cultivos por lo tanto deberlan ser replicados a o en menos de 50% de confluencia. La tendencia a agregarse espontaneamente es variable, pero en general se reduce por replicaciones adicionales, o a traves del establecimiento de llneas celulares clonales.

Replicacion y expansion de celulas NS

Una vez establecidas, las celulas NS se propagan en medio de expansion para NS. Las celulas NS son cultivadas sobre placas/matraces recubiertos con gelatina y se dividen rutinariamente 1 en 2 a 1 en 5. Las celulas NS tienen un tiempo de duplicacion de alrededor de 25 horas. Las celulas son replicadas utilizando tripsina/EDTA o a traves de incubation con PBS libre de calcio/magnesio (Sigma). Para establecer llneas clonales, las celulas individuales pueden ser depositadas en micropozos recubiertos con gelatina en medio de expansion. Menos rigurosamente, las celulas pueden ser sembradas a densidad muy baja, 1000 celulas por placa de 9 cm. Las colonias aparecen al cabo de dos semanas y pueden ser extraldas y expandidas.

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Criopreservacion y recuperacion de celulas NS

Las celulas NS son recuperadas facilmente despues de congelacion/descongelacion. Rutinariamente se tripsiniza un matraz T75 con 60-90% de confluencia, y se resuspende la pella en 1.5 ml de medio de expansion para NS mas 10% de DMSO. Este luego es dividido en 3 criotubos x 1 ml (Nunc) y se almacenan a -80°C. Las celulas NS son recuperables despues de mas de 6 meses de almacenamiento en estas condiciones. Para almacenamiento a largo plazo los viales congelados son transferidos a nitrogeno llquido. Las celulas NS son descongeladas llevando rapidamente el vial a 37°C seguido por transferencia a 10 ml de medio de expansion NS precalentado. Las celulas son convertidas en pella y luego resuspendidas en medio de expansion fresco para eliminar el DMSO. La recuperacion celular despues de la criopreservacion es >95% para celulas NS.

Diferenciacion en astrocitos y neuronas de celulas NS

La diferenciacion rapida de celulas NS a astrocitos positivos para GFAP ocurre al cabo de 2 dlas de exposicion de las celulas NS a BMP4 (10 ng/ml) o 1% de FCS en NS-A (con N2, sin EGF/FGF) sobre matraces/placas recubiertos con gelatina. La densidad celular no es un parametro crucial para la diferenciacion en astrocitos.

Para la diferenciacion en neuronas las celulas NS son recolectadas utilizando Accutase (Sigma) o PBS libre de calcio/magnesio para desprender las celulas y 0.5-1.0 x 104 celulas son resembradas en cada pozo de una placa multiplatos de 4 pozos recubiertos con poliornitina/laminina (Nunc) en medio NS-A suplementado con FGF-2 (5 ng/ml), N2 modificado y B27 (Gibco). Hemos encontrado que el medio basal NS-A es mas permisivo para la diferenciacion neuronal que otros medios basales. La mitad del volumen del medio se reemplaza cada 2-3 dlas para mantener el acondicionamiento del medio. Despues de 7 dlas en estas condiciones cambiamos el medio a NS-A mezclado con medio neurobasal (Gibco) en una proporcion de 1:1 suplementado con 0.25x N2 mas B27 y sin EGF o FGF. Esta formulacion promueve la diferenciacion y maduracion neuronal adicional. Para cultivos a plazo mas largo de neuronas (mas alla de 14 dlas) se intercambia el medio a neurobasal suplementado con B27 sin N2 en la presencia de BdNF (10 ng/ml).

Diferenciacion de cultivo y neuronal de celulas NS humanas

Las celulas NS humanas se expanden sobre matraces/placas recubiertas con gelatina al 0.1% (Sigma) en medio de expansion como se hace para las celulas NS de raton suplementado adicionalmente con 100 U/ml de factor inhibidor de leucemia humana recombinante (LIF). Las celulas tienen un tiempo de duplicacion de aproximadamente 1 semana. Son replicadas con tripsina una vez que alcanzan ~30% de confluencia y se dividen 1 en 2. El sobrecrecimiento debe ser evitado para mantener el cultivo en monocapa y evitar la agregacion y desprendimiento.

Para la diferenciacion neuronal, las celulas NS humanas son recolectadas utilizando Accutase (Sigma) y alrededor de 1 x 104 celulas son resembradas en cada pozo de una placa de 12 pozos recubierta con poliornitina/laminina (Sigma) (Iwaki) en medio de expansion. Las celulas son expandidas hasta que alcanzan alrededor de 80% de confluencia. La diferenciacion neuronal es inducida eliminando EGF y LIF del medio de expansion. Despues de 7 dlas en la ausencia de EGF y LIF, se intercambia el medio a NS-A mezclado con medio neurobasal en una proporcion de 1:1 (Gibco) suplementado con 0.5X N2, B27, FGF2 (5 ng/ml) y BDNF (10 ng/ml). Despues de 7 dlas adicionales en estas condiciones, el medio es cambiado a medio neurobasal suplementado con B27 y BDNF (10 ng/ml) sin N2 ni FGF-2. La mitad del medio es cambiada cada 2 o 3 dlas como se hace para las celulas NS de raton a lo largo de este protocolo. Despues de 10 dlas adicionales las celulas de morfologla neuronal inmunorreactivas con TuJ1 y MAP2 representan hasta 40% del numero total de celulas. Tambien se generan numeros significativos de astrocitos, en contraste con el protocolo para celulas NS de raton para diferenciacion neuronal en el cual emergen pocas celulas positivas a GFAP.

La invencion se relaciona as! con metodos y medios para obtener y mantener celulas madre neuronales de muchas especies en un estado de division simetrica, no diferenciado. La invencion ha sido llevada a cabo utilizando celulas obtenidas o extraldas de fuentes de celulas ES, fetales y adultas excepto celulas ES humanas. En todos los casos las celulas resultantes obtenidas al seguir los metodos descritos aqul parecen y se comportan sustancialmente igual; todas ellas pueden ser mantenidas en cultivos de alta pureza por encima de numeros altos de, por ejemplo, cientos de, duplicadas con una alta proporcion de las celulas que retienen la capacidad de formar neuronas y gllas. Se describen aqul celulas NS obtenidas a partir de humanos (ES, CNS fetal), raton (ES, CNS fetal, CNS de adulto) y rata (CNS fetal). Las celulas madre neuronales de raton han sido cultivadas en cultivo en poblaciones puras y despues de haber sido trasplantadas crecieron sin formar tumores pero diferenciadas in vivo.

Referencias

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   Reivindicaciones

   1. Un metodo para promover la division simetrica de celulas madre neuronales que comprende cultivar dichas celulas madre neuronales unidas a un sustrato en un cultivo de monocapa adherente en un medio que contiene:

   (a) un agonista de un receptor de EGF; o

   (b) un agonista de un receptor de EGF y un agonista de un receptor de FGF,

   en donde al menos 80% de dichas celulas son celulas madre neuronales con division simetrica y en donde no mas del 1% de las celulas son positivas para la expresion de marcadores para astrocitos, neuronas u oligodendrocitos maduros.
2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde al menos 90% de dichas celulas son celulas madre neuronales con division simetrica.
3. 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde al menos 95% de dichas celulas son celulas madre neuronales con division simetrica.
4. 4. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las celulas son celulas madre neuronales son celulas madre neuronales humanas.
5. 5. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las celulas madre neuronales son celulas madre neuronales de rata.
6. 6. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las celulas madre neuronales son celulas madre neuronales de raton.
7. 7. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las celulas madre neuronales en la poblacion se caracterizan porque son positivas para la expresion de los marcadores RC2, 3CB2 y BLBP.
8. 8. Un metodo de acuerdo con cualquiera con la reivindicacion 7, en donde las celulas madre neuronales en la poblacion se caracterizan adicionalmente porque son positivas para la expresion de al menos uno de:

   GLAST, Pax-6, los marcadores de precursor neuronal nestina o vimentina, el antlgeno LewisX, Musashi-1 o prominina.
9. 9. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8, en donde las celulas madre neuronales en la poblacion se caracterizan adicionalmente porque son negativas para la expresion de al menos uno de:

   Oct4 o Nanog.
10. 10. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde las celulas madre neuronales en la poblacion son positivas para la expresion de Sox-2, y negativas para la expresion de Sox-1.
11. 11. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde las celulas madre neuronales en la poblacion estan libres de acido nucleico exogeno que codifique un oncogeno, o en donde las celulas madre neuronales no son celulas madre inmortalizadas.