ES2328345T3

ES2328345T3 - Bibliotecas universales para inmunoglobulinas.

Info

Publication number: ES2328345T3
Application number: ES03726329T
Authority: ES
Inventors: Roberto Crea
Original assignee: Bioren LLC
Current assignee: Bioren LLC
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2003-04-16
Publication date: 2009-11-12
Anticipated expiration: 2023-04-16
Also published as: CN1653335A; US20080153712A1; MXPA04010215A; WO2003088911A2; EP1499887A4; US20030228302A1; DE60328674D1; EP1499887B1; AU2003228569B2; JP2005523008A; US20110136695A1; JP4493347B2; EP1499887A2; WO2003088911A3; CA2482863A1; AU2003228569A1; ATE438852T1; NZ535927A

Abstract

Una biblioteca de aminoácido predeterminado único que comprende inmunoglobulinas de interés con seis regiones determinantes de complementariedad, incluyendo la biblioteca bibliotecas subconjunto que comprenden: a) una biblioteca subconjunto que comprende una inmunoglobulina de interés prototipo, y en la que se basan todas las mutaciones posteriores; y b) seis bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una inmunoglobulinas mutadas en las que se ha sustituido un aminoácido predeterminado único en una o más posiciones en una de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las seis regiones determinantes de complementariedad; y c) 15 bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en dos de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de dos de las seis regiones determinantes de complementariedad; y d) 20 bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en tres de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de tres de las seis regiones determinantes de complementariedad; y e) 15 bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en cuatro de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de cuatro de las seis regiones determinantes de complementariedad; y f) 6 bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en cinco de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de cinco de las seis regiones determinantes de complementariedad; y g) una biblioteca subconjunto que comprende inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo; en la que cada biblioteca subconjunto que contiene inmunoglobulinas mutadas comprende inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único está presente al menos una vez en cada posición en la región determinante de complementariedad en la que se ha introducido el aminoácido predeterminado único.

Description

Bibliotecas universales para inmunoglobulinas.

Antecedentes de la invención

La mutagénesis es una poderosa herramienta en el estudio de la función y estructura de las proteínas. Pueden realizarse mutaciones en la secuencia de nucleótidos de un gen clonado que codifica una proteína de interés y puede expresarse el gen modificado para producir mutantes de la proteína. Comparando las propiedades de una proteína de tipo natural y los mutantes generados, a menudo es posible identificar aminoácidos individuales o dominios de aminoácidos que son esenciales para la integridad estructural y/o la función bioquímica de la proteína, tal como su actividad catalítica y/o de unión. Sin embargo, el número de mutantes que pueden generarse a partir de una única proteína hace que sea difícil seleccionar mutantes que proporcionen información o tengan una propiedad deseada, incluso si los mutantes seleccionados abarcan mutaciones únicamente en regiones específicas, supuestamente importantes de una proteína (por ejemplo, regiones en o alrededor del sitio activo de una proteína). Por ejemplo, la sustitución, deleción o inserción de un aminoácido particular puede tener un efecto local o global sobre la proteína. Sigue habiendo una necesidad de un medio para evaluar los efectos de la mutagénesis de una proteína de manera sistemática.

El documento WO 91/15581 da a conocer el uso de mutagénesis "Walkthrough" (tipo de mutagénesis en la que un único aminoácido predeterminado se sustituye posición por posición a lo largo de una región definida de una proteína) para generar bibliotecas de proteínas, tales como anticuerpos. El documento US 5798208 también da a conocer la generación de bibliotecas de proteínas mutantes usando mutagénesis "Walkthrough". El documento US 5852186 da a conocer la generación de bibliotecas combinatorias jerárquicas y aleatorias de genes de inmunoglobulinas reordenados a partir de linfocitos de sangre periférica de pacientes infectados con VIH sanos. Crameri et al (Nature, Medicine, 2(1) 1996, 100-102) dan a conocer el uso del intercambio de ADN para la construcción de bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos sin tratar mediante la evolución de secuencias de anticuerpos específicas para receptores humanos. El documento US 5667988 da a conocer procedimientos para producir bibliotecas de anticuerpos, y particularmente para aumentar la diversidad de bibliotecas de anticuerpos induciendo mutagénesis dentro de las regiones CDR de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas que se presentan en la superficie de partículas de fagos filamentosos que comprende la biblioteca. El documento US 6537776 da a conocer el uso de mutagénesis por saturación de sitio para producir una biblioteca de polinucleótidos de progenie mutagenizada. Gerstner et al (J. Mol. Biol. (2002) 321, 851-862) dan a conocer bibliotecas de fago de anticuerpo hu4D5 anti-Her2.

Sumario de la invención

La invención se refiere a bibliotecas para una inmunoglobulina de interés. Las bibliotecas, basadas en una inmunoglobulina de interés prototipo, pueden generarse mediante mutagénesis "Walk-through" de la inmunoglobulina prototipo. En una realización, una biblioteca de aminoácido predeterminado único de la invención comprende inmunoglobulinas de interés mutadas en las que se ha sustituido un aminoácido predeterminado único en una o más posiciones en una o más regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina de interés; la biblioteca comprende una serie de bibliotecas subconjunto, incluyendo: a) una biblioteca subconjunto que contiene la inmunoglobulina de interés prototipo; b) seis bibliotecas subconjunto (una biblioteca subconjunto para cada una de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina de interés) que contienen inmunoglobulinas mutadas en las que se ha sustituido el aminoácido predeterminado en una o más posiciones en sólo una de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina; c) 15 bibliotecas subconjunto (una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de dos de las seis regiones determinantes de complementariedad) que contienen inmunoglobulinas mutadas en las que se ha sustituido el aminoácido predeterminado en una o más posiciones en dos de las seis regiones determinantes de complementariedad; d) 20 bibliotecas subconjunto (una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de tres de las seis regiones determinantes de complementariedad) que contienen inmunoglobulinas mutadas en las que se ha sustituido el aminoácido predeterminado en una o más posiciones en tres de las seis regiones determinantes de complementariedad; e) 15 bibliotecas subconjunto (una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de cuatro de las seis regiones determinantes de complementariedad) que contienen inmunoglobulinas mutadas en las que se ha sustituido el aminoácido predeterminado en una o más posiciones en cuatro de las seis regiones determinantes de complementariedad; f) seis bibliotecas subconjunto (una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de cinco de las seis regiones determinantes de complementariedad) que contienen inmunoglobulinas mutadas en las que se ha sustituido el aminoácido predeterminado en una o más posiciones en cinco de las seis regiones determinantes de complementariedad; y g) una biblioteca subconjunto que comprende inmunoglobulinas mutadas en las que se ha sustituido el aminoácido predeterminado en una o más posiciones en las seis regiones determinantes de complementariedad. Cada biblioteca subconjunto que contiene inmunoglobulinas mutadas contiene inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado está presente al menos una vez en cada posición en la región determinante de complementariedad en la que se ha introducido el aminoácido predeterminado.

Los aminoácidos predeterminados se seleccionan de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural. La inmunoglobulina de interés puede ser una inmunoglobulina completa, o un fragmento Fab de una inmunoglobulina, o una inmunoglobulina de cadena sencilla. La inmunoglobulina de interés puede ser cualquiera de los cinco tipos de inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA, IgD o IgE). En una realización, la inmunoglobulina de interés es un anticuerpo catalítico.

La invención se refiere además a una biblioteca universal para una inmunoglobulina de interés prototipo, comprendiendo la biblioteca universal 20 bibliotecas de "aminoácidos predeterminados únicos" tal como se describió anteriormente, una para cada uno de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural. La invención se refiere adicionalmente a bibliotecas de ácidos nucleicos que codifican las bibliotecas de aminoácidos predeterminados únicos así como a bibliotecas de ácidos nucleicos que codifican las bibliotecas universales.

Las bibliotecas descritas en el presente documento contienen inmunoglobulinas mutadas identificadas fácilmente que permiten el análisis sistemático de las regiones de unión de la inmunoglobulina de interés prototipo, y también del papel de cada aminoácido preseleccionado particular en la actividad de las regiones de unión. Las bibliotecas permiten la generación de información específica sobre mutaciones particulares que alteran la interacción de la inmunoglobulina de interés con su antígeno, incluyendo interacciones múltiples por aminoácidos en las regiones determinantes de complementariedad variables, mientras que al mismo tiempo se evitan problemas relativos al análisis de mutaciones generadas mediante mutagénesis al azar.

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Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1B representa la secuencia completa de FV de cadena sencilla frente a GP-120, tanto la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 1) como la secuencia de aminoácidos codificados (SEC ID NO: 2).

La figura 2 representa el esquema de ensamblaje global para el gen de scFV frente a GP-120 mostrado en las figuras 1A-1B.

La figura 3 resume las bibliotecas del gen de scFV obtenidas mediante los procedimientos de la invención, y el número de variantes del gen producidas para cada biblioteca individual.

La figura 4 es una tabla que representa conjuntos de oligonucleótidos para su uso en el esquema de ensamblaje mostrado en la figura 2.

Las figuras 5A-5B ilustran ejemplos de conjuntos de oligonucleótidos diseñados para introducir tres (3) aminoácidos seleccionados como diana, SER, HIS y ASP, en CDR individuales del Fv, en varias posibles combinaciones. Las secuencias de los conjuntos se facilitan usando la nomenclatura de la IUPAC de bases mixtas, mostradas en letras mayúsculas en negrita, R=A o G, Y=C o T, M=A o C, K=G o T, S=C o G, W=A o T; H=A o C o T, B=C o G o T, V=A o C o G, D=A o G o T.

La figura 6 ilustra la estrategia adoptada para el ensamblaje de genes de VL y VH con el fin de generar bibliotecas de scFV frente a GP-120 en las que tres (3) regiones CDR de las seis se mutagenizaron al mismo tiempo para producir la presencia de aminoácidos individuales seleccionados (Ser, His y Asp) en varias (8) combinaciones diferentes (de L1 a L8).

Las figuras 7A-7B ilustran 20 conjuntos de oligonucleótidos individuales, correspondiendo cada uno a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la primera región VL (la primera de las 6 regiones CDR).

Las figuras 8A-8B ilustran 20 conjuntos de oligonucleótidos individuales, correspondiendo cada uno a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la segunda región VL (la segunda de las 6 regiones CDR).

Las figuras 9A-9B ilustran 20 conjuntos de oligonucleótidos individuales, correspondiendo cada uno a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la tercera región VL (la tercera de las 6 regiones CDR).

Las figuras 10A-10B ilustran 20 conjuntos de oligonucleótidos individuales, correspondiendo cada uno a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la primera región VH (la cuarta de las 6 regiones CDR).

Las figuras 11A-11D ilustran 20 conjuntos de oligonucleótidos individuales, correspondiendo cada uno a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la segunda región VH (la quinta de las 6 regiones CDR).

Las figuras 12A-12B ilustran 20 conjuntos de oligonucleótidos individuales, correspondiendo cada uno a uno de los 20 aminoácidos naturales, para la tercera región VH (la secta de las 6 regiones CDR).

Las figuras 13A-13D muestran el agrupamiento de los conjuntos de CDR para aminoácidos individuales.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a bibliotecas de inmunoglobulinas de interés, incluyendo bibliotecas que contienen ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas, y bibliotecas que contienen las propias inmunoglobulinas. Una "inmunoglobulina", tal como se usa en el presente documento, es una proteína de anticuerpo que se genera en respuesta a, y que se une a, un antígeno específico. Hay cinco clases conocidas, o tipos, de inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgD y IgE (véase, por ejemplo, Dictionary of Cell and Molecular Biology, tercera edición). La forma básica de una inmunoglobulina es la forma de IgG: incluye dos cadenas pesadas idénticas (H) y dos cadenas ligeras idénticas (L), unidas mediante puentes disulfuro en forma de una "Y". Las cadenas pesadas comprenden cuatro dominios, incluyendo tres dominios constantes (C_{H}) y una región variable (V_{H}). Las cadenas ligeras tienen una región constante (C_{L}) y una región variable (V_{L}).

Cada región variable de cadena pesada y cada región variable de cadena ligera incluyen tres bucles hipervariables, denominados también regiones determinantes de complementariedad (CDR, "complementary-determining regions"). La región de sitio de unión al antígeno (Fv) (también denominada "bolsillo de unión") incluye estos seis bucles hipervariables (CDR) (tres en la región variable de cadena pesada (V_{H}) y tres en la región variable de cadena ligera (V_{L}) de la inmunoglobulina). Estos residuos en las CDR varían de una molécula de inmunoglobulina a la siguiente, confiriendo especificidad de antígeno a cada anticuerpo.

A continuación sigue una breve descripción de cada clase de inmunoglobulina.

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Inmunoglobulina G (IgG)

IgG es la clase de inmunoglobulina clásica; las IgG tienen un peso molecular de aproximadamente 150 kD. Tal como se indicó anteriormente, las IgG están compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos pesadas idénticas. La molécula de IgG puede descomponerse proteolíticamente en dos fragmentos Fab y un fragmento Fc. Los Fab incluyen los sitios de unión al antígeno (las regiones variables tanto de las cadenas ligeras como de las pesadas), la región constante de la cadena ligera y una de las tres regiones constantes de la cadena pesada. La región Fc está constituida por las regiones constantes restantes de las cadenas pesadas; contiene sitios de unión al complemento y de unión a células.

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Inmunoglobulina M (IgM)

Una molécula de IgM (peso molecular de aproximadamente 970 kD) está constituida por desde cinco monómeros de tipo IgG unidos entre sí, con la ayuda de cadenas J, para formar un pentámero cíclico. La IgM se une al complemento; una única molécula de IgM unida a una superficie celular puede lisar esa célula. La IgM se produce habitualmente en primer lugar en una respuesta inmunitaria antes de la IgG.

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Inmunoglobulina A (IgA)

Las IgA son una clase de inmunoglobulinas que se encuentran en secreciones externas y en el suero de mamíferos. En las secreciones, las IgA se encuentran como dímeros de monómeros de tipo IgG (dímeros que tienen un peso molecular de aproximadamente 400 kD) unidos mediante una cadena J corta y acoplados a un fragmento secretor o un fragmento de transporte; en el suero, se encuentran como monómeros (peso molecular de aproximadamente 170 kD). Las IgA son el medio principal para proporcionar inmunidad local frente a infecciones en el intestino o las vías respiratorias.

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Inmunoglobulina D (IgD)

La IgD (peso molecular de aproximadamente 184 kD) está presente a un bajo nivel en el suero, pero es una inmunoglobulina principal en la superficie de linfocitos B, en los que puede desempeñar un papel en el reconocimiento de antígenos. Su estructura se asemeja a la de la IgG pero las cadenas pesadas son del tipo \delta.

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Inmunoglobulina E (IgE)

Las IgE (peso molecular de aproximadamente 188 kD) están asociadas a reacciones de hipersensibilidad de tipo inmediato e infecciones por helmintos. Están presentes en cantidades muy bajas en el suero y en su mayor parte unidas a mastocitos y basófilos que tienen un receptor de Fc específico de IgE (Fc \varepsilon R). La IgE tiene un alto contenido en hidratos de carbono y está presente también en secreciones externas. La cadena pesada es del tipo \varepsilon.

En una realización preferida, la inmunoglobulina de interés es una inmunoglobulina de clase IgG. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "inmunoglobulina de interés" puede referirse a una inmunoglobulina intacta (es decir, una inmunoglobulina que contiene dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas). Como alternativa, una inmunoglobulina de interés también puede referirse a una parte de una inmunoglobulina (es decir, una inmunoglobulina que contiene menos de las dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas), en la que la parte contiene las regiones variables (por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento Fv) de una inmunoglobulina. En otra realización, la inmunoglobulina de interés también puede ser una inmunoglobulina "monocatenaria" o de "cadena sencilla" que contiene, por ejemplo, una única cadena pesada y una única cadena ligera unidas mediante regiones de conector, o un fragmento Fv de cadena sencilla. En una realización, por ejemplo, puede prepararse una inmunoglobulina de interés que incluye las tres regiones variables de la cadena ligera unidas (por ejemplo, con regiones de conector) a las tres regiones variables de la cadena pesada, formando una inmunoglobulina Fv de cadena sencilla. Si se desea, la inmunoglobulina de interés puede acoplarse a una molécula más grande. En una realización, puede acoplarse a una proteína, tal como una enzima, toxina o citocina. Por ejemplo, podrían acoplarse enzimas proteolíticas a las moléculas de inmunoglobulina para dirigir la actividad enzimática hacia proteínas específicas, tales como fibrina para una aplicación trombolítica, o proteína de la envuelta viral y ARN para terapia antiviral. Pueden dirigirse toxinas acopladas a inmunoglobulinas hacia células cancerosas (véanse, por ejemplo, Antibody Engineering. R. Konterman, S. Dubel (Eds.). Springer Lab manual. Spriger-Verlag. Berlín, Heidelberg (2001), capítulo 41. "Stabilization Strategies and Application of recombinant Fvs y Fv Fusion proteins". Por U. Brinkmann, págs. 593-615. et al.) y citocinas (IL2, etc.) para una aplicación antiinflamatoria, etc.

La inmunoglobulina de interés puede ser de cualquier especie que genere anticuerpos, preferiblemente un mamífero, y particularmente un ser humano; como alternativa, la inmunoglobulina de interés puede ser un anticuerpo quimérico o una estructura "consenso" o canónica generada a partir de bancos de datos de aminoácidos para anticuerpos (véase, por ejemplo, Kabat et al., J Immunol 1991 Sep 1; 147(5): 1709-19). La inmunoglobulina de interés puede ser una inmunoglobulina de tipo natural (por ejemplo, una que se aísla o puede aislarse de un organismo, tal como una inmunoglobulina que puede encontrarse en una muestra fisiológica apropiada (por ejemplo, sangre, suero, etc.) de un mamífero, particularmente un ser humano). Como alternativa, la inmunoglobulina de interés puede ser una inmunoglobulina modificada (por ejemplo, una inmunoglobulina anteriormente de tipo natural, en la que se han introducido alteraciones en una o más regiones variables y/o regiones constantes). En otra realización, la inmunoglobulina de interés puede ser una inmunoglobulina sintética (por ejemplo, preparada mediante procedimientos de ADN recombinante, en vez de aislada de un organismo). En una realización preferida, la inmunoglobulina de interés es una inmunoglobulina humana.

En una realización de la invención, la inmunoglobulina de interés es un anticuerpo catalítico. Una inmunoglobulina puede hacerse catalítica, o puede potenciarse la actividad catalítica, mediante la introducción de aminoácidos adecuados en el sitio de unión de la región variable (región Fv) de la inmunoglobulina en los procedimientos descritos en el presente documento. Por ejemplo, pueden crearse tríadas catalíticas modeladas al estilo de serina proteasas en los segmentos hipervariables de la región Fv de un anticuerpo y examinarse para determinar su actividad proteolítica. Los anticuerpos catalíticos representativos incluyen oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas; estas categorías incluyen proteasas, carbohidrasas, lipasas, dioxigenasas y peroxidasas, así como otras enzimas. Estas y otras enzimas pueden usarse para conversiones enzimáticas en atención sanitaria, productos cosméticos, alimentos, bebidas, detergentes, medioambiente (por ejemplo, tratamiento de aguas residuales), agricultura, curtido, materiales textiles y otros procesos químicos, tales como aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico, conversiones de grasas, hidratos de carbono y proteínas, degradación de contaminantes orgánicos y síntesis de compuestos químicos. Por ejemplo, podrían diseñarse proteasas terapéuticamente eficaces con actividad fibrinolítica, o actividad frente a estructuras virales necesarias para la infectividad, tales como proteínas de la envuelta viral. Tales proteasas podrían ser agentes antitrombóticos útiles o agentes antivirales frente a virus tales como SIDA, rhinovirus, influenza o hepatitis. Como alternativa, en otro ejemplo, las oxigenasas (por ejemplo, dioxigenasas), una clase de enzimas que requieren un cofactor para la oxidación de anillos aromáticos y otros dobles enlaces, tienen aplicaciones industriales en procesos de biopulpaje, conversión de biomasa en combustibles u otros compuestos químicos, conversión de contaminantes de aguas residuales, bioprocesamiento del carbón y destoxificación de compuestos orgánicos peligrosos.

Las bibliotecas de la invención se refieren a una única inmunoglobulina de interés prototipo. La inmunoglobulina "prototipo" es la inmunoglobulina (o fragmento Fab, tal como se describió anteriormente) en la cual se basan todas las mutaciones posteriores.

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Mutagénesis "Walk-through"

Para preparar las bibliotecas de la invención, se realiza "mutagénesis Walk-through" sobre la inmunoglobulina prototipo. La mutagénesis "Walk-through" se describe en detalle en las patentes estadounidenses 5.830.650 y 5.798.208.

Aunque la mutagénesis "Walk-through" es igualmente aplicable a proteínas y polipéptidos distintos de las inmunoglobulinas, se trata en el presente documento en referencia a la mutagénesis de inmunoglobulinas de interés.

En la mutagénesis "Walk-through", se genera un conjunto (biblioteca) de inmunoglobulinas en el que se incorpora un aminoácido predeterminado único al menos una vez en cada posición de una región de interés definida (o varias regiones definidas) en la inmunoglobulina (es decir, en uno o más bucles hipervariables (CDR) de las inmunoglobulinas). Las inmunoglobulinas resultantes (denominadas en el presente documento "inmunoglobulinas mutadas") difieren de la inmunoglobulina prototipo en que tienen el aminoácido predeterminado único incorporado en una o más posiciones dentro de una o más CDR de la inmunoglobulina, en lugar del aminoácido "nativo" o de "tipo natural" que estaba presente en la misma posición o posiciones en la inmunoglobulina prototipo. El conjunto de inmunoglobulinas mutadas incluye inmunoglobulinas mutadas individuales para cada posición de la región de interés definida; por tanto, para cada posición en la región de interés definida (por ejemplo, la CDR) cada inmunoglobulina mutada tiene o bien un aminoácido que se encuentra en la inmunoglobulina prototipo o bien el aminoácido predeterminado, y la mezcla de todas las inmunoglobulinas mutadas contiene todas las posibles variantes.

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El aminoácido predeterminado puede ser un aminoácido que se produce de manera natural. Los veinte aminoácidos que se producen de manera natural difieren sólo con respecto a sus cadenas laterales. Cada cadena lateral es responsable de propiedades químicas que hacen a cada aminoácido único (véase, por ejemplo, Principles of Protein Structure, 1988, por G. E. Schulz y R. M. Schimer, Springer-Verlag). Las cadenas laterales polares y neutras típicas son las de Cys, Ser, Thr, Asn, Gln y Tyr. La Gly se considera también que es un miembro límite de este grupo. La Ser y Thr desempeñan un papel importante en la formación de enlaces de hidrógeno. La Thr tiene una asimetría adicional en el carbono beta, por tanto sólo se usa uno de los estereoisómeros. La amida de ácido de Gln y Asn también puede formar enlaces de hidrógeno, funcionando los grupos amido como donadores de hidrógeno y funcionando los grupos carbonilo como aceptores. La Gln tiene un grupo CH_{2} más que la Asn, lo que hace al grupo polar más flexible y reduce su interacción con la cadena principal. La Tyr tiene un grupo hidroxilo muy polar (OH fenólico) que puede disociarse a altos valores de pH. La Tyr se comporta un tanto como una cadena lateral cargada; sus enlaces de hidrógeno son bastante
fuertes.

Se encuentran ácidos polares neutros en la superficie así como dentro de moléculas de proteína. Como residuos internos, forman habitualmente enlaces de hidrógeno entre sí o con la estructura principal del polipéptido. La Cys puede formar puentes disulfuro. La histidina (His) tiene una cadena lateral aromática heterocíclica con un valor de pK de 6,0. En el intervalo de pH fisiológico, su anillo de imidazol puede estar o bien no cargado o bien cargado, tras captar un ión hidrógeno de la disolución. Dado que estos dos estados están fácilmente disponibles, la His es bastante útil en la catalización de reacciones químicas, y se encuentra en los centros activos de muchas enzimas.

La Asp y Glu están cargadas negativamente a pH fisiológico. Debido a su cadena lateral corta, el grupo carboxilo de la Asp es bastante rígido con respecto a la cadena principal; esto puede explicar por qué el grupo carboxilo en muchos sitios catalíticos lo proporciona la Asp en vez de la Glu. Los ácidos cargados se encuentran generalmente en la superficie de una proteína.

La Lys y Arg se encuentran frecuentemente en la superficie. Tienen cadenas laterales largas y flexibles. Moviéndose en la disolución circundante, aumentan la solubilidad del glóbulo de proteína. En varios casos, la Lys y Arg toman parte en la formación de puentes salinos internos o ayudan en la catálisis. Debido a su exposición en la superficie de las proteínas, la Lys es un residuo más frecuentemente atacado por enzimas que o bien modifican la cadena lateral o bien rompen la cadena peptídica en el extremo carbonilo de residuos de Lys.

Al usar la mutagénesis "Walk-through", puede prepararse un conjunto de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNC) que codifican cada inmunoglobulina mutada. En una realización, puede prepararse un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina mutada uniendo entre sí secuencias de nucleótidos que codifican regiones de la inmunoglobulina que no se seleccionan como diana por la mutagénesis "Walk-through" (por ejemplo, regiones constantes), con secuencias de nucleótidos que codifican regiones de la inmunoglobulina que se seleccionan como diana por la mutagénesis "Walk-through" (por ejemplo, CDR). Por ejemplo, en una realización, puede prepararse un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina mutada uniendo entre sí secuencias de nucleótidos que codifican las regiones constantes de la inmunoglobulina, con secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables. Como alternativa, en otro ejemplo, puede prepararse un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina mutada uniendo entre sí secuencias de nucleótidos que codifican las regiones constantes, secuencias de nucleótidos que codifican partes de las regiones variables que no se alteran durante la mutagénesis "Walk-through" (por ejemplo, oligonucleótidos que están fuera de las CDR), y las secuencias de nucleótidos que codifican las CDR (por ejemplo, oligonucleótidos que se someten a la incorporación de nucleótidos que codifican el aminoácido predeterminado). Aún en otra realización, pueden insertarse individualmente secuencias de nucleótidos que codifican las CDR (por ejemplo, oligonucleótidos que se someten a la incorporación de nucleótidos que codifican el aminoácido predeterminado) en un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina prototipo, en lugar de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del bucle hipervariable (CDR). Si se desea, puede hacerse que las secuencias de nucleótidos que codifican las CDR contengan sitios de reconocimiento flanqueantes para enzimas de restricción (véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 4.888.286), o pueden usarse sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que se producen de manera natural. La mezcla de oligonucleótidos puede introducirse posteriormente clonándolos en una posición apropiada usando los sitios de enzimas de restricción.

Por ejemplo, puede prepararse una mezcla de oligonucleótidos, en la que cada oligonucleótido codifica o bien una CDR de la inmunoglobulina prototipo (o una parte de una CDR de la inmunoglobulina prototipo), o bien un/unos nucleótido(s) que codifica(n) el aminoácido predeterminado en lugar de uno o más aminoácidos nativos en la CDR. La mezcla de oligonucleótidos puede producirse en una única síntesis incorporando, en cada posición dentro del oligonucleótido, o bien un nucleótido requerido para la síntesis del aminoácido presente en la inmunoglobulina prototipo o bien (en lugar de ese nucleótido) un nucleótido apropiado individual requerido para un codón del aminoácido predeterminado. La síntesis de la mezcla de oligonucleótidos puede realizarse usando un sintetizador de ADN automatizado programado para suministrar o bien un nucleótido a la cámara de reacción (por ejemplo, el nucleótido presente en la inmunoglobulina prototipo en esa posición en el ácido nucleico que codifica la CDR), o bien un nucleótido diferente a la cámara de reacción (por ejemplo, un nucleótido que no está presente en la inmunoglobulina prototipo en esa posición), o bien una mezcla de los dos nucleótidos con el fin de generar una mezcla de oligonucleótidos que comprende no sólo oligonucleótidos que codifican la CDR de la inmunoglobulina prototipo, sino también oligonucleótidos que codifican la CDR de una inmunoglobulina mutada.

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Por ejemplo, pueden emplearse un total de 10 recipientes de reactivo, cuatro de los cuales contienen las bases individuales y los 6 restantes contienen todas las posibles mezclas de dos bases entre las 4 bases, para sintetizar cualquier mezcla de oligonucleótidos para el procedimiento de mutagénesis "Walk-through". Por ejemplo, el sintetizador de ADN puede diseñarse para que contenga las siguientes diez cámaras:

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TABLA 1 Sintones para la síntesis de ADN automatizada

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Con esta disposición, puede sustituirse cualquier nucleótido por uno cualquiera de una combinación de dos nucleótidos en cualquier posición de la secuencia. Como alternativa, si es posible mezclar bases individuales en las líneas del sintetizador de oligonucleótidos, la máquina puede programarse para que extraiga de dos o más depósitos de bases puras para generar la proporción deseada de nucleótidos.

En una realización, los dos nucleótidos (es decir, el nucleótido de tipo natural y un nucleótido de tipo no natural) se usan en concentraciones aproximadamente iguales para la reacción de modo que hay una probabilidad igual de incorporar cualquiera de ellos en la secuencia en la posición. Como alternativa, la proporción de las concentraciones de los dos nucleótidos puede alterarse para aumentar la probabilidad de que uno u otro se incorpore en el oligonucleótido. Las alteraciones en la proporción de las concentraciones (denominadas en el presente documento "dopado") se tratan en mayor detalle en el documento US 20040033569 A.

En otra realización, puede usarse la química de beta-cianoetil-fosforamidita en fase sólida en lugar de síntesis de ADN automatizada para la generación de los oligonucleótidos descritos anteriormente (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 4.725.677).

Como alternativa, en otra realización, puede usarse la expresión de ribosomas (véanse, por ejemplo, Hanes y Pluckthun, "In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display", Proc. Natl. Acad Sci. USA, 94:4937-4942 (1997); Roberts y Szostak, "RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins", Proc. Natl. Acad Sci. USA, 94: 12297-12302 (1997); Hanes et al., "Picomolar affinity antibodies from a fully synthetic naive library elected and evolved by ribosome display", Nature Biochemistry 18:1287-1292 (2000)).

Puede prepararse entonces una biblioteca que contiene ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas mutadas a partir de tales oligonucleótidos, tal como se describió anteriormente, y puede generarse entonces una biblioteca que contiene inmunoglobulinas mutadas a partir de los ácidos nucleicos, usando técnicas convencionales. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas mutadas pueden introducirse en una célula huésped para su expresión (véanse, por ejemplo, Huse, W. D. et al., Science 246:1275 (1989); Viera, J. et al., Meth. Enzymol. 153: 3 (1987)). Los ácidos nucleicos pueden expresarse, por ejemplo, en un sistema de expresión de E. coli (véanse, por ejemplo, Pluckthun, A. y Skerra, A., Meth. Enzymol. 178:476-515 (1989); Skerra, A. et al., Biotechnology 9:23-278 (1991)). Pueden expresarse para su secreción en el medio y/o en el citoplasma de las bacterias (véase, por ejemplo, Better, M. y Horwitz, A., Meth. Enzymol. 178:476 (1989)); como alternativa, pueden expresarse en otros organismos tales como células de levadura o de mamíferos (por ejemplo, células de mieloma o hibridoma).

Un experto en la técnica entenderá que pueden emplearse numerosos procedimientos de expresión para producir las bibliotecas descritas en el presente documento. Fusionando el gen (la biblioteca) a elementos genéticos adicionales, tales como promotores, terminadores y otras secuencias adecuadas que facilitan la transcripción y traducción, puede lograrse la expresión in vitro (presentación en ribosomas) tal como se describe por Pluckthun et al. (Pluckthun, A. y Skerra, A., Meth. Enzymol. 178:476-515 (1989)). De manera similar, pueden obtenerse la presentación en fago, expresión bacteriana, expresión en células de insecto infectadas por baculovirus, en hongos (levaduras), en plantas y en células de mamífero tal como se describe (Antibody Engineering. R. Konterman, S. Dubel (Eds.). Springer Lab Manual. Spriger-Verlag. Berlín, Heidelberg (2001), capítulo 1, "Recombinant Antibodies" by S. Dubel and R. E. Konterman. págs. 4-16). También pueden fusionarse bibliotecas de scFV a otros genes para producir proteínas quiméricas con restos de unión (Fv) y otras funciones, tales como catalíticas, citotóxicas, etc. (Antibody Engineering. R. KONTERMAN, S. Dubel (Eds.). Springer Lab Manual. Spriger-Verlag. Berlín, Heidelberg (2001), capítulo 41. Stabilization Strategies and Application of recombinant Fvs and Fv Fusion proteins. Por U. Brinkmann, págs.
593-615).

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Preparación de la biblioteca universal

Para generar una biblioteca para la inmunoglobulina de interés, se realiza mutagénesis "Walk-through" usando un aminoácido predeterminado único para la inmunoglobulina prototipo, produciendo bibliotecas de ácidos nucleicos individuales que comprenden nucleótidos que codifican inmunoglobulinas mutadas (y también nucleótidos que codifican inmunoglobulina prototipo). Las bibliotecas de ácidos nucleicos pueden traducirse para formar bibliotecas de aminoácidos que comprenden proteínas de inmunoglobulina mutada (denominadas en el presente documento "bibliotecas de aminoácidos predeterminados únicos"). Cada biblioteca de aminoácido predeterminado único contiene 64 bibliotecas subconjunto, en las que el aminoácido predeterminado se somete a mutagénesis "walkthrough" en cada bucle hipervariable (CDR) de la inmunoglobulina de interés (es decir, los tres bucles hipervariables en la región variable de la cadena pesada (VH1, VH2 y VH3), y en los tres bucles hipervariables en la región variable de la cadena ligera (VL1, VL2 y VL3)). Las inmunoglobulinas resultantes incluyen inmunoglobulinas mutadas que tienen el aminoácido predeterminado en una o más posiciones en cada CDR, y que tienen colectivamente el aminoácido predeterminado en cada posición en cada CDR. El aminoácido predeterminado único se somete a mutagénesis "walkthrough" en cada uno de los seis bucles hipervariables (CDR) individualmente; y luego a través de cada una de las posibles variaciones combinatorias de las CDR (pares, tríadas, tétradas, etc.). Las posibles variaciones combinatorias se exponen en la
tabla 2:

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TABLA 2 Bibliotecas subconjunto para cada biblioteca de aminoácido predeterminado único

3

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Total: 63 bibliotecas subconjunto. Una 64ª biblioteca subconjunto incluye la inmunoglobulina prototipo.

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Para preparar una biblioteca "universal" para la inmunoglobulina de interés prototipo, se realiza mutagénesis "Walk-through" usando un aminoácido predeterminado único para la inmunoglobulina prototipo, para cada uno de los veinte aminoácidos naturales, produciendo 20 "bibliotecas de aminoácidos predeterminados únicos" individuales, tal como se describió anteriormente. Estas 20 "bibliotecas de aminoácidos predeterminados únicos" individuales forman colectivamente una biblioteca universal para la inmunoglobulina de interés.

Por tanto, en total, la biblioteca universal para una inmunoglobulina de interés contiene 20 bibliotecas (de aminoácidos predeterminados únicos) que incluyen cada una 64 bibliotecas subconjunto, para un total de 1208 bibliotecas.

Usos de las bibliotecas

Las bibliotecas tal como se describen en el presente documento contienen inmunoglobulinas mutadas que se han generado de una manera que permite un análisis sistemático y concienzudo de las regiones de unión de la inmunoglobulina prototipo y, particularmente, de la influencia de un aminoácido preseleccionado particular sobre las regiones de unión. Las bibliotecas evitan problemas referentes al control o la predicción de la naturaleza de una mutación asociados a la mutagénesis al azar; permiten la generación de información específica sobre las mutaciones particulares que permiten una interacción alterada de la inmunoglobulina de interés con su antígeno, incluyendo interacciones múltiples mediante aminoácidos en las regiones determinantes de complementariedad variables.

Las bibliotecas pueden examinarse por medios apropiados para detectar inmunoglobulinas particulares que tienen características específicas. Por ejemplo, puede determinarse la actividad catalítica mediante ensayos adecuados para detectar la conversión de sustratos y puede evaluarse la actividad de unión mediante cromatografía de afinidad y/o inmunoensayo convencional. Pueden diseñarse ensayos para determinar estas actividades en los que una célula requiere la actividad deseada para su crecimiento. Por ejemplo, al examinar para detectar inmunoglobulinas que tienen una actividad particular, tal como la capacidad de degradar compuestos tóxicos, la incorporación de niveles letales del compuesto tóxico en placas con nutrientes permitiría solamente el crecimiento de células que expresan una actividad que degrada el compuesto tóxico (Wasserfallen, A., Rekik, M., y Harayama, S., Biotechnology 9: 296-298 (1991)). También pueden examinarse las bibliotecas para detectar otras actividades, tal como para detectar una capacidad para seleccionar como diana o destruir patógenos. Pueden diseñarse ensayos para detectar estas actividades en los que el patógeno de interés se expone al anticuerpo, y pueden seleccionarse anticuerpos que muestran la propiedad deseada (por ejemplo, destrucción del patógeno).

La información relativa al efecto del aminoácido específico incluido en las regiones CDR, como sustituciones o bien de un único aminoácido o bien de múltiples aminoácidos, proporciona información única sobre el efecto específico de un aminoácido dado relacionada con la afinidad y especificidad entre el anticuerpo y el antígeno (optimización o maduración del anticuerpo).

Además, la presencia o el enriquecimiento de aminoácidos específicos en las regiones de unión de una molécula de anticuerpo (inmunoglobulina) proporciona nuevas secuencias (dominios de aminoácidos) que pueden interaccionar con una variedad de nuevos antígenos para el descubrimiento de anticuerpos.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para el fin de ilustrar la presente invención y no debe interpretarse que limitan el alcance de esta invención.

Ejemplos A. Material y procedimientos

El siguiente ejemplo ilustra la síntesis de bibliotecas génicas mediante la mutagénesis "Walk-through" (WTM) incluyendo el diseño y la síntesis de bibliotecas de aminoácidos universales. La construcción de estas bibliotecas se basó en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo monoclonal humano anti-GP120 de VIH, específicamente limitada a sus regiones Fv (VL y VH), diseñadas como cadena sencilla (scFV). La secuencia de aminoácidos de las regiones VL y VH del anticuerpo monoclonal frente a GP-120 se obtuvo mediante una secuencia humana publicada en la bibliografía (Antibody Engineering. R. KONTERMAN, S. Dubel (Eds.). Springer Lab Manual. Spriger-Verlag. Berlín, Heidelberg (2001), capítulo 1, "Recombinant Antibodies" por S. Dubel y R. E. Konterman. págs. 4-16.).

Las figuras 1A-1B muestran la secuencia completa (aminoácidos y ADN) del Fv frente a GP-120 organizado como cadena sencilla (scFv). Se obtuvo la secuencia de ADN completa conectando artificialmente el extremo C-terminal del gen de VL al extremo N-terminal del gen de VH con una secuencia de ADN que codificaba un péptido sintético (G4S)3 tal como se notificó anteriormente (Huston, JS, Levinson D, Mudgett-Hunter M, Tai MS, Novotny J, Margulis MN, Ridge RJ, Bruccoleri RE, Haber EC, Crea R, y Opperman H, Protein engineering of antibody binding site: recovery of specific activity in an anti-digioxin single-chain Fv analogue produced in E. Coli. Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883, 1988; Bird RE, Hardman KD, Jacobson JW, Johnson S, Kaufman BM, Lee SM, Pope SH, Riordan GS y Witlow M, Single-chain antigen binding proteins. Science 242, 423-426, 1988.). Las secuencias de aminoácidos de VL y VH se numeran según Kabat et al. (Kabat EA, Wu TT, Reid-Miller M, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C, (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest. 5ª edición. Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU. ("US Department Of Health and Human Services"), servicio público, NIH.). Las regiones CDR (L1, L2, L3 y H1, H2, H3) se muestran en negrita.

Se rediseñó la secuencia de ADN para VL y VH para hacer uso de los codones de aa más frecuentes en E. coli. Además, se incluyeron varios sitios de enzimas de restricción en la secuencia para facilitar el análisis de R.E. También se incorporaron extremos cohesivos en 5' (Xba1, HindIII y Sal I) y dos codones para la terminación (TAA, TAG) en la secuencia del gen de scFV para facilitar su clonación, secuenciación y expresión en plásmidos comerciales fácilmente disponibles.

Se obtuvo el esquema de ensamblaje global para el gen de scFV frente a GP-120 a partir de oligonucleótidos sintéticos, tal como se muestra esquemáticamente en la figura 2. Se diseñó el ensamblaje completo para que incluyera la fusión (acoplamiento) de genes de VL y VH ensamblados independientemente. Se logró esto último mediante acoplamiento enzimático (ligasa de T4) de oligonucleótidos sintéticos solapantes de manera apropiada tal como se muestra en la figura 4. El aislamiento de los genes de VL y VH mediante electroforesis en gel preparativa y acoplamiento adicional mediante la ayuda de oligonucleótidos sintéticos (n.º 174, 175, 177 y 189) que codifican el conector (G4S)3 en presencia de ligasa proporcionó el constructo de scFv.

Se realizó la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador Eppendorf D-300 siguiendo el procedimiento proporcionado por el vendedor. Se purificó cada oligonucleótido mediante electroforesis en gel, se desaló mediante un pase rápido a través de una minicolumna a base de Sephadex y se almacenó individualmente a una concentración igual a 5 u de D.O./ml.

Se realizó el acoplamiento enzimático de los genes de VL y VH en condiciones convencionales (Maniatis et al.) en las que todos los oligonucleótidos de VL y VH, con la excepción del extremo 5' de hebras superiores e inferiores, se fosforilaron en primer lugar mediante la quinasa de T-4, y se usaron en concentración equimolar para el ensamblaje génico en presencia de ligasa de T4 y ATP. Se obtuvo el ensamblaje final de scFV mediante el acoplamiento de una cantidad equimolar de VL y VH en presencia de un exceso (10x) de los conectores de oligo. Se amplificó en primer lugar el scFV final mediante el uso de ADN polimerasa en presencia de NTP y los fragmentos n.º 201 y n.º 103, y luego se purificó mediante electroforesis en gel preparativa.

Se confirmó la exactitud del gen de scFV mediante análisis de secuenciación de ADN, usando un secuenciador de ADN automático de Applied Biosystems, siguiendo condiciones convencionales proporcionadas por el vendedor.

Para generar bibliotecas de genes de scFV frente a GP-120 que contienen aminoácidos seleccionados en algunas de las regiones CDR de la proteína scFv, se diseñaron y sintetizaron conjuntos de oligonucleótidos sintéticos correspondientes a las regiones CDR diana siguiendo las normas dictadas por el procedimiento de mutagénesis "Walk through" (tal como se describe en el presente documento; véanse también las patentes estadounidenses 5.830.650 y 5.798.208) usando un sintetizador Eppendorf D300.

La figura 5 ilustra ejemplos de conjuntos de oligonucleótidos diseñados para introducir tres (3) aminoácidos seleccionados como diana, SER, HIS y ASP, en CDR individuales del Fv, en varias combinaciones posibles. Se produjeron los conjuntos de oligonucleótidos mezclando una cantidad igual de fosforamidatos de nucleósidos activados durante la síntesis química. Las secuencias conjunto en la figura 5 se facilitan usando la nomenclatura de la IUPAC de bases mixtas (mostradas en letras mayúsculas en negrita, R = A o G, Y = C o T, M = A o C, K = G o T, S = C o G, W = A o T; H = A o C o T, B = C o G o T, V = A o C o G, D = A o G o T).

La figura 6 ilustra la estrategia adoptada para el ensamblaje del gen de VL y VH con el fin de generar bibliotecas de scFV frente a GP-120 en las que se mutagenizaron al mismo tiempo tres (3) regiones CDR de las seis, para producir la presencia de aminoácidos individuales seleccionados (Ser, His y Asp) en varias (8) combinaciones diferentes (de L1 a L8).

La figura 3 resume las bibliotecas de genes de scFV resultantes obtenidas mediante la estrategia anterior y el número de variantes génicas producidas para cada biblioteca individual.

Pueden clonarse bibliotecas de scFV individuales en plásmidos de expresión y/o secuenciación adecuados. Por tanto, pueden obtenerse en consecuencia la expresión génica y el análisis de secuenciación. En este ejemplo, se empleó un plásmido pFLAG como plásmido de secuenciación, mientras que se usó el plásmido pCANTAB 5E para obtener la expresión de las bibliotecas de genes de scFV en E. coli (espacio periplásmico).

B. Diseño y síntesis de bibliotecas de aminoácidos universales

Usando los procedimientos descritos anteriormente, pueden diseñarse 20 conjuntos de oligonucleótidos individuales, correspondiendo cada uno a uno de los 20 aminoácidos naturales, para cada una de las seis CDR, tal como se ilustra en las figuras 7-12. A partir de la recopilación de estos conjuntos de oligo, pueden usarse los seis (6) conjuntos correspondientes a cada aminoácido seleccionado (cualquiera de los 20 aminoácidos naturales) en cualquier disposición combinatoria posible para mutagenizar las regiones CDR correspondientes del gen de scFV.

La figura 13 muestra el agrupamiento de los conjuntos de CDR para aminoácidos individuales. Pueden usarse los seis conjuntos en cualquier fórmula combinatoria, desde la sustitución de una única CDR (seis bibliotecas individuales) hasta la saturación total (las seis regiones CDR mutagenizadas) y cualquier combinación entre ellas, tal como se describió anteriormente.

Todas y cada una de las bibliotecas resultantes (63 en total + una secuencia de tipo natural) sólo contendrá conjunto(s) de oligonucleótidos diseñados para proporcionar un aminoácido seleccionado, que por tanto se distribuye sistemáticamente en las seis regiones CDR del gen de scFV, tal como se describió anteriormente. Como resultado de este esquema sintético, se obtendrán bibliotecas génicas que contienen con preponderancia un aminoácido seleccionado, distribuido a lo largo de las seis regiones CDR de cualquier modo combinatorio, como entidades individuales y bibliotecas separadas.

Aunque la presente invención se ha mostrado y descrito en particular con referencias a realizaciones preferidas de la misma, los expertos en la técnica entenderán que pueden hacerse en la misma diversos cambios en forma y detalles, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención tal como se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Una biblioteca de aminoácido predeterminado único que comprende inmunoglobulinas de interés con seis regiones determinantes de complementariedad, incluyendo la biblioteca bibliotecas subconjunto que comprenden:

a): una biblioteca subconjunto que comprende una inmunoglobulina de interés prototipo, y en la que se basan todas las mutaciones posteriores; y

b): seis bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una inmunoglobulinas mutadas en las que se ha sustituido un aminoácido predeterminado único en una o más posiciones en una de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las seis regiones determinantes de complementariedad; y

c): 15 bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en dos de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de dos de las seis regiones determinantes de complementariedad; y

d): 20 bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en tres de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de tres de las seis regiones determinantes de complementariedad; y

e): 15 bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en cuatro de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de cuatro de las seis regiones determinantes de complementariedad; y

f): 6 bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en cinco de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de cinco de las seis regiones determinantes de complementariedad; y

g): una biblioteca subconjunto que comprende inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo;

en la que cada biblioteca subconjunto que contiene inmunoglobulinas mutadas comprende inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único está presente al menos una vez en cada posición en la región determinante de complementariedad en la que se ha introducido el aminoácido predeterminado único.

2. Una biblioteca de aminoácido predeterminado único que comprende ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas de interés con seis regiones determinantes de complementariedad, incluyendo la biblioteca bibliotecas subconjunto que comprenden:

a): una biblioteca subconjunto que comprende ácidos nucleicos que codifican una inmunoglobulina de interés prototipo en la que se basan todas las mutaciones posteriores; y

b): seis bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas mutadas en las que se ha sustituido un aminoácido predeterminado único en una o más posiciones en una de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las seis regiones determinantes de complementariedad; y

c): 15 bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en dos de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de dos de las seis regiones determinantes de complementariedad; y

d): 20 bibliotecas subconjunto que comprenden ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en tres de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de tres de las seis regiones determinantes de complementariedad; y

e): 15 bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en cuatro de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de cuatro de las seis regiones determinantes de complementariedad; y

f): 6 bibliotecas subconjunto, comprendiendo cada una ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en cinco de las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo, con una biblioteca subconjunto para cada una de las posibles combinaciones de cinco de las seis regiones determinantes de complementariedad; y

g): una biblioteca subconjunto que comprende ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único se ha sustituido en una o más posiciones en las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina prototipo;

en la que cada biblioteca subconjunto que contiene ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas mutadas comprende ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas mutadas en las que el aminoácido predeterminado único está presente al menos una vez en cada posición en la región determinante de complementariedad en la que se ha introducido el aminoácido predeterminado único.

3. La biblioteca según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la inmunoglobulina de interés es un anticuerpo catalítico; IgG; IgM; IgA; IgD; IgE; un fragmento Fab de una inmunoglobulina; o una inmunoglobulina de cadena sencilla.

4. Una biblioteca universal que comprende:

: veinte bibliotecas de aminoácidos predeterminados únicos constituidas por una biblioteca de aminoácido predeterminado único según la reivindicación 1, 2 ó 3 para cada uno de los veinte aminoácidos que se producen de manera natural.