ES2327972T3 - Derivados de aminofenil como nuevos inhibidores de histona deacetilasa. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula (I), ** ver fórmula** las formas N-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y sus formas isoméricas estereoquímicas, en el que n es un número entero con valor 0, 1 ó 2 y cuando n es 0, entonces se espera que sea un enlace directo; m es un número entero con valor 1 ó 2; X es N o CH; Y es O, S o NR 8 ; donde R 8 es hidrógeno, alquilo C 1-6, alquil C 1-6-oxi-alquilo C 1-6, cicloalquilo C 3-6, cicloalquil C 3-6-metilo, fenil- alquilo C1-6, -C(=O)-CHR 9 R 10 o -S(=O)2-N(CH3)2; donde cada R 9 y R 10 es independientemente hidrógeno, amino, alquilo C 1-6 o amino-alquilo C 1-6; y cuando Y es NR 8 y R 2 está en la posición 7 del indolilo, entonces R 2 y R 8 juntos pueden formar el radical bivalente -(CH 2) 2- (a-1) o -(CH2)3- (a-2); R 1 es hidrógeno, alquilo C1-6, hidroxi-alquilo C1-6, ciano-alquilo C1-6, alquil C1-6-sulfonilo, alquil C1-6-carbonilo, o mono- o di-(alquil C1-6)-aminosulfonilo; R 2 es hidrógeno, hidroxi, amino, halo, alquilo C 1-6, ciano, alquenilo C 2-6, polihalo-alquilo C 1-6, nitro, fenilo, alquil C 1-6-carbonilo, hidroxicarbonilo, alquil C 1-6-carbonilamino, alquil C 1-6-oxi, o mono- o di-(alquil C 1-6)amino; R 3 es hidroxi o amino; R 4 es hidrógeno, tienilo, furanilo o fenilo y cada tienilo, furanilo o fenilo puede estar opcionalmente sustituido con halo, amino, nitro, ciano, hidroxi, fenilo, alquilo C1-6, (di-alquil C1-6)-amino, alquilo C1-6-oxi, fenil-alquil C1-6oxi, hidroxi-alquilo C1-6, alquil C1-6-oxicarbonilo, hidroxicarbonilo, alquil C1-6-carbonilo, polihalo-alquil C1-6-oxi, polihalo-alquilo C1-6, alquil C1-6-sulfonilo, hidroxicarbonil-alquilo C1-6, alquil C1-6-carbonilamino, aminosulfonilo, aminosulfonil-alquilo C 1-6, isoxazolilo, aminocarbonilo, fenil-alquenilo C 2-6, fenil-alquinilo C 3-6 o piridinil-C 3-6 alquinilo; R 5 , R 6 y R 7 son cada uno independientemente hidrógeno, amino, nitro, furanilo, halo, alquilo C1-6, alquil C1-6-oxi, trifluorometilo, tienilo, fenilo, alquil C1-6- carbonilamino, aminocarbonil-alquilo C1-6 o -C*-CH2-R 11 .
Description
Derivados de aminofenil como nuevos inhibidores
de histona deacetilasa.
Esta invención se refiere a compuestos que
tienen actividad enzimática inhibidora de histona desacetilasa
(HDAC). También está relacionada con procesos para su preparación,
con las composiciones que los comprenden, así como su uso, tanto
in vitro como in vivo, para inhibir HDAC y como una
medicina, por ejemplo, como una medicina para inhibir afecciones
proliferativas, tales como el cáncer y la psoriasis.
Se sabe que las histonas nucleares son
componentes integrales y dinámicos de la maquinaria responsable de
regular la transcripción de genes y otros procesos del ADN plantilla
tal como la replicación, reparación, recombinación y segregación de
los cromosomas. Son objeto de modificaciones
post-traslación, incluyendo a la acetilación,
fosforilación, metilación, ubiquitinación y
ADP-ribosilación.
La(s) histona(s)
desacetilasa(s), denominada(s) en este documento
"HDAC", son enzimas que catalizan la eliminación de la
modificación de acetilo en residuos de lisina de proteínas,
incluyendo las histonas nucleosómicas nucleares H2A, H2B, H3 y H4.
Junto con la(s) histona(s)
acetiltransferasa(s), llamadas en este documento "HAT",
las HDAC regulan el nivel de acetilación de las histonas. El
equilibrio de acetilación de las histonas nucleosómicas desempeña
un papel importante en la transcripción de muchos genes. La
hipoacetilación de histonas tiene que ver con la estructura de
cromatina condensada que causa la represión de la transcripción de
los genes, mientras que las histonas acetiladas tienen que ver con
una estructura de cromatina más abierta y la activación de la
transcripción.
Se han descrito once HDAC estructuralmente
relacionadas y se dividen en dos clases. Las HDAC clase I consisten
en HDAC 1, 2, 3, 8 y 11 mientras que las HDAC clase II consisten en
HDAC 4, 5, 6, 7, 9 y 10. Los miembros de una tercera clase de HDAC
no están estructuralmente relacionados con las HDAC clase I y clase
II. Las HDAC clase I/II funcionan por mecanismos dependientes del
cinc, mientras que la HDAC clase III depende del NAD.
Además de las histonas, también han sido
sustrato para la acetilación otras proteínas, en factores de
transcripción particulares tales como p53, GATA-1 y
E2F; receptores nucleares tales como el receptor de
glucocorticoides, los receptores de tiroides, los receptores de
estrógenos; y proteínas reguladoras del ciclo celular tales como
las pRb. La acetilación de proteínas se ha relacionado con la
estabilización de proteínas, tal como la estabilización de p53, el
reclutamiento de cofactores y la mayor unión del ADN. p53 es un
supresor tumoral que puede inducir a la detención del ciclo celular
o a la apoptosis como respuesta a una variedad de señales de
estrés, tal como el daño al ADN. El objetivo principal para la
detención de ciclo celular inducida por p53 parece ser el gen p21.
Junto con su activación por p53, se ha identificado que p21, en
virtud de su asociación con complejos de quinasa dependientes de
ciclina/ciclina que causan la detención del ciclo celular tanto como
en fases G1 como G2, su regulación durante la senectud, y su
interacción con el antígeno nuclear celular proliferante.
El estudio de inhibidores de las HDAC indica que
desempeñan un papel importante en la detención del ciclo celular,
la diferenciación celular, la apoptosis y la inversión de fenotipos
transformados.
El inhibidor de tricostatina A (TSA), por
ejemplo, causa la detención del ciclo celular tanto en la fase G1
como en la G2, devuelve el fenotipo transformado de diferentes
líneas celulares, e induce la diferenciación de células de leucemia
Friend y otras. Se ha descubierto que la TSA (y el ácido hidroxámico
suberoilanilida, SAHA) inhibe el crecimiento celular, induce la
diferenciación terminal, y previene la formación de tumores en
ratones (Finnin et al., Nature, 401:
188-193, 1999).
También se ha descubierto que la Tricostatina A
es útil en el tratamiento de la fibrosis, p.ej la fibrosis hepática
y cirrosis hepática. (Geerts et al., solicitud de patente
europea EP 0 827742, publicada el 11 de marzo de 1998).
El farmacóforo para los inhibidores de HDAC
consiste en un dominio de unión metálico, que se relaciona con el
sitio activo que contiene cinc de las HDAC, un dominio enlazante, y
un dominio de reconocimiento superficial o región cubierta, que
está interacciona con residuos en el borde del sitio activo.
También se ha descubierto que los inhibidores de
las HDAC inducen la expresión de los genes p21. La activación
transcripcional del gen p21 por estos inhibidores está promovida por
la remodelación de la cromatina, siguiendo la acetilación de las
histonas H3 y H4 en la región promotora de p21. Esta activación de
p21 ocurre de una manera independiente de p53 y así los inhibidores
de HDAC están operativos en células con genes de p53 transformados,
el sello de numerosos tumores.
Además, los inhibidores de HDAC pueden tener
actividades indirectas tales como el aumento de las respuestas
inmunes del huésped y la inhibición de la angiogenesis tumoral y así
pueden suprimir el crecimiento de tumores primarios e impedir la
metástasis (Mai et al., Medicinal Research Reviews,
25: 261-309, 2005).
En vista de lo anterior, los inhibidores de HDAC
pueden tener un gran potencial en el tratamiento de enfermedades o
afecciones de células proliferativas, incluyendo los tumores con
genes p53 mutados.
\newpage
La solicitud de patente EP1472216 publicada el
14 de agosto de 2003 describe hidroxamatos bicíclicos como
inhibidores de histona desacetilasa.
Las solicitudes de patente EP1485099, EP1485348,
EP1485353, EP1485354, EP1485364, EP1485365, EP
1485370, EP1485378 publicadas el 18 de Sep., 2003, entre otras, describen ácidos piperazinil-pirimidinil-hidroxámicos sustituidos como inhibidores de histona desacetilasa; además el documento EP1485365 describe a R306465.
1485370, EP1485378 publicadas el 18 de Sep., 2003, entre otras, describen ácidos piperazinil-pirimidinil-hidroxámicos sustituidos como inhibidores de histona desacetilasa; además el documento EP1485365 describe a R306465.
La solicitud de patente EP1492534, publicada el
9 de octubre de 2003, describe compuestos de ácido carbámico que
comprenden un enlace de piperazina, como inhibidores de HDAC.
La solicitud de patente EP1501508, publicada el
13 de noviembre de 2003, describe benzamidas, como inhibidores de
histona desacetilasa.
La solicitud de patente EP1495002, publicada el
23 de octubre de 2003, describe compuestos de
piperazinil-fenil-benzamida
sustituidos, como inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente EP1501508, publicada el
13 de noviembre de 2003, describe benzamidas, como inhibidores de
histona desacetilasa.
La solicitud de patente WO04/009536, publicada
el 29 de enero de 2004, describe derivados que contienen un
enlzante de alquilo entre el grupo arilo y el hidroxamato, como
inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente EP1525199, publicada el
12 de febrero de 2004, describe hidroxamatos bicíclicos sustituidos
con (hetero)arilalquenilo, como inhibidores de histona
desacetilasa.
La solicitud de patente EP1572626, publicada el
24 de junio de 2004, describe derivados
(2-amino-fenil)-amídicos
de ácidos arilen-carboxílicos como agentes
farmacológicos.
La solicitud de patente EP1581484, publicada el
29 de julio de 2004, describe derivados de derivados de
N-hidroxi-benzamida con actividad
anti-inflamatoria y antitumoral.
La solicitud de patente EP1585735, publicada el
29 de julio de 2004, describe derivados de hidroxamato de arilo
sustituidos como inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente EP1592667, publicada el
19 de agosto de 2004, describe derivados
O-fenilendiamínicos monoacilados como agentes
farmacológicos.
La Solicitud de patente EP1590340, publicada el
19 de agosto de 2004, describe derivados diaminofenilénicos como
inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente EP1592665, publicada el
26 de agosto de 2004, describe derivados benzamídicos como
inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente WO04/072047, publicada
el 26 de agosto de 2004, describe índoles, bencimidazoles y
naftimidazoles como inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente EP1608628, publicada el
30 Sep. de 2004, describe hidroxamatos unidos a sistemas de anillo
heterocíclicos no aromáticos como inhibidores de histona
desacetilasa.
La solicitud de patente EP1613622, publicada el
14 de octubre de 2004, describe derivados de oxima, como inhibidores
de histona desacetilasa.
La solicitud de patente EP1611088, publicada el
28 de octubre de 2004, describe derivados de hidroxamato como
inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente WO05/028447, publicada
el 31 de marzo de 2005, describe benzimidazoles como inhibidores de
histona desacetilasa.
Las solicitudes de patente WO05/030704 y
WO05/030705, publicadas el 7 de abril de 2005, describen benzamidas
como inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente WO05/040101, publicada
el 6 de mayo de 2005, describe hidroxamatos conectados de acilurea
y conectados de sulfonilurea como inhibidores de histona
desacetilasa.
La solicitud de patente WO05/040161, también
publicada el 6 de mayo de 2005, describe hidroxamatos unidos a
biarilo como inhibidores de histona desacetilasa.
\newpage
La solicitud de patente WO05/075469, publicada
el 18 de agosto de 2005, describe ácidos
tiazolil-hidroxámicos y ácidos
tiadiazolil-hidroxámicos como inhibidores de histona
desacetilasa.
La solicitud de patente WO05/086898, publicada
el 22 de septiembre de 2005, describe ácidos hidroxámicos
heteropentacíclicos como inhibidores de histona desacetilasa.
La solicitud de patente WO05/092899, publicada
el 6 de octubre de 2005, describe alquenilbenzamidas como histona
desacetilasas.
Los compuestos de la presente invención se
diferencian de la técnica anterior en su estructura, en su actividad
farmacológica y/o su potencia farmacológica.
El problema que se soluciona es proporcionar
inhibidores de histona desacetilasa con alta actividad enzimática y
celular que tienen mayor biodisponibilidad y/o potencia in
vivo.
Los nuevos compuestos de la presente invención
solucionan el anterior problema descrito. Los compuestos de la
presente invención muestran una actividad celular útil. Tienen una
alta capacidad para activar el gen p21, tanto a nivel celular como
in vivo. Pueden tener un perfil farmacocinético deseable y
una baja afinidad para las enzimas P450, lo que reduce el riesgo de
la interacción adversa fármaco-fármaco lo que
permite también un margen de seguridad más amplio. Las ventajosas
características de los presentes compuestos son la estabilidad
metabólica, la solubilidad y/o la capacidad de inducción de p21. Más
en particular, los compuestos de la presente invención tienen una
mayor solubilidad en soluciones acuosas y/o tienen mayores
capacidades inductoras del promotor p21 in vivo.
Esta invención se refiere a compuestos de
fórmula (I):
\vskip1.000000\baselineskip
las formas N-óxido, las sales de
adición farmacéuticamente aceptables y sus formas isoméricas
estereoquímicas, en las
que
n es un número entero con valor 0, 1 ó 2, y,
cuando n es 0, entonces se espera que sea un enlace directo;
m es un número entero con valor 1 ó 2;
X es N o CH;
Y es O, S o NR^{8}; donde
R^{8} es hidrógeno, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi-alquilo
C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6},
cicloalquil C_{3-6}-metilo,
fenil- alquilo C_{1-6},
-C(=O)-CHR^{9}R^{10} o
-S(=O)_{2}-N(CH_{3})_{2};
donde
cada R^{9} y R^{10} es independientemente
hidrógeno, amino, alquilo C_{1-6} o
amino-alquilo C_{1-6}; y
cuando Y es NR^{8} y R^{2} está en la
posición 7 del indolilo, entonces R^{2} y R^{8} juntos pueden
formar el radical bivalente
- -(CH_{2})_{2}-
- (a-1) o
- -(CH_{2})_{3}-
- (a-2);
R^{1} es hidrógeno, alquilo
C_{1-6}, hidroxi-alquilo
C_{1-6}, ciano-alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-sulfonilo, alquil
C_{1-6}-carbonilo, o mono- o
di-(alquil
C_{1-6})-aminosulfonilo;
R^{2} es hidrógeno, hidroxi, amino, halo,
alquilo C_{1-6}, ciano, alquenilo
C_{2-6}, polihalo-alquilo
C_{1-6}, nitro, fenilo, alquil
C_{1-6}-carbonilo,
hidroxicarbonilo, alquil
C_{1-6}-carbonilamino, alquil
C_{1-6}-oxi, o mono- o di-(alquil
C_{1-6})amino;
R^{3} es hidroxi o amino;
R^{4} es hidrógeno, tienilo, furanilo o fenilo
y cada tienilo, furanilo o fenilo puede estar opcionalmente
sustituido con halo, amino, nitro, ciano, hidroxi, fenilo, alquilo
C_{1-6}, (di-alquil
C_{1-6})-amino, alquilo
C_{1-6}-oxi,
fenil-alquil
C_{1-6}-oxi,
hidroxi-alquilo C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxicarbonilo,
hidroxicarbonilo, alquil
C_{1-6}-carbonilo,
polihalo-alquil
C_{1-6}-oxi,
polihalo-alquilo C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-sulfonilo,
hidroxicarbonil-alquilo C_{1-6},
alquil C_{1-6}-carbonilamino,
aminosulfonil-alquilo C_{1-6},
isoxazolilo, aminocarbonilo, fenil-alquenilo
C_{2-6}, fenil-alquinilo
C_{3-6} o
piridinil-C_{3-6} alquinilo;
R^{5}, R^{6} y R^{7} son cada uno
independientemente hidrógeno, amino, nitro, furanilo, halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi, trifluorometilo,
tienilo, fenilo, alquil C_{1-6}- carbonilamino,
aminocarbonil-alquilo C_{1-6} o
-C\equivC-CH_{2}-R^{11}.
La expresión "inhibidor de histona
desacetilasa" se usa para identificar un compuesto que es capaz
de interaccionar con una histona desacetilasa e inhibir su
actividad, más particularmente, su actividad enzimática. La
inhibición de la actividad enzimática de la histona desacetilasa
significa reducir la capacidad de una histona desacetilasa de
quitar un grupo acetilo de una histona. Preferentemente, tal
inhibición es específica, es decir el inhibidor de histona
desacetilasa reduce la capacidad de una histona desacetilasa de
quitar un grupo acetilo de una histona a una concentración que es
inferior que la concentración del inhibidor que se requiere para
producir algún otro efecto biológico no relacionado.
Según se usa en las definiciones anteriores y
posteriores, halo significa fluoro, cloro, bromo y yodo; alquilo
C_{1-2} define radicales hidrocarbonados saturados
de cadena lineal que tienen 1 ó 2 átomos de carbono, tales como,
por ejemplo, metilo o etilo; alquilo C_{1-6}
define alquilo C_{1-2} y radicales hidrocarbonados
saturados de cadena lineal y ramificada que tienen de 3 a 6 átomos
de carbono, tales como, por ejemplo, propilo, butilo,
1-metiletilo, 2-metilpropilo,
pentilo, 2-metilbutilo, hexilo,
2-metilpentilo y similares; polihaloalquilo
C_{1-6} define alquilo C_{1-6}
que contiene tres sustituyentes halo idénticos o diferentes, por
ejemplo trifluorometilo; alquenilo C_{2-6} define
radicales hidrocarbonados de cadena lineal y ramificada que
contienen un doble enlace y que tienen de 2 a 6 átomos de carbono,
tales como, por ejemplo, etenilo, 2-propenilo,
3-butenilo, 2-pentenilo,
3-pentenilo,
3-metil-2-butenilo,
y similares; alquinilo C_{3-6} define radicales
hidrocarbonados de cadena lineal y ramificada que contienen un
triple enlace y que tienen de 3 a 6 átomos de carbono, tales como,
por ejemplo, 2-propinilo,
3-butinilo, 2-butinilo,
2-pentinilo, 3-pentinilo,
3-hexinilo, y similares; cicloalquilo
C_{3-7} incluye grupos hidrocarbonados cíclicos
que tienen de 3 a 7 carbonos, tales como ciclopropilo, ciclobutilo,
ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo,
cicloheptilo y similares.
Las sales de adición farmacéuticamente
aceptables abarcan sales de adición de ácido farmacéuticamente
aceptables y sales de adición de base farmacéuticamente aceptables.
Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, como se
menciona más arriba, se supone que comprenden las formas de la sal
de adición de ácido no tóxicas terapéuticamente activas que los
compuestos de fórmula (I) son capaces de formar. Los compuestos de
fórmula (I) que tienen propiedades básicas pueden ser convertidos
en sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables
tratando dicha forma básica con un ácido apropiado. Los ácidos
apropiados comprenden, por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como
los ácidos hidrohálicos, p.ej ácido clorhídrico o bromhídrico;
sulfúrico; nítrico; fosfórico y otros ácidos similares; o ácidos
orgánicos tales como, por ejemplo, acético trifluoroacético,
propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico, malónico,
succínico (es decir, ácido butanodioico), maleico, fumárico,
málico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico,
bencenosulfónico, p-toluenosulfónico, ciclámico,
salicílico, p-amino-salicílico,
pamoico y otros ácidos similares.
Los compuestos de fórmula (I) que tienen
propiedades ácidas pueden ser convertidos en sus sales de adición
de base farmacéuticamente aceptables tratando dicha forma ácida con
una base orgánica o inorgánica adecuado. Las formas de sal básica
apropiadas comprenden, por ejemplo, las sales de amonio, sales
metálicas alcalinas y alcalino-térreas, p.ej sales
de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y otras similares, sales
con bases orgánicas, p.ej benzatina,
N-metil-D-glucamina,
sales de hidrabamina, y sales con aminoácidos tales como, por
ejemplo, arginina, lisina y otras similares.
La expresión "sales de adición de ácido o
base" también comprende los hidratos y las formas de adición de
disolvente, que los compuestos de fórmula (I) son capaces de formar.
Los ejemplos de tales formas son p.ej hidratos, alcoholatos y otros
similares.
La expresión "formas estereoquímicamente
isoméricas de los compuestos de fórmula (I)", según se usa en
este documento, define a todos los compuestos posibles combinados
de los mismos átomos unidos por la misma secuencia de enlaces, pero
que tienen estructuras tridimensionales diferentes, que no son
intercambiables, que los compuestos de la fórmula (I) pueden
poseer. A menos que se mencione o indique de otra manera, la
designación química de un compuesto abarca la mezcla de todas las
formas estereoquímicamente isoméricas posibles, que dicho compuesto
puede poseer. Dicha mezcla puede contener todos los diastereómeros
y/o enantiómeros de la estructura molecular básica de dicho
compuesto. Todas las formas estereoquímicamente isoméricas de los
compuestos de fórmula (I), tanto en la forma pura como en mezcla,
se requieren que estén dentro del ámbito de la presente
invención.
Las formas de N-óxido de los compuestos de
fórmula (I) se supone que comprenden a aquellos compuestos de
fórmula (I) en los que uno o varios átomos de nitrógeno son
oxidados al llamado N-óxido, en particular aquellos N-óxidos en los
que uno o varios de los nitrógenos de piperidina, piperazina o
piridazinilo están N-oxididados.
Algunos compuestos de la fórmula (I) pueden
existir también en sus formas tautoméricas. Tales formas, aunque no
se indique explícitamente en la fórmula anterior, se requieren que
estén incluidas dentro del ámbito de la presente invención.
Siempre que se use en este documento, la
expresión "compuestos de fórmula (I)" se supone que incluyen
también las sales de adición farmacéuticamente aceptables y todas
las formas estereoisoméricas.
Según se usa en este documento, la expresión
"histona desacetilasa" y el término "HDAC" se refieren a
cualquiera de una familia de enzimas que eliminan los grupos
acetilo de los grupos \varepsilon-amino de
residuos lisina en el extremo N-terminal de una
histona. A menos que se indique de otra forma por el contexto, el
término "histona" se supone que se refiere a cualquier
proteína histona, incluyendo H1, H2A, H2B, H3, H4 y H5, de
cualquier especie. Las proteínas HDAC humanas o los productos
génicos, incluyen, pero sin limitación, a HDAC-1,
HDAC-2, HDAC-3,
HDAC-4, HDAC-5,
HDAC-6, HDAC-7,
HDAC-8, HDAC-9,
HDAC-10 y HDAC-11. La histona
desacetilasa también puede ser derivada a partir de una fuente
protozoaria o fúngica.
Los compuestos de fórmula (I) y sus sales
farmacéuticamente aceptables y N-óxidos y sus formas
estereoquímicamente isoméricas pueden prepararse de manera
convencional. Los materiales de partida y algunos intermedios son
compuestos conocidos y están comercialmente disponibles o pueden
prepararse según procedimientos de reacción convencionales
generalmente conocidos en la técnica o como se describe en las
solicitudes de patente EP1485099, EP1485348, EP1485353, EP1485354,
EP1485364, EP1485365, EP1485370 y EP1485378. Algunos métodos de
preparación serán descritos en este documento de aquí en adelante
más detalladamente. Otros métodos para obtener los compuestos
finales de fórmula (I) son descritos en los ejemplos.
Los compuestos de fórmula (I) se pueden preparar
haciendo reaccionar un intermedio de fórmula (II) donde M
representa hidrógeno o un álcali metálico, por ejemplo, de sodio o
litio, con un compuesto de fórmula (III), en presencia de una base
tal como, por ejemplo, trietilamina y hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-iloxi-tripirrolidino-fosfonio
(PyBOP). Dicha reacción se lleva a cabo en un solvente apropiado
tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano o diclorometano, o una
mezcla de estos.
Los compuestos de fórmula (I) y algunos
intermedios pueden tener al menos un centro estereogénico en su
estructura. Este centro estereogénico puede estar presente en una
configuración R o S.
Los compuestos de fórmula (I), según se preparan
en los procesos arriba descritos, son generalmente mezclas
racémicas de enantiómeros, que pueden ser separados entre sí
siguiendo procedimientos de resolución conocidos por la técnica.
Los compuestos racémicos de fórmula (I) pueden ser convertidos en
las correspondientes formas diastereoméricas salinas por la
reacción con un ácido quiral adecuado. Dichas formas
diastereoméricas salinas son separadas posteriormente, por ejemplo,
por cristalización selectiva o fraccionaria y los enantiómeros son
liberados a partir de ahí por un álcali. Una manera alternativa de
separar las formas enantioméricas de los compuestos de fórmula (I)
implica la cromatografía líquida usando una fase estacionaria
quiral. Dichas formas estereoquímicamente isoméricas puras también
pueden obtenerse a partir de las formas estereoquímicamente
isoméricas puras correspondientes a partir de los materiales de
partida apropiados, a condición de que la reacción ocurra
estereoespecíficamente. Preferentemente, si se desea el
estereoisómero específico, dicho compuesto sería sintetizado por
métodos de preparación estereoespecíficos. Estos métodos emplearán
ventajosamente materiales de partida enantioméricamente puros.
Los compuestos de fórmula (I), las sales de
adición de ácido farmacéuticamente aceptables y sus formas
estereoisoméricas tienen propiedades farmacológicas valiosas porque
tienen un efecto inhibitorio de histona desacetilasa (HDAC).
Esta invención proporciona compuestos de fórmula
(I) para inhibir el crecimiento anormal de células, incluyendo
células transformadas, administrando una cantidad eficaz de un
compuesto de la invención. El crecimiento anormal de células se
refiere al crecimiento de células independiente de los mecanismos
reguladores normales (p.ej, la pérdida de inhibición por contacto).
Esto incluye la inhibición del crecimiento de tumores, directamente
causando la detención del crecimiento, la diferenciación terminal
y/o la apoptosis de las células cancerígenas e, indirectamente,
inhibiendo la neovascularización de tumores.
Esta invención también proporciona compuestos de
fórmula (I) para inhibir el crecimiento de tumores administrando
una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención, a un
sujeto, p.ej un mamífero (y más particularmente un ser humano) en
necesidad de tal tratamiento. En particular, esta invención
proporciona compuestos de fórmula (I) para inhibir el crecimiento
de tumores mediante la administración de una cantidad eficaz de los
compuestos de la presente invención. Los ejemplos de tumores que
pueden ser inhibidos, pero sin limitación, son cáncer de pulmón
(p.ej adenocarcinoma e incluyendo cáncer de pulmón de células no
pequeñas), cánceres pancreáticos (carcinoma, p.ej pancreático, tal
como, por ejemplo carcinoma pancreático exocrino), cánceres de colon
(p.ej carcinomas colorectal, tal como, por ejemplo, adenocarcinoma
de colon y adenoma de colon), cáncer de próstata incluyendo la
enfermedad avanzada, tumores hematopoyéticos de linaje linfoide
(p.ej., leucemia linfocítica aguda, linfoma de células B, linfoma
de Burkitt), leucemias mieloides (por ejemplo, leucemia mielogenosa
aguda (AML)), cáncer de tiroides folicular, síndrome
mielodisplásico (MDS), tumores de origen mesenquimal (p.ej
fibrosarcomas y rabdomiosarcomas), melanomas, teratocarcinomas,
neuroblastomas, gliomas, tumor benigno de la piel (p.ej
queratoacantomas), carcinoma de mama (p.ej, cáncer de mama
avanzado), carcinoma de riñón, carcinoma de ovario, carcinoma de
vejiga y carcinoma epidérmico.
\newpage
El compuesto según la invención puede ser usado
con otros fines terapéuticos, por ejemplo:
- a)
- el reconocimiento de tumores con radioterapia administrando el compuesto según la invención antes, durante o después de la irradiación del tumor para tratar el cáncer;
- b)
- tratar artropatías y afecciones osteopatológicas tales como artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil, gota, poliartritis, artritis psoriática, espondilitis anquilosante y lupus eritematoso sistémico;
- c)
- inhibir la proliferación de células de músculo liso incluyendo desórdenes proliferativos vasculares, aterosclerosis y restenosis;
- d)
- tratar afecciones inflamatorias y afecciones dérmicas tales como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, rinitis alérgica, enfermedad de injerto contra huésped, conjuntivitis, asma, ARDS, enfermedad de Behcets, rechazo de trasplantes, urticaria, dermatitis alérgica, alopecia areata, esclerodermia, exantema, eczemas, dermatomiositis, acné, diabetes, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Kawasaki, esclerosis múltiple, enfisema, fibrosis quística y bronquitis crónica;
- e)
- tratar endometriosis, fibroides uterinas, sangrado uterino disfuncional e hiperplasia endometrial;
- f)
- tratar la vascularización ocular incluyendo la vasculopatía que afecta a los vasos retinales y coroidales;
- g)
- tratar una disfunción cardíaca;
- h)
- inhibir afecciones inmunodepresivas tales como el tratamiento de las infecciones por VIH;
- i)
- tratar la disfunción renal;
- j)
- suprimir los desórdenes endocrinos;
- k)
- inhibir la disfunción de la gluconeogénesis;
- l)
- tratar una neuropatología, por ejemplo, la enfermedad de Parkinson o un neuropatología que causa un desorden cognoscitivo, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer o enfermedades neuronales relacionadas con poliglutamina;
- m)
- tratar desórdenes psiquiátricos, por ejemplo, esquizofrenia, trastorno bipolar, depresión, ansiedad y psicosis;
- n)
- inhibir una patología neuromuscular, por ejemplo, esclerosis lateral amilotrófica;
- o)
- tratar la atrofia muscular espinal;
- p)
- tratar otras afecciones patológicas susceptibles al tratamiento por la expresión potenciadora de un gen;
- q)
- realzar la terapia génica;
- r)
- inhibir la adipogenesis;
- s)
- tratar parasitosis tales como la malaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, la presente invención describe los
compuestos de fórmula (I) para uso como un fármaco así como el uso
de estos compuestos de fórmula (I) para la fabricación de un
medicamento para tratar una o varias de las afecciones arriba
mencionadas.
Los compuestos de fórmula (I), las sales de
adición de ácido farmacéuticamente aceptables y sus formas
estereoisoméricas pueden tener valiosas propiedades diagnósticas en
las cuales pueden ser usados para detectar o identificar una HDAC
en una muestra biológica que comprende la detección o la medición de
la formación de un complejo entre un compuesto marcado y una
HDAC.
Los métodos de detección o identificación pueden
usar compuestos que sean marcados mediante el marcaje de agentes
tales como radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes,
sustancias luminosas, etc. Los ejemplos de radioisótopos incluyen
^{125}I, ^{131}I, ^{3}H y ^{14}C. Las enzimas se hacen, por
lo general, detectables por su conjugación con el sustrato
apropiado que, a su vez, cataliza una reacción detectable. Los
ejemplos de esto incluyen, por ejemplo,
beta-galactosidasa,
beta-glucosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa y
malato deshidrogenasa, preferentemente peroxidasa de rábano picante.
Las sustancias luminosas incluyen, por ejemplo, luminol, derivados
de luminol, luciferina, aecuorina y luciferasa.
Las muestras biológicas pueden ser definidas
como tejido del cuerpo o fluidos del cuerpo. Los ejemplos de
fluidos del cuerpo son fluido cerebroespinal, sangre, plasma, suero,
orina, esputo, saliva y otros similares.
En vista de sus propiedades farmacológicas
útiles, los compuestos objeto pueden ser formulados en varias formas
farmacéuticas con el fin de su administración.
Para preparar las composiciones farmacéuticas de
esta invención, se combina una cantidad eficaz de un compuesto
particular, en forma de sal de adición de base o de ácido, como
ingrediente activo en mezcla con un vehículo farmacéuticamente
aceptable, cuyo vehículo puede tomar una amplia variedad de formas,
según la forma de preparación deseada para la administración. Estas
composiciones farmacéuticas están deseablemente en forma de dosis
unitaria adecuadas, preferentemente, para la administración oral,
rectal, percutánea o inyección parenteral. Por ejemplo, en la
preparación de las composiciones en la forma de administración oral,
puede ser empleado cualquiera de los medios farmacéuticos
habituales, tal como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites,
alcoholes y otros similares en el caso de preparaciones líquidas
orales tales como suspensiones, jarabes, elixires y soluciones; o
vehículos sólidos tales como almidones, azúcares, caolín,
lubricantes, aglomerantes, agentes desintegrantes y otros similares
en el caso de polvos, píldoras, cápsulas y pastillas.
A causa de su facilidad en la administración,
las pastillas y las cápsulas representan la forma de unidad de
administración oral más ventajosa, en cuyo caso son obviamente
empleados vehículos farmacéuticos sólidos. Para composiciones
parenterales, el vehículo comprenderá por lo general agua estéril,
al menos en gran parte, aunque puedan ser incluidos otros
ingredientes para ayudar a la solubilidad, por ejemplo. Pueden
prepararse soluciones inyectables, por ejemplo, en las que el
vehículo comprenda solución salina, solución de glucosa o una
mezcla de solución de glucosa y salina. También pueden prepararse
suspensiones inyectables en cuyo caso pueden ser empleados
vehículos líquidos apropiados, agentes de suspensión y otros
similares. En las composiciones adecuadas para la administración
percutánea, el vehículo comprende opcionalmente un agente que
potencia la penetración y/o un agente humectante adecuado,
opcionalmente combinado con aditivos adecuados de cualquier
naturaleza en proporciones menores, cuyos aditivos no causan ningún
efecto deletéreo significativo en la piel. Dichos aditivos pueden
facilitar la administración a la piel y/o pueden ser provechosos
para preparar las composiciones deseadas. Estas composiciones
pueden ser administradas de varios modos, p.ej, como un parche
transdérmico, tal como una crema o como un
ungüento.
ungüento.
Sobre todo, es ventajoso formular las
composiciones farmacéuticas anteriormente mencionadas en formas de
administración unitaria para facilitar la administración y por la
uniformidad de la dosis. La forma de administración unitaria según
se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones en este
documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas
como dosis unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad
predeterminada del ingrediente activo, calculada para producir el
efecto terapéutico deseado, conjuntamente con el vehículo
farmacéutico requerido. Los ejemplos de tales formas de
administración unitaria son comprimidos (incluyendo comprimidos
revestidos o marcados), cápsulas, píldoras, paquetes en polvo,
obleas, soluciones inyectables o suspensiones, cucharaditas,
cucharadas y otros similares, y sus múltiplos segregados.
Los expertos en la técnica podrían determinar
fácilmente la cantidad eficaz a partir de los resultados de los
ensayos presentados más adelante. En general, se contempla que una
cantidad terapéuticamente eficaz estaría entre 0,005 mg/kg de peso
corporal y 100 mg/kg, y en particular entre 0,005 mg/kg de peso
corporal y 10 mg/kg. Puede ser apropiado administrar la dosis
requerida como dos, tres, cuatro o más subdosis en intervalos
apropiados a lo largo del día. Dichas subdosis pueden ser
formuladas como formas de administración unitarias, por ejemplo,
conteniendo entre 0,5 y 500 mg, y en particular entre 10 mg y 500 mg
del ingrediente activo por forma de administración unitaria.
Como otro aspecto de la presente invención, se
presenta una combinación de un inhibidor de HDAC con otro agente
anticáncer, sobre todo para su uso como un fármaco, más expresamente
en el tratamiento del cáncer o enfermedades relacionadas.
Para el tratamiento de las susodichas
afecciones, los compuestos de la invención pueden ser ventajosamente
empleados en combinación con uno o varios agentes farmacológicos
distintos, más particularmente, con otros agentes anticáncer. Los
ejemplos de agentes anticáncer son:
- -
- compuestos de coordinación de platino, por ejemplo, cisplatin, carboplatin u oxaliplatin;
- -
- compuestos de taxano, por ejemplo, paclitaxel o docetaxel;
- -
- inhibidores de topoisomerasa como compuestos de camptotecin, por ejemplo, irinotecan o topotecan;
- -
- inhibidores de topoisomerasa II como derivados antitumorales de podofilotoxina, por ejemplo, etoposido o teniposido;
- -
- alcaloides de la vinca antitumorales, por ejemplo, vinblastina, vincristina o vinorelbina;
- -
- derivados de nucleósidos antitumorales, por ejemplo, 5-fluorouracil, gemcitabina o capecitabina;
- -
- agentes alquilantes, tales como mostaza de nitrógeno o nitrosourea, por ejemplo, ciclofosfamida, clorambucil, carmustina o lomustina;
- -
- derivados de antraciclina antitumorales, por ejemplo, daunorubicin, doxorubicin, idarubicin o mitoxantrona;
- -
- anticuerpos de HER2, por ejemplo, trastuzumab;
- -
- antagonistas del receptor de estrógeno o moduladores del receptor de estrógeno selectivos, por ejemplo, tamoxifen, toremifeno, droloxifeno, faslodex o raloxifeno;
- -
- inhibidores de aromatasa tales como exemestano, anastrozol, letrazol y vorozol;
- -
- agentes diferenciantes tales como retinoides, vitamina D y agentes bloqueantes del metabolismo del ácido retinoico (RAMBA), por ejemplo, accutano;
- -
- inhibidores de ADN metil-transferasa, por ejemplo, azacitidina;
- -
- inhibidores de quinasa, por ejemplo, flavoperidol, imatinib mesilato o gefitinib;
- -
- inhibidores de farnesiltransferasa;
- -
- otros inhibidores de HDAC
- -
- inhibidores de la ruta de ubiquitina-proteasoma, por ejemplo, Velcade; o
- -
- Yondelis.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "compuesto de coordinación de
platino" se usa en este documento para denotar cualquier
crecimiento de células tumorales que inhiban al compuesto de
coordinación de platino que proporciona el platino en la forma de un
ión.
La expresión "compuestos de taxano" indica
una clase de compuestos que tienen el sistema de anillo de taxano y
que están relacionados o se obtienen a partir de extractos de
ciertas especies de árboles tejo (Taxus).
La expresión "inhibidores de topisomerasa"
se usa para indicar enzimas que son capaces de cambiar la topología
del ADN en células eucariótas. Son críticos para las funciones
celulares importantes y la proliferación de células. Hay dos clases
de topoisomerasas en las células eucarióticas, a saber, tipo I y
tipo II. La topoisomerasa I es una enzima monomérica de
aproximadamente 100.000 de peso molecular. La enzima se une al ADN e
introduce una ruptura monocatenaria pasajera, desenrolla la doble
hélice (o permite que se desenrolle) y posteriormente resella la
ruptura antes de disociar la cadena de ADN. La topisomerasa II tiene
un mecanismo de acción similar que implica la inducción de rupturas
de la cadena de ADN o la formación de radicales libres.
La expresión "compuestos de camptotecin" se
usa para indicar los compuestos que están relacionados o son
derivados a partir del compuesto de camptotecin madre que es un
alcaloide insoluble en agua derivado del árbol chino
Camptothecin acuminata y el árbol indio Nothapodytes
foetida.
La expresión "compuestos de podofilotoxina"
se usa para indicar a los compuestos que están relacionados o son
derivados de la podofilotoxina madre, que es extraída a partir de la
planta mandrágora.
La expresión "alcaloides de la vinca
antitumorales" se usa para indicar a los compuestos que están
relacionados o son derivados de extractos de la planta
vincapervinca (Vinca rosea).
La expresión "agentes alquilantes" abarca a
un grupo diverso de productos químicos que tienen el rasgo común de
que tienen la capacidad de contribuir, en afecciones fisiológicas,
con grupos alquilo a macromoléculas biológicamente vitales tales
como el ADN. Con la mayor parte de los agentes más importantes como
las mostazas de nitrógeno y las nitrosoureas se generan restos
alquilantes activos in vivo después de complejas reacciones
de degradación, algunas de las cuales son enzimáticas. Las acciones
farmacológicas más importantes de los agentes alquilantes son
aquellas que perturban los mecanismos fundamentales ocupados en la
proliferación de células en la síntesis del ADN particular y la
división celular. La capacidad de los agentes alquilantes de
interferir en la función del ADN y la integridad en los tejidos
proliferantes proporciona rápidamente la base para sus aplicaciones
terapéuticas y para muchas de sus propiedades tóxicas.
La expresión "derivados de antraciclina
antitumorales" comprende a los antibióticos obtenidos a partir
del hongo Strep. peuticus var. caesius y sus derivados,
caracterizados por tener una estructura de anillo de tetraciclina
con un azúcar inusual, daunosamina, unido por un enlace
glucosídico.
La amplificación de la proteína del receptor del
factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER 2) en carcinomas de
mama primarios se ha demostrado que guarda correlación con un
deficiente pronóstico clínico para ciertos pacientes. El
Trastuzumab es un anticuerpo kappa de IgG1 monoclónico humanizado
derivado de ADN recombinante muy purificado que se une con afinidad
alta y precisión a la esfera extracelular del receptor HER2.
Muchos cánceres de mama tienen receptores de
estrógenos y el crecimiento de estos tumores puede ser estimulado
por los estrógenos. Los términos "antagonistas del receptor de
estrógeno" y los "moduladores del receptor de estrógeno
selectivos" son usados para indicar a los inhibidores
competitivos del estradiol que se unen al receptor de estrógeno
(ER). Los moduladores del receptor de estrógeno selectivos, cuando
se unen al ER, inducen un cambio de la forma tridimensional del
receptor, modulando su unión al elemento resposable del estrógeno
(ERE) en el ADN.
En mujeres postmenopáusicas, la fuente principal
del estrógeno circulante es la conversión de andrógenos
suprarrenales y ováricos (androestendiona y testosterona) en
estrógenos (estrona y estradiol) por la enzima aromatasa en tejidos
periféricos. La privación de estrógenos por la inhibición de
aromatasa o la inactivación es un tratamiento eficaz y selectivo
para algunos pacientes postmenopáusicos con cáncer de mama hormonal
dependiente.
La expresión "agente antiestrógeno" se usa
en este documento para incluir no sólo a antagonistas del receptor
de estrógeno y moduladores del receptor de estrógeno selectivos sino
también a inhibidores de aromatasa como se comenta antes.
La expresión "agentes diferenciadores"
abarca a compuestos que, de varios modos, pueden inhibir la
proliferación de células e inducir a la diferenciación. Se sabe que
la vitamina D y los retinoides desempeñan un papel principal en la
regulación del crecimiento y la diferenciación de una amplia
variedad de tipos de células normales y malignas. Los agentes
bloqueantes del metabolismo del ácido retinoico (los RAMBA) aumentan
los niveles del ácido retinoico endógeno inhibiendo el catabolismo
mediado por la citocromo P450 de ácidos retinoicos.
Los cambios de la metilación del ADN están entre
las anormalidades más comunes en la neoplasia humana. La
hipermetilación dentro de los promotores de genes seleccionados
tiene que ver por lo general con la inactivación de los genes
implicados. La expresión "inhibidores de la ADN
metil-transferasa" se usa para indicar a los
compuestos que actúan a través de la inhibición farmacológica de la
ADN metil-transferasa y la reactivación de la
expresión del gen supresor del tumor.
La expresión "inhibidores de quinasa"
comprende a potentes inhibidores de quinasas que están implicados en
la progresión del ciclo celular y la muerte celular programada
(apoptosis).
La expresión "inhibidores de
farnesiltransferasa" se usa para indicar a los compuestos que
fueron diseñados para prevenir la farnesilación de Ras y otras
proteínas intracelulares. Se ha demostrado que tienen efectos en la
proliferación de célula malingnas y en la supervivencia.
La expresión "otros inhibidores de HDAC"
comprende, pero no está limitada a:
- -
- carboxilatos, por ejemplo, butirato, ácido cinnámico, ácido 4-fenilbutirato o valproico;
- -
- ácidos hidroxámicos, por ejemplo, ácido suberoilanilida-hidroxámico (SAHA), análogos de SAHA que contienen piperazina, hidroxamato de biarilo A-161906 y sus análogos de carbozoliléter, tetrahidropiridina y tetralona, aril-N-hidroxicarboxamidas bicíclicas, piroxamida, CG-1521, PXD-101, sulfonamida ácido hidroxámico, LAQ-824, LBH-589, tricostatin (TSA), oxamflatin, scriptaid, moléculas tricíclicas relacionadas con scriptaid, ácido m-carboxi cinnámico, ácido bishidroxámico (CBHA), ácidos hidroxamicos tipo CBHA, análogo del ácido trapoxin-hidroxámico, CRA-024781, R306465 y ácidos benzoilo y heteroaril-hidroxámico relacionados, aminosuberatos y malonildiamidas;
- -
- tetrapéptidos cíclicos, por ejemplo, trapoxin, apidicin, depsipeptido, compuestos relacionados con spiruchostatin, RedFK-228, tetrapéptidos cíclicos que contienen sulfhidrilo (SCOP), tetrapéptidos cíclicos que contienen ácido hidroxámico (CHAP), TAN-174S y azumamidas;
- -
- benzamidas, por ejemplo, MS-275 o CI-994, o
- -
- depudecin.
La expresión "inhibidores de la ruta de
ubiquitina-proteasoma" se usa para indentificar a
los compuestos que inhiben la destrucción dirigida de proteínas
celulares en el proteasoma, incluyendo las proteínas reguladoras
del ciclo celular.
Para el tratamiento del cáncer los compuestos
según la presente invención pueden ser administrados a un paciente
como se describe antes, junto con irradiación. La irradiación
significa la radiación de ionización y, en particular, de rayos
gamma, sobre todo la que se emite con aceleradores lineales o
radionucléidos que son de uso común hoy en día. La irradiación del
tumor por radionucléidos puede ser externa o interna.
La presente invención también está relacionada
con una combinación, según la invención, de un agente anticáncer y
un inhibidor de HDAC según la invención.
La presente invención también está relacionada
con una combinación, según la invención, para uso en terapia
médica, por ejemplo, para inhibir el crecimiento de células
tumorales.
La presente invención también está relacionada
con unas combinaciones, según la invención, para inhibir el
crecimiento de células tumorales.
La presente invención también está relacionada
con compuestos de fórmula (I) para inhibir el crecimiento de
células tumorales en un sujeto humano que comprende administrar al
sujeto una cantidad eficaz de una combinación según la
invención.
Esta invención proporciona además compuestos de
fórmula (I) para inhibir el crecimiento anormal de células,
incluyendo células transformadas, administrando una cantidad eficaz
de una combinación según la invención.
El otro agente farmacológico y el inhibidor de
HDAC pueden ser administrados simultáneamente (p.ej, en
composiciones separadas o unitarias) o secuencialmente en cualquier
orden. En el último caso, los dos compuestos serán administrados en
un período y en una cantidad y manera que sean suficientes para
asegurar que es conseguido un efecto sinérgico o ventajoso. Será
apreciado que el método preferido y el orden de administración y las
cantidades de dosis respectivas y regímenes para cada componente de
la combinación dependerán del otro agente farmacológico particular
e inhibidor de HDAC administrado, su ruta de administración, el
tumor particular tratado y el huésped particular tratado. El método
óptimo y el orden de administración y las cantidades de las dosis y
el régimen pueden ser fácilmente determinados por los expertos en
la técnica usando métodos convencionales y a la vista de la
información dispuesta en este documento.
El compuesto de coordinación de platino es
ventajosamente administrado en una dosis de 1 a 500 mg por metro
cuadrado (mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo
entre 50 y 400 mg/m^{2}, en particular para cisplatin en una
dosis de aproximadamente 75 mg/m^{2} y para carboplatin en
aproximadamente 300 mg/m^{2} por curso del tratamiento.
El compuesto de taxano es ventajosamente
administrado en una dosis entre 50 y 400 mg por metro cuadrado
(mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo entre 75
y 250 mg/m^{2}, en particular para paclitaxel en una dosis entre
aproximadamente 175 y 250 mg/m^{2} y para docetaxel entre
aproximadamente 75 y 150 mg/m^{2} por curso del tratamiento.
El compuesto de camptotecin es ventajosamente
administrado en una dosis entre 0,1 y 400 mg por metro cuadrado
(mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo entre 1 y
300 mg/m^{2}, en particular para irinotecan en una dosis entre
aproximadamente 100 y 350 mg/m^{2} y para topotecan entre
aproximadamente 1 y 2 mg/m^{2} por curso del tratamiento.
El derivado de podofilotoxina antitumoral se
administra ventajosamente en una dosis entre 30 y 300 mg por metro
cuadrado (mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo
entre 50 y 250 mg/m^{2}, en particular, para etoposido en una
dosis entre aproximadamente 35 y 100 mg/m^{2} y para teniposido
entre aproximadamente 50 y 250 mg/m^{2} por curso del
tratamiento.
El alcaloid de la vinca antitumoral se
administra ventajosamente en una dosis entre 2 y 30 mg por metro
cuadrado (mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, en
particular para vinblastina en una dosis entre aproximadamente 3 y
12 mg/m^{2}, para vincristina en una dosis entre aproximadamente 1
y 2 mg/m^{2}, y para vinorelbina en una dosis entre
aproximadamente 10 y 30 mg/m^{2} por curso del tratamiento.
El derivado de nucleósido antitumoral se
administra ventajosamente en una dosis entre 200 y 2500 mg por metro
cuadrado (mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo
entre 700 y 1500 mg/m^{2}, en particular para
5-FU en una dosis entre 200 y 500 mg/m^{2}, para
gemcitabina en una dosis entre aproximadamente 800 y 1200
mg/m^{2} y para capecitabina entre aproximadamente 1000 y 2500
mg/m^{2} por curso del tratamiento.
Los agentes alquilantes tales como la mostaza de
nitrógeno o nitrosourea son ventajosamente administrados en una
dosis entre 100 y 500 mg por metro cuadrado (mg/m^{2}) del área de
superficie de cuerpo, por ejemplo entre 120 y 200 mg/m^{2}, en
particular, para ciclofosfamida en una dosis entre aproximadamente
100 y 500 mg/m^{2}, para clorambucil en una dosis entre
aproximadamente 0,1 y 0,2 mg/kg, para carmustina en una dosis entre
aproximadamente 150 y 200 mg/m^{2}, y para lomustina en una dosis
entre aproximadamente 100 y 150 mg/m^{2} por curso del
tratamiento.
El derivado de antraciclina antitumoral se
administra ventajosamente en una dosis entre 10 y 75 mg por metro
cuadrado (mg/m^{2}) del área de superficie de cuerpo, por ejemplo
entre 15 y 60 mg/m^{2}, en particular para doxorubicin en una
dosis entre aproximadamente 40 y 75 mg/m^{2}, para daunorubicin en
una dosis entre aproximadamente 25 y 45 mg/m^{2}, y para
idarubicin en una dosis entre aproximadamente 10 y 15 mg/m^{2}
por curso del tratamiento.
El Trastuzumab se administra ventajosamente en
una dosis entre 1 y 5 mg por metro cuadrado (mg/m^{2}) del área
de superficie de cuerpo, en particular entre 2 y 4 mg/m^{2} por
curso del tratamiento.
El agente antiestrógeno se administra
ventajosamente en una dosis entre aproximadamente 1 y 100 mg
diariamente según el agente particular y la condición tratada. El
Tamoxifen se administra ventajosamente oralmente en una dosis entre
5 y 50 mg, preferentemente entre 10 y 20 mg dos veces al día,
siguiendo la terapia durante el tiempo suficiente para conseguir y
mantener un efecto terapéutico. El Toremifeno se administra
ventajosamente oralmente en una dosis de aproximadamente 60 mg una
vez al día, siguiendo la terapia durante el tiempo suficiente para
conseguir y mantener un efecto terapéutico. El Anastrozol se
administra ventajosamente oralmente en una dosis de aproximadamente
1 mg una vez al día. El Droloxifeno se administra ventajosamente
oralmente en una dosis entre aproximadamente 20 y 100 mg una vez al
día. El Raloxifeno se administra ventajosamente oralmente en una
dosis de aproximadamente 60 mg una vez al día. El Exemestano se
administra ventajosamente oralmente en una dosis de aproximadamente
25 mg una vez al día.
Estas dosis pueden ser administradas por ejemplo
una vez, dos veces o más por curso del tratamiento, que puede ser
repetido por ejemplo cada 7,14, 21 ó 28 días.
En vista de sus propiedades farmacológicas
útiles, los componentes de las combinaciones según la invención, es
decir el otro agente farmacológico y el inhibidor de HDAC, pueden
ser formulados en varias formas farmacéuticas con fines de
administración. Los componentes pueden ser formulados por separado
en composiciones farmacéuticas individuales o en una composición
farmacéutica unitaria que contiene ambos componentes.
La presente invención, por lo tanto, también
está relacionada con una composición farmacéutica que comprende al
otro agente farmacológico y el inhibidor de HDAC junto con uno o
varios vehículos farmacéuticos.
La presente invención también está relacionada
con una combinación según la invención en la forma de una
composición farmacéutica que comprende a un agente anticáncer y un
inhibidor de HDAC según la invención junto con uno o varios
vehículos farmacéuticos.
La presente invención está relacionada además
con el uso de una combinación según la invención en la fabricación
de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de
células tumorales.
La presente invención está relacionada además
con un producto que contiene como primer ingrediente activo un
inhibidor de HDAC según la invención y como segundo ingrediente
activo un agente anticáncer, como una preparación combinada para
uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de pacientes
que sufren de cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
En lo sucesivo, el término
"K_{2}CO_{3}" significa carbonato de potasio,
"CH_{2}Cl_{2}" significa diclorometano, "MgSO_{4}"
significa sulfato de magnesio, "DIPE" significa éter
diisopropílico, "THF" significa tetrahidrofurano, "EtOAc"
significa acetato de etilo, "DMF" significa N,
N-dimetilformamida, "DMSO" significa sulfóxido
de dimetilo, "Et_{3}N" significa trietilamina,
"NaBH_{4}" significa tetrahidroborato (-1) sódico,
"NaBH_{3}CN" significa cianoborohidruro, "PyBOP"
significa hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-iloxi-tripirrolidino-fosfonio,
"DIPEA" significa
N-etil-N-(1-metiletil)-2-propanamina,
"NH_{4}OH" significa hidróxido de amonio, "CH_{3}OH"
significa metanol, "NH_{4}HCO_{3}" significa bicarbonato de
amonio y "M.P." significa punto de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió una solución de
2-[2-(5-cloro-1H-indol-3-il)etil]-1H-isoindol-1,3(2H)-diona
(0,017 mol) en DMF (17 ml) a temperatura ambiente a una suspensión
de hidruro sódico (0,034 mol) en DMF (11 ml) en corriente de
N_{2}. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se añadió 1-yodopropano (0,034 mol) gota a gota. La
mezcla se agitó a temperatura ambiente durante dos horas, se vertió
sobre H_{2}O y NaCl, y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se
lavó con H_{2}O, se secó (MgSO_{4}), se filtró y el disolvente
se eliminó, lo cual produjo 7,77 g del
intermedio 1.
intermedio 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó y se calentó a reflujo una mezcla del
intermedio 1 (0,021 mol) e hidrazina/H2O (0,106 mol) en etanol (100
ml) durante 2 horas, posteriormente se enfrió hasta temperatura
ambiente, se vertió sobre H_{2}O y se extrajo con
CH_{2}Cl_{2}. Se separó la capa orgánica, se secó (MgSO_{4}),
se filtró y el disolvente se evaporó para dar 5 g (100%) del
intermedio 2.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió una solución de éster etílico del
ácido
2-(metilsulfonil)-5-pirimidincarboxílico
(0,094 mol) en acetonitrilo (40 ml) a 10ºC a una suspensión de
4-piperidinmetanol (0,083 mol) y K_{2}CO_{3}
(0.172 mol) en acetonitrilo (200 ml) en corriente de N_{2}. La
mezcla se calentó hasta temperatura ambiente, posteriormente se
agitó 4 horas, se vertió sobre H_{2}O y se extrajo con EtOAc. Se
separó la capa orgánica, se secó (MgSO_{4}), se filtró y el
disolvente se evaporó. El residuo (23 g) se cristalizó en
acetonitrilo/éter dietílico. La capa madre se evaporó y el residuo
obtenido se purificó por cromatografía en columna sobre gel de
sílice (eluyente: CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/NH_{4}OH 97/3/0,1:
20-45 \mum). Las fracciones puras se recogieron y
el disolvente se evaporó para dar 4.6 g (20%) (p. f.: 129ºC) del
intermedio 3.
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Se añadió DMSO (0,127 mol) a -78ºC a una
solución de dicloruro de etanodioilo (0,061 mol) en CH_{2}Cl_{2}
(110 ml) en corriente de N_{2}. La mezcla se agitó durante 15
minutos. Se añadió una solución del intermedio 3 (0,051 mol) en
CH_{2}Cl_{2} (200 ml). La mezcla se agitó a -78ºC durante 1 hora
y 30 minutos. Se añadió Et_{3}N (0.26 mol) gota a gota. La mezcla
se agitó a -78ºC durante 15 minutos, posteriormente se enfrió hasta
temperatura ambiente durante 2 horas y 30 minutos. Se añadió H2O. La
mezcla se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se separó,
se secó (MgSO_{4}), se filtró y el disolvente se evaporó. El
residuo (14 g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel
de sílice (eluyente: ciclohexano/EtOAc 70/30; 20-45
\mum). Las fracciones puras se recogieron y el disolvente se
evaporó para dar 7.6 g (57%) del intermedio 4.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron NaBH_{3} (0,034 mol) y ácido
acético (0,023 mol) a una solución del intermedio 2 (0,021 mol) y
del intermedio 4 (0,021 mol) en CH_{3}OH (500 ml) en corriente de
N_{2}. La mezcla se agitó durante 72 horas, se vertió en una
solución de K_{2}CO_{3} al 10% y se extrajo con EtOAc. La capa
orgánica se separó, se secó (MgSO_{4}), se filtró y el disolvente
se evaporó. El residuo (10,4 g) se purificó por cromatografía en
columna sobre gel de sílice (eluyente:
CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/NH_{4}OH 97/3/0,1:
15-40 \mum). Las fracciones puras se recogieron y
el disolvente se evaporó para dar 5.5 g (54%) del intermedio 5.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una mezcla del intermedio 5 (0,001 mol)
e hidróxido sódico (0,004 mol) en etanol (50 ml) y se calentó a
reflujo durante 5 horas, posteriormente se enfrió hasta temperatura
ambiente y se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en
éter dietílico. El precipitado se filtró y se secó para dar 0.407 g
(85%) (p. f.: > 260ºC) del intermedio 6 como una sal sódica
(.Na).
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\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una mezcla de éster etílico del ácido
2-[4-(aminometil)-1-piperidinil]-5-pirimidincarboxílico
(0,0076 mol) y
1-metil-1H-indol-3-carboxaldehído
(0,0114 mol) en CH_{3}OH (80 ml) y se calentó a reflujo durante
15 horas, posteriormente se enfrió hasta temperatura ambiente. Se
añadió NaBH_{4} (0,012 mol) en porciones. La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante la noche, se vertió en H_{2}O y se
extrajo con EtOAc. La capa orgánica se separó, se secó
(MgSO_{4}), se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (3.2
g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice
(eluyente: CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/NH_{4}OH 95/6/0,5:
15-40 \mum). Las fracciones puras se recogieron y
el disolvente se evaporó para dar 1.6 g (53%) del intermedio 7.
Se agitó una mezcla del intermedio 7 (0,0037
mol) e hidróxido sódico (0,0074 mol) en etanol (60 ml) a 50ºC
durante 15 horas, posteriormente se enfrió hasta temperatura
ambiente y el disolvente se evaporó hasta sequedad para dar 1.5 g
(100%) del intermedio 8 como una sal sódica (.Na).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió hidruro sódico (0,0026 mol, al 60% en
aceite) en porciones a una solución de
5-fluoro-1H-indol-3-carboxaldehído
(0,0024 mol) en DMF (8 ml) en corriente de N_{2}. La mezcla se
agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió
1-yodopropano (0,0029 mol) gota a gota. La mezcla se
agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se vertió sobre agua
helada. El precipitado se filtró, se lavó con H2O y se secó para dar
0,44 g (88%) del intermedio 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una mezcla de éster etílico del ácido
2-[4-(aminometil)-1-piperidinil]-5-pirimidincarboxílico
(0,0053 mol), intermedio 9 (0,008 mol) y MgSO_{4} (1,5 g) en
CH_{3}OH (100 ml) y se calentó a reflujo durante la noche en una
corriente de N_{2}, posteriormente se enfrió hasta 5ºC. Se añadió
NaBH_{4} (0,0091 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente
durante 4 horas, se vertió sobre H_{2}O y se extrajo con
CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO_{4}),
se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (3.4 g) se
purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyente:
CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/NH_{4}OH 97/3/0,5;
15-40 \mum). Las fracciones puras se recogieron y
el disolvente se evaporó para dar 1.3 g (54%) del intermedio
10.
Se agitó una mezcla del intermedio (0,0029 mol)
e hidróxido sódico (0,0057 mol) en etanol (50 ml) a 60ºC durante la
noche, posteriormente se enfrió hasta temperatura ambiente y el
disolvente se evaporó para dar 0,8 g (54%) del intermedio 11 como
una sal sódica (.Na).
Se añadió una solución de
4-piperidinmetanol (0,033 mol) en CH_{2}Cl_{2}
(80 ml) a temperatura ambiente a una solución de éster metílico del
ácido
2-cloro-5-pirimidincarboxílico
(0,066 mol) en DIPEA (0,083 mol) en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) en
corriente de N_{2}. La mezcla se agitó a temperatura ambiente
durante 3 horas y 30 minutos, se vertió sobre agua helada y se
extrajo con CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se separó, se secó
(MgSO_{4}), se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo se
disolvió en pentano. El precipitado se filtró y se secó para dar
7,88 g (95%) del intermedio 12.
Se añadió DMSO (0,058 mol) gota a gota a -78ºC a
una solución de dicloruro de etanodiolilo (0,0278 mol) en
CH_{2}Cl_{2} (50 ml) en corriente de N2. La mezcla se agitó
durante 15 minutos. Se añadió una solución del intermedio 12 (0,023
mol) en CH2Cl2 (200 ml) gota a gota. La mezcla se agitó a -78ºC
durante 1 hora, se vertió sobre H_{2}O y se extrajo con
CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO_{4}),
se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo se cristalizó en
éter dietílico. El precipitado se filtró y secó para dar 3,06 g
(54%) del intermedio 13.
Se añadió NaBH_{3}CN (0,019 mol) en porciones
a 5ºC a una solución del intermedio 13 (0,0125 mol) y
1-H-indol-3-etanamina
(0,0125 mol) en CH_{3}OH (250 ml) en corriente de N_{2}. Se
añadió ácido acético (1 ml). La mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante 48 horas. Se añadió K_{2}CO_{3} al 10%. La
mezcla se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se separó,
secó (MgSO_{4}), filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (5
g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice
(eluyente: CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/NH_{4}OH 96/4/0,3;
15-40 \mum). Las fracciones puras se recogieron y
el disolvente se evaporó para dar 3 g (60%) del intermedio 14.
Se agitó una mezcla del intermedio 14 (0,0064
mol) y hidróxido sódico (0,025 mol) en etanol (80 ml) durante la
noche a 80ºC, posteriormente se enfrió a temperatura ambiente y se
evaporó. El residuo se disolvió en éter dietílico. El precipitado
se filtró y secó para dar 2 g (78%) del intermedio 15 como una sal
sódica (.Na).
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\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una mezcla de éster etílico del ácido
2-[4-(aminometil)-1-piperidinil]-5-pirimidincarboxílico
(0,0049 mol), metanosulfonato de
1H-indol-3-etanol
(0,0054 mol) y K2CO3 (0,01 mol) en acetonitrilo (20 ml) y se
calentó a reflujo durante la noche, posteriormente se enfrió, se
vertió en agua helada y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. La capa
orgánica se separó, secó (MgSO_{4}), filtró y el disolvente se
evaporó. El residuo (2.2 g) se purificó por cromatografía en
columna sobre gel de sílice (eluyente:
CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/NH_{4}OH 96/4/0,2;
15-40 \mum). Las fracciones puras se recogieron y
el disolvente se evaporó para dar 0.442 g (22%) del intermedio
16.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió cloruro de metanosulfonilo (0,0018
mol) gota a gota a temperatura ambiente a una solución del
intermedio 16 (0,0012 mol) y Et_{3}N (0,0036 mol) en
CH_{2}Cl_{2} (15 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente
durante la noche, se vertió sobre H_{2}O y se extrajo con
CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se separó, secó (MgSO_{4}),
filtró y el disolvente se evaporó para dar 0,6 g (100%) del
intermedio 17.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una mezcla del intermedio 17 (0,012
mol) e hidróxido sódico (0,036 mol) en etanol (40 ml) a 60ºC
durante 5 horas, posteriormente se evaporó hasta sequedad. El
residuo se disolvió en éter dietílico. La mezcla se evaporó a
sequedad para dar 0,6 g (100%) del intermedio 18 como una sal sódica
(.Na).
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Se añadió cloruro de propanoilo (0,0018 mol) a
0ºC a una solución del intermedio 16 (0,0012 mol) en Et_{3}N (0,5
ml) y CH_{2}Cl_{2} (15 ml). La mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante la noche, se vertió sobre agua helada y se
extrajo con CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se lavó agua, se secó
(MgSO_{4}), filtró y el disolvente se evaporó para dar 0,56 g
(100%) del intermedio 19. Este producto se utilizó directamente en
el siguiente paso de reacción.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una mezcla del intermedio 19 (0,0012
mol) e hidróxido sódico (0,15 g) en etanol (50 ml) a 60ºC durante 6
horas, posteriormente se enfrió hasta temperatura ambiente y se
evaporó. El residuo se disolvió en éter dietílico. La mezcla se
evaporó hasta sequedad para dar 0,55 g (100%) del intermedio 20 como
una sal sódica (.Na). Este producto se utilizó directamente en el
siguiente paso de reacción.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió Et_{3}N (0,0037 mol) a temperatura
ambiente a una solución del intermedio 6 (0,0008 mol),
monoclorhidrato de 1,2-bencenodiamina (0,0019 mol)
y PyBOP (0,0017 mol) en THF (40 ml) y CH_{2}Cl_{2} (40 ml). La
mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 días, se vertió
sobre agua helada y se extrajo con CH2Cl2. La capa orgánica se
separó, secó (MgSO_{4}), filtró y el disolvente se evaporó. El
residuo (1.2 g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel
de sílice (eluyente: CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/NH_{4}OH de
98/2/0,2 a 90/10/1; 3,5 \mum). Las fracciones puras se recogieron
y el disolvente se evaporó para dar 0,049 g (11%) (p. f.: 80ºC) del
compuesto 1.
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Se añadió Et_{3}N (0,0108 mol) a temperatura
ambiente a una solución del intermedio 8 (0,0025 mol) y
monoclorhidrato de 1,2-bencenodiamina (0,0058 mol)
y PyBOP (0,005 mol) en DMF/tamis (50 ml). La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió sobre H2O y se
filtró. El filtrado se extrajo con EtOAc, posteriormente se lavó
tres veces con H_{2}O, se secó (MgSO_{4}), filtró y el
disolvente se eliminó. El residuo (1,8 g) se purificó por
cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyente:
CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/NH_{4}OH 95/5/0,5;
15-40 \mum). Las fracciones puras se recogieron y
el disolvente se evaporó. El residuo obtenido (0,262 g, 22%) se
cristalizó en acetonitrilo/DIPE. El precipitado se filtró y secó
para dar 0,106 g (p. f.: 142ºC) del compuesto 2.
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Se añadió Et_{3}N (0,01 mol) a temperatura
ambiente a una solución del intermedio 15 (0,0025 mol),
monoclorhidrato de 1,2-bencenodiamina (0,0057 mol)
y PyBOP (0,005 mol) en THF (15 ml) y CH_{2}Cl_{2} (15 ml). La
mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió
en H2O y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se
separó, secó (MgSO_{4}), filtró y el disolvente se evaporó. El
residuo (0,13 g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel
de sílice (eluyente: CH_{3}OH/NH_{4}HCO_{3} 60/40; 5 \mum).
Las fracciones puras se recogieron y el disolvente se evaporó para
dar 0,07 g (p. f.: 95ºC) del compuesto 4.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió Et_{3}N (0,01 mol) a temperatura
ambiente a una solución del intermedio 15 (0,0025 mol),
monoclorhidrato de 1,2-bencenodiamina (0,0057 mol)
y PyBOP (0,005 mol) en THF (15 ml) y CH2Cl2 (15 ml). La mezcla se
agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió sobre agua
y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se separó, secó
(MgSO_{4}), filtró y el solvente se evaporó. El residuo (0,13 g)
se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice
(eluyente: CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/NH_{4}OH 92/8/0.5;
15-40 \mum). Las fracciones puras se recogieron y
el solvente se evaporó. Esta fracción (0,13 g) se purificó por
cromatografía en fase inversa sobre gel de sílice (eluyente:
CH_{3}OH/NH_{4}HCO_{3} 60/40; 5 \mum). Las fracciones puras
se recogieron y el solvente se evaporó para dar 0,07 g (p. f.: 95ºC)
del compuesto 4.
Se añadió Et_{3}N (0,6 mol) a una solución del
intermedio 18 (0,001 mol), monoclorhidrato de
1,2-bencenodiamina (0,0024 mol) y PyBOP (0,002 mol)
en THF (5 ml) y CH_{2}Cl_{2} (5 ml). La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 72 horas, se vertió sobre H_{2}O y
se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se separó, secó
(MgSO_{4}), filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (1,5 g)
se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice
(eluyente: CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH/NH_{4}OH 98/2/0,2;
15-40 \mum). Las fracciones puras se recogieron y
el disolvente se evaporó para dar 0,027 g (5%) (p. f.: 105ºC) del
compuesto 5.
Se añadió Et_{3}N (0,0048 mol) a una solución
del intermedio 20 (0,0012 mol), monoclorhidrato de
1,2-bencenodiamina (0,0027 mol) y PyBOP (0,0024
mol) en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) y THF (5 ml). La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 48 horas, se vertió sobre agua y se
extrajo con CH2Cl2. La capa orgánica se separó, secó (MgSO_{4}),
filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (1,5 g) se purificó
por cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyente:
EtOAc/CH_{3}OH/NH_{4}OH 97/3/0,5; 15-40 \mum).
Las fracciones puras se recogieron y el disolvente se evaporó para
dar 0,16 g (25%) del compuesto 6.
La Tabla F-1 enumera los
compuestos que se prepararon de acuerdo con uno de los Ejemplos
anteriores.
El ensayo in vitro para la inhibición de
histona desacetilasa (véase el ejemplo C.1) mide la inhibición de
la actividad enzimática de HDAC obtenida con los compuestos de
fórmula (I).
La actividad celular de los compuestos de
fórmula (I) fue determinada en células tumorales A2780 usando un
ensayo colorimétrico para observar la toxicidad en la célula o la
supervivencia (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods
65: 55-63, 1983) (véase el ejemplo C.2).
La solubilidad de un compuesto mide la capacidad
de un compuesto de permanecer en la solución. En un primer método,
se mide la capacidad de un compuesto para permanecer en una solución
acuosa bajo dilución (véase el ejemplo C.3.a). Las soluciones madre
de DMSO son diluidas con un disolvente tampón acuoso solo en varias
etapas consecutivas. En este método, entonces las mezclas se
escanean posteriormente en el escáner de solubilidad BD Gentest
para determinar la aparición de precipitación. En un segundo método,
la solubilidad de un compuesto a diferentes pH puede ser medida con
el uso de un detector de nitrógeno quimioluminescente (véase el
ejemplo C.3.b).
La permeabilidad de un fármaco expresa su
capacidad de moverse de un medio a otro o a través de éste.
Expresamente su capacidad de moverse por la membrana intestinal en
la corriente sanguínea y/o a partir de la corriente sanguínea hacia
su objetivo. La permeabilidad (véase el ejemplo C.4) puede ser
medida por la formación de una bicapa fosfolipídica de membrana
artificial inmovilizada en un filtro. En el ensayo de la membrana
artificial inmovilizada en un filtro, se forma un "sandwich"
con una placa de microtítulo de 96 pocillos y una placa de filtro
de 96 pocillos, tal que cada compuesto se divide bien en dos cámaras
con una solución donadora en el fondo y una solución aceptadora
encima, separadas por un disco de microfiltro de 125 \mum (poros
0,45 \mum), revestido con una solución de dodecano al 2% (p/v) de
dioleoilfosfatidil-colina, bajo ciertas condiciones
en las que las bicapas multi-lamminares forman
dentro canales de filtro cuando el sistema se pone en contacto con
una solución reguladora acuosa. La permeabilidad de los compuestos
por esta membrana artificial se mide en cm/s. El objetivo es buscar
la penetración de los fármacos a través de una membrana artificial
paralela a 2 pH diferentes: 4,0 y 7,4. La detección del compuesto
se hace con espectrometría UV a una longitud de onda óptima entre
250 y 500 nm.
El metabolismo de los fármacos significa que un
compuesto endobiótico o xenobiótico soluble en lípidos es
enzimáticamente transformado en (a) metabolitos polar, soluble en
agua y excretable. El órgano principal para el metabolismo del
fármaco es el hígado. Los productos metabólicos son a menudo menos
activos que el fármaco parenteral o inactivo. Sin embargo, algunos
metabolitos pueden tener mayor actividad o efectos tóxicos. Así, el
metabolismo del fármaco puede incluir tanto procesos de
"intoxicación" como de "desintoxicación". Uno de los
sistemas enzimáticos principales que determinan la capacidad del
organismo en las transacciones con fármacos y productos químicos se
representa por las monooxigenasas citocromo P450, que son enzimas
dependientes del NADPH. La estabilidad metabólica de los compuestos
puede ser determinada in vitro con el uso de tejido humano
subcelular (véase el ejemplo C.5.a.). En este caso, la estabilidad
metabólica de los compuestos se expresa como el % del fármaco
metabolizado después de una incubación de 15 minutos de estos
compuestos con microsomas. La cuantificación de los compuestos fue
determinada por análisis LC-MS.
Se ha demostrado que una amplia variedad de
agentes antitumorales activa a la proteína p21, incluyendo a agentes
perjudiciales para el ADN e inhibidores de la histona desacetilasa.
Los agentes perjudiciales del ADN activan el gen p21 a través del
supresor tumoral p53, mientras que los inhibidores de histona
desacetilasa activan transcripcionalmente el gen p21 vía el factor
de transcripción Sp1. Así, los agentes perjudiciales de ADN activan
al promotor p21 a través del elemento sensible p53 mientras que los
inhibidores de histona desacetilasa activan al promotor p21 a
través de los sitios sp1 (localizados en la región de -60 bp a +40
bp con respecto al cuadro TATA) conduciendo ambos a una mayor
expresión de la proteína p21. Cuando el promotor p21 en unas
células consiste en un fragmento promotor de 1300 bp de p21 que no
comprende elementos sensibles de p53 no es, en consecuencia,
sensible a los agentes perjudiciales del ADN.
La capacidad de los compuestos para inducir p21
puede ser evaluada mediante una prueba de la capacidad de los
compuestos para inducir p21 como consecuencia de la inhibición de
HDAC a nivel celular. Las células pueden ser establemente
transfectadas con un vector de expresión que contiene un fragmento
promotor de 1300bp de p21 que no comprende los elementos sensibles
a p53 y en el que un aumento de la expresión del gen reportero,
comparado con los niveles de control, identifica si el compuesto
tiene capacidad de inducción con p21. El gen reportero es una
proteína fluorescente y la expresión del gen reportero se mide como
la cantidad de luz de neón emitida (véase el ejemplo C.6).
Los inhibidores de HDAC específicos no deben
inhibir a otras enzimas como las abundantes proteínas CYP P450. Las
proteínas CYP P450 (expresadas en E. coli) 3A4, 2D6 en 2C9
convierten sus sustratos específicos en una molécula fluorescente.
La proteína CYP3A4 convierte al
7-benciloxi-trifluorometil-coumarin
(BFC) en
7-hidroxi-trifluorometil-coumarin.
La proteína CYP2D6 convierte a
3-[2-(N,N-dietil-N-metilamino)etil-7-metoxi-4-metilcoumarin
(AMMC) en hidrocloruro de
3-[2-(N,N-dietilamino)etil-7-hidroxi-4-metilcoumarin
y la proteína CYP2C9 convierte
7-metoxi-4-trifluorometil-coumarin
(MFC) en
7-hidroxi-trifluorometil-coumarin.
Los compuestos que inhiben la reacción enzimática causarán una
disminución de la señal fluorescente.
Se usó el ensayo de actividad fluorescente de
HDAC/kit de detección de fármacos de Biomol (Nº. de cat.
AK-500-0001). El ensayo de
actividad fluorescente de HDAC está basado en el sustrato "Fluor
de Lys" (abreviatura de "Fluorogenic Histone
deAcetilase Lysyl") y la combinación del revelador.
El sustrato Fluor de Lys comprende una cadena lateral de lisina
acetilada. La desacetilación del sustrato sensibiliza al sustrato de
modo que, en la segundo etapa, el tratamiento con el revelador
Fluor de Lys produzca un fluoróforo.
Se incubaron extractos nucleares de HeLa
(proveedor: Biomol) a 60 \mug/ml con 75 \muM de sustrato. El
sustrato Fluor de Lys fue añadido en un tampón que contenía Tris 25
mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM y MgCl_{2}.6H_{2}O 1 mM a pH 7,4.
Después de 30 minutos, fue añadido 1 volumen del revelador. El
fluoróforo fue excitado con luz a 355 nm y la luz emitida (450 nm)
se detectó en un lector de placas fluorométrico. Para cada
experimento, fueron realizados en paralelo los controles (que
contenían extracto nuclear de HeLa y tampón), una incubación en
blanco (que contenía el tampón pero ningún extracto nuclear de HeLa)
y las muestras (que contenían el compuesto disuelto en DMSO y más
diluido en tampón y extracto nuclear HeLa). En el primer caso, los
compuestos fueron probados a una concentración de 10^{-5} M.
Cuando los compuestos mostraron actividad a 10^{-5}M, se realizó
una curva respuesta frente a la concentración en la que los
compuestos fueron probados a concentraciones entre 10^{-5} M y
10^{-9} M. Toda la muestra fue probada 4 veces. En cada prueba, el
valor en blanco fue sustraído tanto del control como de los valores
de la muestra. La muestra control representaba el 100% de la
desacetilatión del sustrato. Para cada muestra, la fluorescencia
fue expresada como un porcentaje del valor medio de los controles.
Cuando se obtuvieron los valores de IC_{50} apropiados (la
concentración del fármaco, tenía que reducir la cantidad de
metabolitos al 50% del control) estos fueron calculados usando el
análisis de protrozos para los datos clasificados. En este
documento, los efectos de los compuestos de prueba son expresados
como pIC_{50} (valor del log negativo del valor de IC_{50})
(véase la Tabla F-2).
Todos los compuestos probados fueron disueltos
en DMSO y fueron hechas otras diluciones en el medio de cultivo.
Las concentraciones de DMSO finales nunca excedieron el 0,1% (v/v)
en los ensayos de proliferación de células. Los controles contenían
células A2780 y DMSO sin compuesto y los blancos contenían DMSO,
pero ninguna célula. Fue disuelto MTT en 5 mg/ml en PBS. Fue
preparado un tampón de glicina que comprendía glicina 0,1 M y NaCl
0,1 M almacenado en un tampón a pH 10,5 con NaOH (1 N) (todos los
reactivo eran de Merck).
Fueron cultivadas células de carcinoma ovárico
humanas A2780 (por amabilidad del doctor T. C. Hamilton [Fox Chase
Cancer Centre, Pensilvania, EE.UU.) en medio RPMI 1640 suplementado
con L-glutamina 2 mM, gentamicina a 50 \mug/ml y
suero de ternero fetal al 10%.
Las células fueron rutinariamente mantenidas
como cultivos en monocapas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al
5% humedecida. Las células fueron repasadas una vez por semana
usando una solución de tripsina/EDTA en una proporción divisoria
1:40. Todos los medios y los suplementos fueron obtenidos de Life
Technologies. Las células estaban sin ninguna contaminación de
micoplasma como se determina usando el kit Gen-Probe
Mycoplasma Tissue Culture (proveedor: BioMerieux).
Las células fueron sembradas en placas de 96
pocillos de cultivo de NUNCTM (Proveedor: Life Technologies) y se
les permitió adherirse al plástico durante la noche. Las densidades
usadas para la puesta en placa era 1500 células por pocillo en un
volumen total de 200 \mul de medio. Después de la adherencia de
las células a las placas, el medio fue cambiado y los fármacos y/o
los disolventes fueron añadidos a un volumen final de 200 \mul. A
los cuatro días siguientes de la incubación, el medio fue sustituido
por 200 \mul de medio recién preparado y la densidad de las
células y la viabilidad fue evaluada usando un ensayo MTT. A cada
pocillo, fueron añadidos 25 \mul de solución MTM y las células
fueron incubadas durante 2 horas más a 37ºC. El medio fue aspirado
con cuidado después y el producto MTT-formazan azul
fue solubilizado por la adición de 25 \mul de tampón de glicina
seguido de 100 \mul de DMSO. Las placas de microprueba fueron
agitadas durante 10 minutos en un agitador de microplacas y fue
medida la absorbancia a 540 nm usando un espectrofotómetro de 96
pocillos Emax (Proveedor: Sopachem). En cada experimento, los
resultados para cada condición experimental son la media de 3
pocillos repetidos. Para el rastreo inicial, los compuestos fueron
probados a una concentración fija única de 10^{-6} M. Para los
compuestos activos, los experimentos fueron repetidos para
establecer las completas curvas respuesta frente a la
concentración. Para cada experimento, los controles (que no
contenían ningún fármaco) y una incubación en blanco (que no
contenía ninguna célula o fármaco) fueron realizados en paralelo.
El valor del blanco fue restado de todos los valores de control y
muestra. Para cada muestra, el valor medio para el crecimiento de
las células (en unidades de absorbancia) fue expresado como el
porcentaje del valor medio para el crecimiento de las células del
control. Cuando era apropiado, los valores de IC_{50} (la
concentración del fármaco tenía que reducir el crecimiento de las
células en un 50% del control) fueron calculados usando el análisis
de protrozos para los datos clasificados (Finney, D. J., Probit
Analyses, 2ª Ed. Capítulo 10, "Graded Responses",
Cambridge University Press, Cambridge 1962). En este documento, los
efectos de los compuestos de prueba son expresados como pIC_{50}
(el valor del log negativo del valor de IC_{50}) (véase la Tabla
F-2).
Se obtuvieron disoluciones madre en DMSO a
partir de 5000-9,8 \muM (diluciones ½) en DMSO en
una placa de disolución madre de 96 pocillos (200 \mul por
pocillo). Después de cada dilución, las muestras se mezclaron. Las
alícuotas de estas disoluciones de DMSO (2 \mul) se transfirieron
entonces a otras 2 placas de tampón de 96 pocillos, que contienen
200 \mul por pocillo de tampón acuoso. Cada una de las placas
contiene tampón acuoso pH 7,4 o tampón acuoso pH 4,0. Después de la
última dilución, las placas de tampón se mezclaron, y las muestras
se estabilizaron a temperatura ambiente durante ½ hora. La dilución
se realizó por duplicado para cada compuesto, para excluir errores
ocasionales. Las mezclas se escanearon entonces en el Escáner de
Solubilidad BD Gentest en busca de la aparición de precipitación. La
cinética de la solubilidad se calculó por interpolación, basándose
en la ausencia/presencia de precipitado en las mezclas. La
clasificación se llevó a cabo en 3 clases.
Los compuestos con solubilidad elevada
obtuvieron una puntuación de 3, y tienen una solubilidad mayor o
igual a 50 \muM. Los compuestos con solubilidad media obtuvieron
una puntuación de 2, y tienen una solubilidad mayor que 10 \muM y
menor que 50 \muM. Los compuestos con baja solubilidad obtuvieron
una puntuación de 1, y para estos compuestos la solubilidad es
menor o igual a 10 \muM.
Se ensayaron tres compuestos, y tuvieron una
puntuación de 1 a ambos valores de pH en el ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
La solubilidad de un compuesto, a pH 2,3,
también puede ser medida con el uso de un detector de nitrógeno
quimioluminescente (véase la Tabla F-2).
Fueron diluidas las muestras madre (alícuotas de
10 \mul de una solución madre 5 mM en DMSO al 100%) en una placa
de pocillos profundos o placa de premezcla que contenía 2 ml de un
sistema tampón acuoso a pH 4 o pH 7,4 (Concentrado de Solución del
Sistema de PSR4 (pION)). Antes de que las muestras fueran añadidas a
la placa de referencia, fueron añadidos a los pocillos 150 \mul
del tampón y fue realizada una medida UV del blanco. A partir de
entonces, el tampón fue desechado y la placa fue usada como placa de
referencia. Todas las medidas fueron hechas en placas resistentes a
UV (proveedor: Costar o Greiner).
Después de la medida del blanco de la placa de
referencia, fueron añadidos a la placa de referencia 150 \mul de
las muestras diluidas y fueron añadidos a la placa donadora 1200
\mul de las muestras diluidas. Una placa de filtro aceptadora I
(proveedor: Millipore, tipo:MAIP N45) fue revestida de 4 \mul de
la solución artificial formadora de membrana
(1,2-Dioleoil-sn-Glicer-3-Fosfocolina
en Dodecano conteniendo
2,6-Di-terc-butil-4-metilfenol
al 0,1% y fue colocada encima de la placa donadora 1 para formar un
"sandwich". El tampón (200 \mul) fue dispensado en los
pocillos aceptadores en la parte superior. El sandwich fue cubierto
con una tapa y fue almacenado durante 18 h a temperatura ambiente
en oscuridad.
Una medida en blanco de la placa aceptadora 2
fue realizada por la adición de 150 \mul de tampón a los pocillos,
seguido de una medida UV. Después de la medida en blanco de la
placa aceptadora 2, el tampón fue desechado y 150 \mul de la
solución aceptadora fueron transferidos de la placa de filtro
aceptadora I a la placa aceptadora 2. Después, la placa de filtro
aceptadora I fue retirada del sandwich. Después de la medida del
blanco de la placa donadora 2 (véase más arriba), 150 \mul de la
solución donadora fueron transferidos de la placa donadora 1 a la
placa donadora 2. Los espectros UV de la placa donadora 2, placa
aceptadora 2 y los pocillos de placa de referencia fueron
explorados (con un SpectraMAX 190). Todos los espectros fueron
tratados para calcular la permeabilidad con el Software PSR4p
Command. Todos los compuestos fueron medidos por triplicado. Se
usaron carbamazepina, griseofulvin, acicloguanisina, atenolol,
furosemida y clorotiazida como estándares en cada experimento. Los
compuestos fueron clasificados en 3 categorías por tener una
permeabilidad baja (efecto medio < 0,5 x 10^{-6} cm/s;
puntuación 1), una permeabilidad media (1 x 10^{-6} cm/s>
efecto medio > 0,5 x 10^{-6} cm/s; puntuación 2) o una permeabilidad alta (> 1 x 10^{-6} cm/s; puntuación 3).
efecto medio > 0,5 x 10^{-6} cm/s; puntuación 2) o una permeabilidad alta (> 1 x 10^{-6} cm/s; puntuación 3).
Se hicieron preparaciones de tejido subcelulares
según Gorrod et al. (Xenobiotica 5:
453-462, 1975) por separación centrífuga después de
una homogeneización mecánica del tejido. El tejido hepático fue
aclarado en tampón Tris-HCl 0,1 M helado (pH 7,4)
para lavar la sangre en exceso. El tejido fue entonces secado,
transferido, pesado y cortado groseramente con tijeras quirúrgicas.
Los pedazos de tejido fueron homogeneizados en 3 volúmenes de
tampón fosfato 0,1 M helado (pH 7,4) usando o bien un
Potter-S (Braun, Italia) equipado con una manivela
de Teflón o bien un homogeneizador Omni-mix de
Sorvall, durante 7 x 10 segundos. En ambos casos, el matraz fue
mantenido en hielo durante el proceso de homogeneización.
Los homogenados de tejido se centrifugaron a
9000 x g durante 20 minutos a 4ºC usando una centrifugadora Sorvall
o Ultracentrifugadora Beckman. El sobrenadante resultante fue
almacenado a -80ºC y se denominó "S9".
La fracción S9 puede ser centrifugada más a
100,000 x g durante 60 minutos (4ºC) usando una ultracentrifugadora
Beckman. Ell sobrenadante resultante fue aspirado con cuidado,
dividido en alícuotas y fue denominado "citosol". El pelete
fue suspendido de nuevo en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) en un
volumen final de 1 ml por 0,5 g de peso de tejido original y fue
denominado "microsomas".
Todas las fracciones subcelulares fueron
divididas en alícuotas, fueron inmediatamente congeladas en
nitrógeno líquido y almacenadas a -80ºC hasta su uso.
Para las muestras que se probaron, la mezcla de
incubación contenía PBS (0,1M), compuesto (5 \muM), microsomas (1
mg/ml) y un sistema de generación de NADPH
(glucosa-6-fosfato 0,8 mM, cloruro
de magnesio 0,8 mM y 0,8 unidades de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa).
Las muestras de control contenían el mismo material pero los
microsomas fueron sustituidos por microsomas inactivados con calor
(10 minutos a 95 grados Celsius). La recuperación de los compuestos
en las muestras de control era siempre del 100%.
Las mezclas fueron preincubadas durante 5
minutos a 37 grados Celsius. La reacción fue comenzada en el punto
de tiempo cero (t=0) por la adición de NADP 0,8 mM y las muestras
fueron incubadas durante 15 minutos (t=15). La reacción fue
terminada por la adición de 2 volúmenes de DMSO. Entonces, las
muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 900 x g y los
sobrenadantes fueron almacenados a temperatura ambiente durante no
más de 24 h antes del análisis. Todas las incubaciones fueron
realizadas por duplicado. El análisis de los sobrenadantes fue
realizado con análisis LC-MS. La elución de las
muestras fue realizada en MS C18 de Xterra (50 x 4,6 mm, 5 \mum,
Waters, EE.UU). Fue usado un sistema HPLC 2790 de Alliance
(Proveedor: Waters, EE.UU.). La elución se realizó con tampón A
(acetato de amonio 25 mM (pH 5,2) en H_{2}O/acetonitrilo (95/5)),
siendo el disolvente B acetonitrilo y el disolvente C metanol a un
caudal de 2,4 ml/min. El gradiente empleado aumentaba la
concentración de la fase orgánica desde 0% a más del 50% de B y al
50% de C en 5 minutos hasta el 100% de B en 1 minuto de modo lineal
y la concentración de la fase orgánica fue mantenida estacionaria
durante 1,5 minutos más. El volumen de inyección total de las
muestras fue 25 \mul.
Un espectrómetro de masas con triple quadrupolo
de Quattro (proveedor: Micromass, Manchester, Reino Unido) ajustado
y una fuente ESI fue usada como detector. La fuente y la temperatura
de desolvatación fueron puestas a 120 y 350ºC, respectivamente y
fue usado nitrógeno como nebulizador y gas secante. Los datos fueron
adquiridos en el modo de exploración positivo (reacción de ión
única). El voltaje del cono fue puesto a 10 V y el tiempo de espera
era 1 segundo.
La estabilidad metabólica fue expresada como el
% de metabolismo del compuesto después de 15 minutos de incubación
en presencia de microsomas activados (E (act)) (% de metabolismo =
100% - ((corriente iónica total (TIC) x E(act) x a t =
15) / TIC de E (act) a t = 0) x 100). Los compuestos que tenían un
porcentaje de metabolismo menor del 20% fueron definidos como
metabólicos muy estables y fueron dados una puntuación de 3. Los
compuestos que tenían un metabolismo entre el 20 y el 70% fueron
definidos como intermediamente estables y fueron dados una
puntuación de 2. Los compuestos que mostraron un porcentaje de
metabolismo más alto que 70 fueron definidos como metabólicos poco
estables y fueron dados una puntuación de 1. Siempre eran incluidos
tres compuestos de referencia cuando se realizaba una proyección de
estabilidad metabólica. El Verapamil fue incluido como un compuesto
con una estabilidad metabólica baja (% metabolismo=73%). La
Cisaprida fue incluida como un compuesto con una estabilidad
metabólica media (% metabolismo = 45%) y el propanol fue incluido
como un compuesto con una estabilidad metabólica de intermedia a
alta (metabolismo del 25%). Estos compuestos de referencia fueron
usados para validar el ensayo de estabilidad metabólica. Dos
compuestos fueron probados y tenían una puntuación de 3 y una
puntuación de 2 respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron cultivadas células A2780 (ATCC) en medio
RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%, L-glutamina 2
mM y gentamicina a 37ºC en una incubadora humedecida con CO_{2}
al 5%. Todas las soluciones del cultivo celular son proporcionadas
por Gibco-BRL (Gaithersburg, Md.). Otros materiales
fueron proporcionados por Nunc.
El ADN genómico fue extraído de células A2780
proliferantes y fue usado como plantilla para el aislamiento por
PCR anidada del promotor p21. La primera amplificación fue realizada
durante 20 ciclos a una temperatura de hibridación de 55ºC usando
el par de oligonucleótidos GAGGGCGCGGTGCTTGG y TGCCGCCGCTCT
CTCACC con ADN genómico como plantilla. El fragmento de 4,5 kilobytes que resulta y que contiene los fragmentos de -4551 a +88 con relación al cuadro TATA fue amplificado de nuevo con los oligonucleótidos TCGGGTACC
GAGGGCGCGGTGCTTGG y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con hibridación a 88ºC lo que causaba un fragmento de 4,5 kilobytes y posteriormente con el par de oligonucleótidos TCGGGTA
CCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con hibridación a 88ºC lo que causaba un fragmento de 1,3 kilobytes que contiene el fragmento de -1300 a +88 con relación al cuadro TATA. Los sitios de restricción XhoI y KpnI presentes en los oligonucleótidos (secuencia subrayada) fueron usados para la subclonación.
CTCACC con ADN genómico como plantilla. El fragmento de 4,5 kilobytes que resulta y que contiene los fragmentos de -4551 a +88 con relación al cuadro TATA fue amplificado de nuevo con los oligonucleótidos TCGGGTACC
GAGGGCGCGGTGCTTGG y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con hibridación a 88ºC lo que causaba un fragmento de 4,5 kilobytes y posteriormente con el par de oligonucleótidos TCGGGTA
CCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con hibridación a 88ºC lo que causaba un fragmento de 1,3 kilobytes que contiene el fragmento de -1300 a +88 con relación al cuadro TATA. Los sitios de restricción XhoI y KpnI presentes en los oligonucleótidos (secuencia subrayada) fueron usados para la subclonación.
El reportero de luciferasa fue quitado del
pGL3-básico y fue sustituido por el reportero
ZsGreen (a partir del plásmido pZsGreen1-N1) en los
sitios de restricción KpnI y XbaI. El
pGL3-básico-ZsGreen-1300
fue construido vía la introducción del fragmento de 1,3 kilobytes
arriba mencionado de la región promotora p21 humana en
pGL3-basic-ZsGreen en los sitios
XhoI y KpnI. Todas las enzimas de restricción son proporcionadas por
Boehringer Manheim (Alemania). Las células A2780 fueron puestas en
placas en una placa de 6 pocillos a una densidad de 2 x 10^{5}
células, incubadas durante 24 horas, y transfectadas con 2 \mug de
pGL3-basic-ZsGreen-1300
y 0,2 \mug del vector pSV2neo usando Lipofectamina 2000
(Invitrogen, Bruselas, Bélgica) como se describe por el fabricante.
Las células transfectadas fueron seleccionadas durante 10 días con
G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, Md.) y fueron
cultivadas suspensiones de células solas. Después de tres semanas,
fueron obtenidos clones individuales.
Los clones seleccionados de A2780 fueron
ampliados y sembrados a 10000 células por pocillo en placas de 96
pocillos. 24 horas después de la siembra, las células fueron
tratadas durante unas 24 horas adicionales con los compuestos (que
afectan a los sitios sp1 en la región promotora proximal p21).
Posteriormente, las células fueron fijadas con PFA al 4% durante
30' y fueron contrateñidas con tinte de Hoechst. La activación del
promotor p21 que conduce a la producción de ZsGreen y así a la
generación de fluorescencia, fue supervisada por Ascent Fluoroskan
(Thermo Labsystems, Bruselas, Bélgica).
Para cada experimento, los controles (que no
contenían ningún fármaco) y una incubación en blanco (que no
contenía ninguna célula o fármaco) fueron realizados en paralelo. El
valor en blanco fue sustraído de todos los valores de control y
muestra. Para cada muestra, el valor para la inducción de p21 fue
expresado como el porcentaje del valor para el p21 presente en el
control. Un porcentaje de inducción más alto que el 130% fue
definido como una inducción significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los compuestos probados fueron disueltos
en DMSO (5 mM) y se hizo una dilución adicional a 5 x 10^{-4} M
en acetonitrilo. Otras diluciones fueron hechas en tampón de ensayo
(tampón fosfato NaK 0,1M, pH 7,4) y la concentración del disolvente
final nunca fue más alta que el 2%.
El ensayo para la proteína CYP3A4 comprende por
pocillo 15 pmol de P450/mg de proteína (en tampón fosfato NaK 0,01M
+ KCl al 1,15%), un sistema de generación de NADPH
(glucosa-6-fosfato 3,3 mM, 0,4 U/ml
de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, NADP 1,3 mM y MgCl_{2}.6H_{2}O 3,3 m; en tampón
de ensayo) y el compuesto en un volumen de ensayo total de 100
\mul. Después de una preincubación de 5 minutos a 37ºC la reacción
enzimática fue comenzada con la adición de 150 \muM del sustrato
sonda fluorescente BFC en tampón de ensayo. Después de una
incubación de 30 minutos a temperatura ambiente la reacción fue
terminada después de la adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las
determinaciones fluorescentes fueron realizadas a una longitud de
onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de
535 nm. El Ketoconazol (valor IC_{50} = 3 x 10^{-8} M) fue
incluido como el compuesto de referencia en este experimento. El
ensayo para la proteína CYP2D6 comprende por pocillo 6 pmol de
P450/mg de proteína (en tampón fosfato NaK 0,01M + KCl al 1,15%),
un sistema de generación de NADPH
(glucosa-6-fosfato 0,41 mM, 0,4 U/ml
de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
NADP 0,0082 mM y MgCl_{2}.6H_{2}O 0,41 mM en tampón de ensayo)
y el compuesto en un volumen de ensayo total de 100 \mul. Después
de una preincubación de 5 minutos a 37ºC la reacción enzimática fue
comenzada con la adición de 3 \muM del sustrato sonda fluorescente
AMMC en tampón de ensayo. Después de una incubación de 45 minutos a
temperatura ambiente la reacción fue terminada después de la
adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las determinaciones
fluorescentes fueron realizadas a una longitud de onda de
excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. La
Quinidina (valor IC_{50} < 5 x 10^{-8}M) fue incluida como
el compuesto de referencia en este experimento.
El ensayo para la proteína CYP2C9 comprende por
pocillo 15 pmol de P450/mg de proteína (en en tampón fosfato NaK
0,01M + KCl al 1,15%), un sistema de generación de NADPH
(glucosa-6-fosfato 3,3 mM, 0,4 U/ml
de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, NADP 1,3 mM y MgCl_{2}.6H_{2}O 3,3 mM en tampón
de ensayo) y el compuesto en un volumen de ensayo total de 100
\mul. Después de una preincubación de 5 minutos a 37ºC la reacción
enzimática fue comenzada con la adición de 200 \muM del sustrato
sonda fluorescente MFC en tampón de ensayo. Después de una
incubación de 30 minutos a temperatura ambiente la reacción fue
terminada después de la adición de 2 volúmenes de acetonitrilo. Las
determinaciones fluorescentes fueron realizadas a una longitud de
onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de
535 nm. El Sulfafenazol (valor IC_{50} = 6,8 x 10^{-7}M) fue
incluido como el compuesto de referencia en este experimento.
\newpage
Con fines de rastreo inicial, los compuestos
fueron probados a una concentración fija única de 1 x 10^{-5} M.
Para los compuestos activos, los experimentos fueron repetidos para
establecer las curvas respuesta completa frente a la concentración.
Para cada experimento, los controles (que no contenían ningún
fármaco) y una incubación en blanco (que no contenía ninguna enzima
o fármaco) fueron realizados en paralelo. Todos los compuestos
fueron analizado por cuadruplicado. El valor en blanco fue restado
de todos los valores de control y muestra. Para cada muestra, el
valor medio de la actividad de P450 de la muestra (en unidades de
fluorescencia relativas) fue expresado como el porcentaje del valor
medio de la actividad de P450 del control. El porcentaje de
inhibición fue expresado como el 100% menos el valor medio de la
actividad de P450 de la muestra. Cuando fue apropiado, fueron
calculados los valores de IC_{50} (la concentración del fármaco
tenía que reducir la actividad de P450 al 50% del control).
La Tabla F-2 muestra en una
lista los resultados de los compuestos que fueron probados según los
ejemplos C.1, C.2 y C.3.b (un espacio en blanco indica que no hay
disponible ningún valor para el compuesto en cuestión)
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 100 g de un compuesto de fórmula
(I), 570 g de lactosa y 200 g de almidón se mezcla bien y a partir
de entonces se humedece con una solución de dodecilsulfato de sodio
de 5 g y 10 g de polivinil-pirrolidona en
aproximadamente 200 ml de agua. La mezcla en polvo mojada se tamiza,
se seca y se tamiza otra vez, Entonces se añaden 100 g de celulosa
microcristalina y 15 g de aceite vegetal hidrogenado. Se mezcla todo
bien y se prensa como comprimidos, dando 10,000 comprimidos,
comprendiendo cada uno 10 mg de un compuesto de fórmula (I).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 10 g de metilcelulosa en 75 ml
de etanol desnaturalizado se añade una solución de 5 g de
etilcelulosa en 150 ml de diclorometano. Entonces se añaden 75 ml de
diclorometano y 2,5 ml de 1,2,3-propanotriol, 10 g
de polietilenglicol son fundidos y disueltos en 75 ml de
diclorometano. La solución última se añade a la primera y luego se
añaden 2,5 g de octadecanoato de magnesio, 5 g de
polivinilpirrolidona y 30 ml de suspensión de color concentrada y
todo se homogeniza. Los núcleos del comprimido se revisten con la
mezcla así obtenida en un aparato de revestimiento.
Claims (10)
1. Un compuesto de fórmula (I),
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
las formas N-óxido, las sales de
adición farmacéuticamente aceptables y sus formas isoméricas
estereoquímicas, en el
que
n es un número entero con valor 0, 1 ó 2 y
cuando n es 0, entonces se espera que sea un enlace directo;
m es un número entero con valor 1 ó 2;
X es N o CH;
Y es O, S o NR^{8}; donde
R^{8} es hidrógeno, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi-alquilo
C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6},
cicloalquil C_{3-6}-metilo,
fenil- alquilo C_{1-6},
-C(=O)-CHR^{9}R^{10} o
-S(=O)_{2}-N(CH_{3})_{2};
donde
cada R^{9} y R^{10} es independientemente
hidrógeno, amino, alquilo C_{1-6} o
amino-alquilo C_{1-6}; y
cuando Y es NR^{8} y R^{2} está en la
posición 7 del indolilo, entonces R^{2} y R^{8} juntos pueden
formar el radical bivalente
- -(CH_{2})_{2}-
- (a-1) o
- -(CH_{2})_{3}-
- (a-2);
R^{1} es hidrógeno, alquilo
C_{1-6}, hidroxi-alquilo
C_{1-6}, ciano-alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-sulfonilo, alquil
C_{1-6}-carbonilo, o mono- o
di-(alquil
C_{1-6})-aminosulfonilo;
R^{2} es hidrógeno, hidroxi, amino, halo,
alquilo C_{1-6}, ciano, alquenilo
C_{2-6}, polihalo-alquilo
C_{1-6}, nitro, fenilo, alquil
C_{1-6}-carbonilo,
hidroxicarbonilo, alquil
C_{1-6}-carbonilamino, alquil
C_{1-6}-oxi, o mono- o di-(alquil
C_{1-6})amino;
R^{3} es hidroxi o amino;
R^{4} es hidrógeno, tienilo, furanilo o fenilo
y cada tienilo, furanilo o fenilo puede estar opcionalmente
sustituido con halo, amino, nitro, ciano, hidroxi, fenilo, alquilo
C_{1-6}, (di-alquil
C_{1-6})-amino, alquilo
C_{1-6}-oxi,
fenil-alquil
C_{1-6}-oxi,
hidroxi-alquilo C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxicarbonilo,
hidroxicarbonilo, alquil
C_{1-6}-carbonilo,
polihalo-alquil
C_{1-6}-oxi,
polihalo-alquilo C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-sulfonilo,
hidroxicarbonil-alquilo C_{1-6},
alquil C_{1-6}-carbonilamino,
aminosulfonilo, aminosulfonil-alquilo
C_{1-6}, isoxazolilo, aminocarbonilo,
fenil-alquenilo C_{2-6},
fenil-alquinilo C_{3-6} o
piridinil-C_{3-6} alquinilo;
R^{5}, R^{6} y R^{7} son cada uno
independientemente hidrógeno, amino, nitro, furanilo, halo, alquilo
C_{1-6}, alquil
C_{1-6}-oxi, trifluorometilo,
tienilo, fenilo, alquil C_{1-6}- carbonilamino,
aminocarbonil-alquilo C_{1-6} o
-C\equivC-CH_{2}-R^{11}.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
donde:
- a)
- n es 0 ó 1;
- b)
- m es 1 ó 2;
- c)
- X es N o CH;
- d)
- Y es NR^{8} donde R^{8} es hidrógeno, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-6} o cicloalquil C_{3-6}-metilo;
- e)
- R^{1} es hidrógeno, alquilo C_{1-6}, hidroxi-alquilo C_{1-6}, alqui C_{1-6}-carbonilo o alquil C_{1-6}-sulfonilo;
- f)
- R^{2} es hidrógeno o halo;
- g)
- R^{3} es amino;
- h)
- R^{4} es hidrógeno o tienilo; y
- i)
- R^{5}, R^{6} y R^{7} son hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 donde:
- a)
- n es 1;
- b)
- m es 1;
- c)
- X es N;
- d)
- Y es NR^{8} donde R^{8} es metilo;
- e)
- R^{1} es hidrógeno;
- f)
- R^{2} es hidrógeno o halo;
- g)
- R^{3} es amino;
- h)
- R^{4} es hidrógeno o tienilo; y
- i)
- R^{5}, R^{6} y R^{7} son cada uno hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 donde el compuesto es el compuesto No.2, a saber, el compuesto de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5. Una composición farmacéutica que comprende a
vehículos farmacéuticamente aceptables y como ingrediente activo
una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto según se
reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un proceso de preparar una composición
farmacéutica según se reivindica en la reivindicación 5, en el que
los vehículos farmacéuticamente aceptables y un compuesto según se
reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 son
profundamente mezclados.
7. Un compuesto según se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso como una
medicina.
8. El uso de un compuesto según se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de enfermedades proliferativas.
9. Una combinación de un agente anticáncer y un
inhibidor de HDAC según se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
\newpage
10. Un proceso para preparar un compuesto según
se reivindica en la reivindicación 1, caracterizado por hacer
reaccionar un intermedio de fórmula (II), donde M es hidrógeno o un
metal alcalino, con un compuesto de fórmula (III), en presencia de
una base:
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