ES2321047T3 - Variantes de fitasa. - Google Patents

Abstract

Fitasa que difiere de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Peniophora lycii de la Fig. 6 en una o más de las siguientes posiciones, usando la numeración de posición correspondiente a P. lycii de la Fig. 1: D45S; T61R; A115N; L118V; H126S,V; G172P; E173Q,S; D201E; D203R, K, S; N215A, P; M238L; V264R, I; G302R,H; T337Q,S,G; V339I; P340A; E360R; V365L,A,S; D366V,S; E411K,T.

Description

Variantes de fitasa.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a una fitasa que difiere de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Peniophora lycii de la fig. 6 en una o más de las siguientes posiciones, usando la numeración de posición correspondiente a P. lycii de la fig. 1: D45S; T61R; A115N; L118V; H126S.V; G172P; E173Q.S; D201E; D203R,K,S; N215A, P; M238L; V264R, I; G302R, H; T337Q, S, G; V339I; P340A; E360R; V365L,A,S; D366V,S; E411 K,T., las secuencias clonadas de ADN correspondientes, un método para producir este tipo de variantes de fitasa, y el uso del mismo para varias aplicaciones industriales.

Antecedentes de la invención

El ácido fítico o mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexaquis dihidrógeno fosfato (o para abreviar mio-inositol hexaquisfosfato) es la fuente primaria de inositol y la forma de almacenamiento primaria de fosfato en semillas de planta. La fitina es una mezcla de potasio, magnesio y sal cálcica de inositol.

Las fracciones de fosfato ácido fítico forma quelatos de cationes divalentes y trivalentes tales como iones metálicos, en ausencia de los iones nutricionalmente esenciales de calcio, hierro, zinc y magnesio, al igual que los metales traza de manganeso, cobre y molibdeno.

El ácido fítico y sus sales, fitatos, con frecuencia no son metabolizados, es decir, ni el fósforo de las mismas, ni los iones metálicos quelatados están disponibles nutricionalmente.

Por consiguiente, los alimentos y los preparados alimenticios necesitan suplementarse con fosfato inorgánico y, con frecuencia, los iones nutricionalmente esenciales tales como el hierro y el calcio también se deben suplementar.

Aún más, el fósforo de fitato pasa a través del tracto gastrointestinal de animales de este tipo y es excretado con el abono, dando como resultado una contaminación de fosfato indeseable del medio ambiente, produciendo p. ej. una eutroficación del medio ambiente acuático y un crecimiento extensivo de algas.

Ácido fítico o fitatos, siendo dichos términos, a menos que se indique lo contrario, usados en el presente contexto como sinónimos o al azar, son degradables por las fitasas.

De la producción de fitasas por plantas al igual que por microorganismos se ha presentado un informe. Entre los microorganismos se reconocen bacterias productoras de fitasa al igual que hongos productores de fitasa.

Hay diferentes descripciones de hongos filamentosos productores de fitasa del filum fúngico Ascomycota (ascomicetos). En particular, hay diferentes referencias para los ascomicetos productores de fitasa del género Aspergillus tales como el Aspergillus terreus (Yamada et al., 1986, Agric. Biol. Chem. 322:1275-1282). La clonación y expresión del gen de fitasa del Aspergillus Niger var. Awamori también ha sido descrita (Piddington et al., 1993, Gene 133:55-62). En EP 0420358 se describe la clonación y expresión de una fitasa de Aspergillus ficuum (Niger). En EP 0684313 se describe la clonación y expresión de fitasas de los ascomicetos Aspergillus niger, Myceliophthora thermophila, y Aspergillus terreus. Además se dan algunas secuencias parciales de fitasas de Aspergillus nidulans, Talaromyces termofilus, Aspergillus fumigatus y de otra cepa de Aspergillus terreus.

La clonación y expresión de una fitasa de Thermomyces lanuginosus se describe en WO 97/35017.

Actualmente existe una necesidad por parte de las fitasas de poseer propiedades modificadas o características, p. ej. las fitasas de termoestabilidad aumentada, de un pH óptimo alterado (para los tratamientos in vitro se desea un pH óptimo alto, y para los tratamientos in-vivo en el tracto gastro-intestinal uno bajo), y/o de una actividad específica más alta.

Resumen de la invención

Esta invención se refiere a una fitasa que difiere de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Peniophora lycii de la fig. 6 en 5 una o más de las siguientes posiciones, usando la numeración de posición correspondiente a P. lycii de la fig. 1: D45S; T61R; A115N; L118V; H126S.V; G172P; E173Q,S; D201 E; D203R,K,S; N215A,P; M238L; V264R,I; G302R,H; T337Q,S,G; V339I; P340A; E360R; V365L,A,S; D366V,S; E411K,T., las 10 secuencias de ADN clonadas correspondientes, un método de producción de este tipo de variantes de fitasa, y el uso del mismo para varias aplicaciones industriales.

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Breve descripción de los dibujos

En la descripción de la invención detallada de abajo se hace referencia a los dibujos, de los cuales

Fig. 1: es un alineamiento de trece secuencias de fitasa específicas (un alineamiento de secuencia múltiple según el programa PileUp; GapWeight: 3.000; GapLengtWeight: 0.100);

Fig. 2: esta figura muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una primera fitasa ("P. involtus-A1") derivada de la cepa CBS 100231 de Paxillus involutus que fue depositada el 28.11.97; el plásmido de expresión pYES 2.0 que comprende la secuencia de ADNc en su longitud total fue transformado en la cepa DSM 11842 de E. coli que fue depositada el 12.11.97 (véase WO 98/28409);

Fig. 3: esta figura muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una segunda fitasa ("P. involtus-A2") derivada de la cepa CBS 100231 de Paxillus involutus que fue depositada el 28.11.97; el plásmido de expresión pYES 2.0 que comprende la secuencia de ADNc en su longitud total fue transformado en la cepa DSM 11843 de E. coli que fue depositada el 12.11.97 (véase WO 98/28409);

Fig. 4: esta figura muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("T. pubescens") derivada de la cepa CBS 100232 de Trametes pubescens que fue depositada el 28.11.97; el plásmido de expresión pYES 2.0 que comprende la secuencia de ADNc en su longitud total fue transformado en la cepa DSM 11844 de E. coli que fue depositada el 12.11.97 (véase WO 98/28409);

Fig. 5: esta figura muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("A. pediades") derivada de la cepa CBS 900.96 de Agrocybe pediades depositada el 04.12.96; el plásmido de expresión pYES 2.0 que comprende la secuencia de ADNc en su longitud total fue transformada en la cepa DSM 11313 de E. coli que fue depositada el 02.12.96 (véase WO 98/28409);

Fig. 6: esta figura muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("P. lycii") derivada de la cepa CBS 686.96 de Peniophora lycii que fue depositada el 04.12.96; el plásmido de expresión pYES 2.0 que comprende la secuencia de ADNc en su longitud total fue transformada en la cepa DSM 11312 de E. coli que fue depositada el 02.12.96 (véase WO 98/28409);

Fig. 7: esta figura es igual a la figura 2 de EP 0684313 y muestra el aminoácido y secuencia de ADN de una fitasa ("M. thermophila") derivada de la cepa ATCC 48102 (=ATCC 74340) de Myceliophthora thermophila que fue redepositada el 14.03.97;

Fig. 8: esta figura muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("A. fumigatus") derivada de la cepa ATCC 13073 de Aspergillus fumigatus (véase EP 0897985);

Fig. 9: esta figura muestra la secuencia de aminoácidos ("Conphys") y la secuencia de ADN de una fitasa de consenso de ascomiceto (en el presente contexto nombrada como "consphyA") (véase EP 0897985);

Fig. 10: esta figura muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("A. nidulans") derivada de la cepa DSM 9743 de Aspergillus nidulans (véase EP 0897985);

Fig. 11: esta figura es igual a la figura 8 de EP 0420358 y muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("A. ficuum") derivada de la cepa NRRL-3135 de Aspergillus ficuum;

Fig. 12: esta figura es igual a la figura 1 de EP 0684313 y muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("A. terreus") derivada de la cepa CBS 220.95 de Aspergillus terreus;

Fig. 13: esta figura muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("T. thermo") derivada de la cepa ATCC 20186 (=ATCC 74338) de Talaromyces thermophilus que fue redepositada el 14.03.97 (véase EP 0897985);

Fig. 14: esta figura es igual a la figura 2 de WO 97/35017 y muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("T. lanuginosa") derivada de la cepa CBS 586.94 de Thermomyces lanuginosus; un plásmido que comprende la secuencia de ADNc en su longitud total fue transformada en la cepa B-21527 de DH5\alpha (pMWR46) de E. coli que fue depositada con NRRL el 23.02.96;

Fig. 15: esta figura muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("C. foecundissimum") derivada de la cepa CBS 427.97 de Cladorrhinum foecundissimum que fue depositada el 23 de enero de 1997; el plásmido de expresión pYES 2.0 que comprende la secuencia de ADNc en su longitud total fue transformada en la cepa DSM 12742 de E. coli que fue depositada el 17 de marzo de 1999;

Fig. 16: esta figura muestra un alineamiento de la fitasa de C. foecundissimum con el fitasa modelo de M. thermophila, usando el programa GAP gcg (Peso Gap: 3.000; peso de longitud: 0.100); y

Fig. 17: muestra cómo la fitasa de C. foecundissimum puede ser pegada sobre el alineamiento de la fig. 1.

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Descripción detallada de la invención Fitasa

En el presente contexto una fitasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de fitato (mio-inositol hexakisfosfato) a (1) mio-inositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra y/o penta-fosfatos del mismo, y (3) fosfato inorgánico. En lo sucesivo, para abreviar, los compuestos de arriba serán referidos a veces como IP6, I, IP1, IP2, IP3, IP4, IP5 y P, respectivamente. Esto significa que por acción de una fitasa, IP6 se degrada a P + uno o más de los componentes IP5, IP4, IP3, IP2, IP1 y I. De forma alternativa, el mio-inositol que llevaba en total n grupos fosfato fijados en las posiciones p, q, r,... se denomina Ins (p,q,r, ..) Pn. Por conveniencia, Ins (1, 2, 3, 4, 5, 6) P6 (ácido fítico) se ha abreviado a PA.

Según la base de datos de nomenclaturas de enzimas ExPASy (un repositorio de información relativa a la nomenclatura de enzimas basada principalmente en las recomendaciones del Comité de Nomenclaturas de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBBM) que describe todos y cada uno de los tipos de enzima caracterizadas para lo cual se proporcionó un número de la EC (Comisión Enzimática)), son conocidos dos tipos diferentes de fitasas: una así denominada 3-fitasa (mio-inositol hexafosfato 3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8) y una así denominada 6-fitasa (mio-inositol hexafosfato 6-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26). La 3-fitasa hidroliza primero el enlace estérico en la posición D-3, mientras que la 6-fitasa hidroliza primero el enlace estérico en la posición D-6 o L-6.

La expresión "fitasa" o "polipéptido o enzima que presenta actividad fitasa" se destina a cubrir cualquier enzima capaz de efectuar la liberación de fosfato inorgánico o fósforo de diferentes fosfatos de mio-inositol. Ejemplos de fosfatos de mio-inositol de este tipo (sustratos de fitasa) son el ácido fítico y cualquier tipo de sal del mismo, p. ej. fitato de sodio o fitato de potasio o sales mezcladas. Además, cualquier estereoisómero de los mono-, di-, tri-, tetra o penta-fosfatos de mio-inositol puede servir como sustrato de fitasa. Un sustrato de fitasa preferido es el ácido fítico y las sales del mismo.

Conforme a la definición de arriba, la actividad fitasa se puede determinar usando cualquier ensayo en el que se use uno de estos sustratos. En el presente contexto (a menos que se especifique lo contrario) la actividad fitasa se determina en la unidad de FYT, siendo un FYT la cantidad de enzimas que libera 1 \mumol de ortofosfato inorgánico por min. bajo las condiciones siguientes: pH 5.5; temperatura 37ºC; sustrato: fitato de sodio (C_{6} H_{6}O_{24}P_{6}Na_{12}) en una concentración de 0,0050 mol/L. Un ensayo de fitasa adecuado se describe en la parte experimental.

La presente invención proporciona una fitasa como se describe en las reivindicaciones anexas.

Una fitasa creada genéticamente es una fitasa producida de forma no-natural, diferente de una fitasa modelo, p. ej. una fitasa tipo salvaje. Entre las fitasas creadas genéticamente se incluyen, pero no se limitan a, las fitasas preparadas por mutagénesis dirigida, barajado de genes, mutagénesis aleatoria, etc.

La invención también proporciona constructos de ADN, vectores, células huéspedes, y métodos de producción de estas fitasas, así como usos de los mismos.

Una variante de fitasa es un polipéptido, enzima o fragmento del mismo que muestra actividad fitasa y que es modificada en comparación con una fitasa modelo.

Modificado significa alterado por uno o más aminoácidos o sustituciones peptídicas, deleciones, inserciones y/o adiciones; en cada caso por o de uno o más aminoácidos. Tales sustituciones, deleciones, inserciones, y adiciones se pueden conseguir mediante cualquier método conocido en la técnica, p. ej. mediante barajado de genes, mutagénesis aleatoria, mutagénesis dirigida, etc.

La fitasa modelo o parental, de la cual se deriva la variante de fitasa, puede ser cualquier fitasa, p. ej. una fitasa tipo salvaje o un derivado, mutante o variante de la misma, incluyendo variantes alélicas y de especies, al igual que variantes creadas genéticamente a partir de las mismas que, p. ej., pueden ser preparadas por mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria, barajado, etc.

En el concepto de fitasa modelo también se incluye cualquier híbrido o fitasa quimérica, es decir una fitasa que comprende una combinación de secuencias parciales de aminoácidos derivadas de al menos dos fitasas.

La fitasa híbrida puede comprender una combinación de secuencias parciales de aminoácidos que derivan de al menos dos fitasas de ascomiceto, de al menos dos fitasas de basidiomiceto o de al menos una fitasa de un ascomiceto y de al menos una fitasa de basidiomiceto. Estas fitasas de ascomiceto y de basidiomiceto, de las cuales deriva una secuencia parcial de aminoácidos, p. ej., pueden ser cualquiera de estas fitasas específicas a las que se hace referencia en la presente.

En el presente contexto, una fitasa híbrida, barajada, mutagenizada de forma aleatoria, mutagenizada de forma dirigida o creada genéticamente, derivada únicamente de fitasas de ascomiceto, es también una fitasa de ascomiceto; y una fitasa híbrida, barajada, mutagenizada de forma aleatoria, mutagenizada de forma dirigida o creada genéticamente, derivada únicamente de fitasas modelo de basidiomiceto, también es una fitasa de basidiomiceto. Cualquier híbrido derivado de al menos una fitasa de ascomiceto, al igual que al menos una fitasa de basidiomiceto, se denomina fitasa mezclada de ascomiceto/basidiomiceto, y una fitasa de este tipo es también una fitasa modelo en el presente
contexto.

Análogamente, una fitasa híbrida, barajada, mutagenizada de forma aleatoria, mutagenizada de forma dirigida o creada genéticamente, derivada de una o más fitasas de Aspergillus, también es una fitasa derivada de Aspergillus; y una fitasa híbrida, barajada, mutagenizada de forma aleatoria, mutagenizada de forma dirigida o creada genéticamente, derivada de cualquier otro sub-agrupamiento taxonómico mencionado aquí, también se denomina fitasa derivada de este sub-agrupamiento taxonómico.

Además, en el presente contexto, "derivado de" se usa para indicar una fitasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, pero también una fitasa codificada por una secuencia de ADN aislada de tal cepa y producida en un organismo huésped transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el término se usa para indicar una fitasa codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc, que tiene las características identificadoras de la fitasa en cuestión.

Preferiblemente, la fitasa modelo es una fitasa que puede ser alineada como se describe abajo con cualquiera de las trece fitasas de la Fig. 1 (que son particularmente fitasas modelo preferidas).

Las fitasas modelo salvajes preferidas (es decir, ni fitasas recombinantes, ni barajadas, ni fitasas creadas genéticamente) tienen un grado de similitud u homología, preferiblemente identidad, con la secuencia de aminoácidos nº. 38-403 (números de Peniophora) de cualquiera de estas trece fitasas de al menos un 40%, más preferiblemente de al menos un 50%, más preferiblemente de al menos un 60%, en particular de al menos un 70%, especialmente de al menos un 80%, y de la forma más preferible con un grado de similitud de al menos un 90%.

Las fitasas modelo preferidas recombinantes, barajadas o creadas genéticamente tienen un grado de similitud u homología, preferiblemente identidad, con la secuencia parcial nº. 38-49, 63-77, 274-291, 281-300 y 389-403 (números de Peniophora) de cualquiera de estas trece fitasas de al menos un 60%, a ser posible de al menos un 70%, más preferiblemente de al menos un 80%, y en particular de al menos un 90%.

El grado de similitud se basa preferiblemente en una comparación con la secuencia de aminoácidos completa de cualquiera de las trece fitasas.

El grado de similitud u homología, de forma alternativa identidad, se puede determinar usando cualquier programa de alineamiento conocido en la técnica. Un programa de alineamiento preferido es GAP, proporcionado en el GCG, versión 8 del paquete de programas (Manual del Programa para el Paquete Wisconsin, Versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (véase también Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453). Usando GAP con los ajustes siguientes para la comparación de secuencias polipeptídicas: peso GAP de 3.000 y longitud GAP de 0.100.

También es preferida una fitasa modelo salvaje que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN la cual se hibrida a una secuencia ADN que codifica una secuencia de aminoácidos 38-403 (números de Peniophora) de cualquiera de las secuencias de ADN que codifican las trece secuencias específicas de fitasa de la Fig. 1.

Otra fitasa modelo preferida es una fitasa creada genéticamente, que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN la cual se hibrida a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos 38-49, y a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos 63-77, y a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos 274-291, y a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos 281-300, y a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos 389-403 (números de Peniophora) de cualquiera de las secuencias de ADN que codifiquen las trece secuencias de fitasa específicas de la Fig. 1.

Preferiblemente, la hibridación es para la parte codificante completa de la fitasa de cualquiera de las trece fitasas.

Las condiciones experimentales adecuadas para determinar si una secuencia de ADN o de ARN dadas se "hibridan" a un nucleótido especifico o a una sonda de oligonucleótidos es necesario un prerremojo del filtro que contiene los fragmentos de ADN o ARN para examinar la hibridación en 5 X SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio), (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T.. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York) durante 10 min, y una prehibridación del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x de solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989), 0,5% de SDS y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sometido a un baño de ultrasonidos (Sambrook et al. 1989), seguida de una hibridación en la misma solución conteniendo una concentración de 10 ng/ml de una sonda de marcaje aleatorio (Feinberg, a. P. y Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), marcada en 32P-dCTP (actividad específica > 1 X 109 cpm/\mug) durante 12 horas a aproximadamente 45ºC.

Después se lava el filtro dos veces durante 30 minutos en 2 X SSC, 0,5% de SDS a al menos 55ºC (astringencia baja), a al menos 60ºC (astringencia media), a al menos 65ºC (astringencia media/alta), a al menos 70ºC (astringencia alta), o a al menos 75ºC (astringencia muy alta).

Las moléculas con las cuales se hibrida la sonda de oligonucleótidos bajo estas condiciones se detectan usando una película radiográfica.

Debería observarse que una cierta variante específica de fitasa no necesita en realidad haber sido preparada a partir de una fitasa modelo específica para que esta fitasa modelo sea calificada como "fitasa modelo" en el presente contexto. Es suficiente con que la variante muestre al menos una de las enmiendas aquí indicadas cuando ésta se compare después con la fitasa modelo.

El alineamiento de la Fig. 1 se realiza usando el programa Pileup (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711), con un Peso de Gap de 3.000 y un Peso de Longitud de Gap de 0.100. Cuando se alinea una nueva fitasa modelo o una nueva variante de fitasa las trece secuencias pueden incluirse junto con la nueva (variante de) fitasa en un alineamiento múltiple, o, de forma alternativa, al menos una de las trece secuencias de la Fig. 1 se incluye junto con la nueva (variante de) fitasa en un alineamiento.

Un procedimiento preferido para alinear una nueva fitasa modelo (o una variante de fitasa) según la Fig. 1 es el siguiente: la fitasa modelo nueva se alinea con aquella secuencia específica de las trece secuencias de la Fig. 1 con la que la tiene el grado más alto de homología. Para calcular el grado de homología, y para realizar el "alineamiento según la Fig. 1" de las dos secuencias, se usa preferentemente el programa GAP, al que se hace referencia abajo. Habiendo alineado las dos secuencias, la fitasa modelo nueva (o variante de fitasa) se añade (pega) al alineamiento de la Fig. 1 usando el resultado del primer alineamiento (colocando los residuos de aminoácidos idénticos y homólogos uno sobre otro se prescribe en el alineamiento), siguiendo las posiciones correspondientes que son ahora fácilmente identificables.

El Ejemplo 7 muestra un ejemplo de cómo añadir una fitasa modelo nueva al alineamiento de la Fig. 1 y deducir variantes de fitasa correspondientes de las mismas.

Otras fitasas modelo y variantes deducidas en analogía con el Ejemplo 7 pueden ser alineadas. Esto es así para las fitasas modelo siguientes en particular: la fitasa de Aspergillus Niger var. awamori (patente US nº. 5.830.733); la fitasa de Bacillus de WO 98/06858; la fitasa de soja de WO 98/20139; la fitasa de maíz de WO 98/05785; la fitasa de Aspergillus de WO 97/38096; las fitasas de Monascus anka de WO 98/13480; la fitasa de Schwanniomyces occidentalis de EP 0699762, etc.

Al comparar una fitasa modelo con una variante de fitasa propuesta usando el alineamiento como se describe en este caso, se pueden identificar las posiciones de aminoácido correspondientes, es decir, una posición modelo de la fitasa modelo y una posición variante de la variante; la posición modelo y la posición variante correspondientes se sitúan simplemente una debajo de la otra en el alineamiento. Se dice que ha ocurrido una modificación en una posición dada si el aminoácido modelo de la posición modelo y el aminoácido variante de la posición variante son diferentes. Las modificaciones preferidas de estas posiciones se manifiestan ellas mismas como sustituciones de aminoácido, deleciones o adiciones.

Modificado en al menos una posición significa modificado en una o más posiciones, es decir, en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, etc., hasta todas las posiciones N catalogadas. Esta definición incluye cualquier posible subcombinación de las mismas, p. ej. cualquier conjunto de dos sustituciones, cualquier conjunto de tres, cualquier conjunto de cuatro, etc.; hasta cualquier conjunto de posiciones (N-1).

En el presente contexto todas las secuencias, cualquiera que sea la fitasa modelo, incluyendo las trece secuencias de la Fig. 1, se numeran usando la numeración correspondiente a la fitasa de P. lycii. Estos "números de Peniophora" se indican en la Fig. 1 junto con los "números de alineamiento". La numeración de P. lycii comienza en M1 y acaba en E439.

Como se ha explicado arriba, el alineamiento revela qué posiciones de las distintas secuencias de fitasa diferentes a las de P. lycii son equivalentes o corresponden a la posición dada de P. lycii.

Una sustitución de aminoácidos se indica aquí como por ejemplo "3S", lo que indica que en la posición 3 el aminoácido S debería ser sustituido por la posición "original" o la posición modelo del aminoácido 3, cualquiera que sea ésta. De este modo, la sustitución debería dar como resultado una S en la posición variante correspondiente. Considerando ahora el alineamiento de la Fig. 1, una sustitución como p. ej. "3S" se debe interpretar del siguiente modo para las respectivas fitasas mostradas (el aminoácido indicado en primer lugar es el aminoácido "original" o modelo en la "posición de la Peniophora" 3):

P. involtus-A1:

F3S (número 3F sustituido por S)

P. involtus-A2:

L3S

T. pubescens:

M3S

A. pediades:

M3S

P. lycii:

redundante (ya un S)

A. fumigatus:

T3S

consphyA:

V3S

A. nidulans:

T3S

A. ficuum NRRL3135:

A3S

A. terreus:

A3S

T. thermo:

L3S

T. lanuginosa:

V3S

M. thermophila:

G3S

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Sin embargo, en lo sucesivo se denominará a las sustituciones específicas de arriba de la siguiente manera (siempre usando la numeración de la Peniophora):

P. involtus-A1:

F3S

P. involtus-2:

L3S

T. pubescens:

M3S

A. pediades:

M3S

P. lycii:

redundante (ya un S)

A. fumigatus:

T3S

consphyA:

V3S

A. nidulans:

T3S

A. ficuum NRRL3135:

A3S

A. terreus:

A3S

T. thermo:

L3S

T. lanuginosa:

V3S

M. thermophila:

G3S

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Además, denotaciones como p. ej. "3S,F,G" significan que el aminoácido en la posición 3 (números de la Peniophora) de la fitasa modelo en cuestión es sustituida con cualquiera de S, F o G, es decir, p. ej. la designación "3S,F,G" se considera como totalmente equivalente a la designación "3S, 3F, 3G".

Una denotación como ()3S significa que el aminoácido S se añade a la secuencia en cuestión (en un espacio en la secuencia real), en una posición correspondiente al número 3 de la Peniophora; y viceversa para las deleciones (S3()).

En el caso de regiones donde la secuencia de fitasas de Peniophora tiene deleciones más grandes que algunas de las otras fitasas de la Fig. 1, por ejemplo en la región entre la posición 201 y 202 (números de la Peniophora), las posiciones intermedias (residuos de aminoácidos en otras secuencias) se numeran añadiendo a, b, c, d, etc, en minúscula al número en última posición de la Peniophora, p. ej. para la fitasa de M. thermophila: E201; G201a; P201b; Y201c; S201d; T201e; I201f; G202; D203; etc.

En una de las solicitudes prioritarias de la presente solicitud hay dos errores menores de numeración de posición: según las definiciones de arriba, las posiciones a las que se ha hecho referencia en la primera solicitud prioritaria como 204 y 205 (números de la Peniophora) están mal designados; éstas deberían haber sido numeradas como 203a y 204, respectivamente. En consecuencia, 204 ha sido sustituido por 203a y 205 por 204 a lo largo de toda la presente solicitud.

Una variante de fitasa preferida comprende una secuencia de aminoácidos que comprende, preferiblemente contiene, una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 24C; 27P; 31Y; 33C; 39H,S,Q; 40L,N; 42S, G; 43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y; 44N; 45D, S; 47Y,F; 49P; 51E, A, R; 56P; 58D,K,A; 59G; 61R; 62V, I; 69Q; 75W, F; 78D, S; 79G; 80K, A; 81A, G, Q, E; 82T; 83A, I, K, R, Q; 84I, Y, Q, V; 881; 90R, A; 102Y; 115N; 116S; 118V,L; 119E; 120L; 122A; 123N,Q,T; 125M,S; 126H,S,V; 127Q, E, N; 128A,S,T; 132F, I, L; 143N; 148V, I; 151A,S; 152G; 153D, Y; 154D, Q, S, G; 157V; 158D, A; 159T; 160A,S; 161T,N; 162N; 163W; 170fH; 170gA; 171N; 172P; 173Q,S; 184Q,S,P; 185S; 186A,E,P; 187A; 187aS; 190A,P; 193S; 194S, T; 195T, V, L; 198A,N,V; 200G,V; 201D,E; una deleción de al menos uno de 201a, 201b, 201c, 201d, 201e, 201f, preferiblemente todos; 201eT; 202S,A; 203R,K,S; 203aV,T; 204Q, E, S, A, V; 205E; 211L,V; 215A, P; 220L, N; 223H,D; 228N; 232T; 233E; 235Y, L, T; 236Y,N; 237F; 238L, M; 242P,S; 244D; 246V; 251eE, Q; 253P; 256D; 260A, H; 264R, I; 265A, Q; 267D; 270Y; A, L, G; 271D,N; 273D,K; 275F,Y; 278T, H; 280A, P; 283P; 287A,T; 288L, I, F; 292F,Y; 293A, V; 302R,H; 304P,A; 332F; 336S; 337T,G,Q,S; 338I; 339V, I; 340P,A; 343A, S, F, I, L; 348Y; 349P; 352K; 360R; 362P; 364W,F; 365V, L, A, S; 366D, S, V; 367A,K; 368K; 369I, L; 370V; 373A,S; 374S,A; 375H; 376M; 383kQ,E; 387P; 393V; 396R; 404A,G; 409R; 411 K,T; 412R; 417E,R; 421F, Y; 431E.

Preferiblemente esto es con la condición de que la fitasa modelo no comprenda ya la sustitución o adición o deleción de aminoácidos arriba sugerida en la posición indicada. O con la condición de que, para cada posición, el aminoácido modelo ya no sea el aminoácido variante propuesto aquí. Pero estas condiciones se pueden considerar ya de hecho inherentes en la formulación de arriba, debido a la expresión "modificado".

Las diferentes variantes de fitasa preferidas comprenden, preferiblemente contienen o tienen, secuencias de aminoácidos que comprenden o contienen una o más de las sustituciones de aminoácidos, adiciones, o deleciones catalogadas en las respectivas reivindicaciones.

Las diferentes variantes de fitasa descritas aquí comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o incluso 10 de estas sustituciones; o varias sustituciones de 10-15, 15-20, 20-30 o incluso 30-50; finalmente hasta 60, 70, 80 o 90 sustituciones.

Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de las diferentes variantes de fitasa comprenden una o más sustituciones de los sub-agrupamientos de sustitución catalogados a continuación; o combinaciones de sustituciones clasificadas en dos o más sub-agrupamientos.

Generalmente, en vez de "comprender", "contener" o "tener", las secuencias de aminoácidos de variantes preferentes "consisten esencialmente en" o "consisten en" las fitasas modelo específicas de la Fig. 1, siendo modificadas por una o más de las sustituciones aquí descritas.

En el presente contexto un basidiomiceto significa un microorganismo del filo Basidiomycota. Este filo Basidiomycota está comprendido en el reino fúngico junto con p. ej. el filo Ascomycota ("ascomicetos").

Las cuestiones taxonómicas pueden clarificarse consultando las referencias catalogadas abajo o consultando una base de datos de taxonomía fúngica (base de datos NIH (Entrez)) que está disponible vía Internet en la World Wide Web en la siguiente dirección: http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html.

Para dar una definición de basidiomicetos, se hace referencia bien a Jülich, 1981, Higher Taxa of Basidiomycetes; Ainsworth & Bisby's (eds.) Dictionary of the Fungi, 1995, Hawksworth, D.L., P.M. Kirk, B.C. Sutton & D.N. Pegler; o bien a Hansen & Knudsen (Eds.), Nordic Macromycetes, vol. 2 (1992) y 3 (1997). Una referencia preferida es Hansen & Knudsen.

Para dar una definición de ascomicetos, se hace referencia bien a Ainswort & Brisbi, citados arriba, o bien a Systema Ascomycetum by Eriksson, O.E. & D. L. Hawksworth, Vol. 16, 1998. Una referencia preferida es Eriksson et al.

Generalmente, un microorganismo que se clasifica como basidiomiceto/ascomiceto en cualquiera de las referencias catalogadas arriba, incluida la base de datos, es un basidiomiceto/ascomiceto en el presente contexto.

Algunas cepas de Aspergillus son difíciles de clasificar porque son anamorfas, y en consecuencia se pueden clasificar como Fungi Imperfecti. No obstante, una vez se ha encontrado el equivalente teleomorfo, éste reclasifica de forma taxonómica. Por ejemplo, el teleomorfo de A. nidulans es Emericella nidulans (de la familia Trichocomaceae, el órden Eurotiales, la clase Plectomycetes del filo Ascomycota). Estos subagrupamientos de Ascomycota son preferidos, junto con la familia Lasiosphaeriaceae, el orden Sordariales, la clase Pyrenomycetes del filo Ascomycota.

Las palabras "ascomicetos" y análogos, como se utiliza en este caso, incluye cualquier cepa de Aspergillus, Thermomyces, Myceliophthora o Talaromyces que sea anamorfa y de este modo serían clasificadas en Fungi Imperfecti.

Fitasas de basidiomiceto preferidas son aquellas catalogadas en WO 98/28409, exactamente al principio de la sección encabezada como "Descripción detallada de la invención".

Las secuencias de ADN que codifican las trece fitasas modelo específicas catalogadas y otras fitasas modelo se pueden preparar según las instrucciones de cada uno de los documentos catalogados bajo la breve descripción de los dibujos.

Una secuencia de ADN que codifica una fitasa modelo se puede aislar de cualquier célula o microorganismo que produce la fitasa en cuestión usando varios métodos bien conocidos en la técnica. En primer lugar, se debería construir una biblioteca de ADN genómico y/o de ADNc usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la fitasa. Después, si la secuencia de aminoácidos de la fitasa se conoce, se pueden sintetizar y usar sondas oligonucleótidas homólogas marcadas para identificar clones codificadores de fitasa a partir de una genoteca obtenida a partir del organismo en cuestión. De forma alternativa, una sonda de oligonucleótidos marcada que contenga secuencias homólogas a un gen de fitasa conocido podría usarse como sonda para identificar clones codificadores de fitasa, usando condiciones de menor astringencia para la hibridación y el lavado.

Otro método para identificar clones codificadores de fitasa implicaría insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un un plásmido, transformando las bacterias fitasa-negativas con la biblioteca de ADN genómico resultante, y después depositar las bacterias transformadas sobre agar, conteniendo éste un sustrato de fitasa, permitiendo de ese modo identificar los clones que expresan la fitasa.

De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la enzima puede prepararse sintéticamente mediante métodos estándar establecidos, p. ej. el método de fosforamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruters (1981) o el método descrito por Matthes et al. (1984). En el método de fosforamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en un sintetizador de ADN automático, purificados, anillados, ligados y clonados en vectores apropiados.

Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen mixto genómico y sintético, de origen mixto sintético y de ADNc o de origen mixto genómico y de ADNc, lo cual se prepara ligando fragmentos de origen mixto sintético, genómico o de ADNc (siendo apropiados los fragmentos correspondientes a diferentes partes de la secuencia completa de ADN) conforme a las técnicas estándar. La secuencia de ADN también puede prepararse por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en US 4.683.202 o en R.K. Saiki et al. (1988).

El ADN codificante de las variantes de fitasa se puede preparar por métodos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida. Una vez se ha aislado una secuencia de ADN que codifica una fitasa modelo de interés, y se han identificado sitios deseables para la mutación, se pueden introducir mutaciones usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados; los nucleótidos mutantes se insertan durante la síntesis de oligonucleótidos. En un método específico se crea un espacio monocatenario de ADN, el cual conecta la secuencia codificante de fitasa, en un vector que lleva el gen codificador de fitasa. Después, el nucleótido sintético que contiene la mutación deseada se anilla hasta conseguir una porción homóloga del ADN monocatenario. El espacio restante se llena entonces con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) y el constructo se liga usando T4 ligasa. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al. (1984). US 4.760.025 expone la introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples mediante la realización de alteraciones menores del casete. No obstante se puede introducir una variedad incluso mayor de mutaciones en cualquier momento mediante el método de Morinaga puesto que se pueden introducir una multitud de oligonucleótidos de varias longitudes.

Otro método para introducir mutaciones en secuencias de ADN que codifican una fitasa modelo deseada se describe en Nelson and Long (1989). Ello implica una generación de 3 fases de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada, la cual se introduce usando una cadena de ADN químicamente sintetizada como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. Del fragmento generado por PCR se puede aislar un fragmento de ADN que lleva la mutación mediante seccionamiento con endonucleasas de restricción y reinsertar éste en un plásmido de expresión.

Otro método más para mutar secuencias de ADN que codifiquen una fitasa modelo es la Mutagénesis Aleatoria. La Mutagénesis Aleatoria se realiza de manera adecuada bien como mutagénesis aleatoria localizada o en una región específica en al menos tres partes del gen que traduce para la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión, o dentro del gen entero.

La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica una fitasa modelo se puede realizar convenientemente usando cualquier método conocido en la técnica.

En relación con lo expuesto arriba se describe un método para generar una variante de una fitasa modelo, en el cual la variante preferiblemente presenta características modificadas como se describe abajo, y comprende:

(a) someter una secuencia de ADN que codifica la fitasa modelo a una Mutagénesis Dirigida, o el método de Nelson y Long para una mutagénesis de PCR o para una mutagénesis aleatoria,

(b) expresar la secuencia mutada de ADN obtenida en la fase (a) en una célula huésped, y

(c) seleccionar células huéspedes que expresan una variante de fitasa, la cual tiene una propiedad alterada relativa a la fitasa modelo.

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Cuando se usa la Mutagénesis Aleatoria, la fase (a) del método de la invención citado arriba se realiza preferiblemente usando cebadores dopados.

Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria se puede realizar usando un agente físico o mutagenizante químico adecuado, usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a la mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria se puede realizar usando cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes. El agente mutagenizante puede, p. ej., ser uno de los que inducen transiciones, transversiones, inversiones, aleatorizaciones, deleciones y/o inserciones.

Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para el presente objetivo incluyen irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótidos. Cuando se usan tales agentes, la mutagénesis se realiza normalmente mediante incubación de la secuencia de ADN que codifica la enzima parental que debe ser mutagenizada en presencia del agente mutagenizante elegido bajo condiciones adecuadas para que ocurra la mutagénesis, y mediante la selección de ADN mutado que tenga las propiedades deseadas.

Cuando la mutagénesis se realiza usando un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado con los tres nucleótidos no parentales durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que van a ser cambiadas. El dopado o adicionado se pueden realizar con el fin de evitar codones para aminoácidos indeseados. El oligonucleótido dopado o adicionado se puede incorporar en el ADN que codifica la enzima de fitasa mediante cualquier técnica publicada, usando p. ej. PCR, LCR o cualquier ADN-polimerasa y ligasa como se crea conveniente.

Preferiblemente, el dopado se realiza mediante "dopado aleatorio constante", en el cual el porcentaje de tipo salvaje y de mutación en cada posición está predefinido. Además, el dopado puede ser dirigido hacia una preferencia para la introducción de nucleótidos determinados, y de ese modo una preferencia para la introducción de uno o más residuos de aminoácidos específicos. El dopado se puede hacer, p. ej., para permitir la introducción de un 90% de tipo salvaje y un 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de dopado se basa en limitaciones tanto genéticas como de estructuras de proteína. El esquema de dopado se puede hacer usando el programa DOPE, el cual, entre otras cosas, evita de modo seguro la introducción de codones de parada.

Cuando se usa la mutagénesis generada por PCR, bien un gen tratado o no tratado químicamente, el cual codifica una fitasa modelo, está sometido a PCR bajo condiciones que aumentan la no incorporación de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, págs. 11-15).

Una cepa mutágena de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, págs. 179-191), S. cereviseae o cualquier otro organismo microbiano se puede usar para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la fitasa modelo, p. ej., transformando un plásmido que contenga la glicosilasa parental en la cepa mutágena, haciendo crecer la cepa mutágena con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado puede ser posteriormente transformado en el organismo de expresión.

La secuencia de ADN que se va a mutagenizar puede estar convenientemente presente en una biblioteca genómica o de ADNc obtenida a partir de organismo que expresa la fitasa modelo. De forma alternativa, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, que como tal se puede incubar con el agente mutagenizante o, de otro modo, exponer al mismo. El ADN que se va a mutagenizar también puede estar presente en una célula huésped bien siendo integrado en el genoma de dicha célula o bien estando presente en un vector guardado en la célula. Finalmente, el ADN que se va a mutagenizar puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN que va a ser sometida a mutagénesis aleatoria es preferiblemente una secuencia de ADNc o de ADN genómico.

En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia mutada de ADN antes de realizar la fase de expresión b) o la fase de selección c). Una amplificación de este tipo se puede realizar conforme a métodos conocidos en la técnica. El método actualmente preferido es el de amplificación generada por PCR usando cebadores oligonucleótidos preparados en la base del ADN o la secuencia de aminoácidos de la enzima parental.

Después de la incubación con o bajo exposición al agente mutagenizante, el ADN mutado se expresa mediante cultivo de una célula huésped adecuada, la cual lleva la secuencia de ADN, bajo condiciones que permiten que la expresión tenga lugar. La célula huésped usada para este propósito puede haber sido transformada con la secuencia mutada de ADN, opcionalmente presente en un vector, o haber portado la secuencia de ADN que codifica la enzima madre durante el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de células huéspedes adecuadas son los siguiente: bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y bacterias gram-negativas tales como E. coli.

La secuencia mutada de ADN puede comprender además una secuencia de ADN, la cual codifica funciones que permiten la expresión de la secuencia mutada de ADN.

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La mutagénesis aleatoria puede ser ventajosamente localizada para una parte de la fitasa modelo en cuestión usando mutagénesis localizada aleatoria. Esto puede, p. ej., ser ventajoso cuando diferentes regiones de la enzima se han identificado como particularmente importantes para una propiedad dada de la enzima, y cuando al modificarse se espera obtener una variante con propiedades mejoradas. Tales regiones pueden identificarse normalmente cuando la estructura terciaria de la enzima parental se ha dilucidado y relacionado con la función de la enzima.

La mutagénesis aleatoria localizada o de una región específica se realiza convenientemente usando técnicas de mutagénesis generada por PCR, como se ha descrito anteriormente, o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN que va a ser modificada se puede aislar, p. ej., por inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser posteriormente sometida a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionados anteriormente.

Para la mutagénesis aleatoria de una región específica con vistas a modificar p. ej. la actividad específica de una fitasa modelo, se pueden tomar apropiadamente como diana posiciones de codón correspondientes a los siguientes residuos de aminoácidos provenientes de las secuencias de aminoácidos expuestas más adelante en la Fig. 1:

Residuos: 41-47, 68-80, 83-84, 115-118, 120-126, 128, 149-163, 184-185, 191-193, 198-201e, 202-203, 205, 235-236, 238-239, 242-243, 270-279, 285, 288, 332-343, 364-367, 369-375, 394.

Regiones: 41-47, 68-80, 120-128, 149-163, 270-279, 332-343, 364-375.

La mutagénesis aleatoria se puede realizar en las siguientes fases:

1.

Seleccionar regiones de interés para una modificación en la enzima parental

2.

Decidir los sitios de mutación y los sitios de no mutación en la región seleccionada

3.

Decidir qué tipo de mutaciones deberían realizarse, p. ej., con respecto a la estabilidad deseada y/o al rendimiento de la variante que se va a construir

4.

Seleccionar mutaciones estructuralmente razonables

5.

Ajustar los residuos seleccionados en la fase 3 teniendo en consideración la fase 4.

6.

Analizar la distribución de nucleótidos usando un algoritmo de dopado adecuado.

7.

Si es necesario, ajustar los residuos deseados a un realismo de códigos genéticos, p. ej. teniendo en cuenta las limitaciones que resultan del código genético, o p. ej. para evitar la introducción de codones de parada; el experto en la materia será consciente de que algunas combinaciones de codón no se pueden usar en la práctica y necesitarán ser adaptadas

8.

Hacer cebadores

9.

Realizar la mutagénesis aleatoria usando los cebadores

10.

Seleccionar las variantes de fitasa resultantes mediante selección de las propiedades mejoradas deseadas.

Algoritmos de dopado adecuados para ser usados en la fase 6 son conocidos en la técnica. Uno de estos algoritmos está descrito por Tomandl, D. et al., 1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11:29-38. Otro algoritmo es el DOPE (Jensen, LJ., Andersen, KV., Svendsen, A., y Kretzschmar, T. (1998) Nucleic Acids Research, 26: 697-702).

Una secuencia de ADN que codifica una fitasa modelo o una variante de fitasa se puede expresar usando un vector de expresión, un vector de expresión recombinante, el cual normalmente incluye secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la que se va a introducir. De este modo, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, p. ej. un plásmido, un bacteriófago o un elemento extra cromosómico. De forma alternativa, el vector puede poseer la característica de, al ser introducido en una célula huésped, integrarse éste en el genoma de la célula huésped y ser replicado junto con el (los)cromosoma(s) en el(los) que ha sido integrado.

En el vector, la secuencia de ADN debería estar operativamente conectada a una secuencia del promotor adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y pueda ser derivada de proteínas de genes que codifiquen proteínas tanto homólogas como heterólogas a la célula huésped. Un ejemplo de promotor adecuado para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de fitasa de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, es el promotor del operón lac de E. coli. Para la transcripción en un huésped fúngico son ejemplos de promotores útiles aquellos derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de A. oryzae.

El vector de expresión de la invención puede comprender también un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la variante de fitasa de la invención. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden derivar de manera adecuada de las mismas fuentes que el promotor.

El vector puede comprender además una secuencia de ADN que permita al vector replicarse en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de secuencias de este tipo son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19; pACYC177; pUB110; pE194, pAMB1 y pIJ702.

El vector también puede comprender un marcador seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, como sucede con los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiera resistencia a los antibióticos, p. ej. resistencia a la ampicilina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, o la selección puede realizarse por cotransformación, p. ej. como se describe en WO 91/17243.

Los procedimientos usados para enlazar el constructo de ADN de la invención que codifica una variante de fitasa, el promotor, el terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertar estos en vectores adecuados que contengan información necesaria para la replicación, son bien conocidos por los expertos en la técnica (cf., por ejemplo, Sambrook et al. (1989)).

La célula de la invención, tanto si comprende un constructo de ADN como un vector de expresión de la invención tal como se ha definido anteriormente, se usa ventajosamente como célula huésped en la producción recombinante de una variante de fitasa de la invención. La célula puede ser transformada convenientemente con el constructo de ADN de la invención que codifica la variante, integrando el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración está generalmente considerada como una ventaja, ya que es probable que la secuencia de ADN se mantenga de forma estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped se puede realizar según métodos convencionales, p. ej. por recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa, la célula puede ser transformada con un vector de expresión tal como se ha descrito anteriormente en relación con los diferentes tipos de células huéspedes.

Una molécula aislada de ADN o, de forma alternativa, una "secuencia clonada de ADN", "un constructo de ADN" "un segmento de ADN" o "una secuencia aislada de ADN" se refiere a una molécula de ADN o secuencia que puede ser clonada conforme a procedimientos de clonación estándar usados en la ingeniería genética para recolocar el segmento de ADN desde su ubicación natural a un sitio diferente donde éste será replicado. El término se refiere generalmente a una secuencia de ácidos nucleicos esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, p. ej., con al menos aproximadamente un 20% de pureza, preferiblemente con al menos aproximadamente un 40% de pureza, más preferiblemente con aproximadamente un 60% de pureza, incluso más preferiblemente con aproximadamente un 80% de pureza, de la forma más preferible con aproximadamente un 90% de pureza, e incluso de la forma más preferible con aproximadamente un 95% de pureza, tal y como está determinado por la electroforesis en gel de agarosa. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprenda la secuencia de ácidos nucleicos, que a su vez codifique el polipéptido; la inserción del fragmento en una molécula de vector, y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped, donde se replicarán múltiples copias o clones de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los mismos.

El término "vector" se usa para incluir términos/objetos de este tipo, como "constructos de ácidos nucleicos", "constructos de ADN", "vectores de expresión" o "vectores recombinantes".

El constructo de ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

Un "constructo de ácido nucleico" se define aquí como una molécula de ácido nucleico, ya sea única o bicatenaria, que es aislada de un gen de origen natural o que ha sido modificado para contener segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos de tal manera que de no ser así no existiría en la naturaleza.

El término constructo de ácido nucleico puede ser sinónimo del término casete de expresión cuando el constructo de ácido nucleico contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

El término "secuencia codificante" como se define aquí comprende principalmente una secuencia que es transcrita en ARNm y traducida en un polipéptido de la presente invención cuando se sitúa bajo control de las anteriormente mencionadas secuencias de control. Los bordes de la secuencia codificante son generalmente determinados por un codón ATG de iniciación de la traducción en el 5'-término y un codón de parada de la traducción en el 3'-término. Una secuencia codificante puede incluir ADN, ADNc y secuencias de ácidos nucleicos recombinantes, pero sin limitarse a éstos.

El término "secuencias de control" según se define aquí incluye todos los componentes necesarios o ventajosos para la expresión de la secuencia codificante de la secuencia de ácidos nucleicos. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña para la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Este tipo de secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una guía, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden ser provistas de enlaces cuya finalidad es introducir sitios de restricción específicos facilitando la ligadura de las secuencias de control con la región de codificación de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido.

Una "célula huésped" o una "célula huésped recombinante" abarca cualquier descendiente de una célula madre no idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación.

La célula es transformada preferiblemente con un vector que comprenda una secuencia de ácidos nucleicos de la invención seguida de la integración del vector en el cromosoma huésped.

"Transformar" significa introducir un vector que comprenda una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped de modo que el vector sea mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se autoreplica. La integración es generalmente considerada como una ventaja, ya que la secuencia de ácidos nucleicos será más probablemente mantenida de forma estable en la célula. Una integración del vector en el cromosoma huésped puede ocurrir por recombinación por homóloga o no homóloga, como se ha descrito anteriormente.

La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, p. ej., un procariota, o un microorganismo pluricelular, p. ej., un eucariota. Ejemplos de célula eucariota son una célula mamífera, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula fúngica. Las células mamíferas útiles incluyen células de ovarios de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células COS, o cualquier número de otras líneas celulares inmortalizadas disponibles, p. ej., de la Colección Americana de Cultivos Tipo.

En una forma de realización preferida, la célula huésped es una célula fúngica.

Las células micóticas pueden ser transformadas por un proceso que implica formación de protoplastos, transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se.

La presente invención también se refiere a una planta transgénica, a una parte de la planta, tal como una semilla de planta, o una célula vegetal. También se describen composiciones y usos tal planta o parte de la misma, especialmente su uso como pienso o alimento o aditivos, a lo largo de las líneas del presente uso y de las reivindicaciones para alimentos/piensos.

La planta transgénica puede ser dicotiledónea o monocotiledónea, para abreviar una dicot o una monocot. Son de interés primario las plantas que son componentes alimenticios potenciales y las que contienen ácido fítico. Un nivel de ácido fítico normal en componentes alimenticios es 0,1-100 g/kg, o más normalmente 0,5-50 g/kg, y la mayoría normalmente 0,5-20 g/kg. Ejemplos de plantas monocot son hierbas tales como poa de los prados (poa pratense, Poa), hierbas forrajeras tales como festuca o lolium, hierba de zonas templadas tal como agrostis, y cereales, p. ej. trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz.

Ejemplos de plantas dicot son legumbres, tales como altramuces, guisantes, alubias y soja, y crucíferos (de la familia Brassicaceae) tales como coliflor, aceite de semilla de colza y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana.

Tal planta transgénica, etc., es capaz de degradar su propio ácido fítico y, por consiguiente, la necesidad de añadir enzimas de este tipo a alimento o alimentos que comprendan este tipo de plantas se ve aliviada. Preferiblemente, la planta o parte de la planta, p. ej. las semillas, son trituradas o molidas, y posiblemente también mojadas antes de ser añadidas al alimento o alimentos o antes el uso, p. ej. de la toma de los mismos, con el propósito de adaptar la velocidad de degradación enzimática al uso real.

Si se desea, la enzima producida de la planta también puede recuperarse de la planta. En casos determinados la recuperación de la planta será preferida con el propósito de asegurar una formulación de calor estable en un proceso de granulación potencial posterior.

Ejemplos de partes de la planta son tallos, callos, hojas, raíces, frutas, semillas, tubérculos, etc. Pero también se incluye en esta definición cualquier tejido vegetal.

Cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, se incluye en la definición de células vegetales de arriba.

También están incluidos dentro del campo de la invención los descendientes de plantas de este tipo, partes de la planta y células vegetales.

El experto sabrá construir un constructo de expresión de ADN para su inserción en la planta en cuestión, prestando atención i.a. de si la enzima debería ser excretada en una vía específica del tejido. Es relevante para esta evaluación la estabilidad (estabilidad de pH, degradabilidad por proteasas endógenas etc.) de la fitasa en los compartimientos de expresión de la planta. Éste también será capaz de seleccionar secuencias apropiadas reguladoras tales como secuencias del promotor y del terminador, y secuencias señal o de tránsito si fuera necesario (Tague et al, Plant, Phys., 86, 506, 1988).

La planta, parte de planta, etc., puede ser transformada con este constructo de ADN usando cualquier método conocido. Un ejemplo de método de este tipo es la transformación mediante un vector vírico o bacteriano tal como especies bacterianas del género Agrobacterium creadas genéticamente para contener el gen que codifica la fitasa de la invención. También son conocidos en la técnica métodos para introducir directamente el ADN de fitasa en la célula vegetal o tejido vegetal, p. ej. la microinyección y la electroporación (Gasser et al, Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto et al, Nature, 338, 274, 1989).

Después de la transformación se seleccionan los transformantes usando cualquier método conocido por el experto, después de lo cual éstos son regenerados en plantas completas.

Estas plantas, etc., al igual que sus descendientes, llevan entonces el ADN codificador de fitasa como parte de su equipamiento genético.

En general, se hace referencia en WO 9114782A y en WO 9114772A.

La transferencia mediada de genes de Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para revisión Hooykas & Schilperoort, 1992. Plant Mol. Biol. 19: 15-38), no obstante éste también se puede usar para transformar monocotiledóneas. Debido a limitaciones variables del huésped generalmente no es posible transformar monocotiledóneas con ayuda de A. tumefaciens. Aquí se han de emplear otros métodos. El método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas de oro o de tungsteno microscópicas revestidas con el ADN transfomante) de callos embrionarios o de embriones en estado de desarrollo (Christou, 1992. Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994. Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992. Bio/Technology 10: 667-674).

Además, otros sistemas para transportar ADN libre hasta estas plantas, incluyendo los vectores víricos (Joshi & Joshi, 1991. FEBS Left. 281: 1-8), la transformación de protoplastos por medio de polietilenglicol o electroporación (para revisión véase Potirkus, 1991. Annu. Girar. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225), la microinyección de ADN en protoplastos de mesófilo (Crossway et al., 1986. Mol. Gen. Genet. 202: 79-85), y la macroinyección de ADN en brotes florales jóvenes de plantas de cereales (de la Pena et al., 1987. Nature 325: 274-276) son métodos preferidos.

En general, el ADNc o gen que codifica la variante de fitasa se coloca en un casete de expresión (p. ej. Pietrzak et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14: 5857-5868) que consiste en un promotor adecuado activo en la planta diana y en un terminador adecuado (terminación de transcripción). Este casete (que por supuesto incluye un marcador de selección adecuado, ver abajo) se transformará en la planta como tal en caso de monocotiledóneas por medio de bombardeo de partículas . En caso de dicotiledóneas el casete de expresión se coloca primero en un vector adecuado que suministra los bordes del ADN-T y un marcador de selección adecuado que a su vez se transforman en Agrobacterium tumefaciens. Las dicotiledóneas se transformarán a través del Agrobacterium que alberga el casete de expresión y el marcador de selección flanqueado por ADN-T según los protocolos estándar siguientes (p. ej. Akama et al., 1992. Plant Cell Reports 12: 7-11). La transferencia de ADN-T de Agrobacterium a la célula vegetal se ha revisado recientemente (Zupan & Zambriski, 1995. Plant Physiol. 107: 1041-1047). Los vectores para la transformación de plantas por medio de Agrobacterium están disponibles a nivel comercial o se pueden obtener de muchos laboratorios que construyan este tipo de vectores (p. ej. Deblaere et al., 1985. Nucleic Acids Res. 13: 4777-4788; para revisión véase Klee et al., 1987. Annu. Rev. Plant Physiol. 38: 467-486).

Promotores de plantas disponibles: dependiendo del proceso bajo manipulación se puede requerir una expresión específica orgánica y/o celular así como un control apropiado del desarrollo y medioambiental. Por ejemplo, es deseable expresar el ADNc de fitasa en endospermo de maíz, etc. El promotor usado con más frecuencia ha sido el promotor constitutivo 35S- CaMV (Franck et al., 1980. Cell 21: 285-294). La expresión será más o menos igual en toda la planta. Este promotor se ha usado con éxito para manipular plantas resistentes a herbicidas y patógenos (para revisión véase Stitt & Sonnewald, 1995. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46: 341-368). Se ha informado sobre promotores orgánicos específicos para tejidos sumidero de almacenamiento como semillas, tubérculos de patata y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990. Annu. Rev. Genet. 24: 275-303), y para tejidos sumidero metabólicos como meristemas (Ito et al., 1994. Plant Mol. Biol. 24: 863-878).

El medio usado para cultivar las células huéspedes transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar las células huéspedes en cuestión. La fitasa expresada puede segregarse convenientemente en el medio de cultivo y puede recuperarse del mismo mediante procedimientos bien conocidos que incluyen la separación de las células del medio mediante centrifugado o filtración, la precipitación de los componentes proteínicos del medio mediante una sal, p. ej. sulfato de amonio, seguido de procedimientos cromatográficos como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.

Las células huéspedes preferidas son una cepa de Fusarium, Hansenula, Trichoderma o Aspergillus, en particular una cepa de Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Fusarium cerealis, Fusarium sp. con las características identificativas del Fusarium ATCC 20334, como se describe más adelante en PCT/US/95/07743; Hansenula polymorpha, Triahoderma harzianum o Trichoderma reesei, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.

Referencias para la expresión en Hansenula polymorpha: Gellissen, G., Piontek, M., Dahlems, U., Jenzelewski, V., Gavagan, J.E., DiCosimo, R., Anton, D.I. & Janowicz, Z.A. (1996) Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst: coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene. Appl. Microbiol. Biotechnol. 46: 46-54.

Otros usos más específicos de las variantes de fitasa aparecen en PCT/DK97/00568, en las últimas páginas de la sección de la descripción detallada de la invención.

En una forma de realización preferida, la variante de fitasa está esencialmente libre de otros polipéptidos que no son de fitasa, p. ej., como mínimo tiene aproximadamente un 20% de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% de pureza, más preferiblemente aproximadamente un 60% de pureza, incluso más preferiblemente aproximadamente un 80% de pureza, de la forma más preferible aproximadamente un 90% de pureza, e incluso de la forma más preferible aproximadamente un 95% de pureza, como está determinado por SDS-PAGE. A veces se hace referencia a tal polipéptido de forma alternativa como una fitasa "purificada" y/o "aislada".

Un polipéptido de fitasa que comprende una variante de fitasa, la cual a su vez incluye polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles en los cuales se fusiona otro polipéptido en el N-terminal o en el C-terminal del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce por fusión de una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de la misma) que codifica otro polipéptido con una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de la misma) que a su vez codifica una variante de fitasa. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en en la técnica, e incluyen la ligadura de secuencias de que codifican los polipéptidos de manera que forman un marco y que la expresión del polipéptido fusionado está bajo el control del(los) mismo(s) promotor(es) y terminador.

"Pienso" y "alimento", respectivamente, significan cualquier dieta natural o artificial, comida o similar o componentes de tales comidas destinadas o adecuadas para ser comidas, tomadas, digeridas, por un animal y un ser humano, respectivamente.

La variante de fitasa puede ejercer su efecto in vitro o in vivo, es decir, antes de su toma o en el estómago del individuo, respectivamente. También es posible una acción combinada.

Una composición de fitasa según la invención siempre comprende al menos una fitasa de la invención.

Generalmente, las composiciones de fitasa son líquidas o secas.

Las composiciones líquidas no necesitan contener más que la enzima fitasa, preferiblemente en una forma altamente purificada. Normalmente, no obstante, también se añade un estabilizador como puede ser glicerol, sorbitol o mono propilenglicol. La composición líquida también puede comprender otros aditivos tales como sales, azúcares, conservantes, agentes de ajuste de pH, proteínas, fitato (un sustrato de fitasa). Las composiciones líquidas típicas son mezclas acuosas o basadas en aceite. Las composiciones líquidas pueden ser añadidas a uno alimento o pienso después de una granulación opcional de las mismas.

Las composiciones secas pueden ser atomizadas, en cuyo caso la composición no necesita contener nada más que la enzima en una forma seca. Normalmente, no obstante, las composiciones secas se denominan granuladas cuando pueden mezclarse fácilmente con p. ej. componentes alimentarios o de piensos, o más preferiblemente, forman un componente de una premezcla. El tamaño de partícula de los granulados enzimáticos es preferiblemente compatible con los de los otros componentes de la mezcla. Esto proporciona un medio seguro y conveniente para incorporar enzimas p. ej. en pienso.

Los granulados de aglomeración se preparan usando una técnica de aglomeración en un mezclador de alta cizalla (p. ej. un Lödige) durante la cual un material de relleno y la enzima son coaglomerados para formar gránulos. Los granulados de absorción se preparan teniendo núcleos de un material portador para absorber/ser revestidos por la enzima.

Materiales de relleno típicos son sales tales como sulfato disodio. Otros productos de relleno son caolín, talco, silicato alumínico de magnesio y fibras de celulosa. Opcionalmente, aglutinantes tales como dextrinas también se incluyen en granulados de aglomeración.

Materiales portadores típicos son almidón, p. ej. en forma de mandioca, maíz, patata, arroz y trigo. También se pueden usar sales.

Opcionalmente, los granulados son revestidos con una mezcla de revestimiento. Este tipo de mezclas comprenden agentes de revestimiento, preferiblemente agentes de revestimiento hidrofóbicos tales como aceite de palma hidrogenado y sebo bovino, y si se desea otros aditivos, tales como carbonato cálcico o caolín.

Adicionalmente, las composiciones de fitasa pueden contener otros sustituyentes tales como agentes colorantes, compuestos aromáticos, estabilizadores, vitaminas, minerales, otras enzimas enriquecedoras de piensos o de alimentos, es decir enzimas que enriquecen las propiedades nutritivas del pienso/alimento, etc. Esto es así en particular para las así denominadas premezclas.

Un "aditivo de pienso o de alimento" es un compuesto esencialmente puro o una composición de varios componentes destinada a o adecuada para ser añadida a un alimento o pienso. En particular es una sustancia que mediante su uso determinado se está convirtiendo en un componente de un producto alimentario o de pienso o afecta a cualquier característica de un producto alimentario o de pienso. Está compuesto según las indicaciones para las composiciones de fitasa que se dan arriba. Un aditivo típico normalmente comprende uno o más compuestos tales como vitaminas, minerales o enzimas enriquecedoras de piensos y portadores y/o excipientes adecuados.

En una forma de realización preferida, la composición de fitasa de la invención comprende adicionalmente una cantidad eficaz de una o más enzimas enriquecedoras de piensos, en particular enzimas enriquecedoras de piensos seleccionadas del grupo que consiste en \alpha-galactosidasas, \beta-galactosidasas, en particular lactasas; otras fitasas, \beta-glucanasas, en particular endo-\beta-1,4-glucanasas y endo-\beta-1,3(4)-glucanasas; celulasas, xilosidasas, galactanasas, en particular arabinogalactano endo-1.4-\beta-galactosidasas y arabinogalactano endo-1,3-\beta-galactosidasas; endoglucanasas, en particular endo-1,2-\beta-glucanasa; endo-1,3-\alpha-glucanasa, y endo-1,3-\beta-glucanase, enzimas degradantes de pectina, en particular pectinasas, pectinesterasas, pectina liasas, poligalacturonasas, arabinanasas, ramnogalacturonasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, ramnogalacturonano-\alpha-ramnosidasa, pectato liasas, y \alpha-galacturonisidasas, mananasas, \beta-manosidasas, manano acetil esterasas, xilano acetil esterasas, proteasas, xilanasas, arabinoxilanasas y enzimas lipolíticas tales como lipasas, fosfolipasas y cutinasas.

El aditivo de pienso se suplementa antes o de forma simultanea con la dieta al animal mono-gástrico. Preferiblemente, el aditivo de pienso se suplementa simultáneamente con la dieta al animal mono-gástrico . En una forma de realización más preferida, el aditivo de pienso se añade a la dieta en forma de un granulado o de un líquido estabilizado.

Una cantidad eficaz de fitasa en un alimento o pienso es a partir de aproximadamente 10-20.000; preferiblemente a partir de aproximadamente 10 a 15.000, más preferiblemente desde aproximadamente 10 a 10.000, en particular desde aproximadamente 100 a 5.000, especialmente desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 2.000 FYT/kg de pienso o alimento.

Ejemplos de otros usos específicos de la fitasa de la invención son en tratamientos de soja y en la producción de inositol o derivados de los mismos.

La invención también se refiere a un método para reducir los niveles de fitato en abono animal, en donde el animal se alimenta con un alimento que comprende una cantidad eficaz de la fitasa de la invención.

Esta invención también comprende el uso de una fitasa de la invención durante la preparación de un alimento o preparaciones de alimentos o aditivos, es decir que la fitasa ejerce su actividad fitasa únicamente durante la producción y no es activa en el alimento o producto alimenticio final. Este aspecto es pertinente por ejemplo a la hora de hacer y cocer la masa.

Lo que se describe aquí es una variante de fitasa que, cuando se alinea según la Fig. 1, se modifica en comparación con una fitasa modelo en al menos una de las siguientes posiciones, usando la numeración de posición correspondiente a P. lycii: 24; 27; 31; 33; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 49; 51; 56; 58; 59; 61; 62; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 88; 90; 102; 115; 116; 117; 118; 119; 120; 121; 122; 123; 124; 125; 126; 127; 128; 132; 143; 148; 149; 150; 151; 152; 153; 154; 155; 156; 157; 158; 159; 160; 161; 162; 163; 170f; 170g; 171; 172; 173; 184; 185; 186; 187; 187a; . 190; 191; 192; 193; 194; 195; 198; 199; 200; 201; 201a; 201b; 201c; 201d; 201e; 201f; 202; 203; 203a; 204; 205; 211; 215; 220; 223; 228; 232; 233; 234; 235; 236; 237; 238; 239; 242; 243; 244; 246; 251e; 253; 256; 260; 264; 265; 267; 270; 271; 272; 273; 274; 275; 276; 277; 278; 279; 280; 283; 285; 287; 288; 292; 293; 302; 304; 332; 333; 334; 335; 336; 337; 338; 339; 340; 341; 342; 343; 348; 349; 352; 360; 362; 364; 365; 366; 367; 368; 369; 370; 371; 372; 373; 374; 375; 376; 383k; 387; 393; 394; 396; 404; 409; 411; 412; 413; 417; 421; 431.

De estas variantes esperamos características modificadas, preferiblemente características de actividad modificadas. De hecho, para diferentes variantes ya se han mostrado tales características modificadas (ver la parte experimental). Como se ha citado arriba, "modificada" significa en comparación con la fitasa modelo. "Características de actividad modificadas" significa modificadas en al menos una actividad fitasa relacionada al respecto, como (lista no exclusiva): estabilidad de pH, estabilidad de temperatura, perfil de pH, perfil de temperatura, actividad específica (en particular en relación con el pH y la temperatura), especificidad de sustrato, modelo de ruptura de sustrato, unión de sustrato, especificidad de posición, la velocidad y el nivel de liberación de fosfato de maíz, velocidad de reacción, nivel de degradación de fitato), nivel final de fosfato liberado alcanzado.

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Las características de velocidad modificadas preferidas son actividad específica modificada, preferiblemente
aumentada, y preferiblemente aumentada a un pH de 3, 4, 5, o 6; perfil de pH o de temperatura modificados; y/o termoestabilidad modificada, preferiblemente aumentada, p. ej. de una temperatura de fusión aumentada como se ha medido usando DSC.

Variantes de fitasa preferidas son: variantes de fitasa que, cuando se alinean según la Fig. 1, son modificadas en comparación con una fitasa modelo en al menos una de las siguientes posiciones, usando la numeración de posición correspondiente a P. lycii: 43; 44; 47; 51; 58; 62; 78; 80; 83; 88; 90; 102; 143; 148; 153; 154; 186; 187a; 195; 198; 201e; 204; 205; 211; 215; 220; 242; 244; 251e; 260; 264; 265; 267; 270; 273; 278; 302; 336; 337; 339; 352; 365; 373; 383k; 404; 417.

Las siguientes variantes de A. fumigatus constituyen un subgrupo: Q43L; Q270L; G273D,K; N336S; A205E; Y278H; Q43L+Q270L; Q43L+Q270L+G273D; Q43L+Q270L+G273D+N336S; G273K+A205E; G273K+A205E+
Y278H (véase EP 0897010).

Generalmente, las variantes se pueden deducir o identificar del siguiente modo: mirando en el alineamiento según la Fig. 1, comparando dos secuencias, una de las cuales es una fitasa modelo con propiedades mejoradas; identificando diferencias de aminoácidos en posiciones/áreas pertinentes, y transfiriendo (substituyendo con) el aminoácido en una posición pertinente del modelo a la otra secuencia de fitasa.

La invención también expone un proceso para preparar una variante de fitasa que incluye el método citado arriba, y además incluye la deducción y síntesis de la secuencia de ADN correspondiente, la transformación de una célula huésped, el cultivo de la célula huésped y la recuperación de la variante de fitasa.

Posiciones/áreas pertinentes incluyen aquellas mencionadas abajo en relación con características de actividad de fitasa importantes tales como actividad específica, termoestabilidad, actividad/estabilidad de pH.

La presente invención también expone variantes de fitasa (diversas según una fitasa modelo tal y como se define aquí) que es obtenible, preferiblemente obtenida, mediante el proceso perfilado arriba y que se espera que muestren una característica/propiedad modificada, preferiblemente que muestren este tipo de característica modificada, p. ej. una actividad específica mejorada.

Al menos las fitasas modelo de basidiomiceto P. lycii y T. pubescens muestran una alta actividad específica (como se ha determinado usando aquí el método de Ejemplo 2).

Este es un ejemplo de una propiedad deseada que se puede transferir a otras fitasas, p. ej. las otras fitasas catalogadas en la Fig. 1, en particular al A. pediades y a las fitasas de ascomiceto tales como A. fumigatus, A. ficuum, consphyA, por un proceso de deducción como el que se ha mencionado arriba.

Por lo tanto se espera una actividad específica modificada, en particular una actividad específica mejorada, en particular con un pH alto y/o una temperatura alta, de las variantes que han sido modificadas en áreas pertinentes, es decir, (i) en los residuos aminoácidos que apuntan a la hendidura del sitio activo; o (ii) en los residuos aminoácidos en la periferia de estos residuos de sitio activo. Preferiblemente, la periferia se refiere a 10\ring{A} de los residuos de sitio activo.

Se pueden identificar regiones del sitio activo del fichero pdb 1IHP (Brookhaven Database entry of 18.03.98 re 1IHP, Structure of Phosphomonoesterase, D. Kostrewa; o como está publicado en Nature Structural Biology, 4, 1997, pgs. 185-190) usando el programa INSIGHTII del Molecular Simulations MSI, San Diego, California, y usando el comando de subconjunto, una "estructura de sitio activo" se puede definir comprendiendo aquellos residuos aminoácidos que yacen cerca de los residuos catalíticos, definidos como H59, D339 y R58 en fitasa de A. ficuum (que corresponden a los números de Peniophora H71, D335 y R70, respectivamente). Una "cubierta de sitio activo (10\ring{A})" comprende aquellos residuos que yacen dentro de los 10\ring{A} de los residuos catalíticos de arriba.

Los residuos dentro de los 10\ring{A} de H71 y D335 son los siguientes (usando números de Peniophora): 41-47, 68-77, 115-118, 120-126, 128, 149-163, 185, 191-193, 199, 243, 270-271, 273-275, 277-279, 288, 332-343, 364-367, 369-375, 394 ("la cubierta del sitio activo (10\ring{A})").

Preferiblemente, para definir una "cubierta de unión de sustratos" también puede decirse que comprende aquellos residuos que están muy próximos al sitio de unión de sustratos y que en consecuencia puede esperarse que esté en contacto con el sustrato.

Esta información se puede deducir como se ha descrito anteriormente, acoplando un análogo de azúcar a fitina en la estructura del sitio activo (los residuos constituyen la superficie del sitio activo). Si un azúcar sin grupos fosfato se acopla en la hendidura del sitio activo, p. ej. alfa-D-Glucosa (conformación en forma de silla, estructura proporcionada por el programa INSIGHTII), usando una distancia fija como se muestra abajo, los residuos que apuntan hacia la hendidura del sitio activo se pueden extraer usando el comando de subconjunto y usando una distancia de 10\ring{A} desde el análogo de sustrato. De forma alternativa, el compuesto inositol-1,4,5-trifosfato (archivo 1djx. Inositol-1,4,5-trifosfato de la base de datos Brookhaven) puede acoplarse en la hendidura del sitio activo. Estos compuesto y glucosa, no obstante, son más o menos superponibles.

Las distancias en \ring{A}ngstrom (\ring{A}) son: del átomo de oxigeno en la posición alfa-D-glucosa a

átomo ND1 de H59:

5.84

átomo NH2 de R58:

6.77

átomo NH2 de R142:

5.09

átomo ND2 de N340:

3.00

átomo ND1 de H59:

7.76

átomo NH2 de R58:

8.58.

(los números de Peniophora de los residuos de arriba son: H71, R70, R155, N336, H71 y R70, respectivamente).

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En este sentido, los residuos en contacto con los sustratos se identifican del siguiente modo (números de Peniophora): 43-44; 70-80; 83-84; 115; 153; 155-156; 184; 191-192; 198-202; 205; 235; 238; 242; 270; 272-273; 275-277; 332-336; 338; 369; 371 ("la estructura de unión al sustrato (10\ring{A})").

En las variantes que son modificadas en una o más de (1) la cubierta del sitio activo o (2) la cubierta de unión de sustratos, se prevé con mucha seguridad encontrar una actividad específica modificada. Esto conduce al siguiente agrupamiento de conexiones posicionales (todavía números de Peniophora y cubiertas de 10\ring{A}): 41-47, 68-80, 83-84, 115-118, 120-126, 128, 149-163, 184-185, 191-193, 198- 201e, 202-203, 205, 235-236, 238-239, 242-243, 270-279, 285, 288, 332-343, 364-367, 369-375, 394.

Preferiblemente, la cubierta del sitio activo y la cubierta de unión de sustratos se definen como se ha descrito anteriormente usando las fitasas modelo de basidiomiceto de la Fig. 1, siendo la fitasa de Peniophora un modelo preferido. Es posible una deducción de las variantes correspondientes de otras fitasas modelo usando la alineación de la Fig.

Preferiblemente, una distancia de 5A se usa en el comando de subconjunto, definiendo así un sitio activo y cubiertas de unión de sustratos de un tamaño más limitado, p. ej. una cubierta del sitio activo que comprende los residuos 43-44, 69-74, 117, 125, 155-156, 159, 274, 332-340, 370-374 (5\ring{A} desde H71 y D335), "cubierta del sitio activo (5\ring{A})".

Generalmente la cubierta de centro activo y las regiones de la cubierta de unión de sustratos forman la base para seleccionar regiones de mutagénesis aleatorias. Ejemplos de regiones preferidas de mutagénesis aleatoria son las

regiones 69-74, 332-340, 370-374, dopado para ser añadido (un enfoque 5A);

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y las

regiones 57-62, 142-146, 337-343, dopado para ser añadido (un enfoque 10\ring{A}).

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Se contempla actualmente que cualquier modificación en cualquiera de estas posiciones llevará a una fitasa de características modificadas, p. ej. de una actividad específica modificada.

La expresión de arriba "cualquier modificación en cualquiera de las posiciones" se considera completamente equivalente para catalogar cada posición y cada sustitución, p. ej. del siguiente modo para el subgrupo de arriba 41-47:

41A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y;

42A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y;

43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y;

44A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y;

45A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y;

46A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y;

47A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y.

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Se prevé una actividad específica modificada en particular de las siguientes variantes:

42S,G; 43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y; 45D,S; 47Y,F; 51E,A; 75W,F; 785, D; 79G; 80K, A; 83I, Q; 84Q,V; 116S; 118V,L; 119E; 120L; 122A; 123N,T; 125S; 126H,S; 127Q,E; 128A, T; 151A, S; 152G; 153D, Y; 154Q,D,G; 157V; 158D, A; 159T; 160A, S; 161T,N; 162N; 163W; 184Q,S; 186A,E; 198A,N; 200G,V; 201D; deleciones de uno o más de 201a, 201b, 201c, 201d, 201e, 201f - preferiblemente todos; 202S; 205Q,E; 235Y,L; 238L,M; 242P; 270Y,A,L; 271D; 273D,K; 275F,Y; 278T,H; 332F; 336S; 337T,Q; 339V; 340P, A; 343A, S; 364W,F; 365V,L; 366D,V; 367K; 368K; 369I, L; 370V; 373S; 374A; 375H; 376M; 393V.

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Son variantes particularmente preferidas las siguientes: 78S; 79G; 80A; 83I,Q; 84Q,V; 198A,N; 200G,V; 201D; deleciones en uno o más de 201a, 201b, 201c, 201d, 201e, 201f, preferiblemente todas las deleciones; 202S; 205Q, E; 235Y, L; 238L,M; 242P, 273D; 275F, Y.

Otras variantes particularmente preferidas son las siguientes: 3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y; en particular 43M,P; 75W, F; 80K; 153D; 184Q,S; 270Y, A; 332F; 369I, L.

Las variantes siguientes son especialmente preferidas: 43L,G,N,V,A,I,T; 78D; 153Y; 154G; 270L; 273D,K. También son especialmente preferidas las variantes dobles y triples (43L/270L); (43L/270L/273D); (43L/78D) y (43L/
153Y/154G). Otras variantes preferidas son 205E; 278H; 336S.

Estas variantes únicas, dobles y triples especialmente preferidas son preferiblemente variantes de fitasas modelo que pueden ser alineadas según la Fig. 1, en particular variantes de las fitasas modelo específicas catalogadas en la Fig. 1.

ConsphyA es al menos conocida por tener una alta termoestabilidad. Además, la termoestabilidad de P. lycii es más bien alta.

Este es un ejemplo de una propiedad deseada que se puede transferir a otras fitasas, p. ej. las otras fitasas catalogadas en la Fig. 1, en particular a las fitasas de basidiomiceto tales como P. lycii y A. pediades, mediante un proceso de deducción como el ya mencionado arriba.

Con estos antecedentes se prevé una termoestabilidad modificada, en particular una termoestabilidad mejorada, de las siguientes variantes:

39H,S; 40L,N; 43P; 47Y,F; 49P; 51E,A; 56P; 58D; 61R; 62V; 80K; 83A; 84Y; 172P; 184P; 195T; 198A; 204V; 211L; 223D; 236Y; 242P; 246V; 253P; 264R; 265Q; 280A, P; 283P; 287A; 292F,Y; 293A; 302R; 304P; 337S; 348Y; 387P; 396R; 409R; 411K; 412R; 417E; 421F,Y.

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Son particularmente preferidas las siguientes variantes de termoestabilidad modificada: 39S; 40N; 47Y,F; 51A; 83A; 195T; 204V; 211L; 242P; 265A.

Otras variantes de termoestabilidad modificada son las siguientes: 42G; 43T,L,G; 44N; 58K,A; 59G; 62I; 69Q; 75F; 78D; 79G; 80A; 81A, G; 82T; 83K,R; 84I; 88I; 90R, A; 102Y; 115N; 118V; 122A; 123Q,N; 125M,S; 126V,S; 127N,Q; 128S, A; 143N,K; 148V, I; 154S; 158D; 170fH; 170gA; 171T,N; 172N; 173W, 184S; 186A; 187A; 187aS; 193S; 195V, L; 198V; 201E; 201eT; 202A, 203aT; 204A; 211V, 215P, A; 220L,N; 223H; 228N; 232T; 322E; 235T; 236N; 242S; 244D; 251eQ, E; 256D; 264I; 260A,H; 265A; 267D; 270G; 271D; 273K,D; 278T,H; 287T; 293V; 302H; 337T,G; 338I; 339V,I; 340A; 352K; 365A, S; 366S; 367A; 369L; 373S, A; 374S; 376M; 383kE, Q; 404G, A; 411T; 417R; 431E.

Otros conceptos, que pueden ser previstos para impartir una termoestabilidad mejorada a una fitasa, considerando la estructura 1IHP previamente mencionada y transfiriendo a través de un alineamiento según la Fig. 1 como se perfila aquí, son los siguientes:

(A) Introducir residuos de prolina en posiciones espaciales donde se satisfacen los ángulos diédricos especiales de la prolina y no se impide la red de unión de hidrógeno ni se observan conflictos estéricos.

(B) Llenar agujeros: mediante sustitución por residuos mayores en cavidades internas se puede obtener frecuentemente una mejora en la estabilidad.

(C) Puente de cistina: los puentes de cistina harán frecuentemente más rígidas las proteínas y aumentarán la energía de desdoblamiento.

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Otras variantes de las cuales se prevé una termoestabilidad modificada según estos conceptos de (A) a (C) son: 27P, 31Y, 132F, 132I, 132L, 184P, 186P, 190P, 280P, 343F, 343I, 343L, 349P, 362P y (33C y 24C).

Concepto (A): 27P, 184P, 186P, 190P, 349P, 362P.

Concepto (B): 343F, I, L; 31Y; 132F,I,L; 273F.

Concepto (C): 33C/24C.

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Actividad o estabilidad del pH modificada, preferiblemente estabilidad, en particular a un pH bajo, en particular mejorado, es otra propiedad deseada que se puede transferir mediante alineamiento según la Fig. 1 y transferencia desde modelos con perfiles de pH mejorados a otras fitasas, como se perfila arriba.

Otros conceptos, los cuales pueden preverse para impartir una estabilidad mejorada a una fitasa a un pH bajo, considerando la estructura de 1 IHP previamente mencionada y transfiriendo a través de una alineación según la Fig. 1 como se perfila aquí, son los siguientes:

(D) Cargas de superficie: mejor distribución a un bajo pH para evitar agrupaciones de negativo o positivo, y para evitar que los residuos con la misma carga se acerquen demasiado.

(E) Prevenir la desamidación: superficie expuesta Q o N en contacto cercano a residuos negativamente cargados.

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Se prevé que las variantes de fitasa que han mejorado su estabilidad/actividad de pH a bajo pH sean: 39H; 39Q; 80A; 203R; 271N; 51R; 154S; 185S; 194S; 194T; 288L; 288I; 288F; 360R; 173Q,S; 204Q,S; 303K,S; 81Q,E.

Concepto (D): 203R, 271N, 51R, 185S, 360R; 173Q, S; 204Q,S; 303K,S; 81Q, E.

Concepto (E): 154S; 194S, T; 288L, I, F.

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Una fitasa modelo preferida para estos conceptos de (D) y (E) es P. lycii.

Se ha probado experimentalmente que tiene un pH óptimo rebajado: la variante 80A de fitasas de ascomiceto, en particular de A. fumigatus y consphyA.

Son variantes únicas, dobles y triples especialmente preferidas 43L; (43L/270L) y (43L/270L/273D). Estas variantes tienen un perfil de pH cambiado. Estas son preferiblemente variantes de las fitasas modelo específicas catalogadas en la Fig. 1.

Para todas las variantes preferidas catalogadas arriba:

la estabilidad se modifica preferiblemente a alta temperatura, es decir, en el rango de temperatura 50-100ºC, en particular 60-90ºC, más preferiblemente en el rango 70-90ºC;

la actividad se modifica preferiblemente en un rango de temperatura pertinente para el uso en el sistema gastro-intestinal de animales, p. ej. 30-40ºC, más preferiblemente 32-38ºC, y de la forma más preferible en un rango de 35-38ºC; la estabilidad se modifica preferiblemente a bajo pH, es decir. en el rango de pH 1.5-7, preferiblemente 2-6, más preferiblemente 3-5;

la actividad se modifica preferiblemente en el rango de pH 1.5-5.5, más preferiblemente a un pH de 2.5-4.5, y más preferiblemente 3-5.

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Unas pruebas para características de fitasa modificadas, como las mencionadas arriba, se conocen bien en la técnica y cualquier prueba de este tipo se puede utilizar para comparar el rendimiento de las variantes de fitasa con los modelos de fitasa.

Una prueba preferida para actividad específica se da en el Ejemplo 2. Las pruebas preferidas para el pH y la actividad y estabilidad de la temperatura se dan en el ejemplo 3. Una prueba incluso más preferida para la termoestabilidad es el método DSC del Ejemplo 4.

En WO 98/28409 también se exponen pruebas para otros parámetros diferentes, tales como la especificidad de posición. Todas las pruebas de WO 98/28409 son pruebas preferidas.

Generalmente, por supuesto todas estas pruebas se pueden conducir a valores y temperaturas de pH deseados.

De forma análoga se pueden deducir fácilmente otras variantes preferidas basadas en las ocho fitasas modelo restantes especialmente descritas combinando las modificaciones sugeridas con cada una de las secuencias correspondientes de la Fig. 1. Estas variantes preferidas se deducen fácilmente, es decir, lo siguiente:

Las variantes de una fitasa modelo derivada de Paxillus, preferiblemente Paxillus involutus, preferiblemente derivada de la cepa CBS 100231, preferiblemente variantes de P. involtus-A1, cuya secuencia se muestra en la Fig. 2, comprendiendo dichas variantes al menos una de las siguientes modificaciones:

() 24C; T27P; F31Y; 133C; R39H,S,Q; N4OL; S42G;

P43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y; Y44N; S45D; Y47F; A51E, R; A58D; K; Q61R; 162V; F75W; S78D; A80K; T81Q, E, G, A; R83A, I, Q, K; 184Y, Q, V; L88I; K90R, A; F102Y; S115N; D116S; V118L; P119E; F120L; A123N,T,Q; S125M; F126H,S,V; D127Q,E,N; A128T,S; A132F, I, L; 1148V; D151A, S; S153D, Y; D154Q,S, G; D158A; S159T; A160S; T161N; ()170fH; () 170gA; S171N; H172P; N173Q, S; P184Q, S; Q185S; T186A,E,P; G187A; ()187aS; T190P,A; D193S; N194S,T; M195T,V,L; A198N,V; G200V; D201E; ()201eT; S202A; D203R,K,S; P203aV,T; Q204E, S, A, V; V205E; V211L; S215A, I; L220N; A223D, H; D233E; F235Y,L,T; N236Y; L237F; V238L,M; A242P,S; M244D; () 251eE,Q; D253P; T256D; P260A,H; E264R, I; A265Q; A267D; G270Y, A, L; D271N; D273K; F275Y; T278H; Y280A,P; E283P; V287A, T; Q288L, I, F; Y292F; V293A; N302R,H; A304P; N336S; L337T,Q,S,G; M 338I; V339I; A340P; S343A, F, I, L; F348Y; R349P; A352K; P360R; R362P; W364F; R365V, L, A, S; T366D,V,S; S367K, A; S368K; L369I; S373A; G374A,S; R375H; ()383kQ,E; T387P; Q396R; G404A; L409R; T411K; L412R; E417R; F421Y.

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Variantes de una fitasa modelo derivada de una especie del género Paxillus, preferiblemente de la especie Paxillus involutus, preferiblemente derivada de la cepa CBS 100231, preferiblemente variantes de P. involtus-A2, cuya secuencia se muestra en la Fig. 3, comprendiendo dichas variantes al menos una de las siguientes modificaciones:

P24C; 127P; F31Y; I33C; R39H,S,Q; N4OL; S42G;

P43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, Y; Y44N; S45D; Y47F; A51E,R; A58D, K; E61R; 162V; F75W; S78D; A80K; A81Q, E, G; R83A, I, Q, R, K; I84Y, Q, V; L881; K90R,A; F102Y; S115N; D116S; V118L; P119E; F120L; A123N,T,Q; S125M; F126H,S,V; D127Q,E,N; A128T,S; V132F, I, L; D143N; I148V; D151A, S; S153D,Y; D154Q, S, G; D158A; A160S; T161N; ()170fH; ()170gA; S171N; R172P; N173Q,S; P184Q,S; Q185S; T186A, E, P; G187A; ()187aS; T190P,A; D193S; N194S,T; M195T,V,L; A198N,V; G200V; E201D; ()201eT; S202A; D203R,K,S; P203aV,T; Q204E,S,A,V; V205E; S211L,V; S215A, P; L220N; A223D,H; A232T; F235Y, L, T; N236Y; L237F; V238L,M; P242S; M244D; () 251eE, Q; D253P; T256D; P260A,H; E264R, I; A265Q; A267D; G270Y, A, L; D271N; D273K; F275Y; T278H; Y280A,P; A283P; V287A, T; Q288L, I, F; Y292F; I293A, V; N302R,H; A304P; N336S; L337T, Q, S, G; M338I; V339I; 340P,A; A343S,F,I,L; F348Y; R349P; A352K; P360R; R362P; W364F; L365V, A, S; T366D,V,S; S367K, A; S368K; V369I, L; S373A; R375H; ()383kQ,E; T387P; Q396R; G404A; L409R; A411K,T; L412R; E417R; Y421F.

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Variantes de una fitasa modelo derivada de una especie del género Trametes, preferiblemente de la especie Trametes pubescens, preferiblemente derivada de la cepa CBS 100232, preferiblemente variantes de T. pubescens, cuya secuencia se muestra en la Fig. 4, comprendiendo dichas variantes al menos una de las siguientes modificaciones:

R24C; T27P; L31Y; V33C; Q39H,S; S40L,N; S42G;

M43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y; Y44N; S45D; Y47F; A51E,R; A58D,K; S59G; Q61R; 162V; F75W; S78D; A80K; A81Q, E, G; R83A, I, Q, K; I84Y, Q, V; V88I; K90R,A; L102Y; D115N; V118L; T123N,Q; S125M; S126H,V; E127Q,N; A128T,S; A132F, I, L; D143N; V148I; S151A; S153D,Y; D154Q,S,G;
A158D; A160S; N161T; ()170fH; ()170gA; S171N; S172P; N173Q,S; S184Q,P; E185S; A186E,P; G187A; () 187aS; T190P,A; N194S,T; M195T,V,L; A198N,V; G200V; () 201eT; S202A; D203R, K, S; P203aV,T; Q204E,S,A,V; V205E; Q211L, V; P215A; L220N; G223D,H; D233E; Y235L,T; N236Y; L237F; L238M; P242S; E244D; Q 251eE, Q; E253P; Q260A, H; D264R, I; A265Q; A267D; A270Y,L,G; D271N; D273K; F275Y; T278H; Y280A,P; V287A,T; Q288L, I, F; Y292F; I293A, V; A302R,H; N304P,A; N336S; Q337T, S, G; M338I; V339I; A340P; S343A, F, I, L; F348Y; N349P; A352K; P360R; R362P; F364W; L365V,A,S; V366D,S; K367A; 1369L; A373S; A374S; R375H; ()383kQ,E; Q387P; A396R; G404A; V409R; T411K; L412R; E417R; Y421F.

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Variantes de una fitasa modelo derivada de una especie del género Aspergillus, preferiblemente de la especie Aspergillus nidulans, preferiblemente derivada de la cepa DSM 9743, preferiblemente variantes de A. nidulans, cuya secuencia se muestra en la Fig. 10, comprendiendo dichas variantes al menos una de las siguientes modificaciones:

V24C; A27P; H39S,Q; V40L,N; G42S;

Q43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, Y; Y44N; S45D; Y47F; S49P; E51A,R; V56P; H58D,K,A;

E61R; V62I; S69Q; Y75W, F; E78D,S; S79G; K80A; S81Q, E,A,G; K82T; A83I,Q,K,R; Y84Q,V,I; A90R; D115N; D116S; T118V,L; 1119E; F120L; E122A; N123T,Q; M125S; V126H,S; D127Q,E,N; S128A,T; F132I,L; K143N; I148V; S151A; S153D,Y; D154Q,S,G; A158D; S159T; A160S; E161T,N; K162N; F163W; G170fH; S170gA; () 171N; ()172P; K173Q,S; P184Q,S; E185S; I186A,E,P; D187A; G187aS; T190P,A; H193S; S194T; S198A,N,V; E200G,V; N201D, E; D201e(); E201e (), T; R201f() (una deleción de al menos uno de 201d, 201e, 201f, preferiblemente todos); A202S; D203R,K,S; E203aV,T; I204Q, E, S, A, V; 1211L,V; P215A; L220N; D223H; K228N; E232T; N233E; I235Y, L,T; Y236N; L237F; M238L; S242P; M246V; E251eQ; A256D; E260A,H; L264R,I; Q270Y, A, L, G; S271D,N; S273D,K; Y275F; G278T,H; A280P; A287T; Q288L, I, F; F292Y; T293A,V; Q302R,H; P304A; N336S; S337T,Q,G; M338I; I339V; S340P,A; F343A, S, I, L; N349P; Q352K; S360R; Q362P; Y364W, F; A365V,L,S; A366D, V, S; S367K, A; W368K; T369I, L; G373S, A; A374S; R375H; A376M; E383kQ; A404G; T411K; L412R; E417R; F421Y; K431E.

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Variantes de una fitasa modelo derivada de una especie de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus terreus, preferiblemente derivada de la cepa CBS 220.95, preferiblemente variantes de A. terreus, cuya secuencia se muestra en la Fig. 12, comprendiendo dichas variantes al menos una de las siguientes modificaciones:

G24C; V27P; H39S,Q; K40L,N; G42S;

L43A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y; Y44N; A45D, S; Y47F; S49P; Q51E, A, R; V56P; P58D, K,A; D59G; H61R; I62V; A69Q; S75W, F; H78D, S: S79G; K80A; T81Q, E, A, G; A83I, Q, K, R; Y84Q, V, I; A90R; E115N; E116S; T118V,L; P119E; F120L; R122A; N123T,Q; L125S,H; R126H,S,V; D127Q,E,N; L128A, T,S; F132I,L; H143N; V148I; T151A,S; D152G; A153D, Y; S154D,Q,G; H157V; E158D, A; S159T; A160S; E161T,N; K162N; F163W; H173Q,S; P184Q,S; E185S; G186A,E,P; S187A; A187aS; T190P, A; H193S; S194T; L195T, V; A198N,V; E200G,V; S201D,E; S201d (); T201e (); V201f (); G202S,A; D203R,K,S; D203aV,T; A204Q,E,S,V;
V205E; V211L; A215P; L220N; D223H; Q228N; D232T; D233E; V235Y,L,T; N236Y; L237F; M238L; P242S; E244E; T251eE,Q; A260H; T264R,I; Q265A; N267D; L270Y,A,G; S271D,N; K273D; Y275F; H278T; G280A,P; V287A,T; Q288L,I,F; W292F,Y; A293V; Q302H; P304A; N337T,Q,S,G; L338I; V339I; S340P,A; W343A,S,F,I,L; N349P; A352K; S360R; S362P; Y364W,F; A365V,L,S; A366D,V,S; A367K; W368K; T369I,L; A373S; A374S; R375H; A376M; R383kQ,E; P404A,G; K411T; A417E, R; F421Y;. A431E.

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Variantes de una fitasa modelo derivada de una especie de Talaromyces, preferiblemente la especie Talaromyces thermophilus, preferiblemente derivadas de la cepa ATCC 20186 o ATCC 74338, preferiblemente variantes de T. thermo, cuya secuencia se muestra en la Fig. 13, comprendiendo dichas variantes al menos una de las siguientes modificaciones:

H24C; V27P; H39S,Q; S40L,N; G42S;

Q43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, Y; Y44N; S45D; F47Y; S49P; A51E, R; V56P; Q58D, K, A; N59G; K61R; I62V; Y75W, F; S78D; S79G; K80A; T81Q, E, A, G; E82T; L83A, I, Q, R, K; Y84Q, V, I: R90A; D116S; T118V,L; P119E; F120L; E122A; N123T,Q; M125S: I126H,S,V; Q127E,N; L128A,T,S; F132I,L; V148I; S151A; S153D,Y; D154Q,S,G; I157V; A158D; S159T; G160A,S; R161T,N; L162N; F163W; S170gA; D171N;
K172P; H173Q,S; E184Q,S,P; E185S; G186A,E,P: D187A; T190P,A; T193S; G194S,T; S195T,V,L; V198A,N;
E200G,V; D201E; S201dQ; S201e (), T; S201f (); G202S, A; H203R, K, S; D203aV,T; A204Q,E,S,V; Q205E; Q211L,V; A215P; 1220N,L; H223D; D228N; S232T; D233E; P235Y,L,T; Y236N; M237F; D238L,M; P242S; E244D; L246V; () 251eE, Q; A256D; Q260A, H; Q264R, I; A265Q; Q270Y, A, L, G; S271D,N; G273D,K; Y275F; N278T,H; G280A,P; A287T; Q288L, I, F; F292Y; V293A; H302R; P304A; N336S; T337Q, S, G; M338I; T339V, I; S340P, A; A343S, F, I, L; N349P; A352K; S360R; E362P; Y364W,F; S365V, L, A; A366D,V,S; A367K; W368K; T369I, L; G373S, A; G374A, S; R375H; A376M; D383kQ,E; E404A; K411T; R417E; F421Y.

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Variantes de una fitasa modelo derivada de una especie de Thermomyces, preferiblemente la especie Thermomyces lanuginosus, preferiblemente derivada de la cepa DBS 586.94, preferiblemente variantes de T. lanuginosa, cuya secuencia se muestra en la Fig. 14, comprendiendo dichas variantes al menos una de las siguientes modificaciones:

K24C; ()27P; ()31Y; ()33C; R39H,S,Q; H40L,N; G42S;

Q43A, C, D, E, F, G, H; I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, Y; Y44N; S45D; F47Y; S49P; A51E,R; V56P; K58D,A; V62I; S69Q; Y75W,F; A78D,S; H79G; K80A; S81Q,E,A,G; E82T; V83A,I,Q,K,R; Y84Q,V,I; L88I; R90A; F102Y; D115N; N116S; T118V,L; R119E; F120L; E122A; E123N,T,Q; M125S; M126H,S,V; E127Q,N; S128A,T; F132I,L; E143N; V148I; A151S; S153D,Y; A154D,Q,S,G; I157V; A158D; S159T; A160S; E161T,N; F162N; F163W; R170fH; S170gA; K172P; D173Q,S; S184Q,P; E185S; E186A,P; T187A; G187aS; T190P,A; G193S; L194S,T; T195V,L; A198N,V; E200G,V; E201D; A201d (); P201e (), T; D202S, A; P203R,K,S; T203aV; Q204E, S, A, V; P205E; V211L; R215A,P; 1220L, N; H223D; E232T; D233E; P235Y,L,T; L236Y,N; M238L; P242S; Q251eE; H256D; Q260H; M264R, I; A265Q; Y270A,L,G; T271D,N; D273K; Y275F; H278T; G280A,P; A283P; S287A; R288L, I, F; F292Y; V293A; G302R,H; P304A; N336S; T337Q,S,G; M338I; T339V, I; G340P,A; S343A, F, I, L; N349P; P360R; T362P; Y364W,F; A365V, L, S; A366D, V, S; S367K, A; W368K; T369I,L; A373S; A374S; R375H; A376M; E383kQ; R404A,G; R411K,T; K417E, R; F421Y; D431E.

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Variantes de una fitasa modelo derivada de una especie de Myceliophthora, preferiblemente la especie Myceliophthora thermophila, preferiblemente derivada de la cepa ATCC 48102 o ATCC 74340, preferiblemente variantes de M. thermophila, cuya secuencia se muestra en la Fig. 7, comprendiendo dichas variantes al menos una de las siguientes modificaciones:

S24C; F31Y; H39S,Q; F40L,N; G42S;

Q43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, Y; Y44N; S45D; Y47F; S49P; P51E,A,R; I56P; D58K,A; D59G; E61R; V62I; S69Q; A75W, F; L78D,S; K79G; R80K, A; A81Q, E, G; A82T; S83A, I, Q, K, R; Y84Q,V,I; R90A; D115N; E116S; T118V,L; R119E; T120L; Q122A; Q123N,T; M125S; V126H,S; N127Q,E; S128A,T; F132I,L; K143N; V148I; A151S; Q153D,Y; D154Q,S,G; H158D,A; S159T; A160S; E161T,N; G170fH; S170gA; T171N; F163W; V172P; R173Q,S; P184Q,S; E185S; T186A,E,P; G187aS; T190P, A; N193S; D194S,T; L195T, V; A198N, V; E200G,V; E201D; G201a (); P201b (); Y201c (); S201d (); T201e (); I201f (); G202S, A; D203R,K,S; D203aV,T; A204Q, E, S, V; Q205E; T211L,V; P215A; V220N,L; N223D,H; A232T; D233E; V235Y,L,T; A236Y,N; L237F; M238L; P242S; E244D; A251eE, Q; R256D; E260A, H; R264I; A265Q; Q270Y,A,L,G; S271D,N; K273D; Y275F; Y278T,H; P280A; T287A; Q288L,I,F; F292Y; V293A; ()302R,H; P304A; N336S; D337T,Q,S,G; M338I; M339V, I; G340P, A; G343A, S, F, I, L; D349P; P352K; D360R; E362P; Y364W,F; A365V, L, S; A366D, V, S; S367K, A; W368K; A369I, L; A373S; A374S; R375H; I376M; E383kQ; E387P; G404A; M409R; T411K; L412R; E417R; F421Y; D431E.

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También se describe una fitasa nueva que ha sido derivada de una cepa de Cladorrhinum, es decir, C. foecundissimum. Por consiguiente, se describe un polipéptido que tiene actividad fitasa y que comprende SEC ID NO:2 o la parte madura (aminoácidos nos 16-495) de la misma; o un polipéptido homólogo al mismo en al menos un 70, más preferiblemente 75, 80, 85, 90, 95%; homología significando similitud, preferiblemente identidad, y estando determinada usando el programa GAP y los ajustes tal y como se define anteriormente. Y se describe un constructo de ADN que codifica un polipéptido que a su vez tiene actividad fitasa; dicho constructo de ADN comprende una molécula de ADN que a su vez comprende SEC ID NO:1 o nucleótidos nos. 20-70 y 207-1560 de la misma; o nucleótidos nos. 20-70 y 207-1563 de la misma; o nucleótidos nos. 65-70 y 207-1560 de la misma; o nucleótidos nos. 65-70 y 207-1563 de la misma; o un constructo de ADN o molécula homóloga en al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95% a cualquiera de estas secuencias de nucleótidos; homología significando similitud, preferiblemente identidad, y estando determinada usando programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453). Usando GAP con los ajustes siguientes para la comparación de secuencias de ADN: penalización de creación de GAP de 5.0 y penalización de extensión de GAP de 0.3. También se describe un constructo de ADN que se hibrida con cualquiera de las secuencias de ADN de arriba bajo las condiciones mencionadas anteriormente.

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Ejemplos Ejemplo 1 Ensayo de actividad fitasa (FYT)

La actividad fitasa se puede medir usando el siguiente ensayo:

Se añaden 10 \mul de muestras de enzima diluida (diluidas en 0.1 M de acetato sódico, 0,01% de Tween20, pH de 5.5) en 250 \mul de fitato de sodio 5 mM (Sigma) en 0,1 M de acetato sódico, 0,01% de Tween20, pH de 5.5 (pH ajustado después de disolver el fitato de sodio; el sustrato es precalentado) y se incuba durante 30 minutos a 37ºC. La reacción se detiene añadiendo 250 \mul de TCA al 10% y el fosfato libre se mide añadiendo 500 \mul 7.3 g de FeSO4 en 100 ml de reactivo de molibdato (2,5 g (NH_{4})_{6}Mo_{7} O_{24}.4H_{2}O en 8 ml H_{2}SO_{4} diluido a 250 ml). La absorbencia a 750 nm se mide en muestras de 200 \mul en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se incluyen sustrato y formas preliminares enzimáticas. También se incluye una curva estándar de fosfato (0-2 mM de fosfato). 1 FYT es igual a la cantidad de enzimas que libera 1 \mumol de fosfato/min en las condiciones dadas.

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Ejemplo 2 Test de actividad específica

La actividad específica se puede determinar del siguiente modo:

Se usa una muestra altamente purificada de la fitasa (la pureza se controla previamente en un gel de poliacrilamida SDS que muestra la presencia de un sólo componente).

La concentración de proteína en la muestra de fitasa se determina por análisis de aminoácido del siguiente modo: una alícuota de la muestra de fitasa se hidroliza en 6N HCl, 0,1% de fenol durante 16 h a 110ºC en un tubo de vidrio evacuado. Los aminoácidos resultantes se cuantifican usando un sistema de análisis de aminoácidos Applied Biosystems 420A accionado según las instrucciones del fabricante. Puede calcularse a partir de las cantidades de aminoácidos la masa total, y así también la concentración, de proteína en la alícuota hidrolizada.

La actividad se determina en las unidades de FYT. Una FYT equivale a la cantidad de enzima que libera 1 micromol de fosfato inorgánico de fitato (5 mM de fitato) por minuto a un pH de 5.5, a 37ºC; el ensayo se describe p. ej. en el ejemplo 1.

La actividad específica es el valor de FYT/mg de proteína enzimática.

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Ejemplo 3 Test de actividad y estabilidad de temperatura y de pH

La actividad y estabilidad de temperatura y de pH se puede determinar del siguiente modo:

Perfiles de temperatura (es decir, relación de actividad de temperatura) llevando a cabo el ensayo de FYT del Ejemplo 1 a diferentes temperaturas (precalentando el sustrato).

Estabilidad de temperatura preincubando la fitasa en 0,1 M de fosfato sódico, a un pH de 5.5 a diferentes temperaturas antes de medir de la actividad residual.

La estabilidad de pH incubando la enzima a un pH de 3 (25 mM de glicina-HCl), a un pH de 4-5 (25 mM de acetato sódico), a un pH de 6 (25 mM de MES), a un pH de 7-9 (25 mM de Tris-HCl) durante 1 hora a 40ºC, antes de medir la actividad residual.

Los perfiles de pH (es decir, la relación de actividad de pH) llevando a cabo el ensayo con los diferentes pH usando los mismos sistemas tampón (50 mM, pH reajustado al disolver el sustrato).

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Ejemplo 4 DSC como un test de termoestabilidad preferido

La termoestabilidad o temperatura de fusión, Tm, se puede determinar del siguiente modo:

En una DSC el calor consumido para mantener un aumento de temperatura constante en la célula de muestra se mide con respecto a una célula de referencia. Se mantiene un nivel de calentamiento constante (p. ej. 90ºC/hora). Un proceso endotérmico (proceso de consumo de calor, p. ej. el desarrollo de una enzima/proteína) se observa como un aumento en el calor transferido a la célula para mantener el aumento de temperatura constante.

Una DSC se puede realizar usando el aparato MC2 de MicroCal. Las células son equilibradas 20 minutos a 20ºC antes de ser escaneadas a 90ºC a una tasa de barrido de 90º/h. Se cargan muestras de p. ej. aproximadamente 2,5 mg/ml de fitasa en 0,1 M de acetato sódico, con un pH 5.5.

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Ejemplo 5 Variantes de fitasa de características de actividad modificadas

Se prepararon variantes de una fitasa modelo de Aspergillus fumigatus (una fitasa de tipo salvaje derivada de la cepa ATCC 13073) como se describe en EP 98104858.0 (EP-A-0897010), ejemplos 2-3 y 5, y la actividad fitasa se determinó como se describe en el ejemplo 7 de la misma. El pH y la temperatura óptimos y el punto de fusión se determinaron como se describe en los ejemplos 9 y 10 de EP 98113176.6 (EP-A-0897985).

En la Tabla 1 están catalogadas variantes de actividad específica mejorada a un pH 5.0. La tabla 2 cataloga variantes de actividad relativa mejorada a un pH 3.0, y la Tabla 3 cataloga variantes de termoestabilidad mejorada (temperatura óptima, p. ej. determinada por DSC).

TABLA 1

1

TABLA 2

2

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TABLA 3

3

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Ejemplo 6 Otras variantes de fitasa de características de actividad modificadas

Se prepararon variantes de la secuencia de consenso de ascomiceto "conphys" de la Fig. 9 como se describe en EP 98113176.6 (EP-A-0897985), ejemplos 4-8. La actividad fitasa, incluyendo un pH y una temperatura óptimos, y el punto de fusión se determinaron como se describe en los ejemplos 9 y 10, respectivamente, de la misma.

Las tablas más abajo catalogan variantes de características de actividad modificadas, es decir,

En la Tabla 4 variantes de actividad específica mejorada a un pH 6.0;

En la Tabla 5 variantes de pH óptimo modificado (el pH óptimo indicado es un valor aproximado, determinado como el valor de pH (seleccionado del grupo que consiste en pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5; y 7,0) en el que se obtuvo la actividad fitasa máxima);

En la Tabla 6 una variante de termoestabilidad mejorada (expresada por medio del punto de fusión como se determina por calorimetría diferencial de barrido (DSC)); y

En la Tabla 7 variantes de termoestabilidad modificada (temperatura óptima); un "+" o "-" indica un efecto positivo o negativo, respectivamente, en una temperatura óptima de hasta 1ºC; y un "++" y "- -" significa un efecto positivo o negativo, respectivamente, en una temperatura óptima de entre 1 y 3ºC.

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TABLA 4

4

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TABLA 5

5

TABLA 6

7

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TABLA 7

8

9

TABLA 8

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10

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Ejemplo 7 Clonación de una fitasa de Cladorrhinum foecundissimum

Se ha clonado ADN que codifica una fitasa de CBS 427.97 de Cladorrhinum foecundissimum, y la enzima aislada y purificada, esencialmente como se describe en WO 98/28409.

La Fig. 15 muestra la secuencia de ADN del producto PCR clonado de HindIII/XbaI en pA2phy8. El producto PCR clonado se amplifica desde la región genómica que codifica un gen phyA de CBS 427.97 de Cladorrhinum foecundissimum. El intrón putativo se indica mediante doble subrayado de los puntos de escisión-ligadura conforme a la regla GT-AG (R. Breathnach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978) pgs. 4853-4857). Los sitios de restricción usados para clonar están subrayados.

Según la predicción de SignalP V1.1 (Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Stren Brunak y Gunnar von Heijne: "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites", Protein Engineering 10, 1-6 (1997)), la parte del péptido señal de la enzima corresponde a los aminoácidos nos. 1-15, por consiguiente la enzima madura es los aminoácidos nos. 16-495.

La enzima muestra un pH óptimo de aproximadamente pH 6 sin actividad apH bajo (pH 3), sino con una actividad significante de hasta un pH 7.5; de este modo es una fitasa más alcalina en comparación con la fitasa de Aspergillus ficuum.

Se encontró una temperatura óptima de alrededor de 60ºC a un pH 5.5. Así pues, esta fitasa es más termoestable que la fitasa de A. ficuum.

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Ejemplo 8 Alineamiento de una fitasa modelo nueva según la Fig. 1

La secuencia de fitasa de Cladorrhinum foecundissimum como se describe en el ejemplo 7 se compara con las 13 fitasas modelo de la Fig. 1 usando la versión 8 de GAP mencionada arriba con un peso GAP de 3.000 y un peso de longitud GAP de 0.100. Se comparan secuencias completas de aminoácidos. La secuencia de la fitasa de M. thermophila llega a ser la secuencia más homóloga, mostrando un grado de similitud con la secuencia de C. foecundissimum de un 70.86%.

Además, usando el programa GAP y los parámetros mencionados arriba, la secuencia de la fitasa de "C. foecundissimum" se alinea ahora con la fitasa de "M. thermophila"; ver Fig. 16. El promedio de correspondencia es de 0.540;, el promedio de no correspondencia de -0.396; la calidad de 445.2; la longitud de 505; la proporción de 0.914; los espacios 9; el porcentaje de similitud 70.860; el porcentaje de identidad 53.878.

En una siguiente fase, ver Fig. 17, la C. foecundissimum se pega (o se podría simplemente escribir) sobre el alineamiento de la Fig. 1 como la fila inferior, asegurando que estos residuos de aminoácidos que según el alineamiento en la Fig. 16 son idénticos (indicado por una línea vertical) o similares (indicado por uno o dos puntos) se coloquen uno encima del otro. En 5 posiciones a lo largo de la secuencia, la secuencia de C. foecundissimum comprende residuos de aminoácidos en "exceso", para los cuales el alineamiento de la Fig. 1 no deja espacio. En la Fig. 17, estos residuos en exceso se transfieren sobre una fila siguiente (pero pueden incluirse en la alineación múltiple y numerarse como se describe previamente en los párrafos relacionados de numeración de posición (usando las denotaciones a, b, c, etc.).

Las variantes correspondientes de la fitasa de C. foecundissimum se deducen entonces fácilmente basándose en la Fig. 17. Algunos ejemplos: las variantes generalmente designadas "80K,A" y "43T" en C. foecundissimum corresponden a "K80A" y "Q43T", respectivamente.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Bibliografía de patentes citada en la descripción

\bullet EP 0420358 A [0009] [0013]

\bullet EP 0684313 A [0009] [0013] [0013]

\bullet WO 9735017 A [0010] [0013]

\bullet WO 9828409 A [0013] [0013] [0013] [0013] [0013] [0068] [0204] [0204] [0235]

\bullet EP 0897985 A [0013] [0013] [0013] [0013] [0227] [0229]

\bullet US 5830733 A [0044]

\bullet WO 9806858 A [0044]

\bullet WO 9820139 A [0044]

\bullet WO 9805785 A [0044]

\bullet WO 9738096 A [0044]

\bullet WO 9813480 A [0044]

\bullet EP 0699762 A [0044]

\bullet US 4683202 A [0073]

\bullet US 4760025 A [0074]

\bullet WO 9117243 A [0102]

\bullet WO 9114782 A [0130]

\bullet WO 9114772 A [0130]

\bullet US 9507743 W [0136]

\bullet DK 9700568 W [0138]

\bullet EP 0897010 A [0163] [0227]

\bullet EP 98104858 A [0227]

\bullet EP 98113176 A [0227] [0229]

Bibliografía distinta de patentes citada en la descripción

\bulletYAMADA et al. Agric. Biol. Chem., 1986, vol. 322, 1275-1282 [0009]

\bulletPIDDINGTON et al. Gene, 1993, vol. 133, 55-62 [0009]

\bulletProgram Manual for the Wisconsin Package Genetics Computer Group 1994. [0033] [0041]

\bulletNEEDLEMAN, S.B. WUNSCH, C.D. Journal of Molecular Biology, 1970, vol. 48, 443-453 [0033] [0214]

\bullet J. SAMBROOK E.F. FRITSCH T.. MANIATIS Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor 1989. [0037]

\bulletFEINBERG, A. P. VOGELSTEIN, B. Anal. Biochem., 1983, vol. 132, 6-13 [0037]

\bulletJÜLICH Higher Taxa of Basidiomycetes, 1981, [0063]

\bulletHAWKSWORTH, D.L. P.M. KIRK B.C. SUTTON D.N. PEGLER Dictionary of the Fungi 1995. [0063]

\bulletNordic Macromycetes 1992. vol. 2, [0063]

\bulletNORDIC MACROMYCETES 1997. vol. 3, [0063]

\bulletERIKSSON, O.E. D. L. HAWKSWORTH Systema Ascomycetum, 1998, vol. 16, [0064]

\bulletLEUNG et al. Technique, 1989, vol. 1, 11-15 [0084]

\bulletFOWLER et al. Molec. Gen. Genet., 1974, vol. 133, 179-191 [0085]

\bulletTOMANDL, D. et al. Journal of Computer-Aided Molecular Design, 1997, vol. 11, 29-38 [0096]

\bulletJENSEN, LJ ANDERSEN, KV SVENDSEN, A KRETZSCHMAR, T Nucleic Acids Research, 1998, vol. 26, 697-702 [0096]

\bulletTAGUE et al. Plant, Phys., 1988, vol. 86, 506- [0126]

\bulletGASSER et al. Science, vol. 244, 1293- [0127]

\bulletPOTRYKUS Bio/Techn., 1990, vol. 8, 535- [0127]

\bulletSHIMAMOTO et al. Nature, 1989, vol. 338, 274- [0127]

\bulletHOOYKAS SCHILPEROORT Plant Mol. Biol., 1992, vol. 19, 15-38 [0131]

\bulletCHRISTOU Plant J., 1992, vol. 2, 275-281 [0131]

\bulletSHIMAMOTO Curr. Opin. Biotechnol., 1994, vol. 5, 158-162 [0131]

\bulletVASIL et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 667-674 [0131]

\bulletJOSHI JOSHI FEBS Lett., 1991, vol. 281, 1-8 [0132]

\bulletPOTYRKUS Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1991, vol. 42, 205-225 [0132]

\bulletCROSSWAY et al. Mol. Gen. Genet., 1986, vol. 202, 79-85 [0132]

\bullet DE LA PENA et al. Nature, 1987, vol. 325, 274-276 [0132]

\bulletPIETRZAK et al. Nucleic Acids Res., 1986, vol. 14, 5857-5868 [0133]

\bulletAKAMA et al. Plant Cell Reports, 1992, vol. 12, 7-11 [0133]

\bulletZUPAN ZAMBRYSKI Plant Physiol., 1995, vol. 107, 1041-1047 [0133]

\bulletDEBLAERE et al. Nucleic Acids Res., 1985, vol. 13, 4777-4788 [0133]

\bulletKLEE et al. Annu. Rev. Plant Physiol., 1987, vol. 38, 467-486 [0133]

\bulletFRANCK et al. Cell, 1980, vol. 21, 285-294 [0134]

\bulletSTITT SONNEWALD Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1995, vol. 46, 341-368 [0134]

\bulletEDWARDS CORUZZI Annu. Rev. Genet., 1990, vol. 24, 275-303 [0134]

\bulletITO et al. Plant Mol. Biol., 1994, vol. 24, 863-878 [0134]

\bulletGELLISSEN, G. PIONTEK, M. DAHLEMS, U. JENZELEWSKI, V. GAVAGAN, J.E. DICOSIMO, R. ANTON, D.I. JANOWICZ, Z.A. Hansenula polymorpha, 1996, [0137]

\bulletAppl. Microbiol. Biotechnol., vol. 46, 46-54 [0137]

\bullet D. KOSTREWA Brookhaven Database entry of 18.03.98 re 1IHP, Structure of Phosphomonoesterase Nature Structural Biology, 1997, vol. 4, 185-190 [0171]

\bulletProgram Manual for the Wisconsin Package Genetics Computer Group 1996. [0214]

\bullet R. BREATHNACH et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, vol. 75, 4853-4857 [0236]

\bullet HENRIK NIELSEN JACOB ENGELBRECHT STREN BRUNAK GUNNAR VON HEIJNE Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites Protein Engineering, 1997, vol. 10, 1-6 [0237]

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<212> ADN

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<213> Cladorrhinum foecundissimum

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<220>

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<221> intrón

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<222> (71).. (126)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (20)..(70)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (127).. (1563)

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<220>

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<221> péptido señal

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<222> (20)..(64)

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<400> 1

11

12

13

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<210> 2

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<211> 495

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<212> PRT

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<213> Cladorrhinum foecundissimum

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<400> 2

14

15

16

Claims (14)

1. Fitasa que difiere de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Peniophora lycii de la Fig. 6 en una o más de las siguientes posiciones, usando la numeración de posición correspondiente a P. lycii de la Fig. 1: D45S; T61R; A115N; L118V; H126S,V; G172P; E173Q,S; D201E; D203R, K, S; N215A, P; M238L; V264R, I; G302R,H; T337Q,S,G; V339I; P340A; E360R; V365L,A,S; D366V,S; E411K,T.

2. Polipéptido de fitasa que comprende una fitasa según la reivindicación 1.

3. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

4. Vector de expresión recombinante que comprende un constructo de ADN según la reivindicación 3.

5. Célula huésped que se transforma con un constructo de ADN según la reivindicación 3 o un vector según la reivindicación 4.

6. Proceso para preparar una fitasa, comprendiendo éste un cultivo de la célula huésped según la reivindicación 5 bajo condiciones que permiten la producción de la fitasa, y la recuperación de la fitasa del caldo de cultivo.

7. Alimento o alimentos que comprenden al menos una fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

8. Proceso para preparar un pienso o alimento según la reivindicación 7, donde se añade al menos una fitasa a los componentes alimentarios o de piensos.

9. Composición que comprende al menos una fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

10. Composición según la reivindicación 9 adecuada para su uso en preparaciones alimentarias o de piensos.

11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 que es un aditivo para pienso.

12. Proceso para reducir los niveles de fitato en abono animal que comprende la alimentación de un animal con una cantidad eficaz del pienso según la reivindicación 7 u obtenible según la reivindicación 8.

13. Uso de la fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-2; o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 9-10 para liberar fósforo de un sustrato de fitasa.

14. Planta transgénica o parte de la planta que es capaz de expresar una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.