ES2320443T3 - Genes y polipeptidos relacionados con canceres pancreaticos humanos. - Google Patents

Abstract

Polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (b) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la que se sustituyen, delecionan, insertan y/o añaden 6 aminoácidos o menos, teniendo dicho polipéptido actividad de proliferación celular.

Description

Genes y polipéptidos relacionados con cánceres pancreáticos humanos.

La presente solicitud se refiere al documento USSN 60/414.872, presentado el 30 de septiembre de 2002 y al documento USSN 60/450.889, presentado el 28 de febrero de 2003.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la ciencia biológica, más específicamente al campo de la investigación del cáncer. En particular, la presente invención se refiere a un gen novedoso, C1958V1, implicado en los mecanismos de proliferación de las células, así como a polipéptidos codificados por los genes. Pueden usarse el gen y el polipéptido de la presente invención, por ejemplo, en el diagnóstico de la enfermedad proliferativa celular, en particular para diagnosticar cáncer pancreático, y como moléculas diana para desarrollar fármacos contra la enfermedad.

Antecedentes técnicos

La mortalidad entre pacientes con cáncer pancreático es peor que para cualquier otro tipo de tumor maligno, con una tasa de supervivencia a los 5 años de sólo el 4% (Greenlee et al., 2001). El mal pronóstico de este tumor maligno refleja tanto la dificultad del diagnóstico temprano como una respuesta generalmente mala a los tratamientos actuales (DiMagno et al., 1999; Greenlee et al., 2001). En particular, no está disponible clínicamente ningún marcador tumoral para la detección de esta enfermedad en un estadio temprano y potencialmente curativo. La resección quirúrgica es la única cura posible en la actualidad, pero los casos que pueden reseccionarse quirúrgicamente en el diagnóstico representan menos del 20% de los pacientes con este cáncer (DiMagno et al., 1999; Klinkenbijl et al., 1999). Están disponibles la ecografía endoscópica (EUS), la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (ERCP) y el CT espiral para examinar individuos con riesgo de cáncer pancreático familiar (Brentnall et al., 1999), pero esos enfoques no son prácticos en cuanto al tiempo y la economía para detectar cada individuo asintomático. Por tanto, deben descubrirse marcadores tumorales que sean sensibles y específicos para el cáncer pancreático.

Casi todos los pacientes en un estadio avanzado dejan de responder a cualquier tratamiento. Para superar esa situación, algunos ensayos clínicos han intentado establecer estrategias terapéuticas basándose en tecnologías moleculares. Tales ensayos han implicado, por ejemplo, un inhibidor de MMP, fármacos diseñados para inhibir la Ras farnesiltransferasa y enfoques basados en anticuerpos (Hao y Rowinsky, 2002; Laheru et al., 2001; Rosenberg, 2000). Sin embargo, hasta la fecha estos experimentos no han logrado efectos notables sobre esta enfermedad.

Las tecnologías de microalineamiento de ADNc han permitido obtener perfiles completos de la expresión génica en células normales y malignas, y comparar la expresión génica en células malignas y normales correspondientes (Okabe et al., Cancer Res 61:2129-37 (2001); Kitahara et al., Cancer Res 61: 3544-9 (2001); Lin et al., Oncogene 21:4120-8 (2002); Hasegawa et al., Cancer Res 62:7012-7 (2002)). Este enfoque permite dar a conocer la compleja naturaleza de las células cancerosas, y ayuda a entender el mecanismo de la carcinogénesis. La identificación de genes que están desregulados en tumores puede conducir a un diagnóstico más preciso y exacto de cánceres individuales, y a desarrollar dianas terapéuticas novedosas (Bienz y Clevers, Cell 103:311-20 (2000)). Para dar a conocer los mecanismos que subyacen a los tumores desde un punto de vista de todo el genoma, y descubrir moléculas diana para el diagnóstico y el desarrollo de fármacos terapéuticos novedosos, los presentes inventores han analizado los perfiles de expresión de células tumorales usando un microalineamiento de ADNc de 23040 genes (Okabe et al., Cancer Res 61: 2129-37 (2001); Kitahara et al., Cancer Res 61:3544-9 (2001); Lin et al., Oncogene 21:4120-8 (2002); Hasegawa et al., Cancer Res 62:7012-7 (2002)).

Estudios diseñados para revelar mecanismos de la carcinogénesis han facilitado ya la identificación de dianas moleculares para agentes antitumorales. A través del análisis de perfiles de expresión de carcinomas hepatocelulares (HCC), por ejemplo, se detectó una frecuente regulación por incremento del gen VANGL1 en células tumorales y se demostró que la supresión de la expresión de ese gen con oligonucleótidos antisentido puede disminuir significativamente el crecimiento de células de HCC e inducir la muerte celular apoptótica (Yagyu et al., 2002). Además, usando el mismo microalineamiento de ADNc en todo el genoma, se han aislado varios otros genes implicados en la tumorigénesis en el colon, tales como AF17 (Lin et al., 2001), AXUD1 (Ishiguro et al., 2001), HELAD1 (Ishiguro et al., 2002), ENC1 (Fujita et al., 2002) y APCDD1 (Takahashi et al., 2002). Los niveles de expresión de esos genes se correlacionan con la actividad del complejo de transcripción del factor de células T/factor de unión-potenciador linfoide (Tcf-LEF), y están significativamente elevados en células de cáncer de colon. Además, los inhibidores de la farnesiltransferasa (FTI) que se desarrollaron originalmente para inhibir la ruta de señalización-crecimiento relacionada con Ras, cuya activación depende de farnesilación postraduccional, han sido eficaces en el tratamiento de tumores dependientes de Ras en modelos animales (He et al., Cell 99:335-45 (1999)). Se han realizado ensayos clínicos en seres humanos usando una combinación de fármacos anticancerígenos y un anticuerpo monoclonal anti-HER2, trastuzumab, para antagonizar el receptor de protooncogén HER2/neu; y han logrado una supervivencia global y una respuesta clínica mejorada de pacientes con cáncer de mama. (Lin et al., Cancer Res 61:6345-9 (2001)). Se ha desarrollado un inhibidor de tirosina quinasa, STI-571, que inactiva selectivamente proteínas de fusión bcr-abl, para tratar leucemias mielógenas crónicas en las que la activación constitutiva de tirosina quinasa bcr-abl desempeña un papel crucial en la transformación de leucocitos. Los agentes de estas clases están diseñados para suprimir la actividad oncogénica de productos génicos específicos (Fujita et al., Cancer Res 61:7722-6 (2001)). Por tanto, los productos génicos comúnmente regulados por incremento en células cancerosas pueden servir como dianas potenciales para desarrollar agentes anticancerigenos novedosos.

Se ha demostrado que los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) reconocen péptidos de epitopos derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) presentados por moléculas del CMH de clase I y lisan células tumorales. Desde el descubrimiento de la familia MAGE como el primer ejemplo de TAA, se han descubierto muchos otros TAA usando enfoques inmunológicos (Boon, Int J Cancer 54: 177-80 (1993); Boon y van der Bruggen, J Exp Med 183: 725-9 (1996); van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7 (1991); Brichard et al., J Exp Med 178:489-95 (1993); Kawakami et al., J Exp Med 180: 347-52 (1994)). Algunos de los TAA descubiertos están ahora en la fase de desarrollo clínico como dianas de inmunoterapia. Los TAA descubiertos hasta la fecha incluyen MAGE (van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7 (1991)), gpl00 (Kawakami et al., J Exp Med 180: 347-52 (1994)), SART (Shichijo et al., J Exp Med 187: 277-88 (1998)) y NY-ESO-1 (Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997)). Por otra parte, se ha mostrado que productos génicos que se había demostrado que se sobreexpresaban específicamente en células tumorales, se reconocen como dianas que inducen respuestas inmunitarias celulares. Tales productos génicos incluyen p53 (Umano et al., Brit J Cancer 84: 1052-7 (2001)), HER2/neu (Tanaka et al., Brit J Cancer 84: 94-9 (2001)), CEA (Nukaya et al., Int J Cancer 80: 92-7 (1999)) y así sucesivamente.

A pesar del progreso significativo en la investigación básica y clínica referentes a TAA (Rosenbeg et al., Nature Med 4: 321-7 (1998); Mukherji et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 8078-82 (1995); Hu et al., Cancer Res 56: 2479-83 (1996)), sólo está disponible un número limitado de TAA candidatos. Los TAA se expresan abundantemente en células cancerosas, y al mismo tiempo que su expresión se restringe a células cancerosas, serían candidatos prometedores como dianas inmunoterapéuticas. Además, se espera que la identificación de nuevos TAA que induzcan respuestas inmunitarias antitumorales potentes y específicas fomente el uso clínico de la estrategia de vacunación con péptidos en diversos tipos de cáncer (Boon y van der Bruggen, J Exp Med 183: 725-9 (1996); van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7 (1991); Brichard et al., J Exp Med 178: 489-95 (1993); Kawakami et al.,J Exp Med 180: 347-52 (1994); Shichijo et al., J Exp Med 187: 277-88 (1998); Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997); Harris, J Natl. Cancer Inst 88: 1442-5 (1996); Butterfield et al., Cancer Res 59: 3134-42 (1999); Vissers et al., Cancer Res 59: 5554-9 (1999); van der Burg et al., J Immunol 156: 3308-14 (1996); Tanaka et al., Cancer Res 57: 4465-8 (1997); Fujie et al., Int J Cancer 80: 169-72 (1999); Kikuchi et al., Int J Cancer 81:459-66 (1999); Oiso et al., Int J Cancer 81: 387-94 (1999)).

Se ha notificado repetidamente que las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimuladas con péptidos de ciertos donadores sanos producen niveles significativos de IFN-\gamma en respuesta al péptido, pero raramente ejercen citotoxicidad contra células tumorales de una manera restringida a HLA-A24 o -A0201 en ensayos de liberación de ^{51}Cr (Kawano et al., Cancer Res 60: 3550-8 (2000); Nishizaka et al., Cancer Res 60: 4830-7 (2000); Tamura et al., Jpn J Cancer Res 92: 762-7 (2001)). Sin embargo, tanto HLA-A24 como HLA-A0201 son unos de los alelos de HLA más frecuentes en los japoneses, así como en los caucásicos (Date et al., Tissue Antigens 47: 93-101 (1996); Kondo et al., J Immunol 155: 4307-12 (1995); Kubo et al., J Immunol 152: 3913-24 (1994); Imanishi et al., Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992); Williams et al., Tissue Antigen 49: 129 (1997)). Por tanto, los péptidos antigénicos de cánceres presentados por estas HLA pueden ser especialmente útiles para el tratamiento de cánceres entre los japoneses y caucásicos. Además, se sabe que la inducción de CTL de baja afinidad in vitro resulta habitualmente del uso de péptido a una concentración alta, generando un alto nivel de complejos de CHM/péptido específicos sobre células presentadoras de antígeno (APC), que activarán específicamente estos CTL (Alexander-Miller et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7 (1996)).

El documento WO01/55314 da a conocer polipéptidos (SEQ ID NO: 2022) y polinucleótidos (SEQ ID NO: 762) similares a los del gen de C1958V1, así como vectores y células huésped que los comprenden, métodos para producir dichos polipéptidos, anticuerpos contra tales polipéptidos, moléculas antisentido dirigidas contra dichos polinucleótidos y su supuesto uso terapéutico.

También se publica una proteína similar a C1958V1 (SEQ ID NO: 2) en el documento WO03/054152 (SEQ ID NO: 1470; nº de registro de EMBL ADE08404), que da a conocer también polinucleótidos que la codifican, vectores, células huésped, anticuerpos específicos y métodos de expresión de la misma. También la secuencia Q96GX8 de la base de datos UniProt da a conocer una proteína similar a SEQ ID NO: 2.

Sumario de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar una proteína novedosa implicada en el mecanismo de proliferación de células de cáncer pancreático y el gen que codifica la proteína, así como métodos para producir y usar la misma en el diagnóstico y el tratamiento de cáncer pancreático.

Para dar a conocer el mecanismo de la carcinogénesis pancreática e identificar dianas farmacológicas y/o marcadores de diagnóstico novedosos para el tratamiento de estos tumores, los presentes inventores analizaron los perfiles de expresión de genes en carcinogénesis pancreática usando un microalineamiento de ADNc de todo el genoma que contenía 23040 genes. Desde el punto de vista farmacológico, la supresión de señales oncogénicas es más fácil en la práctica que activar efectos supresores de tumores. Por tanto, los presentes inventores buscaron genes que se regulaban por incremento durante la carcinogénesis pancreática.

Entre estos genes regulados por incremento, se identificó un gen humano novedoso, C1958, que se regulaba por incremento significativamente en el 70% de los casos de cáncer pancreático de los que pudieron obtenerse datos de expresión. A través del examen de una biblioteca de ADNc que se prepara a partir de la línea celular de cáncer pancreático Capan-1, los presentes inventores encontraron tres transcritos variantes. Entre las tres variantes, C1958V1 que codifica una proteína de 76 aminoácidos y C1958V2 que codifica una proteína de 20 aminoácidos se expresaban específicamente en líneas celulares de cáncer pancreático tal como se muestra mediante análisis de transferencia de tipo Northern. Además, la tinción inmunohistoquímica muestra que este producto C1958V1 se localiza en el aparato citoplasmático en células COS7. Además, C1958V1 se traduce en productos génicos de un mayor tamaño que el pronosticado mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western, lo que sugiere que éste podría generarse mediante modificación postraduccional.

Además, la reducción de la expresión de C1958V1 o C1958V2 mediante la transfección de sus ARN de interferencia pequeños o S-oligonucleótidos antisentido específicos inhibió el crecimiento de células de cáncer pancreático. Muchos fármacos anticancerigenos, tales como inhibidores de la síntesis de ADN y/o ARN, supresores metabólicos e intercaladores de ADN, no sólo son tóxicos para células cancerosas, sino también para células que crecen de manera normal. Sin embargo, los agentes que suprimen la expresión de C1958V1 o C1958V2 pueden no afectar de manera adversa a otros órganos debido al hecho de que la expresión normal del gen se observa principalmente en la placenta y se observa débilmente en el hígado, tiroides, tráquea o médula ósea, y por tanto puede ser de gran importancia para tratar cáncer.

Por tanto, la presente invención proporciona el gen novedoso aislado C1958V1 que es un candidato como marcador de diagnóstico para cáncer así como una diana potencial prometedora para desarrollar nuevas estrategias para el diagnóstico y agentes anticancerígenos eficaces. Además, la presente invención proporciona un polipéptido codificado por el gen, así como la producción y el uso del mismo. Más específicamente, la presente invención proporciona lo siguiente:

La presente solicitud proporciona el polipéptido humano novedoso C1958V1 o un equivalente funcional del mismo, que promueve la proliferación celular y se regula por incremento en enfermedades proliferativas celulares, tales como cánceres pancreáticos.

En una realización preferida, el polipéptido C1958V1 incluye una proteína de 76 aminoácidos supuesta con aproximadamente el 59% de identidad con la proteína hipotética [Rattus norvegicus] (XP226536). C1958V1 está codificada por el marco de lectura abierto de SEQ ID NO: 1. El polipéptido C1958V1 incluye preferiblemente la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. La presente solicitud también proporciona una proteína aislada codificada a partir de al menos una parte de la secuencia del polinucleótido C1958V1, o las secuencias de polinucleótido al menos el 90% complementarias a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1. Tales polipéptidos se aplican en los métodos de la presente invención.

El polipéptido C1958V2 descrito en el presente documento incluye una supuesta proteína de 20 aminoácidos codificada por el marco de lectura abierto de SEQ ID NO: 3. El polipéptido C1958V2 incluye preferiblemente la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4.

La presente invención proporciona además el gen humano novedoso C1958V1 cuya expresión está notablemente elevada en una gran mayoría de cánceres pancreáticos en comparación con células pancreáticas normales correspondientes. El gen de C1958V1 aislado incluye una secuencia de polinucleótido tal como se describe en SEQ ID NO: 1. En particular, el ADNc de C1958V1 incluye 881 nucleótidos que contienen un marco de lectura abierto de 228 nucleótidos (SEQ ID NO: 1). La presente invención abarca además polinucleótidos que se hibridan a y que son al menos el 90% complementarios a la secuencia de polinucleótido expuesta en SEQ ID NO: 1, hasta el grado de que codifican una proteína C1958V1 o un equivalente funcional de la misma. Ejemplos de tales polinucleótidos son mutantes alélicos y degenerados de SEQ ID NO: 1. Tales polinucleótidos se aplican en los métodos de la presente invención. El gen C1958V2 aislado descrito en el presente documento incluye una secuencia de polinucleótido tal como se describe en SEQ ID NO: 3. En particular, el ADNc de C1958V2 incluye 893 nucleótidos que contienen un marco de lectura abierto de 60 nucleótidos (SEQ ID NO: 3).

Tal como se usa en el presente documento, un gen aislado es un polinucleótido cuya estructura no es idéntica a la de cualquier polinucleótido que se produce de manera natural o a la de cualquier fragmento de un polinucleótido genómico que se produce de manera natural que se extiende sobre más de tres genes separados. Por tanto, la expresión incluye, por ejemplo, (a) un ADN que tiene la secuencia de parte de una molécula de ADN genómico que se produce de manera natural en el genoma del organismo en el que se produce de manera natural; (b) un polinucleótido incorporado en un vector o en el ADN genómico de un procariota o eucariota de una manera tal que la molécula resultante no es idéntica a cualquier ADN genómico o vector que se produce de manera natural; (c) una molécula separada tal como un ADNc, un fragmento genómico, un fragmento producido mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o un fragmento de restricción; y (d) una secuencia de nucleótidos recombinante que es parte de un gen híbrido, es decir, un gen que codifica un polipéptido de fusión.

Se describe también en el presente documento un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido descrito en el presente documento o un fragmento del mismo. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada es al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1. Tales ácidos nucleicos se aplican en el método de la presente invención. En el caso de un polinucleótido aislado que es más largo que o equivalente en longitud a la secuencia de referencia, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, se realiza la comparación con la longitud total de la secuencia de referencia. Cuando el polinucleótido aislado es más corto que la secuencia de referencia, por ejemplo, más corto que SEQ ID NO: 1, se realiza la comparación con el segmento de la secuencia de referencia de la misma longitud (excluyendo cualquier bucle requerido por el cálculo de la homología).

La presente invención también proporciona un método de producción de una proteína transfectando o transformando una célula huésped con una secuencia de polinucleótido que codifica la proteína C1958V1 y expresando la secuencia de polinucleótido. Además, la presente invención proporciona vectores que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína C1958V1 y células huésped que albergan un polinucleótido que codifica la proteína C1958V1. Pueden usarse tales vectores y células huésped para producir la proteína C1958V1.

También se proporciona por la presente solicitud un anticuerpo que reconoce la proteína C1958V1. En parte, también se proporciona un polinucleótido antisentido (por ejemplo, ADN antisentido), ribozima y ARNip (ARN de interferencia pequeño) del gen de C1958V1.

La presente invención proporciona además un método para el diagnóstico de cáncer pancreático que incluye determinar un nivel de expresión del gen en una muestra biológica, comparando el nivel de expresión del gen de C1958V1 con el de la muestra normal y definiendo un nivel de expresión alto del gen de C1958V1 en la muestra como que tiene una enfermedad proliferativa celular tal como cáncer.

Además, se proporciona un método de selección de un compuesto para tratar un cáncer pancreático. El método incluye poner en contacto el polipéptido C1958V1 polipéptido con compuestos de prueba y seleccionar los compuestos de prueba que se unan al polipéptido C1958V1.

La presente invención proporciona además un método de selección de un compuesto para tratar cáncer pancreático, en el que el método incluye poner en contacto el polipéptido C1958V1 con un compuesto de prueba y seleccionar el compuesto de prueba que suprima el nivel de expresión o la actividad biológica del polipéptido C1958V1.

La presente solicitud también proporciona una composición farmacéutica para tratar una enfermedad proliferativa celular, tal como cáncer. La composición farmacéutica puede ser, por ejemplo, un agente anticancerígeno. Puede describirse la composición farmacéutica como al menos una parte de los S-oligonucleótidos antisentido o ARNip de la secuencia de polinucleótido de C1958V1. Un ARNip adecuado consiste en un conjunto de nucleótidos que comprende las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NO: 25, 26 ó 28 como secuencias diana. El ARNip de C1958V que consiste en un conjunto de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25, 26 ó 28 como secuencias diana puede usarse adecuadamente para tratar cáncer pancreático. Las composiciones farmacéuticas también pueden ser aquéllas que comprenden los compuestos seleccionados mediante los presentes métodos de selección de compuestos para tratar enfermedades proliferativas celulares.

El curso de la acción de la composición farmacéutica es deseablemente inhibir el crecimiento de células cancerosas. Puede aplicarse la composición farmacéutica a mamíferos incluyendo seres humanos y mamíferos domésticos.

La presente invención proporciona además composiciones para su uso en métodos para tratar cáncer pancreático. Se espera que se induzca inmunidad antitumoral mediante la administración del polipéptido C1958V1. Por tanto, en el presente documento se describe también una composición para su uso en un método para inducir inmunidad antitumoral, método que comprende la etapa de administrar el polipéptido C1958V1, así como una composición farmacéutica para tratar o prevenir el cáncer que comprende el polipéptido C1958V1.

Debe entenderse que tanto el anterior sumario de la invención como la siguiente descripción detallada son de una realización preferida, y no son restrictivos de la invención u otras realizaciones alternativas de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1(a) representa razones de señal-intensidad de Cy5/Cy3 de C1958 determinadas mediante análisis de microalineamientos en células tumorales de 18 pacientes con cáncer pancreático. La figura 1(b) representa el análisis de RT-PCR semicuantitativa de la expresión de C1958 en células tumorales de pacientes con cáncer pancreático (PC1, PC4, PC5, PC6, PC7, PC8, PC 13, PC 14, PC15; PC16, PC17, PC18) y líneas celulares de cáncer pancreático (Panc-1, Aspc-1, Miapaca-2, Capan-1 y Capan-2).

La figura 2 representa la estructura genómica de tres variantes transcripcionales diferentes de C1958. Una punta de flecha negra indica el codón de terminación y una punta de flecha blanca representa el codón de iniciación. El número entre paréntesis muestra la longitud de cada exón.

La figura 3 representa el análisis de transferencia de tipo Northern del transcrito C1958 en diversos tejidos humanos (a-1, a-2, a-3) y líneas celulares de cáncer pancreático (b). Los tamaños moleculares se indican a la izquierda.

\newpage

La figura 4 (a) representa la localización subcelular de de C1958V1 marcado con Myc en células COS7. La figura 4 (b) representa la expresión de la variante de C1958V1 en células de mamífero mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Las flechas indican bandas específicas de C1958V1.

La figura 5 representa los efectos inhibidores del crecimiento de ARN de interferencia pequeños (ARNip) diseñados para reducir la expresión de C1958V1 en células de cáncer pancreático. La figura 5 (a) representa el análisis de RT-PCR semicuantitativa que muestra la supresión de la expresión endógena de C1958V1 en una célula de cáncer pancreático (KLM-1) en cultivos de 20 días en medio selectivo que contiene neomicina tras la introducción de ARNip en células KLM-1. Se usó \beta-actina (ACTS) como control interno. La figura 5 (b) presenta fotografías que representan el resultado de la tinción de Gimza de células KLM-1 tras el tratamiento con o bien psiU6BX-C1958V1 o bien psiU6BX-EGFP. La figura 5 (c) representa el resultado del ensayo MTT sobre células KLM-1 transfectadas con o bien psiU6BX-C1958V1 o bien psiU6BX-EGFP. La figura 5 (d) presenta fotografías que representan el resultado de la tinción de Gimza de células PK59 tras el tratamiento con o bien psiU6BX-C1958V1 o bien psiU6BX-EGFP. La figura 5 (e) representa el resultado del ensayo MTT sobre células PK59 transfectadas con o bien psiU6BX-C1958V1 o bien psiU6BX-EGFP. Estos experimentos se llevaron a cabo cinco veces también.

Descripción detallada de la invención

Las palabras "un/una" y "el/la" tal como se usan en el presente documento significan "al menos uno" a menos que se indique específicamente lo contrario.

La presente solicitud identifica el gen humano novedoso C1958V1 cuya expresión está notablemente elevada en cáncer pancreático en comparación con tejidos no cancerosos correspondientes. El ADNc de C1958V1 consiste en 881 nucleótidos que contienen un marco de lectura abierto de 228 nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 1. El marco de lectura abierto codifica una supuesta proteína de 76 aminoácidos.

Consecuentemente, la expresión exógena de C1958V1 en células confirió un aumento de crecimiento celular, mientras que la supresión de su expresión con S-oligonucleótidos antisentido o ARN de interferencia pequeño (ARNip) dio como resultado una inhibición del crecimiento significativa de células cancerosas. Estos hallazgos sugieren que C1958V1 produce actividades oncogénicas en células cancerosas, y que la inhibición de la actividad de estas proteínas pudiera ser una estrategia prometedora para el tratamiento de cáncer, en particular cáncer pancreático.

La presente invención abarca el gen humano novedoso C1958V1, que incluye una secuencia de polinucleótido tal como se describe en SEQ ID NO: 1, así como degenerados y mutantes de la misma, hasta el grado que codifican una proteína C1958V1, que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o su equivalente funcional. Los ejemplos de polipéptidos funcionalmente equivalentes a C1958V1 incluyen, por ejemplo, proteínas homólogas de otros organismos correspondientes a la proteína C1958V1 humanas, así como mutantes de proteína C1958V1 humanas.

En la presente invención, la expresión "funcionalmente equivalente" significa que el polipéptido sujeto tiene la actividad para promover la proliferación celular como la proteína C1958V1 y para conferir actividad oncogénica a células cancerosas. Si el polipéptido sujeto tiene o no una actividad de proliferación celular puede juzgarse introduciendo el ADN que codifica el polipéptido sujeto en una célula que expresa el polipéptido respectivo y detectando la estimulación de la proliferación de las células o el aumento en la actividad de formación de colonias. Tales células incluyen, por ejemplo, células NIH3T3, células COS7.

Un experto en la técnica conoce bien métodos para preparar polipéptidos funcionalmente equivalentes a una proteína dada e incluyen métodos conocidos de introducción de mutaciones en la proteína. Por ejemplo, un experto en la técnica puede preparar polipéptidos funcionalmente equivalentes a la proteína C1958V1 humana introduciendo una mutación apropiada en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de estas proteínas mediante mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152: 271-5 (1995); Zoller y Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 (1983); Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441-9456 (1984); Kramer y Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67 (1987); Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92 (1985); Kunkel, Methods Enzymol 85: 2763-6 (1988)). Además, en la naturaleza pueden producirse mutaciones de aminoácidos. El polipéptido de la presente invención incluye aquéllas proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos de la proteína C1958V1 humana en las que uno o más aminoácidos están mutados, siempre que los polipéptidos mutados resultantes sean funcionalmente equivalentes a la proteína C1958V1 humana. El número de aminoácidos que va a mutarse en un mutante de este tipo es preferiblemente de 6 aminoácidos o menos y más preferiblemente de 3 aminoácidos o menos.

Se sabe que proteínas mutadas o modificadas, proteínas que tienen secuencias de aminoácidos modificadas mediante sustitución, deleción, inserción y/o adición de uno o más residuos de aminoácido de una cierta secuencia de aminoácidos, conservan la actividad biológica original (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984); Zoller y Smith, Nucleic Acids Res 10: 6487-500 (1982); Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl. Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)).

El residuo de aminoácido que va a mutarse se muta preferiblemente en un aminoácido diferente en el que se conservan las propiedades de la cadena lateral del aminoácido (un proceso conocido como sustitución de aminoácidos conservativa). Ejemplos de propiedades de cadenas laterales de aminoácidos son aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) y cadenas laterales que tienen los siguientes grupos funcionales o características en común: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); una cadena lateral que contiene un grupo hidroxilo (S, T, Y); una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C, M); una cadena lateral que contiene una amida y un ácido carboxílico (D, N, E, Q); una cadena lateral que contiene una base (R, K, H); y una cadena lateral que contiene un compuesto aromático (H, F, Y, W). Obsérvese que las letras entre paréntesis indican los códigos de una letra de aminoácidos.

Un ejemplo de un polipéptido al que se añaden uno o más residuos de aminoácido a la secuencia de aminoácidos de la proteína C1958V1 humana es una proteína de fusión que contiene la proteína C1958V1 humana. Proteínas de fusión son fusiones de la proteína C1958V1 humana y otros péptidos o proteínas y se incluyen en la presente invención. Pueden prepararse proteínas de fusión mediante técnicas bien conocidas por un experto en la técnica, tal como ligando el ADN que codifica la proteína C1958V1 humana de la invención con ADN que codifica otros péptidos o proteínas, de modo que los marcos se mantengan, insertando el ADN de fusión en un vector de expresión y expresándolo en un huésped. No hay restricción para los péptidos o las proteínas fusionados a la proteína de la presente
invención.

Los péptidos conocidos que pueden usarse como péptidos que se fusionan con la proteína de la presente invención incluyen, por ejemplo, FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-10 (1988)), 6xHis que contiene seis residuos de His (histidina), 10xHis, aglutinina de la gripe (HA), fragmento c-myc humano, fragmento VSP-GP, fragmento p18HIV, T7-tag, HSV-tag, E-tag, fragmento de antígeno SV40T, lck tag, fragmento de \alpha-tubulina, B-tag, fragmento de proteína C y similares. Los ejemplos de proteínas que pueden fusionarse a una proteína de la invención incluyen GST (glutatión-S-transferasa), aglutinina de la gripe (HA), región constante de inmunoglobulinas, \beta-galactosidasa, MBP (proteína de unión a maltosa) y similares.

Pueden prepararse proteínas de fusión fusionando ADN comercialmente disponible, que codifica las proteínas o los péptidos de fusión tratados anteriormente, con el ADN que codifica el polipéptido de la presente invención y expresando el ADN fusionado preparado.

Un método alternativo conocido en la técnica para aislar polipéptidos funcionalmente equivalentes es, por ejemplo, el método que usa una técnica de hibridación (Sambrook et al., Molecular Cloning 2ª ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)). Un experto en la técnica puede aislar fácilmente un ADN que tiene homología con toda o parte de la secuencia de ADN que codifica la proteína C1958V1 humana (es decir, SEQ ID NO: 1) y aislar polipéptidos funcionalmente equivalentes a la proteína C1958V1 humana a partir del ADN aislado. En el presente documento se describen polipéptidos que están codificados por ADN que se hibrida con toda o parte de la secuencia de ADN que codifica la proteína C1958V1 humana y son funcionalmente equivalentes a la proteína C1958V1 humana. Estos polipéptidos incluyen homólogos de mamífero correspondientes a la proteína derivada de seres humanos (por ejemplo, un polipéptido codificado por un gen de mono, rata, conejo y bovino). Al aislar un ADNc sumamente homólogo al ADN que codifica la proteína C1958V1 humana de animales, es particularmente preferible usar tejidos de la placenta, el hígado, la tiroides, la tráquea o la médula ósea.

La condición de hibridación para aislar un ADN que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente a la proteína C1958V1 humana puede seleccionarse rutinariamente por un experto en la técnica. Por ejemplo, puede realizarse la hibridación llevando a cabo una hibridación previa a 68ºC durante 30 min. o más tiempo usando "tampón Rapid-hyb" (Amersham LIFE SCIENCE), añadiendo una sonda marcada y calentando a 68ºC durante 1 hora o más tiempo. La etapa de lavado siguiente puede realizarse, por ejemplo, en una condición de baja rigurosidad. Una condición de baja rigurosidad es, por ejemplo, 42ºC, 2X SSC, SDS al 0,1% o preferiblemente 50ºC, 2X SSC, SDS al 0,1%. Más preferiblemente, se usan condiciones de alta rigurosidad. Una condición de alta rigurosidad es, por ejemplo, lavar 3 veces en 2x SSC, SDS al 0,01% a temperatura ambiente durante 20 min., luego lavar 3 veces en 1x SSC, SDS al 0,1% a 37ºC durante 20 min. y lavar dos veces en 1x SSC, SDS al 0,1% a 50ºC durante 20 min. Sin embargo, varios factores, tales como la temperatura y la concentración de sal, pueden influir en la rigurosidad de la hibridación y un experto en la técnica puede seleccionar adecuadamente los factores para lograr la rigurosidad requerida.

En lugar de hibridación, puede utilizarse un método de amplificación génica, por ejemplo, el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para aislar un ADN que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente a la proteína C1958V1 humana, usando un cebador sintetizado basándose en la información de secuencia del ADN que codifica la proteína (SEQ ID NO: 1 ó 3).

Los polipéptidos que son funcionalmente equivalente a la proteína C1958V1 humana codificada por el ADN aislado a través de las técnicas de hibridación anteriores o técnicas de amplificación génica, tienen normalmente una alta homología con la secuencia de aminoácidos de la proteína C1958V1 humana. "Alta homología" se refiere normalmente a una homología del 40% o superior, preferiblemente del 60% o superior, más preferiblemente del 80% o superior, incluso más preferiblemente del 95% o superior. La homología de un polipéptido puede determinarse siguiendo el algoritmo de "Wilbur y Lipman, Proc Natl. Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)".

Pueden prepararse los polipéptidos de la presente invención como proteínas recombinantes o proteínas naturales, mediante métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Puede prepararse una proteína recombinante insertando un ADN, que codifica el polipéptido de la presente invención (por ejemplo, el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3), en un vector de expresión apropiado, introduciendo el vector en una célula huésped apropiada, obteniendo el extracto y purificando el polipéptido sometiendo el extracto a cromatografía, por ejemplo, cromatografía de intercambio fónico, cromatografía en fase inversa, filtración en gel o cromatografía de afinidad utilizando una columna a la que se fijan anticuerpos contra la proteína de la presente invención, o combinando más de una de las columnas mencionadas anteriormente.

Además, cuando el polipéptido de la presente invención se expresa dentro de células huésped (por ejemplo, células animales y E. coli) como una proteína de fusión con la proteína glutatión-S-transferasa o como una proteína recombinante complementada con múltiples histidinas, puede purificarse la proteína recombinante expresada usando una columna de glutatión o una columna de níquel. Alternativamente, cuando el polipéptido de la presente invención se expresa como una proteína marcada con c-myc, pueden detectarse múltiples histidinas, o FLAG y purificarse usando anticuerpos frente a c-myc, His o FLAG, respectivamente.

Tras purificar la proteína de fusión, también es posible excluir regiones diferentes del polipéptido objetivo cortando con trombina o factor Xa según se requiera.

Puede aislarse una proteína natural mediante métodos conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, poniendo en contacto la columna de afinidad, en la que están unidos anticuerpos que se unen a la proteína C1958V1 descrita a continuación, con el extracto de tejidos o células que expresan el polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales.

En el presente documento se describen también péptidos parciales del polipéptido de la presente invención. El péptido parcial tiene una secuencia de aminoácidos específica para el polipéptido de la presente invención y consiste en al menos 7 aminoácidos, preferiblemente 8 aminoácidos o más y más preferiblemente 9 aminoácidos o más. Puede usarse el péptido parcial, por ejemplo, para preparar anticuerpos contra el polipéptido de la presente invención, seleccionar un compuesto que se una al polipéptido de la presente invención y seleccionar inhibidores del polipéptido de la presente invención.

Puede producirse un péptido parcial de la invención mediante ingeniería genética, mediante métodos conocidos de síntesis peptídica, o digiriendo el polipéptido de la invención con una peptidasa apropiada. Para la síntesis peptídica, por ejemplo, puede usarse síntesis en fase sólida o síntesis en fase líquida.

Además, la presente invención proporciona polinucleótidos que codifican el polipéptido de la presente invención. Pueden usarse los polinucleótidos de la presente invención para la producción in vivo o in vitro del polipéptido de la presente invención tal como se describió anteriormente, o pueden aplicarse a la terapia génica para enfermedades atribuidas a anomalías genéticas en el gen que codifica la proteína de la presente invención. Puede usarse cualquier forma del polinucleótido de la presente invención siempre que codifique el polipéptido de la presente invención, incluyendo ARNm, ARN, ADNc, ADN genómico, polinucleótidos sintetizados químicamente. El polinucleótido de la presente invención incluye un ADN que comprende unas secuencias de nucleótidos dadas así como sus secuencias degeneradas, siempre que el ADN resultante codifique un polipéptido de la presente invención.

Puede prepararse el polinucleótido de la presente invención mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, puede prepararse el polinucleótido de la presente invención: preparando una biblioteca de ADNc a partir de células que expresan el polipéptido de la presente invención y realizando la hibridación usando una secuencia parcial del ADN de la presente invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) como sonda. Puede prepararse una biblioteca de ADNc, por ejemplo, mediante el método descrito en Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); alternativamente, pueden usarse bibliotecas de ADNc comercialmente disponibles. También puede prepararse una biblioteca de ADNc: extrayendo ARN de células que expresan el polipéptido de la presente invención, sintetizando oligo ADN basándose en la secuencia del ADN de la presente invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 ó 3), realizando una PCR usando los oligo ADN como cebadores y amplificando ADNc que codifican la proteína de la presente invención.

Además, secuenciando los nucleótidos del ADNc obtenido, puede determinarse rutinariamente la región de traducción codificada por el ADNc, y puede obtenerse fácilmente la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la presente invención. Además, examinando la biblioteca de ADN genómico usando el ADNc obtenido o partes del mismo como sonda, puede aislarse el ADN genómico.

Más específicamente, en primer lugar pueden prepararse ARNm a partir de una célula, tejido u órgano (por ejemplo, placenta, hígado, tiroides, tráquea o médula ósea) en el que se expresa el polipéptido objeto de la invención. Pueden usarse métodos conocidos para aislar ARNm; por ejemplo, puede prepararse ARN total mediante ultracentrifugación en guanidina (Chirgwin et al., Biochemistry 18:5294-9 (1979)) o el método de AGPC (Chomczynski y Sacchi, Anal Biochem 162:156-9 (1987)). Además, puede purificarse ARNm a partir de ARN total usando el kit de purificación de ARNm (Pharmacia) y similares o, alternativamente, puede purificarse directamente ARNm mediante el kit de purificación de ARNm QuickPrep (Pharmacia).

El ARNm obtenido se usa para sintetizar ADNc usando transcriptasa inversa. Puede sintetizarse ADNc usando un kit comercialmente disponible, tal como el kit de síntesis de ADNc AMV Reverse Transcriptase First-strand (Seikagaku Kogyo). Alternativamente, el ADNc puede sintetizarse y amplificarse siguiendo el método de 5'-RACE (Frohman et al., Proc Natl. Acad Sci USA 85: 8998-9002 (1988); Belyavsky et al., Nucleic Acids Res 17: 2919-32 (1989)), que usa un cebador y similares, tal como se describe en el presente documento, el kit 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Se prepara un fragmento de ADN deseado a partir de los productos de PCR y se ligan con un vector de ADN. Se usan los vectores recombinantes para transformar E. coli y similares, y se prepara un vector recombinante deseado a partir de una colonia seleccionada. Puede verificarse la secuencia de nucleótidos del ADN deseado mediante métodos convencionales, tales como terminación de la cadena con didesoxinucleótidos.

Puede diseñarse la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de la invención para que se exprese más eficazmente teniendo en cuenta la frecuencia de uso de codones en el huésped que va a usarse para la expresión (Grantham et al., Nucleic Acids Res 9: 43-74 (1981)). Puede alterarse la secuencia del polinucleótido de la presente invención mediante un kit comercialmente disponible o un método convencional. Por ejemplo, puede alterarse la secuencia mediante digestión con enzimas de restricción, inserción de un oligonucleótido sintético o un fragmento de polinucleótido apropiado, adición de un ligador o inserción del codón de iniciación (ATG) y/o el codón de terminación (TAA, TGA o TAG).

Específicamente, el polinucleótido de la presente invención abarca el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

Además, en el presente documento se describe un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y codifica un polipéptido funcionalmente equivalente a la proteína C1958V1 de la invención descrita anteriormente. Un experto en la técnica puede elegir apropiadamente condiciones rigurosas. Por ejemplo, puede usarse una condición de baja rigurosidad. Más preferiblemente, puede usarse una condición de alta rigurosidad. Estas condiciones son las mismas que las descritas anteriormente. El ADN de hibridación anterior es preferiblemente un ADNc o un ADN cromosómico.

La presente invención también proporciona un vector en el que se inserta un polinucleótido de la presente invención. Un vector de la presente invención es útil para mantener un polinucleótido, especialmente un ADN, de la presente invención en una célula huésped, para que exprese el polipéptido de la presente invención.

Cuando E. coli es una célula huésped y el vector se amplifica y se produce en una gran cantidad en E. coli (por ejemplo, JM109, DH5\alpha, HB101 o XL1Blue), el vector debe tener la secuencia "ori" para que se amplifique en E. coli y un gen marcador para seleccionar E. coli transformada (por ejemplo, un gen de resistencia a fármacos seleccionado por un fármaco tal como ampicilina, tetraciclina, kanamicina, cloranfenicol o similares). Por ejemplo, pueden usarse vectores de la serie M13, vectores de la serie pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script, etc. Además, también pueden usarse pGEM-T, pDIRECT y pT7 para subclonar y extraer ADNc así como los vectores descritos anteriormente. Cuando se usa un vector para producir la proteína de la presente invención, un vector de expresión es especialmente útil. Por ejemplo, un vector de expresión que va a expresarse en E. coli debe tener las características anteriores para amplificarse en E. coli. Cuando se usa E. coli, tal como JM109, DH5a, HB101 o XL1 Blue, como célula huésped, el vector debe tener un promotor, por ejemplo, el promotor lacZ (Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)), el promotor araB (Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)) o el promotor de T7 o similares, que pueden expresar eficazmente el gen deseado en E. coli. En ese aspecto, pueden usarse pGEX-5X-1 (Pharmacia), "sistema QlAexpress" (Qiagen), pEGFP y pET (en este caso, el huésped es preferiblemente BL21 que expresa la ARN polimerasa de T7), por ejemplo, en lugar de los vectores anteriores. Adicionalmente, el vector también puede contener una secuencia señal para la secreción del polipéptido. Una secuencia señal a modo de ejemplo que dirige el polipéptido que va a secretarse al periplasmo de E. coli es la secuencia señal pelB (Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)). Los medios para introducir los vectores en las células huésped diana incluyen, por ejemplo, el método del cloruro de calcio y el método de electroporación.

Además de E. coli, por ejemplo, pueden usarse vectores de expresión derivados de mamíferos (por ejemplo, pADNc3 (Invitrogen) y pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), vectores de expresión derivados de células de insectos (por ejemplo, "sistema de expresión de baculovirus Bac-to-BAC" (GIBCO BRL), pBacPAK8), vectores de expresión derivados de plantas (por ejemplo, pMH1, pMH2), vectores de expresión derivados de virus animales (por ejemplo, pHSV, pMV, pAdexLcw), vectores de expresión derivados de retrovirus (por ejemplo, pZlpneo), vectores de expresión derivados de levaduras (por ejemplo, "kit de expresión en Pichia" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) y vectores de expresión derivados de Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608, pKTHSO) para producir el polipéptido de la presente invención.

Con el fin de expresar el vector en células animales, tales como células CHO, COS o NIH3T3, el vector debe tener un promotor necesario para su expresión en tales células, por ejemplo, el promotor de SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)), el promotor de LTR del VLMM, el promotor de EFla (Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), el promotor de CMV y similares y preferiblemente un gen marcador para seleccionar transformantes (por ejemplo, un gen de resistencia a fármacos seleccionado por un fármaco (por ejemplo, neomicina, G418)). Los ejemplos de vectores conocidos con estas características incluyen, por ejemplo, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV y pOP13.

Además, pueden usarse métodos para expresar un gen de manera estable y, al mismo tiempo, para amplificar el número de copias del gen en las células. Por ejemplo, puede introducirse un vector que comprende el gen DHFR complementario (por ejemplo, pCHO I) en células CHO en las que la ruta de síntesis de ácidos nucleicos está delecionada, y entonces se amplifica mediante metrotrexato (MTX). Además, en caso de expresión transitoria de un gen, puede usarse el método en el que un vector que comprende un origen de replicación de SV40 (pcD, etc.) se transforma en células COS que comprenden el gen que expresa el antígeno T de SV40 en el cromosoma.

Un polipéptido de la presente invención obtenido como anteriormente puede aislarse del interior o el exterior (tal como el medio) de las células huésped, y purificarse como un polipéptido homogéneo sustancialmente puro. La expresión "sustancialmente puro" tal como se usa en el presente documento en referencia a un polipéptido dado significa que el polipéptido está sustancialmente libre de otras macromoléculas biológicas. El polipéptido sustancialmente puro es al menos el 75% (por ejemplo, al menos el 80, 85, 95 ó 99%) puro en peso seco. Puede medirse la pureza mediante cualquier método convencional apropiado, por ejemplo mediante cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis de HPLC. El método para el aislamiento y la purificación del polipéptido no se limita a ningún método específico; de hecho, puede usarse cualquier método convencional.

Por ejemplo, puede seleccionarse y combinarse apropiadamente cromatografía en columna, filtración, ultrafiltración, precipitación con sal, precipitación con disolvente, extracción con disolvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis de punto isoeléctrico, diálisis y recristalización para aislar y purificar el polipéptido.

Los ejemplos de cromatografía incluyen, por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía en fase inversa, cromatografía de adsorción y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Estas cromatografías pueden realizarse mediante cromatografía de líquidos, tal como HPLC y FPLC. Por tanto, la presente invención proporciona polipéptidos sumamente purificados mediante los métodos anteriores.

Puede modificarse un polipéptido de la presente invención opcionalmente o delecionarse parcialmente tratándolo con una enzima de modificación de proteínas apropiada antes o tras la purificación. Las enzimas de modificación de proteínas útiles incluyen, pero no se limitan a, tripsina, quimotripsina, lisilendopeptidasa, proteína quinasa, glucosidasa y así sucesivamente.

La presente invención proporciona un anticuerpo que se une al polipéptido de la invención. Puede usarse el anticuerpo de la invención en cualquier forma, tal como anticuerpos monoclonales o policlonales, e incluye antisuero obtenido inmunizando un animal tal como un conejo con el polipéptido de la invención, todas las clases de anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados producidos mediante recombinación genética.

Un polipéptido de la invención usado como antígeno para obtener un anticuerpo puede derivarse de cualquier especie animal, pero preferiblemente se deriva de un mamífero tal como un ser humano, un ratón o una rata, más preferiblemente de un ser humano. Puede obtenerse un polipéptido derivado de un ser humano a partir de las secuencias de nucleótidos o aminoácidos dadas a conocer en el presente documento.

-

Según la presente invención, el polipéptido que va a usarse como antígeno de inmunización puede ser una proteína completa o un péptido parcial de la proteína. Un péptido parcial puede comprender, por ejemplo, el fragmento amino (N)-terminal o carboxilo (C)-terminal de un polipéptido de la presente invención.

En el presente documento, un anticuerpo se define como una proteína que reacciona con o bien la longitud completa o bien un fragmento de un polipéptido de la presente invención.

Puede insertarse un gen que codifica un polipéptido de la invención o su fragmento en un vector de expresión conocido, que se usa entonces para transformar una célula huésped tal como se describe en el presente documento. Puede recuperarse el polipéptido deseado o su fragmento del exterior o el interior de las células huésped mediante cualquier método convencional, y puede usarse posteriormente como antígeno. Alternativamente, pueden usarse como antígeno células completas que expresan el polipéptido o sus lisados, o un polipéptido sintetizado químicamente.

Puede inmunizarse cualquier animal mamífero con el antígeno, pero preferiblemente se tiene en cuenta la compatibilidad con las células originales usadas para la fusión celular. En general, se usan animales de los órdenes Rodentia, Lagomorpha o Primates. Los animales del orden Rodentia incluyen, por ejemplo, ratón, rata y hámster. Los animales del orden Lagomorpha incluyen, por ejemplo, conejo. Los animales del orden Primates incluyen, por ejemplo, un mono catarrino (monos del viejo mundo) tal como Macaca fascicularis, mono rhesus, babuino sagrado y chimpancés.

Se conocen en la técnica métodos para inmunizar animales con antígenos. La inyección intraperitoneal o la inyección subcutánea de antígenos es un método convencional para la inmunización de mamíferos. Más específicamente, pueden diluirse y suspenderse antígenos en una cantidad apropiada de solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina fisiológica, etc. Si se desea, puede mezclarse la suspensión de antígenos con una cantidad apropiada de un adyuvante convencional, tal como adyuvante completo de Freund, preparado en emulsión, y administrado luego a animales mamíferos. Preferiblemente, a ésto le siguen varias administraciones de antígeno mezclado con una cantidad apropiada de adyuvante incompleto de Freund cada 4 a 21 días. También puede usarse un vehículo apropiado para la inmunización. Tras la inmunización como anteriormente, se examina el suero mediante un método convencional para detectar un aumento en la cantidad de anticuerpos deseados.

Pueden prepararse anticuerpos policlonales contra los polipéptidos de la presente invención recogiendo sangre del mamífero inmunizado examinado para detectar el aumento de los anticuerpos deseados en el suero, y separando el suero de la sangre mediante cualquier método convencional. Los anticuerpos policlonales incluyen suero que contiene anticuerpos policlonales, así como la fracción que contiene los anticuerpos policlonales puede aislarse a partir del suero. Puede prepararse inmunoglobulina G o M a partir de una fracción que reconoce sólo el polipéptido de la presente invención usando, por ejemplo, una columna de afinidad acoplada con el polipéptido de la presente invención, y purificando adicionalmente esta fracción usando una columna de proteína A o proteína G.

Para preparar anticuerpos monoclonales, se recogen células inmunitarias del mamífero inmunizado con el antígeno y se comprueba que tienen el aumento de nivel de anticuerpos deseados en el suero tal como se describió anteriormente, y se someten a fusión celular. Las células inmunitarias usadas para la fusión celular se obtienen preferiblemente del bazo. Otras células originales preferidas que van a fusionarse con el inmunocito anterior incluyen, por ejemplo, células de mieloma de mamíferos, y más preferiblemente células de mieloma que tienen una propiedad adquirida para la selección de células fusionadas mediante fármacos.

Pueden fusionarse las células de mieloma y el inmunocito anteriores según métodos conocidos, por ejemplo, el método de Milstein et al. (Galfre y Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).

Pueden seleccionarse los hibridomas resultantes obtenidos mediante la fusión celular cultivándolos en un medio de selección convencional, tal como medio HAT (medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo celular se continúa normalmente en el medio HAT durante de varios días a varias semanas, tiempo que es suficiente para permitir que todas las otras células, con la excepción del hibridoma deseado (células no fusionadas), mueran. Entonces, se realiza la dilución limitante convencional para seleccionar y clonar una célula de hibridoma que produce el anticuerpo deseado.

Además del método anterior, en el que se inmuniza un animal no humano con un antígeno para preparar un hibridoma, pueden inmunizarse linfocitos humanos tales como los infectados por el virus de EB con un polipéptido, células que expresan polipéptidos o sus lisados in vitro. Entonces, los linfocitos inmunizados se fusionan con células de mieloma derivadas de seres humanos que pueden dividirse indefinidamente, tales como U266, para proporcionar un hibridoma que produce un anticuerpo humano deseado que puede unirse al polipéptido (solicitud de patente japonesa publicada no examinada número (JP-A) Sho 63-17688).

Los hibridomas obtenidos se trasplantan posteriormente en la cavidad abdominal de un ratón y se extraen las ascitis. Pueden purificarse los anticuerpos monoclonales obtenidos, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato de amonio, una columna de proteína A o proteína G, cromatografía de intercambio iónico en DEAE o una columna de afinidad a la que se acopla el polipéptido de la presente invención. El anticuerpo de la presente invención puede usarse no sólo para la purificación y detección del polipéptido de la presente invención, sino también como candidato para agonistas y antagonistas del polipéptido de la presente invención. Además, este anticuerpo puede aplicarse al tratamiento con anticuerpos para enfermedades relacionadas con el polipéptido de la presente invención. Cuando el anticuerpo obtenido va a administrarse al cuerpo humano (tratamiento con anticuerpos), es preferible un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para reducir la inmunogenicidad.

Por ejemplo, pueden inmunizarse animales transgénicos que tienen un repertorio de genes de anticuerpos humanos con un antígeno seleccionado de un polipéptido, células que expresan polipéptidos o sus lisados. Entonces se recogen células que producen anticuerpos de los animales y se fusionan con células de mieloma para obtener un hibridoma, a partir del cual pueden prepararse anticuerpos humanos frente al polipéptido (véanse los documentos WO92-03918, WO93-2227, WO94-02602, WO94-25585, W096-33735 y WO96-34096).

Alternativamente, puede inmortalizarse mediante un oncogén una célula inmunitaria, tal como un linfocito inmunizado que produce anticuerpos, y usarse para preparar anticuerpos monoclonales.

También pueden prepararse de manera recombinante anticuerpos monoclonales así obtenidos usando técnicas de ingeniería genética (véase, por ejemplo, Borrebaeck y Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en el Reino Unido por MacMillan Publishers LTD (1990)). Por ejemplo, puede clonarse un ADN que codifica un anticuerpo a partir de una célula inmunitaria, tal como un hibridoma o un linfocito inmunizado que produce el anticuerpo, insertarse en un vector apropiado e introducirse en células huésped para preparar un anticuerpo recombinante. La presente invención también proporciona anticuerpos recombinantes preparados tal como se describió anteriormente.

Además, un anticuerpo de la presente invención puede ser un fragmento de un anticuerpo o anticuerpo modificado, siempre que se una a uno o más de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser Fab, F(ab')_{2}, Fv o Fv de cadena sencilla (scFv), en el que fragmentos Fv de cadenas H y L están ligados mediante un espaciador apropiado (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). Más específicamente, puede generarse un fragmento de anticuerpo tratando un anticuerpo con una enzima, tal como papaína o pepsina. Alternativamente, puede construirse un gen que codifica el fragmento de anticuerpo, insertarse en un vector de expresión y expresarse en una célula huésped apropiada (véase, por ejemplo, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better y Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun y Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird y Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).

Puede modificarse un anticuerpo mediante conjugación con una variedad de moléculas, tales como polietilenglicol (PEG). La presente invención proporciona tales anticuerpos modificados. Puede obtenerse el anticuerpo modificado modificando químicamente un anticuerpo. Estos métodos de modificación son convencionales en el campo.

Alternativamente, puede obtenerse un anticuerpo de la presente invención como un anticuerpo quimérico, entre una región variable derivada de anticuerpo no humano y la región constante derivada de anticuerpo humano, o como un anticuerpo humanizado, que comprende la región determinante de complementariedad (CDR) derivada de anticuerpo no humano, la región de entramado (FR) derivada de anticuerpo humano y la región constante. Pueden prepararse tales anticuerpos usando tecnología conocida.

Los anticuerpos obtenidos como anteriormente pueden purificarse hasta la homogeneidad. Por ejemplo, pueden realizarse la separación y la purificación del anticuerpo según métodos de separación y purificación usados para proteínas generales. Por ejemplo, puede separarse y aislarse el anticuerpo mediante el uso combinado y apropiadamente seleccionado de cromatografías en columna, tales como cromatografía de afinidad, filtración, ultrafiltración, precipitación con sales, diálisis, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, isoelectroenfoque y otros (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), pero no se limitan a las mismas. Pueden usarse como columna de afinidad una columna de proteína A y una columna de proteína G. Las columnas de proteína A a modo de ejemplo que van a usarse incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS y Sepharose F.F. (Pharmacia).

La cromatografía a modo de ejemplo, con la excepción de la afinidad, incluye, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía en fase inversa, cromatografía de adsorción y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Pueden llevarse a cabo los procedimientos cromatográficos mediante cromatografía en fase líquida, tal como HPLC y FPLC.

Por ejemplo, pueden usarse la medición de la absorbancia, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el inmunoensayo enzimático (EIA), el radioinmunoensayo (RIA) y/o la inmunofluorescencia para medir la actividad de unión a antígeno del anticuerpo de la invención. En el ELISA, se inmoviliza el anticuerpo de la presente invención sobre una placa, se aplica a la placa un polipéptido de la invención y luego se aplica una muestra que contiene un anticuerpo deseado, tal como sobrenadante de cultivo de células que producen anticuerpos o anticuerpos purificados. Entonces, se aplica un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo primario y que está marcado con una enzima, tal como fosfatasa alcalina, y se incuba la placa. A continuación, tras lavar, se añade a la placa un sustrato enzimático, tal como fosfato de p-nitrofenilo, y se mide la absorbancia para evaluar la actividad de unión a antígeno de la muestra. Puede usarse un fragmento del polipéptido, tal como un fragmento C-terminal o N-terminal, como antígeno para evaluar la actividad de unión del anticuerpo. Puede usarse BlAcore (Pharmacia) para evaluar la actividad del anticuerpo según la presente invención.

Los métodos anteriores permiten la detección o medición del polipéptido de la invención, exponiendo el anticuerpo de la invención a una muestra que se supone que contiene el polipéptido de la invención, y detectando o midiendo el complejo inmunitario formado por el anticuerpo y el polipéptido.

Debido a que el método de detección o medición del polipéptido según la invención puede medir o detectar específicamente un polipéptido, el método puede ser útil en una variedad de experimentos en los que se usa el polipéptido.

En el presente documento se describe también un polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido que codifica la proteína C1958V1 humana (SEQ ID NO: 1) o la hebra complementaria del mismo, y que comprende al menos 15 nucleótidos. El polinucleótido es preferiblemente un polinucleótido que se hibrida específicamente con el ADN que codifica el polipéptido de la presente invención. La expresión "se hibrida específicamente" tal como se usa en el presente documento significa que no se produce hibridación cruzada de manera significativa con ADN que codifica otras proteínas, en las condiciones de hibridación habituales, preferiblemente en condiciones de hibridación rigurosas. Tales polinucleótidos incluyen sondas, cebadores, nucleótidos y derivados de nucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido y ribozimas), que se hibridan específicamente con ADN que codifica el polipéptido de la invención o su hebra complementaria. Además, puede utilizarse tal polinucleótido para la preparación de un chip de ADN.

La presente invención incluye un oligonucleótido antisentido que se hibrida con cualquier sitio dentro de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. Este oligonucleótido antisentido es preferiblemente contra al menos 15 nucleótidos continuos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. Incluso se prefiere más el oligonucleótido antisentido mencionado anteriormente, que contiene un codón de iniciación en los al menos 15 nucleótidos continuos mencionados anteriormente.

Pueden usarse productos modificados o derivados de oligonucleótidos antisentido como oligonucleótidos antisentido. Los ejemplos de tales productos modificados incluyen modificaciones con fosfonato de alquilo inferior tal como de tipo fosfonato de metilo o de tipo fosfonato de etilo, modificaciones con fosforotioato y modificaciones con fosforoamidato.

La expresión "oligonucleótidos antisentido" tal como se usa en el presente documento significa no sólo aquéllos en los que los nucleótidos que corresponden a los que constituyen una región especificada de un ADN o ARNm son totalmente complementarios, sino también aquéllos que tienen un apareamiento erróneo de uno o más nucleótidos, siempre que el ADN o ARNm y el oligonucleótido antisentido puedan hibridarse específicamente con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

Tales polinucleótidos están contenidos como aquéllos que tienen, en la "región de secuencia de al menos 15 nucleótidos continuos", una homología de al menos el 70% o superior, preferiblemente el 80% o superior, más preferiblemente el 90% o superior, incluso más preferiblemente el 95% o superior. Puede usarse el algoritmo establecido en el presente documento para determinar la homología. Tales polinucleótidos son útiles como sondas para el aislamiento o la detección de ADN que codifica el polipéptido de la invención tal como se establece en un ejemplo posterior o como cebador usado para amplificaciones.

Los derivados de oligonucleótido antisentido de la presente invención actúan sobre células que producen el polipéptido de la invención uniéndose al ADN o ARNm que codifica el polipéptido, inhibiendo su transcripción o traducción, promoviendo la degradación del ARNm e inhibiendo la expresión del polipéptido de la invención, dando como resultado de ese modo la inhibición de la función del polipéptido.

Puede prepararse un derivado de oligonucleótido antisentido de la presente invención en una preparación externa, tal como un linimento o emplasto, mezclándolo con un material de base adecuado que es inactivo frente a los derivados.

Además, según se necesite, los derivados pueden formularse en comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas, cápsulas de liposomas, inyecciones, disoluciones, gotas nasales y agentes de liofilización añadiendo excipientes, agentes isotónicos, solubilizantes, estabilizadores, conservantes, analgésicos y similares. Estos pueden prepararse siguiendo métodos habituales.

El derivado de oligonucleótido antisentido se administra al paciente directamente aplicándolo sobre el sitio de la dolencia o inyectándolo en un vaso sanguíneo de modo que alcanzará el sitio de la dolencia. También puede usarse un medio de montaje antisentido para aumentar la durabilidad y la permeabilidad de la membrana. Ejemplos son liposomas, poli-L-lisina, lípidos, colesterol, lipofectina o derivados de éstos.

La dosificación del derivado de oligonucleótido antisentido de la presente invención puede ajustarse adecuadamente según el estado del paciente y usarse en cantidades deseadas. Por ejemplo, puede administrarse un intervalo de dosis de 0,1 a 100 mg/kg, preferiblemente de 0,1 a 50 mg/kg.

La presente invención también incluye ARN de interferencia pequeños (ARNip) que comprenden una combinación de un ácido nucleico de hebra sentido y un ácido nucleico de hebra antisentido de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. Más específicamente, tales ARNip para suprimir la expresión de C1958V1 incluyen aquéllos cuya hebra sentido comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25, 26 ó 28 como secuencias diana. El término "ARNip" se refiere a una molécula de ARN bicatenario que impide la traducción de un ARNm diana. Se usan técnicas convencionales para introducir ARNip en células, incluyendo aquéllas en las que se usa ADN como molde para transcribir el ARN. El ARNip comprende una secuencia de ácido nucleico sentido y una secuencia de ácido nucleico antisentido del polinucleótido que codifica la proteína C1958V1 humana (SEQ ID NO: 1). El ARNip se construye de modo que un único transcrito (ARN bicatenario) tiene tanto las secuencias sentido como antisentido complementaria del gen diana, por ejemplo, una horquilla.

Se usa el método para alterar la expresión génica de una célula, es decir, regular por incremento la expresión de C1958V1, por ejemplo, como resultado de la transformación maligna de las células. La unión del ARNip al transcrito de C1958V1 en la célula diana da como resultado una reducción de la producción de proteínas por la célula. La longitud del oligonucleótido es al menos de 10 nucleótidos y puede ser tan largo como el transcrito que se produce de manera natural. Preferiblemente, el oligonucleótido tiene de 19-25 nucleótidos de longitud. Lo más preferiblemente, el oligonucleótido tiene menos de 75, 50, 25 nucleótidos de longitud. Los ejemplos de oligonucleótidos de ARNip de C1958V1 que inhiben la expresión en células de mamífero incluyen oligonucleótidos que contienen cualquiera de SEQ ID NO: 25, 26 ó 28 como secuencias diana.

La secuencia de nucleótidos de ARNip puede diseñarse usando un programa informático de diseño de ARNip disponible del sitio web de Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). Las secuencias de nucleótidos para el ARNip se seleccionan mediante el programa informático basándose en el siguiente protocolo:

Selección de sitios diana de ARNip:

1.

Comenzar con el codón de iniciación AUG del transcrito objeto, explorar en sentido 3' para detectar secuencias de dinucleótido AA. Registrar la aparición de cada AA y los 19 nucleótidos adyacentes en 3' como posibles sitios diana de ARNip. Tuschl, et al. no recomiendan el diseño de ARNip frente a las regiones no traducidas en 5' y 3' (UTR) y regiones cerca del codón de iniciación (en el intervalo de 75 bases) ya que éstas pueden ser más ricas en sitios de unión de proteínas reguladoras. Las proteínas de unión a UTR y/o los complejos de iniciación de la traducción pueden interferir con la unión del complejo de ARNip-endonucleasa.

2.

Comparar los posibles sitios diana con la base de datos del genoma humano y eliminar de su consideración cualquier secuencia diana con homología significativa con otras secuencias codificantes. La búsqueda de homología puede realizarse usando BLAST, que puede encontrarse en el servidor de NCBI en: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

3.

Seleccionar secuencias diana cualificadas para la síntesis. En Ambion, pueden seleccionarse preferiblemente varias secuencias diana a lo largo de la longitud del gen para su evaluación.

El oligonucleótido antisentido o ARNip de la invención inhiben la expresión del polipéptido de la invención y por tanto son útiles para suprimir la actividad biológica del polipéptido de la invención. Además, inhibidores de la expresión, que comprenden el oligonucleótido antisentido o ARNip de la invención, son útiles en el sentido que pueden inhibir la actividad biológica del polipéptido de la invención. Por tanto, una composición que comprende el oligonucleótido antisentido o ARNip de la presente invención es útil en el tratamiento de cáncer pancreático.

Además, la presente invención proporciona un método para diagnosticar una enfermedad proliferativa celular usando el nivel de expresión de los polipéptidos de la presente invención como marcador de diagnóstico.

Este método de diagnóstico comprende las etapas de: (a) detectar el nivel de expresión del gen de C1958V1 de la presente invención; y (b) relacionar una elevación del nivel de expresión con la enfermedad proliferativa celular, tal como cáncer.

Los niveles de expresión del gen de C1958V1 en una muestra particular pueden estimarse cuantificando el ARNm correspondiente o la proteína codificada por el gen de C1958V1. Los expertos en la técnica conocen métodos de cuantificación para el ARNm. Por ejemplo, los niveles de ARNm correspondientes al gen de C1958V1 pueden estimarse mediante transferencia de tipo Northern o RT-PCR. Dado que las secuencias de nucleótidos de longitud completa del gen de C1958V1 se muestran en SEQ ID NO: 1, cualquier experto en la técnica puede diseñar las secuencias de nucleótidos para obtener sondas o cebadores para cuantificar el gen de C1958V1.

Además, puede analizarse el nivel de expresión del gen de C1958V1 basándose en la actividad o cantidad de proteína codificada por el gen. Se muestra a continuación un método para determinar la cantidad de la proteína C1958V1. Por ejemplo, un método de inmunoensayo es útil para la determinación de las proteínas en materiales biológicos. Puede usarse cualquier material biológico para la determinación de la proteína o su actividad. Por ejemplo, se analiza una muestra de sangre para la estimación de la proteína codificada mediante un marcador sérico. Por otra parte, puede seleccionarse un método adecuado para la determinación de la actividad de una proteína codificada por el gen de C1958V1 según la actividad de cada proteína que va a analizarse.

Se estiman los niveles de expresión del gen de C1958V1 en una muestra (muestra de prueba) y se comparan con los de una muestra normal. Cuando una comparación de este tipo muestra que el nivel de expresión del gen diana es superior al de la muestra normal, se juzga que el sujeto está afectado por una enfermedad proliferativa celular. El nivel de expresión del gen de C1958V1 en las muestras de la muestra normal y el sujeto puede determinarse al mismo tiempo. Alternativamente, pueden determinarse intervalos normales de los niveles de expresión mediante un método estadístico basándose en los resultados obtenidos analizando el nivel de expresión del gen en muestras recogidas previamente de un grupo control. Un resultado obtenido comparando la muestra de un sujeto se compara con el intervalo normal; cuando el resultado no se encuentra dentro del intervalo normal, se juzga que el sujeto está afectado por la enfermedad proliferativa celular. En la presente invención, la enfermedad proliferativa celular que va a diagnosticarse es cáncer pancreático. Más preferiblemente, cuando se estima el nivel de expresión del gen de C1958V1 y se compara con el de una muestra normal, la enfermedad proliferativa celular que va a diagnosticarse es cáncer pancreático.

En la presente invención, también se proporciona un agente de diagnóstico para diagnosticar cánceres pancreáticos. El agente de diagnóstico de la presente invención comprende un compuesto que se une a un polinucleótido o un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, puede usarse un oligonucleótido que se hibrida con el polinucleótido de la presente invención, o un anticuerpo que se une al polipéptido de la presente invención como compuesto de este tipo.

Además, la presente invención proporciona un método de selección de un compuesto para tratar una enfermedad proliferativa celular usando el polipéptido de la presente invención. Una realización de este método de selección comprende las etapas de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido de la presente invención, (b) detectar la actividad de unión entre el polipéptido de la presente invención y el compuesto de prueba y (c) seleccionar un compuesto que se une al polipéptido de la presente invención.

El polipéptido de la presente invención que va a usarse para la selección puede ser una proteína derivada de la naturaleza o polipéptido recombinante, o un péptido parcial del mismo. Puede usarse cualquier compuesto de prueba, por ejemplo, extractos celulares, sobrenadante de cultivo celular, productos de microorganismos fermentadores, extractos de organismos marinos, extractos vegetales, proteínas brutas o purificadas, péptidos, compuestos no peptídicos, compuestos micromoleculares sintéticos y compuestos naturales. El polipéptido de la presente invención que va a ponerse en contacto con un compuesto de prueba puede ser, por ejemplo, un polipéptido purificado, una proteína soluble, una forma unida a un vehículo o una proteína de fusión fusionada con otros polipéptidos.

Como método de selección de proteínas, por ejemplo, que se unen al polipéptido de la presente invención usando el polipéptido de la presente invención, pueden usarse muchos métodos bien conocidos por un experto en la técnica. Puede realizarse una selección de este tipo, por ejemplo, mediante un método de inmunoprecipitación, específicamente, de la siguiente manera. El gen que codifica el polipéptido de la presente invención se expresa en células animales y así sucesivamente insertando el gen en un vector de expresión para genes foráneos, tal como pSV2neo, pADNc I y pCD8. El promotor que va a usarse para la expresión puede ser cualquier promotor que pueda usarse comúnmente e incluye, por ejemplo, el promotor temprano de SV40 (Rigby en Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, Londres, 83-141 (1982)), el promotor de EF-1\alpha (Kim et al., Gene 91: 217-23 (1990)), el promotor CAG (Niwa et al., Gene 108: 193-200 (1991)), el promotor de LTR del VRS (Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)), el promotor SRa (Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466 (1988)), el promotor temprano inmediato de CMV (Seed y Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)), el promotor tardío de SV40 (Gheysen y Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)), el promotor tardío de adenovirus (Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946 (1989)), el promotor de TK del VHS y así sucesivamente. La introducción del gen en células animales para expresar un gen foráneo puede realizarse según cualquier método, por ejemplo, el método de electroporación (Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)), el método del fosfato de calcio (Chen y Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987)), el método de DEAE-dextrano (Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984); Sussman y Milman, Mol Cell Biol 4: 1642-3 (1985)), el método de lipofectina (Derijard, B Cell 7: 1025-37 (1994); Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30 (1993): Rabindran et al., Science 259: 230-4 (1993)) y así sucesivamente. El polipéptido de la presente invención puede expresarse como una proteína de fusión que comprende un sitio de reconocimiento (epítopo) de un anticuerpo monoclonal introduciendo el epítopo del anticuerpo monoclonal, cuya especificidad se ha revelado, en el extremo N- o C-terminal del polipéptido de la presente invención. Puede usarse un sistema de epítopo-anticuerpo comercialmente disponible (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). Están comercialmente disponibles vectores que pueden expresar una proteína de fusión con, por ejemplo, \beta-galactosidasa, proteína de unión a maltosa, glutatión-S-transferasa, proteína de fluorescencia verde (GFP) y así sucesivamente mediante el uso de sus múltiples sitios de clonación.

También se notifica una proteína de fusión preparada introduciendo sólo pequeños epítopos que consisten en, de varios a una docena de aminoácidos, siempre que no cambie la propiedad del polipéptido de la presente invención mediante la fusión. Pueden usarse epítopos, tales como polihistidina (His-tag), HA agregada de la gripe, c-myc humano, FLAG, glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSVGP), proteína del gen 10 de T7 (T7-tag), glicoproteína del virus herpes simple humano (HSV-tag), E-tag (un epítopo de un fago monoclonal) y similares, y anticuerpos monoclonales que los reconocen, como el sistema de epítopo-anticuerpo para seleccionar proteínas que se unen al polipéptido de la presente invención (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)).

En la inmunoprecipitación, se forma un complejo inmunitario añadiendo estos anticuerpos a lisado celular preparado usando un detergente apropiado. El complejo inmunitario consiste en el polipéptido de la presente invención, un polipéptido que comprende la capacidad de unión con el polipéptido y un anticuerpo. También puede realizarse la inmunoprecipitación usando anticuerpos contra el polipéptido de la presente invención, además de usar anticuerpos contra los epítopos anteriores, anticuerpos que pueden prepararse tal como se describió anteriormente.

Puede precipitarse un complejo inmunitario, por ejemplo mediante proteína A-sepharose o proteína G-sepharose cuando el anticuerpo es un anticuerpo de IgG de ratón. Si el polipéptido de la presente invención se prepara como una proteína de fusión con un epítopo, tal como GST, puede formarse un complejo inmunitario de la misma manera que en el uso del anticuerpo contra el polipéptido de la presente invención, usando una sustancia que se une específicamente a estos epítopos, tal como glutatión-Sepharose 4B.

La inmunoprecipitación puede realizarse siguiendo o según, por ejemplo, los métodos de la bibliografía (Harlow y Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, Nueva York (1988)).

Se usa comúnmente SDS-PAGE para el análisis de proteínas inmunoprecipitadas y la proteína unida puede analizarse mediante el peso molecular de la proteína usando geles con una concentración apropiada. Puesto que la proteína unida al polipéptido de la presente invención es difícil de detectar mediante un método de tinción común, tal como tinción de Coomassie o tinción de plata, la sensibilidad de la detección para la proteína puede mejorarse cultivando células en medio de cultivo que contiene isótopo radioactivo, ^{35}S-metionina o ^{35}S-cisteína, marcando proteínas en las células y detectando las proteínas. La proteína diana puede purificarse directamente a partir del gel de SDS-poliacrilamida y su secuencia puede determinarse cuando el peso molecular de la proteína se ha dado a conocer.

Como método para seleccionar proteínas que se unen al polipéptido de la presente invención usando el polipéptido, por ejemplo, puede usarse análisis de inmunotransferencia de tipo West-Western (Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991)). Específicamente, puede obtenerse una proteína que se une al polipéptido de la presente invención preparando una biblioteca de ADNc a partir de células, tejidos, órganos (por ejemplo, placenta, hígado, tiroides, traquea o médula ósea), o células cultivadas que se espera que expresen una proteína que se une al polipéptido de la presente invención usando un vector de fago (por ejemplo, ZAP), expresando la proteína en LB-agarosa, fijando la proteína expresada sobre un filtro, haciendo reaccionar el polipéptido purificado y marcado de la presente invención con el filtro anterior y detectando las placas que expresan proteínas unidas al polipéptido de la presente invención según el marcaje. El polipéptido de la invención puede marcarse utilizando la unión entre biotina y avidina, o utilizando un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la presente invención, o un péptido o polipéptido (por ejemplo, GST) que se fusiona al polipéptido de la presente invención. También pueden usarse métodos que usan radioisótopos o fluorescencia y similares.

Alternativamente, en otra realización del método de selección de la presente invención, puede usarse un sistema de dos híbridos que utiliza células ("sistema de dos híbridos MATCHMAKER", "kit de ensayo de dos híbridos MATCHMAKER de mamífero", "sistema de un híbrido MATCHMAKER" (Clontech); "sistema de vector de dos híbridos HybriZAP" (Stratagene); las referencias "Dalton y Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)", "Fields y Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)").

En el sistema de dos híbridos, el polipéptido de la invención se fusiona a la región de unión de SRF o a la región de unión de GAL4 y se expresa en células de levadura. Se prepara una biblioteca de ADNc a partir de células que se espera que expresen una proteína que se une al polipéptido de la invención, de modo que la biblioteca, cuando se expresa, se fusiona a la región de activación de la transcripción de VP16 o GAL4. Entonces se introduce la biblioteca de ADNc en las células de levadura anteriores y se aísla el ADNc derivado de la biblioteca de los clones positivos detectados (cuando una proteína que se une al polipéptido de la invención se expresa en células de levadura, la unión de las dos activa un gen indicador, haciendo detectables los clones positivos). Puede prepararse una proteína codificada por el ADNc introduciendo el ADNc aislado anteriormente en E. coli y expresando la proteína.

Como gen indicador, por ejemplo, pueden usarse el gen Ade2, el gen lacZ, el gen CAT, el gen de la luciferasa y similares además del gen HIS3.

También puede seleccionarse un compuesto que se une al polipéptido de la presente invención usando cromatografía de afinidad. Por ejemplo, el polipéptido de la invención puede inmovilizarse sobre un soporte de una columna de afinidad y se aplica a la columna un compuesto de prueba, que contiene una proteína que puede unirse al polipéptido de la invención. Un compuesto de prueba en el presente documento puede ser, por ejemplo, extractos celulares, lisados celulares, etc. Tras cargar el compuesto de prueba, se lava la columna y pueden prepararse compuestos unidos al polipéptido de la invención.

Cuando el compuesto de prueba es una proteína, se analiza la secuencia de aminoácidos de la proteína obtenida, se sintetiza un oligo ADN basándose en la secuencia y se examinan bibliotecas de ADNc usando el oligo ADN como sonda para obtener un ADN que codifica la proteína.

Puede usarse un biosensor que usa el fenómeno de resonancia de plasmón de superficie como medio para detectar o cuantificar el compuesto unido en la presente invención. Cuando se usa un biosensor de este tipo, puede observarse en tiempo real la interacción entre el polipéptido de la invención y un compuesto de prueba como una señal de resonancia de plasmón de superficie, usando solamente una cantidad mínima de polipéptido y sin marcar (por ejemplo, BIAcore, Pharmacia). Por tanto, es posible evaluar la unión entre el polipéptido de la invención y un compuesto de prueba usando un biosensor tal como BIAcore.

El experto en la técnica conoce bien los métodos de selección para moléculas que se unen cuando el polipéptido inmovilizado de la presente invención se expone a compuestos químicos sintéticos, o bancos de sustancias naturales, o una biblioteca aleatoria de exposición de péptidos en fagos y los métodos de selección que usan alto rendimiento basándose en técnicas de química combinatoria (Wrighton et al., Science 273: 458-64 (1996); Verdine, Nature 384: 11-13 (1996); Hogan, Nature 384: 17-9 (1996)) para aislar no sólo proteínas sino compuestos químicos que se unen a la proteína de la presente invención (incluyendo agonista y antagonista).

Alternativamente, el método de selección de la presente invención puede comprender las siguientes etapas:

a)

poner en contacto un compuesto candidato con una célula en la que se ha introducido un vector que comprende la región reguladora de la transcripción de uno o más genes marcadores y un gen indicador que se expresa bajo el control de la región reguladora de la transcripción, en el que el gen marcador es C1958V1,

b)

medir la actividad de dicho gen indicador; y

c)

seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de dicho gen indicador en comparación con un control.

Se conocen bien en la técnica genes indicadores y células huéspedes adecuados. La construcción del indicador necesario para la selección puede prepararse usando la región reguladora de la transcripción de un gen marcador. Cuando la región reguladora de la transcripción de un gen marcador la conoce un experto en la técnica, puede prepararse una construcción del indicador usando la información de secuencia anterior. Cuando la región reguladora de la transcripción de un gen marcador permanece sin identificar, puede aislarse un segmento de nucleótidos que contiene la región reguladora de la transcripción a partir de una biblioteca de genoma basándose en la información de la secuencia de nucleótidos del gen marcador.

Un compuesto aislado mediante la selección es un candidato para fármacos que inhiben la actividad del polipéptido de la presente invención, para tratar o prevenir cáncer pancreático. Un compuesto en el que una parte de la estructura del compuesto obtenido mediante el presente método de selección que tiene la actividad de unión al polipéptido de la presente invención se convierte mediante adición, deleción y/o sustitución, se incluye en los compuestos obtenidos mediante el método de selección de la presente invención.

En una realización adicional, la presente invención proporciona métodos para seleccionar agentes candidatos que son dianas potenciales en el tratamiento de cáncer pancreático. Tal como se trató en detalle anteriormente, controlando los niveles de expresión de C1958V1, se puede controlar la aparición y la evolución del cáncer pancreático. Por tanto, pueden identificarse agentes candidatos, que son posibles dianas en el tratamiento de enfermedad proliferativa celular, a través de selecciones que usan los niveles de expresión y actividades de C1958V1 como índices. En el contexto de la presente invención, tal selección puede comprender, por ejemplo, las siguientes etapas:

a)

poner en contacto un compuesto candidato con una célula que expresa el C1958V1; y

b)

seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de C1958V1 en comparación con el nivel de expresión detectado en ausencia del compuesto de prueba.

Las células que expresan al menos uno de C1958V1 incluyen, por ejemplo, líneas celulares establecidas a partir de cánceres pancreáticos; tales células pueden usarse para la selección anterior de la presente invención. El nivel de expresión puede estimarse mediante métodos bien conocidos por un experto en la técnica. En el método de selección, puede seleccionarse un compuesto que reduce el nivel de expresión de al menos uno de C1958V1 como agentes candidatos.

En otra realización del método para seleccionar un compuesto para tratar una enfermedad proliferativa celular de la presente invención, el método utiliza la actividad biológica del polipéptido de la presente invención como índice. Puesto que las proteínas C1958V1 de la presente invención tienen la actividad de promover la proliferación celular, puede seleccionarse un compuesto que promueve o inhibe esta actividad de una de estas proteínas de la presente invención usando esta actividad como índice. Este método de selección incluye las etapas de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con el polipéptido de la presente invención; (b) detectar la actividad biológica del polipéptido de la etapa (a); y (c) seleccionar un compuesto que suprime la actividad biológica del polipéptido en comparación con la actividad biológica detectada en ausencia del compuesto de prueba.

Puede usarse cualquier polipéptido para la selección siempre que comprenda la actividad biológica de la proteína C1958V1. Tal actividad biológica incluye la actividad de proliferación celular de la proteína C1958V1 humana. Por ejemplo, puede usarse una proteína C1958V1 humana y también pueden usarse polipéptidos funcionalmente equivalentes a estas proteínas. Tales polipéptidos pueden expresarse de manera endógena o exógena por las células.

Puede usarse cualquier compuesto de prueba, por ejemplo, extractos celulares, sobrenadante de cultivo celular, productos de microorganismos fermentadores, extractos de organismos marinos, extractos de plantas, proteínas brutas o purificadas, péptidos, compuestos no peptídicos, compuestos micromoleculares sintéticos, compuestos naturales.

El compuesto aislado mediante esta selección es un candidato para antagonistas del polipéptido de la presente invención. El término "antagonista" se refiere a moléculas que inhiben la función del polipéptido de la presente invención uniéndose al mismo. Además, un compuesto aislado mediante esta selección es un candidato para compuestos que inhiben la interacción in vivo del polipéptido de la presente invención con moléculas (incluyendo ADN y proteínas).

Cuando la actividad biológica que va a detectarse en el presente método es proliferación celular, puede detectarse, por ejemplo, preparando células que expresan el polipéptido de la presente invención, cultivando las células en presencia de un compuesto de prueba y determinando la velocidad de proliferación celular, midiendo el ciclo celular y similares, así como midiendo la actividad de formación de colonias.

El compuesto aislado mediante las selecciones anteriores es un candidato para fármacos que inhiben la actividad del polipéptido de la presente invención y puede aplicarse al tratamiento de enfermedades asociadas con el polipéptido de la presente invención, es decir cáncer pancreático. Más particularmente, cuando se usa la actividad biológica de la proteína C1958V1 como índice, los compuestos seleccionados mediante el presente método sirven como candidatos para fármacos para el tratamiento de cáncer pancreático.

Además, un compuesto en el que una parte de la estructura del compuesto que inhibe la actividad de la proteína C1958V1 se convierte mediante adición, deleción y/o sustitución también se incluye en los compuestos que pueden obtenerse mediante el método de selección de la presente invención.

Cuando se administra el compuesto aislado mediante los métodos de la invención como producto farmacéutico para seres humanos y otros mamíferos, tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, pollos, gatos, perros, ovejas, cerdos, ganado, monos, babuinos, chimpancés, para tratar una enfermedad proliferativa celular (por ejemplo, cáncer), el compuesto aislado puede administrarse directamente o puede formularse en una forma farmacéutica usando métodos de preparación farmacéuticos conocidos. Por ejemplo, según sea necesario, los fármacos pueden tomarse por vía oral, como comprimidos recubiertos con azúcar, cápsulas, elixires y microcápsulas, o por vía no oral, en forma de inyecciones de disoluciones o suspensiones estériles con agua o cualquier otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, los compuestos pueden mezclarse con medio o vehículos farmacéuticamente aceptables, específicamente, agua esterilizada, solución salina fisiológica, aceite vegetal, emulsionantes, agentes de suspensión, tensioactivos, estabilizadores, agentes aromatizantes, excipientes, vehículos, conservantes, aglutinantes y similares, en forma de dosis unitaria necesaria para la implementación de fármacos generalmente aceptada. La cantidad de principios activos en estas preparaciones hace que pueda obtenerse una dosificación adecuada dentro del intervalo indicado.

Ejemplos de aditivos que pueden mezclarse en los comprimidos y las cápsulas son aglutinantes tales como gelatina, almidón de maíz, goma tragacanto y goma arábiga; excipientes tales como celulosa microcristalina; agentes de hinchamiento tales como almidón de maíz, gelatina y ácido algínico; lubricantes tales como estearato de magnesio; edulcorantes tales como sacarosa, lactosa o sacarina; agentes aromatizantes tales como menta, aceite de Gaultheria adenothrix y cereza. Cuando la forma farmacéutica unitaria es una cápsula, también puede incluirse adicionalmente un vehículo líquido, tal como aceite, en los componentes anteriores. Pueden formularse materiales compuestos estériles para inyecciones siguiendo implementaciones de fármaco normales usando vehículos tales como agua destilada usada para inyecciones.

Pueden usarse solución salina fisiológica, glucosa y otros líquidos isotónicos que incluyen adyuvantes, tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio, como disoluciones acuosas para inyecciones. Éstas pueden usarse en conjunto con solubilizantes adecuados, tales como alcohol, específicamente etanol, polialcoholes tales como propilenglicol y polietilenglicol, tensioactivos no iónicos, tales como Polisorbato 80 (TM) y HCO-50.

Puede usarse aceite de sésamo o aceite de soja como líquido aceitoso y puede usarse en conjunto con benzoato de bencilo o alcohol bencilico como solubilizantes y pueden formularse con un tampón, tal como tampón de fosfato y tampón de acetato de sodio; un analgésico, tal como clorhidrato de procaína; un estabilizador, tal como alcohol bencilico, fenol; y un antioxidante. La inyección preparada puede cargarse en una ampolla adecuada.

Pueden usarse métodos bien conocidos por un experto en la técnica para administrar el compuesto farmacéutico inventivo a pacientes, por ejemplo como inyecciones intraarteriales, intravenosas, percutáneas y también como administraciones intranasales, transbronquiales, intramusculares u orales. La dosificación y el método de administración varían según el peso corporal y la edad de un paciente y el método de administración; sin embargo, un experto en la técnica puede seleccionarlos rutinariamente. Si dicho compuesto puede codificarse por un ADN, el ADN puede insertarse en un vector para terapia génica y administrarse el vector para realizar la terapia. La dosificación y el método de administración varían según el peso corporal, la edad y los síntomas de un paciente, pero un experto en la técnica puede seleccionarlos de manera adecuada.

Por ejemplo, aunque existan algunas diferencias según los síntomas, la dosis de un compuesto que se une con el polipéptido de la presente invención y regula su actividad es de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg por día, preferiblemente de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 50 mg por día y más preferiblemente de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 20 mg por día, cuando se administra por vía oral a un adulto normal (peso de 60 kg).

Cuando se administra por vía parenteral, en forma de inyección a un adulto normal (peso de 60 kg), aunque existan algunas diferencias según el paciente, el órgano diana, los síntomas y el método de administración, es conveniente inyectar por vía intravenosa una dosis de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 30 mg por día, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg por día y más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg por día. Además, en el caso de otros animales también, es posible administrar una cantidad convertida a 60 kg de peso corporal.

Además, la presente invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo contra el polipéptido de la presente invención para su uso en un método para tratar o prevenir cáncer pancreático. Según el método, se administra una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo contra el polipéptido de la presente invención. Puesto que la expresión de la proteína C1958V1 se regula por incremento en las células cancerosas y la supresión de la expresión de estas proteínas lleva a una disminución en la actividad de proliferación celular, se espera que puedan tratarse o prevenirse enfermedades proliferativas celulares mediante la unión del anticuerpo y estas proteínas. Por tanto, se administra un anticuerpo contra el polipéptido de la presente invención a una dosificación suficiente para reducir la actividad de la proteína de la presente invención, que está en el intervalo de 0,1 a aproximadamente 250 mg/kg por día. El intervalo de dosis para seres humanos adultos es generalmente de desde aproximadamente 5 mg hasta aproximadamente 17,5 g/día, preferiblemente de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 g/día y lo más preferiblemente de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 3 g/día.

Alternativamente, puede usarse un anticuerpo que se une a un marcador de superficie celular específico para células tumorales como herramienta para la administración del fármaco. Por ejemplo, el anticuerpo conjugado con un agente citotóxico se administra a una dosificación suficiente para dañar células tumorales.

También se describe en el presente documento una composición para su uso en un método de inducción de inmunidad antitumoral que comprende la etapa de administrar la proteína C1958V1 o un fragmento inmunológicamente activo de la misma, o un polinucleótido que codifica la proteína o fragmentos de la misma. La proteína C1958V1 o los fragmentos inmunológicamente activos de la misma son útiles como vacunas contra enfermedades proliferativas celulares. En algunos casos, las proteínas o fragmentos de las mismas pueden administrarse en una forma unida al receptor de células T (TCR) o presentarse por una célula presentadora de antígeno (APC), tal como un macrófago, una célula dendrítica (DC) o células B. Debido a la fuerte capacidad de presentación de antígenos de DC, el uso de DC es lo más preferible entre las APC.

\newpage

En la presente invención, vacuna contra una enfermedad proliferativa celular se refiere a una sustancia que tiene la función de inducir inmunidad antitumoral tras su inoculación en animales. Según la presente invención, se sugirió que polipéptidos codificados por SEQ ID NO: 1 eran péptidos de epítopos restringidos por HLA-A24 o HLA-A*0201 que pueden inducir una respuesta inmunitaria potente y específica contra células de cáncer pancreático que expresan C1958V1. En general, la inmunidad antitumoral incluye respuestas inmunitarias tales como las que siguen:

- inducción de linfocitos citotóxicos contra tumores,

- inducción de anticuerpos que reconocen tumores y

- inducción de la producción de citocina antitumoral.

Por tanto, cuando una cierta proteína induce una cualquiera de estas respuestas inmunitarias tras su inoculación en un animal, se determina que la proteína tiene un efecto de inducción de inmunidad antitumoral. La inducción de la inmunidad antitumoral por una proteína puede detectarse observando in vivo o in vitro la respuesta del sistema inmunitario en el huésped contra la proteína.

Por ejemplo, se conoce bien un método para detectar la inducción de linfocitos T citotóxicos. Una sustancia extraña que entra en el organismo vivo se presenta a las células T y células B por la acción de células presentadoras de antígeno (APC). Las células T que responden al antígeno presentado por APC de una manera específica para el antígeno se diferencian en células T citotóxicas (o linfocitos T citotóxicos; CTL) debido a la estimulación por el antígeno y entonces proliferan (esto se denomina activación de células T). Por tanto, la inducción de CTL por un cierto péptido puede evaluarse presentando el péptido a la célula T por la APC y detectando la inducción de CTL. Además, la APC tiene el efecto de activar células T CD4+, células T CD8+, macrófagos, eosinófilos y células NK. Puesto que las células T CD4+ y células T CD8+ también son importantes en la inmunidad antitumoral, puede evaluarse la acción de inducción de la inmunidad antitumoral del péptido usando el efecto de activación de estas células como indicadores.

Se conoce bien en la técnica un método para evaluar la acción de inducción de CTL usando células dendríticas (DC) como APC. La DC es una APC representativa que tiene la acción de inducción de CTL más fuerte entre las APC. En este método, el polipéptido de prueba se pone en contacto inicialmente con la DC y entonces esta DC se pone en contacto con células T. La detección de T células que tienen efectos citotóxicos contra las células de interés tras el contacto con DC muestra que el polipéptido de prueba tiene una actividad de inducción de las células T citotóxicas. Puede detectarse la actividad de CTL contra tumores, por ejemplo, usando la lisis de células tumorales marcadas con ^{51}Cr como indicador. Alternativamente, también se conoce bien el método de evaluación del grado de lesión de células tumorales usando la actividad de captación de ^{3}H-timidina o la liberación de LDH (lactosa deshidrogenasa) como indicador.

Además de DC, también pueden usarse células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como APC. Se notifica que la inducción de CTL puede potenciarse cultivando PBMC en presencia de GM-CSF e IL-4. De manera similar, se ha mostrado que se inducen CTL mediante el cultivo de PBMC en presencia de hemociania de lapa californiana (KLH - keyhole limpet hemocyanin) e IL-7.

Los polipéptidos de prueba que confirmaron tener actividad de inducción de CTL mediante estos métodos son polipéptidos que tienen efecto de activación de DC y actividad de inducción de CTL posterior. Por tanto, polipéptidos que inducen CTL contra células tumorales son útiles como vacunas contra tumores. Además, las APC que adquirieron la capacidad de inducir CTL contra tumores poniéndose en contacto con los polipéptidos son útiles como vacunas contra tumores. Además, las CTL que adquirieron citotoxicidad debido a la presentación de los antígenos de polipéptido mediante APC también pueden usarse como vacunas contra tumores. Tales métodos terapéuticos para tumores que usan inmunidad antitumoral debida a APC y CTL se denominan inmunoterapia celular.

Generalmente, cuando se usa un polipéptido para inmunoterapia celular, se sabe que la eficacia de la inducción de CTL aumenta combinando una pluralidad de polipéptidos que tienen estructuras diferentes y poniéndolos en contacto con DC. Por tanto, cuando se estimulan las DC con fragmentos de proteína, es ventajoso usar una mezcla de múltiples tipos de fragmentos.

Alternativamente, la inducción de inmunidad antitumoral por un polipéptido puede confirmarse observando la inducción de producción de anticuerpos contra tumores. Por ejemplo, cuando se inducen anticuerpos contra un polipéptido en un animal de laboratorio inmunizado con el polipéptido, y cuando se suprime el crecimiento de células tumorales por esos anticuerpos, puede determinarse que el polipéptido tiene la capacidad de inducir inmunidad antitumoral.

Se induce inmunidad antitumoral administrando la vacuna de esta invención y la inducción de inmunidad antitumoral permite el tratamiento y la prevención de enfermedades de proliferación celular, tales como cánceres pancreáticos. El tratamiento contra el cáncer o la prevención de la aparición de cáncer incluye cualquiera de las etapas, tales como inhibición del crecimiento de células cancerosas, involución de cáncer y supresión de la existencia de cáncer. La disminución en la mortalidad de individuos que tienen cáncer, la disminución de marcadores tumorales en la sangre, el alivio de síntomas detectables que acompañan al cáncer y similares también se incluyen en el tratamiento o la prevención del cáncer. Preferiblemente, tales efectos terapéuticos y preventivos son estadísticamente significativos. Por ejemplo, en observación, a un nivel de significación del 5% o inferior, en el que el efecto terapéutico o preventivo de una vacuna contra enfermedades proliferativas celulares se compara con un control sin administración de vacuna. Por ejemplo, puede usarse la prueba de la t de Student, la prueba U de Mann-Whitney o ANOVA para los análisis estadísticos.

La proteína mencionada anteriormente que tiene actividad inmunitaria o un vector que codifica la proteína puede combinarse con un adyuvante. Un adyuvante se refiere a un compuesto que potencia la respuesta inmunitaria contra la proteína cuando se administra junto (o sucesivamente) con la proteína que tiene actividad inmunológica. Los ejemplos de adyuvantes incluyen toxina del cólera, toxina de Salmonella, alumbre y similares, pero no se limitan a estos. Además, la vacuna de esta invención puede combinarse de manera apropiada con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales vehículos son agua esterilizada, solución salina fisiológica, tampón fosfato, líquido de cultivo y similares. Además, la vacuna puede contener según sea necesario estabilizadores, suspensiones, conservantes, tensioactivos y similares. La vacuna se administra de manera sistémica o local. La administración de la vacuna puede realizarse mediante administración única, o con refuerzo mediante múltiples administraciones.

Cuando se usan APC o CTL como la vacuna de esta invención, pueden tratarse o prevenirse los tumores, por ejemplo, mediante el método ex vivo. Más específicamente, se recogen PBMC del sujeto que recibe el tratamiento o la prevención, se ponen en contacto las células con el polipéptido ex vivo y tras la inducción de APC o CTL, las células pueden administrarse al sujeto. También pueden inducirse APC introduciendo un vector que codifica el polipéptido en las PBMC ex vivo. Las APC o los CTL inducidos in vitro pueden clonarse antes de la administración. Clonando y haciendo crecer células que tienen alta actividad de lesión de células diana, puede realizarse la inmunoterapia celular de manera más eficaz. Además, las APC y los CTL aislados de esta manera pueden usarse para inmunoterapia celular no solamente contra individuos de quienes se derivan las células, sino también contra tipos similares de tumores de otros individuos.

Además, se proporciona una composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad proliferativa celular, tal como cáncer, que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz del polipéptido de la presente invención. La composición farmacéutica puede usarse para provocar inmunidad antitumoral. La expresión normal de C1958V1 se observa principalmente en la placenta y se observa débilmente en el hígado, tiroides, traquea o médula ósea. Por tanto, la supresión del gen de C1958V1 puede no afectar negativamente a otros órganos. Por tanto, los polipéptidos C1958V1 son preferibles para tratar una enfermedad proliferativa celular, especialmente cáncer pancreático. En la presente invención, el polipéptido o fragmento del mismo se administra a una dosificación suficiente para inducir inmunidad antitumoral, que está en el intervalo de 0,1 mg a 10 mg, preferiblemente de 0,3 mg a 5 mg, más preferiblemente de 0,8 mg a 1,5 mg. Las administraciones se repiten. Por ejemplo, puede administrarse 1 mg del péptido o fragmento del mismo 4 veces cada dos semanas para inducir la inmunidad antitumoral.

Se presentan los siguientes ejemplos para ilustrar la presente invención y para ayudar a un experto habitual a preparar y usar la misma. Los ejemplos no pretenden de ningún modo limitar de otra manera el alcance de la
invención.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque puedan usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o las pruebas de la presente invención, se describen métodos y materiales adecuados a continuación.

\vskip1.000000\baselineskip

Mejor modo para llevar a cabo la invención

La presente invención se ilustra en detalles mediante los siguientes ejemplos, pero no se restringe a estos ejemplos.

\vskip1.000000\baselineskip

1. Materiales y métodos (1) Líneas celulares y materiales clínicos

Las líneas celulares de cáncer pancreático humano Capan-1, Capan-2, Panc-1, Aspc-1 y MlApaca-2, KLM-1 y PK59 las proporcionó gentilmente el Dr. Jae-Gahb Park (Banco de Líneas Celulares Coreano, Instituto de Investigación del Cáncer, Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl, Corea). Se cultivaron todas las células en medios apropiados; es decir RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO) para Capan-1, Capan-2 y Aspc-1; medio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, CA) para MlApaca-2, Panc-1, COS7. Se complementó cada medio con suero bovino fetal al 10% (Cansera) y disolución de antimicótico/antibiótico al 1% (Sigma). Se mantuvieron las células a 37ºC en una atmósfera de aire humidificado con CO_{2} al 5%. Se obtuvieron muestras clínicas (cáncer pancreático y conducto pancreático normal) de muestras quirúrgicas, acerca de lo cual todos los pacientes habían dado el consentimiento informado.

(2) Aislamiento de un gen humano novedoso representado por el punto número C1958 en el microalineamiento de ADNc

La fabricación de los portaobjetos con microalineamiento de ADNc se ha descrito en otro sitio (Ono et al., 2000). Para cada análisis de perfiles de expresión, se prepararon conjuntos por duplicado de portaobjetos que contenían 23.040 puntos de ADNc para reducir la fluctuación experimental. En resumen, se purificaron los ARN totales de cada muestra de células microdiseccionadas por láser y se llevó a cabo la amplificación de ARN basada en T7 para obtener cantidades adecuadas de ARN para los experimentos de microalineamiento. Se marcaron alícuotas de ARN amplificado de células de cáncer pancreático y de células de conducto pancreático normal mediante trascripción inversa con Cy5-dCTP y Cy3-dCTP, respectivamente (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, RU). Se llevaron a cabo la hibridación, el lavado y la detección tal como se describió anteriormente (Ono et al., 2000). Entre los genes que parecen regularse por incremento en células tumorales, los inventores se centraron en uno con el número de identificación propio
C1958 porque su razón de expresión era superior a 5,0 en más del 50% de los casos cáncer pancreático informados.

(3) Análisis de transferencia de tipo Northern

Se hibridaron las transferencias de tipo Northern de múltiples tejidos humanos (Clontech, Palo Alto, CA) con un producto de amplificación marcado con [\alpha^{32}P]-dCTP de C1958 preparado mediante RT-PCR (véase a continuación). Se realizaron la hibridación previa, la hibridación y el lavado según las recomendaciones del proveedor. Se autorradiografiaron las transferencias con pantallas intensificadoras a -80ºC durante 10 días. Se prepararon sondas específicas para el exón 4 de C1958 mediante PCR usando un conjunto de cebadores específicos tal como sigue; 5'-GTCC
TGAAAGTCAAGCACCTG-3' (SEQ ID NO: 5) y 5'-GAAGTTCTTGTTGGTGCTTATGG-3' (SEQ ID NO: 6).

(4) Análisis de RT-PCR semicuantitativa

Los ARN totales extraídos de muestras clínicas de células microdisecionadas por láser fueron en 350 \mul de tampón de lisis RLT (QIAGEN, Hilden, Alemania) y se trataron los ARN extraídos con DNasa I (Roche, Basilea, Suiza) en presencia de 1 unidad de inhibidor de RNasa (TOYOBO, Osaka, Japón) para eliminar cualquier ADN genómico contaminante. Tras el tratamiento con DNasa I, se purificaron los ARN con un kit RNeasy Mini (QIAGEN) según las recomendaciones del fabricante. Todos los ARN tratados con DNasa I se sometieron a amplificación de ARN basada en T7. Se extrajo el ARN total de las células cultivadas usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. Se trató cada ARN extraído con DNasa I (Roche).

Se transcribió el ARN amplificado o el ARN total de manera inversa para los ADNc monocatenarios usando cebador aleatorio (Roche) o cebador de oligo(dT)_{16} con transcriptasa inversa Superscript II (Roche). Se prepararon diluciones apropiadas de cada ADNc monocatenario para la posterior amplificación por PCR monitorizando la tubulina, alfa 3 (TUBA3) como control cuantitativo. Las secuencias de cebadores eran

5'-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3' (SEQ ID NO: 7) y

5'-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3' (SEQ ID NO: 8) para TUBA3;

5'-GTCCTGAAAGTCAAGCACCTG-3' (SEQ ID NO: 9) y

5'-GAAGTTCTTGTTGGTGCTTATGG-3' (SEQ ID NO: 10) para C1958.

Todas las reacciones implicaban desnaturalización a 94ºC durante 2 min. seguida por 22 ciclos (para TUBA3) ó 28 ciclos (para C1958) a 94ºC durante 30 s, 58ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min., en un sistema de PCR GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems).

(5) Construcción de vector de expresión

Se amplificó toda la secuencia codificante de ADNc de C1958V1 mediante RT-PCR con cebadores de C1958V1 directo (5'-CCGGAATTCGACATGGGGCTTAAGATGTCC-3' (SEQ ID NO: 11)) y de C1958V1 inverso (5'-CCGCT
CGAGGGCTTCTGGGTCGATTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 12)). Se insertó el producto en los sitios EcoRI y XhoI de pADNc3.1(+).myc.his (Invitrogen), que porta un promotor de citomegalovirus (CMV) y un gen que confiere resistencia a neomicina. Se confirmó el constructo (pADNc3.1(+)-C1958-myc-his) mediante secuenciación de ADN.

(6) Tinción inmunocitoquímica

Se transfectaron de manera transitoria células COS7 con pADNc3.1(+)-C1958V1-myc-his usando FuGENE 6 (Roche) según las instrucciones del fabricante, entonces se fijaron con PBS que contenía paraformaldehído al 4% durante 15 min., luego se permeabilizaron con PBS que contenía Triton X-100 al 0,1% durante 2,5 min. a 4ºC. Posteriormente, se cubrieron las células con BSA al 3% en PBS durante 12 h a 4ºC para bloquear la hibridación no específica y se incubaron con un anticuerpo de ratón anti-myc (Sigma) a una dilución 1:1000. Tras lavar con PBS, se tiñeron las células mediante un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con FITC (Organon Teknika). Se contratifleron los núcleos con diclorhidrato de 4',6'-diamidina-2'-fenilindol (DAPI). Se obtuvieron imágenes fluorescentes en un microscopio ECLIPSE E800 (Nikon, Tokio, Japón).

(7) Análisis de inmunotransferencia de tipo Western

Se transfectaron de manera transitoria células COS7 con pADNc3.1(+)-C1958-myc-his usando FuGENE 6 (Roche) según las instrucciones del fabricante, entonces se lavaron dos veces las células con PBS y se recogieron en tampón de lisis (NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, Tris-HCl 50 mM pH 7,4, DTT 1 mM y 1X de cóctel inhibidor de proteasas completo(Boehringer)). Tras homogenizar las células y centrifugar a 10.000xg durante 30 min., se normalizó el sobrenadante para la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford (BioRad). Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE al 12% y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo de ratón anti-myc (SANTA CRUZ).

(8) Construcción de psiU6X3.0

Puesto que se notificó que el gen U6 de ARNsn se transcribía mediante la ARN polimerasa III, que produce los transcritos cortos con uridinas en el extremo 3', se amplificó el fragmento genómico del gen U6 de ARNsn que contenía su región promotora mediante PCR usando un conjunto de cebadores, 5'-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3' (SEQ ID NO: 13) y 5'-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3' (SEQ ID NO: 14) y ADN placentario humano como molde. Se purificó el producto y se clonó en un vector de plásmido pCR usando un kit de clonación TA según el protocolo del proveedor (Invitrogen). Se purificó el fragmento de BamHI, XhoI que contenía el gen U6 de ARNsn y se clonó en el fragmento de nucleótido de 1257 a 56 del plásmido pADNc3.1(+), que se amplificó mediante PCR con un conjunto de cebadores, 5'-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3' (SEQ ID NO: 15) y 5'-CTCTATCTC
GAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3' (SEQ ID NO: 16). Se usó el ADN ligado para un molde de PCR con cebadores, 5'-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3' (SEQ ID NO: 17) y 5'-TTTAAGCTTGAAGA
CACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3' (SEQ ID NO: 18). Se digirió el producto con HindIII, que posteriormente se auto-ligó para producir el plásmido de vector psiU6BX3.0. Para el control, Se preparó psiU6BX-EGFP clonando oligonucleótidos bicatenarios de 5'-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3' (SEQ ID NO: 19) y 5'-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3' (SEQ ID NO: 20) en el sitio BbsI en el vector psiU6BX3.0.

(9) Efecto de silenciamiento génico de C1958V1

Se prepararon plásmidos que expresaban ARNip clonando oligonucleótidos bicatenarios en el vector psiU6BX3.0. Las secuencias diana para C1958 son 5'-CGACAAGCACCTGGACGTG-3' (SEQ ID NO: 25), 5'-ATGTGTGTCAG
CAGCAGCA-3' (SEQ ID NO: 26), 5'-TCCAGCCTGTCCACTTCCA-3' (SEQ ID NO: 27) y 5'-GTTGTTTTACA
GATACGGA-3' (SEQ ID NO: 28). Células pancreáticas humanas de las líneas, KLM-1 y PK59, se sembraron en placas de 10 cm (KLM-1; 2,5 X 10^{5} células/placa, PK59; 5 X 10^{5} células/placa) y se transfectaron con psiU6BX-EGFP, o psiU6BX-C1958V1 usando reactivo FuGENE6 según las recomendaciones del proveedor (Roche). Se extrajo el ARN total de las células 7 días tras la transfección y entonces se confirmó el efecto de reducción de la expresión (knockdown effect) de ARNip mediante RT-PCR semicuantitativa usando cebadores específicos para C1958V1 y para \beta-actina (ACTB) como control interno; 5'-GTCCTGAAAGTCAAGCACCTG-3' (SEQ ID NO: 21) y 5'-GAAGTTCTTGTTGGTGCTTATGG-3' (SEQ ID NO: 22) para C1958, 5'-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3' (SEQ ID NO: 23) y 5'-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3' (SEQ ID NO: 24) para ACTB. Además, se hicieron crecer transfectantes que expresan ARNip usando líneas celulares KLM-1 y PK59 se hicieron crecer durante 9 días en medios selectivos que contenían 0,6 mg/ml de neomicina. Tras la fijación con paraformaldehído al 4%, se tiñeron las células transfectadas con disolución de Giemsa para evaluar la formación de colonias. Se realizaron los ensayos MTT para cuantificar la viabilidad celular. Tras 7 días de cultivo en el medio que contenía neomicina, se añadió disolución de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (Sigma) a una concentración de 0,5 mg/ml. Tras la incubación a 37ºC durante 4 h, se añadió ácido-SDS (HCl 0,01 N/SDS al 10%); se mezcló vigorosamente la suspensión y entonces se incubó durante la noche a 37ºC para disolver los cristales de color azul oscuro. Se midió la absorbancia a 570 nm con un lector de microplaca 550 (BioRad).

2. Resultados (1) Identificación de C1958 como un gen regulado por incremento en células de cáncer pancreático

Cuando se analizaron los perfiles de expresión génica de células cancerosas de 18 pacientes con cáncer pancreático usando un microalineamiento de ADNc que representa 23.040 genes humanos (Nakamura et al., 2003), se identificaron 265 genes que se regulaban por incremento comúnmente en células de cáncer pancreático. Entre ellos, los presentes inventores se centraron en un gen con el código propio C1958, que correspondía a EST Hs. 40530 en la base de datos UniGene en el NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/). La expresión de este gen era elevada en 7 de 9 cánceres pancreáticos con intensidades de señal mayores que el valor de corte en el microalineamiento en comparación con conductos pancreáticos normales (figura 1(a)). Un análisis de RT-PCR semicuantitativo posterior confirmó la expresión elevada en 10 de 12 cánceres pancreáticos y 2 de 5 líneas celulares de cáncer pancreático en comparación con conductos pancreáticos normales (figura 1(b)).

Se aisló el gen C1958 mediante experimentos de examen usando una biblioteca de ADNc preparada a partir de una línea celular de cáncer pancreático, Capan-1. Existían tres variantes transcripcionales diferentes que consistían en 4, 4 y 2 exones, (figura 2, (a) C1958V1 (número de registro de GenBank: AB 115764), (b) C1958V2 (número de registro de GenBank: AB115765) y (c) C1958V3 (número de registro de GenBank: AB115766), respectivamente), ubicado en el cromosoma 16q abarcando aproximadamente 43 kb en el genoma. Existían variaciones entre el exón 1 y 3 y el exón 2 era común a C1958V1 y C1958V2 y el exón 4 también era común a todas las variantes. El exón 1b de la variante C1958V2 era 34 pb más largo que el exón la de C1958V1 en el extremo 5' y el exón 3b era 22 pb más corto que el exón 3a de C1958V1 en el extremo 5', generando un codón de terminación novedoso dentro del exón 3b. La secuencia ADNc de longitud total de las variantes C1958V1 (SEQ ID NO: 1), C1958V2 (SEQ ID NO: 3) contenían 881 y 893 nucleótidos, respectivamente. El ORF de C1958V1 y C1958V2 comienza dentro del exón 2, mientras que el sitio de iniciación de la traducción se ubicaba dentro del exón 3c de las variantes C1958V3, respectivamente.

El análisis de tipo Northern con una transferencia de múltiples tejidos usando un fragmento de ADNc de C1958 como sonda (véase Material y Método y la figura 2) dio a conocer dos transcritos de aproximadamente 1,8 kb y 1,2 kb (figura 3(al-3)). El transcrito de 1,8 kb se expresaba relativamente más en ganglios linfáticos y se expresaba débilmente en el estómago, la traquea y la médula ósea. Por otra parte, el transcrito de 1,2 kb se expresaba de manera abundante en la placenta y débilmente en el hígado, la tiroides, la traquea y la médula ósea. Además, el análisis de transferencia de tipo Northern con transferencia de línea celular de cáncer pancreático usando la misma sonda dio a conocer un transcrito de aproximadamente 1,2 kb (figura 3(b)).

Para investigar la localización subcelular de la proteína C1958V1 en células de mamífero, se transfectó de manera transitoria en células COS7 un plásmido que expresaba la proteína C1958V1 (pADNc3.l(+)-C1958V1-myc-his). Tal como se muestra en la figura 4 (a), la tinción inmunohistoquímica da a conocer este producto de C1958V1 localizado en el aparato citoplásmico en células COS7. Además, C1958V1 se tradujo en productos génicos de un tamaño mayor al pronosticado mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western, sugiriendo que podría generarse mediante modificación postraduccional (figura 4(b)).

(2) Efectos inhibidores del crecimiento de ARN de interferencia pequeño (ARNip) diseñado para reducir la expresión de C1958

Para evaluar el papel de promoción del crecimiento de C1958V1, se redujo la expresión de C1958 endógeno en células KLM-1 y PK59, que son líneas celulares de cáncer pancreático, por medio de la técnica de ARN de interferencia (RNAi) basada en vector de mamífero y se examinó el efecto sobre el crecimiento celular (véase Materiales y Métodos). Tal como se muestra en la figura 5(a), la introducción de psiU6BX-C1958V1 (Si 8-5 y Si 11-3) redujo claramente la expresión del transcrito de C1958V1 en líneas celulares KLM-1 mientras que no se observó efecto en células transfectadas con plásmidos control (vectores de expresión de ARNip psiU6BX-EGFP). Para confirmar la reducción de crecimiento específica de gen por psiU6BX-C1958V1, se realizaron ensayos de formación de colonia de las mismas dos líneas celulares; tal como se muestra en la figura 5(b) y 5(d), la introducción de psiU6BX-C1958V1 (Si 8-5) suprimió significativamente el crecimiento de células KLM-1 y PK59, siendo coherente con el resultado de la expresión reducida anterior, y psiU6BX-C1958V1 (Si 11-3) también suprimió moderadamente el crecimiento de ambas líneas celulares y psiU6BX-C1958V1 (Si 1-8) también suprimió el crecimiento de células PK59. Además, los ensayos MTT también indicaron la inhibición del crecimiento de células KLM1 y/o PL59 cuando se reprimió la expresión de C1958V1 usando psiU6BX-C1958V1 (Si 1-8, Si 8-5 y Si 11-3) (figura 5(c), 5(e)). Se verificó cada resultado mediante tres experimentos independientes.

Aplicabilidad industrial

La expresión de genes de C1958V1 humanos novedosos está notablemente elevada en cáncer pancreático en comparación con tejidos pancreáticos no cancerosos. Por consiguiente, este gen puede servir como marcador de diagnóstico de cáncer y las proteínas codificadas por el mismo pueden usarse en ensayos de diagnostico de cáncer pancreático.

Los presentes inventores también han mostrado que se suprime el crecimiento celular mediante oligonucleótidos antisentido o ARN de interferencia pequeño que corresponden al gen de C1958V1. Estos hallazgos sugieren que la proteína C1958V1 estimula la actividad oncogénica. Por tanto, la oncoproteína novedosa es una diana útil para el desarrollo de productos farmacéuticos anticancerígenos. Por ejemplo, agentes que bloquean la expresión de C1958V1 o que previenen su actividad pueden encontrar utilidad terapéutica como agentes anticancerígenos, particularmente agentes anticancerigenos para el tratamiento de cánceres pancreáticos. Los ejemplos de tales agentes incluyen oligonucleótidos antisentido, ARN de interferencia pequeño y anticuerpos que reconocen C1958V1.

Bibliografía

Brentnall TA, Bronner MP, Byrd DR, Haggitt RC y Kimmey MB. (1999). Ann. Intern. Med., 131, 247-255.

DiMagno EP, Reber HA y Tempero MA. (1999). Gastroenterology, 117, 1464-1484.

Greenlee RT, Hill-tHarmon MB, Murray T y Thun M. (2001). CA. Cancer J. Clin., 51, 15-36.

Fujita M, Furukawa Y, Tsunoda T, Takana T, Ogawa M y Nakamura Y. (2001). Cancer Res., 61, 7722-7726.

Hao D y Rowinsky EK. (2002). Cancer Invest., 20, 387-404.

\newpage

Hasegawa S, Furukawa Y, Li M, Satoh S, Kato T, Watanabe T, Katagiri T, Tsunoda T, Yamaoka Y y Nakamura Y. (2002). Cancer Res., 62, 7012-7017.

Ishiguro H, Tsunoda T, Tanaka T, Fujii Y, Nakamura Y y Furukawa Y (2001). Oncogene, 20, 5062-5066.

Ishiguro H, Shimokawa T, Tsunoda T, Tanaka, Fujii Y, Nakamura Y y Furukawa Y. (2001). Oncogene, 21, 6387-6394.

Kaneta Y, Kagami Y, Katagiri T, Tsunoda T, Jin-nai I, Taguchi H, Hirai H, Ohnishi K, Ueda T, Emi N, Tomida A, Tsuruo T, Nakamura Y y Ohno R. (2002). Jpn. J. Cancer Res., 93, 849-856.

Kaneta Y, Kagami Y, Tsunoda T, Ohno R. Nakamura Y y Katagiri T. (2003). Int. J. Oncol., en prensa.

Kikuchi T, Daigo Y, Katagiri T, Tsunoda T, Okada K, Kakiuchi S, Zembutsu H, Furukawa Y, Kawamura M, Kobayashi K, Imai K y Nakamura Y. (2003) Oncogene, 22, 2192-2205.

Kitahara O, Katagiri T, Tsunoda T, Harima Y y Nakamura Y (2002). Neoplasia, 4, 295-303.

Klinkenbijl JH, Jeekel J, Sahmoud T, van Pel R, Couvreur ML, Veenhof CH, Arnaud JP, Gonzalez DG, de Wit LT, Hennipman A y Wils J. (1999). Ann. Surg., 230, 776-782; discusión 782-784.

Laheru D, Biedrzycki B y Jaffee EM. (2001). Cancer J., 7, 324-337.

Lin YM, Ono K, Satoh S, Ishiguro H, Fujita M, Miwa N, Tanaka T, Tsunoda T, Yang KC, Nakamura Y y Furukawa Y. (2001). Cancer Res. 61, 6345-6349.

Lin YM, Furukawa Y, Tsunoda T, Yue CT, Yang KC y Nakamura Y. (2002). Oncogene, 21, 4120-4128.

Nagayama S, Katagiri T, Tsunoda T, Hosaka T, Nakashima Y, Araki N, Kusuzaki K, Nakayama T, Tsuboyama T, Nakamura T, Imamura M, Nakamura Y y Toguchida J. (2002). Cancer Res., 62, 5859-5866.

Nakamura T, Furukawa Y, Nakagawa H, Tsunoda T, Ohigashi H, Murata K, Ishikawa O, Ohgaki K, Kashimura N, Miyamoto M, Hirano S, Kondo S, Katoh H, Nakamura Y y Katagiri T. (2003) Oncogene, en prensa.

Okabe H, Satoh S, Kato T, Kitahara O, Yanagawa R, Yamaoka Y, Tsunoda T, Furukawa Y y Nakamura Y (2001). Cancer Res., 61, 2129-2137.

Okutsu J, Tsunoda T, Kaneta Y, Katagiri T, Kitahara O, Zembutsu H, Yanagawa R, Miyawaki S, Kuriyama K, Kubota N, Kimura Y, Kubo K, Yagasaki F, Higa T, Taguchi H, Tobita T, Akiyama H, Takeshita A, Wang YH, Motoji T, Ohno R y Nakamura Y (2002). Mol. Cancer Ther., 1, 1035-1042.

Ono K, Tanaka T, Tsunoda T, Kitahara O, Kihara C, Okamoto A, Ochiai K, Takagiri T y Nakamura Y. (2000). Cancer Res., 60, 5007-11.

Takahashi M, Fujita M, Furukawa Y, Hamamoto R, Shimokawa T, Miwa N, Ogawa M y Nakamura Y. (2002). Cancer Res., 62, 5651-5656.

Rosenberg L. (2000). Drugs, 59, 1071-1089.

Yagyu R., Hamamoto R, Furukawa Y, Okabe H, Yamamura T y Nakamura Y. (2002). Int. J. Oncol., 20, 1173-1178.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. JAPÓN REPRESENTADO POR EL PRESIDENTE DE LA UNIVERSIDAD DE TOKYO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> GENES Y POLIPÉPTIDOS RELATIVOS A CÁNCERES PANCREÁTICOS HUMANOS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 0NCA0217Y1P2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/414.872

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 30-09-2002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/450.889

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 28-02-2003

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 881

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (163)..(390)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 893

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (197)..(256)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificial para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctgaaag tcaagcacct g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificial para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagttcttg ttggtgctta tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificial para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttgggtctg taacaaagca ttc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificial para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggattatg aggaggttgg tgt

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificial para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctgaaag tcaagcacct g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificial para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagttcttg ttggtgctta tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificial para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaatttcg acatggggct taagatgtcc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificial para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgctcgagg gcttctgggt cgatttctcc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggatcagc gtttgagtaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taggccccac ctccttctat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcggatcca gagcagattg tactgagagt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttaagcttg aagactattt ttacatcagg tttgtttttct

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttaagcttg aagacacggt gtttcgtcct ttccaca

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia diana sintetizada artificialmente para ARNip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia diana sintetizada artificialmente para ARNip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctgaaag tcaagcacct g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagttcttg ttggtgctta tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catccacgaa actaccttca act

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctccttaga gagaagtggg gtg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia diana para ARNip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgacaagcac ctggacgtg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia diana para ARNip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtgtgtca gcagcagca

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia diana para ARNip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccagcctgt ccacttcca

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia diana para ARNip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgttttac agatacgga

\hfill

19

Claims (14)

1. Polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y

(b)

un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la que se sustituyen, delecionan, insertan y/o añaden 6 aminoácidos o menos, teniendo dicho polipéptido actividad de proliferación celular.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Método para producir el polipéptido según la reivindicación 1, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

cultivar una célula huésped que alberga un polinucleótido que codifica el polipéptido según la reivindicación 1 o un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido según la reivindicación 1;

(b)

permitir que la célula huésped exprese el polipéptido; y

(c)

recoger el polipéptido expresado.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido según la reivindicación 1.

4. ARN de interferencia pequeño, en el que la hebra sentido del mismo se selecciona del grupo que consiste en nucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25, 26 y 28.

5. Método in vitro para diagnosticar cáncer pancreático, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

detectar el nivel de expresión del ARNm que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en una muestra de conducto pancreático; y

(b)

relacionar una elevación del nivel de expresión con la enfermedad.

\vskip1.000000\baselineskip

6. Método in vitro de selección de un compuesto para tratar cáncer pancreático, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.2;

(b)

detectar la actividad de unión entre el polipéptido y el compuesto de prueba; y

(c)

seleccionar un compuesto que se une al polipéptido.

\vskip1.000000\baselineskip

7. Método in vitro de selección de un compuesto para tratar cáncer pancreático, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

poner en contacto un compuesto candidato con una célula que expresa un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1; y

(b)

seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de dicho polinucleótido en comparación con el nivel de expresión detectado en ausencia del compuesto de prueba.

\vskip1.000000\baselineskip

8. Método según la reivindicación 7, en el que la célula es una célula de cáncer pancreático.

9. Método in vitro de selección de un compuesto para tratar cáncer pancreático, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

poner en contacto un compuesto de prueba con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(b)

detectar la actividad biológica del polipéptido de la etapa (a) ; y

\newpage

(c)

seleccionar un compuesto que suprime la actividad biológica del polipéptido en comparación con la actividad biológica detectada en ausencia del compuesto de prueba, en el que la actividad biológica es una actividad para promover la proliferación celular.

\vskip1.000000\baselineskip

10. Método in vitro de selección de un compuesto para tratar cáncer pancreático, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

poner en contacto un compuesto candidato con una célula en la que se ha introducido un vector que comprende la región reguladora de la transcripción de un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y un gen indicador que se expresa bajo el control de la región reguladora de la transcripción,

(b)

medir la actividad de dicho gen indicador; y

(c)

seleccionar un compuesto que reduce el nivel de expresión de dicho gen indicador en comparación con un control.

\vskip1.000000\baselineskip

11. Composición farmacéutica que comprende un ARN de interferencia pequeño, en la que la hebra sentido del mismo se selecciona del grupo que consiste en nucleótidos que comprenden las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 25, 26 y 28 como principio activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que el polinucleótido se incorpora en un vector de expresión.

13. Uso de un polinucleótido antisentido o ARN de interferencia pequeño contra un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar cáncer pancreático.

14. Uso según la reivindicación 13, en el que la hebra sentido del ARN de interferencia pequeño se selecciona del grupo que consiste en nucleótidos que comprenden las secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25, 26 y 28.