ES2315526T3 - Metodo para preparar derivados polimericos solubles en agua que llevan un acido carboxilico terminal. - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar un orto éster de un polímero soluble en agua que comprende la etapa de hacer reaccionar un segmento de polímero soluble en agua que tiene al menos un ión alcóxido o un ión tiolato con un orto éster compuesto por un grupo saliente adecuado.
Description
\global\parskip0.890000\baselineskip
Método para preparar derivados poliméricos
solubles en agua que llevan un ácido carboxílico terminal.
La presente invención se refiere generalmente a
métodos novedosos para preparar derivados poliméricos que
comprenden un ácido carboxílico terminal o un éster del mismo.
Además, la invención se refiere a polímeros, conjugados de los
polímeros, métodos de conjugación e intermedios así como a métodos
para preparar los intermedios. Además, la invención se refiere a
preparaciones farmacéuticas, métodos sintéticos y similares.
La conjugación de un polímero soluble en agua
tal como poli(etilenglicol) (o "PEG") con un agente
biológicamente activo da como resultado un conjugado de
polímero-agente activo que tiene a menudo
propiedades ventajosas con respecto a la versión "no
conjugada" correspondiente del agente activo. Entre otras
ventajas, las formas conjugadas de agentes activos tienen vidas
medias aumentadas y son menos inmunogénicas. Cuando se usa PEG para
formar un conjugado de polímero-agente activo, el
agente activo conjugado se denomina convencionalmente
"PEGilado". Las preparaciones PEGiladas disponibles en el
mercado incluyen interferón alfa-2a PEGilado
PEGASYS® (Hoffmann-LaRoche, Nutley, NJ), interferón
alfa-2b PEGilado PEG-INTRON®
(Schering Corp., Kennilworth, NJ), filgrastima-PEG
de NEULASTA^{TM} (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) y pegvisomant
SOMAVERT® (Pfizer, Nueva York, NY). El éxito comercial de estas
preparaciones atestigua el valor de la tecnología de PEGilación.
Los polímeros que llevan un ácido carboxílico
terminal son útiles, directamente o indirectamente, en reacciones
de conjugación con agentes activos y otras sustancias. Por ejemplo,
los ácidos carboxílicos se pueden hacer reaccionar directamente con
un grupo amino o hidroxilo de un agente activo, formando de este
modo un conjugado. Indirectamente, los polímeros que llevan un
ácido carboxílico terminal (que actúa como un grupo electrófilo
reactivo) pueden servir como un material de partida conveniente para
preparar otros derivados poliméricos que llevan grupos funcionales
diferentes de los ácidos carboxílicos. Los polímeros que llevan un
grupo funcional diferente de un ácido carboxílico, después, pueden
formar conjugados con agentes activos que llevan un grupo reactivo
adecuado.
Se han descrito métodos para preparar
determinados polímeros solubles en agua que llevan un ácido
carboxílico terminal. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
5.681.567 describe la reacción de un poli(óxido de alquileno) con
un haloacetato de alquilo terciario para formar de este modo un
éster de alquilo terciario de un ácido carboxílico de poli(óxido de
alquileno). Esquemáticamente, la reacción que usa un cloroacetato
de alquilo terciario se puede representar del siguiente modo:
donde cada R es alquilo. La
reacción posterior del éster con un ácido retira el resto alquilo
terciario, que produce el ácido acético correspondiente. Sin
embargo, este método da como resultado solamente polímeros que
llevan un resto ácido acético terminal. Los derivados poliméricos
sintetizados para terminar en un resto ácido acético se denominan
en ocasiones polímeros
"carboximetilados".
Los derivados poliméricos que llevan un ácido
acético terminal se pueden hacer reaccionar adicionalmente para
formar derivados poliméricos que llevan otros restos reactivos. Por
ejemplo, se puede formar un de succinimidil éster de carboximetil
PEG. Este succinimidil éster, sin embargo, es tan reactivo que se
hidroliza prácticamente inmediatamente en solución acuosa. Por
tanto, la utilidad práctica de los derivados de PEG que llevan un
resto ácido acético terminal puede ser baja dada la naturaleza
demasiado reactiva de estos derivados.
Otro método para preparar determinados polímeros
solubles en agua que llevan un derivado de ácido carboxílico
terminal se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.523.479.
En esta estrategia, un resto que tiene un peso molecular de 32 a
600 y que tiene de uno a 6 grupos hidroxilo se hace reaccionar con
un éster de alquilo terciario de un ácido carboxílico
beta-insaturado para obtener un producto que tiene
un éster terminal. Esquemáticamente, la reacción se puede
representar del siguiente modo (el resto se presenta teniendo un
único grupo hidroxilo y el éster de alquilo terciario de un ácido
carboxílico beta-insaturado se representa por éster
de alquilo terciario de ácido acrílico)
donde R es alquilo. Una etapa
hidrolítica posterior transforma el éster en el ácido propanoico
correspondiente.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Aunque proporciona derivados poliméricos que
carecen de un resto ácido acético reactivo, este método presenta
otras desventajas. En primer lugar, el método proporciona de forma
inherente solamente derivados de ácido propanoico. Además, la
conversión mejor descrita del grupo hidroxilo al éster es inferior
al 85%. Finalmente, solamente restos que tienen un peso molecular
entre 32 y 6000 se describen en relación a la realización del
método. Sin embargo, sigue habiendo una necesidad de proporcionar un
método que pueda preparar ácidos diferentes de los derivados de
ácido propanoico, dando como resultado la conversión a un éster y/o
ácido superior al 85% y que se pueda usar con restos que tienen un
peso molecular fuera del intervalo de 32 a 6000.
La patente de Estados Unidos Nº 5.672.662
describe derivados de PEG que tienen un resto ácido propanoico o
ácido butanoico terminal que se puede usar para preparar ésteres
activos adecuados para conjugación con proteínas u otras moléculas
que llevan grupos amino. Los ésteres activos descritos en la Patente
de Estados Unidos Nº 5.672.662 muestran mayor estabilidad en
solución que los ésteres activos de PEG carboximetilado y, por
tanto, son más adecuados para la conjugación con moléculas
biológicamente activas. El método descrito para preparar estos
derivados de PEG que tiene un resto propanoico o butanoico terminal,
sin embargo, implica numerosas etapas y solamente da como resultado
aproximadamente el 80% de sustitución en el resto ácido carboxílico.
Como una consecuencia, el método descrito en la patente de Estados
Unidos Nº 5.672.662 requiere etapas de purificación caras y que
requieren tiempo para proporcionar un producto de calidad
farmacéutica.
Por tanto, sigue habiendo una necesidad en la
técnica de métodos mejorados para preparar derivados poliméricos
que llevan un ácido carboxílico terminal. Además, continúa habiendo
una necesidad de proporcionar polímeros novedosos que lleven un
resto ácido carboxílico que sean útiles para reacciones de
conjugación y funcionalización adicional. La presente invención
aborda estas y otras necesidades en la técnica proporcionando, entre
otras cosas, métodos novedosos para la preparación eficaz de
derivados poliméricos que llevan un ácido carboxílico
terminal.
terminal.
El asunto de la presente invención son métodos
de acuerdo con las reivindicaciones 1-25 y productos
de acuerdo con las reivindicaciones 26-36.
En consecuencia, es un objeto principal de esta
invención proporcionar un método para preparar un ácido carboxílico
de un polímero soluble en agua que comprende las etapas de (a) hacer
reaccionar un segmento de polímero soluble en agua que tiene al
menos un ión alcóxido o ión tiolato con un orto éster que comprende
un grupo saliente adecuado para formar un orto éster de un polímero
soluble en agua; y (b) someter el orto éster de un polímero soluble
en agua formado en la etapa (a) a una o más etapas de hidrólisis
para proporcionar el ácido carboxílico correspondiente de un
polímero soluble en agua.
Es otro objeto de la invención proporcionar un
orto éster útil en el método para preparar el ácido carboxílico del
polímero soluble en agua. Por tanto, este objeto de la invención
comprende realizar la etapa (a) indicada en el párrafo
inmediatamente precedente.
Es otro objeto más de la invención proporcionar
un ácido carboxílico de un polímero soluble en agua preparado
mediante un método descrito en este documento.
Es otro objeto más de la invención proporcionar
geles, conjugados y composiciones farmacéuticas que comprenden un
polímero descrito en este documento.
Es otro objeto de la invención proporcionar
métodos para preparar cada uno de los geles, conjugados y
composiciones farmacéuticas descritos en este documento.
Se indicarán objetos, ventajas y características
novedosas adicionales de la invención en la siguiente descripción
y, en parte, serán evidentes para los especialistas en la técnica
después de lo siguiente, o se pueden aprender mediante la práctica
de la invención.
Entonces, en una realización de la invención se
proporciona un orto éster de un polímero soluble en agua. Entre
otros usos, el orto éster tiene utilidad como un intermedio en la
síntesis de un polímero soluble en agua que lleva un grupo de ácido
carboxílico terminal. El orto éster del polímero soluble en agua
comprende preferiblemente la siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en la
que:
- \quad
- POLI es un segmento de polímero soluble en agua;
- \quad
- (a) es cero o uno;
- \quad
- X, cuando está presente, es un resto espaciador;
- \quad
- (z) es un número entero de 1 a 24;
- \quad
- R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido;
- \quad
- R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- representa un residuo de un resto orto éster.
En otra realización, la presente invención
proporciona un método para preparar un orto éster de un polímero
soluble en agua. El método comprende la etapa de hacer reaccionar,
en presencia de una base, un segmento de polímero soluble en agua
que tiene al menos un grupo hidroxilo o tiol con un orto éster que
comprende un grupo saliente adecuado. Se prefiere que el segmento
de polímero soluble en agua tenga al menos un grupo hidroxilo y que
carezca de cualquier grupo tiol.
Típicamente, aunque no necesariamente, el orto
éster que comprende un grupo saliente adecuado comprende la
siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- es el grupo saliente adecuado;
- \quad
- (z) es un número entero de 1 a 24;
- \quad
- R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido;
- \quad
- R^{2} en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- representa un residuo de un resto orto éster.
En una realización adicional de la invención se
proporciona un método para preparar un ácido carboxílico de un
polímero soluble en agua. El método comprende la etapa de someter un
orto éster de un polímero soluble en agua a una o más etapas de
hidrólisis para proporcionar el ácido carboxílico correspondiente de
un polímero soluble en agua. Aunque se puede realizar una única
etapa de hidrólisis, se prefiere que se realicen dos etapas de
hidrólisis secuenciales. Las etapas de hidrólisis doble ilustrativas
incluyen una etapa de hidrólisis con base inicial seguida de una
segunda etapa de hidrólisis con base y una etapa de hidrólisis con
ácido inicial seguida de una etapa de hidrólisis con
base.
base.
Para cualquier estructura que comprende un
segmento de polímero soluble en agua se puede usar cualquier
polímero que sea soluble en agua y la invención no está limitada a
este respecto. Sin embargo, los segmentos de polímero soluble en
agua preferidos están acabados terminalmente en un extremo. Además
se prefieren segmentos de polímero soluble en agua que tengan una
masa molecular promedio en masa inferior a aproximadamente 100.000
Dalton.
La Figura 1 es una representación esquemática de
una estrategia para preparar un polímero soluble en agua que lleva
un ácido carboxílico terminal de acuerdo con la invención.
Antes de describir detalladamente la presente
invención, se tiene que entender que esta invención no está
limitada a los polímeros particulares, técnicas sintéticas, agentes
activos y similares ya que tales pueden variar. También se tiene
que entender que la terminología usada en este documento es
solamente para describir realizaciones particulares y no tiene por
objeto ser limitante.
Se tiene que señalar que, como se usa en esta
memoria descriptiva y las reivindicaciones, las formas singulares
"un", "una" y "el", "la" incluyen referencias
plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otro
modo. Por ejemplo, por tanto, la referencia a un "polímero"
incluye un único polímero así como dos o más del mismo o diferente
polímero, la referencia a un "conjugado" se refiere a un único
conjugado así como a dos o más del mismo o diferentes conjugados,
la referencia a un "excipiente" incluye un único excipiente así
como dos o más del mismo o diferentes excipientes y similares.
Al describir y reivindicar la presente invención
se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones
descritas más adelante.
"PEG", "polietilenglicol" y
"poli(etilenglicol)" como se usan en este documento, se
refiere a que incluyen cualquier poli(óxido de etileno) soluble en
agua. Típicamente, los PEG para usar de acuerdo con la invención
comprenden la siguiente estructura
"-O(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-" donde (m) es de 2
a 4000. Como se usa en este documento, PEG también incluye
-dependiendo de si se ha desplazado o no el o los oxígenos
terminales- las siguientes estructuras similares
"-CH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-CH_{2}CH_{2}-"
y "-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-" donde (m) es de 2 a
4000. Cuando el PEG comprende adicionalmente un resto enlazador (que
se describirá a continuación con más detalle), los átomos que
comprenden el enlazador, cuando se unen covalentemente a un segmento
de polímero soluble en agua, no dan como resultado la formación de
un enlace oxígeno-oxígeno (es decir, un enlace
"-O-O-" o peróxido). A lo largo de la memoria
descriptiva y las reivindicaciones, se debe recordar que el término
"PEG" incluye estructuras que tienen diversos grupos terminales
o de "acabado" etcétera. El término "PEG" también se
refiere a un polímero que contiene una mayoría, es decir, más del
50%, de subunidades monoméricas -CH_{2}CH_{2}O-. Con respecto a
formas específicas, el PEG puede adoptar cualquier número de una
diversidad de pesos moleculares, así como estructuras o geometrías
tales como "ramificada", "lineal", "ahorquillada",
"multifuncional" y similares, que se describirán con más
detalle más
adelante.
adelante.
Las expresiones "acabado" o "acabado
terminalmente" se usan de forma intercambiable en este documento
para referirse a un extremo o punto final de un polímero que
termina con un resto de acabado. Típicamente, aunque no
necesariamente, el resto de acabado comprende un grupo hidroxi o
alcoxi C_{1-20}. Por tanto, los ejemplos de
restos de acabado incluyen alcoxi (por ejemplo, metoxi, etoxi y
benciloxi) así como arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo y
similares. Además, se consideran formas saturadas, insaturadas,
sustituidas y no sustituidas de cada uno de los anteriores. Además,
el grupo de acabado también puede ser un silano. El grupo de acabado
puede comprender también ventajosamente un marcador detectable.
Cuando el polímero tiene un grupo de acabado que comprende un
marcador detectable, la cantidad o localización del polímero y/o del
resto (por ejemplo, agente activo) al que se acopla el polímero de
interés se puede determinar usando un detector adecuado. Tales
marcadores incluyen, pero sin limitación, fluorescentes,
quimioluminiscentes, restos usados en marcado con enzimas,
colorimétricos (por ejemplo, colorantes), iones metálicos, restos
radioactivos y similares. Los detectores adecuados incluyen
fotómetros, películas, espectrómetros y
similares.
similares.
"De origen no natural" con respecto a un
polímero o segmento de polímero soluble en agua se refiere a un
polímero que no se encuentra en su totalidad en la naturaleza. Un
polímero no de origen natural o un segmento de polímero soluble en
agua, sin embargo, puede contener una o más subunidades o partes de
una subunidad que sean de origen natural, mientras que la
estructura polimérica global no se encuentre en la naturaleza.
La expresión "soluble en agua" como en un
"segmento de polímero soluble en agua" y "polímero soluble en
agua" es cualquier segmento o polímero que es soluble en agua a
temperatura ambiente. Típicamente, un polímero o segmento soluble
en agua transmitirá al menos aproximadamente el 75%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de luz transmitida
por la misma solución después del filtrado. En una base de peso, un
polímero soluble en agua o un segmento del mismo será
preferiblemente al menos aproximadamente el 35% (en peso) soluble en
agua, más preferiblemente al menos aproximadamente el 50% (en peso)
soluble en agua, aún más preferiblemente aproximadamente el 70% (en
peso) soluble en agua y aún más preferiblemente aproximadamente el
85% (en peso) soluble en agua. Sin embargo, se prefiere más que el
polímero soluble en agua o segmento sea aproximadamente el 95% (en
peso) soluble en agua o completamente soluble en agua.
"Masa molecular" en el contexto de un
polímero soluble en agua, no de origen natural de la invención tal
como PEG, se refiere a la masa molecular promedio nominal de un
polímero, determinada típicamente por cromatografía de exclusión de
tamaño, técnicas de dispersión de luz o determinación de velocidad
intrínseca en 1,2,4-triclorobenceno. Los polímeros
de la invención son típicamente polidispersos, poseyendo valores de
polidispersidad bajos de preferiblemente menos de aproximadamente
1,2, más preferiblemente menos de aproximadamente 1,15, aún más
preferiblemente menos de aproximadamente 1,10, incluso más
preferiblemente menos de aproximadamente 1,05 y mucho más
preferiblemente menos de aproximadamente 1,03.
"Derivado de tiol", en el contexto de un
polímero soluble en agua, se refiere a un polímero que tiene al
menos un extremo que es un grupo tiol (-SH), un tiolato (-S^{-})
o un tiol protegido, es decir, un grupo tiol en su forma protegida.
Los grupos de protección de tiol típicos incluyen tioéter, tioéster
o disulfuro. Se pueden encontrar grupos de protección ilustrativos
de tioles en Greene et al., "PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC
SYNTHESIS", 3ª Edición, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York,
1999.
Como se usa en este documento, la expresión
"ácido carboxílico" como en un derivado de "ácido
carboxílico" es un resto que tiene un grupo funcional
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
[también representado como un
"-COOH" o -C(O)OH]. A menos que el contexto lo
indique claramente de otro modo, la expresión ácido carboxílico no
solamente incluye la forma ácida, sino también ésteres
correspondientes y formas protegidas. Se vuelve hacer referencia a
Greene et al. anteriormente citado con respecto a grupos de
protección adecuados para ácidos
carboxílicos.
El término "reactivo" o "activado"
cuando se usa junto con un grupo funcional particular, se refiere a
un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un
electrófilo o nucleófilo en otra molécula. Esto es en contraste con
los grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de
reacción muy poco prácticas para reaccionar (es decir, un grupo
"no reactivo" o "inerte").
Las expresiones "protegido" o "grupo de
protección" o "grupo protector" se refieren a la presencia
de un resto (es decir, el grupo de protección) que evita o bloquea
la reacción de un grupo funcional químicamente reactivo particular
en una molécula en determinadas condiciones de reacción. El grupo de
protección variará dependiendo del tipo de grupo químicamente
reactivo que se protege así como las condiciones de reacción que se
tienen que emplear y la presencia de grupos reactivos o de
protección adicionales en la molécula, si las hay. Se pueden
encontrar grupos de protección conocidos en la técnica en Greene
et al., citado anteriormente.
\newpage
Como se usa en este documento, la expresión
"grupo funcional" o cualquier sinónimo de la misma se refiere
a que incluye formas protegidas de la misma.
La expresión "espaciador" o "resto
espaciador" se usa en este documento para referirse a un átomo o
a un conjunto de átomos usados opcionalmente para unir restos de
interconexión tales como un extremo de un segmento de polímero
soluble en agua y un electrófilo. Los restos espaciadores de la
invención pueden ser hidrolíticamente estables o pueden incluir un
enlace fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente
degradable.
"Alquilo" se refiere a una cadena de
hidrocarburo, que varía típicamente de aproximadamente 1 a 20 átomos
de longitud. Tales cadenas de hidrocarburos están preferiblemente,
pero no necesariamente, saturadas y pueden ser de cadena ramificada
o lineal, aunque típicamente se prefiere una cadena lineal. Los
grupos alquilo ilustrativos incluyen etilo, propilo, butilo,
pentilo, 1-metilbutilo,
1-etilpropilo, 3-metilpentilo y
similares. Como se usa en este documento, "alquilo" incluye
cicloalquilo cuando se hace referencia a tres o más átomos de
carbono.
"Alquilo inferior" se refiere a un grupo
alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono y puede ser de
cadena lineal o ramificada, como se ilustra por metilo, etilo,
n-butilo, iso-butilo y
terc-butilo.
"Cicloalquilo" se refiere a una cadena de
hidrocarburo cíclica saturada o insaturada, incluyendo compuestos
enlazados, condensados o espirocíclicos, compuestos preferiblemente
por 3 a aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferiblemente
de 3 a aproximadamente 8.
Los "sustituyentes no interferentes" son
los grupos que, cuando están presentes en una molécula, típicamente
son no reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de
la molécula.
El término "sustituido" como en, por
ejemplo, "alquilo sustituido", se refiere a un resto (por
ejemplo, un grupo alquilo) sustituido con uno o más sustituyentes
no interferentes, tales como, pero sin limitación: cicloalquilo
C_{3}-C_{8}, por ejemplo, ciclopropilo,
ciclobutilo y similares; halo, por ejemplo, fluoro, cloro, bromo y
yodo; ciano; alcoxi, fenilo inferior (por ejemplo, fenilo
0-2 sustituido); fenilo sustituido; y similares.
"Arilo sustituido" es arilo que tiene uno o más grupos no
interferentes como un sustituyente. Para sustituciones en un anillo
fenilo, los sustituyentes pueden estar en cualquier orientación (es
decir, orto, meta o para).
"Alcoxi" se refiere a un grupo
-O-R, en el que R es alquilo o alquilo sustituido,
preferiblemente alquilo C_{1}-C_{20} (por
ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, bencilo, etc.), preferiblemente
C_{1}-C_{7}.
Como se usa en este documento, "alquenilo"
se refiere a un grupo de hidrocarburo ramificado o no ramificado de
1 a 15 átomos de longitud, que contiene al menos un doble enlace,
tal como etenilo, n-propenilo, isopropenilo,
n-butenilo, isobutenilo, octenilo, decenilo,
tetradeceinilo y similares.
El término "alquinilo" como se usa en este
documento se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o no
ramificado de 2 a 15 átomos de longitud, que contiene al menos un
triple enlace, etinilo, n-propinilo, isopropinilo,
n-butinilo, isobutinilo, octinilo, decinilo,
etéctera.
"Arilo" se refiere a uno o más anillos
aromáticos, cada uno de 5 ó 6 átomos de carbono de núcleo. Arilo
incluye múltiples anillos de arilo que pueden estar condensados,
como en naftilo, o no condensados, como en bifenilo. Los anillos de
arilo también pueden estar condensados o no condensados con uno o
más hidrocarburos cíclicos, heteroarilo o anillos heterocíclicos.
Como se usa en este documento, "arilo" incluye heteroarilo.
"Heteroarilo" es un grupo arilo que
contiene de uno a cuatro heteroátomos, preferiblemente N, O o S, o
una combinación de los mismos. Los anillos de heteroarilo también
pueden estar condensados con uno o más hidrocarburos cícliclos,
anillos heterocíclicos, de arilo o heteroarilo.
"Heterociclo" o "heterocíclico" se
refiere a uno o más anillos de 5-12 átomos,
preferiblemente 5-7 átomos, con o sin insaturación
o carácter aromático y que tienen al menos un átomo de anillo que no
es un carbono. Los heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxígeno
y nitrógeno.
"Heteroarilo sustituido" es heteroarilo que
tiene uno o más grupos no interferentes como sustituyentes.
"Heterociclo sustituido" es un heterociclo
que tiene una o más cadenas laterales formadas a partir de
sustituyentes no interferentes.
"Electrófilo" se refiere a un ión o átomo o
grupo de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro
electrófilo, es decir, un centro que busca electrones, capaz de
reaccionar con un nucleófilo.
"Nucleófilo" se refiere a un ión o átomo o
grupo de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro
nucleófilo, es decir, un centro que busca un centro electrófilo o
con un electrófilo.
Un enlace "fisiológicamente escindible" o
"hidrolizable" o "degradable" es un enlace relativamente
débil que reacciona con agua (es decir, se hidroliza) en
condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace a hidrolizarse
en agua no dependerá solamente del tipo general de enlace que
conecta dos átomos centrales sino también de los sustituyentes
unidos a estos átomos centrales. Los enlaces hidrolíticamente
inestables o débiles apropiados incluyen, pero sin limitación,
éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídridos, acetales,
cetales, éter de aciloxialquilo, iminas, orto ésteres, péptidos y
oligonucleótidos.
Un "enlace enzimáticamente degradable" se
refiere a un enlace que está sometido a degradación por una o más
enzimas.
Una unión o enlace "hidrolíticamente
estable" se refiere a un enlace químico, típicamente un enlace
covalente, que es sustancialmente estable en agua, es decir, no se
somete a hidrólisis en condiciones fisiológicas en un alcance
apreciable durante un periodo de tiempo prolongado. Los ejemplos de
enlaces hidrolíticamente estables incluyen, pero sin limitación,
los siguientes: enlaces carbono-carbono (por
ejemplo, en cadenas alifáticas), éteres, amidas, uretanos y
similares. Generalmente, un enlace hidrolíticamente estable es uno
que muestra una velocidad de hidrólisis inferior a aproximadamente
el 1-2% por día en condiciones fisiológicas. Las
velocidades de hidrólisis de enlaces químicos representativos se
pueden encontrar en la mayoría de los libros de textos de química
convenciona-
les.
les.
Las expresiones "agente activo" y "agente
biológicamente activo" se usan de forma intercambiable en este
documento y están definidas para que incluyan cualquier agente,
fármaco, compuesto, composición de material o mezcla que
proporcione algún efecto farmacológico, a menudo beneficioso, que se
puede demostrar in vivo o in vitro. Esto incluye
alimentos, suplementos alimenticios, nutrientes, nutricéuticos,
fármacos, vacunas, anticuerpos, vitaminas y otros agentes
beneficiosos. Como se usan en este documento, estas expresiones
incluyen además cualquier sustancia fisiológicamente o
farmacológicamente activa que produce un efecto localizado o
sistémico en un
paciente.
paciente.
"Excipiente farmacéuticamente aceptable" o
"vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un
excipiente que se puede incluir en las composiciones de la
invención y que no provoca efectos toxicológicos adversos
significativos en el paciente.
"Cantidad farmacológicamente eficaz",
"cantidad fisiológicamente eficaz" y "cantidad
terapéuticamente eficaz" se usan de forma intercambiable en este
documento para referirse a la cantidad de un conjugado de
polímero-agente activo presente en una preparación
farmacéutica que se necesita para proporcionar un nivel deseado de
agente activo y/o conjugado en la corriente sanguínea o en el
tejido diana. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores,
por ejemplo, el agente activo particular, los componentes y las
características físicas de la preparación farmacéutica, la
población de pacientes pretendida, las consideraciones del paciente
y similares, y se pueden determinar fácilmente por un especialista
en la técnica, basándose en la información proporcionada en este
documento y disponible en la bibliografía pertinente.
"Multifuncional" en el contexto de un
polímero de la invención se refiere a un polímero que tiene 3 o más
grupos funcionales contenidos en el mismo, donde los grupos
funcionales pueden ser iguales o diferentes. Los polímeros
multifuncionales de la invención contendrán típicamente
aproximadamente 3-100 grupos funcionales, o
3-50 grupos funcionales, o 3-25
grupos funcionales, o 3-15 grupos funcionales, o de
3 a 10 grupos funcionales o contendrán 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10
grupos funcionales dentro del polímero. Un polímero
"difuncional" se refiere a un polímero que tiene dos grupos
funcionales contenidos en el mismo, el mismo (es decir,
homodifuncional) o diferentes (es decir, heterodifuncional).
"Ramificado", en referencia a la geometría
o estructura global de un polímero, se refiere a un polímero que
tiene 2 o más "brazos" poliméricos. Un polímero ramificado
puede poseer 2 brazos poliméricos, 3 brazos poliméricos, 4 brazos
poliméricos, 6 brazos poliméricos, 8 brazos poliméricos o más. Un
tipo particular de polímero altamente ramificado es un polímero
dendrítico o dendrímero, que, para los propósitos de la invención,
se considera que posee una estructura diferente a la de un polímero
ramificado.
Un "dendrímero" o polímero dendrítico es un
polímero globular, de tamaño monodisperso en el que todos los
enlaces surgen radialmente a partir de un punto focal central o
núcleo con un patrón de ramificación regular y con unidades de
repetición que contribuyen cada una a un punto de rama. Los
dendrímeros muestran determinadas propiedades de estado dendrítico
tales como encapsulación de núcleo, haciendo que sean únicos con
respecto a otros tipos de polímeros.
Un reactivo básico o ácido descrito en este
documento incluye neutro, cargado o cualquier forma de sal
correspondiente de los mismos.
El término "paciente" se refiere a un
organismo vivo que padece o que es propenso a una afección que se
puede prevenir o tratar mediante la administración de un conjugado
como se proporciona en este documento, e incluye tanto seres
humanos como animales.
"Opcional" y "opcionalmente" se
refiere a que la circunstancia descrita posteriormente puede o no
producirse, de tal forma que la descripción incluye casos en los
que se produce la circunstancia y casos en los que no.
Como se usa en este documento, el indicador
"halo" (por ejemplo, fluoro, cloro, yodo, bromo, etcétera) se
usa generalmente cuando el halógeno se une a una molécula, mientras
que el sufijo "uro" (por ejemplo, fluoruro, cloruro, yoduro,
bromuro, etcétera) se usa cuando la forma iónica se usa cuando el
halógeno existe en su forma iónica independiente (por ejemplo, tal
como cuando un grupo saliente sale de una molécula).
En el contexto de la presente descripción, se
debe entender que la definición de una variable proporcionada con
respecto a una estructura o fórmula se puede aplicar a la misma
variable repetida en una estructura diferente, a menos que el
contexto lo indique de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la
definición de "POLI", "un resto espaciador", "(z)",
etc. con respecto a un orto éster de un polímero soluble en agua se
puede aplicar igualmente a un polímero soluble en agua que lleva un
ácido carboxílico.
Los presentes métodos para preparar un ácido
carboxílico de un polímero soluble en agua tienen varias ventajas.
Como se muestra en este documento, por ejemplo, se pueden
proporcionar polímeros solubles en agua que llevan un resto ácido
carboxílico terminal con elevada pureza. Aunque las estrategias de
la técnica anterior dan como resultado una pureza relativamente
baja, en este documento se muestran conversiones de al menos
aproximadamente el 85%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 90%, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 95% y mucho más preferiblemente al menos
aproximadamente el 98% de conversión de una molécula precursora en
el derivado de ácido carboxílico correspondiente. Ya que los
polímeros solubles en agua que llevan un resto ácido carboxílico
terminal se pueden proporcionar ahora con una pureza relativamente
elevada, las etapas de purificación caras y que requieren tiempo
disminuyen o se eliminan completamente.
Otra ventaja de los presentes métodos para
preparar un ácido carboxílico de polímero soluble en agua es la
capacidad de preparar un mayor espectro de derivados
estructuralmente diversos. Los métodos descritos previamente dan
como resultado necesariamente, por ejemplo, determinados derivados
de ácido acético o carboximetilados (véase la Patente de Estados
Unidos Nº 5.681.567), determinados derivados de ácido propanoico
(véase las Patentes de Estados Unidos Nº 5.523.479 y 5.672.662) y
determinados derivados de ácido butanoico (véase la Patente de
Estados Unidos Nº 5.672.662). Estos derivados que se han descrito
previamente están limitados necesariamente a determinadas
estructuras ya que los métodos usados para crear los mismos dependen
de una gama relativamente estrecha de posibles reactivos adecuados
para el uso con estos métodos. Ventajosamente, los presentes métodos
se pueden usar con un número relativamente grande de reactivos,
expandiendo de este modo en gran medida el espectro de posibles
estructuras.
Por tanto, se proporciona un primer método para
formar un orto éster de un polímero soluble en agua, que sirve como
un intermedio útil para realizar adicionalmente una etapa para
formación posterior de un polímero soluble en agua que lleva un
ácido carboxílico terminal. El proceso A como se muestra en la
Figura 1 ilustra una estrategia para realizar este primer método.
Una estrategia para la formación posterior de un polímero soluble en
agua que lleva un ácido carboxílico terminal (Fórmula V) se muestra
como el proceso B en la Figura 1. Proporcionada solamente para la
ayuda a la mejor comprensión de un método sintético presentado en
este documento, la Figura 1 no se debe considerar de ningún modo
como limitante de la invención. Las diversas fórmulas mostradas en
la Figura 1 se describen con más detalle a continuación.
Inicialmente, el método para formar un orto
éster de un polímero soluble en agua comprende la etapa de hacer
reaccionar un segmento de polímero soluble en agua que tiene al
menos un ión alcóxido o ión tiolato con un orto éster que comprende
un grupo saliente adecuado (es decir, una molécula que contiene orto
éster que comprende un grupo saliente adecuado). De forma
conveniente y con referencia a la Figura 1, el segmento de polímero
soluble en agua que tiene al menos un ión alcóxido o ión tiolato se
prepara combinando un polímero soluble en agua que tiene al menos
un grupo hidroxilo o tiol (Fórmula II) en presencia de una base
adecuada. Se permite que un orto éster que comprende un grupo
saliente adecuado (Fórmula I) reaccione con un polímero soluble en
agua que tiene al menos un grupo hidroxilo o tiol (Fórmula II) para
formar un orto éster que comprende un grupo saliente adecuado
(Fórmula III).
Sin embargo, la base usada en esta estrategia
tiene que ser una que formará un alcóxido (es decir,
R-O^{-}) o tiolato (es decir,
R-S^{-}) del polímero soluble en agua que tiene al
menos un grupo hidroxilo o tiol, respectivamente. Por tanto, por
ejemplo, la base transforma POLI-(X)_{a}-OH
en POLI-(X)_{a}-O-_{ }y
POLI-(X)_{a}-SH en
POLI-(X)_{a}-S^{-}. Se cree
adicionalmente que el polímero soluble en agua, que ahora lleva un
resto alcóxido o tiolato, a su vez reacciona por un mecanismo de
reacción de S_{N}2 con el orto éster que tiene un grupo saliente
adecuado (Fórmula I). Como se reconocerá por los especialistas en la
técnica, esta estrategia se corresponde a la síntesis de éter de
Williamson y los principios y las técnicas usadas generalmente en
una síntesis de éter de Williamson también se pueden aplicar en
este
caso.
caso.
Los ejemplos no limitantes de bases adecuadas
para formar un alcóxido de un alcohol o un tiolato de un compuesto
que contiene tiol incluyen sodio, hidróxido sódico, potasio,
hidróxido potásico, hidruro sódico, hidruro potásico, metóxido
sódico, metóxido potásico, terc-butóxido sódico,
terc-butóxido potásico, carbonato sódico y carbonato
potásico. Sin embargo, las bases preferidas para usar de acuerdo
con esta etapa incluyen las seleccionadas del grupo que consiste en
sodio, potasio, hidruro sódico, hidruro potásico, metóxido sódico,
metóxido potásico, terc-butóxido sódico y
terc-butóxido potásico.
Además, el segmento de polímero soluble en agua
que tiene al menos un ión alcóxido o ión tiolato puede
proporcionarse de forma conveniente por una reacción de
polimerización, como se describirá con más detalle a continuación.
En esta estrategia para proporcionar el segmento de polímero soluble
en agua, se prefiere que el segmento de polímero soluble en agua
tenga al menos un ión alcóxido.
Generalmente, aunque no necesariamente, un
exceso del orto éster que comprende un grupo saliente adecuado
(Fórmula I) se deja reaccionar con el polímero soluble en agua que
lleva al menos un ión alcóxido o ión tiolato (Fórmula II).
Típicamente, la cantidad de orto éster que comprende un grupo
saliente adecuado (Fórmula I) representa al menos un equivalente
molar para el número de grupo hidroxilo o tiol disponibles en el
polímero soluble en agua que tiene al menos un grupo hidroxilo o
tiol (Fórmula II). Se pueden preparar especies poliméricas
heterofuncionales (es decir, especies que llevan dos o más grupos
funcionales terminales diferentes) usando cantidades no
estequiométricas del orto éster que comprende un grupo saliente
adecuado (Fórmula I). Es decir, se forman especies
heterofuncionales cuando el número total de moles de grupos
hidroxilo o tiol disponibles en el polímero soluble en agua que
tiene al menos un grupo hidroxilo o tiol (Fórmula II) supera el
número total de moles del orto éster que comprende un grupo
saliente adecuado (Fórmula I) añadido a la reacción.
El orto éster del polímero soluble en agua
(Fórmula III) se puede preparar mediante otros medios y la invención
no se limita simplemente al proceso A como se ilustra en la Figura
1. Por ejemplo, un orto éster que comprende al menos un sitio de
iniciador adecuado para la polimerización se puede usar para hacer
crecer uno o más segmentos de polímero soluble en agua. Usando esta
estrategia, un orto éster que comprende al menos un sitio de
iniciador (por ejemplo, un resto alcóxido) y un monómero reactivo
(por ejemplo, óxido de etileno) se combinan y se deja que la
reacción avance hasta que todo el monómero reactivo se agote o la
reacción se termina mediante, por ejemplo, neutralización del medio
de reacción. El último monómero reactivo, por ejemplo, óxido de
etileno, añadido a la cadena en crecimiento puede proporcionar de
forma conveniente un ión alcóxido o ión tiolato para reacción
posterior con, por ejemplo, un orto éster que comprende un grupo
saliente adecuado.
Específicamente, se pueden seguir las siguientes
etapas para construir el segmento de polímero soluble en agua
directamente en un orto éster que comprende al menos un sitio de
iniciador: (i) proporcionar un orto éster que comprende al menos un
sitio aniónico activo adecuado para iniciar la polimerización; (ii)
poner en contacto el sitio aniónico del orto éster con un monómero
reactivo capaz de polimerizar, para iniciar de este modo la
polimerización del monómero reactivo en el precursor del orto éster;
(iii) añadir monómeros reactivos de adicción al precursor de orto
ácido para formar una o más cadenas poliméricas; (iv) permitir que
dicho contacto continúe hasta que se haya alcanzado una longitud
deseada de la cadena o las cadenas poliméricas; y (v) terminar la
reacción para conseguir un orto éster de un polímero soluble en
agua.
Se puede usar cualquier monómero reactivo para
"dejar crecer" la cadena o cadenas poliméricas hasta que la
cadena de polímero resultante sea soluble en agua. Sin embargo, se
prefiere particularmente que el monómero reactivo sea óxido de
etileno, proporcionando de este modo cadena o cadenas de poli(óxido
de etileno). El crecimiento de la cadena o cadenas poliméricas,
incluyendo la unión inicial del monómero reactivo al sitio de
iniciador, se puede realizar mediante, por ejemplo, un ión alcóxido,
(es decir, R-O^{-}). Estas y otras técnicas se
conocen por los especialistas en la técnica y se hace referencia a
las mismas en, por ejemplo, Odian, Cap. 7, Principles of
Polymerization, 3a Ed., McGraw-Hill, 1991.
El crecimiento de la cadena o cadenas de
polímero continúa hasta que se consigue el peso molecular deseado.
Por tanto, por ejemplo, la neutralización del medio de reacción
detiene el crecimiento de la cadena o las cadenas poliméricas.
Además, la adicción de un peso o una cantidad específica del
monómero reactivo y permitir que la polimerización avance hasta que
todo el monómero reactivo se haya agotado, da como resultado una
cadena polimérica que tiene un peso molecular correspondiente. Una
vez que se ha formado la cadena o las cadenas poliméricas, se puede
añadir un grupo de acabado usando técnicas convencionales. Por
ejemplo, un haluro de alquilo (por ejemplo, haluro de metilo o
metil p-toluenosulfonato) se puede hacer reaccionar con el
extremo expuesto (el extremo distal a la funcionalidad orto éster)
de la cadena polimérica.
También se puede usar una estrategia de
polimerización relacionada, aunque diferente, para proporcionar un
orto éster de un polímero soluble en agua. En esta estrategia
relacionada, la polimerización se realiza para formar en primer
lugar una cadena polimérica que se puede transformar posteriormente
en el derivado de orto éster. Por ejemplo, por tanto, una sal de
alcoxi alcoholato tal como 2-metoxi etanolato sódico
(Na^{+}.^{-}OCH_{2}CH_{2}OCH_{3}) puede iniciar la
polimerización de óxido etileno siguiendo esencialmente el mismo
procedimiento que se ha explicado anteriormente. Asumiendo que el
monómero final añadido a la cadena polimérica abandona un grupo
reactivo tal como un alcóxido (como en el caso del óxido de
etileno), la cadena polimérica se puede hacer reaccionar después
con un orto éster que comprende un grupo saliente adecuado. En la
medida de que la cadena polimérica no abandone un grupo (por
ejemplo, un alcóxido) adecuado para la unión directa a un reactivo
que contiene orto éster, se pueden hacer modificaciones adicionales
en la cadena polimérica de tal forma que se puede unir un orto
éster.
El uso de una sal de alcoxi alcoholato como un
iniciador del polímero da como resultado un orto éster de un
polímero soluble en agua que comprende una única funcionalidad orto
éster. Los polímeros que comprenden dos funcionalidades orto éster
(un polímero bifuncional) pueden producirse cuando se usan sales de
dialcoholato (por ejemplo, 2Na^{+}.^{-}OCH_{2}CH_{2}O) en
lugar de sales de alcoxi alcoholato. Como se ha descrito
anteriormente, también se puede realizar una etapa de acabado
opcional con esta estrategia de polimerización.
Con referencia a la Figura 1, el orto éster de
un polímero soluble en agua (Fórmula III) se puede convertir en un
polímero soluble en agua que lleva un carboxílico terminal (Fórmula
V). La conversión en el derivado de ácido de carboxílico
correspondiente se consigue ventajosamente de forma eficaz y con un
gran rendimiento realizando una o más etapas de hidrólisis. La
hidrólisis catalizada por ácido o la hidrólisis cataliza por ácido
seguida de una hidrólisis promovida por base pueden proporcionar el
polímero soluble en agua que lleva un ácido carboxílico terminal
(Fórmula V).
Aunque la conversión en el ácido carboxílico se
puede realizar en una única etapa de hidrólisis mediante hidrólisis
catalizada por ácido, se considera que esta estrategia hidrolítica
única es ineficaz en términos de tiempo. Se ha observado que, sin
embargo, dos etapas de hidrólisis aumentan la velocidad de
conversión del ácido carboxílico a partir del orto éster
correspondiente.
En una estrategia de dos etapas de hidrólisis,
una primera etapa de hidrólisis da como resultado que la
funcionalidad orto éster se transforma en un éster (Fórmula IV). A
su vez, una segunda etapa de hidrólisis convierte el éster (Fórmula
IV) en el polímero correspondiente que lleva un ácido carboxílico
terminal (Fórmula IV).
La primera etapa de hidrólisis debe ser
hidrólisis catalizada por ácido. La funcionalidad orto éster se
puede escindir mediante condiciones ácidas acuosas débiles tales
como ácido p-toluenosulfónico (p-TsOH) y piridina en
agua y NaHSO_{4} y 1,2-dimetoxietano (DME) en agua
a 0ºC durante 20 minutos. Véase Just et al. (1983) Can. J.
Chem. 61: 712 y Corey et al. (1986) Tetrahedron Lett. 27:
2199, respectivamente. Los ejemplos de otros ácidos adecuados para
usar en hidrólisis catalizada por ácido incluyen, pero sin
limitación, ácido fluorhídrico (HF), ácido clorhídrico (HCl), ácido
bromhídrico (HBr), ácido yodhídrico (HI), ácido nítrico
(NHO_{3}), ácido perclórico (HClO_{4}), ácido sulfúrico
(H_{2}SO_{4}), ácido acético (CH_{3}CO_{2}H), ácido
carbónico (H_{2}CO_{3}), ácido fosfórico (H_{3}PO_{4}),
ácido oxálico (H_{2}C_{2}O_{4}) y ácido fórmico (HCOOH).
La segunda etapa de hidrólisis es típicamente
una etapa de hidrólisis promovida por base. El éster (Fórmula IV)
de la primera etapa de hidrólisis se trata con una base. Para la
hidrólisis promovida por base, la funcionalidad orto éster se trata
con cualquier base acuosa, tal como hidróxido de litio (LiOH),
hidróxido sódico (NaOH), hidróxido potásico (KOH), hidróxido de
rubidio (RuOH), hidróxido de cesio [Cs(OH)_{2}],
hidróxido de estroncio [Sr(OH)_{2}], hidróxido de
bario [Ba(OH)_{2}], hidróxido de amonio
(NH_{4}OH), hidróxido de magnesio [Mg(OH)_{2}],
hidróxido de calcio [Ca(OH)_{2}], acetato sódico
(NaCH_{3}CO_{2}), acetato potásico (KCH_{3}CO_{2}),
carbonato sódico (Na_{2}CO_{3}), carbonato potásico
(K_{2}CO_{3}), carbonato de litio (Li_{2}CO_{3}), fosfato
sódico (Na_{3}PO_{4}), fosfato potásico (K_{3}PO_{4}),
borato sódico (Na_{3}BO_{4}), borato potásico
(Li_{3}PO_{4}), etc.
La primera y la segunda etapa opcional de
hidrólisis se pueden realizar con calor aumentado para aumentar la
velocidad de la reacción.
Las etapas del método tienen lugar en un
disolvente apropiado. El especialista en la técnica puede determinar
si cualquier disolvente específico es apropiado para cualquier
reacción dada. Típicamente y en particular con respecto a los
procesos A y B como se muestran en la Figura 1, sin embargo, el
disolvente preferiblemente es un disolvente no polar o un
disolvente aprótico polar. Los ejemplos no limitantes de disolventes
no polares incluyen benceno, xileno, dioxano, tetrahidrofurano
(THF), t-butil alcohol y tolueno. Los disolventes no polares
particularmente preferidos incluyen tolueno, xileno, dioxano,
tetrahidrofurano y t-butil alcohol. Los disolventes
apróticos polares ilustrativos incluyen, pero sin limitación, DMSO
(dimetil sulfóxido), HMPA (hexametilfosforamida), DMF
(dimetilformamida), DMA (dimetilacetamida), NMP
(N-metilpirrolidinona).
Con respecto a la hidrólisis, en particular, el
agua es un disolvente preferido, aunque se pueden usar mezclar
acuosas de agua con otros disolventes tales como agua y
tetrahidrofurano, agua y 1,2-dimetiletano, agua y
diglima, así como otros disolventes que contienen agua.
Opcionalmente, el método comprende además la
etapa de recuperar el ácido carboxílico del polímero soluble en
agua. Se pueden usar técnicas conocidas en la técnica para recuperar
el polímero e incluyen, por ejemplo, precipitar el polímero a
partir de la solución. Después se puede recoger el precipitado y
opcionalmente filtrar y/o secar. Éstas y otras técnicas se pueden
usar para aislar y recuperar el ácido carboxílico del polímero
soluble en agua.
Además, el método incluye opcionalmente la etapa
de purificar adicionalmente el ácido carboxílico del polímero
soluble en agua. Una etapa de purificación de este tipo, sin
embargo, generalmente no se requiere dado el grado relativamente
elevado de conversión de un precursor (por ejemplo, un orto éster de
un polímero soluble en agua) en el ácido carboxílico
correspondiente. En cualquier caso, se pueden usar técnicas
conocidas en la técnica tales como cromatografía para purificar el
polímero.
Los ácidos producidos de este modo de acuerdo
con el presente método son sustancialmente puros y se pueden
preparar en una estrategia de un recipiente. Con puro se quiere
decir que preferiblemente más de al menos aproximadamente el 85%,
más preferiblemente más de al menos aproximadamente el 90%, aún más
preferiblemente más de al menos aproximadamente el 95% y mucho más
preferiblemente más de al menos aproximadamente el 98% de la
cantidad total (en base de peso o molar) del polímero soluble en
agua que lleva un grupo hidroxilo o tiol se convierte en polímero
soluble en agua que lleva un ácido carboxílico terminal.
Como se ha indicado anteriormente, el método
requiere el uso de un orto éster que comprende un grupo saliente
adecuado. Estructuralmente, el orto éster comprende un "átomo de
carbono de ramificación". Este átomo de carbono de ramificación
es un átomo de carbono unido covalentemente a tres átomos de
oxígeno, que, a su vez, se unen covalentemente típicamente cada
uno, a, por ejemplo, un resto alquilo. Dada la naturaleza
tetravalente del carbono, el átomo de carbono de ramificación
también comprende una cuarta unión covalente. En el caso de los
presentes orto ésteres de la invención usados para preparar ácidos
alcanoicos, la cuarta unión covalente del átomo de carbono de
ramificación es a una cadena de carbono sustituida o no sustituida,
tal como una cadena alquileno. Finalmente, un grupo saliente
adecuado se une, directamente o mediante un resto espaciador, al
extremo de la cadena de carbono que no está unida al átomo de
carbono de ramificación.
A continuación se proporciona una estructura
ilustrativa de un orto éster que comprende un grupo saliente
adecuado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- es el grupo saliente adecuado;
- \quad
- (z) es un número entero de 1 a 24;
- \quad
- R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido;
- \quad
- R^{2} en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- representa un residuo de un resto orto éster.
Con respecto a la Fórmula I, el grupo saliente
adecuado es cualquier átomo o grupo de átomos que puede abandonar
el átomo de carbono al que está unido. Específicamente, un grupo
saliente adecuado es uno que se puede desplazar por un nucleófilo
en aproximación. Los especialistas en la técnica pueden determinar
qué átomo o grupos de átomos pueden servir como un grupo saliente
adecuado. Además, la experimentación de rutina puede identificar si
cualquier átomo específico o grupo de átomos puede servir como un
grupo saliente adecuado. Por ejemplo, un grupo saliente propuesto
en una molécula que comprende un orto éster se puede ensayar
haciendo reaccionar el orto éster con un segmento de polímero
soluble en agua que tiene un grupo hidroxilo; el grupo saliente
propuesto es un grupo saliente adecuado si se forman cantidades
detectables del orto éster correspondiente del polímero soluble
en
agua.
agua.
Los grupos salientes adecuados preferidos
incluyen los que son primarios (por ejemplo, un halo primario),
aunque también se pueden usar grupos salientes que sean secundarios.
Los ejemplos de grupos salientes adecuados incluyen halógenos y
ésteres de sulfonato. Entre los halógenos se prefieren bromo, cloro,
yodo y fluoro, siendo bromo y cloro grupos salientes de tipo
halógeno particularmente preferidos. Con respecto a ésteres de
sulfonato, se prefieren particularmente metanosulfonato,
trifluorometanosulfonato, triclorometanosulfonato,
2,2,2-trifluoroetanosulfonato,
2,2,2-tricloroetanosulfonato y
para-toluenosulfonato, aunque también se pueden usar
otros ésteres de sulfonato y grupos salientes constituidos de forma
similar conocidos por los especialistas en la técnica.
Con respecto a la funcionalidad orto éster
específica asociada a la Fórmula I, se puede usar cualquier
funcionalidad orto éster y la invención no está limitada en este
aspecto. Sin embargo, una funcionalidad orto éster ilustrativa
comprende la siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que cada R^{4} es un
radical orgánico seleccionado independientemente del grupo que
consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo
sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido
y uno o más átomos que se combinan con otro R^{4} o los restos
R^{4} remanentes para formar una estructura
anular.
La funcionalidad orto éster puede ser acíclica,
es decir, carecer de una estructura anular. Cuando es acíclica, se
prefiere que cada R^{4} en la estructura que se ha definido
anteriormente sea independientemente un alquilo
C_{1-6} (por ejemplo, metilo, etilo o propilo) o
alquilo C_{1-6} sustituido. Además, la
funcionalidad orto éster puede estar en forma de una estructura
"cíclica" o "anular". En el presente contexto, se
entenderá que la expresión "cíclico" incluye estructuras
monocíclicas, bicíclicas y policíclicas. En versiones cíclicas, la
funcionalidad orto éster está preferiblemente en forma de un anillo
heterocíclico sustituido o no sustituido que comprende de
aproximadamente 6 a aproximadamente 14 átomos. Los sustituyentes
preferidos para el anillo heterocíclico incluyen alquilo
C_{1-6}, tal como metilo o etilo, o alquilo
C_{1-6} sustituido. Los ejemplos de tales
estructuras cíclicas preferidas incluyen los siguientes anillos
heterocíclicos enlazados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
4-metil-2,6,7-trioxabiciclo[2.2.2.]octanoil,
("éster de
OBO");
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
4-metil-2,7,8-trioxabiciclo[3.2.1.]octanoil,
("éster de
ABO");
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
2,8,9-trioxatriciclo[3.3.1.1^{3,7}]decanilo.
Un especialista en la técnica puede imaginar
fácilmente otras estructuras cíclicas que comprenden otras
estructuras orto éster (tanto cíclicas como acíclicas).
Como se puede observar con respecto a la Fórmula
I, el orto éster que comprende un grupo saliente adecuado comprende
una cadena de carbono de (z) carbonos definida por la siguiente
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que (z), cada R^{1} y cada
R^{2} son como se ha definido previamente. Preferiblemente, sin
embargo, (z) es igual a uno, dos, tres, cuatro o
cinco.
La cadena de carbono puede ser una cadena
simple, lineal de átomos de carbono. Las cadenas de carbonos
simples, lineales son aquellas en las que cada R^{1} y R^{2} se
definen como hidrógeno. Además, la cadena de carbono puede
comprender uno o más enlaces dobles y/o triples de
carbono-carbono. Además, la cadena de carbono puede
estar ramificada de forma sencilla donde uno de R^{1} y R^{2} se
define como un átomo o grupo de átomos diferente de hidrógeno, tal
como alquilo, y todos las demás variables R^{1} y R^{2} son
hidrógeno. También se considera una ramificación múltiple en la que
se definen múltiples casos de R^{1} y/o R^{2} como un átomo o
grupo de átomos diferentes de hidrógeno (por ejemplo, alquilo). Sin
embargo, se prefiere que las especies ramificadas incluyan
solamente un único punto de ramificación. Además, se prefiere que el
único punto de ramificación tenga lugar en el átomo de carbono
\alpha en (o inmediatamente adyacente a) el "átomo de carbono de
ramificación" en la funcionalidad orto éster.
Opcionalmente se puede localizar un resto
espaciador entre la cadena de carbono y el grupo saliente adecuado.
Los orto ésteres ilustrativos que comprenden un resto espaciador de
este tipo comprenden la siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \quad
- X^{2} es un resto espaciador y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- (z), cada R^{1}, cada R^{2} y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- son como se han definido previamente.
El resto espaciador opcional (es decir, X^{2})
en el orto éster que comprende un grupo saliente adecuado es
cualquier átomo o serie de átomos que separan la cadena de carbono
de (z) átomos del grupo saliente. Dependiendo del átomo o átomos
reales que constituyen este resto espaciador, el resto espaciador
puede ser hidrolíticamente estable o hidrolíticamente inestable. Si
un resto específico es hidrolíticamente estable o inestable se puede
determinar por un especialista en la técnica o determinar
experimentalmente usando experimentación de rutina. Este resto
espaciador opcional X^{2} se puede seleccionar de los restos
espaciadores que se identifican a continuación con respecto a X. En
los casos en los que X^{2} aparece dentro de la misma estructura
definida comprendiendo un X o un X^{1}, X^{2} puede ser igual o
diferente.
Se debe subrayar que aunque el orto éster que
comprende un grupo saliente adecuado comprende una cadena de
carbono de (z) átomos, la presencia de la cadena de carbono no es
necesaria para proporcionar un ácido carboxílico. En consecuencia,
cuando se desea un polímero soluble en agua que lleva un ácido
carboxílico terminal diferente de un ácido alcanoico (por ejemplo,
un ácido propanoico, ácido butanoico, etcétera), la cadena de
carbono se omite y sustituye por, por ejemplo, un resto espaciador
u otro grupo de átomos.
El orto éster que tiene un grupo saliente
adecuado se puede preparar sintéticamente. Por ejemplo, se pueden
preparar orto ésteres acíclicos obteniendo un imino éster (también
denominado un "imidato de alquilo") mediante, por ejemplo, una
reacción de Pinner. En esta estrategia, se forma un imino éster por
la adición de gas de cloruro de hidrógeno anhidro a una mezcla de
un nitrilo y un alcohol. El tratamiento posterior del imino éster
con un alcohol proporciona el orto éster correspondiente. Véase, por
ejemplo, Voss et al. (1984) Helv. Chim. Acta. 66: 2294.
Se pueden preparar orto ésteres cíclicos
mediante conversión de un hidroxialquiloxetano al éster carboxílico
correspondiente, que, después de la redisposición, produce un orto
éster enlazado. Éstas y otras estrategias para preparar orto
ésteres cíclicos se describen en la bibliografía. Véase, por
ejemplo: Corey et al. (1983) Tetrahedron Lett.
24(50): 5571-5574; Wipf et al. (1999)
Pure Appl. Chem. 71(3): 415-421; y Greene
et al. PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3a ed. págs.
437-441, John Wiley & Sons, New York, NY (1999).
El grupo saliente adecuado se introduce en el orto éster incluyendo
el grupo saliente en el reactivo antes de la formación del orto
éster o añadiéndolo el mismo posteriormente a la formación del orto
éster.
En algunos casos, el orto éster que comprende un
grupo saliente adecuado está disponible en el mercado. Por ejemplo,
un orto éster disponible en el mercado es trimetil
4-bromoortobutirato disponible en
Sigma-Aldrich Corporation de St. Louis, MO.
Se puede usar cualquier polímero soluble en agua
que tenga al menos un grupo hidroxilo o tiol (para proporcionar,
por ejemplo, un polímero soluble en agua que tenga al menos un ión
alcóxido o ión tiolato, respectivamente) de acuerdo con la
invención y la invención no está limitada en este aspecto. Aunque se
pueden usar polímeros solubles en agua que llevan solamente un
único hidroxilo o tiol, se pueden usar polímeros que llevan dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o
más restos hidroxilo y/o tiol. Ventajosamente, cuando el número de
restos hidroxilo o tiol en el segmento de polímero soluble en agua
aumenta, el número de sitios disponibles para proporcionar restos
ácido carboxílico aumenta. Los ejemplos no limitantes del límite
superior del número de restos hidroxilo y/o tiol asociados al
segmento de polímero soluble en agua incluyen 500, 100, 80 y
40.
El segmento de polímero soluble en agua es
preferiblemente, aunque no necesariamente, un
poli(etilenglicol) o "PEG" o un derivado del mismo. Se
debe entender, sin embargo, que también son adecuados polímeros
relacionados para el uso en la práctica de esta invención y que el
uso del término "PEG" o "poli(etilenglicol)" tiene
por objeto ser incluyente y no excluyente en este aspecto. En
consecuencia, el término "PEG" incluye
poli(etilenglicol) en cualquier de sus formas lineal,
ramificada o multi-brazo, incluyendo alcoxi PEG, PEG
bifuncional, PEG ahorquillado, PEG ramificado, PEG colgante o PEG
con enlaces degradables en el mismo, que se describirá con más
detalle más
adelante.
adelante.
En una forma útil en la presente invención, el
PEG libre o no unido es un polímero lineal terminado en cada
extremo con grupos hidroxilo:
HO-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m'}-CH_{2}CH_{2}-OH
(m') típicamente varía de cero a
aproximadamente 4.000, preferiblemente de aproximadamente 20 a
aproximadamente
1.000.
El anterior polímero, alfa-,
omega-dihidroxilpoli(etilenglicol), se puede
representar de forma resumida como
HO-PEG-OH donde se entiende que el
símbolo -PEG- puede representar la siguiente unidad estructural:
-CH_{2}CH_{2}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m'}-CH_{2}CH_{2}-
donde (m') es como se ha definido
anteriormente.
Otro tipo de PEG útil en la presente invención
es metoxi-PEG-OH, o en resumen,
mPEG, donde un extremo es el grupo metoxi relativamente inerte,
mientras que el otro extremo es un grupo hidroxilo. La estructura de
mPEG se proporciona a continuación:
CH_{3}O-CH_{2}CH_{2}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m'}-CH_{2}CH_{2}-OH
donde (m') es como se ha descrito
anteriormente.
También se pueden usar moléculas de PEG con
múltiples brazos o ramificadas, tales como las descritas en la
Patente de Estados Unidos 5.932.462, como el polímero PEG. Por
ejemplo, PEG puede tener la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \quad
- poli_{a} y poli_{b} son cadenas principales de PEG (iguales o diferentes), tales como metoxi poli(etilenglicol);
- \quad
- R'' es un resto no reactivo, tal como H, metilo o una cadena principal de PEG; y
- \quad
- P y Q son enlaces no reactivos: En una realización preferida, el polímero de PEG ramificado es metoxi poli(etilenglicol) disustituido con lisina.
Además, el PEG puede comprender un PEG
ahorquillado. Un ejemplo de un PEG ahorquillado se representa
mediante la siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que: X es un resto espaciador
y cada Z es un grupo terminal activado unido a CH por una cadena de
átomos de longitud definida. La Solicitud Internacional Nº
PCT/US99/05333 describe diversas estructuras de PEG ahorquillado
que se pueden usar en la presente invención. La cadena de átomos que
une los grupos funcionales Z al átomo de carbono de ramificación
sirven como un grupo de anclaje y puede comprender, por ejemplo,
cadenas de alquilo, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de
amida y combinaciones de las
mismas.
El polímero PEG puede comprender una molécula
PEG colgante que tiene grupos reactivos tales como carboxilo,
unidos covalentemente a lo largo de la longitud del PEG en vez de en
el extremo de la cadena de PEG. Los grupos reactivos colgantes se
pueden unir al PEG directamente o por un resto espaciador, tal como
un grupo alquileno.
Además de las formas que se han descrito de PEG,
el polímero también se puede preparar con uno o más enlaces débiles
o degradables en el polímero, incluyendo cualquiera de los polímeros
que se han descrito anteriormente. Por ejemplo, se puede preparar
PEG con enlaces éster en el polímero que se someten a hidrólisis.
Como se muestra a continuación, esta hidrólisis da como resultado
la escisión del polímero en fragmentos de menor peso
molecular:
molecular:
-PEG-CO_{2}-PEG-
+ H_{2}O \rightarrow -PEG-CO_{2}H +
HO-PEG-
Otros enlaces hidrolíticamente degradables,
útiles como un enlace degradable dentro de una cadena principal del
polímero, incluyen enlaces carbonato; enlaces imina producidos, por
ejemplo, por la reacción de una amina y un aldehído (véase, por
ejemplo, Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1):
582-3); enlaces éster de fosfato formados, por
ejemplo, haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato;
enlaces hidrazona que se forman típicamente por reacción de una
hidrazida y un aldehído; enlaces acetal que se forman típicamente
por la reacción entre un aldehído y un alcohol; enlaces orto éster
que se forman, por ejemplo, por reacción entre un formato y un
alcohol; enlaces amida formados por un grupo amina, por ejemplo, en
un extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de
otra cadena de PEG; enlaces uretano formados por la reacción de, por
ejemplo, un PEG con un grupo isocianato terminal y un alcohol de
PEG; enlaces peptídicos formados por un grupo amina, por ejemplo,
en un extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de
un péptido; y enlaces oligonucleotídicos formados mediante, por
ejemplo, un grupo fosforoamidita, por ejemplo, en el extremo de un
polímero, y un grupo hidroxilo 5' de un
oligonucleótido.
oligonucleótido.
Se entiende por los especialistas en la técnica
que el término poli(etilenglicol) o PEG representa o incluye
todas las anteriores formas de PEG.
Muchos otros polímeros también son adecuados
para la invención. Los polímeros que son no peptídicos y solubles
en agua, con 2 a aproximadamente 300 extremos, son particularmente
útiles en la invención. Los ejemplos de polímeros adecuados
incluyen, pero sin limitación, otros poli(alquilenglicoles),
tales como poli(propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de
etilenglicol y propilenglicol y similares, poli(alcohol
olefínico), poli(vinilpirrolidona),
poli(hidroxialquilmetacrilamida),
poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos),
poli(\alpha-hidroxiácido),
poli(vinilalcohol), polifosfaceno, polioxazolina,
poli(N-acriloilmorfolina), tal como se
describe en la Patente de Estados Nº 5.629.384 y copolímeros,
terpolímeros y mezclas de los mismos. Éstos polímeros pueden ser
lineales, o pueden estar en cualquiera de las formas que se han
descrito anteriormente (por ejemplo, ramificada, ahorquillada y
similares).
Aunque el peso molecular promedio nominal del
polímero soluble en agua puede variar, el peso molecular promedio
nominal estará típicamente en uno o más de los siguientes
intervalos: de aproximadamente 100 Dalton a aproximadamente 100.000
Dalton; de aproximadamente 500 Dalton a aproximadamente 80.000
Dalton; de aproximadamente 1.000 Dalton a aproximadamente 50.000
Dalton; de aproximadamente 2.000 Dalton a aproximadamente 25,000
Dalton; de aproximadamente 5,000 Dalton a aproximadamente 20.000
Dalton. Los pesos moleculares promedios nominales ejemplares para el
segmento de polímero soluble en agua incluyen aproximadamente 1.000
Dalton, aproximadamente 5.000 Dalton, aproximadamente 10.000
Dalton, aproximadamente 15.000 Dalton, aproximadamente 20.000
Dalton, aproximadamente 25.000 Dalton y aproximadamente 30.000
Dalton.
Se considera que el PEG y otros polímeros
solubles en agua como se describen en este documento son típicamente
biocompatibles y no inmunogénicos. Con respecto a la
biocompatibilidad, se considera que una sustancia es biocompatible
si los efectos beneficiosos asociados al uso de la sustancia sola o
con otra sustancia (por ejemplo, agente activo) junto con tejidos
vivos (por ejemplo, administración a un paciente) pesa más que
cualquier efecto perjudicial como se evalúa por un clínico, por
ejemplo, un médico. Con respecto a la no immunogenicidad, se
considera que una sustancia no es inmunogénica si el uso de la
sustancia sola o con otra sustancia junto con tejidos vivos no
produce ninguna respuesta inmune (por ejemplo, la formación de
anticuerpos) o, si una respuesta inmune se produce, de tal forma
que una respuesta de este tipo no se considera clínicamente
significativa o importante cuando se evalúa por un clínico. Se
prefiere particularmente que los polímeros descritos en este
documento, así como conjugados de agentes activos y los polímeros y
segmentos solubles en agua descritos en este documento sean
biocompatibles y no
inmunogénicos.
inmunogénicos.
Los especialistas en la técnica entenderán que
la anterior discusión con respecto a polímeros sustancialmente
solubles en agua en ningún modo es exhaustiva y es meramente
ilustrativa y que se consideran todos los materiales poliméricos
que tienen las cualidades que se han descrito anteriormente. Como se
usa en este documento, la expresión "polímero soluble en agua"
se refiere generalmente a una molécula entera, que puede comprender
grupos funcionales tales como grupos hidroxilo, grupos tiol,
funcionalidades orto éster, etcétera. La expresión segmento de
polímero soluble en agua se reserva generalmente para el uso en la
discusión de estructuras moleculares específicas en las que un
polímero o una parte del mismo es solo una parte de la estructura
molecular
global.
global.
Un ejemplo de un polímero soluble en agua
preferido que lleva un resto hidroxilo o tiol comprende la siguiente
estructura:
(Fórmula
II)POLI-(X)_{a}-YH
en la que POLI es un segmento de
polímero soluble en
agua;
(a) es cero o uno;
X, cuando está presente, es un resto espaciador;
e
Y es O o S.
\newpage
El reconocer ciertos casos en los que un
segmento de polímero soluble en agua (es decir, un "POLI") se
define como que contiene un resto hidroxilo o tiol (por ejemplo,
CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-H o
CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-(CH_{2}CH_{2}S)-H,
respectivamente), se entiende que el resto "-YH" de Fórmula II
representa el resto hidroxilo o tiol de "POLI" y no la
interpretación irracional de, por ejemplo,
"CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-H-YH".
Alternativamente,
CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-
H, por ejemplo, está incluido en Fórmula II cuando POLI se define como "CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-," (a) es uno, X es "-CH_{2}CH_{2}-" e Y es "-O-". Por tanto, dada la posibilidad de que pueda haber más de un único modo de que cualquier molécula individual se incluya en una formula dada, se tiene que dar la debida consideración para determinar si una molécula en cuestión está o no incluida en una fórmula dada.
H, por ejemplo, está incluido en Fórmula II cuando POLI se define como "CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-," (a) es uno, X es "-CH_{2}CH_{2}-" e Y es "-O-". Por tanto, dada la posibilidad de que pueda haber más de un único modo de que cualquier molécula individual se incluya en una formula dada, se tiene que dar la debida consideración para determinar si una molécula en cuestión está o no incluida en una fórmula dada.
Un segmento soluble en agua particularmente
preferido que lleva un único grupo hidroxilo comprende la siguiente
estructura:
R^{5}-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-H
en la
que:
- \quad
- (m) es de 2 a 4000; y
- \quad
- R^{5} es un grupo de acabado tal como H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Se prefiere especialmente que R^{5} sea un alquilo inferior tal como metilo, aunque también se pueden usar bencilo y otros grupos de acabado conocidos por los especialistas en la técnica.
Sin embargo, para los propósitos de la presente
descripción, una serie de átomos no es un resto espaciador cuando
la serie de átomos está inmediatamente adyacente a un polímero y la
serie de átomos es otro monómero de tal forma que el resto
espaciador propuesto representaría una mera extensión de la cadena
polimérica. Por ejemplo, dada la estructura parcial
"POLI-X-" y POLI se define como
"CH_{3}O(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-" en la que
(m) es de 2 a 4000 y X se define como un resto espaciador, el resto
espaciador no se puede definir como "-CH_{2}CH_{2}O-", ya
que una definición de este tipo representaría meramente una
extensión del polímero. Sin embargo, en un caso de este tipo, se
podría definir un resto espaciador aceptable como
"-CH_{2}CH_{2}-".
Los restos espaciadores ejemplares incluyen,
pero sin limitación, -C(O)-,
-C(O)-NH-,
-NH-C(O)-NH-,
-O-C(O)-NH-, -C(S)-,
-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-O-CH_{2}-, -CH_{2}-O-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-O-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-C(O)-NH-CH_{2}-,
-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-,
-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-,
-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-,
-C(O)-O-CH_{2}-,
-CH_{2}-C(O)-O-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-O-CH_{2}-,
-C(O)-O-CH_{2}-CH_{2}-,
-NH-C(O)-CH_{2}-,
-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-,
-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-NH-
C(O)-CH_{2}-CH_{2}-,
-C(O)-NH-CH_{2}-,
-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-,
-O-C(O)-NH-CH_{2}-,
-O-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-NH-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -O-C(O)-NH-[CH_{2}]_{h}-(OCH2CH2)_{j},-, grupo cicloalquilo bivalente, -O-, -S-, un aminoácido, -N (R^{6})-, y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, donde R^{6} es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, (h) es de cero a seis y (j) es cero a 20. Otros restos espaciadores específicos tienen las siguientes estructuras: -C(O-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)- y -O-C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, en las que los valores en subíndice después de cada metileno indican el número de metilenos contenidos en la estructura, por ejemplo, -(CH_{2})_{1-6} significa que la estructura puede contener 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 metilenos.
-O-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-NH-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -O-C(O)-NH-[CH_{2}]_{h}-(OCH2CH2)_{j},-, grupo cicloalquilo bivalente, -O-, -S-, un aminoácido, -N (R^{6})-, y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, donde R^{6} es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, (h) es de cero a seis y (j) es cero a 20. Otros restos espaciadores específicos tienen las siguientes estructuras: -C(O-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)- y -O-C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, en las que los valores en subíndice después de cada metileno indican el número de metilenos contenidos en la estructura, por ejemplo, -(CH_{2})_{1-6} significa que la estructura puede contener 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 metilenos.
En el presente contexto de un aminoácido
incluido en las estructuras proporcionadas en este documento, se
debe recordar que el aminoácido está conectado al resto de la
estructura por uno, dos, tres o más sitios. Por ejemplo, se puede
producir un resto espaciador cuando se une un aminoácido al resto de
la molécula por dos uniones covalentes. Además, se puede producir
una estructura de ramificación cuando se une un aminoácido al resto
de la molécula por tres sitios. Por tanto, la estructura de
aminoácido cambia necesariamente ligeramente debido a la presencia
de una o más uniones covalentes (por ejemplo, la retirada de un
átomo de hidrógeno del aminoácido para alojar un enlace covalente).
En consecuencia, la referencia a un "aminoácido", por lo tanto,
incluye el aminoácido que contiene uno o más enlaces con otros
átomos. El aminoácido se puede seleccionar del grupo que consiste
en alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido
glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina,
lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina,
triptófano, tirosina y valina. Tanto las formas D como L de los
aminoácidos se
consideran.
consideran.
\newpage
La presente invención proporciona polímeros
solubles en agua que comprenden una funcionalidad orto éster. Como
se ha descrito anteriormente, tanto las formas acíclicas como
cíclicas de la funcionalidad orto éster están incluidas. A
continuación se muestran orto ésteres cíclicos ilustrativos de
polímeros solubles en agua de la invención:
\vskip1.000000\baselineskip
en las que (m) es de 2 a 4000, (a)
es cero o uno y X^{t}, cuando está presente, es un resto
espaciador. Por supuesto, también son posibles otros polímeros
solubles en agua que comprenden un resto orto éster y de acuerdo
con la presente
invención.
De acuerdo con los presentes métodos, se puede
preparar cualquier número de polímeros que lleven un ácido
carboxílico terminal o un éster del mismo y la invención no está
limitada en este aspecto. En consecuencia, la invención incluye
ácidos carboxílicos, tales como ácidos alcanoicos y los ésteres
correspondientes de un polímero formado por un método como se
proporciona en este documento.
Para cualquier ácido carboxílico dado se puede
formar el éster correspondiente usando técnicas convencionales. Por
ejemplo, el polímero soluble en agua que lleva un ácido carboxílico
terminal se puede someter a condensación catalizada por ácido con
un alcohol, proporcionando de este modo el éster correspondiente.
Una estrategia para conseguir esto es el uso del método denominado
comúnmente una reacción de esterificación de Fischer. Otras
técnicas para formar un éster deseado se conocen por los
especialistas de la técnica.
Además, el polímero soluble en agua que lleva un
ácido carboxílico terminal se puede modificar para formar derivados
reactivos útiles de ácidos alcanoicos usando metodología conocida en
la técnica. Por ejemplo, el ácido carboxílico se puede derivatizar
adicionalmente para formar haluros de acilo, pseudohaluros de acilo,
tales como acil cianuro, acil isocianato y acil acida, sales
neutras, tales como sales de metal alcalino o metal alcalinotérreo
(por ejemplo, sales de calcio, sodio y bario), ésteres, anhídridos,
amidas, imidas, hidrazidas y similares. En una realización
preferida, el ácido carboxílico se esterifica para formar un
N-succinimidil éster, o-, m-, o
p-nitrofenil éster, 1-benzotriazol éster,
imidazolil éster o N-sulfosuccinimidil éster. Por
ejemplo, el ácido carboxílico se puede convertir en el
N-succinimidil éster correspondiente haciendo
reaccionar el ácido carboxílico con diciclohexil carbodiimida (DCC)
o diisopropil carbodiimida (DIC) en presencia de una base.
Los polímeros que llevan un ácido carboxílico
terminal o un éster del mismo, así como cualquier intermedio en su
formación (por ejemplo, orto ésteres de polímeros solubles en agua),
se pueden almacenar en una atmósfera inerte, tal como con argón o
con nitrógeno. De este modo, los procesos potencialmente
degradativos asociados a, por ejemplo, oxígeno atmosférico, se
evitan o reducen completamente. En algunos casos, para evitar la
degradación oxidativa, se pueden añadir antioxidantes, tales como
hidroxil tolueno butilado (BHT), al producto final antes del
almacenamiento. Además, se prefiere minimizar la cantidad de humedad
asociada a las condiciones de almacenamiento para disminuir las
potenciales reacciones de daño asociadas a agua. Además, se prefiere
mantener las condiciones de almacenamiento en oscuridad para evitar
determinados procesos degradativos que implican luz. Por tanto, las
condiciones de almacenamiento preferidas incluyen una o más de las
siguientes: almacenamiento en argón seco u otro gas inerte seco;
almacenamiento a temperaturas inferiores a aproximadamente -15ºC;
almacenamiento en ausencia de luz; y almacenamiento con una
cantidad adecuada (por ejemplo, aproximadamente
50-500 partes por millón) de un antioxidante tal
como BHT.
Los polímeros que se han descrito anteriormente
que llevan un ácido carboxílico terminal, opcionalmente en una
forma activada, son útiles para la conjugación con agentes
biológicamente activos o superficies que comprenden al menos un
grupo adecuado para la reacción con un ácido carboxílico o la forma
activada opcional. Los grupos ejemplares adecuados para la reacción
con un ácido carboxílico incluyen grupos amino (por ejemplo, aminas
primarias), hidrazinas, hidrazidas y alcoholes. A menudo, el
polímero que lleva un resto ácido carboxílico terminal se puede
conjugar directamente con el agente o la superficie activa. Sin
embargo, en ocasiones es necesario formar una versión
"activada" del ácido carboxílico para aumentar la reactividad
del agente o la superficie biológicamente activa. Los métodos para
activar ácidos carboxílicos se conocen en la técnica e incluyen,
por ejemplo, disolver el polímero soluble en agua que lleva un ácido
carboxílico terminal en cloruro de metileno y añadir posteriormente
N-hidroxisuccinimida y
N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) para formar una
versión activada de N-succinimidil éster del ácido
carboxílico. Otras estrategias para activar un ácido carboxílico se
conocen por los especialistas en la
técnica.
técnica.
Típicamente, el polímero soluble en agua que
lleva el ácido carboxílico o el éster del mismo se añade al agente
activo o la superficie en una cantidad equimolar (con respecto al
número deseado de grupos adecuados para la reacción con el ácido
carboxílico o el éster del mismo) o en un exceso molar. Por ejemplo,
el polímero se puede añadir al agente activo diana con una
proporción molar de aproximadamente 1:1 (polímero: agente activo),
1,5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 8:1 ó 10:1. Se permite que la
reacción de conjugación avance hasta que no tenga lugar
sustancialmente ninguna conjugación adicional, lo que se puede
determinar generalmente controlando el progreso de la reacción a lo
largo del tiempo. El avance de la reacción se puede controlar
retirando alícuotas de la mezcla de reacción en diversos momentos y
analizando la mezcla de reacción por SDS-PAGE o
espectrometría de masa MALDI-TOF o cualquier otro
método analítico adecuado. Una vez que se ha alcanzado un nivel con
respecto a la cantidad de conjugado o la cantidad de polímero no
conjugado remanente, se asume que la reacción está completada.
Típicamente, la reacción de conjugación necesita de minutos a varias
horas (por ejemplo, de 5 minutos a 24 horas o más). La mezcla de
producto resultante preferiblemente, pero no necesariamente, se
purifica para separar el exceso de reactivos, los reactivos no
conjugados (por ejemplo, agente activo), especies
multi-conjugadas no deseadas y polímero libre o no
reaccionado. Los conjugados resultantes se pueden caracterizar
después adicionalmente usando métodos analíticos tales como MALDI,
electroforesis capilar, electroforesis en gel y/o cromatografía.
Con respecto a conjugados de
polímero-agente activo, los conjugados se pueden
purificar para obtener/aislar diferentes especies conjugadas.
Alternativamente, y más preferiblemente para polímeros de menor peso
molecular (por ejemplo, menos de aproximadamente 20 kiloDalton, más
preferiblemente menos de aproximadamente 10 kiloDalton), la mezcla
de productos se puede purificar para obtener la distribución de
segmentos de polímero soluble en agua por agente activo. Por
ejemplo, la mezcla de producto se puede purificar para obtener un
promedio de uno a cinco PEG por agente activo (por ejemplo,
proteína), típicamente un promedio de aproximadamente 3 PEG por
agente activo (por ejemplo, proteína). La estrategia para la
purificación de la mezcla de reacción de conjugado final dependerá
de varios factores, incluyendo, por ejemplo, el peso molecular del
polímero empleado, el agente activo particular, el protocolo de
dosificación deseado y la actividad residual y las propiedades
in vivo del conjugado o los conjugados
individuales.
individuales.
Si se desea, se pueden aislar conjugados que
tengan diferentes pesos moleculares usando cromatografía de
filtración en gel. Es decir, la cromatografía de filtración en gel
se usa para fraccionar proporciones de polímero a agente activo
numeradas de formas diferentes (por ejemplo, 1-mero,
2-mero, 3-mero, etc., donde
"1-mero" indica 1 polímero a agente activo,
"2-mero" indica 2 polímeros a agente activo,
etcétera), basándose en sus pesos moleculares diferentes (donde la
diferencia se corresponde esencialmente al peso molecular promedio
de los segmentos de polímero soluble en agua). Por ejemplo, en una
reacción ejemplar donde una proteína de 100 kDa se conjuga de forma
aleatoria con un ácido alcanoico de PEG que tiene un peso molecular
de aproximadamente 20 kDa, la mezcla de reacción resultante
contendrá probablemente proteína modificada (PM 100 kDa), proteína
mono-pegilada (PM 120 kDa), proteína
di-pegilada (PM 140 kDa), etcétera. Mientras que
esta estrategia se puede usar para separar PEG y otros conjugados
poliméricos que tienen diferentes pesos moleculares, esta estrategia
es generalmente ineficaz para separar isómeros posicionales que
tengan diferentes sitios de unión al polímero dentro de la
proteína. Por ejemplo, se puede usar cromatografía de filtración en
gel para separar entre sí mezclas de PEG 1-mero,
2-mero, 3-mero, etc., aunque cada
una de las composiciones de PEG-mero recuperadas
puede contener PEG unidos a diferentes grupos amino reactivos (por
ejemplo, restos lisina) dentro del agente activo.
Las columnas de filtración en gel adecuadas para
realizar este tipo de separación incluyen Superdex^{TM} y
Sephadex^{TM} disponibles en Amersham Biosciences (Piscataway,
NJ). La selección de una columna particular dependerá del intervalo
de fraccionamiento deseado. La elución se realiza generalmente
usando un tampón adecuado, tal como fosfato, acetato o similares.
Las fracciones recogidas se pueden analizar por varios métodos
diferentes, por ejemplo, (i) densidad óptica (OD) a 280 nm para
contenido de proteína, (ii) análisis proteico de albúmina sérica
bovina (BSA), (iii) ensayo de yodo para contenido de PEG [Sims et
al. (1980) Anal. Biochem, 107: 60-63] y (iv)
electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico
(SDS PAGE), seguido de tinción con yoduro de bario.
La separación de isómeros posicionales se
realiza por cromatografía de fase inversa usando una columna C18 de
cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa
(RP-HPLC) (Amersham Biosciences o Vydac) o por
cromatografía de intercambio iónico usando una columna de
intercambio iónico, por ejemplo, una columna de intercambio iónico
Sepharose^{TM} disponible en Amersham Biosciences. Se puede usar
cualquier estrategia para separar isómeros de
polímero-agente activo que tengan el mismo peso
molecular (isómeros posicionales).
Después de la conjugación, y opcionalmente
etapas de separación adicionales, la mezcla de conjugado se puede
concentrar, filtrar a esterilidad y almacenar a una temperatura
baja, típicamente de aproximadamente -20ºC a aproximadamente -80ºC.
Alternativamente, el conjugado se puede liofilizar, con o sin tampón
residual y almacenar como un polvo liofilizado. En algunos casos es
preferible intercambiar un tampón usado para conjugación, tal como
acetato sódico, por un tampón volátil, tal como carbonato de amonio
o acetato de amonio, que se pueda retirar fácilmente durante la
liofilización, de tal forma que el polvo liofilizado esté
completamente ausente del tampón residual. Alternativamente se
puede usar una etapa de intercambio de tampón usando un tampón de
formulación, de tal forma que el conjugado liofilizado esté en una
forma adecuada para la reconstitución en un tampón de formulación
y, finalmente, para administración a un mamífero.
Los polímeros solubles en agua que llevan un
ácido carboxílico o éster del mismo presentados en este documento
se puede unir, covalentemente o no covalentemente, a varias
entidades, incluyendo películas, superficies de separación y
purificación química, soportes sólidos, superficies metálicas, tales
como oro, titanio, tantalio, niobio, aluminio, acero y sus óxidos,
óxido de silicio, macromoléculas (por ejemplo, proteínas,
polipéptidos, etcétera) y moléculas pequeñas. Adicionalmente, los
polímeros también se pueden usar en sensores bioquímicos,
conmutadores bioelectrónicos y compuertas. Los polímeros también se
pueden emplear como vehículos para síntesis peptídica, para la
preparación de superficies recubiertas con polímero e injertos de
polímero para preparar conjugados de
polímero-ligando para reparto por afinidad, para
preparar hidrogeles reticulados o no reticulados y para preparar
aductos de polímero-cofactor para biorreactores.
Un agente biológicamente activo para el uso en
el acoplamiento a un polímero como se presenta en este documento
puede ser uno cualquier o más de los siguientes. Los agentes
adecuados se pueden seleccionar de, por ejemplo, hipnóticos y
sedantes, psicotónicos, tranquilizantes, fármacos respiratorios,
anticonvulsivantes, relajantes musculares, agentes antiparkinson
(antagonistas de dopamina), analgésicos, antiinflamatorios, fármacos
antiansiedad (ansiolíticos), supresores del apetito, agentes
antimigraña, contractores musculares, antiinfecciosos (antibióticos,
antivirales, antifúngicos, vacunas) antiartríticos, antimaláricos,
antieméticos, antiepilépticos, broncodilatadores, citoquinas,
factores de crecimiento, agentes anticancerosos, agentes
antitrombóticos, antihipertensivos, fármacos cardiovasculares,
antiarrítmicos, antioxidantes, agentes antiasmáticos, agentes
hormonales incluyendo anticonceptivos, simpaticomiméticos,
diuréticos, agentes de regulación de lípidos, agentes
antiandrogénicos, antiparasitarios, anticoagulantes, neoplásicos,
antineoplásicos, hipoglucémicos, agentes nutricionales y
suplementos, suplementos de crecimiento, agentes antienteritis,
vacunas, anticuerpos, agentes de diagnóstico y agentes de
contraste.
Más particularmente, el agente activo puede
entrar dentro de una de varias clases estructurales, incluyendo,
pero sin limitación, moléculas pequeñas (preferiblemente moléculas
pequeñas insolubles), péptidos, polipéptidos, proteínas,
polisacáridos, esteroides, nucleótidos, oligonucleótidos,
polinucleótidos, grasas, electrolitos y similares. Preferiblemente,
un agente activo para el acoplamiento a un polímero como se describe
en este documento posee un grupo amino nativo o, alternativamente,
está modificado para contener al menos un grupo amino reactivo
adecuado para la conjugación con un polímero descrito en este
documento.
Los ejemplos específicos de agentes activos
adecuados para la unión covalente incluyen, pero sin limitación,
aspariginasa, amdoxovir (DAPD), antida, becaplermin, calcitoninas,
cianovirina, denileucina diftitox, eritropoyetina (EPO), agonistas
de EPO (por ejemplo, péptidos de aproximadamente
10-40 aminoácidos de longitud y que comprenden una
secuencia núcleo particular como se describe en el documento WO
96/40749), dornasa alfa, proteína estimulante de eritropoyesis
(NESP), factores de coagulación tales como Factor V, Factor VII,
Factor VIIa, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XII, Factor
XIII, factor von Willebrand; ceredasa, cerezima,
alfa-glucosidasa, colágeno, ciclosporina,
defensinas alfa, defensinas beta, exedina-4, factor
estimulador de colonias de granulocitos (GCSF), trombopoyetina
(TPO), inhibidor de alfa-1 proteinasa, elcatonina,
factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos
(GMCSF), fibrinógeno, filgrastima, hormonas de crecimiento, hormona
de crecimiento humana (hGH), hormona liberadora de hormona de
crecimiento (GHRH), GRO-beta, anticuerpo de
GRO-beta, proteínas morfogénicas óseas, tales como
proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 6,
OP-1; factor de crecimiento de fibroblastos ácido,
factor de crecimiento de fibroblasto básico, ligando de
CD-40, heparina, albúmina sérica humana, heparina
de bajo peso molecular (LMWH), interferones tales como interferón
alfa, interferón beta, interferón gamma, interferón omega,
interferón tau, interferón de consenso; interleucinas y receptores
de interleucina tales como receptor de
interleucina-1, interleucina-2,
proteínas de fusión de interleucina-2, antagonista
del receptor de interleucina-1,
interleucina-3, interleucina-4,
receptor de interleucina-4,
interleucina-6, interleucina-8,
interleucina-12, receptor de
interleucina-13, receptor de
interleucina-17; lactoferrina y fragmentos de
lactoferrina, hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH),
insulina, pro-insulina, análogos de insulina (por
ejemplo, insulina mono-acilada como se describe en
la Patente de Estados Unidos Nº 5.922.675), amilina, péptido C,
somatostatina, análogos de somatostatina incluyendo ocreotida,
vasopresina, hormona folículo estimulante (FSH), vacuna de
influenza, factor de crecimiento similar a insulina (IGF),
insulintropina, factor estimulador de colonias de macrófagos
(M-CSF), activadores de plasminógeno tales como
alteplasa, uroquinasa, reteplasa, estreptoquinasa, pamiteplasa,
lanoteplasa y teneteplasa; factor de crecimiento de nervios (NGF),
osteoprotegerina, factor de crecimiento derivado de plaquetas,
factores de crecimiento tisular, factor de crecimiento
transformante 1, factor de crecimiento de endotelio vascular, factor
inhibidor de leucemia, factor de crecimiento de queratinocitos
(KGF), factor de crecimiento glial (GGF), receptores de células T,
moléculas/antígenos de CD, factor de necrosis tumoral (TNF),
proteína quimiotáctica de monocitos 1, factores de crecimiento
endotelial, hormona paratiroidea (PTH), péptido similar a glucagón,
somatotropina, timosina alfa 1, rasburicasa, inhibidor de timosina
alfa 1 IIb/IIIa, timosina beta 10, timosina beta 9, timosina beta 4,
antitripsina alfa-1, compuestos fosfodiesterasa
(PDE), VLA-4 (antígeno muy tardío 4), inhibidores de
VLA-4, bisfosfonatos, anticuerpo de virus sincitial
respiratorio, gen regulador transmembrana de fibrosis quística
(CFTR), desoxirribonucleasa (Adnasa), proteína aumentadora de
permeabilidad/bactericida (BPI) y anticuerpo
anti-CMV. Los anticuerpos monoclonales ilustrativos
incluyen etanercept (una proteína de fusión dimérica que consiste en
la parte de unión a ligando extracelular del receptor de TNF de 75
kD unido a la parte Fc de lgG1), abciximab, afeliomomab,
basiliximab, daclizumab, infliximab, ibritumomab tiuexetano,
mitumomab, muromonab-CD3, conjugado de yodo
131-tositumomab, olizumab, rituximab, trastuzumab
(herceptina) y adalimumab.
Los agentes adicionales adecuados para la unión
covalente incluyen, pero sin limitación, adefovir, alosetrón,
amifostina, amiodarona, ácido aminocapróico, aminohipurato sódico,
aminoglutetimida, ácido aminolevulínico ácido aminosalicílico,
amsacrina, anagrelida, anastrozol, aripiprazol, asparaginasa,
antraciclinas, bexaroteno, bicalutamida, bleomicina, buserelina,
busulfán, cabergolina, capecitabina, carboplatino, carmustina,
clorambucina, cilastatina sódica, cisplatino, cladribina,
clodronato, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, camptotecinas,
ácido 13-cis retinoico; ácido todo trans retinoico,
dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, deferoxamina,
dexametasona, diclofenaco, dietilstilbestrol, docetaxel,
doxorrubicina, dutasterida, epirrubicina, estramustina, etopósido,
exemestano, ezetimiba, fexofenadina, fludarabina, fludrocortisona,
fluorouracilo, fluoximesterona, flutamida, fondaparinux,
fulvestrant, gamma-hidroxibutirato, gemcitabina,
epinefrina, L-Dopa, hidroxiurea, idarrubicina,
ifosfamida, imatinib, irinotecano, itraconazol, goserelina,
letrozol, leucovorina, levamisol, lisinoprilo, lovotiroxina sódica,
lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalano,
mercaptopurina, bitartrato de metaraminol, metotrexato,
metoclopramida, mexiletina, mitomicina, mitotano, mitoxantrona,
naloxona, nicotina, nilutamida, nitisinona, ocreotida,
oxaliplatino, pamidronato, pentostatina, plicamicina, porfímero,
prednisona, procarbazina, proclorperazina, ondansetrón,
oxaliplatino, raltitrexed, sirolimo, estreptozocina, tacrolimo,
pimecrolimo, tamoxifeno, tegaserod, temozolomida, tenipósido,
testosterona, tetrahidrocannabinol, talidomida, tioguanina,
tiotepa, topotecano, treprostinilo, tretinoína, valdecoxib,
celecoxib, rofecoxib, valrrubicina, vinblastina, vincristina,
vindesina, vinorelbina, voriconazol, dolasetrón, granisetrón;
formoterol, fluticasona, leuprolida, midazolam, alprazolam,
anfotericina B, podofilotoxinas, antivirales nucleósidos,
hidrazonas de aroilo, sumatriptán; macrólidos tales como
eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, roxitromicina,
claritromicina, davercina, acitromicina, fluritromicina,
diritromicina, josamicina, espiramicina, midecamicina, loratadina,
desloratadina, leucomicina, miocamicina, rokitamicina,
andazitromicina y swinolida A; fluoroquinolinas tales como
ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, trovafloxacina,
alatrofloxacina, moxifloxicina, norfloxacina, enoxacina,
grepafloxacina, gatifloxacina, lomefloxacina, esparfloxacina,
temafloxacina, pefloxacina, amifloxacina, fleroxacina,
tosufloxacina, prulifloxacina, irloxacina, pazufloxacina,
clinafloxacina y sitafloxacina; aminoglucósidos tales como
gentamicina, netilmicina, paramicina, tobramicina, amikacina,
kanamicina, neomicina y estreptomicina, vancomicina, teicoplanina,
ramopolanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina,
colistimetato; polimixinas tales como polimixina B, capreomicina,
bacitracina, penemos; penicilinas incluyendo agentes sensibles a
penicilasa como penicilina G, penicilina V; agentes resistentes a
penicilasa como meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina,
floxacilina, nafcilina; agentes activos de microorganismos gram
negativos como ampicilina, amoxicilina y hetacilina, cilina y
galampicilina; penicilinas antipseudomonas como carbenicilina,
ticarcilina, azlocilina, mezlocilina y piperacilina; cefalosporinas
como cefpodoxima, cefprozil, ceftbuteno, ceftizoxima, ceftriaxona,
cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefadrina, cefoxitina,
cefamandol, cefazolina, cefaloridina, cefaclor, cefadroxilo,
cefaloglicina, cefuroxima, ceforanida, cefotaxima, cefatrizina,
cefacetrila, cefepima, cefixima, cefonicida, cefoperazona,
cefotetano, cefmetazol, ceftazidima, loracarbef y moxalactamo,
monobactamos como aztreonam; y carbapenemos tales como imipenem,
meropenem y ertapenem, isetionato de pentamidina, sulfato de
albuterol, lidocaína, sulfato de metaproterenol, diprepionato de
beclometasona, acetamida de triamcinolona, acetonida de budesonida,
fluticasona, bromuro de ipratropio, flunisolida, cromolina sódica y
tartrato de ergotamina; taxanos tales como paclitaxel;
SN-38 y tirfostinas.
Las moléculas pequeñas preferidas para el
acoplamiento a un polímero como se describen en este documento son
las que tienen al menos un grupo amino de origen natural. Las
moléculas preferidas como tales incluyen aminohipurato sódico,
amfotericina B, doxorrubicina, ácido aminocaproico, ácido
aminolevulínico, ácido aminosalicílico, bitartrato de metaraminol,
pamidronato disósidco, daunorrubicina, levotiroxina sódica,
lisinopril, cilastatina sódica, mexiletina, cefalexina,
deferoxamina y amifostina.
Los péptidos o las proteínas preferidas para el
acoplamiento a un polímero como se describen en este documento
incluyen EPO, IFN-\alpha,
IFN-\beta, IFN de consenso, Factor VIII, Factor
IX, GCSF, GMCSF, hGH, insulina, FSH y PTH.
Los anteriores agentes biológicamente activos
ejemplares incluyen, cuando sea aplicable, análogos, agonistas,
antagonistas, inhibidores, isómeros y sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos. Con referencia a péptidos y proteínas, la
invención tiene por objeto incluir formas sintéticas, recombinantes,
nativas, glicosiladas y no glicosiladas, así como fragmentos
biológicamente activos de los mismos.
La presente invención también incluye
preparaciones farmacéuticas que comprenden un conjugado como se
proporciona en este documento en combinación con un excipiente
farmacéutico. Generalmente, el propio conjugado estará en una forma
sólida (por ejemplo, un precipitado), que se puede combinar con un
excipiente farmacéutico adecuado que puede estar en forma sólida o
líquida.
Los excipientes ejemplares incluyen, pero sin
limitación, los seleccionados del grupo que consiste en
carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos,
antioxidantes, tensioactivos, tampones, ácidos, bases y
combinaciones de los mismos.
Un carbohidrato tal como un azúcar, un azúcar
derivatizado tal como un alditol, ácido aldónico, un azúcar
esterificado y/o un polímero de azúcar pueden estar presentes como
un excipiente. Los excipientes de carbohidratos específicos
incluyen, por ejemplo: monosacáridos, tales como fructosa, maltosa,
galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares;
disacáridos tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y
similares; polisacáridos tales como rafinosa, melezitosa,
maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales
como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol
(glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol y similares.
El excipiente también puede incluir una sal
inorgánica o un tampón tal como ácido cítrico, cloruro sódico,
cloruro potásico, sulfuro sódico, nitrato potásico, fosfato sódico
monobásico, fosfato sódico dibásico y combinaciones de los
mismos.
La preparación también puede incluir un agente
antimicrobiano para evitar o impedir crecimiento microbiano. Los
ejemplos no limitantes de agentes antimicrobianos adecuados para la
presente invención incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de
bencetonio, alcohol benzilo, cloruro de cetilpiridinio, clorbutanol,
fenol, alcohol feniletilo, nitrato de fenilmercurio, timersol y
combinaciones de los mismos.
Un antioxidante también puede estar presente en
la preparación. Los antioxidantes se usan para evitar la oxidación,
evitando de este modo el deterioro del conjugado u otros componentes
de la preparación. Los antioxidantes adecuados para el uso en la
presente invención incluyen, por ejemplo, ascorbil palmitato,
hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido
hipofosfórico, monotioglicerol, propil galato, bisulfito sódico,
sulfoxilato de formaldehído sódico, metabisulfito sódico y
combinaciones de los mismos.
Un tensioactivo puede estar presente como un
excipiente. Los tensioactivos ejemplares incluyen: polisorbatos,
tales como "Tween 20" y "Tween 80" y pluronics tales como
F68 y F88 (que están ambos disponibles en BASF, Mount Olive, New
Jersey); ésteres de sorbitán, lípidos, tales como fosfolípidos tales
como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas
(aunque preferiblemente no en forma liposomal), ácidos grasos y
ésteres grasos; esteroides, tales como colesterol; y agentes
quelantes, tales como EDTA, zinc y otros cationes adecuados de este
tipo.
Los ácidos o las bases pueden estar presentes
como un excipiente en la preparación. Los ejemplos no limitantes de
ácidos que se pueden usar incluyen los ácidos seleccionados del
grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido
fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido
fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico,
ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico y combinaciones de
los mismos. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen, pero sin
limitación, bases seleccionadas del grupo que consiste en hidróxido
sódico, acetato sódico, hidróxido de amonio, hidróxido potásico,
acetato de amonio, acetato potásico, fosfato sódico, fosfato
sódico, fosfato potásico, citrato sódico, formato sódico, sulfato
sódico, sulfato potásico, fumerato potásico y combinaciones de los
mismos.
Las preparaciones farmacéuticas incluyen todos
los tipos de formulaciones y en particular las que son adecuadas
para inyección, por ejemplo, polvos que se pueden reconstituir así
como suspensiones y soluciones. La cantidad del conjugado (es
decir, el conjugado formado entre el agente activo y el polímero que
se describe en este documento) en la composición variará
dependiendo de varios factores, pero óptimamente será una dosis
terapéuticamente eficaz cuando la composición se almacena en un
recipiente de dosis unitaria (por ejemplo, un vial). Además, la
preparación farmacéutica se puede alojar en una jeringa. Una dosis
terapéuticamente eficaz se puede determinar experimentalmente
mediante administración repetida de cantidades crecientes del
conjugado para determinar qué cantidad produce un criterio de
valoración clínicamente deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual
en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente
y las necesidades particulares de la composición. Típicamente, la
cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina por
experimentación de rutina, es decir, preparando composiciones que
contienen cantidades variables del excipiente (que varían de bajas
a altas) examinando la estabilidad y otros parámetros y determinando
después el intervalo en el que se consigue un rendimiento óptimo
sin efectos adversos significativos.
Sin embargo, generalmente, el excipiente estará
presente en la composición en una cantidad de aproximadamente el 1%
a aproximadamente el 99% en peso, preferiblemente de aproximadamente
el 5%-98% en peso, más preferiblemente de aproximadamente el
15-95% en peso del excipiente, prefiriéndose
concentraciones inferiores al 30% en peso.
Estos anteriores excipientes farmacéuticos junto
con otros excipientes se describen en "Remington: The Science
& Practice of Pharmacy", 19ª ed., Williams & Williams,
(1995), la "Physician's Desk Reference", 52ª ed., Medical
Economics, Montvale, NJ (1998) y Kibbe, A. H., Handbook of
Pharmaceuticals Excipients, 3ª Edición, American Pharmaceutical
Association, Washington, D.C., 2000.
Las preparaciones farmacéuticas de la presente
invención se administran típicamente, aunque no necesariamente,
mediante inyección y por lo tanto, son generalmente soluciones o
suspensiones líquidas inmediatamente antes de la administración. La
preparación farmacéutica también puede adoptar otras formas tales
como jarabes, cremas, pomadas, comprimidos, polvos y similares.
Otros modos de administración también están incluidos, tales como
pulmonar, rectal, transdérmica, transmucosa, oral, intratecal,
subcutánea, intra-arterial, etcétera.
Como se ha descrito anteriormente, los
conjugados se pueden administrar inyectados por vía parenteral por
inyección intravenosa, o menos preferiblemente, por inyección
intramuscular o por inyección subcutánea. Los tipos de formulación
adecuados para la administración parenteral incluyen soluciones
preparadas para la inyección, polvos secos para la combinación con
un disolvente antes del uso, suspensiones preparadas para la
inyección, composiciones insolubles secas para la combinación con
un vehículo antes del uso y emulsiones y concentrados de líquido
para dilución antes de la administración, entre otros.
La invención también proporciona un método para
la administración de un conjugado como se proporciona en este
documento a un paciente que padece una afección que responde a
tratamiento con el conjugado. El método comprende administrar,
generalmente por inyección, una cantidad terapéuticamente eficaz del
conjugado (preferiblemente proporcionado como parte de una
preparación farmacéutica). El método de administración se puede usar
para tratar cualquier afección que se pueda remediar o prevenir
mediante la administración del conjugado particular. Los
especialistas en la técnica entenderán qué condiciones puede tratar
eficazmente un conjugado específico. La dosis real que se tiene que
administrar variará dependiendo de la edad, el peso y el estado
general del sujeto, así como la gravedad de la afección que se está
tratando, el juicio del profesional de asistencia sanitaria y el
conjugado que se está administrando. Los especialistas en la técnica
conocen cantidades terapéuticamente eficaces y/o se describen en
los textos de referencia y la bibliografía pertinente. Generalmente,
una cantidad terapéuticamente eficaz variará de aproximadamente de
0,001 mg a 100 mg, preferiblemente en dosis de 0,01 mg/día a 75
mg/día y más preferiblemente en dosis de 0,10 mg/día a 50
mg/día.
Las dosificaciones unitarias de cualquier
conjugado dado (de nuevo, proporcionadas preferiblemente como parte
de una preparación farmacéutica) se pueden administrar en una
diversidad de protocolos de dosificación dependiendo del juicio del
clínico, las necesidades del paciente, etc. El protocolo de
dosificación específico se conocerá por los especialistas en la
técnica o se puede determinar experimentalmente usando métodos de
rutina. Los protocolos de dosificación ejemplares incluyen, pero
sin limitación, la administración cinco veces al día, cuatro veces
al día, tres veces al día, dos veces diariamente, una vez
diariamente, tres veces semanalmente, dos veces semanalmente, una
vez semanalmente, dos veces al mes, una vez al mes y cualquier
combinación de los mismos. Una vez que se haya conseguido el
criterio de valoración clínico, la dosificación de la composición
se detiene.
Una ventaja de la administración de los
conjugados de la presente invención es que se pueden escindir partes
individuales de polímero soluble en agua. Un resultado de este tipo
es ventajoso cuando el aclaramiento del cuerpo es potencialmente un
problema debido al tamaño del polímero. Óptimamente, la escisión de
cada parte de polímero soluble en agua se facilita mediante el uso
de enlaces fisiológicamente escindibles y/o enzimáticamente
degradables tales como enlaces uretano, amida, carbonato o que
contienen éster. De este modo, el aclaramiento del conjugado (por
escisión de partes individuales de polímero soluble en agua) se
puede modular seleccionando el tamaño molecular del polímero y el
tipo de grupo funcional que proporcionaría las propiedades de
aclaramiento deseadas. El especialista en la técnica puede
determinar el tamaño molecular apropiado del polímero así como el
grupo funcional de escisión. Por ejemplo, el especialista en la
técnica, usando experimentación de rutina, puede determinar un
tamaño molecular apropiado y el grupo funcional escindible
preparando en primer lugar una diversidad de derivados poliméricos
con diferentes pesos de polímero y grupos funcionales escindibles y
obteniendo de después el perfil de aclaramiento (por ejemplo, por
muestreo periódico de sangre u orina) administrando el derivado
polimérico a un paciente y tomando muestras periódicas de sangre y/u
orina. Una vez que se ha obtenido una serie de perfiles de
aclaramiento para cada conjugado ensayado se puede identificar un
conjugado adecuado.
Se tiene que entender que mientras que la
invención se ha descrito en relación a las realizaciones específicas
preferidas de la misma, la anterior descripción así como la parte
experimental que sigue tienen por objeto ilustrar y no limitar el
alcance de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones
dentro del alcance de la invención serán evidentes para los
especialistas en la técnica a la que se refiere la invención.
La práctica de la invención empleará, a menos
que se indique de otro modo, técnicas convencionales de síntesis
orgánica y similares, que se comprenden por el especialista en la
técnica y se explican en la bibliografía. En los siguientes
ejemplos se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con
respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades,
temperaturas, etcétera), pero se puede producir cierto error
experimental y desviación. A menos que se indique de otro modo, la
temperatura es en grados Celsius y la presión es o prácticamente
presión atmosférica al nivel del mar. Todos los reactivos se
obtuvieron del mercado al menos que se indique de otro modo. Todas
las RMN se obtuvieron de un espectrómetro de RMN de 300 ó 400 Mhz
fabricado por Bruker (Billerica, MA). La referencia a un "orto
éster de OBO" se corresponde a ésteres que comprenden el
4-metil-2,6,7-trioxabicilo[2.2.2]octanoilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se disolvió
3-metil-3-hidroximetiloxetano
(10,2 g, 0,1 mol) (Sigma-Aldrich Corporation, St.
Louis, MO) en diclorometano anhidro (200 ml). Después, a la
solución se le añadió piridina (9,8 ml, 0,12 mol). Después, la
solución se enfrió a 0ºC y se añadió gota a gota cloruro de
4-bromobutirilo (18,5 g, 0,1 mol) (Sigma Aldrich
Corporation, St. Louis, MO) disuelto en diclorometano anhidro (50
ml) durante 20 minutos. La mezcla se agitó durante una noche en una
atmósfera de argón. Después, la mezcla de reacción se lavó con agua
y se secó con sulfato de magnesio anhidro. Después, el disolvente
se retiró por destilación a presión reducida. Rendimiento de 23,6
g. RMN (d_{6}-DMSO): 1,26 ppm (s, 3H), 2,07 ppm
(m, 2H), 2,51 ppm (t, 2H), 3,56 ppm (t, 2H), 4,14 ppm (s, 2H), 4,24
ppm (d, 2H), 4,38 ppm (d, 2H).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El producto del Ejemplo 1
(4-bromobutirato éster de
3-metil-3-hidroximetiloxetano
en bruto, 20,1 g, 0,08 mol) se disolvió en diclorometano anhidro
(100 ml), la solución se enfrió a 0ºC y se añadió dietileterato de
trifluoruro de boro (2,5 ml, 0,022 mol). Después, la mezcla se
agitó durante cuatro horas a 0ºC. Se añadió trietilamina (12 ml),
la mezcla se agitó durante 15 minutos y el disolvente se retiró por
destilación a presión reducida. El producto en bruto se disolvió en
éter etílico (180 ml) y después la solución se filtró para retirar
las impurezas sólidas. Después, el éter se retiró por destilación y
el producto se destiló a presión reducida (tubo de bolas,
110-115ºC, 0,05 mm de Hg). Rendimiento de 15,0 g.
RMN (d_{6}-DMSO): 0,74 ppm (s, 3H), 1,68 ppm (m,
2H), 1,88 ppm (m, 2H), 3,52 ppm (t, 2H), 3,81 ppm (s, 6H).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Una mezcla de etilenglicol anhidro (120 g, 1,93
mol), una solución 1,0 M de terc-butóxido potásico
en terc-butanol (70 ml, 0,070 mol) y el producto
del Ejemplo 2
[1-(3-bromopropil)-4-metil-2,6,7-trioxabiciclo[2,2,2]octano
(15 g, 0,060 mol)] se agitó durante una noche a 70ºC en una
atmósfera de argón. Después de enfriar a temperatura ambiente, la
mezcla de reacción se añadió a 600 ml de agua destilada. El producto
se extrajo tres veces con diclorometano (150 ml, 125 ml y 125 ml).
Los extractos combinados se secaron con sulfato de magnesio anhidro
y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida.
Después, el producto (Compuesto 1) se sometió a destilación al
vacío (tubo de bolas, t = 120-130ºC, 0,05 mm de Hg).
Rendimiento de 6,2 g. RMN (d_{6}-DMSO): 0,74 ppm
(s, 3H), 1,59 ppm (m, 4H), 3,34 ppm (m, 4H), 3,45 ppm (t, 2H), 3,80
ppm (s, 6H), 4,54 ppm (t, 1H).
Esquemáticamente, la reacción puede
representarse como se indica a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se añadió gota a gota acrilato de
terc-butilo (130 g, 1,01 mol) durante 3 horas a una
mezcla de etilenglicol anhidro (62 g, 1,0 mol), bromuro de
tetrabutilamonio (9,6 g) y KOH (en polvo, 2,2 g) y la mezcla se
agitó durante una noche a temperatura ambiente en una atmósfera de
argón. Los productos volátiles se retiraron por destilación a
presión reducida (evaporador rotatorio, 60ºC) y la mezcla se
disolvió en 250 ml de diclorometano. La solución se lavó con 250 ml
de agua destilada, se secó con sulfato de magnesio anhidro y el
disolvente se retiró por destilación a presión reducida. Después,
el producto (Compuesto 2) se sometió a destilación al vacío (tubo
de bolas, t = 95-100ºC, 0,05 mm de Hg). Rendimiento
de 36,6 g. RMN (d_{6}-DMSO): 1,40 ppm (s, 9H),
2,42 ppm (t, 2H), 3,39 ppm (m, 2H), 3,46 ppm (m, 2H), 3,59 ppm (s,
2H), 4,55 ppm (t, 1H).
Esquemáticamente, la reacción puede
representarse como se indica a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla del Compuesto 2 (36,6 g, 0,19 mol),
piridina (52 ml, 0,64 mol), anhídrido acético (52 ml, 0,55 mol) y
dimetilaminopiridina (DMAP, 1,0 g) se agitó durante una noche a
temperatura ambiente. Después, los productos volátiles se retiraron
por destilación a presión reducida (evaporador rotatorio, t = 65ºC)
y el producto (Compuesto 3) se sometió a destilación al vacío (tubo
de bolas, 100-110ºC, 0,05 mm de Hg). Rendimiento de
40,9 g. RMN (d_{6}-DMSO): 1,40 ppm (s, 9H), 2,02
ppm (s, 3H), 2,42 ppm (t, 2H), 3,58 ppm (m a, 4H), 4,08 ppm (m,
2H).
Esquemáticamente, la reacción puede
representarse como se indica a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Al Compuesto 3 (30,0 g, 0,19 mol) se le añadió
ácido trifluoroacético (40 ml) y la solución se agitó durante 1
hora a temperatura ambiente. Después, los productos volátiles se
retiraron por destilación a presión reducida (evaporador rotatorio,
t = 60ºC) y el producto se disolvió en 400 ml de diclorometano. La
solución se lavó dos veces con una solución al 5% de NaCl, se secó
con sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se retiró por
destilación a presión reducida para proporcionar el Compuesto 4.
Rendimiento de 19,1 g. RMN (d_{6}-DMSO): 2,01 ppm
(s, 3H), 2,44 ppm (t, 2H), 3,57 ppm (m, 2H), 3,61 ppm (t, 2H) 4,09
ppm (m, 2H).
Esquemáticamente, la reacción puede
representarse como se indica a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución del Compuesto 4 (19,1 g, 0,108
mol) se le añadieron
3-metil-3-hidroxioxetano
(17,6 g, 0,172 mol), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt,
1,6 g) y DMAP (3,6 g) en diclorometano anhidro (500 ml), junto con
1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC, solución 1,0 M
en diclorometano, 114 ml, 0,114 mol) a 0ºC y la mezcla se agitó
durante una noche a temperatura ambiente. Después, la mezcla se
filtró para retirar la 1,3-diciclohexilurea
precipitada y la solución se lavó con 250 ml de H_{3}PO_{4} al
5%. Después, el diclorometano se retiró por destilación a presión
reducida (evaporador rotatorio) y el producto (Compuesto 5) se
sometió a destilación al vacío (tubo de bolas,
125-135ºC, 0,05 mm de Hg). Rendimiento de 18,5 g.
RMN (d_{6}-DMSO): 1,26 ppm (s, 3H), 2,00 ppm (s,
3H), 2,59 ppm (t, 2H), 3,57 ppm (m, 2H), 3,66 ppm (t, 2H), 4,08 ppm
(m, 2H), 4,14 ppm (s, 2H), 4,23 ppm (d, 2H), 4,38 ppm (d, 2H).
Esquemáticamente, la reacción puede
representarse como se indica a continuación:
Después, el compuesto 5 (15,0 g, 0,08 mol) se
disolvió en diclorometano anhidro (75 ml), la solución se enfrió a
0ºC y se añadió dietileterato de trifluoruro de boro (1,65 ml).
Después, la mezcla se agitó durante 3 horas a 0ºC. Se añadió
trietilamina (7,5 ml), la mezcla se agitó durante 10 minutos y el
disolvente se retiró por destilación a presión reducida. El
producto en bruto (Compuesto 6) se disolvió en éter etílico (150 ml)
y la solución se filtró para retirar las impurezas sólidas.
Después, el éter se retiró por destilación. Rendimiento de 12,9 g.
RMN (d_{6}-DMSO): 0,74 ppm (s, 3H), 1,83 ppm (t,
2H), 2,00 ppm (s, 3H), 3,46 ppm (t, 2H), 3,52 ppm (m, 2H), 3,80 ppm
(s, 2H), 3,52 ppm (t, 6H), 4,07 ppm (m, 2H).
Esquemáticamente, la reacción puede
representarse como se indica a continuación:
Una mezcla del compuesto 6 (12 g), alcohol
etílico (80 ml) y una solución acuosa al 50% de hidróxido potásico
(8 g) se agitó durante 40 minutos a temperatura ambiente. Después,
el disolvente se retiró por destilación a presión reducida
(evaporador rotatorio). El producto en bruto se disolvió en 400 ml
de diclorometano y la solución se lavó con una solución acuosa al
5% de cloruro sódico. Después, la solución se secó con MgSO_{4}
anhidro y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida
(evaporador rotatorio), dando 8,0 g de un producto líquido incoloro
(Compuesto 7). RMN (d_{6}-DMSO): 0,74 ppm (s, 3H),
1,83 ppm (t, 2H), 3,35 ppm (m, 2H), 3,46 ppm (m, 4H), 3,80 ppm (s,
6H), 3,52 ppm (t, 6H), 4,54 ppm (t, 1H).
Esquemáticamente, la reacción puede
representarse como se indica a continuación:
Ejemplo
5
El Compuesto 1 (0,564 g, 0,00243 mol),
tetrahidrofurano (THF, 200 ml) y una solución de 0,3 mol/l de
naftaleno potásico-tetrahidrofurano (10 ml, 0,00300
mol) se añadieron a un reactor de vidrio y la mezcla se agitó
durante 3 minutos en una atmósfera de argón. A esta solución se le
añadió óxido de etileno (8,8 g, 0,20 mol) y la mezcla de reacción
se agitó durante 44 horas a temperatura ambiente. Después, la mezcla
se purgó con argón y se añadió tampón fosfato 0,1 M (pH = 8, 100
ml). La capa de THF se separó y se desechó. El naftaleno se retiró
de la solución por extracción en éter etílico. Después, el producto
se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). El extracto se secó con
sulfato sódico anhidro y el disolvente se retiró por destilación a
presión reducida. Rendimiento de 7,2 g. RMN
(d_{6}-DMSO): 0,73 ppm (s, -CH_{3} de OBO, 3H),
1,57 ppm (m, -CH_{2}-CH_{2}-CO-,
4H), 3,51 ppm (s, estructura PEG), 3,80 ppm (s, CH_{2} de OBO,
6H), 4,58 ppm (t, OH, 1H).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El producto del Ejemplo 5 (es decir, ácido
PEG_{(3,500\
Da)}-\alpha-hidroxi-\omega-butanoico,
orto éster de OBO, 7,0 g) se disolvió en agua destilada (100 ml).
El pH de la solución se ajustó a 2 con ácido fosfórico al 5% y la
solución se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Después, el pH se ajusto de nuevo a 12 mediante la adición de
hidróxido sódico 1 M y la solución se agitó durante dos horas
mientras se mantenía a un valor de pH igual a 12 mediante la
adición periódica de hidróxido sódico 1 M. Después, el pH se ajustó
a 3 con ácido fosfórico al 5%, después de lo cual el producto se
extrajo con diclorometano. El extracto se secó con sulfato de
magnesio anhidro y se añadió a éter etílico. El producto precipitado
se retiró por filtración y se secó a presión reducida. Rendimiento
de 6,6 g. RMN (d_{6}-DMSO): 1,72 ppm (c,
CH_{2}-CH_{2}-COO-, 2H) 2,24 ppm (t,
-CH_{2} -COO-, 2H), 3,51 ppm (s, estructura PEG), 4,58 ppm (t,
-OH, 1H).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Una mezcla del producto del Ejemplo 5 (es decir,
ácido PEG_{(3,500\
Da)}-\alpha-hidroxi-\omega-butanoico,
orto éster de OBO, 7,0 g, 0,002 mol), tolueno (100 ml), una
solución 1,0 M de terc-butóxido potásico en
terc-butanol (10 ml, 0,01 mol) y
p-toluenosulfonato de metilo (1,49 g, 0,008 mol) se
agitó durante una noche a 45ºC. Los disolventes se retiraron por
destilación a presión reducida (evaporador rotatorio). El producto
en bruto se disolvió en diclorometano y se añadió a éter etílico
frío. El producto precipitado se retiró por filtración y se secó a
presión reducida. Rendimiento de 6,2 g. RMN
(d_{6}-DMSO): 0,73 ppm (s, -CH_{3} de OBO, 3H),
1,57 ppm (m, -CH_{2}-CH_{2}-CO-,
4H), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}, 3H), 3,51 ppm (s, estructura PEG),
3,80 ppm (s, CH_{2} de OBO, 6H).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
El producto del Ejemplo 7 (ácido mPEG_{(3,500\
Da)}-butanoico, orto éster de OBO, 6,0 g) se
disolvió en agua destilada (60 ml). El pH de la solución se ajustó
a 2 con ácido fosfórico al 5% y la solución se agitó durante 15
minutos a temperatura ambiente. Después, el pH se ajustó de nuevo a
12 con hidróxido sódico 1 M y la solución se agitó durante 2 horas.
El pH de 12 se mantuvo mediante la adición periódica de hidróxido
sódico 1 M. Después de dos horas de agitación y manteniendo un
valor de pH de 12, el pH se ajustó a 3 con ácido fosfórico al 5% y
el producto se extrajo con diclorometano. Después, el extracto se
secó con sulfato de magnesio anhidro y se añadió a éter etílico. El
producto precipitado se retiró por filtración y se secó a presión
reducida. Rendimiento de 5,6 g. RMN (d_{6}-DMSO):
1,72 ppm (c, CH_{2}-CH_{2}-COO-, 2H) 2,24
ppm (t, -CH_{2} -COO-, 2H), 3,24 ppm (s, CH_{3}O-, 3H), 3,51
ppm (s, estructura PEG).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
El Compuesto 7 (0,53 g, 0,00243 mol),
tetrahidrofurano (THF, 200 ml) y una solución de 0,3 mol/l de
naftaleno potásico-tetrahidrofurano (10 ml, 0,00300
mol) se añadieron a un reactor de vidrio y la mezcla se agitó
durante tres minutos en una atmósfera de argón. A esta solución se
le añadió óxido de etileno (12,2 g, 0,277 mol) y la mezcla de
reacción se agitó durante 44 horas a temperatura ambiente. Después,
la mezcla se purgó con argón y se añadió tampón fosfato 0,1 M (pH =
8, 100 ml). La capa de THF se separó y después se desechó. El
naftaleno se retiró de la solución por extracción con éter etílico.
Después, el producto se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). El
extracto se secó con sulfato sódico anhidro y el disolvente se
retiró por destilación a presión reducida. Rendimiento de 11,7 g.
RMN (d_{6}-DMSO): 0,73 ppm (s, -CH_{3}, 3H),
1,82 ppm (t, -CH_{2}- CO-, 2H), 3,51 ppm (s, estructura PEG),
3,80 ppm (s, CH_{2} de OBO, 6H), 4,57 ppm (t, -OH, 1H).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
El producto del Ejemplo 9 (ácido PEG_{(5,000\
Da)}-\alpha-hidroxi-\omega-propanoico,
orto éster de OBO, 5,0 g) se disolvió en agua destilada (75 ml). El
pH de la solución se ajustó a 2 con ácido fosfórico al 5% y la
solución se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Después, el pH se ajustó de nuevo a 12 con hidróxido sódico 1 M y
la solución se agitó durante dos horas. El pH de la solución se
mantuvo a un pH igual a 12 mediante la adición periódica de
hidróxido sódico 1 M. Después de dos horas de agitación y
manteniendo el pH a 12, el pH de la solución se ajustó a 3 con
ácido fosfórico al 5% y después el producto se extrajo con
diclorometano. Después, el extracto se secó con sulfato de magnesio
anhidro y se añadió a éter etílico. El producto precipitado se
retiró por filtración y se secó a presión reducida. Rendimiento de
4,4 g. RMN (d_{6}-DMSO): 2,43 ppm (t, -CH_{2}
-COO-, 2H), 3,51 ppm (s, estructura PEG), 4,58 ppm (t, -OH, 1H).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Una mezcla del producto del Ejemplo 9 (ácido
PEG_{(5,000\
Da)}-\alpha-hidroxi-\varepsilon-propanoico,
orto éster de OBO, 4,0 g, 0,0008 mol), tolueno (50 ml), solución
1,0 M de terc-butóxido potásico en
terc-butanol (8 ml, 0,008 mol) y
p-toluenosulfonato de metilo (1,49 g, 0,008 mol) se
agitó durante una noche a 50ºC. Después, los disolventes se
retiraron por destilación a presión reducida (evaporador rotatorio).
Después, el producto en bruto se disolvió en diclorometano y se
añadió a éter etílico frío. El producto precipitado se retiró por
filtración y se secó a presión reducida. Rendimiento de 3,6 g. RMN
(d_{6}-DMSO): 0,73 ppm (s, -CH_{3}, 3H), 1,82
ppm (t, -CH_{2}- CO-, 2H), 3,24 ppm (s, CH_{3}O-, 3H), 3,51 ppm
(s, estructura PEG), 3,80 ppm (s, CH_{2} de OBO, 6H).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
El producto del Ejemplo 11 (ácido mPEG_{(5,000\
Da)}-propanoico, orto éster de OBO, 6,0 g) se
disolvió en agua destilada (60 ml). El pH de la solución se ajustó
a 2 con ácido fosfórico al 5% y la solución se agitó durante 15
minutos a temperatura ambiente. Después, el pH se ajustó de nuevo a
12 con hidróxido sódico 1 M y la solución se agitó durante dos
horas. Se mantuvo un pH de 12 mediante la adición periódica de
hidróxido sódico 1 M. Después de dos horas de agitación y
manteniendo a un pH de 12, el pH de la solución se ajustó a 3 con
ácido fosfórico al 5% y después el producto se extrajo con
diclorometano. Después, el extracto se secó con sulfato de magnesio
anhidro y se añadió a éter etílico. El producto precipitado se
retiró por filtración y se secó a presión reducida. Rendimiento de
5,6 g. RMN (d_{6}-DMSO): 2,43 ppm (t, -CH_{2}
-COO-, 2H), 3,24 ppm (s, CH_{3}O-, 3H), 3,51 ppm (s, estructura
PEG).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Una solución de mPEG_{(20,000\ Da)} (2,0 g,
0,0001 mol) (NOF Corporation) en tolueno (30 ml) se secó
azeotrópicamente mediante retirada por destilación 15 ml de
tolueno. Se añadieron una solución 1,0 M de
terc-butóxido potásico en
terc-butanol (0,80 ml, 0,0008000 mol) y el producto
del Ejemplo 2
[1-(3-bromopropil)-4-metil-2,6,7-trioxabiciclo[2,2,2]octano,
0,15 g, 0,0005973 mol] y la mezcla se agitó durante una noche a
70ºC en una atmósfera de argón. El disolvente se retiró por
destilación a presión reducida y el residuo se disolvió en agua
destilada (40 ml). El pH de la solución se ajustó a 2 con ácido
fosfórico al 5% y la solución se agitó durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Después, el pH se ajustó de nuevo a 12 con
hidróxido sódico 1 M y la solución se agitó durante dos horas
manteniendo el pH a 12 mediante la adición periódica de hidróxido
sódico 1 M. Después, el pH se ajustó a 3 con ácido fosfórico al 5%
y el producto se extrajo con diclorometano. El extracto se secó con
sulfato de magnesio anhidro y se añadió a éter etílico. El producto
precipitado se retiró por filtración y se secó a presión reducida.
Rendimiento de 1,6 g. RMN (d_{6}-DMSO): 1,72 ppm
(c, CH_{2}-CH_{2}-COO-) 2,24 ppm
(t, -CH_{2} -COO-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}), 3,51 ppm (s,
estructura PEG). Cromatografía de intercambio aniónico: ácido
mPEG_{(20.000)}-butanoico al 98,6%,
m-PEG-20K al 1,4%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Se disolvió
3-metil-3-hidroximetiloxetano
(20,5 g, 0,201 mol) en diclorometano anhidro (250 ml) y se añadió
piridina (20,0 ml, 0,12 mol). La solución se enfrió a 0ºC y se
añadió gota a gota cloruro de 4-bromohexanoílo
(42,7 g, 0,200 mol) disuelto en diclorometano anhidro (50 ml)
durante 20 minutos. Después, la mezcla se agitó durante una noche
en una atmósfera de argón. Después, la mezcla de reacción se lavó
con agua y se secó con sulfato de magnesio anhidro. Después, el
disolvente se retiró por destilación a presión reducida. Rendimiento
de 56,8 g. RMN (d_{6}-DMSO): 1,26 ppm (s, 3H),
2,07 ppm (m, 2H), 2,51 ppm (t, 2H), 3,56 ppm (t, 2H), 4,14 ppm (s,
2H), 4,24 ppm (d, 2H), 4,38 ppm (d, 2H).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
El producto del Ejemplo 14
(4-bromohexanoato éster de
3-metil-3-hidroximetiloxetano
en bruto, 20,1 g, 0,08 mol) se disolvió en diclorometano anhidro
(100 ml), la solución se enfrió a 0ºC y se añadió dietileterato de
trifluoruro de boro (2,5 ml, 0,022 mol). Después, la mezcla se agitó
durante 4 horas a 0ºC. Se añadió trietilamina (12 ml), la mezcla se
agitó durante 15 minutos y después el disolvente se retiró por
destilación a presión reducida. Después, el producto en bruto se
disolvió en éter etílico (180 ml) y la solución se filtró para
retirar las impurezas sólidas. Después, el éter se retiró por
destilación y el producto se destiló a presión reducida (tubo de
bolas, 110-115ºC, 0,05 mm de Hg). Rendimiento de
15,0 g. RMN (d_{6}-DMSO): 0,74 ppm (s, 3H), 1,68
ppm (m, 2H), 1,88 ppm (m, 2H), 3,52 ppm (t, 2H), 3,81 ppm (s,
6H).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
Una solución de mPEG_{(2,000\ Da)} (2,0 g,
0,0010 mol) (NOF Corporation) en tolueno (30 ml) se secó
azeotrópicamente mediante retirada por destilación de 15 ml de
tolueno. Se añadieron una solución 1,0 M de
terc-butóxido potásico en
terc-butanol (0,60 ml, 0,0006000 mol) y el producto
del Ejemplo 16
[1-(3-bromopentil)-4-metil-2,6,7-trioxabiciclo[2,2,2]octano,
0,15 g, 0,0005973 mol] y la mezcla se agitó durante una noche a
70ºC en una atmósfera de argón. Después, el disolvente se retiró
por destilación a presión reducida y el residuo se disolvió en agua
destilada (40 ml). El pH de la solución se ajustó a 2 con ácido
fosfórico al 5% y la solución se agitó durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Después, el pH se ajustó de nuevo a 12 con
hidróxido sódico 1 M y la solución se agitó durante 2 horas
mientras se mantenía el pH igual a 12 mediante la adición periódica
de hidróxido sódico 1 M. Después, el pH se ajustó a 3 con ácido
fosfórico al 5% y el producto se extrajo con diclorometano. El
extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y se añadió a éter
etílico. El precipitado se retiró por filtración y se secó a
presión reducida. Rendimiento de 1,6 g. RMN
(d_{6}-DMSO): 1,72 ppm (c,
CH_{2}-CH_{2}-COO-) 2,24 ppm (t,
-CH_{2}-COO-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}), 3,51 ppm
(s, estructura PEG).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
Una solución de mPEG_{(5,000\
Da)}-O-CH(CH_{2}OH)_{2}
(2,0 g, 0,0004 mol) (preparada a partir de mesilato de
mPEG_{(5,000\ Da)} y
1,3-dibenciloxi-2-propanol
de acuerdo con el método descrito en la Publicación de Solicitud de
Patente de Estados Unidos US 2001/0011115) en tolueno (30 ml) se
secó azeotrópicamente mediante la retirada por destilación de 15 ml
de tolueno. Se añadieron una solución 1,0 M de
terc-butóxido potásico en
terc-butanol (2,4 ml, 0,0024 mol) y
1-(3-bromopropil)-4-metil-2,6,7-trioxabiciclo[2,2,2]octano,
0,60 g, 0,0024 mol) (preparado como se ha descrito en el Ejemplo 2)
y la mezcla se agitó durante una noche a 70ºC en una atmósfera de
argón. El disolvente se retiró por destilación a presión reducida y
el residuo se disolvió en agua destilada (30 ml). El pH de la
solución se ajustó a 2 con ácido fosfórico al 5% y la solución se
agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, el pH se
ajustó de nuevo a 12 con hidróxido sódico 1 M y la solución se
agitó durante 1,5 horas mientras se mantenía un a pH igual a 12
mediante la adición periódica de hidróxido sódico 1 M. Después, el
pH se ajustó a 3 con ácido fosfórico al 5% y el producto se extrajo
con diclorometano. Después, el extracto se secó con sulfato de
magnesio anhidro y se añadió a éter etílico. El precipitado se
retiró por filtración y se secó a presión reducida. Rendimiento de
1,6 g. RMN (d_{6}-DMSO): 1,72 ppm (c,
CH_{2}-CH_{2}-COO-) 2,24 ppm (t,
-CH_{2}-COO-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}), 3,51 ppm
(s, estructura PEG).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
Una solución de mPEG_{(5,000\ Da)} (2,0 g,
0,0004 mol) (NOF Corporation) en tolueno (20 ml) se secó
azeotrópicamente mediante la retirada por destilación del
disolvente a sequedad a presión reducida. El material secado se
disolvió en 15 ml de tolueno anhidro. Se añadieron una solución 1,0
M de terc-butóxido potásico en
terc-butanol (1,2 ml, 0,0012 mol) y
4-bromoortobutirato de trimetilo
(Sigma-Aldrich, 0,25 g, 0,0011 mol) y la mezcla se
agitó durante una noche a 70ºC en una atmósfera de argón. El
disolvente se retiró por destilación a presión reducida y el
residuo se disolvió en agua destilada (40 ml). El pH de la solución
se ajustó a 2 con ácido fosfórico al 5% y la solución se agitó
durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, el pH se ajustó
de nuevo a 12 con hidróxido sódico 1 M y la solución se agitó
durante 2 horas manteniendo un pH igual a 12 mediante la adición
periódica de hidróxido sódico 1 M. El pH se ajustó a 3 con ácido
fosfórico al 5% y el producto se extrajo con diclorometano. El
extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y se añadió a éter
etílico. El producto precipitado se retiró por filtración y se secó
a presión reducida. Rendimiento de 1,5 g. RMN
(d_{6}-DMSO): 1,72 ppm (c,
CH_{2}-CH_{2}-COO-) 2,24 ppm (t,
-CH_{2} -COO-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}), 3,51 ppm (s, estructura
PEG).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
El producto del Ejemplo 18 (ácido mPEG_{(5,000\
Da)}-butanoico) se disuelve en cloruro de metileno
para formar una solución. Después, se disuelven
N-hidroxisuccinimida y
N,N-diciclohexilcarbodiimida en 2 ml de cloruro de
metileno y la mezcla se añade a la solución, que después se agita
durante una noche. Después, la mezcla se filtra y el filtrado se
concentra al vacío. El producto se precipita mediante la adición del
filtrado a isopropanol y después se recoge por filtración y se seca
al vacío. El producto se representa como se indica a
continuación:
Ejemplo
20
La lisozima sirve como un modelo de proteína
útil para reacciones de conjugación. Por consiguiente, otras
proteínas de agente activo pueden sustituirse por lisozima en este
Ejemplo.
Se añade solución de lisozima (4 ml, 3 mg/ml) en
50 ml de tampón a pH 6,5 (fosfato sódico 50 mM/NaCl 50 mM) a 20 mg
de N-succinimidil éster del ácido mPEG_{(5,000\
Da)}-butanoico (el producto del Ejemplo 19,
butanoato de mPEG-succinimidilo). El progreso de la
reacción se controla por electroforesis capilar durante el
transcurso de seis horas para controlar la reacción. Después de las
seis horas, la electroforesis capilar muestra evidencia de lisozima
PEGilada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
La lisozima sirve como un modelo de proteína
útil para reacciones de conjugación. Por consiguiente, otras
proteínas de agente activo pueden sustituirse por lisozima en este
Ejemplo.
El producto del Ejemplo 18 (ácido mPEG_{(5,000\
Da)}-butanoico) se disuelve en 20 ml de cloruro de
metileno a temperatura ambiente y se forma una solución. Después,
la solución se trata con
1,3-diisopropilcarbodiimida,
4-dimetilaminopiridina y lisozima a 0ºC. Después, la
solución de reacción se calienta a temperatura ambiente después de
varias horas y se mantiene a la temperatura ambiente durante
aproximadamente 16 horas. Después, la mezcla de reacción se lava
con ácido clorhídrico, se seca y se evapora para producir el
producto conjugado.
Claims (36)
-
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. Un método para preparar un orto éster de un polímero soluble en agua que comprende la etapa de hacer reaccionar un segmento de polímero soluble en agua que tiene al menos un ión alcóxido o un ión tiolato con un orto éster compuesto por un grupo saliente adecuado. - 2. El método de la reivindicación 1, en el que el segmento de polímero soluble en agua tiene al menos un ión alcóxido y se prepara por una reacción de polimerización.
- 3. El método de la reivindicación 1, en el que el segmento de polímero soluble en agua que tiene al menos un ión alcóxido o un ión tiolato se prepara por combinación de un segmento de polímero soluble en agua que tiene al menos un resto hidroxilo o tiol con una base adecuada.
- 4. El método de la reivindicación 3, en el que la base adecuada se selecciona del grupo que consiste en sodio, potasio, hidruro sódico, hidruro potásico, metóxido sódico, metóxido potásico, terc-butóxido sódico y terc-butóxido potásico.
- 5. El método de la reivindicación 1, en el que el orto éster compuesto por un grupo saliente adecuado comprende la siguiente estructura:
35 en la que:36 - \quad
- es el grupo saliente adecuado;
- \quad
- (z) es un número entero de 1 a 24;
- \quad
- R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido;
- \quad
- R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; y
37 - \quad
- representa un residuo de un resto orto éster.
- 6. El método de la reivindicación 5, en el que el grupo saliente adecuado se selecciona del grupo que consiste en halógenos y ésteres de sulfonato.
- 7. El método de la reivindicación 5, en el que el grupo saliente adecuado se selecciona del grupo que consiste en bromo, cloro y yodo.
- 8. El método de la reivindicación 5, en el que el grupo saliente adecuado se selecciona del grupo que consiste en metanosulfonato, trifluorometanosulfonato, triclorometanosulfonato, 2,2,2-trifluoroetanosulfonato, 2,2,2-tricloroetanosulfonato y para-toluenosulfonato.
- 9. El método de la reivindicación 5, en el que el resto
38 \newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
está compuesto por la siguiente estructura:39 en la que cada R^{4} es un radical orgánico seleccionado independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. - 10. El método de la reivindicación 5, en el que el resto
40 está en forma de una estructura cíclica. - 11. El método de la reivindicación 10, en el que el resto
41 se selecciona del grupo que consiste en42 - 12. El método de la reivindicación 5, en el que el orto éster compuesto por un grupo saliente adecuado comprende la siguiente estructura:
43 en la que:44 - \quad
- es el grupo saliente adecuado;
- \quad
- X^{1} es un resto espaciador;
- \quad
- (z) es un número entero de 1 a 24;
- \quad
- R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido;
\global\parskip0.930000\baselineskip
- \quad
- R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; y
45 - \quad
- representa un residuo de un resto orto éster.
- 13. El método de la reivindicación 5, en el que el resto orto éster compuesto por un grupo saliente adecuado se prepara por una reacción de polimerización realizada sobre una molécula iniciadora que tiene un resto orto éster.
- 14. El método de la reivindicación 1, en el que el segmento de polímero soluble en agua que tiene al menos un ión alcóxido o un ión tiolato está compuesto por la siguiente estructura:POLI-(X)_{a}-Y''en la que POLI es un segmento de polímero soluble en agua;
- \quad
- (a) es cero o uno;
- \quad
- X, cuando está presente, es un resto espaciador; e
- \quad
- Y es O o S.
- 15. El método de la reivindicación 14, en el que el segmento de polímero soluble en agua que tiene al menos un ión alcóxido o un ión tiolato está compuesto por la siguiente estructura:R^{5}-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-CH_{2}CH_{2}-Y-en la que:
- \quad
- (m) es de 2 a 4000;
- \quad
- Y es O o S; y
- \quad
- R^{5} es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido.
- 16. El método de la reivindicación 3, en el que el segmento de polímero soluble en agua que tiene al menos un grupo hidroxilo o tiol está compuesto por la siguiente estructura:POLI-(X)_{a}-YHen la que:
- \quad
- POLI es un segmento de polímero soluble en agua;
- \quad
- (a) es cero o uno;
- \quad
- X, cuando está presente, es un resto espaciador; e
- \quad
- Y es O o S.
- 17. El método de la reivindicación 16, en el que el segmento de polímero soluble en agua tiene un grupo hidroxilo y está compuesto por la siguiente estructura:R^{5}-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-Hen la que:
- \quad
- (m) es de 2 a 4000; y
- \quad
- R^{5} es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido.
- 18. El método de la reivindicación 17, en el que el segmento de polímero soluble en agua que tiene un grupo hidroxilo está compuesto por la siguiente estructura:H_{3}C-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-Hen la que (m) es de 2 a 4000.
- 19. Un método para preparar un ácido carboxílico de un polímero soluble en agua que comprende las etapas de
- (a)
- hacer reaccionar un segmento de polímero soluble en agua que tiene al menos unión alcóxido o un ión tiolato con un orto éster compuesto por un grupo saliente adecuado para formar un orto éster de un polímero soluble en agua; y
- (b)
- someter el orto éster de un polímero soluble en agua formado en la etapa (a) al menos a una etapa de hidrólisis para proporcionar el ácido carboxílico correspondiente de un polímero soluble en agua.
- 20. El método de la reivindicación 19, en el que el segmento de polímero soluble en agua que tiene al menos un ión alcóxido o un ión tiolato se prepara por combinación de un segmento de polímero soluble en agua que tiene al menos un resto hidroxilo o tiol con una base adecuada.
- 21. El método de la reivindicación 19, que comprende adicionalmente la etapa de recuperar el ácido carboxílico del polímero soluble en agua.
- 22. El método de la reivindicación 19, que comprende adicionalmente la etapa de purificar el ácido carboxílico del polímero soluble en agua.
- 23. El método de la reivindicación 19, en el que la conversión del orto éster del polímero soluble en agua en el ácido carboxílico del polímero soluble en agua es de aproximadamente el 85% o mayor.
- 24. El método de la reivindicación 19, en el que al menos una etapa de hidrólisis comprende dos etapas de hidrólisis.
- 25. El método de la reivindicación 24, en el que las dos etapas de hidrólisis comprenden una etapa de hidrólisis de ácido inicial seguido de una hidrólisis de base.
- 26. Un polímero que comprende la siguiente estructura:
46 en la que:- \quad
- POLI es un segmento de polímero soluble en agua;
- \quad
- (a) es cero o uno;
- \quad
- X, cuando está presente, es un resto espaciador;
- \quad
- (z) es un número entero de 1 a 24;
- \quad
- R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido;
- \quad
- R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; y
47 - \quad
- representa un residuo de un resto orto éster cíclico.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 27. El polímero de la reivindicación 26, en el que (z) es igual a tres y el polímero está compuesto por la siguiente estructura:
48 en la que POLI, X, (a), cada R^{1}, cada R^{2} y49 son como se han definido anteriormente. - 28. El polímero de la reivindicación 26, en el que (z) es igual a cuatro y el polímero está compuesto por la siguiente estructura:
50 en la que POLI, X, (a); cada R^{1}, cada R^{2} y51 son como se han definido anteriormente. - 29. El polímero de la reivindicación 26, en el que (z) es igual a cinco y el polímero está compuesto por la siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
52 \vskip1.000000\baselineskip
en la que POLI, X, (a), cada R^{1}, cada R^{2} y53 son como se han definido anteriormente. - 30. El polímero de una cualquiera de las reivindicaciones 27-29 en el que el R^{1} unido al carbono \alpha del carbono del resto orto éster es alquilo, todas las demás variables R^{1} son H y todas las variables R^{2} son H.
- 31. El polímero de la reivindicación 26, en el que (a) es igual a cero.
- 32. El polímero de la reivindicación 26, en el que (a) es igual a uno.
- 33. El polímero de la reivindicación 32, en el que X se selecciona independientemente del grupo que consiste en -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-
CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -O-CH_{2}-, -CH_{2}-O-, -O-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-O-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-O-, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-, -C(O)-NH-CH_{2}-, -C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-,
-C(O)-O-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-O-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-O-CH_{2}-, -C(O)-O-CH_{2}-CH_{2}-, -NH-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-, -NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, C(O)-NH-CH_{2}-, -C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -O-C(O)-NH-CH_{2}-, -O-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-NH-CH_{2}-, CH_{2}-CH_{2}-NH-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -O-C(O)-NH-[CH_{2}]_{h}-(OCH_{2}CH_{2})_{J}, -C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)- y -O-C(O)-NH-(CH_{2})_{1-6}-NH-C(O)-, grupo cicloalquilo bivalente, un aminoácido, -N(R^{6})- y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, donde R^{6} es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, (h) es de cero a seis y (j) es de cero a 20. - 34. El polímero de la reivindicación 26, en el que el resto
\vskip1.000000\baselineskip
54 \vskip1.000000\baselineskip
es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11. - 35. El polímero de la reivindicación 26, que comprende la siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
55 \vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que POLI, cada X, cada (a), cada R^{1}, cada R^{2} y cada\vskip1.000000\baselineskip
56 \vskip1.000000\baselineskip
son como se han descrito anteriormente.\newpage
- 36. El polímero de la reivindicación 26, seleccionado del grupo que consiste en
57 58 59 60 61 donde (m) es de 2 a 4000, (a) es cero o uno y X^{1}, cuando está presente, es un resto espaciador.
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