ES2307824T3 - Uso de anticuerpos contra el antigeno muc18. - Google Patents
Uso de anticuerpos contra el antigeno muc18. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia aminoacídica de cadena pesada y de cadena ligera, en el que dicho anticuerpo tiene una secuencia aminoacídica de cadena pesada y de cadena ligera seleccionada del grupo constituido por: SEC ID Nº: 1 y 2, SEC ID Nº: 5 y 6, SEC ID Nº: 9 y 10, SEC ID Nº: 13 y 14, SEC ID Nº: 17 y 18, SEC ID Nº: 21 y 22, SEC ID Nº: 25 y 26, SEC ID Nº: 29 y 30, SEC ID Nº: 33 y 34 y SEC ID Nº: 37 y 38, y en el que dicho anticuerpo monoclonal se une a MUC18 para la preparación de un medicamento para inhibir el crecimiento tumoral.
Description
Uso de anticuerpos contra el antígeno MUC18.
Realizaciones de la presente invención se
refieren a anticuerpos que se unen al antígeno MUC18, así como a
procedimientos y medios para preparar y usar dichos anticuerpos.
MUC18 es una glicoproteína de superficie celular
identificada originalmente como un antígeno de melanoma, molécula
de adhesión celular a melanoma (MCAM), cuya expresión está asociada
a la progresión tumoral y al desarrollo del potencial metastásico.
MUC18 es una glicoproteína de membrana integral de superficie
celular de 113 kDa compuesta por un péptido señal, cinco dominios
similares a inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola
citoplasmática corta (Lehmann y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 86 (24): 9891-5 (1989)).
MUC18 es un miembro de la superfamilia de la
inmunoglobulina y tiene una homología de secuencia significativa
con una serie de moléculas de adhesión celular de la superfamilia de
Ig (Lehmann y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:
9891-9895 (1989)), incluyendo BEN (Pourquie y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5261-5265
(1992)), molécula de adhesión neural (NCAM).
(Owens y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84: 294-298 (1987)), glicoproteína asociada
a mielina (MAG) (Lai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:
4337-4341 (1987)), eliminada en cáncer colorrectal
(DCC) (Hedrick y col., Genes Devel., 8 (10):
1174-83 (1994)) y glicerina (Taira y col.,
Neuron, 12: 861-872 (1994)). La expresión de
MUC18 se ha detectado en un espectro relativamente limitado de
tejidos humanos normales y en una variedad de neoplasmas malignos.
En tejidos adultos normales, MUC18 se expresa en células
endoteliales, células de músculo liso (Shih y col., Lab.
Invest., 75: 377-388 (1996); Sers y col.,
Cancer Res., 54 (21): 5689-94 (1994)), una
subpoblación de linfocitos T activados (Pickl y col., J.
Immunol., 158: 2107-2115 (1997)) y trofoblastos
intermedios (Shih y col., Lab. Invest., 75:
377-388 (1996)). MUC18 se expresa también en una
variedad de neoplasmas malignos, incluyendo neoplasmas de músculo
liso (liomiomas y liomiosarcomas), tumores de origen vascular
(angiosarcomas y sarcomas de Kaposi), tumores trofoblásticos de
sitio placentario, coriocarcinomas y melanomas (Shih y col.,
Clinical Cancer Res., 2: 569-575 (1996);
Holzmann y col., Int. J. Cancer, 39: 466-471
(1987)). La expresión de MUC18 se correlaciona directamente con el
potencial metastásico de células de melanoma humano
(Bar-Eli, M., Cancer Metastasis, 18 (3):
377-85 (1999)).
Una serie de estudios han identificado a MUC18
como un marcador de la progresión tumoral y metástasis en melanomas.
La expresión de MUC18 está ausente en melanocitos normales y nevos
benignos pero es destacada en muchos melanomas primarios y en la
mayoría de las lesiona metastásicas (Lehmann y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 86: 9891-9895 (1989); Lehmann y
col., Cancer Res., 47: 841-845 (1987); Shih y
col., Cancer Res., 54: 2514-2520 (1994)). De
forma importante, la expresión de MUC18 se correlaciona bien con el
grosor vertical de tumores y la formación de metástasis y más del
80% de las lesiones metastásicas expresan MUC18 (Lehmann y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 9891-9895
(1989); Xie y col., Cancer Res., 57:
2295-2303 (1997); Sers y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 90: 85 14-8518 (1993); Lehmann y col.,
Cancer Res., 47: 841-845 (1987); Shih y col.,
Cancer Res., 54: 2514-2520 (1994). En la
Figura 1 se presenta un diagrama que representa la expresión de
MUC18 con respecto a otras lesiones moleculares en melanoma humano
conocidas.
La expresión de los factores de transcripción
ATF-1 y CREB está regulada positivamente en células
de melanoma metastásicas. Sin embargo, no está claro cómo la
sobreexpresión de ATF-1/CREB contribuye a la
adquisición de la metástasis. CREB/ATF-1 puede
desempeñar un papel esencial en la invasión regulando la expresión
dependiente de CRE de la molécula de adhesión MUC18 y la
metaloproteinasa MMP-2 (Jean y col., Mol. Cell.
Biochem., 212 (1-2): 19-28
(2000)) que pertenece a la familia de MMP, conocida por contribuir a
cánceres y por tener un papel en la invasión, angiogéneis y
metástasis tumorales. Se cree que las células tumorales utilizan la
capacidad de degradación de la matriz de las MMP para extenderse a
sitios distantes y, una vez se han metastatizado las células
tumorales, se cree que las MMP promueven el crecimiento de estas
células tumorales. El papel de MUC18 en la progresión del tumor de
melanoma no se entiende completamente, pero puede incluir un papel
en una o más etapas del proceso metastásico, posiblemente afectando
a la activación de MMP-2 o migración celular.
El análisis de líneas celulares de melanoma
humano mostró una correlación positiva de la expresión de MUC18 con
la capacidad de las células de producir metástasis en ratones
desnudos (Johnson y col., Cancer Metastasis Rev., 18:
345-357 (1999)). Yang y col. (Gene 265:
131-145 (2001)) aislaron y caracterizaron ADNc de
MUC18 de ratón y correlacionaron la expresión de MUC18 en líneas
celulares de melanoma de ratón con capacidad metastásica. Se ha
reseñado que la generación de variantes tumorigénicas de una línea
celular de melanoma no tumorigénica está acompañada por la
inducción de la expresión de MUC18 (Luca y col., Melanoma
Res., 3: 35-41 (1993)). La expresión de MUC18
en líneas celulares de melanoma humano negativas de MUC18 aumentó su
tumorigenicidad y potenció su capacidad metastásica en modelos
tumorales experimentales (Xie y col., Cancer Res., 57:
2295-2303 (1997); Bani y col., Cancer Res.
56: 3075-3086 (1996)). Finalmente, la inhibición de
la expresión de MUC18 en metástasis usando elementos supresores
genéticos de ADNc de MUC18 condujo a una reducción del fenotipo
tumorigénico en ratones desnudos (Styamoorthy y col.,
Oncogene, 20: 4676 (2001)).
Aunque la función de MUC18 no se entiende
totalmente, varios estudios han demostrado un papel para esta
proteína en la mediación de las interacciones
célula-célula y célula-matriz al
unirse a un ligando no identificado (Shih y col., Cancer
Res., 57: 3835-3840 (1997); Johnson y col.,
Int. J. Cancer, 73: 769-774 (1997)). La
expresión de moléculas de adhesión celular que median interacciones
célula-célula o célula-matriz es una
propiedad de la célula tumoral que es esencial para las metástasis.
En consecuencia, las células de melanoma transfectadas con MUC18
mostraron una adhesión homotípica aumentada, una unión aumentada a
células endoteliales y una invasión aumentada a través de filtros
recubiertos con Matrigel, sugiriendo un papel en la invasión tumoral
y la migración transendotelial (Xie y col., Cancer Res., 57:
2295-2303 (1997)). De forma importante, los
anticuerpos anti-MUC18 eran capaces de inhibir
estas funciones en células transfectadas con MUC18 (Xie y col.,
Cancer Res., 57: 2295-2303 (1997)).
En consecuencia, existe una gran necesidad de
anticuerpos anti-MUC18 que sean capaces de inhibir
la función biológica de MUC18 y, lo más importante, la
proliferación y crecimiento celulares que pueden ser esenciales en
la progresión y metástasis tumorales. Dichos anticuerpos
interferirían probablemente con la capacidad inherente de MUC18 de
mediar interacciones célula-célula y
célula-matriz. La inhibición de dicha actividad
puede ser posible con un anticuerpo monoclonal dirigido a MUC18. La
capacidad de afectar a la progresión de células tumorales que
expresan MUC18 en la superficie celular puede probar ser un
tratamiento para pacientes con tumores o de uso para la prevención
de enfermedad metastásica en pacientes con dichos tumores.
La presente invención está basada en el
desarrollo de anticuerpos monoclonales que se encontró que se unían
a MUC18 y afectaban a la función de MUC18. Esta solicitud describe
anticuerpos anti-MUC18 humanos y preparaciones de
anticuerpo anti-MUC18 con propiedades deseables
desde una perspectiva terapéutica, incluyendo una fuerte afinidad
de unión por MUC18, la capacidad de inhibir el crecimiento tumoral y
la metástasis in vivo, la capacidad de promover la
supervivencia celular y la capacidad de inhibir la invasión tumoral
in vitro.
Una realización de la invención es el uso de un
anticuerpo monoclonal que comprende un aminoácido de cadena pesada
y de cadena ligera, en el que dicho anticuerpo tiene una secuencia
aminoacídica de cadena pesada y de cadena ligera seleccionada del
grupo constituido por:
SEC ID Nº: 1 y 2,
SEC ID Nº: 5 y 6,
SEC ID Nº: 9 y 10,
SEC ID Nº: 13 y 14,
SEC ID Nº: 17 y 18,
SEC ID Nº: 21 y 22,
SEC ID Nº: 25 y 26,
SEC ID Nº: 29 y 30,
SEC ID Nº: 33 y 34 y
SEC ID Nº: 37 y 38,
y en el que dicho anticuerpo monoclonal se une a
MUC18, para la preparación de un medicamento para inhibir el
crecimiento tumoral, o para inhibir el crecimiento de melanoma, o
para inhibir el crecimiento de un tumor metastásico.
Según una realización de la invención, el
anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.
Según otra realización de la invención, dicho
anticuerpo está conjugado con un agente terapéutico y/o citotóxico.
Según otra realización de la invención, dicho agente citotóxico es
ricina. Según otra realización de la invención, dicho agente
terapéutico es un radioisótopo.
Según otra realización de la invención, cuando
el anticuerpo se usa para inhibir el crecimiento tumoral, dicho
tumor es un melanoma. Según otra realización de la invención, cuando
el anticuerpo se usa para inhibir el crecimiento tumoral, dicho
tumor es un tumor pulmonar. Según otra realización de la invención,
cuando dicho anticuerpo se usa para inhibir el crecimiento tumoral,
dicho tumor es una metástasis tumoral.
Según otra realización de la invención, cuando
el anticuerpo se usa para inhibir el crecimiento de un tumor
metastásico, la inhibición del crecimiento da como resultado una
metástasis inhibida de dicho tumor, dando como resultado una
supervivencia aumentada de dicho animal.
Un anticuerpo monoclonal
anti-MUC18 humano puede unirse a y neutralizar una
actividad biológica de al menos MUC18 humana o estimular la
internalización y regulación negativa de la proteína. El anticuerpo
puede reducir significativamente o eliminar una actividad biológica
de la MUC18 humana en cuestión.
Inhibir el crecimiento tumoral en un animal
puede incluir: seleccionar un animal que necesita tratamiento por
un tumor; proporcionar un anticuerpo monoclonal que comprende una
secuencia aminoacídica de cadena pesada, en el que el anticuerpo
tiene una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido
por las SEC ID Nº: 1,5 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33 y 37 y en el que
el anticuerpo monoclonal se une a MUC18; y poner en contacto el
tumor con una cantidad eficaz de dicho anticuerpo, en el que el
contacto da como resultado la proliferación inhibida de dichas
células.
Inhibir la invasión celular asociada al melanoma
puede proceder: seleccionar un animal que necesita tratamiento por
melanoma; proporcionar un anticuerpo monoclonal que tiene una
secuencia aminoacídica de cadena pesada, en el que el anticuerpo
tiene una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido
por las SEC ID Nº: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33 y 37 y en el que
el anticuerpo monoclonal se une a MUC18; y poner en contacto el
melanoma con una cantidad eficaz del anticuerpo, en el que el
contacto da como resultado una invasión celular inhibida.
Aumentar la supervivencia de un animal que tiene
un tumor metastásico puede incluir: seleccionar un animal que
necesita tratamiento por un tumor metastásico; proporcionar un
anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia aminoacídica de
cadena pesada, en el que el anticuerpo tiene una secuencia
aminoacídica seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº:
1,5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33 y 37, y en el que el anticuerpo
monoclonal se une a MUC18; y poner en contacto dicho animal con una
cantidad eficaz del anticuerpo, en el que el contacto da como
resultado un crecimiento tumoral inhibido, dando como resultado una
metástasis inhibida del tumor, dando como resultado la
supervivencia aumentada del animal.
La actividad biológica de la MUC18 humana objeto
puede ser la proliferación celular. Además, la actividad biológica
puede incluir angiogénesis y proliferación celulares, importantes
para el crecimiento y metástasis del tumor primario, la invasión
y/o migración celular y la activación de la metaloproteinasa
MMP-2. Aún más, la actividad biológica puede
incluir el crecimiento y metástasis de células tumorales en
pacientes con tumores, por ejemplo, melanoma.
Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente
memoria, un vector puede comprender la molécula de ácido nucleico
aislada, una célula hospedadora transformada con la molécula de
ácido nucleico y un procedimiento de producción de anticuerpo que
comprende cultivar la célula hospedadora en condiciones en las que
la molécula de ácido nucleico se expresa produciendo el anticuerpo
y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora. El
anticuerpo puede ser de la clase IgG. La molécula de ácido nucleico
aislada puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica un
dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo monoclonal, en
la que dicha secuencia nucleotídica se selecciona del grupo
constituido por la secuencia nucleotídica del dominio variable de
cadena pesada c3.19.1 (SEC ID Nº 3), c6.11.3 (SEC ID Nº 7), C3.10
(SEC ID Nº 11), C3.22 (SEC ID Nº 15), C3.27 (SEC ID Nº 19), C3.45
(SEC ID Nº 23), C3.65 (SEC ID Nº 27), C6. 1 (SEC ID Nº 31), C6.9
(SEC ID Nº 35) o C6.2 (SEC ID Nº 39), o una secuencia nucleotídica
que codifica un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo
monoclonal, en el que dicha secuencia nucleotídica se selecciona
del grupo constituido por la secuencia nucleotídica del dominio
variable de cadena ligera 3.19.1 (SEC ID Nº 4), 6.11.3 (SEC ID Nº
8), C3.10 (SEC ID Nº 12), C3.22 (SEC ID Nº 16), C3.27 (SEC ID Nº
20), C3.45 (SEC ID Nº 24), C3.65 (SEC ID Nº 28), C6.1 (SEC ID Nº
32), C6.9 (SEC ID Nº 36) o C6.2 (SEC ID Nº 40).
La inhibición del crecimiento tumoral asociado a
la expresión de MUC18 en un paciente puede comprender administrar
al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo
anti-MUC18. El paciente es un paciente mamífero,
preferiblemente un paciente humano. La enfermedad es un tumor tal
como melanoma.
La Figura 1 es un diagrama que representa el
patrón de expresión de MUC18 y otros oncogenes y factores de
crecimiento conocidos implicados en la progresión del tumor de
melanoma.
La Figura 2 muestra el análisis de
inmunotransferencia con anticuerpos anti-MUC18 y
demuestra una correlación positiva entre la expresión de MUC18 y la
capacidad metastásica de células de melanoma humano. Se muestra la
expresión de MUC18 en líneas celulares de melanoma metastásicas
(A375SM, TXM-13 y WM2664), línea celular no
metastásica SB-2 y células endoteliales normales de
ratón (NME).
Las Figuras 3A y 3B son gráficas lineales que
ilustran que ni las células A375-SM (Figura 3A) ni
las células WM-2664 (Figura 3B) demostraron un
desplazamiento fluorescente cuando se incubaron en presencia del Ab
de control IgG2 (línea en negrita). Sin embargo, cuando se
incubaron en presencia de anti-MUC18 (línea de
puntos), se observó un fuerte desplazamiento de la intensidad de
fluorescencia indicativo de expresión de superficie celular del
antígeno.
La Figura 4 muestra que el anticuerpo
anti-MUC18, c3.19.1, inhibe el crecimiento
subcutáneo de células tumorales WM-2264 in
vivo.
La Figura 5 demuestra que el tratamiento con
anticuerpo anti-MUC18, c3.19.1, prolonga la
supervivencia de ratones WM-2664 que portan tumores
de melanoma metastásico.
La Figura 6 muestra la secuencia aminoacídica de
la región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 1) y de cadena
ligera (SEC ID Nº 2) y la secuencia nucleotídica que codifica la
región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 3) y ligera (SEC ID Nº
4) de anticuerpo anti-MUC18, c3.19.1.
La Figura 7 muestra la secuencia aminoacídica de
la región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 5) y de cadena
ligera (SEC ID Nº 6) y la secuencia nucleotídica que codifica la
región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 7) y ligera (SEC ID Nº
8) de anticuerpo anti-MUC18, c6.11.3.
La Figura 8 muestra la secuencia aminoacídica de
la región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 9) y de cadena
ligera (SEC ID Nº 10) y la secuencia nucleotídica que codifica la
región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 11) y ligera (SEC ID Nº
12) de anticuerpo anti-MUC18, c3.10.
La Figura 9 muestra la secuencia aminoacídica de
la región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 13) y ligera (SEC ID
Nº 14) y la secuencia nucleotídica que codifica la región variable
de cadena pesada (SEC ID Nº 15) y ligera (SEC ID Nº 16) de
anticuerpo anti-MUC18, c3.22.
La Figura 10 muestra la secuencia aminoacídica
de la región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 17) y de cadena
ligera (SEC ID Nº 18) y la secuencia nucleotídica que codifica la
región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 19) y ligera (SEC ID Nº
20) de anticuerpo anti-MUC18, c3.27.
La Figura 11 muestra la secuencia aminoacídica
de la región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 21) y de cadena
ligera (SEC ID Nº 22) y la secuencia nucleotídica que codifica la
región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 23) y ligera (SEC ID Nº
24) de anticuerpo anti-MUC18, c3.45.
La Figura 12 muestra la secuencia aminoacídica
de la región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 25) y de cadena
ligera (SEC ID Nº 26) y la secuencia nucleotídica que codifica la
región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 27) y ligera (SEC ID Nº
28) de anticuerpo anti-MUC18, c3.65.
La Figura 13 muestra la secuencia aminoacídica
de la región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 29) y de cadena
ligera (SEC ID Nº 30) y la secuencia nucleotídica que codifica la
región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 31) y ligera (SEC ID Nº
32) de anticuerpo anti-MUC18, c6.1.
La Figura 14 muestra la secuencia aminoacídica
de la región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 33) y de cadena
ligera (SEC ID Nº 34) y la secuencia nucleotídica que codifica la
región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 35) y ligera (SEC ID Nº
36) de anticuerpo anti-MUC18, c6.9 (clonado también
independientemente como c6.12).
La Figura 15 muestra la secuencia aminoacídica
de la región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 37) y de cadena
ligera (SEC ID Nº 38) y la secuencia nucleotídica que codifica la
región variable de cadena pesada (SEC ID Nº 39) y ligera (SEC ID Nº
40) de anticuerpo anti-MUC18, c6.2.
La Figura 16 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada de
anticuerpo anti-MUC18, c3.10 (SEC ID Nº 9) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región V4-59
(SEC ID Nº 41) del gen V_{H} de la línea germinal usado. La
secuencia de consenso (SEC ID Nº 42) se representa a debajo del
alineamiento.
La Figura 17 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena ligera de
anticuerpo anti-MUC18, c3.10 (SEC ID Nº 10) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región 02 (SEC ID Nº 43) del
gen V_{k} de la línea germinal usado. La secuencia de consenso
(SEC ID Nº 44) se representa debajo del alineamiento.
La Figura 18 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada de
anticuerpo anti-MUC18, c3.22 (SEC ID Nº 13) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región V4-31
(SEC ID Nº 45) del gen V_{H} de la línea germinal usado. La
secuencia de consenso (SEC ID Nº 46) se representa debajo del
alineamiento.
La Figura 19 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena ligera de
anticuerpo anti-MUC18, c3.22 (SEC ID Nº 14) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región A30 (SEC ID Nº 47)
del gen V_{k} de la línea germinal usado. La secuencia de consenso
(SEC ID Nº 48) se representa debajo del alineamiento.
La Figura 20 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada de
anticuerpo anti-MUC18, c3.27 (SEC ID Nº 17) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región V4-59
(SEC ID ND 49) del gen V_{H} de la línea germinal usado. La
secuencia de consenso (SEC ID Nº 50) se representa debajo del
alineamiento.
La Figura 21 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena ligera del
anticuerpo anti-MUC18, c3.27 (SEC ID Nº 18) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región A30 (SEC ID Nº 51)
del gen V_{k} de la línea germinal. La secuencia de consenso (SEC
ID Nº 52) se representa debajo del alineamiento.
La Figura 22 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada de
anticuerpo anti-MUC18, c3.45 (SEC ID Nº 21) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región V1-18
(SEC ID Nº 53) del gen V_{H} de la línea germinal usado. La
secuencia de consenso (SEC ID Nº 54) se representa debajo del
alineamiento.
La Figura 23 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena ligera de
anticuerpo anti-MUC18, c3.45 (SEC ID Nº 22) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región B3 (SEC ID Nº 55) del
gen V_{k} de la línea germinal usado. La secuencia de consenso
(SEC ID Nº 56) se representa debajo del alineamiento.
La Figura 24 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada de
anticuerpo anti-MUC18, c3.65 (SEC ID Nº 25) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región 4-31
(SEC ID Nº 57) del gen V_{H} de la línea germinal usado. La
secuencia de consenso (SEC ID Nº 58) se representa debajo del
alineamiento.
La Figura 25 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena ligera de
anticuerpo anti-MUC18, c3.65 (SEC ID Nº 26) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región 98 (SEC ID Nº 59) del
gen V_{k} de la línea germinal usado. La secuencia de consenso
(SEC ID Nº 60) se representa debajo del alineamiento.
La Figura 26 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada de
anticuerpo anti-MUC18, c6.1 (SEC ID Nº 29) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región V3-30
(SEC ID Nº 61) del gen V_{H} de la línea germinal usado. La
secuencia de consenso (SEC ID Nº 62) se representa debajo del
alineamiento.
La Figura 27 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena ligera de
anticuerpo anti-MUC18, c6.1 (SEC ID Nº 30) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región A20 (SEC ID Nº 63)
del gen V_{k} de la línea germinal usado. La secuencia de consenso
(SEC ID Nº 64) se representa debajo del alineamiento.
La Figura 28 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada de
anticuerpo anti-MUC18, c6.12, y la secuencia
aminoacídica que codifica la región V4-31 (SEC ID Nº
65) del gen V_{H} de la línea germinal usado. La secuencia de
consenso (SEC ID Nº 66) se representa debajo del alineamiento.
La Figura 29 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena ligera de
anticuerpo anti-MUC18, c6.12, y la secuencia
aminoacídica que codifica la región L2 (SEC ID Nº 67) del gen
V_{k} de la línea germinal usado. La secuencia de consenso (SEC ID
Nº 68) se representa debajo del alineamiento.
La Figura 30 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada de
anticuerpo anti-MUC18, c6.2 (SEC ID Nº 37) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región V4-59
(SEC ID Nº 69) del gen V_{H} de la línea germinal usado. La
secuencia de consenso (SEC ID Nº 70) se representa debajo del
alineamiento.
La Figura 31 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena ligera de
anticuerpo anti-MUC18, c6.2 (SEC ID Nº 38) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región A19 (SEC ID Nº 71)
del gen V_{k} de la línea germinal usado. La secuencia de consenso
(SEC ID Nº 72) se representa debajo del alineamiento.
La Figura 32 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada de
anticuerpo anti-MUC18, c6.9 (SEC ID Nº 33) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región V4-31
(SEC ID Nº 73) del gen V_{H} de la línea germinal usado. La
secuencia de consenso (SEC ID Nº 74) se representa debajo del
alineamiento.
La Figura 33 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada de
anticuerpo anti-MUC18, c6.9 (SEC ID Nº 34) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región L2 (SEC ID Nº 75) del
gen V_{k} de la línea germinal usado. La secuencia de consenso
(SEC ID Nº 76) se representa debajo del alineamiento.
La Figura 34 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena pesada de
anticuerpo anti-MUC18, c6.11.3 (SEC ID Nº 5) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región V4-31
(SEC ID Nº 77) del gen V_{H} de la línea germinal usado. La
secuencia de consenso (SEC ID Nº 78) se representa debajo del
alineamiento.
La Figura 35 representa un alineamiento entre la
secuencia aminoacídica de la región variable de cadena ligera de
anticuerpo anti-MUC18, c6.11.3 (SEC ID Nº 6) y la
secuencia aminoacídica que codifica la región L2 (SEC ID Nº 79) del
gen V_{k} de la línea germinal usado. La secuencia de consenso
(SEC ID Nº 80) se representa debajo del alineamiento.
La Figura 36 representa un resumen de las
secuencias que comprenden las regiones de recombinación V, D, J y N
resultantes de los clones de anticuerpo MUC18 identificados en la
presente invención.
A menos que se definan de otro modo, los
términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen
los mismos significados que entiende normalmente un experto en la
técnica a la que pertenece esta invención. Véanse, por ejemplo,
Singleton y col., "Dictionary of Microbiology and Molecular
Biology" 2ª ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994);
Sambrook y col., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold
Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Con los fines
de la presente invención, se definen a continuación los siguientes
términos.
Como se usa en la presente memoria, el término
"MUC18" designa el polipéptido de superficie celular que es un
miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas con similitud de
secuencia con una serie de moléculas de adhesión celular. MUC18 es
también conocida en la técnica como "MCAM",
"Mel-CAM" o "CD146". Con los fines de
esta invención, de aquí en adelante, se usa "MUC18" para
representar "MCAM", "Mel-CAM" y
"CD146".
El término "c3.19.1" como se usa en la
presente memoria designa un anticuerpo monoclonal IgG2 completamente
humano dirigido contra el antígeno MUC18. El anticuerpo se generó
usando tecnología XenoMouse® (Abgenix, Inc. Fremont, CA) y consiste
en dos cadenas gamma pesada y kappa ligera humanas con un peso
molecular de aproximadamente 150 kDa. C3.19.1 se designa también en
la presente memoria como ABX-MA1 y se une
específicamente a MUC18 humana con alta afinidad (Kd = 6 X
10^{-10} M).
Los términos "actividad biológica" y
"biológicamente activa" con respecto a MUC18 designan la
capacidad de una molécula de afectar específicamente a la
progresión tumoral. Las actividades biológicas preferidas incluyen
la capacidad de inducir crecimiento y metástasis de células
tumorales. El efecto de MUC18 sobre la metástasis de células
tumorales puede incluir la capacidad de inducir la activación de
MMP-2 y/o la migración celular. Es una actividad
biológica preferida adicional la capacidad de inducir la muerte
animal debido a la carga tumoral.
Los términos "actividad biológica" y
"biológicamente activo" con respecto a anticuerpos
anti-MUC18 designan la capacidad de una molécula de
inhibir el crecimiento y la metástasis de células tumorales a menudo
asociadas a la expresión de MUC18. Además, otro mecanismo de acción
o actividad de anticuerpos anti-MUC18 incluye la
capacidad de estimular la internalización de MUC18 y la pérdida
consiguiente de expresión de la superficie celular.
Específicamente, las células tumorales incluyen células tumorales en
pacientes con tumores.
"Reacción en cadena de la polimerasa" o
"PCR" designa un procedimiento o técnica en el que se
amplifican cantidades diminutas de un trozo específico de ácido
nucleico, ARN y/o ADN, como se describe en la patente de EE.UU. nº
4.683.195 expedida el 28 de julio de 1987. Generalmente, tiene que
estar disponible la información de secuencia de los extremos de la
región de interés o más allá, de tal modo que puedan diseñarse
cebadores oligonucleotídicos; estos cebadores serán idénticos o
similares en secuencia a cadenas opuestas del molde a amplificar.
Los nucleótidos 5'-terminales de los dos cebadores
pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR
puede usarse para amplificar secuencias de ARN específicas,
secuencias de ADN específicas del ADN genómico total y ADNc
transcrito a partir de ARN celular total, secuencias de bacteriófago
o plásmido, etc. Véanse, en general, Mullis y col., Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263 (1987); Erlich, ed., "PCR
Technology" (Stockton Press, NY, 1989). Como se usa en la
presente memoria, la PCR se considera que es un ejemplo, pero no el
único, de procedimiento de reacción de polimerasa de ácido nucleico
para amplificar una muestra de ensayo de ácido nucleico que
comprende el uso de un ácido nucleico conocido como cebador y una
polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un trozo
específico de ácido nucleico.
"Tumor", como se usa en la presente
memoria, designa todos los crecimientos y proliferaciones celulares
neoplásicos, tanto malignos como benignos, y todas las células y
tejidos precancerosos y cancerosos.
Los términos "cáncer" y "canceroso"
designan o describen la afección fisiológica en mamíferos que se
caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los
ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, melanoma,
carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores malignos
linfoides. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres
incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células
escamosas epiteliales), cáncer de pulmón incluyendo cáncer de
pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no
pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso pulmonar,
cáncer peritoneal, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de
estómago, incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático,
glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado,
cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer
rectal, cáncer colorrectal, cáncer endometrial o carcinoma uterino,
carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de riñón o renal,
cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma
hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de
cabeza y cuello.
"Anticuerpos" (Ab) e
"inmunoglobulinas" (Ig) son glicoproteínas que tienen las
mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos
exhiben una especificidad de unión a un antígeno específico, las
inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas
similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno.
Los polipéptidos del último tipo se producen, por ejemplo, a bajos
niveles por el sistema linfático y a niveles elevados por
mielomas.
"Anticuerpos e inmunoglobulinas nativos"
son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de
aproximadamente 150.000 Da, compuestas por dos cadenas ligeras (L)
idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera
está ligada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente,
mientras que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas
pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena
pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios
regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un
dominio variable (VH) seguido por una serie de dominios constantes.
Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y
un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la
cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena
pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el
dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos
aminoacídicos particulares forman una interfase entre los dominios
variables de cadena ligera y pesada (Chothia y col. J. Mol.
Biol. 186: 651 (1985; Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad Sci.
U.S.A. 82: 4592 (1985); Chothia y col., Nature 342:
877-883 (1989)).
El término "anticuerpo" en la presente
memoria se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente
anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales,
anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos
biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos
intactos, y fragmentos de anticuerpo, siempre que exhiban la
actividad biológica deseada.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse
a uno de dos tipos claramente distintos, denominados \kappa y
\lambda, basándose en las secuencias aminoacídicas de sus dominios
constantes.
Dependiendo de la secuencia aminoacídica del
dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignarse los
anticuerpos intactos a diferentes "clases". Hay cinco clases
principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y
varias de ellas pueden dividirse adicionalmente en "subclases"
(isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los
dominios constantes de cadena pesada que corresponden a diferentes
clases de anticuerpos se denominan \alpha, \delta,
\varepsilon, \gamma y \mu, respectivamente. Son bien
conocidas las estructuras subunitarias y las configuraciones
tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas.
El término "anticuerpo" incluye todas las
clases y subclases de inmunoglobulinas intactas. El término
"anticuerpo" cubre también fragmentos de anticuerpo. El
término "anticuerpo" cubre específicamente anticuerpos
monoclonales, incluyendo clones de fragmento de anticuerpo.
El término "anticuerpo monoclonal" como se
usa en la presente memoria designa un anticuerpo obtenido a partir
de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos,
concretamente, los anticuerpos individuales que comprenden una
población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de
origen natural que pueden estar presentes en cantidades
minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente
específicos, estando dirigidos contra un sitio antigénico único.
Además, en contraposición con las preparaciones de anticuerpo
policlonal que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra
diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal
está dirigido contra un único determinante en el antígeno. Además de
su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos
porque pueden sintetizarse no contaminados por otros anticuerpos. El
modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo de
estar obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea
de anticuerpos, y no ha de considerarse que requiera la producción
de anticuerpo mediante ningún procedimiento particular. Por
ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usar según la presente
invención pueden prepararse mediante el procedimiento de hibridoma
descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256: 495
(1975), o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN
recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº
4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse
también de bancos de anticuerpo de fagos usando las técnicas
descritas en Clackson y col., Nature, 352:
624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol.,
222: 581-597 (1991), por ejemplo.
Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha
identificado y separado y/o recuperado de un componente de su
entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno
natural son materiales que interferirían con usos de diagnóstico o
terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas
y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones
preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95% en peso
del anticuerpo determinado por el procedimiento de Lowry, y la
secuencia aminoacídica terminal o interna mediante el uso de un
secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante
PAGE-SDS en condiciones reductoras o no reductoras
usando azul de Coomasie o, preferiblemente, tinte de plata. Los
anticuerpos aislados incluyen el anticuerpo in situ en
células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno
natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo,
habitualmente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos
una etapa de purificación.
Por "anticuerpo neutralizante" se quiere
indicar una molécula de anticuerpo que es capaz de eliminar o
reducir significativamente una función efectora de un antígeno
diana al que está unido. En consecuencia, un anticuerpo
anti-MUC18 "neutralizante" es capaz de eliminar
o reducir significativamente una función efectora que puede incluir
la regulación de la adhesión celular, la migración o la activación
de MMP dependiente de MUC18. El anticuerpo puede afectar a la
función de MUC18 estimulando la internalización y degradación de la
molécula, retirando así eficazmente la expresión de superficie
celular del antígeno.
El término "variable" designa el hecho de
que ciertas porciones de los dominios variables difieren
extensamente en secuencia entre los anticuerpos, y se usan en la
unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno
particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida
igualmente por todos los dominios variables de anticuerpos. Está
concentrada en tres segmentos denominados regiones determinantes de
la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, tanto en los
dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las
porciones más altamente conservadas de los dominios variables se
denominan regiones marco conservadas (FR). Los dominios variables
de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro
regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina
\beta, conectadas por tres CDR que forman bucles que conectan y,
en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina \beta.
Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad
por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a
la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos
(véase Kabat y col. (1991)). Los dominios constantes no están
directamente implicados en la unión de un anticuerpo a un antígeno,
pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la
participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de
anticuerpo.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo
que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo.
En una especie Fv bicatenaria, esta región consiste en un dímero de
un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en
estrecha asociación no covalente. En una especie Fv monocatenaria,
pueden ligarse covalentemente un dominio variable de cadena pesada
y uno de cadena ligera mediante un ligamiento peptídico flexible de
tal modo que las cadenas ligera y pesada puedan asociarse en una
estructura "dimérica" análoga a la de una especie Fv
bicatenaria. Es en esta configuración cuando las tres CDR de cada
dominio variable interaccionan definiendo un sitio de unión a
antígeno en la superficie del dímero VH-VL.
Colectivamente, las seis CDR confieren especificidad de unión a
antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio
variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR
específicas de un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y
unirse al antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de
unión entero.
El término "región hipervariable", cuando
se usa en la presente memoria, designa los residuos aminoacídicos
de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La
región hipervariable comprende generalmente residuos aminoacídicos
de una "región determinante de la complementariedad" o
"CDR" (por ejemplo, residuos 24-34 (L1),
50-62 (L2) y 89-97 (L3) en el
dominio variable de cadena ligera y 31-55 (H1),
50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el
dominio variable de cadena pesada; Kabat y col., "Sequences of
Proteins of Immunological Interest", 5ª Ed. Public Health
Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o
aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo,
los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2)
y 91-96 (L3) del dominio variable de cadena ligera
y 26-32 ((H1), 53-55 (H2) y
96-101 (H3) del dominio variable de cadena pesada;
Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917
(1987)). "Región marco conservada" o residuos "FR" son
aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de
región hipervariable como se definen en la presente memoria.
El término "regiones determinantes de la
complementariedad" o "CDR" cuando se usa en la presente
memoria designa partes de receptores inmunológicos que entran en
contacto con un ligando específico y determinan su especificidad.
Las CDR de receptores inmunológicos son la parte más variable de la
proteína receptora, proporcionando a los receptores su diversidad,
y están portados en seis bucles en el extremo distal de los dominios
variables del receptor, procediendo tres bucles de cada uno de los
dos dominios variables del receptor.
El término "epítopo" se usa para designar
sitios de unión para anticuerpos (monoclonales o policlonales) en
antígenos de proteína.
El término aminoácido o residuo aminoacídico,
como se usa en la presente memoria, designa
L-aminoácidos de origen natural o
D-aminoácidos como se describen adicionalmente a
continuación con respecto a las variantes. Se usan en la presente
memoria las abreviaturas de una y tres letras usadas habitualmente
para aminoácidos (Bruce Alberts y col., "Molecular Biology of the
Cell", Garland Publishing, Inc., New York (3ª ed. 1994)).
El término "estado patológico" designa un
estado fisiológico de una célula o de un mamífero entero en el que
ha ocurrido una interrupción, un cese o un trastorno de funciones,
sistemas u órganos celulares o corporales.
El término "tratar" o "tratamiento"
designa tanto tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas
preventivas, en el que el objeto es prevenir o frenar (reducir) un
cambio fisiológico indeseado o trastorno, tal como el desarrollo o
difusión de cáncer. Con los fines de esta invención, resultados
clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación,
alivio de síntomas, reducción de la extensión de la enfermedad,
estado patológico estabilizado (concretamente no empeorado),
retardo o freno de la progresión de la enfermedad, mejora o
paliación del estado patológico y remisión (tanto parcial como
total), tanto detectable como no detectable. "Tratamiento"
puede significar también prolongar la supervivencia en comparación
con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos
que necesitan de tratamiento incluyen aquellos que sufren ya la
afección o trastorno, así como aquellos con tendencia a sufrir la
afección o trastorno o aquellos en que ha de prevenirse la afección
o trastorno.
Un "trastorno" es cualquier afección que se
beneficiaría del tratamiento de la presente invención. Esto incluye
trastornos y enfermedades crónicos y agudos, incluyendo aquellas
afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en
cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se van a
tratar en la presente memoria incluyen tumores benignos y malignos,
leucemias y tumores malignos linfoides, en particular cáncer de
próstata, renal, de ovario, de estómago, endometrial, de glándula
salivar, de riñón, de colon, de tiroides, pancreático, de próstata
o vejiga, y tumores malignos tales como carcinomas cervicales y
neoplasia cervical intraepitelial escamosa y glandular, carcinoma
de células renales (RCC), tumores esofágicos y líneas celulares
derivadas de carcinoma. Un trastorno preferido para tratar
según la presente invención es cáncer renal y de próstata. Un trastorno aún más preferido para tratar es melanoma.
según la presente invención es cáncer renal y de próstata. Un trastorno aún más preferido para tratar es melanoma.
"Mamífero" con fines de tratamiento designa
cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres
humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico,
deportivos o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas,
etc. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
"Lipofección" designa un procedimiento no
vírico práctico para la introducción de información genética en
tejidos diana. Los procedimientos no víricos incluyen procedimientos
químicos o físicos. La lipofección usa un complejo unido
electrostáticamente de lípidos cargados positivamente y ADN cargado
negativamente como vector que se fusiona con la membrana celular y
suministra ADN al citoplasma. La lipofección difiere de los
procedimientos víricos en que la eficacia de la transferencia de
información genética mediante lipofección es menor que mediante
vectores víricos y en que la expresión del gen es transitoria. Como
alternativa, el complejo de lípido y ADN es más estable y más fácil
de manejar en comparación con vectores víricos.
Se da una descripción de las técnicas ejemplares
para la producción de los anticuerpos usados según la presente
invención.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
usando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por
Kohler y col., Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse
mediante procedimientos de ADN recombinante (patente de EE.UU. nº
4.816.567).
En el procedimiento de hibridoma, se inmuniza un
ratón u otro animal hospedador apropiado tal como un hámster o mono
macaco como se describe anteriormente para desencadenar linfocitos
que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán
específicamente a la proteína usada para inmunización. Como
alternativa, pueden usarse para inmunización células que expresan
el antígeno de interés. Como alternativa adicional, pueden
inmunizarse linfocitos in vitro. Los animales se inmunizan
contra los conjugados o derivados inmunogénicos combinando 1 mg o 1
\mug de conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3
volúmenes de coadyuvante completo de Freud e inyectando la
disolución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después,
se refuerzan los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de
conjugado en coadyuvante completo de Freund mediante inyección
subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días después se extrae
sangre a los animales y se ensaya en el suero el título de
anticuerpo anti-MUC18. Se refuerzan los anticuerpos
hasta que el título llega a una meseta. Preferiblemente, se
refuerza el animal con el conjugado del mismo antígeno MUC18, pero
conjugado con una proteína diferente y/o mediante un agente de
reticulación diferente. Los conjugados pueden prepararse también en
cultivo de células recombinantes en forma de fusiones de proteína.
También, se usan agentes de agregación tales como alumbre para
potenciar la respuesta inmune.
Se fusionan después linfocitos, o más
preferiblemente linfocitos enriquecidos en células B, de dichos
animales inmunizados con células de mieloma mediante un proceso de
fusión electrocelular o usando un agente de fusión adecuado tal
como polietilenglicol, formando una célula de hibridoma (Goding,
"Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", pág.
59-109, [Academic Press, 1996]).
Se siembran las células de hibridoma así
preparadas y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que
contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el
crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales
no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales
carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas incluirá
típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas
sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en
HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquellas
que se fusionan eficazmente, soportan una producción estable de
alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo y
son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre éstas, las
líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma
murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón
MOP-21 y MC-11 disponibles en el
Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California,
EE.UU. y células SP-2 o
X63-Ag8-653 disponibles en la
American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. Se
han descrito también líneas celulares de mieloma humano y
heteromieloma de ratón-humano para la producción de
anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:
3001 (1984); Brodeur y col., "Monoclonal Antibody Production
Techniques and Applications", pp. 51-63, Marcel
Dekker, Inc., Nueva York, [1987]).
Se ensaya en el medio de cultivo en el que
crecen las células de hibridoma la producción de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la
especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos
por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o
mediante un ensayo de unión in vitro tal como
radioinmunensayo (RIA) o ensayo de inmunosorción ligado a enzima
(ELISA).
\global\parskip0.900000\baselineskip
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal
puede determinarse, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard de
Munson y col., Anal. Biochem. 107: 220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma
que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o
actividad deseadas, las células pueden subclonarse mediante
procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante
procedimientos estándar (Goding, "Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice", pp. 59-103, Academic
Press, 1996). Los medios de cultivo adecuados con este fin incluyen,
por ejemplo, medio DMEM o RPMI-1640. Además, las
células de hibridoma pueden cultivarse in vivo en forma de
tumores ascíticos en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido
ascítico o suero mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína
A-Sepharose, cromatografía con hidroxiapatito,
electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales
se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos
convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que
son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las
cadenas pesada y ligera de anticuerpos monoclonales). Las células de
hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez
aislado, el ADN puede disponerse en vectores de expresión, que se
transfectan después a células hospedadoras tales como células de
E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster
chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otro modo
proteína inmunoglobulina, obteniéndose la síntesis de anticuerpos
monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN puede
modificarse también, por ejemplo, uniendo covalentemente a la
secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la
secuencia de codificación de un polipéptido no de inmunoglobulina.
De esa manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o
"híbridos" que tienen la especificidad de unión de un
anticuerpo monoclonal anti-MUC18 en los mismos.
Típicamente, se sustituyen dichos polipéptidos
no de inmunoglobulina por los dominios constantes de un anticuerpo
de la invención, o se sustituyen por los dominios variables de un
sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención,
creando un anticuerpo divalente quimérico que comprende un sitio de
combinación con antígeno que tiene especificidad por MUC18 y otro
sitio de combinación con antígeno que tiene especificidad por un
antígeno diferente.
Los anticuerpos quiméricos o híbridos pueden
prepararse también in vitro usando procedimientos conocidos
en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que
implican agentes reticulantes. Por ejemplo, pueden construirse
inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o
formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados con
este fin incluyen iminotiolato y
4-mercaptobutirimidato de metilo.
Los intentos de usar la misma tecnología para
generar mAb humanos han estado obstaculizados por la falta de una
línea celular de mieloma humano adecuada. Se han obtenido los
mejores resultados usando heteromielomas (mielomas híbridos de
ratón x ser humano) como asociados de fusión (Kozbor, J.
Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur, y col., "Monoclonal
Antibody Production Techniques and Applications", pág.
51-63, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987). Como
alternativa, las células secretoras de anticuerpo humano pueden
inmortalizarse mediante infección con virus de
Epstein-Barr (EBV). Sin embargo, las células
infectadas con EBV son difíciles de clonar y habitualmente producen
sólo rendimientos relativamente bajos de imunoglobulina (James y
Bell, J. Immunol. Methods 100: 5-40 [1987]).
En el futuro, la inmortalización de células B humanas podría
conseguirse posiblemente introduciendo una combinación definida de
genes transformantes. Dicha posibilidad está destacada por la
reciente demostración de que la expresión de la subunidad catalítica
telomerasa junto con la oncoproteína T grande de SV40 y un alelo
oncogénico de H-ras daba como resultado la
conversión tumorigénica de células epiteliales y de fibroblasto
humanas normales (Hahn y col., Nature 400:
464-468 [1999]).
Ahora es posible producir animales transgénicos
(por ejemplo, ratones) que son capaces de producir, tras
inmunización, un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de
producción de inmunoglobulina endógena (Jakobovits y col.,
Nature 362: 255-258 [1993]; Lonberg y Huszar,
Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 [1995]; Fishwild
y col., Nat. Biotechnol. 14: 845-851 [1996];
Mendez y col., Nat. Genet. 15: 146-156
[1997]; Green, J. Immunol. Methods 231: 11-23
[1999]; Tomizuka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:
722-727 [2000]; revisado en Little y col.,
Immunol. Today 21: 364-370 [2000]). Por
ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la
región de unión a la cadena pesada de anticuerpo (J_{H}) en
ratones quiméricos y mutantes de línea germinal daba como resultado
la completa inhibición de la producción endógena de anticuerpo
(Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
2551-2555 [1993]). La transferencia del conjunto
génico de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos
ratones mutantes de línea germinal da como resultado la producción
de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno (Jakobovits y
col., Nature 362: 255-258 [1993]).
Mendez y col. (Nature Genetics 15:
146-156 [1997]) han generado una línea de ratones
transgénicos designada como "XenoMouse® II" que, cuando se
exponen a un antígeno, generan anticuerpos completamente humanos de
alta afinidad. Esto se consiguió mediante la integración en línea
germinal de una megabase de loci de cadena pesada y cadena ligera
humana en ratones con deleción en el segmento J_{H} endógeno como
se describe anteriormente. El XenoMouse® II alberga 1.020 kb de
locus de cadena pesada humana que contienen aproximadamente 66 genes
V_{H}, regiones D_{H} y J_{H} completas y tres regiones
constantes diferentes (\mu, \delta y \gamma), y alberga
también 800 kb de locus \kappa humanos que contienen 32 genes
V\kappa, segmentos J\kappa y genes C\kappa. Los anticuerpos
producidos en estos ratones se parecen mucho a los observados en
ratones en todos los aspectos, incluyendo transposición, ensamblaje
y repertorio génicos. Los anticuerpos humanos se expresan
preferiblemente frente a los anticuerpos endógenos debido a la
deleción en el segmento J_{H} endógeno, que evita la
transposición génica en el locus murino.
Las técnicas para generar anticuerpos usando
tecnología XenoMouse® de Abgenix incluyen la inyección de un
antígeno de interés particular en dichos ratones. En los sueros de
dichos animales inmunizados puede examinarse la reactividad de
anticuerpo frente al antígeno inicial. Pueden aislarse linfocitos de
nódulos linfáticos o células de bazo y pueden seleccionarse
adicionalmente células B seleccionando las células CD138 negativas
y CD19+. Los cultivos de células B (BCC) pueden fusionarse con
células de mieloma generando hibridomas como se detalla
anteriormente o examinarse adicionalmente la reactividad contra el
antígeno inicial. Dicho examen incluye ELISA.
La transfección designa la incorporación de un
vector de expresión a una célula hospedadora tanto como si se
expresan de hecho secuencias de codificación como si no. Son
conocidos numerosos procedimientos de transfección por el técnico
experto, por ejemplo, precipitación con CaPO_{4} y
electroporación. La transfección exitosa se reconoce generalmente
cuando aparece cualquier indicación de la operación de este vector
en la célula hospedadora.
En una realización preferida, los anticuerpos de
la presente invención comprenden una cadena pesada de anticuerpo
monoclonal anti-MUC18 humano o un fragmento de la
misma que comprende las siguientes CDR (como se definen por Kabat y
col., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5ª
Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD
(1991), vol. 1-3): (a) CDR1, (b) CDR2 y (c) CDR3. La
cadena pesada de los anticuerpos en una realización de la presente
invención comprende las siguientes secuencias: SEC ID Nº 1, SEC ID
Nº 5, SEC ID Nº 9, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 21, SEC ID
Nº 25, SEC ID Nº 29, SEC ID Nº 33 o SEC ID Nº 37.
En otra realización más, la invención
proporciona una cadena ligera de anticuerpo monoclonal
anti-MUC18 humano o un fragmento de la misma que
comprende las siguientes CDR: (a) CDR1, (b) CDR2 y (c) CDR3. La
cadena ligera de los anticuerpos en una realización de la presente
invención comprende las siguientes secuencias: SEC ID Nº 2, SEC ID
Nº 6, SEC ID Nº 10; SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 18; SEC ID Nº 22; SEC ID
Nº 26; SEC ID Nº 30; SEC ID Nº 34; o SEC ID Nº 38.
En un aspecto, la presente invención incluye
anticuerpos anti-MUC18 tales como c3.19.1 y c6.11.3.
Las secuencias aminoacídica y nucleotídica de cadena pesada de
c3.19.1 están codificadas por las SEC ID Nº 1 y 3, respectivamente,
y las secuencias aminoacídicas y nucleotídicas de cadena pesada de
c6.11.3 están codificadas por 5 y 7, respectivamente. Las
secuencias aminoacídica y nucleotídica de cadena ligera de c3.1.9.1.
están codificadas por las SEC ID Nº 2 y 4, respectivamente, y las
secuencias aminoacídica y nucleotídica de cadena ligera de c6.11.3
están codificadas por 6 y 8, respectivamente.
Se han descrito anteriormente técnicas para
generar anticuerpos. Pueden seleccionarse adicionalmente anticuerpos
con ciertas características biológicas, según se desee.
En una realización de la invención, se usaron
células de melanoma para análisis de la función de anticuerpo
anti-MUC18. Las células de melanoma se derivaron de
una serie de fuentes y poseían una variedad de características que
podrían contribuir potencialmente al fenotipo metastásico. Se
presentan sus fenotipos en la Tabla 1.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, para identificar anticuerpos
anti-MUC18 con alta afinidad por MUC18 humano, se
obtuvieron medidas cinéticas y de afinidad de unión de anticuerpos
anti-MUC18 a partir de experimentos Biacore. Los
experimentos Biacore medían la afinidad de los anticuerpos MUC18
capturados sobre una superficie de proteína A por el antígeno MUC18
marcado y se describen adicionalmente en los ejemplos siguientes.
Los anticuerpos anti-MUC18 con una K_{d} de 6 x
10^{-10} M se consideraron anticuerpos anti-MUC18
de alta afinidad.
En un ejemplo adicional, para determinar si los
anticuerpos anti-MUC18 de la presente invención eran
capaces de reconocer MUC18 desnaturalizada en células de melanoma
humano, se usaron los anticuerpos para inmunotransferencias de
células de melanoma metastásico y células de melanoma no metastásico
(control). Aquellos anticuerpos que fueron capaces de detectar
MUC18 en células de melanoma mestastásico, se seleccionaron como
anticuerpos anti-MUC18 de interés.
Adicionalmente, para identificar los anticuerpos
anti-MUC18 que reconocen la forma nativa de la
proteína MUC18 sobre la superficie de células, se realizó un
análisis de citometría de flujo. Según este ensayo, se separaron
las células que expresan el antígeno de interés de placas de cultivo
celular, se incubaron con un anticuerpo humano de control de
isotipo coincidente o el anticuerpo anti-MUC18
durante 20 minutos a 4ºC. Después de lavar, se incubaron todas las
muestras con fragmentos F(ab')_{2} conjugados con
ficoeritrina de IgG (H+L) antihumana de cabra (Jackson) durante 20
minutos a 4ºC en la oscuridad. Después de varios lavados, las
células se resuspendieron en tampón FACS y se analizaron por
citofluorometría. Aquellos anticuerpos que desplazaban la intensidad
de fluorescencia cuando se comparaban con los anticuerpos de
control se seleccionaron como anticuerpos anti-MUC18
de interés.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, para seleccionar los anticuerpos
anti-MUC18 inhibidores del crecimiento tumoral, se
examinó en anticuerpos su capacidad de inhibir el crecimiento
tumoral en modelos animales. En una realización, el anticuerpo
inhibidor del crecimiento de elección era capaz de inhibir el
crecimiento de células tumorales WM-2664 cuando
crecían subcutáneamente. Para evaluar el efecto del tratamiento con
anticuerpo anti-MUC18 sobre el crecimiento de un
tumor subcutáneo, se recogieron células WM-2664 en
crecimiento exponencial, se resuspendieron y se inyectaron en los
flancos de ratones desnudos BALB/c macho. Empezando el día 3 después
del implante, se trataron los animales con 0,1 mg o 1 mg de
anticuerpos anti-MUC18 o 0,1 mg de anticuerpo humano
de control una vez por semana. Se controló el crecimiento tumoral
semanalmente. Aquellos anticuerpos que inhibían el crecimiento de
células tumorales WM-2264 in vivo se
seleccionaron como anticuerpos inhibidores del crecimiento
tumoral.
Para seleccionar anticuerpos
anti-MUC18 inhibidores del crecimiento tumoral, se
examinó en anticuerpos su capacidad de inhibir la proliferación de
células tumorales en cultivo. Para examinar dichos anticuerpos, se
incubaron células que expresaban diversos niveles de MUC18 en
presencia de anti-MUC18 durante un periodo de
4-5 días. Cada día del experimento, se determinó el
número de células en pocillos por triplicado usando un ensayo de
bromuro de dimetiltiazoldifeniltetrazolio (MTT). Después de
incubación en MTT, se lisaron las células. Se controló la
conversión de MTT en formazano por células metabólicamente viables a
570 nm. Se determinó la capacidad de anticuerpos
anti-MUC18 de afectar al crecimiento o viabilidad
celulares en este ensayo.
Es bien conocido en la técnica que la inhibición
de la actividad MUC18 es importante para el crecimiento
tridimensional de células tumorales de melanoma in vivo,
pero no en cultivo celular (Satyamoorthy y col., Oncogene,
20: 4676 (2001)). Se ensayaron los anticuerpos
anti-MUC18 de la presente invención para determinar
si tenían un efecto sobre la proliferación de célula de melanoma
in vitro. Se incubaron células que expresaban diversos
niveles de MUC18 en presencia de anticuerpo
anti-MUC18 durante un periodo de 4-5
días. En cada día del experimento, se determinó el número de
células en pocillos por triplicado usando un ensayo de bromuro de
dimetiltiazoldifeniltetrazolio (MTT). Después de la incubación
durante 2 horas en medio que contenía MTT, se retiró el medio y se
lisaron las células. Se controló la conversión de MTT en formazano
mediante células metabólicamente viables. Los anticuerpos
anti-MUC18 (c3.19.1) no afectaban al crecimiento o
viabilidad celulares, una característica apoyada por la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Para seleccionar los anticuerpos
anti-MUC18 inhibidores de la metástasis, se examinó
en los anticuerpos la capacidad de inhibir la metástasis en modelos
animales. En una realización, el anticuerpo inhibidor de la
metástasis de elección era capaz de inhibir la formación de
metástasis pulmonares de células de melanoma A375-SM
y WM-2664 in vivo. Para evaluar el efecto
del tratamiento con anticuerpo anti-MUC18 sobre la
metástasis de células de melanoma que se inyectaron en ratones
desnudos, se recogieron células de melanoma A375-SM
y WM-2664 de crecimiento exponencial, se
resuspendieron y se inyectaron en la vena lateral de la cola de
ratones. Se trataron los ratones con anticuerpos
anti-MUC18 empezando el día 3 y una vez por semana
después de ello. Se sacrificaron los ratones 6-8
semanas después. Después de fijar y teñir con disolución de Bouin,
se contaron los nódulos pulmonares con la ayuda de un microscopio
de disección. Aquellos anticuerpos que inhibían las mestástasis
pulmonares en animales inyectados con células tumorales se
seleccionaron como anticuerpos inhibidores de la metástasis.
En un experimento más extenso, se recogieron
células A375SM de crecimiento exponencial el día 0, se
resuspendieron y se inyectaron en las venas laterales de la cola de
ratones desnudos hembra. Se trataron los animales un día antes de
la inyección de células tumorales y una vez por semana después de
ello con una dosis específica de anticuerpo
anti-MUC18. Se sacrificaron todos los animales
después de 6 semanas, en cuyo momento se retiraron los pulmones y
se contaron los nódulos tumorales con la ayuda de un microscopio de
disección. Aquellos anticuerpos que inhibían las mestástasis de
melanoma en el pulmón de manera dependiente de la dosis, se
seleccionaron como anticuerpos inhibidores de la metástasis.
\vskip1.000000\baselineskip
Para seleccionar anticuerpos que aumentan la
supervivencia de animales que portan tumores de melanoma
mestastásicos, se examinó en los anticuerpos la capacidad de
aumentar la supervivencia de ratones que portan tumores. Se
recogieron células tumorales de melanoma humano
WM-2664 en su fase exponencial, se resuspendieron en
tampón adecuado y se inyectaron en la vena lateral de la cola de
ratones BALB/c desnudos macho. Después de la administración de
anticuerpo anti-MUC18 o anticuerpo de control por
vía intraperitoneal a 1 mg o 0,2 mg por ratón semanalmente, se
controló diariamente la supervivencia de los ratones. Aquellos
anticuerpos que demostraron un aumento dependiente de la dosis de
la supervivencia de los ratones se seleccionaron como anticuerpos
prolongadores de la supervivencia.
\vskip1.000000\baselineskip
La metástasis de melanoma está estrechamente
asociada con la expresión de MUC18. Uno de los cambios fenotípicos
asociados a menudo con la metástasis es la capacidad de las células
de migrar e invadir a través de la matriz extracelular.
Para seleccionar anticuerpos que influyen en la
capacidad de células que expresan MUC18 de invadir y migrar a
través de la matriz extracelular, se examinó en los anticuerpos su
capacidad de inhibir la capacidad de las células de migrar e
invadir a través de membranas recubiertas con Matrigel. Para
identificar dichos anticuerpos, se sembraron células que expresaban
MUC18 en placas y se dejaron adherirse. Se retiró después el medio
de crecimiento y se reemplazó por medio de crecimiento reciente que
contenía anticuerpo de control o anticuerpo
anti-MUC18. Después de un periodo de 5 días, se
separaron las células de las placas y se dispusieron en la cámara
superior de una membrana recubierta con Matrigel en medio exento de
suero que contenía anticuerpo de control o
anti-MUC18. Después de un periodo de incubación, se
retiraron las células que permanecían en la cámara superior
mediante rascado y se sometió el filtro inferior a tinción. Se
montaron después las matrices en portaobjetos y se contaron las
células que habían migrado a través de la membrana. Aquellos
anticuerpos que demostraron un efecto inhibidor sobre la capacidad
de las células de melanoma de digerir la matriz extracelular y
migrar hacia el quimioatractor en el lado opuesto se seleccionaron
como anticuerpos inhibidores de la invasión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan formulaciones terapéuticas de
anticuerpos anti-MUC18 de la invención para
almacenamiento mezclando anticuerpo que tiene el grado de pureza
deseado con portadores, excipientes o estabilizantes
fisiológicamente aceptables opcionales (Remington: "The Science
and Practice of Pharmacy", 19ª edición, Alfonso, R., ed, Mack
Publishing Co. (Easton, PA: 1995)), en forma de torta liofilizada o
disoluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes
aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y
concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato,
citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido
ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menor de
aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina sérica,
gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes
quelantes tales como EDTA; azúcares de alcohol tales como manitol o
sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o
tensioactivos no iónicos tales como Tween, Pluronics o
polietilenglicol (PEG).
El anticuerpo anti-MUC18 para
usar para administración in vivo debe ser estéril. Esto se
consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de
filtración estériles, antes o después de la liofilización y
reconstitución. El anticuerpo anti-MUC18 se
almacenará habitualmente en forma liofilizada o en disolución.
Las composiciones terapéuticas de anticuerpo
anti-MUC18 se disponen generalmente en un envase que
tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de
disolución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable por una
aguja de inyección hipodérmica.
La vía de administración de anticuerpo
anti-MUC18 es según procedimientos conocidos, por
ejemplo, inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal,
intracerebral, subcutánea, intramuscular, intraocular,
intraarterial, intracerebroespinal o intralesional, o mediante
sistemas de liberación sostenida como se observa a continuación.
Preferiblemente, el anticuerpo se administra por vía sistémica.
Los ejemplos adecuados de preparaciones de
liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables
en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o
microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen
poliésteres, hidrogeles, polilactidas (documentos U.S. 3.773.919, EP
58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y
gamma-L-glutamato de etilo (Sidman y
col., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)),
poli-(2-hidroxietilmetacrilato) (Langer y col.,
J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) y
Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)),
acetato de etilenvinilo (Langer y col., supra) o poliácido
D-(-)-3-hidroxibutírico (documento
EP 133.988). Las composiciones de anticuerpo
anti-MUC18 de liberación sostenida pueden incluir
también anticuerpo atrapado en liposoma. Los liposomas que
contienen anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos
por sí mismos: documentos DE 3.218.121; Epstein y col., Proc.
Natl. Acad Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang
y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:
4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046;
EP 143.949; EP 142.641; solicitud de patente japonesa
83-118008; U.S. 4.485.045 y 4.544.545 y EP 102.324.
Habitualmente los liposomas son de tipo unilamelar pequeño
(aproximadamente 200-800 \ring{A}) en el que el
contenido de lípido es mayor de aproximadamente el 30% en moles de
colesterol, estando ajustada la proporción seleccionada para la
terapia de anticuerpo óptima.
El anticuerpo anti-MUC18 puede
administrarse también por inhalación. Los nebulizadores
comercialmente disponibles para formulaciones líquidas, incluyendo
nebulizadores de chorro y nebulizadores ultrasónicos, son útiles
para administración. Las formulaciones líquidas pueden nebulizarse
directamente y el polvo liofilizado puede nebulizarse después de
reconstitución. Como alternativa, el anticuerpo
anti-MUC18 puede aerosolizarse usando una
formulación de fluorocarbono y un inhalador de dosis medida, o
inhalarse en forma de un polvo liofilizado y molido.
Una "cantidad eficaz" de anticuerpo
anti-MUC18 para emplear terapéuticamente dependerá,
por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de
administración, el tipo de anticuerpo anti-MUC18
empleado y la afección del paciente. En consecuencia, será
necesario para el médico titular la dosificación y modificar la
administración según sea necesario para obtener el efecto
terapéutico óptimo. Típicamente, el médico administrará el
anticuerpo anti-MUC18 hasta que se alcance una
dosificación que consiga el efecto deseado. El progreso de la
terapia se controla fácilmente mediante ensayos convencionales.
Los anticuerpos específicos de antígenos
tumorales tales como anti-MUC18 son útiles para
dirigirlos a células tumorales para su destrucción. Por ejemplo, la
ricina, una toxina celular derivada de plantas, está encontrando
aplicaciones únicas, especialmente en la lucha contra tumores y
cáncer. Se están descubriendo las implicaciones respecto al uso de
ricina en el tratamiento de tumores. Se ha sugerido que la ricina
tiene una mayor afinidad por células cancerosas que por células
normales (Montfort y col. 1987) y se ha denominado a menudo como una
"bala mágica" para dirigir a tumores malignos. Las toxinas
tales como la ricina permanecen activas incluso si se retira la
cadena B de la toxina. En consecuencia, si se acopla la cadena A
solitaria a un anticuerpo específico de tumor, tal como anticuerpo
anti-MUC18, la toxina tiene una afinidad específica
por células cancerosas frente a células normales (Taylorson 1996).
Por ejemplo, se ha desarrollado la inmunotoxina ricina para dirigir
al antígeno de células T CD5 encontrado a menudo en tumores malignos
de células T y células B (Kreitman y col. 1998). Además, el
enlazamiento de dichos anticuerpos anti-MUC18 con
radioisótopos proporciona ventajas a los tratamientos de tumores.
Al contrario que la quimioterapia y otras formas de tratamiento del
cáncer, la radioinmunoterapia o administración de una combinación
de radioisótopo-anticuerpo se dirige directamente a
las células cancerosas con un daño mínimo del tejido sano normal
circundante. Con esta "bala mágica", el paciente puede
tratarse con cantidades mucho menores de radioisótopos que con otras
formas de tratamiento disponibles hoy en día. Lo más habitual es
que los anticuerpos se conjugan con agentes quimioterapéuticos
potentes tales como maitansina, geldanamicina o calicamicina para
suministro a tumores (Frankel y col., Cancer Biotherapy and
Radiopharmaceuticals, 15: 459-476 (2000); Knoll
y col., Cancer Res., 60: 6089-6094 (2000);
Liu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:
8618-8623 (1996); Mandler y col., J. Natl. Cancer
Inst., 92: 1573-1581 (2000); y Ota y col., Int.
J. Clin. Oncol., 4: 236-240 (1999). Estos
medicamentos son demasiado tóxicos para administrar por sí solos.
Cuando se conjugan con un anticuerpo terapéutico tal como MUC18, su
actividad biológica puede dirigirse específicamente a células
tumorales. En consecuencia, los anticuerpos tales como anticuerpos
MUC18 pueden modificarse para actuar como inmunotoxinas utilizando
técnicas que son bien conocidas en la técnica. Veánse, por ejemplo,
Vitetta y col., Immunol. Today, 14: 252 (1993) y la patente
de EE.UU. nº 5.194.594. Con respecto a la preparación de
anticuerpos radiomarcados, dichos anticuerpos modificados pueden
prepararse también fácilmente utilizando técnicas que son bien
conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Junghans y col.,
"Cancer Chemotherapy and Biotherapy", pág.
655-686 (2ª edición, Chafner y Longo, eds.,
Lippincott Raven (1996)) y las patentes de EE.UU. nº 4.681.581,
4.735.210, 5.101.827, 5.102.990, 5.648.471 y 5.697.901. Será
probable que las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas maten
células que expresan MUC18, y particularmente aquellas células en
las que los anticuerpos de la invención son eficaces.
Los pacientes para tratar con el anticuerpo
anti-MUC18 de la invención incluyen pacientes con
tumores, preferiblemente melanoma y/o cáncer de próstata o renal.
Otros tumores incluyen tumores esofágico, pancreático, colorrectal,
carcinomas tales como carcinoma de células renales (RCC), carcinomas
cervicales y neoplasia escamosa intraepitelial cervical y
glandular, y cánceres tales como cáncer colorrectal, cáncer de mama,
cáncer de pulmón y otros tumores malignos. Los pacientes son
candidatos a terapia según esta invención hasta aquel punto en que
no permanece tejido sano para proteger de la progresión tumoral. Es
deseable administrar un anticuerpo anti-MUC18 lo
antes posible en el desarrollo del tumor y continuar mientras sea
necesario.
En el tratamiento y la prevención de trastornos
asociados a tumor por un anticuerpo anti-MUC18, la
composición de anticuerpo se formulará, se dosificará y se
administrará de modo acorde con una buena práctica médica. Los
factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno
particular que se esté tratando, el mamífero particular que se esté
tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa de
la enfermedad, el sitio de suministro del anticuerpo, el tipo
particular de anticuerpo, el modo de administración, el programa de
administración y otros factores conocidos por los profesionales
médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" de anticuerpo
para administrar estará dictada por dichas consideraciones, y es la
cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar el
trastorno, incluyendo tratar afecciones autoinmunes crónicas y el
mantenimiento de la inmunosupresión en receptores de trasplante.
Dicha cantidad es preferiblemente menor que la cantidad que es
tóxica para el hospedador o vuelve al hospedador significativamente
más susceptible a infecciones.
Como propuesta general, la cantidad
farmacéuticamente eficaz inicial del anticuerpo administrado por vía
parenteral estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg
de peso corporal del paciente al día, siendo el intervalo inicial
típico de anticuerpo usado de 0,3 a 20 mg/kg/día, más
preferiblemente de 0,3 a 15 mg/kg/día. La dosificación deseada
puede suministrarse mediante administración intravenosa rápida
única, mediante administraciones intravenosas rápidas múltiples o
mediante una administración por infusión continua de anticuerpo,
dependiendo del patrón de degradación farmacocinética que el
profesional desee conseguir.
Sin embargo, como se observa anteriormente,
estas cantidades sugeridas de anticuerpo están sujetas en gran
medida a la discrecionalidad terapéutica. El factor clave en la
selección de una dosis y un programa apropiados es el resultado
obtenido, como se indica anteriormente. Por ejemplo, el anticuerpo
puede formularse opcionalmente con uno o más agentes usados
actualmente para prevenir o tratar tumores tales como quimioterapia
estándar o de dosis alta y trasplante de células madre
hematopoyéticas. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende
de la cantidad de anticuerpo anti-MUC18 presente en
la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros
factores discutidos anteriormente. Estos se usan generalmente en las
mismas dosificaciones y vías de administración que se usan
anteriormente en la presente memoria, o aproximadamente del 1 al 99%
de las dosificaciones empleadas hasta el momento.
Pueden encontrarse detalles adicionales de la
invención en el siguiente ejemplo, que define adicionalmente el
alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
En el presente estudio, se prepararon proteínas
MUC18 recombinantes. Se clonó el dominio extracelular (ECD) (aa nº
1-559) de MUC18 humana de células
SK-MEL-28 (ATCC
HTB-72) mediante PCR con transcriptasa inversa
(PCR-TI) con cebadores que incorporan un sitio
EcoRJ en el cebador de codificación y un sitio NheI en el cebador
inverso basándose en la secuencia NCBI publicada (nº de acceso
NM006500).
Los cebadores usados para la amplificación de
ECD de MUC18 fueron los siguientes:
Cebador de codificación:
- 5'-ATATTACGAATTCACTTGCGTCTCGCCCTCCGG-3'
- (SEC ID Nº 10)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso:
- 5'-CAGCTTAGAGCTAGCCGGCTCTCCGGCTCCGGCA-3'
- (SEC ID Nº 11)
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó ADNc de MUC18 (kit de PCR Gene Amp
XL, Perkin Elmer) a partir de ARN (RNAzol, Tel Test, INC) preparado
a partir de células SK-MEL-28 (ATCC
HTB-72). Para la construcción de una proteína de
fusión V5-HIS o HuIgG2, se digirió el producto PCR
de 1700 pb que codifica los aminoácidos 1-559 con
EcoRI y NheI y se ligó en el vector CD147HuIgG2DHFR (ABGX) digerido
con EcoRI y NheI o el vector pcDNA3.1V5HISB (Invitrogen) digerido
con EcoRI y Xbal. Se transfectaron los plásmidos resultantes en
células 293 mediante el procedimiento de CaPO_{4} y después se
purificó la proteína de fusión a partir de medio acondicionado
recogido mediante cromatografía en proteína A
(MUC18-HulgG2) o cromatografía
Ni-NTA (MUC18-V5HIS).
El ECD de MUC18 contenía 4 diferencias
aminoacídicas con la secuencia NCBI publicada: nº 383 D>G, nº 390
P>L, nº 424 K>N y nº 425 L>V.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desarrolló anticuerpo monoclonal contra MUC18
inmunizando secuencialmente ratones XenoMouse (XenoMouse G2,
Abgenix, Inc. Fremont, CA). La inmunización inicial fue con 5 x
10^{6} células SK-MEL-28 mezcladas
1:1 v/v con coadyuvante completo de Freund (CFA). Se hicieron
refuerzos posteriores en primer lugar con 5 x 10^{6} células
SK-MEL-28 mezcladas 1:1 v/v con
coadyuvante incompleto de Freund (IFA), seguido de cuatro
inyecciones con 5 \mug de proteína de fusión
MUC18-Fc de IgG2 soluble humana mezclada 1:1 v/v con
IFA, y después un refuerzo final de 10 \mug de proteína de fusión
MUC18-Fc de IgG2 humana soluble sin coadyuvante. En
particular, se inmunizó cada ratón en la base de la cola mediante
inyección intraperitoneal o mediante inyección en la almohadilla de
la pata trasera con antígeno recombinante MUC18, seguido de la
generación de un gran número de mAb candidatos y el examen en los
anticuerpos de unión y actividad.
Se inyectaron inicialmente los ratones con
antígeno MUC18 a una concentración de 1-5
\mug/ratón. Se inmunizó cada ratón adicionalmente en cada
almohadilla de pata trasera 6 veces adicionales (a intervalos de
3-4 días) con antígeno soluble, específicamente 5
\mug de proteína de fusión MUC18-Fc de IgG2 humana
soluble en DPBS mezclado 1:1 v/v con IFA y después un refuerzo
final de 10 \mug de proteína de fusión MUC18-Fc de
IgG2 humana soluble en DPBS sin coadyuvante. Se inmunizaron los
animales los días 0, 4, 7, 10, 14, 17 y 20 y se realizaron las
fusiones 4 días después el día 4. Para las fusiones, se sacrificaron
los ratones y se recuperaron los nódulos linfáticos inguinales y
poplíteos.
Se liberaron linfocitos de ratones XenoMouse
inmunizados mediante la desestabilización mecánica de los nódulos
linfáticos usando un triturador de tejido y se empobrecieron en
células T mediante selección negativa de CD90. Se realizó la fusión
mezclando células B enriquecidas lavadas y células P2X63Ag8.653 de
mieloma no secretor adquiridas en la ATCC (nº de cat. CRL 1580)
(Kearney y col., J. Immunol., 123: 1548-1550
(1979)) a una relación de 1:1. Se sometió la mezcla celular
suavemente a centrifugación a 800 g. Después de la completa retirada
del sobrenadante, se trataron las células con 2-4
ml de disolución de Pronase (CalBiochem, nº de cat. 53702; 0,5
mg/ml en PBS) durante no más de 2 minutos. Después, se añadieron
3-5 ml de FBS para detener la actividad enzimática,
y se ajustó la suspensión a 40 ml de volumen total usando una
disolución de fusión electrocelular, ECFS (sacarosa 0,3 M, Sigma,
nº de cat. S7903; acetato de magnesio 0,1 mM, Sigma, nº de cat.
M2545; acetato de calcio 0,1 mM, Sigma, nº de cat. C4705). Se
retiró el sobrenadante después de centrifugación y se resuspendieron
las células en 40 ml de ECFS. Se repitió esta etapa de lavado y se
resuspendieron de nuevo las células en ECFS a una concentración de
2x10^{6} células/ml. Se realizó la fusión electrocelular usando un
generador de fusión, modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego,
CA.
Después de la fusión, se resuspendieron las
células en DMEM (JRH Biosciences), 15% de FCS (Hyclone), que
contenía HAT, y se suplementaron con L-glutamina,
pen/estrep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de
Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim) para cultivo a
37ºC y 10% de CO_{2} en aire. Se sembraron las células en placas
de cultivo de tejido de 96 pocillos de fondo plano a 4x10^{4}
células por pocillo. Se mantuvieron los cultivos en medios
enriquecidos con HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) durante
2 semanas antes de transferir a medios enriquecidos con HT
(hipoxantina y timidina). Se seleccionaron los hibridomas por
supervivencia en medio HAT y se examinó en los sobrenadantes de
aquellos pocillos que contenían hibridomas la reactividad a
antígeno por ELISA. El formato ELISA incluía incubar sobrenadantes
en placas recubiertas con antígeno y detectar la unión de
anti-MUC18 humana usando IgG2 de ratón
anti-humana marcada con peroxidasa de rábano picante
(HRP).
Se realizó la clonación en pocillos positivos de
antígeno seleccionados usando siembra de dilución limitada. Se
inspeccionó visualmente en las placas la presencia de crecimiento de
colonia individual, y los sobrenadantes de pocillos de colonia
individual se examinaron después por ELISA específica de antígeno
como se describe anteriormente. Se ensayaron clones altamente
reactivos para verificar la pureza de la cadena gamma y kappa
humanas mediante ELISA múltiple usando un instrumento Luminex.
Basándose en los resultados de ensayo, se
identificaron los siguientes clones como anticuerpos
anti-MUC18: c3.19.1, c6.11.3, c3.10, c3.22, c3.27,
c3.45, c3.65, c6.1, c6.9, c6.2, y c6.12. c6.9 y c6.12 eran clones
identificados individualmente como idénticos. Se analizó en los
anticuerpos de la presente invención la similitud de secuencia con
los genes V_{H} y V_{K} de la línea germinal. Dicho análisis se
resume en la Tabla 2 y la Figura 36. Se alinearon posteriormente
las secuencias aminoacídicas de las regiones variables de cadena
pesada y ligera de los anticuerpos MUC18 de la presente invención
con secuencias V_{H} y V_{K} de la línea germinal,
respectivamente. Estos alineamientos se muestran en las Figuras
16-17 (c3.10), Figuras 18-19
(C3.22), Figuras 20-21 (C3.27), Figuras
22-23 (c3.45), Figuras 24-25
(c3.65), Figuras 26-27 (c6.1), Figuras
28-29 (c6.12), Figuras 30-31 (c6.2),
Figuras 32-33 (c6.9) y Figuras
34-35 (c6.11). c3.19.1 se seleccionó para
caracterización adicional.
Para determinar si el anticuerpo
anti-MUC18 reconocía MUC18 expresada en líneas
celulares de melanoma, se sembraron líneas celulares de melanoma
A375SM, SB2, TXM-13, WM-2664 y
células endoteliales de ratón desnudo (NME) (1 x 10^{6}) en
placas de cultivo de tejido de 100 mm (Falcon) en 10 ml de medio de
crecimiento completo. Después de incubación durante una noche, se
lavaron las placas dos veces con PBS y se rascaron en 400 \mul de
tampón de lisis Triton que contenían un cóctel de inhibidores de
proteasas más DTT. Después de la centrifugación, se determinó la
concentración de proteína usando un kit de BioRad. Se cargaron 40
\mug de proteína en un PAGE-SDS al 10% y se
transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa
de 0,45 \mum (Millipore). Se incubó la membrana en tampón que
contenía anticuerpo anti-MUC18 durante una noche, se
hizo reaccionar con un anticuerpo secundario conjugado (IgG
antihumana) durante 1 hora y se detectaron posteriormente las
proteínas mediante el procedimiento ECL (Amersham Corp) según el
protocolo de los fabricantes.
Los anticuerpos anti-MUC18
detectaron altos niveles de MUC18 en las células A375SM,
TXM-13 y WM-2664 metastásicas y
ninguna señal en la línea celular no metastásica
SB-2 y en las células endoteliales de ratón normales
(NME2) (Figura 2). La razón de la falta de señal en NME2 en este
experimento era debida lo más probablemente a la incapacidad del
anticuerpo anti-MUC18 de reaccionar de forma cruzada
con proteína MUC18 de ratón.
Además, estos resultados corroboran los
hallazgos de otros con respecto a una correlación positiva entre
MUC18 y la capacidad mestastásica de células de melanoma (Shih y
col., Clinical Cancer Res., 2: 569-575
(1996); Johnson y col., Cancer Metastasis Rev., 18:
345-357 (1999); Xie y col., Oncogene, 15
(17): 2069-75 (1997); Xie y col., Cancer
Res., 57 (11): 2295-303 (1997);
Schlagbauer-Wadl y col., Int. J. Cancer, 81
(6): 951-5 (1999)).
Para determinar si el anticuerpo
anti-MUC18 reconocía la forma nativa de la proteína
MUC18 sobre la superficie de células, se realizó un análisis de
citometría de flujo.
Se desprendieron células A375-SM
y WM-2664 (4 X 10^{5}) con
PBS-EDTA y se incubaron en tampón FACS (PBS, 2% de
FBS y 0,02% de azida de sodio) con un anticuerpo IgG2 humano de
control de isotipo coincidente o anticuerpo
anti-MUC18 durante 20 minutos a 4ºC. Después de
lavar con tampón FACS, se incubaron todas las muestras con
fragmentos F(ab')_{2} conjugados con ficoeritrina de IgG
(H+L) antihumana de cabra (Jackson) durante 20 minutos a 4ºC en la
oscuridad. Después de varios lavados, se resuspendieron las células
en tampón FACS y se analizaron por citofluorometría.
Como se muestra en la Figura 3, ni las células
A375-SM ni WM-2664 demostraron un
desplazamiento fluorescente cuando se incubaron en presencia de Ab
IgG2 de control (línea negrita). Sin embargo, cuando se incubaron en
presencia de anti-MUC18 (línea de puntos), se
observó un fuerte desplazamiento de la intensidad de fluorescencia
indicativo de la expresión del antígeno en la superficie celular.
Estos resultados muestran que el anticuerpo
anti-MUC18 puede reconocer al antígeno MUC18 nativo
expresado sobre la superficie de células de melanoma humano.
Se usó un instrumento Biacore 3000 para todas
las medidas cinéticas con tampón HBS-P (disolución
salina tamponada con Hepes, 0,005% de polisorbato 20). Se
realizaron las medidas utilizando 3 chips sensores B1 (matriz de
carboximetildextrano con un bajo contenido de carboxilación). Se
realizaron los experimentos inmovilizando covalentemente proteína A
mediante acoplamiento amina estándar a un nivel de
1500-3000 UR (unidades de resonancia) sobre la
superficie de las cuatro celdas de flujo de un chip B1. Se capturó
el mAb 3.19.1 haciendo fluir una disolución 1 \mug/ml de 3.19.1 a
un caudal de 60 \mul/min durante 20-30 s a través
de la superficie de proteína A, dando un nivel capturado de
110-250 UR. La superficie de proteína A de control
no tenía mAb capturado sobre ella. Se hicieron fluir diversas
concentraciones de antígeno
MUC18-VS-His en el intervalo de 0,5
nM-100 nM a través de la superficie por triplicado
durante 2,5 minutos a 100 \mul/min, y se continuó la fase de
disociación durante 10 min. Se procesaron los datos mediante
"Scrubber", versión 1.10, y se ajustaron no linealmente los
sensorgramas procesados mediante "Clamp", versión 3.40,
empleando un modelo cinético bimolecular 1:1 sencillo (Tabla
3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar el efecto del tratamiento con
anticuerpo anti-MUC18 (c3.19.1) sobre el crecimiento
de un tumor subcutáneo, se recogieron células
WM-2664 de crecimiento exponencial y se
resuspendieron en 0,2 ml de disolución salina equilibrada de Hanks
(HBSS). Se produjeron tumores después de la inyección de 2,5 x
10^{5} células en los flancos de ratones BALB/c macho desnudos.
Empezando el día 3 después del implante, se trataron los animales
con 0,1 mg (n=5) o 1,0 mg (n=5) de c3.19.1 ó 0,1 mg (n=5) de IgG2
humana de control (Jackson Laboratories) una vez por semana. Se
controló semanalmente el crecimiento tumoral y se presentaron los
resultados como media \pm EE
(Figura 4).
(Figura 4).
Los resultados presentados en la Figura 4
demuestran que los anticuerpos anti-MUC18 pueden
inhibir el crecimiento subcutáneo de células
WM-2664 in vivo. Concentraciones tan bajas
como 0,1 mg de anticuerpo anti-MUC18 por semana son
eficaces en este modelo tumoral.
Debido a que la expresión de MUC18 está asociada
muy estrechamente con el fenotipo metastásico en pacientes de
melanoma, se examinó la capacidad del anticuerpo
anti-MUC18 (c3.19.1) de inhibir la formación de
metásasis pulmonares cuando se inyecta por vía subcutánea en las
venas de la cola de ratones desnudos. Se recogieron células de
melanoma A375-SM y WM-2664 en su
fase de crecimiento exponencial, se resuspendieron en disolución
salina equilibrada de Hanks (HBSS) y se inyectaron 2,5 x 10^{5}
células tumorales viables en la vena lateral de la cola. Se
trataron los ratones con la concentración indicada de anticuerpo
anti-MUC18 (c3.19.1) empezando el día 3 y una vez
por semana después de ello. Se sacrificaron los ratones
6-8 semanas después. Después de fijar y teñir con
disolución de Bouin, se contaron los nódulos pulmonares con la ayuda
de un microscopio de disección.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 4, el tratamiento
con anticuerpo anti-MUC18 (c3.19.1) dio como
resultado una reducción significativa del número e incidencia de
metástasis pulmonares en animales inyectados con células tumorales
A375-SM. Se observó la inhibición de las metástasis
pulmonares en ambos grupos de tratamiento de dosis alta y baja. Se
observó también una tendencia hacia una reducción del número de
metástasis en las células WM-2664.
Para corroborar adicionalmente estos datos, se
realizó un experimento más extenso. Se recogieron células
A375-SM de crecimiento exponencial el día 0, se
resuspendieron en disolución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y
se inyectaron 4 x 10^{5} células tumorales viables en las venas
laterales de la cola de ratones hembra desnudos de Harlan
Laboratories. Se trataron los animales un día antes de la inyección
de células tumorales y una semana después de ello con la dosis
indicada de anticuerpo anti-MUC18. Se sacrificaron
todos los animales después de seis semanas, momento en el que se
retiraron los pulmones y se contaron los nódulos tumorales con la
ayuda de un microscopio de disección. Se presentan los resultados
de este experimento en la Tabla 5, y demuestran que el anticuerpo
anti-MUC18 inhibe la formación de tumor pulmonar de
manera dependiente de la dosis. Se redujo el número total de
metástasis pulmonares en todos los animales tratados. En ratones que
recibían 1,0 mg por ratón de dosis de anti-MUC18
(c3.19.1), la carga tumoral era muy baja y ningún animal tenía más
de 50 nódulos en sus pulmones.
Se realizó un estudio adicional in vivo
para evaluar la capacidad del anticuerpo anti-MUC18
(c3.19.1) de aumentar la supervivencia de ratones que portan
tumores de melanoma metastásicos. Se recogieron células tumorales
de melanoma humano WM-2664 en su fase de crecimiento
exponencial y se resuspendieron en PBS. Se inyectaron células
tumorales viables (10^{6} en 0,2 ml de PBS) en la vena lateral de
la cola de ratones desnudos BALB/c macho el día 0. El mismo día, se
administró a los animales PBS (n=21), c3.19.1 (n=12) o anticuerpo
IgG de control de isotipo coincidente (n=12) por vía intraperitoneal
a 1 mg ó 0,2 mg por ratón y después de ello una vez por semana. Se
controló la supervivencia de los ratones cada día. Se realizaron
autopsias de los ratones muertos de diferentes grupos para
confirmar la presencia de metástasis tumorales. Los datos se
expresaron como porcentaje de supervivencia calculado del modo
siguiente: 100 - [100 x (número de ratones muertos/número total de
ratones)].
La Figura 5 demostró que el tratamiento con
anticuerpo anti-MUC18 (c3.19.1) puede prolongar la
supervivencia de ratones que portan tumores de melanoma
metastásicos. Se observó un aumento de la supervivencia dependiente
de la dosis y hasta la fecha no han muerto debido a carga tumoral
animales del grupo que recibió la dosis alta de anticuerpo
anti-MUC18.
La metástasis de melanoma está estrechamente
asociada con la expresión de MUC18. Uno de los cambios fenotípicos
asociados a menudo con la metástasis es la capacidad de las células
de migrar e invadir a través de la matriz extracelular. En
consecuencia, se ensayó en los anticuerpos
anti-MUC18 su capacidad de influir en la capacidad
de las células que expresan MUC18 de invadir y migrar a través de
membranas recubiertas con Matrigel. Se sembraron 5 x 10^{3}
células en placas de seis pocillos y se dejaron adherirse durante 24
horas. En ese momento, se retiró el medio y se reemplazó por medio
de crecimiento reciente que contenía una IgG no específica,
anticuerpo anti-MUC18 o sin adición. Después de 5
días, se despegaron las células de las placas usando
tripsina-EDTA y se contaron. Se dispusieron 5 x
10^{4} células en la cámara superior de membrana recubierta con
Matrigel en medio exento de suero que contenía 100 \mug/ml de
anticuerpo anti-MUC18 (c3.19.1), IgG no específica
o medios exentos de suero solos. Después de la incubación a 37ºC
durante 22 horas, se retiraron las células restantes de la cámara
superior rascando y se tiñó el filtro inferior con
Diff-Quik según las instrucciones del fabricante.
Se montaron las matrices en portaobjetos y se contaron las células
que habían migrado a través de la membrana.
Los datos presentados en la Tabla 6 demuestran
que la exposición de células de melanoma metastásicas a anticuerpo
anti-MUC18 (c3.19.1) inhibía su capacidad de digerir
la matriz extracelular y migrar hacia el quimioatractor dispuesto
en el lado opuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El papel de MUC18 en la progresión del tumor de
melanoma y el mecanismo del anticuerpo anti-MUC18
(c3.19.1) sobre esta diana no se entienden completamente. Aunque el
anticuerpo anti-MUC18 no inhibe el crecimiento de
células tumorales de melanoma en cultivo celular, inhibe el
crecimiento de células tumorales subcutáneas y metastásicas in
vivo. La evidencia acumulada indica que MUC18 desempeña un papel
en una o más etapas del proceso metastásico, posiblemente afectando
a la activación de MMP-2 o a la migración celular.
Cuando se consideran conjuntamente, estos datos proporcionan
evidencias de que el anticuerpo anti-MUC18 es un
anticuerpo terapéutico prometedor para inhibir el crecimiento y la
metástasis de células de melanoma humano en pacientes con esta
enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos específicos de antígenos tales
como anti-MUC18 son útiles para dirigirse a células
tumorales que expresan dichos antígenos para eliminación.
\vskip1.000000\baselineskip
La ricina, una toxina celular, está encontrando
aplicaciones únicas, especialmente en la lucha contra tumores y
cáncer. Se están descubriendo implicaciones respecto al uso de
ricina en el tratamiento de tumores. Se ha sugerido que la ricina
tiene una mayor afinidad por células cancerosas que por células
normales (Montfort y col. 1987) y se ha denominado a menudo como
una "bala mágica" para dirigir a tumores malignos. Las toxinas
tales como la ricina permanecen activas incluso si se retira la
cadena B de la toxina, que es responsable de los efectos
secundarios tóxicos debido a que conduce a la actividad lectina no
específica de la toxina. En consecuencia, si se acopla la cadena A
solitaria a un anticuerpo específico de tumor, la toxina tiene una
afinidad específica por células cancerosas frente a células normales
(Taylorson 1996). Por ejemplo, se ha desarrollado la inmunotoxina
ricina para dirigir al antígeno de células T CD5 encontrado a menudo
en tumores malignos de células T y células B (Kreitman y
col.
1998).
1998).
Se describe un procedimiento novedoso de
acoplamiento de ricina intacta entera con anticuerpo monoclonal en
Pietersz y col. (Cancer Res. 48 (16): 4469-76
(1998)), e incluye bloquear la unión no específica de la cadena B
de ricina. El acoplamiento de los anticuerpos
anti-MUC18 de la presente invención puede hacerse
usando los reactivos bifuncionales anhídrido
S-acetilmercaptosuccínico para el anticuerpo y
3-(2-piridiltio)propionato de succinimidilo
para la ricina. El acoplamiento debería dar como resultado la
pérdida de la actividad de unión de la cadena B, no impidiendo el
potencial tóxico de la cadena A ni la actividad del anticuerpo. Los
conjugados de ricina entera-anticuerpo producidos de
este modo no deberían unirse no específicamente a células diana,
siendo la consecuencia más importante que dichas inmunotoxinas
deberían ser más potentes que los conjugados de
ricina-cadena A y capaces de usarse
in vivo.
in vivo.
\newpage
El enlazamiento de dichos anticuerpos
anti-MUC18 con radioisótopos proporciona ventajas a
los tratamientos tumorales. Al contrario que la quimioterapia y
otras formas de tratamiento del cáncer, la radioinmunoterapia o la
administración de una combinación de
radioisótopo-anticuerpo se dirige directamente a las
células cancerosas con un daño mínimo al tejido sano normal
circundante. Con esta "bala mágica", el paciente puede tratarse
con cantidades mucho menores de radioisótopos que otras formas de
tratamiento disponibles hoy en día. Los radioisótopos preferidos
incluyen itrio^{90} (90Y), indio^{111} (111In), ^{131}I,
^{99}mTc, radioplata-111,
radioplata-199 y bismuto^{213}.
El enlazamiento de radioisótopos con anticuerpos
puede realizarse con quelatos bifuncionales convencionales. Puesto
que la plata es monovalente, para el enlazamiento
radioplata-111 y radioplata-199,
pueden usarse enlazantes basados en azufre (Hazra y col., Cell
Biophys, 24-25: 1-7 (1994)). El
enlazamiento de radioisótopos de plata puede implicar reducir la
inmunoglobulina con ácido ascórbico. En otro aspecto, el tiuxetano
es un quelante enlazante de MX-DTPA unido a
ibritumomab formando tiuxetano de ibritumomab (Zevalin) (Witzig,
T.E, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Supl 1:
S91-5 (2001). El tiuxetano de ibritumomab puede
reaccionar con radioisótopos tales como indio^{111} (111In) o 90Y
formando tiuxetano de ibritumomab-^{111}In o
tiuxatano de ibritumomab-^{90}Y,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos más habituales para tratar el
cáncer se están conjugando con medicamentos quimioterapéuticos
tóxicos tales como maitansina, geldanamicina o calicamicina. Se
emplean con esta tecnología diferentes enlazantes que liberan
medicamentos en condiciones ácidas o reductoras o tras exposición a
proteasas específicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar los efectos in vivo del
tratamiento con anticuerpo anti-MUC18 en pacientes
humanos con tumores, se inyecta a dichos pacientes humanos durante
una cierta cantidad de tiempo una cantidad eficaz de anticuerpo
anti-MUC18. Periódicamente durante el tratamiento,
se controlan los pacientes humanos para determinar si sus tumores
progresan, en particular, si los tumores crecen y metastatizan.
Un paciente de tumor tratado con anticuerpos
anti-MUC18 tiene un menor nivel de crecimiento y
metástasis tumoral comparado con el nivel de crecimiento y
metástasis tumoral en pacientes de tumor tratados con anticuerpos
de control. Los anticuerpos de control que pueden usarse incluyen
anticuerpo del mismo isotipo que los anticuerpos
anti-MUC18 ensayados y, además, pueden no tener la
capacidad de unirse al antígeno tumoral MUC18.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar los efectos in vivo de
conjugados de anticuerpo anti-MUC18, se inyecta a
pacientes humanos o animales que exhiben tumores durante una cierta
cantidad de tiempo una cantidad eficaz de conjugado de anticuerpo
anti-MUC18. En una realización, el conjugado de
anticuerpo anti-MUC18 administrado es conjugado de
maitansina-anticuerpo anti-MUC18 o
conjugado de radioisótopo-anticuerpo
anti-MUC18. Periódicamente durante el tratamiento,
se controlan los pacientes humanos o animales para determinar su
sus tumores progresan, particularmente, si los tumores crecen y
metastatizan.
Un paciente humano o animal que exhibe tumores y
experimenta tratamiento con conjugados de
maitansina-anticuerpo anti-MUC18 o
radioisótopo-anticuerpo anti-MUC18
tiene un nivel menor de crecimiento y metástasis tumoral cuando se
compara con un paciente o animal de control que exhibe tumores y
experimenta tratamiento con conjugados de anticuerpos de control
tales como maitansina-anticuerpo de control o
radioisótopo-anticuerpo de control. Los
maitansina-anticuerpos de control que pueden usarse
incluyen conjugados que comprenden maitansina enlazada con
anticuerpos del mismo isotipo que los anticuerpos
anti-MUC18, pero más específicamente que no tienen
la capacidad de unirse al antígeno tumoral MUC18. Los
radioisótopo-anticuerpos de control que pueden
usarse incluyen conjugados que comprenden radioisótopo enlazado con
anticuerpos del mismo isotipo que los anticuerpos
anti-MUC18, pero más específicamente que no tienen
la capacidad de unirse al antígeno tumoral MUC18.
La siguiente descripción escrita se considera
suficiente para posibilitar a un experto en la técnica practicar la
invención.
\newpage
La lista de referencias citadas por el
solicitante es sólo por utilidad para el lector. No forma parte del
documento de patente europea. Aunque se ha tenido un gran cuidado en
la recopilación de las referencias, no pueden excluirse errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad a este
respecto.
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- \bullet US 4485045 A
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\vskip0.400000\baselineskip
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4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 112
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 337
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
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<211> 107
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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<210> 7
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<211> 352
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
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<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 364
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 117
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 107
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 352
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 322
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 17
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<211> 107
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<211> 322
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<212> ADN
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<211> 123
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 21
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<210> 22
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<211> 113
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<210> 23
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<211> 370
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 23
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<211> 119
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 25
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<211> 358
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 27
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<210> 28
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<211> 322
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<211> 120
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<210> 30
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<211> 107
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 30
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<210> 31
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<211> 367
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 31
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 32
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<210> 33
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<211> 117
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 35
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<210> 36
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 39
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<210> 40
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<211> 337
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
Claims (19)
1. Uso de un anticuerpo monoclonal que comprende
una secuencia aminoacídica de cadena pesada y de cadena ligera, en
el que dicho anticuerpo tiene una secuencia aminoacídica de cadena
pesada y de cadena ligera seleccionada del grupo constituido
por:
SEC ID Nº: 1 y 2,
SEC ID Nº: 5 y 6,
SEC ID Nº: 9 y 10,
SEC ID Nº: 13 y 14,
SEC ID Nº: 17 y 18,
SEC ID Nº: 21 y 22,
SEC ID Nº: 25 y 26,
SEC ID Nº: 29 y 30,
SEC ID Nº: 33 y 34 y
SEC ID Nº: 37 y 38,
y en el que dicho anticuerpo monoclonal se une a
MUC18 para la preparación de un medicamento para inhibir el
crecimiento tumoral.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.
3. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho anticuerpo está conjugado
con un agente terapéutico y/o citotóxico.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que el
agente citotóxico es ricina.
5. Uso según las reivindicaciones 3 ó 4, en el
que el agente terapéutico es un radioisótopo.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, en el que dicho tumor es melanoma.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, en el que dicho tumor es un tumor pulmonar.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 8, en el que dicho tumor es una metástasis tumoral.
9. Uso de un anticuerpo monoclonal que comprende
una secuencia aminoacídica de cadena pesada y de cadena ligera, en
el que dicho anticuerpo tiene una secuencia aminoacídica de cadena
pesada y de cadena ligera seleccionada del grupo constituido
por:
SEC ID Nº: 1 y 2,
SEC ID Nº: 5 y 6,
SEC ID Nº: 9 y 10,
SEC ID Nº: 13 y 14,
SEC ID Nº: 17 y 18,
SEC ID Nº: 21 y 22,
SEC ID Nº: 25 y 26,
SEC ID Nº: 29 y 30,
SEC ID Nº: 33 y 34, y
SEC ID Nº: 37 y 38,
y en el que dicho anticuerpo monoclonal se une a
MUC18 para la preparación de un medicamento para inhibir el
crecimiento de melanoma.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que
dicho anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.
11. Uso según las reivindicaciones 9 ó 10, en el
que dicho anticuerpo se conjuga con un agente terapéutico y/o
citotóxico.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que el
agente citotóxico es ricina.
13. Uso según las reivindicaciones 11 ó 12, en
el que el agente terapéutico es un radioisótopo.
14. Uso de un anticuerpo monoclonal que
comprende una secuencia aminoacídica de cadena pesada y de cadena
ligera, en el que dicho anticuerpo tiene una secuencia aminoacídica
de cadena pesada y de cadena ligera seleccionada del grupo
constituido por:
SEC ID Nº: 1 y 2,
SEC ID Nº: 5 y 6,
SEC ID Nº: 9 y 10,
SEC ID Nº: 13 y 14,
SEC ID Nº: 17 y 18,
SEC ID Nº: 21 y 22,
SEC ID Nº: 25 y 26,
SEC ID Nº: 29 y 30,
SEC ID Nº: 33 y 34, y
SEC ID Nº: 37 y 38,
y en el que dicho anticuerpo monoclonal se une a
MUC18 para la preparación de un medicamento para inhibir el
crecimiento de un tumor metastásico.
15. Uso según la reivindicación 14, en el que
dicha inhibición del crecimiento da como resultado una metástasis
inhibida de dicho tumor que da como resultado una supervivencia
aumentada de dicho animal.
16. Uso según las reivindicaciones 14 ó 15, en
el que dicho anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.
17. Uso según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, en el que dicho anticuerpo está conjugado
con un agente terapéutico y/o citotóxico.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que
el agente citotóxico es ricina.
19. Uso según las reivindicaciones 17 ó 18, en
el que el agente terapéutico es un radioisótopo.
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