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ES2227522T3 - Compuestos aminoalquilo sustituidos. - Google Patents

Compuestos aminoalquilo sustituidos.

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ES2227522T3
ES2227522T3 ES94900587T ES94900587T ES2227522T3 ES 2227522 T3 ES2227522 T3 ES 2227522T3 ES 94900587 T ES94900587 T ES 94900587T ES 94900587 T ES94900587 T ES 94900587T ES 2227522 T3 ES2227522 T3 ES 2227522T3
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ES
Spain
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compounds
cells
group
alkyl
integer
Prior art date
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ES94900587T
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English (en)
Inventor
J. Peter Klein
Gail E. Underiner
Alistair J. Leigh
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CTI Biopharma Corp
Original Assignee
Cell Therapeutics Inc
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Publication date
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Abstract

Compuestos que presentan la fórmula general: **(Fórmula)** incluyendo enantiómeros separados, diastereómeros, hidratos, sales, solvatos y mezclas de los mismos, en la que j es lo un número entero de uno a tres, la parte central es un residuo xantina y los compuestos presentan la fórmula general II **(Fórmula)** en la que R se selecciona de entre el grupo constituido por hidrógeno, átomos halógenos y grupos hidroxilo, amino, benzilo, alquilo (C1-6) o alquenilo con hasta 6 átomos de carbono no sustituidos o sustituidos por un grupo hidroxi, un átomo halógeno o un grupo dimetilamino y al menos un R presenta la fórmula general I: **(Fórmula)** en la que n es un número entero de cuatro a dieciocho; R¿1 y R¿2 son, independientemente, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C1-4) o alquenilo con hasta 4 átomos de carbono, opcionalmente interrumpido por un átomo de oxígeno y R¿3 y R¿4 son, independientemente, un átomo de hidrógeno o un grupo metílico con la condición de que R no sea un alquilaminoC6.

Description

Compuestos aminoalquilo sustituidos.
Campo técnico de la invención
La invención proporciona una clase de compuestos aminoalquilo sustituidos que son agentes efectivos para la inhibición de señales celulares específicas con frecuencia inducidas por estímulos nocivos o inflamatorios o como agentes directa o indirectamente (estimulación inmunitaria) antimicrobianos en las infecciones por levaduras o fúngicas. Más específicamente, los compuestos de la invención tienen al menos un sustituyente que contiene amina unido a una parte central. Los compuestos de la invención son útiles antagonistas para el control de las concentraciones intracelulares de ácidos fosfatídicos no araquinodil sn-2 insaturados y los correspondientes diacilgliceroles derivados del ácido fosfatídico que se producen en respuesta a los estímulos celulares proliferativos.
Antecedentes de la técnica
La pentoxifilina (1-(5-oxohexil)-3,7-dimetilxantina), abreviadamente PTX y expuesta en los documentos de las patentes U.S. nº 3.422.307 y nº 3.737.433, es un derivado de la xantina de amplia utilización médica para el incremento del flujo sanguíneo. Los metabolitos de la PTX han sido resumidos por Davis et al., Applied Environment Microbial. 48:327, 1984. Un metabolito, la 1-(5-hidroxihexil)-3,7-dimetilxantina, designada M1 y expuesta en las patentes U.S. nº 4.515.795 y nº 4.576.947, incrementa el flujo sanguíneo cerebral. Además, las patentes U.S. nº 4.833.146 y nº 5.039.666 exponen el uso de alcoholes terciarios análogos de xantina para aumentar el flujo sanguíneo cerebral. La patente U.S. nº 4.558.051 describe composiciones farmacéuticas que comprenden xantinas y uno o más agentes analgésicos o xantinas y un agente antiinflamatorio y métodos para el uso de dichas composiciones para acelerar el inicio de una respuesta antiinflamatoria o analgésica y para aumentar la respuesta antiinflamatoria o analgésica.
La patente U.S. nº 4.636.507 expone que la PTX y la M1 estimulan la quimiotaxis en los leucocitos polimorfonucleares en respuesta a un estimulador de la quimiotaxis. La PTX y xantinas sustituidas con alcohol terciario relacionadas afectan a la quimiotaxis por inhibición de la actividad de ciertas citocinas (patentes U.S. nº 4.965.271 y nº 5.096.906). La administración de PTX y GM-CSF disminuye las concentraciones de factor de necrosis tumoral (TNF) en los pacientes sometidos a trasplante alogénico de médula ósea (Bianco et al., Blood 76: Suplemento 1 (522A), 1990). La disminución de las complicaciones relacionadas con el trasplante de médula ósea acompañó a la reducción de las concentraciones analizadas de TNF. Sin embargo, en voluntarios normales, las concentraciones de TNF fueron superiores entre los receptores de PTX. Por lo tanto, las elevadas concentraciones de TNF no son la causa primaria de dichas complicaciones.
Por consiguiente, existe una necesidad de disponer de compuestos terapéuticos efectivos que sean seguros y eficaces para su administración a seres humanos y animales y que sean capaces de mantener la homeostasia celular ante una serie de distintos estímulos inflamatorios. La invención es el resultado de la investigación realizada para la búsqueda de tales compuestos.
Sumario de la invención
Los compuestos de la presente invención son útiles en una amplia variedad de indicaciones terapéuticas para el tratamiento o prevención de enfermedades mediadas por señales intracelulares, a través de una o dos vías específicas de señalización intracelular. Además, los compuestos de la invención y las composiciones que contienen dichos compuestos son apropiados para proporcionar dosis efectivas tras su administración a través de las rutas habituales de administración de fármacos (por ejemplo, parenteral, oral, tópica, etc.).
La invención proporciona compuestos de fórmula general:
(R)j - parte central,
incluyendo los enantiómeros separados, diastereómeros, hidratos, sales, disolventes y mezclas de los mismos en los que j es un número entero de uno a tres, la parte central es un residuo xantina y los compuestos tienen la fórmula general II
1
Preferentemente R, unido a los nitrógenos N_{3} y N_{7} de la xantina se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, átomos de flúor o cloro y un grupo amino.
R, se selecciona de entre el grupo constituido por un átomo de hidrógeno, átomos halógenos (preferiblemente, bromo, cloro, flúor y yodo), grupos hidroxilo, amino, bencilo, alquilo (C_{1-6}, preferiblemente metilo) o alquenilo con hasta 6 átomos de carbono, preferiblemente grupos alquilo o alquenilo sustituidos por un grupo hidroxi, un átomo halógeno o un grupo dimetilamino y al menos un R tiene la fórmula general I:
2
en la que n es un número entero entre cuatro y dieciocho; R'_{1} y R'_{2} son, independientemente, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C_{1-4}) o alquenilo con hasta 4 átomos de carbono, y en la que los grupos alquilo o alquenilo son preferiblemente interrumpidos por un átomo de oxígeno; y R'_{3} y R'_{4} son, independientemente, un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, con la condición de que R no sea una alquilamina C_{6}. Preferiblemente, n es un número entero entre cuatro y doce (más preferiblemente entre seis y diez), R'_{1} y R'_{2} son, independientemente átomos de hidrógeno o grupos metilo y R'_{3} y R'_{4} son átomos de hidrógeno.
Preferiblemente, R, unido a los nitrógenos N_{3} y N_{7} de la xantina se seleccionan independientemente del grupo constituido por un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, átomos de flúor o cloro y un grupo amino.
Preferiblemente, los ejemplos de sustituyentes R que no tienen la fórmula I pueden incluir grupos metilo, etilo, isopropilo, n-propilo, isobutilo, n-butilo, t-butilo, 2-hidroxietilo, 3-hidroxipropilo, 3-hidroxi-n-butilo, 5-hidroxihexilo, 2-bromopropilo, 3-dimetilaminobutilo, 4-cloropentilo y similares. Son sustituyentes particularmente preferidos de R los grupos etilo, metilo o átomos de hidrógeno, más preferiblemente grupos metilo y átomos de hidrógeno. Se ejemplifican los compuestos preferidos de la invención.
Los compuestos de la invención pueden ser proporcionados como mezclas de enantiómeros o diastereómeros o en formas separadas o parcialmente separadas. Para la separación de los isómeros ópticos se han utilizado procedimientos estándar. Diferentes variantes de enantiómeros (por ejemplo, estereoisómeros y formas quirales) de los compuestos de la invención pueden tener diferentes actividades farmacológicas, basada en su capacidad para inhibir PAPH y LPAAT. Un isómero óptico, sustancialmente exento del correspondiente enantiómero y/o diastómeros, es al menos aproximadamente el 85% de un isómero óptico relevante, preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de isómero óptico relevante y especialmente al menos aproximadamente el 99% o más de isómero óptico relevante. Más preferiblemente, no serán detectables otras formas ópticas.
Como ejemplo, los compuestos preferidos de la invención incluyen enantiómeros R y S y mezclas racémicas de los siguientes compuestos:
CT1520 1-(5-aminohexil)-3,7-dimetilxantina
CT1520.1 dímero de CT1520
CT1548 1-(7-aminooctil)-3,7-dimetilxantina
CT1557 1-(5-metilaminohexil)-3,7-dimetilxantina
CT1558 1-(5-dimetilaminohexil)-3,7-dimetilxantina
CT3506 1-[5-(undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un producto de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas para su administración al paciente por vía oral, parenteral, ocular o tópica.
La invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto según la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable, siendo las composiciones farmacéuticas formuladas para su administración al paciente por vía oral, parenteral o tópica. Una composición farmacéutica puede, alternativamente, comprender uno o varios compuestos de la invención y un vehículo o excipiente farmacológicamente aceptable. El tratamiento con un compuesto o composición farmacéutica de la invención puede incluir el contacto con el compuesto de la invención en cultivo in vitro, el tratamiento extracorporal o la administración (oral, parenteral o tópica) del compuesto o composición farmacéutica de la invención a un sujeto cuyas células requieren tratamiento.
Los compuestos de la invención son fármacos valiosos para el tratamiento de diversas enfermedades. Las enfermedades se caracterizan, o pueden ser tratadas, por inhibición de la respuesta inmunitaria o de una respuesta celular a estímulos primarios, externos o in situ, estando dicha respuesta celular mediada por un segundo mensajero específico basado en fosfolípido que actúa adyacente a la capa interna de la membrana celular. La vía del segundo mensajero es activada en respuesta a diversos estímulos nocivos o proliferativos, característicos de diversas formas de patología. Más específicamente, los compuestos de la invención son útiles para el tratamiento o prevención de los síntomas clínicos de diferentes enfermedades o para reducir la toxicidad de otros tratamientos mediante la inhibición de la señalización celular a través de la vía de un segundo mensajero que implica la señalización por un ácido fosfatídico intermediario no araquidónico.
Una enfermedad o toxicidad inducida por un tratamiento se selecciona de entre el grupo constituido por: la progresión tumoral en la que existe estimulación del flujo sanguíneo por el tumor (angiogénesis) por producción de factor de crecimiento fibroblástico (FGF), factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) o factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); la invasión tumoral y formación de metástasis por unión a moléculas de adhesión expresadas por las células endoteliales vasculares (VCAM e ICAM); la invasión tisular mediante la producción de metaloproteasa tumoral como la MMP-9; las enfermedades autoinmunitarias causadas por desregulación de los sistemas inmunitarios de las células T o B, tratables mediante supresión de las respuestas de las células T o B; las reacciones alérgicas agudas, incluyendo, aunque sin limitarse, el asma y las enfermedades inflamatorias crónicas mediadas por citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF) y la IL-1, y la artritis reumatoide, osteoartritis, esclerosis múltiple o diabetes mellitas insulinodependiente (IDDM) asociadas al incremento localizado de células inflamatorias y secreción de citocinas inflamatorias y metaloproteasas; la proliferación de células musculares lisas, células endoteliales, fibroblastos y otros tipos celulares en respuesta a factores de crecimiento como PDGF-AA, -BB, FGF, EGF, etc. (por ejemplo, aterosclerosis, reestenosis, ictus y cardiopatía coronaria); la activación del virus de la inmunodeficiencia humana (SIDA y complejo relacionado con el SIDA); la demencia asociada a la infección por el VIH; la proliferación de células mesangiales en el riñón en respuesta a la IL-1, MIP-I\alpha, PDGF ó FGF; la inflamación; la toxicidad renal, glomerular o tubular en respuesta al tratamiento con ciclosporina A o anfotericina B; la toxicidad de otros órganos (por ejemplo, de la mucosa digestiva o pulmonar) en respuesta al tratamiento citotóxico (por ejemplo, fármacos citotóxicos o radiaciones); los efectos de los agentes alquilantes antitumorales; la inflamación en respuesta a estímulos inflamatorios (por ejemplo, TNF, IL-1 y similares) caracterizada por producción de metaloproteasas o las alergias debidas a desgranulación de las células cebadas y los basófilos en respuesta a la IgE o RANTES; las enfermedades óseas causadas por hiperproducción del factor activador de los osteoclastos (OAF) por los osteoclastos; las enfermedades del SNC causadas por sobreestimulación por neurotransmisores proinflamatorios como la acetilcolina, serotonina, leuencefalina o glutamato; las enfermedades inflamatorias agudas como el shock séptico, el síndrome de distrés respiratorio del adulto, la disfunción multiorgánica asociada con la cascada de citocinas inflamatorias y combinaciones de dichos procesos.
En muchos tipos celulares, la señalización depende de la generación de una amplia variedad de especies de PA no araquidonil, algunas de las cuales son generadas a partir de liso-PA por la enzima liso-PA aciltransferasa (LPAAT). La generación de cada una de estas especies de PA (cuyas formas predominantes son compuestos 1-acil y 1-alquil 2-linoleoil PA, generados por la LPAAT) sirve para efectuar la señalización proliferativa y/o inflamatoria en las enfermedades mencionadas en los sistemas celulares descritos más arriba.
Los compuestos de la invención tienen una significación particular para la inhibición de la respuesta proliferativa inducida por la IL-2. La inhibición de la señalización por IL-2 es potencialmente útil en numerosos procesos patológicos en los que existe activación e hiperproliferación de células T. Son ejemplos de enfermedades autoinmunitarias el lupus, la esclerodermia, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la glomerulonefritis, la diabetes mellitas insulinodependiente (IDDM) y también algunos tumores malignos, incluyendo, sin limitarse a la misma, la leucemia mieloide crónica y otros.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una reacción linfocitaria mixta de PTX y tres compuestos de la invención CT1558 (N-(5-dimetilaminohexil)-3,7-dimetilxantina racémica), CT1557 (N-(5-metilaminohexil)-3,7-dimetilxantina racémica) y CT1548 (N-(7-aminooctil)-3,7-dimetilxantina racémica). La reacción linfocitaria mixta muestra una respuesta proliferativa de las PBMC (células mononucleares de la sangre periférica) a la estimulación alogénica determinada en la reacción linfocitaria mixta de tipo bidireccional. Todos los compuestos de la invención analizados fueron más efectivos que la PTX en este procedimiento analítico de la actividad inmunomoduladora.
La Figura 2 muestra una comparación de CT1558 y ciclosporina A (CyA) con respecto a la reversibilidad en la reacción linfocitaria mixta (MLR) y demuestra la capacidad de cada compuesto para inhibir la respuesta proliferativa cuando el CT1558 o la CyA entraban en contacto con la célula, y la recuperación de la respuesta proliferativa al retirar el fármaco. Los datos presentados en la Figura 2 muestran que tanto el CT1558 como la CyA disminuyen la respuesta proliferativa del cultivo mixto de linfocitos. Sin embargo, tras más de 24 horas de tratamiento, la inhibición producida por la CyA era irreversible en tanto que la producida por el compuesto CT1558 era reversible.
La Figura 3 muestra el efecto del CT1520 (racemato de (N-(5-aminohexil)-3,7-dimetilxantina) y CT1548 para la protección de células L929 frente al tratamiento con una concentración tóxica de TNF (factor de necrosis tumoral, 300 ng/ml). Para comparación, también se muestran los resultados con PTX y otro compuesto. Los resultados más potentes se observaron con CT1520 y CT1548. Este es un modelo predictor in vitro del tratamiento y prevención del shock séptico.
La Figura 4 muestra los efectos del CT1558 y CT1548 sobre la proliferación inducida por PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas) de las células del estroma de la médula ósea. La actividad de fondo era aproximadamente el 10% de los valores control.
La Figura 5 muestra el efecto de CT1558 para inhibir la proliferación de la línea celular B Ramos tras la estimulación con anticuerpos anti-mu o PMA acetato de forbol miristato. El compuesto CT1558 inhibió parte de la respuesta proliferativa a los anticuerpos anti mu y PMA.
La Figura 6 muestra un análisis de la proliferación de timocitos cuando son estimulados por Con A e IL-1\alpha. Tanto CT1521 como Ct1558 inhibieron la proliferación de los timocitos.
La Figura 7 muestra los efectos de la 1-[5-(undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina] sobre la proliferación de las células del estroma de la médula ósea inducida por el PDGF.
La figura 8 muestra los efectos inhibidores de la proliferación y activación linfocitaria mixta coestimulada con Con A e IL-2, por el compuesto de la invención 1-[5-(undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina]. Diferentes concentraciones del compuesto de la invención analizado inhiben la proliferación y activación de los timocitos.
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona un tipo de compuestos capaces de controlar el comportamiento de las células mediante una fase particular de un sistema de segundo mensajero (Bursten et al., J. Biol. Chem. 266:20732, 1991). Los segundos mensajeros son lípidos o fosfolípidos y se denominan con las siguientes abreviaturas:
PE = fosfatidiletanolamina
LPE = lisofosfatidiletanolamina
PA = ácido fosfatídico
LPA = ácido lisofosfatídico
DAG = diacilglicerol
LPLD = lisofosfolipasa D
LPAAT = ácido lisofosfatídico aciltransferasa
PAPH = ácido fosfatídico fosfohidrolasa
PLA2 = fosfolipasa A-2
PLD = fosfolipasa D
PAA = ácido fosfoarquidónico
PLA-2 = fosfolipasa A2
PC = fosfatidilcolina
Vía cíclica PA "remodelada" = intermediarios PAA, LPA, PA y DAG sustituidos con 1-saturado, 2-linoleoil o 1,2-dioleoil/1,2-sn-dilinoleoil en las posiciones indicadas sn-1 y sn-2.
"Vía clásica PI" = intermediarios PI, DAG, PA sustituidos con cadenas laterales acilo graso 1-estearoil, 2-araquidonoil.
"PA generado por PLD" = intermediarios PE, PC, LPA, PA y DAG sustituidos con, por ejemplo, cadenas laterales de 1,2-sn-dioleoil, 1-alquil, 2-linoleoil y 1-alquil, 2-docosahaexenoil.
La transferasa del ácido lisofosfatidico (LPAAT) realiza la síntesis del ácido fosfatídico (PA) a partir del ácido lisofosfatídico (LPA) mediante la incorporación de un grupo acilo de la acil CoA. La hidrólisis de la parte fosfato por la PA fosfohidrolasa (PAPH) da lugar a la formación de DAG. Estos aspectos de la vía parecen ser activados inmediatamente (en un minuto) después de la estimulación por un estímulo primario (por ejemplo, una citocina como la IL-1, IL-2 o TNF) que actúa sobre el receptor de la superficie celular. Un efecto detectable inmediatamente es una elevación de las concentraciones de PA y DAG. La administración de los compuestos de la invención revierte esta elevación.
Los compuestos y composiciones farmacéuticas de la invención incluyen inhibidores de subespecies de las enzimas LPAAT y PAPH con especificidad de sustrato para los intermediarios con subespecies 1,2-diinsaturadas, y 1-alquilo, 2-insaturadas. Un ejemplo representativo de este tipo de inhibidor (aunque no del tipo de los compuestos de la invención) es la PTX. La PTX bloquea la PAPH en una vía específica de activación que no implica al PI sino que deriva del PA y está en gran parte constituida por subespecies 1,2-diinsaturadas y 1-alquilo, 2-insaturadas. Esto ha sido demostrado, por ejemplo, con la constatación de que las células mesangiales humanas estimuladas con TNF producen DAG a partir de PI y generan PI en ausencia y en presencia de PTX. En este último sistema no hay datos para sugerir que el PA o el DAG deriven de fuentes distintas del PI. Hay que subrayar que los compuestos de la invención afectan al subgrupo de PAPH y LPAAT relacionado con sustratos con ácidos grasos distintos de araquidonato en la posición sn-2, no a las formas específicas de estas enzimas de la vía del PI.
Cada subclase de fosfolípido de membrana (por ejemplo, PA, PI, PE, PC y PS) alcanza un contenido estable de cadenas laterales acilo graso debido a la remodelación cíclica de la membrana plasmática así como al recambio de cada subclase. El PA es con frecuencia estable pero está presente en cantidades relativamente pequeñas. En las células en reposo el PA consta principalmente de cadenas acilo saturadas, generalmente constituidas por miristato, estearato y palmitato. En las células en reposo, las cadenas acilo laterales del PC constan principalmente de acil palmitato en la posición sn-1 y oleato en posición sn-2. PE y PI están constituidos principalmente por sn-1 estearato y sn-2 araquidonato.
Debido a este característico contenido en grupos acilo en las posiciones sn-1 y sn-2, el origen de cualquiera de las especies de PA puede ser deducido de la naturaleza química de sus grupos acilo en las posiciones sn-1 y sn-2. Por ejemplo, si el PA deriva de la PC por la acción de la enzima PLD, el PA contendrá las características cadenas laterales acilo graso del sustrato PC pasado a través de la vía del segundo mensajero. Además, el origen de cualquier especie de sustrato 1,2-sn puede ser diferenciado con respecto a su origen. Sin embargo, es importante saber si la especie fosfolipídica pasa por una forma PA antes de la hidrólisis a DAG. Puede mostrarse el liso-PA es convertido en PA y luego en DAG. La complejidad de la vía de este segundo mensajero puede ser analizada mediante análisis adecuados de la química de las cadenas laterales acilo (por ejemplo, cromatografía en capa fina, cromatografía gas-líquido o cromatografía líquida de alta presión) de los intermediarios en las células en diferentes tiempos tras la estimulación de la vía del segundo mensajero.
En ciertas células mesenquimatosas, como los neutrófilos y las células mesangiales de rata o humanas pueden activarse varias vías de señalización, correlativamente, simultáneamente, o de ambas formas. Por ejemplo, en los neutrófilos, el F-Met-Leu-Fe estimula la formación de PA por la acción de la PLD, seguido de la formación de DAG por la acción de la PAPH. Varios minutos después se genera DAG a partir de PI por la vía clásica fosfoinositídica. En muchas células, el DAG deriva del PA remodelado a través de un ciclo en el que el PA es hidrolizado en sn-2 por la PLA-2, seguido de la sn-2 transacetilación por la LPAAT, y mediante una vía de la PLD a partir del PA generado de PE o PC, o de ambos sustratos por la PLD.
La presente vía del segundo mensajero implica a sustratos con ácidos grasos insaturados en la posición sn-2 distintos del araquidonato y a las subespecies de PAPH y LPAAT no implicadas en funciones celulares "domésticas" normales que son parte de la vía PI clásica. Las enzimas PAPH y LPAAT implicadas en la presente vía del segundo mensajero son extremadamente estereoespecíficas de diferentes cadenas laterales acilo y formas isoméricas de sustratos. Por lo tanto, los compuestos de la invención son, preferible y sustancialmente enantioméricamente puros.
La PTX bloquea (in vitro) la formación de PA remodelado en la vía PA/DAG con altas concentraciones de PTX (superiores a las que pueden alcanzarse en los pacientes son efectos colaterales limitadores de la dosificación), mediante el bloqueo de la formación de subespecies de PA por LPAAT. Incluso en presencia de PTX, las células continúan formando PA por la acción de PLD y también se forma DAG por la acción de la fosfolipasa C sobre PC y PI. Las últimas vías no son inhibidas por los compuestos de la invención ni por la PTX. En las células tratadas con PTX, disminuye el DAG derivado del PA remodelado y generado por PLA (por ejemplo, 1,2-sn-dioleoil DAG, 1-alquil, 2-linoleoil DAG y 1-alquil, 2-docosahexaneoil DAG). Por lo tanto, los compuestos de la invención y la PTX inhiben la formación sólo de ciertas especies de PA y DAG, inhibiendo selectivamente una vía de segundo mensajero específica que sólo es activada en las células por estímulos nocivos pero que no se utiliza en las funciones celulares "domésticas" normales.
Usos terapéuticos de los compuestos de la invención
La inhibición específica de la activación de la vía del segundo mensajero, tal como se ha descrito más arriba, activada principalmente por diversos estímulos nocivos, sugiere que los compuestos de la invención son de utilidad para el tratamiento de una amplia variedad de indicaciones clínicas. Además, los datos procedentes de estudios in vitro e in vivo aquí presentados proporcionan datos predictores de la posibilidad de tratamiento de una gran variedad de indicaciones clínicas con los compuestos de la presente invención, que inhiben específicamente la vía activada por estímulos nocivos y mediados, por ejemplo, por citocinas inflamatorias, con efectos similares sobre la vía específica del segundo mensajero. De hecho, el mecanismo de acción de los compuestos de la invención explica porqué estos compuestos tienen una amplia variedad de indicaciones clínicas.
La activación de la vía del segundo mensajero es un importante mediador de la respuesta a estímulos nocivos y origina señales celulares que dan lugar, por ejemplo, a inflamación aguda y crónica, respuestas inmunitarias y al crecimiento de las células tumorales. Sin embargo, no todos los inhibidores inhiben todas las enzimas de esta vía de segundo mensajero. Aunque es deseable que los compuestos de la invención puedan inhibir muchos otros estímulos nocivos no mencionados, median de forma más efectiva las afecciones anteriormente mencionadas. Las señales mediadas por la presente vía de segundo mensajero comprenden, por ejemplo, las respuestas celulares directamente al LPS, la activación de los linfocitos T por antígenos, la activación de células B por antígenos, las respuestas celulares a la IL-1 mediada a través del receptor de IL-1 de tipo I (pero no del receptor de IL-1 de tipo II), el receptor de TNF tipo I, el crecimiento estimulado por transformaciones, incluyendo, aunque sin limitarse a los mismos, los oncogenes activados (por ejemplo, ras, abl, her 2-neu y similares), la proliferación de las células musculares lisas por el PDGF, b/FGF e IL-1; la estimulación de las células B y T por IL-2, IL-4 o IL-7 e IL-4 ó IL-6, respectivamente y, de forma más general, la señalización por el receptor de las células T.
In vitro, los compuestos de la invención: (1) bloquean la transducción de señales IL-1 a través del receptor de tipo I como se ha demostrado, por ejemplo, por la inhibición de la inducción de la proliferación del músculo liso, endotelios y células mesangiales renales estimuladas por IL-1 e IL-1 más PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas); (2) suprimen la regulación por incremento de moléculas de adhesión, como se demuestra, por ejemplo, por el bloqueo de la VCAM en las células endoteliales; (3) inhibe las metaloproteasas inducidas por TNF, LPS e IL-1 (un modelo de inflamación); (4) bloquea las metaloproteasas inducidas por LPS, TNF o IL-1 y la producción secundaria de citocinas (para la prevención y tratamiento del shock séptico); (5) suprime la activación de las células T y B por antígenos, por ejemplo, IL-2 e IL-4; (6) inhibe la activación de las células cebadas por la IgE; (7) son citotóxicos para las células transformadas y líneas de células tumorales pero no para las células normales; y (8) bloquean la señalización por IL-2, IL-4, IL-6 e IL-7 en las células B y T.
Los mencionados efectos in vitro dan lugar a los siguientes efectos biológicos in vivo, incluyendo pero sin limitarse, la protección y tratamiento del shock endotóxico y la sepsis inducidos por las bacterias grampositivas o gramnegativas, la inhibición del crecimiento tumoral, la inmunodepresión sinérgica, la actividad en las enfermedades autoinmunitarias y la supresión de las reacciones a los aloinjertos y la estimulación del crecimiento del pelo mediante la reversión de un proceso de apoptosis. Los compuestos de la invención son más potentes cuando se utilizan como prevención y tratamiento del shock séptico, en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, en el tratamiento y prevención de las enfermedades autoinmunitarias y para la estimulación del crecimiento del pelo (en aplicación tópica).
Los compuestos de la invención también son útiles como adyuvantes para la inhibición de los efectos colaterales tóxicos de fármacos cuyos efectos colaterales están mediados por la vía del presente segundo mensajero. Las metaloproteasas median lesiones titulares como las enfermedades glomerulares del riñón, la destrucción articular en la artritis y la destrucción del tejido pulmonar en el enfisema e intervienen en las metástasis tumorales. Tres ejemplos de metaloproteasas son una gelatinasa de tipo V de 92 kD inducida por TNF, IL-1 y PDGF más bFGF, una colagenasa de tipo IV, de 72 kD que habitualmente es constitutiva e inducida por TNF o IL-1 y una estromelisina/PUMP-1 inducida por TNF e IL-1. Los compuestos de la invención pueden inhibir la inducción por el TNF o la IL-1 de la metaloproteasa inducible por gelatinasa de tipo V de 92 kD. Además, los compuestos de la invención pueden reducir la actividad de PUMP-1 inducida por 100 U/ml de IL-1. En consecuencia, los compuestos de la invención previenen la inducción de ciertas metaloproteasas inducidas por IL-1 ó TNF y no están implicados con las proteasas producidas de forma constitutiva (por ejemplo, la colagenasa de tipo IV de 72 kD) que intervienen en la remodelación tisular normal.
Los compuestos de la invención inhiben la transducción de señales mediadas por el receptor de IL-1 de tipo I y, por lo tanto, se consideran antagonistas de IL-1. Un artículo reciente de revisión, titulado "The Role of Interleukin-1 in Disease" (Dinarello and Wolff N. Engl. J. Med. 328, 106, enero 14, 1993) describe el papel de la IL-1 como "un determinante importante, rápido y directo de la enfermedad". "Por ejemplo, en el shock séptico, la IL-1 actúa directamente sobre los vasos sanguíneos induciendo vasodilatación mediante la rápida producción de factor activador de las plaquetas y óxido nítrico en tanto que en las enfermedades autoinmunitarias actúa estimulando a otras células a producir citocinas y enzimas que posteriormente actúan sobre el tejido diana". El artículo describe un grupo de enfermedades mediadas por la IL-1, incluyendo el síndrome séptico, la artritis reumatoide, la enfermedad inflamatoria intestinal, la leucemia mieloide aguda, la diabetes insulinodependiente, la aterosclerosis y otras enfermedades como el rechazo de los injertos, la enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), la psoriasis, el asma, la osteoporosis, la enfermedad periodontal, la tiroiditis autoinmunitaria, la hepatitis alcohólica, el parto prematuro secundario a infecciones uterinas e incluso trastornos del sueño. Como los compuestos de la invención inhiben la señalización celular a través del receptor de IL-1 de tipo I y son antagonistas de IL-1, son útiles para el tratamiento de todos los trastornos anteriormente mencionados.
Por ejemplo, en el síndrome séptico, el mecanismo del shock inducido por la IL.1 parece ser la capacidad de la IL-1 para incrementar las concentraciones plasmáticas de pequeñas moléculas mediadoras como el factor activador de las plaquetas, las prostaglandinas y el óxido nítrico. Estas sustancias son potentes vasodilatadores e inducen shock séptico en los animales de experimentación. El bloqueo de la acción de la IL-1 previene la síntesis y secreción de estos mediadores. En los animales, una inyección intravenosa única de IL-1 disminuye la presión arterial, la resistencia vascular periférica e induce leucopenia y trombocitopenia. En el hombre, la administración intravenosa de IL-1 también disminuye rápidamente la presión arterial y las dosis de 300 ng, o superiores, por kilo de peso pueden causar intensa hipotensión. La ventaja terapéutica del bloqueo de la acción de la IL-1 reside en la prevención de sus deletéreos efectos biológicos sin interferir con la producción de moléculas que intervienen en la homeostasis. Los compuestos de la presente invención están dirigidos a la necesidad identificada por Dinarello y Wolf ya que inhiben la señalización celular sólo a través del receptor de IL-I de tipo I y no a través del receptor de IL-1 de tipo II.
Con respecto a la artritis reumatoide, Dinarello y Wolff señalan "la interleucina-1 está presente en el revestimiento y en el líquido sinovial de los pacientes con artritis reumatoide y los explantes de tejido sinovial de los pacientes producen IL-1 in vitro. Las inyecciones intraarticulares de interleucina-1 a los animales inducen infiltración leucocitaria, destrucción del cartílago y remodelación ósea periarticular. En el cartílago y células óseas aislados, la interleucina-1 induce in vitro la expresión de genes de las colagenasas, fosfolipasas y ciclooxigenasas y el bloqueo de esta acción reduce la artritis inducida por las paredes celulares bacterianas en la rata". Por lo tanto, los compuestos de la invención, como antagonistas de la IL-1, son útiles para la prevención y el tratamiento de la artritis reumatoide.
Con respecto a la enfermedad inflamatoria intestinal, la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn se caracterizan por lesiones infiltrativas del intestino que contienen neutrófilos y macrófagos activados. La IL-1 puede estimular la producción de eicosanoides inflamatorios como la prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) y leucotrieno B_{4} (LTB_{4}) e IL-8, una citocina inflamatoria con propiedades de quimioatracción y estimuladoras de los neutrófilos. En los pacientes con colitis ulcerosa las concentraciones titulares de PGE_{2} y LTB_{4} se correlacionan con la gravedad de la enfermedad y las concentraciones titulares de IL-1 e IL-8 están elevadas en los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal. Por consiguiente, un antagonista de la IL-1, como los compuestos de la invención, sería efectivo para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.
En cuanto a la leucemia mieloide aguda y crónica, hay cada vez más datos de que la IL-1 actúa como factor de crecimiento de dichas células tumorales. Por lo tanto, los compuestos de la invención deben ser efectivos para prevenir el agravamiento de la enfermedad en las leucemias agudas y crónicas.
La diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM) es considerada una enfermedad autoinmunitaria con destrucción de las células beta de los islotes de Langerhans mediada por células inmunocompetentes. Los islotes de los animales con IDDM espontánea (por ejemplo, ratas BB o ratones NOD) contienen células inflamatorias que contienen IL-1. Por lo tanto, los compuestos de la invención deben ser útiles para la prevención y tratamiento de la DMID.
La IL-1 también interviene en el desarrollo de la aterosclerosis. Las células endoteliales son dianas de la IL-1. La IL-1 estimula la proliferación de las células musculares lisas de los vasos. Las células espumosas aisladas de las placas grasas arteriales de los conejos hipercolesterolémicos contienen IL-1\beta y ARN mensajero de IL-1\beta. La captación de monocitos de la sangre periférica da lugar a la iniciación de la producción de IL-1 por dichas células. La IL-1 también estimula la producción de PDGF. En conjunto, estos datos indican que la IL-1 interviene en el desarrollo de las lesiones ateroscleróticas. Por lo tanto, un antagonista de la IL-1, como los compuestos de la invención, debe ser de utilidad para la prevención y tratamiento de la aterosclerosis.
La IL-1 activa (a través del receptor de IL-1 de tipo I) una liso-PA aciltransferasa (LPAAT) y una fosfatidato fosfohidrolasa dentro de los 5 segundos siguientes a la exposición de las células (por ejemplo, células mesangiales humanas, HMC) a esta citocina. La activación de ambas enzimas da lugar a la producción de especies de PA con grupos acilo insaturados sn-1 y sn-2, con la mayoría de cadenas acilo sn-2 poliinsaturadas. Tanto la IL-1 como un producto de la LPAAT, el 1,2-sn dilinoleoil PA, activan una vía de señalización que implica la hidrólisis del PE a PA. Esta reacción se sigue de desfosforilación del PA para producir especies 1,2-sn-diacilglicerol y 1-O-alquil o 1-O-alquenilacilglicerol (AAG). Los compuestos de la invención ejercen su actividad mediante la inhibición de una o ambas enzimas en la capa interna de la membrana plasmática. Por lo tanto, el modelo in vitro apropiado para medir la actividad del fármaco es medir la inhibición de la estimulación causada por una citocina proinflamatoria u otra señal inflamatoria celular.
La generación de la fracción PA sn-2 insaturada por la LPAAT sirve para activar proteínas G o actúa directamente sobre la PLD mediante la alteración de su microambiente lipídico. La activación de la LPAAT y generación de estas especies PA sn-insaturadas es una vía sensible a la energía de la PLD. Esto proporciona un mecanismo para un sistema limitado de receptores para amplificar la señal y generar una respuesta celular mediante la rápida síntesis de pequeñas cantidades de PA. La captación de PA diinsaturado, que es aproximadamente <0,1% del total de la masa lipídica de la membrana, es suficiente para activar la actividad de la PLD. La cuantía de PA es similar a la sintetizada endógenamente por la LPAAT. La PLD estimulada por el PA actúa sobre la PE, que debe estar localizada en la capa interna de la membrana celular, que está enriquecida en PE en comparación con la capa externa. Por lo tanto, la respuesta inflamatoria a la IL-1 es mediada por la vía: IL-1R \rightarrow PA \rightarrow (PAD) \rightarrow PE. En tanto que la respuesta en las localizaciones titulares es: lisoPA \rightarrow PI \rightarrow PKC \rightarrow (PLD) \rightarrow PC. Las especies de PLD suelen ser isoenzimas diferentes. La vía de segundo mensajero cuya activación es inhibida por los compuestos de la invención no es una vía derivada del PI y no implica a la PKC en el curso de la inhibición. La PKC es activada de forma aguda por el DAG derivado del PI pero la activación crónica (por ejemplo, > 30 minutos) es mantenida por el PA derivado de la PC, generada por PLD dirigida a PC. Por tanto, la vía inhibida por los compuestos de la invención está dirigida a la PE y no a la PC. Además, la PLD dirigida a la PE favorece a los sustratos con instauración de cadena larga sn-2.
La DAG y el PA están incrementados en las células transformadas oncogénicamente. Por ejemplo, las mutaciones activadoras de ras dan lugar a incremento de la generación de DAG tras la estimulación con mitógenos aunque las fuentes de DAG son diferentes en distintos sistemas experimentales. En las células mesangiales renales no transformadas, la estimulación por IL-1\beta incrementa la activación de PLA-2 y LPAAT, dando lugar a la generación de PA sn-2 insaturado e hidrólisis posterior a DAG por la fosfatidato fosfohidrolasa. La transformación ras de células NIH/3T3 incrementa la generación de DAG y PA estimulada por el suero. La especie específica de DAG que es estimulada por el suero es dioleoil y para PA son dilinoleoil y dioleoil. Esta regulación por incremento ocurre durante 4-12 horas y el pretratamiento de las células con un compuesto de la invención o PTX bloquea la generación de estos segundos mensajeros fosfolípidos. La inhibición ocurre por supresión de la generación de PA de novo, a partir de la lisoPA o por inhibición de una o ambas rutas del ciclo de Lands. El incremento coordinado de lisoPA en el contexto de disminución de la producción de PA/DAG sugiere inhibición de la transacilación de un lípido precursor. Por lo tanto, la transformación ras media la regulación por incremento del PA mediante la estimulación indirecta de PLA2 y/o LPAAT. Los compuestos de la invención inhiben la conversión de la lisoPA incrementada a PA y subsiguientemente bloquean los cambios fenotípicos inducidos por PA/DAG en la membrana.
La capacidad de los compuestos de la invención para inhibir la generación de fosfolípidos saturados e insaturados se refleja por la capacidad de los mismos para inhibir la proliferación y tumorigenicidad de las células con transformación ras, in vitro e in vivo. La PTX inhibe a las células NIH/3T3 con transformación ras más que a las células parentales. Esta inhibición es reversible y no se asocia a una significativa toxicidad.
La producción excesiva o no regulada de TNF (factor de necrosis tumoral) está implicada en la mediación o exacerbación de ciertas enfermedades como la artritis reumatoide, la espondilitis reumatoide, la osteoartritis, la artritis gotosa y otras afecciones artríticas; en la sepsis, el shock séptico, el shock endotóxico, las sepsis por gramnegativos, el síndrome de shock tóxico, el distrés respiratorio del adulto, la malaria cerebral, la enfermedad pulmonar inflamatoria crónica, la silicosis, la sarcoidosis pulmonar, las enfermedades con reabsorción ósea, las lesiones por reperfusión, la reacción de injerto contra huésped, el rechazo de los injertos, la fiebre, las mialgias debidas a infecciones como la influenza, la caquexia secundaria a las infecciones, el SIDA o los tumores malignos, el SIDA, otras infecciones víricas (por ejemplo, por CMV, influenza, adenovirus, la familia de los herpes), la formación de queloides, la formación del tejido cicatricial, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa o la fiebre. Los compuestos de la invención o sus sales farmacéuticamente aceptables pueden utilizarse para la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de cualquier enfermedad humana o de otros mamíferos, exacerbada o señalada por la vía de un segundo mensajero basado en fosfolípidos celulares (como se ha expuesto aquí) y por una producción excesiva, o regulada por incremento, de citocinas inflamatorias "primer mensajero", tales como el TNF ó la IL-1. Con respecto a la señalización por el TNF como primer mensajero, hay diversas enfermedades en las que la producción excesiva, o regulada por incremento, del TNF por los monocitos/macrófagos está implicada en la exacerbación o causalidad de las mismas. Entre estas enfermedades están las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la endotoxemia o síndrome de shock tóxico (Tracey et al., Nature 330:662, 1987 y Hinshaw et al., Circ. Shock 30:279, 1990); la caquexia (Dezube et al., Lancet 355:662, 1990) y el síndrome de distrés respiratorio del adulto (Miller et al., Lancet 2(8665):712, 1989). Los compuestos de la invención pueden utilizarse tópicamente para las profilaxis de las enfermedades tópicas mediadas o exacerbadas por la producción excesiva de TNF o IL-1, como las infecciones víricas (herpes o conjuntivitis víricas), la psoriasis, las infecciones por hongos o levaduras (tiña, pie de atleta, vaginitis, caspa, etc.) y otras alteraciones hiperproliferativas cutáneas. Las concentraciones elevadas de TNF han sido implicadas en los ataques agudos de la malaria (Grau et al., N. Engl. J. Med. 320:1585, 1989), en las enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas, como la silicosis y la asbestosis (Piguet et al., Nature 344:245, 1990 y Bissonnette et al., Inflammation 13:329, 1989) y en las lesiones de reperfusión (Vedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2643, 1990).
Además, los compuestos de la invención pueden utilizarse para el mantenimiento de la homeostasis en las células que han contactado con el estímulo primario, para mitigar los efectos de estos estímulos primarios sobre las vías de señalización secundarias, invocados en unos segundos tras un estímulo primario. Por ejemplo, la administración de un compuesto de la invención in vivo o ex vivo proporciona un método para modificar el comportamiento celular que comprende el contacto de las células (in vivo o ex vivo) cuyo comportamiento ha de ser modificado con una cantidad efectiva de un compuesto de la invención o de una composición farmacéutica que lo contenga para: (1) inhibir la proliferación de las células tumorales si la cuantía es suficiente para inhibir dicha proliferación; (2) inhibir la activación de las células T, por antígenos o por IL-2, si la cuantía es suficiente para promover inhibir dicha activación; inhibir la activación de los monocitos/macrófagos por endotoxinas, TNF, IL-1 o GM-CSF si la cuantía es suficiente para inhibir dicha activación; (4) inhibir la producción de anticuerpos por las células B en respuesta a un antígeno, IL-4 o ligando CD40, si la cuantía es suficiente para inhibir dicha producción de anticuerpos; (5) inhibir la proliferación de las células musculares lisas en respuesta a factores de crecimiento capaces de estimular dicha proliferación; (6) disminuir la resistencia vascular periférica conferida por las células endoteliales si la cuantía es suficiente para reducir la secreción de sustancias inductoras de hipertensión; (7) disminuir la resistencia vascular periférica conferida por las células endoteliales si la cuantía es suficiente para incrementar la secreción de sustancias antihipertensoras; (8) disminuir la expresión de moléculas de adhesión inducida por estimuladores de las mismas si la cuantía es suficiente para inhibir dicha expresión; (9) inhibir la activación de las células T y macrófagos por el VIH si la cuantía es suficiente para inhibir dicha activación, inhibiendo así la replicación vírica; (10) inhibir la proliferación de las células mesangiales renales en respuesta a la estimulación por IL-1 y/o MIP-1\alpha y/o PDGF y/o FGF si la cuantía es suficiente para inhibir dicha proliferación; (11) aumentar la resistencia de las células glomerulares o tubulares a la ciclosporina A o a la anfotericina B si la cuantía es suficiente para aumentar dicha resistencia; (12) prevenir la secreción de MIP-1\alpha por los monocitos y macrófagos estimulados por IL-1, TNF o endotoxina; (13) prevenir la secreción de factor activador de las plaquetas por los megacariocitos, células fibroblásticas y macrófagos tratados con IL-1, TNF o endotoxina; (14) prevenir la regulación por disminución de los receptores de citocinas TNF en las células progenitoras hematopoyéticas si la cuantía es suficiente para prevenir la mencionada regulación por disminución; (15) inhibir la producción de metaloproteasas por las células epiteliales glomerulares o las células sinoviales estimuladas por IL-1 o TNF si la cuantía es suficiente para disminuir incrementar dicha producción; (16) incrementar la resistencia de las células epiteliales pulmonares o del tubo digestivo frente a los fármacos citotóxicos si la cuantía es suficiente para incrementar dicha resistencia; (17) incrementar el efecto antitumoral de los agentes antitumorales no alquilantes si la cuantía es suficiente para incrementar dicho efecto; (18) inhibir la producción de factor activador de los osteoclastos en respuesta a la IL-1 si la cuantía es suficiente para inhibir dicha producción; (19) inhibir la desgranulación en respuesta a la IgE si la cuantía es suficiente para inhibir dicha desgranulación; (20) incrementar la secreción de los neurotransmisores adrenérgicos dopamina, norepinefrina o epinefrina o el neurotransmisor acetilcolina si la cuantía es suficiente para incrementar dicha secreción; (21) modular los efectos de "corriente lenta" postsináptica de los neurotransmisores adrenérgicos dopamina, epinefrina o norepinefrina o del neurotransmisor acetilcolina si la cuantía es suficiente para modular dichas corrientes lentas; (22) inhibir la señalización por neurotransmisores incluyendo la acetilcolina, la leuencefalina y la serotonina; o (23) incrementar el umbral para las convulsiones.
Los compuestos de la invención pueden inhibir in vivo ciertos efectos del VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), FGF (factor de crecimiento fibroblástico) y PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas), tales como la inhibición de la angiogénesis y las reestenosis. Por ejemplo, Ferns et al., (Science 253:1129, 1991) han mostrado inhibición de la quimiotaxis y angioplastia del músculo liso de la neoíntima en ratas usando un anticuerpo neutralizante anti PDGF. Además, Jawien et al., (J. Clin. Invest. 89:507, 1992) han demostrado que el PDGF promueve la migración del músculo liso y el engrosamiento de la íntima en un modelo de angioplastia con balón en ratas. La inhibición por los compuestos de la invención de los efectos mediados por PDGF tras la angioplastia con balón es el fundamento farmacológico para usar los compuestos de la invención como agentes terapéuticos para prevenir la reestenosis. Los compuestos de la invención también inhiben la aterogénesis porque los elevados valores de PDGF expresados por los macrófagos se asocian con todas las fases de la aterogénesis (Ross et al., Science 248:1009, 1990). Además, muchos tumores humanos expresan valores elevados de PDGF, FGF, receptores de FGF o PDGF u oncogenes celulares mutados con gran homología con estos factores de crecimiento o sus receptores. Por ejemplo, dichas líneas celulares tumorales incluyen líneas de células de sarcoma (Leveen et al., Int. J. Cancer 46:1066, 1990), células de melanoma metastático (Yamanishi et al., Cancer Res. 52:5024, 1992) y tumores gliales (Fleming et al., Cancer Res. 52:4550, 1992).
Por tanto, los compuestos de la invención también son útiles para elevar el umbral de las convulsiones, para estabilizar las sinapsis frente a las neurotoxinas como la estricnina, para potenciar el efecto de los fármacos antiparkinsonianos, como la L-dopa, para potenciar los efectos de los compuestos para el sueño, para aliviar los trastornos de la motilidad resultantes de la administración de tranquilizantes y para disminuir o prevenir la hiperexcitabilidad asociada a la muerte neural progresiva tras accidentes vasculares cerebrales como el ictus. Además, los compuestos de la invención son útiles en el tratamiento de la depresión con déficit de norepinefrina y en las depresiones asociadas a la secreción de glucocorticoides endógenos, para prevenir la toxicidad del sistema nervioso central de la dexametasona o metilprednisolona y para el tratamiento del dolor crónico sin adición al fármaco. También son útiles los compuestos de la invención para el tratamiento de los niños con déficit de atención y del aprendizaje y generalmente mejoran la memoria de los sujetos con déficit orgánicos, incluyendo a los pacientes con enfermedad de Alzheimer.
Análisis in vitro de los efectos fisiológicos y farmacológicos de los compuestos de la invención
Para medir los efectos de los compuestos de la invención en la modulación de la actividad inmunitaria y su actividad antitumoral se pueden utilizar diversos análisis in vitro usando distintos tipos celulares. Por ejemplo, una reacción linfocitaria mixta (MLR) proporciona una útil herramienta de detección para determinar la actividad biológica de cada uno de los compuestos de la invención. En la MLR, se obtienen mononucleares de la sangre periférica (PBMC) extrayendo sangre a voluntarios sanos en un envase heparinizado y se diluye con un volumen igual de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Esta mezcla se deposita en un gradiente de densidad de sacarosa, como el gradiente de Ficoll-Hypaque® (densidad 1,08) y se centrifuga a 1.000 g durante 25 minutos, a la temperatura ambiente o inferior. Los PBMC forman una banda en la interfase plasma-Ficoll; se separan y se lavan al menos dos veces con una solución salina como HBSS. Los hematíes que puedan contaminar se lisan, por ejemplo con ACK durante 10 minutos a 37ºC y se lavan dos veces en HBSS los PBMC. El "pellet" de PBMC purificados se resuspende en un medio completo como RPMI 1640 adicionado con suero humano inactivado al 20%. La respuesta proliferativa de los PBMC a la estimulación alogénica se determina en una MLR bidireccional que se realiza en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Brevemente, se cultivan aproximadamente 10^{5} células PBMC purificadas en 200 \mul de medio completo, conjuntamente con aproximadamente 10^{5} PBMC autólogos (cultivo control) o alogénicos (cultivo estimulado), procediendo las células alogénicas de individuos HLA diferentes. Se añaden dosis diversas de los compuestos (fármacos) al poner las células en los pocillos de la placa de microtitulación. Se incuban los cultivos durante 6 días a 37ºC en atmósfera con CO_{2} al 5%. Al concluir la incubación se añade timidina tritiada (por ejemplo, 1\muCi/pocillo de 40 a 60 Ci/mmol) y se determina la proliferación mediante contador de centelleo líquido.
Otro método para medir la actividad de los compuestos de la invención implica la determinación de la respuesta proliferativa a PDGF, FGF o VEGF usando células de ratón NIH-3T3 Balb o células derivadas del estroma humano. Las células del estroma de la médula ósea humana se siembran (por ejemplo, aproximadamente 2.000 células por pocillo) en un medio definido (por ejemplo 69% de McCoy, 12,5% de suero de ternera fetal, 12,5% de suero de caballo, 1% de antibióticos, 1% de glutamina, 1% de suplemento vitamínico, 0,8% de aminoácidos esenciales, 1% de piruvato sódico, 1% de bicarbonato sódico, 0,4% de aminoácidos no esenciales y 0,36% de hidrocortisona). De dos a tres días después se recolectan las células en un medio exento de suero. Veinticuatro horas después se tratan las células con un agente estimulante como PDGF-AA, PDGF-BB o FGF básico (factor de crecimiento fibroblástico), con o sin IL-1\alpha o TNF, y timidina tritiada. La proliferación celular se determina en un contador de centelleo líquido.
El análisis de la proliferación de las células B determina el efecto de los compuestos de la invención sobre la inhibición de la proliferación de las células B estimuladas por un anticuerpo anti mu (40 \mug/ml), IL-4 o PMA (2,5 nM). Para medir la inhibición de la proliferación celular causada por el agente estimulador se incuban las células tumorales B Ramos o los esplenocitos murinos con un agente estimulador, un compuesto de la invención y timidina tritiada.
Compuestos de la invención
Hemos visto que los compuestos de la invención son útiles en una amplia variedad de indicaciones terapéuticas para modular las enfermedades por señalización intracelular a través de una o dos vías de señalización intracelular específicas. Además, los compuestos y composiciones de la invención son adecuados por las vías normales de administración de agentes terapéuticos (por ejemplo, parenteral, oral, ocular, tópica, etc.).
Los compuestos de la invención también pueden disminuir los valores elevados relevantes de PA y DAG resultantes de la estimulación de los sinaptosomas con acetilcolina y/o epinefrina. Esto sugiere que los efectos de los compuestos de la invención aumentan la secreción de los neurotransmisores inhibidores como la dopamina y modulan los efectos de "corriente lenta" distal de tales neurotransmisores.
Aunque las dosis son variables, la eficacia terapéutica se logra cuando los compuestos de la invención se administran en dosis efectivas subletales, orales, parenterales o intravenosas, de unos 50 a 5.000 mg al día, aproximadamente, dependiendo del peso del paciente. Un régimen particularmente preferido para el tratamiento de la leucemia consiste en 4-50 mg/kg de peso corporal. Sin embargo, hay que entender, que en cualquier individuo en particular, el régimen específico debe ajustarse a las necesidades del individuo y al juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de los compuestos de la invención.
Formulaciones farmacéuticas
La formulación farmacéutica adecuada dependerá de la naturaleza de la afección a tratar, de la naturaleza del medicamento elegido y del juicio del médico que atiende al paciente. En general, los compuestos de la invención están formulados para su administración en inyectables o por vía oral, aunque pueden emplearse otras formas de administración, como las vías transmucosa o transdérmica. Se pueden encontrar formulaciones adecuadas de estos compuestos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (última edición), Mack Publishing Company, Easton, PA.
Los compuestos de la invención y sus sales farmacéuticamente aceptables pueden ser utilizados en una amplia variedad de formas farmacéuticas. La preparación de una sal farmacéuticamente aceptable está determinada por la naturaleza química del propio compuesto y puede ser preparada mediante las técnicas convencionales disponibles. Así pues, si se utiliza un vehículo sólido, la preparación puede ser tableteada, colocada en cápsulas de gelatina dura, en polvo, o "pellet" o en forma de pastillas para chupar. La cantidad de vehículo sólido variará ampliamente pero preferiblemente oscilará entre 25 mg y 1 gramo, en el que la cantidad del compuesto de la invención por dosis puede variar entre aproximadamente 25 g a aproximadamente 1 gramo para un adulto. Cuando se utiliza un vehículo líquido, la preparación puede ser en forma de jarabe, emulsión, cápsula de gelatina blanda, líquido estéril inyectable, como en ampollas o suspensiones líquidas no acuosas. Cuando la composición está en forma de cápsula, es apropiada cualquier forma rutinaria de encapsulación, por ejemplo, usando los vehículos anteriormente mencionados con una cápsula de gelatina dura. Cuando la composición está en forma de gelatina blanda, puede considerarse cualquier vehículo farmacéutico utilizado rutinariamente para preparar suspensiones o dispersiones, por ejemplo, gomas acuosas, celulosas, silicatos o aceites que se introducen en cápsulas de gelatina dura. La formulación en jarabe generalmente consiste en una suspensión o solución del compuesto, o de una de sus sales, en un vehículo líquido (por ejemplo, etanol, polietilenglicol (macrogol), aceite de coco, glicerina o agua) con un agente saborizante o colorante.
La cantidad requerida del compuesto de la invención para obtener un efecto terapéutico en administración tópica dependerá, lógicamente, del compuesto elegido, de la naturaleza y gravedad de la enfermedad y del juicio del médico. La vía parenteral comprende la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranasal, rectal, intravaginal o intraperitoneal. Las formas de dosificación apropiadas para dicha administración pueden preparase mediante las técnicas convencionales. Una composición parenteral típica consiste en una solución o suspensión del compuesto de la invención, o de una de sus sales, en un vehículo estéril o no acuoso que contenga opcionalmente un aceite aceptable para la vía parenteral, por ejemplo macrogol, pilivinilpirrolidona, lecitina, aceite de cacahuete o aceite de sésamo. La dosificación diaria por vía parenteral, adecuada para el tratamiento de la sepsis u otras afecciones inflamatorias graves oscila entre 0,001 mg/kg y 40 mg/kg, aproximadamente, preferiblemente entre 0,01 mg/kg y 20 mg/kg, aproximadamente, de un compuesto de la invención o de una de sus sales farmacéuticamente aceptables, calculada como base libre.
Los compuestos de la invención pueden ser administrados por vía oral. El régimen de dosificación diaria adecuado para la administración oral oscila entre 0,1 mg/kg y 1.000 mg/kg, aproximadamente. Para la administración, la dosificación adecuada oscila entre 0,001 mg/kg a 40 mg/kg, aproximadamente, del compuesto de la invención o de una de sus sales farmacéuticamente aceptable, calculado como base libre. El ingrediente activo puede ser administrado de 1 a 6 veces al día, suficiente para mostrar actividad.
Los compuestos de la invención pueden ser administrados mediante inhalaciones (por ejemplo, por vía nasal u oral). Las formas de dosificación adecuadas comprenden los aerosoles o los inhaladores dosificados, preparados según las técnicas convencionales. La dosis diaria adecuada oscila entre 0,001 mg/kg y 40 mg/kg, aproximadamente, del compuesto de la invención o de una de sus sales farmacéuticamente aceptables, calculado como base libre. Los compuestos típicos para inhalación están en forma de solución, suspensión o emulsión que pueden ser administrados como polvo seco o como aerosol, usando un propulsor convencional.
Ilustran la invención los siguientes ejemplos, que en modo alguno deben ser considerados como limitadores. En estos ejemplos PTX significa pentoxifilina.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra un método de síntesis de 1-(5-aminohexil)-3,7-dimetilxantina (CT1520). Para preparar CT1520 se siguió el método descrito en Koziara and Zwierzak, Tetrahedron Letters 28:6513-6516, 1097. Resumiendo, se añadió gota a gota eterato de trifluoruro bórico (0,06 mol), a 10-30ºC a una solución agitada de 1-(5-hidroxihexil)-3,7- dimetilxantina (0,05 mol) y trimetilsililazida (0,06 mol) en pentano (50 ml). Tras 24 horas a la temperatura ambiente, se volcó la mezcla en 100 ml de agua. Se separó la fase orgánica, se lavó con una solución de bicarbonato de sodio al 10% y se secó sobre sulfato de sodio. La solución de la azida en el pentano se agitó a 25-30ºC y se añadieron 0,05 moles de fosfito trietílico. Se continuó la agitación durante 6 horas y se mantuvo la solución a esta temperatura durante 72 horas. Se evaporó el disolvente, se disolvió el iminofosforano en etanol (15 ml) y se trató con ácido paratoluensulfónico monohidrato (0,05 moles) y agua (0,05 moles). Se llevó la mezcla a reflujo durante ocho horas, se evaporó y se diluyó el residuo con 100 ml de éter. La sal tosilato de la amina se precipitó y se recuperó mediante filtración. A continuación, se añadió hidróxido amónico acuoso al 30% (20 ml) a los cristales y se extrajo la amina libre en diclorometano (3 x 15 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó el disolvente para obtener la amina libre como un aceite viscoso, 0,7 g, con un rendimiento del 50%.
Otro método para síntetizar CT1520 comienza con una solución de PTX (Sigma, 1,39 g, 5,0 mmoles) en metanol (50 ml). Se añadió acetato de amonio (3,85 g, 50 mmoles) y se agitó durante cinco minutos. Se añadió cianoborohidruro de sodio (0,64 g, 10 mmoles) a esta solución, seguido de tamiz molecular de 3\ring{A} (5 g) y se agitó esta mezcla durante 24 horas. Se filtró la mezcla de reacción para separar los sólidos. Se lavaron los sólidos con diclorometano (50 ml) y se lavó el filtrado con agua (50 ml). La fase acuosa se trató con una solución saturada de cloruro amónico (25 ml), se agitó durante 15 minutos y se añadió luego una solución de hidróxido amónico al 30% (20 ml) para hacer básica la fase acuosa. Se extrajo la fase acuosa básica con etanol/diclorometano al 25% (3 x 35 ml). Los extractos combinados se secaron con sulfato magnésico. Se evaporó el disolvente bajo presión reducida para obtener el producto en forma de un aceite viscoso (0,95 g, 3,41 mmoles, 68% de rendimiento).
Ejemplo 2
Este ejemplo ilustra un método para la síntesis de 1-(7'-aminooctil)-3,7-dimetilxantina (CT1548). Se utilizó 8-bromo-2-octanona para alquilar la posición N_{1} de la teobromina, como se describe en el Ejemplo 1. La 1-(2-octanona)-3,7-dimetilxantina resultante (5 mmol) se disolvió en 50 ml de metanol. Se añadió acetato de amonio (50 mmoles) y se agitó la mezcla durante 5 minutos, aireando en una campana. Se añadió cianoborohidruro de sodio (10 mmoles), seguido de tamiz molecular de 3 \ring{A} (3 cucharadas). Tras 24 horas de agitación, se filtró la mezcla por gravedad y se lavaron los sólidos con 50 ml de diclorometano. Los filtrados combinados se lavaron con 50 ml de agua, se secaron con sulfato sódico y se evaporó el disolvente bajo presión reducida. Se trató el residuo con clorhídrico al 5% (25 ml) y se extrajo con éter (2 x 20 ml). Se trató la capa acuosa con una solución saturada de cloruro amónico (20 ml) y se agitó durante 15 minutos. A continuación se añadió hidróxido amónico acuoso al 30% (30 ml) y se extrajo la solución con etanol/diclorometano al 25% (3 x 35 ml). Se secaron sobre sulfato magnésico los extractos combinados y los disolventes se evaporaron bajo presión reducida, obteniéndose 1,02 g, 3,4 mmoles, con 68% de rendimiento de un aceite viscoso.
Otro método para sintetizar CT1548 comienza con una suspensión de NaH (580 mg, 24,2 mmoles) en DMSO (100 ml) y añadiendo teobromina (3,96 g, 22,0 mmoles). Al cabo de 30 minutos se añadió 8-bromo-1-octeno (3,96 g, 22,0 mmoles) y se agitó la mezcla de reacción durante 16 horas a 25ºC. Se volcó la mezcla de reacción sobre 200 ml de agua y se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). Se combinaron las partes orgánicas, se lavó con solución salina (50 ml), se secaron (sulfato de sodio) y se evaporó para obtener 1-(7'-octenil)-3,7-metilxantina como un aceite blanco y espeso que se solidificó al reposar (6,22 g, 97%). Se agitaron en 5 ml de agua/6 ml de ácido sulfúrico durante 16 horas dos gramos (6,89 mmoles) de 1-(7'-octenil)-3,7-metilxantina. Se añadió agua a la mezcla (100 ml) y se realizó una extracción con diclorometano (3 x 50 ml). Se combinaron las fases orgánicas, se secaron (MgSO_{4}) y se evaporaron obteniéndose 1-(7'-hidroxioctil)-3,7-dimetilxantina en forma de un aceite que se solidificó al reposar (1,80 g, 85% de rendimiento). Se añadió 1-(7'-hidroxioctil)-3,7-dimetilxantina (1,92 g, 6,22 mmoles) en 10 ml de diclorometano a una solución de 2,2'-clorocromato de bipiridinio (2,73 g, 9,34 mM) en diclorometano (60 ml)). Se agitó la mezcla de reacción durante 16 horas y se añadió Celite® (1 g). Se filtró la mezcla de reacción a través de un filtro de Celite y se evaporó el filtrado hasta obtener un residuo. Se recristalizó el residuo en diclorometano/éter para obtener 1,52 g de (7'-oxooctil)-3,7-dimetilxantina como un producto sólido ligeramente amarillento, con un rendimiento del 80%. Se agitaron durante 5 minutos la 7'-oxooctil)-3,7-dimetilxantina (192 mg, 0,63 mmoles), acetato de amonio (438 mg, 6,3 mmoles) y tamiz molecular de 4 \ring{A} (1 g) y se añadió N_{2}BH_{3}CN (79 mg, 1,26 mmoles). Se agitó la mezcla de reacción durante 16 horas y se filtró para separar el tamiz molecular. Se lavó la mezcla de reacción con diclorometano para eliminar todos los subproductos. Se trató la capa acuosa con NH_{4}Cl acuoso saturado (25 ml) y NH_{4}OH concentrado (10 ml). Se extrajo la mezcla con etanol/diclorometano al 25% (3 x 20 ml). Se combinaron las fases orgánicas, se secaron (MgSO_{4}) y se evaporaron, obteniéndose CT1548 (mezcla racémica) como un aceite purpúreo que se solidificó lentamente al reposar (80 mg, 42% de rendimiento).
Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra un método para la síntesis de 1-(5-metilaminohexil)-3,7-dimetilxantina (CT1557). Se añadió una solución de PTX (2,0 g, 7,2 mmoles) en metanol (50 ml) a clorhidrato de metilamina (4,85 g, 72 mmoles) y se agitó durante 5 minutos. Se añadió cianobromohidruro de sodio (0,9 g, 14,4 mmoles) y esta solución y se agitó durante 48 horas. Se trató la solución con una solución saturada de cloruro de amonio (70 ml), se agitó durante 1 minuto y se añadió una solución acuosa de hidróxido amónico al 28% (100 ml). Se extrajo la solución con diclorometano (3 x 50 ml) y se secaron (sulfato magnésico) los extractos combinados. Se evaporó el disolvente obteniéndose el producto como un aceite viscoso (2,08 g, 7,10 mmoles), 98% de rendimiento).
Ejemplo 4
Este ejemplo ilustra un método para la síntesis de 1-(5-dimetilaminohexil)-3,7-dimetilxantina (CT1558). Se añadió una solución de PTX (2,0 g, 7,2 mmoles) en metanol (50 ml) a clorhidrato de dimetilamina (5,86 g, 72 mmoles) y se agitó durante 5 minutos. Se añadió cianobromohidruro de sodio (0,9 g, 14,4 mmoles) a esta solución y se agitó durante 42 horas. Se trató la solución con una solución saturada de cloruro de amonio (70 ml), se agitó durante 1 minuto y se añadió una solución acuosa de hidróxido amónico al 28% (50 ml). Se extrajo la solución con diclorometano (3 x 40 ml), se lavaron los extractos combinados con agua (30 ml) y se secaron (sulfato magnésico). Se evaporó el disolvente bajo presión reducida obteniéndose el producto como un aceite viscoso (2,20 g, 7,10 mmoles), 99% de rendimiento).
Ejemplo 5
Este ejemplo ilustra los efectos de CT1558, CT1557 y CT1548 sobre la respuesta proliferativa de las PBMC a la estimulación alogénica, determinada en una reacción linfocitaria mixta bidireccional. A continuación se describe el procedimiento de la reacción linfocitaria mixta bidireccional. Resumiendo, se cocultivan en 200 \mul de medio completo 10^{5} PBMC con 10^{5} células alogénicas. Los cultivos de control autólogos producen recuentos inferiores a 1.000. El fármaco se añade al mismo tiempo que las células. Se incuban los cultivos durante 6 días y se marcan con timidina tritiada para medir la proliferación celular. En este análisis, todos los compuestos de la invención fueron más eficientes que la PTX en la modulación de la actividad inmunitaria (Figura 1).
Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra los efectos reversibles del producto CT1558 y la ciclosporina A (CyA) en un cultivo mixto de linfocitos reversible. Este análisis compara la capacidad de cada fármaco para inhibir la respuesta proliferativa cuando el fármaco entra en contacto con las células y la reanudación de la respuesta proliferativa tras la retirada del fármaco. Los cultivos fueron tratados con 350 \mug de CT1558 ó 3,3 \mug/ml de ciclosporina A, continuamente, durante 6 días antes de pulsar con timidina tritiada. Alternativamente, los cultivos fueron tratados con el fármaco durante 24, 48, 72 ó 96 horas antes del lavado y resuspensión en un medio exento de fármaco y luego pulsados con timidina tritiada. Los resultados de la Figura 2 indican que el CT1558 y la CyA disminuyen la respuesta proliferativa. Sin embargo, la inhibición llevada a cabo por la CyA es irreversible en tanto que la producida por el CT1558 es reversible.
Ejemplo 7
Este ejemplo ilustra los efectos protectores de CT1520, CT1548, CT1521 y PTX sobre las células L929 de ratón de los efectos citotóxicos del TNF. Este procedimiento es un modelo in vitro de shock séptico. Las células LA929 (10^{5}/pocillo) fueron tratadas con 300 ng/ml de TNF humano, con o sin el fármaco (añadido una hora antes que el TNF) en las concentraciones mostradas en la Figura 3. Un día después se tiñeron las células para analizar su viabilidad, usando BCECF y fluorescencia, con un lector de fluorescencia de placas Millipore. Los resultados mostrados en la Figura 3 ilustran los efectos citoprotectores más potentes observados con CT1520 y CT1548.
Ejemplo 8
Este ejemplo ilustra los efectos de CT1548, CT1558 sobre la inhibición de la proliferación de las células del estroma de la médula ósea humana inducida por PDGF. Las células del estroma de la médula ósea humana se mantuvieron en medio exento de suero durante 24 horas y a continuación fueron estimuladas con 50 ng/ml de PDGF-BB. Se añadieron diversas concentraciones de los fármacos una hora antes de la estimulación con el PDGF. Se añadió timidina tritiada en el momento de la estimulación con el PDGF y se esperó a su incorporación por las células durante 24 horas. Se recolectaron las células y se midió la proliferación celular (Figura 4). Las cuentas del fondo (células en medio de cultivo exento de suero) fueron aproximadamente el 10% de los valores control.
Ejemplo 9
Este ejemplo ilustra los efectos inhibidores del CT1558 (250 \mumoles) sobre la proliferación de células B. Se trataron células B Ramos con CT1558 durante una hora antes de su estimulación con anticuerpo anti mu o PMA (5 nM). Un día después se marcaron las células con timidina tritiada y se determinó la proliferación (Figura 5). El CT1558 inhibía la respuesta proliferativa.
Ejemplo 10
Este ejemplo ilustra los efectos del CT1521 y el CT1558 sobre la proliferación de los timocitos estimulados por IL-1 o Con A. Los datos se muestran en la Figura 6. Los fármacos se añadieron 2 horas antes de la estimulación. Ambos fármacos inhibieron la proliferación de los timocitos.
Ejemplo 11
Este ejemplo ilustra un método para la síntesis de 1-[5-(undecilamino)hexil]dimetilxantina. Se agitaron durante 50 minutos una mezcla de teobromina (1,0 g, 5,5 nmoles), de Sigma) e hidruro de sodio en aceite al 50% (264 mg, 5,5 mmoles) y dimetilsulfóxido (20 ml), tras lo cual se añadió 6-bromo-1-hexanol (1,0 g, 5,5 mmoles, de Aldrich). Tras agitar durante 18 horas, se trató la solución con agua (50 ml) y posteriormente se realizó una extracción con dos alícuotas de 25 ml de hexano. Se extrajo la fase acuosa con etanol/diclorometano al 25% (3 x 35 ml) y los extractos en etanol/diclorometano combinados se secaron sobre sulfato de magnesio. Se evaporaron los disolventes bajo presión reducida. El dimetilsulfóxido restante se eliminó por destilación bajo un vacío de 1 Torr (1 mmHg) para obtener así 1,4 g de 1-(6-hidroxihexil)-3,7-dimetilxantina (91% de rendimiento) en forma de polvo blanco.
Se añadió lentamente dimetilsulfóxido (156 ml, 172 mg, 2,2 mmoles) a una solución de cloruro de oxalilo (103 ml, 150 mg, 1,2 mmoles) en diclorometano (5 ml) a -78ºC. Se añadió una solución de 1-(6-hidroxihexil)-3,7-dimetilxantina (300 mg, 1,1 mmoles) en cloruro de metileno (5 ml), seguido de agitación durante 15 minutos. Se retiró el baño frío tras la adición de trietilenamina (765 ml, 555 mg, 5,5 mmoles). A la temperatura ambiente se añadió la reacción a 20 ml de agua y se extrajo con cloruro de metileno (3 x 50 ml). Se combinaron las capas orgánicas y se lavó con solución acuosa de ácido clorhídrico al 1% (20 ml), bicarbonato de sodio saturado (20 ml) y solución salina (20 ml) y a continuación se secó sobre sulfato de sodio. La evaporación del disolvente y recristalización del residuo en cloroformo/éter de petróleo proporcionó 267 mg de 1-(6-oxohexil)-3,7-dimetilxantina (87% de rendimiento).
Se añadió cianoborohidruro de sodio (63 mg, 1,0 mmoles) a una mezcla de 1-(6-oxohexil)-3,7-dimetilxantina (150 mg, 0,5 mmoles), undecilamina (0,43 ml, 2,5 mmoles), solución acuosa de ácido clorhídrico al 38% (0,2 ml, 2,5 mmoles), metanol (5 ml) y tetrahidrofurano (5 ml). La mezcla resultante se agitó durante 48 horas. Se añadió solución acuosa saturada de cloruro amónico (20 ml) a la mezcla agitada, seguido de agitación adicional durante 20 minutos y adición de solución acuosa de hidróxido amónico al 30% (30 ml). Se extrajo la mezcla con metanol/diclorometano al 25% (3 x 35 ml) y se secaron los extractos combinados sobre sulfato de sodio. Se evaporaron los disolventes bajo presión reducida, obteniéndose 190 mg de 1-[5-undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina (86% de rendimiento).
Ejemplo 12
Este ejemplo muestra los efectos de la 1-[5(-undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina sobre la proliferación inducida por PDGF de las células del estroma de la médula ósea. Como en el ejemplo 9, las células del estroma de la médula ósea se mantuvieron en un medio carente de suero durante 24 horas y a continuación fueron estimuladas con 50 ng/ml de PDGF-BB. Se añadieron diferentes concentraciones de los fármacos una hora antes de la estimulación con el PDGF. La timidina tritiada se añadió al tiempo de la estimulación con el PDGF y se permitió la incorporación por las células durante 24 horas. Se recolectaron las células y se midió la proliferación celular con un fondo de cuentas (es decir, el de las células del medio de cultivo carente de suero) aproximadamente del 10% de los valores control. La Figura 7 ilustra la inhibición de la proliferación inducida por el PDGF por diferentes concentraciones (\muM) de los compuestos de la invención.
Ejemplo 13
Este ejemplo muestra el efecto inhibidor de diferentes concentraciones (IC50) del compuesto de la invención 1-[5-(undecilamino)hexil]-3,7-dimetilxantina sobre la activación y proliferación de timocitos murinos coestimulados con concanavalina A (Con A) e interleucina-2 alfa (IL-2). La Con A, usada para activar los linfocitos CD3, junto a la coestimulación con IL-2 induce la proliferación y diferenciación de las células T.
Las glándulas tímicas obtenidas de ratones Balb/C normales se fragmentaron y se sembraron en placas de 96 pocillos con una densidad de 2 x 10^{5} células por pocillo. Se añadió a los pocillos Con A (0,25 mg/ml) e IL-2 (15 U/ml). Se incubaron las células durante 4 días a 37ºC. El día 4 se incorporó la timidina tritiada y se incubó durante 4 horas adicionales. La timidina tritiada incorporada se determinó en un contador de centelleo líquido. Las dosis de los fármacos se añadieron dos horas antes de la activación con Con A e IL-2 (mostrado en la Figura 8, \muM). Las cuentas del fondo fueron inferiores a 200 cpm. Los compuestos de la invención analizados inhibieron la activación y proliferación de los timocitos en concentraciones relativamente bajas, con un valor de IC50 de 2,3 \muM.

Claims (5)

1. Compuestos que presentan la fórmula general:
(R)_{j}-(parte central),
incluyendo enantiómeros separados, diastereómeros, hidratos, sales, solvatos y mezclas de los mismos, en la que j es un número entero de uno a tres, la parte central es un residuo xantina y los compuestos presentan la fórmula general II
3
en la que R se selecciona de entre el grupo constituido por hidrógeno, átomos halógenos y grupos hidroxilo, amino, benzilo, alquilo (C_{1-6}) o alquenilo con hasta 6 átomos de carbono no sustituidos o sustituidos por un grupo hidroxi, un átomo halógeno o un grupo dimetilamino y al menos un R presenta la fórmula general I:
4
en la que n es un número entero de cuatro a dieciocho; R'_{1} y R'_{2} son, independientemente, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (C_{1-4}) o alquenilo con hasta 4 átomos de carbono, opcionalmente interrumpido por un átomo de oxígeno y R'_{3} y R'_{4} son, independientemente, un átomo de hidrógeno o un grupo metílico
con la condición de que R no sea un alquilamino C_{6}.
2. Compuestos según la reivindicación 1, en los que el grupo alquilo o alquenilo R'_{1} y R'_{2} está interrumpido por un átomo de oxígeno.
3. Compuestos según las reivindicaciones 1 ó 2, en los que n es un número entero comprendido entre cuatro y doce.
4. Compuestos según las reivindicaciones 1 ó 2, en los que R'_{1} y R'_{2} son, independientemente, átomos de hidrógeno o grupos metilo.
5. Composición farmacéutica que contiene un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
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