ES2213747T3 - Plantas que tienen una respuesta modificada al etileno. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION INCLUYE PLANTAS TRANSFORMADAS QUE TIENEN AL MENOS UNA CELULA TRANSFORMADA CON UN ACIDO NUCLEICO ETR MODIFICADO. TALES PLANTAS TIENEN UN FENOTIPO QUE SE CARACTERIZA POR UNA MENOR RESPUESTA DE AL MENOS UNA CELULA VEGETAL TRANSFORMADA AL ETILENO EN COMPARACION A UNA PLANTA QUE NO CONTIENE LA CELULA VEGETAL TRANSFORMADA. EL TEJIDO Y/O ESPECIFICIDAD TEMPORAL PARA LA EXPRESION DEL ACIDO NUCLEICO ETR MODIFICADO SE CONTROLA SELECCIONANDO LAS SECUENCIAS DE REGULACION DE LA EXPRESION APROPIADAS PARA DETERMINAR EL LUGAR Y/O TIEMPO DE EXPRESION DEL ACIDO NUCLEICO TRANSFORMADO. LAS PLANTAS SE OBTIENEN TRANSFORMANDO AL MENOS UNA CELULA VEGETAL CON UN ACIDO NUCLEICO ETR MODIFICADO APROPIADO, REGENERANDO LAS PLANTAS A PARTIR DE UNA O MAS DE LAS CELULAS VEGETALES TRANSFORMADAS Y SELECCIONANDO AL MENOS UNA PLANTA QUE TENGA EL FENOTIPO DESEADO.

Description

Plantas que tienen una respuesta modificada al etileno.

Esto es una continuación en parte de la solicitud con número de serie 08/086.555, registrada el 1 de julio de 1993.

El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre esta invención de acuerdo con el Contrato de Energía nº DE-FG03-88ER13873,

Campo técnico de la invención

La invención se refiere de forma general a ácido nucleico ETR modificado y a plantas transformadas con dicho ácido nucleico, las cuales tienen un fenotipo caracterizado por una modificación en la respuesta normal al etileno.

Antecedentes de la invención

El etileno ha sido reconocido como una hormona de plantas desde los inicios del siglo XX, cuando se describió por primera vez su efecto sobre el desarrollo de las plántulas de guisantes. Neljubow, Pflanzen Beith. Bot. Zentralb. 10:128-139 (1901). Desde entonces, han aparecido numerosos informes que demuestran que el etileno es un regulador endógeno del crecimiento y desarrollo en plantas superiores. Por ejemplo, se ha implicado el etileno en el estado vegetativo las semillas, en el crecimiento de las plántulas, en la floración, en la abscisión de las hojas, en la senescencia y maduración de las frutas. El etileno es una hormona de plantas cuya biosíntesis es inducida por estrés medioambiental, tal como la deficiencia en oxígeno, las lesiones, la invasión por patógenos, y las inundaciones.

Recientemente se han clonado los genes que codifican algunos de los enzimas implicados en la biosíntesis del etileno, Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6621-6625 (1989); Nakajima et al., Plant Cell Phys. Physiol. 29:989-996 (1990); Van Der Straeten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4859-4963 (1991); Hamilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7434-7437 (1991); y Spanu et al., EMBO J. 10:2007-2013 (1991). Las vías para la síntesis del etileno se muestran en la Figura 1. Como puede observarse, el aminoácido metionina es convertido en S-adenosil-metionina (SAM) por la sintetasa de SAM, el cual es convertido a su vez en ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) por la sintasa de ACC. Adams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:170-174 (1979). El ACC se convierte a continuación en etileno por medio del enzima oxidasa del ACC. Yang et al., Annu. Rev. Plant. Physiol. 35:155-189 (1984).

Se han adoptado una serie de aproximaciones en un intento de controlar la biosíntesis del etileno y, de este modo, controlar la maduración de las frutas. Oeller et al., Science 254:437-439 (1991) informaron que la expresión de un ARN antisentido de la sintasa del ACC inhibe la maduración de los frutos en las tomateras. Hamilton et al., Nature 346:284-287 (1990) informaron del uso de un gen TOM13 antisentido (oxidasa del ACC) en plantas transgénicas. Picton et al., Plant Journal 3:469-481 (1993), informaron de la maduración alterada de frutas y de la senescencia de las hojas en tomateras que expresaban in enzima antisentido formador de etileno.

En una segunda estrategia, se describió la biosíntesis modulada del etileno mediante la expresión de una desaminasa del ACC en tejidos de plantas, disminuía el nivel de ACC disponible para su conversión a etileno. Ver la publicación del PCT nº WO92/12.249, publicada el 23 de julio de 1992, y Klee et al., Plant Cell 3:1187-1193 (1991).

Mientras que se ha generado una cantidad sustancial de información en relación a la biosíntesis del etileno, se conoce muy poco sobre cómo el etileno control el desarrollo de las plantas. Aunque varios informes indican que hay un sitio de unión con alta afinidad para el etileno presente en los tejidos de plantas, tales receptores no se han identificado. Jerie et al., Planta 144:503 (1979); Sisler, Plant Physiol 64:538 (1979); Sisler et al., Plant Growth Reg. 9:157-164 (1990); y Sisler "Ethylene Binding Component in Plants", The Plant Hormone Ethylene, Eds. A.K. Mattoo y J.C. Suttle, 1990, Boston, C.R.C. Press, Inc., pp. 81-90. En Arabidopsis se han descrito varias categorías de mutantes. En las dos primeras categorías, se informó sobre mutantes que producían etileno en exceso o menos etileno en comparación con el tipo salvaje. Guzman et al., The Plant Cell 2:513-523 (1990). En una tercera categoría, los mutantes no consiguieron responder al etileno. Id.; Bleecker et al., Science 241:1086-1089 (1988); Harpham et al., Ann. of Botany 68:55-61 (1991). La insensibilidad observada respecto el etileno se describió como una mutación dominante o recesiva. Id.

En base a lo precedente, está claro que no se ha delineado claramente la base genética y el mecanismo molecular de la interacción del etileno con las plantas. Dado el amplio rango de funciones reguladas por el etileno, y los intentos previos de controlar la función del etileno regulando su síntesis, sería deseable disponer de una estrategia alternativa para modular el crecimiento y desarrollo de varios tejidos de plantas, tales como los frutos, vegetales y flores, mediante la alteración de la interacción del etileno con los tejidos de plantas.

En consecuencia, es un objeto de la invención proporcionar ácidos nucleicos que comprenden un ácido nucleico de respuesta al etileno (ETR).

Además, es un objeto proporcionar modificaciones de tales ácidos nucleicos de ETR para sustituir, insertar y/o suprimir uno o más nucleótidos con objeto de sustituir, insertar y/o suprimir uno o más residuos de aminoácidos en la proteína codificada por el ácido nucleico de ETR.

Aún más, es un objeto proporcionar células vegetales transformadas con uno o más ácidos nucleicos de ETR. Tales células vegetales transformadas pueden usarse para producir plantas transformadas, en donde el fenotipo, en relación a la respuesta de uno o más tejidos de la planta al etileno, esté modulado.

Resumen de la invención

De acuerdo con los objetivos anteriores, la invención incluye plantas transformadas que tienen al menos una célula transformada con un ácido nucleico de ETR modificado. Tales plantas tienen un fenotipo caracterizado por una disminución en la respuesta al etileno, de al menos una célula vegetal transformada, en comparación con una planta que no contiene la célula vegetal transformada.

La invención también incluye vectores capaces de transformar una célula vegetal para alterar la respuesta al etileno. En una realización, el vector comprende un ácido nucleico de ETR modificado, el cual causa una disminución en la respuesta celular al etileno. La especificidad de tejido y/o temporal de la expresión del ácido nucleico del ETR modificado se controla seleccionando secuencias apropiadas de regulación de la expresión, para controlar la ubicación y/o el momento de expresión del ácido nucleico transformado.

La invención incluye también procedimientos para producir plantas que tienen un fenotipo caracterizado por una disminución en la respuesta de al menos una célula vegetal transformada, en comparación con una planta del tipo salvaje que no contenga tal célula transformada. El procedimiento comprende transformar al menos una célula vegetal con el ácido nucleico de ETR modificado, regenerar las plantas a partir de una o más de las células vegetales transformadas, y seleccionar al menos una planta que tenga el fenotipo deseado.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 ilustra la vía biosintética del etileno.

Las Figuras 2A, 2B y 2C ilustran la secuencia de ácido nucleico genómico (SEC. Nº ID.: 1) para el gen ETR de Arabidopsis thaliana.

Las Figuras 3A, 3B, 3C y 3D, ilustran el ácido nucleico de cADN (SEC. Nº ID.: 2) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. Nº ID.: 3) para el gen ETR de Arabidopsis thaliana.

Las Figuras 4A, 4B, 4C y 4D, hasta las Figuras 7A, 7B, 7C y 7D, ilustran el cADN y la secuencia de aminoácidos deducida de cuatro mutantes de genes ETR de Arabidopsis thaliana, los cuales confieren insensibilidad al etileno. Cada secuencia difiere de la secuencia del tipo salvaje, detallada en la Figura 3, por la sustitución de uno residuo de aminoácido. La mutación etr1-3 (anteriormente ein1-1) en la Figura 4 (SEC. Nº ID.: 8 y 9) comprende la sustitución de la alanina-31 por valina. La mutación etr4 en la Figura 5 (SEC. Nº ID.: 10 y 11) comprende la sustitución de la isoleucina-62 por fenilalanina. La mutación etr1-1 (anteriormente etr) en la Figura 6 (SEC. Nº ID.: 4 y 5) comprende la sustitución de la cisteína-65 por treonina. La mutación etr1-2 en la Figura 7 (SEC. Nº ID.: 6 y 7) comprende la sustitución de la alanina-102 por treonina.

La Figura 8 ilustra la estructura de un inserto de cósmido usado para localizar el gen ETR1 en Arabidopsis thaliana. La posición de inicio para el recorrido por el cromosoma se indica con una barra rayada. La barra vacía indica la ubicación y longitud de los segmentos de ADN usados como sondas para detectar puntos de rotura de la recombinación. Se muestra el número máximo de puntos de rotura detectados para cada sonda. Los números a la derecha del gen ETR1 proceden de 74 recombinantes F2 entre etr1-1 y ap-1, y aquéllos a la izquierda del gen ETR-1 proceden de 25 recombinantes F2 entre etr1-1 y clv2. También se muestran los clones YAC solapados EG4E4 y EG2G11.

Las Figuras 9A y 9B ilustran los alineamientos de las secuencias de aminoácidos de la proteína de ETR1 predicha y los dominios conservados de varias quinasas de histidina y reguladores de respuesta bacterianos. Los aminoácidos se muestran en negrita en las posiciones en las que hay al menos dos coincidencias con la ETR1. En la Figura 9A, se alinea la secuencia de aminoácidos de ETR1 deducida (SEC. Nº ID.: 12 y 27) (residuos 326 a 562) con los dominios quinasa de histidina de BarA (SEC. Nº ID.: 13 y 28) de E. coli, LemA (SEC. Nº ID.: 14 y 29) de P. syringae, y RpfC (SEC. Nº ID.: 15 y 30) de X. campestris. Los recuadros enmarcan los cinco motivos conservados característicos del dominio quinasa de histidina de bacterias, tal como fueron compilados por Parkinson y Kofoid (Parkinson et al., Annu. Rev. Genet. 26:71 (1992)). El residuo de histidina conservado que es el sitio supuesto de autofosforilación se indica mediante un asterisco. Los números y posiciones de los aminoácidos que no se muestran se indican entre paréntesis. En la Figura 9B se alinea la secuencia de aminoácidos de ETR1 deducida (residuos 610 a 729) (SEC. Nº ID.: 15 y 31) con los dominios reguladores de respuesta BvgS (SEC. Nº ID.: 17 y 32) de B. parapertussis, LemA (SEC. Nº ID.: 19 y 34) de P. syringae, y RscC (SEC. Nº ID.: 18 y 33) de E. coli. Los recuadros enmarcan los cuatro residuos altamente conservados en los reguladores de respuesta. El residuo aspartato conservado que es el sitio de fosforilación se indica mediante un asterisco. Los números y posiciones de los aminoácidos que no se muestran se indican entre paréntesis. Con motivo del alineamiento, se introdujo una discontinuidad (_) en la secuencia del ETR1.

Las Figuras 10A y 10B ilustran las secuencias de ADN específicas para los ácidos nucleicos de ETR procedentes de tomates y Arabidopsis thaliana. La Figura 10A compara la secuencia de ADN que codifica los residuos de aminoácidos 1 a 123 (SEC. Nº ID.: 20 y 21). La Figura 10B compara la secuencia de ácido nucleico de ETR que codifica los aminoácidos 306 a 403 (SEC. Nº ID.: 22 y 23). Las líneas verticales en cada figura identifican nucleótidos homólogos.

Las Figuras 11A y 11B comparan secuencias parciales de aminoácidos (usando la denominación de letra única) para una proteína ETR procedente de tomates y Arabidopsis thaliana. La Figura 11A compara la secuencia de aminoácidos de la proteína ETR para los aminoácidos 1 a 123 (SEC. Nº ID.: 24 y 25). La Figura 11B compara la secuencia de aminoácidos de la proteína ETR para los residuos 306 a 403 (SEC. Nº ID.: 26 y 27). Las líneas verticales indican la homología exacta de secuencia. Dos puntos verticales indican que los residuos aminoácidos están funcionalmente conservados, un punto indica una conservación funcional débil entre residuos de aminoácidos.

Las Figuras 12A, 12B, 12C y 12D, ilustran la secuencia de ácido nucleico genómico (SEC. Nº ID.: 45) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. Nº ID.: 46) para el gen QITR ETR de Arabidopsis thaliana.

La Figura 13 ilustra la secuencia de ácido nucleico del cADN y la secuencia proteica deducida para el gen QITR ETR de Arabidopsis thaliana.

La Figura 14 ilustra la secuencia de ácido nucleico genómico (SEC. Nº ID.: 41) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. Nº ID.: 42) para el gen Q8 ETR de Arabidopsis thaliana.

La Figura 15 ilustra la secuencia de ácido nucleico del cADN (SEC. Nº ID.: 43) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. Nº ID.: 44) para el gen Q8 ETR de Arabidopsis thaliana.

La Figura 16 ilustra la secuencia de ácido nucleico (SEC. Nº ID.: 35) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. Nº ID.: 36) para el ácido nucleico TETR del tomate.

La Figura 17 es un comparación de las porciones amino-terminales de las proteínas TETR y ETR1 procedentes respectivamente del tomate y de Arabidopsis thaliana. La línea superior es la secuencia TETR y se extiende hasta el residuo de aminoácidos 315. La línea inferior representa la secuencia de la proteína ETR1 y se extiende hasta el aminoácido 316. Las líneas verticales y los puntos sencillo y doble vertical tienen el mismo significado establecido en la descripción de las Figuras 11A y 11B. El porcentaje de identidad entre estas porciones de secuencias es del 73,33%. El porcentaje de similitud es del 84,76%.

La Figura 18 ilustra la secuencia de ácido nucleico (SEC. Nº ID.: 37) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. Nº ID.: 38) para el ácido nucleico TGETR1 ETR del tomate.

La Figura 19 ilustra la secuencia de ácido nucleico (SEC. Nº ID.: 39) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. Nº ID.: 40) para una secuencia parcial del ácido nucleico TGETR2 ETR del tomate.

La Figura 20 es un comparación de las porciones amino-terminales de las proteínas TGETR1 y ETR1 procedentes respectivamente del tomate y de Arabidopsis thaliana. La línea superior es la secuencia TGETR1 hasta el residuo aminoácido 316. La línea inferior representa la secuencia de la proteína ETR1 hasta el residuo aminoácido 316. La identidad entre estas dos secuencias es del 91,75%. El porcentaje de similitud es del 95,87%. Las líneas verticales y los puntos sencillo y doble vertical tienen el mismo significado que en las Figuras 11A y 11B.

La Figura 21 es un comparación de la porción amino-terminales de la proteína TGETR2 con la correspondiente secuencia de ETR1. La línea superior es la secuencia de TGETR2, desde el residuo aminoácidos 11 hasta el residuo aminoácido 245. La línea inferior es la secuencia de la ETR1, desde el residuo aminoácido 1 hasta el residuo aminoácido 235. La identidad entre estas dos secuencias es del 85,11%. El porcentaje de similitud es del 92,34%. Las líneas verticales y los puntos sencillo y doble vertical tienen el mismo significado que en las Figuras 11A y 11B.

La Figura 22 ilustra el ácido nucleico (SEC. Nº ID.: 50) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEC. Nº ID.: 51) para el ácido nucleico Nr-ETR (Never-ripe, no madurar nunca) procedente del tomate Never-ripe. La secuencia de aminoácidos en la Figura 22 difiere de la secuencia TETR en la Figura 6 en que el residuo aminoácido prolina en el residuo 36 está remplazado con leucina.

Descripción detallada

La invención proporciona, en parte, plantas que tienen células transformadas con un vector que comprende un ácido nucleico de ETR o un ácido nucleico de ETR modificado. Tales células vegetales transformadas tienen una respuesta modulada por el etileno. En una realización preferida, la expresión de un ácido nucleico de ETR modificado confiere a la planta un fenotipo caracterizado por una disminución en la respuesta al etileno en, al menos, aquellas células que expresan el ácido nucleico de ETR modificado, en comparación con una planta no transformada. De este modo, por ejemplo, cuando el ácido nucleico de ETR modificado se expresa en frutos tales como el tomate, el proceso de maduración de fruto se retarda, reduciéndose de ese modo el deterioro, y alargándose la durabilidad antes de la venta y/o la temporada de recolección del fruto. La invención es igualmente útil parar impedir el deterioro del tejido vegetativo y para potenciar la longevidad de las flores cortadas.

Tal como se usa en ésta, un "ácido nucleico de ETR de planta" se refiere a un ácido nucleico que codifica la totalidad o parte de un "proteína de ETR de una planta". El ácido nucleico de ETR puede identificarse inicialmente por homología con las secuencias de ácido nucleico de ETR descubiertas en ésta, pero puede identificarse también por homología con cualquier ácido nucleico o secuencia de aminoácidos de ETR identificada. Los ejemplos de ácido nucleico de ETR incluyen el ETR1, el QITR, y el Q8 procedentes de Arabidopsis, y el TETR, TGETR1 y TEGTR2 procedentes del tomate. No obstante, los ácidos nucleicos de ETR también se definen funcionalmente por su capacidad para conferir una respuesta modulada por el etileno a partir de su transformación en un tejido vegetal. Por ejemplo, una construcción antisentido de un ácido nucleico de ETR o un ácido nucleico de ETR modificado, son capaces de reducir la respuesta al etileno en tejidos vegetales que expresen el ácido nucleico de ETR antisentido o modificado. Además, la transformación con un ácido nucleico de ETR o ácido nucleico de ETR modificado puede resultar en la co-supresión de los alelos de ETR endógenos, la cual, a su vez, modifica la respuesta al etileno. Más aún, los ácidos nucleicos de ETR pueden modificarse tal como se describe en ésta, para producir ácidos nucleicos de ETR modificados, los cuales, cuando se usan para transformar tejidos vegetales, resultan en diferentes grados de insensibilidad al etileno en los tejidos que expresan tales ácidos nucleicos de ETR modificados. Cuando se evalúa un ácido nucleico de ETR putativo, mediante la capacidad de un ácido nucleico de ETR de conferir insensibilidad al etileno, se prefiere que un codón o combinación de condones que codifican los residuos de aminoácidos equivalentes a Ala-31, Ile-62, Cys-65 o Tyr-102 en la proteína ETR1 de Arabidopsis thaliana, o Pro-36 en la proteína TETR del tomate, estén modificados con objeto de sustituirlos por un residuo aminoácido diferente, tal como aquéllos discutidos en esta para los residuos especificados.

Los ácidos nucleicos de ETR de plantas incluyen el ADN genómico, el cADN, y los oligonucleótidos, incluyendo los ácidos nucleicos con sentido y antisentido, así como las transcripción en ARN de los mismos. La secuencia de ADN genómico (SEC. Nº ID.: 1) del gen ETR1 de Arabidopsis thaliana se muestra en la Figura 2. La secuencia de cADN correspondiente (SEC. Nº ID.: 2) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. Nº ID.: 3) se muestran en la Figura 3. Un dominio amino-terminal (es decir, los residuos 1 hasta aproximadamente 316) de la secuencia de proteína ETR predicha no tienen homología con secuencias de proteínas conocidas. Aproximadamente hacia la mitad de la proteína ETR (es decir, los residuos 295 hasta 313) es un dominio transmembrana putativo seguida por un dominio intracelular putativo (es decir, los residuos 314 hasta 738). Una porción sustancial de este dominio intracelular putativo tiene homología de secuencia con los dos componentes sensor-regulador del entorno conocidos en las bacterias. Estas dos familia forman en bacterias un sistema sensor-regulador que permite a las bacterias responder a una amplio rango de fluctuaciones del entorno. Se cree que la porción amino-terminal de la proteína ETR interacciona, bien directamente con el etileno o indirectamente (por ejemplo, a través de una proteína unidora de etileno u otra proteína) y que a partir de tal interacción, ocurre la transducción de señal a través del dominio intracelular.

Un ácido nucleico de ETR o proteína ETR puede identificarse mediante una homología sustancial de la secuencia de ácido nucleico y/o aminoácido con una secuencia de ETR conocida. Tal homología puede basarse en la secuencia global de ácido nucleico o aminoácido, en cuyo caso la homología global de la secuencia proteica es preferiblemente superior al 50%, preferiblemente superior al 60%, todavía más preferiblemente superior al 75%, y los más preferiblemente es homóloga en más del 90%. A pesar de la homología global de secuencia, se prefiere el uso de la porción amino-terminal única de una secuencia de proteína ETR, o de la secuencia de ácido nucleico que codifica esta porción de la molécula (es decir, la porción terminal en 5'), para identificar una proteína ETR o ácido nucleico de ETR. Cuando se usa esta porción de secuencia amino-terminal, se prefiere que la homología de secuencia de aminoácidos con la secuencia ETR conocida sea superior a aproximadamente el 55%, más preferiblemente aproximadamente el 60%, de forma todavía más preferible aproximadamente el 70%, más preferiblemente superior al 85%, y los más preferiblemente que sea homóloga en más del 95%. La homología basada en la secuencia de ácido nucleico es proporcional a la homología de aminoácidos, pero toma en consideración la degeneración del código genético y el sesgo en codones en plantas diferentes. En consecuencia, la homología de secuencia de ácido nucleico podría ser sustancialmente inferior a la basada en secuencia proteica. Por tanto, una proteína ETR es cualquier proteína que tiene una porción amino-terminal que es sustancialmente homóloga con el dominio amino-terminal de una proteína ETR conocida. Una proteína ETR tal es la proteína ETR1 (ver Figura 3) procedente de Arabidopsis thaliana. Por analogía, un ácido nucleico de ETR también codifica al menos el dominio amino-terminal de una proteína ETR.

Un ácido nucleico de ETR procedente de una especie de planta distinta de Arabidopsis thaliana puede identificarse fácilmente mediante procedimientos estándares utilizando un ácido nucleico de ETR conocido. Por ejemplo, las sondas marcadas correspondientes a un ácido nucleico de ETR conocido o que codifica el dominio amino-terminal conocido, pueden usarse para la hibridación in situ para detectar la presencia de un gen de ETR en una especie de planta determinada. Además, tales sondas pueden usarse para examinar las bibliotecas genómicas o de cADN de una especie de planta diferente, o para identificar una o más bandas que contengan la totalidad o parte de un gen de ETR, mediante hibridación con una preparación separada electroforéticamente de una digestión de ADN genómico con uno o más endonucleasas de restricción.

Las condiciones de hibridación variarán dependiendo de la sonda usada. Cuando se usa una secuencia de nucleótidos única de un ácido nucleico de ETR, por ejemplo, un oligonucleótido que contiene la totalidad o parte del dominio amino-terminal, se usa una rigurosidad relativamente elevada, por ejemplo, aproximadamente 0,1 \times SSPE a 65ºC. Cuando la sonda de hibridación cubre una región que tiene una homología de secuencia potencialmente inferior con ácidos nucleicos de ETR conocidos, por ejemplo, una región que abarque una porción del dominio amino-terminal único y una porción que abarca un dominio transmembrana, la hibridación se lleva a cabo preferiblemente en condiciones de rigurosidad más moderadas, por ejemplo, aproximadamente 5 \times SSPE a 50ºC.

Por ejemplo, usando los criterios anteriores, se examinó una biblioteca de cADN de tomate en proceso de maduración (Stratagene, La Jolla, California, nº de catálogo 936.004) con una sonda marcada que comprendía una secuencia de ácido nucleico que codificaba una porción amino-terminal de la secuencia de proteína ETR de Arabidopsis thaliana descubierta en ésta en las Figuras 3A, B, C y D. Se identificaron varios clones y se secuenciaron mediante técnicas estándares. Las secuencias de ADN de este ácido nucleico de ETR procedente del tomate (TETR) y de Arabidopsis thaliana (ETR1) que codifican los residuos de aminoácidos 1 hasta 123 (SEC. Nº ID.: 20 y 21) y los aminoácidos 306 hasta 403 (SEC. Nº ID.: 22 y 23) se detallan respectivamente en las Figuras 10A y 10B.

Las secuencias de aminoácidos para la proteína ETR1 de Arabidopsis thaliana y de tomate (TETR) para los residuos 1 a 123 (SEC. Nº ID.: 25 y 24), y 306 a 403 (SEC. Nº ID.: 27 y 26) se detallan respectivamente en las Figuras 11A y 11B.

La secuencia completa de ácido nucleico de ETR (SEC. Nº ID.: 35) y de aminoácidos (SEC. Nº ID.: 36) para la TETR se muestra en la Figura 16. En la Figura 17 se muestra una comparación directa de la secuencia de aminoácidos entre las proteínas TETR y ETR1 para los 316 residuos amino-terminales.

Tal como puede verse, hay una homología sustancial entre estas secuencias ETR de tomate y Arabidopsis, tanto a nivel de la secuencias de ADN como de la secuencias de aminoácidos. En particular, la homología a nivel de ADN para la secuencia que codifica los aminoácidos 1 a 45 es ligeramente superior al 72%. La homología a nivel de aminoácidos para los residuos de aminoácidos 1 a 123 es aproximadamente del 79%. Para la porción amino-terminal (residuos 1 a 316), la homología global es aproximadamente del 73%. En el caso de la homología de secuencia de aminoácidos, cuando las diferencias entre los aminoácidos en residuos equivalentes se compara, y tales diferencias incluyen la sustitución de un residuo conservado, es decir, residuos de aminoácidos que son funcionalmente equivalentes, la similitud de secuencias de aminoácidos aumenta hasta aproximadamente el 90% para los primeros 123 residuos. El anticuerpo de secuencia para los 316 aminoácidos amino-terminales aumenta hasta casi el 85%. Tal similitud de secuencia se determinó usando un programa para ajuste óptimo de secuencias, tal como fue descrito por Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12:387-395 (1984).

Los residuos funcionalmente equivalentes (es decir, conservados) se identifican mediante datos dobles y únicos en las secuencias de comparación. Similarmente, la homología de secuencia de ácido nucleico entre Arabidopsis y tomate para la secuencia que codifica los residuos de aminoácidos 306 a 403 es aproximadamente del 75%. La homología de secuencia a nivel de aminoácidos para aminoácidos idénticos es casi del 86%, mientras que la similitud es casi del 96%.

Además de la ETR1 de Arabidopsis y la TETR (denominada a veces TXTR) del tomate, se han identificado un cierto número de otros ácidos nucleicos de ETR en Arabidopsis y el tomate. En Arabidopsis, se han identificado los ácidos nucleicos y proteínas QITR y Q8 ETR. Ver las Figuras 12, 13, 14 y 15, y las secuencias con nº de ID. 41 a 48. Para la QITR, la homología global de ácido nucleico con la ETR1 es aproximadamente idéntica en el 71% para la secuencia de aminoácidos, y aproximadamente idéntica en el 72% en términos de secuencia de ácido nucleico. Con respecto a Q8, la homología de secuencia global respecto la ETR1 de Arabidopsis es aproximadamente del 69% para la secuencia global de ácido nucleico, en comparación con aproximadamente el 81% de homología para la porción de la Q8 que codifica los 316 aminoácidos amino-terminales. La homología a nivel de aminoácidos para la porción amino-terminal entre Q8 y ETR1 es aproximadamente del 72%.

Los otros ácidos nucleicos de ETR identificados en el tomate incluyen el TGETR1 (SEC. Nº ID.: 37) y TGETR2 (SEC. Nº ID.: 39). Las secuencias proteicas deducidas para el TGETR1 (SEC. Nº ID.: 38) y TGETR2 (SEC. Nº ID.: 40) se detallan respectivamente en las Figuras 18 y 19. La secuencia del TGETR2 es incompleta. Una comparación de la homología de secuencia para los primeros 316 residuos aminoácidos de la proteína TGETR1 y de la proteína ETR1 se muestran en la Figura 20. La identidad de secuencia está justo por debajo del 92%. La similitud de secuencia aumenta hasta casi el 96% entre esta porción de las dos proteínas. Con respecto a la TGETR2, la Figura 21 establece una comparación de la porción amino-terminal de esta molécula (hasta el residuos aminoácido 245) con la porción correspondiente de la proteína ETR1. La identidad de secuencias entre estas dos porciones de secuencias es de aproximadamente el 85%. La similitud de secuencia aumenta hasta justo por encima del 92%.

La clonación y secuenciación de los ácidos nucleicos de ETR procedentes de Arabidopsis se describen en los ejemplos en ésta. No obstante, dado el extenso descubrimiento de las secuencias de estos ácidos nucleicos de ETR, un especialista en la técnica puede fácilmente construir sondas oligonucleotídicas, realizar amplificaciones mediante PCR, o utilizar otros protocolos estándares, conocidos por los especialistas en la técnica, para aislar los genes descubiertos, así como otros ácidos nucleicos de ETR procedentes de otras especies y que tengan homología con éstos. Cuando se examina la misma especie de planta, pueden usarse condiciones de rigurosidad desde relativamente moderadas a elevadas para la hibridación, las cuales variarán entre 55ºC y 65ºC en 5\times SSPE. Cuando es deseable sondear en busca de homología inferior o en otras especies de plantas, pueden usarse condiciones de rigurosidad inferiores, tales como 50ºC a 5\times SSPE. No obstante, las condiciones de lavado requeridas son 0,2\times SSPE.

El aislamiento del ácido nucleico de ETR TETR1 procedente del tomate se describe en los ejemplos. El aislamiento de esta secuencia utilizó la porción amino-terminal del gen ETR1 de Arabidopsis. Los otros ácidos nucleicos de ETR del tomate descubiertos en ésta (TGETR1 y TGETR2) se identificaron examinando una biblioteca genómica de tomate con una sonda ETR1. La biblioteca genómica se construyó a partir del EMBL 3, al cual se ligó un extracto de ADN genómico de tomate parcialmente digerido con Sau3A. Las condiciones fueron 65ºC y 5\times SSC, con lavados a 2\times SSC.

Al revisar la estructura global de los diversos ácidos nucleicos y proteínas de ETR identificados hasta la fecha, parece que al menos una clase de proteína ETR contiene una porción amino-terminal única, seguida por un dominio quinasa de histidina, seguido por una región reguladora de la respuesta. Los ejemplos de tales proteínas incluyen la QITR en Arabidopsis y la TETR en el tomate. La importancia de esto no se comprendió en su día. No obstante, tal como se describe de aquí en adelante, las mutaciones en los ácidos nucleicos de ETR que codifican miembros de cada clase pueden conferir una insensibilidad al etileno a las plantas transgénicas que contienen tales ácidos nucleicos.

Tal como se describe de aquí en adelante, la sustitución de los residuos aminoácidos Ala-31, Ile-62, Cys-65 y Tyr-102 con un aminoácido diferente resulta en un ácido nucleico de ETR de Arabidopsis modificado, el cual es capa de conferir insensibilidad al etileno en una planta transformada. Cada uno de estos residuos son idénticos entre la proteína ETR del tomate (ETR) y de Arabidopsis thaliana (ETR1).

Una vez se ha identificado el ácido nucleico de ETR, éste puede clonarse y, si es necesario, sus partes constituyentes pueden recombinarse para formar el ácido nucleico de ETR entero. Una vez aislado a partir de su fuente natural, por ejemplo, contenida dentro de un plásmido u otro vector, o cortado a partir de los mismos como un segmento lineal de ácido nucleico, el ácido nucleico de ETR puede usarse además como una sonda para identificar y aislar otros ácidos nucleicos de ETR. También puede usarse como ácido nucleico "precursor" para construir ácidos nucleicos y proteínas ETR modificados.

Tal como se usa en ésta, el término "ácido nucleico de ETR modificado" se refiere a una ácido nucleico de ETR que contiene la sustitución, inserción o supresión de uno o más nucleótidos de un ácido nucleico de ETR precursor. Los ácidos nucleicos de ETR precursores incluyen ácidos nucleicos de ETR que ocurren de forma natural, así como otros ácidos nucleicos de ETR modificados. Los ácidos nucleicos de ETR que ocurren de forma natural procedentes de Arabidopsis thaliana pueden usarse como un ácido nucleico precursor, el cual puede modificarse mediante técnicas estándares, tales como la mutagénesis dirigida contra un sitio, la mutagénesis de "cassettes", y similares, para sustituir uno o más nucleótidos en un codón, tal como el que codifica la alanina en el residuos 31 en el ácido nucleico de Arabidopsis thaliana. Tal modificación in vitro del codón puede resultar en la generación de un codón en la posición 31 que codifica cualquier otro de los residuos aminoácidos que ocurren de forma natural. Tal modificación resulta en un ácido nucleico de ETR modificado.

Por ejemplo, la mutación responsable del fenotipo observado en el mutante Never-ripe se descubre en los ejemplos. Tal como se describe, una única mutación en punto cambia a leucina la prolina presente normalmente en el residuo 36 en la proteína TETR. Esta única mutación es suficiente para conferir un fenotipo dominante de insensibilidad al etileno a la planta del tipo salvaje. Se espera que la transformación de la tomatera y otras plantas con este ácido nucleico modificado confiere el fenotipo dominante de insensibilidad al etileno a tales células vegetales transformadas.

Alternativamente, el ácido nucleico precursor puede ser uno o más de los nucleótidos de un ácido nucleico de ETR del tipo salvaje que ya ha sido modificado. De este modo, por ejemplo, el ácido nucleico de ETR de Arabidopsis thaliana puede modificarse en el codón 31 para formar un ácido nucleico modificado que contiene la sustitución de ese codón con un codón que codifica un aminoácido distinto de la alanina, por ejemplo, la valina. Este ácido nucleico de ETR modificado puede actuar también como un ácido nucleico precursor para introducir una segunda modificación. Por ejemplo, puede modificarse el codón que codifica la Ala-102 para codificar la sustitución por treonina, en cuyo caso el ácido nucleico modificado así formado codifica la sustitución de dos aminoácidos diferentes en los residuos 31 y 102.

También se contemplan las supresiones en los ácidos nucleicos de ETR. Por ejemplo, una ácido nucleico de ETR puede modificarse para suprimir la porción que codifica los dominios transmembrana o intracelular putativos. El ácido nucleico de ETR modificado así formado, cuando se expresa en una célula vegetal, produce sólo una porción amino-terminal de la proteína ETR, la cual es potencialmente capaz de unir el etileno, bien directa o indirectamente, para modular el nivel efectivo de etileno en el tejido de la planta.

Además, el ácido nucleico de ETR modificado puede identificarse y aislarse a partir de una planta mutante que tenga un fenotipo dominante o recesivo caracterizado por una respuesta alterada al etileno. Tales plantas mutantes pueden surgir espontáneamente, o inducirse mediante técnicas de mutagénesis químicas o por radiación bien conocidas, seguidas por la determinación de la respuesta al etileno en la progenie de tales plantas. Los ejemplos de tales plantas mutantes que ocurren espontáneamente incluyen el mutante Never-ripe del tomate, y el mutante insensible al etileno del clavel. Por tanto, los ácidos nucleicos de ETR modificados pueden obtenerse mediante la modificación recombinante de ácidos nucleicos de ETR del tipo salvaje, o mediante la identificación y aislamiento de alelos ETR modificados procedentes de especies de plantas mutantes.

Se prefiere que el ácido nucleico de ETR modificado codifique la sustitución, inserción y/o supresión de uno o más residuos aminoácidos en la proteína ETR precursora. A partir de la expresión del ácido nucleico en células de la planta huésped, la proteína ETR modificada producida de ese modo es capaz de modular al menos la respuesta de las células huésped al etileno. En relación con la generación de un fenotipo tal, se han identificado un cierto número de codones en el ácido nucleico de ETR procedente de Arabidopsis thaliana, los cuales, cuando se modifican y reintroducen en una planta del tipo salvaje, resultan en una disminución en la respuesta al etileno por parte de la planta transformada. Estos codones codifican los residuos aminoácidos Ala-31, Ile-62, Cys-65 y Tyr-102 en la proteína ETR de Arabidopsis thaliana. El gen ETR y cada uno de estos residuos aminoácidos modificados concretos se identificaron mediante la clonación del gen ETR del tipo salvaje procedente de Arabidopsis thaliana, y de los alelos modificados químicamente procedentes de cuatro variedades diferentes (etr1-1, etr1-2, etr1-3 y etr1-4) de Arabidopsis thaliana (cada uno de los cuales presentaba un fenotipo dominante que incluía la insensibilidad al etileno), y comparando las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas. No obstante, la invención, no se limita a ácidos nucleicos de ETR modificados procedentes de Arabidopsis thaliana, tal como se describe en los ejemplos. Más bien, la invención incluye otros ácidos nucleicos de ETR modificados, bastante fácilmente identificables, los cuales modulan la sensibilidad al etileno.

Los cuatro variantes anteriores, que presentaban una insensibilidad al etileno dominante, se generaron mediante modificación química de plántulas de Arabidopsis thaliana, y se identificaron observando el desarrollo de la planta a partir de tales plántulas modificadas con la adición de etileno exógeno. Usando una estrategia similar, bien con o sin la adición de etileno exógeno, el especialista capacitado puede generar fácilmente otras variantes de cualquier especie de planta seleccionada, las cuales también presentan una respuesta modulada por el etileno. A continuación, usando las sondas de ETR basadas en las secuencias de ácido nucleico de ETR del tipo salvaje o modificadas descubiertas en ésta, pueden aislarse otros ácidos nucleicos de ETR modificados sondeando bibliotecas apropiadas, genómicas o de cADN, de la especie de planta seleccionada y modificada. La secuencia de nucleótidos y/o de aminoácidos codificada de tales ácidos nucleicos de ETR generados de nuevo se compara a continuación, preferiblemente con el ácido nucleico de ETR del tipo salvaje procedente de la especie de planta seleccionada, para determinar qué modificaciones, si alguna, en el ácido nucleico de ETR son responsables del fenotipo observado. Si la secuencia del tipo salvaje de la especie planta seleccionada no está disponible, pueden usarse para la comparación las secuencias de ETR del tipo salvaje o modificadas descubiertas en ésta y procedentes de Arabidopsis thaliana, u otras secuencias de ETR que se hayan identificado. De esta forma, pueden identificarse otras modificaciones de las proteínas ETR las cuales pueden conferir el fenotipo de insensibilidad al etileno. Tales modificaciones incluyen la identificación de aminoácidos distintos de los descubiertos en ésta, los cuales pueden sustituirse en residuos equivalentes al Ala-31, Ile-62, Cys-65 y Ala-102 en el proteína ETR de Arabidopsis thaliana, y la identificación de otros residuos aminoácidos que pueden modificarse mediante sustitución, inserción y/o supresión de uno o más residuos de aminoácidos para producir el fenotipo
deseado.

Alternativamente, un ácido nucleico de ETR precursor clonado puede modificarse sistemáticamente, de forma que codifique la sustitución, inserción y/o supresión de uno o más residuos aminoácidos, y ensayarse para determinar el efecto de tal modificación sobre la respuesta al etileno de una planta. Tales modificaciones se hacen preferiblemente dentro de la porción del ácido nucleico de ETR que codifica la porción amino-terminal de la proteína ETR. No obstante, también se contemplan las modificaciones de los dominios carboxi-terminal o transmembrana putativo para modular la transducción de la señal (por ejemplo, modificaciones de la histidina conservada del dominio quinasa de histidina, la cual es el supuesto sitio de autofosforilación, o el aspartato conservado del dominio regulador de la respuesta, el cual es el supuesto sitio de fosforilación). Un procedimiento que podría usarse para identificar residuos aminoácidos concretos implicados en la interacción directa o indirecta con el etileno, el la sustitución secuencial de los codones de un ácido nucleico de ETR con codones que codifican un aminoácido de barrido, tal como la glicina o alanina (ver, por ejemplo, la publicación del PCT WO90/04.788, publicada el 3 de mayo de 1990), seguida por transformación en una planta de cada uno de los ácidos nucleicos así formados, para determinar el efecto de tal sustitución secuencial sobre la respuesta al etileno. Otras estrategias incluyen las modificaciones aleatorias o las modificaciones apuntadas y predeterminadas de los ácido nucleico de ETR clonados (ver la publicación del PCT nº WOW92/07.090, publicada el 30 de abril de 1992), seguida por la transformación de células vegetales y la identificación de la progenie que tiene una respuesta al etileno alterada. El ácido nucleico de ETR procedente de aquellas plantas que tengan el fenotipo deseado se aísla y secuencia para confirmar la identidad de la modificación responsable del fenotipo observado.

Los residuos aminoácidos equivalentes a aquéllos identificados específicamente en una proteína ETR, los cuales pueden modificarse para alterar la respuesta al etileno, también pueden identificarse fácilmente en proteínas ETR de otras especies de plantas. Por ejemplo, los residuos aminoácidos equivalente a los identificadas en la proteína ETR de Arabidopsis thaliana pueden identificarse fácilmente en otras proteínas ETR. Una residuo aminoácido en una proteína ETR precursora es equivalente a un residuo concreto en la proteína ETR de Arabidopsis thaliana si es homólogo en posición, en la estructura primaria o terciaria, con el residuo especificado de la proteína ETR de Arabidopsis.

Con objeto de establecer la homología por medio de la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos primaria de una proteína ETR precursora se compara directamente mediante alineamiento con la secuencia primaria de la proteína ETR procedente de Arabidopsis thaliana. Tal alineamiento es preferiblemente el del dominio amino-terminal, y tomará en consideración la inserción o supresión potencial de uno o más residuos aminoácidos entre las dos secuencias para maximizar la homología de secuencia de aminoácidos. Una comparación de una multiplicidad de secuencias de proteína ETR con la de Arabidopsis thaliana proporciona la identificación de residuos conservados entre tales secuencias, cuya conservación se mantiene preferiblemente para ulterior comparación de la secuencia de aminoácidos primaria. En base al alineamiento de tales secuencias, el especialista cualificado puede identificar fácilmente los residuos aminoácidos en otras proteínas ETR que son equivalentes a Ala-31, Ile-62, Cys-65, Ala-102 y otros residuos en la proteína ETR de Arabidopsis thaliana. Tales residuos equivalentes se seleccionan para modificaciones análogas aquéllas de otras proteínas ETR modificadas, las cuales confieren el fenotipo deseado de repuesta al etileno. Tales proteínas ETR modificadas se construyen preferiblemente modificando un ácido nucleico de ETR precursor para codificar la correspondiente sustitución, inserción y/o supresión en el residuo aminoácido equivalente.

Además de la homología a nivel de secuencia primaria, pueden identificarse residuos equivalentes en base a la homología a nivel de estructura terciaria. La determinación de equivalencia a este nivel generalmente requerirá estructuras cristalinas tridimensionales para una proteína ETR o proteína ETR modificada de Arabidopsis (o la estructura cristalina del otra proteína ETR que tenga residuos equivalentes definidos), y la estructura cristalina de una proteína ETR seleccionada. Los residuos equivalentes a nivel de estructura terciaria se definen como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal de un residuo aminoácido particular de la proteína ETR seleccionada, en comparación con la proteína ETR procedente de Arabidopsis, están dentro de los 0,13 nm, y preferiblemente 0,10 nm, de alineamiento. El alineamiento se consigue después que se haya orientado y colocado el mejor modelo para obtener el máximo solapamiento de coordenadas atómicas de átomos de proteína, que no son hidrógenos, de las proteínas ETR en cuestión.

Los ácidos nucleicos de ETR pueden derivarse a partir de cualquiera de las plantas superiores que responden al etileno. Las plantas particularmente apropiadas incluyen la tomatera, el bananero, el fruto del kiwi, el aguacate, el melón, el mango, la papaya, la manzana, el melocotón, y otras plantas de frutos climatéricos. Las especies no climatéricas a partir de las cuales pueden aislarse ácidos nucleicos de ETR incluyen la fresa, frambuesa, zarzamora, arándano, lechuga, calabaza, coliflor, cebolla, brécol, coles de bruselas, algodón, canola, uva, soja y semillas de colza. Además, los ácidos nucleicos de ETR pueden aislarse a partir de plantas de flor dentro de la división Magnoliofita, la cual incluye las angiospermas, las cuales incluyen las dicotiledóneas (clases Magnoliopsida y Dicotyledoneae) y las monocotiledóneas (clase Liliopsida). Los órdenes de angiospermas particularmente preferidos, de acuerdo con la "Taxonomy of Flowering Plants", by A.M. Johnson, The Century Co., NY, 1931, incluyen los Rosales, Cucurbitales, Rubiales, Campanulatae, Contortae, Tubiflorae, Plantaginales, Ericales, Primulales, Ebenales, Diapensiales, Primulales, Plumbaginales, Opuntiales, Sarraceniales, Ramales, Centrospermae, Santales, Euphorbiales, Capparales, Aristolochiales, Julianiales, Juglandales, Fagales, Urticales, Myricales, Polygonales, Batidales, Balanopsidales, Proteales, Salicales, Leitneriales, Garryales, Vriticillatae, y Piperales. Las plantas particularmente preferidas incluyen el lirio, el clavel, el crisantemo, la petunia, la rosa, el geranio, la violeta, los gladiolos, las orquídeas, las lilas, el manzano silvestre, "sweetgum", el arce, la poinsettia, el algarrobo, el fresno y el tilo.

Además de proporcionar una fuente de ácido nucleico de ETR que pueden modificarse o aislarse de acuerdo con las enseñanzas en ésta, las plantas anteriores pueden usarse como receptoras del ácido nucleico modificado para producir plantas quiméricas o transgénicas, las cuales presentan un fenotipo de resistencia al etileno en uno o más tipos de tejidos de la planta transformada.

Una vez de ha clonado un ácido nucleico de ETR modificado, éste se usa para construir vectores para transformar las células vegetales. La construcción de tales vectores está facilitada por el uso de un vector lanzadera, el cual es capaz de manipulación y selección en ambos, la planta y un huésped de clonación conveniente, tal como un procariota. Por tanto, tales vectores pueden incluir un gen de resistencia a antibióticos para su selección en células vegetales (por ejemplo, el de la resistencia a la kanamicina), y un gen de resistencia a antibióticos para selección en un huésped bacteriano (por ejemplo, el de la resistencia a la actinomicina). Tales vectores lanzadera también contienen un origen de replicación apropiado para el huésped procariota usado, y, preferiblemente, al menos un único sitio de restricción o un poliengarce que contiene sitios de restricción únicos para facilitar la construcción del vector. Los ejemplos de tales vectores lanzadera incluyen el pMON530 (Rogers et al., Methods in Enzymology 153:253-277 (1988)) y pCGN1547 (McBride et al., Plant Molecular Biology 14:269-276 (1990)).

En las realizaciones preferidas, las cuales incluyen el mejor modo de poner en práctica la invención, se usa un promotor para dirigir la expresión de un ácido nucleico de ETR o ETR modificado, en al menos una porción de los tejidos de una planta transformada. La expresión de un ácido nucleico de ETR es preferiblemente en la orientación antisentido para modular la respuesta al etileno mediante la reducción en la traducción del transcrito de ARN de ETR endógeno. La expresión de un ácido nucleico de ETR modificado resulta en la producción de una proteína ETR modificada, la cual es capaz de conferir insensibilidad al etileno. Tales promotores podrían obtenerse a partir de plantas, de bacterias patógenas de plantas, o de virus de plantas. Los promotores constitutivos incluyen los promotores 25S y 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S y CaMV19S), el promotor transcrito de longitud completa del virus del mosaico de Figwort (FMV35S) (ver publicación del PCT nº WO92/12.249, publicada el 23 de julio de 1992), y los promotores asociados con genes de Agrobacterium tales como los de la sintasa de nopalina (NOS), de la sintasa de manopina (MOS), o de la sintasa de octopina (OCS). Otros promotores constitutivos incluyen los promotores \alpha-1 y \beta-1 de la tubulina (Silflow et al., Devel. Genet. 8:435-460 (1987)), los promotores de histona (Chaubet, Devel. Genet. 8:461-473 (1987)), y los promotores que regulan la transcripción de los ácidos nucleicos de la ETR.

En algunas realizaciones, pueden usarse promotores específicos de tejidos y/o temporales para controlar la expresión de los ácidos nucleicos de ETR y modificados de ETR. Los ejemplos de promotores específicos de frutas incluyen los promotores E8, E4, E17 y J49 del tomate (Lincoln et al., Mol. Gen. Genet. 212:72-75 (1988)) y los promotores 2A11, Z130 y Z70 del tomate, tal como se describen en las patentes estadounidenses nº 4.943.674, 5.175.095, y 5.177.307. Además, la expresión preferente en tejido dividiéndose rápidamente puede obtenerse utilizando el promotor EF-1\alpha de la planta, tal como se describe en la patente estadounidense nº 5.177.011. Los ejemplos de promotores específicos de flores incluyen los promotores leafy y los promotores procedentes de los genes apetala, pistillata y agamous. Un sistema promotor para apuntar la expresión a las hojas de una planta transformada es un promotor quimérico que comprende el promotor CaMV35S ligado a la porción del gen ssRUBISCO que reprime la expresión del ssRUBISCO en ausencia de luz. Además, también pueden usarse promotores específicos del polen. Tales promotores son bien conocidos por los especialistas en la técnica y pueden adquirirse fácilmente. Un ejemplo de un promotor tal es el ZnI3 (Hamilton et al., Plant Mol. Biol. 18:211-218 (1992)). Este promotor se clonó a partir de trigo (monocotiledónea), pero funciona como un promotor fuerte y específico de polen cuando se usa en el tabaco (dicotiledónea).

Los ejemplos de promotores inducibles que pueden usarse para la expresión condicionada de ácidos nucleicos de ETR incluyen aquéllos procedentes de genes de proteína de choque térmico, tales como el gen de la proteína de choque térmico PHS1 (Takahashi et al., Mol. Gen. Genet. 219:365-372 (1989)), y los promotores inducibles mediante luz, incluyendo los tres promotores de las proteínas captoras de luz clorofila a/b (Leutwiler et al., Nucl. Acids Res. 14:4051-4064 (1986)) y el promotor de la pre-ferrodoxina (Vorst et al., Plant Mol. Biol. 14:491-499 (1990)).

En una realización ulterior de la invención, el vector usado para transformar las células vegetales se construye para apuntar la inserción del ácido nucleico de ETR en un promotor endógeno dentro de la célula vegetal. Un tipo de vector, que puede usarse para apuntar la integración de un ácido nucleico de ETR modificado hacia un promotor endógeno, incluye una vector de selección positiva-negativa análogo al detallado por Monsour et al., Nature 336:348-352 (1988), el cual describe el apuntamiento de ADN exógeno a un locus endógeno predeterminado en células ES de mamífero. Construcciones similares, utilizando marcadores de selección positiva y negativo funcionales en las células vegetales, pueden diseñarse fácilmente en base a la identificación del promotor endógeno de la planta y las secuencias que lo rodean. Cuando se usa tal estrategia, se prefiere el uso de un vector del tipo de remplazo para minimizar la posibilidad de reversión al genotipo del tipo salvaje.

Los vectores de la invención se diseñaron de tal forma que la secuencia de promotor contenida en el vector, o la secuencia de promotor apuntada en el genoma de la planta, estén operativamente unidas al ácido nucleico que codifica el ácido nucleico de ETR o de ETR modificado. Cuando se usa la hebra positiva del ácido nucleico de ETR, el término "operativamente unido" significa que la secuencia del promotor está ubicada en relación a la secuencia codificante del ácido nucleico de ETR de tal forma que la polimerasa de ARN es capaz de iniciar la transcripción del ácido nucleico de ETR a partir de la secuencia promotora. En tales realizaciones, también se prefiere proporcionar sitios de unión a ribosomas, secuencias de iniciación y terminación de la transcripción, secuencias de iniciación y terminación de la traducción, y secuencias de poliadenilación apropiadas para producir un transcrito de ARN funcional, el cual puede traducirse en una proteína ETR. Cuando se usa una orientación antisentido del ácido nucleico de ETR, todo lo que se precisa es que el promotor esté operativamente unido para transcribir la hebra ETR antisentido. Por tanto, en tales realizaciones, sólo se necesitan las secuencias de iniciación y terminación de la transcripción para proporcionar un transcrito de ARN capaz de hibridarse con el mARN y otros transcritos de ARN procedentes de un gen ETR endógeno o de un ácido nucleico de ETR modificado contenido en una célula vegetal transformada. Además de los promotores, pueden añadirse otras secuencias de regulación de la expresión, tales como potenciadores, para facilitar la expresión del ácido nucleico de ETR in vivo.

Una vez se ha construido el vector, la transformación de plantas puede realizarse de acuerdo con la invención, mediante, esencialmente, cualquiera de los varios procedimientos de transformación conocidos por los especialistas en la técnica de la biología molecular de plantas. Tales procedimientos se describen de forma general en Methods in Enzymology, Vol. 153 ("Recombinant DNA Part D"), 1987, Eds. Wu y Grossman, Academic Press. Tal como se usa en ésta, el término "transformación" significa la alteración del genotipo de una célula vegetal por la introducción de ácido nucleico exógeno. Los procedimientos particulares para la transformación de células vegetales incluyen la microinyección directa del ácido nucleico en una célula vegetal mediante el uso de micropipetas. Alternativamente, el ácido nucleico puede transferirse a una células vegetal mediante el uso de polietilenglicol (Paszkowski et al., EMBO J 3:2712-2722 (1984)). Otros procedimientos de transformación incluyen la electroporación de protoplastos (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824 (1985)); la infección con un virus específico de plantas, por ejemplo el virus del mosaico de la coliflor (Hohn et al., "Molecular Biology of Plant Tumors", Academic Press, Nueva York (1982), pp. 549-560), o el uso de secuencias de transformación procedentes de bacterias específicas de plantas, tales como Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, un plásmido Ti transmitido a una célula vegetal a partir de su infección por Agrobacterium tumefaciens (Horsch et al., Science 233:496-498 (1984); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983)). Alternativamente, las células vegetales pueden transformarse mediante la introducción de ácido nucleico, contenido en la matriz o en la superficie de pequeñas cuentas o partículas, por medio de penetración balística de alta velocidad en la célula vegetal (Klein et al., Nature 327:70-73 (1987)).

Después de la introducción del vector en una célula vegetal, la selección de la transformación exitosa se realiza típicamente antes de la regeneración de una planta. Tal selección de la transformación no es necesaria, pero facilita la selección de plantas regeneradas que tienen el fenotipo deseado mediante la reducción del fondo de tipo salvaje. Tal selección se basa convenientemente en genes de resistencia a antibióticos y/o de resistencia a herbicidas, los cuales podrían incorporarse en el vector de transformación.

Prácticamente todas las plantas pueden regenerarse a partir de células o tejidos cultivados. Tal como se usa en ésta, el término "regeneración" se refiere al crecimiento de una planta completa a partir de una célula vegetal, un grupo de células vegetales, o de parte de una planta. Los procedimientos para la regeneración de plantas son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, la regeneración a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., "Protoplasts Isolation and Culture", Handbook of Plant Cell Cultures 1:124-176 (MacMillan Publishing Co., Nueva York (1983); M.R. Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts", Protoplasts (1983) Lecture Proceedings, pp. 12-29 (Birkhauser, Brasil, 1983); y H. Binding "Regeneration of Plants", Plant Protoplasts, pp. 21-73 (CRC Press, Bocaraton, 1985). Cuando las transformación es de parte de un órgano, la regeneración puede hacerse a partir de callos de plantas, explantes, órganos o partes. Tales procedimientos de regeneración son conocidos también por los especialistas en la técnica. Ver, por ejemplo, Methods in Enzymology, más arriba; Methods in Enzymology, Vol. 118; y Klee et al., Annual Review of Plant Physiology 38:467-486.

Un procedimiento preferido para transformar y regenerar petunias con los vectores de la invención fue descrito por Horsch, R.B. et al., Science 227:1229-1231 (1985). Un procedimiento preferido para transformar algodón con los vectores de la invención y regenerar plantas a partir del mismo se describe en Trolinder et al., Plant Cell Reports 6:231-234 (1987)).

Las células de tomatera se transforman preferiblemente usando cepas de Agrobacterium mediante el procedimiento descrito en McCormick et al., Plant Cell Reports 5:81-84 (1986)). En concreto, se obtienen cotiledones a partir de plántulas de 7-8 días. Las plántulas se esterilizan superficialmente durante 20 minutos en lejía Clorox al 30%, y se germinan en cajas Pantcons en medio de germinación Davis. El medio de germinación Davis está formado por 4,3 g/l de sales MS, 20 g/l de sacarosa, y 10 mls/l de vitaminas Nitsch, pH 5,8. La solución de vitamina Nitsch está formada por 100 mg/l de myo-inositol, 5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina HCl, 0,5 mg/l de tiamina HCl, 0,05 mg/l de ácido fólico, 0,05 mg/l de biotina, 2 mg/l de glicina. Las plántulas se dejaron germinar durante 7-8 días en la cámara de cultivo, a 25ºC, 40% de humedad, bajo bombillas de luz blancas fría con una intensidad de 80 einstein m^{2} s^{-1}. El fotoperiodo fue de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.

Una vez ocurre la germinación, los cotiledones se extraen usando un hoja de bisturí #15 cortando el meristemo apical y el hipocotilo para crear un explante rectangular. Estos cortes en los extremos cortos del cotiledón de germinación incrementan el área de la superficie para infección. Los explantes se bañan en líquido de regeneración Davis estéril para impedir su desecación. El medio de regeneración Davis está formado por 1\times sales MS, 3% de sacarosa, 1\times vitaminas Nitsch, 2,0 mg/ml de zeatina, pH 5-8. Esta solución se autoclavó con 0,8% de agar Noble.

Los cotiledones se pre-cultivaron en "placas de alimentación" compuestas por medio que no contenía antibióticos. El medio está compuesto por 4,3 g/l de sales MS, 30 g/l de sacarosa, 0,1 g/l de myo-inositol, 0,2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1,45 ml/l de una solución de 0,9 mg/ml de tiamina HCl, 0,2 ml de una solución de 0,5 mg/ml de kinetina, y 0,1 ml de una solución de 0,2 mg/ml de solución de 2,4 D. Esta solución se ajusta a pH 6,0 con KOH. Estas placas se recubrieron con 1,5-2,0 ml de células en suspensión de tabaco (TXD) y un filtro Whatman estéril empapado en medio 2COO5K. El medio 2COO5K está compuesto por 4,3 mg/l de mezcla de sales MS de Gibco, 1 ml de vitaminas B5 (1000\times, de reserva), 30 g/l de sacarosa, 2 ml/l de PCPA a partir de una solución de reserva 2 mg/ml, y 10 \mul/l de kinetina a partir de una solución de reserva 0,5 mg/ml. Los cotiledones se cultivaron durante 1 día en una cámara de cultivo a 25ºC, bajo luz blanca fría, con una intensidad de luz de 40-50 eisntein m^{2} s^{-1}, con una fotoperiodo de luz continuo.

Los cotiledones se inoculan a continuación con una solución en fase log de Agrobacterium conteniendo el ácido nucleico de ETR modificado o del tipo salvaje. La concentración de Agrobacterium es aproximadamente de 5 \times 10^{8} células/ml. Los cotiledones se dejan empapar en la solución de bacterias durante seis minutos, y a continuación se transfieren, para retirar la solución en exceso, a discos de filtro Whatman estériles, y se devuelven subsiguientemente a la placa de alimentación original, en donde se dejan co-cultivar durante 2 días. Transcurridos los dos días, los cotiledones se transfieren a placas de selección que contienen medio de regeneración Davis con 2 mg/l de zeatina-ribosa, 500 \mug/ml de carbenicilina, y 100 \mug/ml de kanamicina. Transcurridas 2-3 semanas, los cotiledones con callos y/o formación de brotes se transfieren a placas de regeneración Davis nuevas conteniendo carbenicilina y kanamicina a los mismos niveles. El experimento se puntúa por los transformantes en este momento. El tejido de callo se subcultiva a intervalos regulares de 3 semanas, y cualesquiera estructuras anormales se recortan, de forma que las yemas de los brotes en desarrollo continúen regenerándose. Los brotes se desarrollan en 3-4 meses.

Una vez se desarrollan los brotes, éstos pueden seccionarse claramente del tejido calloso y plantarse sobre placas de selección de arraigamiento. Estas placas contienen 0,5\times MSO que contiene 50 \mug/ml de kanamicina y 500 \mug/ml de carbenicilina. Estos brotes forman raíces sobre el medio de selección en dos semanas. Si no aparecen raíces transcurridas 2 semanas, los brotes se recortan y replantan sobre el medio de selección. Los cultivos de brotes se incuban en "percivals" a una temperatura de 22ºC. Los brotes con raíces se transfieren a tiestos cuando las raíces tienen aproximadamente 2 cm de longitud. Las plantas se fortalecen en una cámara de cultivo a 21ºC, con un fotoperiodo de 18 horas de luz y 6 horas de oscuridad, durante 2-3 semanas antes de transferirlas a un invernadero. En el invernadero, las plantas se hacen crecer a una temperatura de 26ºC durante el día, y de 21ºC durante la noche. El fotoperiodo es de 13 horas de luz y 11 horas de oscuridad, y las plantas se dejan madurar.

Una vez se han regenerado las plantas, se seleccionan una o más plantas en base al cambio en la respuesta al etileno. Por ejemplo, cuando se usa un ácido nucleico de ETR modificado con su promotor nativo, la selección puede basarse en una alteración de cualquiera de una de las "respuestas triples" de las plántulas de tales plantas. Guzman et al., The Plant Cell 2:523 (1990). Alternativamente, o cuando se usan promotores constitutivos, pueden ensayarse otras diversas respuestas al etileno, y compararse con las de las planta del tipo salvaje. Tales otras respuestas al etileno incluyen la epinastia (la cual se observa principalmente en el tomate), la escisión, la abscisión, la senescencia de los pétalos florales, y la maduración de los frutos. Además de los cambios evidentes en la respuesta al etileno, pueden determinarse los niveles de varios enzimas a continuación de la exposición a etileno para determinar el tiempo de respuesta para le incremento o disminución típicos en el nivel de una proteína determinada, tal como un enzima. Los ejemplos de varias respuestas al etileno, que pueden usarse para determinar si una planta concreta tiene una respuesta disminuida al etileno, se detallan en el Capítulo 7, "The Mechanisms of Ethylene Action", en Ethylene in Plant Biology, 2ª edición, Eds. F.B. Abels, P.W. Morgan, y M.E. Salveit, San Diego, Academic Press, Inc. (1982). Cuando se usa un promotor específico de tejido y/o temporal, o un promotor inducible, la determinación de una modulación en la respuesta al etileno se determina en el tejido apropiado en el momento apropiado, y, si es necesario, en las condiciones apropiadas para activar/desactivar un promotor inducible. En cada caso, la respuesta al etileno se compara preferiblemente con la misma respuesta al etileno de una respuesta del tipo salvaje.

Las que siguen son realizaciones particularmente preferidas para modular la respuesta al etileno en los frutos. No obstante, tales realizaciones pueden modificarse fácilmente para modular la respuesta al etileno en tejidos vegetativos y flores.

En una estrategia, un ácido nucleico de ETR modificado está operativamente unido a un promotor constitutivo de fuerza moderada se usa para reducir la respuesta al etileno. Esto resulta en un alargamiento del tiempo de maduración de la fruta.

En una realización alternativa, se usa un ácido nucleico de ETR modificado operativamente unido a un promotor regulable (inducible), de forma que puede mantenerse la condición que pone en marcha la expresión del ácido nucleico de ETR modificado para impedir la maduración de la fruta. La condición que apaga la expresión del ácido nucleico de ETR modificado puede entonces mantenerse para obtener la maduración. Por ejemplo, puede usarse un promotor inducible mediante calor, el cual es activo a altas temperaturas (en el campo), pero no a bajas temperaturas, tales como durante la refrigeración. Un ejemplo ulterior utiliza un promotor inducido por auxina o giberelina, de tal como que las plantas transformadas pueden tratarse con análogos comerciales de la auxina, tales como el 2,4-D, o con análogos comerciales de la giberelina, tales como el Pro-Gibb, para impedir la maduración de la fruta.

Alternativamente, puede unirse operativamente un promotor constitutivo fuerte a un ácido nucleico de ETR modificado para impedir la maduración de la fruta. Con objeto de impedir la maduración eventual de la fruta, la planta también se transforma con un ácido nucleico de ETR del tipo salvaje operativamente unido a un promotor inducible. La expresión del ácido nucleico de ETR del tipo salvaje se incrementa exponiendo la planta a la condición apropiada a la cual responde el promotor inducible. Cuando se incrementa la expresión del ácido nucleico de ETR del tipo salvaje, el efecto de la expresión del ácido nucleico de ETR modificado se reduce, de tal forma que ocurre la maduración de la fruta.

Las construcciones particulares que son deseables para su uso en la transformación de plantas, para conferir insensibilidad al etileno, incluyen el promotor CMV35S unido operativamente a cualesquier otros clones de cADN o genómicos de ETR de Arabidopsis mutante, incluyendo la correspondiente modificación en el residuo 36 para convertir la prolina en leucina. Se espera que tales construcciones confieran un fenotipo dominante de insensibilidad al etileno a células y plantas transformadas con y expresando tales construcciones.

Además, una construcción preferida incluye el promotor FMV operativamente unido para dirigir la expresión del cADN de TETR del tomate, el cual se ha manipulado para contener una mutación análoga a cualquiera de las identificadas en los genes de ETR procedentes de Arabidopsis, así como la mutación Nr hallada en el gen ETR del tomate. Se espera que tales construcciones confieran un fenotipo dominante de insensibilidad al etileno a células y plantas que se han transformado con y expresan tales construcciones.

Otras construcciones preferidas incluyen el promotor FMV operativamente unido a cADN de ETR antisentido, incluyendo el TETR y ETR1. Se espera que tales construcciones confieran un fenotipo dominante de insensibilidad al etileno a células y plantas que se han transformado con y expresan tales construcciones.

La invención puede practicarse en una amplia variedad de plantas para obtener fenotipos útiles. Por ejemplo, la invención puede usarse para retrasar o impedir la senescencia floral y la abscisión durante el crecimiento o durante el transporte o almacenamiento, tal como ocurre en las camas de flores o cultivos de algodón (Hall et al., Physiol. Plant 10:306-317 (1957)) y en flores ornamentales (por ejemplo, claveles, rosas) que, o son cortadas (Halevy et al., Hort. Rev. 3:59-143 (1981)) o no. Además, la invención puede practicarse para retrasar o impedir la senescencia y abscisión de hojas y frutas en el pepino (Jackson et al., Can. J. Bot. 50:1465-1471 (1972)), legumbres y otros cultivos (Heck et al., Texas Agric. Expt. Sta. Misc. Publ. MP 613:1-13 (1962)), y plantas ornamentales (por ejemplo, "holly wreath") (Curtis et al., Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 560:104-108 (1952)). Otros usos incluyen la reducción y prevención de compuestos fenólicos de gusto amargo (isocoumarinos), los cuales son inducidos por el etileno, por ejemplo, en las patatas dulces (Kitinokja "Manipulation of Ethylene Responses in Horticulture", Ed. Reid, Acta Hort., Vol. 201, pp. 337-342 (1978)) y zanahorias (Coxon et al., Phytochemistry 12:1881-1885 (1973)), chirivía (Shattuck et al., Hort. Sci. 23:912 (1988)) y Brassica. Otros [usos] incluyen el impedir o lesionar selectivamente los tejidos reproductores, tal como ocurre en la avena y canola (Reid et al., en "Ethylene in Plant Development", Eds. Roberts, Tucker, Londres, Butterworths, pp. 277-286, 1985), la pérdida de aroma, firmeza y/o textura, tal como ocurren en productos almacenados, tales como las manzanas y sandías (Risse et al., Hort. Sci. 17:946-948 (1982)), el moteado bermejo (una alteración posterior a la recolección), el cual es inducido por el etileno en las lechugas de cabeza crujiente (crisphead) (Hyodo et al. Plant Physiol. 62:31-35 (1978)), para promover la producción de flores macho (Jaiswal et al., Proc. Indian Acad. Sci. (Plant Sci 95:453-459) (1985)), y para incrementar el tamaño de la planta, por ejemplo, retrasando la formación de flores en bromelias ornamentales (Mekers et al., Acta Hortic. 137:217-223 (1983)). Más aún, una disminución en la respuesta al etileno puede usarse para retrasar el desarrollo de enfermedades, tales como la prevención de lesiones y senescencia en pepinos infectados por Colleototrichum lagenarium, y para reducir las enfermedades en plantas en las que el etileno causa un incremento en el desarrollo de enfermedades, por ejemplo, en la cebada, los cítricos, las plántulas del abeto de Douglas, la uva, las ciruelas, las rosas, los claveles, las fresas, el tabaco, el tomate, el trigo, la sandía y las plantas ornamentales. Además, la invención puede usarse para reducir el efecto del etileno hallado en el entorno, e indirectamente el efecto de varias presiones ambientales que resultan en la biosíntesis de etileno en el tejido de la planta. Por ejemplo, el etileno existe con niveles biológicos perjudiciales en atmósferas localizadas a causa de incendios, humos de automóviles e industria. Ver, por ejemplo, el Capítulo 8, "Ethylene in the Environment", en Ethylene in Plant Biology, ver más arriba. Además, la invención puede usarse para minimizar el efecto del etileno sintetizado en respuesta a presiones ambientales tales como las inundaciones, la sequía, la deficiencia de oxígeno, las lesiones (incluyendo la presión y las magulladuras), las heladas, la invasión por patógenos (por virus, bacterias, hongos, insectos, nemátodos, y similares), la exposición química (por ejemplo, a ozono, sales, e iones de metales pesados), y la radiación.

Lo que sigue se presenta a modo de ejemplo y no debe considerarse como una limitación del ámbito de la invención.

Ejemplo 1 Clonación del gen ETR1

Se cruzaron plantas etr1-1 respectivamente con dos líneas portadoras de los marcadores visibles recesivos ap1 y ap2. La progenie F_{1} se dejo auto-polinizar. Los fenotipos de puntuaron en la F_{2}. Los porcentajes de recombinación (usando la función de mapado de Kosambi, D.D. Kosambi Ann. Eugen. 12:172 (1944)) se determinaron en centimorgans. El locus ETR1 se localizó en la porción inferior del cromosoma 1, entre los marcadores genéticos visibles ap1 y clv2 (6,5 \pm 1,0 cM desde AP1 y 2,8 \pm 1,1 cM desde CLV2).

Se cruzó etr1-1 con la línea W100 de prueba (ecotipo Landsberg (Koorneef et al., Arabidopsis inf. Serv. 23:46 (1987)) y las plantas F_{1} se dejaron auto-polinizar. Se analizó la unión de marcadores RFLP al locus ETR1 en 56 plantas F_{2} tal como se describe en Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6856 (1988). Lo de los marcadores RFLP que residen en esta región del cromosoma 1, un marcador, 1bAt315, se co-segregó completamente con el fenotipo del mutante etr1-1 de entre 112 cromosomas. Por tanto, el clon 1bAt315 se usó como una sonda para iniciar un recorrido por el cromosoma en la región del gen ETR1. Se utilizaron varias bibliotecas de cósmidos de ADN genómico. Una biblioteca contenía subclones de dos cromosomas artificiales de levadura (YAC EG4E4 y EG2G11 (Grill et al., Mol. Gen. Genet. 226:484 (1991)) que se hibridan con el 1bAt315. Para subclonar los YAC, el ADN total procedente de células de levadura que albergaban EG4E4 o EG2G11 se digirieron parcialmente con Sau3Al, y se clonaron en el sitio BgIII del vector de cósmido pCIT30 (Ma et al., Gene 117:161 (1992)). Se usaron procedimientos estándares de clonación y verificación (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)). Se construyó una biblioteca a partir del mutante etr1-1 de forma similar en pCIT30. La biblioteca del tipo salvaje se construyó previamente (Yanofsky et al., Nature 346:35 (1990)). Mediante análisis de restricción e hibridación secuencial con estas bibliotecas, se obtuvieron cósmidos solapados (un "contig") que abarcaban una distancia de aproximadamente 230 kb. Ver la Figura 8.

El gen ETR1 se localizó en una subregión de aproximadamente 47 kb usando el mapado de RFLP de estructura fina.

Para crear el mapa de estructura fina, se aislaron recombinantes meióticos en base al fenotipo de la auto-progenie de F_{2} de los cruces anteriores entre el mutante etr1-1 (ecotipo Columbia) y dos líneas (ambas del ecotipo Landsberg) portadoras de ap1 y clv2. Se identificaron los recombinantes en la progenie F_{2} como plantas que eran, o bien del tipo salvaje en ambos loci, o mutantes en ambos loci. El ETR1 se puntuó en plántulas creciendo a oscuras (Bleecker et al., Science 241:1086 (1988)). Se obtuvieron setenta y cuatro (74) recombinantes entre ETR1 y AP1, y 25 recombinantes entre ETR1 y CLV2. Los puntos de rotura de la recombinación se ubicaron usando como sondas fragmentos de ADN procedentes del recorrido del cromosoma. Dado el número de recombinantes aislados, la distancia promedio calculada entre los puntos de rotura fue aproximadamente de 20 kb para cada cruce. A lo largo del contig de 230 kb, se halló que la densidad real de puntos de rotura era consistente con la densidad calculada sobre el lado CLV2 (con 5 puntos de rotura en aproximadamente 120 kb). Los puntos de rotura más cercanos flanqueando el gen ETR1 definieron un segmento de ADN de aproximadamente 47 kb.

Para buscar transcritos derivados de esta región de 47 kb, se examinaron bibliotecas de cADN usando fragmentos de ADN. Un clon de cADN se denominó \lambdaC4, y se detectó con el fragmento 1 de EcoRI de 4,25 kb mostrado en la Figura 8. Puesto que \lambdaC4 potencialmente representaba el gen ETR1, este clon se caracterizó más a fondo.

Ejemplo 2 Caracterización del gen ETR1

Las secuencias de nucleótidos del cADN de \lambdaC4 y el ADN genómico correspondiente (Figura 2) (SEC. Nº ID.: 1) se determinó usando la versión 2.0 de Sequenase (United States Biochemical Co., Cleveland, Ohio) y cebadores de oligonucleótidos sintéticos que tienen una longitud de 17 nucleótidos. Las secuencias cebadoras se escogieron a partir de secuencias de ETR1 existente con objeto de extender la secuencia hasta que se determinó la secuencia completa. La secuencia inicial se obtuvo usando cebadores que se asociaban al vector de clonación. Las plantillas eran plásmidos de doble hebra. Se secuenciaron ambas hebras del ADN genómico, incluyendo 225 p.b. cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción presumido, y 90 p.b. cadena abajo del sitio de poliadenilación. El \lambdaC4 se secuenció en una única hebra.

\lambdaC4 tenía 1812 p.b. de longitud, incluyendo una cola poliA de 18 bases. A partir de las secuencias de ADN y de transferencias de ARN (descritas más abajo) se determinó que el \lambdaC4 carecía de aproximadamente 1000 pares de bases del extremo 5'.

Para obtener cADN más largos, se sintetizó cADN de la primera hebra (RiboClone cDNA Synthesis System, Promega, Madison, Wisconsin) a partir de poliA+ARN de plántulas, usando cebadores específicos de la secuencia internos para el \lambdaC4. A continuación se amplificó el cADN mediante PCR (Saiki, R.K. et al., Science 230:1350 (1985)) usando varios pares de cebadores: se escogieron cebadores de PCR 3' para asociarse a diferentes exones, tal como se dedujo a partir de las secuencias de cADN y ADN genómico, y se escogieron cebadores de PCR 5' para asociarse a varias porciones 5' de secuencias de ADN genómico. Se usaron seis cebadores diferentes en el extremo 5'. El cebador de cadena arriba más lejano que amplificó el cADN fue el cebador Q (5' AGT AAG AAC GAA GAA GAA GTG) (SEC. Nº ID.: 26). Un cebador solapado, el cual se desplazó doce bases cadena abajo, también amplificó el cADN. El cADN no pudo amplificarse usando un cebador del extremo 5' que estaba 98 pares de bases más lejos cadena arriba. Se usaron plantillas de ADN genómico para controles de PCR. El cADN más largo se consideró que se extendía hasta el extremo 5' del cebador Q. Los cADN amplificados se secuenciaron directamente con la versión 2.0 de Sequenase como sigue: después de la concentrar las reacciones de PCR mediante precipitación con etanol, los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa LMP al 0,8%. Los fragmentos de ADN se cortaron, y se calentó a 90ºC una mezcla de 10 \mul de gel cortado (fundido a 70ºC), 1 ml de cebador 10 mM, y 1,2 ml de Nonidet P-40 al 5%, durante 2 minutos para desnaturalizar el ADN. La mezcla se enfrió a continuación hasta 37ºC antes de proceder con las reacciones de secuenciación.

El cADN más largo, el cual tenía 2786 bases (sin incluir la cola de poliA) era consistente con el tamaño estimado de 2800 bases a partir de transferencias de ARN, y se presumió que era próximo a la longitud completa. Hay una caja TATA potencial (5' ATAATAATAA) 33 p.b. cadena arriba respecto el extremo 5' de la secuencia genómica. En base a la comparación de las secuencias de cADN y de ADN genómico, el gen tiene seis intrones, uno de los cuales está en el líder no traducido en 5'. Los exones contienen una única pauta de lectura abierta de 738 aminoácidos. Ver la

\hbox{Figura 3.}

La determinación de que este gen es, de hecho, el ETR1 se estableció comparando las secuencias de nucleótidos del alelo del tipo salvaje y de los cuatro alelos mutantes. Para cada alelo mutante, se construyó una biblioteca, con tamaño seleccionado mediante EcoRI, en el vector lambda ZAPII (Stratagene, La Jolla, California). Los clones del fragmento de EcoRI de 4,25 kb se aislaron mediante hibridación con el fragmento del tipo salvaje. Estos clones se convirtieron a continuación en plásmidos (vector pBluescript), mediante escisión in vivo de acuerdo con el proveedor (Stratagene), y se secuenciaron. Se secuenciaron dos clones independientes sobre una única hebra para cada alelo mutante. Los extremos 5' (535 p.b. no contenidos en el fragmento de EcoRI de 4,25 kb) se amplificaron mediante PCR y se secuenciaron directamente tal como se ha descrito previamente. Las diferencias de codones fueron como sigue: codón 65 TGT a TAT en etr1-1 (Figuras 6A, B, C y D), codón 102 GCG a ACG en etr1-2 (Figuras 7A, B, C y D), codón 31 GCG a GTG en etr1-3 (Figuras 4A, B, C y D), codón 62 ATC a TTC en etr1-4 (Figuras 5A, B, C y D). Las cuatro mutaciones están agrupadas en la región amino-terminal de la secuencia de proteína deducida.

Se examinó el mensajero de ETR1 en transferencias de gel de electroforesis (formaldehído) estándar de ARN. El transcrito de 2,8 kb del ETR1 estaba presente en todas las partes de plantas examinadas: hojas, raíces, tallos, flores y plántulas (no se muestran los datos). Además, no se observaron diferencias entre los transcritos de ETR1 del tipo salvaje y los alelos mutantes (no se muestran los datos). El tratamiento con etileno no alteró de forma detectable la cantidad de mARN de ETR1 en plántulas del tipo salvaje creciendo a oscuras (no se muestran los datos).

Cuando el gen ETR1 se hibridó con transferencias de ADN genómico de Arabidopsis en rigurosidad normal (es decir, durante la noche, en 5\times SSPE (NaCl 0,9 M, NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaOH 40 mM, EDTA 4,5 mM, pH 7,4, a 65ºC, con el lavado más riguroso en 0,1\times SSPE a 65ºC, durante 30 minutos) sólo se observaron los fragmentos esperados del locus ETR1 (no se muestran los datos). No obstante, con rigurosidad disminuida (es decir, hibridación en 5\times SSPE a 50ºC, y lavados en 5\times SSPE a 50ºC), se detectaron numerosos fragmentos, lo cual sugiere que existe una familia de genes similares en Arabidopsis.

La secuencia amino-terminal predicha de ETR1 (residuos 1-316) no tiene similitud con secuencias en la base de datos GenBank (versión 77,0). Sin embargo, la porción carboxi-terminal, es muy similar a los dominios conservados de ambos, el sensor y el regulador de respuesta del sistema procariota de dos componentes de transducción de señal. En las bacterias, el dominio quinasa de proteína en histidina del sensor se caracteriza por cinco motivos de secuencia ordenados en un orden específico con un espaciado débilmente conservado (Parkinson, Annu. Rev. Genet. 26:71 (1992)). La secuencia de ETR1 deducida contiene la totalidad de los cinco motivos con el mismo orden relativo y espaciado hallado en las proteínas bacterianas (Figura 9A). La secuencia deducida es lo más similar a las secuencias BarA de Escherichia coli (Nagasawa et al., Mol. Microbiol. 6:3011 (1992)) y LemA de Pseudomonas syringae (Harbak et al., J. Bact. 174:3011 (1992)); a lo largo de todo el dominio quinasa de histidina (los 241 aminoácidos desde el residuo 336 hasta el 566), hay respectivamente un 43% y 41% de identidad de aminoácidos con BarA y LemA, y respectivamente el 72% y 71% de similitudes. La función de BarA es desconocida, aunque se clonó en base a su capacidad para complementar una supresión en la proteína sensora osmótica EnvZ de E. coli (Nagasawa, ver más arriba). LemA es necesaria para la patogenicidad de P. syringae en plantas de alubias (Hrabak, ver más arriba). Otras proteínas bacterianas con secuencias altamente similares a este dominio ETR1 putativo son: RpfC de Xanthomonas campestris (35% de identidad), la cual posiblemente está implicada en el reconocimiento del huésped para la patogenicidad en plantas de crucíferas (Tang et al., Mol. Gen. Genet. 226:409 (1991)), RcsC de E. coli (34% de identidad), la cual está implicada en la regulación de la síntesis de la cápsula (Stout et al., J. Bacteriol. 172:659 (1990)), y ArcB de E. coli (25% de identidad), la cual es responsable de la represión de enzimas anaeróbicos (Luchi et al., Mol. Microbiol. 4:715 (1990)).

De forma adyacente al dominio quinasa de histidina putativo, la secuencia de ETR1 deducida presenta características estructurales y residuos conservados de reguladores de la respuesta bacterianos. Las características estructurales de los reguladores de respuesta se basan en la estructura tridimensional conocida de CheY (el regulador de la respuesta para la quimiotaxis) en Salmonella typhimurium y E. coli, el cual consiste en cinco hojas-\beta paralelas rodeadas por cinco hélices-\alpha (Stock et al., Nature 337:745 (1989); Volz et al., J. Biol. Chem. 266:15.511 (1991)). Las secuencias de los reguladores de respuesta bacterianos se han alineado con esta estructura en base a residuos que son compatibles con el núcleo hidrofóbico del CheY (Stock et al., Microbiological Rev. 53:450 (1989)). La secuencia de ETR1 deducida puede alinearse de forma similar (no se muestran los datos). En cuatro posiciones específicas, los reguladores de respuesta contienen residuos altamente conservados -tres aspartatos y una lisina (Parkinson et al., Annu. Rev. Genet. 26:71 (1992); Stock et al., ver más arriba); los tres aspartatos forman bolsillo ácido en el cual se inserta la cadena lateral de la lisina conservada (Stock et al., Nature 337:745 (1989); Volz et al., J. Biol. Chem. 266:15.511 (1991) y el tercer aspartato es el receptor del fosfato de la fosfohistidina (Stock et al., (1989), ver más arriba). Excepto por la sustitución conservadora de glutamato para el segundo aspartato, estos aminoácidos conservados se hallan en las mismas posiciones en la secuencia de ETR1 deducida (Figura 9B). La similitud de la secuencia deducida en este dominio (una tirada de 121 aminoácidos, desde el residuo 609 hasta el 729 en ETR1) es máxima con las secuencias de Bordetella pertussis BvgS (29% de identidad, 60% de similitud), la cual controla los genes asociados con la virulencia para la patogenicidad en humanos (Arico et al., Mol. Microbiol. 5:2481 (1991)), RcsC de E. coli (29% de identidad, 64% de similitud), LemA de P. syringae (26% de identidad, 57% de similitud), RpfC de X. campestris (25% de identidad), y BarA de E. coli (20% de identidad). Todas las proteínas bacterianas que son similares a ETR1 en secuencia sonda también estructuralmente similares a ETR1 en que contienen ambos, el dominio quinasa de histidina y el dominio regulador de la respuesta. Aunque se comparten estas característica, las funciones sensoras divergen
claramente.

Existe un potencial dominio que abarca la membrana (residuos 295-313) en la secuencia de ETR1 deducida en base al análisis de hidropatía (Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105 (1982)), pero no está claro si la ETR1 es realmente una proteína transmembrana, puesto que no hay una secuencia señal clara. Tampoco hay sitios de glicosilación asociados a N. Mientras que todas las proteínas bacterianas, a las que es similar la secuencia de ETR1 deducida, tienen dos dominios potenciales que abarcan la membrana flanqueando el dominio amino-terminal, unos pocos sensores bacterianos (los que carecen de regulador de la respuesta) no los tienen.

Ejemplo 3 Un gen ETR1 mutante confiere insensibilidad al etileno a plantas del tipo salvaje

Se confirió insensibilidad al etileno dominante a plantas de Arabidopsis del tipo salvaje cuando el gen mutante

\hbox{ etr1-1 }

se introdujo establemente usando transformación mediada por Agrobacterium. El gen era portado en un fragmento de ADN genómico de 7,3 kb (fragmentos 1 y 2 en la Figura 8, los cuales incluían aproximadamente 2,7 kb cadena arriba, del sitio de iniciación de la transformación, y aproximadamente 1 kb cadena abajo respecto el sitio de poliadenilación). Éste se clonó en un vector de transformación binaria pCGN1547, obtenido de Calgene, Inc., Davis, California. El vector también portaba un marcador seleccionable para la resistencia a la kanamicina en
plantas.

Para la construcción de etr1-1, se linealizó el clon del plásmido de EcoRI de 4,25 kb que contenía la mutación

\hbox{ etr1-1 }

mediante digestión parcial con EcoRI, y se ligó con el fragmento de EcoRI de 3,1 kbm el cual se purificó mediante gel de agarosa a partir de clon theta8 de cósmido (un subclón del YAC EG4E4 en su camino). El plásmido resultante, que contenía los dos fragmentos de EcoRI en la orientación relativa correcta, se linealizó en el sitio de poliengarce Asp718, los extremos de rellenaron usando enzima Klenow, y los engarces para BamHI se ligaron a los extremos romos. Finalmente, se suprimió un inserto de 7,3 kb en el sitio del poliengarce de BamHI, y se ligó en el sitio BamHI del vector de transformación binario pCGN1547 (McBride, K.E. et al., Plant Molecular Biology 14:269 (1990)). Para la construcción control, el fragmento de 7,3 kb del tipo salvaje se purificó en gel de agarosa a partir del cósmido theta8 parcialmente digerido con EcoRI, y se subclonó en el sitio EcoRI del pBluescript. El fragmento se retiró a continuación usando los sitios BamHI y KpnI del poliengarce, y se ligó en pCGN1547 que se había digerido con BamHI y KpnI. Las construcciones del tipo salvaje y mutante se transformaron en Agrobacterium (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163:181 (1978), cepa ASE (Monsanto) (Rogers et al., Meth. Enzymol. 153:253 (1988)). Se transformó el ecotipo Nossen de Arabidopsis (Valvekens, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5536 (1988)) usando tejido de raíz cultivado en medio líquido en vez de sólido. Se obtuvieron plantas triploides que tenían una copia mutante del gen ETR1 como cruces de la progenie entre el homocigoto del etr1-1 (diploide) y un tipo salvaje tetraploide del ecotipo Bensheim, el cual tiene el mismo fenotipo de triple respuesta que el ecotipo Columbia. Las plantas del tipo salvaje triploides se obtuvieron de forma similar cruzando el tipo salvaje diploide y el tetraploide. La sensibilidad al etileno se ensayó en plántulas creciendo a oscuras y tratadas, bien con etileno (Bleecker et al., ver más arriba) o con ACC 0,5 mM. Para el tratamiento con ACC, las plantas se germinaron y cultivaron en una mezcla de sal basal de Murashige y Skoog (MS, Sigma), pH 5,7, ACC 0,5 mM (Sigma), 1% de Bacto-agar (Difco). La resistencia a la kanamicina se midió mediante la extensión de la elongación de la raíz en plántulas de una semana de edad cultivadas sobre MS, pH 5,7, 5,5 \mug/ml de kanamicina, Bacto-agar al 1%.

Se produjeron diez plantas resistentes a la kanamicina. Ocho de las diez presentaron auto-progenie insensible al etileno, tal como se evaluó por la repuesta al etileno de las plántulas creciendo a oscuras. En cada línea, la insensibilidad al etileno se co-segregó con la resistencia a la kanamicina. Como un control, se realizaron transformaciones usando el correspondiente fragmento de ADN genómico de 7,3 kb del tipo salvaje, a partir del cual se obtuvieron seis plantas resistentes a la kanamicina. Estas líneas dieron lugar sólo a una auto-progenie sensible al etileno que no parece ser diferente del tipo salvaje.

Los transformantes de etr1-1 mostraron diferentes niveles de insensibilidad al etileno. Por tanto, el gen del tipo salvaje es capaz de atenuar el fenotipo mutante, y la mutación etr1-1 no es completamente dominante en las plantas transformadas. De las diez líneas resistentes a la kanamicina, seis dieron una insensibilidad al etileno completamente dominante, indicando la presencia de múltiples copias del gen mutante. Las otras dos líneas mostraron una dominancia parcial, y dos líneas parecían ser del tipo salvaje. La insensibilidad al etileno reducida presumiblemente se debía a niveles de expresión bajos, los cuales pueden estar causados por efectos de posición (por ejemplo, metilación del ADN) o posiblemente por el truncamiento del ADN transferido.

Ejemplo 4 Construcciones de vector que contienen un promotor heterólogo

Este ejemplo describe la construcción de un vector de transformación de plantas que contiene e un promotor heterólogo para controlar la expresión de los ácidos nucleicos del ETR1 del tipo salvaje y mutante.

El promotor de la proteína 35S del virus del mosaico de la coliflor (Guilley et al., Cell 30:763-773 (1982); Odell et al., Nature 313:810-812 (1985), y Sanders et al., Nucl. Acids Res. 15:2543-2558 (1987)) y el extremo 3' del gen de la sintasa de nopalina (NOS) se clonaron en el vector pCGN1547 para crear el pCGN18. El promotor de 35S, en un fragmento HindIII-BamHI de aproximadamente 1,6 kb, se clonó en el único sitio HindIII-BamHI del pCGN1547. El fragmento BamHI-KpnI de 1 kb de NOS se clonó en el único sitio BamHI-KpnI del pCGN1547.

El fragmento de EcoRI de 4,25 kb de ambos, el tipo salvaje y el alelo mutante ETR1-1 se clonaron independientemente en el único sitio BamHI del anterior vector pCGN18 usando engarces BamHI. Este fragmento genómico de EcoRI de 4,25 kb contiene la secuencia codificante completa, incluyendo cinco intrones y aproximadamente 1 kb de ADN genómico cadena abajo del sitio de poliadenilación. No contiene el promotor del ETR1, el cual está en el fragmento 2 EcoRI de 3,1 en la Figura 5.

Estos vectores se usaron para transformar explantes de raíz tal como se describió en el Ejemplo 3. Se obtuvieron plantas resistentes a la kanamicina que contenían el gen ETR1-1 mutante, y se demostró un fenotipo de insensibilidad al etileno similar al hallado en el Ejemplo 3. Las plantas control transformadas con el gen ETR1 del tipo salvaje produjeron sólo auto-progenie sensible al etileno.

Ejemplo 5 Construcción de un vector utilizando ETR1 antisentido

La insensibilidad al etileno se confirió a Arabidopsis del tipo salvaje mediante la expresión de un ácido nucleico antisentido de ETR1, el cual se introdujo usando el procedimiento estándar de transformación de raíces con Agrobacterium. Valvekens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5536 (1988). El ácido nucleico anti-sentido consistió en un fragmento de cADN de ETR1 de 1,9 kb. La expresión de este fragmento, que se extiende desde el sitio de restricción MscI en el nucleótido 220 hasta el primer sitio SmaI en el nucleótido 2176 en las Figuras 3A, 3B, 3C y 3D, se dirigió en la dirección inversa mediante el promotor de 35S de CaMV. Para construir el ácido nucleico anti-sentido, se ligaron engarces BamHI a los extremos del fragmento MscI-SmaI de 1,9 kb, y el fragmento así formado se ligó en el sito BamHI del vector de transformación pCGN18. Jack et al., Cell 76:703 (1994). La construcción se transformó en las cepa ASE de Agrobacterium tal como se ha descrito más arriba, y a continuación en Arabidopsis.

Las plántulas derivadas de este experimento de transformación se ensayaron por su sensibilidad al etileno como se ha descrito previamente. Las plántulas que contenían la construcción anti-sentido eran insensibles al etileno.

Ejemplo 6 Identificación de QITR, un segundo ácido nucleico de ETR en Arabidopsis

El ADN genómico de Arabidopsis thaliana se digirió parcialmente con Sau3A y se clonó en un \lambdaGEM11 (brazos de medio sitio) obtenido de Promega, Madison, Wisconsin. El digerido genómico se rellenó parcialmente en sus extremos antes de clonarlo con \lambdaGEM11, y se sembró sobre medio tal como sugería el fabricante.

La biblioteca clonada de ese modo se examinó con una fragmento XbaI de cADN marcado con ^{32}P que se extendía entre los nucleótidos 993-2308, tal como se detalla en las Figuras 3B, 3C y 3D. Las condiciones de hibridación fueron 50ºC y 5\times SSPE. Los lavados se realizaron a 50ºC y 0,2\times SSPE. Se identificaron varios clones que se hibridaban positivamente, se sembraron y se examinaron de nuevo. Los clones que se hibridaban positivamente se digirieron con SacI (que corta dentro de los brazos del fago de clonación y dentro del inserto). Los múltiples fragmentos obtenidos del mismo se subclonaron en plásmidos bacterianos para su secuenciación. La secuencia del ADN genómico (SEC. Nº ID.: 45) junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. Nº ID.: 46 y 48) se detallan en la Figura 12. Esta secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos de ETR se denominan respectivamente como secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos QITR. La secuencia de cADN del QITR (SEC. Nº ID.: 47) y la secuencia de aminoácidos del QITR (SEC. Nº ID.: 46 y 48) se muestran en la Figura 13.

Por comparación con la secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos del ETR1 de Arabidopsis (ver Figuras 2 y 3), la proteína QITR parece contener una porción amino-terminal que tiene un nivel de homología relativamente elevado con la porción amino-terminal de la proteína ETR1, y una porción quinasa de histidina con un nivel de homología moderado por la misma secuencia en ETR1. La región reguladora de la respuesta hallada en ETR1 no está presente en la proteína QITR. La homología de ácido nucleico global es aproximadamente del 69%. Con relación a la porción amino-terminal (es decir, entre los residuos 1 a 316) la homología es aproximadamente el 71% idéntica en términos de secuencia de aminoácidos y 72% idéntica en términos de secuencia de ácido nucleico.

Ejemplo 7 Modificación del ácido nucleico de QITR para conferir insensibilidad al etileno

Se realizó una sustitución de aminoácido en un clon genómico de QITR de 5 kb, el cual era análogo al de la mutación ETR1-4, es decir, la sustitución de la isoleucina en la posición 62 con fenilalanina. Comparar la Figura 3A con la Figura 5A en el residuo 62. Como se indica además en las Figuras 12 y 13, el residuo 62 en la proteína QITR es también una isoleucina, como en la proteína ETR1.

La sustitución de aminoácido se realizó en el ácido nucleico de QITR usando mutagénesis in vitro dirigida a oligonucleótido, Kunkel et al. Methods in Enzymology 154:367-382 (1987). En relación a esta mutación concreta Se usó un equipo "Muta-gene" de Bio-Rad Laboratories, Hercules, California. La secuencia del oligonucleótido usado fue 5' GGA GCC TTT TTC ATT CTC. La sustitución del nucleótido A con T en el codón ATC cambió el aminoácido Ile en el residuo 62 a Phe en la secuencia de proteína deducida.

El ácido nucleico de QITR, que abarcaba aproximadamente 5 kb desde el primer sitio HindIII hasta el segundo sitio KpnI, contenía aproximadamente 2,4 kb de nucleótidos cadena arriba respecto el codón de inicio. Este fragmento de 5 kb se ligó en el vector de transformación pCGN1547 (ver más arriba). Esta construcción se transformó a continuación en la cepa ASE de Agrobacterium, tal como se describió más arriba, y a continuación en Arabidopsis.

Las plántulas derivadas de este experimento de transformación se ensayaron por su sensibilidad al etileno como se ha descrito previamente. Las plántulas que contenían el ácido nucleico de QITR conteniendo la modificación en el residuo 62 eran insensibles al etileno.

Ejemplo 8 Identificación del ácido nucleico Q8 de ETR en Arabidopsis

El ácido nucleico Q8 de ETR (SEC. Nº ID.: 41 y 43) se identificó mediante comparación directa de la secuencia con el ácido nucleico de ETR1 de Arabidopsis. El ácido nucleico Q8 de Arabidopsis se identificó en relación con un recorrido de cromosoma sobre el cromosoma 3 de Arabidopsis thaliana.

En resumen, se generaron clones de YAC solapados, los cuales fueron a continuación subclonados en plásmidos. Los insertos genómicos en tales plásmidos se extrajeron mediante digestión con endonucleasas de restricción, y se hibridaron con una biblioteca de cADN procedente de tejido floral de Arabidopsis.

Los insertos que se hibridaban positivamente se secuenciaron para producir la secuencia genómica global (SEC. Nº ID.; 41), junto con la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. Nº ID.: 42 y 44), tal como se detalla en la Figura 14. La secuencia de cADN (SEC. Nº ID.; 43) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. Nº ID.: 42 y 44), se detallan en la Figura 15.

La homología global del ácido nucleico entre el ácido nucleico de Q8 y el ácido nucleico de ETR1 es aproximadamente del 69%. Con respecto a la porción amino-terminal que se extiende desde el residuo 1 hasta el 316, la homología global de secuencia de cADN es aproximadamente del 72%, mientras que el ácido nucleico que codifica esta secuencia tiene una homología de secuencia de aproximadamente el 71%, como entre los ácidos nucleicos de Q8 y ETR1.

Ejemplo 9 Aislamiento del cADN de TETR

Se preparó una sonda de hibridación marcada con ^{32}P mediante marcaje aleatorio con cebador de un fragmento de PCR de 1,3 kb generado mediante la amplificación con PCR del gen ETR1 de Arabidopsis, con los cebadores de PCR "5' BamHI" (CCC GGA TCC ATA GTG TAA AAA ATT CAT AAT GG) y la "3' BamHI" (CCG GAT CCG TTG AAG ACT TCC ATC TTC TAA CC).

Esta sonda se usó para examinar una biblioteca de cADN de mARN del fruto rojo de la tomatera, clonada en el sitio EcoRI del vector lambda ZAP II de Stratagene, La Jolla, CA. Se identificaron veinte (20) placas positivas primarias que se hibridaban con esta sonda (condiciones de lavado: 2\times SSC a 65ºC), y se realizaron exámenes secundarios sobre éstas para obtener placas puras. A continuación se realizó el corte in vivo con los fagos recombinantes resultantes y se obtuvieron 19 clones de plásmidos independientes.

Los ADN complementarios, procedentes de clones de plásmidos que contenían los fragmentos mayores del cADN de tomate más largo (TETR14, también denominado TXTR), se compararon con las secuencias ETR1 y QITR. La secuencia de nucleótidos del TETRA14 predijo que el péptido codificado era más parecido al péptido QITR que al péptido ETR1. Esta conclusión se basó en el hecho de que el dominio regulador de la respuesta (el cual está presente en ETR1) está ausente en ambos, el TETR14 y el QITR. Se determinó la secuencia (o secuencia parcial) de varios de los otros clones de cADN, y se halló que correspondían al mismo gen.

Ejemplo 10 Análisis de la expresión del gen TETR14

Se realizó un análisis de Northern con mARN procedente de frutos en desarrollo, de tomate normal o mutante (inhibidor de la maduración (rin), sin maduración (non) o "Never-ripe" (Nr)). Los estadios de desarrollo de los frutos usados fueron: verde maduro, en su punto, en su punto más 7 días, y fruto verde maduro tratado con etileno. El ARN mensajero que se hibridaba con la sonda del gen TETR14 no estaba presente en el estadio verde maduro, pero estaba presente en "en su punto", "en su punto" más 7 días, y en la fruta verde madura tratada con etileno. Por tanto, se concluyó que la acumulación del mARN de ETR14 estaba regulada por el etileno. La acumulación del mARN de ETR14 estaba atenuada en los tres mutantes de maduración, apoyando aún más el hallazgo de que la acumulación de mARN está regulada por el etileno.

Ejemplo 11 Análisis del gen TETR14 procedente de ADN de Pearson y "Never-ripe"

Se obtuvieron cebadores de PCR que amplificaban específicamente la región N-terminal del gen TETR14. La porción amplificada estaba entre Met1 e Ile214 en las Figuras 16A y 16B. Los cebadores fueron (CCG GAT CCA TGG AAT CCT GTG ATT GCA TTG) y TETR4A (GAT AAT AGG AAG ATT AAT TGG C). Las condiciones de PCR (Perkin-Elmer Cetus): 1 \mug de ADN genómico de tomate, 40 picomoles de cada cebador, 1 min a 94ºC, 2 min a 45ºC, 2 min a 72ºC, 35 ciclos. Los productos de la PCR obtenidos con estos cebadores, que resultaron de dos reacciones de amplificación independientes de AND de pearson y Nr, se purificaron en gel de agarosa y se subclonaron, bien en el vector T/A (Invitrogen), o se digirieron con BamHI y XhoI y se subclonaron en Bluescript KS- que había sido linealizado con BamHI y SaII. Se preparó ADN de plantilla de hebra única a partir de los plásmidos resultantes, y se secuenció. La secuencia de los productos de la PCR del ADN de pearson fue idéntica a la secuencia del clon TETR14A- El análisis de la secuencia reveló que los fragmentos de la PCR que resultaban de la PCR del ADN Nr (TETR14-Nr) no eran idénticos a los obtenidos a partir del ADN de pearson. El nucleótido citosina en la posición 395 del gen TETR14 es una timina en el gen amplificado a partir del ADN de Nr. Esta sustitución de nucleótido en el TETR14-Nr cambia la prolina en la posición del aminoácido 36 del péptido predicho a una leucina. Ver la Figura 22 y las SEC. Nº ID.: 49 y 50 respectivamente para las secuencias globales de ácido nucleico y aminoácidos. Este Pro-36 del TETR14 corresponde a la Prot-36 del péptido ETR1 y a la Prot-36 del péptido QITR. Este resultado indica que una mutación en el gen TETR14 del tomate confiere una insensibilidad al etileno dominante. Y, por tanto, es posible predecir que otros cambios en el gen TETR14 y en otros homólogos del ETR1 del tomate resultarán en la insensibilidad al etileno en el tomate.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Meyerowitz, Elliot M.

\hskip3.3cm

Chang, Caren

\hskip3.3cm

Bleecker, Anthony B.

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PLANTAS QUE TIENEN UNA RESPUESTA AL ETILENO MODIFICADA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 50

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Richard F. Trecartin

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

DIRECCIÓN: 3400 Embarcadero Center, Suite 3400

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: San Francisco

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAIS: Estados Unidos de América

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO: 94111

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: Patent In Release #1.0,

\hskip4.4cm

Versión #1.25

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US94/____

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 01-Julio-1994

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Trecartin, Richard F.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 31.801

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA: FP57515-1RFT

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (415) 781-1989

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (415) 398-3249

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3879 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2787 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 188..2401

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 2:

4

5

6

7

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 738 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2787 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 188..2401

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 4:

162

11

12

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 738 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2787 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 188..2401

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 6:

17

18

19

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 738 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2787 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 188..2401

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 8:

24

25

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 738 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

29

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2787 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 188..2401

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

32

33

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 738 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 11:

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 155 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 155 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 13:

166

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 155 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 149 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 66 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 67 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 67 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 67 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 19:

42

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 369 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 369 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 296 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 296 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTAAGAACG AAGAAGAAGT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 56 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 56 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 56 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 29:

51

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 56 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 30:

52

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Leu Val Ala Leu Ser Gly Asn Thr Asp Lys Ser Thr Lys Glu}

\sac{Lys Cys Met Ser Phe Gly Leu Asp Gly Val Leu Leu Lys Pro Val Ser}

\sac{Leu Asp Asn Ile Arg Asp Val Leu Ser Asp Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ile Leu Phe Gly Pge Thr Ala Ser Ala Gln Met Asp Glu Ala His}

\sac{Ala Cys Arg Ala Ala Gly Met Asp Asp Cys Leu Pge Lys Pro Ile Gly}

\sac{Val Asp Ala Leu Arg Gln Arg Leu Asn Glu Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Pro Val Ile Gly Val Thr Ala Asn Ala Leu Ala Glu Glu Vys Gln}

\sac{Arg Cys Leu Glu Ser Gly Met Asp Ser Cys Leu Ser Lys Pro Val Thr}

\sac{Leu Asp Val Ile Lys Gln Ser Leu Thr Leu Tyr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 34:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Pro Ile Val Ala Leu Thr Ala His Ala Met Ala Asn Glu Lys Arg}

\sac{Ser Leu Leu Gln Ser Gly Met Asp Asp Tyr Leu Thr Lys Pro Ile Ser}

\sac{Glu Arg Gln Leu Ala Gln Val Val Leu Lys Trp Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 35:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2405 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 288..2196

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

53

54

55

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 36:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 636 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 37:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4566 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: unión(763..1671, 3062..3433, 3572..3838, 3969..4096, 4234..4402)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 37:

59

60

61

62

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 38:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 615 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 38:

63

64

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 39:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 737 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 33..719

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 39:

65

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 40:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 228 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 40:

66

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 41:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6202 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: unión(3522..5288, 5372..5926)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 41:

67

68

69

70

71

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 42:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 773 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

73

74

75

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 43:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2404 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..2322

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 43:

76

77

78

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 44:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 773 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 44:

79

80

81

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 45:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3009 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: unión(564..1469, 1565..1933, 2014..2280, 2359..2486, 2577..2748)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 45:

82

83

84

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 46:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 613 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

85

86

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 47:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2314 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 224..2065

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

87

88

89

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 48:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 613 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

90

91

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 49:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2405 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 288..2196

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

92

93

94

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 50:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 636 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

95

96

Claims (16)

1. Ácido nucleico aislado que codifica una proteína ETR, la cual es una proteína (i) que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se detalla en la SEC. ID. Nº: 3, o es una proteína (ii) que tiene al menos una homología de secuencia del 50% con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº: 3, y tiene una porción amino-terminal que tiene al menos un 55% de homología de secuencia con la secuencia amino-terminal de la SEC. ID. Nº: 3, residuos

\hbox{1-316.}

2. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, que codifica una proteína ETR, dicha proteína ETR tiene una secuencia de aminoácidos que es la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº: 3, con al menos un aminoácido de la región amino-terminal de SEC. ID. Nº: 3 que está sustituido, insertado o suprimido.

3. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, que codifica una proteína ETR que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº: 3, con al menos un aminoácido en la posición 31 (Ala), 36 (Pro), 62 (Ile), 65 (Cys) o 102 (Ala) que está sustituido, insertado o suprimido.

4. Ácido nucleico recombinante que comprende un promotor unido operativamente al ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que codifica dicha proteína (ii).

5. Ácido nucleico recombinante según la reivindicación 4, en donde el promotor es heterólogo respecto el ácido nucleico que codifica dicha proteína (ii), y que es capaz de causar la expresión de dicho ácido nucleico en una célula vegetal.

6. Ácido nucleico recombinante según la reivindicación 4 o reivindicación 5, en donde el promotor es específico para un tejido, específico del fruto, o específico-temporal.

7. Ácido nucleico recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el promotor es inducible.

8. Célula vegetal transformada con el ácido nucleico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

9. Planta que comprende células vegetales de la reivindicación 8.

10. Planta según la reivindicación 9, en donde la planta tiene un fenotipo caracterizado por una disminución en la respuesta de la planta al etileno en comparación con una planta del tipo salvaje.

11. Planta según la reivindicación 9 o reivindicación 10, en donde la planta es portadora de frutos y el promotor es específico del fruto.

12. Planta según la reivindicación 11, en donde la planta tiene un fenotipo caracterizado por una disminución en la velocidad de maduración del fruto.

13. Fruto de la planta de la reivindicación 11 o reivindicación 12.

14. Fruto según la reivindicación 13, en donde el fruto es el tomate.

15. Procedimiento para producir una planta que tiene un fenotipo caracterizado por una disminución en la respuesta de la planta al etileno, en comparación con una planta del tipo salvaje, comprendiendo el procedimiento los pasos de:

a.

transformar al menos una célula vegetal de la planta con el ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

b.

regenerar las plantas a partir de una o más células vegetales transformadas, y

c.

seleccionar al menos una planta que tenga dicho fenotipo.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en donde la planta es la tomatera.