ES2295464T3 - Proteinas con dominios de repeticion de bacterias de tipo ig presentes en especies de leptospira. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido sustancialmente purificado que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:2.
Description
Proteínas con dominios de repetición de
bacterias de tipo IG presentes en especies de leptospira.
La invención se refiere a tres moléculas de ADN
aisladas que codifican BigL1, BigL2 y BigL3, en la bacteria
Leptospira sp que tienen dominios de repetición de bacterias
de tipo IG (Big) y su uso en diagnóstico, aplicaciones terapéuticas
y de vacuna. De acuerdo con la presente invención, las moléculas
aisladas de acuerdo a proteínas BigL1, BigL2 y especies de
Leptospira que son capaces de producir enfermedad en seres
humanos y otros mamíferos, incluyendo los de importancia
veterinaria.
Las espiroquetass son bacterias, movibles, de
forma helicoidal e incluyen tres géneros Leptospira, Borrelia
y Treponema, que son patógenos de seres humanos y otros
animales. Borrelia y Treponema son los agentes
causantes de enfermedades que incluyen enfermedad de Lyme, fiebre
reincidente, sífilis y yaws. Leptospira consta de de un
grupo genéticamente diverso de ocho especies saprofititas patógenas
y cuatro no patógenas (1, 2). Las Leptospiras también se clasifican
de acuerdo con el estado serovar - se han identificado 200 serovares
patógenos. La heterogeneidad estructural en restos de
lipopolisacáridos parece ser la base para el gran grado de
variación antígena observada entre los serovars (1, 2).
La Leptospirosis es una enfermedad zoonótica:
la: transmisión a los seres humanos se produce mediante contacto
con reservorios animales domésticos o salvajes o un ambiente
contaminado por su orina. La infección produce un amplio espectro
de manifestaciones clínicas. La fase temprana de enfermedad está
caracterizada por fiebre, escalofríos, cefaleas y mialgias graves.
La enfermedad progresa en un 5 a 15% de las infecciones clínicas
que producen complicaciones multisistema graves tales como,
ictericia, insuficiencia renal y manifestaciones hemorrágicas (1
- 4). La Leptospirosis grave está asociada a unas tasas de
mortalidad de 5 - 40%.
La Leptospirosis tiene una amplia distribución
en el mundo. Debido al gran espectro de especies animales que
sirven como reservorios, se considera que es la enfermedad zoonótica
más extendida (1). La Leptospirosis es tradicionalmente una
enfermedad ocupacional importante entre los grupos de riesgo tales
como personal militar, granjeros, mineros, trabajadores de aguas
residuales y desechos, veterinarios y trabajadores mataderos
(1-3). Sin embargo, han surgido recientemente
nuevos patrones de transmisión de enfermedad que resaltan la
creciente importancia de la leptospirosis como un problema de
salud pública. En los países desarrollados, la leptospirosis se
considera la causa de erupciones asociadas a actividades
recreativas (1) y episodios deportivos (1, 4, 5). En Brasil y otros
países desarrollados, que son el fundamento de condiciones de de
pobreza han producido una gran cantidad de episodios de epidemia
urbanos de leptospirosis que se asocian a una alta mortalidad (4,
5).
Además de su impacto en la salud pública, la
leptospirosis es una carga económica principal que provoca
enfermedad en el gana y animales domésticos (2). La Leptospirosis
produce abortos, mortalidad, infertilidad, fallo para procrear,
reducción en la producción de leche y animales muertos tales como
vacas, credos, ovejas, cabras, caballos y perros e induce infección
crónica y eliminación de leptospiras patógenas en ganado (2) y por
lo tanto representa una fuente adicional de la pérdida económica
para la industria de ganadería animal debido a las regulaciones de
cuarentena internacionales y nacionales actuales.
El control de la leptospirosis humana y animal
está dificultado por la carencia actual de las herramientas de
diagnóstico adecuadas. El ensayo serológico convencional, el ensayo
de aglutinación microscópica (MAT), es inadecuado para la
identificación rápida del caso ya que se puede solucionar solamente
en unas pocas referencias de laboratorios y requiere análisis de
sueros apareados para lograr una sensibilidad suficiente (1, 2). La
dependencia de la MAT da como resultado el establecimiento de la
causa de erupciones como se ha observado por varios investigadores
(1, 2). Los ensayos de microabsorbencia unidos a enzima (ELISA), y
otros ensayos serológicos rápidos basados en las preparaciones de
antígenos de Leptospira de células enteras se han desarrollado para
uso como un procedimiento alternativo para seleccionar una infección
leptospiral, aunque el MAT se requiere todavía para la confirmación
del caso (1, 2). Los ensayos serológicos basados en antígenos
recombinantes los ensayos se usan de manera amplia en la selección
de infecciones por espiroquetas tales como enfermedad de Lyme y
sífilis, pero el uso de proteínas recombinantes para la
serodiagnosis de leptospirosis no se ha investigado todavía de
manera amplia. De manera reciente, un ensayo de inmuno captura de
antígeno flagelar recombinante se describió para la serodiagnosis
de leptospirosis bovina (6). Una proteína de trauma encefálico,
Hsp58, mostró un alto grado de reactividad de ELISA con muestras de
suero de un pequeño número de casos humanos (7). Sin embargo, la
utilidad de los antígenos recombinantes para la serodiagnosis de
leptospirosis no se ha investigado todavía en un gran número de
estudios de validación.
Además, no existen intervenciones eficaces
disponibles actualmente, que controlan o evitan la leptospirosis.
Las mediciones de control medioambiental son difíciles de
implementarse debido a que la supervivencia a largo plazo de
leptospiras patógenos en suelo y agua y la abundancia de los
reservorios salvajes y domésticos (1, 3). Se han centralizado
esfuerzos en el desarrollo de inmunización eficaz como una
intervención contra la leptospirosis. Actualmente las vacunas
disponibles se basan en las preparaciones de células inactivadas o
enteras de leptospiras patógenas y parece que induzcan respuestas
protectoras mediante la inducción de anticuerpos contra el
lipopolisacárido de Leptospira (1, 3). Sin embargo, estas vacunas no
incluyen protección a largo plazo contra infección. Además, no
proporcionan inmunidad de protección cruzada contra serovares de
Leptospira que no se incluyen en la preparación de vacunas. El gran
número de serovares patógenos (> 200) y el coste de producción
de una vacuna multi - serovar tiene limitaciones importantes en el
desarrollo de vacunas eficaces mediante estrategias basadas en
preparaciones de células enteras o de membrana.
El mecanismo de membrana en leptospirosis, como
una enfermedad de espiroquetas tal como enfermedad de Lyme y
sífilis, depende de la capacidad del patógeno de diseminar de manera
amplia en el huésped durante la fase temprana de infección (2).
Las proteínas de Leptospira asociadas a membrana se supone que
median interacciones que permiten la entrada y diseminación
mediante tejidos huéspedes. Los factores supuestos de virulencia
asociados a la superficie sirven como candidatos para estrategias
de vacunación que inducen respuestas a estos factores que bloquean
la diseminación en el huésped. Además, las proteínas asociadas a
membrana deben ser accesibles a la respuesta inmune durante la
infección de huésped y por lo tanto, constituyen dianas para la
protección inmune mediante mecanismos tales como fagocitosis
dependiente de anticuerpos y la muerte mediada por complemento. La
producción de estas dianas de antígenos son proteínas recombinantes
ofrece un planteamiento rentable para la inmunización protectora
para leptospirosis tales como vacuna a base de subunidad. Además, la
selección de las dianas asociadas a superficie que se conservan
leptospiras patógenas pueden evitar las limitaciones encontradas
con las preparaciones de vacunas de células enteras actualmente
disponibles.
Una limitación principal en el campo de
leptospirosis ha sido la identificación de proteínas asociadas a
superficie y que se expresan en huésped con procedimientos
bioquímicos y convencionales. A partir de la secuencia de genoma de
las espiroquetas, Borrelia burgdorferi, se identificaron más
de 100 lipoproteínas asociadas. Basándose en el tamaño del genoma
y la biología de su ciclo de vida, se espera que Leptospira
tenga un número mayor de dianas asociadas a superficie.
Actualmente menos de 10 proteínas asociadas a superficie se han
caracterizado mediante el aislamiento de extractos de membrana,
purificación y caracterización de proteínas en estos extractos y
clonación molecular de estas dianas de proteína
(8-14) (12). La inmunización con proteínas
recombinantes para varias dianas identificadas, LipL32, OmpL1 y
LipL41, inducen respuestas parciales, pero no completas,
protectoras (11, 12).
Para desarrollar un mayor entendimiento de de la
expresión de Leptospira los inventores han usado la respuesta
inmune humoral durante la leptospirosis humana como un indicador de
antígenos de proteína que se expresan durante la infección. La
identificación de antígenos de Leptospira que se expresan durante la
infección tiene implicaciones potencialmente importantes para el
desarrollo de nuevas estrategias de serodiagnóstico e
inmunoprotectoras. Los sueros de pacientes con leptospirosis se usó
para identificar clones de una genoteca de fagos de ADN de
Leptospira que expresan polipéptidos inmunorreactivos. Una
proporción de estos clones se encontró que codifican una familia
novedosa de proteínas Leptospira asociadas a membrana. La
identificación de estos polinucleótidos y polipéptidos y su
aplicación para diagnosis de leptospirosis y que induce una
respuesta inmune a las espiroquetas patógenas en base a esta
invención.
La invención se refiere a moléculas de ADN en
Leptospira y los polipéptidos que codifican dominios de
repetición de bacterias de tipo Ig. La invención describe el
aislamiento de tres moléculas de ADN, originalmente derivadas de
L. kirschneri y L. interrogans, que codifican
proteínas, en el presente documento denominadas "BigL1"
"BigL2" y "BigL3", que tienen pesos moleculares de
aproximadamente 110, 205 y 205 kDa, respectivamente, basándose en
la secuencia de aminoácidos predicha de los polipéptidos. Las tres
proteínas tienen 12 - 13 secuencias de repetición en tándem de
aproximadamente 90 aminoácidos. Las secuencias de repetición de
BigL1, BigL2 y BigL3 están de manera alta relacionadas (> 90% de
identificación de secuencias de aminoácidos) entre sí y pertenecen
a la familia de dominios de bacterias de tipo Ig (Big), restos que
se encuentran en factores de virulencia de patógenos
bacterianos.
Las moléculas de ADN que codifican proteínas de
Leptospira con dominios Big, llamados en el presente
documento " bigL1", " bigL2" y " bigL3", se pueden
insertar como ADN heterólogos en un vector de expresión para
producir los péptidos y polipéptidos. Los polipéptidos recombinantes
se pueden purificar a partir de huéspedes suplentes transformados
con tales vectores de expresión. Los polipéptidos derivados de
BigL1, BigL2 y BigL3- son marcadores serológicos para la infección
activa y pasada ya que los sueros de pacientes y animales con
leptospirosis infectados o inmunizados con Leptospira patógena
reconocen polipéptidos aislados.
Además, los polipéptidos BigL1, BigL2 y BigL3 de
las preparaciones de antígenos recombinantes o nativas son
inmunogénicas. Los anticuerpos obtenidos a partir de animales
experimentales inmunizados con polipéptidos BigL1, BigL2 y BigL3
recombinantes reconocen antígeno nativo de Leptospira, y son
útiles para para detectar espiroquetas patógenas en muestras de
sujetos con una sospecha de infección.
Además, los polipéptidos BigL1, BigL2 y BigL3
inducen una respuesta inmune contra espiroquetas patógenas. Los
polipéptidos derivados de BigL1, BigL2 y BigL3-; los anticuerpos a
estos polipéptidos; y polinucleótidos que codifican BigL1, BigL2 y
BigL3 se pueden usar solos o combinados con vehículo
farmacéuticamente aceptable para tratar o prevenir infección con
Leptospira. Ya que los dominios Big están presentes en las
proteínas asociadas a virulencia en otros patógenos bacterianos,
estos restos se pueden usar para tratar o prevenir infecciones no
relacionadas con las provocadas por Leptospira.
En una primera realización, la descripción
describe moléculas de ADN para bigL1, bigL2 y bigL3 y los
polipéptidos que están codificados por estas moléculas de ADN.
Además, se proporciona un procedimiento para producir un vector de
expresión que contiene los polipéptidos bigL1, bigL2 y
bigL3 y se obtienen polipéptidos sustancialmente purificados
derivados de estas secuencias.
Una segunda realización de la presente
descripción es describir una composición farmacéutica para inducir
respuestas inmunes en sujetos a espiroquetas patógenas,
comprendiendo una cantidad inumogénicamente eficaz de uno o más
antígenos seleccionados entre el grupo constituido BigL1, BigL2,
BigL3 y polipéptidos secuencias funcionalmente equivalentes en un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una tercera realización, la descripción
describe un procedimiento para identificar un compuesto que se une
de manera específica a los polipéptidos BigL1, BigL2, BigL3 o
polipéptidos que incluye componentes de incubación que comprenden
el compuesto y polipéptido o polipéptidos BigL1, BigL2 o BigL3 en
condiciones suficientes para permitir los componentes que
interactúan y miden la unión del compuesto al polipéptido o
polipéptidos BigL1, BigL2 o BigL3. Preferiblemente, el
procedimiento de la invención es un procedimiento de serodiagnóstico
que utiliza suero de un sujeto con una sospecha de infección activa
o pasada con Leptospira u otros patógenos bacterianos
relacionados.
En una cuarta realización, la descripción
describe un procedimiento para detectar patógenos en una muestra
que incluye poner en contacto una muestra sospechosa de contener una
espiroqueta patógena con un reactivo que se une de manera
específica al componente de células específico de patógeno y que
detecta la unión del reactivo al componente. En otro aspecto, el
reactivo que se une de manera específica al componente de células
específico de patógeno es un anticuerpo contra el polipéptido o
polipéptidos BigL1, BigL2 o BigL3.
Una quinta realización, la descripción describe
un kit útil para la detección de polipéptidos BigL1, BigL2, y BigL3
o polipéptidos o anticuerpos que se unen de manera específica a
polipéptidos o polipéptidos BigL1, BigL2, BigL3,.
Otros objetos, características y ventajas de la
presente descripción serán evidentes a partir de la siguiente
descripción detallada.
Las Figs. 1A y B muestran un análisis de
transferencia de Southern de las secuencias del gen bigL en
Leptospira. El ADN genómico (3 mcg/calle) de la cepa de L.
interrogans Fiocruz L1-130 (calles 1), cepa de
L. kirschneri Rm52 (calles 2) y cepa de L. biflexi
Patoc I (calles 3) digerido NsiI y sometido a electroforesis de gel
de agarosa. Después de transferir a membranas de nitrocelulosa, las
transferencias se sondaron con fragmentos de ADN que codifican
dominios repetitivos de BigL (dominio 4º y 5º BigL3, Fig. 1A) y
regiones C-terminal de bigL1, bigL2 y bigL3, que
son únicos a cada uno de estos genes, respectivamente (Fig.1B).
La Fig. 2 muestra un diagrama esquemático de la
organización genómica de la región que codifica las proteínas BigL1
y BigL3 en L. kirschneri. La proteína de BigL1 contendría un
péptido de señal (casilla entre ventanilla) y treinta dominios de
tipo inmunoglobulina bacterianos de 90-aminoácidos
(casillas en negro). La proteína BigL3 contendría un péptido señal,
doce dominios de tipo inmunoglobulina bacterianos de 90 aminoácidos
y un dominio terminal carboxi (C-terminal) de 793
aminoácidos. Se muestran las localizaciones de la región de 2156
pares de bases de 100% de identidad de secuencia. La organización
de de la región mostrada se conservó en L. interrogans y
L. kirschneri.
La Fig. 3 muestra la amplificación por la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de fragmentos de ADN de
cepas de cinco especies patógenas L. kirschneri y L.
interrogans que codifica la región de BigL3 que corresponde a
las posiciones 46 -6 5 de aa. Las reacciones de PCR se realizaron a
partir de ADN purificado de cinco especies patógenas (L.
kirschneri, borgpetersenii, interrogans, santarosai, y
noguchi) y dos no patógenas (L. biflexi y
wolbachii).
La Fig. 4 muestra productos amplificados de
RT-PCR de extractor de ARN de L. kirschneri
con cebadores específicos de bigL1, bigL2 y bigL3. Las reacciones
de transcripción inversa (calles "+") se realizaron sobre
extractos de ARN de leptospiras cultivadas y después se someten a
una etapa de amplificación de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) con cebadores que se unen a secuencias únicas en bigL1,
bigL2 y bigL3. La amplificación con cebadores basados en
las secuencias dentro de lipL45 se realizó como una reacción
de control como lo eran las reacciones de PCR para las que las
muestras no estaban sometidas a la etapa de transcripción
inversa.
La Fig. 5 muestra la reactividad de
inmunotransferencia de suero combinado de pacientes y reservorios
animales infectados con Leptospira patógena y animales de
laboratorio inmunizados con preparación de antígeno de L.
interrogans entero a la proteína recombinante de BigL3
(rBigL3). El análisis de transferencia de Western se realizó con
rBigL3 purificado (1 mcg por calle, calles 3). Se sondaron las
membranas con suero de pacientes con leptospirosis (calle A),
individuos sanos (calle B), ratas capturadas que están colonizadas
con L. interrogans (calle C), ratas capturadas que no están
colonizados con L. interrogans (calle D), ratas de
laboratorio inmunizadas con preparaciones de antígenos enteros de
L. interrogans cultivada in vitro (calle E) y suero
preinmune de ratas de laboratorio recogidas antes de la inmunización
(calle F). la reactividad a la preparación de antígeno de L.
interrogans entero (calles 1) y proteína recombinante LipL32
(rLipL32, calles 2) se muestra para comparación. Los números a la
izquierda indican las posiciones y movilidades relativas (kDa) para
pesos moleculares convencionales (Invitrogen).
La Fig. 6 muestra una evaluación de ELISA de
seroactividad de pacientes individuales a rBigL3 durante la fase
aguda (calles A) y de convalecencia (calles B) de enfermedad con
leptospirosis. El suero de 4 pacientes con leptospirosis (líneas
continuas) y 4 individuos sanos (líneas discontinuas), a diluciones
de 1:50, 1:100 y 1:200, se incubaron con RBigL3 (25 - 200
ng/pocillo). Los anticuerpos específicos de cadena mu y gamma
conjugados a peroxidasa de rábano picante se usaron para determinar
la seroactividad de IgM e IgG, respectivamente. Los valores de
absorbancia media (DO 450 nm) y desviaciones estándar se representan
en los gráficos.
La Fig. 7 muestra la reactividad de rBigL3 IgM
(Columna A) y IgG (Columna B) de sueros de 29 pacientes individuales
de leptospirosis durante la fase aguda (calles 2) y de
convalecencia (calles 3) de enfermedad y 28 individuos sanos
(calles 1). El suero (diluciones 1:50) y Mu y anticuerpos
específicos de la cadena gamma conjugados a peroxidasa de rábano
picante se usaron para determinar la reactividad. La barras en
negro representan valores de absorbancia media (DO 450 nm).
La Fig. 8 muestra la reactividad de
inmunotransferencia de pacientes individuales con bleptospirosis a
rBigL3 durante la fase aguda (calles 6 - 9) y de convalecencia
(calles 10 - 13) de la enfermedad. El análisis de transferencia de
Western se realizó con rBigL3 purificado (1 mcg por calle, calles
3). Las membranas se sondaron 1:100. Se usaron anticuerpos
específicos de cadena gamma conjugados a fosfatasa alcalina para
determinar la reactividad a la proteína de 58 kD recombinante de la
región 1 de BigL3 (segundo a sexto dominios de repetición Big). La
reactividad a rLipL32 (1 mcg por calle) se realizó como comparación.
La movilidad de rBigL32 y rLipL32 purificados (calle 14) y
patrones de peso molecular (calle 15) se muestran después de la
tinción con Ponceau-S y azul coomassie,
respectivamente.
La Fig. 9 muestra la reactividad de
inmunotransferencia de antisueros de rata rat
anti-rBigL3 a rBigL3 y antígeno nativo de lisados
de L. interrogans. Las inmunotransferencias se prepararon
con rBigL3 purificado (1 mg/calle; calles 3, 5, 7, 9) y
preparaciones de antígeno entero (10^{8} leptospira por calle;
calles 2, 4, 6 y 8) de leptospiras cultivadas. Las membranas se
sondaron son suero combinado (diluciones 1:500 [calles 4 y 5],
1:100 [calles 6 y 7] y 1:2500 [calles [8 y 9]] de ratas inmunizadas
con rBigL3 de E. coli que expresa un fragmento de ADN
clonado de bigL3 de L. interrogans. Se obtuvo suero
preinmune antes de la primera inmunización y se usó en el análisis
de inmunotransferencia como control (calles 2 y 3). La movilidad
(kDa) de patrones de peso molecular s muestran en el lado izquierdo
de la figura.
La Fig. 10 muestra la reactividad de
inmunotransferencia de antisuero de conejo
anti-rBigL3 a antígeno nativo de lisados de cepas
de Leptospira. Las inmunotransferencias se prepararon con
preparaciones de antígeno entero (10^{8} leptospira por calle) de
las siguientes cepas de cultivo: calle 1, L interrogans sv
pomona (tipo kennewicki) cepa RM211, pasaje bajo; calle 2, L.
interrogans sv canicola cepa CDC Nic 1808, pasaje bajo; calle
3, L. interrogans sv pomona cepa PO-01,
pasaje alto; calle 4, L. interrogans sv bratislava cepa
AS-05, pasaje alto; calle 5, L. kirschneri sv
grippotyphosa cepa RM52, pasaje bajo; calle 6, L. kirschneri
sv grippotyphosa cepa P8827-2, pasaje bajo; calle 7,
L. kirschneri sv grippotyphosa cepa 86-89,
pasaje bajo; calle 8, L. kirschneri sv grippotyphosa cepa
Moskva V, pasaje alto; calle 9, L. kirschneri sv mozdok cepa
5621, pasaje alto; calle 10, L. kirschneri sv grippotyphosa
cepa RM52, pasaje alto. Se sondaron las membranas con suero de
conejos inmunizados con rBigL3 recombinante de E. coli que
expresa un fragmento de ADN clonado de bigL3 de L.
kircshneri y, como medida de control, suero de conejos
inmunizados con proteína GroEL de L. kirschneri
recombinante. Las posiciones de antígenos nativos que corresponden a
BigL3 y GroEL y la movilidad de los patrones de peso molecular
(kDa) se muestran en los lados izquierdos y derecho,
respectivamente, de la figura.
Por conveniencia, el significado de ciertos
términos y frases empleados en la memoria descriptiva, ejemplos, y
reivindicaciones anexas se proporcionan a continuación. Salvo que se
defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos
usados en el presente documento tienen el mismo significado que
comúnmente se entiende por los expertos en la técnica a la que esta
invención pertenece.
BgL - son polipéptidos de Leptospira sp.
que tienen secuencias de repetición en tándem cada una de las
cuales son similares, de acuerdo con la homología de sus secuencia,
a los dominios de tipo inmunoglobulina bacteriológicos (Big). Los
dominios Big están presentes en las proteínas bacterianas,
expresadas en patógenos bacterianos tales como E. coli,
Yersinia y Bordetella, que tienen funciones de virulencia
tales como adhesión a célula huésped.
Secuencia de referencia - es una nueva secuencia
obtenida mediante aislamiento a partir de un organismo natural o a
través ingeniería genética y presenta una función biológica precisa,
que es característica de la presente invención.
Secuencias funcionalmente equivalentes - son las
secuencias, relacionadas con una secuencia de referencia, que son
el resultado de variabilidad, es decir, toda modificación,
espontánea o inducida, en una secuencia, que es sustitución y/o
supresión y/o inserción de nucleótidos o aminoácidos, y/o extensión
y/o acortamiento de la secuencia en uno de sus extremos, sin dar
como resultado la modificación de la función característica de la
secuencia de referencia. Las secuencias funcionalmente equivalentes
abarcan fragmento y sus análogos. En otras palabras, secuencias
funcionalmente equivalentes son secuencias que son
"sustancialmente la misma" o "sustancialmente idéntica" a
la secuencia de referencia, tales como polipéptidos o ácidos
nucleicos que tienen al menos un 80% de homología en relación con
la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de referencia. La
homología usualmente se mide por un sistema de software que realiza
el análisis de secuencia (paquete de Software de Análisis de
secuencia del Grupo de Ordenadores de Genética, Universidad de
Wisconsin Centro de Biotecnología, 1710, University Avenue,
Madison, Wis, 53705).
Como se ha mencionado anteriormente, los
antígenos de Leptospira expresados durante la infección del
huésped son importantes en la identificación de dianas para ensayos
de diagnosis y vacunas. La proteína LipL32 es una de estas dianas
y se identificó con antígeno inmunodominante por la respuesta
humoral inmune durante la infección natural. Sin embargo la
sensibilidad de ensayos serológicos basados en la detección de
anticuerpos contra LipL32 en suero de paciente durante la
enfermedad en fase aguda con detección de leptospirosis está
limitada (véase Flannery, B: "Evaluation of recombinant Leptospira
antigen-based Enzyme-linked
Immunosorbent Assays for the serodiagnosis of Leptospirosis" J.
Clin. Microbiology 2001; 39 (9): 3303 - 3310; documento
WO9942478).
La presente invención se basa en la
identificación de la familia de proteínas BigL asociadas a las
especie de bacterias de espiroquetas, que incluyen los
pertenecientes a Leptospira.
De acuerdo con la presente invención, la familia
de proteína BigL se identificó como dianas de la respuesta inmune
humoral de huésped, generada durante la infección con
Leptospira inmunogénica o inmunización con
Leptospira patógena o polipéptidos BigL. Los polipéptidos y
polinucleótidos de BigL que codifican estos polipéptidos son útiles
como en ensayo de diagnóstico para identificar la infección de
origen natural en diferentes especies incluyendo seres humanos y
reservorios de animales. El ensayo de diagnóstico basado en
aquellas proteínas presenta sensibilidad y especificidad mejorada
en relación con los ensayos de diagnóstico convencionales que se
han usado en la bibliografía publicada, la identificación de
leptospirosis en la fase inicial.
Además los polipéptidos de BigL pueden inducir
respuestas inmunes cuando se usan en una composición farmacéutica
para inmunización.
En la presente invención los tres polipéptidos
de BigL se caracterizan pos pesos moleculares de128,4 kD, 201.3 kD
y 200,4 kD, basándose en la secuencia de aminoácidos deducidos de
los polinucleótidos aislados, bigL1, bigL2 y bigL3, que
codifican estos polipéptidos. La secuencia de aminoácidos de los
polipéptidos de BigL tiene una secuencia señal y un sitio de
escisión de peptidasa de señal supuesta que conforma la lipocasilla
de espiroquetas; por lo tanto los polipéptidos de BigL son
lipoproteínas asociadas a membrana. Los polipéptidos de 128,4 kD,
201,3 kD y 200,4 kD se denominan "BigL1" "BigL2" y
"BigL3", respectivamente..
Aunque los polipéptidos de BigL de la presente
invención se han aislado de manera original de Leptospira
sp, son útiles no solamente para inducción de la respuesta
inmune contra los organismos patógenos Leptospira sp., sino
también contra otras bacterias de espiroquetas y patógenos que
tienen factores con dominios Big. De manera adicional, los
polipéptidos de BigL se pueden usar para la diagnosis de de
infecciones debidas Leptospira sp., otras espiroquetas
patógenas y patógenos bacterianos.
Se pueden usar varios procedimientos que
incorporan metodologías establecidas en la técnica para obtener
secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos de
BigL. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el
aislamiento de ADN que usa hibridación de genotecas genómicas con
sondas para detectar secuencias homólogas de nucleótidos; selección
de anticuerpos de genotecas de expresión, para detectar fragmentos
de ADN clonado con aspectos estructurales compartidos; la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) en ADN genómico que usa
iniciadores capaces de recombinar secuencia de ADN de interés; y las
investigaciones basadas en ordenador de bases de datos de
secuencias para las secuencias similares a las de los
polinucleótidos de bigL.
En la presente invención, la identificación de
los antígenos de Leptospira durante el cultivo (in
vitro) y durante la infección de huésped (in vivo). La
expresión diferencial de antígenos de Leptospira se presume
que es importante en la adaptación de huéspedes durante la
infección. Los inventores usaron una estrategia para identificar
antígenos inmunorreactivos y por lo tanto expresados durante la
infección del huésped. Suero de pacientes infectados con
Leptospira patógena se usaron para seleccionar secuencias de
polinucleótidos de una genoteca de ADN del genoma de
Leptospira a partir de la genoteca de ADN de en el fago
lambda que codifica polipéptidos inmunorreactivos.
La presente invención identificaba y aislaba
tres polinucleótidos con secuencias de nucleótidos que corresponde
a las SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3 y SEQ ID No: 5, así como las
secuencias de aminoácidos de los polipéptidos respectivos, BigL1,
BigL2 y BigL3, codificadas por tales nucleótidos.
Etapa
1
La selección de los clones positivos constaban
básicamente de las siguientes etapas:
(a) El ADN de una Leptospira patógena se
cortó con una enzima apropiada y se ligó en un sitio específico en
el genoma del fago lambda. Se infectaron bacterias del huésped con
fago y los clones resultantes que expresan polipéptidos
recombinantes después de la inducción con IPTG, se sometieron a
protocolo inmunológico donde una membrana de lisados de colonia se
incubó con suero de pacientes con leptospirosis confirmada en el
laboratorio y después con un anticuerpo secundario conjugado a
peroxidasa de rábano picante, que reconocía Ig humana. Los clones
positivos se suprimieron mediante una reacción de indicador, para
complejos antígeno anticuerpo basándose en la producción de
color.
(b) La secuencia de polinucleótidos clonados y
aislados se determinó usando secuencias específicas del vector de
fago como iniciadores de la reacción de secuenciación. El análisis
de las secuencias de clon y el uso de una estrategia de
secuenciación anterior identificó la secuencia de nucleótidos
completa para los genes que codifican BigL1, BigL2, y BigL3.
(c) La mayoría de los clones positivos obtenidos
contiene genes que codifican proteínas de Hsp58 y DnaK de choque
térmico y la proteína de la membrana externa LipL41. Sin embargo, se
encontraron clones que contienen genes que codifican repeticiones
en tándem de 90 aminoácidos comparado con la Base de datos de la
familia de proteínas (Pfam) como proteínas de bacterias, tipo
inmunoglobulina (Big). Con el análisis de las secuencias del clon,
se identificaron 3 genes que contenían 12 repeticiones en tándem
para bigL1 y 13 repeticiones en tándem en bigL2 y bigL3.
Etapa
2
- Diseño de dos oligonucleótidos con base en
secuencias de dos proteínas BigL
- Amplificación mediante PCR de la porción
inicial de BigL que codifica parte de la región repetitiva, a partir
de aquellos oligonucleótidos
- Secuenciación del producto de la
amplificación
- Subclonación de la región que codifica el
producto secuenciado
- Expresión de la proteína recombinante.
- Purificación de la proteína recombinante.
Los análisis de inmunotransferencia demuestran
que el suero de paciente con leptospirosis y reservorios de
roedores infectados con Leptospira patógena producen
anticuerpos principalmente para las repeticiones del dominio BigL
fe los polipéptidos de BigL, que indica que son las principales
regiones antigénicas reconocidas durante la infección.
En relación con los polipéptidos de la presente
invención constan de secuencias de ADN, ADNc o ARN (y secuencias de
ácidos nucleicos que son complementarios), así como su secuencia
funcionalmente equivalente, es decir, las secuencias que codifican
el total o parte, de los polipéptidos denominados BigL1, BigL2 y
BigL3, pero que no son idénticos debido a la variabilidad.
Los polipéptidos y polinucleótidos en la
presente invención constan de BigL1, BigL2 y BigL3 y los
polinucleótidos que codifican estos polipéptidos; sin embargo
incluyen, además, polipéptidos y polinucleótidos que tienen
secuencia funcionalmente equivalente.
En la presente invención, ambos polinucleótidos
y polipéptidos pueden ser de origen natural, sintético o
recombinante, teniendo el grado de pureza necesario para conceder
sus actividades biológicas.
La presente invención también se refiere a los
polinucleótidos que codifican BigL1, BigL2 y BigL3 que se usan en
las reacciones de PCR para obtener fragmentos de ADN completos o
parcialmente amplificados de los polinucleótidos bigL, para el
propósito de detección de Leptospira en muestras o expresión de
polipéptidos de BigL recombinantes. En el caso de usar iniciadores
para las la amplificación de polinucleótidos en la presente
invención, son oligonucleótidos hechos de dos o más
desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, naturales o
sintéticos.
Cada iniciador está preferiblemente construido
con el fin de ser sustancialmente similar a la región flanqueante
de la hebra de al secuencia que es la diana para la amplificación.
En este sentido, se puede diseñar un iniciador funcionalmente
equivalente si los polímeros correspondientes pueden producir el
mismo procedimiento, sin ser idénticos, haciendo frente a la
utilización o aplicación considerada.
Las secuencias de polinucleótidos de esta
invención también se pueden insertar en un vector de expresión, tal
como un plásmido, virus u otro vehículo usado para la clonación
recombinante, que se usa mediante la inserción o incorporación de
las secuencias de nucleótidos enteras o parciales que codifican
BigL1, BigL2 y BigL3 o sus secuencias funcionalmente equivalentes.
Tales vectores d expresión contienen una secuencia promotora que
facilita la transcripción eficaz de la secuencia genética en el
huésped en el que se inserta el vector. Tales huéspedes pueden
incluir procarióticos y eucarióticos, incluyendo microorganismos
tales como levaduras o insectos y mamíferos. Tales procedimientos
para el uso de construcción de los vectores de expresión y para la
expresión de secuencias recombinantes, llamadas así propiamente,
son bien conocidos por los expertos en la técnica.
La presente invención proporciona un
procedimiento para producir anticuerpos que se unen a polipéptidos
completos o parciales de BigL1, BigL2 y BigL3 o sus secuencias
funcionalmente equivalentes. Tales anticuerpos son útiles como
herramientas de investigación y diagnóstico en el estudio y
diagnosis de infecciones de espiroquetas en general, y más
específicamente en el desarrollo de diagnosis y terapia o bien en el
tratamiento o prevención, para leptospirosis. Tales anticuerpos se
pueden administrar solos o como parte de una composición
farmacéutica que usa estos anticuerpos y un vehículo
farmacéuticamente aceptable como parte de la terapia contra las
espiro-
quetas.
quetas.
La invención se refiere al uso de composiciones
farmacéuticas de polipéptidos o los polinucleótidos BigL que
codifican estos polipéptidos como vacunas, o bien como una vacuna
para al prevención de enfermedad que induce una respuesta
inmunoprotectora a la infección o colonización con espiroquetas
patógenas o como vacuna terapéutica que proporciona un impacto
beneficioso en la reducción de la duración o gravedad del curso
clínico de la enfermedad en un sujeto infectado directamente con
una espiroqueta patógena o en la reducción del espato de reservorio
de un vehículo de espiroqueta patógena tales como cerdos, vacas,
ratas o perros que guardan y excretan espiroquetas patógenas
durante períodos prolongados de tiempo. Tales composiciones se
pueden preparar con una cantidad inmunogénicamente eficaz de un
anticuerpo contra BigL1, BigL2 y BigL3 respectivamente, o con uno o
más de BigL1, BigL2 y BigL3 aislados aislados a partir de
polipéptidos de BigL recombinantes, o sus secuencias funcionalmente
equivalentes, en excipientes y aditivos o auxiliares..
Otra realización de la presente invención se
refiere a la composición farmacéutica usada para inducir una
respuesta inmune a espiroqueta alucinógena en un individuo,
particularmente Leptospira sp., que incluye una cantidad
inmunológicamente ficaz de BigL1, BigL2 y BigL3 o su secuencia
funcionalmente equivalente en un vehículo farmacéuticamente eficaz.
Como "individuo" los inventores se refieren a cualquier
mamífero, incluyendo seres humanos, roedores, animales domésticos y
de laboratorio y ganado. Como "cantidad inmunológicamente
eficaz" los inventores se refieren a la cantidad de antígeno de
polipéptido de BigL necesario para inducir, en un individuo, una
respuesta inmunógena contra Leptospira o cualquiera de otro
patógeno de espiroqueta o bacteriano. La invención además
proporciona un kit para:
1 - detectar uno de los polipéptidos
polipéptidos, BigL1, BigL2 y BigL3, o sus secuencias funcionalmente
equivalentes;
2 - detectar ácido nucleico que codifica BigL1,
BigL2 y BigL3 o sus secuencias funcionalmente equivalentes;
3 - detectar anticuerpos para tales
polipéptidos, BigL1, BigL2 y BigL3, o sus secuencias funcionalmente
equivalentes.
El kit usado para la detección de polipéptidos
de BigL incluye los que usan un vehículo que contiene uno o más
receptáculos conteniendo un primer receptáculo un reactivo de unión
a BigL1, BigL2 y BigL3 o a sus secuencias funcionalmente
equivalentes.
El kit usado para la detección de
polinucleótidos que codifican los polipéptidos BigL incluye los que
usan un vehículo que contiene uno o más receptáculos conteniendo un
primer receptáculo un polinucleótido que se hibridiza a la
secuencia de ácido nucleico que codifica BigL1, BigL2 y BigL3 o a
sus secuencias funcionalmente equivalentes.
El kit útil para detector anticuerpos contra los
polipéptidos de BigL incluye los que usan un vehículo que contiene
un polipéptido de BigL1, BigL2 y BigL3 o de sus secuencias
funcionalmente equivalentes.
La presente invención se describirá ahora con
referencia a los ejemplos, que no se deben considerar como
limitantes de la presente invención.
Ejemplo
1
Ejemplo
1A
Leptospira kirschneri serovar
grippotyphosa, cepa RM52, se aisló una erupción de aborto porcino en
1983). L. interrogans serovar copenhageni, cepa Fiocruz
(L1-130), se aisló del torrente sanguíneo de un
paciente de leptospirosis. L. kirschneri serovar
grippotyphosa cepa RM52 y otras cepas de Leptospira se obtuvieron
a partir del Centro de Referencia de Leptospirosis (Centro Nacional
de Enfermedades de Animales, Servicio de Investigación Agrícola,
Departamento de Agricultura de Estados Unidos, Ames, Iowa). Las
cepas de Leptospiral se cultivaron a 30ºC en medio albúmina sérica
bovina de Johnson-Harris - Tween 80 (Bovuminar medio
microbiológico PLM-5, Intergen (2). Muestras de
bajo pasaje del aislamiento de RM52 o bien se almacenaron en
nitrógeno líquido al menos 200 veces para generar una forma de alto
pasaje en medio líquido al menos 200 veces para generar una forma
de alto pasaje. La cepa de alto pasaje fue incapaz de producir una
infección letal en hámsteres a cualquier dosis y fue solamente
capaz de infectar hámsteres a una dosis de 10^{7} mediante
inoculación por vía intraperitoneal.
Escherichia coli XL1-Blue
MRF'KmcrA) 183KmcrCB-hsdSMR-mrr) 173
endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F'proAB
lacI^{q}Z M15 Tn10 (Tetr)] (Stratagene) y E. coli
PLK-F' (endA1 gyrA96 hsdR17
lac-recA1 relA1 supE44
thi-1 [F' lacI^{q} K M15]) se usaron como cepas huésped
para la infección con los vectores \lambdaZap II (Stratagene) y
\lambdaTriplEx (Clontech), respectivamente. E. coli SOLR
(e14^{-} [mcrA],
[mcrCB-hsdSMR-mrr] 171 sbcC recB
recJ umuC:: Tn 5[Kan^{r}] uvrC lac gyrA96
relA1 thi-1 endA1 \lambda^{r}, [F'
proAB lacIq Z M15], Su- [no supersor]] y E. coli
BM25.8 (supE44 thi lacproAB [F' traD36
proAB^{+} lacIqZ M15] \lambdaimm434
(kan^{r}) P1(cam^{r}) hsdR(r^{K12}
-m^{K12})) se usaron para la escisión in vivo de los
fagémidos pBluescript y pTriplEx, respectivamente.
BLR(DE3)pLysS [F-ompT hsdS_{B}
(r_{B}-m_{B}-) gal dcm
(srl-recA) 306:: Tn 10(TcR)
(DE3) pLysS(CmR)] (Novagen) se usó como la cepa huésped para
el vector de expresión pRSET (Invitrogen).
Las cepas de E. coli se desarrollaron en
LB complementado con 100 \mug/ml de ampicilina, 100 \mug/ml de
carbenicilina, o 25 \mug/ml de cloranfenicol donde fuera
apropiado. Los antibióticos se compraron de Sigma.
Ejemplo
1B
Este ejemplo ilustra la identificación y
aislamiento de los genes bigL. Se preparó ADN genómico a
partir de bajo pasaje de L. kirschneri, serovar
grippotyphosa, cepa RM52 mediante el procedimiento de Yelton y
Charon (15). El ADN genómico se preparó a partir de un aislamiento
clínico de L. interrogans, serovar copenhageni, cepa Fiocruz
L1-130, usando un kit para el y genómico (Qiagen).
Se usó el kit de Purificación de la PCR QIAquick (Qiagen) para
obtener el y purificado. El ADN genómico se digirió parcialmente con
Tsp509I y se ligó a brazos de \lambdaTriplEx siguiendo las
instrucciones proporcionadas (Clontech). Se usó el el Extracto de
Empaquetamiento Gigapack III Gold (Stratagene) para empaquetar ADN
genómico ligado, digerido en las cabezas de lambda. El título del
fago de la genoteca se determinó mediante infección de E.
coli XL1-Blue.
Para la selección de genoteca genómica, se
sembraron aproximadamente 10^{3} unidades formadoras de colonias
(u f c) sobre una monocapa de E. coli
XL1-Blue, se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa (Schleicher & Schuell), se sensibilizaron con
IPTG y se procesaron como se recomienda (Schleicher & Schuell).
El filtro de nitrocelulosa se bloqueó con leche desnatada al 5% en
solución salina tamponada con Tris 5% (pH 7,8) con Tween 20 al
0,05% (TBST) o solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) con
Tween 20 al 0,05% (PBST), y se incubaron durante 1 hora con suero
combinado, se diluyó 1:50, de pacientes de leptospirosis confirmados
en laboratorio. Los sueros se recogieron de pacientes, se
identificaron en epidemia urbana en Brasil entre 1996 y 1999,
durante la fase de convalecencia de la enfermedad, y se absorbieron
previamente con lisados de cepas de E. coli antes de usar
para eliminar los anticuerpos de E. coli. Las membranas se
lavaron tres veces con TBST o PBST, y se incubaron durante más de 1
hora con anticuerpo de antiinmunoglobulina
anti-humano de conejo o ratón conjugado con
fosfatasa alcalina (Sigma) en la dilución de 1:1000. La detección
con NBT (0,3 mg/ml) y BCIP (0,15 mg/ml) o desarrollo con los
Reactivos de Detección de Transferencia de (Amersham) seguido de
exposición a Hyperfilm (Amersham) se usó para identificar placas con
complejos antígeno - anticuerpo.
Cada placa positiva se almacenó a 4ºC en 1 ml de
SM (0,1 1 M NaCl, 8 mM MgSO_{4}, 50 mM Tris-HCl pH
7,5; 0,01% en gelatina, con 1 - 2 gotas de cloroformo. Los clones
de la placa lamda que reaccionaron con suero combinado se
sometieron a dos fases adicionales de purificación. Los fragmentos
de ADN genómico insertados en el bacteriófago lambda se escindieron
mediante infección de cepas de E. coli SOLR o BM25.8 cepas
con los clones lambda como se ha descrito por el proveedor
(Stratagene y Clontech, respectivamente).
La secuencia de de los primeros 500 - 700
nucleótidos de la inserción se obtuvo usando un cebador específico
de vector que se une adyacente a la inserción. El análisis de
secuencia de nucleótidos de 131 clones identificó 13 que tenían
inserciones de fragmentos de ADN, se encontró que codifican
repeticiones en tándem de aproximadamente 90 aminoácidos de
longitud. Cada una de las secuencias repetidas se identificaron
posteriormente en Pfam 6.6 (http://pfam.wustl.edu/) que pertenecían
a la familia Big2 familia Big2 de dominios de tipo inmunoglobulina
bacteriano (Big).
Para identificar las secuencias que codifican
las proteínas de longitud completa de acuerdo con la secuencia de
aminoácidos predicha, las secuencias de nucleótidos de los clones se
ensamblaron a partir de secuencias individuales obtenidas mediante
una combinación de la secuenciación anterior y supresiones
jerarquizadas. Las supresiones se generaron a partir de clones de
plásmidos mediante la retirada de fragmentos de restricción que se
extienden desde el interior de la inserción en los sitios de
multiclonación que flanquean la inserción. Los oligonucleótidos se
sintetizaron y se obtuvieron a partir de GIBCO BRL u Operon. La PCR
Inversa (iPCR) se realizó para obtener las secuencias que contienen
el resto de los genes y ADN flanqueante. La UCLA Core Sequencing
Facility, la Yale/Keck Core y Sequencing Facility y la Universidad
de California en la Berkeley Sequencing Facility realizaron las
reacciones de secuenciación.
Dos clones de L. kirschneri y cuatro
clones de L. interrogans se encontraron que codifican un gen
que los inventores denominaron una Leptospiral de tipo
inmunoglobulina bacteriana, bigL1. La secuencia de nucleótidos
completa de L. kirschneri bigL1 y la secuencia de aminoácidos
predicha del producto génico se muestra en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID
NO: 2. Se encontraron seis clones de L. kirschneri que
codifican un segundo gen que se denominaron bigL2. La
secuencia de nucleótidos completa de L. kirschneri bigL2
se muestra en la SEQ ID NO: 3. L. kirschneri bigL2 parece
ser un pseudogen, un resto adenina extra se produce en el
nucleótido 1011 que da como resultado una mutación de desplazamiento
de fase y cadena abajo del codón de parada TAG. Sin embargo, la
selección de anticuerpos con suero de pacientes combinados era capaz
de identificar clones lamda con fragmentos de ADN que codifican
productos génicos de bigL2, presumiblemente ya que los fragmentos
clonados no tenían la mutación de desplazamiento de fase y se
insertaron en una orientación que permitía la expresión de un
producto que se reconoció por sueros de pacientes. La secuencia de
aminoácidos predicha del producto génico de L. kirschneri
bigL2, sin la mutación de desplazamiento de fase, se muestra en
la SEQ ID NO: 4. Un quinto clon de L. interrogans se encontró
que codifica varias repeticiones de Big inicialmente aunque
pertenecían a BigL1. Sin embargo, el ADN cadena arriba que codifica
este quinto clon de L. interrogans se encontró que difieren
de la secuencia cadena arriba de bigL1 (Fig. 2). La secuencia de
nucleótidos completa para bigL3 se obtuvo a partir de ADN de
L. kirschneri ADN y se muestra en la SED ID NO: 5. La
secuencia de aminoácidos predicha del producto génico L.
kirschneri bigL3 se muestra en la SEQ ID NO: 6.
Los tres genes de bigL que codifican un péptido
de señal y sitio de escisión de peptidasa de señal supuesta
conforman de manera amplia la lipocasilla de espiroqueta, como se ha
definido previamente (Haake, D. A. 2000. Spirochetal lipoproteins y
pathogenesis. Microbiology. 146:1491 - 1504). La comparación de las
secuencias de lipoproteínas de espiroquetas conocidas indica que la
lipocasilla de espiroqueta está mucho más definida de manera
holgada que la lipocasilla de E. coli. Por ejemplo, mientras
la mayoría de lipoproteínas de E. coli tienen Leu en la
posición 3 con relación a Cys, lipoproteínas de de espiroquetas
también pueden tener un número de otros aminoácidos hidrófobos en
esta posición, incluyendo Val, Phe, e Ile. Los experimentos de
E. coli que implican mutagénesis específica del sitio de
aminoácidos después de cisteína indica que los restos ácidos
provocan separación de lipoproteínas de la membrana citoplasmática.
Los análisis de secuencia de lipoproteínas indican que una señal de
separación similar está presente en estas bacterias. Por ejemplo,
LipL31 es la única lipoproteína que tiene una carga negativa no
opuesta en los primeros dos aminoácidos después de cisteína, y
también es la única lipoproteína separada de manera exclusiva a la
membrana citoplásmica. Como las lipoproteínas de la membrana
externa LipL32 y LipL41, las proteínas de BigL tienen aminoácidos no
cargados en las posiciones +2 y +3, que indican que estarían
separados de la membrana exterior.
Después de los péptidos de señal, las tres
proteínas contendrían una serie de repeticiones en tándem, de
aproximadamente 90 aminoácidos de longitud. La proteína madura de
BigL1 consiste en la mayoría enteramente de trece repeticiones, por
el contrario BigL2 y BigL3 contiene doce repeticiones seguidas de
dominios carboxi terminal grandes. Aunque existe un alto grado de
variación de secuencias entre las 31 repeticiones únicas
encontradas en las tres proteínas, todas las repeticiones se
identificaron por la base de datos Pfam como una familia de la
proteína Big de tipo inmunoglobulina bacteriana con valores de E tan
bajas como 4 x e^{-30}.
Las versiones de L. kirschneri de bigL1,
bigL2, y bigL3 estaban relacionadas en gran medida, con >90% de
identidad de secuencias de ADN y de aminoácidos. En ambas especies
existe una región de identidad de secuencias de aminoácidos. En
ambas especies existe una identidad de secuencia de ADN que implica
los extremos 5' de bigL1 y big L3 (Fig 2). La región de identidad
de secuencia se extiende desde el codón de inicio ATG a la posición
de 1890 pares de base en ambos genes. La gran región de identidad de
secuencias de ADN entre bigL1 y bigL3 da como resultado una
secuencia de aminoácidos idéntica a los primeros 630 aminoácidos
(posiciones 1 - 630) de BigL1 (SEQ ID NO: 2) y BigL3 (SEQ ID NO:
6). Esta región de identidad corresponde a las primeras seis
repeticiones del dominio BigL.
Ejemplo
2
Ejemplo
2A
Este ejemplo ilustra la distribución de copias
múltiples de genes de bigL genes entre especies de
Leptospira y procedimientos para detectar ADN y ARN de bigL
en muestras.
El análisis de transferencia de Southern se
realizó para identificar copias múltiples de genes bigL en ADN
genómico de L. interrogans cepa Fiocruz L1- 130, L.
kirschneri cepa RM52, y L. biflexi cepa Patoc I. Las
enzimas de restricción y modificación de ADN se compraron en New
England Biolabs. El ADN genómico se extrajo a partir de 500 ml de
cultivos de 7-días de células de Leptospira con el
kit Blood y Cell Culture (Qiagen, Valencia, Calif.).
Aproximadamente 3 mcg de ADN se digirieron con 5 - 20 unidades de
NsiI durante toda una noche en un volumen final de 50 mcl. Después
el ADN se purificó con fenol : cloroformo : isoamilo y se
precipitó con etanol frío al 100% y pH en acetato de sodio 3 M y se
lavó con etanol al 70% etanol. Después el ADN purificado se
volvió a digerir con 5 - 20 unidades PacI durante toda una noche en
un volumen final de in 25 mcl. El ADN doble digerido se separó en
un gel de azarosa al 0,8% a 20 V durante toda una noche. Después el
gel se incubó dos veces durante 30 minutos en tampón de
desnaturalización (1,5 M NaCl, 0,5 N NaOH), y dos veces durante 30
minutos en tampón de desnaturalización (1M Tris (pH 7,4) 1,5 M
NaCl). El y genómico se transfirió sobre una membrana de nylon
cargada positivamente (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis,
Ind.) de acuerdo con el procedimiento descrito por Southern.
Se sintetizaron sondas con el kit PCR Dig Probe
Synthesis kit (Roche, Manheim, Alemania). Las reacciones se
ensamblaron de acuerdo con el fabricante en un volumen final de 50
mcl. Los ciclos de temperatura para la amplificación eran 94ºC
durante 5 min, 94ºC durante 30 sec, 57ºC durante 30 min, y 72ºC
durante 1 min, con un tiempo de extensión final de 7 min después de
un total de 35 ciclos. Las secuencias de sonda eran como sigue:
para amplificar los fragmentos de ADN de bigL que codifica
los dominios repetitivos de BigL3 se seleccionó una secuencia de
ADN bigL que corresponde a la región que codifica los
dominios repetitivos 4 - 6 de BigL3, BigL3 395
gat-ttt-aaa-gtt-aca-caa-gc
y BigL3 573
aaa-ccg-gac-tac-tta-cct-ttc-;
y para amplificar los fragmentos de ADN bigL que son específicos
para cada unjo de los genes bigL, se seleccionaron las
secuencias que codifican las regiones C- terminal de los productos
génicos BigL:
BigL1.2078p,
tta-cgg-cta-cag-gta-ttt-tta-cg
y BigL1.2691p
att-gga-aga-ttt-cca-
agt-aac-c, BigL2.5121p
tat-cta-cgc-tgc-aaa-tgg
y BigL2.5865p
ttg-ttg-gcg-ata-cgt-ccg,
BigL3.5071p
cat-aac-tct-cct-cat-aac-a
y BigL3.5548p
tat-gta-gag-ata-aga-tcc.
La membrana reticulada de UV se sometió a la
hibridación previa a 42ºC durante 1 hora en solución de Dig Easy
Hybridization (Roche). Antes de la hibridación, las sondas marcadas
con Dig se sometieron a ebullición durante 10 minutos y se
transfirieron rápidamente a hielo durante 5 minutos. Las sondas
desnaturalizadas mezclaron con solución de hibridación y se
incubaron durante toda una noche con la membrana a 42ºC. Después
de la hibridación, la membrana se lavó dos veces durante 5 minutos a
temperatura ambiente con 2xSSC (NaCl, citarto de sodio), 0,1% de
SDS. Después las membranas se lavaron durante 30 minutos a 42ºC con
0,1 de SSC, 0.1% de SDS. Las membranas se expusieron durante 1 - 3
minutos a película Biomax ML (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) para
la detección de productos de quimioluminiscencia.
Las Figs. 1A y B muestran el resultado de las
transferencias de Southern. Las sondas que corresponden a las
secuencias de ADN que codifican repeticiones de BiGL hibridazas a
fragmentos de ADN en L. kirschneri e interrogans
(Fig. 1A). En contraste, la hibridación no se identificó con ADN
genómico digerido de L. biflexi no patógena. Las sondas
basadas en las secuencias que codifican las regiones
C-terminal específicas para cada una de los
productos génicos de L. interrogans bigL hibridazos a un
único fragmento en ADN digerido de L. interrogans,
confirmando por lo tanto que son solamente una copia de cada uno de
los tres genes identificados bigL en el Ejemplo 1 (Figs. 1B). Estos
resultados ilustran un procedimiento de identificación de
Leptospira patógena basada en la detección de fragmentos de ADN no
encontrado en Leptospira no patógena.
Ejemplo
2B
Este ejemplo ilustra la distribución del gen
bigL en Leptospira patógena. Con el fin de detectar genes de bigL
en otras especies de Leptospira, se diseñaron cebadores
degenerados basándose en una alineación de los genes bigL de L.
kirschneri cepa RM52 y L. interrogans cepa Fiocruz
L1-130, identificadas en el Ejemplo 1. La secuencia
del cebador "cadena arriba", denominada
BigL-lup, es 5'- (GC) AAAGTTG
(TC)(AG)(TC)G(TG) CTTGGCC-3' que
corresponde a las posiciones 46 - 65 en bigL1 y bigL3 (SEQ ID NO: 1
y 5), con relación a A del códon de inicio. La secuencia del
cebador "cadena abajo", denominada BigL-2dn, es
5'-(GC) (AT) ACC (AG) TC (CT) GAAAA (AG) AT (AT)
CC-3' que corresponde a las posiciones 506 - 487 en
bigL1 y bigL3 (SEQ ID NO: 1 y 5), con relación a A del codón de
partida. Cada cebador tiene 20 nucleótidos de longitud. Estos
cebadores se diseñaron para que se hibridaran a bigL2 en las
posiciones 97 - 116 y 590 - con relación a A en el codón de partida
de bigL2' (SEQ ID NO: 3).
Las reacciones de PCR se realizaron con y
genómico purificado de capas de alto y bajo pasaje
Leptospira. en la Fig 3., fragmentos amplificados de ADN se
identificaron en ADN genómico de cepas en las cuatro especies
patógenas evaluadas. Los fragmentos tenían la movilidad por
electroforesis predicha basándose en las secuencias de bigL1/bigL3
(461 pares de bases) y bigL2 (494 pares de bases). Los fragmentos de
ADN amplificados no se identificaron en las especies no patógenas
de Leptospira evaluadas. Por lo tanto este ejemplo ilustra la
aplicación de este procedimiento de PCR para la identificación de
ADN específicamente de Leptospira patógena en muestras.
Ejemplo
2C
Este ejemplo ilustra la detección de ARN de bigL
en muestras. L. kirschneri cepa RM52 se desarrolló hasta la
fase exponencial tardía, y el ARN total se extrajo de 1 x 10^{10}
células de leptospira usando el procedimiento de precipitación con
etanol caliente y se volvieron a suspender en agua después de la
precipitación con etanol (ref). \sim2 \mug de ARN de leptospira
se digirió con 6 unidades de ADNasa I (Ambion) en 70 \mul de
tampón de ADNasa I (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM
MgCl_{2}, 1 mM CaCl_{2} en 1 x ARN secure de Ambion) durante 30
min a 37 K. Para inactivar la ADnasa I, 1.75 \mul de 25 mM EDTA
se añadió para terminar la reacción, y la se inactivó por calor
durante 5 min a 70º. La RT-PCR se realizó usando
-200 ng de ARN de leptospira y Omniscript RT como se ha descrito
(Qiagen). Se usaron los siguientes cebadores para cebar la reacción
de transcriptasa inversa:
bigL1,
5'-CGCAGAAATTTTAGAGGAACCTACAG-3'
bigL2,
5'-TTTGACTCCAAGACGCAGAGGATGAT-3'
bigL3,
5'-ATTTTCAAGATTTGTTCTCCAGATTT-3';
lipL45,
5'-ATTACTTCTTGAACATCTGCTTGAT-3'.
Las reacciones de RT se sometieron a PCR de ADN
PCR usando Taq polimerasa (Qiagen). Antes de la PCR, se añadieron
los siguientes cebadores a las reacciones:
bigL1,
5'-CTGCTACGCTTGTTGACATAGAAGTA-3'
bigL2,
5'-TAGAACCAACACGAAATGGCACAACA-3'
bigL3,
5'-ATCCGAAGTGGCATAACTCTCCTCAT-3'
lipL45,
5'-TGAAAAGAACATTACCAGCGTTGTA-3'.
Junto con los cebadores añadidos para la
transcripción inversa, se esperan los productos de PCR de 500 pares
de bases, 479 pares de bases, 440 pares de bases, y 438 pares de
bases. Para realizar la PCR, las mezclas de reacción se colocaron
en un termociclador Techne Progene. A una etapa de de
desnaturalización inicial de 95º durante 1 min siguieron 30 ciclos
de desnaturalización a 95º durante 30 segundos, hibridación a 53º
durante 30 segundos, y extensión a 72º durante 30 segundos. Se
realizó después una incubación final de 72º durante 30
segundos.
Los resultados de la Fig. 4 muestran que el
procedimiento RT-PCR puede detectar transcripciones
de BigL3 y las transcripciones de control LipL46 BigL1 y BigL2 no
se identificaron indicando que mientras BigL3 se expresa en
Leptospira, BigL1 y BigL2 pueden no estar. Además, los resultados
demuestran la aplicación del procedimiento de RT-PCR
para identificar las transcripciones del gen BigL en muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Este ejemplo ilustra el uso de las secuencias de
ADN de bigL que expresan y purifican polipéptidos de BigL
recombinantes. Dos pares de oligonucleótidos se diseñaron para uso
en la expresión de dos regiones de L. interrogans BigL3.
La primera región era una región dentro de BigL3
correspondiente al Segundo y sexton dominios repetitivos y que
corresponden a las posiciones 131 - 649 de la SEQ ID NO: 6 en la
secuencia de L. kirschneri BigL3DNA. Se diseñaron
oligonucleótidos basándose en la secuencia de los clones de L.
interrogans BigL3 lambda identificados en el ejemplo 1 y sus
secuencias son:
45B-1
5'-ATGGGACTCGAGATTACCGTTACACCAGCCATT-3'
45B-2
5'-ATTCCATGGTTATCCTGGAGTGAGTGTATTTGT-3'
Se realizó la amplificación de PCR con
oligonucleótidos 45B-1 y 45B-2 y ADN
genómico de L. interrogans para obtener fragmentos de ADN.
Estos fragmentos se digirieron con las enzimas XhoI y NcoI (New
Biolabs) y después religaron en el vector de expresión pRSETA
(Invitrogen) (16). El producto clonado se secuenció usando
cebadores de vectores específicos y secuenciación anterior y la
secuencia de los productos de 1557 pares de bases se muestra en la
SEQ ID NO: 7. La secuencia predicha del polipéptido de 519
aminoácidos, designada región 1 de BigL3 1, se muestra en la SEQ
ID NO: 8.
Se seleccionó una segunda región para la
expresión que contenía los 200 aminoácidos finales de la región
C-terminal de L. interrogans BigL3. Esta
región corresponde a las posiciones de 1687 - 1886 de la SEQ ID NO:
6 en L. kirschneri BigL3. Los oligonucleótidos usados para
clonar esta región son:
BIGLCTERM1 5'
aac-ctc-gag-cat-aac-tct-cct-cat-aac
3'
BIGLCTERM2 5'
ttc-gaa-ttc-tta-ttg-att-ctg-ttg-tct-g
3'
La amplificación de PCR con los oligonucleótidos
BIGLCTERM1 y BIGLCTERM2 y ADN genómico de L. interrogans se
realizó para obtener fragmentos de ADN. Estos fragmentos se
digirieron con las enzimas XhoI y EcoRI (New Biolabs) y después se
ligaron en el vector de expresión pRSETA (Invitrogen) (16). Se
secuenció el producto clonado usando cebadores específicos de
vector y secuenciación anterior y la secuencia de nucleótidos del
producto de 600 pares de bases se muestra en la SEQ ID NO: 9. La
secuencia predicha del polipéptido de 200 aminoácidos, designada
región 2 de BigL3, se muestra en la SEQ ID NO: 10.
Las proteínas recombinantes, regiones 1 y 2 de
rBigL, se expresaron en BL21(DE3) pLysogen (Invitrogen).
Isopropyl-\beta-D-tiogalactopiranósidoe
(IPTG; 2 mM de concentración final, Life Technologies) se añadió a
los cultivos en fase logarítmica de E. coli BLR (DE3) pLysS
(Novagen) transformados con plásmidos pRSET que codifican
fragmentos de ADN de leptospira para expresión de las proteínas de
fusión His6-fusion. Se usó clorhidrato de guanidina
6 M para solubilizar los sedimentos de los cultivos y la proteínas
de fusión His6- se purificaron mediante cromatografía de afinidad
con Ni2+- ácido nitritotriacético-agarosa (Qiagen y
Pharmacia). La pureza de las proteínas de fusión eluidas de His6 se
ensamblaron electroforesis y tinción con azul brillante Coomassie.
Las proteínas se dializaron contra PBS, glycerol al 10% (v/v),
azida de sodio al 0,025% (p/v). Después de la diálisis, la
concentración de proteína se determinó con ácido bicinocrínico
(42). Se muestra una región d membrana de nitrocelulosa teñida con
Ponceau-S (Sigma Chem Co)-después de
la transferencia de la región 1 de BigL3 purificada 1 se muestra
en la Fig 7. La movilidad relativa de la BigL3 purificada era
similar al peso molecular de estimado de aproximadamente 58 kD, que
se calculó basándose en la secuencia de aminoácidos predicha de la
proteína recombinante.
Ejemplo
4
Ejemplo
4A
Este ejemplo ilustra entre otros dos
procedimientos que utilizan los polipéptidos de BigL para detectar
anticuerpos en las muestras sujeto. Además, este ejemplo
proporciona procedimientos para un kit de serodiagnóstico para
detectar la infección en sujetos sospechosos de infección de
alojamiento.
El polipéptido de la región 2 de BigL3
recombinante (lmcg/calle) (Ejemplo 3) se sometió a electroforesis en
gel al 12% (SDS-PAGE) usando un sistema de tampón
discontinuo y se transfirió a membranas de nitrocelulosa
(Osmomics), como se ha descrito previamente (17). El filtro de
nitrocelulosa se bloqueó con TBST con leche desnatada al 5%, se
incubó durante más de 1 hora con suero combinado de pacientes con
leptospirosis confirmada por laboratorio, reservorios de rata
capturada (Rattus norvegicus) de Leptosprira que tenían cultivos de
orina y riñón positivos para Leptospira patógena, y ratas y
conejos experimentales de laboratorio, inmunizados con lisados
enteros de L. interrogans serovar copenhageni cepa Fiocruz
L1-130. Como experimentos de control, las
incubaciones se realizaron con suero de individuos sanos de Brasil,
ratas capturadas que no tenían ningún cultivo o evidencia
sexológica para una infección de Leptospira y ratas y conejos de
laboratorio antes de la inmunización. Los sueros se diluyeron
1:100 antes de uso. Después de lavar, se incubaron las membranas
con anticuerpo de cadena gamma anti-humano de cabra
conjugado a la fosfatasa alcalina (Sigma), diluido 1:1000, durante
más de 1 hora. Los complejos antígeno-anticuerpo se
detectaron mediante reacción de color mediante NBT (0,3 mg/ml) y
BCIP (0,15 mg/ml). Los sueros combinados de pacientes con
leptospirosis, ratas capturadas que estaban infectadas en gran
medida con leptospiras patógena reconocieron la proteína de la
región 1 de BigL 3 recombinante purificada. Sin embargo, las ratas
inmunizadas con lisados de Leptospira enteros no se unieron de
manera visible al polipéptido BigL3, que indica que BigL3 se
expresa en leptospiras cultivadas (Ejemplo 2, Fig. 4), puede
existir expresión diferencial del gen bigL3. Pueden no estar
presentes cantidades suficientes de proteína BigL3 nativa in
vitro mientras, durante la infección natural, las leptospiras
in vivo producen cantidades suficientes de BigL3 para
inducir una fuerte respuesta inmune. Además, este ejemplo ilustra
que un espectro de animal produce una respuesta inmune a BigL3
durante la infección y detección de esta respuesta inmune, y
supresión de anticuerpos al polipéptido BigL3 se puede usar como un
procedimiento para identificar la infección en sujetos.
Para ilustrar adicionalmente el uso de un
procedimiento de detección de anticuerpos contra el polipéptido
BigL3 recombinante, se realizó una evolución de inmunotransferencia
con suero individual de pacientes con leptospirosis confirmada en
laboratorio, individuos sanos de Brasil y los Estados Unidos y
pacientes hospitalizados o evaluados en clínicas de ambulatorio
con diagnosis diferente de leptospirosis. El ensayo de
microaglutiación y aislamiento de cultivo se usó para confirmar la
diagnosis de leptospirosis en pacientes con enfermedad sospechosa
de manera clínica (5). La recogida de suero de pacientes con
leptospirosis duró una vigilancia de cinco años para leptospirosis
en la ciudad de Salvador, Brasil. La recogida de suero de
individuos control se obtuvo a partir de bancos de suero
preexistente de pacientes hospitalizados y clínicos e individuos
sanos de Salvador, Brasil y mediante las, Estados Unidos. Una lista
de los sueros se muestra en la Tabla 1. Sueros diluidos 1:100 se
analizaron siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. El
hallazgo de cualquier coloración visible de la banda de 1 mcg del
polipéptido de la región 1 de BigL3 en la inmunotransferencia se
consideró como reacción positiva.
La Fig. 8 ilustra que los sueros de pacientes
individuales con leptospirosis reaccionan con BigL3 recombinante.
La Tabla 1 resume los hallazgos que demuestran que más de un 90% de
pacientes hospitalizados y aproximadamente 70% de pacientes
externos con leptospirosis reaccionan con rBigL3 durante la
infección activa. Todos (100%) de los pacientes con leptospirosis
reaccionan con rBigL3 durante la fase de convalecencia de la
enfermedad. La Tabla 2 compara la serorreactividad a rBigL3 con
ensayos de diagnósticos convencionales. La serorreactividad de
RBigL3 era mayor durante la fase inicial de enfermedad a las
observadas para los ensayos de diagnóstico convencionales. Los
individuos sanos de los Estados Unidos y el 88% de los individuos
sanos de Brasil no reaccionan con rBigL3, lo que demuestra que esta
reacción a rBigL3 es específica. La especificidad de la reacción se
incrementa hasta 100% cuando se calcula basándose en la frecuencia
de serorreactividad de IgM entre individuos sanos brasileños.
Juntos, estos hallazgos ilustran que el procedimiento tiene utilidad
como un marcados sexológico de la infección activa y es la base
para un kit que se puede usar para la diagnosis con
leptospirosis.
La Tabla 1 también resume los hallazgos para
la serorreactividad de rBigL3 en regiones endémicas que tienen
alto riesgo de leptospirosis. El 25% de la población que reside en
estas regiones demuestra la seropositividad de rBigL3 IgG, lo que
indica que esta reacción puede ser un marcador útil para
identificar la infección pasada. Entre los pacientes con
leptospirosis confirmada, un 56% eran serorreactivos contra rBigL3
durante el período de dos años después de su infección con
leptospirosis (Tabla 2). En el período entre 2 y 4 años después de
la infección con leptospirosis, el 18% demostró serorreactividad de
rBigL3. Juntos, estos hallazgos ilustran que un kit basado en el
procedimiento de inmunotransferencia puede detectar una infección
pasada con leptospirosis.
Ejemplo
4B
Este ejemplo ilustra que los procedimientos
ELISA son útiles en la detección de anticuerpos a BigL y en la
identificación de de pacientes con leptospirosis entre los que son
sospechosos de infección. Placas de microvaloración de poliestireno
de fondo plano (Corning) se recubrieron a 4ºC durante toda una noche
con His_{6}-fusión rBigL3, 0,5 - 100 ng/pocillo,
se suspendieron en carbonato de sodio 0,05 M, pH 9,6 (16). Las
placas se lavaron dos veces con agua destilada y tres veces con PBS,
0,05% (v/v) Tween 20 (PBST). Las placas se incubaron con solución
de bloqueo (PBST/1% [p/v] albúmina sérica bovina) durante 2 horas a
temperatura ambiente y después de cuatro lavados con PBST, se
almacenaron a -20ºC hasta el uso. Los pocillos se incubaron con 50
\mul de suero, se diluyó 50 a 200 veces en solución de bloqueo,
durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Después de
cuatro lavados con PBST, los pocillos se incubaron con 50 \mul de
diluciones 5.000 a 20.000 veces de anticuerpos de cabra
anti-humanos de cadena \mu o \gamma- conjugados
a peroxidasa de rábano picante (Sigma) durante 1 hora a temperatura
ambiente con agitación. Después, las placas se lavaron dos veces
con PBST y tres veces con PBS y se incubaron con 50 ul/pocillo de
0,01% (p/v) 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina en tampón de sustrato
(0,03% [v/v] peróxido de hidrógeno, 25 mM de ácido cítrico, 50 mM de
Na_{2}HPO_{4}, pH 5,0) durante 20 minutos en la oscuridad a
temperatura ambiente. La reacción de color se detuvo mediante la
adición de 25 uL de 2 N H_{2}SO_{4} y se midió la absorbancia a
450 nm en un lector de microplacas Emax (Molecular Devices,
Sunnyvale, CA). Se realizaron ensayos iniciales para determinar la
concentración de antígenos (mcgg/pocillo) que discriminó mejor
entre las reacciones de ELISA de muestras de suero de casos de
leptospirosis confirmados en laboratorio (n = 4) e individuos sanos
de un área endémica para leptospirosis en Brasil (n = 4). Se
realizaron valoraciones de tablero de ajedrez con 25, 50, 100 y 200
ng. La Fig. 6 ilustra que se observaron valores de incremento de
manera significativa a todas las diluciones de suero y
concentraciones de polipéptido rBigL3 para pacientes con
leptospirosis que para individuos control.
En los ensayos posteriores para determinar la
sensibilidad y especificidad, se recubrieron las placas con 50 ng
de rBigL3. Las incubaciones se realizaron con diluciones de 50 y
10.000 veces de suero primario y anticuerpo secundario conjugados,
respectivamente. De ensayaron muestra de suero individuales por
duplicado y las medias de las dos mediciones se calcularon para
análisis. Se volvieron a ensayar mediciones apareadas que diferían
en más de un 10%. Se incluyeron una muestra de suero de control
positivo que reaccionó con todos los antígenos recombinantes y una
muestra de suero de control negativo, por duplicado, en cada placa
como medición de control de calidad. La Fig. 7 ilustra que los
pacientes de leptospirosis en la fase aguda de la enfermedad tenía
incrementos de absorbancias de manera significativa mayores que los
individuos control para la serorreactividad de IgM e IgG (Fig. 7).
Estas diferencias se incrementaron cuando recomparan los valores de
absorbancia para los pacientes en su fase de convalecencia de a
enfermedad. Estos experimentos ilustran que un procedimiento basado
en ELISA- para la detección de anticuerpos contra el polipéptido de
rBigL3 es útil para identificar la infección con leptospirosis y se
puede usar como un kit para diagnosis.
Ejemplo
5
Este ejemplo ilustra que una respuesta inmune
contra las proteínas de BigL se puede inducir mediante inmunización
con proteínas de BigL recombinantes. El polipéptido de BigL3
recombinante purificado derivado de L. interrogans se obtuvo
con el procedimiento descrito en el Ejemplo 3. Se inmunizaron ratas
de laboratorio (raza Wistar) con 40 mcgs de rBigL3 en adyuvante de
Freund (Sigma), y se inocularon de manera subcutánea. Se
realizaron inmunizaciones adicionales con 20 mcgs de rBigL3 en las
semanas 3 y 6. Se recogió sangre 7 semanas después de la
inmunización y proceso primario de suero. Las inmunotransferencias
con rBigL3 (1mcg/calle) se prepararon en el Ejemplo 4. La Fig. 9
ilustra la serorreactividad de ratas inmunizadas con rBigL3. rBigL3
era un inmunógeno eficaz para inducir la serorreactividad de rBigL3
por inmunotransferencia con valoraciones mayores que 1:2500 después
de un total de tres inmunizaciones. Además, los anticuerpos que
surgían para el polipéptido de rBigL3 reconocidos en los antígenos
nativos en lisados enteros de Leptospira (108 leptospiras
por calle) (Fig. 9). Una banda con movilidad relativa a 200 kD se
tiñe de manera débil en inmunotransferencias como bandas que se
tiñen más intensamente con una movilidad relativa, que puede
representar la degradación la degradación de las proteínas de BigL
de peso molecular de 200 kD o mayor. La serorreactividad contra
estos antígenos nativos es específica ya que no se observó ninguna
reacción en el suero preinmune.
Se realizaron experimentos inmunogénicos con
polipéptidos de BigL purificados derivados de L. kirschneri.
Las proteínas recombinantes purificadas se cargaron en un gel
preparativo al 12% de SDS-PAGE gel y se permitió
que migrara en el gel de separación mediante electroforesis. Se
escindió una banda que contenía 100 - 200 mcg de proteína
recombinante se escindió del gel, se desecó, se molió hasta polvo,
se disolvió en 1 ml de agua, se mezcló con 1 ml de adyuvante de
Freund (Sigma), y se inoculó por vía subcutánea e intramuscular en
ratones blancos de Nueva Zelanda (Harlan Sprague Dawley) que no
tenían anticuerpos de leptospira. Se administraron inmunizaciones
adicionales con cantidades similares de proteína de fusión en gel de
poliacrilamida en polvo mezclada con adyuvante de Freund (Sigma) a
las cuatro y ocho semanas después de la inmunización primaria. Se
recogió sangre de los conejos diez semanas después de la
inmunización primaria y se procesaron para suero (Harlow, 1988). Se
realizaron inmunotransferencias como se ha descrito previamente
(Guerreiro et al Infect Immun 2001) con concentraciones de
10^{8} leptospiras por calle.
La Fig 10. ilustra que la inmunización con
rBigL3 derivado de L. kirschneri induce valoraciones de
anticuerpos de alto nivel a polipéptidos nativos de BigL3 en L.
kirschneri y otras especies de Leptospira patógena tales
como L. interrogans. Juntos estos hallazgos ilustran la
inmunización con polipéptidos de rBigL induce una respuesta inmune
contra las especies de espiroquetas patógenas distintas de las
especies usadas para diseñar el polipéptido de rBigL. Además,
los anticuerpos producidos mediante este procedimiento de
inmunización se pueden usar para detectar espiroquetas patógenas en
las muestras.
Finalmente, este ejemplo demuestra que la
presencia de polipéptidos de BigL nativos se observa en cepas de
pasaje bajo virulentas y no en cepas de pasaje alto de cultivo
atenuadas sin virulencia (Fig 10). Los sueros de conejos
inmunizados con rBigL3n reconocían uno de 200 kDa que corresponde a
BigL3 en lisados enteros de Leptospira de cepas atenuadas
virulentas y no virulentas. Este ejemplo ilustra que las proteínas
de BigL son marcadores para virulencia y los anticuerpos contra las
proteínas de BigL se pueden usar como un procedimiento para
identificar las cepas virulentas. Ya que BigL puede ser un factor
de virulencia, inducción de una respuesta inmune a las proteínas de
BigL como se demuestra en el ejemplo será útil para la aplicación
como vacuna.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con lo anterior, la invención está
limitada solamente por las siguientes reivindicaciones.
\newpage
1. Levett PN. Leptospirosis. Clin
Microbiol Rev. 2001; 14 (2):296 - 326.
2. Faine SB, Adler B, Bolin
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during the humoral immune response to leptospirosis in humans.
Infect Immun. 2001; 69 (8): 4958 - 68.
1) INFORMACIÓN GENERAL
| I.a) | SOLICITANTES: FIOCRUZ y KO, Albert I.; HAAKE, David A.; REIS, Mitermayer Galv\tilde{a}o; |
| MATSUNAGA, | |
| James; CRODA, Julio Henrique Rosa; SIQUEIRA, Isadora Cristina; RILEY, Lee W.; BAROCCHI, | |
| Michele; | |
| YOUNG, Tracy Ann. |
\vskip1.000000\baselineskip
| I.b) | DIRECCIÓN: |
| Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz | |
| Fundaçao Oswaldo Cruz/MS | |
| Rua Waldemar Falc\tilde{a}o, 121 | |
| Salvador, Bahia 40295-001 | |
| Brasil |
\vskip1.000000\baselineskip
| II) | TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ``familia de proteínas con dominios de repetición de bacterias de tipo Ig |
| {}\hskip4.5cm (Big) presentes en especies de leptospira'' | |
| III) | NÚMERO DE SECUENCIAS: 10 (diez). |
| IV) | FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR: |
| IV.a) | TIPO DE MEDIO: Disquete | |
| IV.b) | ORDENADOR: IBM PC compatible | |
| IV.c) | SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS. |
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN GENERAL PARA LAS SECUENCIAS:
| I.a) | Número identificador para las secuencias: SEQ ID NO: 1 |
| II) | Características de la secuencia: |
| II.a) | LONGITUD: 3672 pares de bases | |
| II.b) | TIPO: ADN | |
| II.c) | TIPO DE HEBRA: cadena sencilla | |
| II.d) | TOPOLOGÍA: lineal |
| III) | Posición en el genoma: |
| III.a) | organismo: Leptospira kirschneri | |
| III.b) | Nombre/clave: CDS | |
| III.c) | posición en el mapa: (0) - (3672) |
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
| I.b) | Número identificador de secuencia: SEQ ID NO2 |
| II) | Características de la secuencia: |
| II.a) | LONGITUD: 1224 | |
| II.b) | TIPO: aminoácido | |
| II.c) | TOPOLOGÍA: lineal |
| III) | TIPO: péptido |
| IV) | FUENTE: parte N-terminal a C-terminal |
\newpage
| I.c) | Número identificador de la Secuencia: SEQ ID NO: 3 |
| II) | Características de la secuencia: |
| II.a) | LONGITUD: 5863 pares de bases | |
| II.b) | TIPO: ácido nucleico | |
| II.c) | TIPO DE HEBRA: cadena sencilla | |
| II.d) | TOPOLOGÍA: lineal |
| III) | Posición en el genoma: |
| III.a) | organismo: Leptospira kirschneri | |
| III.b) | Nombre/clave: CDS | |
| III.c) | posición en el mapa:(0) - (5863) |
\newpage
| I.d) | Número identificador de la secuencia: SEQ ID NO 4 |
| II) | Característica de la secuencia: |
| II.a) | LONGITUD: 1954 | |
| II.b) | TIPO: aminoácido | |
| II.c) | TOPOLOGÍA: lineal |
| III) | TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
| IV) | FUENTE: parte N-terminal a C-terminal |
\newpage
| I.e) | Número identificador de la secuencia: SEQ ID NO: 5 |
| II) | Características de la secuencia: |
| II.a) | LONGITUD: 5658 pares de bases | |
| II.b) | TIPO: ácido nucleico | |
| II.c) | TIPO DE HEBRA: cadena sencilla | |
| II.d) | TOPOLOGÍA: lineal |
| III) | Posición en el genoma: |
| III.a) | organismo: Leptospira kirschneri | |
| III.b) | Nombre/clave: CDS | |
| III.c) | Posición en el mapa: (0) - (5658) |
\vskip1.000000\baselineskip
| I.f) | Número identificador de la secuencia: SEQ ID NO: 6 |
| II) | Característica de la secuencia: |
| II.a) | LONGITUD: 1886 | |
| II.b) | TIPO: aminoácido | |
| II.c) | TOPOLOGÍA: lineal |
| III) | TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
| IV) | FUENTE: parte N-terminal a C-terminal |
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
| I.g) | Número identificador de la secuencia: SEQ ID NO: 7 |
| II) | Característica de la secuencia: |
| II.a) | LONGITUD: 1557 pares de bases | |
| II.b) | TIPO: ácido nucleico | |
| II.c) | TIPO DE HEBRA: cadena sencilla | |
| II.d) | TOPOLOGÍA: lineal |
| III) | Posición en el genoma: |
| III.a) | organismo: Leptospira interrogans | |
| III.b) | Nombre/clave: CDS | |
| III.c) | Posición en el mapa: (0) - (1557) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| I.h) | Número identificador de la secuencia: ID SEQ NO: 8 |
| II) | Característica de la secuencia: |
| II.a) | LONGITUD: 519 | |
| II.b) | TIPO: aminoácido | |
| II.c) | TOPOLOGÍA: lineal |
| III) | TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
| IV) | FUENTE: parte N-terminal a C-terminal (0) - (519) |
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
| I.i) | Número identificador de la secuencia: SEQ ID NO: 9 |
| II) | Característica de la secuencia: |
| II.a) | LONGITUD: 600 pares de bases | |
| II.b) | TIPO: ácido nucleico | |
| II.c) | TIPO DE HEBRA: cadena sencilla | |
| II.d) | TOPOLOGÍA: lineal |
| III) | Posición en el genoma: |
| III.a) | organismo: Leptospira interrogans | |
| III.b) | Nombre/clave: CDS | |
| III.c) | Posición en el mapa: (0) - (600) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| I.j) | Número identificador de la secuencia: SEQ ID NO: 10 |
| II) | Característica de la secuencia: |
| II.a) | LONGITUD: 200 | |
| II.b) | TIPO: aminoácido | |
| II.c) | TOPOLOGÍA: lineal |
| III) | TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
| IV) | FUENTE: parte N-terminal a C-terminal (0) - (200) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> FIOCRUZ
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Familia de proteínas con dominios de
repetición de bacterias de tipo Ig (Big) presentes en especies de
leptospira
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GS/MPW/P207680
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP02807433.4
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-05-20
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3672
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leptospira kirschneri
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1224
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leptospira kirschneri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5863
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leptospira kirschneri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1954
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leptospira kirschneri
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5658
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leptospira kirschneri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1886
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Leptospira kirschneri
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1557
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Leptospira kirschneri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 519
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leptospira kirschneri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leptospira kirschneri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leptospira kirschneri
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
Claims (14)
1. Un polipéptido sustancialmente purificado
que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ
ID NO:2.
2. Un segmento de polinucleótidos aislados que
tiene una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por
(a) una secuencia de polinucleótidos que
codifica una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ
ID NO: 2; y
(b) una secuencia de polinucleótidos de la SEQ
ID NO: 1.
3. Un polipéptido sustancialmente purificado que
tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID
NO:4.
4. Un polinucleótido aislado que tiene una
secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:
(a) una secuencia de polipéptidos que codifica
una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 4;
y
(b) una secuencia de polipéptidos de la SEQ ID
NO: 3.
5. Un polipéptido sustancialmente purificado que
tiene una secuencia de aminoácidos como se ha establecido en SEQ
ID NO: 6.
6. Un polinucleótido aislado que tiene una
secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:
(a) una secuencia de polinucleótidos que
codifica una secuencia de aminoácidos como se ha establecido en la
SEQ ID NO: 6; y
(b) una secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO:
5.
7. Una secuencia de polipéptidos sustancialmente
purificados seleccionados entre la SEQ ID NO: 8.
8. Un segmento de polinucleótido aislado que
tiene una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:
(a) una secuencia de polinucleótidos que
codifica una secuencia de aminoácidos como se ha establecido en la
SEQ ID NO: 8; y
(b) un polinucleótido de la SEQ ID NO 7.
9. Una secuencia de polipéptidos sustancialmente
purificados seleccionados entre SEQ ID NO: 10.
10. Un segmento de polinucleótido aislado que
tiene una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por
(a) una secuencia de polinucleótidos que
codifica una secuencia de aminoácidos como se ha establecido en la
SEQ ID NO: 10;
(b) a una secuencia de polinucleótidos de la SEQ
ID NO: 9.
11. Anticuerpos que se unen de manera especifica
al polipéptido sustancialmente purificado definid en las
reivindicaciones 1, 3, 5, 7 ó 9.
12. Un procedimiento para detectar patógenos en
una muestra que comprende poner en contacto una muestra sospechosa
de contener una espiroqueta patógena con un reactivo que se une de
manera específica al componente de células específicas de patógeno
y que detecta la unión del reactivo con el componente, en el que el
reactivo se selecciona de las SED ID números 2, 4, 6, 8 y 10.
13. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12 en el que el reactivo que se une al componente
específico de células del patógeno es un anticuerpo contra el
polipéptido o polipéptidos de BigL1, BigL2 o BigL3 de las SEQ ID
Números 2, 4, 6, 8, 10.
14. Un kit útil para la detección de
polipéptidos BigL1, BigL2, y BigL3; o anticuerpos que se unen a
polipéptidos de BigL1, BigL2, BigL3 o polipéptidos, en el que las
proteínas presentes en el kit se seleccionan entre las SEQ ID
Números 2, 4, 6, 8 ó 10 o anticuerpos que se unen de manera
específica a dichas proteínas.
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