ES2288879T3

ES2288879T3 - Genes y metodos para manipulacion del crecimiento.

Info

Publication number: ES2288879T3
Application number: ES00975621T
Authority: ES
Inventors: Gurmukh S Johal; Dilbag S Multani; Steven P Briggs
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; University of Missouri System
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; University of Missouri System
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 2000-11-10
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2020-11-10
Also published as: CA2391368C; US20020162142A1; ATE369431T1; HUP0302908A2; US7041874B2; WO2001034819A2; US7612256B2; AU1364201A; EP1228226B1; DE60035892T2; DE60035892D1; US20070079397A1; US7276584B1; HUP0302908A3; CA2391368A1; MXPA02004715A; AU783458B2; EP1228226A2; WO2001034819A3

Abstract

Una molécula aislada de ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2; (c) una secuencia de nucleótidos que consiste de al menos 30 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta; (d) una secuencia de nucleótidos que consiste de al menos 30 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3; (f) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos 58 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta; (g) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una identidad del 70% con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta; (h) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una identidad del 70% con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta; (i) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de (a)-(h), y (j) una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones estrictas hasta la secuencia de nucleótidos de (a) o (b), o hasta la secuencia complementaria de (a) o (b), en donde dichas condiciones estrictas comprenden la hibridación en una solución que contiene 50% de formamida, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en 0, 1X SSC a 60°C, ydicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta

Description

Genes y métodos para manipulación del crecimiento.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con la manipulación genética de organismos, particularmente plantas, con genes que controlan el crecimiento y el desarrollo. La invención se relaciona además con genes que controlan el crecimiento, incluidas las formas homólogas y mutantes, las proteínas codificadas a partir de allí y las plantas transformadas con esos genes.

Antecedentes de la invención

Las plantas enanas han tenido un impacto grande en la agricultura. Las variedades enanas de trigo son ampliamente utilizadas en Norte América debido tanto al reducido potencial para alojarlo como a los altos rendimientos. Los arboles frutales enanos también son muy utilizados y le permiten a los agricultores producir más frutos por acre incrementando así el rendimiento económico potencial. Existen otros beneficios que pueden ser reportados a partir del uso de cosechas de plantas enanas y de árboles frutales enanos, incluida la reducción en la cantidad de pesticidas y fertilizantes requeridos, la mayor densidad de las plantaciones y costos laborales reducidos.

En vista de las tendencias actuales tanto del incremento en la población humana como la disminución en las áreas de tierra adecuadas para la agricultura, el incremento de la productividad en la agricultura es, y continuará siendo un reto de importancia principal. El cultivo de plantas y de árboles frutales enanos ha sido y continuará siendo un componente importante de nuestro sistema productivo en la agricultura. El mayor uso de cultivos de plantas enanas y de árboles frutales enanos puede ayudar a satisfacer las demandas de producción agrícola del futuro. Sin embargo, las variedades enanas comercialmente aceptables no están disponibles para todos los cultivos.

Además del uso de plantas enanas para controlar la altura de la planta, se aplican rutinariamente químicos sintéticos para ciertas especies de plantas de importancia económica para reducir su crecimiento. Los reguladores de crecimiento de la planta conocidos como retardantes del crecimiento se utilizan para reducir el alargamiento del tallo en una variedad de cultivos incluidos algodón, vides, árboles frutales, cacahuetes, trigo y plantas ornamentales tales como azaleas, crisantemos, hortensias, poinsetias y muchas plantas de parterre. Todos los retardantes de crecimiento comúnmente utilizados son inhibidores de la biosíntesis de giberelinas y limitan el crecimiento del tallo o plantón por medio de la reducción del alargamiento. En los Estados Unidos, el retardante de crecimiento más comúnmente utilizado es el cloruro de mepiquat, que está registrado para ser usado sobre el algodón. Los beneficios atribuidos al uso del cloruro de mepiquat sobre el algodón incluyen u mayor rendimiento, una defoliación mejorada, una mejor tolerancia al estrés, una madurez más uniforme del cultivo y la posibilidad de cosechar más temprano. Previamente, se registró la daminozida como retardante del crecimiento para uso en los Estados Unidos sobre manzanas, uvas y cacahuetes bajo las marcas ALAR y KYLAR pero se lo retiró del uso sobre cultivos alimenticios debido a una preocupación sobre la salud en humanos. A pesar de las demandas de los productores agrícolas por in producto que reemplace a la daminozida, no existen retardantes del crecimiento registrados para el uso sobre vides, árboles frutales y cacahuetes en los Estados
Unidos. La daminozida, sin embargo, es aún ampliamente utilizada en ciertas especies de plantas no alimenticias.

El descubrimiento de los mecanismos moleculares que controlan los procesos del crecimiento de la planta tales como la división celular y el alargamiento celular probablemente ayudará en el desarrollo de nuevas variedades de plantas con estatura reducida y de nuevos métodos para reducir el crecimiento de la planta. Tales nuevas variedades de plantas y de métodos pueden proveer tanto a los granjeros como a los horticultores con alternativas ambientalmente benignas para el uso de químicos sintéticos para retardar el crecimiento.

El alargamiento de las células y de los órganos de la planta es uno de los parámetros más críticos del crecimiento y desarrollo de la planta. La regulación de este rasgo en las plantas, sin embargo, es un proceso bastante complicado, ya que tanto factores externos como internos influyen sobre él. El estímulo externo más importante es la luz, con su efecto normalmente represivo o negativo sobre el alargamiento celular (Quail, P.H. (1995) Science 268:675-680; Kende y colaboradores (1997) Plant Cell 9:1197-1210). El control interno del alargamiento celular es mediado por una variedad de productos químicos, normalmente denominados como reguladores del crecimiento de la planta u hormonas (Kende y colaboradores (1997) Plant Cell 9:1197-1210). Entre las hormonas clásicas de la planta, las auxinas y las giberelinas (GAs) ambas promueven el alargamiento celular mientras que las citoquininas y el ácido abscísico han mostrado cada uno tener un efecto negativo sobre el alargamiento celular (Kende y colaboradores (1997) Plant Cell 9:1197-1210). Recientemente, otra clase de reguladores del crecimiento de la planta, denominados brasinoesteroides, se ha identificado que promueven dramáticamente también el crecimiento de la planta (Yokota, T. (1997) Trends Plant Sci. 2:137-143; Azpiroz y colaboradores (1998) Plant Cell 10:219-230; Choe y colaboradores (1998) Plant Cell 10:231-243). Sin embargo, los mecanismos por medio de los cuales las hormonas de la planta actúan, ya sea solas o en forma concertada, para controlar el alargamiento celular permanecen sin aclarar.

Una forma de comprender los mecanismos que median el alargamiento celular es estudiar a los mutantes en los cuales este aspecto del crecimiento de la planta esté comprometido (Klee y colaboradores (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:529-551). Se han identificado numerosos de tales mutantes a través de casi todas las especies de plantas, incluido el maíz, en el cual más de 25 mutaciones de genes únicos que afectan la estatura de la planta han sido caracterizadas (Coe y colaboradores (1988) En: Corn & Corn Improvement, G. F. Sprague (Ed.) Madison, WI; Sheridan, W.F. (1988) Annu. Rev. Genet. 22:353-385). Se considera que estos mutantes enanos están relacionados con GA, principalmente porque GA es la única fitohormona cuyo papel en la regulación de la altura del maíz ha sido establecido en forma convincente (Phinney y colaboradores (1985) Curr. Top. Plant Biochem. Physiol. 4:67-74; Fujioka y colaboradores (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9031-9035). Ambos tipos de mutantes, sensibles a GA y no sensible a GA, han sido encontrados en este grupo de mutantes del maíz. Mientras que se han clonado genes para una cantidad de mutantes sensibles a GA y se ha encontrado que están involucrados en la biosíntesis de GA (Bensen y colaboradores (1995) Plant Cell 7:75-84; Winkler y colaboradores (1995) Plant Cell 7: 1307-1317), nada se conoce acerca de la naturaleza de los defectos en los mutantes del maíz no sensibles a GA.

Un tipo de mutantes enanos no sensible a GA que ha recibido mucha atención por parte de los genetistas del maíz y regeneradores es llamado braquítico. Estos enanos se caracterizan por internodios de longitud substancialmente reducida, con relación al tipo natural, sin tener ningún efecto sobre el tamaño o número de otros órganos, incluidas las hojas, espiga y campanilla (Kempton, J.H. (1920) J. Hered. 11: 111-115). Existen tres mutaciones braquíticas conocidas en el maíz, br1, br2 y br3, todas las cuales son recesivas (Coe y colaboradores (1988) En: Corn & Corn Improvement, G. F. Sprague (Ed.) Madison, WI; Sheridan, W.F. (1988) Annu. Rev. Genet. 22:353-385). Debido al interés comercial en br2 para el mejoramiento de la productividad de la planta (Pendleton y colaboradores (1961) Crop Sci. 1:433-435; Duvick, D.N. (1977) Maydica 22:187-196; Djisbar y colaboradores (1987) Maydica 32:107-123; Russel, W.A. (1991) Adv. Agron. 46:245-298), este enano ha sido el más caracterizado. Dependiendo del antecedente genético, las plantas homocigotas recesivas para br2 son 30-70% más cortas que sus hermanos normales. Esta reducción en la altura de la planta es debida exclusivamente a una reducción de la longitud de los internodios del pedúnculo (tallo). Además de ser enanos, los mutantes br2 crecieron bajo condiciones de invernadero sufriendo a menudo de látigo de cochero, una condición enfermiza en la cual las hojas que la desarrollan en el verticilo sufren necrosis y permanecen pegadas juntas. Esta condición resulta a menudo en la muerte de la punta en crecimiento de la planta.

Para persistir en la demanda por una mayor producción agrícola, se requieren nuevos objetivos para modificar genéticamente por medio de ingeniería genética plantas agrícolas para mejorar las características agronómicas. La elucidación de los mecanismos moleculares de la división y el alargamiento celulares proveerá nuevos objetivos para que los científicos agrícolas puedan manipular.

Resumen de la invención

Se proveen composiciones y métodos para la expresión de los genes que codifican P-glicoproteínas de la invención en plantas. Las composiciones de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que codifican P-glicoproteínas de la invención. En particular, la invención provee secuencias de nucleótidos del gen br2 del maíz. Las secuencias de la invención son útiles en la transformación de plantas para expresión preferida o constitutiva del tejido y encuentran uso en métodos para controlar el crecimiento de plantas, particularmente el crecimiento del tallo.

La invención provee:

- una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1;

(b): una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2;

(c): una secuencia de nucleótidos que consiste de al menos 30 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta;

(d): una secuencia de nucleótidos que consiste de al menos 30 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta;

(e): una secuencia de nucleótidos que codifica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3;

(f): una secuencia de nucleótidos que codifica al menos 58 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta;

(g): una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una identidad del 70% con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta;

(h): una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una identidad del 70% con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta;

(i): una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de (a)-(h), y

(j): una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones estrictas hasta la secuencia de nucleótidos de (a) o (b), o hasta la secuencia complementaria de (a) o (b),

en donde dichas condiciones estrictas comprenden la hibridación en una solución que contiene 50% de formamida, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC y un lavado en 0,1X SSC a 60ºC, y dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta; y

- un método para modificar el crecimiento de una planta, dicho método comprendiendo transformar una planta con una secuencia de nucleótidos que codifica una P-glicoproteína, en donde dichas funciones de una glicoproteína para controlar el crecimiento de una planta, dicha secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha secuencia en dicha planta; en donde dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia de la invención.

También se proveen los casetes de expresión que contienen a las secuencias de la invención. Adicionalmente se proveen plantas transformadas, tejidos de plantas, células de plantas y semillas de las mismas.

Se proveen proteínas aisladas codificadas por las secuencias de nucleótidos de la invención. Por lo tanto la invención también provee:

- una proteína aislada que contiene un miembro seleccionado del grupo que consiste de:

(a): un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3;

(b): un polipéptido que consiste de al menos 58 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3, en donde dicho polipéptido es una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta, y

(c): un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o en la SEQ ID NO: 2;

(d): un polipéptido codificado por una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una identidad del 70% con la secuencia de aminoácidos de (a), en donde dicho polipéptido es una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra esquemáticamente al clon genómico de maíz XhoI de 7,0 kb que contiene la mayor parte del gen Br2. Los sitios de las inserciones clementes de Mu se indican por los alelos br2-3, br2-6 y br2-9 así como el transposón nuevo en br2-5.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona, en particular, con el control del crecimiento del tallo en plantas. De este modo, se proveen plantas transformadas, células de plantas, tejidos y semilla de plantas que contienen ácidos nucleicos de la invención.

Las composiciones de la invención incluyen las secuencias nativas de nucleótidos para el gen que codifica para la P-glicoproteína del locus Br2 del maíz y la respectiva secuencia de aminoácidos para la P-glicoproteína codificada allí dentro, así como fragmentos y variantes de la misma. Las secuencias de Br2 se exponen en la SEQ ID NOs: 1-3. Las secuencias o las secuencias antisentido correspondientes encuentran uso en la modulación de la expresión de una P-glicoproteína en una planta o célula de una planta. Esto es, las secuencias de codificación se pueden utilizar para incrementar la expresión mientras que las secuencias antisentido se pueden utilizar para disminuir la expresión.

En una modalidad de la invención, las secuencias de nucleótidos de la invención encuentran uso en los métodos de modificación del crecimiento de la planta. Con este fin, las secuencias de la invención se pueden utilizar en casetes de expresión o en construcciones de nucleótidos operativamente enlazados a cualquiera entre una variedad de promotores de una planta. Los aspectos del crecimiento de una planta que pueden ser impactados por los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, la altura de una planta, el tamaño, la forma y el número de células y de órganos; la velocidad de la división celular; la velocidad de alargamiento de las células; la velocidad de crecimiento de la planta. Sus órganos, tejidos y células; la regulación del tiempo y la localización de la iniciación el órgano; lapso de vida; y similares.

La invención divulga métodos para reducir el crecimiento de la planta que encuentran uso como alternativas para la aplicación de químicos sintéticos para retardar el crecimiento de las plantas. Estos métodos proveen alternativas ambientalmente seguras para los medios tradicionales de retardar el alargamiento del tallo o el crecimiento con químicos sintéticos. Ciertas modalidades de la invención hacen uso de plantas transformadas con promotores preferidos para el tejido, particularmente promotores preferidos para el tallo, operativamente enlazados a secuencias de nucleótidos de la invención.

Los métodos de la invención incluyen la transformación de plantas con secuencias de nucleótidos de la invención para reducir el crecimiento de la planta. Se pueden utilizar las secuencias de nucleótidos ya sea en orientación sentido o antisentido para suprimir el nivel de una P-glicoproteína endógena que controla el crecimiento de una planta. Por medio de la reducción del nivel en una planta de tal P-glicoproteína, particularmente de una que controle el crecimiento del tallo o del pedúnculo, se puede producir una planta de estatura reducida, una planta enana. Las plantas enanas que tienen características agronómicas mejoradas, tal como un potencial reducido para alojamiento, una mayor eficiencia en el uso del agua, un ciclo de vida reducido, mayor eficiencia en la cosecha y mayor producción por unidad de área, se obtienen por medio de estos métodos. Los métodos de la invención pueden eliminar la necesidad de injertar vástagos de árboles frutales sobre los rizomas enanos para producir árboles frutales enanos.

Los métodos de la invención encuentran uso en la producción de variedades enanas de plantas para cosecha. En una modalidad de la invención, se produce una planta enana de arroz Basmati por medio de la transformación de la planta con una secuencia de nucleótidos de la invención. El arroz Basmati, conocido por su fragancia aromática, granos alargados delgados, y tiempo de cocción relativamente corto, es el tipo de arroz favorito de la mayoría de la gente en el subcontinente Indio. Mientras que se han desarrollado cultivos enanos comercialmente aceptables para otros tipos de arroz, los intentos previos para producir variedades comercialmente aceptables de arroz Basmati por medio de métodos tradicionales de reproducción de la planta han fallado. Aun cuando se obtuvieron plantas enanas en tales intentos, algunas de las características distintivas del grano que los consumidores esperan en el arroz Basmati no se retuvieron en las plantas enanas. Los métodos de la invención proveen un medio de elaboración de plantas enanas de arroz Basmati que producen un grano que posee las características deseadas por los consumidores.

Las plantas enanas deseadas de arroz Basmati se producen por medio de la transformación de una planta no enana de arroz Basmati con una secuencia de nucleótidos de la invención operativamente enlazada a un promotor que dirige la explosión en una planta. Aun cuando la escogencia del promotor depende del resultado deseado, los promotores preferidos son promotores preferidos del tejido, particularmente promotores preferidos del tallo. A través de la cosupresión o supresión antisentido, tales plantas producen niveles reducidos de al menos una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta de arroz, particularmente el crecimiento del tallo.

Por "fenotipo mutante" se entiende cualquier fenotipo de tipo no natural, no típico o no estándar que se presenta como resultado de una alteración genética en el genoma de un organismo. Cuando se lo utiliza con referencia a plantas y animales domésticos, un "fenotipo mutante" es cualquier fenotipo que sea sustancialmente diferente el fenotipo típico de la progenie particular domesticada o de la variedad cultivada a partir de la cual surge el fenotipo mutante.

Por "planta mutante" se entiende una planta que tiene un fenotipo mutante.

Por "alelo mutante" se entiende un alelo de un gen que es capaz de causar un "fenotipo mutante".

Por "enano" se entiende atípicamente pequeño. Por "planta enana" se entiende una planta atípicamente pequeña. Generalmente, tal "planta enana" tiene una estatura o altura reducida a partir de aquella de una planta típica aproximadamente en un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o superior. Generalmente, pero no exclusivamente, dicha planta enana se caracteriza por una longitud reducida de tallo, pedúnculo o tronco comparada con la planta típica.

Por "molécula de nucleótido" se entiende una molécula compuesta de nucleótidos covalentemente enlazados entre sí. Los nucleótidos incluyen tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. Una "molécula de nucleótido" abarca formas monocatenarias y bicatenarias tanto de ADN como de ARN. Las "moléculas de nucleótido" se pueden presentar en forma natural, sintética, o una combinación de ambas. La disposición lineal de nucleótidos en una "molécula de nucleótido" es conocida como una "secuencia de nucleótidos" y a menos que se especifique otra cosa se presenta aquí de izquierda a derecha que corresponde a la dirección 5' a 3'. Debido a la naturaleza complementaria de las cadenas opuestas de una molécula bicatenaria de nucleótido, una secuencia de nucleótidos de la invención abarca adicionalmente a su secuencia complementaria antisentido.

Las composiciones de la invención incluyen secuencias nativas de nucleótidos para genes que codifican para P-glicoproteínas codificadas por el gen del tipo que genera resistencia a múltiples drogas, homólogos de P-glicoproteínas codificadas por el gen del tipo que genera resistencia a múltiples drogas, así como fragmentos y variantes y fragmentos de los mismos. En particular, la presente invención provee moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 3. Se proveen además polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico descrita aquí, por ejemplo aquellos expuestos en las SEQ ID NOs: 1 y 2 y fragmentos y variantes de los mismos.

La invención abarca composiciones de proteína o de ácido nucleico sustancialmente purificadas o aisladas. Una molécula de ácido nucleico o de proteína "aislada" o "purificada", o una porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo, cuando se la produce por medio de técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se la sintetiza químicamente. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferiblemente de secuencias que codifican proteína) que naturalmente flanquean al ácido nucleico (esto es, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diferentes modalidades, la molécula añadida de ácido nucleico puede contener aproximadamente menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ó 1 kb de secuencias de nucleótidos que normalmente flanquean a la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico. Una proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen aproximadamente menos del 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención o una porción biológicamente activa de la misma es producida en forma recombinante, preferiblemente el medio de cultivo representa aproximadamente menos del 30%, 20%, 10% ó 5% (en peso seco) de los precursores químicos o de los productos químicos no proteicos de interés.

Los fragmentos y variantes de las secuencias divulgadas de nucleótidos y de las proteínas codificadas así son también abarcados por la presente invención. Por "fragmento" se entiende una porción de la secuencia de nucleótidos o una porción de la secuencia de aminoácidos y en consecuencia la proteína así codificada. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteína que retienen actividad biológica de la P-glicoproteína nativa de la invención y por lo tanto retienen una o más funciones de la P-glicoproteína nativa tales como, por ejemplo, la actividad transportadora transmembrana y el enlazamiento de ATP.

Un fragmento de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica para la P-glicoproteína que codifica una porción biológicamente activa de una P-glicoproteína de la invención codificará al menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200 ó 1300 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una P-glicoproteína de longitud completa de la invención (por ejemplo, 1.394 aminoácidos para la SEQ ID NO: 3). Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos del gen que codifica para una P-glicoproteína que son útiles como sondas de hibridación para los iniciadores PCR generalmente no necesitan codificar una porción biológicamente activa de una P-glicoproteína.

Se puede preparar una porción biológicamente activa de una P-glicoproteína por medio del aislamiento de una porción de una de las secuencias de nucleótidos del gen que codifica para la P-glicoproteína de la invención, expresando la porción codificada de la P-glicoproteína por ejemplo, por medio de expresión recombinante in vitro), y evaluando la actividad de la porción de las moléculas de ácido nucleico que codifican para la P-glicoproteína que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos del gen que codifica para una P-glicoproteína que comprende al menos 30, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 500, 700, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000 u 8,000 nucleótidos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos que codifican para una P-glicoproteína de longitud completa divulgada aquí (por ejemplo, 8.036 y 4.653 nucleótidos para la SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente).

Por "variantes" se entienden secuencias sustancialmente similares. Para las secuencias de nucleótidos, las variantes conservadoras incluyen a aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican a la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de la P-glicoproteína de la invención. Las variantes alélicas de ocurrencia natural tal como estas se pueden identificar por medio del uso de técnicas conocidas de biología molecular, como, por ejemplo, con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como las esbozadas más adelante. Las variantes de secuencias de nucleótidos también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, tales como aquellas generadas, por ejemplo, por medio del uso de mutagénesis dirigida al sitio pero que aún codifica a una proteína P-glicoproteína de la invención. Generalmente, las variantes de una secuencia particular de nucleótidos de la invención tendrán al menos 70%, generalmente aproximadamente al menos 75%, 80%, 85%, preferiblemente aproximadamente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, y más preferiblemente aproximadamente al menos 98%, 99% o más identidad de secuencia con aquella secuencia particular de nucleótidos como la determinada por medio de los programas de alineación de secuencia descritos aquí en otra parte utilizando parámetros por defecto.

Por "variante" de proteína se entiende una proteína derivada de la proteína nativa por supresión (también llamado truncamiento) o adición de uno o más aminoácidos del extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; supresión o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las variantes de proteína comprendidas dentro de la presente invención son biológicamente activas, esto es, que ellas continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, esto es, actividad transportadora o actividad de enlazamiento de ATP como se describe aquí. Tales variantes pueden resultar, por ejemplo, de polimorfismo genético o de manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de la invención tendrán al menos 70%, generalmente al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, preferiblemente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, y más preferiblemente aproximadamente al menos 98%, 99% o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos para la proteína nativa como la determinada por medio de los programas de alineación de secuencia descritos aquí en otra parte utilizando parámetros por defecto. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de aquella proteína por tan pocos como 1-15 residuos aminoácidos, tan pocos como 1-10, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2 o inclusive 1 residuo aminoácido.

Las proteínas de la invención se pueden alterar en diferentes formas incluidas sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en el arte. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos de las P-glicoproteínas se pueden preparar por medio de mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones en la secuencia de nucleótidos son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel y colaboradores, (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente estadounidense No. 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias citadas allí. Una guía para las sustituciones apropiadas de aminoácidos que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se puede encontrar en el modelo de Dayhoff y colaboradores (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).

De esta forma, los genes y las secuencias de nucleótidos incluyen tanto a las secuencias de ocurrencia natural como a las formas mutantes. Igualmente, las proteínas de la invención abracan tanto a las proteínas de ocurrencia natural como a las variaciones y formas modificadas de las mismas. Tales variantes continuarán poseyendo la actividad transportadora deseada. Obviamente, las mutaciones que se harán en el ADN que codifica a la variante no debe colocar la secuencia por fuera del marco de lectura y preferiblemente no creará regiones complementarias que podrían producir una estructura secundaria de ARNm. Ver, la publicación de la solicitud europea de patente No. 75.444.

Las supresiones, inserciones, y sustituciones de las secuencias de proteína comprendidas aquí no se espera que produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión, o inserción en forma anticipada, alguien capacitado en el arte apreciará que el efecto será evaluado por medio de análisis de selección de rutina.

Las variantes de las secuencias de nucleótidos y de proteínas también abarcan a las secuencias de nucleótidos y a las proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como el arrastre de ADN. Con tal procedimiento se pueden manipular una o más secuencias diferentes de codificación de P-glicoproteína para crear una variante de una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de P-glicoproteína que posee las propiedades deseadas. De esta forma, las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que contienen las regiones de secuencia que tienen una identidad sustancial de secuencia y se pueden recombinar en forma homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando esta aproximación, los motivos de secuencia que codifican un domino de interés se pueden arrastrar entre el gen que codifica para la P-glicoproteína de la invención y otros genes conocidos que codifican para la P-glicoproteína para obtener un nuevo gen que codifica para una proteína con una propiedad mejorada de interés, tal como un K_{m} mayor en el caso de una enzima. Las estrategias para tal arrastre de ADN son conocidas. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri y colaboradores (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore y colaboradores (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang y colaboradores (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 94:4504-4509; Crameri y colaboradores (1998) Nature 391:288-291; y las patentes estadounidenses Nos. 5.605.793 y 5.837.458.

Las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden utilizar para aislar las secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras plantas, particularmente otras monocotiledoneas. De esta forma, se pueden utilizar métodos tales como PCR, hibridación, y similares para identificar tales secuencias con base en su homología de secuencia para las secuencias expuestas aquí. Las secuencias aisladas con base en su identidad de secuencia para las secuencias completas expuestas aquí o para los fragmentos de los mismos están comprendidas por la presente invención. Tales secuencia incluyen a las secuencias que son ortólogas de las secuencias divulgadas. Por "ortólogas" se entiende a los genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como resultado de la especificación. Los genes encontrados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias codificadas de proteína comparten identidad sustancial como se define aquí en otra parte. Las funciones de los ortólogos están a menudo altamente conservadas entre las especies.

En una aproximación PCR, se pueden diseñar iniciadores oligonucleótidos para uso en reacciones PCR para amplificar las correspondientes secuencias de ADN a partir del ADNc o del ADN genómico extraido de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar iniciadores PCR y clonación PCR son generalmente conocidos en el arte y se divulgan en Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Ver también Innis y colaboradores, eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no se limitan a, métodos que utilizan iniciadores apareados, iniciadores anidados, iniciadores específicos sencillos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos para el gen, iniciadores específicos para el vector, iniciadores parcialmente correlacionados en forma desigual, y similares. En técnicas de hibridación, todo o parte de una secuencia conocida de nucleótidos es utilizada como sonda que hibrida selectivamente a otras secuencias correspondientes de nucleótidos presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (esto es, bibliotecas de ADNc o genómico) de un organismo escogido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden ser marcados con un grupo detectable tal como ^{32}P, o cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo, las sondas para hibridación se pueden elaborar por medio de la marcación de oligonucleótidos sintéticos con base en las secuencias de nucleótidos del gen que codifica para la P-glicoproteína de la invención. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación y para la construcción de ADNc y de bibliotecas genómicas son generalmente conocidos en el arte y se divulgan en Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Por ejemplo, una secuencia completa de Br2 divulgada aquí, o una o más porciones de la misma, se pueden utilizar como una sonda capaz de hibridar específicamente a las correspondientes secuencias génicas que codifican para la P-glicoproteína y los ARN mensajeros. Para lograr una hibridación específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias génicas que codifican para la P-glicoproteína y son preferiblemente aproximadamente de al menos 10 nucleótidos de longitud, y lo más preferible al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Tales sondas se pueden utilizar para amplificar las secuencias génicas correspondientes que codifican para las P-glicoproteínas a partir de una planta escogida por PCR. Esta técnica se puede utilizar para aislar secuencias adicionales de codificación de una planta deseada o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en una planta. Las técnicas de hibridación incluyen la selección por hibridación de bibliotecas de ADN sembradas en placa (ya sean placas o colonias, ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

La hibridación de tales secuencias se puede llevar cabo bajo condiciones rigurosas. Por "condiciones rigurosas" o "condiciones rigurosas de hibridación" se entiende condiciones bajo las cuales una sonda hibridará hasta su secuencia objetivo en un grado detectable mayor que para otras secuencias (por ejemplo, al menos dos veces sobre el valor base). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Controlando la rigurosidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, se pueden identificar las secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones rigurosas se pueden ajustar para permitir alguna concordancia en forma desigual en las secuencias para que se detecten bajos grados de similitud (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda es aproximadamente menor a 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menor a 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es aproximadamente menor a 1,5 M de ión Na, típicamente aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de ión Na (o de otras sales) a pH entre 7,0 y 8,3 y la temperatura es aproximadamente al menos de 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y aproximadamente al menos 60ºC para sondas largas (por ejemplo, superiores a 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también se pueden lograr con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja rigurosidad incluyen hibridación con una solución amortiguadora de 30 a 35% de formamida, NaCl 1 M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37ºC y un lavado en 1X a 2X con SSC (20X con SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a 50-55ºC. Los ejemplos de condiciones de rigurosidad moderada incluyen hibridación en 40 a 45% de formamida, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,5X a 1X con SSC a 55-60ºC. Los ejemplos de condiciones de rigurosidad alta incluyen hibridación en 50% de formamida, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,1X con SSC a 60-65ºC. La duración de la hibridación es generalmente menor aproximadamente a 24 horas, usualmente aproximadamente 4 hasta aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución final de lavado. Para híbridos de ADN-ADN, la T_{m} se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: T_{m} = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC)-0,61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de los nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del hibrido en pares de bases. El T_{m} es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la cual 50% de una secuencia complementaria objetivo hibrida hasta una sonda perfectamente apareada. T_{m} se reduce aproximadamente en 1ºC por cada 1% de concordancia en forma desigual; por lo tanto, T_{m}, la hibridación, y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar hasta las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se observan secuencias con \geq90% de identidad, se puede disminuir el T_{m} 10ºC. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para estar 5ºC por debajo del punto térmico de fusión (T_{m}) para la secuencia específica y su complemento con una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 1, 2, 3 ó 4ºC por debajo del punto térmico de fusión (T_{m}); las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 ó 20ºC por debajo del punto térmico de fusión (T_{m}). Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y de lavado, y el T_{m} deseado, aquellos ordinariamente capacitados entenderán que las variaciones en la rigurosidad de la hibridación y/o de las soluciones de lavado están descritas en forma inherente. Si el grado deseado de concordancia en forma desigual resulta en un T_{m} menor a 45ºC (solución acuosa) ó 32ºC (solución de formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC para poder utilizar una temperatura más alta. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel y colaboradores, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). See Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

De esta forma, las secuencias aisladas que codifican par alas P-glicoproteínas y que hibridan bajo condiciones rigurosas hacia las secuencias génicas divulgadas aquí que codifican para la P-glicoproteína, o hacia fragmentos de las mismas, son abarcadas por la presente invención. Tales secuencias serán al menos aproximadamente 70% a 75%, aproximadamente 80% a 85%, y aún 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, homólogas con las secuencias divulgadas. Esto es, la identidad de secuencia de las secuencias puede estar en el rango, compartiendo aproximadamente al menos 70% a 75%, aproximadamente 80% a 85%, y aún aproximadamente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia.

Los siguientes términos son utilizados para describir las relaciones de las secuencias entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia", y (e) "identidad sustancial".

(a): Como se la utiliza aquí, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para comparación con la secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de un ADNc o secuencia génica de longitud completa, o el ADNc o secuencia génica completa.

(b): Como se la utiliza aquí, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede contener adiciones o supresiones (esto es, vacíos) comparada con la secuencia de referencia (que no contiene adiciones o supresiones) para alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de al menos 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40,50, 100 o más larga. Aquellos capacitados en el arte entienden que para evitar una similitud alta con una secuencia de referencia debido a la inclusión de vacíos en la secuencia de polinucleótidos, se introduce típicamente una penalización por vacío y se resta del número de concordancias.

Los métodos de alineación de secuencias para comparación son conocidos en el arte. De esta forma, la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias cualquiera se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitantes de tales algoritmos matemáticos son los algoritmos de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de homología local de Smith y colaboradores (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de homología de alineación de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Las implementaciones por computador de estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no se limita a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible con Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Versión 8 (disponible con Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Los alineamientos que utilizan estos programas se puede llevar a cabo utilizando los parámetros por defecto. El programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins y colaboradores (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins y colaboradores (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet y colaboradores (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang y colaboradores (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson y colaboradores (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN está basado en el algoritmo de Myers y Miller (1988), ver más arriba. Se pueden utilizar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud del vacío de 12, y una penalización por vacío de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan las secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), ver más arriba. Las búsquedas de nucleótidos a través de BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTN, puntaje = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína de la invención. Las búsquedas de proteína a través de BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTX, puntaje = 50, longitud de palabras = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones vacías para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul y colaboradores (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, se puede utilizar PSI-BLAST (in BLAST 2.0) para llevar a cabo una búsqueda reiterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul y colaboradores (1997), ver más arriba. Cuando se utilizan BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Ver http://www.ncbi.hlm.nih.gov. También se puede llevar a cabo la alineación manualmente por medio de inspección.

A menos que se establezca otra cosa, los valores de identidad/similitud de secuencia suministrados aquí se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 usando los siguientes parámetros: % de identidad utilizando GAP Weight de 50 y Lenght Weight de 3; % de similitud utilizando GAP Weight de 12 y Lenght Weight de 4, o cualquier programa equivalente. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencia que, para cualquier par de secuencias en discusión, genere una alineación que tenga un nucleótido idéntico o residuo aminoácido que casen entre sí y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia cuando se los compara con la correspondiente alineación generada por el programa preferido.

GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, para encontrar la alineación de dos secuencias completas lo que maximiza el número de correlaciones y minimiza el número de vacíos. GAP considera todas las posibles alineaciones y las posiciones de los vacíos y crea las alineaciones con el mayor número de bases emparejadas y el menor número de vacíos. Esto permite por la estipulación de un vacío la creación de una penalización y una penalización por la extensión de un vacío en unidades de bases emparejadas. GAP debe elaborar una ventaja de la penalización por la creación de un vacío por el número de correlaciones para cada vacío que él inserte. Si se escoge una penalización por la extensión del vacío que sea superior a cero, GAP debe, además, elaborar una ventaja por cada vacío insertado de la longitud del vacío, las veces que la extensión del vacío penalice. Los valores por defecto de la penalización por la creación de un vacío y los valores de la penalización por la extensión de un vacío en la Versión 10 del Wisconsin Genetics Software Package para secuencias de proteína son 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos la penalización por defecto por la creación de un vacío es de 50 mientras que la penalización por defecto por la extensión de un vacío es de 3. Las penalizaciones por la creación de un vacío y por la extensión de un vacío se pueden expresar como un entero seleccionado del grupo de enteros que consiste de 0 a 200. Así, por ejemplo, las penalizaciones por la creación de un vacío y por la extensión de un vacío pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o superiores.

GAP representa a un miembro de la familia de los mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una calidad mejor. GAP exhibe cuatro distinciones meritorias para los alineamientos: Calidad, Proporción, Identidad, y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada con el propósito de alinear las secuencias. La Proporción es la calidad dividida por el número de bases en el segmento más corto. El porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que realmente concuerdan. El porcentaje de Similitud es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que aparecen a través de los vacíos se ignoran. Una similitud puntúa cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor o igual a 0,50, el umbral de similitud. La matriz de puntuación utilizada en la Versión 10 del Wisconsin Genetics Software Package es BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

(c): Como se lo utiliza aquí, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o de polipéptido hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para máxima correspondencia sobre una ventana de comparación especificada. Cuando se utiliza el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos, en donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de la secuencia se puede ajustar hacia arriba y para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Las secuencias que difieren por tales sustituciones conservadoras se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para lograr este ajuste son conocidos por aquellos capacitados en el arte. Típicamente, esto involucra puntuar una sustitución conservadora como parcial envés de una concordancia completa en forma desigual, incrementando por lo tanto el porcentaje de identidad de la secuencia. Así, por ejemplo, donde se da un puntaje de 1 a un aminoácido idéntico y a una sustitución no conservadora se le da un puntaje de cero, a una sustitución conservadora se le da un puntaje entre cero y 1. El puntaje de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como está implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).

(d): Como se lo utiliza aquí, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado por medio de la comparación de dos secuencias opcionalmente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de nucleótidos en la ventana de comparación puede contener adiciones o supresiones (esto es, vacíos) en comparación con la secuencia de referencia (que no contiene adiciones o supresiones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula por medio de la determinación del número de posiciones en las cuales se presenta una base idéntica de ácido nucleico o residuo de aminoácido en ambas secuencias para producir el número de posiciones en concordancia, dividiendo el número de posiciones en concordancia por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia.

(e) \; (i): El término "identidad sustancial" de las secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido contiene una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferible al menos 95%, comparada con una secuencia de referencia que utiliza uno de los programas de alineación descrito utilizando parámetros estándar. Alguien capacitado en el arte reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente para determinar la correspondiente identidad de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración del codón, la similitud de los aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, y similares. La identidad sustancial de las secuencias de aminoácidos para estos propósitos normalmente significa una identidad de secuencia de al menos 60%, más preferiblemente al menos del 70%, 80%, 90%, y lo más preferible al menos 95%.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas. Generalmente, se seleccionan las condiciones rigurosas para estar aproximadamente 5ºC por debajo del punto térmico de fusión (T_{m}) para la secuencia específica con una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones rigurosas abarcan temperaturas en el rango aproximadamente desde 1ºC aproximadamente hasta 20ºC por debajo del T_{m}, dependiendo del grado deseado de rigurosidad como se calificó aquí de otra manera. Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas son aún sustancialmente idénticos si los polipéptidos que ellos codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración permitida del codón por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es cuando el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo en forma cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.

(e) \; (ii): El término "sustancialmente idéntico" en el contexto de un péptido indica que un péptido contiene una secuencia con al menos un 70% de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, preferiblemente 80%, más preferiblemente 85%, los más preferible al menos 90% ó 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia sobre una ventana de comparación especificada. Preferiblemente, el alineamiento óptimo se lleva a cabo utilizando el algoritmo de homología de alineación de Needleman y colaboradores (1970) J. Mol. Biol. 48:443. Una indicación de que dos secuencias de péptidos son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos surgidos contra el segundo péptido. Por lo tanto, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren únicamente en una sustitución conservadora. Los péptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como se observó anteriormente excepto porque las posiciones de los residuos que no son idénticos pueden diferir en los cambios conservadores de aminoácidos.

El uso del término "construcciones de nucleótidos" no pretende limitar aquí a la presente invención a las construcciones de nucleótidos que contienen ADN. Aquellos ordinariamente capacitados en el arte reconocerán que las construcciones de nucleótidos, particularmente polinucleótidos y oligonucleótidos, compuestos de ribonucleótidos y de combinaciones de ribonucleótidos y de desoxirribonucleótidos también pueden ser empleados en los métodos descritos aquí. De este modo, las construcciones de nucleótidos de la presente invención abarcan a todas las construcciones de nucleótidos que pueden ser empleadas en los métodos de la presente invención para transformar plantas incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas que contienen desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y combinaciones de los mismos. Tales desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas de ocurrencia natural como análogos sintéticos. Las construcciones de nucleótidos de la invención también abarcan a todas las formas de construcciones de nucleótidos que incluyen, pero no se limitan a, formas monocatenarias, formas bicatenarias, horquillas, estructuras de tallo y bucle, y similares.

Además, se reconoce que los métodos de la invención pueden emplear una construcción de nucleótidos que es capaz de dirigir, en una planta transformada, la expresión de al menos una proteína, o al menos un ARN, tal como, por ejemplo, un ARN antisentido que es complementario a al menos una porción de un ARNm. Típicamente, tal construcción de nucleótidos contiene una secuencia de codificación para una proteína o un ARN operativamente enlazado a regiones reguladoras transcripcionales 5' y 3'. Alternativamente, también se reconoce que los métodos de la invención pueden emplear una construcción de nucleótidos que no es capaz de dirigir, en una planta transformada, la expresión de una proteína o de un ARN.

Adicionalmente, se reconoce que los métodos de la presente invención no dependen de la incorporación dentro del genoma de la construcción entera de nucleótidos que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para la P-glicoproteína, excepto que la planta o una célula de la misma se altere como resultado de la introducción de la construcción de nucleótidos dentro de una célula. En una modalidad de la invención, se puede alterar el genoma después de la introducción de la construcción de nucleótidos dentro de una célula. Por ejemplo, la construcción de nucleótidos, o cualquier parte de la misma, puede incorporar dentro del genoma de la planta alteraciones al genoma de la presente invención incluyendo, pero sin limitarse a, adiciones, supresiones, y sustituciones de nucleótidos en el genoma. Mientras que los métodos de la presente invención no dependen de adiciones, supresiones, o sustituciones de cualquier número particular de nucleótidos, se reconoce que tales adiciones, supresiones, o sustituciones comprenden al menos un nucleótido.

Las construcciones de nucleótidos de la inversión también abarcan a las construcciones de nucleótidos que se puede emplear en los métodos para alterar o mutar una secuencia genómica de nucleótidos en un organismo, incluyendo, pero sin limitarse a, vectores quiméricos, vectores mutacionales quiméricos, vectores quiméricos de reparación, dobletes mezclados de oligonucleótidos, oligonucleótidos quiméricos complementarios en si mismos, y oligonucleóbases recombinogénicas. Tales construcciones de nucleótidos y los métodos para utilizarlas, tales como, por ejemplo, quimeroplastia, son conocidos en el arte. La quimeroplastia involucra el uso de tales construcciones de nucleótidos para introducir cambios específicos en el sitio en de la secuencia de ADN genómico dentro de un organismo. Ver, las patentes estadounidenses Nos. 5.565.350; 5.731.181; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; y 5.871.984. Ver también, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, y Beetham y colaboradores (1999) Proc. Natl. Acad Sci. USA 96:8774-8778.

Las secuencias de nucleótidos de la invención son proveidas en casetes de expresión para la expresión en la planta de interés. El casete incluirá a las secuencias reguladoras 5' y 3' operativamente enlazadas a una secuencia de nucleótidos de la invención. Por "operativamente enlazado" se entiende un enlace funcional entre el promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operativamente enlazado significa que las secuencias de ácido nucleico que son enlazadas son contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones de codificación de proteína, en forma contigua y en el mismo marco de lectura. El casete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional que es cotransformado dentro del organismo. Alternativamente, el(los) gen(es) adicional(es) pueden ser proveídos en múltiples casetes de expresión.

Tal casete de expresión está provisto con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de nucleótidos de la invención este bajo regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresión puede contener adicionalmente genes marcadores seleccionables.

El casete de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de iniciación de la transcripción y de la traducción, una secuencia de nucleótidos de la invención, y una región de terminación de la transcripción y de la traducción funcional en plantas. La región de iniciación de la transcripción, el promotor, puede ser nativa o análoga o exterior o heteróloga a la planta huésped. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Por "externa" se entiende que la región de iniciación de la transcripción no se encuentra en la planta nativa dentro de la cual se introduce la región de iniciación de la transcripción.

Mientras que puede ser preferible expresar las secuencias utilizando promotores heterólogos, se pueden utilizar las secuencias promotoras nativas. Tales construcciones cambiarían los niveles de expresión en la planta o en la célula de la planta. Por lo tanto, se altera el fenotipo de la planta o de la célula de la planta.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN operativamente enlazada de interés, o se puede derivar de otra fuente. Las regiones convenientes de terminación están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Ver también Guerineau y colaboradores (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y colaboradores (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y colaboradores (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe y colaboradores (1990) Gene 91:151-158; Ballas y colaboradores (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi y colaboradores (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando sea conveniente, el(los) gen(es) se puede(n) optimizar para una mayor expresión en la planta transformada. Esto es, los genes se pueden sintetizar utilizando codones preferidos de la planta para una expresión mejorada. Los métodos están disponibles en el arte para la síntesis de los genes preferidos de la planta. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5.380.831, y 5.436.391, y Murray y colaboradores (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

Se conocen modificaciones adicionales de la secuencia para mejorar la expresión génica en un huésped celular. Estas incluyen la eliminación de las secuencias que codifican señales espurias de poliadenilación, señales del sitio de empalme exón-intrón, repeticiones del tipo transposón, y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser nocivas para la expresión del gen. El contenido G-C de la secuencia se puede ajustar hasta niveles promedio para un huésped celular, como el calculado por referencia a los genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar las estructuras secundarias predichas tipo horquilla de ARNm.

Los casetes de expresión pueden contener adicionalmente las secuencias líder 5' en la construcción del casete de expresión. Tales secuencias líder pueden actuar para mejorar la traducción. Los líderes de traducción son conocidos en el arte e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, el líder de EMCV (región 5' no codificadora de Encefalomiocarditis) (Elroy-Stein y colaboradores (1989) PNAS USA 86:6126-6130); líderes de potyvirus, por ejemplo, líder del TEV (Virus Etch del Tabaco) (Allison y colaboradores (1986); líder del MDMV (Virus del Mosaico Enano de Maíz); Virology 154:9-20), y la proteína de enlazamiento de cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP), (Macejak y colaboradores (1991) Nature 353:90-94); líder no traducido del ARNm de la proteína de recubrimiento del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling y colaboradores (1987) Nature 325:622-625); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie y colaboradores (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), páginas 237-256); y líder del virus de la mancha clorótica del maíz (MCMV) (Lommel y colaboradores (1991) Virology 81:382-385). Ver también, Della-Cioppa y colaboradores (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Se pueden utilizar también otros métodos conocidos por mejorar la traducción, por ejemplo, intrones, y similares.

En la preparación del casete de expresión, se pueden manipular los diferentes fragmentos de ADN, a fin de proveer las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, según sea conveniente, en el marco de lectura apropiado. Con este propósito, se pueden emplear adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN o se pueden involucrar otras manipulaciones para suministrar los sitios de restricción convenientes, remoción de ADN superfluo, remoción de sitios de restricción, o similares. Para este propósito, se puede involucrar mutagénesis in vitro, reparación del iniciador, restricción, apareamiento, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.

Se reconoce que con las secuencias de nucleótidos de la invención, se pueden elaborar construcciones antisentido, complementarias al menos a una porción del ARN mensajero (ARNm) para las secuencias génicas que codifican para la P-glicoproteína. Los nucleótidos antisentido se construyen para hibridar con el ARNm correspondiente. Se pueden hacer modificaciones de las secuencias antisentido mientras las secuencias hibridan hasta, e interfieren con, la expresión del ARNm correspondiente. De esta forma, se pueden utilizar las construcciones antisentido que tienen 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente 85% de identidad de secuencia con las secuencias objetivo correspondientes. Además, se pueden utilizar porciones de los nucleótidos antisentido para desbaratar la expresión del gen objetivo. Generalmente, se pueden utilizar secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, o superiores.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención se pueden utilizar también en la orientación sentido para suprimir la expresión de genes endógenos en plantas. Los métodos para suprimir la expresión génica en plantas utilizando secuencias de nucleótidos en la orientación sentido, también conocidos como métodos de cosupresión, son conocidos en el arte. Los métodos generalmente involucran la transformación de plantas con una construcción de nucleótidos que contiene un promotor que dirige la expresión en una planta operativamente enlazada al menos a una porción de una secuencia de nucleótidos que corresponde al transcripto del gen endógeno. Típicamente, tal secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia sustancial con la secuencia del transcripto del gen endógeno, preferiblemente aproximadamente mayor al 65% de identidad de secuencia, más preferiblemente aproximadamente mayor al 85% de identidad de secuencia, lo más preferible aproximadamente mayor al 95% de identidad de secuencia. Ver, las patentes estadounidenses Nos. 5.283.184 y 5.034.323.

Generalmente, el casete de expresión contendrá un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o de tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican Resistencia antibiótica, tal como aquellos que codifican para la neomicina fosfotransferasa II (NEO) y para la higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas, y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ver generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:6314-6318; Yao y colaboradores (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley y colaboradores (1980) en The Operon, páginas 177-220; Hu y colaboradores (1987) Cell 48:555-566; Brown y colaboradores (1987) Cell 49:603-612: Figge y colaboradores (1988) Cell 52:713-722; Deuschle y colaboradores (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst y colaboradores (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:2549-2553; Dcuschle y colaboradores (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines y colaboradores (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:1917-1921; Labow y colaboradores (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim y colaboradores (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072.5076; Wyborski y colaboradores (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillen and-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb y colaboradores (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt y colaboradores (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen y colaboradores (1992) Proc. Nail. Acad Sci. USA 89:5547-5551; Oliva y colaboradores (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka y colaboradores (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill y colaboradores (1988) Nature 334:721-724.

El listado anterior de genes marcadores seleccionables no pretende ser una limitante. Se puede utilizar cualquier gen marcador seleccionable en la presente invención.

Se pueden utilizar una cantidad de promotores en la práctica de la invención. Los promotores se pueden seleccionar con base en la regulación de tiempo deseada, la localización y el nivel de expresión de los genes que codifican para la P-glicoproteína en una planta. Se pueden utilizar promotores constitutivos, preferidos del tejido, inducibles por patógenos, inducibles por heridas y químicamente regulables en la práctica de la invención.

Tales promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, al promotor central del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos divulgados en WO 99/43838 y en la patente estadounidense No. 6.072.050; al promotor central CaMV 35S (Odell y colaboradores (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy y colaboradores (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen y colaboradores (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen y colaboradores (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last y colaboradores (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten y colaboradores (1984) EMBO J. 3:2723-2730); al promotor ALS (U.S. Application Serial No. 08/409.297 (Patente estadounidense No. 5.659.026)), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; y 5.608.142.

Se pueden utilizar los promotores preferidos del tejido para dirigir la expresión mejorada de la P-glicoproteína dentro de un tejido particular de una planta. Los promotores preferidos del tejido incluyen Yamamoto y colaboradores (1997) Plant J 12(2):255-265; Kawamata y colaboradores (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen y colaboradores (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell y colaboradores (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112 (2):525-535; Canevascini y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto y colaboradores (1994) Plant Cell Physiol. 33(3): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco y colaboradores (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka y colaboradores (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; y Guevara-Garcia y colaboradores (1993) Plant J. 4(3): 495-505. Tales promotores pueden ser modificados, si es necesario, para expresión débil.

Los promotores preferidos de la hoja incluyen, Yamamoto y colaboradores (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata y colaboradores (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen y colaboradores (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343; Russell y colaboradores (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112 (2):525-535; Canevascini y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto y colaboradores (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco y colaboradores (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka y colaboradores (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; y Guevara-Garcia y colaboradores (1993) Plant J. 4(3): 495-505.

Los promotores preferidos de la raíz son conocidos y se pueden seleccionar a partir de los muchos que se encuentran disponibles en la literatura o se pueden aislar de novo a partir de diferentes especies compatibles. Ver, por ejemplo, Hire y colaboradores (1992) Plant Mol. Biol. 20(2): 207-218 (gen que codifica para la glutamina sintetasa preferido de la raíz de la soja); Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de control preferido de la raíz en el gen GRP 1.8 de alubia francesa); Sanger y colaboradores (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor preferido de la raíz del gen que codifica para la manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); y Miao y colaboradores (1991) Plant Cell 3 (1):11-22 (clon de ADNc de longitud completa que codifica para la glutamina sintetasa citosólica (GS), que se expresa en raíces y en los nódulos de las raíces de soja). Ver también Bogusz y colaboradores (1990) Plant Cell 2(7):633-641, donde se describen dos promotores preferidos de la raíz aislados de los genes que codifican para la hemoglobina a partir de la Parasponia andersonii no leguminosa fijadora de nitrógeno y de la Trema tomentosa no leguminosa no fijadora de nitrógeno relacionada. Los promotores de estos genes se enlazaron a un gen reportero que codifica para la \beta-glucuronidasa y se lo introdujo dentro tanto de la Nicotiana tabacum no leguminosa como de la leguminosa Lotus corniculatus, y en ambos casos se preservó la actividad del promotor preferido de la raíz. Leach y Aoyagi (1991) describen sus análisis de los promotores de los genes altamente expresados que inducen rolC y rolD en la raíz de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick) 79(1):69-16). Ellos concluyeron que los determinantes de ADN preferidos del tejido y los reforzadores se disocian en esos promotores. Teeri y colaboradores (1989) usaron fusión génica con lacZ para mostrar que el gen T-AND de Agrobacterium que codifica para la octopina sintasa es especialmente activo en la epidermis de la punta de la raíz y que el gen TR2' es preferido de la raíz en la planta intacta y es estimulado por las lesiones en el tejido de la hoja, una combinación especialmente deseable de características para el uso con un gen insecticida o larvicida (ver EMBO.J. 8(2):343-350). El gen TR1', fusionado a nptII (neomicina fosfotransferasa II) mostró características similares. Los promotores adicionales preferidos de la raíz incluyen al promotor génico VfENOD-GRP3 (Kuster y colaboradores (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772); y al promotor rolB (Capana y colaboradores (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Ver también las patentes estadounidenses Nos. 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; y 5.023.179.

Generalmente, será beneficioso expresar al gen de un promotor inducible, particularmente de un promotor inducible por un patógeno. Tales promotores incluyen a aquellas proteínas relacionadas con patogénesis (proteínas PR), que se inducen después de la infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc. Ver, por ejemplo, Redolfi y colaboradores (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes y colaboradores (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol 4:111-116. Ver también las solicitudes de patente en trámite junto con la presente tituladas "Inducible Maize Priomoters", la solicitud estadounidense con serial No. 60/076.100, presentada el 26 de febrero 26 de 1998, y la solicitud estadounidense con serial No. 60/079.648, presentada el 27 de marzo de 1998, ambas correspondientes a la solicitud PCT WO99/43819, publicada el 2 de septiembre de 1999.

Los promotores que se expresan localmente en o cerca del sitio de una infección patógena son de interés. Ver, por ejemplo, Marineau y colaboradores (1987) Plant Mol Biol. 9:335-342; Matton y colaboradores (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch y colaboradores (1986) Proc. Natl. Acad Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch y colaboradores (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; y Yang (1996) Proa Natl. Acad Sci. USA 93:14972-14977. Ver también, Chen y colaboradores (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang y colaboradores (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:2507-2511; Warner y colaboradores (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz y colaboradores (1989) Plant Cell 1:961-968; la patente estadounidense No. 5.750.386 (inducible por un nemátodo); y las referencias citadas allí. De interés particular es el promotor inducible por el gen PRms del maíz, cuya expresión se induce por el patógeno Fusarium moniliforme (ver, por ejemplo, Cordero y colaboradores (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).

Adicionalmente, ya que los patógenos encuentran entrada en las plantas a través de heridas o daños por insectos, se puede utilizar un promotor inducible por una herida en las construcciones de la invención. Tales promotores inducibles por una herida incluyen al gen inhibidor de la proteinasa de patata (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 y wun2, patente estadounidense No. 5.428.148; win1 y win2 (Stanford y colaboradores, (1989) Mol. Gen Genet. 215:200-208); system in (McGurl y colaboradores (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier y colaboradores (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp y colaboradores (1993) FEBS Letters 323:73-76); gen MPI (Corderok y colaboradores (1994) Plant J. 6(2):141-150); y similares.

Los promotores químicamente regulados se pueden utilizar para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor químicamente inducible, donde la aplicación del químico induce la expresión del gen, o un promotor químicamente reprimible, donde la aplicación del químico reprime la expresión del gen. Los promotores químicamente inducibles son conocidos en el arte e incluyen, pero no se limitan a, el promotor In2-2 del maíz, que se active por los antídotos del herbicida bencenosulfonamida, el promotor GST del maíz, que se activa por compuestos electrofílicos hidrófobos que se utilizan como herbicidas preemergentes, y el promotor PR-1a del tabaco, que se activa por el ácido salicílico. Otros promotores químicamente regulados de interés incluyen promotores sensibles a esteroides (ver, por ejemplo, al promotor inducible por un glucocorticoide en Schena y colaboradores (1991) Proc. Natl. Acad Sci USA 88:10421-10425 y McNellis y colaboradores (1998) Plant J. 14(2):247-257) y promotores reprimibles por tetraciclina e inducibles por tetraciclina (ver, por ejemplo, Gatz y colaboradores (1991) Mol. Gen. Genet.227:229-237, y las patentes estadounidenses Nos. 5.814.618 y 5.789.156).

Los protocolos de transformación así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o de célula de una planta, esto es, monocotiledónea o dicotiledónea, destinadas a transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en células de plantas y la posterior inserción en el genoma de la planta incluyen microinyección (Crossway y colaboradores (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs y colaboradores (1986) Proc. Natl. Acad Sci. USA 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (Townsend y colaboradores, patente estadounidense No. 5.563.055; Zhao y colaboradores, patente estadounidense No. 5.981.840), transferencia génica dirigida (Paszkowski y colaboradores (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración balística de partículas (ver, por ejemplo, Sanford y colaboradores, patente estadounidense No. 4.945.050; Tomes y colaboradores (1995) "Direct ADN Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); y McCabe y colaboradores (1988) Biotechnology 6:923-926). Ver también Weissinger y colaboradores (1988) Ann. Rev. Genet. 12:421-477; Sanford y colaboradores (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou y colaboradores (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe y colaboradores (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh y colaboradores (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta y colaboradores (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein y colaboradores (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein y colaboradores (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Tomes, patente estadounidense No. 5.240.855; Buising y colaboradores, patentes estadounidenses Nos. 5.322.783 y 5.324.646; Tomes y colaboradores (1995) "Direct ADN Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (maíz); Klein y colaboradores (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maize); Fromm y colaboradores (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren y colaboradores (1984) Nature (London) 311:763-764; Bytebier y colaboradores (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:5345-5349 (Liliácea); De Wet y colaboradores (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman y colaboradores (Longman, New York), páginas 197-209 (pollen); Kaeppler y colaboradores (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler y colaboradores (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por bigote de gato); D'Halluin y colaboradores (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li y colaboradores (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (rice); Osjoda y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz a través de Agrobacterium tumefaciens).

Alternativamente, se pueden introducir las secuencias de nucleótidos de la invención en un organismo y permitirle experimentar recombinación con regiones homólogas del genoma del organismo. Tales aproximaciones a la recombinación homóloga son bien conocidas por aquellos ordinariamente capacitados en el arte y se las puede utilizar para incorporar en forma estable secuencias de la invención en un organismo. Además, se pueden utilizar tales estrategias para introducir "mutaciones desactivadoras" en un gen específico de un organismo que comparte homología sustancial con las secuencias de la invención. Una mutación desactivadora es cualquier mutación en la secuencia de un gen que elimina o reduce substancialmente la función o el nivel del producto codificado por el gen. Los métodos que involucran la transformación de un organismo seguidos por recombinación homóloga para integrar en forma estable las secuencias de la invención en el genoma del organismo son abarcados por la invención. La invención está particularmente dirigida a los métodos donde se utilizan las secuencias de la invención para alterar el crecimiento de un organismo. Tales métodos incluyen el uso de las secuencias de la invención para interferir con la función o la síntesis de una P-glicoproteína que controla el crecimiento de un organismo.

Las células que han sido transformadas se pueden cultivar en plantas de acuerdo con formas convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas se pueden desarrollar luego, y se pueden polinizar ya sea con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, e identificar el híbrido resultante que tiene la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para garantizar que la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada se mantenga en forma estable y heredada y luego se cosechan las semillas para garantizar que se ha logrado la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada.

Se puede utilizar la presente invención para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero sin limitarse a, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuente de aceite de semilla, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucum), mijo común (Panicum miliaceum), mijo cola de zorra (Setaria italica), mijo africano (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), potata (Solanum tuberosum), cacahuete (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), patata dulce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus cosica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), marañón (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prumus amygdalus), remolachas dulces (Beta vulgaris), caña de aúcar (Saccharum spp.), avenas, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coníferas.

Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), fríjoles verdes (Phaseolus vulgaris), frójoles de media luna (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis), y melón almizcle (C. melo). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.). hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasamensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narciso (Narcissus spp.). Petunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), poinsettia (Euphorbia pulcherrima), y crisantemo. Las coníferas que se pueden emplear en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como el pino de incinso (Pinus taeda), pino laciniado (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino lodgepole (Pinus contorta), y pino Monterrey (Pinus radiata); abeto Douglas (Pseudotsuga menziesti); abeto Occidental (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea glauca); secoya (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como el abeto plateado (Abies amabilis) y abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros tales como el cedro rojo Occidental (Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). Preferiblemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivos (por ejemplo, arroz, maíz, alfalfa, girasol, crucífera, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.), más preferiblemente plantas de maíz, arroz y sorgo.

Se ofrecen los siguientes ejemplos a manera de ilustración y no en una forma limitante.

Ejemplo 1

Mapeo de la localización de br2 sobre el cromosoma 1L

Estudios genéticos previos revelaron que br2 se localizaba sobre el cromosoma 1L del maíz dentro de 0,1 cM de hm1. En una población F_{2} de 1500 plantas entre el probador mutante recombinante br2 (br2br2Hm1Hm1) y Pr (un maíz engendrado por endogamia homocigoto recesivo en el sitio hm1; Br2hm1), únicamente se encontró un recombinante (hm1hm1br2br2) entre br2 y hm1. Sin embargo, no se determinó la orientación de estos dos genes en relación uno con el otro. Para abordar el problema de si br2 está próximo o distante a hm1, la progenie del recombinante anterior y sus progenitores se hizo un genotipo RFLP utilizando sondas del gen hm1 así como dos marcadores RFLP, PIO200644 y PIO200044. Estos marcadores de ADN flanquean a hm1, con PIO200644 y PIO200044 mapeando 5 cM próximo y distante a hm1, respectivamente (Johal y colaboradores (1992) Science 258:985-987). El alelo PIO200044 del probador recombinante fue el mismo que el probador br2 original mientras que el hm1 y los alelos PIO200644 se habían recombinado, indicando que br2 se localiza entre hm1 y PIO200044.

Ejemplo 2

Marcación del Transposón y Clonación de br2

Para clonar al gen Br2 de tipo natural, se utilizó una aproximación de marcación dirigida (fijada como objetivo) en la cual se utilizó el Mutador de Robertson (Mu) como el mutágeno genético (Robertson (1978) Mutation Res. 51:21-28; Walbot (1992) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:49-82). Se hicieron cruces entre las hembras Br2/Br2 que contenían Mu y el probador mutante recombinante (descrito en el Ejemplo 1) que contenía al alelo de referencia br2 (br2-ref). Se plantaron un total de 90.000 plantas híbridas de la población F1 resultante en el campo que produjo 35 plantas enanas. Estos mutantes putativos br2 se propagaron por medio de cruzamiento con hembras B73 (una endogámica) así como por medio de un nuevo cruzamiento con el probador br2. El último conjunto de cruces, que esencialmente analizó el alelismo entre br2-raf y los nuevos alelos braquíticos mutantes, se realizó para evaluar cuál de los 35 nuevos mutantes era heredable y no causado por factores ambientales. La estatura braquítica de las plantas de maíz puede ser imitado por plantas a las que se les ha infligido un marchitamiento de Stewart, una enfermedad bacteriana causada por Erwinia stewartii. Los resultados obtenidos a partir del análisis de alelismo permitieron eventualmente la selección de 11 mutantes br2 genuinos, que fueron designados br2-1 hasta br2-11.

En un esfuerzo para promover estos mutantes potencialmente marcados con Mu por medio de un análisis de cosegregación, se hizo un genotipo de la progenie cruzada externamente de cada mutante con B73 con sondas de hm1 y de PIO200044. Esto ayudó en la identificación de plantas de cada progenie que heredaron al alelo mutante marcado. Unas pocas de estas plantas fueron cruzadas nuevamente con el probador br2, y resultó en la producción de poblaciones de cada mutante que segregaron 1:1 para plantas que contenían y que carecían del alelo mutante marcado. Ya que únicamente las plantas braquíticas de estas poblaciones conocían al alelo mutante marcado, este nuevo esquema de cruzamiento alivió la necesidad de utilizar marcadores moleculares para hacer seguimiento a la herencia de los alelos marcados.

Se utilizó un análisis de transferencia en gel de ADN para buscar elementos Mu que puedan haber causado estos alelos mutantes. Las plantas altas y braquíticas de cada familia se compararon entre sí sobre una transferencia de Southern hibridada con cada uno de los nueve elementos Mu (Bennetzen y colaboradores (1993) Crit. Rev. Plant Sci. 12:57-95). Este análisis resultó en la identificación de un fragmento de restricción que hibrida a Mu8 de cada uno de los dos mutantes, br2-5 y br2-6, que segregaron completamente con el alelo mutante en más de 80 plantas de la progenie. Mientras que el tamaño del fragmento Xhol que hibrida a Mu8 era de -7,5 kb en el alelo mutante br2-5, era de -9,0 kb en br2-6. Extrañamente, sin embargo, un fragmento de restricción Xhol de ~9,0 kb cosegregado con el alelo mutante de br2-6 también hibridó hasta una sonda específica Mu7. Sin embargo, después de la clonación, se reportó que tanto las sondas específicas Mu7 como Mu8 hibridaron hasta el mismo fragmento de restricción Xhol. El fragmento Xhol de 7,5 kb que hibridó hasta Mu8 en br2-5 fue también clonado. Ambos clones fueron posteriormente subclonados y parcialmente secuenciados.

La comparación de las secuencias reveló que tanto las secuencias terminales como los sitios Xhol de estos clones eran idénticas indicando que ellas se habían originado a partir de la misma región del genoma del maíz. Las comparaciones también revelaron que las regiones homólogas de Mu8 de ambos subclones eran idénticas, tanto en tamaño como en secuencia, indicando que la fuente de polimorfismo de longitud del fragmento de restricción era debida a una variación en otro sitio dentro de los clones. Análisis adicionales de la secuencia revelaron las fuentes del polimorfismo. En br2-6, se encontró una inserción de un elemento Mu7 de 2,1 kb localizado 510 pb secuencia abajo del extremo 5' del sitio Xhol (Figura 1). Ya que esta inserción está en el exón 1, aunque únicamente nueve pb de la unión exón/intrón, se espera que rompa la función del gen br2. En br2-5, se descubrió una nueva inserción en el intrón 4 (Figura 1). Esta inserción, que tiene características de un elemento trasladable, puede o no haber interferido con la función del gen.

La región homóloga de Mu8 de ambos clones que abarca a los nucleótidos 4569 a 5472 (880 pb) desde el extremo 5' coincidió con los nucleótidos 276 a 1163 de Mu8, y los dos mostraron una identidad de secuencia del 94%. No se encontraron, sin embargo, repeticiones terminales invertidas (TIR) de Mu para flanquear al ADN homólogo de Mu8 en cualquier clon, surgiendo preguntas relacionadas con la fuente o el origen de este ADN. Que no resultara de un evento inserción de Mu8 se hizo obvio cuando se llevó a cabo un análisis por BLAST con esta secuencia. La búsqueda de homología demostró claramente que la región homóloga de Mu8 del gen clonado es su parte genuina. Aparentemente, esta secuencia fue de alguna manera apropiada por un elemento Mu, que luego se recombinó para crear un elemento número 8 (Mu8) del sistema Mutador.

Para determinar si el gen br2 había sido clonado, o en vez de eso algún polimorfismo natural que estaba firmemente enlazado con br2, se utilizó una aproximación de genéticas inversas involucrando PCR que confía en la identificación de las inserciones de Mu en mutaciones adicionales de un gen candidato. Esta aproximación, que fue previamente utilizada para verificar la clonación de dos genes separados, lls1 (Gray y colaboradors, (1997) Cell 89:25-31) y Les22 (Hu y colaboradores (1998) Plant Cell 10:1095-1105), se basa en la premisa de que en mutaciones independientes, únicamente se pueden encontrar múltiples inserciones de Mu en la vecindad de un gen clonado, si las inserciones están casualmente involucradas en la generación de estas mutaciones (Walbot (1992) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:49-82).

Para ejecutar este experimento, se diseñaron dos iniciadores específicos para el gen, orientados en forma opuesta a partir de la región 5' de la inserción de Mu7 en br2-6. Esta región del gen fue dirigida ya que los elementos Mu tienden a insertarse en el extremo 5' de los genes (Bennetzen y colaboradores (1993) Crit. Rev. Plant Sci. 12:57-95). Cada iniciador fue utilizado en combinación con un iniciador específico para las TIR de Mu para amplificar ADN utilizando PCR de cada uno de los otros nueve mutantes de br2. Los productos de amplificación que hibridaron con una sonda específica para el gen a partir del extremo 5' fueron obtenidos del ADN de dos mutantes, br2-3 y br2-9. Estos productos PCR fueron clonados y secuenciados, y reveló que los elementos Mu se habían insertado en br2-3 y br2-9 en las posiciones de los nucleótidos 269 y 394, respectivamente, del sitio de la inserción de Mu7 en br2-6. De esta forma se identificaron tres inserciones que estaban dentro de los nucleótidos 400 de cada uno de ellos en tres mutantes independientes de br2. Estos resultados sugieren fuertemente que br2 había sido clonado. El hecho de que el fragmento de Xhol de 9,0 kb que hibrida a Mu7/Mu8 estuviera desaparecido en el progenitor de br2-6 soportó adicionalmente esta interpretación.

Una pieza adicional de evidencia para la clonación correcta de br2 provino del análisis molecular de dos revertantes, los cuales fueron aislados del alelo br2-ref. Estos revertantes fueron identificados durante un experimento realizado para generar un nuevo probador de maíz con cuatro marcadores genéticos recesivos, especialmente hm1, br2, hm2 (un duplicado de hm1, que le confiere a la planta adulta resistencia a C. carbonum raza 1; Multani y colaboradores (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1686-1691, y bk2 (plantas homocigotas recesivas para este gen que tienen tallos y hojas quebradizos; Coe y colaboradores (1988) Corn & Corn Improvement, G. F. Sprague (ed.), Madison, WI). De este modo, se marcaron estos revertantes del tallo con hm1, hm2 y bk2, todos los cuales son raros en el germoplasma del maíz. Se llevó a cabo un análisis de transferencias de Southern para buscar si estos revertantes habían sufrido cualquier polimorfismo del ADN en o cerca de la región clonada. El ADN de estos revertantes fue mapeado por restricción con un cierto número de enzimas y comparado con aquel del progenitor y una cierta cantidad de engendrados de maíz por endogamia, incluidos todos aquellos que son susceptibles a C. carbonum. Se detectó un RFLP único en ambos revertantes que estaban perdidos en sus progenitores así como en todos los engendrados de maíz por endogamia que fueron analizados en este experimento. Ya que este polimorfismo es idéntico en ambos revertantes, estos resultados indican que cualquiera de estos revertantes son el resultado del mismo evento molecular, o que se requiere de un evento molecular similar para la reversión funcional del alelo br2-ref. Es improbable que estos revertantes fueran el resultado de contaminación con polen, ya que ambos revertantes eran quebradizos y susceptibles a C. carbonum raza 1, y también poseían los mismos RFLP hm1 y hm2 que aquellos de sus progenitores. La naturaleza molecular exacta del(los) evento(s) que condujo(eron) a estos revertantes siguen siendo investigados, al igual que la naturaleza de la mutación en el alelo br2-ref.

Ejemplo 3

Identidad del Gen Br2 y de la proteína que él Codifica

Para determinar la naturaleza molecular de Br2, ambos clones Xhol fueron secuenciados completamente. Esto permitió la recopilación de un trecho aproximadamente de 7,0 kb de la región genómica del sitio de br2 que parece contener más del 90% de la región de codificación de Br2 (SEQ ID NO: 1). Cuando esta secuencia fue sometida a análisis por BLAST, reveló que la proteína predicha de br2 tiene una secuencia extensa y similitud estructural con las P-glicoproteínas codificadas por el gen del tipo de resistencia a múltiples drogas (MDR) (Gottesman y colaboradores (1995) Annu. Rev. Genet. 29:607-649; Borst y colaboradores (1997) Trends Genet. 13:217-222; Croop (1998) Methods Enzym. 292:101-116). Los productos de los genes del tipo MDR pertenecen a la familia de transportadores que contienen al casete de enlazamiento de ATP (ABC) que median la transposición transmembrana dirigida por la ATP de una gran variedad de sustratos (Gottesman y colaboradores (1995) Annu. Rev. Genet. 29:607-649; Higgins (1992)) Annu. Rev. Cell Biol. 8:67-113). Se observó una identidad de secuencia mayor al 67% entre br2 y la proteína predicha del gen que codifica para la P-glicoproteína de Arabidopsis, AtPGP1 (Dudler y colaboradores (1992) J. Biol. Chem. 267:5882-5888). AtPGP1, que fue el primer gen clonado de las plantas que codifica para la P-glicoproteína, fue aislado con base en su homología con el gen MDR1 humano, con el cual comparte un 41% de identidad (Dudler y colaboradores (1992) J. Biol. Chem. 267:5882-5888). Otros tres genes que codifican para la P-glicoproteína han sido clonados desde entonces a partir de Arabidopsis (Dudler y colaboradores (1998) Methods Enzym. 292:162-173, cebada (Davies y colaboradores (1997) Gene 199:195-202) y patata (Wang y colaboradores (1996) Plant Mol. Biol. 31:683-687). Sin embargo, todos estos genes fueron identificados molecularmente, y en ningún caso, incluido AtPGP1, se sabe cuál(es) puede(n) ser la(las) función(es) real(es) en la planta de estos genes. De este modo, BR2 es la primera P-glicoproteína de la planta donde existe una evidencia clara de su función. Además, BR2 es la primera P-glicoproteína de cualquier organismo que se sabe que está involucrada en controlar el crecimiento o desarrollo de un organismo.

BR2 puede estar también involucrado en las respuestas de defensa de la planta contra patógenos. Cuando crecen bajo condiciones de invernadero, los mutantes de br2 muestran una mayor incidencia de látigo de cochero, una condición necrótica de carácter enfermizo de la punta de crecimiento que imita la necrosis inducida por bacterias. La concurrencia de las P-glicoproteínas en defensa contra una toxina producida por una cepa de Pseudomonas aeruginosa que infecta tanto a plantas como animales ha sido recientemente demostrada (Mahajan-Miklos y colaboradores (1999) Cell 96:47-56).

En contraste con el gen AtPGP1 de Arabidopsis, que contiene 10 exones y 9 intrones, el gen Br2 de maíz contiene 5 exones y 4 intrones, aunque las ubicaciones y límites del exón/intrón de estos 4 intrones son idénticas a las de los correspondientes intrones del gen AtPGP1 de Arabidopsis. La organización estructural de los genes que codifican para la P-glicoproteína de la cebada y de la patata no ha sido aún elucidada. La SEQ ID NO: 2 representa al ADNc de Br2 de longitud completa que fue aislado de plantas de semillero B73 de diez días de edad en cuatro partes de superposición por medio de una combinación de RT-PCR y 3'-RACE.

Un análisis por BLAST de la secuencia genómica deBr2 (SEQ ID NO: 1) reveló que Br2 estaba más cercanamente relacionado a una secuencia de ARNm para una P-glicoproteína de patata (EMBL Acceso No. Y10099). Ignorando la región homóloga de Mu8 de Br2 (SEQ ID NO: 1), el trecho más largo de identidad de secuencia de nucleótidos fue de 29 nucleótidos con una secuencia de ARNm de una proteína de ratón resistente a múltiples drogas (GenBank, Acceso No. M14757).

Ejemplo 4

Transformación de Maíz por medio de Bombardeo de Partículas y Regeneración de Plantas Transgénicas

Los embriones inmaduros de maíz de plantas donantes de invernadero se bombardean con un plásmido que contiene una secuencia de nucleótidos de una P-glicoproteína de la invención operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión en una planta y el gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben y colaboradores (1988) Gene 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialaphos. Alternativamente, el gen marcador seleccionable es proveído sobre un plásmido separado. La transformación se lleva a cabo de la siguiente manera. Las recetas de los medios siguen a continuación.

Preparación de un Tejido Objetivo

Se descascaran las espigas y se esteriliza la superficie en blanqueador Clorox al 30% más detergente Micro al 0,5% durante 20 minutos, y se enjuaga dos veces con agua estéril. Se cortan los embriones inmaduros y se coloca el eje del embrión boca abajo (con el escudete hacia arriba), 25 embriones por placa, sobre medio 560Y durante 4 horas y luego se alinean dentro de la zona objetivo de 2,5 cm en preparación para el bombardeo.

Preparación de ADN

Se elabora un vector plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos de la invención que codifica para la P-glicoproteína, operativamente enlazada al promotor de la planta de interés. Este ADN del plásmido más el ADN del plásmido que contiene un marcador PAT seleccionable se precipitan sobre gránulos de tungsteno de 1,1 \mum (diámetro promedio) utilizando un procedimiento de precipitación en CaCl_{2}, de la siguiente forma:

100 \mul de partículas de tungsteno preparadas en agua

10 \mul de ADN (1\mug) en amortiguador Tris EDTA (1\mug de ADN total)

100 \mul de CaCl_{2} 2,5 M

10 \mul de espermidina

Cada reactivo se añade secuencialmente a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene sobre un vórtice para múltiple tubos. Se sónica brevemente la mezcla final y se le permite incubar bajo agitación constante con vórtice durante 10 minutos. Después del período de precipitación, se centrifugan brevemente los tubos, se remueve el líquido, se lava con 500 ml de etanol al 100%, y se centrifuga durante 30 segundos. Se remueve nuevamente el líquido y se añaden 105 \mul de etanol al 100% al gránulo final de la partícula de tungsteno. Para el bombardeo con pistola de partículas, se sonican brevemente las partículas de tungsteno/ADN y se salpican 10 \mul sobre el centro de cada portador macro y se le permite secarse aproximadamente durante 2 minutos antes del bombardeo.

Tratamiento con la Pistola de Partículas

Las placas con la muestra se bombardean a nivel #4 en una pistola de partículas #HE34-1 o #HE34-2. Todas las muestras reciben un disparo único a 650 PSI, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas/ADN preparado.

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Tratamiento Posterior

Después del bombardeo, se mantienen los embriones sobre medio 560Y durante 2 días, luego se los transfiere a un medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bialaphos, y se subcultiva cada 2 semanas. Aproximadamente después de 10 semanas de selección, los clones de callo resistente a la selección se transfieren a medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración somática del embrión (2-4 semanas), se transfieren los embriones somáticos bien desarrollados a medio para germinación y se transfieren a la habitación iluminada de cultivo. Aproximadamente 7-10 días después, se transfieren las plántulas en desarrollo a un medio libre de hormonas 272V, en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas están bien establecidas. Se transfieren luego las plantas a insertos en plataformas (equivalentes a materas de 2,5'') que contienen suelo para matera y se desarrollan durante 1 semana en una cámara de cultivo, posteriormente se desarrollan durante 1-2 semanas adicionales en el invernadero, luego se las transfiere a 600 materas clásicas (1,6 galones) y se desarrollan hasta la madurez. Se hace monitoreo a las plantas y se lleva la cuenta del fenotipo enano o de otro fenotipo asociado con la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para la P-glicoproteína de la invención.

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Bombardeo y Medio de Cultivo

El medio para bombardeo (560Y) contiene 4,9 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (100X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de clorhidrato de tiamina, 120,0 g/l de sucrosa, 1,0 mg/1 de 2,4-D, y 2,88 g/l de L-prolina (llevado a volumen con D-I H_{2}O después del ajuste a pH 5,8 con KOH); 2.0 g/l de Gelrite (añadido después de llevar a volumen con D-I H_{2}O); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (añadido después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente). El medio de selección (560R) contiene 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (100X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de clorhidrato de tiamina mg/l, 30,0 g/l sucrosa, y 2,0 mg/l de 2,4-D (llevado a volumen con D-I H_{2}O después del ajuste a pH 5,8 con KOH); 3.0 g/l de Gelrite (añadido después de llevar a volumen con D-I H_{2}O); y 0,85 mg/l de nitrato de plata y 3,0 mg/l de bialafos (ambos añadidos después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente).

El medio para regeneración de la planta (288J) contiene 4,3 g/l de sales de MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de una solución patrón de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de clorhidrato de tiamina, 0,10 g/l de clorhidrato de piridoxina, y 0,40 g/l de glicina llevado a volumen con D-I H_{2}O refinada) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l de mioinositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sucrosa, y 1,0 ml/l de ácido abscísico 0,1 mM (llevado a volumen con D-I H_{2}O refinada después de ajustar a pH 5,6); 3.0 g/l de Gelrite (añadido después de llevar a volumen con D-I H_{2}O); y 1.0 mg/l de ácido indolacético y 3,0 mg/l de bialafos (añadido después de esterilizar el medio y enfriar a 60ºC). El medio libre de hormona (272V) contiene 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solución patrón de vitaminas MS (0,100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de cloruro de tiamina, 0,10 g/l de clorhidrato de piridoxina, y 0,40 g/l de glicina llevado a volumen con D-I H_{2}O refinada), 0,1 g/l de mioinositol, y 40,0 g/l de sucrosa (llevado a volumen con D-I H_{2}O refinada después de ajustar el pH en 5,6); y 6 g/l de agar bacto (añadido después de llevar a volumen con D-I H_{2}O refinada), esterilizado y enfriado a 60ºC.

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Ejemplo 5

Transformación de Maíz Mediada por Agrobacterium y Regeneración de Plantas Transgénicas

Para la transformación de maíz mediada por Agrobacterium con una secuencia de nucleótidos que codifica para P-glicoproteína de la invención, se emplea preferiblemente el método de Zhao (patente estadounidense No. 5.981.840, y publicación de la patente PCT WO98/32326; el contenido de los cuales se incorpora aquí como referencia). En resumen, se aíslan los embriones inmaduros de maíz y se pone en contacto a los mismos con una suspensión de Agrobacterium, donde la bacteria es capaz de transferir la secuencia de nucleótidos que codifica para la P-glicoproteína de la invención al menos a una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa los embriones inmaduros se sumergen preferiblemente en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la inoculación. Se cultivan en conjunto los embriones durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2: etapa de cultivo conjunto). Se cultivan preferiblemente los embriones inmaduros sobre medio sólido después de la etapa de infección. Después de este período de cultivo conjunto se contempla una etapa opcional de "descanso". En esta etapa de descanso, se incuban los embriones en presencia de al menos un antibiótico conocido para inhibir el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para transformantes de la planta (etapa 3: etapa de descanso). Preferiblemente, se cultivan los embriones inmaduros sobre medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación del Agrobacterium y para la fase de descanso para las células infectadas. A continuación, se cultivan los embriones inoculados sobre medio que contiene un agente selectivo y se recupera el callo transformado en crecimiento (etapa 4: la etapa de selección). Preferiblemente, los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido con un agente selectivo resultando en el crecimiento selectivo de células transformadas. Se regenera luego el callo en las plantas (etapa 5: la etapa de regeneración), y preferiblemente se cultivan los callos desarrollados en medio selectivo sobre medio sólido para regenerar las plantas.

Aunque la invención anterior ha sido descrita con algún detalle por medio de la ilustración y ejemplo para propósitos de claridad en su comprensión, será obvio que ciertos cambios y modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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<110> Johal, Gurmukh S

\hskip1cm

Multani, Dilbag S

\hskip1cm

Briggs, Steven P

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<120> GENES Y MÉTODOS PARA MANIPULACIÓN DEL CRECIMIENTO

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 5718-81 (035718/205794)

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<140>

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<141>

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<150> 60/164,886

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<151> 1999-11-12

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<160> 3

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 8036

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Zea mays

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<400> 1

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1

2

3

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<210> 2

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<211> 4653

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<220>

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<221> CDS

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<222> (91)..(4272)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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100

4

5

6

7

8

9

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<210> 3

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<211> 1394

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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<400> 3

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101

10

11

12

13

Claims

1. Una molécula aislada de ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1;

(b): una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2;

en donde dichas condiciones estrictas comprenden la hibridación en una solución que contiene 50% de formamida, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC y un lavado en 0,1X SSC a 60ºC, y dicha secuencia de nucleótidos codifica a una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta.

2. Un casete de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta.

3. El casete de expresión de la reivindicación 2, en donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste de promotores preferidos del tejido, preferidos del tallo, constitutivos, químicamente regulables, y preferidos del patógeno.

4. Una planta transformada con y que tiene incorporado en forma estable en su genoma una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta.

5. La planta de la reivindicación 4, en donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste de promotores preferidos del tejido, preferidos del tallo, constitutivos, químicamente regulables, y preferidos del patógeno.

6. La planta de la reivindicación 4, en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a dicho promotor para la producción de transcritos antisentido.

7. La planta de la reivindicación 4, en donde dicha planta es una monocotiledónea.

8. La planta de la reivindicación 7, en donde dicha monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, arroz Basmati, sorgo, centeno, mijo y cebada.

9. La planta de la reivindicación 4, en donde dicha planta es una dicotiledónea.

10. La planta de la reivindicación 9, en donde dicha dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste de semillas de soja, girasoles, cártamos, alfalfa, Brassica sp., algodón, cacahuetes y árboles frutales.

11. Semillas transformada de cualquiera de las plantas de las reivindicaciones 4-10, dicha semilla teniendo establemente incorporado en su genoma una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta.

12. Un método para modificar el crecimiento de una planta, dicho método comprendiendo la transformación de una planta con una secuencia de nucleótidos que codifica a una P-glicoproteína, en donde dichas funciones de la P-glicoproteína para controlar el crecimiento de una planta, dicha secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha secuencia en dicha planta, en donde dicha secuencia de nucleótidos es como se definió en la reivindicación 1.

13. El método de la reivindicación 12, en donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste de promotores preferidos del tejido, preferidos del tallo, constitutivos, químicamente regulables, y preferidos del patógeno.

14. El método de la reivindicación 12, en donde la altura de dicha planta se reduce.

15. El método de la reivindicación 12, en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a dicho promotor para la producción de transcriptos antisentido.

16. Una célula de una planta transformada con y que tiene incorporado en forma estable en su genoma una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta.

17. Una proteína aislada que contiene un miembro seleccionado del grupo que consiste de:

(d): un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una identidad del 70% con la secuencia de aminoácidos de (a), en donde dicho polipéptido es una P-glicoproteína que controla el crecimiento de la planta.