ES2278386T3 - Proteina receptora, especifica para el epididimo, y su uso. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN NUEVAS PROTEINAS RECEPTORAS ESPECIFICAS DEL EPIDIDIMO DE MAMIFEROS Y UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE LAS CODIFICA. LA PROTEINA RECEPTORA DE LA INVENCION, COMO PROTEINA TRANSMEMBRANA DEL EPITELIO DEL EPIDIDIMO SE ENCUENTRA ESTRECHAMENTE RELACIONADA CON LA MADURACION DE LOS ESPERMATOZOIDES. POR ESTE MOTIVO ES ADECUADA PARA EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE LA INFERTILIDAD MASCULINA ASI COMO MEDIO ANTICONCEPTIVO. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A ANTICUERPOS FRENTE AL POLIPEPTIDO DE LA INVENCION ASI COMO SU UTILIZACION EN EL DIAGNOSTICO DE LA FERTILIDAD MASCULINA.

Description

Proteína receptora, específica para el epidídimo, y su uso.

El invento se refiere a una nueva proteína receptora transmembranal, específica para los epidídimos de mamíferos, a secuencias de ADN que codifican la proteína, y a ligandos específicos, así como a su utilización para la preparación de agentes destinados al diagnóstico de la infertilidad masculina y a la regulación de la maduración de espermatozoides.

En el momento actual, aproximadamente un 15% de todas las parejas en la República Federal Alemana (RFA) son involuntariamente estériles (es decir, no pueden tener niños), y su proporción está aumentando constantemente. Las causas de la esterilidad se encuentran a partes iguales en los varones y en las mujeres. Mientras que, sin embargo, las causas en las mujeres han sido ampliamente investigadas y son diagnosticables, en los varones solamente se han comprobado causas orgánicas en aproximadamente un 30% de los casos. Aproximadamente una tercera parte del restante 70% se puede atribuir a oligospermias de origen desconocido, mientras que las causas en los casos restantes todavía están confusas, de acuerdo con el estado actual de los conocimientos. En particular, en el caso de la infertilidad idiopática, en la que a pesar de haber un número suficiente de espermatozoides en el eyaculado no se efectúa ninguna fecundación del óvulo femenino (H.W.G. Backer y colaboradores (1986) Relative incidence of etiological disorders in male infertility in: Male Reproductive Dysfunction [Incidencia relativa de trastornos etiológicos en una infertilidad de varones. En: Disfunción reproductiva de varones] (coordinadores de edición R.J. Santen y R.S. Swerdloff), páginas 341 - 372 Marcel Dekker Inc., Nueva York), se supone que ha tenido lugar un trastorno de la maduración de espermatozoides en el epidídimo.

En el caso de la maduración de los espermatozoides, el epidídimo desempeña un cometido clave. Él consiste en los seres humanos en un único canal con una longitud de aproximadamente 5 m, que está enrollado a modo de meandros. Los espermatozoides, todavía inmaduros, que se han formado en el testículo, son transportados hasta el epidídimo y son sometidos a un proceso de maduración durante un paso que dura de 2 a 3 días. El medio especial del epidídimo procura que los espermatozoides allí encerrados permanezcan vitales durante largo tiempo y además de esto alcancen las especiales propiedades físicas, inmunológicas, así como bioquímicas, de los espermatozoides capaces de fecundación.

Por consiguiente hay que partir del hecho de que la esterilidad masculina, y en particular la infertilidad idiopática, se deben en numerosos casos a trastornos de los procesos de maduración que transcurren en el epidídimo.

Aun cuando la estructura anatómica fina del epidídimo humano ha sido muy bien descrita en términos macroscópicos, microscópicos y microscópicos electrónicos (compárese la cita de A.F. Holstein Morphologische Studien am Nebenhoden des Menschen, Zwanglose Abhandlungen aus dem Gebiet der normalen und pathologischen Anatomie [Estudios morfológicos en el epidídimo de un ser humano, informes sin compromiso procedentes del sector de la anatomía normal y patológica, 20, 1-91 (1969)), sus productos proteínicos, con pocas excepciones (compárese por ejemplo la cita de Tezon y colaboradores, Immunochemical localization of secretory antigens in the human epididymis and their association with spermatozoa, Biology of Reproduction [Localización inmunoquímica de antígenos secretores en el epidídimo humano y su asociación con espermatozoos, Biología de la Reproducción], 32, 591-597 (1985)), se han investigado poco. Casi todos los conocimientos adquiridos acerca de este órgano proceden de trabajos con ratas, ratones, hámsteres, berracos, toros u ocasionalmente monos, siendo grandes las diferencias específicas para cada animal, tal como es sabido.

Los conocimientos adquiridos con diferentes especies de animales acerca de la maduración de los espermatozoides durante el paso a través del epidídimo, se pueden recopilar de la siguiente manera (compárese la cita de T.G. Cooper The Epididymis. Sperm Maturation and Fertilisation [El epidídimo, la maduración y fertilización de los espermatozoides], editorial Springer, Berlín, (1986)):

(a)

Desarrollo de un movimiento de avance dirigido y capacitación para la hiperactivación de los espermatozoides,

(b)

Evitación de una capacitación prematura, es decir la predisposición a llevar a cabo la reacción acrosomal, desempeñando un cometido regulador ciertos factores de descapacitación, en cuyos casos se trata presumiblemente de polipéptidos epididimales.

(c)

Modificación de los antígenos superficiales de los espermatozoides, con el fin de favorecer la fijación entre los espermatozoides y el óvulo.

(d)

Modificación de la membrana de los espermatozoides, con el fin de hacer posible la fusión con el óvulo.

El suceso metabólico en el epidídimo, que desencadena estos procesos, está ampliamente sin explicar, incluso en los casos de los animales investigados. Sin embargo, con ayuda de unas electroforesis en geles se pudo mostrar que, en el epidídimo, algunos polipéptidos se agregan al líquido seminal que procede de la Rete testis (red testicular). Dentro de éstos, están presentes en el caso de ratas los polipéptidos (a) hasta (e) de Cooper (véase cita anterior, Tabla 20), en los que se contienen la denominada glicoproteína epididimal ácida (AEG, de "acidic epididymal glycoprotein" (Lea y colaboradores, (1978)) y respectivamente los polipéptidos B hasta E de Brooks y colaboradores (D. E. Brooks y J. Higgins, Characterization and androgen-dependence of proteins associated wiht luminal fluid and spermatozoa in the rat epididymis, Journal of Reproduction and Fertility [Caracterización y dependencia con respecto de los andrógenos de las proteínas asociadas con el fluido luminar y los espermatozoos en el epidídimo de ratas, Revista de Reproducción y Fertilidad], 59, 363-375, (1980)). Los resultados de estos modelos apuntan a que la formación de estos polipéptidos se encuentra bajo la acción de andrógenos.

Los conocimientos adquiridos a partir de experimentos con animales, no se pueden transferir, sin embargo, a los seres humanos, a causa de la alta especificidad para tejidos y especies. Por ejemplo, los polipéptidos epididimales esenciales en los casos de ratas o los ARNm's (ácidos ribonucleicos mensajeros) que las codifican, no se encuentran en ningún otro tejido y, dejando aparte a los ratones, en ninguna otra especie (D.E. Brooks y colaboradores, Europ. J. Biochem., 161, 13-18 (1986); J. Biolog. Chem. 261, 4.956-4.981 (1986)).

A partir del documento de solicitud de patente europea EP-A-0.440.321 se conocen 5 polipéptidos específicos del epidídimo humano, así como secuencias de nucleótidos que codifican estos polipéptidos, los cuales se encuentran en una estrecha relación con la maduración de los espermatozoides en el epidídimo. Estas secuencias de nucleótidos, así como los correspondientes productos de expresión, como también los anticuerpos dirigidos contra ellos, son apropiados para el diagnóstico y para la utilización en el tratamiento de la infertilidad masculina.

La misión, que constituye el fundamento del presente invento, consiste, por lo tanto, en la puesta a disposición de otros agentes, con cuya ayuda se puedan diagnosticar, y eventualmente curar terapéuticamente, los trastornos del metabolismo proteico en el epidídimo de seres humanos -y en particular la infertilidad masculina-.

Para resolver el problema planteado por esta misión, se proponen la proteína receptora, específica para el epidídimo (NSRP de Nebenhoden Spezifische Rezeptor Protein), conforme al invento, según la SEQ ID NO 2, así como secuencias de ADN que codifican la NSRP conforme al invento, en particular las que están de acuerdo con SEQ ID NO 1, y secuencias de ADN derivadas de ésta, así como, tomando en consideración la degeneración del código genético, secuencias de ADN que coinciden con estas secuencias de ADN.

El invento incluye además secuencias homólogas de aminoácidos y correspondientes secuencias de ADN, con un grado de homología de por lo menos un 90%. Finalmente, están incluidas conforme al invento, y son apropiadas en particular como sondas, unas secuencias de nucleótidos, que se hibridan con las precedentemente mencionadas en las condiciones seguidamente definidas.

El aislamiento y la identificación de proteínas receptoras específicas para el epidídimo, que están participando en el suministro del medio epididimal arriba descrito, de acuerdo con procedimientos convencionales, no es posible a causa de las pequeñas cantidades del tejido que está a disposición.

Dentro del marco del presente invento, se ha conseguido ahora por primera vez detectar y caracterizar una proteína receptora transmembranal específica para el epidídimo de mamíferos, y hacer posible su producción mediante procedimientos recombinantes o síntesis químicas.

Para la identificación de la proteína receptora conforme al invento, se organizó en primer lugar una biblioteca de ADNc (ácido desoxirribonucleico cromosomal) a partir de un ARNm epididimal en Lambda gt11 (de Clontech, California), seguidamente los recombinantes específicos para el epidídimo se seleccionaron en una sucesión de etapas diferenciales de hibridación (compárense las Figuras 1 y 3 a 5), y a continuación se subclonaron y caracterizaron en el plásmido bacteriano pBs (de Stratagene, California, EE.UU.).

El escrutinio diferencial tenía como objetivo aislar clones de ARNm's, que están presentes en el tejido del epidídimo, pero no lo están en el tejido de otros órganos distintos y afines en cuanto a su función. En el caso del procedimiento empleado conforme al invento sirvió como material comparativo en la primera etapa un tejido de testículo humano. Puesto que algunas de las muestras de tejidos, que se utilizaron como material de partida, procedían de varones orquiectomizados, que habían sido tratados con diferentes medicamentos, se comprobó en primer lugar si, y en qué extensión, ejerce influencia la medicación sobre el respectivo modelo de polipéptido. Sin embargo, en 7 pacientes de diferentes edades y con diferente medicación se pudo mostrar (compárense el Ejemplo 2 y las Figuras 2a hasta c), que los modelos son influidos sólo de una manera insignificante mediante una precedente administración de medicamentos, y que también son pequeñas las desviaciones individuales.

Como se representa esquemáticamente en la Figura 1, el escrutinio se efectúo conforme al invento en una etapa primaria y en otra etapa secundaria, aislándose en la etapa primaria, mediante hibridación cruzada con un ARNm de testículo, los clones potencialmente específicos para el epidídimo, y éstos se seleccionaron adicionalmente en la etapa secundaria mediante hibridación cruzada con un ARNm procedente del cerebro y del hígado (compárense el Ejemplo 3 y las Figuras 3 y 4).

Mediante subsiguiente análisis de transferencia de borrón Northern frente al ARNm total procedente de testículos y de deciduas humanas, se pudo concentrar adicionalmente el número de los clones que entraban en consideración y finalmente se pudo asociar a seis familias independientes de ADNc (compárense el Ejemplo 3 y la Figura 5). A partir de una de estas familias de ADNc se aisló el clon de ADNc según la SEQ ID NO 1, que codifica la proteína receptora conforme al invento.

Los resultados obtenidos conforme al invento muestran que el ARNm que constituye el fundamento de este clon no es sintetizado en otros tejidos humanos (compárese la Figura 6); se trata, por consiguiente, de una molécula específica para el epidídimo. Las Figuras 6 y 7 muestran los autorradiogramas que en cada caso constituyen el fundamento.

La secuencia de nucleótidos, así como la correspondiente secuencia de aminoácidos, del clon de ADNc conforme al invento, fueron analizadas tal como se indica en el Ejemplo 7. El resultado está reproducido en SEQ ID NO 1.

La especificidad de este clon, y por consiguiente del correspondiente producto de expresión, se establece a partir de su hibridación exclusiva según Northern con un ARN extraído a partir de un epidídimo humano, que no se pudo detectar mediante hibridación cruzada en ningún otro tejido humano investigado, incluyendo a los órganos cerebro e hígado. La especificidad para tejidos se confirmó además mediante el recurso de que una sonda génica homóloga, producida mediando aplicación de la tecnología de PCR (de Polymerase Chain Reaction = reacción en cadena de la polimerasa) procedente de una rata, se hibridaba asimismo de una manera exclusiva con un ARN procedente del tejido epididimal, pero no con un ARN de otro tejido distinto de esta especie de animal (compárese la Figura 7).

Una secuenciación total de una serie de clones homólogos de ADNc, que se habían aislado a partir de dos bibliotecas de ADNc de epidídimos humanos o respectivamente por aplicación del procedimiento 5'RACE (M.A. Frohman, RACE: Rapid Amplification of cDNA ends. En: Protocols: A Guide to Methods and Applications [RACE: amplificación rápida de extremos de ADNc, en: protocolos de PCR: una guía de métodos y aplicaciones], Academic Press Inc., páginas 28 - 38 (1990)), dio como resultado un transcrito génico uniforme según la SEQ ID NO 1 con una longitud de 4.665 nucleótidos, que se corresponde con la longitud del ARNm, que se había determinado mediante una hibridación de Northern. Esta secuencia comprende un cuadro de lectura completo, que codifica un polipéptido de 1.038 aminoácidos.

Se analizó la homología de las secuencias de aminoácidos y de ADN conformes al invento (SEQ ID NO 1 y 2) con las secuencias almacenadas en diferentes Bancos de Datos internacionales (base de datos de NIH-Genbank, EMBL, PIR). En este contexto se mostró que existía la máxima homología encontrada frente a la "superfamilia de secretinas/VIP" de receptores acoplados a la proteína G (W.C. Probst y colaboradores, Sequence Alignment of G-Protein Coupled Receptor Superfamily, DNA and Cell Biology [Alineación de secuencias de la superfamilia de receptores acoplados a la proteína G, ADN y biología celular], 11, páginas 1-20 (1992)), y que ésta era de un 25%. Se trata por consiguiente de un receptor hasta ahora desconocido, cuyo extremo terminal de N largo apunta a la existencia de un dominio extracelular, que es comparable con el de receptores de glicoproteínas, es decir, que se trata de un nuevo receptor para un gran ligando de glicoproteína, que procede de la secreción testicular. Con ayuda de un análisis de la hidrofobia (Ej. 7) se mostraron siete regiones hidrófobas claramente definidas, que se pueden designar como dominios transmembranales (compárese la Figura 8a). La estructura de la proteína conforme al invento caracteriza a ésta como un receptor situado en membranas, que se ha de asociar con la familia de genes de los receptores acoplados a la proteína G (véase más arriba). Ella posee el dominio de fijación a la proteína G, que es típico para este conjunto de proteínas, con cuya ayuda se transducen informaciones a través del receptor y se transmiten ulteriormente a través de proteínas G al interior de células (L. Bimbaumer, J. Abramowitz y A.M. Brown, Receptor-effector coupling by G proteins [Acoplamiento de un receptor y un efector por proteínas G] Biochem. Biophys. Act. 1031, 163 - 224 (1990).

La proteína receptora conforme al invento se presenta en el epidídimo en una alta abundancia (el ARNm constituye aproximadamente un 0,01% de la biblioteca de ADNc) y unos ensayos de hibridación in situ localizaron al ARNm en las células epiteliales, que revisten al Ductus epididymidis (conducto del epidídimo).

Además, se trata de una molécula altamente conservada dentro de las especies de mamíferos, puesto que en los casos de las especies de mamíferos investigadas hasta ahora se había encontrado una homología de los productos de expresión de aproximadamente un 90%, a igualdad de especificidad para tejidos.

Las secuencias de nucleótidos, que codifican a la nueva proteína receptora conforme al invento, se pueden transferir, de acuerdo con procedimientos habituales, a través de vectores apropiados, a células anfitrionas pro-o eucarióticas y se pueden expresar allí como una proteína.

Son apropiadas, y están incluidas, conforme al invento, todas las secuencias de ADN que, después de una transformación de células anfitrionas pro- y/o eucarióticas apropiadas. garantizan la obtención de ácidos nucleicos para la utilización como agentes de diagnóstico y/o la expresión de proteínas o polipéptidos. Estas secuencias en forma mono- o bicatenaria comprenden en particular:

a)

La secuencia de nucleótidos indicada bajo la SEQ ID NO 1 en el protocolo de secuencias, la secuencia allí indicada de los nucleótidos 1 a 3.114, secuencias homólogas con respecto a las secuencias antes mencionadas, con un grado de homología de por lo menos un 90%, o secuencias complementarias;

b)

Secuencias de nucleótidos que se hibridan con la región codificadora de proteínas de la secuencia de nucleótidos indicada en a), por ejemplo en las condiciones de hibridación que se indican en los Ejemplos 3 ó 4;

c)

Secuencias de nucleótidos que, con excepción de las desviaciones causadas por la degeneración del código genético, se hibridan con las secuencias mencionadas dentro a) y/o b).

Como apropiados vectores para células anfitrionas procarióticas sirven por ejemplo plásmidos de la serie de pET (Rosenburg y colaboradores, "Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA Polymerase" [Vectores para la expresión selectiva de ADN's clonados por la polimerasa de ARN T7], Gene, 56, páginas 125-135 (1987), de la serie pGEX (de Pharmacia, Freiburg), de la serie pRIT (de Pharmacia Freiburg), y de la serie pH6EX3 (Berthold y colaboradores "Purification of Recombinant Antigenic Epitopes of the Human 68-kDa (U1) Ribonucleoprotein Antigen Using the Expression System pH6EX3 Followed by Metal Chelating Affinity Chromatography, Protein Expression and Purification [Purificación de epítopos antigénicos recombinantes del antígeno de ribonucleoproteína de 68-kDa (U1) humano usando el sistema de expresión pH6EX3 seguido por cromatografía de afinidad quelante de metales", Expresión y purificación de proteínas], 3, páginas 50-56 (1992). Ejemplos de células anfitrionas procarióticas son las usuales cepas de laboratorio de Escherichia coli K12 así como las cepas BL21 (DE3) y LE392.

Ejemplos de apropiados sistemas de vectores para células anfitrionas eucarióticas son, en el caso de células de mamíferos, virus SV40, poliomavirus, adenovirus, diferentes retrovirus, papilomavirus (P.W.J. Rigby, "Expression of cloned genes in eucaryotic cells using vector systems derived from viral replicons", Genetic Engineering ["Expresión de genes clonados en células eucarióticas usando sistemas de vectores derivados de replicones víricos" Ingeniería Genética], tomo 3, páginas 84-141 (1982)) así como Vaccinia - virus (Mackett y colaboradores "The construction and characterization of Vaccinia virus recombinants expressing foreign genes" DNA Cloning ["La construcción y caracterización de genes ajenos que expresan recombinantes de Vaccinia virus" Clonación de ADN], tomo II (1985), IRL Press, Oxford) y derivados de los mismos, así como los plásmidos, que tienen partes de genes víricos (p.ej. el pSV2) y se pueden emplear como "vectores de lanzadera" (= "Shuttle Vektoren") (P.W.J Rigby, véase cita anterior). Como vectores para células de insectos entran en consideración, por ejemplo, baculovirus de pJVETL (de Invitrogen, San Diego California, EE.UU), mientras que para células de levadura se pueden utilizar, p.ej., el pJP31, los plásmidos YEp e YIp (Carter y colaboradores "Expression and secretion of foreing genes in Yeast", DNA Cloning ``Expresión y secreción de genes ajenos en una levadura, Clonación de ADN], tomo III (1987), IRL Press, Oxford).

Apropiadas células de mamíferos son p.ej. células COS, células CHO, células AtT20 y células N1H3T3 (Rigby, véase cita anterior, Mackett y colaboradores, véase cita anterior), mientras que apropiadas células de insectos son p.ej. las Sf9, Sf21 y TN5 (de Invitrogen, San Diego, California, EE.UU). Apropiadas células de levadura son p.ej. las X4003-5B (Carter, véase cita anterior).

Además, la proteína receptora conforme al invento se puede sintetizar químicamente de acuerdo con procedimientos conocidos (J.M. Stewart, "Synthesis and use of neuropeptides" Neuroendocrine Peptide Metodology ["Síntesis y uso de neuropéptidos" Metodología de Péptidos Neuroendocrinos], coordinador de edición P.M. Conn, Academic Press, Nueva York, páginas 815-844 (1989)). Lo mismo es válido para polipéptidos o epítopos de péptidos con la misma inmunogenicidad, que son codificados por fragmentos o por secuencias singénicas de la secuencia de ADN conforme al invento (SEQ ID NO 1).

Los polipéptidos y respectivamente las proteínas conformes al invento, las secuencias de nucleótidos que codifican a éstas o éstos, incluyendo a sus secuencias complementarias, así como los anticuerpos producidos sobre la base de los polipéptidos y las proteínas, ofrecen por primera vez la posibilidad de diagnosticar trastornos en el metabolismo proteico del epitelio epididimal y eventualmente de curarlos terapéuticamente o respectivamente poner a disposición nuevos agentes contraceptivos.

Así, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos arriba señaladas pueden ser provistas de marcadores y ser utilizadas como sondas para la hibridación in situ en el diagnóstico de tejidos de muestras de biopsias o secciones delgadas, con el fin de determinar el estado fisiológico del tejido en lo que se refiere a la presencia y a la concentración de las proteínas receptoras conformes al invento, y compararlo con valores patrones.

Anticuerpos policlonales y monoclonales destinados a la utilización en procedimientos inmunológicos de detección, se pueden producir de una manera conocida con ayuda del polipéptido muy puro conforme al invento. Tales anticuerpos se pueden producir sobre la base de la proteína receptora completa (compárense los Ejemplos 8, 9).

Los anticuerpos pueden estar marcados y pueden servir para la detección in vitro o in vivo de la proteína receptora conforme al invento.

La proteína receptora conforme al invento puede servir además, en una forma marcada o no marcada, como antígenos para la identificación de autoanticuerpos en los sueros de varones infértiles. Esta posibilidad presenta una importancia especial, puesto que se supone que la infertilidad ha de ser atribuida, en una gran parte de los casos, a la presencia de autoanticuerpos contra componentes esenciales del sistema de procreación y reproducción. Los métodos de ensayo, que hasta ahora están a disposición, miden sin embargo solamente anticuerpos, que están dirigidos contra algunos antígenos superficiales de espermatozoides, teniendo que estar presente un título suficientemente alto de los anticuerpos, con el fin de permitir efectuarse la aglutinación de los espermatozoides. Se supone, sin embargo, que los anticuerpos pueden estar presentes en unos títulos muchísimo más bajos y pueden causar una infertilidad. Éstos se pueden determinar como antígenos con la proteína receptora pura, preparada conforme al invento.

Partiendo de la secuencia de aminoácidos, que se divulga conforme al invento, se recomiendan dos diferentes procedimientos en relación con la obtención de antígenos para la producción de anticuerpos.

Por una parte, con ayuda de un ordenador, se puede escoger una región potencialmente inmunogénica de la secuencia proteica interesante, la cual, por una parte, es relativamente hidrófila y por consiguiente está situada en el lado exterior de la molécula de proteína, pero, por otra parte, no es perturbada en su conformación estérea mediante la formación de dobles puentes de cisteína o posibles sitios de glicosilación.

Esta región de péptido es sintetizada a continuación eventualmente junto con aminoácidos flanqueadores, seguidamente es acoplada con sustancias de soporte y es empleada como inmunógeno para la inducción de anticuerpos (compárese el Ejemplo 9).

Alternativamente, se puede cambiar de clon (es decir, transclonar) por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido interesante, en un apropiado vector de plásmido de expresión. Después de una subsiguiente transformación en el seno de apropiadas bacterias, estos vectores permiten una expresión inducible del polipéptido codificado. La proteína bacteriógena, preparada de esta manera, se puede utilizar, después de una purificación a partir del extracto bacteriano, directamente como antígeno para una inmunización destinada a la inducción de anticuerpos (compárese el Ejemplo 8).

Los anticuerpos pueden ser provistos de un marcador detectable, tal como p.ej. una molécula fluorescente (fluorófora) y se puede emplear, por ejemplo, en el caso de muestras de tejidos, con el fin de determinar, con ayuda de la inmunofluorescencia, la presencia de la proteína receptora específica para el epidídimo en el epitelio epidi-
dimal.

La identificación y la caracterización de la proteína receptora conforme al invento como una molécula mediadora altamente específica, que está presente exclusivamente en las células del epitelio epididimal de mamíferos y que está en situación de transmitir informaciones acerca de la regulación de la función celular dentro de las células del epitelio, la convierten en un candidato extremadamente interesante para el diagnóstico y eventualmente para el influjo sobre la fisiología antes mencionada del epitelio epididimal. Mediante un influjo positivo deliberado, conseguido de esta manera, se puede mejorar el proceso de maduración de espermatozoides en el epidídimo por una vía terapéutica, administrando como medicamento, por ejemplo, el ligando que falta en el individuo que ha de ser tratado, o que se ha formado en una cantidad insuficiente. Por otra parte, un influjo negativo sobre el epitelio puede conducir a un empeoramiento de la maduración de espermatozoides y por consiguiente a la puesta a disposición de nuevos agentes contraceptivos para los varones. Para esta finalidad, es apropiado por ejemplo un ligando artificial, que ciertamente se fija firmemente a la proteína receptora conforme al invento, pero no provoca ninguna transferencia o respectivamente transmisión de señales. Además, se pueden emplear anticuerpos dirigidos contra la proteína receptora conforme al invento, a fin de impedir al o a los ligando(s) específico(s) para la proteína receptora, que se fije(n) por la vía de un desplazamiento competitivo, y por consiguiente impedir que participe(n) en el desencadenamiento de
señales.

Mediante aplicación de determinados procedimientos, tales como p.ej. la visualización (display) de fagos y la visualización de péptidos (J.K. Scott y G.P. Smith, Searching for peptide ligand with an epitope library [Investigación en cuanto a un ligando de péptidos con una biblioteca de epítopos], Science 249, páginas 386-390 (1990); J.J. Devlin y colaboradores, Random peptide libraries; a source of specific protein binding molecules [Bibliotecas aleatorias de péptidos, una fuente de específicas moléculas que se fijan a proteínas], Science 249, páginas 404-406 (1990)), biotecnología evolutiva (M. Eigen, Selforganization of matter and the evolution of biological macromolecules, Die Naturwissenschaften [Autoorganización de la materia y la evolución de macromoléculas biológicas, Las Ciencias Naturales], 58, páginas 465-523 (1971); M. Eigen, Automated molecular evolution [Evolución molecular automática], Max-Planck-Institut f. Biophysikalische Chemie (1991), es posible sin ninguna dificultad para un experto en la especialidad identificar ligandos artificiales, que poseen la capacidad de fijarse específicamente y con alta afinidad a una de tales proteínas receptoras, y actuar ya sea de manera agonista o antagonista sobre su capacidad para la transmisión de señales (Ej. 11). Por esta vía se pueden poner a disposición unas moléculas, mediante las cuales se puede influir positivamente (de manera terapéutica) o negativamente (de manera contraceptiva) en su fisiología sobre las células, que expresan a la proteína receptora.

El invento se explica seguidamente con detalle con ayuda de Ejemplos.

Ejemplo 1 Preparado de ARN

El ARN total fue extraído de acuerdo con el procedimiento de J.M. Chirgwin y colaboradores, Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease, Biochemistry [Aislamiento de un ácido ribonucleico biológicamente activo a partir de fuentes enriquecidas en cuanto a ribonucleasa, Bioquímica], 18, 5294, (1979), a partir de los tejidos congelados de testículos y epidídimos humanos que se habían extraído mediante una orquiectomía de varones con carcinoma de próstata en las edades de 58 y 74 años, mediando empleo de isotiocianato de guanidina, y a continuación se habían purificado mediante una centrifugación con un gradiente de densidades de cloruro de cesio. Mediante utilización de una columna de oligo(dT)-celulosa se pudo enriquecer por cromatografía de afinidad un ARN poli(A)+, tal como ha sido descrito por H. Aviv & P. Leder, Purification of biologically active globin messenger RNA by chromatography on oligothymidylic acid-cellulose [Purificación de un ARN mensajero de globina biológicamente activa mediante cromatografía sobre celulosa - ácido oligotimidílico], Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 1.408-1.412, (1972). Las muestras de ARN fueron precipitadas con etanol y, después de volverlas a suspender en agua estéril, fueron conservadas a -80ºC en una concentración de 1 \mug/\mul.

Ejemplo 2 Traducción y caracterización in vitro de los productos mediante una electroforesis en gel bidimensional

De 0,5 a 1 \mug del ARN poli(A)+ de epidídimos y testículos del Ejemplo 1, se tradujeron in vitro en cada caso en un sistema exento de células de un material lisado de reticulocitos, procedente de conejos (New England Nuclear (NEN), Dreieich, RFA). La síntesis se llevó a cabo en presencia de (^{35}S)-metionina (actividad específica > 1.000 Ci/mmol). Los resultantes productos proteicos fueron separados a continuación por electroforesis en un gel bidimensional (compárese la cita de P.H. O'Farrel, High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins [Electroforesis bidimensional con alta resolución de proteínas], J. Biol. Chem., 250, 4.007-4021 (1975)). Para la primera dimensión se aplicó sobre el gel en cada caso una cantidad de 350.000 cpm de las tandas de traducción marcadas con (^{35}S)-metionina y se enfocaron isoeléctricamente con una tensión eléctrica aplicada de 10.000 V.h. El gradiente de pH estaba situado entre 4,0 y 7,5. La separación de los polipéptidos según sus pesos moleculares, se llevó a cabo en la segunda dimensión dentro de un gradiente lineal de 7,5 -15% de acrilamida (compárese la cita de D.M. Neville & H. Glossman, Molecular weight determination of membrane protein and glycoprotein subunits by discontinous gel electrophoresis in dodecylsulfate [Determinación de los pesos moleculares de subunidades de proteínas y glicoproteínas de membranas mediante una electroforesis discontinua en gel en dodecilsulfato], Meth. Enzym. 32, 92-102, (1974)). Para la estimación de los pesos moleculares, se aplicó en la segunda dimensión un marcador de proteínas, marcado con ^{14}C (Amersham, GB). A continuación, el gel fue fluorografiado con ayuda de la película autorradiográfica Kodak X-AR5 (compárese la cita de W.M. Bonner & R.A. Laskey, A film detection method for Tritium-labelled proteine and nucleic acids in polyacrylamide gels [Un método de detección en película para proteínas y ácidos nucleicos que se han marcado con litio en geles de poli(acrilamida)] Europ. J. Biochem, 46, 83-88 (1974)). El tiempo de exposición fue de 8 días. Los resultados están reproducidos en la Figura 2.

La Figura 2, que representa los resultados, muestra el modelo de los productos de traducción sintetizados sin células, que se derivan de un ARN poli(A)+, específico para el epidídimo o respectivamente para el testículo.

En particular:

La Figura 2a muestra un tejido de epidídimo de un paciente de orquiectomía con una edad de 74 años, tratado con acetato de ciproterona.

La Figura 2b muestra un tejido de epidídimo de un paciente de orquiectomía con una edad de 58 años, no tratado con medicamentos.

La Figura 2c un tejido de testículo del mismo paciente no tratado con medicamentos (véase la Figura 2b).

Los productos de traducción, específicos para el epidídimo, cuyas bandas correspondientes no aparecen en la Figura 2c (productos de traducción de ARNm's procedentes de testículos), son caracterizados mediante pequeñas flechas (véase la Figura 2b).

Una modificación de la expresión en el tejido de epidídimo mediante un precedente tratamiento con antiandrógenos, la muestra una comparación de las Figuras 2a y 2b. Unas bandas, que son reducidas en la Figura 2a en comparación con la Figura 2b, fueron marcadas por grandes flechas. Los pesos moleculares del marcador de proteínas se indican en kilodalton. Se caracterizan en cada caso productos similares a actina (A) y tubulina (T).

Ejemplo 3 Organización de la biblioteca global de ADNc y elección de clones potencialmente específicos

La cultivación, la manipulación y la conservación de bacterias y bacteriófagos, así como el empleo de técnicas de ADN recombinantes, se efectuaron de acuerdo con los datos de T. Maniatis y Colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y., (1982).

a)

Para la organización de la biblioteca de ADNc, se empleó un ARN poli(A)+ procedente del tejido de epidídimo de un paciente no tratado con medicamentos (en lo que se refiere al modelo de los productos de traducción in vitro, compárese la Figura 2b). 20 \mug de un ARN poli(A)+ de acuerdo con el Ejemplo 1 se transcribieron inversamente, mediando utilización de un oligo(dT) como cebador (compárese la cita de U. Gubler y B.J. Hoffmann, A simple and very efficient method for generating cDNA libraries, Gene [Un método simple y muy eficiente para generar bibliotecas de ADNc, Genes], 15, 263-269 (1983)).

Las construcciones artificiales bicatenarias de ADNc fueron ligadas por ambos lados con engarzadores de EcoRI y a continuación fueron introducidas en el sitio de clonación con EcoRI del bacteriófago Lambda gt11 (de Clontech, California).

Para el descubrimiento de clones de longitud completa, se organizó una biblioteca adicional de ADNc específico para el epidídimo, en lo esencial de acuerdo con el procedimiento expuesto, pero con la diferencia de que las construcciones artificiales de ADNc habían sido clonadas unidireccionalmente. Esto se efectuó ligando el respectivo extremo de 5' con un engarzador EcoRI y el respectivo extremo de 3' con un engarzador XhoI, e introduciendo la respectiva construcción artificial seguidamente en el bacteriófago Lambda Uni-ZAP (de Stratagene, La Jolla, California).

Bacterias de las cepas Y 1090 y XL-1 Blue de E. coli se cultivaron hasta la fase logarítmica, se transfirieron a agarosa blanda y se extendieron en placas juntamente con la biblioteca de Lambda no amplificada, en una densidad de fagos de 500 hasta 1.000 pfu (de plate forming units = unidades de formación de placas) por cada cápsula de Petri (de 15 cm) y se incubaron durante 8 horas a 42ºC y respectivamente a 37ºC.

Para el escrutinio diferencial, las calvas de cada una de las cápsulas se sembraron en placas de réplicas seguidamente sobre dos filtros de nitrocelulosa (de Schleicher & Schüll, Darmstadt, RFA, BA85), siendo el tiempo de incubación para el primer filtro de 1 minuto y para el segundo filtro de 2 minutos.

De esta manera se produjeron filtros de réplicas, en total de 20 cápsulas de Petri, y a continuación se hibridaron en cada caso con dos sondas de ADNc monocatenarias (mc.), marcadas radiactivamente (compárese b. abajo) (de manera positiva/negativa).

b) Las sondas de un ARN poli(A)+ de epidídimo (que proporciona sondas positivas) y de un ARN poli(A)+ de testículo (que proporciona sondas negativas) se produjeron, mediando utilización de un oligo(dT) como cebador, de la siguiente manera:

Ambas especies de ARN procedían de los correspondientes tejidos de un paciente, que no había sido sometido a ningún tratamiento previo con medicamentos. En cada caso 1 \mug del ARN poli(A)+ de acuerdo con el Ejemplo 1 se desnaturalizó durante 5 minutos a 65ºC en un volumen de 2 \mul. Después de un rápido enfriamiento de las tandas sobre hielo, se añadieron consecutivamente en cada caso los siguientes componentes:

-

2 \mul de oligo(dT) (100 \mug/ml)

-

1 \mul de una mezcla de dNTP (dATP, dGTP, dTTP, en cada caso 2 mM)

-

1 \mul de pirofosfato de sodio 40 mM

-

1 \mul de RNasin (de Amersham; GB)

-

2 \mul de un tampón de 10x transcriptasa inversa (500 mM de Tris-Cl (de pH 8,5), 500 mM de KCl, 100 mM de MgCl_{2}, 100 \mug/ml de BSA, 10 mM de EDTA, 10 mM de ditiotreitol)

-

20 unidades de transcriptasa inversa AMV (de Boehringer Mannheim, RFA)

-

10 \mul de un (\alpha-^{32}P)-dCTP (NEN, 10 \mu Ci/\mul; S.A. > 3.000 ci/mmol).

Las tandas de reacción fueron incubadas durante 15 minutos a 42ºC. Después de haber añadido 1 \mul de una "Chasemix" (que contenía la totalidad de los cuatro dNTP's en una concentración en cada caso de 10 mM), se prosiguió la incubación durante 20 minutos adicionales. La reacción fue detenida por adición en cada caso de 1 \mul de EDTA 0,5 M, y los productos se precipitaron con etanol sin ninguna purificación adicional. Las sondas, marcadas con una actividad específica de > 10^{8} cpm/\mug, fueron hibridadas paralelamente con los filtros de réplica arriba mencionados. La hibridación se llevó a cabo en una solución 5x de Denhardt, 4x SET (200 mM de Tris (de pH 8,0), 20 mM de EDTA, 0,6 M de NaCl), 0,1% de pirofosfato de sodio y 25 mM de un tampón de fosfato de sodio (de pH 7,0), durante 72 horas a 65ºC y con una concentración de la radiactividad de 5 x 10^{6} cpm/ml. Los filtros fueron lavados a continuación a una temperatura de 65ºC en 0,1% de SDS, 2 x SSC (300 mM de cloruro de sodio, 30 mM de citrato de sodio_{3}).

La Figura 3 muestra los autorradiogramas de dos filtros de réplicas de una de las cápsulas de Petri, que habían sido hibridados con sondas de ADNc epididimales (a) o respectivamente testiculares (b). El revelado de los autorradiogramas se efectuó después de un período de tiempo de exposición de 16 horas, mediando utilización de una lámina amplificadora. Los filtros representan aproximadamente 500 clones independientes de la biblioteca global de ADNc, organizada en el sistema de Lambda gt11, a base de tejidos de epidídimo. Las señales de hibridación positivas, específicas para el epidídimo, están marcadas con puntas de flechas (compárese la Figura 3a).

Con ayuda de este procedimiento de escrutinio primario (compárese la Figura 1a) se pudieron lisar aproximadamente 10.000 clones de ADNc independientes. En este caso se pudieron identificar 265 recombinantes, cuyas señales, después de una hibridación con la sonda de ADNc epididimal, eran muchísimo más fuertes en comparación con las producidas a base de tejidos de testículo. Referido a la parte de la biblioteca de fagos, analizada por escrutinio, el número de clones de ADNc positivos corresponde a una proporción de 2,5%.

Se aislaron los clones de ADNc positivos y se subdividieron para un escrutinio secundario en conjuntos con hasta 80 clones.

El procedimiento arriba descrito se repitió, con la diferencia de que de cada una de las cubetas de Petri, que habían crecido en conjuntos en cada caso de 80 clones, se produjeron cada vez 3 filtros de réplica. Para la producción de las sondas de ADNc negativas se utilizó aquí un ARN poli(A)+ procedente de un cerebro humano o respectivamente de un hígado humano (de Clontech California, EE.UU.).

El número de recombinantes positivos se redujo a 59 clones (compárese la Figura 4) después de un análisis de este procedimiento de escrutinio secundario (compárese la Figura 1b).

El aislamiento de clones positivos se efectuó sin ninguna purificación adicional de las calvas. El ADN de Lambda purificado se cortó con EcoRI y los insertos se aislaron mediante una elución con Biotrap (de Schleicher & Schüll). Los insertos de EcoRI fueron subclonados en el vector de plásmido bacteriano pBS (de Stratagene, California, EE.UU.) e introducidos, mediante el procedimiento de transformación con CaCl_{2}, en las células de bacterias de la cepa de E. coli XL1 Blue (de Stratagene, California) (compárese la cita de T. Maniatis y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y., (1982)).

Ejemplo 4 Producción de borrones de transferencia Northern para el análisis de la expresión génica, específica para tejidos, y subdivisión de los clones de ADNc específicos para el epidídimo, en familias con secuencias afines

20 \mug de un ARN total procedente de un epidídimo humano (E) de un paciente tratado con acetato de ciproterona, así como la misma cantidad de un ARN total procedente de un testículo humano (T) y de una decidua humana (D) se separaron por electroforesis en un gel horizontal de agarosa y formaldehído al 1,3% durante 16 horas con una tensión eléctrica constante de 25 voltios (compárese la cita de T. Maniatis y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y., (1982)) (Figuras 5, 6 y 7). Para la determinación de los tamaños de los ARN's, el gel fue cargado adicionalmente con un director conductor de ARN (0,24-9,5 kb (kilobases). El ARN fue transferido a continuación mediante transferencia de borrón capilar en presencia de 20 x SSC sobre membranas de nylon (Hybond N., de Amersham). Los borrones de transferencia fueron hibridados sucesivamente a continuación con sondas radiactivas de ADNc, potencialmente específicas para el epidídimo. Las sondas fueron aisladas mediante una restricción con EcoRI del ADN de Lambda gt11 subclonado en el plásmido pBS, así como mediante una subsiguiente elución en Biotrap y, después de una marcación radiactiva, tenían una radiactividad específica de > 10^{9} cpm/\mug (compárese la cita de A.P. Feinberg y B. Vogelstein, A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity, Analytical Biochemistry [Una técnica para marcar radiológicamente fragmentos de de endonucleasas de restricción de ADN a una alta actividad específica. Bioquímica Analítica], 132, 6-13 (1983)). La hibridación se efectuó durante una noche con una concentración de la radiactividad de 1-2 x 10^{6} cpm/\mul. Seguidamente, los filtros se lavaron escalonadamente mediando rigurosidad creciente, comenzando con 2 x SSC a la temperatura ambiente hasta llegar a 0,1 x SSC a una temperatura de 65ºC. Para la deshibridación, los filtros se incubaron durante 15 minutos a 65ºC en presencia de 2 mM de Tris (de pH 7,5), 1 mM de EDTA y 0,1% de SDS. Los filtros secados se investigaron por autorradiografía en cuanto a la presencia de un material de sonda, antes de que ellos, en el caso de no aparecer señales, se utilizasen para una hibridación repetida con una sonda adicional.

En la Figura 5 se representan Ejemplos para los autorradiogramas de los análisis de transferencia de borrón Northern de clones de ADNc potencialmente positivos. El período de tiempo de exposición fue de 20 horas. Con ayuda de los diferentes modelos de hibridación, se valoraron cualitativamente los clones en lo que se refería a su especificidad para tejidos.

a)

Un clon positivo de ADNc, indicado por una hibridación específica para el epidídimo.

b)

Un modelo de hibridación positivo, pero no específico para el epidídimo.

c)

Un clon positivo de ADNc (*), que también se hibrida con un ARNr (ácido ribonucleico ribosomal)

d)

Un clon de ADNc sin expresión específica para tejidos.

Con ayuda de este procedimiento se pudo identificar un número de 36 clones de ADNc epididimales. La señal de hibridación específica de cada uno de los insertos de clones con ARN epididimal era más fuerte en por lo menos un orden de magnitud que la obtenida con un ARN procedente de testículos o de deciduas (compárese la Figura 5a).

Mediante los resultados procedentes de hibridaciones cruzadas con la original biblioteca de fagos, los 36 clones de ADNc específicos para el epidídimo pudieron ser asignados a seis familias independientes, las cuales abarcaban en cada caso un conjunto de clones afines entre ellos. En tal caso, se pudo mostrar que cinco de las familias de clones de ADNc se derivaban de diferentes moléculas de ARNm, relativamente cortas, con una longitud media de 600 a 1.000 nucleótidos, mientras que el clon conforme al invento, que contiene la información genética para la presente proteína receptora, tiene una longitud de aproximadamente 5.000 nucleótidos.

Puesto que también a partir de la segunda biblioteca de ADNc se pudieron aislar solamente fragmentos de ADNc con una longitud máxima de 3,7 kb (compárese la Figura 8b), en virtud de los resultados de la hibridación de Northern, había que partir sin embargo de una longitud de ARNm de aproximadamente 5 kb, el comienzo en 5' de este ADNc se clonó mediando aplicación del método 5'-RACE (RACE = Rapid amplification of cDNA ends [Amplificación rápida de extremos de ADNc; M.A. Frohman y colaboradores, "Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: Amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer" [Producción rápida de ADNc's de plena longitud a partir de transcritos raros: Amplificación usando un único cebador de oligonucleótidos específico para un gen], Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, páginas 8.988-9.002 (1988)). Para esto, a partir de la región 5' de la conocida secuencia de ADNc que abarcaba 3,7 kb, se produjeron dos cebadores antisentido específicos para un gen, A1 y A2 (A1 = 5' AGC TAT GGG TGA AG 3', A2 = 5' TGT CAA TGG CAG GGC TG 3'). Con ayuda de estos cebadores, se obtuvo, partiendo de 1 \mug de ARN total, procedente de un epidídimo humano, mediando aplicación del protocolo "5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends" [Sistema 5'RACE para la amplificación rápida de extremos de ADNc] de la entidad Gibco BRL, Berlín, un fragmento de 5' con una longitud de 996 nucleótidos, que se solapaba con la secuencia de ADNc ya conocida a lo largo de una longitud de 49 nucleótidos (incluyendo al cebador A1) (compárese la Figura 8b, fragmento de 5'RACE, 1,0 kb).

Ejemplo 5 Control de la especificidad para tejidos del clon conforme al invento

En cada caso 20 \mug de un ARN total procedente de deciduas, epidídimos y testículos de origen humano se separaron de acuerdo con el Ejemplo 4 y se transfirieron sobre membranas de nylon. Para el control de la especificidad para tejidos del clon conforme al invento, se transfirieron además en cada caso 10 \mug de un ARN poli(A)+ procedente de epidídimos y el ARN total procedente de conductos deferentes (Vas deferens) de espermatozoides, así como en cada caso 20 \mug de un ARN total procedente de un linaje de células linfoblastoides (Daudi), a partir de linajes de células de carcinoma de próstata (LNCaP, DU145) y a partir de linajes de células epididimales embrionarias (RVP, REP) se separaron de una manera análoga y se transfirieron asimismo sobre una membrana de nylon. Como sonda se empleó en la Figura 6a un inserto de ADNc marcado con ^{32}P, procedente de la región de 3' del clon conforme al invento (compárese la Figura 8b, 3'-UTR) y se hibridó con borrones de transferencia Northern de acuerdo con el Ejemplo 4. En la Figura 6b se empleó, a diferencia de esto, un inserto de ADNc de BamHI, marcado con ^{32}P, procedente de la región de 5' del clon conforme al invento (compárese la Figura 8b, fragmento 5'BamHI). La Figura 6c muestra un borrón de transferencia Northern después de una hibridación con un fragmento 5'-RACE marcado con ^{32}P del clon conforme al invento.

Los resultados representados en las Figuras 6 a-c muestran que el clon de ADNc conforme al invento proporciona una señal de hibridación inequívoca solamente con el ARN epididimal. Además, con ayuda del autorradiograma correspondiente a la Figura 6c, se pudo confirmar la autenticidad del fragmento 5'-RACE (considérese la exclusiva señal con un ARN de epidídimo a aproximadamente 5 kb).

Ejemplo 6 Detección de secuencias homólogas en el epidídimo de otras especies de animales y control de la especificidad para tejidos del clon conforme al invento en una rata

Con el fin de investigar si ciertas homólogas de la proteína receptora conforme al invento son expresadas también en otras especies de mamíferos con la misma especificidad para tejidos, mediando aplicación de la técnica de PCR (referencia general, compárese la cita de R.S. Cha y W.G. Thilly, Specificity, Efficiency and Fidelity of PCR, PCR-Methods and Applications [Especificidad, eficiencia y fidelidad de una PCR, métodos de PCR y aplicaciones], volumen 3, páginas 18-29 (1993)) se intentó con el subfragmento E - F1 humano (compárese la Figura 8b, subclones de PCR, producidos mediando utilización de los cebadores E = 5' CAT CCG AAA ATA CAT CC 3' y F1 = 5' TGA AGG CAC ACA TCT CC 3'), amplificar correspondientes fragmentos procedentes del ARN total de epidídimos de ratas, ratones y perros.

En cada caso 5 \mug de un ARN total de las mencionadas especies de animales se sometieron a un reanillado en un volumen total en cada caso de 20 \mul mediando utilización de 0,5 \mug de un oligo(dT)_{12-18} (de Pharmacia, Freiburg). La subsiguiente síntesis de la primera cadena se efectuó en presencia en cada caso de 10 mM de dATP, dGTP, dCTP y dTTP así como de 200 unidades de una transcriptasa inversa (de Superscript, Gibco BRL, Berlín). Para la subsiguiente amplificación por PCR, se mezcló en cada caso 1 \mul de los productos de la síntesis de la primera cadena en cada caso con 10 mM de los cuatro dNTP's, en cada caso con 20 pM de los cebadores E y F1 humanos específicos para genes (véase más arriba). así como en cada caso con 7 unidades de una polimerasa de Taq (de Promega, Heidelberg) en un volumen total en cada caso de 50 \mul, y se sometieron a los siguientes ciclos de PCR: desnaturalización (durante 5 minutos a 95ºC), luego a 30 ciclos que comprendían una desnaturalización (durante 1 minuto a 95ºC), un reanillado (durante 1 minuto a 55ºC) y una elongación (durante 1 minuto a 72ºC). Los fragmentos de ADNc complementarios, obtenidos de esta manera, fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 1,2%. A continuación, unos fragmentos con una longitud de aproximadamente 750 nucleótidos fueron electroeluidos e insertados en el vector de clonación pCRII (de Invitrogen, ITC Biotechnology, Heidelberg). La determinación de las secuencias de los fragmentos clonados de ADN se efectuó tal como se describe en el siguiente Ejemplo 7 y proporcionó - tanto en el plano de los nucleótidos como también en el de los aminoácidos - una respectiva homología de aproximadamente un 90% con respecto a la secuencia humana. Este sorprendente resultado muestra que la secuencia de ADN, que codifica la proteína receptora conforme al invento, presenta, por lo menos dentro de los mamíferos, un alto grado de conservación.

Para el control de la especificidad para tejidos del clon conforme al invento en una rata, se separaron en cada caso 20 \mug del ARN total procedente de diferentes tejidos de ratas (con excepción de la 2ª traza (testículo), solamente 4 \mug) de acuerdo con el Ejemplo 4, y se transfirieron sobre membranas de nylon. Como sonda se empleó un inserto de ADNc marcado con ^{32}P (actividad específica 19^{9} cpm/\mug) procedente del homólogo para rata del clon conforme al invento (E - F1) y se hibridó con borrones de transferencia Northern de acuerdo con el Ejemplo 4. En la Figura 7 se representan esquemáticamente los autorradiogramas, revelados después de un período de tiempo de exposición de 15 horas, del análisis por transferencia de borrón Northern para el clon conforme al invento. En el centro de la Figura 7 se representa una rehibridación del borrón de transferencia reproducido encima con una sonda testigo para actina, a partir de la que se desprende que en todas las trazas del gel se habían encontrado cantidades aproximadamente equimolares de ARN.

La Figura 7 muestra que la sonda E - F1 de la rata se hibridaba exclusivamente con un ARN de epidídimo, siendo las señales de máxima intensidad dentro del epidídimo en la región caput o de cabeza (proximal) y en la región caudal o de cola (distal) (véanse las trazas 5-7).

Los resultados con la rata confirman el modelo de expresión, específico para el epidídimo, de la secuencia conforme al invento, puesto que en los casos de las otras especies investigadas de tejidos (en total 15) no se pudo detectar ninguna hibridación cruzada.

Ejemplo 7 Determinación de la secuencia de nucleótidos y de la secuencia de aminoácidos, derivada de ésta, del clon de ADNc conforme al invento

La secuencia de bases del más largo clon de ADNc conforme al invento, de acuerdo con los Ejemplos 4, 5 y 6, se determinó con ayuda del método didesoxi según Sanger F. y Coulson A.R. "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase" ["Un método rápido para determinar secuencias en un ADN mediante una síntesis cebada con una polimerasa de ADN"] J. Mol. Biol. 94, 441 (1975). Con esta finalidad, se produjeron subclones de acuerdo con el Ejemplo 3 y se transformaron en condiciones alcalinas en ADN's monocatenarios.

El resultado para el clon conforme al invento se representa en el protocolo de secuencias (SEQ ID NO 1).

La Figura 8a muestra el resultado de la representación gráfica (plot) de la hidrofobia, siendo representadas secuencias hidrófobas de aminoácidos por debajo de la línea cero. Son llamativas las regiones hidrófobas situadas entre la posición 620 y la posición 900 de la secuencia de aminoácidos, que caracterizan a los 7 dominios transmembranales y que permiten sacar la conclusión de la existencia de un receptor con la estructura que se representa en términos generales en la Figura 8c (a partir de: J.D. Watson y colaboradores "Rekombinierte DNA" [ADN recombinado], 2ª edición, editorial Spektrum, página 299 (1993)). Es digno de hacerse observar, además, el extremo terminal de N extracelular que comprende 620 aminoácidos. En la Figura 8b se representa un correspondiente diagrama de barras de la proteína conforme al invento. Éste muestra el cuadro de lectura abierto (ORF, de Open Reading Frame) en forma de una caja con una longitud de 3.114 nucleótidos, lo cual corresponde a una capacidad de codificación de 1.038 aminoácidos (aa). Los 7 dominios transmembranales están resaltados de un modo sombreado y se corresponden con los resultados del análisis de la hidrofobia. La secuencia de nucleótidos desde la posición 3.115 hasta la posición 4.665 comprende la región no traducida en 3' (3'UTR) del clon conforme al invento y se corresponde aproximadamente con el clon de ADNc aislado a partir de la primera biblioteca de ADNc. Por debajo del diagrama de barras se representan los dos clones de ADNc, que habían sido aislados y secuenciados a partir de las dos bibliotecas de ADNc del epidídimo (biblioteca 1/biblioteca 2). Finalmente se representan debajo unos subclones de PCR y los cebadores (A1, A2, E, F1) empleados para su respectiva síntesis. Los fragmentos utilizados como sondas están resaltados como barras
negras.

Ejemplo 8 Producción de antígenos por medio de vectores bacterianos de expresión para la inducción de anticuerpos

La región codificadora de proteínas del clon de ADNc conforme al invento, insertado en los subclones pBS producidos de acuerdo con el Ejemplo 3, fue recortada con ayuda de usuales endonucleasas de restricción y cambiada de clon por una vía usual (Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" [Clonación molecular - un manual de laboratorio] 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)) en el vector plásmido de expresión pET3 (Rosenberg y colaboradores "Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA Polymerase" [Vectores para la expresión selectiva de ADN's clonados mediante la polimerasa de ARN T7], Gene 56, 125-135 (1989)) tomando en consideración el cuadro de lectura. Este vector hace posible la inserción del inserto de ADNc directamente detrás (secuencia abajo) de una secuencia de promotor, que es específica para la enzima polimerasa T7 y comprende además un gen de resistencia a ampicilina.

Después de una transformación de estas construcciones artificiales en el seno de la cepa BL21 (DE3) de E. coli, que dispone del gen para la polimerasa T7, se efectuó la cultivación de los transformantes mediando una selección con ampicilina. Por adición de rifampicina se desactivaron todas las polimerasas propias de E. coli. Puesto que solamente la polimerasa T7 es resistente frente a este antibiótico y el inserto de ADNc conforme al invento estaba sometido al control del promotor para la polimerasa T7, se expresó principalmente el polipéptido conforme al invento.

Los polipéptidos bacteriógenos, producidos de esta manera, fueron a continuación purificados por electroforesis en gel a partir de los extractos bacterianos, y fueron utilizados directamente como antígenos para una inmunización de conejos, gallinas y ratas.

Ejemplo 9 Producción de antígenos por medio de una síntesis química para la inducción de anticuerpos

La secuencia Arg-Ile-Lys-Lys-Lys-Lys (que se corresponde con los nucleótidos 2.503-2.520 y respectivamente con los codones 835-840 de SEQ ID NO 1) se identificó por ordenador como posible epítopo antígeno de la proteína receptora conforme al invento y se sintetizó químicamente, junto con los aminoácidos flanqueadores en la secuencia total Cys-Arg-Ile-Lys-Lys-Lys-Lys-Gln-Leu-Gly-Ala-Gln-Arg-Lys-Thr (que se corresponde con los nucleótidos 2.500-2.544 y respectivamente con los codones 834-848 de la SEQ ID NO 1) de acuerdo con el procedimiento de Merrifield (J.M. Stewart "Synthesis and use of neuropeptides" Neuroendocrine Peptide Methodology ["Síntesis y uso de neuropéptidos" Metodología de Péptidos Neuroendocrinos], coordinador de edición P.M. Conn, Academic Press, Nueva York, páginas 815-844 (1989)), estando contenida en el extremo terminal de N una cisteína natural.

Los fragmentos inmunógenos del polipéptido conforme al invento, producidos de esta manera, fueron acoplados a continuación en cada caso con un éster de N-hidroxi-succinimida del ácido m-maleimido benzoico (M8759 de Sigma) (Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) a sustancias de soporte (hemocianina de lapa de bocallave = Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH) y se emplearon como antígenos para la inmunización de conejos, gallinas y ratas con el fin de producir anticuerpos.

Los anticuerpos policlonales, obtenidos de esta manera, son apropiados en particular para la detección diagnóstica cualitativa y cuantitativa de la proteína receptora conforme al invento en secciones tisulares de pacientes de infertilidad. La detección puede efectuarse de acuerdo con métodos inmunohistológicos conocidos, mediando utilización de un segundo anticuerpo obtenible en el comercio, marcado eventualmente de acuerdo con procedimientos usuales, que reconoce de una manera específica a los anticuerpos mencionados en primer lugar (Harlow y Lane, Antibodies - A Laboratory Manual [Anticuerpos, un manual de laboratorio], Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (1988)).

Ejemplo 10 Hibridación in situ de transcritos del ARNm conforme al invento en secciones tisulares de epidídimos de seres humanos y ratas

Mediando utilización del fragmento E - F1 con una longitud de 743 pb (pares de bases) (compárese el Ejemplo 6) de la secuencia de ADN conforme al invento, se produjo en presencia de [\alpha^{35}S]CTP, mediante una transcripción in vitro, una sonda específica, que se había empleado para la determinación de la expresión de la secuencia conforme al invento en secciones congeladas.

Los resultados de correspondientes experimentos de hibridación in situ se representan en la Figura 9. Los puntitos blancos de la sección congelada de origen humano, que se representa en la Imagen a mediando utilización de un microscopio de campo oscuro, muestran señales específicas procedentes de la hibridación in situ en presencia del fragmento anterior como sonda "antisentido". La Imagen b representa el resultado de un ensayo testigo llevado a cabo con una sección tisular comparable, en la que en lugar de la sonda "antisentido" precedentemente utilizada, la cadena complementaria se utiliza como sonda "del mismo sentido" (testigo negativo).

La Imagen a muestra con claridad que la secuencia de ADN conforme al invento es expresada exclusivamente en la capa epitelial del epidídimo, pero no en las células de estroma o músculo del mismo tejido humano.

Las Imágenes c y d muestran ensayos llevados a cabo paralelamente, mediando utilización de secciones tisulares del epidídimo de ratas. La Imagen c muestra una sección de la región proximal del epidídimo, mientras que en la Imagen d se representa la región distal del mismo tejido. Al realizar una consideración comparativa de las Imágenes c y d se pone en claro que la región proximal suministra señales más intensas, lo cual se ha de atribuir presumiblemente a una especialización funcional de esta región.

Los resultados de este Ejemplo demuestran la extremadamente alta especificidad para tipos de células de la proteína receptora conforme al invento. y por consiguiente la idoneidad de las sustancias propuestas conforme al invento para el influjo positivo o negativo, específico y por consiguiente exclusivo, sobre las funciones del epidídimo en conexión con la maduración de los espermatozoides. Además, los resultados ilustran la utilización, propuesta conforme al invento, de las secuencias puestas a disposición, incluyendo a fragmentos de las mismas, como sondas específicas para investigaciones diagnósticas tanto cualitativas como también cuantitativas de muestras de biopsias. Además de esto, la tasa de expresión, extremadamente alta, de la proteína receptora conforme al invento apunta a su idoneidad como mediadora prometedora de éxito en el marco de formas de aplicación terapéuticas o contraceptivas.

Ejemplo 11 Utilización de la proteína receptora conforme al invento o respectivamente del ADNc que la codifica, para el aislamiento de ligandos específicos

Para la obtención de ligandos específicos para la proteína receptora conforme al invento, se produjo el dominio extracelular terminal de N (desde la posición 1 hasta la 620 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO 2) de la proteína receptora en un sistema eucariótico de expresión, tal como el linaje de células COS-7. Para esta finalidad, la región del ADNc que codificaba este dominio (correspondiente a las posiciones 1 a 1.860 de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO 1) fue provisto en el extremo 3' de una secuencia de bandera (flag), es decir de una secuencia de oligonucleótidos, que codificaba un epítopo de péptido conocido, muy específico, y se clonó en el vector de expresión pRc/CMV (de Invitrogen San Diego, California, EE.UU.). Después de haberse efectuado la transfección del linaje de células COS-7 con el descrito vector de expresión, se obtuvo el producto de fusión de acuerdo con procedimientos conocidos y se purificó por una cromatografía de afinidad mediando utilización de anticuerpos inmovilizados, dirigidos hacia el epítopo de bandera.

A continuación, el producto de fusión se empleó como sonda en un procedimiento convencional de escrutinio de proteínas (compárese la cita de J. Sambrook. E.F. Fritsch, y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N. Y., capítulo 2 (1989)), mediando utilización de una biblioteca de expresión de un ADNc procedente de un testículo humano, producida en bacteriófagos Lambda. Para esto, se transfirieron sobre membranas de nylon aproximadamente 1 millón de clones bacterianos de ADNc independientes, que mediante inducción por IPTG expresan productos testiculares y por consiguiente potenciales ligandos, y se incubaron en condiciones apropiadas (véase más arriba) con el dominio recombinante de fijación a receptores. Seguidamente, los fragmentos de receptores no fijados específicamente, se eliminaron en condiciones rigurosas de lavado, de manera tal que sobre los filtros se encontraban solamente unos complejos de fijación específicos, que pudieron ser hechos visibles a través del epítopo de bandera con sistemas convencionales de detección de anticuerpos (sistema con utilización de una fosfatasa alcalina, de Sigma, Deisenhofen). Las colonias de fagos identificadas de esta manera fueron aisladas y purificadas, así como aportadas a una determinación de secuencias.

Con el fin de determinar si los ligandos encontrados pueden inducir una transducción de señales mediante el receptor conforme al invento, y por lo tanto si son apropiados para la estimulación de la maduración de espermatozoides en el caso de mamíferos subfértiles, unos cultivos del linaje de células COS-7, transfectado con toda la construcción artificial de ADNc, se incubaron por separado con los ligandos positivos, y se determinó su modificación, causada por la fijación específica, del nivel de cAMP intracelular y/o del contenido de Ca^{2+}. Los ligandos positivos, que no estaban en situación de provocar tales modificaciones, son apropiados por ejemplo como antagonistas para la inhibición de la maduración de espermatozoides y se pueden emplear para la preparación de agentes contraceptivos.

La utilización de tales ligandos para finalidades terapéuticas es especialmente ventajosa, puesto que mediante la expresión, específica para tejidos, de la proteína receptora conforme al invento se influye selectivamente sobre este tipo de tejido y por lo tanto no son de esperar efectos colaterales de ningún tipo o solamente son de esperar pequeños efectos colaterales.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE:Institut für Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Grandweg 64

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

LOCALIDAD: Hamburgo

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Alemania

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 22529

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA SOLICITUD: Proteína receptora específica para el epidídimo

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

SOPORTE DE DATOS: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA LÓGICO - SOFTWARE: Patent In Release nº 1.0, Versión nº 1.25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID. NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4.665 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1..3.114

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 3'UTR

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 3.115..4.665

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de poliA

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 4.647..4.652

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

4

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID. NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.038 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2

8

9

10

11

Claims (19)

1. Ácido nucleico, que comprende

a.

la secuencia de nucleótidos que se representa en SEQ ID NO 1,

b.

una secuencia parcial de la secuencia de los nucleótidos 1 a 3.114, indicada en a.,

c.

secuencias homólogas con respecto a las secuencias antes mencionadas, con un grado de homología de por lo menos un 90%,

d.

una secuencia de nucleótidos correspondiente a una secuencia de a. y b. dentro del marco de la degeneración del código genético, o

e.

una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con las secuencias de a., b. o d.,

codificando el ácido nucleico procedente de a - e una proteína receptora específica para el epidídimo.

2. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un segmento que codifica proteínas, que corresponde a la secuencia de ácido nucleico que se representa en SEQ ID NO 1.

3. Ácido nucleico, que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos que se representa en SEQ ID NO. 2.

4. Polipéptidos codificados por un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3.

5. Polipéptido, que comprende la secuencia de aminoácidos que se representa en SEQ ID NO. 2.

6. Fragmento de polipéptido que corresponde a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO. 2 desde la posición 1 hasta la 620.

7. Anticuerpos, caracterizados porque están en situación de tomar parte en una reacción inmunitaria con una de las proteínas o con uno de los polipéptidos de acuerdo con las reivindicaciones 4-6.

8. Anticuerpos monoclonales de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Moléculas de vectores que contienen por lo menos una copia de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3.

10. Moléculas de vectores de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizadas porque ellas contienen insertadas las secuencias de una manera tal que se puede efectuar su expresión en apropiados microorganismos.

11. Célula anfitriona procariótica o eucariótica, caracterizada porque ella es transfectada con un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3 o con un vector de acuerdo con la reivindicación 9.

12. Procedimiento para la preparación de las proteínas o de los polipéptidos de acuerdo con las reivindicaciones 4-6, caracterizado porque las células anfitrionas de acuerdo con la reivindicación 11 se cultivan en unas condiciones, que permiten la expresión de la secuencia de ADN, y el producto de expresión se puede obtener a partir de la tanda de cultivo.

13. Composición farmacéutica, que como componente activo contiene una o varias de las proteínas o uno o varios de los polipéptidos de acuerdo con las reivindicaciones 4-6, o que se prepara de acuerdo con la reivindicación 12 o que contiene una célula de acuerdo con la reivindicación 11, como componente activo.

14. Composición farmacéutica, que contiene anticuerpos de acuerdo con las reivindicaciones 7-8, como componente activo.

15. Composición farmacéutica, que como sustancia activa eficaz contiene unas secuencias de nucleótidos, que se hibridan con las secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3.

16. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, estando las secuencias de nucleótidos provistas de un marcador detectable.

17. Composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 13-16 para el diagnóstico de trastornos de la reproducción masculina.

18. Composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 13 - 16 para la terapia de trastornos de la reproducción masculina o para la contracepción.

19. Utilización de las proteínas o de los polipéptidos de acuerdo con las reivindicaciones 4-6 para el aislamiento y la preparación de ligandos específicos.