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ES2268693T3 - Particulas de tipo retrovirico no infecciosas marcadas con antigeno. - Google Patents

Particulas de tipo retrovirico no infecciosas marcadas con antigeno. Download PDF

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ES2268693T3
ES2268693T3 ES95927611T ES95927611T ES2268693T3 ES 2268693 T3 ES2268693 T3 ES 2268693T3 ES 95927611 T ES95927611 T ES 95927611T ES 95927611 T ES95927611 T ES 95927611T ES 2268693 T3 ES2268693 T3 ES 2268693T3
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hiv
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retroviral
gag
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Benjamin Rovinski
Shi-Xian Cao
Fei-Long Yao
Roy Persson
Michel H. Klein
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Sanofi Pasteur Ltd
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Abstract

PARTICULAS TIPO RETROVIRUS, NO INFECCIOSAS QUE COMPRENDEN UN CONJUNTO DE PRODUCTO GENETICO ENV, UN PRODUCTO GENETICO POL Y UN PRODUCTO GENETICO GAG CONTIENEN UN MARCADOR ANTIGENETICO QUE ES NO RETROVIRAL O RETROVIRAL NO-VIH. EN UNA REALIZACION, EL MARCADOR COMPRENDE UNA SECUENCIA DE AMINOACIDO QUE CONTIENE UN EPITOPE INSERTADO EN EL PRODUCTO GENETICO GAG EN UN EMPLAZAMIENTO DE INSERCION ANTIGENETICAMENTE ACTIVO. EN OTRA REALIZACION, EL MARCADOR COMPRENDE UNA SECUENCIA DE FIJACION ANTIGENETICA OPERATIVAMENTE CONECTADA AL PRODUCTO GENETICO ENV QUE SUSTITUYE LA FUNCION DE FIJACION ENDOGENA. EN OTRA REALIZACION, EL MARCADOR COMPRENDE LA MODIFICACION DE UNA REGION INMUNODOMINANTE DEL PRODUCTO GENETICO ENV PARA EVITAR SUSTANCIALMENTE EL RECONOCIMIENTO DE LA REGION INMUNODOMINANTE. SE DESCRIBEN LAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO CORRESPONDIENTES. LAS PARTICULAS TIPO RETROVIRUS, NO INFECCIOSAS TIENEN UTILIDAD EN ADMINISTRACION IN VIVO INCLUYENDO A HUMANOS Y EN DIAGNOSTICO. LA PRESENCIA DEL MARCADOR ANTIGENETICO PERMITE EL RECONOCIMIENTO DE QUE EL ANTISUERO QUE CONTIENE ANTICUERPOS ANTI-RETROVIRALES HA SIDO GENERADO MEDIANTE LA EXPOSICION A PARTICULAS TIPO RETROVIRUS NO INFECCIOSAS MEDIANTE LA COMPROBACION DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS AL MARCADOR ANTIGENETICO.

Description

Partículas de tipo retrovírico no infecciosas marcadas con antígeno.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la inmunología y atañe en particular a las partículas retrovíricas no infecciosas marcadas con antígenos (denominadas a veces pseudoviriones).
Antecedentes de la invención
El virus de la inmunodeficiencia humana es un retrovirus humano y es el agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Desde que el SIDA se describió por primera vez en los Estados Unidos en 1981, más de 194.000 personas han muerto de SIDA y más de 330.000 casos de infección por VIH se han descrito en los Estados Unidos solo. En todo el mundo se estima que más de 14 millones de personas han sido infectadas con el VIH.
Más de 100 medicinas relacionadas con el SIDA están en pruebas clínicas humanas o esperan la aprobación de la FDA pero actualmente no existe curación para la enfermedad.
Existe por consiguiente una necesidad evidente de preparaciones inmunógenas útiles como vacunas experimentales, como antígenos en análisis de diagnóstico y de kits y para la generación de reactivos inmunológicos para el diagnóstico del VIH y de otras enfermedades e infecciones retrovíricas.
Preparaciones inmunógenas específicas de la técnica anterior comprenden partículas del tipo VIH no infecciosas y no replicativas. Así las solicitudes PCT WO 93/20220 publicada el 14 de Octubre de 1993 y la WO 91/05860 publicada el 2 de Mayo de 1990 (Whitehead Institute for Biomedical Research), dan a conocer montajes que comprenden genomas del VIH que presentan una alternancia en una secuencia de nucleótidos que es crítica para el empaquetamiento del ARN genómico, y la producción de partículas de VIH inmunógeno no infecciosas producidas por la expresión de estos montajes en células de mamífero.
La solicitud PCT WO 91/07425 publicada el 30 de Mayo de 1991 (Oncogen Limited Partnership) da a conocer partículas retrovíricas no replicativas producidas por la coexpresión del núcleo retrovírico maduro y las proteínas estructurales de la envoltura tales como el montaje de proteínas retrovíricas expresado en el brote de partículas retrovíricas. Se preparó una partícula de tipo VIH-1 específica no replicativa coinfectando células huésped de mamífero con un virus de la vacuna recombinante que lleva el hueco del VIH-1 y genes de proteasa y un virus de la vacuna recombinante que lleva el gen env del VIH-1.
En la solicitud PCT WO 91/05864 publicada en nombre de su apoderado, se han descrito las partículas retrovíricas específicas no replicativas y no infecciosas que contienen por lo menos las proteínas gag, pol y env y su conformación natural y que están codificadas por un genoma retrovírico modificado carente de repeticiones terminales largas y que contiene los genes gag, pol y env en su configuración genómica natural.
Dado que no existe ninguna vacuna ni tratamiento eficaz para el SIDA y ya que dichas partículas del tipo VIH de la técnica anterior contienen muchas de las proteínas del VIH en sus conformaciones naturales, un huésped inmunizado con éstas puede montar una respuesta inmunitaria inmunológicamente indistinguible a partir de la infección por el VIH. El antisuero anti-VIH inactivado térmicamente obtenido a partir de personas infectadas por VIH y el VIH inactivado están disponibles en el mercado actualmente como componentes de muchos métodos de diagnóstico. Por seguridad, facilidad de manipulación, envío, almacenaje y utilización puede ser preferible sustituir dichos antisueros y antígenos inactivados térmicamente por VIH no infeccioso y antisueros generados por inmunización con partículas de VIH no infecciosas tal como se describió anteriormente. Además, los antisueros generados por inmunización con estas partículas de VIH no infecciosas no necesitan inactivación térmica para eliminar el VIH no infeccioso. Sin embargo, debido a la gravedad de la infección por VIH se desea poder distinguir entre el VIH inactivado y el no infeccioso, las partículas de VIH no replicativas y los antisueros generados por el VIH virulento y no infeccioso, las partículas de VIH no replicativas. Por lo tanto, en el desarrollo de vacunas experimentales contra el SIDA, las preparaciones inmunógenos y los métodos y kits para diagnóstico, sería útil que proporcionasen una partícula del tipo VIH inmunológicamente o si no distinguible del VIH virulento.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a la capacidad para diferenciar entre la infección por VIH u otros retrovirus, particularmente un retrovirus humano, y la inmunización con una preparación inmunógena. La presente invención se refiere asimismo a la capacidad para diferenciar entre el VIH virulento inactivado y las partículas de tipo VIH no infecciosas y no replicativas. La presente invención incorpora un marcador en una partícula retrovírica, no infecciosa.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona una partícula de tipo VIH del virus de la inmunodeficiencia humana no infecciosa, que comprende un montaje de (a) un producto del gen env; (b) un producto del gen pol; (c) un producto del gen gag; y (d) al menos un marcador antigénico que es retrovírico no del VIH y que puede ser no retrovírico y es capaz de producir una respuesta inmunitaria.
Al menos un marcador antigénico puede tener aproximadamente de 5 a aproximadamente 100 restos de aminoácido, particularmente aproximadamente 10 a aproximadamente 75 restos de aminoácido. El marcador antigénico puede comprender al menos un epítopo antigénico procedente de otro virus. La invención se ilustra, en una realización, mediante al menos un epítopo antigénico procedente de la proteína de la envoltura del virus del mosaico del tabaco (TMV), que incluye específicamente una secuencia de aminoácidos AFDTRNRIIEVEN (SEQ ID NO: 1) o un fragmento, variación o mutante de la misma capaz de producir anticuerpos que reconocen esta secuencia, o copias múltiples, específicamente de 1 a 4, de dicha secuencia de aminoácidos.
El marcador antigénico puede incorporarse en el montaje de los productos de los genes para env, pol y gag de cualquier manera conveniente. En una realización de la invención, la secuencia del marcador está contenida dentro del producto del gen gag para formar un producto del gen gag híbrido que presenta las características formadoras de partículas del producto del gen gag no modificado. La secuencia del marcador puede estar contenida dentro del producto del gen gag por inserción del marcador antigénico en el producto del gen gag en una secuencia de inserción antigénicamente activa.
En una realización específica de la invención, la secuencia de inserción puede ser la situada entre los restos de aminoácidos 210 y 211 del producto del gen gag de la cepa LAI del VIH-1 o en la posición correspondiente de otros productos del gen retrovírico gag.
La secuencia del marcador también puede proporcionarse eliminando o impidiendo la producción de una secuencia de aminoácidos que corresponde a un epítopo de una proteína retrovírica. Por ejemplo, dicho epítopo puede comprender una zona inmunodominante, gp41, que proporciona una función endógena de anclaje. Cuando dicha función de anclaje endógena se elimina de esta manera, la función de anclaje es proporcionada por una secuencia de anclaje antigénica diferente. Alternativamente, la zona inmunodominante del producto del gen env puede modificarse mediante la sustitución o eliminación de al menos un aminoácido de la misma para prevenir sustancialmente el reconocimiento de la zona inmunodominante en la mutación resultante por sueros procedentes de huéspedes infectados por retrovirus.
En esta realización de la invención, el retrovirus puede ser VIH-1 y la zona inmunodominante puede contener la secuencia de aminoácidos LGIWGCSGKLIC (SEQ ID No: 27). Las secuencias específicas de aminoácidos de las mutaciones que pueden ser proporcionadas en la presente memoria comprenden LGIWGCTGRKILC (SEQ ID No: 28), LGIWGCAFRLIC (SEQ ID No: 29) y LGIWGCTLELIC (SEQ ID No: 30).
Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención proporciona una partícula de retrovírica no infecciosa, que comprende un montaje de (a) un producto del gen env modificado en el que la función endógena de anclaje ha sido sustituida por una secuencia de anclaje diferente operativamente conectada al producto del gen env para anclar el producto del gen env a la partícula retrovírica; (b) un producto del gen pol; y (c) un producto del gen gag.
La secuencia de anclaje, que puede ser antigénica, puede tener entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 restos de aminoácido, con preferencia aproximadamente de 10 a aproximadamente 75 restos de aminoácido. La secuencia de anclaje puede comprender al menos un fragmento de un componente de transmembrana de una proteína que se extiende sobre la membrana, particularmente una glucoproteína. Dicha glucoproteína puede ser cualquier glucoproteína conveniente, tal como una proteína del virus de la gripe, particularmente una proteína del virus de la gripe humana o una proteína del virus de la gripe aviar.
La secuencia de anclaje puede incluir una secuencia de aminoácidos WILWISFAISCFLLCWLLGFIMW (SEQ ID NO: 2) o una fracción, variación o mutante de la misma capaz de producir anticuerpos que reconocen esta secuencia, una secuencia de aminoácidos STVASSLALAIMIAGLSMWMCSNGSLQ (SEQ ID NO: 3) o una fracción, variación o mutante de la misma capaz de producir anticuerpos que reconocen esta secuencia; o una secuencia de aminoácidos WILWISFAISCFLLCVVCWGSSCGPAKKATLGATFAFDSKEEWCREKK EQWE (SEQ ID NO: 4) o una fracción, variación o mutante de la misma capaz de producir anticuerpos que reconocen esta secuencia.
La secuencia de anclaje preferentemente está insertada en el producto del gen env adyacente y aguas arriba de las secuencias de escisión operativas del producto del gen env. La secuencia de inserción preferentemente está situada entre los restos 507 y 508 de aminoácidos del producto del gen env de la cepa LAI del VIH-1 o la posición correspondiente de otros productos retrovíricos del gen env.
La partícula retrovírica proporcionada de acuerdo con uno de los dos aspectos de la invención preferentemente es una en la que los productos del gen env, pol y gag corresponden a los productos de los genes env, pol y gag de un retrovirus humano, particularmente VIH-1 o VIH-2.
Específicamente, el retrovirus humano puede ser VIH-1 y el producto del gen env puede ser un producto del gen env del LAI, un producto del gen env del MN, un producto del gen env de la cepa primaria del VIH-1 o un producto del gen env antigénicamente equivalente a éstos. Los productos de los genes gag y pol pueden proceder de una cepa de VIH-1 diferente de la cepa del VIH-1 de la que procede el producto del gen env. En particular, en dichas partículas, el producto del gen env puede proceder de la cepa primaria del VIH-1.
La presente invención incluye también moléculas de ácido nucleico que codifican partículas retrovíricas, no infecciosas de la invención. Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una partícula de tipo VIH no infeccioso, que comprende un genoma de VIH modificado carente de repeticiones terminales largas y que contiene los genes gag, pol y env en su configuración genómica natural y un segmento que codifica al menos un marcador antigénico que es retrovírico no del VIH y que puede ser no retrovírico. La molécula de ácido nucleico puede comprender una molécula del ADN que contiene los elementos genéticos característicos presentes en un fragmento SacI a XhoI del genoma de la cepa LAI del VIH-1. El genoma modificado también puede carecer de la secuencia de fijación al cebador.
En una realización específica ilustrativa de este aspecto de la invención, la secuencia que codifica al menos un marcador antigénico se inserta en el gen gag, específicamente en la secuencia PstI en el nucleótido 1415 del gen gag de la cepa LAI del VIH-1 o en la posición correspondiente de otros genes retrovíricos gag. Un segmento específico comprende de 1 a 4 copias de una secuencia de ADN seleccionada del grupo consistente en:
(a)
5' GCATTCGACACTAGAAATAGAATAATAGAAGTTGAAAAT 3'; (SEQ ID NO: 5);
(b)
3' CGTAAGCTGTGATCTTTATCTTATTATCTTCAACTTTTA 5'; (SEQ ID NO: 6); y
(c)
las secuencias de ADN que se hibridan con (a) o (b) en condiciones severas, particularmente las secuencias que presentan al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia de (a) o (b).
Puede emplearse una variedad de condiciones de hibridación para conseguir grados variables de selectividad de hibridación. Para un grado elevado de selectividad, se utilizan condiciones severas para formar duplicados, tales como condiciones de baja salinidad y/o de alta temperatura, tales como las proporcionadas por NaCl 0,02 M a 0,15 M entre aproximadamente 50ºC y 70ºC. Para algunas aplicaciones, se requieren condiciones de hibridación menos severas tales como sal 0,15 M a 0,9 M a temperaturas que oscilan entre aproximadamente 20ºC y 55ºC. Las condiciones de hibridación pueden hacerse también más severas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida, para desestabilizar el híbrido doble.
En una realización más todavía de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una partícula infecciosa de tipo VIH, que comprende un genoma VIH modificado carente de repeticiones terminales largas y que contiene los genes gag, pol y env en su configuración genómica natural estando modificado el gen env para proporcionar en el mismo un segmento que codifica una secuencia de anclaje antigénica para anclar el producto del gen env a la partícula retrovírica, por lo que el gen modificado env codifica un producto del gen env modificado en el que la función de anclaje endógena de env ha sido sustituida por la secuencia de anclaje antigénica.
En una realización ilustrativa específica de este aspecto de la invención, el segmento que codifica la secuencia del marcador antigénico se inserta en el gen env, particularmente entre los nucleótidos 7777 y 7778 del gen env de la cepa LAI del VIH o en la posición correspondiente de otros genes env retrovíricos. Un segmento específico que codifica la secuencia de anclaje incluye una secuencia de ADN seleccionada del grupo consistente en:
(a)
1
(b)
2
y
(c)
las secuencias de ADN que se hibridan con (a) o (b) en condiciones severas, particularmente las secuencias que presentan al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con las secuencias de (a) o (b).
Otro segmento específico que codifica la secuencia de anclaje incluye una secuencia de ADN seleccionada del grupo consistente en:
(a)
3 
\newpage
(b)
4
y
(c)
las secuencias de ADN que se hibridan con (a) o (b) en condiciones severas, particularmente las secuencias que presentan al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con las secuencias de (a) o (b). Un segmento específico más que codifica la secuencia de anclaje incluye una secuencia de ADN seleccionada del grupo consistente en:
(a)
5
(b)
6
y
(c)
las secuencias de ADN que se hibridan con (a) o (b) en condiciones severas, particularmente las secuencias que presentan al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con las secuencias de (a) o (b).
La presente invención incluye además, en un aspecto adicional, una composición inmunógena capaz de producir una respuesta inmunitaria específica al VIH y una respuesta inmunitaria específica contra un marcador no retrovírico que comprende las partículas retrovíricas o la molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria, y por consiguiente un vehículo. Dicha composición puede ser formulada para la administración en las mucosas o parental, por las vías oral, anal, vaginal o intranasal. La composición inmunógena puede comprender al menos otro material inmunológico o inmunoestimulante, específicamente un adyuvante, tal como fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, QS21, Quil A, fosfato de calcio, hidróxido de calcio, hidróxido de cinc, un análogo glucolípido, un éster de octadenilo de un aminoácido, un dipéptido de muraclilo, una lipoproteína o el adyuvante incompleto de Freund.
En un aspecto adicional, la presente invención puede emplearse en un método de inmunización de un hospedante para producir una respuesta inmunitaria específica para VIH y una respuesta inmunitaria específica no retrovírica contra un marcador antigénico, que comprende la administración al hospedante de una cantidad inmunoeficaz de la composición inmunógena proporcionada en la presente memoria.
La presente invención puede también utilizarse en procedimientos y kits para diagnóstico que utilizan estos materiales.
Particularmente, puede proporcionarse un método de determinación de la presencia de anticuerpos que reacciona específicamente con antígenos del VIH en una muestra, que comprende las etapas de (a) poner en contacto la muestra con la partícula de tipo VIH no infecciosa proporcionada en la presente memoria para producir complejos que comprenden las partículas de tipo VIH no infecciosas y algunos de dichos anticuerpos presentes en la muestra específicamente reactiva con éstas; y (b) determinar la producción de los complejos.
Además, puede proporcionarse un método de determinación de la presencia de antígenos de VIH en una muestra, que comprende las etapas de (a) inmunizar un hospedante con la composición inmunógena proporcionada en la presente memoria para producir anticuerpos específicos para el antígeno del VIH; (b) poner en contacto la muestra con los anticuerpos específicos para el antígeno del VIH para producir complejos que comprenden cualquier antígeno del VIH en la muestra y los anticuerpos específicos para el antígeno del VIH; y (c) determinar la producción de los complejos.
La invención puede emplearse en un kit para diagnóstico destinado a detectar la presencia de antígenos del VIH en una muestra que comprende (a) al menos un anticuerpo específico para el antígeno del VIH como se describe en la presente memoria; (b) medios para poner en contacto al menos un anticuerpo con la muestra para producir un complejo que comprende alguno de los antígenos del VIH en la muestra y los anticuerpos específicos para el antígeno del VIH; y (c) medios para determinar la producción del complejo.
Además, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de identificación del antisuero generado por inmunización con la composición inmunógena proporcionada en la presente memoria, que comprende detectar los anticuerpos en el antisuero específico para el marcador antigénico.
Las ventajas de la presente invención incluyen:
-
una partícula de tipo VIH inmunógena que comprende los productos de los genes gag, pol y env en sus conformaciones naturales transformadas en no infecciosas y no replicantes; y
-
una partícula de tipo VIH inmunógena inmunogénicamente distinguible de un retrovirus virulento.
Breve descripción de los dibujos
La presente invención se entenderá con más detalle a partir de la descripción siguiente con relación a los dibujos en los que:
La Figura 1 presenta un esquema de construcción de un plásmido (pMTVIH-A) que codifica una partícula retrovírica según una realización de la invención;
La Figura 2 presenta un esquema de construcción de un plásmido (pMTVIHBRU) que codifica una partícula retrovírica según otra realización de la invención;
La Figura 3 presenta un esquema de construcción de un plásmido (p83-19) que codifica una partícula retrovírica según otra realización de la invención;
La Figura 4 presenta un esquema de construcción de un plásmido (pSeBS-HA2) según una realización de la invención;
la Figura 5 presenta un diagrama de flujo para la mutagénesis asistida por el montaje del gen;
la Figura 6 presenta un esquema de construcción de un plásmido (pMTVIHA2-701) que codifica una partícula retrovírica que contiene una secuencia antigénica del marcador que comprende una fracción del componente de la transmembrana de la glucoproteína hemoaglutinina de la gripe humana según una realización adicional de la presente invención;
la Figura 7 presenta un esquema de construcción de un plásmido (pMTVIHmHA2) que codifica una partícula retrovírica que contiene un marcador no natural según una realización adicional de la presente invención;
la Figura 8 presenta un esquema de construcción de un plásmido (pMTVIHMNmHA2-5) que codifica una partícula retrovírica que contiene un marcador no natural según todavía una realización adicional de la presente invención;
la Figura 9 presenta detalles de un oligonucleótido que codifica un epítopo antigénico del virus del mosaico del tabaco insertado en el producto del gen gag de una partícula retrovírica no replicante y no infecciosa según otra realización de la invención;
la Figura 10 presenta un esquema de construcción de plásmidos que codifican partículas retrovíricas con epítopos antigénicos del virus del mosaico del tabaco;
la Figura 11 presenta un análisis de inmunotransferencia de partículas retrovíricas (pseudoviriones) marcadas antigénicamente de la presente invención; y
la Figura 12 presenta un análisis de inmunotransferencia de partículas retrovíricas marcadas antigénicamente para demostrar la inclusión del marcador antigénico en el producto del gen gag;
la Figura 13 presenta la respuesta inmunitaria en cobayas inmunizados con partículas retrovíricas, marcadas antigénicamente mediante la inclusión de la secuencia mHA2;
la Figura 14 presenta la respuesta inmunitaria en cobayas inmunizados con partículas retrovíricas, marcadas antigénicamente mediante la inclusión de la secuencia del marcador TMV;
la Figura 15 presenta la posición de una zona inmunodominante en la glucoproteína gp120 de la envoltura del VIH-1 destinada a la modificación para producir una partícula retrovírica no infecciosa antigénicamente distinguible del VIH-1; y
la Figura 16 presenta un análisis por inmunotransferencia de las partículas retrovíricas que contienen la glucoproteína gp120 de la envoltura de una cepa primaria, clínica del VIH-1.
Descripción general de la invención
Es manifiestamente evidente para un experto en la materia, que las varias realizaciones de la presente invención presentan muchas aplicaciones en los campos de la vacunación, del diagnóstico, del tratamiento de infecciones por VIH y de la generación de reactivos inmunológicos. Una exposición no limitativa más de tales usos se presenta con más detalle a continuación.
Con referencia a las Figuras 1 y 2, se ilustra la construcción de un vector pMTVIHBRU (denominación de la ATCC nº 75.852) que contiene un genoma retrovírico modificado carente de repeticiones terminales largas, una secuencia de fijación del cebador y una secuencia de empaquetamiento del ARN y que contiene los genes gag, pol y env en su configuración genómica natural. El gen pol del pMTVIHBRU se ha modificado mediante la deleción de uno de sus fragmentos para eliminar sustancialmente la transcriptasa inversa y sus actividades de integrasa. Además, en la realización de la invención particular ilustrada, se ha insertado un oligonucleótido dentro del gen pol eliminado para introducir tres codones de terminación en tres marcos de lectura diferentes para impedir que se traduzcan las secuencias restantes de la integrasa. El gen gag del pMTVIHBRU se ha modificado asimismo para sustituir los dos restos de cisteína (Cys^{392} y Cys^{395}) en la primera secuencia Cys-His por las serinas.
De este modo, el plásmido pMTVIHBRU codifica una partícula de tipo VIH carente de varios elementos requeridos para la infección y/o replicación del VIH pero prescindible para la producción de la partícula vírica.
El plásmido pMTVIHBRU codifica una partícula de tipo VIH con una proteína de la envoltura que corresponde a la de la cepa LAI del VIH-1. Con referencia a la Figura 3 se presenta un plásmido p83-19 en el que la envoltura de LAI de pMTVIHBRU se ha sustituido sustancialmente por la secuencia de la envoltura de MN. De este modo, el plásmido p83-19 codifica una partícula de tipo VIH carente de varios de los elementos requeridos para la infección y/o replicación del VIH pero prescindible para la producción de partículas víricas, que contiene como producto del gen env sustancialmente la envoltura de la cepa MN del VIH-1. La partícula de tipo VIH puede contener otros productos del env, particularmente de las cepas clínicas de pacientes infectados con el VIH-1, tal como una cepa primaria del VIH-1 de los clades A, B, C, D, E y O, incluyendo la cepa bx08 específica. El producto del gen env también puede ser un híbrido de la proteína gp120 de una fuente y el resto de otra fuente, tales como MN/LAI, bx08/LAI y clades/híbridos de LAI.
Con referencia a las Figuras 4 a 6, se ilustra la construcción de un vector pMTVIHHA2-701 que contiene un genoma del VIH modificado carente de repeticiones terminales largas, una secuencia de fijación del cebador y una secuencia de empaquetamiento del ARN y que contiene los genes gag, pol y env en su configuración genómica natural. El gen env en pMTVIHHA2-701 se ha modificado para proporcionar en el mismo un gen que codifica una secuencia de anclaje diferente para anclar el producto del gen env al producto retrovírico, por lo que el gen env modificado codifica un producto del gen env modificado en el que la función de anclaje endógena de env ha sido sustituida por la secuencia de anclaje diferente. En las partículas retrovíricas codificadas por pMTVIHHA2-701 no se expresa ya un epítopo inmunodominante de gp41 (que proporciona la función de anclaje endógena). Por lo tanto, dichas partículas retrovíricas son marcadas antigénicamente de manera negativa por la ausencia de una secuencia de aminoácidos correspondiente a un epítopo de una proteína retrovírica. La propia secuencia de anclaje diferente puede ser antigénica para proporcionar además un marcador antigénico no retrovírico positivo o retrovírico no del VIH para las partículas retrovíricas.
En esta realización ilustrada específica de la invención, una secuencia de 135 bp que comprende un fragmento de ADN de codificación y un codón de terminación del gen HA2 del virus de la gripe humano se insertó entre los nucleótidos 7777 (G) y 7778 (A) del gen de la envoltura de VIH-1_{LAI} para impedir la síntesis de la glucoproteína gp41 de la transmembrana de VIH-1_{LAI}. El plásmido pMTVIHHA2-701 codifica de este modo una partícula de tipo VIH en la que la función de anclaje de la glucoproteína gp41 de la transmembrana ha sido sustituida por una secuencia de anclaje de la proteína HA2 del virus de la gripe humano y la proteína HA2 proporciona además un marcador antigénico.
Con respecto a la Figura 7, se ilustra el plásmido pMTVIHmHA2 que es similar al pMTVIHHA2-701 pero contiene como secuencia del marcador antigénico que sustituye a la función de anclaje endógeno de env, una secuencia de aminoácidos sin homología con las proteínas naturales conocidas.
Con referencia a la Figuras 8, se ilustra un vector pMTVIMNmHA2-5 (denominación de la ATCC nº 75.853) que contiene un genoma de VIH modificado carente de repeticiones terminales largas, la secuencia de fijación del cebador y una secuencia de empaquetamiento del ARN y que contiene los genes gag, pol y env en su configuración genómica natural. El gen pol de pMTVIHMNmHA2-5 se ha modificado mediante la deleción de uno de sus fragmentos para eliminar sustancialmente la transcriptasa inversa y sus actividades de integrasa. Además se insertó un oligonucleótido dentro del gen pol eliminado para introducir tres codones de terminación en tres marcos de lectura diferentes para impedir que se traduzcan las secuencias restantes de la integrasa. El gen gag del pMTVIHMNmHA2-5 se ha modificado asimismo para sustituir los dos restos de cisteína en la primera secuencia Cys-His de gag por las serinas. En el pMTVIHMNmHA2-5 la función de anclaje endógena del env se ha sustituido por una secuencia de aminoácidos sin homología conocida por proteínas naturales. Las partículas de tipo VIH producidas procedentes de células Vero transfectadas con el plásmido pMTVIHMNmHA2-5 se purificaron y se utilizaron para inmunizar cobayas. Se extrajeron antisueros y se analizaron por ELISA los anticuerpos anti-V3 (es decir anti-envoltura) y los anticuerpos anti-mHA2 (es decir marcador anti-antigénico) como se muestra en la Tabla 1. Se repitieron estos experimentos en otras cobayas y se extendieron al análisis de los anticuerpos anti-gag y los resultados obtenidos se presentan en la Figura 13. Estos resultados indican que los productos de los genes gag y env se presentan sustancialmente en su conformación natural y que el marcador antigénico es inmunógeno.
Aunque se han descrito partículas retrovíricas específicas en las que la función de anclaje endógena de env ha sido sustituida por la secuencia de anclaje antigénica de proteínas naturales y no naturales específicas, se aprecia que pueden realizarse muchas variaciones, adaptaciones y modificaciones con los medios específicos mediante las cuales la función de anclaje endógena puede sustituirse sin apartarse de la esencia de la invención.
Con respecto a las Figuras 9 y 10, se ilustran los plásmidos (pVIH-T1; pVIH-T2 (denominación 75851 de la ATCC); pVIH-T3 y pVIH-T4) que contienen entre una y cuatro copias de una secuencia de ADN que codifica un epítopo antigénico del TMV. En las realizaciones específicas mostradas, el epítopo del TMV se inserta en el gen gag del VIH para producir un producto del gen gag híbrido, y los plásmidos carecen de varios de los elementos requeridos para la infección y/o replicación del VIH pero prescindibles para la producción de partículas víricas como se describió anteriormente. Se produjeron líneas celulares estables utilizando los plásmidos pVIH-T1, pVIH-T2 (denominación ATCC), pVIH-T3 y pVIH-T4 (que contienen las copias 1, 2, 3 y 4 del epítopo del antígeno, respectivamente) que produjeron las partículas de tipo VIH que contienen el marcador antigénico insertado en la proteína gag. Estas partículas de tipo VIH se purificaron y se determinó su reactividad con los anticuerpos monoclonales anti-VIH (Figura 11) y el antisuero del marcador anti-TMV (Figura 12). Los resultados se presentan en las Figuras 11 y 12 e indican que las partículas de tipo VIH contienen gp120, gp41 y p24 sustancialmente en sus conformaciones naturales y que el marcador TMV es capaz de ser reconocido por los anticuerpos del anti-marcador.
Las partículas de tipo VIH purificadas producidas por el plásmido pVIH-T2 se utilizaron para inmunizar cobayas. Se extrajeron antisueros y se analizaron por ELISA los anticuerpos anti-gag, anticuerpos anti-V3 (es decir anti-envoltura) y anticuerpos TMV (es decir marcador anti-antigénico) como se muestra en la Figura 14. Estos resultados indican que los productos de los genes gag y env se presentan sustancialmente en su conformación natural y que el marcador antigénico es inmunógeno.
Además, se realizó un ensayo de inhibición de infección vírica en los sueros de cobaya de estas inmunizaciones. Se formaron anticuerpos neutralizantes como se muestra en la Tabla 2. La generación de dichos anticuerpos neutralizantes indica la utilidad potencial de las partículas retrovíricas como vacunas experimentales y en aplicaciones de diagnóstico.
Con relación a la Figura 16, se presenta un análisis por inmunotransferencia de partículas retrovíricas (pseudoviriones) que expresan glucoproteínas de la envoltura de la cepa bx08 clínica (primaria). La bx08 de NIH-1 es una cepa clínica de la clade B aislada en Francia. Este análisis demuestra la expresión de las glucoproteínas de la envoltura de cepas clínicas en una molécula que contiene la proteína gag de la cepa no clínica.
Aunque las realizaciones específicas de las secuencias del marcador, que pueden ser también una secuencia de anclaje, se describen en la presente memoria, es evidente que cualquier otra secuencia de aminoácidos conveniente que proporciona la función del marcador y/o de anclaje puede emplearse en la presente memoria, incluyendo la ausencia de una secuencia de aminoácidos que corresponde a un epítopo de una proteína retrovírica. La ausencia de una secuencia de aminoácidos correspondiente a un epítopo de proteína retrovírica puede conllevar mutagénesis de uno o más aminoácidos procedente de una zona inmunodominante del producto del gen env, como representa en la Tabla 3, para impedir sustancialmente el reconocimiento de la zona inmunodominante en la mutación resultante por los sueros de hopedantes infectados retrovíricos. La secuencia de aminoácidos que proporciona la función del marcador puede comprender una secuencia antigénica no natural que no presenta homología con la proteína conocida. Un ejemplo de dicha secuencia es la secuencia HA2 mutante descrita anteriormente. Otros ejemplos pueden incluir zonas antigénicas de proteína no humana o de animal no mamífero, tal como los organismos patógenos o comensuales no humanos o no mamíferos. Un ejemplo de dicha secuencia es la TMV descrita anteriormente.
Es manifiestamente evidente para un experto en la materia, que las varias realizaciones de la presente invención presentan muchas aplicaciones en los campos de la vacunación, del diagnóstico, del tratamiento de infecciones por VIH y de la generación de reactivos inmunológicos. Una exposición no limitativa más de tales usos se presenta con más detalle a continuación.
Preparación y utilización de la vacuna
Se ha demostrado que una preparación inmunógena según la invención puede provocar una respuesta inmunitaria. Una posible utilización de la presente invención sirve, por consiguiente, como base de una vacuna potencial contra enfermedades retrovíricas que incluyen las afecciones del SIDA y relacionadas con el SIDA. En un aspecto más, la invención proporciona de este modo una vacuna contra las afecciones del SIDA y relacionadas con el SIDA, que comprende una composición inmunógena según la invención.
Las composiciones inmunógenas, adecuadas que deben utilizarse como vacunas, pueden prepararse a partir de partículas retrovíricas no infecciosas como se da a conocer en la presente memoria. La composición inmunógena provoca una respuesta inmunitaria que produce anticuerpos que son antivíricos. El sujeto vacunado debería someterse a una prueba de provocación por un retrovirus, tal como el VIH, los anticuerpos unirse al virus y de este modo inactivarlo.
Pueden prepararse vacunas como inyectables, como soluciones líquidas o emulsiones. Las partículas retrovíricas no infecciosas pueden mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con las partículas retrovíricas. Los excipientes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol y sus combinaciones. La vacuna puede contener además sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes de pH o adyuvantes para potenciar la eficacia de las vacunas. Los métodos para conseguir un efecto adyuvante para la vacuna incluyen la utilización de agentes, tal como el hidróxido o fosfato de aluminio (alumbre), utilizado normalmente como solución del 0,05 al 0,1 por ciento en solución salina tamponada con fosfato y otros adyuvantes, incluyendo QS21 y el adyuvante incompleto de Freund. Las vacunas pueden administrarse por vía parenteral, mediante inyección por vía subcutánea o intramuscular. Alternativamente, las composiciones inmunógenas formuladas según la presente invención, pueden formularse y administrarse de manera que provoquen una respuesta inmunitaria en las superficies de la mucosa. De este modo, la composición inmunógena puede administrarse a las superficies de la mucosa, por ejemplo, por las vías nasal u oral (intragástricas). Alternativamente, pueden ser deseables otros modos de administración incluyendo los supositorios y las formulaciones orales. Para los supositorios, aglutinantes y vehículos pueden incluirse, glicoles de polialcaleno o triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir los productos de partida empleados normalmente, tales como los grados farmacéuticos de sacarina, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones o polvos de liberación lenta y contienen del 10 al 95% de las partículas retrovíricas de la invención.
Las vacunas se administran de manera compatible con la formulación, y en cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz, protectora e inmunógena. La cantidad que debe administrarse depende del sujeto en tratamiento, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos y para producir una respuesta inmunitaria mediada por las células. Las cantidades exactas de ingrediente activo requeridas que deben administrarse dependen del criterio del médico. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados pueden ser determinados fácilmente por un experto en la materia y pueden ser del orden de microgramos de partículas retrovíricas. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo son también variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida de administraciones posteriores. Un ejemplo de un programa de inmunización es al menos una preinmunización con una partícula retrovírica, según la presente invención, seguida de al menos una inmunización secundaria con un péptido sintético descrito en la Publicación de Patente Europea publicada número 0 570 980 asignada al apoderado de la presente memoria. La dosificación de la vacuna puede depender también de la vía de administración y variará asimismo según el tamaño del hospedante.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican las partículas retrovíricas de la presente invención pueden utilizarse también directamente para la inmunización mediante la administración de las moléculas de ácido nucleico directamente, por ejemplo mediante la inyección a un hospedante. Los procedimientos para la inyección directa de ADN en los sujetos de la prueba destinados a la inmunización genética se describen, por ejemplo, en Ulmer et al., 1993.
Las moléculas según la invención pueden encontrar utilización además en el tratamiento (profiláctico o curativo) del SIDA y de las afecciones relacionadas, actuando ya sea para desplazar la fijación al virus del VIH a células humanas o animales o perturbando la organización tridimensional del virus.
Un aspecto adicional de la invención proporciona de este modo un método para la profilaxis o el tratamiento del SIDA o de las afecciones relacionadas, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición inmunógena según la invención.
Inmunoanálisis
Las partículas retrovíricas de la presente invención son útiles como inmunógenos, como antígenos en inmunoanálisis incluyendo el análisis inmunosorbente con enzima ligada (ELISA), los RIA y otros análisis de fijación del anticuerpo sin enzima ligada, por los procedimientos conocidos en la materia para la detección de anticuerpos del VIH anti-retrovíricos (por ejemplo, VIH) y antígeno retrovírico (por ejemplo, VIH). En los análisis por ELISA, las partículas retrovíricas se inmovilizan en una superficie seleccionada, por ejemplo en una superficie capaz de fijar proteínas, tales como los pocillos de una placa de microvaloración de poliestireno. Tras el lavado para eliminar las partículas retrovíricas adsorbidas de forma incompleta, puede fijarse a la superficie seleccionada una proteína no específica, tal como una solución de albúmina de suero bovino (BSA) o caseína, que es conocida por ser antigénicamente neutra con respecto a la muestra de ensayo. Esto permite el bloqueo de puntos de adsorción no específica en la superficie inmovilizante y disminuye de este modo el fondo producido por las fijaciones no específicas de los antisueros en la superficie.
La superficie inmovilizante se pone en contacto a continuación con una muestra, tales como los materiales clínicos o biológicos que han de ser ensayados, de manera conductiva para la formación del complejo (antígeno/anticuerpo) inmunitario. Esto puede incluir la dilución de la muestra con diluyentes, tales como soluciones de BSA, gammaglobulina bovina (BGG) y/o solución salina tamponada con fosfato (PBS)/Tween. La muestra se deja incubar a continuación durante aproximadamente 2 a 4 horas, a temperaturas tales como del orden de aproximadamente 25º a 37ºC. Tras la incubación, la superficie puesta en contacto con la muestra es lavada para eliminar el material no inmunocomplejado. El procedimiento de lavado puede incluir lavado con una solución, tal como PBS/Tween, o un tampón
borato.
Tras la formación de inmunocomplejos específicos entre la muestra de ensayo y las partículas retrovíricas fijadas, y el lavado posterior, puede determinarse la aparición, e incluso la cantidad, de formación de inmunocomplejo sometiendo al inmunocomplejo a un segundo anticuerpo con especificidad para el primer anticuerpo. Si la muestra de ensayo es de origen humano, el segundo anticuerpo es un anticuerpo con especificidad para las inmunoglobulinas humanas y en general IgG. Para proporcionar medios de detección, el segundo anticuerpo puede tener una actividad asociada, tal como una actividad enzimática que generará, por ejemplo, desarrollo de color en el momento de la incubación con un sustrato cromégeno apropiado. La cuantificación puede conseguirse a continuación midiendo el grado de generación de color utilizando, por ejemplo, con un espectrofotómetro de espectro visible.
En una realización para diagnóstico en la que se desea identificar anticuerpos que reconozcan varias cepas de VIH, se inmovilizan varias partículas retrovíricas inmunológicamente distintas de la presente invención sobre la superficie seleccionada. Alternativamente, cuando los anticuerpos anti-VIH reconocen epítopos que están muy conservados entre varias cepas de VIH (por ejemplo, un epítopo de linfocito B de gag o gp41) puede inmovilizarse una sola o un número limitado de partículas retrovíricas. En una realización adicional para diagnóstico en la que se desea identificar específicamente anticuerpos que reconozcan una sola cepa de VIH (por ejemplo, LAI, MN, SF2 o HXB2) puede inmovilizarse una sola partícula retrovírica específica de la presente invención. Esta realización adicional para diagnóstico presenta utilidad específica en los campos de la medicina, ensayos clínicos, derecho y ciencia forense en los que puede ser crítica para determinar la cepa de VIH específica que era responsable de la generación de una respuesta inmunitaria incluyendo una respuesta del anticuerpo.
En una realización para diagnóstico adicional, puede ser deseable identificar específicamente retrovirus inmunológicamente distintos, por ejemplo, cepas de VIH que pertenecen a diferentes clades, cepas de VIH inmunológicamente distintas pueden incluir por ejemplo, las cepas LAI, MN, SF2, HXB2 o de VIH-1 primaria. En esta realización para diagnóstico, una partícula retrovírica específica de la presente invención sirve para generar anticuerpos incluyendo anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente dicha cepa de VIH inmunológicamente distinta.
Se entiende que una mezcla de partículas retrovíricas inmunológicamente distintas puede utilizarse ya sea como inmunógeno, por ejemplo, en una vacuna, o como agente para diagnóstico. Pueden existir circunstancias en las que una mezcla de partículas retrovíricas se utilicen para proporcionar protección de la cepa cruzada y/o para diagnóstico. En este caso, la mezcla de inmunógenos se denomina normalmente preparación "cocktail".
La presente invención proporciona de manera ventajosa partículas retrovíricas que comprenden los productos de los genes gag, pol y env sustancialmente en sus conformaciones naturales. Dichas partículas retrovíricas serán reconocidas de este modo por anticuerpos anti-VIH conformacionales (tales como los anticuerpos anti-env) que puede que no reconozcan el antígeno del VIH en forma desnaturalizada o un péptido sintético correspondiente a dicho antígeno del VIH. Las partículas retrovíricas de la invención son particularmente útiles por consiguiente como antígenos y como inmunógenos para la generación de anticuerpos anti-retrovíricos (incluyendo los anticuerpos monoclonales) en las realizaciones para diagnóstico.
Además, la presencia del marcador genera una respuesta inmunitaria específica a éste cuya detección por los métodos descritos anteriormente permite la distinción fácil entre la inmunización de un hospedante con las composiciones inmunógenas proporcionadas en la presente memoria comparadas con la infección del material por un retrovirus virulento. La capacidad para efectuar dicho diagnóstico y diferenciación presenta utilidad ventajosa en los campos de la epidemiología, ensayos clínicos, ciencia forense e inmunología.
Otras utilizaciones
Las moléculas que se fijan a las partículas retrovíricas en las que se basa la invención, particularmente los anticuerpos, las moléculas relacionadas con anticuerpos y sus análogos estructurales, son también de posible utilización como agentes en el tratamiento y diagnóstico del SIDA y de las afecciones relacionadas.
Las variantes de anticuerpos (incluyendo las variantes de la secuencia de fijación al antígeno), tales como los anticuerpos híbridos, anticuerpos humanizados, anticuerpos revestidos y anticuerpos modificados genéticamente que son específicos para las partículas retrovíricos de la invención están incluidos dentro del alcance de la invención.
Los anticuerpos y otras moléculas que se fijan a las partículas retrovíricas de la presente invención pueden utilizarse con fines terapéuticos (profilácticos y curativos) y de diagnóstico en numerosas formas diferentes, incluyendo las siguientes:
Para la inmunización pasiva mediante la administración adecuada de anticuerpos, posiblemente anticuerpos humanizados, para pacientes infectados por VIH.
Para activar, complementar o mediar en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) mediante la utilización de anticuerpos de subclase adecuada o de isótopos (obtenidos posiblemente por modificación genética de anticuerpos apropiados) que son capaces de realizar la función deseada.
Para la administración dirigida de toxinas u otros agentes, por ejemplo la utilización de inmunotoxinas que comprenden conjugados de anticuerpo y un grupo citotóxico, para fijarse directa o indirectamente a las proteínas del VIH expuestas en la superficie celular de las células infectadas por VIH (por ejemplo, gp120).
Para la administración dirigida de materiales muy inmunógenos a la superficie de las células infectadas por VIH, conduciendo a la posible extirpación de dichas células por el sistema inmunitario humoral o celular del hospedante.
Para la detección del VIH, utilizando una variedad de técnicas de inmunoanálisis.
Por lo tanto, todavía en una realización de diagnóstico adicional, las composiciones inmunógenas de la presente invención (individualmente, o como mezclas que incluyen preparaciones cocktail) son útiles para la generación de anticuerpos específicos del antígeno del VIH (incluyendo los anticuerpos monoclonales) que pueden utilizarse para detectar VIH o antígenos, o para neutralizar el VIH en las muestras incluyendo las muestras biológicas.
En una realización alternativa para diagnóstico, las partículas retrovíricas de la presente invención pueden utilizarse para estimular específicamente los linfocitos T específicos para el VIH en muestras biológicas de, por ejemplo, individuos infectados por el VIH para diagnóstico o terapia.
Depósitos biológicos
Determinados plásmidos que codifican partículas retrovíricas según los aspectos de la presente invención que están descritos y citados en la presente memoria han sido depositados en la American Type Culture Collection (ATCC) situada en 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, 20852, siguiendo el tratado de Budapest y antes de la presentación de esta solicitud. Las muestras de los plásmidos depositados estarán disponibles al público en el momento de la concesión de una patente basada en esta solicitud de patente de Estados Unidos. La invención descrita y reivindicada en la presente memoria no está limitada en el alcance por los plásmidos depositados, ya que la realización depositada se propone únicamente como ilustración de la invención. Cualesquiera de los plásmidos equivalente o similar que codifican partículas retrovíricas similares o equivalentes a las descritas en esta solicitud están comprendidas dentro del alcance de la invención.
Compendio del depósito
Plásmido Denominado ATCC Fecha depositada
PMTVIHBRU 75852 4 de Agosto de 1994
pMTVIHMNmHA2-5 75853 4 de Agosto de 1994
pVIH-T2 75851 4 de Agosto de 1994 
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La descripción anterior describe generalmente la presente invención. Una comprensión más completa puede obtenerse con relación a los Ejemplos específicos siguientes. Estos Ejemplos se describen únicamente a título de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención. Aunque se han empleado términos específicos en la presente memoria, dichos términos se proponen en sentido descriptivo y no a título de limitaciones. Los métodos de ADN inmunológico y recombinante pueden no estar escritos de forma explícita en esta exposición pero están comprendidos todos dentro del alcance de los expertos en la materia.
Ejemplos
Los métodos de la genética molecular, bioquímica de proteínas e inmunología utilizados pero no descritos de manera explícita en esta descripción y estos Ejemplos se describen ampliamente en la bibliografía científica y están comprendidos dentro de la capacidad de los expertos en la materia.
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Ejemplo 1
Este Ejemplo describe la construcción del plásmido pMTVIHBRU.
El plásmido pMTVIHBRU se construyó como se muestra en las Figuras 1 y 2. Este plásmido es una modificación del vector de expresión pMTVIHd25 descrito en Rovinski et al. 1992 (las referencias de la bibliografía están identificadas al final de la memoria) y que contiene una deleción de empaquetamiento del ARN, y se modificó genéticamente para contener una serie de mutaciones/deleciones. Por lo tanto, una mutación de la secuencia Cys-His incluía las sustituciones de dos codones de cisteína (en la SEQ ID NO: 13) con dos codones de serina en la primera secuencia Cys-His (SEQ ID NO: 14) de la proteína de gag como se presenta en la Figura 1. Esto se realizó por un método de mutagénesis basado en PCR. Se sintetizaron dos cebadores: el cebador aguas arriba que posee la secuencia 5'-GGACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAGGATGGATGACAAA TAATCCACCTATCCCAGTAGGAG-3' (SEQ ID NO: 15), que comprende los nucleótidos 1.507 a 1.567 de VIH-1_{LAI}, (toda la numeración del nucleótido es de acuerdo con Wain-Hobson et al., 1985) con una secuencia SpeI y el extremo 5'; y el cebador aguas abajo con la secuencia 5'CTCGGGCCCTGCAATTTCTGGCTATGTGCCCTTC TTTGCCACTATTGAAACTCTTAACAATC-3' (SEQ ID NO: 16), que es el suplemento inverso de los nucleótidos 2.011 a 1.953 con una secuencia ApaI en el extremo 5'. En el cebador corriente abajo, dos restos de adenosina que representan el suplemento inverso de los nucleótidos 1.963 y 1.972 (Wain Hobson et al., 1985; Myers et al., 1990) se cambiaron por timidina, resultante en la sustitución de las dos cisternas en las posiciones 392 y 395 de los aminoácidos del producto del gen gag con dos serinas (Figura 1). Estos dos cebadores se utilizaron para ampliar el fragmento SpeI-ApaI del ADN (nucleótidos 1.507 a 2.006) de pMTVIH (Rovinski et al., 1992) que se utilizó como plantilla. El fragmento SpeI-ApaI ampliado por PCR se purificó por electroforesis en gel de agarosa y se digirió con las enzimas de restricción SpeI y ApaI. Este fragmento se utilizo para reemplazar el fragmento correspondiente en pMTVIHd25 (Rovinski et al., 1992). El plásmido resultante se denominó pMTVIH-A, que contiene tanto la deleción de la secuencia de empaquetamiento del ARN como la mutación de la secuencia Cys-His.
Para eliminar la transcriptasa inversa y la integrasa, se utilizaron dos secuencias de reconocimiento BalI en los nucleótidos 2.655 y 4.587 del VIH-1_{LAI} (Figura 2). El fragmento de 1,9-kbp entre las dos secuencias BAlI contiene las secuencias del ADN que codifican más del 95% de la transcriptasa inversa y los primeros 108 aminoácidos de la integrasa. El plásmido pMTVIH-A se digirió con BalI. Después de eliminar el fragmento BalI de 1,9 kbp por electroforesis en gel, el fragmento restante del plásmido se ligó con un nucleótido de doble cadena: 5'-GTATAAGTGAGTAGCGGCCGCAC-3' (solamente se muestra una cadena, SEQ ID NO: 17) que contiene tres codones de terminación en tres marcos de lectura diferentes para impedir que se traduzcan las secuencias restantes de la integrasa. El plásmido resultante se denominó pMTVIHBRU.
Ejemplo 2
Este Ejemplo describe la construcción de los plásmidos que codifican las partículas de VIH que contienen anclajes de la envoltura marcados antigénicamente.
El plásmido p83-19 se construyó a partir del vector de expresión pMTVIHBRU, como se muestra en la Figura 3. Este plásmido contiene un gen de la envoltura híbrido que se modificó genéticamente sustituyendo el ADN que codifica la mayor parte del gp120_{LAI}, con el ADN análogo que codifica a gp120_{MN}. Esto se realizó sustituyendo un fragmento KpnI/BglII del ADN (nucleótidos 6.379 a 7.668) del VIH-1_{LAI}, con un fragmento KpnI/BglII del ADN (nucleótidos 6.358 a 7.641) del VIH-1_{MN}.
Se construyó el plásmido pMTVIHHA2-701 a partir de los vectores de expresión pBT1 (Alizon et al., 1984) y del pMTVIHd25 (Rovinski et al., 1992), como se muestra en las Figuras 4 a 6. El vector pMTVIHHA2-701 contiene una secuencia de 135 bp que comprende un fragmento del ADN de codificación y un codón de terminación procedente del gen HA2 del virus de la gripe humano (Min Jou et al., 1980) insertado entre los nucleótidos 7777(G) y 7778(A) del gen de la envoltura del VIH-1_{LAI} (Wain-Hobson et al., 1985; Myers et al., 1990). El codón de terminación fue insertado para impedir la síntesis de la glucoproteína de la transmembrana gp41 del VIH-1_{LAI}. Un fragmento SalI (nucleótido 5821)/BamHI (nucleótido 8522) procedente del pBT1 se subclonó en pselect (Promega) para producir pSeBS (Figura 4). El último plásmido se utilizó para la inserción de 135 bp por un procedimiento denominado en la presente memoria "mutagénesis asistida por el montaje del gen (GAAM)". Se montó un cebador mutágeno, que se diseñó para contener la secuencia de 135 bp que comprende un fragmento del ADN de codificación procedente del gen HA2 del virus de la gripe humano (Min Jou et al., 1980), como se muestra en la Figura 5. El oligonucleótido I es un polímero de 99 unidades que contiene (desde 3' a 5') 30 bases complementarias a los nucleótidos 7748 a 7777 del VIH-1_{LAI} (Wain-Hobson et al., 1985; Myers et al., 1990) y 69 bases que son complementarias con las secuencias del gen HA2 (Min Jou et al., 1980) que codifican los aminoácidos 180 a 202 de la proteína HA2. El oligonucleótido II es un polímero de 96 unidades que comprende (desde 3' a 5') i) 60 bases complementarias a las secuencias del gen HA2 que codifican los aminoácidos 203 a 221 de la proteína HA2 y que contienen el codón de terminación de HA2 (Min Jou et al., 1980), ii) 6 bases (ATCATT - SEQ ID NO: 18) que definen dos codones de terminación más, y iii) 30 bases complementarias a los nucleótidos 7778 a 7807 de VIH-1_{LAI}, (Wain-Hobson et al., 1985; Myers et al., 1990). El oligonucleótido III es un puente polímero de 30 unidades con 15 nucleótidos complementarios al extremo 5' del oligonucleótido I y 15 nucleótidos complementarios con el extremo 3' del oligonucleótido II. Se mezclaron diez picomoles de los oligonucleótidos I y II con 20 picomoles del oligonucleótido III y se fosforilaron a 37ºC durante 1,5 h en 20 \mul de tampón cinasa (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, KCl 10 mM, DTT 5 mM y ATP 0,5 mM) tiene 2 unidades de T4 polinucleótido cinasa. Se hibridaron los oligonucleótidos calentando la mezcla a 95ºC durante 5 min y posteriormente enfriándola lentamente a temperatura ambiente. A esta mezcla se añadieron 3 \mul de 10 \times tampón de ligasa (Tris-HCl 0,5 M, pH 7,4, MgCl_{2} 0-1 M, DTT 0,1 M, espermidina 10 mM y 1 mg/ml de BSA), 3 \mul de ATP 10 mM y 5 unidades de T4 ADN ligasa, y la mezcla de ligadura se incubó durante la noche a 16ºC para completar el montaje del cebador mutágeno (Figura 5). Este cebador se utilizó en el procedimiento de mutagénesis sin purificación posterior.
La mutagénesis se realizó utilizando el Sistema de Mutagénesis in vitro de Secuencias Alteradas de Promega (Madison, WI). La plantilla para la mutagénesis consistía en el plásmido pSeBS (Figura 4) que contenía el fragmento SalI/BamHI de 2,7 kbp del ADN del gen de la envoltura del VIH_{LAI} (nucleótidos 5821 a 5822) clonado en el vector fagómido pselect proporcionado en el kit de mutagénesis. Tras el procedimiento de mutagénesis, se identificaron supuestos clones por hibridación de colonias con una sonda del oligonucleótido III marcada con ^{32}P. Los clones positivos fueron confirmados mediante secuenciado del ADN. Uno de estos clones, denominado pSeBS-HA2, se utilizó para la construcción del vector final. Con esta finalidad, la mencionada inserción SalI/BamHI procedente del pSeBS-HA2 se subclonó en pMTVIHd25-dSalI; este último es un plásmido derivado del pMTVIHd25 (Rovinski et al., 1992) mediante digestión parcial con SalI seguido de tratamiento de Klenow para eliminar la secuencia SalI en el eje principal del plásmido. El montaje de la expresión final se denominó pMTVIHmHA2 (Figura 7).
Un vector de expresión pMTVIHmHA2 (mostrado en la Figura 7) que contiene una secuencia de ADN heterólogo insertada entre los nucleótidos 7777 (G) y 7778 (A) del gen de la envoltura del VIH-1_{LAI} (Rovinski et al., 1992; Wain-Hobson et al., 1985) se modificó genéticamente como se describió anteriormente. En este caso, una secuencia de 134 bp, que comprende un fragmento del ADN de codificación procedente del gen HA2 del virus de la gripe humano (Min Jou et al., 1990) y 68 nucleótidos que, cuando se fusionan a las secuencias de HA2, codifica una secuencia de aminoácidos sin homología con las proteínas naturales conocidas, se insertó aguas abajo del nucleótido 7777 del VIH-1_{LAI} (Figura 7). La inserción produjo un desplazamiento del marco en la traducción de las secuencias de codificación del VIH-1_{LAI}, y la creación de un codón de terminación (TAG) para impedir la síntesis de la glucoproteína de transmembrana gp41 del VIH-1_{LAI}. El montaje de expresión final se denominó pMTVIHmHA2 (Figura 7).
Se construyó el plásmido pMTVIHMNmHA2-5 procedente de los vectores de expresión p83-19 y pMTVIHmHA2 como se muestra en la Figura 8. Este plásmido se diseñó para tener todas las mutaciones de los elementos requeridos para la infección y/o replicación de p83-19 y para contener la secuencia de inserción de 134 bp del pMTVIHmHA2 (Figura 7). Con esta finalidad, se digirió el p83-19 con BglII (nucleótido 7.641) y XhoI (nucleótido 8.944) para eliminar un fragmento de ADN de 1276 bp que se sustituyó por el fragmento BglII/XhoI homólogo de pMTVIHmHA2.
Ejemplo 3
Este Ejemplo describe la construcción de plásmidos que codifican partículas de tipo VIH que contienen epítopos antigénicos del TMV.
Los plásmidos pVIH-T1, pVIH-T2, pVIH-T3 y pVIH-T4 representan versiones modificadas del montaje p83-19 en el que contienen, respectivamente, ya sea una, dos, tres o cuatro copias de un oligonucleótido de doble cadena (Figuras 9, 10 y 11) que comprenden al menos un epítopo antigénico (Westhof et al., 1984; Trililleff et al., 1991) procedentes de la proteína de la envoltura del TMV. La construcción de estos cuatro vectores se ilustra en las Figuras 9 y 10. Para modificar genéticamente todos los montajes, el plásmido pMTVIH-A (Figura 1) se digirió en primer lugar con SacII y ApaI para aislar un fragmento de ADN de 1328 bp que se subclonó a continuación en pBluescript (Stratagene). El plásmido recombinante se digirió a continuación con PstI que escinde el ADN del VIH-1_{LAI} en el nucleótido 1.415 dentro del gen gag. Posteriormente, se insertaron en esta zona de restricción una, dos, tres o cuatro copias del oligonucleótido de doble cadena mostrado en la Figura 9 (cadena de codificación: SEQ ID NO: 19, la cadena complementaria: SEQ ID NO: 20, los aminoácidos codificados: SEQ ID NO: 21). Por último los plásmidos recombinantes resultantes se digirieron con SacII y ApaI para liberar la inserción modificada que se clonó a continuación en la zona homóloga del plásmido p83-19 (Figura 10).
La expresión de las partículas retrovíricas que contienen el epítopo de mHA2 o varias copias del epítopo del TMV se representan en la Figura 11. Se cultivaron células Vero hasta el 80% de confluencia y se transfirieron con 20 \mug del ADN del plásmido por el procedimiento transfinity de fosfato cálcico (BRL). Se analizó la expresión proteica en los sobrenadantes del cultivo 48 h después de la transfección. Los medios de cultivo (10 ml) de las células transfectadas con montajes de expresión individuales se recogieron y se clarificaron por centrifugación a 2.000 \times g (sorvall RT 6000B; Dupont Company, Wilmington, Del.) durante 15 min a 4ºC. Se aislaron partículas retrovíricas por ultracentrifugación. Las partículas sedimentadas se pusieron en suspensión a 40 \mul de TNA, se mezclaron con 10 \mul de 5\times tampón de muestra Laemmli y se hirvieron durante 3 min. Las proteínas víricas se separaron a continuación por SDS PAGE y se transfirieron a membranas Immobilon (Millipore, Bedford, Mass.). Se bloquearon las membranas con tampón BLOTTO (PBS que contiene 5% de leche en polvo no grasa instantánea Carnation al 5%, timerosal al 0,0001% p/vol y emulsión de antiespumante A al 0,01% vol/vol) durante 2 h a 25ºC y a continuación se incubaron con diluciones apropiadas de anticuerpos durante la noche a 4ºC. Se incubaron a continuación los filtros con un anticuerpo de inmunoglobulina G anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Promega, Madison, Wis.) y se hicieron reaccionar con los sustratos cromógenos de fosfatasa alcalina, cloruro de tetrazolio nitroblue y la sal de p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-3-indolifosfato (BRL). Se utilizó una mezcla de los anticuerpos anti-gp120, anti-gp41 y anti-p24 en el Panel A. Se utilizó una mezcla de anti-gp120 y anti-p24 en el Panel B.
Los resultados mostrados en la Figura 11 demuestran que las partículas de tipo VIH marcadas antigénicamente producen gp120, gp41 y p24 sustancialmente en sus conformaciones naturales.
Ejemplo 4
Este Ejemplo describe la inmunogenicidad e inmunorreactividad de las partículas de tipo VIH marcadas antigénicamente.
Uno de los plásmidos pVIH-T1, pVIH-T2, pVIH-T3 o pVIH-T4 (Figura 10) se cotransfectó con el plásmido pSV2neo en células Vero, y se crearon líneas celulares estables que producen partículas de tipo VIH. Se purificaron las partículas de tipo VIH, y se determinó por análisis de inmunotransferencia su reactividad a los antisueros de cobayas inmunizados con un péptido correspondiente al marcador TMV insertado en el producto del gen gag. Para obtener los antisueros, se inmunizaron los cobayas con 100 \mug de un péptido consistente en el marcador TMV conjugado con KLH y suplementado en el adyuvante completo de Freund. Se administraron dosis de refuerzo a todos los animales tres veces en intervalos de 3 semanas con el mismo péptido enriquecido con adyuvante incompleto de Freund. Se extrajeron antisueros dos semanas después de las últimas dosis de refuerzo. Los resultados, presentados en la Figura 12, ilustran la reactividad de los antisueros para varias formas del producto del gen gag presente en varias partículas de tipo VIH y demuestran la antigenicidad del marcador TMV en el contexto de una partícula de tipo VIH-1 modificada.
En un estudio adicional, se inmunizaron cobayas con 10 \mug de cantidades equivalentes a p24 de gag de partículas de tipo VIH que contienen dos copias de la secuencia del marcador TMV (GAFDTRNRIIEVENGA, SEQ ID No: 21) y se administraron dosis de refuerzo de 5 \mug de las mismas partículas de tipo VIH en intervalos de tres semanas. Las partículas de tipo VIH se enriquecieron con adyuvante completo de Freund (y las dosis de refuerzo se enriquecieron con adyuvante incompleto de Freund) o QS21. Se tomaron muestras de sueros la undécima semana tras la primera inmunización y se analizó la reactividad por ELISA con los péptidos correspondientes a la secuencia de aminoácidos que contiene el epítopo neutralizante V3 del VIH-1_{MN} (TRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIRQAHC, SEQ ID No: 31), la secuencia del marcador TMV (ARDTRNRIIEVEN, SEQ ID No: 1) y la proteína p24 (gag) a partir de un foco recombinante. Los resultados se presentan en la Figura 14 e indican que las partículas de tipo VIH que contienen la secuencia del marcador TMV pueden generar una respuesta inmunitaria para producir anticuerpos que reconocen específicamente a p24 (gag), gp120 (y específicamente el epítopo neutralizante V3) y la secuencia del marcador TMV. En los antisueros de cobaya se determinó también la neutralización del virus utilizando un análisis de inhibición de la infección por virus descrito por Skinner et al., 1988. Los títulos del punto final se presentan en la Tabla 2 e indican que los anticuerpos producidos por inmunización con las partículas retrovíricas que expresan la secuencia del marcador TMV son capaces de inhibir la infección celular por VIH.
El plásmido pMTVIHMNmHA2-5 se cotransfectó con el plásmido pSV2neo en células Vero, y se creó una línea celular estable que produce partículas de tipo VIH. Las partículas de tipo VIH se purificaron a continuación, y los cobayas inmunizados con 10 \mug de cantidades equivalentes a gag p24 de partículas de tipo VIH se enriquecieron con adyuvante completo de Freund. Se administraron dosis de refuerzo a todos los animales tres veces a la semana a intervalos de 3 semanas con partículas de tipo VIH complementadas con adyuvante incompleto de Freund. Dos semanas después de las últimas dosis de refuerzo, se extrajeron antisueros y se analizaron por ELISA las reactividades del marcador anti-V3 y anti-mHA2. Los resultados, presentados a continuación en la Tabla 1, indican que las cobayas inmunizadas con partículas de tipo VIH que contienen el marcador mHA2 producían anticuerpos capaces de reconocer los péptidos que representan el marcador mHA2 (MHA-1) y los dominios de neutralización del bucle V3 (CLTB56, CLTB71 y CLTB73).
En un estudio adicional, se inmunizaron cobayas con 10 \mug de cantidades equivalentes a p24 de gag de partículas de tipo VIH que contienen la secuencia del marcador antigénico mHA2 y se administraron dosis de refuerzo de 5 \mug de las mismas partículas de tipo VIH tres veces a intervalos de tres semanas. Las partículas de tipo VIH se enriquecieron con adyuvante completo de Freund (y las dosis de refuerzo se enriquecieron con adyuvante incompleto de Freund), QS21 o fosfato de aluminio (ALUMBRE). Se tomaron muestras de sueros once semanas después de la primera inmunización y se analizó la reactividad por ELISA con los péptidos correspondientes a la secuencia de aminoácidos que contiene el epítopo neutralizante V3 del VIH-1_{MN} (TRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIRQAHC, SEQ ID No: 31), la secuencia de mHA2 (GPAKKATLGATFAFDSKEEWCREKKEQWE, SEQ ID No: 22) y la proteína p24 (gag) a partir de un foco recombinante. Los resultados se presentan en la Figura 13 e indican que las partículas de tipo VIH que contienen la secuencia del marcador mHA2 pueden generar anticuerpos que reconocen específicamente a p24 (gag), gp120 (y específicamente el epítopo neutralizante V3) y la secuencia del marcador mHA2. En los antisueros de cobaya se determinó también su capacidad para impedir la infección por VIH_{MN} descrita por Skinner et al., 1988. Los títulos del punto final se presentan en la Tabla 2 e indican que los anticuerpos producidos por inmunización con las partículas retrovíricas que expresan la secuencia del marcador mHA2 son capaces de inhibir la infección celular por VIH. Estos datos, por consiguiente, demuestran que el marcador mHA2 es inmunógeno cuando se presenta en el contexto de una partícula de tipo VIH y que se producen también anticuerpos contra los determinantes neutralizantes principales de los bucles V3 a partir de diferentes cepas de VIH.
Ejemplo 5
Este Ejemplo describe la producción de partículas de tipo VIH antigénicamente marcadas por mutaciones con una zona inmunodominante de gp41.
El dominio de transmembrana de gp160 (gp41) contiene una zona inmunodominante que contiene la secuencia de aminoácidos LGIWGCSGKLIC (SEQ ID No: 28) y los anticuerpos que reconocen esta secuencia están presentes en todos los individuos infectados por VIH-1. De hecho, la detección de anticuerpos específicos para esta zona inmunodominante se utiliza para el diagnóstico clínico de la infección por VIH-1. Dichos anticuerpos específicos para esta zona inmunodominante se utilizan para el diagnóstico clínico de la infección por VIH-1. Dichos anticuerpos, sin embargo, no neutralizan generalmente el VIH-1. Las partículas de tipo VIH antigénicamente distinguibles del VIH-1 natural se produjeron de este modo por mutagénesis de la zona inmunodominante. Los mutantes de la zona inmunodominante que no son reconocidos por el suero de los pacientes con infección por VIH se identificaron mediante reconocimiento de los péptidos que contienen la secuencia mutante con dichos sueros como se presenta en la Tabla 3. Se introdujeron mutaciones mediante mutagénesis específica del sitio utilizando un kit del sistema Sculpture^{TM} de mutagénesis in vitro fabricado por Amersham Life Science, Amersham International PLC. Un fragmento de ADN de SalI BamHI del p83-19 que contiene la secuencia de codificación de la envoltura se subclonó en M13 y los oligonucleótidos que contienen el ADN que especifica las mutaciones presentadas en la Tabla 3 se utilizaron para producir las mutaciones apropiadas a la zona inmunodominante dentro del gp41 para producir montajes smIDR, clon 4 y clon 16. Cada uno de los montajes se transfectó en células VERO para producir partículas retrovíricas por inmunotransferencia. En estas partículas retrovíricas se analizó la expresión de las glucoproteínas gp120, gp160 y gp41 de la envoltura. Todas estas glucoproteínas estaban presentes en varias partículas retrovíricas. En particular se seleccionó el clon 4 que presenta las sustituciones de aminoácidos SGK \rightarrow AFR en la zona inmunodominante de gp41.
Compendio de la exposición
En el compendio de esta exposición, la presente invención proporciona determinadas partículas de tipo VIH, no infecciosas, no replicantes, y moléculas de ácido nucleico que las codifican como, por ejemplo, las preparaciones inmunógenas útiles para vacunación, la generación de antisueros específicos para VIH y como antígenos en métodos de diagnóstico y kits. Las partículas de tipo VIH pueden haberse convertido en no infecciosas por modificaciones a los productos de los genes pol y/o gag. Determinadas partículas de tipo VIH contienen marcadores antigénicos no retrovíricos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
7
TABLA 2
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TABLA 3
9 
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Referencias
1. Rovinski, B., Haynes, J.R., Cao, S.X., James, O., Sia, C., Zolla-Pazner, S., Matthews, T.J. and Klein, M. (1992) J. Virol., 66, 4003-4012.
2. Wain-Hobson, S., Sonigo, P., Danos, O., Col, S. and Alizon, M. (1985) Cell, 40, 9-17.
3. Myers, G., Berzofsky, J.A., Rabson, A.B., Smith, T.F. and Wong-Staal, F. (ed.) (1990) Human retroviruses and AIDS. Theoretical Biology and Biophysics, Group T-10. Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N.Mex.
4. Alizon, M.. Sonigo, P., Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Tiollais, P., Montagnier, L. and Wain-Hobson, S. (1984) Nature, 312, 757-780.
\newpage
5. Min Jou, W., Verhoeven, M., Devos, R., Saman, E., Fang, R., Huvlebroeck, D. and Fiers, W. (1980) Cell, 19, 683-696.
6. Westhof, E., Altschuh, D., Moras, D., Bloomer, A.C., Mondragon, A., Klug, A. and Van Regenmortel, M.H. (1984) Nature, 311, 123-126.
7. Trifilleff, E., Dubs, M.C. and Regenmertel, M.H.V. (1991) Mol. Immunol., 28, 889-896.
8. Ullmer, Current Opinion, Invest. Drugs, 1993, 2: 983-989.
9. Skinner, M.A., A.J. Langlois, C.B. McDanal, J.S. McDougal, D.P. Bolognesi and T. J. Matthews. 1988. J. Virol. 62: 4195-4200.

Claims (31)

1. Una partícula de tipo VIH del virus de la inmunodeficiencia humana no infecciosa, que comprende un montaje de:
(a)
un producto del gen env;
(b)
un producto del gen pol; y
(c)
un producto del gen gag; y caracterizada por:
(d)
al menos un marcador antigénico que es retrovírico no del VIH y que puede ser no retrovírico y es capaz de producir una respuesta inmunitaria.
2. Una partícula de tipo VIH según la reivindicación 1, en la que al menos dicho marcador antigénico no es retrovírico.
3. La partícula de tipo VIH según la reivindicación 1, en la que al menos un marcador antigénico está contenido dentro del producto del gen gag para formar un producto del gen gag híbrido que presenta las características formadoras de partículas del producto del gen gag no modificado.
4. La partícula de tipo VIH según la reivindicación 3, en la que al menos un marcador antigénico está insertado dentro del producto del gen gag en una secuencia de inserción antigénicamente activa.
5. La partícula de tipo VIH según la reivindicación 4, en la que dicha secuencia de inserción está situada entre los restos de aminoácidos 210 y 211 del producto del gen gag de la cepa LAI del VIH-1 o en la posición correspondiente de otros productos del gen retrovírico gag.
6. Una partícula de tipo VIH del virus de la inmunodeficiencia humana no infecciosa, caracterizada por un montaje de:
(a)
un producto del gen env del VIH modificado en el que la función de anclaje endógena de env ha sido sustituida por una secuencia de anclaje antigénica diferente operativamente conectada al producto del gen env para anclar dicho producto del gen env a la partícula de tipo VIH;
(b)
un producto del gen pol del VIH; y
(c)
un producto del gen gag del VIH.
7. La partícula de tipo VIH según la reivindicación 6, en la que la secuencia de anclaje comprende al menos una parte de un componente de la transmembrana de una proteína que se extiende por la transmembrana.
8. La partícula de tipo VIH según la reivindicación 7, en la que la proteína que se extiende por la transmembrana es una glucoproteína.
9. La partícula de tipo VIH según la reivindicación 6, en la que dicha secuencia de anclaje está insertada en el producto del gen env adyacente y aguas arriba de las secuencias de escisión operativas del producto del gen env.
10. La partícula de tipo VIH según la reivindicación 9, en la que dicha secuencia de anclaje está insertada entre los restos 507 y 508 de aminoácidos del producto del gen env de la cepa LAI del VIH-1 o en la posición correspondiente de otros productos retrovíricos del gen env.
11. La partícula de tipo VIH según la reivindicación 10, en la que el VIH se selecciona de entre el grupo constituido por VIH-1 y VIH-2.
12. La partícula de tipo VIH según las reivindicaciones 1 a 11, en la que se ha realizado al menos una modificación en el producto del gen pol para eliminar sustancialmente la actividad de la transcriptasa inversa y la actividades de la integrasa del producto del gen pol.
13. La partícula de tipo VIH según la reivindicación 12, en la que la eliminación sustancial de actividad de la transcriptasa inversa del producto del gen pol por eliminación de al menos una de las partes del mismo que contribuye a la actividad de la transcriptasa inversa.
14. La partícula de tipo VIH según la reivindicación 12, en la que la eliminación sustancial de actividad de la integrasa del producto del gen pol por eliminación de al menos una de las partes del mismo que contribuye a la actividad de la integrasa.
15. Una molécula de ácido nucleico que codifica una partícula de tipo VIH del virus de la inmunodeficiencia humana no infecciosa, caracterizada por:
un genoma de VIH modificado carente de repeticiones terminales largas y que contiene los genes gag, pol y env del VIH en su configuración genómica natural y un segmento que codifica al menos un marcador antigénico que es retrovírico no del VIH y que es capaz de producir una respuesta inmunitaria.
16. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15, en la que al menos dicho marcador antigénico no es retrovírico.
17. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15, en la que el segmento que codifica al menos un marcador antigénico está contenido en el gen gag para proporcionar un gen gag modificado que codifica un producto del gen gag híbrido con las características formadoras de partículas del producto del gen gag no modificado.
18. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 17, en la que el segmento que codifica al menos un marcador antigénico está insertado en el gen gag para proporcionar el marcador antigénico a una secuencia de inserción antigénicamente activa en el producto del gen gag híbrido.
19. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 18, en la que el segmento que codifica al menos un marcador antigénico está insertado en una secuencia de inserción situada en la secuencia PstI en el nucleótido 1415 del gen gag del HIV de la cepa LAI del VIH-1 o en la posición correspondiente de los genes gag del VIH.
20. Una molécula de ácido nucleico que codifica una partícula de tipo VIH del virus de la inmunodeficiencia humana no infecciosa, caracterizada por:
un genoma de VIH modificado carente de repeticiones terminales largas y que contiene los genes gag, pol y env del VIH que se modifica para proporcionar en éstos un segmento que codifica una secuencia de anclaje antigénica para anclar el producto del gen env a la partícula de tipo VIH con lo cual el gen env modificado codifica un producto del gen env modificado en el que la función de anclaje endógena de env ha sido sustituida por la secuencia de anclaje antigénica.
21. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 20, en la que el segmento que codifica la secuencia de anclaje codifica al menos una parte de un componente de la transmembrana de una proteína que se extiende por la transmembrana.
22. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 21, en la que la proteína que se extiende por la transmembrana es una glucoproteína.
23. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 20, en la el segmento que codifica la secuencia de anclaje está situado en el producto del gen env adyacente y aguas arriba del nucleótido que codifica las secuencias de escisión operativas del producto del gen env.
24. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 23, en la que dicho segmento que codifica la secuencia de anclaje está situado entre los nucleótidos 7777 y 7778 del gen env de la cepa LAI del VIH-1 o en la posición correspondiente de otros genes env del VIH.
25. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, en la que dicho genoma del VIH modificado carece de una secuencia de fijación al cebador.
26. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, en la que el VIH se selecciona de entre el grupo constituido por VIH-1 y VIH-2.
27. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 26, en la que se ha mutado al menos un codón en el gen pol para eliminar sustancialmente la actividad de la transcriptasa inversa y la actividad de la integrasa del producto del gen pol.
28. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una molécula de ADN que contiene los elementos característicos presentes en un fragmento desde SacI (678) hasta XhoI (8944) del genoma de la cepa LAI del VIH-1.
29. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 28, sin secuencia de fijación al cebador y/o una señal de empaquetamiento del ARN.
30. Una composición inmunógena capaz de provocar una respuesta inmunitaria específica del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y una respuesta inmunitaria específica contra un marcador no retrovírico, que comprende la partícula de tipo VIH reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o la molécula de ácido nucleico reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29 y un vehículo para éstas.
31. Un método de identificación del antisuero generado por inmunización con la composición inmunógena de la reivindicación 30, caracterizado por:
que detecta anticuerpos específicos para dicho marcador antigénico en dicho antisuero.
ES95927611T 1994-08-15 1995-08-15 Particulas de tipo retrovirico no infecciosas marcadas con antigeno. Expired - Lifetime ES2268693T3 (es)

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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6080408A (en) 1994-08-22 2000-06-27 Connaught Laboratories Limited Human immunodeficiency virus type 1 nucleic acids devoid of long terminal repeats capable of encoding for non-infectious, immunogenic, retrovirus-like particles
CA2202761A1 (en) 1994-10-18 1996-04-25 Sean Nicholas Chapman Method of producing a chimeric protein
WO1996030523A2 (en) * 1995-03-31 1996-10-03 Hans Wolf Antigen presentation system based on retrovirus-like particles
GB9607899D0 (en) * 1996-04-17 1996-06-19 Scottish Crop Research Inst Virus-like particle
US6602505B2 (en) * 1998-04-30 2003-08-05 University Of Southern California Viral chimeras comprised of CAEV and HIV-1 genetic elements
CA2331599C (en) * 1998-05-12 2005-11-29 Genecure Llc Replication defective hiv vaccine
EP2206785A1 (en) * 1998-12-31 2010-07-14 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Improved expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles
JP2003523721A (ja) * 1998-12-31 2003-08-12 カイロン コーポレイション 抗原性ｈｉｖｃ型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびそれらの使用
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
DK1141315T3 (da) 1998-12-31 2008-05-19 Novartis Vaccines & Diagnostic Modificerede HIV Env-polypeptider
US6534064B1 (en) * 1999-10-13 2003-03-18 Chiron Corporation Stabilized protein particles for inducing cellular immune responses
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
CA2401974C (en) 2000-03-02 2013-07-02 Emory University Dna expression vectors and methods of use
AU2001270164A1 (en) * 2000-06-26 2002-01-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Production of vaccines using transgenic plants
US6461616B1 (en) * 2000-09-09 2002-10-08 Akzo Nobel Nv EIAV p26 deletion vaccine and diagnostic
AU8710301A (en) * 2000-09-09 2002-03-22 Akzo Nobel Nv Eiav chimeric vaccine and diagnostic
US7122180B2 (en) * 2000-10-23 2006-10-17 Children's Medical Center Corporation DNA vectors containing mutated HIV proviruses
EP1201750A1 (en) * 2000-10-26 2002-05-02 Genopoietic Synthetic viruses and uses thereof
DE60234018D1 (de) * 2001-03-08 2009-11-26 Univ Emory Mva-exprimierende modifizierte hiv-envelope-, gag-, und pol-gene
JP5033303B2 (ja) 2001-07-05 2012-09-26 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 抗原性ｃ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用
JP4302513B2 (ja) * 2001-07-05 2009-07-29 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 抗原性ｂ型ｈｉｖポリペプチドおよび／または抗原性ｃ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドおよびそれらの使用
WO2003020876A2 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20030170614A1 (en) * 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2003077838A2 (en) * 2002-03-05 2003-09-25 National Institutes Of Health Office Of Technology Transfer Hiv-1 envelope glycoproteins stabilized by flexible linkers as potent entry inhibitors and immunogens
JP2006506615A (ja) * 2002-11-14 2006-02-23 ファイザー・プロダクツ・インク ワクチンのためのマーカー抗原として、およびＡｍｐｈｉｇｅｎと共同的なアジュバントしてのｒｍＬＴの使用
AU2007207544A1 (en) 2006-01-17 2007-07-26 Health Research, Inc. Heteroduplex tracking assay
WO2009009215A2 (en) * 2007-05-02 2009-01-15 Emory University Enhancement of glycoprotein incorporation into virus-like particles
AU2011230619C1 (en) 2010-03-25 2016-06-23 Oregon Health & Science University CMV glycoproteins and recombinant vectors
AU2012267786B2 (en) 2011-06-10 2017-08-03 Oregon Health & Science University CMV glycoproteins and recombinant vectors
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
US10174292B2 (en) 2015-03-20 2019-01-08 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5352449A (en) * 1986-05-30 1994-10-04 Cambridge Biotech Corporation Vaccine comprising recombinant feline leukemia antigen and saponin adjuvant
GB8923123D0 (en) * 1989-10-13 1989-11-29 Connaught Lab A vaccine for human immunodeficiency virus
JPH05501201A (ja) * 1989-10-16 1993-03-11 ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ 非感染性ｈｉｖ―１粒子およびそれらの使用
HUT60506A (en) * 1989-11-20 1992-09-28 Oncogen Process for producing non-replicable, recombinant retrovirus particles and antiviral and immunogenic preparations
WO1991019803A1 (en) * 1990-06-19 1991-12-26 Applied Biotechnology, Incorporated Self assembled, defective, nonself-propagating viral particles
JPH08500005A (ja) * 1992-03-27 1996-01-09 ホワイトヘッド インスティチュート フォー バイオメディカル リサーチ 非感染性ｈｉｖ粒子およびその用途
AU4685293A (en) * 1992-07-20 1994-02-14 Immune Response Corporation, The Prophylactic and therapeutic control of retroviral infections
GB9412844D0 (en) * 1994-06-27 1994-08-17 Medical Res Council Improvements in or relating to therapeutic methods

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Publication number Publication date
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US5955342A (en) 1999-09-21
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JP2006020635A (ja) 2006-01-26

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