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ES2267654T3 - Polipeptido y acidos nucleicos que lo codifican. - Google Patents

Polipeptido y acidos nucleicos que lo codifican. Download PDF

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ES2267654T3
ES2267654T3 ES01127792T ES01127792T ES2267654T3 ES 2267654 T3 ES2267654 T3 ES 2267654T3 ES 01127792 T ES01127792 T ES 01127792T ES 01127792 T ES01127792 T ES 01127792T ES 2267654 T3 ES2267654 T3 ES 2267654T3
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pro polypeptide
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polypeptide
pro
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ES01127792T
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William I. Wood
Austin L. Gurney
Audrey Goddard
Diane Pennica
Jian Chen
Jean Yuan
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Original Assignee
Genentech Inc
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Abstract

Polipéptido aislado, que: (a) tiene una secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2, con o sin la secuencia de señal terminal N en los residuos 1-27, con o sin la metionina de inicio, con o sin el dominio transmembrana en los residuos 236 a 258 aproximadamente y con o sin el dominio intracelular en los residuos 258 a 299 aproximadamente; o (b) es una variante de (a) que tiene por lo menos un 80% de identidad de la secuencia en la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO:2) o en la secuencia de aminoácido codificada por el ADN (DNA40628- 1216) depositado bajo en número de adhesión ATCC 209432, y que es capaz de inhibir la proliferación de células endoteliales estimuladas con VEGF, en el que el polipéptido es para usarse como medicamento.

Description

Polipéptido y ácidos nucleicos que lo codifican.
Campo de la invención
La presente invención se refiere de modo general a la identificación y aislamiento de ADN novedoso y a la producción recombinante de polipéptidos novedosos codificados por ese ADN.
Antecedentes de la invención
Las proteínas extracelulares y transmembrana juegan importantes papeles en la información, diferenciación y mantenimiento de los organismos pluricelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, normalmente está dirigido por la información recibida desde otras células y/o en el entorno inmediato. Esta información a menudo la transmiten polipéptidos de secreción (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos u hormonas) que son, a su vez, recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas transmembrana. Estos polipéptidos de secreción o moléculas de señalización pasan a través de la ruta de secreción celular para alcanzar su lugar de acción en el entorno extracelular, normalmente en una proteína receptora transmembrana.
Las proteínas de secreción tienen varias aplicaciones industriales, incluyendo su uso como productos farmacéuticos, de diagnóstico, biosensores y bioreactores. De hecho, la mayoría de fármacos proteicos disponibles en el presente, como agentes trombolíticos, interferones, interleucinas, eritropoyetinas, factores de estimulación de colonias y otras varias citoquininas, son proteínas de secreción. Sus receptores, que son proteínas transmembrana, tienen además un potencial como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Los receptores inmunoadhesinas, por ejemplo, se pueden emplear como agentes terapéuticos para bloquear la interacción receptor/ligando. Las proteínas transmembrana se pueden también emplear para la selección de péptidos potenciales o pequeñas moléculas inhibidoras de la interacción receptor/ligando pertinente. Tales proteínas transmembrana y receptores celulares, incluyen, pero no se limitan a, citoquininas, receptores, receptor quinasas, receptor fosfatasas, receptores implicados en las interacciones célula-célula y moléculas de adhesión celular como selectinas e integrinas. La transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está regulada en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteína tirosina quinasas, enzimas que catalizan ese proceso, pueden actuar además como receptores de factores de crecimiento. Algunos
ejemplos incluyen el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y el receptor del factor de crecimiento nervioso.
Se están realizando esfuerzos tanto a nivel industrial como académico para identificar proteínas de secreción receptoras transmembrana nativas, nuevas. Muchos de los esfuerzos se están centrando en la selección de genotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias codificadoras de proteínas de secreción y transmembrana novedosas. Algunos ejemplos de procedimientos y técnicas de selección están descritos en la bibliografía [ver por ejemplo, Klein y col., Proc. Nati. Acad. Sci., 93: 7108-7113 (1996)]; Patente de EE.UU. Nº 5.536.637].
En la presente memoria descriptiva nosotros describimos la identificación y caracterización de polipéptidos de secreción y transmembrana novedosos y ácidos nucleicos novedosos que codifican esos polipéptidos.
PRO301
La amplia aparición de cáncer ha provocado la dedicación de considerables recursos y el descubrimiento de nuevos tratamientos de tratamiento. Un procedimiento particular implica la creación de anticuerpos monoclonales de tumores o cánceres específicos (mAbs) que son específicos para los antígenos de los tumores. Estos mAbs, que pueden distinguir entre células normales y cancerosas, son útiles en el diagnóstico, la prognosis y el tratamiento de la enfermedad. Se conocen antígenos particulares que se asocian con enfermedades neoplásticas, tal como el cáncer colorectal.
Un antígeno particular, el antígeno A33 se expresa en más de 90% de los cánceres de colon primarios o metastáticos, así como el epitelio normal del colon. Como el cáncer de colon en una enfermedad extendida, un diagnóstico y un tratamiento temprano es un objetivo médico importante. El diagnóstico y el tratamiento del cáncer de colon se puede implementar usando anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos que tienen así etiquetas fluorescentes, magnéticas nucleares o radiactivas. Se pueden usar mAbs de gen radiactivo, toxinas y/o medicamentos marcados para el tratamiento in situ con una descripción mínima del paciente. Los mAbs también se pueden usar para diagnosticar durante el diagnóstico y el tratamiento de cánceres de colon. Por ejemplo, cuando los niveles de suero del antígeno A22 son elevados en un paciente, una caída en los niveles después de la cirugía indicaría que la resección del tumor fue exitosa. Por otro lado, un aumento posterior en los niveles de antígeno A22 en suero después de la cirugía indicaría que se puede haber formado metástasis del tumor original o que pueden haber aparecido nuevos tumores primarios. Estos anticuerpos monoclonales se pueden usar en lugar, o en conjunción con la cirugía y/o otras quimioterapias. Por ejemplo la patente US-4.579.827 y la solicitud US-424.991 (EP-199.141) se dirigen a la administración terapéutica de anticuerpos monoclonales, refiriéndose esta última a la aplicación de mAb A33.
Muchos cánceres de origen epitelial tienen receptores adenovirus. De hecho, se han propuesto vectores derivados de adenovirus como medios para insertar ácidos nucleicos antisentido en tumores (US-5.518.885). Así, no es inesperada la asociación de receptores virales con tumores neoplásticos.
Nosotros describimos aquí la identificación y la caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología con ciertos antígenos asociados a cánceres, designados aquí como polipéptidos PRO301.
Descripción de la invención PRO301
Los solicitantes han identificado un clon de ADNc (DNA40628-1216) que codifica un polipéptido, designado en la presente solicitud como "PRO301".
En una realización, la invención proporciona polipéptido PRO301 aislado tal como se define en las reivindicaciones, para usarse en un procedimiento de tratamiento médico. En particular, la invención proporciona polipéptido PRO301 de secuencia nativa aislada, que en una realización, incluye una secuencia de amino ácido que comprende los residuos de dominio extracelular 28 a 258 de la figura 2 (SEQ ID NO:2). Los polipéptidos nativos PRO301 con o sin la secuencia de señal nativa (amino ácidos 1 a 27 en la figura 2 (SEQ ID NO:2), y con o sin la metionina de inicio están específicamente incluidos. Además, las secuencias de la invención también puede comprender el dominio de transmembrana (residuos 236 a aproximadamente 258 en la figura 2; SEQ ID NO:2) y/o el dominio intracelular (aproximadamente residuo 259 a 299 en la figura 2: SEQ ID NO:2). Alternativamente, la invención proporciona un polipéptido PRO301 codificado mediante el ácido nucleico depositado bajo accesión número ATCC 209432, tal como se define en las reivindicaciones, para usarse en un procedimiento de tratamiento médico.
La figura 1 muestra una secuencia de nucleótido (SEQ ID NO:1) de una secuencia nativa ADNc PRO301, en el que SEQ ID NO:1 es un clon designado aquí como "UNQ264" y/o "DNA40628-1216".
La figura 2 muestra la secuencia de amino ácido (SEQ ID NO:2) derivada de la secuencia de codificación SEQ ID NO:1 mostrada en la figura 1.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones
Los términos "polipéptido PRO" y "PRO" se usan en la presente memoria descriptiva y cuando están inmediatamente seguidos de una denominación numérica se refiere a varios polipéptidos, en el que la denominación completa (es decir, PRO/número) se refiere a secuencias polipeptídicas específicas como se describe en la presente memoria descriptiva. Los términos "polipéptido PRO/número" y "PRO/número" como se usan en la presente memoria descriptiva engloban polipéptidos de secuencia nativa y variantes polipeptídicas (que se definen con más detalle en la presente memoria descriptiva). Los polipéptidos PRO descritos en la presente memoria descriptiva se pueden aislar de varias fuentes, como a partir de tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o preparados con procedimientos sintéticos recombinantes.
Un "polipéptido PRO de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia aminoacídica que el polipéptido PRO correspondiente derivado natural. Tales polipéptidos PRO de secuencia nativa se pueden aislar a partir de la naturaleza o se pueden producir por medios sintéticos o recombinantes. El término "polipéptido PRO de secuencia nativa" engloba específicamente formas truncadas naturales o de secreción del polipéptido PRO específico (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes que se producen naturalmente (por ejemplo formas de ayuste alternativas) y variantes alélicas naturales del polipéptido. En una realización de la invención, la secuencia nativa PRO301 es una secuencia nativa madura o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 299 de la Figura 2 (SEQ ID NO:2) con o sin la secuencia de señal N-terminal, con o sin la metionina de inicio en la posición 1, con o sin el dominio potencial de transmembrana en la posición 236 a aproximadamente 258, y con o sin el dominio intracelular en aproximadamente la posición 259 a 299.
"Variante del polipéptido PRO" quiere decir un polipéptido PRO activo como se define anteriormente o a continuación que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia del polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente memoria descriptiva. Tales variantes del polipéptido PRO incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO en los que se añaden, o eliminan uno o más residuos aminoacídicos, en el extremo amino (N) o carboxilo (C) terminal de la secuencia aminoacídica nativa de longitud completa. Habitualmente, una variante de polipéptido PRO tendrá al menos aproximadamente un 80% por ciento de identidad de secuencia aminoacídica, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia aminoacídica e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de la secuencia aminoacídica nativa de longitud completa como se describe en la presente memoria descriptiva.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia aminoacídica" respecto a las secuencias polipeptídicas PRO identificadas en la presente memoria descriptiva se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos de la secuencia polipeptídica PRO específica, después de alinear las secuencias e introducir espacios de disparidad, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia aminoacídica se puede lograr de varios modos accesibles para los expertos en la materia, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles públicamente como los programas BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El programa de alineamiento preferido es BLAST. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para la medida del alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo que se necesite para lograr un alineamiento máximo en toda la longitud de las secuencias que se están comparando.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia nucleotídica" respecto a las secuencias nucleotídicas que codifican los PRO identificadas en la presente memoria descriptiva se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos de la secuencia aminoacídica PRO de interés, después de alinear las secuencias e introducir espacios de disparidad, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia nucleotídica se puede lograr de varios modos accesibles a los expertos en la materia, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles públicamente como los programas BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El programa de alineamiento preferido es BLAST. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para la medida del alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo que se necesite para lograr un alineamiento máximo en toda la longitud de las secuencias que se están comparando.
"Aislado", cuando se usa para describir los varios polipéptidos descritos en la presente memoria descriptiva, quiere decir que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que típicamente puede interferir con el diagnóstico o usos terapéuticos del polipéptido, y que pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o interna usando un secuenciador spinning cup (de taza giratoria), o (2) para homogenizar con SDS-PAGE (gel de poliacrilamida con SDS) en condiciones no reductoras o reductoras usando Azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido in situ en las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido PRO no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará al menos con una etapa de purificación.
Un ácido nucleico polipeptídico PRO "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula nucleotídica contaminante con la que está normalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico polipeptídico PRO. Una molécula de ácido nucleico polipeptídico PRO aislado es distinta de la forma o entorno en el que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico polipeptídico PRO aislado se distinguen, por lo tanto, de la molécula de ácido nucleico polipeptídico PRO específica que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico polipeptídico PRO aislado incluye moléculas de ácido nucleico polipeptídico PRO contenidas en células que normalmente expresan el polipéptido PRO donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.
El "análisis Southern" o "transferencia Southern" es un procedimiento por el que se confirma la presencia de secuencias de ADN en una digestión con endonucleasas de restricción de ADN o una composición que contiene ADN mediante la hibridación con un oligonucleótido o un fragmento de ADN etiquetado conocido. Los análisis Southern típicamente implican una separación electroforética de las digestiones de ADN en geles de agarosa, la desnaturalización del ADN tras la separación electroforética, y la transferencia del ADN a una membrana soporte de nitrocelulosa, nailon o de otro material adecuado para analizarla con una sonda etiquetada con un enzima, biotinizada o etiquetada radiactivamente como se describe en las secciones 9.37-9.52 de Sambrook y col., "Molecular cloning: A Laboratory Manual" (Clonación molecular: Manual de laboratorio) (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989).
El "análisis Northern" o "transferencia Northern" es un procedimiento usado para identificar secuencias de ARN que hibridan con una sonda conocida como un oligonucleótido, un fragmento de ADN, ADNc o sus fragmentos, o un fragmento de ARN. La sonda está etiquetada con un isótopo radiactivo como P^{32}, o por biotinización, o con un enzima. El ARN que se va a analizar normalmente se separa electroforéticamente en un gel de agarosa o poliacrilamida, se transfiere a una membrana de nitrocelulosa, nailon o de otro material adecuado y se hibrida con una sonda, usando técnicas habituales muy conocidas como las que se describen en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook y col., supra.
El término "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora unidas operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias control adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia nucleotídica. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o una secuencia guía de secreción se une operativamente al ADN que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador se une operativamente a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas se une operativamente a una secuencia codificadora si se sitúa de modo que facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas, y en el caso de las secuencias guías de secreción, contiguas y en pauta de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se realiza mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o ADN de enlace según la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales anti-polipéptido PRO únicos (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) y composiciones de anticuerpos anti-polipéptido PRO con especificad poliepitópica. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones naturales que puedan estar en cantidades minoritarias.
"Activo" o "actividad" para los propósitos de la presente memoria descriptiva se refieren a formas del polipéptido PRO que mantienen las actividades biológicas y/o inmunológicas del polipéptido nativo específico o natural. La actividad de un polipéptido PRO332 implica preferiblemente la regulación de la matriz extracelular, y la función cartilaginosa u ósea.
"Tratamiento" o "el tratamiento" se refiere tanto al tratamiento médico como a las medidas preventivas o profilácticas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen a los que ya tienen el trastorno, como a los propensos a tenerlo, en los que hay que prevenir el desorden.
"Mamífero" para los propósitos del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo a los humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoo, de deportes o de compañía, como ovejas, perros, caballos, gatos, vacas y similares. Preferiblemente, el mamífero de la presente memoria descriptiva en un humano.
"Vehículos" como se usa en la presente memoria descriptiva incluyen vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, o estabilizantes que no sean tóxicos para la célula o mamífero expuesto a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo el vehículo fisiológicamente aceptable, es una solución acuosa tamponada. Algunos ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como seroalbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilo como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextranos; agentes quelantes como EDTA; polioles como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal como sodio; y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™.
El término "agonista" se usa para hacer referencia a análogos peptídicos y no peptídicos de los polipéptidos PRO nativos (donde polipéptido PRO nativo se refiere a propolipéptido PRO, prepolipéptido PRO, prepropolipéptido PRO o polipéptido PRO maduro) de la presente invención y a anticuerpos que se unen específicamente a tales polipéptidos PRO nativos, con la condición de que mantengan al menos una actividad biológica del polipéptido PRO maduro. Preferiblemente, los agonistas de la presente invención mantienen las propiedades de reconocimiento de unión cualitativas y las propiedades de activación del receptor del polipéptido PRO maduro.
El término "antagonista" se usa para hacer referencia a una molécula que inhibe una actividad biológica del polipéptido PRO nativo de la presente invención, en la que polipéptido PRO nativo se refiere a propolipéptido PRO, prepolipéptido PRO, prepropolipéptido PRO o polipéptido PRO maduro. Preferiblemente, los antagonistas aquí inhiben la unión de un polipéptido PRO nativo de la presente invención. Un polipéptido PRO "antagonista" es una molécula que evita, o interfiere con, una función efectora antagonista PRO (por ejemplo, una molécula que evita o interfiere con la unión y/o la activación de un receptor del polipéptido PRO por un polipéptido PRO). Tales moléculas se pueden seleccionar por su capacidad de inhibir completamente la activación del receptor del polipéptido PRO controlando la unión de un polipéptido PRO en presencia y ausencia de la molécula antagonista de prueba, por ejemplo. Un antagonista de la invención además engloba un polinucleótido antisentido contra el gen del polipéptido PRO, cuyo polinucleótido antisentido bloquea la transcripción o traducción del gen del polipéptido PRO, inhibiendo por lo tanto su expresión y actividad biológica.
"Condiciones restrictivas" quiere decir (1) el empleo de soluciones de baja resistencia iónica y alta temperatura para los lavados, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015 M; citrato de sodio 0,0015 M; 0,1% de dodecilsulfato de sodio a 50ºC, o (2) el empleo durante la hibridación de un agente desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, 50% de formamida (vol/vol) con 0,1% de seroalbúmina bovina; 0,1% de Ficol; 1% de polivinilpirrolidona; tampón de pirofosfato de sodio 50 nM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC. Otro ejemplo es usar 50% de formamida, SSC 5X (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6/8), 0,1% de pirofosfato de sodio, solución de Denhardt 5X, ADN de esperma de salmón sometido a sonicación (50 \mug/ml), 0,1% de SDS y 10% de sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC 0,2X y 0,1% de SDS. Aún otro ejemplo es la hibridación usando un tampón con 10% de sulfato de dextrano, SSC 2X (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado altamente restrictivo constituido por SSC 0,1X que contenga EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente restrictivas" se describen en Sambrook y col., supra e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, resistencia iónica y % de SDS) menos restrictivas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente restrictivas es una condición como la incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprenda: 20% de formamida, SSC 5X (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5X, 10% de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, seguida con un lavado del filtro en SSC 1X a 37-50ºC. Los expertos en la materia sabrán cómo ajustar la temperatura, concentración iónica, etc., como sea necesario para acomodar factores tales como longitud de la sonda y similares.
II Composiciones y procedimientos de la invención Polipéptidos PRO301 de longitud completa
La presente invención proporciona polipéptidos indicados en la presente solicitud como PRO301 para usarse en procedimientos de tratamiento médico. En particular, los solicitantes han identificado y aislado un ADNc que codifica un polipéptido PRO 301, como se describe con más detalle en los siguientes ejemplos. Usando programas informáticos de alineación de secuencias BLAST y FastA, los solicitantes descubrieron que una secuencia nativa PRO301 de longitud completa (mostrada en la figura 2 y en la SEQ ID NO: 2) tiene una puntuación Blast de 246 correspondiente al 30% de identidad de la secuencia de amino ácido con precursor del antígeno humano A33. En consecuencia, se cree actualmente que el PRO301 descrito en la presente solicitud es un nuevo elemento identificado de la familia de la proteína del antígeno A33 y se puede expresar en enfermedades neoplásticas humanas tales como el cáncer colorectal.
Variantes del polipéptido PRO
Además de los polipéptidos PRO de secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente memoria descriptiva, se contempla que se puedan preparar variantes del polipéptido PRO. Se pueden preparar variantes del polipéptido PRO introduciendo los cambios nucleotídicos apropiados en el ADN del polipéptido PRO, o sintetizando el polipéptido PRO deseado. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios aminoacídicos pueden alterar los procesos postraduccionales de los polipéptidos PRO, como cambios del número o posición de sitios de glicosilación o alteraciones las características de anclaje a la membrana.
Las variaciones de los polipéptidos PRO de secuencia nativa de longitud completa o en varios dominios de los polipéptidos PRO, descritos en la presente memoria descriptiva, se pueden realizar, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y orientaciones para mutaciones conservativas y no conservativas expuestas, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican el polipéptido PRO que tengan como resultado el cambio de la secuencia aminoacídica del polipéptido PRO en comparación con el polipéptido PRO de secuencia nativa. Opcionalmente la variación es por la sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más dominios del polipéptido PRO. La orientación para determinar que aminoácido se puede introducir, sustituir o delecionar sin afectar adversamente la actividad deseada se puede encontrar comparando la secuencia del polipéptido PRO con la de moléculas proteicas conocidas homólogas y minimizando el número de cambios en la secuencia aminoacídica hechos en regiones de alta homología. Las sustituciones aminoacídicas pueden resultar de remplazar un aminoácido con otro que tenga características estructurales y químicas similares, como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, reemplazos aminoacídicos conservativos. Las inserciones y deleciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se pude determinar realizando inserciones, deleciones o sustituciones sistemáticas de aminoácidos en la secuencia y probando la actividad de las variantes resultantes en el ensayo in vitro descritos en los siguientes Ejemplos.
Las variaciones se pueden realizar usando procedimientos conocidos en la técnica como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida), sustitución sistemática de alaninas y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter y col., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis con caete [Wells y col., Gene, 34: 315 (1985)], mutagénesis por selección de restricción [Wells y col., Philos. Trans R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] u otras técnicas conocidas se pueden realizar sobre el ADN clonado para producir el ADN variante del polipéptido PRO.
El análisis de aminoácidos de sustitución sistemática se puede también emplear para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de sustitución sistemática preferidos están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de sustitución sistemática preferido entre este grupo ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina se prefiere además típicamente porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones protegidas y expuestas [Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman y Cía., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isostérico.
Modificaciones de Polipéptidos PRO
Las modificaciones covalentes de los polipéptidos PRO están incluidas en el alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los residuos aminoacídicos diana del polipéptido PRO con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos N-terminal o C-terminal del polipéptido PRO. La Es útil la derivatización con agentes bifuncionales, por ejemplo para reticular (crosslinking) un polipéptido PRO a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para usar en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-polipéptido PRO, y viceversa. Los agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano; glutaraldehído; ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-acidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo como 3,3'-ditiobis(succinidimilpropionato), maleimidas bifuncionales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes como metil-3-[(p-acidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desaminación de residuos glutaminilo y asparraginilo hasta los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T. E. Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties" (Proteínas: Estructura y Propiedades Moleculares) Freeman y Cía., San Francisco, págs 79-86 (1983)].
Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos PRO incluidos en el alcance de esta invención comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del polipéptido. "La alteración del patrón de glicosilación nativo" está diseñada para los propósitos de la presente memoria descriptiva para significar eliminar uno o más residuos glucídicos encontrados en la secuencia nativa del polipéptido PRO, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no estén presentes en el polipéptido PRO de secuencia nativa.
La adición de sitios de glicosilación al polipéptido PRO se puede lograr alterando la secuencia aminoacídica. La alteración se puede realizar, por ejemplo, añadiendo o sustituyendo uno o más residuos de serinas o treoninas al polipéptido PRO de secuencia nativa (para sitios de enlace O-glucosídico). La secuencia aminoacídica del polipéptido PRO se puede alterar opcionalmente a través de cambios a nivel del ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido PRO en bases preseleccionadas ya que esos codones generados se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios de aumentar el número de residuos glucosídicos en el polipéptido PRO es por unión química o enzimática de glucósidos al polipéptido. Tales procedimientos se describen en la técnica, por ejemplo, en el documento WO87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs 259-306 (1981).
La eliminación de residuos glucosídicos presentes en el polipéptido PRO se puede conseguir químicamente o enzimáticamente o por sustitución mutacional de codones que codifiquen residuos aminoacídicos que sirvan de diana de glicosilación. Las técnicas de desgliosilación química se conocen en la técnica y se describen por ejemplo, en Hakimuddin y col., Arch. Biochem. Biophys.., 259: 52 (1987) y en Edge y col., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). El corte enzimático de los residuos glucídicos de polipéptidos se puede lograr usando una variedad de endoglicosidasas y exoglicosidasas como se describe en Thotakura y col., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos PRO de la invención comprende la unión del polipéptido PRO a una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, en la manera expuesta en las Patentes de EE.UU. Nº 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192, o 4.179.337.
Los polipéptidos PRO de la presente invención se pueden modificar además de modo que formen una molécula quimérica que comprenda un polipéptido PRO fusionado a otra secuencia polipeptídica o aminoacídica heteróloga. En una realización, tal molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido PRO con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que un anticuerpo antietiqueta se puede unir selectivamente. La etiqueta epítopo se coloca generalmente en los extremos amino terminal o carboxilo terminal del polipéptido PRO. La presencia de tales formas etiquetadas con epítopo posibilita que el polipéptido PRO sea fácilmente purificado mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo antietiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la etiqueta epítopo. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO con una inmunoglobina o una región particular de una inmunoglobina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, tal fusión puede ser con la región Fc de una molécula de IgG.
Varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos son muy conocidos en la técnica. Algunos ejemplos incluyen polihistidina (poli-His) o polihistidinglicina (Poli-His-Gly); el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field y col., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la etiqueta Myc-c y sus anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 [Evan y col., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)].; y la etiqueta glicoproteína D del virus Herpes Simple (gD) y su anticuerpo [Paborsky y col., Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)] Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp y col., Biotechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; el péptido epítopo KT3 [Martin y col., Science, 225: 192-194 (1992)]; un péptido epítopo de \alpha-tubulina [Skinner y col., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)] y la etiqueta peptídica del la proteína de gen 1o del T7 [Lutz-Freyermuth y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 87: 6393-6397 (1990)].
Preparación de Polipéptidos PRO
La siguiente descripción describe principalmente la producción de polipéptidos PRO cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico del polipéptido PRO deseado. Se contempla, por supuesto, que se puedan emplear procedimientos alternativos, muy conocidos en la técnica, para preparar el polipéptido PRO. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido PRO, o sus porciones, se pueden producir por síntesis peptídica directa usando técnicas en fase sólida [ver por ejemplo, Stewart y col., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman y Cía., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar usando técnicas manuales o automáticas. La síntesis automática se puede lograr, por ejemplo, usando un sintetizador peptídico de Applied Biosystems (Foster City, CA) usando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del polipéptido PRO deseado e pueden sintetizar químicamente por separado y combinar usando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido PRO de longitud completa.
A. Aislamiento de ADN que codifica Polipéptidos PRO
El ADN que codifica los polipéptidos PRO se puede obtener de una genoteca de ADNc preparada a partir de un tejido que se crea que posee el ARNm del polipéptido PRO deseado a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN del polipéptido PRO humano se puede obtener convenientemente de una genoteca de ADNc preparada a partir de un tejido humano, como se describe en los Ejemplos. El gen que codifica el polipéptido PRO se puede obtener además a partir de genotecas genómicas o por síntesis de oligonucleótidos.
Las genotecas se pueden investigar con sondas (como los anticuerpos frente al polipéptido PRO deseado u oligonucleótidos de la menos aproximadamente 20-80 pares de bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína que codifica. La investigación de la genoteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada se puede llevar a cabo usando procedimientos habituales, como se describe en Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Clonación molecular: Manual de laboratorio) (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el polipéptido PRO deseado es usar la metodología de la PCR [Sambrook y col., supra; Dieffenbach y col., "PCR Primer: A Laboratory Manual" (Cebador de PCR: Manual de laboratorio; New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los siguientes Ejemplos describen técnicas para investigar una genoteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben tener suficiente longitud y ser lo suficientemente precisas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido se etiqueta preferiblemente de modo que se pueda detectar un vez hibridado al ADN en la genoteca que se está investigando. Los procedimientos de etiquetado son muy conocidos en la técnica, e incluyen el uso de etiquetas radiactivas como ATP etiquetado con P^{32}, biotinización o etiquetado enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo condiciones moderadamente restrictivas y muy restrictivas, se proporcionan en Sambrook y col., supra.
Las secuencias identificadas en tales procedimientos de investigación de librerías se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identificación de la secuencia (a nivel aminoacídico o nucleotídico) dentro de las regiones definidas de la molécula o por toda la longitud de la secuencia se puede determinar a través de un alineamiento de secuencias usando un programa informático como BLAST, ALIGN, DNAstar e INHERIT que emplea varios algoritmos para medir la homología.
El ácido nucleico que tiene la secuencia que codifica la proteína se puede obtener investigando la genoteca de ADNc o genómica usando la secuencia aminoacídica deducida descrita en la presente memoria descriptiva por primera vez y, si fuera necesario, usando procedimientos de extensión con cebador convencionales que se describen en Sambrook y col., supra, para detectar precursores e intermediarios de procesamiento del ARNm que puedan no haber sido retrotranscritos a ADNc.
B. Selección y transformación de células hospedadoras
Las células hospedadoras se transfectan o transforman con los vectores de expresión o de clonación descritos en la presente memoria descriptiva para la producción de polipéptido PRO y se cultivan en medios nutricionales convencionales modificados como sea apropiado para inducir a los promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Los expertos en la materia pueden seleccionar las condiciones de cultivo, como medios, temperatura, pH y similares, sin excesiva experiencia. En general, en "Mammalian Cell Biotechnology a Practical Approach" (Biotecnología con células de mamífero: Enfoque práctico), M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y en Sambrook y col., supra, se pueden encontrar los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares.
Los expertos habituales en la materia conocen muy bien los procedimientos de transfección, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. Dependiendo de la célula hospedadora que se use, la transformación se realiza usando técnicas habituales apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio, que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook y col., supra, o la electroporación se usa generalmente para procariotas u otras células que contienen paredes celulares barrera considerables. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, como se escribe en Shaw y col., Gene, 23: 315 (1983) y en el documento WO89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin tales paredes celulares, se puede emplear el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb., Virology, 53: 456-457 (1978). Se han descrito los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células hospedadoras de mamífero en la Patente de EE.UU. Nº 4.339.216. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo típicamente según el procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Nati. Acad. Sci. (EE.UU), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también se pueden emplear otros procedimientos para introducir ADN en las células, como por microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para varias técnicas de transformación de células de mamífero, ver Keown y col., Methods in Enzimology, 185: 527-537 (1990) y Mansour y col., Nature, 336: 348-352 (1988).
Las células hospedadoras adecuadas para clonar o expresar el ADN de los vectores en la presente memoria descriptiva incluyen procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Los procariotas adecuados incluyen pero no se limitan a eubacterias, como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo Enterobacterias como E. coli. Varias cepas de E. coli son disponibles públicamente, como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.357); cepa de E. coli W3110 (ATCC 53.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Otras células hospedadoras procariotas adecuadas incluyen enterobacterias como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Kleibsella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhymurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens, y Sighella, así como Bacilos como, B. subtillis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aureginosa, y Streptomyces. Varias cepas de E. coli son disponibles públicamente, como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.357); cepa de E. coli W3110 (ATCC 53.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es una célula hospedadora o célula parenteral preferida particularmente porque es una cepa hospedadora común para fermentaciones con productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula hospedadora secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo la cepa W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas de la hospedadora., con ejemplos de tales hospedadoras que incluyen E. coli W3110 cepa 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; E. coli W3110 cepa 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3, E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT karl; E. coli W3110 cepa 37D6 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan^{r}; E. coli W3110 cepa 40B4 que es la cepa 37D6 con una mutación por deleción degP sin resistencia a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de EE.UU. Nº 4.946.783 publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados otros procedimientos in vitro de clonación, por ejemplo PCR u otras reacciones con polimerasa de ácido nucleico.
Además de los procariotas, los microorganismos eucariotas como hongos filamentosos o las levaduras son adecuados como hospedadores de clonación o expresión de vectores que codifican el polipéptido PRO. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo hospedador eucariota inferior usado comúnmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; (documento EP139.383 publicado el 2 de mayo de 1985); Hospedadores de Kluiveromyces (Patente de EE.UU. Nº 4.943.529; Fleer y col., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y col., J. Bacteriol., 737 [1993]), K. fragilis (ATCC 12.244), K. bulgaricus (ATCC16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophylarum (ATCC 36.906; Van dern Berg y col., Bio/Technollogy, 8: 135 (1990)); K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (documento EP402.226) Pichia pastoris (documento EP183.070; Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (documento EP244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 76: 5259-5263 [1979]; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis (documento EP394.538 publicado el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos como, por ejemplo Neurospora, Penicillium, Tolyplocadium (WO91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y hospedadores aspergillus como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]); Tiburn y col., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton y col., Proc. Nati. Acad. Sci EE.UU, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly ye Hynes, EMBO J. 4: 475-479 [1985]. Las levaduras metilotróficas son adecuadas en la presente memoria descriptiva pero no se limitan a, una levadura capaz de crecer en metanol seleccionada entre los géneros constituidos por Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Se puede encontrar una lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras en C. Anthony, "The Biochemistry of Methylotrophs" (Bioquímica de los Metilótrofos), 269 (1982).
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos PRO glicosilados se derivan de organismos pluricelulares. Algunos ejemplos de células de invertebrado incluyen células de insecto como Drosophyla S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Algunos ejemplos de células hospedadoras de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y células COS. Ejemplos más específicos incluyen línea de riñón de mono CV1 transformada con el SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 ó 293 subclonadas para un crecimiento en cultivos en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); células de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (YM4, Mather Biol Reprod., 23: 243-251 (1980)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas (Hep G2, HB 8065); y células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). Se supone que la selección de la célula hospedadora apropiada depende de la experiencia en la materia.
C. Selección y uso de vectores replicativos
El ácido nucleico (por ejemplo ADNc o ADN genómico) que codifica un polipéptido PRO deseado se puede introducir en un vector replicativo para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Hay varios vectores públicamente disponibles. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia nucleotídica apropiada se puede introducir en el vector mediante varios procedimientos. En general, el ADN se introduce en un(os) sitio(s) de una endonucleasa de restricción apropiado usando las técnicas conocidas en la materia. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación habituales que los expertos en la materia conocen.
El polipéptido PRO de interés se puede producir de modo recombinante no sólo directamente, sino además como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en el extremo N terminal de la proteína madura o del polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN del polipéptido PRO que se introduce en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la secuencias guía de la fosfatasa alcalina, la penicilasa, la 1pp, o la enterotoxina termoestable II. Para la secreción en levaduras la secuencia señal, por ejemplo, la secuencia guía de la invertasa de levadura, la secuencia guía del factor alfa (incluyendo los factores \alpha de Saccharomyces y Kluiveromyces, descrito el último en la Patente de EE.UU. Nº 5.010.182), o la secuencia guía de la fosfatasa ácida, la secuencia guía de la glucoamilasa de C. albicans (documento EP362.179 publicado el 4 de abril de 1990), o la secuencia señal descrita en el documento WO90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero, se pueden usar secuencias señal para dirigir la secreción de la proteína, como secuencias señal de polipéptidos de secreción de la misma especie o relacionadas, así como secuencias guía de secreción virales.
Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia nucleotídica que hace que el vector se pueda replicar en una o más células hospedadoras seleccionadas. Tales secuencias son muy conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gram negativas, el origen del plásmido de 2 \mum es adecuado para levaduras y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero.
Los vectores de expresión y clonación contendrán típicamente un gen de selección, también denominado marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan diferencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes críticos no disponibles en los medios complejos, por ejemplo el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilos.
Un ejemplo de marcadores de selección adecuados para células de mamífero son aquellos que posibilitan la identificación de las células competentes para llevar el ácido nucleico del polipéptido PRO, como DHFR o timidina quinasa. Una célula hospedadora apropiada cuando se emplea un DHFR silvestre es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como se describe en Urlaub y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 77: 4216 (1980). Un gen de selección adecuado para usar en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras YRp7 [Stinchcomb y col., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979; Tschemper y col., Genes, 10: 157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo ATCC Nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].
Los vectores de expresión y clonación contienen normalmente un promotor unido operativamente a la secuencia nucleotídica del polipéptido PRO para dirigir la síntesis del ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células hospedadoras potenciales son muy conocidos. Los promotores adecuados para usar con hospedadores procariotas incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y de la lactosa [Chang y col., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281: 544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptófano (trp), [Goedel, Nucleic Acid Res., 8: 4057 (1980); documento EP36.776], y promotores híbridos como el promotor tac [deBoer y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 80: 21-25 (1983)]. Los promotores para usar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el polipéptido PRO deseado.
Algunos ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usar con células hospedadoras de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)], u otros enzimas glucolíticos [Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968)]; Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978), como la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de tener controlada la transcripción mediante condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas de degradación asociadas al metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para el uso en expresión en levaduras se describen con más detalle en el documento EP73.657.
La transcripción del polipéptido PRO a partir de vectores en células hospedadoras de mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus como el virus del polioma o el virus de la viruela aviar (documento UK2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus a, virus de la hepatitis B y virus del simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de una inmunoglobulina, y promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula hospedadora.
La transcripción de un ADN que codifique el polipéptido PRO deseado en eucariotas superiores se puede incrementar introduciendo una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Muchas secuencias potenciadoras se conocen muy bien actualmente para genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus celular eucariota. Algunos ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el extremo tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma o en el extremo tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede cortar y desplazar a la posición 5' ó 3' de la secuencia que codifica el polipéptido PRO, pero se localiza preferiblemente en el sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanas o células nucleadas de otro organismo pluricelulares) contendrán además secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias son comúnmente disponibles en el extremo 5' y, ocasionalmente del 3', regiones no traducidas de ADNs o ADNcs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica los polipéptidos PRO.
Aún otros procedimientos, vectores y células hospedadoras adecuadas para la adaptación para la síntesis de polipéptidos PRO en cultivos celulares de vertebrado recombinantes se describen en Gething y col., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei y col., Nature, 281: 40-46 (1979); documentos EP117.060 y EP117.058.
D. Detección de la amplificación/expresión del gen
La amplificación y/o expresión génica se puede medir directamente en una muestra, por ejemplo, con una transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 77: 5201-5205 (1980)], transferencia en mancha (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda etiquetada apropiadamente, en base a las secuencias proporcionadas en la presente memoria descriptiva. Alternativamente, se pueden usar anticuerpos que reconozcan dúplex específicos incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex ADSN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden etiquetar y el ensayo se lleva a cabo cuando el dúplex está unido a la superficie, de modo que tras la formación del dúplex en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpos unidos al dúplex.
La expresión génica, alternativamente, se puede medir mediante procedimientos inmunológicos, como tinciones inmunohistoquímicas de células cortes de tejidos y análisis de cultivos celulares o fluidos sanguíneos, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o análisis de muestras de fluidos pueden ser monoclonales o policlonales y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido PRO de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente memoria descriptiva o contra secuencias exógenas fusionadas al ADN de un polipéptido PRO y que codifican un epítopo para un anticuerpo específico.
E. Purificación del Polipéptido
Las formas de polipéptidos PRO se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisados de las células hospedadoras. Si están unidos a la membrana, se pueden liberar de la membrana usando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o por corte enzimático. Las células empleadas en la expresión de los polipéptidos PRO se pueden romper por varios procedimientos físicos o químicos, como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica, o agentes de lisis celular.
Puede desearse purificar los polipéptidos PRO a partir de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados. Por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en una resina de sílice o de intercambio catiónico como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE (gel de poliacrilamida con SDS); precipitación con sulfato de amonio; usando filtración por gel, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de Proteína A-Sepharose para eliminar los contaminantes como IgG; y columnas de quelantes metálicos para unir las formas etiquetadas con epítopos del polipéptido PRO. Se pueden varios procedimientos de purificación de proteínas como procedimientos muy conocidos en la técnica y descritos por ejemplo en Deutscher, "Methods in Enzimology" (Procedimientos en enzimología), 182 (1990); Alcances, "Protein Purification: Principles and Practice" (Purificación de proteínas: Principios y práctica), Springer-Verlag, New York (1982). Las etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y el polipéptido PRO particular producido.
Usos para los polipéptidos PRO
Las secuencias nucleotídicas (o sus complementarias) que codifican los polipéptidos PRO de la presente invención, tienen varias aplicaciones en la técnica de la biología molecular, incluyendo uso en sondas de hibridación, en mapeo cromosómico y génico y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO será además útil para la preparación de polipéptidos PRO mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente memoria descriptiva.
El ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa o sus porciones, se pueden usar como sondas de hibridación para genotecas de ADNc para aislar el gel del polipéptido PRO de longitud completa o para aislar aún otros genes (por ejemplo, los que codifican variantes naturales del polipéptido PRO o de los polipéptidos PRO de otras especies) que tengan una identidad de secuencia deseada con las secuencias nucleotídicas del polipéptido PRO. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a 50 bases. Las sondas de hibridación se pueden derivar de secuencias nucleotídicas de cualquiera de las moléculas de ADN descritas en la presente memoria descriptiva o de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos potenciadores e intrones del ADN que codifica el polipéptido PRO de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un procedimiento de selección comprenderá el aislamiento de la región codificadora del gen del polipéptido PRO usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación se pueden etiquetar con una variedad de etiquetas, incluyendo radionucleótidos como P^{32} o S^{35}, o etiquetas enzimáticas como la fosfatasa alcalina unida a la sonda vía sistemas de unión avidina/biotina. Se pueden usar sondas etiquetadas que tengan una secuencia complementaria a la del gen del polipéptido PRO específico de la presente invención para investigar genotecas de ADNc, ADN genómico o ARNm humanas para identificar con que miembros de tales genotecas hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con más detalle en los siguientes Ejemplos.
Las TSE descritas en la presente solicitud se pueden emplear de modo similar como sondas, usando los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva.
Las sondas se pueden emplear en técnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para identificar secuencias de polipéptido PRO estrechamente relacionadas.
Las secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido PRO se pueden usar además para construir sondas de hibridación para el mapeo del gen que codifica es polipéptido PRO y para el análisis genético de individuos con alteraciones genéticas. Las secuencias nucleotídicas proporcionadas en la presente memoria descriptiva se pueden usar para el mapeo de un cromosoma y regiones específicas del cromosoma usando técnicas conocidas como la hibridación in situ, análisis de unión frente marcadores cromosómicos conocidos e investigación de genotecas por hibridación.
Los polipéptidos PRO se pueden usar en análisis para identificar sus ligandos. De modo similar, se pueden identificar los inhibidores de la interacción de unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en tal interacción de unión se pueden usar además para investigar péptidos o pequeñas moléculas inhibidoras o agonistas de la interacción de unión. Los análisis de investigación se pueden diseñar para encontrar compuestos guía que mimeticen la actividad biológica del polipéptido PRO nativo o un ligando para el polipéptido PRO. Tales análisis de investigación incluirán análisis preparadas para investigaciones de alto rendimiento de genotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos farmacológicos de molecularmente pequeños. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los análisis se pueden realizar de varias formas, incluyendo análisis de unión proteína-proteína, análisis de investigación bioquímica, inmunoanálisis y análisis celulares, caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido PRO o sus formas modificadas se pueden usar además para generar animales transgénicos o animales "knock out" (sin un determinado gen) que a su vez, son útiles en el desarrollo e investigación terapéutica de reactivos útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgen, dicho transgen fue introducido en el animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, en una etapa embrionaria. Un transgen es un ADN que se integra en el genoma de una célula a partir de la que se desarrolla un animal. En una realización, el ADNc que codifica un polipéptido PRO de interés se puede utilizar para clonar ADN genómico que codifique el polipéptido PRO según con las técnicas establecidas y las secuencias genómicas usadas para generar los animales transgénicos que contienen las células que expresan el ADN que codifica el polipéptido PRO. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales como ratones o ratas, se han convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº 4.736.866 y 4.870.009. Típicamente, las células individuales serán las dianas para la incorporación de un transgen del polipéptido PRO con potenciadores específicas de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica un polipéptido PRO introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria se pueden usar para examinar el efecto de la expresión aumentada del ADN que codifica el polipéptido PRO. Tales animales se pueden usar como animales de prueba para reactivos que se crea que confieren protección frente, por ejemplo, a estados patológicos asociados con su sobreexpresión. Según esta faceta de la invención, un animal se trata con el reactivo y una incidencia reducida del estado patológico en comparación con los animales sin tratar que lleven el transgen, indicaría una intervención terapéutica potencial del estado patológico.
Alternativamente, se pueden usar homólogos no humanos de los polipéptidos PRO para construir un animal "knock out" para el polipéptido PRO que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica el polipéptidos PRO de interés como resultado de una recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el polipéptidos PRO y un ADN genómico alterado que codifica el polipéptidos PRO introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, ADNc que codifique un polipéptidos PRO que se use para clonar ADN genómico que codifica el polipéptidos PRO según las técnicas establecidas. Se puede eliminar o reemplazar una porción del ADN genómico que codifica un polipéptido PRO con otro gen como un gen que codifique un marcador de selección que se usa para controlar la integración. Típicamente, se incluyen en el vector varias quilobases de ADN sin alterar flanqueante (tanto en el extremo 5' como en el 3') [ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea celular troncal embrionaria (por ejemplo por electroporación) y se seleccionan las células en las que se introdujo el ADN y ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno [ver por ejemplo, Li y col., Cell, 69: 915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocisto de un animal (por ejemplo, ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver por ejemplo, Bradley, en "Teratocarcinomas and Embrionyc Stem Cells: A Practical Approach", (Teratocarcinomas y células troncales embrionarias: Un enfoque práctico), E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), págs 113-125]. Un embrión quimérico se puede después implantar en un animal receptor hembra pseudoembarazada adecuada y el embrión llevado a término para crear un animal "knock out". La descendencia que porta el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales se puede identificar mediante técnicas habituales y se puede usar para criar animales que contengan en todas sus células el ADN recombinado homólogamente. Los animales "knock out" se pueden caracterizar por ejemplo, por su capacidad de defenderse frente ciertos estados patológicos y por su desarrollo de estados patológicos debido a la ausencia del polipéptido PRO.
El PRO301 nativo (SEQ ID NO:2) tiene una puntuación Blast de 246 y una homología del 30% en los residuos 24 a 282 de la figura 2 con A33_HUMAN, un precursor del antígeno A33. El precursor del antígeno A33, tal como se explica en los antecedentes, es un antígeno de tumores específicos, y como tal, es un marcador reconocido y objetivo terapéutico para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer de colon. La expresión de antígenos de tumores específicos se asocia a menudo con la progresión de enfermedades de tejido neoplástico. El PRO301 nativo (SEQ ID NO:2) y A33_HUMAN también muestran una puntuación Blast de 245 y una homología del 30% en los residuos 21 a 282 de la figura 2 con A33_HUMAN, dependiendo la variación de cómo están insertados los espacios en las secuencias comparadas. El PRO301 nativo (SEQ ID NO:119) también tiene una puntuación Blast de 165 y una homología del 29% en los residuos 60 a 255 de la figura 2 con HS46KDA_1, una proteína receptora de coxsackie humano y adenovirus, también conocida como proteína superficial celular HCAR. Esta región del PRO301 también muestra una puntuación Blast similar y una homología con HSU90716_1. La expresión de estas proteínas se asocia usualmente con infecciones virales y se pueden concebir en consecuencia terapias para la prevención de esta infección. Como se menciona en los antecedentes, la expresión de los receptores virales está a menudo asociada con los tumores
neoplásticos.
Anticuerpos de Polipéptido Anti-PRO
La presente invención también proporciona anticuerpos de polipéptido anti-PRO. Anticuerpos de ejemplo incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.
A. Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos anti polipéptido PRO pueden comprender anticuerpos policlonales. Los expertos en la materia conocen los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales se pueden producir en un mamífero, por ejemplo mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectará en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido PRO o una de sus proteínas de fusión. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína que se sepa que es inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Algunos ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de semilla de soja. Algunos ejemplos de adyuvantes que se pueden emplear incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (Monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trealosa sintético). Un experto en la materia sin demasiada experiencia puede seleccionar el protocolo de inmunización.
B. Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos anti polipéptido PRO pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando procedimientos de formación de hibridomas, como los que se describen en Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de formación de hibridomas, un ratón, hámster u otro animal hospedador apropiado, se inmuniza típicamente con un agente inmunizante para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan activamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.
El agente inmunizante incluirá típicamente el polipéptido PRO de interés o una de sus proteínas de fusión. Generalmente, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o células de ganglios linfoides si se desean fuentes mamíferas no humanas. Los linfocitos se fusionan entonces con una línea inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice" (Anticuerpos monoclonales: Principios y práctica), Academic Press, (1986) págs 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son normalmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen murino, bovino o humano. Normalmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se cultivan en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de células inmortalizadas sin fusionar. Por ejemplo, si las células parenterales carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan eficazmente, soportan los altos y estables niveles de expresión de anticuerpo de las células que producen el anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que se pueden obtener por ejemplo, del Salk Institue Cell Distribution Center (Centro de distribución celular del Instituo Salk), San Diego, California y del American Type Culture Collection (Colección de cultivos tipo estadounidense), Rockville, Maryland. Se ha descrito también a las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma murino-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y col., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications" (Técnicas y aplicaciones de la producción de anticuerpos monoclonales), Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) págs 51-63].
Se puede analizar el medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma para ver la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido PRO de interés. Preferiblemente, la especificidad de unión los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante análisis de unión in vitro, como radioinmunoanálisis (RIA) o análisis de inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA). Tales técnicas son análisis conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y se pueden crecer mediante procedimientos habituales [Goding, supra]. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, Medio Eagle modificado de Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente las células de hibridoma se pueden crecer in vivo como una ascitis en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar a partir de medios de cultivo o del fluido de la ascitis mediante procedimientos de purificación con inmunoglobulinas convencionales, por ejemplo, Proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales se pueden realizar además por procedimientos de ADN recombinante, como los descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la infección se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo usando sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que se transfectan en células hospedadoras como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras. El ADN también se puede modificar por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas [Patente de EE.UU. Nº 4.816.567; Morrison y col., supra] o mediante unión covalente a toda la secuencia codificadora de la inmunoglobulina o parte de la secuencia codificadora de un polipéptido no inmunoglobulina. Tal polipéptido no inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se pueden sustituir por los dominios variables de un sitio de combinación con el antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente
quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera de la inmunoglobulina y una cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto de la región Fc para evitar la reticulación (crosslinking) de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos pertinentes de cisteína se sustituyen con otro residuo aminoacídico o se eliminan para evitar la reticulación (crosslinking).
Los procedimientos in vitro son también adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir sus fragmentos, particularmente, fragmentos Fab, se puede lograr usando técnicas habituales conocidas en la técnica.
C. Anticuerpos humanizados
Los anticuerpos anti polipéptido PRO de la invención pueden comprender adicionalmente anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o sus fragmentos (como Fv, Fab, Fab', F(ab)_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígenos) que contienen secuencias mínimas derivadas de una inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las que residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor se reemplazan con residuos de una CDR de especies no humanas (anticuerpo del donante) como ratón, rata o conejo que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos ejemplos, los residuos de la estructura Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos correspondientes no humanos. Los anticuerpos humanizados pueden comprender además residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo del receptor ni en la CDR o secuencias estructurales importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos un, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de una inmunoglobulina humana consenso. El anticuerpo humanizado óptimamente comprenderá demás al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son muy conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos introducidos en el de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos se refieren a menudo a residuos de "importación", que se toman típicamente de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239: 1534-1536 (1988)], sustituyendo CDR murinas o secuencias CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de EE.UU. Nº 4.816.567), en los que sustancialmente, menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente residuos FR están sustituidos por residuos de sitios análogos de anticuerpos murinos.
Los anticuerpos humanos se pueden producir además usando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo genotecas de exposición a fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Están además disponibles las técnicas de Cole y col., y Boerner y col., para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col,. "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy" (Anticuerpos monoclonales y terapia del cáncer), Alan R. Liss, pág 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)].
D. Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En el caso que nos ocupa, una de las especificidades de unión es por el polipéptido PRO, la otra es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por una proteína de superficie celular o receptor o subunidad receptora.
Los procedimientos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas pesada-ligera/ligera-pesada de inmunoglobulinas, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (quadromas), producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo distintas, de las que sólo una tiene la correcta estructura biespecífica. La purificación de la molécula correcta se logra normalmente por etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en el documento WO93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y col., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
Los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra CH2 y CH3. Se prefiere que tengan la primera región constante (CH1) de la cadena pesada que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina, si se desea, la cadena pesada de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh y col., "Methods in Enzymology" (Procedimientos en enzimología), 121: 210 (1986).
E. Anticuerpos heteroconjugados
Los anticuerpos heteroconjugados están además dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto a tales anticuerpos, por ejemplo, para hacer diana en células del sistema inmune para células no deseadas [Patente de EE.UU. Nº 4.676.980], y para el tratamiento de la infección del VIH [documentos WO91/00360; WO92/200373; EP03089]. Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vitro usando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo las que implican agentes de reticulantes. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Algunos ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 4.676.980.
Usos de los anticuerpos anti polipéptido PRO
Los anticuerpos anti polipéptido PRO de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo los anticuerpos anti polipéptido PRO se pueden usar en ensayos de diagnóstico para un polipéptido PRO, por ejemplo para detectar la expresión en células, tejidos específicos, o suero. Se pueden usar varias técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en la técnica, como ensayos de unión competitiva, ensayos bocadillo directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques" (Anticuerpos monoclonales: Manual de técnicas), CRC Press. Inc. (1987) págs 147-158]. Los anticuerpos usados en los ensayos de diagnóstico se pueden etiquetar con un residuo detectable. El residuo detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el residuo detectable puede ser un isótopo radiactivo, como H^{3}, C^{14}, P^{32}, S^{35} o I^{125}, un compuesto fluorescente o quimiofluorescente, como fluoresceína isotiocianato, rodamina, o luciferina, o un enzima, como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante. Se puede emplear cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo al residuo detectable, incluyendo los procedimientos descritos en Hunter y col., Nature, 144: 945 (1962); David y col., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain y col., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem and Cytochem., 30: 407 (1982).
Los anticuerpos anti polipéptido PRO son además útiles para la purificación por afinidad de un polipéptido PRO a partir de un cultivo de células recombinantes o de fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra el polipéptido PRO se inmovilizan en un soporte adecuado, como resina Sephadex o papel de filtro, usando procedimientos muy conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto entonces con una muestra que contiene el polipéptido PRO que se va a purificar, una vez purificado, se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra salvo el polipéptido PRO, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará el polipéptido PRO del anticuerpo.
El PRO301 nativo (SEQ ID NO:2) tiene una puntuación Blast de 246 y una homología del 30% en los residuos 24 a 282 de la figura 2 con A33_HUMAN, un precursor del antígeno A33. El precursor del antígeno A33, tal como se explica en los antecedentes, es un antígeno de tumores específicos, y como tal, es un marcador reconocido y objetivo terapéutico para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer de colon. La expresión de antígenos de tumores específicos se asocia a menudo con la progresión de enfermedades de tejido neoplástico. El PRO301 nativo (SEQ ID NO:119) y A33_HUMAN también muestran una puntuación Blast de 245 y una homología del 30% en los residuos 21 a 282 de la figura 2 con A33_HUMAN, dependiendo la variación de cómo están insertados los espacios en las secuencias comparadas. El PRO301 nativo (SEQ ID NO:2) también tiene una puntuación Blast de 165 y una homología del 29% en los residuos 60 a 255 de la figura 2 con HS46KDA_1, una proteína receptora de coxsackie humano y adenovirus, también conocida como proteína superficial celular HCAR. Esta región del PRO301 también muestra una puntuación Blast similar y una homología con HSU90716_1. La expresión de estas proteínas se asocia usualmente con infecciones virales y se pueden concebir en consecuencia terapias para la prevención de esta infección. En consecuencia, los anticuerpos de los antígenos y receptores identificados anteriormente tienen potencial terapéutico como técnicas de diagnóstico y tratamiento.
Los antígenos específicos o asociados a un cáncer permiten la creación de anticuerpos monoclonales específicos de tumores o cánceres (mAbs) que son específico para los antígenos de dicho tumor. Tales mAbs, que distinguen entre células normales u cancerosas son útiles en diagnosis, prognosis y tratamiento de la enfermedad.
Anticuerpos monoclonales específicos de un cáncer (mAbs) que son específicos frente los antígenos de un tumor. Tales mAbs, que pueden distinguir entre células normales y cancerosas son útiles en diagnosis, prognosis y tratamiento de la enfermedad. Se sabe que ciertos antígenos están asociados con enfermedades neoplásicas, como cáncer colorectal o de mama. Debido a que el cáncer de colon es una enfermedad muy extendida, una diagnosis y un tratamiento precoces son un importante objetivo médico. La diagnosis y el tratamiento del cáncer se pueden llevar a cabo usando anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos que tengan por tanto etiquetas fluorescentes, nucleares magnéticas o radiactivas. Se pueden usar genes radiactivos, toxinas y/o mAbs etiquetados con un fármaco para el tratamiento in situ con una mínima descripción del paciente.
Los siguientes ejemplos se ofrecen con propósitos sólo ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en ningún modo.
Ejemplos
Los reactivos disponibles comercialmente mencionados en los ejemplos se usaron según las instrucciones del fabricante a menos que se indique de otro modo. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y en toda la memoria descriptiva, mediante números de registro de adquisiciones ATCC es la American Type Cultures Collection (Colección de cultivos tipo estadounidense), Rockville Maryland.
Ejemplo 1 Investigación de homología de dominios extracelulares para identificar polipéptidos novedosos y sus ADNc codificadores
Se usaron las secuencias de los dominios extracelulares (SCD) (incluyendo la secuencia señal de secreción, si existiera) de aproximadamente 950 proteínas de secreción conocidas de la base de datos pública Swiss-Prot para buscar bases de datos de EST. Las bases de datos de EST incluyeron bases de datos públicas (por ejemplo, Dayhoff, GenBank), y bases de datos privadas (por ejemplo, LIFESEQ™, Incyte Pharmaceutical, Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó usando el programa informático BLAST o BLAST2 (Altschul. y Gish, Methods in Enzimology, 266: 460-80 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html) como comparación de las secuencias proteicas ECD hasta una traducción de 6 pautas de lectura de las secuencias EST. Aquellas comparaciones que con un Blast tuvieron un resultado de 70 (o 90 en algunos casos) o mayor y que no codificaban proteínas conocidas se agruparon y reunieron en secuencias de ADN consenso con el programa "phrap" (Phil Green, Universidad de Washington, Seattle, WA; (http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html).
Usando esta investigación de homología de dominios extracelulares, se reunieron secuencias de ADN consenso relacionadas con las otras secuencias EST identificadas. Además, las secuencias de ADN consenso obtenidas a menudo (pero no siempre) se extendieron usando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender la secuencia consenso tanto como fuera posible usando las fuentes de secuencias EST descritas anteriormente.
En base a las secuencias consenso obtenidas como se describe anteriormente, se sintetizaron después oligonucleótidos y se usaron para identificar por PCR una genoteca de ADNc que contenía la secuencia de interés y para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificadora de longitud completa de un polipéptido PRO. A menudo se diseñaron cebadores de PCR directos (.f) y reversos (.r) generalmente en el intervalo de 20 a 30 nucleótidos para producir un producto de PCR de aproximadamente 100 a 1000 pb de longitud. Las secuencias sonda (.p) típicamente tienen de 40 a 55 pb de longitud. En algunos casos se sintetizaron oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia consenso era mayor de 1 a 1,5 kpb. Para investigar varias genotecas en busca de un clon de longitud completa, el ADN de las genotecas se investigó mediante amplificación con PCR, como en Ausbel y col., "Current Protocols in Molecular Biology" (Protocolos actuales en biología molecular), con el par de cebadores de PCR. Una genoteca positiva se usó entonces para aislar clones que codificaran el gen de interés usando el oligonucleótido sonda y uno del par de cebadores.
Las genotecas de ADNc que se usaron para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos habituales usando reactivos disponibles comercialmente como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con un oligo dT que contenía un sitio NotI, se ligó en romo con adaptadores SalI semifosforilados, se cortó con NotI, y se determinó su tamaño aproximadamente en una electroforesis en gel, y se clonó en un sentido determinado en vector de clonación adecuado (como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio SfiI; ver Holmes y col., Science, 253: 1278-1280 (1991)) en los sitios únicos XhoI y NotI.
Ejemplo 2 Aislamiento de clones de ADNc que codifican el PRO301 humano
Una secuencia de ADN de consenso designada aquí como DNA35936 se unió usando phrap tal como se ha descrito en el ejemplo 1 anterior. Basado en esta secuencia de consenso, se sintetizaron los oligonucleótidos: 1) para identificar por PCR una librería de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa.
Para separar diferentes librerías de una fuente de un clon de longitud completa, se separó ADN de las librerías mediante amplificación PCR con el par del cebador de PCR identificado posteriormente. A continuación se usó una librería positiva para aislar clones que codifican el gen PRO301 usando el oligonucleótido de sonda y uno de los cebadores de PCR.
El ARN para la construcción de las librerías de ADNc se aisló del riñón fetal humano.
Se secuenció un clon de ADNc en su totalidad. La secuencia de nucleótido de longitud completa de la secuencia PRO301 nativa se muestra en la figura 1 (SEQ ID NO:1). El clon DNA40628-1216 contiene un único marco de lectura abierta con un sitio de iniciación translacional aparente en las posiciones 52-54 del nucleótido (figura 1, SEQ ID NO:1). El precursor de polipéptido predicho tiene una longitud de 299 aminoácidos con un peso molecular predicho de 32.583 daltons y pl de 8,29. El clon DNA40628-1216 se ha depositado con ATCC y se le asigna el depósito de ATCC Nº. ATCC 209432.
Basado en un análisis de alineación de secuencia BLAST y FastA de la secuencia de longitud completa, el PRO301 muestra una identidad de secuencia de aminoácidos con el precursor del antígeno A33 (30%) y proteína receptora de coxsackie y adenovirus (29%).
Las secuencias de oligonucleótidos usadas en el procedimiento anterior fueron las siguientes:
OLI2162 (35936.fl)
5'-TCGCGGAGCTGTGTTCTGTTTCCC-3' (SEQ ID NO:3)
OLI2163 (35936.pl)
5'-TGATCGCGATGGGGACAAAGGCGCAAGCTCGAGAGGAAACTGTTGTGCCT-3' (SEQ ID NO:4)
OLI2164 (35936.f2)
5'-ACACCTGGTTCAAAGATGGG-3' (SEQ ID NO:5)
OLI2165 (35936.r1)
5'-TAGGAAGAGTTGCTGAAGGCACGG-3' (SEQ ID NO:6)
OLI2166 (35936.f3)
5'-TTGCC7TACTCAGGTGCTAC-3' (SEQ ID NO:7)
OLI2167 C35936.r2)
5'-ACTCAGCAGTGGTKGGAAAG-3' (SEQ ID NO:8);
Ejemplo 3 Uso del ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO como sondas de hibridación
El siguiente procedimiento describe el uso de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido PRO como una sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificadora de un polipéptido PRO de interés como se describe en la presente memoria descriptiva se puede emplear como una sonda o usar como base a partir de la cual preparar sondas para buscar ADNs homólogos (como los que codifican variantes naturales del polipéptido PRO) en genotecas de ADNc de tejido humano o genotecas genómicas de tejido humano.
La hibridación y los lavados de los filtros que contienen el ADN de genotecas se realizan bajo las siguientes condiciones altamente restrictivas. La hibridación de la sonda derivada del ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO etiquetada radiactivamente con los filtros se realiza en una solución de 50% de formamida, SSS 5X, 0,1% de SDS, 0,1% de pirofosfato de sodio, fosfato de sodio 50 mM, una solución acuosa de SSC 0,1X y 0,1% de SDS a 42ºC.
Los ADNs que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica el polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa se pueden identificar entonces usando técnicas habituales conocidas en la técnica.
Ejemplo 4 Expresión de Polipéptido PRO en E. coli
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma sin glicosilar de un polipéptido PRO por expresión recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido PRO deseado se amplifica inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzimas de restricción que correspondan a los sitios de enzimas de restricción del vector de expresión seleccionado. Se puede emplear una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector de expresión adecuado es el pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar y col., Gene, 2: 95 (1997)) que contiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina. Se digiere el vector con enzimas de restricción y se desfosforila. Las secuencias amplificadas por PCR se ligan entonces en el vector. El vector incluirá preferentemente secuencias que codifiquen un gen de resistencia a un antibiótico, un promotor trp, y una secuencia guía poliHis (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia poliHis, y un sitio de corte de enteroquinasa), la región que codifica el polipéptido PRO específico, el terminador transcripcional lambda y un gen argU.
La mezcla de ligación se usa entonces para transformar una cepa de E. coli seleccionada usando los procedimientos descritos en Sambrook y col., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad de crecer en placas LB y se seleccionan las colonias resistentes al antibiótico. El ADN plasmídico se puede aislar y confirmar con análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Los clones seleccionados se pueden crecer toda la noche en un medio de cultivo líquido como LB complementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche se puede usar después para inocular un cultivo a escala mayor. Se crecen las células entonces hasta alcanzar la densidad óptica deseada, durante la cual se induce el promotor de expresión.
Después de cultivar las células durante varias horas más, las células se recogen por centrifugación. El sedimento celular obtenido en la centrifugación se puede solubilizar usando varios agentes conocidos en la técnica, y el polipéptido PRO solubilizado se puede entonces purificar usando una columna con un quelante metálico en condiciones que permitan una fuerte unión de la proteína.
El PRO301 se expresó con éxito en E. coli en una forma etiquetada poli-His, usando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica el PRO301 se amplificó inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contenían sitios de restricción de enzimas que corresponden a los sitios de restricción de enzimas en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan una iniciación de translación eficiente y fiable, una rápida purificación en una columna de quelación de metal, y retirada proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas poli-His amplificadas con PCR se ligaron a continuación en un vector de expresión, que se usó para transformar un huésped E. coli basado en la variedad 52 (W3110 fuhA (tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP (Iaclp). Los transformantes crecieron primero en LB que contenía 50 mg/ml de carbenicillina a 30ºC con agitación hasta que se alcanzó un O.D.600 de 3-5. Los cultivos se diluyeron 50-100 pliegues en medio CRAP (preparado mediante la mezcla de 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato de sodio-2H2O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Disco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 mL de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, 0,55% (w/v) de glucosa y 7 mM de MgSOJ y crecimiento durante 20-30 horas aproximadamente a 30ºC con agitación. Las muestras se retiraron para verificar la expresión mediante análisis SDS-PAGE, y el cultivo a granel se centrifugó para granular las células. Los gránulos de células se congelaron hasta su purificación y replegado.
La masa de E. coli de 0,5 a 1 litro de fermentaciones (6-10 g de sedimentos) se resuspendió en 10 volúmenes (p/v) en un tampón de guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8,0. Se añadieron sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio para hacer unas concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agitó toda la noche a 4ºC. Este paso tiene como resultado la desnaturalización de la proteína con todos los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. La solución se centrifugó a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante se diluyó con 3-5 volúmenes de tampón de la columna de quelante metálico (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtró a través de filtros de 0,22 micrómetros para depurar. Dependiendo, el extracto depurado se cargó en una columna con quelante metálico Qiagen de 5 mL equilibrada con tampón de columna con quelante metálico. La columna se lavó con un tampón adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, Grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluyó con tampón que contiene imidazol 250 mM. Se combinaron las fracciones que contienen la proteína deseada y se almacenaron a 4ºC. La concentración proteica se estimó por su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia aminoacídica.
Las proteínas se replegaron diluyendo la muestra lentamente en un tampón de replegamiento recién preparado compuesto por Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegamiento se eligieron de modo que la concentración final de proteína fuera de 50 a 100 microgramos/ml. La solución de replegamiento se agitó suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de replegamiento se detuvo añadiendo TFA a una concentración final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de una purificación adicional de la proteína, se filtró la solución través de un filtro de 0,22 micrómetros y se añadió acetonitrilo a una concentración final de 2-10%. La proteína replegada se cromatografió en una columna de fase inversa R1/H de Poros usando una fase móvil de 0,1% de TFA con elución con un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Se analizaron alícuotas de fracciones con una absorbancia a 280 nm en geles de poliacrilamida con SDS y se combinaron las fracciones que contenían proteína replegada homogénea. Generalmente, las especies replegadas adecuadamente de la mayoría de las proteínas se eluyen a las menores concentraciones de acetonitrilo ya que esas especies son las más compactas con su interior hidrófobo protegido de la interacción con la resina de la fase inversa. Las especies agregadas se eluyen normalmente a mayores concentraciones de acetonitrilo. Además de resolver las formas mal plegadas de proteínas de la forma deseada, la etapa de la fase inversa elimina la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen la proteína de PRO301 plegada deseada se mezclaron y se retiró el acetonitrilo usando una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formularon en 20 mM de Hepes, pH 6,8 con cloruro de sodio 0,14 M y manitol 4% mediante diálisis o filtración de gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y se filtraron estériles.
Ejemplo 5 Expresión de Polipéptidos PRO en células de mamífero
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma glicosilada de un polipéptido PRO deseado mediante expresión recombinante en células de mamífero.
El vector, pRK5 (ver el documento EP307.247, publicado en marzo de 1989), se emplea como el vector de expresión. Opcionalmente el ADN que codifica el polipéptido PRO se liga en el pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la introducción del ADN de polipéptido PRO usando procedimientos de ligación como los descritos en Sambrook y col., supra. El vector resultante se llama pRK5-polipéptido PRO.
En una realización, las células hospedadoras seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se crecen hasta que confluyen en placas de cultivos tisulares como DMEM complementado con suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-polipéptido PRO con aproximadamente 1 \mug del ADN que codifica el gen VA ARN [Thimmappaya y col., Cell, 31: 543 (1982)] y se disuelven en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227. A esta mezcla se añaden gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se deja que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se resuspende y se añade a las células 293 y se deja que sedimenten durante aproximadamente cuatro horas a 37 C. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se lavan entonces con medio sin suero, se añade medio recién preparado y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, se elimina el medio de cultivo y se reemplaza con medio de cultivo (sólo) o medio de cultivo con cisteína-S^{35} 200 \muCi/ml y metionina-S^{35} 200 \muCi/ml. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el medio acondicionado, se concentra en un filtro de centrífuga, y se carga en un gel con 15% de SDS. El gel procesado se puede secar y exponer a una película durante un periodo tiempo para revelar la presencia de polipéptido PRO. Los cultivos que contienen las células transfectadas pueden continuar con la incubación (en medio sin suero) y el medio se prueba en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el polipéptido PRO se puede introducir en células 293 temporalmente usando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito en Somparyrarc y col., Proc. Nati. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Las células 293 se crecen hasta una densidad óptica máxima en un recipiente giratorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5-polipéptido PRO. Las células primero se concentran en el recipiente giratorio por centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado ADN-dextrano se incuba sobre el sedimento celular durante cuatro horas. Las células se tratan con un 20% de glicerol durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo tisular y se reintroducen en el recipiente giratorio que contiene le medio de cultivo tisular, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se puede concentrar y purificar por cualquier procedimiento seleccionado, como diálisis y/o columna cromatográfica.
En otra realización, los polipéptidos PRO se pueden expresar en células CHO. El pRK5-polipéptido PRO se puede transfectar en células CHO usando reactivos conocidos como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Como se describe anteriormente, los cultivos celulares se pueden incubar, y remplazar el medio con medio de cultivo (sólo) o medio con un isótopo radiactivo como metionina-S. Después de determinar la presencia del polipéptido PRO, se puede reemplazar el medio de cultivo con medio sin suero. Preferiblemente los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y entonces se concentran y purifican por cualquier procedimiento seleccionado.
El polipéptido PRO etiquetado con un epítopo se puede expresar además en células hospedadoras CHO. El polipéptido PRO se puede subclonar fuera del vector pRK5. El inserto de subclonación se puede someter a PCR para fusionar el pauta de lectura con una etiqueta epítopo seleccionada como etiqueta poliHis en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de polipéptido PRO etiquetado con poliHis se puede subclonar entonces en un vector dirigido SV40 que contiene un marcador de selección como DHFR para seleccionar clones estables. Finalmente, las células CHO se pueden transfectar (como se describe anteriormente) con el vector dirigido SV40. El etiquetado se puede realizar, como se describe anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el polipéptido PRO etiquetado con poliHis se puede concentrar y purificar por cualquier procedimiento seleccionado, como por cromatografía de afinidad con quelato Ni^{2+}.
El PRO301 se expresó satisfactoriamente en células CHO mediante un procedimiento de expresión oscilante y estable.
La expresión estable en células CHO se realizó usando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresaron como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificadoras de las formas solubles (por ejemplo, dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionaron a una secuencia de una región constante IgG1 que contiene la región bisagra, los dominios CH2 y CH2 y/o es una forma etiquetada con poliHis.
Después de la amplificación por PCR, se subclonaron los respectivos ADNs en un vector de expresión CHO usando técnicas habituales como se describe en Ausubel y col., "Current Protocols in Molecular Biology" (Protocolos actuales en biología molecular), Unidad 3.16, John Willey e hijos (1997). Los vectores de expresión CHO se construyen de modo que tengan sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir el transporte conveniente de los ADNcs. El vector de expresión usado en las células CHO es como se describe en Lucas y col., Nucl. Acids Res., 24: 9 (1774-1779 (1996)), y usa el promotor/potenciador temprano del SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para un mantenimiento estable del plásmido después de la transfección.
Se introdujeron doce microgramos del ADN plasmídico deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO usando reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect^{*}(Quiangen), Dospei*, o Fugene* (Boehringer Mannheim). Las células se crecieron como se describe en Lucas y col., supra. Se congelaron aproximadamente 3 x 10^{-7} células en una ampolla para un crecimiento y producción adicional como se describe a continuación.
Las ampollas que contienen el ADN plasmídico se descongelaron colocándolas en una baño de agua y se mezclaron con un vórtex. Se tomo con una pipeta el contenido y se transfirió a un tubo de centrífuga que contenía 10 ml de medio y se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado con por un filtro de 0,2 \mum con 5% de suero fetal bovino dializado y filtrado con por un filtro de 0,2 \mum). Se alicuotaron entonces las células en un recipiente giratorio de 100 ml que contenía 90 ml de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfirieron a un recipiente giratorio de 250 ml con 150 ml de medio de crecimiento selectivo y se incubaron a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se sembraron 3 x 10^{5} células/ml en recipientes giratorios de 250 ml, 500 ml y 2000 ml. El medio celular se cambió por medio recién preparado por centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque se puede emplear un medio CHO adecuado, se usó en realidad un medio descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.122.469, publicada el 16 de junio de 1992. Se sembraron 3 l del recipiente giratorio con 1,2 x 10^{6} células/ml. El día 0, se calculó el pH y el número de células. El día 1, se tomó una muestra del recipiente giratorio y se comenzó a burbujear con aire filtrado. El día 2, se tomó una muestra del recipiente giratorio, se cambió la temperatura a 33ºC, y se añadieron 30 ml de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, emulsión de grado médico de Dow Corning 365). Durante toda la producción, se ajustó el pH como fuese necesario para mantenerlo aproximadamente a 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad descendió por de bajo del 70%, se recogió el cultivo celular por centrifugación y se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado o se almacenó a 4ºC o se cargó en columnas para su
purificación.
Para las construcciones etiquetadas con poliHis, se purificaron las proteínas usando una columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió el imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. Los medios acondicionados se bombearon a una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4, conteniendo el tampón NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después de cargar, se lavó la columna con tampón de equilibrado adicional y se eluyó la proteína con tampón de equilibrado que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfinde de 25 ml (Pharmacia) y se almacenó a -80ºC.
Las construcciones con inmunoadhesina (que contienen Fc) fueron purificadas del medio acondicionado como se describe a continuación. El medio acondicionado se bombeó sobre una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado con tampón fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8. Después de cargar, se lavó la columna abundantemente con tampón de equilibrado antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \mul de tampón Tris 1 M, pH 9. Se eliminaron las sales de la solución con proteína altamente purificada en tampón de almacenamiento como se describe anteriormente para las proteínas poliHis. Se valoró la homogeneidad en geles de poliacrilamida con SDS y por secuenciación del extremo amino terminal mediante degradación de Edman.
El PRO293 también se expresó temporalmente con éxito en células COS.
Ejemplo 6 Expresión de polipéptido PRO en levaduras
El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de un polipéptido deseado en levaduras.
Primero, se construyeron los vectores de expresión para la producción intracelular o secreción de los polipéptidos PRO con el promotor ADH2/GAPDH. Se introducen el ADN que codifica un polipéptido PRO deseado, un péptido señal seleccionado y el promotor en los sitios de enzima de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular del polipéptido PRO. Para la secreción, el ADN que codifica el polipéptido PRO se puede clonar en el plásmido seleccionado, junto con un ADN que codifique el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia guía/señal de secreción del factor alfa, y secuencias adaptadoras, si fuera necesario, para la expresión del polipéptido PRO.
Las células de levadura, como la cepa de levadura AB110, se pueden transformar con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y se pueden cultivar en medios de fermentación seleccionados. Se puede analizar el sobrenadante de las células transformadas mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y por separación en un gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), seguida de la tinción de los geles con colorante azul de Coomassie.
El polipéptido PRO recombinante se puede aislar a continuación y purificar eliminando las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación y después concentrando el medio usando filtros en cartucho. El concentrado que contiene el polipéptido PRO se puede purificar adicionalmente usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.
Ejemplo 7 Expresión de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas con Baculovirus
El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas con Baculovirus.
El polipéptido PRO deseado se fusiona en la dirección 5' de una etiqueta epítopo contenida con un vector de expresión de Baculovirus. Tal etiqueta epítopo incluye etiquetas poliHis y etiquetas de inmunoglobulina (como regiones Fc o IgG). Se pueden emplear una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente como el pVL1393 (Novagen). Brevemente, el polipéptido PRO o la porción deseada del polipéptido PRO (como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cenador 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción (seleccionados) flanqueantes. El producto se digiere entonces con esas enzimas de restricción y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera cotrasfectando el anterior plásmido y el ADN del virus BaculoGold™ (Pharmigen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (comercialmente disponible en GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se usan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de proteínas se realiza como se describe en O'Reilley y col., "Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual" (Vectores de expresión de Baculovirus: Manual de laboratorio), Oxford, Oxford University Press (1994).
El polipéptido PRO etiquetado con poliHis expresado se puede entonces purificar, por ejemplo con cromatografía de afinidad con quelato Ni^{2+} como se describe a continuación. Se prepararan los extractos a partir de las células Sf9 infectadas con el virus recombinante como se describe en Rupert y col., Nature, 362: 175-179 (1993). Brevemente, se lavan las células Sf9, se resuspenden en un tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; 10% de glicerol; 0,1% de NP-40; KCl 0,4 M), y se someten a sonicación dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se aclaran por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, 10% de glicerol, pH 7,8) y se filtran a través de un filtro de 0,45 \mum de diámetro. Se prepara una columna de agarosa con Ni^{2+}-NTA (disponible comercialmente en Qiagen) en un volumen de soporte de 5 ml, lavada con 25 ml de agua y equilibrada con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta una base de referencia a A_{280} con tampón de carga, punto en el cual comienza la recogida de fracciones. Después, se lava la columna con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM; 10% de glicerol, pH 6,0), que eluye las proteínas unidas no específicamente. Después de alcanzar la base de referencia a A_{280} de nuevo, se desarrolla la columna con un gradiente de imidazol desde 9 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen y analizan fracciones de un ml mediante un gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) y tinción con plata o inmunotransferencia tipo Western con Ni^{2+}-NTA conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen).Se combinan las fracciones que contienen el polipéptido PRO etiquetado con His_{10} y se dializan frente tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del polipéptido Pro marcado con IgG (o marcado con Fc) se puede realizar usando técnicas de cromatografía conocidas, que incluyen, por ejemplo, cromatografía de columna de proteína A o proteína G. El PRO301 se expresó con éxito en células de insecto Sf9 o high5 infectadas con baculovirus. Aunque la expresión se realizó realmente en una escala 0,5-2 L, se puede escalar fácilmente para preparaciones mayores (por ejemplo, 8 L). Las proteínas se expresaron como una construcción IgG (immunoadhesina), en la que la región extracelular de la proteína se fundió con una secuencia de región constante IgG1 que contiene la articulación, dominios CH2 y CH3 y/o en formas marcadas poli-His.
Después de la amplificación por PCR, se subclonaron las secuencias codificadoras respectivas en un vector de expresión de Baculovirus (pb.PH.IgG para fusiones con IgG y pb.PH.His para proteínas etiquetadas con poliHis), y se cotransfectaron el vector y el ADN de baculovirus BaculoGold® (Pharmigen) en células 105 de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711), usando Lipofectina (Gibco BRL). pb.PH.IgG y pb.PH.His son modificaciones del vector de expresión de baculovirus pVL1393 (Pharmigen) disponible comercialmente, con regiones del poliligador modificadas para incluir secuencias etiqueta His o Fc. Se crecieron las células en medio TNM-FH de Hink complementado con 10% de FBS (Suero fetal bovino) (Hyclone). Se incubaron las células durante 5 días a 28ºC. Se recogió el sobrenadante y se usó posteriormente para la primera amplificación viral infectando células Sf9 en medio TNM-FH de Hink complementado con 10% de FBS (Suero fetal bovino) a una multiplicidad de infección aproximada (MDI o MOI por sus siglas en inglés) de 10. Se incubaron las células durante 3 días a 28ºC. Se recogió el sobrenadante y se determinó la expresión de las construcciones en el vector de expresión de baculovirus por unión en lote de 1 ml de sobrenadante a 25 ml de perlas de Ni-NTA (QIAGEN) para proteínas etiquetadas con histidina o perlas de Proteína A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG, seguido de un análisis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) comparando con una concentración conocida de patrón de proteína por tinción con azul de Coomassie.
Se usó el sobrenadante de la primera amplificación viral para infectar un cultivo giratorio (500 ml) de células Sf9 crecidas en medio ESF-921 (Expression Systems LLC) a una MDI de aproximada de 0,1. Se incubaron las células durante 3 días a 28ºC. Se recogió y se filtró el sobrenadante. Se repitió la unión en lote y el análisis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), como fuera necesario, hasta que se confirmó la expresión del cultivo giratorio.
Se recogió el medio acondicionado para las células transfectadas (0,5 a 3 l) por centrifugación para eliminar las células y se filtró a través de filtros de 0,22 micrómetros. Para las construcciones etiquetadas con poliHis, se purificó la construcción de la proteína con una columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio acondicionado a una concentración de 5 mM. Los medios acondicionados se bombearon en una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón con NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/m a 4ºC. Después de cargar, se lavó la columna con tampón de equilibrado adicional y se eluyó la proteína con tampón de equilibrado con imidazol 0,25 M. Se eliminaron las sales de la proteína altamente purificada y se guardó en un tampón de equilibrado con Hepes 10 mM, NaCl y 4% de manitol, pH 6,8, con una columna G25 Superfinde (Pharmacia) de 25 ml y se almacenó a -80ºC.
Las construcciones con inmunoadhesina (que contienen Fc) se purificaron del medio acondicionado como se describe a continuación. Se bombeó el medio acondicionado en una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que había sido equilibrada con tampón fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8. Después de cargar, la proteína se neutralizó abundantemente con tampón de equilibrado antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos con 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. Posteriormente se eliminaron las sales de la proteína altamente purificada y se guardó en tampón de almacenamiento como se describe anteriormente para las proteínas etiquetadas con poliHis. La homogeneidad de las proteínas se verificó por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (EGP) y secuenciación del extremo amino terminal mediante degradación de Edman.
Ejemplo 8 Preparación de anticuerpos que se unan a los polipéptidos PRO
Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que se pueden unir específicamente a un polipéptido PRO.
Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunógenos que se pueden emplear incluyen el polipéptido PRO purificado, proteínas de fusión que contienen el polipéptido y células que expresan el polipéptido PRO recombinante en la superficie celular. Los expertos en la materia pueden realizar la selección del inmunógeno si una excesiva experiencia.
Se inmunizan ratones, como Balb/c, con el polipéptido PRO inmunógeno emulsionado en adyuvante de Freund completo y se inyectan subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en el animal en las almohadillas del pie trasero. Se estimula después a los ratones inmunizados 10 a 12 días después con un inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A partir de entonces, durante varias semanas, se pueden estimular además a los ratones con inyecciones inmunizantes adicionales. Se pueden obtener muestras de suero de los ratones periódicamente mediante tomas de sangre retroorbitales para realizar ensayos de ELISA para detectar anticuerpos anti polipéptido PRO.
Después de que se haya detectado una cantidad de anticuerpos adecuada, se puede inyectar a los animales "positivos" para los anticuerpos una inyección intravenosa final de polipéptido PRO. Tres o cuatro días después, se sacrifica a los ratones y se recogen células del bazo. Las células del bazo se fusionan entonces (usando un 35% de polietilenglicol) a una línea celular de mieloma murino como P3X63AgU.1, disponible en ATCC, Nº CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que pueden proliferar en placas de cultivo tisular con 96 pocillos con medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células de bazo.
Las células de hibridoma se pueden analizar en una ELISA para determinar la reactividad frente al polipéptido PRO. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secreten los anticuerpos monoclonales deseados contra el polipéptido PRO depende de la experiencia en la materia.
Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar intraperitonealmente en ratones Blab/c singénicos para producir ascitis que contenga los anticuerpos monoclonales anti polipéptido PRO. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden crecer en matraces o frascos de rosca de cultivo tisular. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en la ascitis se puede lograr a cabo usando precipitación con sulfato de amonio, seguida de cromatografía de exclusión por gel. Alternativamente, se puede emplear cromatografía de afinidad basándose en la unión del anticuerpo a la proteína A o G.
Ejemplo 9 Polipéptidos PRO quiméricos
Los polipéptidos PRO se pueden expresar como proteínas quiméricas con uno o más dominios polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína. Tales dominios de facilitación de purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes metálicos como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación con metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación con inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación extensión/afinidad FLAGS™ (Immunex Corp., Seattle Wash.). La inclusión de una secuencia de unión que se pueda cortar como Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, Calif.) entre el dominio de purificación y la secuencia del polipéptido PRO puede ser útil para facilitar la expresión del ADN que codifica el polipéptido PRO.
Ejemplo 10 Purificación de polipéptidos PRO usando anticuerpos específicos
Los polipéptidos PRO recombinantes se pueden purificar mediante una variedad de técnicas habituales en la técnica de la purificación de proteínas. Por ejemplo, se purifica el propolipéptido PRO, polipéptido PRO maduro, o prepolipéptido PRO por cromatografía de afinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO de interés. En general, una columna de inmunoafinidad se construye uniendo covalentemente el anticuerpo anti polipéptido PRO a una resina cromatográfica activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de precipitación sérica con sulfato de amonio o mediante purificación en Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Así mismo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de líquido de ascitis de ratón mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. Una proteína parcialmente purificada está covalentemente unida a la resina cromatográfica como SEPHAROSE™ CnBr-activada (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se une a la resina, se bloquea la resina y la resina derivada se lava según las instrucciones del fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación de polipéptido PRO preparando una fracción de células que contengan el polipéptido PRO en forma soluble. Esta preparación se obtiene solubilizando todas las células o una fracción subcelular obtenida vía centrifugación diferencial mediante la adición de un detergente o mediante otros procedimientos muy conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido PRO soluble que contiene una secuencia señal se puede secretar en una cantidad útil al medio en el que crecen las células.
Una preparación que contenga un polipéptido PRO soluble se pasa a través de la columna de inmunoafinidad, y se lava la columna en condiciones que permitan la absorción preferencial del polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de alta concentración iónica en presencia de detergente). Entonces, se eluye la columna en condiciones que alteren la unión anticuerpo/polipéptido PRO (por ejemplo, un tampón de pH bajo de aproximadamente 2-3, o una mayor concentración de una agente caotrópico como urea o ion tiocianato), y se recoge el polipéptido PRO.
Ejemplo 11 Selección de fármacos
Esta invención es particularmente útil para seleccionar compuestos usando polipéptidos PRO o sus fragmentos de unión en cualquier variedad de técnicas de selección de fármacos. El polipéptido o fragmento PRO empleado en tal prueba puede estar libre en disolución, sin unir a un soporte sólido, suspendido en una superficie celular, o localizado intracelularmente. Un procedimiento de selección de fármacos utiliza células hospedadoras eucariotas o procariotas que se han transformado de modo estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido o un fragmento PRO. Los fármacos se seleccionan frente dichas células transformadas en ensayos de unión competitivos. Tales células, tanto en forma soluble como fija, se pueden usar para ensayos de unión habituales. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido o un fragmento PRO y el agente que se está probando. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la formación de complejos entre el polipéptido PRO y su célula diana o receptores diana provocada por el agente que se está probando.
Así, la presente invención proporciona procedimientos para seleccionar fármacos o cualquier otro agente que pueda afectar a enfermedades o desórdenes asociados al polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden el contacto de tal agente con un polipéptido PRO o uno de sus fragmentos y el ensayo de (I) la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido o un fragmento PRO, o (II) la presencia de un complejo entre el polipéptido o un fragmento PRO y la célula, por procedimientos muy conocidos en la técnica. En dichos ensayos de unión competitiva, el polipéptido o el fragmento PRO está típicamente etiquetado. Después de una incubación adecuada se separa la forma unida del polipéptido o el fragmento PRO, y la cantidad de etiqueta libre o no unida a complejo es una medida de la capacidad del agente particular de unirse al polipéptido PRO o para interferir con el complejo polipéptido PRO/célula.
Otra técnica para la selección de fármacos proporciona un alto rendimiento de selección de compuestos que tienen la adecuada afinidad de unión al polipéptido PRO y se describe con detalle en el documento WO84/03564, publicado el 13 de septiembre de 1984. Brevemente descrito, se sintetiza un gran número de diferentes compuestos de prueba peptídica pequeños sobre un sustrato sólido, como agujas de plástico u otra superficie. Como se ha solicitado para un polipéptido PRO, los compuestos de prueba peptídica se hacen reaccionar con polipéptidos PRO y se lavan. El polipéptido PRO unido se detecta por procedimientos muy conocidos en la técnica. El polipéptido PRO purificado se puede recubrir directamente sobre placas para el uso en las técnicas de selección de fármacos antes mencionado. Además, los anticuerpos no neutralizantes se pueden usar para capturar el péptido e inmovilizarlo en el soporte sólido.
Esta invención contempla el uso de ensayos de selección de fármacos competitivos en los que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse al polipéptido PRO específicamente compitan con un compuesto de prueba en la unión al polipéptido PRO o sus fragmentos. De este modo, los anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido PRO.
Ejemplo 12 Diseño de fármacos racionales
El objetivo del diseño de fármacos racionales es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de pequeñas moléculas con las que interactúan, por ejemplo, agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se puede usar para modelar fármacos que sean más activos o formas estables del polipéptido PRO o que potencien o interfieran con la función del polipéptido PRO in vivo (c.f., Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).
En un enfoque, la estructura tridimensional del polipéptido PRO o de un complejo inhibidor-polipéptido PRO, se determina por cristalografía de rayos X, por modelado informático, o más típicamente, mediante una combinación de los dos enfoques. Se deben averiguar tanto la forma como las cargas del polipéptido PRO para elucidar la estructura de la molécula y determinar su(s) sitio(s) activo(s). Menos frecuentemente, se puede lograr la información útil relacionada con la estructura del polipéptido por modelado basándose en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información de la estructura relevante se usa para diseñar moléculas análogas al polipéptido PRO o para identificar inhibidores eficaces. Algunos ejemplos útiles del diseño de fármacos racionales pueden incluir moléculas que mejoren la actividad o la estabilidad como se muestra en Braxton y Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992) o que actúen como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos como se muestra en Athauda y col., J. Biochem., 113: 742-746 (1993).
Es también posible aislar un anticuerpo con una diana específica, seleccionado por ensayo funcional, como se describe anteriormente, y resolver entonces su estructura cristalina. Este enfoque, en principio, produce un núcleo farmacológico a partir del cual se puede basar el diseño de un fármaco. Es posible englobar la cristalografía de proteínas generando anticuerpos anti idiotipo (anti ids) frente a un anticuerpo farmacológicamente activo, funcional. Como imagen especular de una imagen especular, se podría esperar que el sitio de unión de los anti ids fuera análogo del receptor original. El anti id se podría usar entonces para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían así como núcleo farmacológico.
En virtud de la presente invención, puede haber disponibles suficientes cantidades del polipéptido PRO para realizar tales estudios analíticos como cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia aminoacídica del polipéptido PRO proporcionado en la presente memoria descriptiva proporcionará una guía a los que empleen técnicas de modelado informático en lugar de o junto con la cristalografía de rayos X.
Ejemplo 13 Capacidad de los polipéptidos PRO para inhibir de la proliferación estimulada con factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de crecimiento de células endoteliales
Se probó la capacidad de varios polipéptidos PRO de inhibir la proliferación estimulada con VEGF de células endoteliales. Específicamente, se colocaron células endoteliales capilares corticales adrenales (ACE) bovinas (del cultivo primario, máximo 12-14 pasajes) sobre placas de microtítulo de 96 pozos (Amersham Life Science) con una densidad de 500 células/pozo por 100 \muL en DMEM de baja glucosa, suero de ternero al 10%, glutamina 2 mM, pen/strept 1x y fungizona, suplementado con 3 ng/mL de VEGF. Se colocaron controles en placas de la misma manera, pero algunos no contenían VEGF. Se añadió una muestra de prueba al polipéptido PRO de interés en un volumen de 100 \mul para un volumen final de 200 \mul. Las células se incubaron durante 6-7 días a 37ºC. El medio se aspiró y las células se lavaron 1x con PBS. Se añadió una mezcla de reacción de fosfatasa ácida (100 \muL, acetato de sodio 0:1M, pH 5,5, 0,1% Triton-100, p-nitrofenil fosfato 10 mM). Después de incubación durante 2 horas a 37ºC, se detuvo la reacción mediante la adición de 10 \mul de NaOH 1N. Se añadió OD sobre un lector de placas de microtítulo a 450 nm. Los controles fueron ninguna célula, células en solitario, células + FGF (5 ng/mL), células + VEGF (3 ng/mL), células + VEGF (3 ng/ml) + TGF-\beta (1 ng/ml), y células + VEGF (3 ng/mL) + LIF (5 ng/mL). (Se conoce que el TGF-\beta en una concentración de 1 mg/ml bloquea el 70-90% de la proliferación celular estimulada con VEGF).
Los resultados se determinaron calculando el porcentaje de inhibición de la proliferación de células estimuladas con VEGF (3 ng/ml), determinados midiendo la actividad de la fosfatasa ácida en OD405 nm, (1) respecto a las células sin estimulación, y (2) respecto a la inhibición TGF-\beta de referencia de la actividad estimulada con VEGF. Los resultados, tal como se muestra en la Tabla 2 adjunta, son indicativos de la utilidad de los polipéptidos PRO en la terapia contra el cáncer y específicamente en la inhibición de la angiogénesis tumoral. Los valores numéricos (inhibición relativa) mostrados en la Tabla 2 se determinan calculando el porcentaje de inhibición de la proliferación estimulada con VEGF mediante el polipéptido PRO respecto a las células sin estimulación, y a continuación dividiendo ese porcentaje por el porcentaje de inhibición obtenido mediante TGF-\beta a 1 mg/ml que es conocido que bloquea el 70-90% de proliferación celular estimulada con VEGF.
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TABLA 2
Nombre PRO Concentración PRO Inhibición relativa
PRO301 7,0 \muM 1,02
PRO301 70 \muM 0,88
PRO301 700 \muM 0,44
PRO301 0,01% 0,92
PRO301 0,1% 0,85
PRO301 1,0% 0,68
Ejemplo 14 Inhibición de la célula PDB12
Este ejemplo demuestra que varios polipéptidos PRO tienen eficacia en inhibir la producción de proteínas de las células del ductales pancreáticas PDB12.
Las células ductales pancreáticas se siembran en placas de 96 pocillos recubiertos de fibronectina a razón de 1,5 x 10^{3} células por pocillo en 100 \mul/180 \mul de medio de crecimiento. Se añaden entonces al pocillo 100 \mul de medio de crecimiento con la muestra de prueba del polipéptido PRO o un control negativo que carece del polipéptido PRO, en un volumen final de 200 \mul. Los controles contienen medio de crecimiento que contienen una proteína se muestran inactivos en este ensayo. Las células se incuban durante 4 días a 37ºC. Se añaden entonces 20 \mul de colorante Azul de Alamar (AB) a cada pocillo y se mide la lectura de fluorescencia 4 horas después de la adición de AB, en un lector de placas de microvaloración a 530 nm de excitación y 590 nm de emisión. El patrón empleado son células sin BPE (extracto de pituitaria bovina) y con varias concentraciones de BPE. El tampón o controles CM de las desconocidas se corren dos veces en cada placa de 96 pocillos.
Los resultados de estos ensayos se muestran en la siguiente Tabla 6 en la que el porcentaje de disminución en la producción de proteína se calcula comparando la concentración de proteína calculada a base al colorante Azul de Alamar producida por las células tratadas con el polipéptido PRO con concentración de proteína calculada a base al colorante Azul de Alamar producida por las células del control negativo. Una disminución en el porcentaje de producción de proteína mayor o igual al 25% en comparación con las células del control negativo se considera
positiva.
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TABLA 6
Nombre PRO Concentración PRO Porcentaje de disminución en
la producción de proteína
PRO301 2,0% 0,0%
PRO301 10% 59,8%
PRO301 50% 65,6% 
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Ejemplo 15 Estimulación de la hipertrofia cardiaca en adultos
Este ensayo está diseñado para medir la capacidad de varios polipéptidos PRO para estimular la hipertrofia del corazón adulto.
Se sembraron miocitos ventriculares recién aislados de ratas Sprague Dawley adultas (250 g) a razón de 2000 células/pocillo en un volumen de 180 \mul. Las células se aíslan y siembran el día 1, las muestras de prueba que contienen el polipéptido PRO o sólo medio de crecimiento (control negativo) (volumen de 20 \mul) se añaden el día 2 y las células, entonces, se fijan y tiñen el día 5. Después de la tinción, se visualiza el tamaño celular en las células que no muestran un aumento del crecimiento en comparación con las células control dan un valor de 0,0 de células que muestran un aumento de crecimiento de pequeño a moderado en comparación con las células control que dan un valor de 1,0 y las células que muestran un gran aumento de crecimiento en comparación con las células control dan un valor de 2,0. Cualquier grado de aumento del crecimiento en comparación con las células del control negativo se considera positivo para el ensayo. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 7.
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TABLA 7
Nombre PRO Concentración PRO Valor de aumento
del crecimiento
PRO301 20% 1,0
PRO301 20% 1,0
Ejemplo 16 Proliferación de Células PDB12
Este ejemplo demuestra que varios polipéptidos PRO tienen eficacia al inducir proliferación de células ductales pancreáticas PDB12.
Se colocan células ductales pancreáticas PDB12 sobre placas de 96 pozos recubiertas con fibronectina a 1,5 x 10^{3} células por pozo en 100-180 \muL de medio de crecimiento. A continuación se añade 100 \muL de medio de crecimiento con la muestra de prueba de polipéptido PRO o control negativo sin polipéptido PRO a los pozos, para un volumen final de 200 \muL. Los controles contienen medio de crecimiento que contiene una proteína mostrada que es inactiva en este ensayo. Las células se incuban durante 4 días a 37ºC. Se añaden a continuación 20 \muL de Alamar Blue Dye (AB) a cada pozo y se mide la lectura fluorescente a las 4 horas después de la adición de AB, en un lector de placas microtítulo con 530 nm de excitación y 590 nm de emisión. El estándar utilizado son células sin extracto pituitario bovino (BPE) y con varias concentraciones de BPE. El tampón o medio de control solamente controla los desconocidos que funcionan 2 veces en cada placa de 96 pozos.
Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 8 adjunta, en los que se calcula el porcentaje de aumento en la producción de proteínas comparando la concentración de proteínas calculada con Alamar Blue Dye producida por las células tratadas con polipéptido PRO con la concentración de proteínas calculada con Alamar Blue Dye producida por las células de control negativas. Un aumento en el porcentaje en la producción de proteínas mayor o igual al 25% comparado con las células de control negativo se considera positivo.
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TABLA 8
Nombre PRO Concentración PRO Porcentaje de aumento en la
producción de proteínas
PRO301 2,0% 44,0%
PRO301 10% 67,4%
PRO301 50% 185,8% 
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Ejemplo 17 Hibridación in situ
La hibridación in situ es una técnica poderosa y versátil para la detección y localización de secuencias de ácido nucleico en preparaciones celulares o tisulares. Puede ser útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión génica, analizar la distribución tisular de la transcripción, identificar y localizar una infección vírica, seguir cambios en la síntesis de un ARN específico y como ayuda en el mapeo cromosómico.
En el documento EP1027434A (98926909,2), se realizó la hibridación in situ siguiendo una versión optimizada del protocolo de Lu y Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994), usando ribosondas etiquetadas con P^{32} generadas por PCR. Brevemente, se cortaron los tejidos humanos fijados con formalina, en parafina, se les eliminó la parafina, las proteínas con proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37ºC, y se procesaron adicionalmente para la hibridación in situ como se describe en Lu y Gillett, supra. Se generó una ribosonda etiquetada con UTP [P^{33}] a partir de un producto de PCR y se hibridó a 55ºC toda la noche. Se bañaron los portaobjetos en emulsión de seguimiento nuclear NTB2 y se expusieron 4 semanas.
Síntesis de ribosondas con P^{33}
se secaron en una centrífuga de vacío 6,0 \mul (125 mCi) de UTP-P^{33} (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol). A cada tubo con UTP-P^{33}, se agregaron los siguientes ingredientes:
2,0 \mul de tampón de transcripción 5X
1,0 \mul de DTT (100 mM)
2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM:10 \mul de cada, GTP, CTP y ATP 10 mM + 10 \mul de H_{2}O)
1,0 \mul de UTP (50 \muM)
1,0 \mul de ARNsina
1,0 \mul de molde de ADN (1 \mug)
1,0 \mul de H_{2}O
1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de PCR T3 = AS, T7 = S, normalmente)
Se incubaron los tubos a 37ºC durante una hora. Se añadió 1,0 \mul de DNasa RQ1, seguido de una incubación a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 90 \mul de TE (Tris 10 mM pH 7,6; EDTA 1 mM pH 8,0), y se transfirió la mezcla con una pipeta a un papel DE81. La solución restante se cargó en una unidad de ultracentrifugación Microcon-50, y se centrifugó usando el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió en un segundo tubo y se centrifugó usando el programa 2 (3 minutos). Después del pulso de recuperación final, se añadieron 100 \mul de TE, se transfirió con una pipeta 1 \mul de producto final a un papel DE81 y se realizó un recuento en 6 ml de Bioflúor II.
Se corrió la sonda en un gel de TBE/urea. Se añadieron 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de RNA Mrk III a 3 \mul del tampón de carga. Tras calentar a 95ºC calentar el bloque durante tres minutos, el gel se colocó inmediatamente en hielo. Se nivelaron los pocillos, se cargó la muestra, y se corrió a 180-250 voltios durante 45 minutos. Se envolvió el gel con revestimiento de saran y se expuso a una película XAR con una pantalla de intensificación al congelador a -70ºC de una hora a toda la noche.
Hibridación-P^{33} A. Pretratamiento de los cortes congelados
Los portaobjetos se sacaron del congelador, se colocaron en bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en un incubador a 55ºC durante cinco minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en 4% de paraformaldehído en hielo en la campana extractora de gases, y se lavaron en SSS 0,5X durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml de SSC 20X + 975 ml de H_{2}O SQ). Después de eliminar las proteínas con 0,5 \mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de 10 mg/ml de solución madre en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa precalentado), los cortes se lavaron con SSC 0,5X durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los cortes se deshidrataron en etanol al 70%, 95%, 100%, 2 minutos en cada uno.
B. Pretratamiento de los cortes en parafina
Se eliminó la parafina de los portaobjetos, se colocaron en H_{2}O SQ, y se aclararon dos veces en SSC 2X a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Se eliminaron las proteínas de los cortes con 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa, 37ºC, 15 minutos) para embrión humano, o proteinasa K 8X (100 \mul en 250 ml de tampón de ARNasa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos con formalina. Los aclarados posteriores en SSC 0,5X y la deshidratación se realizaron como se describe anteriormente.
C. Prehibridación
Se prepararon los portaobjetos en una caja de plástico recubierta con tampón Box (SSC 4X, 50% de formamida) para papel de filtro saturado. Se cubrió el tejido con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de sulfato de dextrano + 6 ml de H_{2}O SQ), se agitaron con un vórtex y se calentaron en el microondas durante 2 minutos con la tapa aflojada. Tras enfriar en hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de SSS 20X y 9 ml de H_{2}O SQ, el tejido se agitó en el vórtex bien y se incubó a 42ºC durante 1-4 horas.
D. Hibridación
Se calentaron 1,0 x 10^{6} cpm de sonda y 1,0 de ARNt (50 mg/ml de solución madre) por portaobjetos a 95ºC durante 3 minutos. Los portaobjetos se enfriaron en hielo, y se añadieron 48 \mul de tampón de hibridación por portaobjetos. Después de agitar con el vórtex, se añadieron 50 \mul de mezcla de P^{33} a 50 \mul de prehibridación en el portaobjetos. Los portaobjetos se incubaron toda la noche a 55ºC.
E. Lavados
Se realizaron 2 lavados de 10 minutos con SSS 2X, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de SSC 20X + 16 ml de EDTA 0,25 M, V_{f}= 4 l), seguidos de un tratamiento con ARNasa A a 37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón de ARNasa= 20 \mug/ml), se lavaron los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos con SSC 2X, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones restrictivas de lavado fueron 2 horas a 55ºC, SSC 0,1X, EDTA (20 ml de SSC 20X + 16 ml de EDTA, V_{f}= 4l).
\newpage
Depósito de material
Los siguientes materiales se han depositado en la "American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):
Material Nº. Dep. ATCC Fecha de Depósito
DNA40628-1216 ATCC 209432 7 noviembre 1997
Estos depósitos se realizaron bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patente y las normativas conforme al mismo (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. La ATCC dispondrá de los depósitos bajo los términos del Tratado de Budapest, y estarán sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, que garantiza la disponibilidad permanente y sin restricciones de la descendencia del cultivo del depósito al público bajo la emisión de la patente de EE.UU. pertinente o bajo la puesta pública de cualquiera de de las solicitudes de patente de EE.UU. o extranjeras, lo que primero ocurra, y garantiza la disponibilidad de la descendencia a uno determinado por los EE.UU. Se autoriza al Comisario de patentes y marcas comerciales por la misma con arreglo a la 35 USC \NAK 122 y las normas del Comisario según la misma (incluyendo la 37 CFR § 1.14 con una referencia particular a la 886 OG 638).
El apoderado de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en depósito muriera o se perdiese o destruyera cuando se cultive bajo las condiciones adecuadas, se reemplazara rápidamente los materiales bajo notificación con otro igual. La disponibilidad del material depositado no está construida como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos concedidos por la autoridad o por cualquier gobierno con arreglo a estas leyes sobre patentes.
La memoria descrita anterior se considera que es suficiente para permitir a un experto en la materia poner en práctica la invención. La presente invención no está limitada en su ámbito a la construcción depositada, ya que la realización depositada está pensada como una simple ilustración de ciertos aspectos de la invención. El depósito de material aquí no constituye una admisión de que la descripción escrita aquí contenida es inadecuada para permitir la práctica en cualquier aspecto de la invención, incluyendo su mejor modo, ni está construida para limitar el ámbito de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. Incluso, varias modificaciones además de las aquí mostradas y descritas serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y que están incluidas dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
<110> Genentech, Inc.
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<120> Polipéptidos de membrana y de secreción y Ácido nucleicos que codifican los mismos
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<130> CMD/FP5963046
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<140> EP01127795,1
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<141> 22-11-2001
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> us60/063.542
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<151> 28-10-1997
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<160> 5
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<170> Patente Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 3679
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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1 
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<210> 2
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<211> 713
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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2
3 
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<210> 3
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Fuente
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<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Cebador de PCR directo"
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcgcggagct gtgttctgtt tccc 
\hfill
24 
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<210> 4
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Fuente
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<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Cebador de PCR reverso"
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
tgatcgcgat ggggacaaag gcgcaagctc gagaggaaac tgttgtgcct 
\hfill
50 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Fuente
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<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: Sonda de hibridación"
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<400> 5
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Claims (11)

1. Polipéptido aislado, que:
(a) tiene una secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2, con o sin la secuencia de señal terminal N en los residuos 1-27, con o sin la metionina de inicio, con o sin el dominio transmembrana en los residuos 236 a 258 aproximadamente y con o sin el dominio intracelular en los residuos 258 a 299 aproximadamente; o
(b) es una variante de (a) que tiene por lo menos un 80% de identidad de la secuencia en la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO:2) o en la secuencia de aminoácido codificada por el ADN (DNA40628-1216) depositado bajo en número de adhesión ATCC 209432, y que es capaz de inhibir la proliferación de células endoteliales estimuladas con VEGF,
en el que el polipéptido es para usarse como medicamento.
2. Polipéptido aislado según la reivindicación 1, en el que el nivel de identidad es de por lo menos el 90%.
3. Polipéptido aislado según la reivindicación 1, en el que el nivel de identidad es de por lo menos el 95%.
4. Polipéptido aislado según cualquier reivindicación anterior, que comprende los residuos 28-258 de la figura 2.
5. Polipéptido aislado según cualquier reivindicación anterior, para usarse en el tratamiento del cáncer.
6. Polipéptido aislado según la reivindicación 5, para usarse en la inhibición de la angiogénesis tumoral.
7. Utilización de un polipéptido en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, en el que el polipéptido:
(a) tiene una secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2, con o sin la secuencia de señal terminal N en los residuos 1-27, con o sin la metionina de inicio, con o sin el dominio transmembrana en los residuos 236 a 258 aproximadamente y con o sin el dominio intracelular en los residuos 258 a 299 aproximadamente; o
(b) es una variante de (a) que tiene por lo menos un 80% de identidad de la secuencia en la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO:2) o en la secuencia de aminoácido codificada por el ADN (DNA40628-1216) depositado bajo en número de adhesión ATCC 209432, y que es capaz de inhibir la proliferación de células endoteliales estimuladas con VEGF.
8. Utilización según la reivindicación 7, en la que el medicamento es para la inhibición de angiogénesis tumoral.
9. Utilización según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en la que el nivel de identidad es por lo menos del 90%.
10. Utilización según la reivindicación 9, en la que el nivel de identidad es por lo menos del 95%.
11. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en la que el polipéptido comprende los residuos 28-258 de la figura 2.
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