ES2255048T3

ES2255048T3 - Metodo para procesar y conservar tejidos basados en colageno para trasplante.

Info

Publication number: ES2255048T3
Application number: ES93102264T
Authority: ES
Inventors: Stephen A. Livesey; Anthony A. Del Campo; Abhijit Nag; Ken B. Nichols; Edward S. Griffey; Christopher Coleman
Original assignee: LifeCell Corp
Current assignee: LifeCell Corp
Priority date: 1992-02-12
Filing date: 1993-02-12
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2013-02-12
Also published as: EP0564786A2; EP0564786A3; ATE311746T1; EP0564786B1; DE69333926D1; EP1637037A2; EP1637037A3; AU668703B2; DE69333926T2; AU3293493A; JPH06261933A; US5336616A; JP4001642B2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA PROCESAR Y CONSERVAR UNA MATRIZ DE TEJIDO ACELULAR A BASE DE COLAGENO PARA TRASPLANTE. EL METODO COMPRENDE LAS SIGUIENTES FASES DE TRATAR LOS TEJIDOS BIOLOGICOS CON UNA SOLUCION ESTABILIZADORA PARA REDUCIR EL DAÑO, TRATAMIENTO CON UNA SOLUCION DE OPERACION PARA ELIMINAR CELULAS, TRATAMIENTO CON UNA SOLUCION CRIOPROTECTORA SEGUIDO POR CONGELACION, SECADO, ALMACENAMIENTO Y REHIDRATACION BAJO CONDICIONES QUE IMPIDE FUNCIONALMENTE CUALQUIER DAÑO SIGNIFICANTE Y LA RECONSTITUCION CON CELULAS VIABLES.

Description

Método para procesar y conservar tejidos basados en colágeno para trasplante.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos para obtener, descelularizar y además procesar y conservar en seco tejidos basados en colágeno derivados de seres humanos y animales para el trasplante en seres humanos u otros animales. Estos métodos producen un producto tisular que consiste en una matriz proteínica extracelular selectivamente conservada que carece de ciertas células viables que normalmente expresan determinantes antigénicos del complejo principal de histocompatibilidad y otros antígenos que serían reconocidos como extraños por el receptor. Esta matriz proteínica extracelular está constituida por colágeno y otras proteínas y proporciona una plantilla estructural que puede repoblarse con nuevas células viables que no serían rechazadas por el huésped. Estas células viables pueden derivarse del huésped (células autólogas) antes o después del trasplante o de una fuente humana alternativa incluyendo prepucio, cordón umbilical o tejidos fetales de abortos. Más particularmente, esta invención se refiere a la obtención y el procesamiento de tejidos basados en colágeno de modo que las complicaciones que siguen a la implantación (incluyendo, pero no limitadas a, inmunorrechazo, contractura, calcificación, oclusión e infección) se reducen significativamente con relación a procedimientos y materiales de implante actuales.

Descripción de la técnica relacionada

El trasplante de tejidos y órganos es un campo terapéutico en rápido crecimiento como resultado de mejoras en los procedimientos quirúrgicos, avances en los fármacos inmunosupresores y el conocimiento incrementado de la interacción injerto/huésped. A pesar de los grandes avances en este campo, el trasplante de tejidos moderno continúa asociado con complicaciones que incluyen inflamación, degradación, formación de cicatrices, contracturas, calcificación (endurecimiento), oclusión y rechazo. Existen numerosas investigaciones en marcha dirigidas a la manipulación de injertos tisulares trasplantables mejorados, sin embargo, se cree generalmente en la industria que todavía no se han producido implantes ideales.

EP 0 128 706 describe implantes corporales de matriz extracelular y métodos para elaborar y usar tales implantes. EP 0267026 describe un aparato para la criopreparación de muestras de tejido biológico para análisis ultraestructural. El uso del aparato comprende vitrificar una muestra de tejido biológico bajo condiciones de temperatura criogénica y ultravacío. US 4.776.853 describe un procedimiento para preparar material biológico para implantación en sistema cardiovascular, sistema respiratorio o tejido blando de mamífero, que incluye una etapa de digestión enzimática en una solución salina tamponada. Krejci, N.C. y otros (1991) J. Invest. Dermatol. 97, 843 describen un método para la reconstrucción in vitro de piel que incluye procesar con tripsina para degradar componentes de la membrana basal. Sasamoto, J. y otros (1990) J. Burncare 11, 190 describen métodos para la generación de piel reconstituida usando láminas epiteliales alogénicas cultivadas y dermis alogénica cultivada, que incluye procesar con tripsina. Grillo, H.C. y otros (1964) Transplantation 1, 48 describen homoinjertos de piel de ratón en los que la destrucción de la población celular se alcanzaba mediante congelación y descongelación repetidas. En algunos experimentos, la piel de ratón se trataba subsiguientemente con una solución de tripsina que contenía cianuro. Fang, C.H. y otros (1990) J. Burn. Care Rehab. 11, 538 describen injertos de piel compuestos de xenodermis o alodermis con una cobertura delgada de isoinjerto de grosor parcial. Oliver, R.F. y otros (1972) Br. J. Exp. Path. 53, 540 describen la purificación de colágeno dérmico tratando piel entera con una solución de tripsina cristalina a temperaturas por debajo de 20ºC. Oliver, R.F. y otros (1977) Br. J. Plast. Chir. 30, 88 describen la incorporación de aloinjertos de colágeno dérmico libres de células almacenados generados usando tripsina cristalina en heridas de la piel. Griffiths, R.W. y Shakespeare, P.G. (1982) Br. J. Plast. Sur. 35, 519 describen injertos de piel compuestos que consisten en queratinocitos cultivados y dermis crioconservada, en donde la dermis se preparó mediante tripsinación. Ben-Bassat, H. y otros (1992) Plast. Reconstr. Sur. 89, 510 describen la apariencia histológica de aloinjertos de colágeno dérmico fibrosos humanos tratados con glutaraldehído.

El tejido humano autólogo o autoderivado a menudo se usa para procedimientos de trasplante. Estos procedimientos incluyen cirugías de baipás coronario y vascular periférico, donde un vaso sanguíneo, habitualmente una vena, se extirpa de algún otro área del cuerpo y se trasplanta para corregir el flujo sanguíneo obstruido a través de una o más arterias críticas. Otra aplicación del tejido autólogo es en el tratamiento de quemaduras de tercer grado y otras lesiones profundas de la piel. Este tratamiento implica el injerto de piel sana de lugares corporales no lesionados en el lugar de la herida, un procedimiento denominado injerto de piel de grosor parcial. Aplicaciones adicionales de trasplante de tejidos autólogos incluyen injerto de huesos,cartílagos y fascias, usado para procedimientos reconstructivos.

El motivo de usar tejido autólogo para el trasplante se basa en el concepto de que se eliminarán complicaciones de inmunorrechazo, dando como resultado condiciones mejoradas para la supervivencia del injerto. Sin embargo, desgraciadamente, pueden surgir otras complicaciones con los trasplantes autólogos. Por ejemplo, puede producirse un daño significativo a varios componentes tisulares de venas trasplantadas durante la extirpación y antes de la implantación. Este daño puede incluir contracción mecánica de las células del músculo liso en la pared de la vena conduciendo a pérdida de endotelio e hipoxia y muerte de las células del músculo liso. El daño hipóxico puede dar como resultado la liberación de lisosomas celulares, enzimas que pueden provocar daño significativo a la matriz extracelular. Después del implante, tal daño puede conducir a una adhesión de plaquetas incrementadas, infiltración de leucocitos y macrófagos y subsiguientemente daño adicional a la pared del vaso. El resultado final de tal daño es trombosis y oclusión en el período inicial después del implante. Incluso en ausencia de tal daño, las venas autólogas trasplantadas típicamente sufren espesamiento de la pared del vaso y aterosclerosis avanzada conduciendo a una oclusión final. La causa exacta de este fenómeno es incierta pero puede relacionarse con un desajuste de adaptación de la vena en la posición arterial de presión y caudal sanguíneos altos. Este fenómeno puede ser aumentado y acelerado por cualquier daño a las células del músculo liso y la matriz inicial que se produzca durante la obtención. La oclusión de venas trasplantadas puede necesitar procedimientos de baipás repetidos, con una nueva extirpación subsiguiente de venas autólogas adicionales o substitución por conductos sintéticos o vasos no autólogos.

Otro ejemplo de complicaciones que resultan del trasplante de tejidos autólogos es la formación de cicatrices y la contractura que pueden producirse por injertos de piel de grosor parcial para la reparación de heridas de grosor total. Los injertos de piel de grosor parcial típicamente se expanden mecánicamente mediante el uso de un instrumento mallado, que introduce un patrón de pequeñas ranuras en la piel. El injerto de piel de grosor parcial se estira a continuación para cubrir un área mayor de la herida. Las células epidérmicas que se dividen crecerán finalmente dentro de y cubrirán las áreas de las ranuras, sin embargo, la matriz de soporte dérmica subyacente realmente no se expande en estas áreas. La matriz dérmica, compuesta principalmente por colágeno, otras proteínas de la matriz proteínica extracelular y complejo de membrana basal, es responsable de la naturaleza extensible y flexible de la piel. La ausencia de una matriz dérmica da como resultado formación de cicatrices y contractura en el área de las ranuras. Esta contractura puede ser intensa y en caso de pacientes masivamente quemados que se someten a injerto de piel de grosor parcial extensivo puede necesitar procedimientos quirúrgicos de liberación subsiguientes para restaurar el movimiento de las articulaciones.

Cuando se agota el suministro de tejidos autólogos trasplantables o cuando no existe tejido autólogo adecuado disponible para el trasplante (por ejemplo, substitución de la válvula cardíaca), entonces pueden usarse substitutos, incluyendo materiales sintéticos artificiales, tejidos derivados de animales y productos tisulares, o tejidos humanos alogeneicos donados por otros individuos (habitualmente derivados de cadáveres). Materiales de implante artificiales incluyen polímeros sintéticos (por ejemplo, (PTFE) politetrafluoroetileno, Dacron y Goretex) formados a veces en una conformación tubular y usados como un conducto de flujo sanguíneo para algunos procedimientos de baipás arterial periférico. Adicionalmente, pueden usarse materiales sintéticos (poliuretanos) e hidrocoloides o geles artificiales como vendajes temporales de heridas antes del injerto de piel de grosor parcial.

Otros materiales artificiales incluyen plásticos y metales carbonizados, adaptados como una válvula cardíaca protética, utilizados para procedimientos de substitución de la válvula cardíaca aórtica. Los materiales sintéticos pueden elaborarse con baja inmunogenicidad pero están sometidos a otras limitaciones. En el caso de válvulas cardíacas mecánicas, sus características hemodinámicas necesitan una terapia anticoagulante de larga duración. Los conductos vasculares sintéticos, a menudo usados en procedimientos de baipás vascular periférico femoral, están sometidos a una incidencia de oclusión aún superior que los injertos autólogos. En muchos casos, se prefiere un implante biológico que pueda ser un tejido animal procesado o un tejido humano alogeneico reciente o crioconservado.

Tejidos animales (bovinos o porcinos) químicamente tratados se usan comúnmente como substituciones para válvulas cardíacas humanas defectuosas y se han usado en el pasado para conductos vasculares. El concepto en el procesamiento químico es estabilizar la matriz estructural de proteínas y colágeno reticulando con glutaraldehído o un agente de reticulación similar. Este tratamiento también enmascara los determinantes antigénicos, de modo que el huésped humano no reconocerá el implante como extraño y evita una respuesta de inmunorrechazo. Sin embargo, los tejidos tratados con glutaraldehído no permitirán la inmigración de células huésped que son necesarias para la remodelación y gradualmente se endurecerán como resultado de la calcificación. Por esta razón, los tejidos tratados con glutaraldehído requieren generalmente una substitución en 5-7 años. Venas bovinas tratadas con glutaraldehído se han usado en el pasado para procedimientos de baipás vascular, sin embargo, su uso se ha interrumpido debido a la incidencia inaceptable de formación de aneurismas y oclusión.

El uso de tejidos de trasplantes alogeneicos se ha aplicado a procedimientos de substitución de válvulas cardíacas, procedimientos de baipás arterial, procedimientos de substitución de huesos, cartílagos y ligamentos y a tratamiento de heridas de grosor total como un vendaje temporal. El tejido alogeneico se usa reciente o puede crioconservarse con el uso de DMSO y/o glicerol, para mantener la viabilidad de los componentes celulares. Se cree que los componentes celulares contienen antígenos de histocompatibilidad y son capaces de provocar una respuesta inmunitaria del huésped. En muchos casos, el paciente que recibe el trasplante alogeneico se somete a terapia inmunosupresora. A pesar de esta terapia, muchos trasplantes alogeneicos, incluyendo válvulas cardíacas y vasos sanguíneos, sufren una respuesta inflamatoria y fallan en 5-10 años. La piel alogeneica es rechazada típicamente en 1-5 semanas de aplicación y nunca se ha demostrado que sea permanentemente aceptada por el huésped, incluso con el uso de fármacos inmunosupresores.

Otros han desarrollado métodos de procesamiento alternativos que están destinados a tratar las limitaciones de los tejidos de trasplantes alogeneicos y derivados de animales. El secado por congelación se usa habitualmente en el procesamiento de hueso alogeneico para trasplante. Se ha encontrado que el procedimiento de secado por congelación da como resultado un injerto que no provoca una respuesta de rechazo significativa en comparación con hueso alogeneico reciente o crioconservado. El hueso secado por congelación después del implante actúa como una plantilla, que subsiguientemente es remodelada por el huésped. Cuando el procedimiento de secado por congelación se ha aplicado a tejidos más complejos tales como válvulas cardíacas, los resultados han sido variados pero globalmente insatisfactorios. Se efectuó un estudio en el que 15 válvulas cardíacas alogeneicas se procesaban mediante secado por congelación antes del trasplante. La mayoría de las válvulas secadas por congelación fallaban debido a causas mecánicas en el intervalo reciente después del injerto. Sin embargo, aquellas válvulas secadas por congelación que no fallaban demostraban una funcionalidad prolongada (hasta 15 años).

También se han usado enzimas y procesamiento con detergentes para eliminar células antigénicas de tejidos trasplantables basados en colágeno. Los disolventes orgánicos y los tratamientos con detergente se han usado satisfactoriamente con tejidos relativamente simples tales como duramadre usada en procedimientos quirúrgicos reconstructivos. Sin embargo, el procesamiento químico de estructuras más complejas tales como válvulas cardíacas, conductos vasculares y piel solo ha tenido un éxito limitado en aplicaciones clínicas.

La invención de esta patente es una técnica de procesamiento exhaustiva que trata episodios de daño potenciales en la preparación de tejidos basados en colágeno complejos para el trasplante. La tecnología combina etapas de procesamiento tanto bioquímicas como físicas para alcanzar las características ideales de la función de plantilla de modo que el injerto tisular pueda ser remodelado para un mantenimiento a largo plazo por el paciente.

Breve sumario de la invención

En su forma preferida, el método de esta invención incluye las etapas de procesar tejidos biológicos incluyendo el tratamiento con una solución estabilizante para reducir el daño provocado por la obtención, el tratamiento con una solución de procesamiento para eliminar células y otros componentes tisulares antigénicos, el tratamiento con una solución crioprotectora, la congelación y el almacenamiento bajo condiciones específicas para evitar una formación de cristales de hielo dañina funcionalmente significativa, el secado bajo condiciones que eviten la recristalización de hielo dañina, el almacenamiento en estado seco a temperaturas por encima de la congelación, la rehidratación bajo condiciones específicas y con una solución de rehidratación para minimizar el daño provocado por tensión superficial y aumentar adicionalmente la conservación selectiva de la matriz, y la reconstitución con células viables que no serán rechazadas por el huésped.

Descripción de las modalidades preferidas

La presente invención proporciona un método para procesar y conservar tejidos biológicos basados en colágeno para el trasplante, a través de etapas de pretratamiento químico y eliminación de células, criopreparación, estabilización en seco, secado, rehidratación y reconstitución celular. El método de procesamiento y conservación se diseña para generar un injerto tisular biológico trasplantable que cumple específicamente los siguientes criterios:

(a): proporciona una matriz extracelular de proteínas y colágeno que puede ser remodelada y reparada por el huésped,

(b): proporciona una membrana basal intacta para la religazón segura de células endoteliales o epiteliales viables,

(c): no provoca una respuesta inmunitaria por parte del huésped,

(d): no se calcifica y

(e): puede almacenarse y transportarse fácilmente a temperaturas ambientales.

En la modalidad preferida, el tejido biológico que ha de procesarse se obtiene o extirpa en primer lugar de un cadáver humano o donante animal e inmediatamente se pone en una solución de transporte estabilizante que detiene e impide la degradación osmótica, hipóxica, autolítica y proteolítica, protege contra la contaminación bacteriana y reduce el daño mecánico que puede producirse con tejidos que contienen componentes del músculo liso (por ejemplo, vasos sanguíneos). La solución estabilizante contiene generalmente un tampón apropiado, uno o más antioxidantes, uno o más agentes oncóticos, un antibiótico, uno o más inhibidores de proteasas y, en algunos casos, un relajante del músculo liso.

En la modalidad preferida, el tejido se incuba a continuación en una solución de procesamiento para eliminar células antigénicas viables (incluyendo células epiteliales, células endoteliales, células del músculo liso y fibroblastos) de la matriz estructural sin dañar el complejo de la membrana basal o la integridad estructural de la matriz de colágeno. La solución de procesamiento contiene generalmente un tampón apropiado, sal, un antibiótico, uno o más detergentes, uno o más inhibidores de proteasas y/o una o más enzimas. El tratamiento del tejido con esta solución de procesamiento debe ser a una concentración durante un tiempo tal que se evite la degradación del complejo de la membrana basal y se mantenga la integridad estructural de la matriz, incluyendo fibras de colágeno y elastina.

Después de que el tejido se descelularice, se prefiere incubar en una solución de crioconservación. En la modalidad preferida, esta solución contiene generalmente uno o más crioprotectores para minimizar el daño provocado por cristales de hielo a la matriz estructural que podría producirse durante la congelación, y uno o más componentes protectores en seco, para minimizar la alteración provocada por daño estructural durante el secado, y puede incluir una combinación de un disolvente orgánico y agua que no sufre ni expansión ni contracción durante la congelación. Como un método alternativo, la matriz tisular descelularizada puede fijarse con un agente de reticulación tal como glutaraldehído y almacenarse antes del trasplante. Después de la incubación en esta solución de crioconservación, el tejido se envasa dentro de un recipiente estéril, tal como un vial de vidrio o una bolsa, que es permeable al vapor de agua pero impermeable a las bacterias.

En la modalidad preferida, una cara de esta bolsa consiste en membrana Tyvek porosa de calidad médica, un producto comercializado de DuPont Company de Wilmington, Delaware. Esta membrana es porosa al vapor de agua y hermética a bacterias y polvo. La membrana Tyvek se sella térmicamente a una lámina de estratificado de polietileno impermeable de 2,5 milímetros, dejando una cara abierta, formando así una bolsa de dos caras. La bolsa abierta se esteriliza mediante radiación gamma antes del uso. El tejido se pone asépticamente a través de esta abertura dentro de la bolsa estéril. A continuación, la cara abierta se termosella asépticamente para cerrar la bolsa. El tejido envasado se protege en lo sucesivo de la contaminación microbiana a través de las etapas de procesamiento
subsiguientes.

En la modalidad preferida, el tejido envasado se enfría hasta una temperatura baja a una velocidad especificada que es compatible con el crioprotector específico para minimizar el hielo hexagonal dañino y para generar las formas de hielo menos estables de fases amorfa y cúbica. El tejido se seca a continuación a una temperatura baja bajo condiciones de vacío, de modo que el vapor de agua se elimina secuencialmente de cada fase cristalina de hielo sin recristalización de hielo. Tal secado se alcanza mediante secado por congelación convencional o usando un secador de destilación molecular previamente patentado. Secadores de destilación molecular adecuados pueden obtenerse de LifeCell Corporation en the Woodlands, Texas y se describen en las Patentes de EE.UU. Nº 4.567.847 y 4.799.361, que se incorporan aquí mediante referencia.

Al terminar el ciclo de secado de las muestras secadas en una bolsa, el vacío del aparato de secado por congelación se invierte con un gas inerte seco tal como nitrógeno, helio o argón. Mientras se mantiene en el mismo ambiente gaseoso, la bolsa semipermeable se pone dentro de una bolsa hermética que se sella térmicamente o a presión adicionalmente. La configuración final de la muestra seca está por lo tanto en una atmósfera gaseosa inerte, herméticamente sellada en una bolsa impermeable.

Al terminar el ciclo de secado de muestras secadas en un vial de vidrio, el vial se sella bajo vacío con un tapón inerte apropiado y el vacío del aparato de secado se invierte con un gas inerte antes de la descarga.

En la modalidad preferida, el tejido secado envasado puede almacenarse durante períodos de tiempo prolongados bajo condiciones ambientales. El transporte puede efectuarse a través de soportes estándar y bajo condiciones estándar relativas a exposición a temperaturas normales y tiempos de aporte.

En la modalidad preferida, el tejido secado se rehidrata antes del trasplante. Es importante minimizar fuerzas osmóticas y efectos de tensión superficial durante la rehidratación. El objetivo de la rehidratación es aumentar la conservación selectiva de la matriz de soporte extracelular mientras que se eliminan cualesquiera células antigénicas residuales y otros componentes potencialmente antigénicos. La rehidratación apropiada puede efectuarse mediante una incubación inicial del tejido secado en un ambiente de aproximadamente 100% de humedad relativa, seguido por inmersión en una solución de rehidratación adecuada. Alternativamente, el tejido secado puede sumergirse directamente en la solución de rehidratación sin incubación previa en un ambiente de alta humedad. La rehidratación no debe provocar daño osmótico a la muestra. La rehidratación con vapor debe alcanzar idealmente un nivel de humedad residual de al menos 15% y la rehidratación con fluido debe dar como resultado un nivel de humedad del tejido de entre 20% y 70%.

Dependiendo del tejido que ha de rehidratarse, la solución de rehidratación puede ser simplemente solución salina normal, lactato de Ringer o un medio de cultivo celular estándar. Cuando el tejido se somete a la acción de colagenasas, elastasas o actividad autolítica residual procedente de células previamente eliminadas, endógenas, se elaboran aditivos para la solución de rehidratación e incluyen inhibidores de proteasas. Cuando está presente actividad de radicales libres residual, se usan agentes para proteger contra la hipoxia incluyendo antioxidantes, agentes enzimáticos que protegen contra el daño por radicales libres y agentes que minimizan la perturbación de rutas bioquímicas que resultan del daño hipóxico. También pueden incluirse antibióticos para inhibir la contaminación bacteriana. Agentes oncóticos que están en forma de proteoglicanos, dextrano y/o aminoácidos también pueden incluirse para evitar el daño osmótico a la matriz durante la rehidratación. La rehidratación de una muestra seca es especialmente adecuada para este procedimiento ya que permite la distribución rápida y uniforme de los componentes de la solución de rehidratación. Además, la solución de rehidratación puede contener componentes específicos no usados previamente, por ejemplo difosfonatos para inhibir fosfatasa alcalina y evitar la calcificación subsiguiente. También pueden incluirse en la solución de rehidratación agentes para estimular la neovascularización y la infiltración de células huésped después del trasplante de la matriz extracelular rehidratada. Alternativamente, la rehidratación puede realizarse en una solución que contiene un agente de reticulación tal como glutaraldehído.

Las células viables inmunotolerables deben devolverse a la matriz estructural rehidratada para producir un injerto permanentemente aceptado que pueda ser remodelado por el huésped. En la modalidad preferida, las células viables inmunotolerables pueden reconstituirse mediante técnicas de cultivo celular in vitro antes del trasplante, o mediante repoblación in vivo después del trasplante.

En la modalidad preferida los tipos de células usados para la reconstrucción in vitro dependerán de la naturaleza del injerto trasplantable. El requisito principal para la reconstitución de piel de grosor completo a partir de dermis procesada y rehidratada es la devolución de las células epidérmicas o queratinocitos. Estas células pueden derivarse del paciente receptor en cuestión, en forma de un pequeño injerto de piel de grosor parcial mallado o como queratinocitos aislados expandidos en láminas bajo condiciones de cultivo celular. Alternativamente, pueden usarse queratinocitos alogeneicos derivados de prepucio u origen fetal para cultivar y reconstituir la epidermis.

La célula importante para la reconstitución de válvulas cardíacas y conductos vasculares es la célula endotelial, que recubre la superficie interna del tejido. Las células endoteliales también pueden expandirse en cultivo y pueden derivarse directamente del paciente receptor en cuestión o de arterias o venas umbilicales.

Después del secado, o después del secado y la rehidratación, o después del secado, la rehidratación y la reconstitución, el injerto tisular procesado se transportará al hospital o centro de tratamiento apropiado. La elección de la composición final del producto dependerá de la aplicación clínica pretendida específica.

En la práctica de esta invención, es fundamental que se obtengan tejidos adecuados antes del procesamiento. Pueden obtenerse tejidos de cadáver humano a través de aproximadamente 100 bancos de tejido de EE. UU. Adicionalmente, pueden obtenerse tejidos humanos directamente de los hospitales. Se requiere un documento de consentimiento informado firmado de la familia del donante para permitir la extirpación de tejidos para el trasplante. Los tejidos animales pueden obtenerse de un número de compañías de procesamiento de carne y de suministradores de animales de laboratorio. El tipo particular de tejido extirpado no es limitativo para el método de esta invención. Sin embargo, el procesamiento del tejido se mejora mediante el uso de procedimientos de obtención específicos y el tratamiento con solución estabilizante para evitar ciertos episodios de daño mecánico y bioquímico.

Los tejidos extirpados pueden sufrir una variedad de episodios de daño mecánico y bioquímico durante la obtención. Tanto los componentes celulares como la matriz extracelular pueden lesionarse durante estos episodios. El daño a la matriz extracelular se produce principalmente como resultado de la desestabilización del componente celular. La intención de esta invención es eliminar definitivamente este componente celular y conservar óptimamente la matriz extracelular, por lo tanto la solución estabilizante se formula para minimizar el daño celular y subsiguientemente a la matriz extracelular. La matriz extracelular de proteína y colágeno comprende una red tridimensional natural que incluye diversas proteínas tales como colágeno Tipo I, colágeno Tipo II, colágeno Tipo III, colágeno Tipo IV, elastina, laminina, teninsina y actinina, y proteoglicanos.

El episodio iniciador en el daño celular es la hipoxia (deficiencia de oxígeno que alcanza a tejidos del cuerpo) y una falta de suministro de nutrientes requerido para que la célula mantenga el metabolismo y la producción energética. La hipoxia y especialmente la hipoxia y la reperfusión dan como resultado la generación de radicales libres tales como peróxido de hidrógeno, una especie oxidante que reacciona con componentes celulares incluyendo membranas y proteínas. Los cambios subsiguientes de peroxidación de lípidos y reticulación dan como resultado un trastorno estructural y funcional de la célula e inician la liberación de enzimas autolíticas (normalmente contenidas en lisosomas) a la matriz extracelular. El daño a la matriz es doble, daño oxidante y degradación enzimática. Una falta de suministro de nutrientes amplía estos episodios en los que la célula ya no puede proporcionar los requerimientos energéticos necesarios para mantener sus mecanismos de defensa contra el daño hipóxico. Para minimizar estos episodios, son posibles varios enfoques. Estos incluyen el uso de enzimas (superóxido dismutasa y catalasa) para neutralizar el anión superóxido y el peróxido de hidrógeno o compuestos que pueden reaccionar directamente con y neutralizar otras especies de radicales libres. Estos compuestos denominados antioxidantes incluyen terc-butilhidroquinona (BHT), alfa-tocoferol, manitol, hidroxiurea, glutationa, ascorbato, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y los aminoácidos histidina, prolina y cisteína. Además de los antioxidantes, la solución estabilizante contiene generalmente agentes que inhiben la alteración hipóxica hasta rutas bioquímicas normales, por ejemplo, alopurinol para inhibir xantina deshidrogenasa, inhibidores de lipoxigenasa, fármacos bloqueadores de canales del calcio, agentes que se unen a calcio, agentes que se unen a hierro, intermediadores metabólicos y substratos de la generación de trifosfato de adenosina (ATP).

La solución estabilizante también contiene generalmente uno o más antibióticos, agentes antifúngicos, proteoglicanos y un tampón apropiado. Los antibióticos son necesarios para inhibir o evitar el crecimiento bacteriano y la infección tisular subsiguiente. Los antibióticos pueden seleccionarse de penicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, neomicina, bacitracina y vancomicina. Adicionalmente, pueden emplearse agentes antifúngicos, incluyendo anfotericina B, nistatina y polimixina.

Los proteoglicanos se incluyen en la solución estabilizante para proporcionar un equilibrio osmótico coloidal entre la solución y el tejido, evitando de ese modo la difusión de proteoglicanos endógenos desde el tejido a la solución. Los proteoglicanos endógenos realizan una variedad de funciones en la fisiología de tejidos conectivos basados en colágeno. Pueden estar implicados en la regulación del crecimiento y la diferenciación celulares (por ejemplo, sulfato de heparina y células del músculo liso) o, alternativamente, son importantes para prevenir la calcificación patológica (como con las válvulas cardíacas). Los proteoglicanos también están implicados en la regulación compleja de la síntesis de colágeno y elastina y la remodelación, que es fundamental para la función del tejido conectivo. Los proteoglicanos se seleccionan del grupo de sulfato de condroitina, sulfato de heparina y sulfato de dermatano. Agentes osmóticos no proteoglicánicos que también pueden incluirse son polímeros tales como dextrano y polivinilpirrolidona (PVP) y aminoácidos tales como glicina y prolina.

La solución estabilizante también contiene generalmente un tampón apropiado. La naturaleza del tampón es importante en varios aspectos de la técnica de procesamiento. Los tampones cristaloideos de fuerza osmótica baja se han asociado con el daño que se produce durante la obtención de la vena sáfena y con el almacenamiento corneal. Es esencial un pH y una capacidad de tamponamiento óptimos contra los productos del daño provocado por hipoxia (descritos posteriormente). En este contexto, los tampones orgánicos y de bicarbonato tienen ventajas claras. (En el almacenamiento de glóbulos rojos, se ha mostrado que los tampones de acetato-citrato con glicina y glucosa son eficaces para prolongar la vida útil y mantener la integridad celular). Los inventores prefieren usar un tampón orgánico seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MPOS) y ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico (HEPES). Alternativamente, un tampón con bajo contenido de sal o fisiológico, incluyendo, fosfato, bicarbonato y acetato-citrato, puede ser más apropiado en ciertas aplicaciones.

En otra modalidad preferida, los componentes de la solución estabilizante tratan uno o más de los episodios que se producen durante la extirpación de tejidos vasculares, tales como espasmo, hipoxia, reperfusión con hipoxia, liberación de enzimas lisosómicas, adhesión de plaquetas, esterilidad y condiciones de tamponación. La contracción involuntaria del revestimiento del músculo liso de una pared de un vaso sanguíneo puede resultar de estiramiento o distensión mecánicos, así como de la acción química de ciertos factores de contracción derivados de células endoteliales, típicamente liberados bajo condiciones hipóxicas (bajo contenido de oxígeno). Esta contracción involuntaria da como resultado un daño irreversible al propio músculo, las células endoteliales y la matriz extracelular circundante. Por esta razón, la solución estabilizante para vasos sanguíneos incluye uno o más relajantes del músculo liso, seleccionados del grupo de péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), papaverina, nitroprusiato sódico (NaNP), H7 (un inhibidor de proteína quinasa C), bloqueadores de canales del calcio, queladores de calcio, isoproterenol, fentolamina, pinacidil, isobutilmetilxantina (IBMX), nifedipina y flurazina. El tejido extirpado se pone inmediatamente en esta solución estabilizante y se mantiene a 4ºC durante el transporte y cualquier almacenamiento antes del procesamiento adicional.

En la práctica de esta invención, es esencial que el tejido extirpado se procese para eliminar componentes celulares antigénicos.

La descelularización puede efectuarse usando un número de tratamientos químicos, incluyendo incubación en ciertas sales, detergentes o enzimas. Se ha demostrado que el uso de detergente Triton X-100, un producto comercializado de Rohm and Haas Company de Philadelphia, PA, elimina membranas celulares, según se detalla en la Patente de EE.UU. Nº 4.801.299. Otros detergentes descelularizantes aceptables incluyen monooleato de polioxietilen(20)sorbitán y monooleato de polioxietilen(80)sorbitán (Tween 20 y 80), desoxicolato sódico, 3-[3-(cloramidopropil)-dimetilamino]-1-propanosulfonato, octilglucósido y dodecilsulfato sódico.

Alternativamente, pueden usarse enzimas para efectuar la descelularización, incluyendo, pero no limitadas a, dispasa II, tripsina y termolisina. Estas enzimas reaccionan con diferentes componentes del colágeno y las conexiones intercelulares para alcanzar sus efectos. La dispasa II ataca al colágeno Tipo IV, que es un componente de la lámina densa y las fibrillas de anclaje de la membrana basal. La termolisina ataca al antígeno del pemfigoide bulboso en el hemidesmosoma de la capa basal de los queratinocitos. La tripsina ataca al complejo desmosómico entre las células. Debido a la naturaleza proteolítica de estas enzimas, debe tenerse cuidado de que la eliminación de células se produzca sin daño significativo a la matriz extracelular, incluyendo el complejo de la membrana basal. Esto es una función de la concentración, el tiempo y la temperatura, si se usa durante demasiado tiempo o a una concentración demasiado alta, la dispasa II, por ejemplo, puede eliminar completamente el complejo de la membrana basal de la dermis.

Por ejemplo, con dispasa II de piel de cadáver humano a 1,0 unidades/ml durante 90 minutos a 37ºC se eliminarán todos los queratinocitos excepto la capa basal, aunque ya se haya producido algún daño al complejo de la membrana basal. La termolisina a 200 \mug/ml durante 30 minutos a 4ºC eliminará esencialmente todos los queratinocitos sin daño al complejo de la membrana basal en algunas ocasiones, pero esto varía de donante a donante observándose en algunos donantes evidencia de daño a la membrana basal. La incubación de piel en cloruro sódico 1 molar durante 16 horas para piel humana y 48 horas para piel porcina permitirá habitualmente la separación limpia de la epidermis y la dermis sin daño al complejo de la membrana basal.

Además de sales, detergentes y enzimas, la solución de procesamiento también contiene ciertos inhibidores de proteasas, para prevenir la degradación de la matriz extracelular. Los tejidos conectivos basados en colágeno contienen proteasas y colagenasas como enzimas endógenas en la matriz proteínica extracelular. Adicionalmente, ciertos tipos de células, incluyendo células del músculo liso, fibroblastos y células endoteliales, contienen un número de estas enzimas dentro de vesículas llamadas lisosomas. Cuando estas células son dañadas por episodios tales como hipoxia, los lisosomas se rompen y su contenido se libera. Como resultado, la matriz extracelular puede sufrir daño grave a partir de descomposición de proteínas, proteoglicanos y colágenos. Este daño puede ser grave, según se evidencia en casos clínicos de isquemia cardíaca en los que una reducción en el oxígeno que es insuficiente para provocar la muerte celular da como resultado un daño pronunciado a la matriz de colágeno. Adicionalmente, una consecuencia de la descomposición extracelular es la liberación de quimioatrayentes, que requieren células inflamatorias, incluyendo leucocitos polimorfonucleares y macrófagos, hacia el injerto, que están destinados a eliminar tejido muerto o dañado. Sin embargo, estas células también perpetúan la destrucción de la matriz extracelular a través de una respuesta inflamatoria no específica. De acuerdo con esto, la solución de procesamiento contiene uno o más inhibidores de proteasas seleccionados del grupo de N-etilmaleimida (NEM), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis(2-aminoetil(éter)N,N,N',N'-tetraacético, cloruro amónico, pH elevado, apoprotinina y leupeptina para evita tal daño.

Además de sales, detergentes, enzimas e inhibidores de proteasas, la solución de procesamiento contiene generalmente un tampón apropiado. Este puede implicar uno de muchos tampones orgánicos diferentes que se describen anteriormente. Los inventores prefieren usar un tampón orgánico seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) y (N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[ácido 2-etanosulfónico] (HEPES). Alternativamente, un tampón con bajo contenido de sal o fisiológico, incluyendo fosfato-bicarbonato-acetato-citrato-glutamato con o sin glicina, puede ser más apropiado en ciertas aplicaciones. Los tampones con bajo contenido de sal o fisiológicos son más capaces de soportar la infiltración del injerto con células viables y de ahí son más pertinentes cuando la infiltración celular, incluyendo noevascularización, es esencial para la supervivencia inicial del injerto, como en una matriz dérmica trasplantada.

Como la solución de procesamiento puede contener productos químicos que podrían ser irritantes o inflamatorios durante el trasplante, es importante para la práctica de esta invención que la solución de procesamiento se enjuague a fondo del tejido. En la modalidad preferida, este lavado se produce enjuagando en cambios suficientes de tampón apropiado, hasta que los residuos de la solución de procesamiento se reducen a niveles compatibles con el trasplante. Alternativamente, los componentes de la solución de procesamiento pueden neutralizarse mediante inhibidores específicos, por ejemplo, dispasa II mediante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o tripsina mediante suero.

Las etapas iniciales de crioconservación del tejido descelularizado incluyen incubar el tejido en una criosolución antes de la etapa de congelación. La criosolución comprende un tampón apropiado, uno o más crioprotectores y/o protectores en seco con o sin un disolvente orgánico que en combinación con agua no sufre ni expansión ni contracción

Un tampón apropiado puede incluir cualquiera de los tampones previamente descritos utilizados para obtener o procesar por descelularización el tejido extirpado.

Además de un tampón apropiado, la criosolución contiene generalmente un crioprotector. Los crioprotectores elevan el intervalo de temperatura de transición vítrea del tejido permitiendo de ese modo la estabilización óptima del tejido en estado congelado. Elevando este intervalo, el tejido puede secarse a una velocidad más rápida. El crioprotector también disminuye la formación de hielo para una velocidad de enfriamiento dada permitiendo en algún grado la vitrificación (ausencia de una red cristalina), pero, en una mayor extensión, la formación de hielo cúbico. Con los métodos actuales de enfriamiento ultrarrápido en ausencia de crioprotectores, la vitrificación solo se alcanza con muestras muy pequeñas y solo hasta una profundidad de unas pocas micras. Se encuentra entonces hielo cúbico y hexagonal. El agua vitrificada y el hielo cúbico son menos dañinos para los componentes de la matriz extracelular que el hielo hexagonal. Sin embargo, en algunos casos, se puede permitir que esté presente hielo hexagonal (por ejemplo, el procesamiento de piel). Es permisible algún grado de formación de hielo hexagonal cuando no da como resultado un deterioro de las características funcionales del tejido. Las válvulas cardíacas después de la implantación se someten a tensión repetitiva y de ahí tolerarán menos daño por cristales de hielo que, por ejemplo, la dermis.

Pueden usarse diversos crioprotectores en la presente invención. Estos incluyen: dimetilsulfóxido (DMSO), dextrano, sacarosa, 1,2-propanodiol, glicerol, sorbitol, fructosa, trehalosa, rafinosa, propilenglicol, 2,3-butanodiol, hidroxietilalmidón, polivinilpirrolidona (PVP), prolina (u otros estabilizantes proteínicos), albúmina de suero humano y combinaciones de los mismos. Los crioprotectores adecuados estructuran las moléculas de agua de modo que el punto de congelación se reduce y/o la velocidad de enfriamiento necesaria para alcanzar la fase vítrea se reduce. También elevan el intervalo de temperatura de transición vítrea del estado vítreo.

La criosolución también puede incluir exponer el tejido biológico a uno o más componentes protectores en seco. Los protectores en seco, por definición, estabilizan muestras en estado seco. Algunos crioprotectores también actúan como protectores en seco. Algunos compuestos poseen cantidades variables de cada actividad, por ejemplo, la trehalosa es predominantemente un protector en seco y un crioprotector más débil, mientras que la sacarosa es predominantemente un crioprotector y un protector en seco más débil. Por ejemplo, la trehalosa y los carbohidratos polihidroxilados se unen a y estabilizan macromoléculas tales como proteínas. Pueden usarse diversos protectores en seco en la presente invención: sacarosa, rafinosa, trehalosa, zinc, prolina (u otros estabilizantes proteínicos), ácido mirístico, espermina (un compuesto polianiónico) y combinaciones de los mismos.

Se ha mostrado que la combinación de dimetilsulfóxido 0,5 molar, propilenglicol 0,5 M, 2,3-butanodiol 0,25 M, prolina 1,0 M, rafinosa al 2,5%, polivinilpirrolidona al 15% y dextrano (PM 70.000) al 15% en combinación con velocidades de enfriamiento del orden de -2500ºC/segundo es eficaz para mantener la integridad estructural de venas sáfenas humanas después tanto de congelación como de secado. Los inventores también han demostrado que cuando esta solución de crioprotectores, protectores en seco y tampón se usa con una muestra tisular más grande, tal como una válvula cardíaca, entonces el tejido puede sufrir agrietamiento después de la congelación y/o el secado. Este fenómeno puede vencerse reemplazando un porcentaje del agua por un disolvente orgánico tal como formamida. El porcentaje (50%) se determina como la combinación de disolvente, agua, crioprotectores y protectores en seco que no se expandirá o contraerá durante la congelación. La formamida (HCONH_{2}) es un disolvente orgánico hidrófilo carbonado que disuelve crioprotectores basados en carbohidratos. Puede substituirse por otros disolventes orgánicos con propiedades similares, tales como dimetilformamida, dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, propilenglicol, etilenglicol y piridina.

Las muestras biológicas se incuban en las criosoluciones durante un período de unos pocos minutos a unas pocas horas antes de que se enfríen rápidamente. En general, la crioconservación se realiza como una secuencia de episodios continua. Este tejido se incuba en primer lugar en la criosolución durante un período definido (de 0,5 a 2 horas) hasta que se alcanza la penetración completa de los componentes de la criosolución y la muestra se congela a continuación hasta una temperatura a la que es estable, habitualmente menos de -20ºC.

Los inventores se han implicado en el desarrollo de la criofijación y el secado por destilado molecular a temperatura ultrabaja como un método para preparar muestras biológicas para análisis microscópico electrónico. Para validar este enfoque, investigaron la relación entre las características de secado y las fases de hielo presentes dentro de las muestras congeladas.

La preparación de muestras para microscopía electrónica mediante técnicas de procesamiento puramente físicas o en seco tiene un atractivo teórico, especialmente cuando el objetivo definitivo es el análisis tanto de la estructura como de la bioquímica. Desde los primeros días de la microscopía electrónica, se han realizado varios intentos de refinar y desarrollar el procedimiento de secado por congelación y vacío o secado por congelación (FD) para muestras de células y tejidos.

A pesar de las ventajas conceptuales y el progreso realizado, el secado por congelación para microscopía electrónica todavía tiene que alcanzar el estado de una técnica habitual ampliamente aplicable. Varias razones explican esto. En primer lugar, la conservación ultraestructural es a menudo inferior en comparación con la química convencional, o técnicas del procesamiento en húmedo o técnicas híbridas tales como substitución por congelación. En segundo lugar, existen numerosos problemas prácticos con la manipulación de muestras, el control de la temperatura, los parámetros de vacío y los procedimientos de procesamiento final. En tercer lugar, y quizás lo más fundamentadamente, se cree que el secado a temperaturas por debajo de -123ºC para evitar el daño ultraestructural es imposible o poco práctico. Como resultado de estos obstáculos prácticos y teóricos, solo se ha presentado una investigación esporádica del secado por congelación a baja temperatura.

La base de esta barrera teórica viene de la aplicación de la teoría cinética de gases y las velocidades de sublimación predichas según se expresa mediante la ecuación de Knudsen:

Js = NPs \left(\frac{M}{2\pi QT}\right)^{0,5}

donde

Js = velocidad de sublimación

N = coeficiente de evaporación

Ps = presión de vapor de saturación

Q = constante universal de los gases

T = temperatura absoluta de la muestra

M = peso molecular del agua.

Para las condiciones de secado teóricamente ideales, esta ecuación indica que la velocidad de sublimación es directamente proporcional a la presión de vapor de saturación del agua dentro de la muestra e inversamente proporcional a la temperatura absoluta de la muestra. Aunque la temperatura puede definirse claramente, la presión de vapor de saturación es un parámetro más complejo.

Aplicaciones previas de esta ecuación han usado presiones de vapor de saturación que se determinaban teóricamente. Sin embargo, estas presiones de vapor teóricas incluyen el calor latente de fusión y, de ahí, son aplicables solo a hielo hexagonal. Los cálculos basados en estos valores teóricos han conducido a conclusiones tales como "a 150 K, se emplearían 3,5 años hasta que una capa de hielo de 1 mm de grosor se eliminara completamente mediante secado por congelación. Por lo tanto, no es realista intentar secar por congelación a temperaturas por debajo de 170 K".

Sin embargo, varias fases de hielo distintas a la hexagonal pueden coexistir dentro de una muestra dependiendo del modo de enfriamiento y el uso de crioprotectores. Estas fases diferentes pueden alcanzarse mediante varios métodos incluyendo: condensación de vapor, aplicación hiperbárica y enfriamiento por apagado ultrarrápido.

Las fases principales de hielo ahora reconocidas son amorfa, cúbica y hexagonal. Estas fases de hielo exhiben diferentes estabilidades, lo que podría sugerir que las presiones de vapor de saturación también serían diferentes. Se ha determinado que para agua condensada al vapor a temperaturas a las que ambas fases pueden coexistir, la presión de vapor de saturación del hielo amorfo es uno o dos logaritmos superior que la del hielo cúbico.

La aplicación de estas presiones de vapor de saturación determinadas experimentalmente en la ecuación de Knudsen reduce el tiempo de secado a 150 K de 3,5 años a 0,035 años, o 12,7 días, para 1 mm de hielo amorfo. Debido a que las técnicas de enfriamiento por apagado de muestras biológicas alcanzan aproximadamente 5 \mum de esta fase, el tiempo de secado de este componente, basándose solamente en la ecuación de Knudsen, sería del orden de 1,5 horas. De aquí que, en términos de tiempos de secado prácticos, pueda vencerse la barrera teórica para secar a temperaturas ultrabajas.

Sin embargo, el secado no es un procedimiento estático sino dependiente de la velocidad. Además de la presión de vapor de saturación de las diferentes fases de hielo, también debe tenerse en cuenta la velocidad de transición de una fase a otra con la temperatura creciente. Para la preparación de muestras para microscopía electrónica, el secado debe producirse idealmente sin tal transición o desvitrificación. La información en cuanto a la velocidad de estas transiciones es limitada. Se ha encontrado que la transición de amorfo a cúbico se produce como un proceso irreversible que depende fuertemente de la temperatura en el intervalo de 160ºC a 130ºC y se expresa
mediante

t = 2,04 \ x \ 10^{28} \ x \ exp \ (-0,465 \ T)

La transición de cúbico a hexagonal era menos dependiente de la temperatura, produciéndose en el intervalo de -120ºC a -65ºC, y se expresa mediante

t = 2,58 \ x \ 10^{212} \ x \ exp \ (-0,126 \ T)

De forma interesante, cuando la temperatura de la muestra se incrementaba a una velocidad de 5ºC/minuto, la transición de amorfo a cúbico se producía en un episodio repentino cerca de -130ºC.

Basándose en los datos anteriores, la velocidad de transición, así como la presión de vapor de saturación, determinan la profundidad a la que una fase de hielo particular puede secarse a una temperatura específica. Para hielo amorfo a -160ºC, el tiempo de transición es 205 días. Basándose en la extrapolación de presiones de vapor de saturación determinadas experimentalmente y la ecuación de Knudsen, esto permitiría el secado de 26 micras. A -140ºC, el tiempo de transición es 28 minutos y permitiría el secado de 0,8 \mum bajo condiciones ideales. Por debajo de -160ºC, es decir, antes del inicio de la transición, podría predecirse poca energía cinética de translación, si es que hubiera alguna, de las moléculas de agua y de ahí poco secado, si es que hubiera alguno.

Basándose en estas consideraciones, puede postularse la hipótesis del secado de transición es decir, que para una muestra que contiene múltiples fases de hielo, es posible secar cada fase secuencialmente durante su transición. La cantidad de cada fase secada obviamente dependerá de múltiples parámetros incluyendo la eficacia del aparato de secado, la velocidad de calentamiento y la impedancia de la envuelta de secado.

Crioconservación

La crioconservación es la conservación de la estructura celular o tisular frente a una lesión asociada con episodios de congelación. La crioprotección natural puede resultar del metabolismo adaptativo del organismo, con cambios en la estructura celular, la composición y el equilibrio metabólico que dan una tolerancia mejorada de congelación. En experimentos de laboratorio, cuando la viabilidad celular o la ultraestructura tisular han de conservarse después del enfriamiento, están disponibles dos métodos. El primero es enfriar ultrarrápidamente la muestra, dando como resultado que los fluidos tisulares se vitrifiquen, es decir, ausencia de cristales de hielo. El segundo es incorporar aditivos químicos para conferir un grado de crioprotección. Los productos químicos cambian de crioprotectores presentes en la naturaleza tales como glicerol, prolina, azúcares y alcoholes a disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido (DMSO) a polímeros de alto peso molecular tales como polivinilpirrolidona (PVP), dextrano e hidroxietilalmidón (HES).

La vitrificación de células y tejidos está limitada por la velocidad a la que la muestra puede enfriarse y las propiedades aislantes del propio tejido. Debido a limitaciones físicas, solo puede alcanzarse la vitrificación de una capa delgada de tejidos usando las técnicas del estado de la especialidad. Esto hace muy atractiva la idea de aditivos químicos para la crioprotección y la manipulación de la velocidad de enfriamiento en intentos de enfriar y almacenar muestras biológicas sin provocar daño estructural y funcional.

La lesión a las muestras biológicas debido a congelación está sometida a principios físicos y biológicos fundamentales, algunos conocidos desde hace mucho tiempo, pero otros solo entendidos recientemente. No se han iniciado investigaciones serias de los mecanismos de la lesión por congelación en muestras biológicas hasta el segundo cuarto de este siglo. Estos estudios previos estuvieron dominados por la creencia de que el daño físico por cristales de hielo era la principal causa de la lesión por congelación. Se han demostrado los efectos de la deshidratación y una correlación entre la concentración de solutos extracelulares y el daño celular y tisular. Una hipótesis "de dos factores" para la lesión por congelación de las células proponía que la lesión celular era el resultado de la concentración de solutos por hielo extracelular o la formación de hielo intracelular que provocaba lesión mecá-
nica.

La acción del glicerol y otros pequeños compuestos polares se ha interpretado como penetrante y ejerciente de una acción coligativa dentro de las células. En la proporción que la acción coligativa de los compuestos penetrantes mantiene el agua en estado líquido a temperaturas por debajo de 0ºC, se mantiene un volumen incrementado de solución celular. Esto evita una concentración excesiva de electrolitos tóxicos en la solución celular no congelada. Una influencia similar también tiene lugar en la solución externa. En este contexto, se hace referencia a la acción coligativa como una acción por un soluto extraño, al disminuir el punto de congelación de la solución en contacto con hielo. Si está presente suficiente compuesto protector, la concentración de sal no se eleva hasta un nivel críticamente dañino hasta que la temperatura se hace tan baja que las reacciones dañinas son suficientemente lentas para ser toleradas por las células. También pueden aplicarse conceptos similares de daño a la matriz tisular tanto mediante crecimiento mecánico de cristales de hielo como daño químico debido a la concentración de soluto y cambios en el
pH.

Los crioprotectores no penetrantes varían en tamaño desde sacarosa a substancias polímeras grandes, tales como PVP, HES y dextrano. Se ha sugerido que las substancias no penetrantes actúan mediante algún otro medio distinto al mecanismo coligativo descrito anteriormente. Se cree que el papel de moléculas más grandes es deshidratante mediante acción osmótica. Cuando se extrae una gran proporción de agua de las células por medio de un diferencial osmótico, está disponible menos agua libre para la cristalización de hielo intracelular, lo que a menudo se identifica como un factor letal. En los tejidos, las substancias polímeras pueden actuar uniéndose a y estructurando las moléculas de
agua.

La velocidad de enfriamiento en presencia de compuestos crioprotectores es un factor muy importante en la lesión por congelación. Normalmente, para las células, el enfriamiento lento es mejor que las velocidades de enfriamiento elevadas debido a que las últimas promueven la formación de hielo intracelular. Esto se produce debido a que hay un tiempo insuficiente para que el agua escape de las células antes de que el agua celular contenida se congele. Con el enfriamiento a velocidad lenta, se forma en primar lugar hielo extracelular, dando como resultado la deshidratación de la célula que, junto con la presencia del crioprotector, evita la formación de hielo intracelular. Para muestras de matriz celular existe una correlación más directa con la reducción global en el grado de formación total de cristales de
hielo.

Se creía que los compuestos penetrantes actuaban al no permitir un transporte excesivo de agua desde las células demasiado pronto en el procedimiento de congelación mientras que los compuestos no penetrantes tenían un efecto deshidratante sobre las células junto con un efecto coligativo de diluir la solución que rodea la célula. Sin embargo, ninguna de estas descripciones es completa.

Solutos tales como HES y PVP son compuestos que retiran agua totalmente no penetrantes de un peso molecular meramente mayor que la sacarosa no penetrante. El peso molecular mayor debe hacer a tales compuestos menos osmóticamente y coligativamente eficaces, cuando se consideran sobre una base en peso. Sin embargo, en soluciones concentradas, se ha observado que la acción coligativa de los compuestos es mucho mayor de lo que se esperaría basándose meramente en una relación lineal con la concentración.

Una fuente de daño para tejido congelado, distinta a la propia congelación, son los efectos osmóticos y tóxicos de muchos de los agentes crioprotectores. Cuando se usan en mezclas, algunos compuestos crioprotectores pueden contrarrestar la toxicidad de otros crioprotectores, como se demostró mediante la adición de polietilenglicol (PEG) a una mezcla de DMSO y glicerol. Los inventores han desarrollado varias soluciones de vitrificación
(VS).

Se probó la toxicidad de los componentes individuales de estas soluciones. En la mezcla, los efectos tóxicos eran inferiores que cuando se usaba solamente una concentración equivalente de un componente cualquiera. Las soluciones resultantes son atóxicas para los cultivos celulares y permanecen vítreas y ópticamente transparentes (es decir, no se forma cristal de hielo visible) cuando se sumergen en nitrógeno líquido.

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Solución de Vitrificación 1

Dimetilsulfóxido (DMSO)	-	0,5 M
Propilenglicol	-	0,5 M
2,3-butanodiol	-	0,25 M
Prolina	-	1,0 M
Rafinosa	-	25% (p/v)
Polivinilpirrolidona (PVP)	-	15% (p/v) (P.M. medio \approx 40.000)
Dextrano	-	15% (p/v) (P.M. medio \approx 40.000-70.000)

También se ha desarrollado una solución de vitrificación modificada (VS_{2}) que comprende una mezcla de:

DMSO	-	0,5 M
Propilenglicol	-	0,5 M
2,3-butanodiol	-	0,25 M
Rafinosa	-	10% (p/v)
Trehalosa	-	6% (p/v)
Sacarosa	-	6% (p/v)
PVP	-	12% (p/v) (P.M. medio \approx 40.000)
Dextrano	-	12% (p/v) (P.M. medio \approx 40.000-70.000)

Otra solución de vitrificación modificada (VS_{3}) que se ha desarrollado comprende una mezcla de:

DMSO	-	0,5 M
Propilenglicol	-	0,5 M
2,3-butanodiol	-	0,25 M
Rafinosa	-	2,5 (p/v)
Sacarosa	-	12% (p/v)
PVP	-	15% (p/v) (P.M. medio \approx 40.000)
Dextrano	-	15% (p/v) (P.M. medio \approx 40.000-70.000)

Se ha desarrollado una cuarta solución modificada (VS_{4}). Esta solución difiere en que contiene 50% de formamida, un disolvente orgánico. Esta mezcla ni se expande ni se contrae con la congelación y de ahí que no provoque agrietamiento cuando se congelan muestras de tejido mayores. Comprende una mezcla de:

Formamida	-	50% (p/v)
Dextrano 70 K	-	15% (p/v)
Rafinosa	-	2,5% (p/v)
PVP 40 K	-	15% (p/v)
Sacarosa	-	12% (p/v)

En resumen, los factores que afectan a la naturaleza crioprotectora de los compuestos son (a) la composición química, (b) la baja toxicidad, (c) el tamaño molecular y la capacidad de penetración y (d) la interacción con otros compuestos de la mezcla.

Los efectos fisicoquímicos de los crioprotectores son (a) disminución del punto de congelación en equilibrio del substrato del citoplasma sobre una base coligativa, (b) disminución de la temperatura de nucleación de hielo homogéneo, (c) velocidad reducida de crecimiento con cristales de hielo debido al cambio en la viscosidad y la difusividad térmica de la solución y (d) efectos deshidratantes sobre las células mediante la acción osmótica.

Parámetros de Enfriamiento

Para los propósitos de la criopreparación de los tejidos biológicos de esta invención, es esencial apuntar que puede usarse una variedad de procedimientos de enfriamiento. En una modalidad preferida de esta invención, el enfriamiento rápido se considera esencial para obtener la combinación de cristales de hielo apropiada. En la modalidad más preferida de esta invención, se usa un procedimiento de vitrificación que da como resultado la formación de una proporción substancial de agua amorfa en la muestra biológica. Como se describirá más adelante aquí, independientemente de la forma de enfriamiento que se use, se cree que están presentes en el producto final agua en fase amorfa, cristales de hielo cúbico y cristales de hielo hexagonal. El método de enfriamiento tiene una relación clara con la distribución de tipos de cristales de hielo encontrados en la criosolución enfriada.

Parámetros de Secado

El objetivo del secado controlado de un tejido biológico congelado por destilación molecular es eliminar agua de la muestra sin que se produzca un daño mecánico o químico adicional durante el procedimiento de secado. Esto implica evitar, mediante el uso de condiciones de secado apropiadas, dos episodios dañinos fundamentales. El primero es eliminar agua de las fases cristalinas de hielo sin transición a cristales mayores más estables y más destructivos. El segundo es eliminar agua de agua sólida pero no cristalina o mezclas de agua-soluto sin la fusión o cristalización de estas fases sólidas. Este segundo componente se refiere a agua presente en estado amorfo, agua junto con soluto en la mezcla eutéctica o el agua junto con un compuesto que se une a y estructura el agua y de ahí previene su cristalización durante el proceso de congelación. De ahí que el agua vítrea pueda ser de energía y estabilidad bajas, como en agua pura enfriada ultrarrápidamente, o energía y estabilidad altas, según se alcanza con agentes crioprotectores con velocidades de enfriamiento intermedias.

Muchas de las características requeridas del secado controlado para evitar la presencia de estos episodios se solapan. La razón de esto es que cada forma de agua tendrá un estado de energía particular, ya sea en un cristal o unida a un compuesto crioprotector, y es este estado de energía, en vez de su configuración, lo que determina los requisitos para el secado. Considérese, por ejemplo, (1) una muestra de hielo cúbico alcanzada enfriando agua pura a una velocidad de enfriamiento intermedia y (2) agua vitrificada alcanzada mezclando agua con glicerol hasta 45% vol:vol y enfriamiento a una velocidad intermedia. La muestra final será cristalina y el objetivo del secado es eliminar agua de este estado sin transición hasta hielo hexagonal. La segunda muestra es un sólido amorfo y el objetivo del secado es eliminar agua de esta fase sin fusión del cristal hasta un líquido con ebullición subsiguiente. Para el hielo cúbico, el inicio de su transición es -130ºC y la velocidad de transición depende de la temperatura, siendo muy baja a -130ºC y muy rápida a -90ºC. Para glicerol al 45%-agua, la temperatura de transición vítrea es -120ºC y representa el comienzo de la fusión. El proceso de fusión es muy lento a -120ºC y depende de la temperatura, haciéndose muy rápido a -90ºC.

Antes del comienzo de la transición de cúbico a hexagonal o la transición vítrea de glicerol al 45%-agua, la presión de vapor de saturación del agua en estas fases es extremadamente baja y el secado se produciría a velocidades extremadamente lentas. Por lo tanto, el objetivo de controlar el secado es eliminar agua de la fase de hielo cúbico durante su transición y en un tiempo menor que el que se requiere para cualquier transición significativa hasta hielo hexagonal y desde la fase de glicerol al 45%-agua durante su transición hasta un líquido pero en menos tiempo del que se requiere para que se forme cualquier líquido apreciable.

Este argumento puede aplicarse repetitivamente a todas las formas de agua presentes, ya sea cristalina en forma cúbica o hexagonal o no cristalina como amorfa o unida a cualquiera molécula, ya sea un crioprotector, una proteína, un carbohidrato o un lípido. Para simplificar este concepto, el agua en una muestra biológica congelada puede describirse por tener un nivel de energía específico E. En una muestra biológica congelada existirán formas de agua de múltiples niveles energéticos definibles:

E_{1}

\hskip1cm

E_{2}

\hskip1cm

E_{3}

\hskip1cm

- - - -

\hskip1cm

E_{n}

El modo de preparación, la naturaleza de la muestra, el uso de crioprotectores u otros aditivos y la velocidad de enfriamiento usados determinarán las proporciones relativas de estas diferentes formas de agua. Cada nivel energético determinará la temperatura de inicio de su transición o fusión y la dependencia con la temperatura de la velocidad de la transición o fusión.

Los procedimientos de secado controlado deben ser capaces de eliminar cada uno de estos diferentes estados del agua durante la transición y en menos tiempo del que se requiere para completar la transición. Por lo tanto, este modo de secado requiere que se cumplan varias condiciones.

En primer lugar, la muestra congelada debe cargarse al secador sin elevación de temperatura por encima de su temperatura de transición más baja. Si se produce la elevación de la temperatura, esta debe ser durante un corto período de tiempo de modo que no se produzca transición apreciable. Idealmente, la carga se produce bajo nitrógeno líquido a -190ºC, muy por debajo de la transición discernible más baja de -160ºC para agua amorfa pura enfriada ultrarrápidamente. Sin embargo, si la muestra es predominantemente hielo cúbico o una mezcla de agua y crioprotectores con una transición vítrea del orden de -100ºC a 130ºC, un sistema de refrigeración de circuito cerrado puede ser suficiente para permitir el mantenimiento de la temperatura de la muestra por debajo del inicio de la transición.

Una vez cargada, la muestra debe exponerse a vacío y estar en línea recta visual con las superficies del condensador. Los criterios para esto están determinados de nuevo por la naturaleza de las fases de agua presentes en la muestra. Deben alcanzarse los siguientes objetivos. El vacío dentro de la cámara durante el secado de una fase particular debe crear una presión parcial de agua al menos equivalente a o menor que la presión de vapor de saturación de agua en la fase que ha de eliminarse. Esta presión de vapor de saturación depende de la naturaleza de la fase acuosa y su temperatura. De ahí que, para agua amorfa pura en el intervalo de transición de -160ºC a -130ºC, las presiones de vapor de saturación aproximadas sean 6 x 10^{-12} mbar (-160ºC) y 5 x 10^{-7} mbar (-130ºC), respectivamente. Como los tiempos de transición de hielo amorfo a cúbico en este mismo intervalo de temperatura, de -160ºC a -130ºC, varían de 5 x 10^{5} minutos a 5 minutos, el secado será muy lento hasta que se alcanzan temperaturas del orden de -150 a -140ºC requiriendo un vacío de 5 x 10^{-10} a 2 x 10^{-8} mbar. Esto representa un extremo.

Para el hielo cúbico, se producirá poco secado, si es que se produce alguno, por debajo de su inicio de transición a -130ºC ya que su presión de vapor de saturación será del orden de un logaritmo inferior que el agua amorfa. En el intervalo de transición, de -130ºC a -100ºC, la presión de vapor de saturación del hielo cúbico es aproximadamente 5 x 10^{-8} a 9 x 10^{-5} mbar. Los tiempos de transición de cúbico a hexagonal son 700 minutos y 109 minutos, respectivamente. Por lo tanto, la presión de vapor de saturación determina los requisitos de vacío para el secado y puede aplicarse a todas las fases de agua presentes. Es importante apuntar que los mismos criterios no son aplicables a todas las fases, sino que en cambio son dependientes de la fase.

Un segundo criterio del vacío es que el camino libre medio esté por encima de la distancia entre la muestra y la superficie del condensador. Idealmente, este debe ser un exceso de diez veces. La superficie del condensador debe estar a una temperatura inferior que la temperatura de transición de inicio de la fase de agua que se elimina de la muestra de modo que la presión de vapor de saturación de agua condensada sobre esta superficie durante el secado sea considerablemente inferior que la de la fase acuosa dentro de la muestra. Idealmente, esto debe ser tres órdenes de magnitud inferior. Para una muestra que contiene múltiples fases de agua, la temperatura de la superficie del condensador debe permanecer por debajo del comienzo de la transición de la fase de hielo menos estable restante que ha de eliminarse. Idealmente, el condensador también debe estar en la línea visual de la muestra.

Una vez que la muestra se ha cargado y expuesto a vacío y a la superficie del condensador, la muestra y el soporte de la muestra deben calentarse a fin de incrementar la movilidad de las moléculas de agua y, de ahí, provocar su escape. Este es el componente esencial crítico en el secado de una muestra que contiene múltiples fases o niveles energéticos de agua. La temperatura de la muestra debe conocerse exactamente. El control de la temperatura y la velocidad de calentamiento de la muestra debe efectuarse exactamente. Esto es necesario para asegurar que el secado para cada fase de agua de la muestra sea secuencial.

De ahí que, para una muestra que contiene múltiples fases de agua de un nivel energético E_{1} y E_{2} - - - - E_{n}, donde E_{1} es el menos estable, entonces el calentamiento deba producirse a una velocidad tal que E_{1} se elimine antes de su transición a E_{2}, E_{2} antes de su transición a E_{3}, etc. Esto requiere condiciones de secado sin equilibrio y calentamiento a una velocidad continua o manteniendo a un nivel de temperatura constante de modo que se produzca la sublimación, según se determina mediante:

Js = NPs \left(\frac{M}{2\pi QT}\right)^{0,5}

donde

Js = velocidad de sublimación en g cm^{1-} s^{-1}

N = coeficiente de evaporación

Ps = presión de vapor de saturación

M = peso molecular del agua

Q = constante universal de los gases

T = temperatura absoluta de la muestra.

Esto está de acuerdo con la velocidad de transición para la fase particular que se elimina. Por ejemplo, la velocidad de transición de amorfo a cúbico se da mediante:

E = 2,04 \ x \ 10^{28} \ x \ exp \ (-0,465 T)

Alternativamente, si la ventana de transición es T_{1} a T_{2}, la velocidad de sublimación y la velocidad de transición variarán con la temperatura durante este intervalo. La velocidad de calentamiento durante esta ventana T_{1} a T_{2} debe ser tal que la sublimación se produzca en todas las dimensiones de la muestra antes de que se complete la transición a cualquier temperatura particular.

De este modo, se alcanza el objetivo del secado controlado, es decir, la eliminación secuencial de cada fase de agua bajo condiciones apropiadas para las propiedades de cada fase sin crecimiento o formación apreciables de cristales de hielo o fusión de la fase particular. Una vez seca, la muestra debe aislarse físicamente o mecánicamente del agua sobre la superficie del condensador o cualquier otra fuente y almacenarse en un recipiente cerrado bajo vacío o gas inerte seco.

En una modalidad preferida, las muestras se recogen mediante un método apropiado de modo que la formación de cristales de hielo esté por debajo del grado que provocaría daño a la muestra. Una vez congelada, la muestra se almacena a continuación por debajo de la temperatura de transición de la forma de hielo más inestable. Para hielo amorfo, esto está preferiblemente por debajo de -160ºC. La muestra se carga a continuación a un soporte para muestras, se preenfría hasta -196ºC y se transfiere a un secador de destilación molecular. La cámara del secador se cierra a continuación y se sella para la integridad del vacío. Para evitar la recristalización, la muestra hidratada debe permanecer por debajo de la temperatura de transición de la forma de hielo más inestable a lo largo de todas las manipu-
laciones.

Una vez que la muestra está cargada, se genera alto vacío (de 10^{-8} a 10^{-6} mbar) dentro de la cámara. La muestra se pone considerablemente más cerca de la superficie del condensador (paredes de la cámara enfriadas con nitrógeno líquido) que el camino libre medio dentro de la cámara. La temperatura del condensador siempre debe estar por debajo de la de la muestra. Para una muestra amorfa, el condensador está preferiblemente a -196ºC.

El soporte para muestras se calienta a continuación a través de un circuito de termopar de microprocesador de calentador programable. Los programas de calentamiento se determinan de acuerdo con la composición de hielo de la muestra. Un programa típico para una muestra que contiene hielo amorfo, cúbico y hexagonal es 10ºC por hora de -180ºC a -150ºC, 1ºC por hora de -150ºC a -70ºC y 10ºC por hora de -70ºC a +20ºC.

Una vez que la muestra ha alcanzado 20ºC, puede sellarse dentro de un recipiente apropiado dentro de la cámara de vacío y descargarse para el almacenamiento subsiguiente. En una configuración, la muestra está contenida dentro de un vial de vidrio y se sella con un tapón de liofilización de caucho butílico al final del ciclo. Detalles más específicos de la operación del secador de destilación molecular se dan en la Patente de EE.UU. Nº 4.865.871.

Reconstitución

La congelación y el secado de tejidos biológicos imparten una gran tensión física sobre las fuerzas de unión que normalmente estabilizan la conformación macromolecular. Contribuyendo a este efecto desestabilizador está el incremento en la concentración de electrolitos y posibles cambios de pH a medida que la solución se congela. Como consecuencia, pueden resultar modificaciones en la muestra, incluyendo la inactivación de ciertas enzimas y la desnaturalización de proteínas.

Estudios con deshidrogenasa láctica han mostrado que la congelación y la descongelación provocan disociación de la enzima tetrámera en subundiades que se efectúa mediante un cambio en la actividad biológica. Se encontró que la disociación dependía de la fuerza iónica y el pH durante la congelación.

Otros estudios que investigaban la estructura cuaternaria de la L-asparaginasa demostraron que esta enzima se disociaba desde el tetrámero activo en monómeros inactivos cuando se secaba por congelación. Se encontró que este estado monómero se estabilizaba mediante la reconstitución de la enzima secada con tampones de alto pH y alta fuerza iónica. Sin embargo, se observó que la disociación era completamente reversible con la reconstitución a pH neutro y baja fuerza iónica. Por otra parte, el efecto del pH puede inducir cambios en la estructura tridimensional dando como resultado subunidades impedidas conformacionalmente para la reasociación.

Estos estudios indican la importancia de determinar las condiciones óptimas de pH y fuerza iónica no solo de la formulación usada en el procedimiento de crioconservación sino también de la solución de reconstitución. De este modo, pueden obtenerse una actividad y estabilidad máximas de la muestra.

Otras variables de la reconstitución, tales como rehidratación en fase de vapor o temperatura, también pueden ser importantes para la retención de la actividad después de la congelación y el secado. Otros trabajadores de la materia han demostrado una diferencia notable en la respuesta proliferativa a lectinas dependiendo de la temperatura de rehidratación o de si las muestras se reconstituían mediante fase de vapor. Se apreciaron respuestas mejoradas a las lectinas cuando los linfocitos secados por congelación se rehidrataban a temperaturas de hielo seco y a continuación se dejaban calentar. Este método gradual de reconstitución reducía la tensión osmótica inducida por la rehidratación repentina.

En el procesamiento de tejidos biológicos, la etapa de rehidratación también puede usarse para aumentar los compuestos de procesamiento y estabilización usados en las etapas de obtención y procesamiento. Estos incluyen componentes para minimizar los efectos de la hipoxia y la generación de radicales libres, agentes para inhibir enzimas, agentes oncóticos incluyendo proteoglicanos, dextrano y aminoácidos para prevenir el daño osmótico.

Además, la rehidratación de ciertos tejidos, por ejemplo los conductos vasculares y las válvulas cardíacas, puede requerir agentes específicos para inhibir la agregación de plaquetas durante el período inicial después del implante. Cuando el tejido biológico ha de reticularse, la rehidratación directamente en el fijador tiene la ventaja adicional de una distribución inmediata y uniforme del fijador a través del tejido.

Consideraciones de Almacenamiento

La sublimación de agua de una muestra congelada es un método para conservar los componentes activos del material biológico. Sin embargo, la conservación óptima de la actividad con estabilidad a largo plazo requiere el control crítico del procedimiento de secado y las condiciones de almacenamiento. Después de la eliminación de agua libre o no unida, avanza el procedimiento de secado secundario, durante el cual ser elimina agua unida estructuralmente. El agua unida está íntimamente asociada con el mantenimiento de la conformación proteínica. Así, la cantidad de agua que permanece en la muestra secada, conocida como el contenido de humedad residual, es una variable significativa en el procedimiento de secado. El contenido de humedad residual final afecta tanto a la supervivencia como a la estabilidad de la muestra.

El contenido de humedad residual se expresa como el "porcentaje de humedad residual" y se equipara al peso (g) de agua residual por unidad de peso (g) de muestra original.

Se acepta generalmente que los materiales biológicos secados mediante sublimación a vacío de hielo muestran una estabilización incrementada cuando se secan hasta contenidos óptimos de humedad residual. Los materiales que se han sub- o sobre-secado, es decir, hasta contenidos de humedad que están por encima o por debajo del óptimo, mostrarán un deterioro incrementado.

Aunque el contenido de humedad residual óptimo variará dependiendo de la muestra secada particular, pueden esperarse ciertos problemas de estabilidad cuando los niveles de humedad son subóptimos. Sobresecar una muestra, es decir, contenidos de humedad residual menores que 1-2%, sin usar un estabilizante del secado, da como resultado generalmente la eliminación de casi todo el agua estructurada permitiendo la modificación o el bloqueo de sitios de proteínas hidrófilos expuestos, mediante oxidación. Esta oxidación provoca la degradación con una disminución correspondiente en la actividad biológica. Por otra parte, contenidos de humedad residual de más de 5% generalmente son indicativos de subsecado en el que cantidades suficientes de "agua libre" permanecen en la muestra, lo que podría contribuir a la transconformación de la proteína. Las transposiciones resultantes de las cadenas polipeptídicas cambian desde la disposición ordenada típica de la proteína natural hasta una disposición más desordenada. Estas perturbaciones de las proteínas pueden dar como resultado una estabilidad a largo plazo escasa del producto
secado.

El almacenamiento a largo plazo satisfactorio requiere el secado de la muestra hasta niveles óptimos de humedad residual. El secado inadecuado de muestras biológicas y sus consecuencias se han mostrado en la literatura. La estabilidad máxima de suspensiones de virus de influenza secadas mediante sublimación de agua a vacío se producía con un contenido de humedad residual de aproximadamente 1,7%. El sub- o sobre-secado hasta un contenido de agua no óptimo daba como resultado la degradación del virus, sugiriendo que cantidades variables de agua libre y unida en una muestra secada tienen un efecto sobre la estructura y la estabilidad de las proteínas.

Para maximizar la estabilidad de la muestra y satisfacer los requerimientos reguladores para la preparación de productos farmacéuticos o reactivos secados, es esencial que el contenido de humedad residual se determine después del secado de la muestra.

Están disponibles varios métodos para medir contenidos de humedad residual:

1.: Gravimétrico (Método de Calentamiento) - Una cantidad conocida de producto secado se calienta y la pérdida de peso puede equipararse con el contenido de agua.

2.: Ensayo Químico - Este método se basa en la reacción entre agua y yodo libre en una mezcla de piridina, dióxido de azufre y metanol. El punto final se detecta culombimétricamente cuando está presente yodo libre. H_{2}O + I_{2} + SO_{2} + ROH + 3RN \rightarrow 2RNHI + RN + HSO_{4}R

3.: Cromatografía de Gases

Cada uno de los métodos tiene limitaciones y, por lo tanto, no se desea confiar en un solo método de determinación de la humedad. En cambio, deben emplearse múltiples métodos para validar los resultados.

Una vez secada hasta el contenido de humedad residual óptimo, la muestra todavía se considera inestable cuando se retira del vacío debido a su naturaleza higroscópica y susceptibilidad a la oxidación. Deben tomarse medidas durante el almacenamiento para proteger a la muestra de la rehidratación atmosférica y minimizar la exposición al oxígeno. Tal protección es esencial para el mantenimiento de la estabilidad a largo plazo de la muestra.

La evidencia en la literatura indica que el estado gaseoso bajo el que se sellan las muestras, así como la temperatura de almacenamiento, afectan a la estabilidad a largo plazo de la muestra. Se ha demostrado en un estudio que compara diferentes gases y temperaturas de almacenamiento que la estabilidad máxima del virus de influenza se obtenía cuando las muestras se almacenaban bajo helio o hidrógeno gaseoso a baja temperatura (-20ºC). Sellar bajo otros gases o vacío a diferentes temperaturas de almacenamiento daba como resultado niveles de estabilidad variables. Los inventores postulan que las condiciones que limitan más eficazmente el contacto del oxígeno con la muestra mejoran notablemente la actividad biológica al reducir la oxidación de sitios hidrófilos expuestos en la superficie de las proteínas. Los parámetros de almacenamiento, es decir, temperatura, apropiados y el sellado bajo gas o vacío son importantes para obtener estabilidad de la muestra a largo plazo.

Ejemplo 1 Procesamiento y almacenamiento de piel trasplantable

Piel donante humana se recoge del modo habitual de cadáveres y se almacena bajo condiciones refrigeradas o congeladas en un número de bancos de tejidos en todos los EE.UU. Esta piel se usa como un vendaje temporal para víctimas de quemaduras que están siendo sometidas a autoinjerto extensivo. También se recoge piel porcina bajo condiciones similares y se usa como un vendaje temporal para quemaduras. En su estado no procesado, la piel alogeneica y la piel porcina son rechazadas finalmente por el paciente. Esta misma piel también está disponible para procesar mediante los métodos descritos posteriormente.

Piel de donante se recoge bajo condiciones asépticas con un dermatomo y se mantiene a 4ºC en medio de cultivo tisular RPMI 1640 que contiene solución de penicilina y estreptomicina durante no más de 7 días antes del procesamiento adicional. El transporte hasta el centro de procesamiento de tejidos de LifeCell es a través de suministro nocturno, sobre hielo húmedo, en el mismo medio. Al llegar al centro de procesamiento, se verifica que la temperatura del recipiente para tejidos sea al menos 4ºC o la piel se descarta. Después de la verificación de la temperatura del recipiente, la identificación del donante y los datos de rastreo de la prueba, se transfiere a una campana de flujo laminar para procesamiento adicional.

La piel del donante se retira del recipiente para transporte y se pone con su cara reticular hacia abajo sobre una pieza de soporte de dimensionamiento que es un polietileno de baja densidad. Una pieza de tamaño apropiado de gasa se añade a la cara epidérmica de la piel que a continuación se corta como una pieza rectangular tan grande como sea posible, que no supere un cuadrado de 10,2 x 10,2 cm y no inferior que 5,1 x 7,6 cm. La piel se pone a continuación con la cara reticular hacia abajo en una placa Petri a la que se añade 50 ml de solución desepidermizante que consiste en NaCl 1 M. La placa Petri se transfiere a continuación a una incubadora y se incuba a 37ºC \pm 2ºC durante de 18 a 32 horas para la piel humana y de 35 a 55 horas para la piel porcina.

Después de la incubación, la placa Petri que contiene la piel se transfiere a una campana de flujo laminar para la desepidermización. La gasa se retira en primer lugar y se descarta. La epidermis se ase a continuación suavemente con fórceps y se retira de la dermis como una lámina. La solución desepidermizante en exceso se aspira a continuación. Se realiza a continuación una ranura de aproximadamente un centímetro de largo en la esquina inferior izquierda de la dermis para identificar las superficies superior e inferior.

La dermis se enjuaga a continuación en la misma placa Petri mediante la adición de 50 ml de solución de lavado de tejidos, que consiste en solución salina equilibrada de Hanks estéril. La placa Petri se pone a continuación en un rotor a 40 \pm 5 RPM durante 5 minutos a temperatura ambiente (20ºC-26ºC). La placa Petri se devuelve a continuación a la campana de flujo laminar y la tapa de la placa Petri se retira para aspirar la solución de lavado de tejidos. Este procedimiento se repite dos veces más.

La dermis se trata a continuación con 50 ml de solución descelularizante y la placa Petri se pone sobre un rotor a 40 \pm 5 RPM durante 1 hora a temperatura ambiente (20ºC-26ºC). La solución descelularizante para piel humana consiste en dodecilsulfato sódico al 0,5% en solución salina equilibrada de Hanks y para la piel porcina contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) disódico 1 mM. La solución descelularizante se elimina mediante aspiración. La dermis se lava a continuación con 50 ml de solución de lavado de tejidos. La placa Petri se pone a continuación en un rotor a 40 \pm 5 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente (20ºC-26ºC). La solución de lavado de tejido se elimina mediante aspiración. El procedimiento de lavado se repite dos veces. Después de que la dermis se haya lavado un total de tres veces, se añaden a la placa Petri 50 ml de solución de precongelación. La placa se pone a continuación en un rotor a 40 \pm 5 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente (20ºC-26ºC). La solución de preenfriamiento para piel humana consiste en 7% de dextrano (PM 70.000), 6% de sacarosa, 6% de rafinosa y ácido etilendiaminotetraacético disódico 1 mM en solución salina equilibrada de Hanks. La solución de preenfriamiento para piel porcina consiste en 7,5% de dextrano (PM 70.000), 6% de sacarosa, 7,5% de polivinilpirrolidona (PM 40.000), 1,5% de rafinosa y ácido etilendiaminotetraacético disódico 1 mM elaborados en solución salina equilibrada de
Hanks.

Una nueva pieza de gasa se pone a continuación sobre la cara papilar de la dermis y se le da la vuelta a la dermis de modo que la cara reticular esté hacia arriba. El reverso de la cara reticular de la pieza de dermis se descarta en un recipiente para residuos biopeligrosos. Una tira de aproximadamente 0,5 a 1,0 cm de ancho de reverso y dermis se corta a continuación de la muestra original. Esta tira se corta a continuación en dos piezas secundarias, cada una de aproximadamente 1,0 cm de largo. Toda la confirmación de calidad necesaria se lleva a cabo finalmente sobre estas muestras secundarias, incluyendo el análisis microbiológico y estructural.

Los tejidos se transfieren a continuación a bolsas Tyvec individuales. Los tejidos se sitúan en la bolsa con el reverso hacia arriba y la abertura blanca hacia abajo. La bolsa Tyvec se sella térmicamente a continuación.

La bolsa de secado por congelación sellada se transfiere a un secador de congelación que tiene una temperatura mínima de la bandeja de -70ºC y una temperatura del condensador mínima de -85ºC. El tejido se congela a continuación sobre la bandeja del secador por congelación elevando la temperatura de la bandeja a una velocidad de -2,5ºC/minuto a -35ºC, y se mantiene durante al menos 10 minutos.

El ciclo de secado es tal que el contenido de humedad residual final de la muestra es menor que 6% y opcionalmente 2%. En este ejemplo, la dermis congelada se seca mediante el siguiente programa:

1.: La temperatura de la bandeja se eleva a una velocidad de -2,5ºC/minuto hasta -35ºC y se mantiene durante 10 minutos, con vacío fijado a 2000 mT.

2.: La temperatura de la bandeja se eleva a continuación a una velocidad de 1,5ºC/minuto hasta -23ºC y se mantiene durante 36 horas con vacío fijado a 2000 mT.

3.: La temperatura se eleva a continuación a una velocidad de 1,5ºC/minuto hasta una temperatura de la bandeja de -15ºC y se mantiene durante 180 minutos con vacío fijado a 2000 mT.

4.: La temperatura se eleva a continuación a una velocidad de 1,5ºC/minuto hasta una temperatura de la bandeja de -5ºC y se mantiene durante 180 minutos con vacío fijado a 2000 mT.

5.: La temperatura se eleva finalmente a una velocidad de 1,5ºC/minuto hasta una temperatura de la bandeja de 20ºC y se mantiene durante 180 minutos con el vacío fijado a 0 mT.

Después del secado, la bolsa de secado por congelación que contiene la dermis secada se descarga bajo una atmósfera de nitrógeno gaseoso seco, y se pone en un segundo saco hermético presecado y se sella térmicamente bajo el mismo ambiente inerte.

(Durante el procedimiento de procesamiento y antes de sellar para el secado por congelación, se corta una muestra secundaria de la muestra principal y se procesa adicionalmente bajo condiciones idénticas a la muestra principal. Antes del uso de la muestra principal en el trasplante, se lleva a cabo toda la confirmación de calidad necesaria sobre la muestra secundaria, incluyendo análisis microbiológico y estructural).

Después del secado, la muestra se almacena a temperaturas por encima de la congelación, óptimamente 4ºC en un ambiente protegido de la luz.

Antes de usar, la muestra se retira del saco sellado bajo condiciones asépticas y se rehidrata mediante inmersión en solución salina equilibrada a de 20ºC a 37ºC. La rehidratación es completa después de 30 minutos de incubación en esta solución de rehidratación.

El análisis del producto final mediante microscopía óptica y electrónica ha demostrado que está estructuralmente intacto con formación de bandas de colágeno normales y la presencia de haces de colágeno en la matriz de la dermis y con conservación estructural de la lámina densa y fibrillas de anclaje del complejo de la membrana basal.

El aspecto reticular de la dermis procesada se ha demostrado para proporcionar un substrato para el crecimiento externo de queratinocitos a partir de un explante de prepucio en un laboratorio mediante métodos de cultivo celular. También se ha demostrado que la dermis procesada soporta el crecimiento de queratinocitos aislados. En esta circunstancia, cuando se cultivan en una interfase aire-líquido, los queratinocitos se diferencian de todas las capas identificables de piel normal e interactúan con la dermis procesada a través del complejo de la membrana basal. También se ha demostrado que la piel porcina procesada soporta el crecimiento de queratinocitos a partir de explantes de prepucio humano.

La dermis procesada, en combinación con un injerto autólogo mallado, ultrafino o epidérmico o reconstituida con queratinocitos cultivados, tiene un número de aplicaciones clínicas en una lesión de piel de grosor completo. Estas incluyen, pero no se limitan a, pacientes quemados, pacientes que sufren úlceras venosas, diabéticas o de presión y pacientes que están sometidas a cirugía reconstructiva o substitución de piel después de la excisión de lesiones de piel.

Se ha observado que la piel humana y porcina procesada sufre infiltración de fibroblastos y neovascularización en pacientes quemados humanos y en lesión de piel de grosor completo quirúrgicamente inducida en cerdos.

Ejemplo 2 Conducto vascular: venas sáfenas de donantes humanos

Las venas sáfenas se extirpan de donantes cadáver y se hacen disponibles mediante bancos de tejidos a lo largo de los EE.UU. Los bancos de tejidos tienen directrices de obtención establecidas, publicadas por the American Association of Tissue Banks. Estas directrices incluyen instrucciones para la selección de pacientes, llenado de formularios de consentimiento y una precaución para evitar la distensión mecánica u otro daño mecánico a la vena durante el proceso de disección. La extirpación comienza con barrido y distensión de la vena con solución de barrido de la vena, que consiste en 1000 cc de solución PlasmaLyte para inyección, complementada con 5000 unidades de heparina y 120 mg de papaverina (1 litro por vena). Las venas se retiran cuidadosamente bajo condiciones estériles con tantos afluentes mantenidos intactos como sea posible, con una longitud de al menos 5 mm. Estos afluentes se ligan con seda 3-0. El tejido graso circundante también se mantiene con amplios márgenes alrededor de la vena. Una vez que la vena se retira, se enjuagan de nuevo con solución de barrido de la vena, se entierra en 500 cc de medio de transporte de venas, que consiste en 500 cc de medio de cultivo tisular RPMI 1640 complementado con 60 mg de papaverina, frío (4ºC) y se traslada mediante suministro nocturno a un banco de tejidos para el procesamiento adicional.

En el banco de tejidos, todos los afluentes se ligan por sutura y el tejido graso/blando subcutáneo se elimina usando procedimientos quirúrgicos estándar. Después de la disección, la vena se desinfecta de cualquier contaminante superficial poniéndola en un medio de cultivo tisular complementado con cefoxidina (240 mcg/ml), lincomicina (120 mcg/ml), sulfato de polimixina B (100 mcg/ml) y vancomicina (50 mcg/ml). La vena se mantiene en la mezcla de antibióticos a 4ºC durante 24 horas. La vena desinfectada se pone en 500 cc de medio de transporte, que consiste en 500 cc de medio de cultivo tisular RPMI 1640, frío (4ºC) y se transporta sobre hielo seco hasta el centro de procesamiento de tejidos de LifeCell mediante suministro nocturno.

Al llegar, se verifica que la temperatura del recipiente sea al menos 4ºC. Después de la verificación, la vena se pone en un recipiente que contiene criosolución y se incuba durante una hora a temperatura ambiente. La criosolución consiste en lo siguiente:

Dimetilsulfóxido (DMSO) 0,5 M

Propilenglicol 0,5 M

2,3-Butanodiol 0,25 M

Rafinosa al 2,5% (p/v)

Sacarosa al 12,0% (p/v)

Polivinilpirrolidona (PVP) al 15,0% (p/v)

Dextrano al 15,0%.

Después de la incubación, la vena se pone a continuación en una bolsa de plástico inerte que contiene una abertura porosa que permite que salga el vapor de agua pero impide que entren las bacterias y se sella térmicamente. La bolsa y la vena se congelan a continuación sumergiendo en nitrógeno líquido. La vena congelada se almacena a temperaturas por debajo de -160ºC.

Para el secado, la vena congelada dentro de la bolsa se transfiere bajo nitrógeno líquido a un secador de destilación molecular y se seca mediante métodos descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.865.871. Para venas sáfenas procesadas en la criosolución descrita anteriormente y congeladas rápidamente, el intervalo óptimo para el secado es de -130ºC a -70ºC con una velocidad de calentamiento de 1ºC por minuto durante la fase de secado. Una vez seca, la vena se sella en el recipiente bajo nitrógeno gaseoso inerte y se almacena a temperaturas refrigeradas (2-4ºC) hasta que se necesita para el trasplante.

La vena se rehidrata en fase de vapor, abriendo el recipiente de saco de plástico y poniendo la vena en una incubadora humidificada a 37ºC. La vena se mantiene en esta incubadora durante una hora, después de lo cual se retira y se pone en un recipiente con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La vena se enjuaga a continuación con 3 cambios de PBS.

El análisis de las venas procesadas muestra que poseen una matriz extracelular intacta mediante espectroscopía tanto óptica como electrónica. La digestión con proteasas indica falta de susceptibilidad incrementada del colágeno a la degradación. La prueba de tensión en un ciclo dinámico con un corazón artificial ha demostrado que soportan presiones suprafisiológicas sin compromiso de su función de barrera para fugas de líquido o gas.

Ejemplo 3 Procesamiento de conductos vasculares para estudios animales. Obtención

Perros mestizos de veinte a treinta kilogramos de cualquier sexo son inducidos a través de pentatol sódico, entubados y preparados y cubiertos de un modo estéril. La anestesia se mantiene con oxígeno, nitrógeno y halotano. Se realiza una incisión media en el cuello con lo que las venas yugulares externas y las arterias carótidas internas se exponen, se aíslan y se liberan de fascia circundante. Durante este procedimiento, una solución de barrido comprendida por 5000 unidades de heparina y 120 mg de papaverina en 1000 cc de solución salina tamponada de Hank (HBSS) estéril de pH 7,4 se pulveriza sobre los vasos a través de una aguja y una jeringa. Los extremos proximal y distal del vaso se aprietan a continuación con pinzas vasculares atraumáticas con lo que el vaso se corta rápidamente. Inmediatamente, el vaso se barre una y otra vez con la solución de barrido mencionada anteriormente y se pone en solución de barrido a 4ºC para el transporte. Alternativamente, el vaso puede ponerse en la solución de descelularización A mencionada posteriormente para incubación durante el transporte.

Descelularización

Después de la eliminación de cualquier fascia en exceso, el vaso se pone en solución de descelularización A (DSA). La DSA está comprendida por EDTA 25 mM, NaCl 1 M y CHAPS 8 mM o un detergente zwitteriónico similar en una base de PBS estéril a un pH de 7,5. Después de una incubación de 30 minutos a una hora, se le dan al vaso dos lavados de 10 minutos en PBS y a continuación se pone en solución de descelularización B (DSB). La DSB está comprendida por EDTA 25 mM, NaCl 1 M y dodecilsulfato sódico (SDS) 1,8 mM o un detergente aniónico o no iónico similar en una base de PBS estéril a pH 7,5. Después de una incubación de 30 minutos a una hora, se le dan al vaso dos lavados de 10 minutos en PBS.

Vitrificación

Después de la descelularización, el vaso se pone en solución de vitrificación a partes iguales (VSFF) durante de una a cinco horas. La VSFF está comprendida por 2,5% de rafinosa, 15% de polivinilpirrolidona (PVP) de peso molecular 40.000, 15% de dextrano de peso molecular 70.000 y 12% de sacarosa en solución de agua-formamida 50/50 (en volumen). El vaso se sumerge a continuación rápidamente en nitrógeno líquido (LN_{2}) hasta que se congela según se evidencia por el cese de la ebullición. El vaso puede almacenarse a continuación en LN_{2} o vapor de LN_{2} o secarse inmediatamente.

Secado

Después de la vitrificación, el vaso se transfiere en una atmósfera de nitrógeno gaseoso a un soporte para muestras de un secador de destilación molecular especial que se ha preenfriado hasta -196ºC. El soporte para muestras se transfiere a continuación rápidamente bajo atmósfera de nitrógeno gaseoso al secador de destilación molecular. El secador se evacúa a continuación y se pone en marcha de acuerdo con un procedimiento desarrollado específicamente para la VSFF. Bajo un vacío menor que 1 x 10^{-6} mbar, el soporte para muestras se calienta de acuerdo con el siguiente esquema:

-196ºC -> -150ºC durante 10 horas

-150ºC -> -70ºC durante 80 horas

-70ºC -> 20ºC durante 10 horas

El secador se abre a continuación y el vaso se transfiere a un vial de vidrio estéril sellado bajo atmósfera de nitrógeno gaseoso. El vaso se almacena a continuación a 4ºC hasta que se necesita.

Rehidratación

Veinticuatro horas antes del uso, el vial de vidrio se abre en una atmósfera de 100% de humedad, 37ºC. El vaso se deja rehidratarse al vapor de esta manera durante de una a dos horas. El vaso se sumerge a continuación en PBS estéril a 4ºC durante dos horas. La PBS se intercambia a continuación con solución reciente después de lo cual el vaso se almacena a 4ºC durante la noche. El vaso está listo para usar al día siguiente.

Ejemplo 4 Laminillas de válvula cardíaca porcina

Se obtuvieron válvulas cardíacas porcinas de corazones aislados inmediatamente después del sacrificio en un matadero. Se obtuvieron discos de las laminillas de la válvula intacta mediante biopsia de punción bajo condiciones asépticas y se transfirieron a una solución para transporte que comprendía PBS de Dulbecco con glucosa 5,6 mM, piruvato sódico 0,33 mM con antioxidantes añadidos que comprenden 0,025 mg/l de fosfato de alfa-tocoferol, 50 mg/l de ácido ascórbico y 10 mg/l de glutationa (monosódica) a 4ºC.

Al recibir el tejido, los discos se transfirieron a una criosolución que comprendía DMSO 0,5 M, propilenglicol 0,5 M, 2,3-butanodiol 0,25 M, 2,5% de rafinosa, 15% de polivinilpirrolidona, 1% de dextrano y 12% de sacarosa y se incubaron a 20ºC durante 60 minutos con agitación moderada.

Las muestras de tejido se pusieron a continuación sobre substratos de cobre delgados que se adaptaban al tamaño de la muestra de tejido y se enfriaron mediante inmersión en nitrógeno líquido.

Las muestras congeladas se almacenaron a continuación a menos de -160ºC hasta el procesamiento adicional.

Antes del secado, las muestras se transfirieron bajo nitrógeno líquido a un soporte para muestras equipado con termopar y calentador. El soporte para muestras se preenfrió hasta la temperatura del nitrógeno líquido y la transferencia se completó bajo nitrógeno líquido.

Las muestras congeladas se cargaron a continuación a un secador de destilación molecular y se secaron mediante secado por destilación molecular empleando el método descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 4.865.871. El ciclo de secado empleado era de -180ºC a -150ºC en 3 horas, de -150ºC a -70ºC en 80 horas y de -70ºC a +20ºC en 9 horas. Después del secado, el vacío en la cámara de secado se invirtió con nitrógeno gaseoso ultrapuro y los discos se mantuvieron en esta atmósfera hasta el procesamiento.

La rehidratación de las muestras secas consistía en primer lugar en la exposición de las muestras a 100% de humedad a 37ºC durante 60 minutos. Las muestras se rehidrataron a continuación en una solución de rehidratación que consistía en una de las siguientes:

a.: tampón de Hepes 0,06 M

b.: tampón de Hepes 0,06 M + MgCl_{2} 0,06 M

c.: tampón de Hepes 0,06 M + SDS al 1%

d.: tampón de Hepes 0,06 M + PMSF 0,5 mM

Las muestras se incubaron a continuación durante al menos cuatro horas.

Después de la rehidratación, las muestras se determinaron bajo los siguientes criterios:

a.: La estructura se determinó mediante microscopía tanto óptica como electrónica y se encontró que la matriz de la válvula era indistinguible de la de muestras no procesadas recientes.

b.: Se encontró que la digestión con proteasas era equivalente a una muestra reciente.

c.: Se encontró que la prueba de tensión (estática) podía soportar más carga por tensión que las muestras de control.

d.: Modelo de implante animal subcutáneo con explante subsiguiente a los 7 ó 21 días.

Las muestras explantadas demostraban:

i.: Formación de cápsulas disminuida con relación a controles recientes o crioconservados.

ii.: Calcificación disminuida con relación a controles tratados con glutaraldehído.

iii.: Infiltración de células inflamatorias variable dependiente de la naturaleza de la solución de rehidratación como sigue:

Tratamiento: MgCl_{2} 0,06 M en tampón de Hepes 0,06 M

Disco claramente desmarcado con morfología de válvula normal bien definida. Muestra rodeada incompletamente con una cápsula delgada con infiltración de células inflamatorias mínima cerca de la periferia del disco.

Tratamiento: SDS al 1% en tampón de Hepes 0,06 M

Disco claramente desmarcado con morfología de válvula normal bien definida. Muestra rodeada completamente por una cápsula ligeramente más gruesa que la observada en muestra tratada con MgCl_{2}. Infiltración de células inflamatorias mínima.

Tratamiento: PMSF 0,5 mM en tampón de Hepes 0,06 M

Morfología de la válvula normal bien definida. Formación de cápsula casi ausente. Infiltración de células inflamatorias mínima.

Tratamiento: Control - tampón de Hepes 0,06 M

Estructura de la válvula escasamente definida. Infiltración de células inflamatorias masiva, pero poca evidencia de formación de cápsula.

Ejemplo 5 Válvulas cardíacas porcinas intactas Obtención

Se obtienen válvulas cardíacas porcinas de corazones aislados inmediatamente después del sacrificio en un matadero. La válvula aórtica y al menos 2,5 centímetros o más de aorta ascendente se corta a continuación cuidadosamente con instrumentos preesterilizados.

La válvula se lava dos veces en solución tamponada con fosfato (PBS) estéril y a continuación se pone en PBS al 10ºC estéril para el transporte. A las tres horas de la obtención, la válvula se lleva a las instalaciones de LifeCell donde se limpia y se procesa adicionalmente.

Descelularización

Después de la limpieza, la válvula intacta se pone en solución de descelularización A (DSA). La DSA está comprendida por EDTA 25 mM, NaCl 1 M y CHAPS 8 mM o un detergente zwitteriónico similar en una base de PBS estéril a pH 7,5. Después de una incubación de 30 minutos a una hora, se le dan a la válvula dos lavados de 10 minutos en PBS y a continuación se pone en solución de descelularización B (DSB). La DSB está comprendida por EDTA 25 mM, NaCl 1 M y dodecilsulfato sódico (SDS) 1,8 mM o un detergente aniónico o no iónico similar en una base de PBS estéril a
pH 7,5. Después de una incubación de 30 minutos a una hora, se le dan a la válvula dos lavados de 10 minutos en PBS.

Vitrificación

Después de la descelularización, la válvula se pone en solución de vitrificación a partes iguales (VSFF) durante de una a cinco horas. La VSFF está comprendida por 2,5% de rafinosa, 15% de polivinilpirrolidona (PVP) de peso molecular 40.000, 15% de dextrano de peso molecular 70.000 y 12% de sacarosa en una solución de agua-formamida 50/50 (en volumen). La válvula se sumerge a continuación rápidamente en nitrógeno líquido (LN_{2}) hasta que la congelación se evidencia mediante el cese de la ebullición. La válvula puede almacenarse a continuación en LN_{2} o vapor de LN_{2} antes del secado.

Secado

Después de la vitrificación, la válvula se transfiere en una atmósfera de nitrógeno gaseoso a un soporte para muestras de secador de destilación molecular especial que se ha preenfriado hasta -196ºC. El soporte para muestras se transfiere a continuación rápidamente bajo atmósfera de nitrógeno gaseoso al secador de destilación molecular. El secador se evacúa a continuación y se inicia un ciclo de calentamiento que se ha optimizado específicamente para la deshidratación de VSFF. Bajo un vacío menor que 1 x 10^{-6} mbar, el recipiente para muestras se calienta de acuerdo con el siguiente procedimiento:

-196ºC -> -150ºC durante 10 horas

-150ºC -> -70ºC durante 80 horas

-70ºC -> 20ºC durante 10 horas

El secador se abre a continuación y la válvula se transfiere a un vial de vidrio estéril sellado bajo una atmósfera de nitrógeno gaseoso. La válvula se almacena a continuación a 4ºC hasta que se requiere para el trasplante.

Rehidratación

Veinticuatro horas antes del uso, el vial de vidrio se abre en una atmósfera de 100% de humedad, 37ºC. Se deja que la válvula se rehidrate al vapor de esta manera durante de una a dos horas. La válvula se sumerge a continuación en PBS estéril a 4ºC durante dos horas. La PBS se intercambia a continuación con solución reciente después de lo cual la válvula se almacena a 4ºC durante la noche. La válvula está lista para usar al día siguiente.

Aunque la invención se ha descrito en términos de las modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la especialidad que pueden aplicarse variaciones y modificaciones a las composiciones, los métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas de los métodos descritos aquí sin apartarse del concepto, el espíritu y el alcance de la invención. Se considera que tales substitutos y modificaciones están dentro del alcance de la invención según se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Un método para procesar tejido basado en colágeno para trasplante, que comprende:

(i): obtener dicho tejido y poner dicho tejido en una solución estabilizante, en donde dicha solución estabilizante comprende:

(a): un tampón seleccionado de ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico, bicarbonato, fosfato potásico, fosfato sódico, acetato-citrato, y combinaciones de los mismos; y

(b): un antibiótico seleccionado de penicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, neomicina, polimixina, bacitracina y combinaciones de las mismas;

(ii): incubar dicho tejido en una solución de procesamiento, en donde dicha solución de procesamiento comprende:

(a): un tampón seleccionado de ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico, bicarbonato, fosfato potásico, fosfato sódico, acetato-citrato, y combinaciones de los mismos;

(b): un detergente seleccionado de éter terc-octilfenílico de poletilen(100)glicol, monooleato de polioxietilen(20)sorbitán, monooleato de polioxietilen(80)sorbitán, desoxicolato sódico, 1-propanosulfonato de 3-[3-(colamidopropil)-dimetilamonio], octil-glucósido, dodecilsulfato sódico y combinaciones de los mismos;

(c): un inhibidor de proteasa seleccionado de N-etilmaleimida, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, ácido etilendiaminotetraacético, ácido etilenglicol-bis(2-aminoetil-éter)-N,N,N',N'-tetraacético, leupeptina, cloruro amónico, pH elevado, apoprotinina y combinaciones de los mismos; y

(d): una sal seleccionada de cloruro sódico, cloruro magnésico, fosfato potásico y combinaciones de los mismos;

(iii): incubar dicho tejido en una solución de crioconservación, en donde dicha solución de crioconservación comprende

(b): un crioprotector seleccionado de dimetilsulfóxido, dextrano, sacarosa, 1,2-propanodiol, glicerol, sorbitol, fructosa, trehalosa, rafinosa, propilenglicol, 2,3-butanodiol, hidroxietilalmidón, polivinilpirrolidona, prolina, albúmina de suero humana y combinaciones de los mismos; y

(iv): congelar y secar dicho tejido después del procesamiento.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además la etapa de fijar dicho tejido con un agente de reticulación después del procesamiento.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la etapa de rehidratar dicho tejido hasta un contenido de agua de 20% a 70%.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además la etapa de reconstituir dicho tejido rehidratado con células viables.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además la etapa de fijar dicho tejido con un agente de reticulación después del secado.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho tejido basado en colágeno se selecciona de piel, vasos sanguíneos, válvulas cardíacas, ligamentos, tendones, hueso, cartílago, duramadre y nervios derivados de uno o más mamíferos.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha solución estabilizante contiene además uno o más de los siguientes componentes:

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(a): un agente antioxidante para evitar el daño hipóxico seleccionado de terc-butilhidroquinona, alfa-tocoferol, manitol, hidroxiurea, glutationa, ascorbato, ácido etilendiaminotetraacético, histidina, prolina, cisteína y combinaciones de los mismos;

(b): un agente enzimático para minimizar el daño resultante de la formación de radicales libres relacionada con la hipoxia seleccionado de superóxido dismutasa, catalasa, glutationa peroxidasa, glutationa reductasa y combinaciones de las mismas;

(c): un agente químico para inhibir las alteraciones de rutas bioquímicas relacionadas con la hipoxia seleccionado de alopurinol, inhibidores de lipoxigenasa, inhibidores de la metilación de fosfolípidos, fármacos bloqueadores de canales del calcio, agentes que se unen a calcio, agentes que se unen a hierro, intermediadores metabólicos, substratos de la generación de trifosfato de adenosina y combinaciones de los mismos;

(d): un agente antifúngico seleccionado de nistatina, vancomicina, anfotericina B y combinaciones de las mismas;

(e): un agente oncótico proteoglicánico seleccionado de sulfato de condroitina, sulfato de heparina, sulfato de dermatano y combinaciones de los mismos;

(f): un agente químico para inhibir la adhesión, la agregación y la activación de plaquetas seleccionado de heparina, nitropusiato sódico, H7, isobutilmetilxantina, ácido \alpha-aminocaproico, ácido salicílico, dipiridamol, dazoxibeno, adenosina, prostaciclina, amilorida, amantadina y combinaciones de los mismos;

(g): un agente químico para prevenir la contracción del músculo liso seleccionado de nitropusiato sódico, isoproterenol, fentolamina, pinacidil, H7, nifedipina, péptido relacionado con el gen de la calcitonina, flurazina, papaverina, isobutilmetilxantina y combinaciones de los mismos;

(h): un agente oncótico seleccionado de dextrano, glicina, prolina y combinaciones de los mismos; y

(i): un inhibidor de proteasas seleccionado de N-etilmaleimida, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, ácido etilendiaminotetraacético, ácido etilenglicol-bis(2-aminoetil-éter)-N,N,N',N'-tetraacético, leupeptina, cloruro amónico, pH elevado, apoprotinina y combinaciones de los mismos.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha solución de procesamiento contiene además una enzima seleccionada de dispasa II, tripsina, hialuronidasa, termolisina y combinaciones de las mismas.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho agente de reticulación es glutaraldehído.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha solución crioprotectora contiene una combinación de un disolvente orgánico y agua, combinación que no se expande o contrae durante la congelación.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha solución crioprotectora contiene además uno o más protectores en seco seleccionados de sacarosa, rafinosa, trehalosa, prolina, zinc, ácido mirístico y espermina y combinaciones de los mismos.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha etapa de congelación se alcanza congelando dicho tejido a velocidades entre -1ºC por minuto y -2.500ºC por segundo hasta una temperatura final del tejido de menos de -20ºC.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho secado se realiza bajo condiciones de temperatura, vacío, orientación de la superficie del condensador, temperatura de la superficie del condensador y calentamiento tales que el secado se produce por debajo de la transición vítrea del cristal de hielo menos térmicamente estable del tejido congelado y secuencialmente de modo que cada cristal de hielo subsiguientemente más estable se seca de una manera similar.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho secado comprende secar por congelación a temperaturas por encima de -70ºC.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho secado comprende el secado fásico secuencial en el intervalo de temperatura media de -130ºC a -80ºC y más.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho secado comprende el secado fásico secuencial mediante secado por destilación molecular a de -160ºC a -90ºC y más.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 16, en el que dicha rehidratación se alcanza incubando dicho tejido en una solución de rehidratación fluida.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicha solución de rehidratación incluye un tampón seleccionado de solución salina normal, solución de lactato de Ringer, un medio de cultivo celular y combinaciones de los mismos.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en el que dicha solución de rehidratación contiene agentes seleccionados de:

(d): un antibiótico seleccionado de penicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, neomicina, polimixina, bacitracina y combinaciones de las mismas;

(e): un agente antifúngico seleccionado de nistatina, vancomicina, anfotericina B y combinaciones de las mismas;

(f): un inhibidor de proteasas seleccionado de N-etilmaleimida, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, ácido etilendiaminotetraacético, ácido etilenglicol-bis(2-aminoetil-éter)-N,N,N',N'-tetraacético, leupeptina, cloruro amónico, pH elevado, apoprotinina y combinaciones de los mismos.

(g): un agente oncótico proteoglicánico seleccionado de sulfato de condroitina, sulfato de heparina, sulfato de dermatano y combinaciones de los mismos;

(h): un tampón seleccionado de ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico, bicarbonato, fosfato potásico, fosfato sódico, acetato-citrato, y combinaciones de los mismos; y

(i): un agente para inhibir la adhesión, la agregación y la activación de plaquetas seleccionado de heparina, nitropusiato sódico, H7, isobutilmetilxantina, ácido \alpha-aminocaproico, aspirina, dipiridamol, dazoxibeno y adenosina; y

(j): un agente oncótico seleccionado de dextrano, glicina y prolina.

20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que la rehidratación de dicho tejido procesado, criopreparado y secado comprende además la etapa de añadir una solución de rehidratación vaporizada seguida por incubar la mezcla en una solución de rehidratación fluida para formar tejido rehidratado.

21. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que comprende además inocular dicho tejido rehidratado con células viables seleccionadas de células autogeneicas, células alogeneicas o combinaciones de las mismas.

22. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en la que dicha solución de rehidratación es un agente de reticulación.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho agente de reticulación es glutaraldehído.

24. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 23, en el que dicho tejido rehidratado comprende dermis.

25. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 24, en el que dicho tejido rehidratado comprende uno o más conductos vasculares de origen venoso o arterial.

26. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 25, en el que dicho tejido rehidratado comprende una o más válvulas cardíacas.