ES2254224T3 - Nueva proteina del receptor de hematopoyetina, nr12. - Google Patents

Abstract

Un DNA seleccionado de un grupo formado por: (a) un DNA que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. Sec. núm.: 2, 4, 6, 8 y 10; (b) un DNA que comprende una región que codifica la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las Id. de Sec. núm.: 1, 3, 5, 7 y 9; (c) un DNA que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. núm.: 2, 4, 6, 8 y 10, en la que están modificados de 2 a diez aminoácidos mediante sustitución, supresión o adición, donde dicha proteína tiene una actividad como receptor de factor hematopoyético; y (d) un DNA que codifica un péptido que forma parte de la proteína con una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. núm.: 2, 4, 6, 8 y 10, donde el péptido tiene una actividad como receptor de factor hematopoyético.

Description

Nueva proteína del receptor de hematopoyetina, NR12.

Campo técnico

La presente invención está relacionada con las proteínas del receptor de hematopoyetina y los genes que las codifican, además de los métodos utilizados para producirlas y usarlas.

Antecedentes

Existe una gran cantidad de citocinas conocidas como factores humorales que regulan la proliferación/diferencia-
ción de diversas células o que regulan el mantenimiento, activación y muerte de células maduras diferenciadas. Existen receptores específicos para estas citocinas los cuales están clasificados en varias familias según su similitud estructural (Hilton D. J., en "Guidebook to Cytokines and Their Receptors" editado por Nicola N. A., (publicación de Sambrook & Tooze en Oxford University Press, 1994, pág. 8-16).

Por otro lado, comparada con la similitud de sus receptores, la homología de la estructura primaria entre las citocinas es relativamente baja. No se ha observado ninguna homología significativa respecto a los aminoácidos, incluso entre miembros de las citocinas que pertenecen a la misma familia de receptores. Este hecho explica la especificidad funcional de las citocinas respectivas, además de las similitudes entre las reacciones celulares inducidas por cada citocina.

Algunos ejemplos representativos de las familias de receptores antes mencionadas son la familia de los receptores de la tirosina quinasa, la familia de los receptores de hematopoyetina, la familia de los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) y la familia de los receptores del factor de crecimiento transformante (TFG). Se han asociado diferentes vías de transducción de señal con cada una de estas familias. Entre ellas, muchos de los receptores de la familia de los receptores de hematopoyetina en particular se expresan en las células sanguíneas y los inmunocitos. Hilton et al. (WO 97/12037) muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos del receptor de hematopoyetina NR2. Según WO 97/12037 se observó que dos especies de mRNA para el NR2 humano se expresaban en baja cantidad en un abanico de tejidos adultos y en cantidades más elevadas en tejidos fetales como el pulmón y el hígado. Willson et al. (WO 97/15663) muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos del receptor de hematopoyetina NR4. Willson et al. revelan que se detectaron dos especies de mRNA para el NR4 murino en la mayoría de los tejidos pero no se pudo detectar en el músculo esquelético. Revelan también que IL-13Ra (NR4) puede unirse a IL-13.

Los ligandos de la familia de los receptores de hematopoyetina, las citocinas, a menudo son algunos de estos factores hematopoyéticos o interleucinas, están en la sangre y se cree que están involucrados en la regulación humoral sistémica de las funciones hematopoyéticas o inmunitarias.

Esto contrasta con la creencia de que las citocinas que pertenecen a otras familias suelen estar involucradas solamente en la regulación tópica. Algunas de estas hematopoyetinas se pueden ver como factores de tipo hormonal, y algunas hormonas peptídicas representativas, como la hormona del crecimiento, la prolactina o los receptores de leptina, pertenecen también a la familia de los receptores de hematopoyetina. Debido a estas características de regulación sistémica de tipo hormonal se puede anticipar que es posible aplicar al tratamiento de diversas enfermedades la administración de estas hematopoyetinas. Del gran número de citocinas conocidas, aquellas que están siendo aplicadas clínicamente en la actualidad son: eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF y IL-2. Si tenemos en cuenta IL-11, LIF y IL-12, que actualmente están siendo estudiadas para ensayos clínicos, y las hormonas peptídicas arriba mencionadas como la hormona del crecimiento y la prolactina, es posible prever que mediante la búsqueda de nuevas citocinas que se unan a receptores de hematopoyetina de entre las superfamilias de receptores mencionadas anteriormente se puede encontrar una citocina que se puede aplicar clínicamente con una mayor eficiencia.

Tal como se ha mencionado antes los receptores de citocina presentan semejanzas estructurales entre los miembros de la familia. Muchas investigaciones usan dichas similitudes para buscar nuevos receptores. En especial se han clonado muchos receptores de la familia de receptores de la tirosina quinasa utilizando su secuencia altamente conservada en el sitio catalítico (Mathews W. et al., Cell, 1991, 65 (7) pág. 1143-52). En cambio, los receptores de hematopoyetina no tienen un dominio de actividad enzimática de tipo tirosina quinasa en sus regiones citoplasmáticas y se sabe que sus transducciones de señal están mediadas a través de asociaciones con otras proteínas tirosina quinasa que se encuentran libres en el citoplasma. Aunque los sitios para los receptores que se unen a estas tirosina quinasas citoplasmáticas, llamados grupo de las JAK quinasas, se conservan entre los miembros de la familia, la homología no es muy alta (Murakami M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Usa, 1991, 88, pág.11349-11353). De hecho, la secuencia que mejor caracteriza a este receptor de hematopoyetina se encuentra en la región extracelular. En concreto, en casi todos los receptores de hematopoyetina se conserva un motivo de cinco aminoácidos: Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (donde "Xaa" es un aminoácido arbitrario). Por lo tanto se pueden obtener nuevos receptores mediante la búsqueda de un nuevo miembro de la familia a través de la secuencia de este motivo. De hecho, estas aproximaciones ya han conducido a la identificación del receptor de IL-11 (Robb, L. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, (23) pág.13754-13761), el receptor de leptina (Gainsford T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Usa, 1996, 93 (25) pág. 14564-8) y el receptor de IL-13 (Milton D.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Usa, 1996, 93(1) pág.479-501).

Descripción de la invención

La presente invención proporciona nuevas proteínas del receptor de hematopoyetina y DNA que codifica para dichas proteínas. Además también proporciona un vector en el cual se ha insertado el DNA, un transformante que contiene el vector y un método para producir proteínas recombinantes utilizando el transformante. La presente invención también proporciona métodos de cribado para compuestos que se unen a la proteína.

Inicialmente los inventores intentaron encontrar un receptor nuevo utilizando oligonucleótidos que codificaban para el motivo Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (motivo WS) mediante el método de hibridación en placa, el método RT-PCR, etcétera. Sin embargo, fue extremadamente difícil seleccionar de manera estricta solamente aquellos receptores en los que los 15 nucleótidos que codifican para el motivo conseguían hibridarse completamente bajo las condiciones de hibridación habituales, porque el oligonucleótido "tggag (t/c) nnntggag (t/c)" (donde "n" es un nucleótido arbitrario) que codifica para el motivo era corto, puesto que solo tenía 15 pares de bases. Además, como el contenido en g/c del oligonucleótido era alto, fueron necesarias unas condiciones de temperatura de hibridación más altas de lo habitual para poder seleccionar estrictamente aquellas secuencias en las que los 15 nucleótidos que codifican para el motivo conseguían hibridarse completamente al oligonucleótido. Por esta razón fue extremadamente difícil realizar el cribado bajo las condiciones experimentales de hibridación normales.

Para solventar estos problemas los inventores buscaron motivos adicionales diferentes del sitio del motivo WS antes mencionado que se conserva en la familia de los receptores de la hematopoyetina. Encontraron que un residuo, tanto tirosina como histidina, situado de 13 a 27 aminoácidos del motivo WS en dirección 5' en la región extracelular se encontraba altamente conservado en la familia de receptores. Además, investigaciones adicionales para encontrar secuencias de consenso que se encuentran frecuentemente en los seis aminoácidos del residuo anterior Tyr/His hacia el C-terminal llevaron a la identificación de la siguiente secuencia de consenso: (Tyr/His)-Xaa-(Hidrofóbico/Ala)-(Gln/Arg)-Hidrofóbico-Arg (a partir de ahora abreviada como el motivo YR). Sin embargo, este motivo YR no es exactamente una secuencia de consenso perfecta y la combinación de las secuencias nucleotídicas que codifican para el motivo es muy complicada. Consecuentemente, sintetizar y proporcionar oligonucleótidos que codifiquen para todas las secuencias de aminoácidos para que actúen como sondas de hibridación, método muy práctico para el cribado, o como cebadores destinados a RT-PCR es prácticamente imposible.

Por consiguiente, los inventores buscaron otras aproximaciones para buscar nuevos miembros de la familia de los receptores de la hematopoyetina de una forma práctica utilizando como sondas los dos motivos que se han nombrado. Determinaron que sería adecuado realizar una búsqueda electrónica en bases de datos usando secuencias parciales de aminoácidos de receptores de hematopoyetina conocidos e incluyendo ambos motivos como búsqueda. Los inventores repitieron búsquedas TblastN en las bases de datos gss y htgs del GenBank utilizando secuencias parciales de aminoácidos de múltiples receptores conocidos de hematopoyetina como búsqueda. Como resultado se obtuvieron en todos los casos muchos clones positivos, incluidos los receptores conocidos de hematopoyetina. Entonces, la secuencia nucleotídica de entre aquellas secuencias, que parecían ser positivas en una tasa alta, fue convertida en una secuencia de aminoácidos. Los genes que se consideraron que codificaban para los miembros de la familia de receptores se seleccionaron mediante una búsqueda BlastX en la cual las secuencias de aminoácidos (convertidas a partir de las secuencias nucleotídicas de los clones) fueron comparadas con aquellas de los receptores conocidos de hematopoyetina. De acuerdo con la búsqueda Blast en dos pasos realizada, se identificaron las secuencias del genoma humano que codifican para los dos clones de los genes de los receptores de hematopoyetina conocidos y para un clon del gen del receptor de la hematopoyetina nuevo. Seguidamente se diseñaron cebadores de oligonucleótidos específicos basándose en las secuencias del exón predichas a partir de la secuencia nucleotídica obtenida. Se obtuvieron clones correspondientes a la región N-terminal y a la región C-terminal de la NR12 mediante métodos 5'-RACE y 3'-RACE usando los cebadores y bibliotecas de cDNA de hígado fetal, timo adulto y testículo adulto humanos funcionando como moldes. La secuencia nucleotídica completa del cDNA entero se mostró mediante la determinación de las secuencias nucleotídicas de ambos clones y mediante la conexión de la secuencia en la región central
duplicada.

A partir del análisis estructural se reconocieron por lo menos tres tipos de productos de trascripción derivados de variantes de corte y empalme. Un clon de cDNA de estas variantes de corte y empalme que contiene 337 aminoácidos y que potencialmente codifica para una forma secretable de una proteína de receptor soluble se le denominó NR12.1; los otros dos clones que contienen 428 aminoácidos y 629 respectivamente, y que codifican cada uno para una forma transmembrana de proteínas de receptor, se les denominó NR12.2 y NR12.3. Se consideró que estos clones codifican para los receptores típicos de hematopoyetina porque la estructura repetida de los receptores de cisteína, el motivo YR, el motivo WS y demás, que están conservados en la región extracelular de otros miembros de la familia, también lo está en la estructura primaria de todos los clones de cDNA de la NR12 aislados.

Posteriormente se realizó una RT-PCR utilizando conjuntos de cebadores específicos para NR12.1, NR12.2 y NR12.3, respectivamente, frente mRNA derivado de diferentes tejidos humanos. Luego se buscaron los tejidos que expresaban dichos genes y se analizó la distribución y el patrón de expresión de los genes en cada tejido humano. Finalmente, para poder descartar la posibilidad de una amplificación no específica y cuantificar la cantidad de productos de la RT-PCR, estos productos fueron sometidos a un Southern blot utilizando fragmentos de DNA específicos para los clones respectivos. El resultado indicó que estos clones se expresan principalmente en el tejido de la línea celular hematopoyética y en el tejido de la línea celular inmunitaria.

Además, estos mismos inventores consiguieron obtener dos clones (NR12.4 y NR12.5) que codificaban para proteínas completas que diferían en 3 aminoácidos respecto a NR12.2 y NR12.3, respectivamente. Esto lo realizaron mediante una clonación por PCR frente a la biblioteca de cDNA del timo humano (donde se aislaron cinco clones genéricamente llamados "NR12").

Basándose en las características antes mencionadas, el NR12 se supone que es una molécula nueva del receptor de hematopoyetina relacionada con el sistema inmunitario o con la hematopoyesis. El gen que codifica para NR12 será extremadamente útil para el cribado en busca de nuevos factores hematopoyéticos que puedan unirse funcionalmente al receptor.

Es más, los mismos inventores también consiguieron aislar fragmentos del genoma de homólogos del receptor de ratón a través de una clonación por hibridación cruzada xenogénica utilizando cDNA de NR12 humano como sonda. Se espera que más adelante se pueda aclarar la función in vivo de la proteína del receptor mediante la creación de un ratón mutante al que le falte el gen NR12 usando fragmentos del gen del ratón.

En consecuencia, la presente invención está relacionada con nuevos receptores de hematopoyetina y nuevos genes que codifican para dichos receptores, así como el uso de los mismos. Más concretamente la presente invención proporciona lo siguiente:

(1) un DNA seleccionado a partir del grupo que consiste en:

(a)

un DNA que codifica para una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los ID. de SEC. núm.: 2, 4, 6, 8 y 10;

(b)

un DNA que contiene la región que codifica para la secuencia de cualquiera de los ID.de SEC. núm.: 1, 3, 5, 7 y 9;

(c)

un DNA que codifica para una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los ID. de SEC. núm.: 2, 4, 6, 8 y 10; en los que de dos a diez aminoácidos están modificados por sustitución, deleción, inserción y/o adición, y donde dicha proteína presenta una actividad como receptor de factor hematopoyético y

(d)

un DNA que codifica para un péptido que forma parte de la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los ID. de SEC. núm.: 2, 4, 6, 8 y 10; en la que el péptido presenta una actividad como receptor de factor hematopoyético;

(2) un vector en el cual está insertado el DNA descrito en (1);

(3) un transformante que contiene el vector descrito en (2);

(4) un método para producir la proteína o el péptido codificados por el DNA de (1), que comprende los pasos siguientes: el cultivo del transformante mencionado en (3) y la recuperación de la proteína expresada a partir de dicho transformante o del sobrenadante del cultivo;

(5) una proteína o un péptido codificados por el DNA descrito en (1) o que se pueden obtener mediante el método de (4);

(6) un anticuerpo de reacción específica contra la proteína o el péptido de (5);

(7) un polinuceótido antisentido complementario a un DNA que contiene al menos 15 nucleótidos de cualquiera de los ID. de SEC. núm.: 1, 3, 5, 7 y 9;

(8) un método de cribado para un compuesto que se une a la proteína o el péptido de (5) y que comprende los siguientes pasos:

(a)

puesta en contacto de una muestra del ensayo con la proteína o el péptido de la misma mencionados;

(b)

detección de la actividad de unión de la muestra de ensayo con la proteína o el péptido de la misma y

(c)

selección del compuesto que se une a la proteína o el péptido de la misma;

(9) una composición farmacéutica que contenga el DNA de (1), la proteína de (5), el vector de (2), el anticuerpo de (6) y/o el polinucleótido de (7) y

(10) el uso de la proteína de (5) y/o el anticuerpo de (6) para la preparación de la composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad y la hematopoyesis.

\newpage

La presente invención proporciona un nuevo receptor de hematopoyetina "NR12". Según los resultados de las búsquedas de la base de datos en GenBank y también según los análisis de 5'-RACE y 3'-RACE, los presentes inventores finalmente consiguieron determinar y aislar un gen nuevo de receptor de hematopoyetina NR12. Se descubrió que como mínimo tres variantes alternativas de corte y empalme se traducen del NR12. Una de estas variantes, la NR12.1 del clon de cDNA, codifica una proteína soluble parecida al receptor. Las otras dos que parecía que debían codificar las proteínas de receptor transmembrana, NR12.2 y NR12.3 del clon de cDNA, codifican una proteína que parece tener una región intracelular tan corta como 51 aminoácidos y tan larga como 252 aminoácidos, respectivamente.

Además, los presentes inventores llevaron a cabo una clonación por PCR frente a una biblioteca de cDNA de timo humano para aislar las secuencias continuas de codificación de extensión completa (CDS). Un clon que tenía casi la misma extensión completa de marco de lectura abierto (ORF) que el NR12.2 se denominó NR12.4; y la que tenía casi la misma extensión completa de marco de lectura abierto (ORF) que el NR12.3 se denominó NR12.5.

En el ID. de SEC. núm.: 1 se muestra la secuencia de nucleótidos del cDNA NR12.1 y la correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el cDNA se muestra en el ID.de SEC. núm.: 2. La secuencia de nucleótidos del cDNA NR12.2 se muestra en la SEC. ID. núm.: 3 y la correspondiente secuencia aminoácido de la proteína codificada por el cDNA se muestra en el ID. SEC. núm.: 4. La secuencia de nucleótidos del cDNA NR12.3 se muestra en el ID. SEC. núm.: 5 y la correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el cDNA se muestra en el ID. SEC. núm.: 6. La secuencia de nucleótidos del cDNA NR12.4 se muestra en el ID. SEC. núm.: 7 y la correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el cDNA se muestra en el ID. SEC. núm.: 8. La secuencia de nucleótidos del cDNA NR12.5 se muestra en el ID. SEC. núm.: 9 y la correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el cDNA se muestra en el ID. SEC. núm.: 10.

Como las regiones extracelulares del NR12.1, NR12.2, NR12.3, NR12.4 y del NR12.5 son casi idénticas, se cree que estas regiones tienen la misma estructura terciaria y por lo tanto reconocen el mismo ligando específico.

Los análisis de la expresión génica en varios órganos humanos mediante RT-PCR mostraron: una fuerte expresión de NR12 en tejidos de la línea celular hematopoyética y en tejidos de la línea celular inmunitaria como bazo, timo, ganglio linfático, médula ósea y leucocitos periféricos adultos; y expresión en testículo, hígado, pulmón, riñón, páncreas y tubo digestivo como el intestino delgado y colon. Además, también se observó expresión de NR12 en todo el mRNA analizado que derivaba de órganos fetales humanos. A partir del patrón de distribución hallado de la expresión de NR12 se supuso que NR12 codifica para un nuevo receptor de factor hematopoyético, principalmente porque se detectó la localización de una fuerte expresión en tejidos que se pensaba incluían líneas celulares inmunitarias y células hematopoyéticas. Además, el hecho de que se observó la expresión de NR12 en otros tejidos aparte de los descritos anteriormente sugiere que la NR12 puede regular no solo las funciones fisiológicas del sistema inmunitario y del sistema hematopoyético in vivo sino también otras diversas funciones fisiológicas in vivo.

Estas proteínas NR12 son potencialmente útiles para la aplicación médica. Dado que NR12.1 se expresa en el timo, en leucocitos periféricos y el bazo se predice que se trata de un receptor para un factor hematopoyético desconocido. Por lo tanto las proteínas NR12 son instrumentos útiles para la identificación de factores hematopoyéticos desconocidos. También pueden utilizarse en el examen de una biblioteca de péptidos o compuestos químicos sintéticos para aislar o identificar agonistas y antagonistas que puedan unirse funcionalmente a la molécula NR12. También se espera que exista una aplicación clínica de nuevas moléculas que se unan a la molécula NR12 y de anticuerpos específicos que puedan limitar la función de la molécula NR12 en la regulación de la respuesta inmunitaria o de la hematopoyésis in vivo, mediante la búsqueda de dichas moléculas y anticuerpos.

Se espera que NR12 se exprese en una población reducida de células de los tejidos hematopoyéticos y, por lo tanto, los anticuerpos anti-NR12 son útiles para aislar dichas poblaciones celulares. Estas poblaciones celulares aisladas pueden usarse para el transplante celular. Incluso se piensa que el anticuerpo anti-NR12 pueda utilizarse para el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades como la leucemia.

Por otro lado, las proteínas solubles que conforman el dominio extracelular de la proteína NR12 y la variante de corte y empalme de la NR12. NR12.1, pueden usarse como un receptor señuelo para inhibir le ligando de la NR12. Pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades en las que la NR12 esté implicada, como es el caso de la leucemia.

La presente invención incluye proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína NR12. Por ejemplo, homólogos de la proteína NR12 humana. Por esto el término "funcionalmente equivalente" se refiere a las proteínas que presentan una actividad biológica equivalente comparadas con la de una proteína NR12. Semejante actividad biológica puede incluir la actividad de la proteína como receptor de factor hematopoyético unido a la membrana o en forma soluble.

Para las personas que dominan la materia son bien conocidos los métodos para introducir mutaciones con el fin de preparar proteínas que sean funcionalmente equivalentes a otra proteína. Por ejemplo, un experto podría utilizar mutagénesis dirigida (Hashimoto-Gotoh T. et al. (1995), Gene 152, 271-275; Zoller, M. J. and Smith, M (1983), Methods
Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W. and Fritz H. J. (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; Kunkel (1988), Methods Enzymol. 85, 2763-2766) y demás para introducir una mutación pertinente en la secuencia de aminoácidos de la proteína NR12 humana y preparar una proteína que sea funcionalmente equivalente a la misma. En la naturaleza también se dan mutaciones de aminoácidos. Entre las proteínas de la presente invención se encuentran proteínas que presentan la secuencia de aminoácidos de la proteína NR12 humana con uno o dos aminoácidos mutados, pero siempre en el caso de que las proteínas resultantes sean funcionalmente equivalentes a la proteína NR12 humana.

Se pueden mencionar específicamente las siguientes proteínas (como funcionalmente equivalentes a la proteína NR12 de la invención): una en la que cualquiera de las secuencias de aminoácidos de ID. DE SEC. núm.: 2, 4, 6, 8 o 10 presenta una deleción en uno o dos, preferiblemente de dos a 30, más preferiblemente de dos a 10 aminoácidos; una en la que cualquiera de las secuencias de aminoácidos de ID. de SEC. núm.: 2, 4, 6, 8 o 10 presenta una adición en uno o dos, preferiblemente de dos a 30, más preferiblemente de dos a 10 aminoácidos; una en la que cualquiera de las secuencias de aminoácidos de ID. de SEC. núm.: 2, 4, 6, 8 o 10 presenta una sustitución por otros aminoácidos de uno o dos, preferiblemente de dos a 30, más preferiblemente de dos a 10 aminoácidos.

En lo que respecta a la mutación del residuo de aminoácido es preferible que de cómo resultado un aminoácido diferente que permita la conservación de las propiedades de la cadena lateral del mismo. Unos ejemplos de propiedades de cadenas laterales de aminoácidos son los siguientes: aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) y aminoácidos con las siguientes cadenas: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); una cadena lateral que contiene un grupo hidroxilo (S, T, Y); una cadena lateral con un átomo de azufre (C, M); una cadena lateral con un ácido carboxílico y una amida (D, N, E, Q); una cadena lateral con una base (R, K, H) y una cadena lateral con un anillo aromático (H, F, Y, W) (Las letras entre paréntesis indican los códigos de una letra de los aminoácidos).

Es bien conocido que una proteína puede presentar una secuencia de aminoácidos modificada por deleción, adición y/o sustitución de otros aminoácidos por uno o más residuos de aminoácido sin perder su actividad biológica (Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1984), 81, 5662-5666; Zoller, M. J. & Smith, M., Nucleic Acids research, (1982), 10, 6487-6500; Wang, A. et al., Science, 224, 1431-1433; Dalbadie-McFarland, g. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., (1982), 79, 6409-6413).

Una proteína de fusión que contiene la proteína NR12 humana es un ejemplo de proteína en la que uno o más residuos de aminoácido han sido añadidos a la secuencia de aminoácidos de la proteína NR12 humana (p. ej., ID. de SEC. núm.: 2, 4, 6, 8 o 10). Una proteína de fusión se fabrica mediante la fusión de la proteína NR12 humana con otro péptido(s) o proteína(s) y se encuentra en la presente invención. La preparación de una proteína de fusión consiste en ligar un DNA que codifique para la proteína NR12 humana de la presente invención con un DNA que codifique para otro péptido(s) o proteína(s) conservando la pauta de lectura, e introducir el DNA ligado en un vector de expresión para expresar el gen de fusión en un huésped. Para preparar un gen de fusión semejante se pueden usar los métodos conocidos por quienes dominan la materia. No hay restricciones respecto al otro péptido(s) o proteína(s) que está(n) fusionados con la proteína de la presente invención.

Otro(s) péptido(s) que puedan ser fusionados con una proteína de la presente invención incluye péptidos conocidos como son, por ejemplo, FLAG (Hopp, T.P. et al., Biotechnology (1988) 6,1204-1210), 6x His que consiste en seis residuos de histidina, 10x His, aglutinina del virus de la gripe (HA), fragmento de c-myc humano, fragmento de VSV-GP, fragmento de p18HIV, T7-tag, HSV-tag, E-tag, fragmento del antígeno SV40T, lck-tag, fragmento de \alpha-tubulina, B-tag, fragmento de la Proteína C y demás. Otros ejemplos son el GST (glutación-S-transferasa), la aglutinina del virus de la gripe (HA), la región constante de la inmunoglobulina, la \beta-galactosidasa, MBP (proteína de unión a la maltosa) y muchos más.

Las proteínas de fusión se pueden preparar mediante la fusión de DNA disponible comercialmente que codifica para estos péptidos o proteínas con DNA que codifica para una proteína de la presente invención y la expresión del DNA de fusión preparado.

La técnica de hibridación (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) es ampliamente conocida por aquellos entendidos en la materia como método alternativo para el preparado de una proteína funcionalmente equivalente a una proteína determinada. De un modo más específico, un entendido de la materia puede seguir el procedimiento general para obtener una proteína funcionalmente equivalente a una proteína NR12 humana al aislar DNA con una alta homología con todo o parte de la secuencia de DNA que codifica para la proteína NR12 humana (p. ej. ID. de SEC. núm.: 1, 3, 5, 7 o 9). Por lo tanto, la presente invención describe aquellas proteínas que están codificadas por unos DNA que hibridan con un DNA que codifica para una proteína NR12 humana o una parte de la misma y que además son funcionalmente equivalentes a la proteína NR12 humana. Algunos ejemplos son los homólogos de la NR12 humana en otros mamíferos (por ejemplo los del gen de mono, rata, ratón, conejo o bovino). Para poder aislar a partir de animales un cDNA que presente una gran homología con el DNA que codifica para la proteína NR12 humana es preferible utilizar un tejido de línea celular hematopoyética como por ejemplo bazo, timo, ganglio linfático, médula ósea o leucocitos periféricos; sin embargo la invención no está limitada a éstos.

Un entendido en la materia puede seleccionar adecuadamente unas condiciones rigurosas de hibridación para aislar DNA que codifica para proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína NR12 humana y, por ejemplo, se pueden dar unas condiciones de baja astringencia. Estas últimas son, por ejemplo, 42ºC, 2x SSC y 0,1% SDS, y preferiblemente 50ºC, 2x SSC y 0,1% SDS. Son más preferibles las condiciones de alta astringencia y comprenden, por ejemplo, 65ºC, 2x SSC y 0,1% SDS. Bajo estas condiciones, a temperaturas más bajas el DNA obtenido tendrá una homología menor. Al contrario, se espera que la homología del DNA obtenido sea mayor a temperaturas más altas. Sin embargo hay otros factores, además de la temperatura, que también pueden influir sobre la astringencia de hibridación, como por ejemplo la concentración de sales, y un experto en la materia puede seleccionar de manera rutinaria los factores necesarios para conseguir una astringencia similar.

Para aislar el DNA objeto en lugar de la hibridación se puede utilizar el método de amplificación génica, por ejemplo la técnica de la reacción en cadena por la polimerasa (PCR), que utiliza cebadores sintetizados basándose en la información de la secuencia de un DNA (p. ej., ID. de SEC. núm.: 1, 3, 5, 7, o 9) que codifica para la proteína NR12 humana.

Aquellas proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína NR12 humana y que están codificadas por DNA aislado mediante la técnica de hibridación arriba explicada o mediante las técnicas de amplificación génica, suelen presentar una gran homología con la secuencia de aminoácidos de la proteína NR12 humana. Entre las proteínas de la presente invención también se encuentran aquellas proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína NR12 humana y que además presentan una gran homología con la proteína que contiene cualquiera de las secuencias de aminoácidos de ID. de SEC. núm.: 2, 4, 6, 8 o 10. Habitualmente una alta homología se define como un homología del 70% o mayor, preferiblemente del 80% o mayor, más preferiblemente del 90% o mayor y lo más preferible del 95% o mayor. La homología de una proteína se puede determinar mediante el algoritmo que se describe en "Wilbur, W. J, and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730".

La secuencia de aminoácidos, el peso molecular, el punto isoeléctrico, la presencia o ausencia de cadenas de azúcar y la forma de una proteína de la presente invención pueden ser distintos según la producción de células, el huésped o el método de purificación descrito más adelante. Sin embargo, siempre que la proteína obtenida tenga una función equivalente a la de la proteína NR12 humana (ID. de SEC. núm.: 2, 4, 6, 8 o 10), será incluida en la presente invención. Por ejemplo, si una proteína de la presente invención es expresada en células procariotas, como E. coli, se añade un residuo de metionina en el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada. En cambio, si es expresada en células eucariotas, como células de mamífero, la secuencia señal del extremo N-terminal es eliminada. Tales proteínas también forman parte de la presente invención.

Por ejemplo, como resultado de los análisis sobre la proteína de la invención basados en el método explicado en "Von Heijne, G., Nucleic Acids Research, (1986), 14, 4683-4690", se supuso que la secuencia señal va desde la Met 1 hasta la Gly 23 en las secuencias de aminoácidos de ID. DE SEC. núm.: 2, 4, 6, 8 o 10. Por lo tanto la presente invención comprende una proteína que incluye la secuencia desde la Gly 24 hasta la Cys 337 de la secuencia de aminoácidos de ID. de SEC. núm.: 2. De igual manera la presente invención comprende una proteína que incluye la secuencia desde la Gly 24 hasta la Ser 428 de la secuencia de aminoácidos de ID. DE SEC. núm.: 4. Además, la presente invención comprende una proteína que incluye la secuencia desde la Gly 24 hasta la Lys 629 de la secuencia de aminoácidos de ID. de SEC. núm.: 6. La presente invención también comprende una proteína que incluye la secuencia desde la Gly 24 hasta la Ser 428 de la secuencia de aminoácidos de ID. de SEC. núm.: 8. La presente invención también comprende una proteína que incluye la secuencia desde la Gly 24 hasta la Lys 629 de la secuencia de aminoácidos de ID. de SEC. núm.: 10.

Se puede preparar una proteína de la presente invención como una proteína recombinante o como una proteína natural mediante métodos conocidos por un experto en la materia. Se puede preparar un DNA recombinante mediante la inserción de un DNA que codifique para una proteína de la presente invención (por ejemplo, el DNA que contiene la secuencia nucleotídica de ID. de SEC. núm.: 1, 3, 5, 7 o 9) en un vector de expresión adecuado, la inserción del vector en una célula huésped adecuada y la recolección del extracto a partir del transformante resultante. Una vez obtenido el extracto se puede purificar y preparar la proteína recombinante sometiéndola a cromatografía, como la cromatografía de intercambio de iones, la cromatografía de fase inversa, la filtración sobre gel y demás métodos parecidos, o una cromatografía de afinidad donde se inmovilizan los anticuerpos contra la proteína de la presente invención, o bien utilizando una o varias de estas columnas combinadas.

Más adelante, cuando una proteína de la presente invención ya es expresada en las células huésped (por ejemplo en células animales o en E. coli) como una proteína de fusión con la proteína glutatión-S-transferasa o como una proteína recombinante complementada con un gran número de histidinas, la proteína recombinante expresada puede ser purificada utilizando una columna de glutatión o de níquel.

Después de purificar la proteína de fusión también es posible excluir aquellas regiones que no sean la proteína objetivo mediante el corte con trombina, factor-Xa o parecidos, como sea necesario.

Se puede aislar una proteína natural mediante métodos ampliamente conocidos. Por ejemplo, se pueden hacer reaccionar extractos de tejido o células que expresen una proteína de la invención en una columna de afinidad que se describe más adelante, en la que se encuentran adheridos anticuerpos de unión a la proteína NR12 humana, para aislar la proteína natural. Se pueden utilizar tanto anticuerpos policlonales como monoclonales.

La presente invención también incluye péptidos que forman parte de las proteínas de la misma. El péptido consiste en una secuencia de aminoácidos específica para una proteína de la presente invención y está compuesta por, al menos, 7 aminoácidos, preferiblemente más de 8 y más preferiblemente más de 9. Estos péptidos pueden ser útiles para la preparación de anticuerpos contra una proteína de la presente invención, para el análisis de compuestos de unión a una proteína de la presente invención o para el análisis de aceleradores o inhibidores de una proteína de la presente invención. Como alternativa también pueden usarse como antagonistas del ligando de una proteína de la presente invención. Un ejemplo de un péptido que forma parte de una proteína de la presente invención es un péptido cuyo centro activo de la proteína consiste en la secuencia de aminoácidos de ID. de SEC. núm.: 2, 4, 6, 8 o 10. Además, los péptidos también pueden presentar una o más regiones de la región hidrofílica e hidrofóbica determinadas mediante un análisis gráfico de hidrofobicidad. Dichos péptidos pueden contener la región hidrofílica en su totalidad o una parte de ella, o bien contener la totalidad o una parte de la región hidrofóbica. Además, las proteínas solubles y las proteínas que comprenden las regiones extracelulares de una proteína de la invención también se encuentran comprendidas en la invención.

Los péptidos que forman parte de la proteína de la invención pueden ser sintetizados mediante técnicas de ingeniería genética, métodos de síntesis peptídico bien conocidos, o mediante la escisión de una proteína de la invención con una peptidasa adecuada. Como método de síntesis peptídica se puede usar por ejemplo el método de síntesis en fase sólida o el método de síntesis en fase líquida.

Otro propósito de la presente invención es proporcionar un DNA que codifique para una proteína de la presente invención. El DNA puede ser útil para producir las proteínas arriba mencionadas de la presente invención in vivo o in vitro. Además, por ejemplo, también se puede utilizar el DNA aplicado a la terapia génica y otros de enfermedades que surgen de anomalías en el gen que codifica para la proteína de la presente invención. Dicho DNA puede proporcionarse en cualquier forma siempre y cuando codifique para una proteína de la presente invención. Por lo tanto el DNA puede ser un cDNA sintetizado a partir de mRNA, DNA genómico o DNA sintetizado químicamente. Incluso se puede incluir un DNA que comprenda una secuencia nucleotídica basada en la degeneración del código genético siempre y cuando codifique para una proteína de la presente invención.

El DNA de la presente invención puede prepararse mediante cualquier método conocido por los expertos. Por ejemplo, se puede preparar construyendo una biblioteca de cDNA a partir de células que expresen la proteína de la presente invención, y llevando a cabo una hibridación utilizando una secuencia parcial de un DNA de la presente invención como sonda (por ejemplo, ID. DE SEC. núm.: 1, 3, 5, 7 o 9). Para construir una biblioteca de cDNA se puede seguir el método descrito en la bibliografía (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), o sino también se puede usar una biblioteca de cDNA comercial. Otra posibilidad para preparar el DNA es mediante la obtención de RNA a partir de una célula que exprese una proteína de la presente invención, la síntesis de un oligo-DNA basado en la secuencia de un DNA de la presente invención (por ejemplo, ID. de SEC. núm.: 1, 3, 5, 7 o 9), se lleva a cabo una PCR utilizando el DNA sintetizado como cebadores y se amplifica el cDNA que codifica para una proteína de la presente invención.

Mediante la determinación de la secuencia nucleotídica de cDNA obtenido se puede determinar la región de traslación codificada por el cDNA y se puede obtener la secuencia de aminoácidos de la proteína de la presente invención. Aún más, el DNA genómico puede aislarse mediante el análisis de bibliotecas de DNA genómico usando el cDNA obtenido como sonda.

Más concretamente, esto se puede realizar de la siguiente manera: primero, se aísla el mRNA de células, tejidos u órganos que expresan una proteína de la presente invención (por ejemplo, tejido de una línea celular con competencia en la hematopoyesis como bazo, timo, ganglio linfático, médula ósea o leucocito periférico, y tejido de una línea celular inmunocompetente, y demás). Para aislar el mRNA primero es necesario preparar el RNA completo mediante métodos ampliamente conocidos como, por ejemplo, el método de ultracentrifugación por guanidina (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry, 18:5294-5299 (1979)), el método AGPC (Chomczynski, P. and Saacchi, N., Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)) u otros. Después, se puede purificar mRNA a partir del RNA completo utilizando el Purification Kit (Pharmacia) u otros. También se puede preparar directamente mediante el QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).

Posteriormente, se puede sintetizar el cDNA utilizando la transcriptasa inversa del mRNA obtenido. Para esto se puede utilizar el AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Kogyo), etcétera. Otra manera de sintetizar y amplificar cDNA consiste en usar el cebador y demás aquí descritos, siguiendo el método 5'-RACE (Forman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8998-9002 (1988); Belyavsky, A. et al. Nucleic acids Res. 17:2919-2932 (1989)) utilizando la reacción en cadena por la polimerasa (PCR) y el 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech).

El fragmento de DNA objetivo se prepara a partir del producto obtenido de la PCR y se liga a un DNA vector. Entonces se crea un vector recombinante y se introduce en E. coli y otros, y se seleccionan colonias para preparar el vector recombinante deseado. La secuencia nucleotídica del DNA objetivo se puede verificar mediante métodos convencionales como por ejemplo la terminación de cadena dideoxinucleotídica.

Por lo que respecta al DNA de la invención, se puede diseñar una secuencia con una mayor eficiencia de expresión al considerar la frecuencia de uso del codón en el huésped usado para la expresión (Grantham R. et al., Nucleic Acids research (1981) 9, r43-74). También es posible modificar el DNA de la presente invención mediante el uso de kits comercialmente disponibles y los métodos convencionales. Algunas modificaciones ilustrativas son por ejemplo la digestión por enzimas de restricción, la inserción de oligonucleótidos sintéticos y de fragmentos apropiados de DNA, la adición de unidores, la inserción de un codón de iniciación (ATG) y/o un codón finalizador (TAA, TGA o TAG) y otros.

Concretamente, el DNA de la presente invención incluye un DNA que contiene la secuencia nucleotídica desde la "A" 98 hasta la "C" 1108 de ID. de SEC. núm.: 1; desde la "A" 98 hasta la "C" 1381 de ID. de SEC. núm.: 3; desde la "A" 98 hasta la "G" 1984 de ID. de SEC. núm.: 5; desde la "A" 1ª hasta la "C" 1284 de ID. de SEC. núm.: 7 y desde la "A" 1ª hasta la "G" 1887 de ID. de SEC. núm.: 9.

Además, la presente invención describe DNA que hibrida bajo condiciones astringentes con el DNA formado por cualquiera de las secuencias nucleotídicas de ID. de SEC. núm.: 1, 3, 5, 7 o 9, dando lugar a un DNA resultante que codifica para una proteína funcionalmente equivalente a la proteína de la invención arriba mencionada.

Un experto en la materia puede seleccionar adecuadamente las condiciones de astringencia, por ejemplo condiciones da baja astringencia como 42ºC, 2x SSC y 0,1% SDS y, preferiblemente, 50ºC, 2x SSC y 0,1% SDS. Es más preferible escoger unas condiciones de alta astringencia que son por ejemplo 65ºC, 2x SSC y 0,1% SDS. Bajo estas condiciones, cuanto más alta sea la temperatura mayor será la homología de DNA obtenido. El DNA de hibridación arriba mencionado debe ser preferiblemente DNA natural, como cDNA o DNA cromosómico.

Por otra parte, la presente invención proporciona un vector que tiene un DNA de la presente invención como un inserto. Dicho vector puede ser útil para mantener el DNA de la presente invención en células huésped o producir la proteína de la presente invención.

Si la célula huésped es E. coli (como JM109, DH5\alpha, HB101 y XL1Blue), se puede utilizar cualquier vector siempre que contenga la región "ori" para la amplificación de E. coli, que permite la preparación a gran escala, y un marcador de selección para transformantes (por ejemplo un gen resistente a un fármaco que permite la selección mediante un fármaco como la ampicilina, la tetraciclina, la kanamicina o el cloranfenicol). Pueden utilizarse, por ejemplo, los vectores de la serie M13, los de la serie pUC, la pBR322, pBluescript, pCR-Script y demás. Con el propósito de subclonar o excisionar un cDNA también se pueden usar pGEM-T, pDIRECT, pT7 u otros vectores similares. Para producir la proteína de la presente invención es especialmente útil el uso de un vector de expresión. Por ejemplo, si la proteína debe ser expresada en E. coli el vector de expresión debe tener las características mencionadas anteriormente para ser amplificada en E. coli. Además, cuando se utiliza E. coli (como JM109, DH5\alpha, HB101 o XL1 Blue) como la célula huésped el vector debe tener un promotor como por ejemplo el promotor lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB, J.(1992)6, 2422-2427), el promotor araB (Better et al., Science (1988) 240,1041-1043), el promotor T7 y otros que pueden expresar eficientemente el gen deseado en E. coli. Dichos vectores incluyen pGFX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP, pET (en este caso el huésped es preferiblemente BL21 que expresa la RNA polimerasa T7), y demás excepto los mencionados anteriormente.

Se pueden introducir los vectores en las células huésped por ejemplo mediante el método del cloruro cálcico o la electroporación. El vector puede contener una secuencia señal para la secreción polipeptídica. La secuencia señal pelB (Lei, S. P. et al., J. Bacterial. (1987) 169, 4379) puede usarse para producir las proteínas en el periplasma de E. coli.

Por ejemplo, el vector de expresión para la preparación de una proteína de la presente invención puede ser un vector de expresión derivado de mamífero (por ejemplo pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p5322, pEF y pCDM8); un vector de expresión derivado de célula de insecto (por ejemplo, "Bac-to-BAC baculovirus expression system" (GIBCO BRL), pBacPAK8); un vector de expresión derivado de planta (por ejemplo pMH1 y pMH2); un vector de expresión derivado de virus animal (por ejemplo pHSV, pMV y pAdexLcw; un vector de expresión derivado de retrovirus (por ejemplo pZIpneo); un vector de expresión derivado de levadura (por ejemplo "Pichia Expresión Kit" (Invitrogen), pNV11 y SP-Q01); o un vector de expresión derivado de Bacillus subtilis (por ejemplo pPL608 y pKTH50), diferentes de E. coli.

Para la expresión en células animales, como células CHO, COS y NIH3T3, el vector de expresión debe tener un promotor como el SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), el promotor MMLV-LTR, el promotor EF1\alpha (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) y el promotor CMV. Preferiblemente el vector debe contener un gen marcador para la selección de transformantes (por ejemplo un gen resistente a un fármaco para la selección mediante un fármaco como la neomicina y G418). Tales vectores incluyen pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOp13 y demás.

Se pueden utilizar también células CHO deficientes en la vía metabólica de la síntesis nucleotídica para conseguir una expresión génica estable y una amplificación del número de copias del gen en la célula. Se transfecta la célula CHO con un vector de expresión que contiene el gen DHFR que complementa la deficiencia (por ejemplo pCHO I), entonces el vector puede ser amplificado mediante el tratamiento con metotrexato (MTX). Para una expresión génica transitoria se pueden utilizar células COS que contengan un gen que exprese el antígeno T de SV40 en su cromosoma para la transformación con un vector que contenga el origen de replicación SV40 (p. ej. pcD). Algunos ejemplos de orígenes de replicación que se pueden utilizar en la presente invención incluyen aquellos derivados de poliomavirus, adenovirus, papilomavirus bovino (BPV) y demás. Además, para amplificar las copias del gen en líneas de células del huésped, el vector de expresión puede incluir un gen de la aminoglicósido transferasa (APH), el gen de la timidina quinasa (TK), el gen xantina guanina fosforibosil transferasa de E. coli (Ecogpt), dihidrofolato reductasa (dhfr) y demás, como marcador selectivo.

Por otro lado, se puede realizar la expresión in vivo de un DNA de la presente invención en animales mediante, por ejemplo, la inserción de un DNA de la presente invención en un vector apropiado y la introducción del vector en el cuerpo usando retrovirus, liposomas, liposomas catiónicos, adenovirus y similares. Es posible utilizar estos métodos par llevar a cabo terapia génica para enfermedades que surgen a raíz de mutaciones en el gen NR12 de la presente invención. Algunos ejemplos de vectores utilizados con este fin son los adenovirus (por ejemplo pAdexlcw), retrovirus (por ejemplo pZIPneo) y demás, pero no están limitados a ellos. Las manipulaciones génicas generales, como la inserción del DNA de la presente invención en un vector, se puede llevar a cabo utilizando métodos estándar (Molecular Cloning, 5,61-5,63). La administración del vector a un cuerpo vivo puede realizarse a través de métodos ex vivo o in vivo.

Otro objeto de la presente invención es el de proporcionar un transformante que contenga el vector de la presente invención. No existe una limitación en cuanto a la célula huésped utilizada para insertar el vector de la invención y, por ejemplo, es posible usar E. coli, una serie de células animales diferentes y demás. Las células huésped de la presente invención se pueden usar, por ejemplo, como sistema de producción para preparar o expresar una proteína de la presente invención. Los sistemas de producción in vivo e in vitro son conocidos como sistemas de producción de proteínas.
También es posible utilizar células eucariotas y procariotas del mismo modo que los sistemas de producción in vitro.

Al utilizar células eucariotas como sistema de producción se puede disponer de células animales, vegetales o fúngicas a modo de huésped. Algunos ejemplos de células animales a utilizar son las células de mamífero como CHO (J. Exp. Med. 108:945(1995)), COS, 3T3, mieloma, riñón de cría de hamster (BHK), HeLa, células Vero; células de anfibio como ocitos de Xenopus (Valle, et al., Nature 291:338-340 (1981)) y células de insecto como Sf9, Sf21 o Tn5. De las células CHO, se pueden utilizar de forma adecuada células CHO deficientes en el gen DHFR, dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77:4216-4220 (1980)) y CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 60:1275 (1968)). Este tipo de células se deben usar preferiblemente para la preparación en células animales a gran escala. La introducción del vector en las células huésped puede hacerse a través del método del fosfato cálcico, del método DEAE dextrano, métodos que utilizan el liposoma catiónico DOTAP (Boehringer Mannheim), el método de la electroporación, el de la lipofección y demás por el estilo.

Las células derivadas de Nicotiana tabacum son ampliamente conocidas como sistemas de producción de proteínas en células vegetales y pueden proceder del cultivo del callo. Respecto a las células fúngicas son conocidas levaduras como el género Saccharomyces (p. ej. Saccharomyces cerevisiae) y hongos filamentosos como el género Aspergillus (p. ej. Aspergillus Níger).

Como sistema de producción procariota se pueden usar células bacterianas. Son conocidas como tales E. coli, por ejemplo JM109, DH5\alpha, HB101 y otros, así como otras como Bacillus subtilis.

Se pueden obtener proteínas transformando estas células con el DNA objetivo y cultivando las células transformadas in vitro. Los transformantes se pueden cultivar según métodos conocidos. Por ejemplo, DMEM, MEM, RPMI1640 y IMDM pueden usarse como medio de cultivo de células animales. Ocasionalmente se puede añadir a estos medios suero fetal bovino (FCS) y otros suplementos séricos semejantes, pero también es posible utilizar medios de cultivo sin suero. El pH del medio de cultivo oscila preferiblemente entre 6 y 8. El cultivo se realiza habitualmente entre 30 y 40ºC aproximadamente, y entre 15 y 200 horas y cuando sea necesario realizando los cambios de medio de cultivo, la aireación y la agitación.

Por otro lado, los sistemas de producción que usan animales y plantas pueden usarse como sistemas de producción de proteínas in vivo. El DNA objetivo es introducido en el animal o planta, y la proteína es producida en su interior para luego recuperarla. El término huésped tal como se ha utilizado en la presente invención también incluye estos animales y plantas.

Si se utilizan animales se pueden usar sistemas de producción de mamíferos y de insectos. En cuanto a los mamíferos destacamos el uso de cabras, cerdos, ovejas, ratones y bóvidos (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). A modo alternativo también es posible usar animales transgénicos.

Por ejemplo, el DNA objetivo puede prepararse como un gen de fusión que contenga un gen que codifica para una proteína producida intrínsecamente en la leche, como la \beta-caseína de la cabra. El siguiente paso es inyectar el fragmento de DNA que contiene el gen de fusión en un embrión de cabra que será implantado en una cabra hembra. La proteína objetivo se puede recuperar a partir de la leche de las cabras transgénicas descendientes de la cabra que recibió el embrión y su descendencia misma. Para aumentar la cantidad de leche (que contiene la proteína) producida por la cabra transgénica se le puede administrar hormonas adecuadas (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology 12:699-702 (1994)).

En cuanto a los insectos, se pueden utilizar gusanos de seda. Esto se lleva a cabo infectándolos con baculovirus en los que se ha insertado el DNA que codifica para la proteína objetivo y recuperando la proteína deseada a partir de los fluidos corporales de los gusanos (Susumu M. et al., Nature 315:592-594 (1985)).

Respecto a las plantas, el tabaco es una de las elecciones: se inserta el DNA que codifica para la proteína objetivo en un vector de expresión vegetal, por ejemplo pMON530, y este es insertado en una bacteria como por ejemplo Agrobacterium tumefaciens. El tabaco, por ejemplo Nicotiana tabacum, es infectado con esta bacteria que será capaz de obtener el polipéptido deseado a partir de las hojas de la planta (Julian K., -C. Ma et al., Eur. J. Inmunol. 24:131-138(1994)).

Las proteínas de la presente invención obtenidas de este modo, se aíslan a partir del interior o el exterior (p. ej. el medio) de la célula huésped y pueden así ser purificadas en proteínas considerablemente homogéneas puras. La separación y purificación de la proteína se puede realizar mediante métodos convencionales de separación y purificación de proteínas y no hay ninguna limitación en cuanto a un método específico. Por ejemplo, los siguientes métodos pueden seleccionarse adecuadamente o combinarse para separar y purificar la proteína: cromatografía en columna, filtro, ultrafiltración, precipitación salina, precipitación de disolvente, extracción de disolvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, electroforesis por punto isoeléctrico, diálisis, recristalización y otros.

Como ejemplo de cromatografías tenemos: cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía hidrofóbica, filtración sobre gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de adsorción y otros (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Estas cromatografías pueden realizarse por cromatografía líquida como HPLC, FPLC y otras. La presente invención contiene proteínas altamente purificadas mediante el uso de estos métodos de purificación.

Las proteínas pueden modificarse de forma arbitraria, o los péptidos sufrir una escisión parcial, mediante el tratamiento de las proteínas con enzimas de modificación de proteínas previa o posteriormente a la purificación. Algunas de estas enzimas son: tripsina, quimiotripsina, lisil-endopeptidasa, proteína quinasa, glucosidasa y otras.

La presente invención también proporciona anticuerpos que específicamente reaccionan a la proteína de la invención. No existe ninguna restricción en concreto en cuanto a la forma del anticuerpo de la invención y esta incluye anticuerpos policlonales, además de anticuerpos monoclonales. También están incluidos los antisueros que se han obtenido mediante la inmunización de animales como los conejos con una proteína de la invención, también los anticuerpos policlonales y monoclonales de todos los tipos, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados producidos mediante recombinación genética.

Una proteína de la invención que se usa como antígeno sensibilizante para obtener anticuerpos no está restringida por las especies de animales de los cuales deriva, pero preferentemente es una proteína derivada de mamíferos, por ejemplo, humanos, ratones o ratas, preferiblemente de humanos. Las proteínas humanas se pueden obtener con el uso de secuencias nucleotídicas o de secuencias de aminoácidos aquí expuestas.

En la presente, se puede usar una proteína intacta o su péptido parcial como antígeno para la inmunización. Como péptidos parciales de las proteínas se pueden dar, por ejemplo, el fragmento amino (N)-terminal de la proteína y el fragmento carboxi (C)-terminal. "Anticuerpo" tal y como se usa aquí significa un anticuerpo que reacciona específicamente con la proteína entera o con fragmentos.

Un gen que codifica una proteína de la invención o un fragmento de la misma se inserta dentro de un vector de expresión conocido y, mediante la transformación de las células huésped con el vector aquí descrito, la proteína deseada o su fragmento se recupera del exterior o del interior de las células huésped utilizando los métodos habituales. Esta proteína se puede usar como el antígeno sensibilizante. También, las células que expresan la proteína, los lisados de células o una proteína de la invención sintetizada químicamente se pueden usar como antígeno sensibilizante.

El mamífero que se inmuniza con el antígeno sensibilizante no está restringido; sin embargo, es preferible seleccionar los animales considerando la compatibilidad con las células originales usadas en la fusión celular. Generalmente se usan animales pertenecientes a las clases de los roedores, los lagomorfos y de los primates.

Algunos ejemplos de los animales pertenecientes a los roedores que se pueden utilizar son por ejemplo, los ratones, las ratas y los hámsters entre otros. Ejemplos de animales pertenecientes a los lagomorfos que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, los conejos. Ejemplos de animales primates que se pueden utilizar son, por ejemplo, los monos. Algunos ejemplos de monos para utilizar incluyen los catarrinos de infraorden (monos del viejo mundo), por ejemplo, el macaco cangrejero, los monos rhesus, los babuinos sagrados y los chimpancés entre otros.

Se usarán métodos bien conocidos para inmunizar los animales con el antígeno sensibilizante. Por ejemplo, el antígeno sensibilizante se inyecta en los animales por vía intraperitoneal o subcutánea. Específicamente, el antígeno sensibilizante se diluye y suspende en una solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS), etcétera; y, si se desea, se mezcla con una cantidad adecuada de adyuvante general, por ejemplo, con el adyuvante completo de Freund. Entonces se emulsiona la solución y se inyecta en el mamífero. A partir de entonces, el antígeno sensibilizante mezclado de forma adecuada con el adyuvante incompleto de Freund preferentemente se suministra varias veces cada 4 a 21 días. También se puede usar un transportador adecuado cuando se inmuniza un animal con el antígeno sensibilizante. Después de la inmunización, se detecta el aumento del nivel de anticuerpos séricos mediante los métodos habituales.

Los anticuerpos policlonales contra las proteínas de la presente invención se pueden preparar de la siguiente manera. Después de verificar que el nivel deseado de anticuerpos séricos se ha alcanzado, se saca sangre al mamífero sensibilizado con el antígeno. Se aísla el suero de esta sangre usando los métodos convencionales. El suero con el anticuerpo policlonal se puede usar como el anticuerpo policlonal, o según las necesidades, la fracción con anticuerpos policlonal además se puede aislar del suero. Por ejemplo, una fracción de anticuerpos que reconocen específicamente la proteína de la invención se pueden preparar mediante el uso de una columna de afinidad a la que está acoplada la proteína. Entonces, la fracción además se puede purificar usando una columna de proteína A o proteína G para preparar la inmunoglobulina G o M.

Para obtener anticuerpos monoclonales, una vez se ha verificado que se ha alcanzado el nivel deseado de anticuerpos séricos en el mamífero sensibilizado con el antígeno descrito más arriba, se cogen los inmunocitos del mamífero y se usan para la fusión celular. Con este propósito, se pueden mencionar los esplenocitos como los inmunocitos preferibles. Como células originales fusionadas con dichos inmunocitos, se usan preferentemente las células de mieloma de mamíferos. Más preferiblemente, las células de mieloma que han adquirido la característica, la cual se puede usar para distinguir las células de fusión mediante agentes, se usan como células originales.

La fusión celular entre dichos inmunocitos y células de mieloma se puede controlar según los métodos conocidos, por ejemplo, el método de Milstein et al. (Galfre, G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

El hibridoma que se obtiene de la fusión celular se selecciona haciendo el cultivo de las células en un medio seleccionado habitual, por ejemplo, el medio de cultivo HAT (medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Se continua el cultivo en este medio HAT durante el periodo suficiente para las células (células de no fusión) a parte del deterioro del hibridoma objetivo, normalmente de unos días a pocas semanas. Entonces, se lleva a cabo el método de dilución límite habitual y se criba y clona el hibridoma que produce el anticuerpo objetivo.

Aparte de dicho método para obtener hibridomas, mediante la inmunización de un animal diferente de los humanos con un antígeno, se puede obtener un hibridoma que produce los anticuerpos humanos objetivo con la actividad para unirse a las proteínas mediante el método de sensibilización de linfocitos humanos, por ejemplo, los linfocitos humanos infectados con el virus EB, con proteínas, las células que expresan las proteínas o sus lisados in vitro y fusionando los linfocitos sensibilizados con las células de mieloma derivadas de humanos, por ejemplo U266, con una capacidad permanente de división celular (Solicitud de patente Japonesa publicada no revisada (JP-A) Núm. Sho 63-17688).

Los anticuerpos monoclonales conseguidos mediante el transplante de los hibridomas obtenidos en la cavidad abdominal de un ratón y mediante la extracción de ascitis se puede purificar con, por ejemplo, una precipitación de sulfato de amonio, una columna de proteína A o G, cromatografía de intercambio iónico en DEAE, una columna de afinidad a la que está acoplada la proteína de la presente invención, etcétera. Un anticuerpo de la presente invención se puede usar para la purificación o detección de una proteína de dicha invención y también puede ser un candidato como agonista o antagonista de una proteína de la presente invención. Además, es posible usar dicho anticuerpo en el tratamiento de anticuerpos para las enfermedades donde la proteína está implicada. Para administrarlos al cuerpo humano (tratamiento de anticuerpos), normalmente se usan anticuerpos humanos o anticuerpos humanizados por su inmunogenicidad reducida.

Por ejemplo, un anticuerpo humano contra una proteína se puede obtener usando hibridomas hechos mediante la fusión de células mieloma con células productoras de anticuerpos que se obtienen mediante la inmunización de un animal transgénico con un repertorio de genes de anticuerpos humanos con un antígeno como proteína, células que expresan proteínas o lisados del mismo (véase WO92-03918, WO93-2227, WO94-02602, WO94-25585, WO96-33735 y WO96-34096).

A parte de usar el hibridoma para la producción de anticuerpos también se pueden usar los inmunocitos que producen anticuerpos, como los linfocitos sensibilizados que son inmortalizados con oncogenes.

Dichos anticuerpos monoclonales también se pueden obtener como anticuerpos recombinantes producidos mediante el uso de la técnica de ingeniería genética (véase, por ejemplo, Borrebaeck C.A.K y Larrick, J.W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERES LTD (1990)). Los anticuerpos recombinantes se producen al clonar el DNA codificante de los inmunocitos, como el hibridoma o los linfocitos sensibilizados que producen anticuerpos, incorporándolo a un vector adecuado e introduciendo este vector en un huésped para producir el anticuerpo. La presente invención también abarca dichos anticuerpos recombinantes.

Además, el anticuerpo de la presente invención puede ser un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo modificado, siempre y cuando se una a una proteína de la invención. Por ejemplo: Fab, F (ab')2, Fv o Fv de cadena sencilla (scFv), en el que la cadena Fv H y la cadena Fv L están unidas adecuadamente por un enlazante (Houston J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883 (1988)), pueden proporcionarse como fragmentos de anticuerpos. De una manera específica los fragmentos de anticuerpo son generados mediante el tratamiento de anticuerpos con enzimas, como por ejemplo papaína o pepsina. Alternativamente, pueden ser generadas al construir un gen que codifique para un fragmento de anticuerpo, introducirlo en un vector de expresión y expresar este vector en las células huésped adecuadas (véase por ejemplo, Co. M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A.H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R.E. and Walter, B.W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

Es posible utilizar anticuerpos unidos a varias moléculas, por ejemplo el polietilenglicol (PEG), como anticuerpos modificados. Los anticuerpos de la presente invención engloban también a estos anticuerpos modificados. Para la obtención de estos últimos es necesario realizar unas modificaciones químicas en el anticuerpo obtenido mediante los métodos convencionales ya establecidos.

Se puede obtener utilizando métodos convencionales un anticuerpo de la presente invención en forma de anticuerpo quimérico, que comprende una región variable derivada de anticuerpo no humano y una región constante derivada de anticuerpo humano, o en forma de anticuerpo humanizado que comprende una región determinante de complementariedad derivada de anticuerpo no humano (CDR), una región armazón derivada de anticuerpo humano (FR) y una región constante derivada de anticuerpo humano.

Los anticuerpos así obtenidos pueden ser purificados hasta la uniformidad. Los métodos de separación y purificación utilizados en la presente invención para separar y purificar el anticuerpo pueden ser cualquier método de los empleados para las proteínas. Se pueden seleccionar adecuadamente y combinar para este fin, sin que la invención esté limitada a ellos, los siguientes métodos: cromatografía en columna (como la cromatografía de afinidad), filtración, ultrafiltración, desalado, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, isoelectroenfoque y otros (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). La concentración del anticuerpo antes mencionado se puede analizar midiendo la absorbancia o mediante el análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), etcétera.

La columna de Proteína A o de Proteína G son útiles en la cromatografía de afinidad. Ejemplos de la columna de Proteína A son Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia), etcétera.

También es posible emplear una cromatografía diferente como por ejemplo la cromatografía de intercambio de iones, cromatografía hidrofóbica, filtración sobre gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Estas cromatografías pueden realizarse por cromatografía líquida como HPLC, FPLC y otras.

Algunos ejemplos de métodos de análisis de la actividad de unión antigénica de los anticuerpos de la invención incluyen la medición de la absorbancia, el análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), el enzimoinmunoensayo (EIA), el radioinmunoensayo (RIA) y/o la inmunofluorescencia. Por ejemplo, cuando se usa ELISA se añade una proteína de la invención a una placa recubierta con los anticuerpos de la presente invención; luego se añade la muestra de anticuerpo objetivo, por ejemplo los sobrenadantes del cultivo de las células productoras de anticuerpos, o bien anticuerpos purificados. Entonces se añade el anticuerpo secundario que reconoce al anticuerpo primario, marcado con fosfatasa alcalina y otras enzimas del mismo tipo, se incuba la placa, se lava y, tras añadir un sustrato enzimático como el p-nitrofenil fosfato, se mide la absorbancia para evaluar la actividad de unión antigénica. A modo de proteína se puede utilizar un fragmento de proteína, como por ejemplo un fragmento que contenga un C-terminal o un fragmento que contenga un N-terminal. Para evaluar la actividad del anticuerpo de la invención es posible utilizar BIAcore (Pharmacia).

Al utilizar estos métodos entran en contacto el anticuerpo de la invención y una muestra que se supone contiene una proteína de la invención; entonces se detecta o analiza dicha proteína mediante la detección o el análisis del inmunocomplejo formado entre el anticuerpo mencionado y la proteína.

Un método para detectar o analizar una proteína de la invención tiene utilidad para varios experimentos en los que se usan proteínas puesto que es capaz de detectar o analizar las proteínas de una manera específica.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un polinucleótido antisentido complementario a un DNA que contenga por lo menos 15 nucleótidos de ID. de SEC. núm.: 1, 3, 5, 7 o 9.

Aquí el término "cadena complementaria" se define como una cadena de un polinucleótido de doble cadena compuesta por pares de bases A:T y G:C complementarias a la otra cadena. También "complementario" viene definido como no solo aquellas que concuerdan exactamente con una región continua de al menos 15 nucleótidos sino también aquellas que presentan una homología en dicha región de por lo menos el 70%, preferiblemente del 80%, más preferiblemente del 90% o lo más preferiblemente del 95% o mayor. La homología puede determinarse a través del algoritmo que aquí se describe.

En estos polinucleótidos se incluyen sondas y cebadores para la detección o amplificación del DNA que codifica para una proteína de la invención, o bien un nucleótido o derivado de nucleótido para la supresión de la expresión proteica (como un oligonucleótido antisentido o una ribozima). Otra utilidad de dichos polinucleótidos es en la preparación de biochips o chips de DNA.

Los oligonucleótidos antisentido que hibridan con una porción de la secuencia nucleotídica de cualquiera de ID. de SEC. núm.: 1, 3, 5, 7 y 9 también están incluidos en los oligonucleótidos antisentido de la presente invención. Estos están dirigidos preferiblemente contra una secuencia que contenga por lo menos 15 nucleótidos continuos comprendidos en cualquiera de las secuencias nucleotídicas de ID. de SEC. núm.: 1, 3, 5, 7 y 9. Más preferiblemente se trata del oligonucleótido antisentido dirigido contra por lo menos 15 nucleótidos continuos que contengan un codón de iniciación de traducción.

En lugar de oligonucleótidos antisentido es posible utilizar derivados o productos modificados de oligonucleótidos antisentido. Algunos ejemplos de tales productos modificados incluyen, por ejemplo, modificaciones de alquil fosfonato inferior como las de tipo metil-fosfonato o las de tipo etil-fosfonato, modificaciones fosforotioato, modificaciones fosforoamidato y otras.

El término "oligonucleótido antisentido" utilizado aquí no solo se refiere a aquellos en los que los nucleótidos que corresponden con aquellos que constituyen una región específica de un DNA o mRNA son completamente complementarios, sino también aquellos que presentan un desemparejamiento uno o más nucleótidos siempre y cuando el DNA o el mRNA y el oligonucleótido puedan hibridar de manera específica con la secuencia nucleotídica de ID. de SEC. núm.: 1, 3, 5, 7 o 9.

Los derivados de oligonucleótidos antisentido de la presente invención actúan sobre las células produciendo una proteína de la invención al unirse al DNA o mRNA que codifica para la proteína y así poder inhibir su trascripción o traducción, y poder promover la degradación del mRNA a la vez que tener un efecto de supresión de la función de la proteína de la invención al suprimir la expresión de dicha proteína.

Un derivado de oligonucleótido antisentido de la presente invención se puede generar en una preparación externa, como un linimento o una cataplasma, al mezclarlo con un material de base adecuado que sea inactivo respecto a los derivados.

En función de las necesidades, los derivados pueden formularse en comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas, cápsulas de liposomas, inyecciones, soluciones, gotas nasales, agentes de congelación en seco y demás mediante la adición de excipientes, agentes isotónicos, agentes solubilizantes, estabilizantes, conservantes, analgésicos y otros. Pueden prepararse según métodos convencionales.

Un derivado de oligonucleótido antisentido se le administra al paciente aplicándolo directamente sobre el lugar afectado, mediante inyección directa en el vaso sanguíneo u otros sistemas, de manera que llegue al lugar afectado. También puede usarse un medio de montaje antisentido para aumentar la durabilidad y la permeabilidad de membrana; algunos ejemplos son liposoma, poli-L-lisina, lípido, colesterol, lipofectina o derivados de ellos.

La dosificación del derivado de oligonucleótido antisentido de la presente invención se puede ajustar correctamente de acuerdo con la enfermedad del paciente y se puede utilizar en las cantidades deseadas. Un ejemplo de administración es una dosis en el rango de 0,1 a 100 mg/kg, preferiblemente de 0,1 a 50 mg/kg.

El oligonucleótido antisentido de la presente invención sirve para inhibir la expresión de la proteína de la invención y, por lo tanto, sirve para suprimir la actividad biológica de las proteínas de la invención. Además, los inhibidores de expresión que contienen el oligonucleótido antisentido de la invención son útiles debido a su capacidad para suprimir la actividad biológica de las proteínas de la invención.

Las proteínas de esta invención son útiles para el cribaje de los compuestos que se unen a la proteína. Es decir, las proteínas se usan en un método de cribaje para los compuestos que se unen a las proteínas de esta invención; donde el método pone las proteínas de esta invención en contacto con una muestra de prueba que se espera que contenga un compuesto que puede unirse a las proteínas y selecciona el compuesto con la actividad de unirse a las proteínas de la invención.

Las proteínas de esta invención para usar en el cribaje de la invención pueden ser cualquiera de los péptidos parciales, naturales o recombinantes. También, pueden aparecer en la superficie de la célula o en las fracciones membranosas en forma de proteínas expresadas. Las muestras de prueba que se pueden usar en el método de cribaje de la presente invención son entre otras, por ejemplo, extractos celulares, sobrenadantes de cultivos celulares, productos de fermentación microbiana, extractos de organismos marinos, extractos de plantas, proteínas parcial o totalmente purificadas, péptidos, compuestos no péptidos, compuestos moleculares inferiores sintéticos o compuestos naturales. Las proteínas de esta invención se puede exponer a la muestra como proteínas purificadas o solubles, en una forma ligada a un portador, como proteínas fusionadas con otra proteína, en una forma expresada en la superficie celular o como fracciones membranosas.

Una proteína de la presente invención se puede usar para hacer el cribaje para otras proteínas que se unen a la proteína diana (como los ligandos) mediante el uso de una variedad de métodos conocidos por los especialistas en el campo. Estos procesos de cribaje se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante el método de inmunoprecipitación. En concreto, el método se puede llevar a cabo de la siguiente manera. El gen que codifica una proteína de la presente invención se expresa mediante la inserción del gen dentro de un vector de expresión para expresiones génicas extrañas como pSV2neo, pcDNA I, pCD8 y otras, y mediante la expresión del gen en células animales, etcétera. Cualquier promotor que se use de forma general se puede emplear para la expresión, incluyendo el promotor temprano del SV40 (Rigby in Williamson (ed.), Genetic engineering, Vol. 3. Academic Press, Londres, pág. 83-141 (1982)), el promotor del EF-1\alpha (kim et al., Gene 91, pág. 217-223 (1990)), el promotor de CAG (Niwa et al. Gene 108, pág. 193-200 (1991)), el promotor de LTR RSV (Cullen Methods in Enzymology 152, pág. 684-704 (1987)), el promotor de SR\alpha (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8, pág. 466 (1988), el promotor temprano inmediato de CMV (Seed an Aruffo Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, pág. 3365-3369 (1987)), el promotor tardío de SV40 (Gheysen y Fiers J. Mol. Appl. Genet. 1, pág. 385-394 (1982)), el promotor tardío de adenovirus (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 9, pág. 946 (1989)), el promotor de TK HSV, etcétera.

La transferencia de un gen extraño dentro de células animales para su expresión se puede realizar con cualquiera de los siguientes métodos, incluyendo el método de electroporación (Chu, G. et al. Nucl. Acid Res. 15, 1311-1326 (1987)), el método de fosfato cálcico (Chen, c y Okayama, H. Mol Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987)), el método del dextrano DEAE (Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717 (1984); Sussman, D. J. y Milman, G. Mol. Cell. Bio. 4, 1642-1643 (1985)), el método de lipofectina (Derijard, B. Cell 7 1025-1037 (1994); Lamb, B. T. et al. Nature Genetics 5, 22-30 (1993); Rabindran, S. K et al. Science 259, 230-234 (1993)), etcétera. Una proteína de la presente invención se puede expresar como una proteína de fusión con un sitio de reconocimiento (epítopo) para un anticuerpo monoclonal mediante la introducción de un sitio de reconocimiento (epítopo) para un anticuerpo monoclonal, la especificidad del cual se ha establecido, en un N- o C- terminal de la proteína de la presente invención. Para esto, se puede usar un sistema de anticuerpos-epítopos comercial (Experimental medicine 13, 85-90 (1995)). Los vectores, que están disponibles a nivel comercial, tienen la capacidad de expresar las proteínas de fusión con \beta-galactosidasa, proteína de unión de maltosa, glutación S-transferasa, proteína verde fluorescente (GFP), etcétera, a través del sitio de multiclonaje.

Para minimizar la alteración de las propiedades de una proteína de esta invención que surge de la formación en una proteína de fusión, una proteína de fusión se puede preparar mediante la introducción de solo una porción de epítopo pequeña con varios, hasta diez aminoácidos tal y como se cita en la literatura. Por ejemplo, los epítopos de polihistidina (His-tag), HA agregado del virus de la gripe, c-myc humano, FLAG, glicoproteína (VSV-GP) del virus de estomatitis vesicular, proteína (T7-tag) 10 de gen T7, glicoproteína (HSV-tag) del virus de herpes simple humano, E-tag (epítopo en el fago monoclonal), etcétera; y anticuerpos monoclonales para reconocer esto epítopos se pueden usar como el sistema de anticuerpos de epítopos para el cribaje de las proteínas que se unen a la proteína de la presente invención (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)).

En la inmunoprecipitación, los inmunocomplejos se forman al añadir estos anticuerpos al lisado celular que se prepara usando detergentes adecuados. Este inmunocomplejo está formado por una proteína de la presente invención, una proteína capaz de unirse a la proteína y un anticuerpo. La inmunoprecipitación también se puede llevar a cabo usando un anticuerpo contra una proteína de la presente invención, además de los anticuerpos contra los anteriores epítopos. La preparación de un anticuerpo contra la proteína de la presente invención puede realizarse por ejemplo mediante la inserción de un gen que codifique para una proteína de la presente invención en un vector de expresión E. coli, la purificación de la proteína expresada y la inmunización de conejos, ratones, ratas, cabras, pollos y demás con la proteína purificada. También se puede preparar inmunizando a los animales descritos con péptidos que forman parte de la proteína de la presente invención.

Es posible precipitar los inmunocomplejos utilizando por ejemplo Proteína A Sefarosa o Proteína G Sefarosa en el caso en que el anticuerpo es un anticuerpo IgG de ratón. En el caso de que la proteína de la presente invención se haya preparado como una proteína de fusión con el epítopo de, por ejemplo, GST y otros parecidos, el inmunocomplejo se puede formar utilizando una sustancia que se una específicamente a estos epítopos como es la glutatión-Sefarosa 4B y otras dando el mismo resultado que en el caso en el que se use el anticuerpo para la proteína de la presente invención.

Generalmente la inmunoprecipitación se puede realizar siguiendo, o según, el método descrito en la bibliografía por ejemplo (Harlow, E. and Lane, D.: Antibodies pp. 511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)).

En los análisis de inmunoprecipitación generalmente se utiliza la SDS-PAGE y las proteínas unidas se pueden analizar basándose en su peso molecular y utilizando un gel de una concentración adecuada. En este caso, aunque las proteínas unidas a una proteína de la presente invención normalmente son difícilmente detectables mediante los métodos de tinción habituales (como la tinción Coomassie o la tinción de plata), es posible mejorar la sensibilidad de detección mediante el cultivo de células en un medio de cultivo con metionina-S^{35} y cisteína-S^{35} marcadas con un isótopo radiactivo para marcar las proteínas del interior de las células y así poder detectarlas. Una vez determinado su peso molecular la proteína podrá ser purificada directamente a partir del gel de poliacrilamida con SDS y secuenciada.

Además también se puede llevar a cabo el aislamiento de las proteínas unidas a la proteína de la presente invención utilizando por ejemplo el análisis West-western blotting (Skolnik, E. Y. et al., Cell (1991) 65, 83-90). De una manera específica la construcción de una biblioteca de cDNA se realiza a partir de células, tejidos y órganos en los que la proteína unida a la proteína de la presente invención se espera que se exprese al utilizar vectores fágicos (como son \lambdagt11 y ZAP). Las proteínas expresadas en LB-agarosa se fijan en un filtro que luego reaccionará con una proteína de la presente invención purificada y marcada y se podrá detectar a través del marcador las proteínas unidas a la proteína de la presente invención expresadas en las calvas. Algunos métodos para marcar una proteína de la invención incluyen el uso de la unión de la biotina y la avidina, el uso de anticuerpos de unión específica a la proteína de la presente invención o de péptidos o polipéptidos (como GST y otros) fusionados con la proteína de la presente invención y el uso de radioisótopos y fluorescencia o similares.

Aún más, otra realización para el método de cribaje de la presente invención viene ejemplificada por un método que usa el sistema del doble híbrido con células (Fields, S. and Sternglanz, R., Trends Genet. 10, 286-292 (1994); Dalton, s. and Treisman, R. (1992) "Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element." Cell 68, 597-612; "MATCHMAKER Two-hybrid System", "Mammalian MATCHMAKER Two-hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid System" (todos de Clontech); "HybriZAP Two-hybrid Vector System" (Stratagene)). En el sistema del doble híbrido es posible fusionar una proteína de esta invención con el dominio de unión a DNA de SRF o GAL4, y expresar la proteína en células de levadura. Una biblioteca de cDNA se construye a partir de células que expresarán proteínas de unión a la proteína de esta invención de manera que dichas proteínas se expresarán como proteínas de fusión con regiones de activación de la trascripción de VP16 o GAL4. Entonces se transfecta la biblioteca de cDNA en las mencionadas células de levadura y luego se detectan los clones positivos para aislar el cDNA derivado de la biblioteca (p. ej. la expresión de una proteína de unión a la proteína de la presente invención en células de levadura conlleva la unión de las dos proteínas y la posterior activación del gen indicador lo cual permite la detección de los clones positivos). La proteína codificada por el cDNA aislado se puede obtener introduciendo el cDNA en E. coli y expresándola allí mismo. Entonces es posible preparar proteínas de unión a una proteína de esta invención y los genes que las codifican. El gen indicador a utilizar en el sistema del doble híbrido puede ser cualquier gen apropiado como sería el gen HIS3, el gen Ade2, el gen LacZ, el gen CAT, el gen de la luciferasa o el gen del inhibidor del activador de plasminógeno de tipo 1 (PAI-1), aunque no exclusivamente.

Otra técnica para analizar los compuestos que se unen a una proteína de la presente invención es la cromatografía de afinidad. Se inmoviliza una proteína de la invención en un transportador de la columna de cromatografía de afinidad a la que se le aplica una muestra de ensayo de la que se espera que exprese una proteína de unión a la proteína de la invención. Las muestras pueden ser extractos celulares o lisados celulares, por ejemplo. Después de cargar la muestra de ensayo, se lava la columna, y es posible obtener las proteínas que se unen a la proteína de la invención.

Estas proteínas obtenidas pueden ser analizadas en busca de su secuencia de aminoácidos para sintetizar sondas oligonucleotídicas que podrán utilizarse para analizar una biblioteca de cDNA y así obtener un DNA que codifica para la proteína.

Para detectar o medir el compuesto unido hay la posibilidad de usar un biosensor que utilice el fenómeno de resonancia del plasmon de superficie. Este tipo de biosensores (por ejemplo BIAcore (Pharmacia)) son capaces de proporcionar la observación de la interacción en tiempo real utilizando una pequeña cantidad de proteína sin necesidad de marcaje. Por lo tanto, es posible seguir la interacción entre la proteína de la invención y los compuestos de ensayo utilizando biosensores como el BIAcore.

Además, los compuestos que se unen a la proteína de la invención (agonistas y antagonistas incluidos), que no siempre son proteínas, pueden aislarse mediante una serie de métodos conocidos por los expertos. Por ejemplo, la proteína de la invención puede fijarse y exponerse a compuestos sintéticos, a un banco de sustancias naturales o a una biblioteca aleatoria de exposición de péptidos fágicos con el fin de buscar moléculas de unión a la proteína. También es posible utilizar un cribado de alto rendimiento (HTS) con técnicas de química combinatoria (Wrighton, N.C.; Farrel, F.X.; Chang, R.; Kashyap, A.K.; Barbone, F.P.; Mulcahy, L.S.; Johnson, D.L.; Barret, R.W.; Jolliffe, L.K.; Dower, W.J., "Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietine", Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64; Verdine, G.L., "The combinatorial chemistry of nature." Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p11-13; Hogan, J.C. Jr., "Directed combinatorial chemistry." Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p17-9).

La detección de un ligando de unión a una proteína de la invención se puede realizar de la siguiente manera. El dominio extracelular de una proteína de la invención es fusionado con el dominio intracelular que incluye un dominio transmembrana de una proteína del receptor de la hematopoyetina que posee una capacidad conocida de transducción de señal para preparar un receptor quimérico. El receptor quimérico puede expresarse en la superficie celular de una línea celular adecuada, preferiblemente una línea celular que pueda sobrevivir y proliferar solo en presencia de un factor de crecimiento proliferativo (línea celular dependiente de factor de crecimiento). Entonces se puede cultivar dicha línea celular en un medio complementado con un material de muestra en el que se pueden expresar una variedad de factores de crecimiento, citocinas o factores hematopoyéticos. Según este método la línea celular dependiente de factor de crecimiento solamente puede sobrevivir y proliferar cuando la muestra contiene un ligando adecuado de unión específica al dominio extracelular de la proteína de la invención. Es posible usar los receptores de hematopoyetina conocidos, como son el receptor de trombopoyetina, el de eritropoyetina, el de G-CSF, el de gp130 y otros. El compañero en la construcción de un receptor quimérico para el sistema de detección de la invención no está limitado a los receptores anteriormente descritos siempre y cuando su dominio intracelular proporcione una estructura necesaria para la actividad de transducción de señal. La línea celular dependiente de factor de crecimiento podría ser una línea celular dependiente de IL-3 como son BaF3 o FDC-P1.

En un caso inusual, el ligando de unión específica a una proteína de la invención podría no ser una proteína soluble sino una proteína de unión a membrana. En este caso la detección se debe realizar usando una proteína que solo contenga el dominio extracelular de la proteína de la invención o bien una proteína de fusión en la que el dominio extracelular esté adherido a una parte de otras proteínas solubles. Estas proteínas tienen que ser marcadas antes de poder utilizarlas en la medición de la unión con las células que se espera expresen el ligando. La primera proteína, la que contiene solo el dominio extracelular, puede ser una proteína soluble de receptor generada artificialmente a través de la introducción de un codón finalizador en el lado N-terminal del dominio transmembrana, o bien una proteína soluble como NR12-1. La segunda proteína, la de fusión, puede ser una proteína en la que la región Fc de la inmunoglobulina o el péptido FLAG se encuentren adheridos a la región C-terminal del dominio extracelular. Estas proteínas solubles marcadas también pueden ser útiles en la detección mediante el método antes descrito de West-western blotting.

Una proteína quimérica del dominio extracelular de una proteína de la presente invención y la región Fc de un anticuerpo (como el anticuerpo IgG humano) se pueden purificar mediante una columna de Proteína A, etcétera. Una proteína quimérica tipo anticuerpo como ésta mantiene su actividad de unión al ligando. Por eso se podrá marcar la proteína adecuadamente con un isótopo, por ejemplo, y usarla para la detección de un ligando (Suda, T. et al., Cell, 175, 1169-1178 (1993)). Algunas citocinas, como las moléculas de la familia TNF, primero existen en una forma de unión a membrana, por lo tanto dichos ligandos se pueden aislar al exponer la proteína quimérica similar a un anticuerpo a distintas células y seleccionar las células según la actividad de unión a la proteína. De forma alternativa, se pueden aislar los ligandos según el mismo método mediante el uso de células a las que se ha introducido una biblioteca de cDNA. Además, la proteína quimérica parecida a un anticuerpo también se puede usar como antagonis-
ta.

El compuesto aislado con el anterior cribaje puede ser un candidato para los medicamentos que activan o inhiben la actividad de una proteína de esta invención. Es posible aplicar dichos compuestos para el tratamiento de la enfermedad que aparece a causa de una expresión aberrante o una alteración funcional de una proteína de la presente invención. El compuesto que se ha obtenido al usar el método de cribaje de la invención incluye los compuestos resultantes de la modificación del compuesto con la actividad para unirse a la proteína de la invención al añadir, eliminar y reemplazar una parte de la estructura.

Cuando se usa el compuesto aislado o una proteína de la presente invención (tipo señuelo (forma soluble)) como una forma farmacéutica para humanos y otros mamíferos, por ejemplo, ratones, ratas, cobayas, conejos, pollos, gatos, perros, ovejas, cerdos, bovinos, monos, papiones sagrados y chimpancés, el compuesto aislado se puede administrar de forma directa o se puede formular en forma de dosis usando los métodos de preparación farmacéutica conocidos. Por ejemplo, según las necesidades, los compuestos farmacéuticos se pueden tomar de forma oral, como comprimidos cubiertos de azúcar, cápsulas, microcápsulas y elixires; o de forma parenteral, como inyecciones de soluciones estériles, suspensiones con agua o cualquier otro líquido aceptado farmacéuticamente. Por ejemplo, los compuestos se pueden mezclar con un portador o medio aceptado farmacológicamente, en concreto, agua esterilizada, una solución salina fisiológica, aceite de plantas, emulsionante, agente de suspensión, surfactantes, estabilizantes, agentes aromatizantes, excipientes, vehículos y aglomerantes y conservantes, en forma de dosis unitaria que requiere la implementación de un medicamento aceptado de forma general. La cantidad de ingrediente activo en estas preparaciones hace una dosis adecuada que se puede obtener dentro del rango indicado.

Algunos ejemplos de aditivos que se pueden mezclar en los comprimidos y las cápsulas son los siguientes: aglomerantes, como la gelatina, almidón de maíz, goma adragante y goma arábica; excipientes, como celulosa cristalina; agentes de inflamiento, como almidón de maíz, gelatina y ácido algínico; lubricantes, como es estearato magnésico; y endulzantes, como sacarosa, lactosa o sacarina; agentes aromatizantes, como menta, aceite de Gaultheria adenothrix y cereza. Cuando la forma de dosis unitaria es una cápsula, un portador líquido, como el aceite, también se puede introducir en los anteriores ingredientes. Los compuestos estériles para las inyecciones se pueden formular siguiendo las implementaciones de medicamentos normales, mediante el uso de vehículos como el agua destilada usada para las inyecciones.

Por ejemplo, la solución salina fisiológica, la glucosa y otros líquidos isotónicos, incluyendo los adyuvantes, como el D-Sorbitol, la D-manosa, el D-manitol y el cloruro sódico, se pueden usar como soluciones acuosas para las inyecciones. Estas se pueden usar en conjunto con los solubilizantes, como el alcohol, el etanol específico, los polialcoholes como el propilenglicol y el polietilenglicol de; y los tensioactivos no iónicos, como el polisorbato 80 (TM) y
HCO-50.

El aceite de sésamo o el aceite de soja se pueden usar como líquidos oleaginosos y se pueden usar conjuntamente con el benzoato de bencilo y el alcohol de bencilo como solubilizantes; se pueden formular con un tampón como un tampón de fosfato y un tampón de acetato sódico; y se pueden usar junto con un calmante como el clorhidrato de procaína, un estabilizador como el alcohol de bencilo y el fenol y un antioxidante. La inyección preparada se rellena dentro de una ampolla adecuada.

Los métodos que conocen bien los expertos en el tema se usarán para administrar los compuestos farmacéuticos a los pacientes, por ejemplo como intraarteriales, intravenosos, inyecciones percutáneas y también como administraciones intranasales, transbronquiales, intramusculares u orales. La dosificación varia según el peso y la edad del paciente, el método de administración, etcétera, pero un experto en el tema puede escogerlos de forma adecuada. Si dicho compuesto se puede codificar con un DNA, dicho DNA se puede insertar dentro de un vector para una terapia génica para realizar la terapia. La dosificación y el método de administración pueden variar según el peso, la edad y los síntomas de un paciente, pero un experto en el tema puede escogerlos de forma adecuada.

Por ejemplo, la dosificación de la proteína de esta invención (forma señuelo (forma soluble)) puede variar dependiendo del paciente a administrar, el órgano diana, el síntoma y el método de administración. Sin embargo, se puede inyectar a un adulto normal (peso, 60 Kg) a una dosis de unos 100 \mug hasta 10-20 mg al día.

Por ejemplo, aunque existen algunas diferencias según los síntomas, la dosis de un compuesto que se une con una proteína de la presente invención o un compuesto que inhibe la actividad de la proteína de esta invención es normalmente de 0,1 mg hasta 100 mg al día, preferentemente de unos 1,0 mg hasta unos 50 mg al día, y aún más preferible de unos 1,0 mg hasta 20 mg al día, cuando es administrada de forma oral a un adulto normal (peso 60
Kg).

Cuando se administra una proteína de forma parenteral, como inyección, a un adulto normal (peso 60 Kg), aunque existen algunas diferencias según el paciente, el órgano diana, los síntomas y el método de administración, es conveniente inyectar de forma intravenosa una dosis de unos 0,01 mg hasta 30 mg al día, preferentemente de unos 0,1 mg hasta unos 20 mg al día y más preferible de unos 0,1 mg hasta unos 10 mg al día. También, en el caso de otros animales, es posible administrar la cantidad convertida a 60 Kg de peso corporal o a la superficie.

Descripción breve de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos parcial de AL109843 identificada en la base de datos de htgs. La secuencia de aminoácidos que se ha deducido se muestra bajo la secuencia de axón predicha. La secuencia de motivo YR y la de motivo WS que se utilizaron como dianas están dentro de los recuadros.

La figura 2 muestra las secuencias de nucleótidos parciales de NR12 encontradas en la secuencia de AL109843, y las de receptores de hematopoyetina conocidos con una homología a estos. Las secuencias de aminoácidos idénticas están en los recuadros y las secuencias de aminoácidos similares están sombreadas. Los espacios vacíos están subrayados. Los receptores de hematopoyetina conocidos son, desde la parte superior, gp130 humano, NR9 humano, receptor de prolactina humano, receptor de IL-7 humano y receptor de LIF humano.

La figura 3 muestra una fotografía que demuestra los resultados del análisis de PCR, que muestran los productos expresados que se han amplificado mediante 5'-RACE y 3'-RACE usando los cebadores de oligonucleótidos diseñados contra el exón de WS predicho dentro de la secuencia AL109843. Los productos específicos por PCR se muestran con las flechas.

La figura 4 muestra la secuencia nucleotídica del cDNA NR12.1 entera, que se obtuvo mediante la combinación de los productos 5'-RACE y 3'-RACE. También se muestra la secuencia de aminoácidos deducida codificada por NR12.1. La secuencia de aminoácidos que se ha predicho que será la señal de secreción está subrayada. Los residuos de cisteína conservados y las secuencias de aminoácidos del motivo YR y el motivo WS están encuadradas.

La figura 5 muestra la secuencia nucleotídica del cDNA NR12.2 entera, que se obtuvo mediante la combinación de los productos 5'-RACE y 3'-RACE. También se muestra la secuencia de aminoácidos codificada por NR12.2. La secuencia de señal de secreción predicha está subrayada. La región transmembranosa predicha está sombreada. Los residuos de cisteína conservados y las secuencias de aminoácidos del motivo YR y el motivo WS están encuadra-
das.

La figura 7 es la continuación de la figura 6.

La figura 8 muestra las fotografías que demuestran los resultados de los análisis RT-PCR de la distribución de expresión genética del NR12 en órganos humanos. La flecha indica la medida del producto de amplificación de PCR específico del NR12.

La Figura 9 muestra una fotografía que presenta los resultados de la cuantificación de la expresión del gen NR12 en órganos humanos mediante la técnica de Southern blotting. La flecha indica el tamaño de la señal específica de la NR12 detectada.

La Figura 10 es una ilustración esquemática de la estructura de la proteína de fusión NR12 que será expresada a partir del vector de expresión en la célula de mamífero.

La Figura 11 muestra la secuencia nucleotídica del cDNA completo de la NR12.4, obtenido al combinar los productos de 5'-RACE y 3'-RACE. También aparece la secuencia de aminoácidos codificada por la NR12.4. La señal de secreción predicha está subrayada. El residuo de cisteína conservado y las secuencias de aminoácidos del motivo YR y el motivo WS aparecen en un recuadro.

La Figura 12 es la continuación de la Figura 11.

La Figura 13 muestra la secuencia nucleotídica del cDNA completo de la NR12.5. También aparece la secuencia de aminoácidos codificada por la NR12.5. La señal de secreción predicha está subrayada. La secuencia transmembrana predicha aparece sombreada. El residuo de cisteína conservado en la región extracelular y las secuencias de aminoácidos del motivo YR y el motivo WS aparecen en un recuadro.

La Figura 14 es la continuación de la Figura 13.

El mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención va a explicarse en adelante en referencia a unos ejemplos sin estar limitada a ellos.

Ejemplo 1 Aislamiento del gen NR12 (1) Detección primaria mediante búsqueda TblastN

A pesar de que la secuenciación del genoma humano está promovida ampliamente por los proyectos sobre el genoma humano de institutos varios, la proporción de secuencias completamente acabadas del genoma humano en su totalidad no ha alcanzado ni el 10%. Sin embargo, la información proporcionada por los proyectos antes mencionados hasta el día de hoy se considera como un buen sistema para buscar genes diana, determinar secuencias nucleotídicas y mapear genes. La base de información de las secuencias mencionadas consiste en una gran cantidad de información proveniente de la unidad de cromosoma artificial bacteriano (BAC) y el cromosoma artificial de levadura (YAC) que persigue construir en un futuro una base de datos completa. Los inventores identificaron un gen humano que codificaba una parte de una nueva proteína del receptor de hematopoyetina a partir de una secuencia de un clon BAC en una de las bases de datos públicas, "High Throughput Genomic SECuence (htgs)" de GenBank.

Tal como se ha mencionado los inventores encontraron secuencias motivo conservadas en la familia de los receptores de hematopoyetina: el motivo (Tyr/His)-Xaa-(Hidrofóbico/Ala)-(Gln/Arg)-Hidrofóbico-Arg (motivo YR) en la región extracelular y el motivo Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (motivo WS) situado cerca del C-terminal. Sin embargo, es extremadamente difícil diseñar sondas oligonucleotídicas que incluyan exhaustivamente ambas secuencias de los motivos. Por lo tanto los inventores realizaron una búsqueda en bases de datos in silico usando secuencias parciales de aminoácidos del fragmento de proteínas del receptor de hematopoyetina conocido e incluyendo ambos motivos como búsqueda. Se examinó la fragmentación de las secuencias parciales de aminoácidos de posible uso como objeto de búsqueda utilizando los receptores humanos mostrados en la tabla 1 como la secuencia de receptores de hematopoyetina conocidos. De acuerdo con la estructura genómica de las secuencias de receptores de hematopoyetina conocidos, los exones que codifican para estos motivos YR y WS tenían una longitud de unos 50 a 70 aminoácidos, y el exón proximal al N-terminal (exón PP) también tenía una longitud aproximada de 50 a 70 aminoácidos. Por esta razón se cortó una secuencia que contenía ambos exones formada por unos 120 aminoácidos para preparar una secuencia de búsqueda a conveniencia. A pesar de que la longitud de la secuencia parcial de aminoácidos utilizada como secuencia de búsqueda variaba en función de cada receptor de hematopoyetina conocido, se conservaron las características esenciales de la estructura. A partir de todas las secuencias del receptor de hematopoyetina conocidas se extrajo una secuencia de búsqueda que oscila desde uno o más residuos de prolina situados cerca del sitio de iniciación en el exón PP hasta el residuo aminoacídico situado a unos 10 aminoácidos del C-terminal de la terminación del motivo WS del exón WS.

Los receptores de hematopoyetina conocidos utilizados como secuencias de búsqueda para la búsqueda en bases de datos se muestran en la tabla. Los residuos aminoacídicos conservados de entre las secuencias motivo se destacan en negrita y subrayados.

TABLA 1

Receptores humanos	Acceso de GenBank	Secuencia motivo YR	Secuencia motivo WS
LIF-R	NM_002310	\sneg{Y}TFRI\sneg{R}	\sneg{WS}K\sneg{WS}
gp130	NM_002184	\sneg{Y}VFRI\sneg{R}	\sneg{WD}D\sneg{WS}
IL-12R\beta1	NP_005526	QEFQL\sneg{R}	\sneg{WS}K\sneg{WS}
IL-12R\beta2	NM_001559	\sneg{Y}EFQIS	\sneg{WS}D\sneg{WS}
G-CSFR	NM_000760	\sneg{Y}TLQI\sneg{R}	\sneg{WS}D\sneg{WS}
EPO-R	M34986	\sneg{Y}TFAV\sneg{R}	\sneg{WS}A\sneg{WS}
TPO-R	M90103	\sneg{Y}RLQL\sneg{R}	\sneg{WS}S\sneg{WS}
Leptina-R	U50748	\sneg{Y}AVQV\sneg{R}	\sneg{WS}N\sneg{WS}
IL-3R\alpha	M74782	\sneg{Y}TVQI\sneg{R}	L\sneg{S}A\sneg{WS}
IL-4R	NM_000418	\sneg{Y}RARV\sneg{R}	\sneg{WS}E\sneg{WS}
IL-5R\alpha	M96651	\sneg{Y}DVQV\sneg{R}	\sneg{WS}E\sneg{WS}
IL-6R	NM_000565	HVVQL\sneg{R}	\sneg{WS}E\sneg{WS}

TABLA 1 (continuación)

Receptores humanos	Acceso de GenBank	Secuencia motivo YR	Secuencia motivo WS
IL-7R	NM_002185	\sneg{Y}EIKV\sneg{R}	\sneg{WS}E\sneg{WS}
IL-11R\alpha	U32324	HAVRVS	\sneg{WS}T\sneg{WS}
IL-13R\alpha	NM_001560	NTVRI\sneg{R}	\sneg{WS}N\sneg{WS}
IL-2R\beta	A28052	\sneg{Y}EFQV\sneg{R}	\sneg{WS}P\sneg{WS}
IL-2R\gamma	NM_000206	\sneg{Y}TFRV\sneg{R}	\sneg{WS}E\sneg{WS}
GM-CSFR	M64445	HSVKI\sneg{R}	\sneg{WS}S\sneg{WS}
CNTF-R	NM_001842	\sneg{Y}IIQVA	\sneg{WS}D\sneg{WS}
PRL-R	NM_000949	\sneg{Y}LVQV\sneg{R}	\sneg{WS}AWS
NR6 (CRLF1)	NM_004750	\sneg{Y}FVQV\sneg{R}	\sneg{WS}E\sneg{WS}
NR9 (CREME9)	AF120151	\sneg{Y}QFRVC	\sneg{WS}P\sneg{WS}

Las búsquedas aquí mostradas se utilizaron en el rastreo de la base de datos htgs en GenBank utilizando el programa TblastN (Advanced TblastN 2.0.9). Los valores por defecto (Esperado=100, Descripciones=250 y alineaciones=250) constituyeron los parámetros de la búsqueda. Como resultado la búsqueda dio lugar a muchos clones positivos falsos y se excluyeron aquellos clones en los que tanto el motivo YR como el WS no estaban codificados en el mismo marco de lectura o aquellos que contenían un codón finalizador entre los dos motivos. También se excluyeron los clones que contenían solamente el motivo YR y no el WS porque, tal como se ha mencionado antes, el motivo YR no constituye una secuencia consenso completamente establecida. Por lo tanto se consideró predominante la conservación del motivo WS. Como resultado de la selección antes hecha se escogieron, de entre unos 1000 clones pseudopositivos obtenidos en la búsqueda TblastN, los clones positivos de la búsqueda primaria mostrada en la tabla 2.

Se seleccionaron aquellos clones positivos obtenidos en la búsqueda primaria frente a la base de datos htgs y que tenían una gran probabilidad de presentar la secuencia motivo diana, y Se muestran en la tabla. Los residuos aminoacídicos conservados se destacan en negrita con un subrayado en las secuencias motivo.

TABLA 2

Acceso GenBank	Secuencia motivo	Nota
\sneg{AC008048}	\sneg{WS}P\sneg{WS}	\sneg{IL-2R beta}
\sneg{AC007174}	\sneg{WS}E\sneg{WS}	\sneg{IL-5R}
AL031406	\sneg{WS}T\sneg{WS}	CH.22
AC003656	\sneg{WS}G\sneg{WS}	CH.21
AC008663	\sneg{WS}K\sneg{WS}	CH.5
AC008614	\sneg{WS}G\sneg{WS}	CH.5
AC008532	\sneg{WS}G\sneg{WS}	CH.19
AC009267	\sneg{WS}T\sneg{WS}	CH.18
AC007596	\sneg{WS}S\sneg{WS}	CH.16
AC007227	\sneg{W}GE\sneg{WS}	CH.16
AL031123	\sneg{WS}D\sneg{W}A	CH.6

TABLA 2 (continuación)

Acceso GenBank	Secuencia motivo	Nota
AC005911	WGEWS	CH.12
AL096870	\sneg{WS}N\sneg{W}K	CH.14
Z97201	\sneg{WS}N\sneg{W}K	CH.12
AC007902	\sneg{WS}G\sneg{WS}	CH.18
AC008536	\sneg{WS}M\sneg{WS}	CH.5
AC006167	\sneg{WS}G\sneg{WS}	CH.10
AC004846	\sneg{WS}Q\sneg{WS}	Ninguno
\sneg{AL109843}	\sneg{W}QP\sneg{WS}	\sneg{CH.1 (NR12)}
AC003656	\sneg{WS}E\sneg{W}G	CH.21
AC005143	T\sneg{S}G\sneg{WS}	CH.15
AL109743	\sneg{WS}G\sneg{WS}	CH.1
AC008403	\sneg{WS}A\sneg{WS}	CH.19
AL032818	\sneg{WS}G\sneg{WS}	CH.22
Z93017	\sneg{WS}G\sneg{WS}	CH.6
AC009456	\sneg{WS}R\sneg{WS}	CH.18
AC008427	\sneg{WS}EG\sneg{S}	CH.5
AC0096791	\sneg{WS}Q\sneg{WS}	CH.X

(2) Detección secundaria por búsqueda BlastX

El primer paso fue cortar, en cada uno de los 28 clones positivos de la búsqueda primaria TblastN mostrada en la tabla 2, secuencias nucleotídicas cercanas a la secuencia positiva en la secuencia de búsqueda de la búsqueda primaria. Se rastreó de nuevo la base de datos nr de GenBank con el programa BlastX (Advanced BlastX 2.0.9) utilizando como objeto de búsqueda las secuencias cortadas. La secuencia de búsqueda era una secuencia nucleotídica con un total de 240 pb que convenientemente contenía la secuencia aproximadamente a unos 200 pb en dirección 5' de la secuencia que podría codificar el motivo WS. Ya que el exón que codifica para el motivo WS era tan corto como de unos 50 a 70 aminoácidos de la estructura genómica de los receptores de hematopoyetina conocidos, tal como se ha mencionado antes, entonces se esperaba que la secuencia de búsqueda preparada de 240 pb cubriese al exón suficientemente. En la búsqueda BlastX se utilizó el valor "Esperado=100, Descripciones=100 y alineaciones=100, filtro=defecto". Se esperaba que los clones positivos que mostrasen al menos una homología con numerosos receptores de hematopoyetina conocidos diferentes serían seleccionados como clones positivos de la búsqueda secundaria que codificaban para los miembros de la familia de los receptores de hematopoyetina de entre los clones positivos de la búsqueda secundaria de acuerdo con la búsqueda.

Como resultado de la búsqueda Blast en dos pasos arriba explicada, se identificaron con éxito como clones positivos de la búsqueda secundaria tres clones (AC008048, Ac007174 y AL109843) de entre los clones del genoma humano mostrados en la tabla 2. Sin embargo, AC008048 y Ac007174 resultaron ser secuencias genómicas que codifican para la cadena beta del receptor de la IL-2 humana y para el receptor de la IL-5 humana, respectivamente. Se infirió que AL109843 codificaba para el receptor de hematopoyetina nuevo diana. Por lo tanto este clon se llamó NR12 y se determinó que aislaría el cDNA completo.

AL109843 es una versión de secuencia genómica derivada del cromosoma 1 humano presentada a la base de datos htgs el 16 de agosto de 1999 y que tiene una longitud de 149104 pb. Sin embargo, por el momento las secuencias nucleotídicas en las posiciones 10, aproximadamente 8000 pb en total, siguen sin determinar. Se podría predecir la existencia de un exón WS en la secuencia de AL109843 la cual salió positiva en la búsqueda primaria TblastN como se muestra en la Figura 1. El motivo YR, la secuencia [YVFQVR], y el motivo WS, la secuencia [WQPWS], fueron reconocidos en la secuencia. En la Figura 2 se muestra la comparación entre la secuencia de aminoácidos de la NR12 y la secuencia del receptor de hematopoyetina conocido; ambas presentaron homología en la búsqueda secundaria BlastX. Utilizando este resultado se diseñaron cebadores oligonucleotídicos específicos en base a la secuencia del exón predicho en la secuencia AL109843, y estos cebadores se utilizaron en el método 5'-RACE y el método 3'-RACE, descritos más adelante.

(3) Diseño de los cebadores oligonucleotídicos

Tal como se ha descrito en el punto anterior los sitios del exón se predijeron en secuencias de AL109843 y se utilizaron para el diseño de los siguientes cebadores oligonucleotídicos específicos para la NR12. Se sintetizaron tres cebadores directos (NR12-S1, NR12-S2 y NR12-S3; orientados en dirección 3') y tres cebadores antisentido (NR12-A1, NR12-A2 y NR12-A3; orientados en dirección 5') utilizando el sintetizador ABI 394 DNA/RNA bajo la condición de añadir un grupo tritilo en el extremo 5'. Entonces se purificaron los productos mediante una columna OPC (ABI núm.: 400771) para la obtención de cebadores completos.

NR12-S1; 5' - GCA ACA GTC AGA ATT CTA GGA GCC -3' (ID. DE SEC. núm.: 11)

NR12-S2; 5' - CAT TAA GTA CGT ATT TCA AGT GAG ATG TC -3' (ID. DE SEC. núm.: 12)

NR12-S3; 5' - GGT ACT GGC AGC CTT GGA GTT CAC TG -3' (ID. DE SEC. núm.: 13)

NR12-A1; 5' - CAG TGA ACT CCA AGG CTG CCA GTA CC -3' (ID. DE SEC. núm.: 14)

NR12-A2; 5' - GAC ATC TCA CTT GAA ATA CGT ACT TAA TG -3' (ID. DE SEC. núm.: 15)

NR12-A3; 5' - GGC TCC AAG TAG ATT TCT GAC TGT TGC -3' (ID. DE SEC. núm.: 16)

Las siguientes parejas de cebadores oligonucleotidícos fueron diseñadas para tener secuencias completamente complementarias entre ellas: NR12-S1 y NR12-A3, NR12-S2 y NR12-A2 y, por último, NR12-S3 y NR12-A1.

(4) Clonación de cDNA N-terminal mediante el método 5'-RACE

Con el fin de aislar todo el cDNA de NR12 se realizó una 5'-RACE PCR utilizando el NR12-A1 de (3) para una PCR primaria y el NR12-A2 de (3) para una PCR secundaria, respectivamente. El experimento con PCR se realizó con la biblioteca de cDNA Marathon-Ready de hígado fetal humano (Clontech núm. 7403-1) como el molde y con la mezcla de polimerasa de cDNA Advantage (Clontech núm. 8417-1) en el ciclador térmico (Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400). Bajo las siguientes condiciones, como resultado, se obtuvieron resultados de PCR de dos tamaños diferentes, tal y como se muestra en la figura 3.

Las condiciones de la PCR primaria fueron las siguientes: 94ºC durante 4 minutos, 5 ciclos de "94ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 90 segundos", 5 ciclos de "94ºC durante 20 segundos, 70ºC durante 90 segundos", 28 ciclos de "94ºC durante 20 segundos, 68ºC durante 90 segundos", 72ºC durante 3 minutos y finalizar a 4ºC.

Las condiciones de la PCR secundaria fueron las siguientes: 94ºC durante 4 minutos, 5 ciclos de "94ºC durante 20 segundos, 70ºC durante 90 segundos", 25 ciclos de "94ºC durante 20 segundos, 68ºC durante 90 segundos", 72ºC durante 3 minutos y finalizar a 4ºC.

Se obtuvieron dos productos de ampliación con la PCR y ambos se subclonaron en el vector pGEM-T Easy (Promega núm. A1360) y se determinaron las secuencias de nucleótidos. La transformación del producto de la PCR en el vector pGEM-T Easy se realizó mediante el uso de la ligasa T4 de DNA (Promega núm. 1360) en una reacción a 4ºC durante 12 horas. Los recombinantes de los productos de la PCR y del vector pGEM-T Easy se obtuvieron con la transformación de la cepa de E. coli DH5\alpha (Toyobo núm. DNA-903). Los recombinantes se seleccionaron usando el Insert Check Ready Blue (Toyobo núm. PIK-201). Las secuencias nucleotídicas se determinaron usando el BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI/Perkin Elmer núm. 4303154) y analizándolo con el Secuenciador de DNA 377 ABI PRISM. Se determinaron las secuencias nucleotídicas de todo el fragmento de inserción de 10 clones independientes. Por consiguiente, se separaron en dos grupos, uno formado por 4 clones con un tamaño de 1,3kb, y el otro formado por 6 clones con un tamaño de 1,0kb, basados en la longitud de los pares base y las diferencias en la secuencia. Sin embargo, se descubrió que los anteriores productos de la PCR 5'-RACE de 1,3kb eran productos no específicos de la amplificación de PCR. Esta secuencia se deriva de la banda menor mostrada en la figura 3. Por otro lado, los últimos productos de la PCR 5'-RACE de 1,0kb se reconocieron como secuencias nucleotídicas parciales de NR12 que fueron el resultado de una reacción de amplificación de PCR correcta.

(5) Clonación de cDNA C-terminal mediante el método 3'-RACE

Para aislar la secuencia C-terminal de un clon de cDNA correspondiente a toda la NR12. se realizó una PCR 3'-RACE utilizando un NR12-S1 primario de (3) para una PCR primaria y la NR12-A2 de (3) para una PCR secundaria respectivamente. La PCR se realizó bajo las mismas condiciones que la anterior 5'-RACE excepto que se usó como molde la biblioteca de cDNA Marathon-Ready de timo humano (Clontech núm. 7415-1). De forma más específica, la mezcla de polimerasa de cDNA Advantage y el termociclador 2400 sistema de PCR Amp Gen de Perkin Elmer se utilizaron en el experimento de la PCR. Bajo las mismas condiciones de la PCR descritas en (4), el producto de amplificación 3'-RACE que mostró exactamente el mismo tamaño de 750bp como se muestra en la figura 3. El producto de la PCR obtenido se subclonó en el vector pGEM-T easy del mismo modo que antes para determinar la secuencia de nucleótidos. La recombinación del producto de la PCR en el vector pGEM-T Easy se realizó usando la ligasa de DNA T4 en una reacción a 4ºC durante 12 horas. La recombinación del producto de la PCR y el vector pGEM-T Easy se obtuvo mediante la transformación de la cepa de E. coli DH5\alpha y la selección del recombinante se realizó usando el Insert Check Ready Blue descrito más arriba. La secuencia nucleotídica se determinó usando el Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit y el Secuenciador de DNA 377 PRISM ABI para el análisis. Las secuencias de nucleotídicas de todo el fragmento de inserción de 2 clones independientes de los recombinantes genéticos desvelaron que los clones contienen la secuencia C-terminal de todo el clon de cDNA NR12 con una polisecuencia A.

Entonces, la secuencia de nucleótidos determinada mediante la PCR-3'RACE y las determinadas por la PCR-5'RACE en (4) se combinaron para finalmente determinar la secuencia de nucleótidos entera del clon de cDNA codificando la proteína similar a un receptor soluble segregado llamada NR12.1. En la figura 4 se muestran la secuencia de nucleótidos determinada de cDNA NR12.1 (ID. de SEC. núm.:1) y la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia (ID. de SEC. núm.: 2).

(6) Clonación de una variante de empalme C-terminal mediante el método 3'-RACE

Aunque el clon NR12.1 aislado más arriba tenía los rasgos suficientes de receptores de hematopoyetina conocidos según el resultado del análisis estructural, no tenía una región transmembrana. Por lo tanto, se indujo para codificar una proteína soluble similar a un receptor como la que se ha mencionado más arriba. Además, los presentes inventores predijeron la existencia de variantes de empalme que tienen una región transmembrana especialmente en la región C-terminal del producto de trascripción del presente gen, e intentaron aislar clones de cDNA NR12 mediante el sucesivo método 3'-RACE.

Así, la PCR 3'-RACE se realizó usando el cebador NR12-S2 de (3) ya mencionado para la PCR primaria y un cebador NR12-13 para la PCR secundaria. Bajo las mismas condiciones de la PCR que las descritas en (4) para el método 5'-RACE excepto al usar como molde la biblioteca de cDNA Marathon-Ready de testículos humanos (Clontech núm. 7414-1). Por consiguiente, se obtuvieron múltiples productos de PCR 3'-RACE de diferentes tamaños. Todos los productos de PCR obtenidos se subclonaron en el vector pGEM-T Easy tal y como se ha descrito anteriormente para determinar las secuencias de nucleótidos. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de todos los fragmentos de inserción de 6 clones independientes de los recombinantes genéticos. Por consiguiente, se descubrió que uno de estos clones era idéntico al NR12.1 determinado arriba. Los otros 5 clones posiblemente codificaban la proteína transmembrana diana al tener regiones transmembrana. Es decir, tal y como se esperaba, los presentes inventores fueron capaces de confirmar la existencia de variantes de empalme del NR12. Además, los anteriores 5 clones de cDNA mostraron diferencias en la región extracelular C-terminal debido a empalmes alternativos. Concretamente, dos de estos clones solo tenían una corta región intracelular y se denominaron NR12.2. Por otro lado, los otros 3 clones tenían una larga región intracelular. Estos clones de cDNA con una larga ORF se denominaron NR12.3 y se distinguieron de la anterior secuencia, NR12.2.

Entonces, la secuencia de nucleótidos determinada mediante la PCR 3'-RACE y las secuencias de los productos de PRC 5'-RACE en (4) se combinaron para finalmente determinar toda la secuencia de nucleótidos del clon de cDNA que codifica la proteína receptora transmembrana. En la figura 5 se muestran la secuencia de nucleótidos determinada por cDNA NR12.2 (ID. de SEC. núm.: 3) y su secuencia de aminoácidos (ID. de SEC. núm.: 4). En las figuras 6 y 7 se muestran la secuencia nucleotídica de cDNA NR12.3 (ID. de SEC. núm.: 5) y su secuencia de aminoácidos (ID. de SEC. núm.: 6).

La secuencia de lugar de axón se predijo antes en (2) de la secuencia consenso de empalme en la trascripción de RNA (Hames, B.D. y Glover, D.M., Transcription and Splicing (Oxford, IRL Press), 1988, pág. 131 a 206) y no mediante el uso de un programa como el programa de análisis del genoma. Según la determinación de la secuencia de nucleótidos entera de los clones de cDNA aislados, se descubrió que el lugar del exón predicho en la secuencia parcial de AL109843 mostrada en la figura 1 corresponde totalmente a la que se observó en la presente trascripción del gen NR12. Sin embargo, se descubrió que solo el producto de trascripción del clon cDNA NR12.1 era el que se extendía hasta la región 3'-no traducida leída a través de la secuencia idéntica como la de la estructura del genoma sin empalmar después de la finalización del exón WS.

(7) Rasgo estructural del NR12 y predicción de su función

Como resultado de la determinación de las secuencias de nucleótidos enteras de NR12.1, NR12.2 y NR12.3, se descubrió que son los productos de trascripción con una variedad estructural en la C-terminal debido al empalme alternativo. La NR12.1 puede codificar una proteína parecida a un receptor de hematopoyetina soluble segregado formada por 337 aminoácidos según su estructura primaria, mientras que la NR12.2 y la NR12.3 pueden codificar proteínas receptoras de hematopoyetina transmembrana formadas por 428 y 639 aminoácidos respectivamente. Las características de cada NR12 fueron las siguientes:

Primero, se predice que la secuencia de la Met 1 hasta la Gly 23 en el dominio extracelular común de estos clones es la típica secuencia señal de secreción. Aquí, se supone que la primera Met es el sitio de inicio de traducción porque hay un codón de finalización conservando la pauta de lectura en la posición menos 32 de la Met 1. Seguidamente, una región parecida a Ig existe en la región desde la Gly 24 hasta el residuo Pro 124. Además, se predice que la región desde la Cys 133 hasta el residuo Cys 144 forma una de las estructuras de bucle que es un sitio de unión de ligandos. Además, la región desde la Tyr 290 hasta el residuo Arg 295 corresponde al motivo YR altamente conservado, y un motivo típico WS también se encuentra en los residuos desde la Trp 304 hasta la Ser 308.

Aquí, el NR12.1 codifica 29 aminoácidos después del motivo WS y el marco de traducción finaliza en el siguiente codón de parada. Por lo tanto, el NR12.1 codifica una proteína receptora de hematopoyetina soluble que no tiene dominio transmembrana. Por otro lado, los 26 aminoácidos siguiendo el motivo conservado más arriba desde la Gly 352 hasta el residuo Asn 377 en NR12.2 y NR12.3 corresponde a un dominio transmembrana habitual. El NR12.2 y el NR12.3 codifican secuencias de aminoácidos idénticas hasta el residuo Gln 413 en la región extracelular. Sin embargo, existen diferencias estructurales en la región C-Terminal siguiendo el residuo Gln 413 debido a los empalmes alternativos que los conecta a diferentes exones. Concretamente, el NR12.2 codifica 428 aminoácidos y el marco de traducción finaliza en el siguiente codón de parada. Así, solo tiene una corta región intracelular formada por 51 aminoácidos. Por otro lado, NR12.3 codifica 629 aminoácidos y tiene una región intracelular formada por 252 aminoácidos. Según las características estructurales de más arriba, se reconoció que el gen NR12 poseía suficientes características como nueva proteína receptora de hematopoyetina.

Ejemplo 2 Determinación de la distribución en tejido y análisis del patrón de expresión del gen NR12 mediante RT-PCR

El mRNA se detectó utilizando el método de RT-PCR para analizar la distribución de la expresión y el patrón de expresión del gen NR12.1 en diferentes órganos humanos. El cebador NR12-PPD con la secuencia de más abajo se sintetizó como el cebador directo (orientación 3') para el análisis de RT-PCR. El cebador NR12-A1 sintetizado en el ejemplo 1 (3) se utilizó como el cebador antisentido (orientación 5'). El cebador NR12-PPD se sintetizó y purificó como en el Ejemplo 1 (3). Se esperaba que la región común N-terminal en todas las variantes de corte y empalme, NR12.1, NR12.2, NR12.3, se amplificaran y detectaran utilizando este grupo de cebadores (NR12-PPD y NR12-A1).

hNR12-PPD; 5'-CCG CCA GAT ATT CCT GAT GAA GTA ACC -3' (Id de Sec. Núm.:17)

Los moldes utilizados fueron cDNA de Panel I de Tejido Múltiple Humano (MTC) (Clontech núm.:K1420-1), Panel II de MTC Humano (Clontech núm.: K1421-1), Panel de MTC del Sistema Inmunitario Humano (Clontech núm.: K1426-1), y Panel de MTC de Feto Humano (Clontech núm.: K1425-1). La PCR se realizó utilizando Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech núm.: 8417-1) en un ciclador térmico (Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400). La PCR se realizó siguiendo las condiciones de amplificación del gen diana: 94ºC durante 4 minutos, 5 ciclos de "94ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 1 minutos", 5 ciclos de "94ºC durante 20 segundos, 70ºC durante 1 minuto", 25 ciclos de "94ºC durante 20 segundos, 68ºC durante 1 minutos", 72ºC durante 3 minutos, y terminación a 4ºC.

Como se muestra en la Figura 8, se observó una fuerte expresión de NR12 en el tejido de la línea celular hematopoyética y en los tejidos de la línea celular del sistema inmunitario como el bazo adulto, el timo, los ganglios linfáticos, la médula ósea y los leucocitos de sangre periférica. La expresión también se detectó en los testículos, el hígado, pulmón, riñón, páncreas y tracto gastrointestinal como el intestino delgado y el colon. Además, la expresión del gen NR12 también se observó en todos los mRNA analizados que derivaban de tejidos humanos fetales. Al utilizar la PCR utilizando cebadores G3PDH bajo las condiciones anteriores y detectando la expresión del gen constitutivo G3PDH, se confirmó que el número de copias de mRNA entre el molde de mRNA había sido normalizado.

El tamaño del producto de amplificación de la RT-PCR fue de 561pb, que fue consistente con el tamaño calculado de la secuencia de nucleótido determinada del cDNA de NR12. Así, el producto fue considerado como el producto de la reacción de amplificación específica de PCR. Este también se confirmó mediante Southern blotting como se describe posteriormente, y se descartó la posibilidad de que el producto fuera un amplificación de PCR inespecífica.

Los análisis de la distribución de la expresión y el patrón de expresión del gen NR12 mediante RT-PCR reveló que la expresión se restringe a órganos específicos y tejidos y también que la cantidad de expresión varía enormemente entre órganos. Teniendo en cuenta el resultado de la distribución de la expresión del gen NR12. el hecho de que la expresión especialmente fuerte se detectara en tejidos que incluyen principalmente tejidos inmumológicos y células hematopoyéticas, sugiere con fuerza la posibilidad de que NR12 funcione como un nuevo receptor de hematopoyetina. Además, el hecho de que la expresión de NR12 también se observara en otros tejidos, sugiere que NR12 puede regular varias funciones fisiológicas in vivo a parte de aquellas en el sistema inmunitario y hematopoyético.

Además, se ha reconocido la existencia de variantes de corte. Esto sugiere que la regulación trascripcional de la expresión del gen NR12 está estrictamente controlada por la regulación trascripcional que determina la especificidad funcional, la inducción trascripcional mediante un factor estimulante exógeno, y la regulación de corte alternativo en tipos celulares específicos.

Ejemplo 3 Verificación de la especificidad del producto de RT-PCR mediante Southern blotting

Para poder verificar la especificidad de la amplificación, el producto génico diana amplificado por RT-PCR en el Ejemplo 2 se sometió a Southern blotting utilizando un fragmento de cDNA específico como sonda. A la vez, la cantidad de producto de RT-PCR se detectó cuantitativamente mediante la fuerza de la señal de marcaje para evaluar los niveles de expresión génica relativa entre los diferentes órganos humanos. El producto de RT-PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa y se traspasó a una membrana de nylon cargada, Hybond N (+) (Amersham, catnúm.: RPN303B) y se sometió a hibridación. El producto de PCR del fragmento de cDNA mediante 5'-RACE, que corresponde con el N-terminal del NR12 obtenido en el Ejemplo 1 (4) se utilizó como sonda específica de NR12. Las sondas se prepararon utilizando el Mega Prime Kit (Amersham, cat núm.: RPN1607) y se marcó con isótopos radiactivos, [\alpha-^{32}P] dCTP (Amersham, catnúm.: AA0005). La hibridación se realizó utilizando la solución de hibridación Express Hyb (Clontech núm.: 8015-2) y tras la prehibridación a 68ºC durante 30 minutos, se añadió sonda marcada desnaturalizada por calor para realizar la hibridación a 68ºC durante 120 minutos. Tras el posterior lavado en (1) 1XSSC/0,1% SDS a temperatura ambiente durante 5 minutos; (2) 1XSSC/0,1% SDS a 50ºC durante 30 minutos; y (3) 0,1XSSC/0,1% SDS a 50ºC durante 30 minutos, se expuso la membrana a Imaging Plate (FUJI núm.: BAS-III) y la señal específica NR12 se detectó mediante el analizador de imágenes (FUJIX, BAS-2000 II).

Tal como se muestra en la Figura 9, todos los productos de PCR amplificados mediante la RT-PCR anterior se verificaron como productos de amplificación específicos. Además, el resultado de la cuantificación del nivel de expresión relativo entre cada tejido también apoyó la evaluación anteriormente mencionada. El método de detección para la expresión de dianas génicas utilizando la combinación de RT-PCR y Southern blotting, se conoce por poseer una sensibilidad extremadamente alta en comparación con otros métodos para el análisis de la expresión. Sin embargo, la expresión génica de NR12 no se detectó en absoluto en el corazón de adultos, músculo esquelético, cerebro adulto, próstata, ovario, o placenta.

Ejemplo 4 Análisis Northern blot de la expresión génica de NR12

El análisis Northern blot de la expresión génica de NR12 se realizó para examinar el patrón de expresión del gen NR12 en órganos humanos y en líneas celulares humanas y para determinar el tamaño de los transcritos de NR12. Se utilizaron Northern Blot de Tejido Múltiple Humano (MTN) (Clontech núm.: 7760-1), MTN Humano Blot II (Clontech núm.: 7759-1), MTN Humano Blot III (Clontech núm.: 7767-1) y Línea celular de cáncer humano MTN Blot (Clontech núm.: 7757-1).

El fragmento de cDNA obtenido mediante 5'-RACE en el Ejemplo 1 (4) se utilizó como sonda. La sonda se preparó utilizando el Mega Prime Kit y se marcó con isótopos radiactivos, [\alpha-^{32}P] dCTP como en el Ejemplo 3. La hibridación se realizó utilizando la Solución de Hibridación Express y tras la prehibridación a 65ºC durante 30 minutos, se añadió sonda marcada desnaturalizada por calor para realizar la hibridación a 65ºC durante 16 horas. Tras el posterior lavado en (1) 1XSSC/0,1% SDS a temperatura ambiente durante 5 minutos; (2) 1XSSC/0,1% SDS a 48ºC durante 30 minutos; y (3) 0,5XSSC/0,1% SDS a 48ºC durante 30 minutos, se expuso la membrana a Imaging Plate como antes y se intentó detectar la señal específica de NR12 mediante el analizador de imágenes.

El método no sirvió para detectar ninguna señal en ninguno de los órganos humanos examinados. Esto puede ser debido a que el Northern blotting posee una sensibilidad significativamente menor que la RT-PCR y por eso falló al detectar mRNA en niveles de expresión bajos.

Ejemplo 5 Construcción de un sistema de cribado de ligando de NR12 utilizando líneas celulares dependientes de factores de crecimiento

Los ligandos que se unen específicamente a la proteína de esta invención pueden ser cribadas de la siguiente manera: (1) preparando un receptor quimérico por ligación del dominio extracelular de la proteína de esta invención con el dominio intracelular que contiene el dominio transmembrana de una proteína receptora de hematopoyetina que comprende una capacidad conocida de transducción de señales; (2) la expresión de este receptor quimérico en la superficie celular de una línea celular adecuada, preferiblemente, una línea celular que puede sobrevivir y proliferar solo bajo la presencia de un factor adecuado (una línea celular dependiente de factor de crecimiento); y (3) el cultivo de la línea celular por adición de un material que se espera que contenga varios factores de crecimiento, citocinas, o factores hematopoyéticos. Este método utiliza el hecho de que la línea celular dependiente de factor de crecimiento anteriormente mencionada solo sobrevive y prolifera cuando existe un ligando que se une específicamente al dominio extracelular de la proteína de la invención dentro del material de prueba y que muere rápidamente en ausencia del factor de crecimiento. Los receptores hematopoyéticos conocidos son, por ejemplo, el receptor de trombopoyetina, el receptor de eritropoyetina, el receptor de G-CSF, gp130, etcétera. No obstante, la pareja del receptor quimérico utilizado en el cribaje de la invención no se limita a estos receptores hematopoyéticos conocidos, y cualquier receptor puede ser utilizado con tal que contenga la estructura necesaria para la señal transductora de señales en el dominio citoplasmático. Las líneas celulares dependientes de IL-3, como Ba/F3 y FDC-P1, pueden ejemplificarse como líneas celulares dependientes de factores de crecimiento.

Primero, la secuencia de cDNA que codifica la región extracelular de NR12 (la secuencia de aminoácidos desde la Met 1 a la Gly 319) se amplificó por PCR, y este fragmento de DNA se unió conservando la pauta de lectura a los fragmentos de DNA que codifican la región transmembrana y la región intracelular de un receptor de hematopoyetina conocido para preparar una secuencia de fusión que codifica un receptor quimérico. El receptor TPO (MPL-P humano) se seleccionó de los candidatos descritos antes como la pareja conocida del receptor de hematopoyetina. La secuencia del receptor quimérico construido se insertó en el vector plasmídico, pME18s/neo, que puede ser expresado en células de mamífero. Un diagrama esquemático de la estructura del receptor quimérico construido pME18s/NR12-TPOR se muestra en la Figura 10. El vector que expresa el receptor quimérico se introdujo en la línea celular Ba/F3 dependiente de factor de crecimiento, y se forzó a que lo expresara. Entonces, se seleccionaron las células con el gen introducido de forma estable. La selección se puede realizar utilizando el hecho de que el vector de expresión contiene un gen de resistencia a fármaco (neomicina), y así, solo las células con el gen incorporado que obtienen la tolerancia al fármaco, pueden proliferar en el cultivo que contiene el fármaco. Se pueden buscar nuevas hematopoyetinas construyendo un nuevo sistema de cribado que utiliza la capacidad de las líneas celulares que expresan el receptor quimérico para sobrevivir y proliferar solo bajo la existencia de un ligando que se une de forma funcional y específicamente a NR12. En este caso, el cultivo de la línea celular que expresa el receptor quimérico crece en un medio suplementado con un material que se espera que incluya un ligando diana en lugar del medio libre de factor de crecimiento (IL-3 en este caso) descrito anteriormente.

Ejemplo 6 Construcción de un sistema de expresión de proteína NR12 recombinante soluble y secretable

Aunque es raro, las proteínas de unión a membranas celulares excepto las proteínas solubles pueden concebirse como un ligando que se une específicamente a la proteína de la invención. En tales casos, el cribado puede realizarse marcando la proteína que contiene solo el dominio extracelular de la proteína de la invención, o una proteína de fusión en que una secuencia parcial de otra proteína soluble se añade al dominio extracelular de la presente proteína, y entonces, se mide la unión con las células que se espera que expresen el ligando.

Ejemplos de tales proteínas que contienen solo el dominio extracelular de la proteína de la invención son, por ejemplo, proteínas de receptor soluble preparadas artificialmente mediante la inserción de un codón finalizador en el lado N-terminal del dominio transmembrana, o un NR12.1 que codifica para el tipo soluble de la proteína NR12. Por otro lado, las otras proteínas, las de fusión, pueden prepararse mediante la adición de secuencias peptídicas marcadas, como el sitio Fc de las inmunoglobulinas, y un péptido FLAG a la C-terminal del dominio extracelular de la proteína de la invención. Estas proteínas solubles marcadas también pueden emplearse para la detección en el método de West-western blotting.

Los presentes inventores seleccionaron un método de construcción de la siguiente manera:

(1) amplificación por PCR de la secuencia de cDNA que codifica para la región extracelular de la NR12 (secuencia de aminoácidos desde la Met 1 hasta la Gly 319) y (2) adición de la secuencia del péptido FLAG en la pauta de lectura del C-terminal del fragmento de DNA amplificado para obtener una secuencia que codifique para la proteína soluble diana. La secuencia construida fue insertada en el vector plasmídico, pCHO, que puede expresado en células de mamífero. La Figura 10 muestra un diagrama esquemático de la estructura del receptor quimérico pCHO/NR12-TPOR. Este vector de expresión fue introducido en células de mamífero, células CHO, y se forzó su expresión. Entonces se seleccionaron las células con el gen introducido estables. Una vez confirmada la expresión de la proteína soluble se cultivaron las células de expresión a gran escala. Es posible llevar a cabo la inmunoprecipitación de a proteína recombinante secretada en el sobrenadante del cultivo usando un anticuerpo anti-péptido FLAG, además de purificarla mediante columnas de afinidad, etcétera.

La aplicación de la proteína recombinante obtenida no se ciñe solo al ensayo arriba mencionado sino también a la detección de actividad de unión específica del material que se espera contenga un ligando diana mediante el sistema BIA-CORE (Pharmacia). Por lo tanto desempeña un papel extremadamente importante en la búsqueda de nuevas hematopoyetinas de unión a NR12.

Ejemplo 7 Reaislamiento de la CDS completa de la NR12 humana (1) Diseño de cebadores oligonucleotídicos

Los presentes inventores ya habían tenido éxito en el aislamiento del cDNA completo del gen NR12. Sin embargo, las secuencias N-terminal y C-terminal del gen diana aislado se aislaron separadamente debido a la utilización de los métodos 5'-RACE y 3'-RACE en el aislamiento del cDNA. Por tanto intentaron reaislar los genes NR12.2 y NR12.3 que contienen secuencias de codificación completas continuas.

Primero se diseñó un cebador directo (NR12.2-MET), descrito más abajo y que contiene el codón de iniciación (secuencia Met), con una secuencia nucleotídica común a cada clon de cDNA de NR12. Se diseñaron para ser los cebadores antisentido NR12.2-STP y NR12.3-STP que contienen un codón finalizador específico para NR12.2 y NR12.3 respectivamente. La síntesis de los cebadores se llevó a cabo como en el Ejemplo 1 (3). Más específicamente se utilizó el ABI's 394 DNA/RNA Synthesizer para la síntesis de los cebadores bajo la condición de añadir un grupo tritilo en el extremo 5'. Entonces se purificó el producto en una columna OPC (ABI núm.: 400771) para obtener cebadores completos.

NR12.1-MET; 5'- ATG AAT CAG GTC ACT ATT CAA TGG -3' (ID. DE SEC. núm.:18)

NR12.2-STP; 5'- GCA GTC CTC CTA CTT CAG CTT CCC -3' (ID. DE SEC. núm.:19)

NR12.3-STP; 5'- TTG ATT TTG ACC ACA CAG CTC TAC -3' (ID. DE SEC. núm.:20)

(2) Clonación por PCR

Con el fin de aislar la CDS completa de NR12 se llevó a cabo la clonación por PCR utilizando el cebador NR12.1-MET de (1) como cebador directo y los cebadores NR12.2-STP y NR12.3-STP como cebadores antisentido. Para el experimento de PCR se utilizó la Biblioteca de cDNA Marathon-Ready de timo humano (Clontech núm. 7415-1) como molde junto con la Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech núm. 8417-1) en un ciclador térmico (Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400) bajo la condición más adelante descrita. El producto de la PCR de 1301 pb llamado NR12.4 Se obtuvo con un conjunto de cebadores "NR12.1-MET y NR12.2-STP" mientras que el producto de 1910 pb llamado NR12.5 se obtuvo con el conjunto de cebadores "NR12.1-MET y NR12.3-STP".

La PCR se llevó a cabo en un único ciclo de "94ºC durante 4 minutos", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s, 72ºC durante 90 s", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s, 70ºC durante 90 s", 28 ciclos de "94ºC durante 20 s, 68ºC durante 90 s", un único ciclo de "72ºC durante 3 minutos" y finalizó a 4ºC.

Los productos de la PCR fueron subclonados en vectores pGEM-T Easy (Promega núm.: A1360) de la misma forma que en el Ejemplo 1 (4) y se determinaron las secuencias nucleotídicas. Se realizó la recombinación de los productos de la PCR en los vectores pGEM-T Easy utilizando T4 DNA ligasa (Promega núm.: 1360) en una reacción a 4ºC durante 12 horas. Se obtuvo el recombinante correspondiente mediante la transformación de la cepa de E. coli DH5\alpha (Toyobo núm.: DNA-903), y para la selección del recombinante genético se utilizó Insert Check Ready Blue (Toyobo núm.: PIK-201). Se determinó la secuencia nucleotídica con el BigDye Terminator Cycle Sequencing SF Ready Reaction Kit (ABI/Perkin Elmer núm.: 4303150) y fue analizada mediante el secuenciador de DNA ABI PRISM 377. La secuencia nucleotídica de los fragmentos del inserto en los recombinantes respectivos de NR12.4 y NR12.5 fue analizada y se determinaron las secuencias de los clones de cDNA que pudieran codificar la CDS completa.

El resultado final indicó que NR12.4 contiene el ORF completo de NR12.2 pero no la región 5' no traducida y la región 3' no traducida excepto la secuencia derivada de los cebadores debido al diseño de los cebadores usados en la PCR. NR12.5 también contiene el ORF completo de NR12.3 pero no la región 5' no traducida y la región 3' no traducida excepto la secuencia derivada de los cebadores. Se muestra en las Figuras 11 y 12 la secuencia nucleotídica determinada de NR12.4 y su secuencia de aminoácidos; en las Figuras 13 y 14 se muestra la secuencia nucleotídica determinada de NR12.5 y su secuencia de aminoácidos.

La cepa de E. coli DH5\alpha transfectada con el vector pGEM-T Easy (pGEM/NR12.5CDS) que contiene el cDNA de NR12.5 de esta invención fue depositada internacionalmente el 31 de julio del 2000 de la siguiente forma.

Nombre y dirección de la institución depositaria

Institución depositaria: Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología, Ministerio de Comercio Internacional e Industria.

Dirección: 1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibraki 305-8566, Japón.

Fecha de deposición: 31 de julio del 2000

Núm. de acceso: FERM BP-7259

Ejemplo 8 Clonación de gen genómico homólogo NR12 de ratón (1) Preparación de un fragmento de sonda de NR12 humana

Con el propósito de analizar la estructura genómica del gen NR12 de ratón los presentes inventores realizaron hibridación de calvas frente a la biblioteca de DNA genómica de ratón. Para llevar a cabo clonación mediante hibridación cruzada heteróloga frente a la biblioteca de DNA genómica de ratón se preparó un fragmento de sonda de cDNA NR12 humana. El fragmento del inserto cortado con Not I del producto de 5'-RACE de NR12 humana obtenido en el Ejemplo 1 (4) fue purificado y utilizado como el fragmento de sonda. Se utilizó el QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN núm.: 28704) para extraer y purificar el fragmento de inserto del gel de agarosa. La sonda se marcó radiactivamente con [\alpha-^{32}P] dCTP utilizando el Mega Prime Kit de la misma manera que en el Ejemplo 3 y se utilizó en la hibridación de calvas.

(2) Hibridación de calvas

Se utilizó como biblioteca el DNA genómico de la cepa 129SVJ de ratón (Stratagene núm.: 946313) construida en Lambda Fix II. Se desarrolló una biblioteca genómica de 320.000 calvas aproximadamente sobre un medio de agar NZY y se transfirieron las calvas por adsorción sobre una membrana de nylon cargada con Hybond N (+) (Amersham núm.: RPN303B) para realizar la detección primaria. En la hibridación se utilizó la solución Perfect-Hyb Solution (Toyobo núm.: HYB-101) y, después de una prehibridación a 60ºC durante 30 minutos, se añadió la sonda marcada desnaturalizada por calor. La hibridación se llevó a cabo a 60ºC durante 16 horas. Después del posterior lavado en: (1) 1x SSC/0,1% SDS a temperatura ambiente durante 5 minutos; (2) 1x SSC/0,1% SDS a 50ºC durante 30 minutos y (3) 0,5x SSC/0,1% SDS a 50ºC durante 30 minutos, se expuso la membrana a una película de rayos X (Hyperfilm MP: Amersham núm.: RPN8H) para detectar calvas positivas de NR12 de ratón.

El resultado fue la obtención de seis colones positivos o pseudopositivos independientes. Los inventores consiguieron aislar calvas de dos clones positivos de NR12 independientes al llevar a cabo una detección secundaria, de forma similar a la primaria realizada, frente a estos seis clones obtenidos con la detección primaria. Se preparó DNA de Lambda de la calva aislada a gran escala mediante el método de lisado en calvas. Los fragmentos de inserto se cortaron con la enzima de restricción Sal I. El análisis de su tamaño mostró que los fragmentos tenían aproximadamente 18,5 kb y 16,0 kb, respectivamente.

Aplicación industrial

La presente invención proporciona nuevas proteínas del receptor de hematopoyetina y DNA que las codifica. Además también proporciona: un vector en el cual se ha insertado el DNA, un transformante que acoge al vector y un método para producir proteínas recombinantes utilizando el transformante. Incluso proporciona un método de detección de un compuesto o un ligando natural que se une a la proteína. Se piensa que la proteína de esta invención está asociada a la regulación del sistema inmunitario y la hematopoyesis. Por lo tanto se supone que las proteínas de esta invención son útiles para comprender las respuestas inmunitarias y las características fundamentales de la hematopoyesis in vivo. También se cree que las mismas pueden utilizarse en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad y la hematopoyesis.

Es importante aislar factores hematopoyéticos desconocidos que puedan unirse a la molécula de NR12 de esta invención. Se cree que el gen de la invención es extremadamente útil en la detección de tales factores desconocidos. Más aún, es posible rastrear bibliotecas peptídicas y materiales químicos sintéticos para aislar e identificar agonistas y antagonistas que puedan unirse funcionalmente a NR12.

Tal como se ha descrito se piensa que el gen NR12 constituye una fuente útil de obtención de factores hematopoyéticos desconocidos o de agonistas que son capaces de unirse funcionalmente a la proteína del receptor codificada por el gen NR12. Se espera que la inmunidad celular y la función hematopoyética in vivo se verán impulsadas por la administración de estas substancias de unión funcional o de anticuerpos específicos que pueden activar la función de la molécula NR12 en el organismo. De este modo el gen NR12 facilita el desarrollo de fármacos de aplicación clínica que promuevan la proliferación o diferenciación de las células inmunitarias o las hematopoyéticas, o bien que activen la función de las células inmunitarias. Estos fármacos se pueden usar para impulsar la inmunidad citotóxica frente a tipos específicos de tumor. Cabe la posibilidad de que NR12 se exprese en una población restringida de células de los tejidos hematopoyéticos. Por consiguiente, los anticuerpos anti-NR12 serían útiles en el aislamiento de dichas poblaciones de células que pueden entonces utilizarse en tratamientos de transplante celular.

Por otro lado, NR12.1, una variante de empalme de NR12 se puede utilizar como inhibidor para el ligando NR12, como un receptor de tipo señuelo. Además, se espera que con la administración de antagonistas que puedan unirse de manera funcional a la molécula NR12, u otros inhibidores, así como anticuerpos específicos que pueden inhibir la función molecular de NR12 hacia el organismo, potencialmente se pueda suprimir la inmunidad celular o inhibir la proliferación de las células hematopoyéticas in vivo. Así, dichos inhibidores pueden ser aplicados como fármacos para la aplicación clínica para usarlos como, por ejemplo, inhibidores de la proliferación de la célula inmune y de la célula hematopoyética, inhibidores de diferenciación, fármacos inmunosupresores y fármacos antiinflamatorios. En concreto, dichos inhibidores se pueden utilizar para suprimir el comienzo de enfermedades autoinmunes que aparecen de la autoinmunidad o el rechazo de tejidos por el sistema inmunitario del cuerpo vivo, el principal problema son los transplantes. Además, los inhibidores se pueden usar de una forma efectiva para tratar las enfermedades causadas por tal promoción aberrante de la respuesta inmunitaria. Así, los inhibidores se pueden usar para tratar una variedad de alergias que son especificas a antígenos concretos como el metal y el polen.

<110> CHUGAI RESEARCH INSTITUTE FOR MOLECULAR MEDICINE, INC.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> NUEVA PROTEÍNA DEL RECEPTOR DE HEMATOPOYETINA, NR12

\vskip0.400000\baselineskip

<130> C2-110DP1PCT

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 1999-273358

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-09-27

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 2000-240397

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-08-03

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1784

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (98)..(1108)

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1479

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (98)..(1381)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 428

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2123

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (98)..(1984)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

23

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 629

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

29

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1284)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,2cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 428

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1910

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1887)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

46

47

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 629

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

52

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador sintetizada artificialmente

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaacagtca gaattctact tggagcc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador sintetizada artificialmente

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cattaagtac gtatttcaag tgagatgtc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador sintetizada artificialmente

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtactggca gccttggagt tcactg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador sintetizada artificialmente

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtgaactc caaggctgcc agtacc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador sintetizada artificialmente

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacatctcac ttgaaatacg tacttaatg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador sintetizada artificialmente

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctccaagt agaattctga ctgttgc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador sintetizada artificialmente

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgccagata ttcctgatga agtaacc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador sintetizada artificialmente

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaatcagg tcactattca atgg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador sintetizada artificialmente

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagtcctcc tacttcagct tccc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador sintetizada artificialmente

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgattttga ccacacagct ctac

\hfill

24

Claims (10)

1. Un DNA seleccionado de un grupo formado por:

(a)

un DNA que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. Sec. núm.: 2, 4, 6, 8 y 10;

(b)

un DNA que comprende una región que codifica la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las Id. de Sec. núm.: 1, 3, 5, 7 y 9;

(c)

un DNA que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. núm.: 2, 4, 6, 8 y 10, en la que están modificados de 2 a diez aminoácidos mediante sustitución, supresión o adición, donde dicha proteína tiene una actividad como receptor de factor hematopoyético; y

(d)

un DNA que codifica un péptido que forma parte de la proteína con una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Id. de Sec. núm.: 2, 4, 6, 8 y 10, donde el péptido tiene una actividad como receptor de factor hematopoyético.

2. Un vector en el cual se ha insertado el DNA descrito en la reivindicación 1.

3. Un transformante que es portador del vector descrito en la reivindicación 2.

4. Un método para producir la proteína o el péptido codificado por el DNA de la reivindicación 1, con los siguientes pasos: cultivar el transformante de la reivindicación 3 y recuperar la proteína expresada de dicho transformante o del sobrenadante del cultivo.

5. Una proteína o péptido que está codificado por el DNA descrito en la reivindicación 1 o que se puede obtener con el método de la reivindicación 4.

6. Un anticuerpo que reacciona específicamente a la proteína o péptido de la reivindicación 5.

7. Un polinucleótido antisentido formado por un DNA que es complementario en al menos 15 nucleótidos de cualquiera de las Id. de Sec. núm.: 1, 3, 5, 7 y 9.

8. Un método de cribaje para un compuesto que se une a la proteína o péptido de la reivindicación 5, con los siguientes pasos:

(a)

poner en contacto una muestra de prueba don dicha proteína o péptido de la misma;

(b)

detectar la actividad de unión de la muestra de prueba con la proteína o péptido de la misma; y

(c)

seleccionar el compuesto que se une a la proteína o péptido de la misma.

9. Una composición farmacéutica formada por el DNA de la reivindicación 1, la proteína de la reivindicación 5, el vector de la reivindicación 2, el anticuerpo de la reivindicación 6 y/o el polinucleótido de la reivindicación 7.

10. El uso de la proteína de la reivindicación 5 y el anticuerpo de la reivindicación 6 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad y la hematopoyesis.