ES2253901T3 - Procedimiento de obtencion in vitro de secuencias de polinucleotidos recombinadas, bancos de secuencias y secuencias asi obtenidas. - Google Patents
Procedimiento de obtencion in vitro de secuencias de polinucleotidos recombinadas, bancos de secuencias y secuencias asi obtenidas.Info
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Abstract
Procedimiento de recombinación aleatoria in vitro de fragmentos de ácidos nucleicos, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: a) la fragmentación de un banco de secuencias de polinucleótidos b) la hibridación de los fragmentos obtenidos sobre una matriz de acoplamiento c) la ligación de los fragmentos hibridados que poseen extremos adyacentes con la ayuda de una ligasa d) la desnaturalización de los fragmentos ligados de la matriz de acoplamiento, y la repetición de las etapas de hibridación (b), de ligación (c) y de desnaturalización (d) para formar varias recombinaciones aleatorias, dicho procedimiento estando además caracterizado por el hecho de que las etapas (a) a (d) son realizadas en ausencia de polimerasa.
Description
Procedimiento de obtención in vitro de
secuencias de polinucleótidos recombinadas, bancos de secuencias y
secuencias así obtenidas.
La presente invención se relaciona con un método
de obtención in vitro de secuencias de polinucleótidos
recombinadas. La invención apunta más particularmente a generar y
luego seleccionar secuencias de polinucleótidos susceptibles de
presentar una o varias propiedades ventajosas con relación a las
propiedades correspondientes de las secuencias de referencia y por
lo tanto capaces de conferir un fenotipo mejorado y/o de producir
proteínas mejoradas.
Se entiende por secuencia de referencia una
secuencia que tiene propiedades próximas a aquellas buscadas.
Diferentes técnicas han sido desarrolladas para
favorecer la recombinación in vitro entre diferentes
secuencias de polinucleótidos, entre estas se pueden citar más
particularmente el DNA-Shuffling (12) y la StEP
(14) las dos fundadas en la utilización de la PCR.
El DNA-Shuffling comprende dos
etapas, la fragmentación aleatoria por la ADNsa I de secuencias de
polinucleótidos, y una amplificación por PCR en la cual los
fragmentos precedentemente generados sirven de cebadores. En cada
etapa de hibridación, el cambio de matriz provoca recombinaciones al
nivel de las regiones que tienen secuencias homólogas. Una
representación esquemática de este método es dado en la figura 1A en
anexo.
La StEP consiste en mezclar diferentes secuencias
de polinucleótidos que contienen diversas mutaciones en presencia
de un par de cebadores. Esta mezcla es sometida a una reacción de
tipo PCR en la cual las etapas de hibridación y de polimerización
son reagrupadas en una sola etapa de muy corta duración. Estas
condiciones permiten la hibridación de los cebadores pero disminuyen
la velocidad de polimerización, de manera que los fragmentos que
son parcialmente sintetizados se hibridan de manera aleatoria sobre
las secuencias de polinucleótidos que portan las diferentes
mutaciones, permitiendo así la recombinación. Una representación
esquemática de este método es dada en la figura 1B en anexo.
En cada uno de estos dos métodos, la etapa de
polimerización es indispensable en el proceso de recombinación. De
esta forma, en función de las polimerasas seleccionadas esta etapa
de polimerización puede ser generadora de mutaciones suplementarias
no deseadas. Además, a partir de un cierto número de ciclos, el
DNA-Shuffling y la StEP reposan sobre el principio
de la hibridación de un "mega-cebador" (6)
sobre una matriz, lo que ocasiona probablemente dificultades de
ejecución para secuencias de polinucleótidos cuyo tamaño es
superior a 1,5 Kpb (11). En fin, estas dos técnicas no permiten
controlar la tasa de recombinaciones, ya que estas se hacen de
manera aleatoria en el curso de las etapas sucesivas de
polimerización.
La presente invención apunta precisamente a
paliar los inconvenientes de aquí arriba ofreciendo un método
simple de preparación de secuencias de polinucleótidos recombinadas,
que permite generar secuencias de polinucleótidos susceptibles de
presentar propiedades ventajosas con relación a las propiedades
correspondientes de las secuencias de referencia y por lo tanto
capaces de conferir un fenotipo mejorado y/o de producir proteínas
mejoradas.
Este objetivo es alcanzado gracias a un
procedimiento de obtención in vitro de secuencias de
polinucleótidos recombinadas a partir de un banco de secuencias de
polinucleótidos, también designado en lo adelante banco inicial,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- la fragmentación de un banco de secuencias de polinucleótidos de doble hebra,
- b)
- la desnaturalización de los fragmentos eventualmente en presencia de una o varias matriz(ces) de acoplamiento,
- c)
- la hibridación de dichos fragmentos con una o varias matriz(ces) de acoplamiento si esta(s) no está(n) presente(s) en la etapa (b),
- d)
- la ligación de dichos fragmentos para obtener secuencias de polinucleótidos recombinadas,
- e)
- la selección de las secuencias de polinucleótidos recombinadas que presentan propiedades ventajosas con relación a las propiedades correspondientes a una o varias secuencias de referencia.
El procedimiento de la invención puede comprender
a la salida de la etapa (d) y antes de la etapa (e), la repetición
de las etapas (b), (c) y (d) no con los fragmentos de la etapa (a)
sino con los productos de la etapa (d).
Este modo de realización es particularmente útil
en el caso en el que a la salida de la etapa (d) todos los
fragmentos no están ligados. En este caso, el procedimiento de la
invención comprende además, al final de la etapa (d) y antes de la
etapa (e), uno o varios ciclos de las reacciones siguientes:
- -
- desnaturalización de los fragmentos ligados y no ligados salidos de la etapa (d), eventualmente en presencia de una o varias matriz(ces) de acoplamiento,
- -
- hibridación de dichos fragmentos con una o varias matriz(ces) de acoplamiento si esta(s) no está(n) presente(s) durante la desnaturalización,
- -
- ligación de dichos fragmentos.
Estas reacciones de desnaturalización,
hibridación y ligación, son equivalentes en las etapas (b), (c) y
(d) pero realizadas no con los mismos fragmentos de la etapa (a)
sino con los fragmentos ligados y no ligados salidos de la etapa
(d).
El procedimiento de la invención puede comprender
además, una o varias de las etapas siguientes:
- -
- la separación de las secuencias de polinucleótidos recombinadas de la o de las matrices de acoplamiento antes de la etapa (e),
- -
- la amplificación de las secuencias de polinucleótidos recombinadas de doble hebra antes de la etapa (e),
- -
- la clonación de las secuencias de polinucleótidos recombinadas eventualmente después de la separación de las hebras recombinadas de la o de las matrices y obtención de la doble hebra correspondiente antes de la etapa (e).
Los extremos de los fragmentos generados en la
etapa (a) son tales que puede haber allí hibridación adyacente de
estos extremos sobre la o las matrices de acoplamiento en la etapa
(c) y ligación de estos fragmentos unos con otros en la etapa (d).
Las secuencias de polinucleótidos del banco sobre el cual es
efectuado el procedimiento de la invención deben presentar zonas de
homología tanto entre ellas, como con las matrices de acoplamiento,
permitiendo generar extremos de fragmentos tales como los descritos
aquí arriba.
Una forma de ejecución ventajosa del
procedimiento de la invención consiste en realizar simultáneamente
las etapas (c) y (d) según una reacción llamada de RLR por la
expresión inglesa de "Recombining Ligation Reaction".
Aparte de las ventajas indicadas precedentemente,
el procedimiento de la invención es remarcable porque favorece y
acelera la recombinación aleatoria in vitro de secuencias de
polinucleótidos, estas secuencias de polinucleótidos pudiendo ser
genes. Se entiende por gen un fragmento o una secuencia de ADN
asociada a una función biológica. Un gen puede ser obtenido de
diferentes formas, como la síntesis química, la síntesis por
polimerización o por extracción de dicho gen a partir de una fuente
de ácidos nucleicos.
La recombinación in vitro de las
secuencias de polinucleótidos del banco inicial por el
procedimiento de la invención permite por lo tanto obtener un nuevo
banco que contiene secuencias que han adquirido una o varias de las
características de las secuencias del banco precedente. El
procedimiento de la invención constituye por lo tanto una técnica
de evolución in vitro.
El procedimiento de la invención constituye una
alternativa a la PCR recombinante tal como la ejecución en las
técnicas de DNA shuffling (12) o de StEP (14), ya que no necesita la
etapa de polimerización in vitro para conducir a la
recombinación. Por el contrario, la etapa clave del procedimiento de
la invención es la etapa (d) de ligación sobre una matriz de
acoplamiento, lo que asegura un grado muy alto de fidelidad en el
curso de los eventos de recombinación.
El procedimiento de la invención es remarcable
porque permite aumentar considerablemente la eficacia del
acoplamiento de los fragmentos a ligar. En efecto, en el caso de una
secuencia cortada en n fragmentos, existe n^{n} posibilidades de
reasociación de los fragmentos utilizando un procedimiento de
ligación clásico (sin utilización de una matriz de acoplamiento que
oriente la ligación), entre los cuales una sola forma es
interesante. En el caso del procedimiento de la invención, la
ligación es orientada por la matriz de acoplamiento, lo que permite
obtener directamente la única forma interesante.
La fragmentación de estas secuencias de
polinucleótidos en la etapa (a) puede hacerse tanto de manera
controlada, como de manera aleatoria.
En el caso de una fragmentación realizada de
manera controlada, la fragmentación permite dominar con precisión
el grado de recombinación deseado y la posición de los puntos de
recombinación. Según una forma de realización preferida del
procedimiento de la invención, la etapa (a) consiste en someter las
secuencias de polinucleótidos del banco a una hidrólisis por la
acción de una o varias enzimas de restricción. De esta manera, en
una forma de ejecución particular del procedimiento de la invención,
el grado de recombinación y la posición de los puntos de
recombinación de las secuencias de polinucleótidos recombinadas son
determinados por la fragmentación de la etapa (a).
De esta forma, mientras más grande es el número
de fragmentos generados por secuencias, más elevado es el número de
fragmentos necesarios para recomponer una secuencia, lo que ocasiona
una tasa de recombinación elevada. Además, la naturaleza y la
posición de los extremos de los fragmentos generados en este modo de
realización del procedimiento de la invención pueden ser conocidas
y controladas, lo que permite:
- -
- controlar con precisión las zonas donde la recombinación tiene lugar, o
- -
- inducir la recombinación entre secuencias de polinucleótidos, por ejemplo de genes, si los extremos de los fragmentos son creados en zonas de homología entre estas secuencias, o zonas de homologías entre estas secuencias y la o las matrices de acoplamiento.
En el caso de una fragmentación aleatoria,
cualquier medio enzimático o mecánico conocido por el hombre del
arte capaz de cortar de manera aleatoria el ADN de doble hebra podrá
ser utilizado, como por ejemplo una digestión por la Adnasa I o una
sonicación.
El procedimiento de la invención permite aumentar
considerablemente la eficacia del acoplamiento de los fragmentos a
ligar, el mismo puede por lo tanto ser aplicado a la orientación de
la ligación multi-molecular de extremos libres. En
esta aplicación, se utiliza como matriz de acoplamiento en las
etapas (b) o (c) oligonucleótidos de simple o de doble hebra
complementarios con el extremo 3' de un fragmento y 5' del fragmento
adyacente, lo que permite la hibridación adyacente de estos dos
extremos en la misma matriz después de la etapa de
desnaturalización. Una vez hibridados, los extremos de los
fragmentos pueden ser ligados entre ellos de forma de orientar el
sentido de ligación de los fragmentos de extremos libres. La misma
aproximación puede ser considerada para la orientación de la
ligación de los fragmentos de extremos cohesivos.
Una realización preferida del procedimiento de la
invención consiste en adicionar a la etapa (c) y/o a la etapa (d)
enzimas capaces de reconocer y de cortar de manera específica los
extremos no hibridados de fragmentos, cuando estos recubren otros
fragmentos hibridados sobre la misma matriz. Un ejemplo preferido
de este tipo de enzima es la enzima Flap endonucleasa (10).
Una realización particular del procedimiento de
la invención consiste por lo tanto en utilizar enzimas de tipo Flap
endonucleasas cuando los fragmentos generados en la etapa (a) pueden
recubrirse durante la hibridación sobre la matriz de acoplamiento
en la etapa (c).
De esta forma, durante la hibridación de
fragmentos de ADN de simple hebra sobre una matriz, estas enzimas
tienen por propiedad reconocer y cortar de manera específica los
extremos no hibridados de estos fragmentos, cuando estos recubren
otros fragmentos hibridados sobre la misma matriz. En el curso de la
etapa (c) de hibridación, estas enzimas permiten por lo tanto
aumentar el número de extremos adyacentes que pueden estar ligados
a la etapa (d), lo que es particularmente importante en el caso de
fragmentos obtenidos por corte aleatorio, ya que estos fragmentos
presentan zonas de recubrimiento unos con otros cuando los mismo se
hibridan sobre la matriz de acoplamiento.
En una realización particular del procedimiento
de la invención que utiliza una ligasa activa a alta temperatura y
preferentemente termoestable en la etapa (d), las endonucleasas
capaces de reconocer y de cortar de manera específica los extremos
no hibridados de los fragmentos como los Flaps, adicionados en la
etapa (c) y/o en la etapa (d) tendrán las mismas propiedades de
termo-resistencia y de actividad a alta temperatura
que dicha ligasa.
El banco de secuencias de polinucleótidos sobre
el cual es efectuado el procedimiento de la invención puede ser
generado por cualquier método conocido por el hombre del arte, por
ejemplo a partir de un gen salvaje por etapas de mutagénesis
dirigidas sucesivas, por PCR "error prone" (2), por mutagénesis
aleatoria química, por mutagénesis aleatoria in vivo, o
combinando los genes de familias próximas o distintas en el seno de
la misma especie o de especies diferentes de manera de disponer de
una variedad de secuencias de polinucleótidos en dicho banco.
Entre estas técnicas, la invención considera más
particularmente, un proceso en el que el banco de secuencias de
polinucleótidos de doble hebra es obtenido por una reacción de
polimerización en cadena realizada en condiciones que permiten
crear mutaciones puntuales aleatorias.
El banco inicial de secuencias de polinucleótidos
de doble hebra puede estar constituido por secuencias sintéticas
que serán fragmentadas en el etapa (a) o que pueden constituir los
fragmentos de la etapa (a).
Según una forma de realización preferida del
procedimiento de la invención, la etapa (a) consiste en someter las
secuencias de polinucleótidos del banco a una hidrólisis por la
acción de una o varias enzimas de restricción.
Para incrementar el grado de recombinación
generado por el procedimiento de la invención, es suficiente
aumentar el número de fragmentos de restricción utilizando enzimas
de restricción que tienen un gran número de sitios de corte sobre
las secuencias de polinucleótidos del banco, o combinando varias
enzimas de restricción. En el caso de la utilización de una ligasa
termoestable y termoactiva, el tamaño del fragmento más pequeño así
generado será ventajosamente superior o igual a 40 pb, a fin de
conservar una temperatura de hibridación compatible con aquella de
la etapa (d) de ligación que es generalmente del orden de 65ºC.
La etapa (a) puede también ser realizada
generando un banco de fragmentos por tratamiento aleatorio
enzimático o mecánico. En particular, la etapa (a) puede consistir
en un tratamiento aleatorio con la ADNsa de un banco de secuencias
de polinucleótidos de doble hebra parcialmente heterólogas. En el
caso donde se utiliza en la etapa (a) una fragmentación enzimática
o mecánica aleatoria, esta forma de realización del procedimiento
de la invención tiene la particularidad de permitir la utilización
de los fragmentos generados por este tratamiento como matrices unos
por otros, para la hibridación en el curso de la etapa (c) o de la
reacción de RLR de las etapas (c) y (d) simultaneadas.
La etapa (b) puede ser realizada combinando al
menos dos bancos de fragmentos distintos generados separadamente en
la etapa (a) a partir del mismo banco inicial por tratamientos
diferentes, como por ejemplo con enzimas de restricción diferentes.
En el caso de la realización de tales bancos, se utilizan los
fragmentos obtenidos en la etapa (a) como matrices unos por otros,
para la hibridación en el curso de la etapa (c) o de la reacción de
RLR de las etapas (c) y (d) simultaneadas.
Los fragmentos de la etapa (a) del procedimiento
de la invención pueden igualmente ser generados por reacciones de
amplificación como la PCR conducidas sobre las secuencias de
polinucleótidos del banco. Dos soluciones son consideradas. En un
primer caso, los oligonucleótidos cebadores pueden ser orientados de
manera de generar fragmentos cuyos extremos son adyacentes a todo
lo largo de la secuencia de acoplamiento. En un segundo caso, los
oligonucleótidos cebadores son orientados de manera de generar
fragmentos que tienen secuencias comunes, estos fragmentos pueden
servir de matriz de acoplamiento unos por otros en la etapa (b) o
en la epata (c). El procedimiento de la invención permite combinar
de manera aleatoria diferentes fragmentos obtenidos en la etapa (a)
y de reacoplarlos en el curso de las etapas (b), (c) y (d) en el
seno de una secuencia de polinucleótidos. Este procedimiento
reproduce por lo tanto in vitro los fenómenos de
recombinación que pueden producirse in vivo favoreciéndolos.
El procedimiento de la invención es por tanto particularmente
interesante para recombinar secuencias de polinucleótidos entre
ellas a fin de generar nuevas secuencias de polinucleótidos que
tienen propiedades interesantes con relación a las propiedades
correspondientes de secuencias de referencia.
La eficacia de recombinación del procedimiento de
la invención es función del número de fragmentos generados por
secuencia de polinucleótidos en la etapa (a). En consecuencia, el
procedimiento de la invención utilizará secuencias de
polinucleótidos que hayan sido fragmentadas en n fragmentos, n
siendo ventajosamente superior o igual a
tres.
tres.
La matriz de acoplamiento en la etapa (b) o (c)
es por ejemplo una secuencia de polinucleótidos salida del banco
inicial o una secuencia de consenso de dicho banco, de simple o de
doble hebra. En el caso en que la matriz de acoplamiento está
incorporada directamente en la etapa (c) de la invención, esta
matriz debe estar bajo la forma de simple hebra.
Según una variante del procedimiento de la
invención, las matrices de acoplamiento de las etapas (b) o (c)
están constituidas por oligonucleótidos de simple o de doble
hebra.
Según una forma particular de realización del
procedimiento de la invención, los oligonucleótidos, de simple o
doble hebra, de longitud variable, son adicionados en la etapa (b) o
(c) además de la matriz. Estos oligonucleótidos son orientados para
poder sustituirse en una parte de los fragmentos en la etapa (c),
en efecto, su secuencia es tal que:
- si son perfectamente homólogos con la secuencia
del fragmento que reemplazan, estos favorecen ciertas combinaciones,
o
- si son parcialmente heterólogos con la
secuencia del fragmento que reemplazan, estos introducen una o
mutaciones dirigidas suplementarias.
Antes de la etapa (e) del procedimiento de la
invención, es posible separar las secuencias de polinucleótidos
recombinadas de la matriz de acoplamiento gracias a un marcador
presente sobre la matriz de acoplamiento o sobre las secuencias de
polinucleótidos recombinadas. Es en efecto posible marcar cada hebra
de la matriz según técnicas conocidas por el hombre del arte. Por
ejemplo, el marcador de la matriz de acoplamiento puede ser un
hapteno y se separa de las secuencias de polinucleótidos
recombinadas de la matriz de acoplamiento por técnicas conocidas
por el hombre del arte, como por ejemplo un anticuerpo
anti-hapteno fijado sobre un soporte o una reacción
biotina-estreptavidina, si el hapteno es un marcador
biotina.
Otras técnicas pueden ser empleadas para separar
las secuencias de polinucleótidos recombinadas de la matriz de
acoplamiento. La matriz de acoplamiento puede también ser preparada
específicamente de forma de facilitar su eliminación al final del
procedimiento de la invención. La misma puede así ser sintetizada
por amplificación PCR utilizando dATP metilados, lo que permite su
degradación por la endonucleasa de restricción Dpn I. En
este caso, las secuencias de polinucleótidos recombinadas no deben
contener dATP metilados. La matriz puede también haber sido
preparada por amplificación PCR utilizando dUTP, lo que permite su
degradación por tratamiento con una
uracil-ADN-glicosilasa. A la
inversa, es posible proteger las secuencias de polinucleótidos
recombinadas y amplificarlas por PCR selectiva con oligonucleótidos
que portan grupos fosforotioatos en 5'. Un tratamiento con una
exonucleasa permite entonces degradar específicamente la matriz de
acoplamiento.
El procedimiento de la invención puede comprender
antes de la clonación eventual de la etapa (e), una etapa de
amplificación de las secuencias de polinucleótidos recombinadas.
Cualquier técnica de amplificación es aceptable específicamente una
amplificación por PCR. Una de las más simples consiste en realizar
una PCR que permite amplificar específicamente las secuencias de
polinucleótidos recombinadas gracias a cebadores que sólo pueden
hibridarse sobre los extremos de las secuencias recombinadas. Los
productos PCR son seguidamente clonados para ser caracterizados y
las secuencias de polinucleótidos que presentan propiedades
ventajosas con relación a las propiedades correspondientes de
secuencias de referencia son seleccionadas.
La invención tiene por objeto generar secuencias
de polinucleótidos susceptibles de presentar propiedades ventajosas
con relación a las propiedades correspondientes de las secuencias de
referencia. Las secuencias de polinucleótidos recombinadas
obtenidas en la etapa (d) y eventualmente clonadas son cribadas por
cualquier medio apropiado para seleccionar las secuencias de
polinucleótidos recombinadas o los clones que presentan propiedades
ventajosas con relación a las propiedades correspondientes de las
secuencias de referencia. Se entiende, por ejemplo, por propiedades
ventajosas la termo-estabilidad de una enzima o su
calidad de poder funcionar en condiciones de pH o de temperatura o
de concentración salina más adaptadas a un procedimiento
enzimático, que las proteínas testigos habitualmente utilizadas para
dicho procedimiento. A título de ejemplo de tal procedimiento, se
puede citar un procedimiento industrial de desencolado de las fibras
textiles o de blanqueo de las pastas de papel o de la producción de
aromas en al industria láctea, los procedimientos de
bio-catálisis para la síntesis por vía enzimática de
nuevas moléculas terapéuticas, etc...
Según un modo de realización ventajosa del
procedimiento de la invención, el banco de secuencia de
polinucleótidos puede por lo tanto ser el resultado de una criba que
tiene permiso de seleccionar por cualquier medio apropiado las
secuencias de polinucleótidos que presentan propiedades ventajosas
con relación a secuencias testigos. Las secuencias así
seleccionadas constituyen un banco restringido.
Pero, es también posible partir de un banco no
restringido a fin de conservar la representatividad de las
propiedades contenidas en este banco.
Las secuencias que codifican para la o las
proteínas que presentan una o varias propiedades ventajosas con
relación a las proteínas de referencia son entonces seleccionadas,
por cribados in vivo o in vitro, y pueden servir para
constituir un nuevo banco para una eventual reiteración del
procedimiento de la invención. Una realización ventajosa del
procedimiento de la invención consiste por lo tanto en utilizar
como banco varias secuencias de polinucleótidos seleccionadas
después de una primera realización del procedimiento de la
invención, eventualmente mezcladas con otras secuencias de
polinucleótidos. Entre las técnicas de cribado que pueden ser
aplicadas a cada uno de los clones de la etapa (e), las técnicas de
cribado in vitro presentan la ventaja de franquear problemas
de fisiología celular, y todos los inconvenientes unidos a la
clonación de la expresión in vivo. Además, este tipo de
cribado es fácilmente automatizable, lo que permite cribar un
número elevado de secuencias de polinucleótidos recombinadas.
La invención concierne también a una secuencia de
polinucleótidos recombinada obtenida por un procedimiento según la
invención, así como un vector que contiene tal secuencia de
polinucleótidos recombinada, un hospedero celular transformado por
una secuencia de polinucleótidos recombinada o un vector de la
invención, así como una proteína codificada por esta secuencia de
polinucleótidos recombinada. La invención comprende igualmente los
bancos correspondientes de secuencias de polinucleótidos
recombinadas, de vectores, de hospederos celulares o de
proteínas.
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán en los ejemplos de realización de la invención que
siguen y que se refieren a los dibujos anexos en los que:
La figura 1 es una representación esquemática de
los procedimientos del arte anterior que corresponde respectivamente
al DNA-shuffing (figura 1A) y al StEP (figura
1B).
La figura 2 es una representación esquemática de
un ejemplo de realización del procedimiento de la invención y de
algunas de sus variantes y aplicaciones.
La figura 3 representa las posiciones de las diez
zonas de mutaciones (Pvu II y Pst I) portados por cada
mutante del gen ponB utilizado para los ejemplos de
realización de la invención.
La figura 4 representa la posición de los
cebadores utilizados con relación a la secuencia del gen
ponB.
La figura 5 representa la migración de los
productos de las reacciones de RLR y de PCR de los productos de
estas reacciones de RLR sobre gel de agarosa.
La figura 6 representa la posición de las
mutaciones con relación a los fragmentos de restricción.
I -
Ejemplo
El procedimiento de la invención ha sido
realizado a partir de un banco de mutantes del gen ponB, que
codifica para la PBPIb de E. coli(1). Diez mutantes de este
gen fueron utilizados. Las secuencias del gen de cada mutante
difiere de aquella del gen salvaje por una zona no homóloga de trece
a dieciséis bases de longitud constituida por la sustitución de
cinco codones iniciales por cinco codones alaninas según la técnica
descrita por Lefèvre y otros (8).
La sustitución portada por cada mutante está
caracterizada por la presencia de un sitio único de la enzima de
restricción Pvu II enmarcado por dos sitios de la enzima
Pst I, que permiten distinguir los mutantes unos de otros
por su perfil de digestión con estas endonucleasas de restricción.
La figura 3 representa las posiciones de diez zonas de mutaciones
(Pvu II y Pst I) portadas por cada mutante.
Después de la amplificación por PCR de los genes
de los diez mutantes, los productos PCR fueron purificados,
mezclados en cantidad equimolar para constituir el banco. Las
secuencias de polinucleótidos de este banco fueron digeridas por
las enzimas de restricción HinfI y BsaI, de manera de
generar bancos de fragmentos de restricción. Los fragmentos de
restricción fueron entonces incubados con la matriz salvaje, a
diferentes cantidades, en presencia de una ligasa termoestable.
Después de varios ciclos de desnaturalización/hibridación/ligación,
una fracción de esta mezcla de reacción fue utilizada para realizar
una amplificación PCR con un par de cebadores específicos de los
extremos 5' y 3' de los genes de los mutantes y no específicos de
los extremos 5' y 3' de la matriz salvaje. El producto de
amplificación fue clonado, y los clones obtenidos fueron analizados
por su perfil de digestión con la endonucleasa de restricción
Pvu II o Pst I. Los perfiles obtenidos permitieron
determinar que el(los) fragmento(s) de los mutantes
había(n)
podido recombinarse con los otros para reconstituir un gen entero.
podido recombinarse con los otros para reconstituir un gen entero.
La cepa MC1061 (F^{-} araD139,
\Delta(ara-leu)_{7696}, galE15,
galK16, \Delta(lac)X74,
rpsL(Str^{R}), mcrA mcrB1, hdsR2 (r_{k}^{-}
m_{k}^{+})) es derivada de Escherichia coli K12.
El vector pARAPONB es salido del vector pARA13
(3) en el que el gen ponB que porta un sitio de corte
trombina (9) fue introducido entre los sitios de restricción
Nco I y Nar I. El vectos pET26b+ forma parte de la
familia de los vectores pET desarrollados por Studier y Moffatt (13)
y comercializados por la sociedad NOVAGEN.
Los oligonucleótidos han sido sintetizados por la
sociedad ISOPRIM (Toulouse). Las secuencias de oligonucleótidos son
reportadas en la tabla I aquí abajo.
Las enzimas de restricción y de modificaciones
citadas en la tabla II aquí debajo han sido utilizadas según las
recomendaciones de los suministradores.
| Enzima | Concentración | Suministrador |
| NcoI | 10 U/\mul | NEB |
| PstI | 20 U/\mul | NEB |
| Eco RI | 20 U/\mul | NEB |
| Bsa I | 5 U/\mul | New England Biolabs |
| Hinf I | 10 U/\mul | New England Biolabs |
| Pvu II | 10 U/\mul | New England Biolabs |
| T4 DNA ligasa | 400 U/\mul | New England Biolabs |
| Taq ADN polimerasa | 5 U/\mul | PROMEGA |
| AMPLIGASA | 100 U/\mul | EPICENTRE |
Los tampones utilizados son reportados en la
tabla III aquí debajo.
| Tampones | Composición |
| T | Tris HCl 10 mM, pH 8.0 |
| Polimerización 20X | Tris HCl 100 mM pH 8,3, MgCl_{2} 15 mM, KCl 500 mM, 1.0% Triton X100® |
| Restricción A 10X | 500 mM NaCl, 100 mM Tris HCl pH 7,9, 100 mM MgCl_{2}, 10 mM DTT |
| Restricción B 10X | 1M NaCl, 500 mM Tris HCl pH 7,9, 100 mM MgCL_{2}, 10 mM DTT |
| Restricción C 10X | 500 mM NaCl, 1 M Tris HCl pH 7,5, 100 mM MgCL_{2}, 0,25% Triton X100® |
| AMPLIGASA 10X | 200 mM Tris HCl pH 8,3, 250 mM KCl, 100 mM MgCl_{2}, 5 mM NAD, 0,1% Triton X100® |
| Ligación 10X | 500 mM Tris HCl pH 7,5, 100 mM MgCl_{2}, 100 mM DTT, 10 mM ATP, 250 \mug/ml BSA. |
El gen ponB salvaje fue amplificado por
una etapa de reacción de PCR utilizando como cebadores los
oligonucleótidos M1 y M2 (fig.4). Cinco reacciones de PCR fueron
preparadas adicionando 50 ng del plásmido pPONBPBR que porta el gen
salvaje (7) a una mezcla que contiene 10 \mul de tampón de
polimerización, 10 \mul de dNTPs 2 mM, 20 pmol de cada
oligonucleótido M1 y M2, y 5U de Taq ADN polimerasa, en un volumen
final de 100 \mul. Estas mezclas fueron incubadas en un
termociclador Perkin-Elmer 9600 según el programa
siguiente: (94ºC - 2 min.) - (94ºC 15 seg. - 60ºC 30 seg. - 72ºC 1
min.) x 29 ciclos - (72ºC - 3 min.).
El producto de las cinco PCR fue mezclado y
dispuesto en un gel de agarosa TBE 1%. Después de la migración y la
coloración con bromuro de etidium del gel, la banda de 2651 pb, que
corresponde con el producto de amplificación del gen ponB
enmarcado por dos fragmentos de 26 pb y 90 pb respectivamente, fue
visualizada por trans-iluminación a los rayos
ultravioletas, y cortada con la ayuda de un escalpelo para ser
purificada con el sistema Quiaquick (QIAGEN). La totalidad del ADN
así purificado fue eluida en 120 \mul de tampón T. La
concentración de este ADN fue evaluada por una dosificación
espectrofotométrica a 260 nm, a 100 ng/\mul.
Los genes de los diez mutantes fueron
amplificados separadamente por medio de una reacción de PCR
utilizando los oligonucleótidos N y E. Estos oligonucleótidos
introducen respectivamente los sitios de restricción Nco I y
Eco RI, permitiendo clonar los productos obtenidos con estos
dos sitios.
Cada reacción de PCR fue preparada adicionando 50
ng del plásmido que porta el gen mutante a una mezcla que contiene
10 \mul de tampón de polimerización, 10 \mul de dNTPs 2 mM, 20
pmol de cada oligonucleótido N y E, y 5U de Taq ADN polimerasa, en
un volumen final de 100 \mul. Esta mezcla fue incubada en un
termociclador Perkin-Elmer 9600 según el programa
siguiente: (94ºC - 2 min.) - (94ºC 15 seg. - 60ºC 30 seg. - 72ºC 1
min.) x 29 ciclos - (72ºC - 3 min.).
La especificidad de la amplificación génica fue
verificada por el perfil de restricción con la endonucleasa Pvu
II, incubando 5 \mul de cada producto PCR 1 hora a 37ºC en una
mezcla que contiene 3 \mul de tampón de restricción A y 5U de la
enzima Pvu II en un volumen final de 30 \mul. 15 \mul de
esta reacción de digestión fueron depositados sobre un gel de
agarosa TBE 1%. Después de la migración y coloración con bromuro de
etidium, el gel fue expuesto a los rayos ultravioletas. La
visualización de los fragmentos de restricción permitió confirmar
la especificidad de la amplificación génica de cada gen mutante.
Paralelamente, 3 \mul de cada reacción PCR
fueron depositados sobre un gel de agarosa TBE 1%. Después de la
migración, el gel fue tratado como aquí arriba. La intensidad de
cada banda permitió estimar que las amplificaciones génicas avalan
el mismo rendimiento.
50 \mul de cada una de las diez PCR fueron
mezcladas y depositada sobre un gel de agarosa TBE 1%. Después de
la migración y coloración con bromuro de etidium, la banda de 2572
pb, que corresponde al producto de amplificación de los genes de
los diez mutantes, fue cortada con la ayuda de un escalpelo y
purificada con el sistema Quiaquick (QIAGEN). La totalidad del ADN
así purificado fue eluida en 120 \mul de tampón T. La
concentración de este ADN fue evaluada por una dosificación
espectrofotométrica a 260 nm, a 100 ng/\mul.
Para generar los bancos de fragmentos de
restricción, 100 \mul de este ADN fueron incubados una hora a
50ºC en una mezcla que contiene 12 \mul de tampón de restricción
B, 1,2 \mul de BSA (a 10 mg/ml), 25 U de la enzima Bsa I y
4 \mul de agua. Luego 2 \mul del tampón de restricción B, 2
\mul de BSA (a 1 mg/ml), 50 U de la enzima Hinf I y 11,5
\mul de agua fueron adicionados a la mezcla, que fue incubada una
hora a 37ºC. La totalidad de la mezcla de digestión fue purificada
sobre una columna QIAquick (QIAGEN), y eluida con 30 \mul de
tampón T. 1 \mul de este eluido fue dispuesto sobre gel de agarosa
TBE 1% para verificar que la digestión había sido total, y que la
misma había generado 6 fragmentos de restricción, y por consiguiente
seis bancos de fragmentos, de 590 pb, 500 pb, 472 pb, 438 pb, 298
pb y 274 pb. La concentración de este ADN fue evaluada (por una
dosificación espectofotométrica a 260 nm) a 250 ng/\mul.
La reacción de RLR (Recombining Ligation
Reaction) fue realizada incubando cantidades determinadas de
fragmentos de restricción Hinf I - Bsa I de los genes
de los diez mutantes con la matriz completa (es decir el gen
ponB salvaje), en presencia de una ADN ligasa termoestable.
La tabla IV aquí abajo reporta la composición de las mezclas de
RLR.
\vskip1.000000\baselineskip
| RLR 1 | RLR 2 | RLR 3 | RLR 4 | T- | |
| Fragmentos Hinf I - Bsa I de los | 0,5 \mul | 1 \mul | 2 \mul | 5 \mul | 5 \mul |
| diez mutantes (100 ng/\mul) | |||||
| Matriz ponB salvaje (100 ng/\mul) | 0,6 \mul | 1,2 \mul | 2,4 \mul | 6 \mul | 6 \mul |
| Tampón AMPLIGASE 10X | 2 \mul | 2 \mul | 2 \mul | 2 \mul | 2 \mul |
| AMPLIGASE (25 U/\mul) | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul | - |
| H_{2}O | qsp 20 \mul | qsp 20 \mul | qsp 20 \mul | qsp 20 \mul | qsp 20 \mul |
\vskip1.000000\baselineskip
El testigo negativo es idéntico a la reacción de
RLR4, pero no contiene ADN ligasa termoestable. Estas diferentes
mezclas fueron recubiertas con una gota de aceite mineral e
incubadas en un termociclador Perkin-Elmer 9600 en
microtubos de 200 \mul según el programa siguiente: (94ºC 5 min.)
- (94ºC 1 min. - 65ºC 4 min.) x 35 ciclos.
10 \mul de cada reacción de RLR fueron entonces
adicionados a una mezcla de reacción PCR que contiene 10 \mul de
tampón de polimerización, 10 \mul de dNTPs 2 mM, 40 pmol de cada
oligonucleótido A1 y A2, y 5 U de Taq ADN polimerasa en un volumen
final de 100 \mul. Esta mezcla fue incubada en un termociclador
Perkin-Elmer 9600 según el programa siguiente:
(94ºC 5 min.) - (94ºC 30 seg. - 46ºC 30 seg. - 72ºC 1 min.) x 29
ciclos - (72ºC 2 min.). Esta reacción de PCR permitió amplificar
específicamente los productos de ligación formados en el curso de
la reacción de RLR, sin amplificar la matriz, ya que los
oligonucleótidos A1 y A2 no pueden hibridarse sobre esta, como es
mostrado en la figura 4.
5 \mul de cada reacción de RLR y 10 \mul de
cada una de las reacciones de PCR precedentes fueron depositados
sobre un gel de agarosa TEB 1%. Después de la coloración con bromuro
de etidium, el gel fue expuesto a los rayos ultravioleta, como es
mostrado en la figura 5.
El análisis de este gel reveló que sólo la
reacción de RLR4 contiene, como el testigo negativo, fragmentos de
restricción todavía visibles (pistas 4 y 5).
La ausencia de producto PCR para el testigo
negativo (pista 10) reveló no solamente que la reacción PCR es
específica (sin amplificación de la matriz completa), sino también
que los fragmentos de restricción presentes en la mezcla no pueden
sustituirse con los cebadores para generar un producto PCR
contaminante en las condiciones seleccionadas. De manera paralela,
la presencia de una banda única de alrededor de 2500 pb sobre las
pistas 6, 7 y 8 demuestra que un producto de RLR pudo ser
amplificado por PCR para las reacciones de RLR1, 2 y 3. Estas tres
reacciones de RLR permitieron por lo tanto reconstituir uno o varios
genes completos a partir de seis bancos de fragmentos de
restricciones.
Los productos de amplificación PCR de las
reacciones de RLR1, 2 y 3 fueron purificados con el sistema Wizard
PCR Preps (PROMEGA) y eluidos en 45 \mul de tampón T, 6 \mul de
cada PCR purificada fueron incubados 1 hora a 37ºC en una mezcla
que contiene 3 \mul de tampón de restricción C, 3 \mul de BSA (a
1 mg/ml), 20 U de la enzima Eco RI, 10 U de la enzima
Nco I y 15 \mul de agua.
De manera paralela, dos vectores (pARAPONB y
pET26b+) fueron preparados para la clonación. Estos vectores fueron
linealizados incubando 3 \mug de estos plásmidos 2 horas a 37ºC,
en una mezcla que contiene 3 \mul de tampón de restricción C, 3
\mul de BSA (a 1 mg/ml), 20 U de la enzima Eco RI, 10 U de
la enzima Nco I y 19 \mul de agua.
Los vectores linealizados así como las PCR
digeridas fueron purificados sobre gel de agarosa TBE 1% con el
sistema QIAquick (QUIAGEN). Cada vector o cada PCR digerida fue
eluida en 30 \mul de tampón T.
La ligación de cada PCR digerida con uno u otro
de los vectores fue realizada según las condiciones descritas en la
tabla V aquí abajo, e incubadas a 16ºC durante 16 horas.
| Ligación con el vector pARABONB | Ligación con el vector pET26b+ | |||||||
| LpAR1 | LpAR2 | LpAR3 | TLpAR | LpET1 | LpET2 | LpET3 | TLpET | |
| PCR Amplificación RLR 1 | 4 \mul | - | - | - | 4 \mul | - | - | - |
| digerida Nco I - Eco RI | ||||||||
| PCR Amplificación RLR 2 | - | 4 \mul | - | - | - | 4 \mul | - | - |
| digerida Nco I - Eco RI | ||||||||
| PCR Amplificación RLR 3 | - | - | 4 \mul | - | - | - | 4 \mul | - |
| digerida Nco I - Eco RI | ||||||||
| Vector pARAPONB digerido | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul | - | - | - | - |
| Nco I - Eco RI | ||||||||
| Vector pET26b+ digerido | - | - | - | - | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul |
| Nco I - Eco RI | ||||||||
| Tampón de ligación | 2 \mul | 2 \mul | 2 \mul | 2 \mul | 2 \mul | 2 \mul | 2 \mul | 2 \mul |
| Ligasa | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul |
| H_{2}O | 12 \mul | 12 \mul | 12 \mul | 16 \mul | 12 \mul | 12 \mul | 12 \mul | 16 \mul |
200 \mul de células MC1061
quimio-competentes (4) fueron transformadas con 10
\mul de cada ligación por un shock térmico (5), y las células así
transformadas fueron expuestas sobre un medio de selección.
Ningún clon fue obtenido después de la
transformación de los testigos de ligación TL pAR y TL pET,
indicando de esta forma que los vectores pARAPONB y pET26b+
linealizados Nco I - Eco RI no pueden sufrir una
ligación intramolecular.
Un primer cribado de los clones obtenidos después
de la transformación de las ligaciones con el vector pARAPONB fue
realizado por PCR. 42 colonias, 14 de cada ligación LpAR1, LpAR2 y
LpAR3, fueron resuspendidas individualmente en una mezcla de PCR
que contiene 5 \mul de tampón de polimerización, 40 pmol de cada
oligonucleótido A1 y A2, 5 \mul de dNTPs 2 mM y 5U de Taq ADN
polimerasa en un volumen final de 50 \mul. Un testigo negativo fue
constituido adicionando a la mezcla de PCR 50 ng del plásmido
pBR322 en lugar de una colonia. Estos 43 tubos fueron incubados en
un termociclador Perkin-Elmer 9600 según el programa
siguiente: (94ºC 5 min.) - (94ºC 30 seg. - 46ºC 30 seg. - 72ºC 1
min.) x 29 ciclos - (72ºC 2 min.). 5 \mul de cada una de estas
reacciones PCR fueron seguidamente incubados 1 hora a 37ºC en una
mezcla que contiene 2 \mul de tampón de restricción A, 2 \mul
de BSA (a 1 mg/ml) y 5 U de la enzima de restricción Pvu II
en un volumen final de 20 \mul.
10 \mul de cada una de estas digestiones fueron
depositadas sobre un gel de agarosa TBE 1% en paralelo de 5 \mul
de cada PCR no digerida (lo que permite no confundir eventuales
bandas no específicas de la PCR con un fragmento obtenido por
digestión de restricción). Después de la migración y coloración con
bromuro de etidium de ese gel, las bandas salidas de la digestión
por la enzima Pvu II fueron analizadas a fin de determinar
cual(es) fragmento(s) de los mutantes iniciales se
habían asociado con los otros para reconstituir un gen entero. Este
cribado revela la presencia de 27 genes que portan una mutación, 7
genes que portan dos mutaciones y 8 genes que no portan
mutación.
El segundo cribado fue efectuado realizando una
extracción del ADN plasmídico (5) de 21 clones salidos de la
transformación de las ligaciones con el vector pET26b+ (7 clones de
cada ligación). 5 \mul del ADN plasmídico así obtenido para cada
clon fueron incubados 1 hora a 37ºC en presencia de una mezcla que
contiene 1 \mul de tampón de restricción C, 6 U de la enzima
Pst I, 3 U de la enzima Nco I y 6 U de la enzima
Eco RI en un volumen final de 10 \mul. 5 \mul de cada una
de esas digestiones fueron depositadas sobre un gel de agarosa TBE
1%. Después de la migración y coloración con bromuro de etidium de
ese gel, las bandas salidas de la digestión por la enzima
Pst I fueron analizadas a fin de determinar cual(es)
fragmento(s) de los mutantes iniciales se habían asociado
con los otros para reconstituir un gen entero. Este cribado revela
la presencia de 13 genes que portan una mutación, 5 genes que portan
dos mutaciones y 3 genes que no portan mutación.
En función de la posición de cada mutación con
relación a los sitios de corte de las enzimas Hinf I y
Bsa I, como es representado en la figura 6, es posible
calcular la probabilidad de obtener en el curso de la reacción de
RLR la creación de un gen que porta 0, 1, 2, 3 o 4 mutaciones de los
genes iniciales.
Así, considerando que la reacción de RLR es
totalmente aleatoria las probabilidades P son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
P(0
mutación) = \prod\limits^{9}_{i=6} \left(\frac{i}{10}\right) =
30,24%
P(1
mutación) = \sum\limits^{4}_{n=1} \left[\frac{n}{10 - n}
\prod\limits^{4}_{i=1}
\left(\frac{10-i}{10}\right)\right] =
44,04%
P(2
mutaciones) = \sum\limits^{4}_{n=1}
\left[\sum\limits^{4-n}_{n=1} \left(\frac{10 -
a}{a}\right) \left(\frac{10 - (a + n)}{a + n}\right)
\prod\limits^{4}_{i=1} \left(\frac{i}{10}\right)\right] =
21,44%
P(3
mutaciones) = \sum\limits^{4}_{n=1} \left[\left(\frac{10 -
n}{n}\right) \prod\limits^{4}_{i=1}
\left(\frac{i}{10}\right)\right] =
4,04%
P(4
mutaciones) = \prod\limits^{4}_{i=1} \left(\frac{i}{10}\right) =
0,24%
\vskip1.000000\baselineskip
Los dos cribados efectuados dan resultados
próximos a estas previsiones estadísticas, como es reportado en la
tabla VI aquí debajo, indicando de esta forma que la reacción de RLR
es casi aleatoria. Una proporción ligeramente más elevada de genes
que portan una mutación, en detrimento de los genes que portan cero
mutación es observada. Este fenómeno podría ser atribuido a una baja
toxicidad del gen ponB ya observada y a la ligera fuga de
vectores de expresión pARAPONB y pET26b+, que favorecerían la
selección de genes que portan una mutación
inactivante.
inactivante.
\vskip1.000000\baselineskip
| % | 0 mutación | 1 mutación | 2 mutaciones | 3 mutaciones | 4 mutaciones |
| Estadística | 30,24 | 44,04 | 21,44 | 4,04 | 0,24 |
| Cribado PCR | 21 | 63 | 16 | 0 | 0 |
| Cribado mini-preparación | 14 | 62 | 24 | 0 | 0 |
1) Broome-Smith J.K.,
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practical approach, Glover D.M. (Ed), IRL Press, Oxford
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Acids Res., 25, 447-448.
9) Lefèvre F., Rémy M.H. y
Masson J.M., 1997 (b), Topographical and functional
investigation of Escherichia coli Penicillin Binding Protein
1b by alanine stretch scanning mutagenesis, J. Bacteriol.,
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10) Lyamichev V., Mast A.L.,
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recombination, Nature Biotech., 16,
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Claims (40)
1. Procedimiento de recombinación aleatoria in
vitro de fragmentos de ácidos nucleicos, caracterizado
porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- la fragmentación de un banco de secuencias de polinucleótidos
- b)
- la hibridación de los fragmentos obtenidos sobre una matriz de acoplamiento
- c)
- la ligación de los fragmentos hibridados que poseen extremos adyacentes con la ayuda de una ligasa
- d)
- la desnaturalización de los fragmentos ligados de la matriz de acoplamiento, y la repetición de las etapas de hibridación (b), de ligación (c) y de desnaturalización (d) para formar varias recombinaciones aleatorias,
dicho procedimiento estando además
caracterizado por el hecho de que las etapas (a) a (d) son
realizadas en ausencia de polimerasa.
2. Procedimiento de recombinación aleatoria in
vitro de fragmentos de ácidos nucleicos según la reivindicación
1, caracterizado porque comprende además la etapa
siguiente
- e)
- la selección de las secuencias de polinucleótidos recombinadas que presentan propiedades ventajosas con relación a las propiedades correspondientes a una o varias secuencias de referencia.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque comprende la separación de las
secuencias de polinucleótidos recombinadas de la o de las matrices
de acoplamiento antes de la etapa (e).
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque comprende la
amplificación de las secuencias de polinucleótidos recombinadas de
doble hebra antes de la etapa (e).
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque comprende antes
de la etapa (e), la clonación de las secuencias de polinucleótidos
recombinadas eventualmente después de la separación de las hebras
recombinadas de la o de las matrices y la obtención de la doble
hebra correspondiente.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los
extremos de los fragmentos generados en la etapa (a) son tales que
puede haber hibridación adyacente de estos extremos sobre la o las
matrices de acoplamiento en la etapa (b) y ligación de estos
fragmentos unos con otros en la etapa (c).
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
secuencias de polinucleótidos del banco presentan zonas de homología
tanto entre ellas, como con las matrices de acoplamiento, de forma
de generar en la etapa (a) extremos de fragmentos que permiten la
hibridación adyacente de estos extremos sobre la o las matrices de
acoplamiento en la etapa (b) y la ligación de estos fragmentos unos
con otros en la etapa (c).
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
etapas (b) y (c) son realizadas simultáneamente.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
fragmentación de las secuencias de polinucleótidos en la etapa (a)
se hace de manera controlada o de manera aleatoria.
10. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la etapa
(a) consiste en someter las secuencias de polinucleótidos del banco
a una hidrólisis por la acción de una o varias enzimas de
restricción.
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el grado
de recombinación y la posición de los puntos de recombinación de las
secuencias de polinucleótidos recombinadas son determinados por la
fragmentación de la etapa (a) si la misma es realizada de manera
controlada.
12. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la fragmentación
aleatoria de las secuencias de polinucleótidos en la etapa (a) se
realiza por cualquier medio enzimático o mecánico conocido.
13. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se
adiciona en una o varias de las etapas (b) a (d) enzimas capaces de
reconocer y de cortar de manera específica los extremos no
hibridados de los fragmentos, cuando dichos extremos recubren otros
fragmentos hidridados sobre la misma matriz.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque se adiciona en una o varias de las
etapas (b) a (d) la enzima Flap endonucleasa.
15. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se
utiliza en la etapa (c) una ligasa activa a alta temperatura y de
preferencia termoestable.
16. Procedimiento según las reivindicaciones 13 y
14, caracterizado porque las endonucleasas capaces de
reconocer y de cortar de manera específica los extremos no
hibridados de los fragmentos adicionados en una o varias de las
etapas (b) a (d) tienen las mismas propiedades de termoresistencia y
de actividad a alta temperatura que la ligasa utilizada en la etapa
(c).
17. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el banco
de secuencias de polinucleótidos utilizados para la etapa (a) de
fragmentación está constituido de varios genes generados por
mutagénesis a partir de un gen o combinando genes de familias
próximas o distintas en el seno de la misma especie o de especies
diferentes.
18. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
secuencias de polinucleótidos del banco utilizado para la etapa (a)
de fragmentación presentan zonas de homología entre ellas.
19. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el banco
de secuencias de polinucleótidos de doble hebra está constituido de
secuencias sintéticas que serán fragmentadas en la etapa (a) o que
pueden constituir los fragmentos de la etapa (a).
20. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la etapa
(a) consiste en someter el banco a una hidrólisis por la acción de
enzimas de restricción que tienen un gran número de sitios de corte
sobre las secuencias de polinucleótidos del banco, o combinando
varias enzimas de restric-
ción.
ción.
21. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 y 12 a 19, caracterizado porque la
etapa (a) consiste en un tratamiento aleatorio con la ADNsa I de un
banco de secuencia de polinucleótidos de doble hebra parcialmente
heterólogas.
22. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 o 21, caracterizado porque se utilizan
fragmentos generados por un tratamiento de forma aleatoria como
matrices unas por las otras, para la hibridación en el curso de la
etapa (b) o de la reacción de las etapas (b) y (c)
simultaneadas.
23. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 o 20, caracterizado porque la etapa (b)
es realizada combinando al menos dos bancos de fragmentos distintos
generados de manera separada en la etapa (a) a partir del mismo
banco por un tratamiento con enzimas de restricción diferentes.
24. Procedimiento según la reivindicación 23,
caracterizado porque se utilizan los fragmentos obtenidos en
al etapa (a) por un tratamiento con enzimas de restricción como
matrices unos por otros, para la hibridación en el curso de la
etapa (b) o de la reacción de las etapas (b) y (c)
simultaneadas.
25. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, 11, 13 a 17, caracterizado porque
los fragmentos de la etapa (a) son obtenidos por reacciones de
amplificación conducidas sobre las secuencias de polinucleótidos
del banco.
26. Procedimiento según la reivindicación 25,
caracterizado porque las reacciones de amplificación son
realizadas con oligonucleótidos cebadores que permiten generar
fragmentos cuyos extremos son adyacentes a todo lo largo de la
secuencia de acoplamiento.
27. Procedimiento según la reivindicación 25,
caracterizado porque las reacciones de amplificación son
realizadas con oligonucleótidos cebadores que permiten generar
fragmentos que tienen secuencias comunes, dichos fragmentos sirven
de matriz de acoplamiento unos por otros en la etapa (b).
28. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque en la etapa
(a) el banco es fragmentado en n fragmentos, n siendo superior o
igual a tres.
29. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, 23, 25 a 28 caracterizado porque la
matriz de acoplamiento en al etapa (b) o (c) es una secuencia de
polinucleótidos salida del banco o una secuencia de consenso de
dicho banco, de simple o de doble hebra.
30. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, 23, 25 a 28 caracterizado porque se
utiliza como matriz de acoplamiento en las etapas (b) o (c)
oligonucleótidos de simple o doble hebra complementarios con el
extremo 3' de un fragmento y 5'del fragmento adyacente.
31. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque se adiciona en
la etapa (b) además de la matriz, oligonucleótidos, de simple o
doble hebra, de longitud variable.
\newpage
32. Procedimiento según la reivindicación 31,
caracterizado porque, antes de la etapa (e), se separan las
secuencias de polinucleótidos recombinadas de la matriz de
acoplamiento gracias a un marcador presente sobre la matriz de
acoplamiento o sobre las secuencias de polinucleótidos
recombinadas.
33. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 32, caracterizado porque las secuencias
de polinucleótidos recombinadas obtenidas en la etapa (d) y
eventualmente clonadas son cribadas por cualquier medio apropiado
para seleccionar las secuencias de polinucleótidos recombinadas o
los clones que presentan propiedades ventajosas con relación a las
propiedades correspondientes de secuencias de referencia.
34. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 33, caracterizado porque el banco de
secuencias de polinucleótidos está constituido por uno o varios
bancos preparados por un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 33, eventualmente mezcladas con otras
secuencias de polinucleótidos.
35. Utilización del procedimiento según una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes para seleccionar una
secuencia de polinucleótidos recombinada que presenta propiedades
ventajosas con relación a las propiedades correspondientes a una o
varias secuencias de referencia.
36. Utilización del procedimiento según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 para seleccionar una
secuencia de polinucleótidos recombinada que codifica para una
proteína que presenta una o varias propiedades ventajosas con
relación a las proteínas de referencia.
37. Utilización de una ligasa y de la hibridación
sobre una matriz de acoplamiento de fragmentos obtenidos a partir
de un banco de secuencias de polinucleótidos en un procedimiento de
recombinación para obtener varios fragmentos recombinados de manera
aleatoria.
38. Utilización según la reivindicación 37,
caracterizada porque la recombinación no necesita de la
etapa de polimerización in vitro.
39. Utilización según la reivindicación 38,
caracterizada porque el banco de secuencias de
polinucleótidos es generado a partir de un gen por una técnica de
mutagénesis o combinando genes de familias próximas o distintas en
el seno de la misma especie o de especies diferentes.
40. Utilización del procedimiento según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 para seleccionar una
secuencia de polinucleótidos recombinada de manera aleatoria que
codifica para una nueva molécula terapéutica.
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