ES2253036B1

ES2253036B1 - Peptidos bioactivos derivados de proteinas de la clara de huevo mediante hidrolisis enzimatica.

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Publication number: ES2253036B1
Application number: ES200301829A
Authority: ES
Inventors: Marta Miguel Castro; Rosina Lopez-Alonso Fandiño; Isidra Recio Sanchez; Mercedes Ramos Gonzalez; Amaya Aleixandre De Artiñano
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2003-07-31
Filing date: 2003-07-31
Publication date: 2007-07-16
Anticipated expiration: 2023-07-31
Also published as: ES2253036A1; ATE388166T1; DE602004012289T2; WO2005012355B1; JP2007523045A; EP1661913A1; ES2303090T3; WO2005012355A1; DK1661913T3; US8227207B2; US20060280804A1; EP1661913B1; DE602004012289D1

Abstract

Péptidos bioactivos derivados de proteínas de la clara de huevo mediante hidrólisis enzimática. La invención consiste en la producción de ovoproductos conteniendo péptidos bioactivos a partir de clara de huevo sometida a un tratamiento enzimático. Dichos péptidos muestran actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (actividad IECA) in vitro y/o actividad antihipertensiva en ratas y/o actividad antioxidante. Estos ovoproductos: los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos de bajo peso molecular, o sus péptidos constituyentes, podrían utilizarse como sustancias terapéuticas con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva y/o con actividad antioxidante, ya sea como productos alimentarios funcionales, aditivos o ingredientes alimentarios, o productos farmacéuticos, para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un animal y para el tratamiento y/o la prevención de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en un animal.

Description

Péptidos bioactivos derivados de proteínas de la clara de huevo mediante hidrólisis enzimática.

Sector de la técnica

La invención consiste en la producción de ovoproductos bioactivos derivados de proteínas de clara de huevo. Éstas dan lugar, tras un tratamiento enzimático, a péptidos con actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (actividad IECA) in vitro y/o actividad antihipertensiva y/o antioxidante, que pueden aplicarse en la industria alimentaria y farmacéutica.

Estado de la técnica

El papel del huevo en la nutrición humana es esencial ya que constituye un alimento nutritivo y saludable. El reciente desarrollo de nuevas técnicas biotecnológicas y de separación permite el fraccionamiento de distintos componentes del huevo para ser usados con nuevos propósitos alimenticios o no alimenticios y, de este modo, están apareciendo nuevas aplicaciones que contribuyen a aumentar su consumo. Así, distintas empresas dedicadas a la producción de proteínas aisladas a partir de fracciones del huevo, están interesadas en aumentar y diversificar los usos de algunos componentes, como la ovoalbúmina y la ovotransferrina. Este es el caso de las industrias dedicadas a la producción de lisozima, utilizada como agente antimicrobiano, que obtienen como subproductos otras fracciones nitrogenadas de bajo coste, destinadas generalmente a alimentación animal o para su uso como emulgentes y gelificantes en distintos alimentos.

En los últimos años, los alimentos funcionales han irrumpido con fuerza en el sector alimentario, debido a la mayor concienciación de los consumidores de la relación existente entre la dieta y la salud. Dentro de los ingredientes funcionales, es decir, componentes que, incorporados al alimento, proporcionan al mismo actividades biológicas específicas que van más allá de la mera nutrición, ocupan un lugar destacado los péptidos bioactivos, por su diversidad y multifuncionalidad. Los péptidos bioactivos corresponden a fragmentos que se encuentran inactivos dentro de la proteína precursora, pero que pueden liberarse mediante hidrólisis in vivo o in vitro y, en esta forma, ejercer distintas funciones fisiológicas en el organismo. Desde su descubrimiento, en 1979, se han descrito péptidos derivados de proteínas alimentarias con diferentes actividades biológicas: antihipertensiva, antitrombótica, opiácea, antioxidante, inmunomodulante, etc.

Entre los péptidos bioactivos, cabe destacar aquellos que ejercen actividad antihipertensiva mediante la regulación del sistema renina-angiotensina (T. Takano, Milk derived peptides and hypertension reduction, International Dairy Journal, 1998, 8: 375-381). Es notoria la elevada incidencia de enfermedades coronarias en la población, y el tratamiento de la hipertensión constituye una de las estrategias más utilizadas para reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares. El mecanismo de acción de estos péptidos se ha explicado mediante la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), que cataliza la formación de angiotensina II, un octapéptido con una potente actividad vasoconstrictora y, además, inactiva la bradiquinina, que produce vasodilatación. Se han descubierto distintos péptidos con actividad inhibidora de la ECA (IECA), obtenidos a partir de hidrolizados enzimáticos de proteínas de suero lácteo (WO01/85984, Enzymatic treatment of whey proteins for the production of antihypertensive peptides, the resulting products and treatment of hypertension in mammals), caseínas (US6514941, Method of preparing a casein hydrolysate enriched in anti-hypertensive peptides), etc.

Otro grupo de péptidos bioactivos de gran importancia es el de los péptidos con actividad antioxidante. El envejecimiento y diversas patologías (alteraciones neurológicas, procesos cancerosos, cataratas, etc.) están relacionados con la oxidación de componentes celulares, como lípidos, proteínas o ADN, por lo que la inclusión de antioxidantes en la dieta tiene un carácter preventivo. Además, de su acción biológica, estos compuestos pueden prevenir la oxidación de las grasas, evitando la aparición de sabores desagradables en los alimentos. Algunas investigaciones han puesto de manifiesto la capacidad de distintas proteínas y de hidrolizados de las mismas para ejercer una acción antioxidante, bien actuando como secuestradores de radicales libres (K. Suetsuna, H. Ukeda y H. Ochi, Isolation and characterization of free radical scavenging activities peptides derived from casein, Journal of Nutritional Biochemistry, 2000, 11:128-131) o inhibiendo enzimas relacionadas con la oxidación de las grasas (S. G. Rival, S. Fornaroli, C. G.
Boeriu y H. J. Wichers, Caseins and casein hydrolysates. I. Lipoxygenase inhibitory properties, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49: 287-294). Debe destacarse que los estudios de la relación estructura-actividad de los péptidos IECA y antioxidantes han puesto de manifiesto una caracteristica común a ambos: la importancia de ciertos aminoácidos hidrofóbicos en estas dos actividades biológicas (H. M. Chen, K. Muramoto, F. Yamauchi, K. Fujimoto y K. Nokihara, Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46: 49-53).

Entre las estrategias más utilizadas para la obtención de péptidos activos para su uso alimentario, destacan la hidrólisis enzimática y los procesos fermentativos. Por otra parte, en los últimos años se han propuesto distintos tratamientos tecnológicos para la funcionalización de proteínas. El empleo de altas presiones hidrostáticas, como método físico de desnaturalización, tiene como resultado la modificación de los enlaces no covalentes responsables de la estructura de las proteínas, dando lugar a cambios conformacionales que conducen a un estado desplegado. Varios estudios han demostrado que la proteolisis se acelera y aparecen distintos productos de hidrólisis bajo condiciones de alta presión, en comparación con lo que ocurre a presión atmosférica (F. Bonomi, A. Fiocchi, H. Frokiaer, A. Gaiaschi, S. Iametti, C. Poesi, P. Rasmussen, P. Restani y P. Royere, Reduction of immunoreactivity of bovine \beta-lactoglobulin upon combined physical and proteolytic treatment, Journal of Dairy Research, 2003, 70: 51-59). Además, debe tenerse en cuenta que la mayoría de las enzimas mantienen su actividad hasta 400 MPa, inactivándose a presiones mayores. Sin embargo, en la bibliografia no se ha descrito la producción de péptidos bioactivos en condiciones de alta presión.

A diferencia de otras proteínas alimentarias, existen muy pocos estudios relacionados con péptidos bioactivos derivados de las proteínas de huevo, aún siendo éstas una fuente de nitrógeno muy importante en la dieta. H. Fujita, K Yokoyama, y M. Yoshikawa (Classification and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins, Journal of Food Science, 2000, 65: 564-569) encontraron actividades IECA en hidrolizados de ovoalbúmina con pepsina y termolisina, con valores de IC_{50} (concentración que inhibe el 50% de la actividad de la enzima) de 45.0 y 83.0 \mug/ml respectivamente. Estos autores aislaron seis péptidos con actividad IECA a partir del hidrolizado con pepsina, con valores de IC_{50} de 0.4 a 15 \muM, pero ninguno de ellos, excepto el dipéptido LW, mostró actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas (SHR). Se postuló que dichos péptidos serian sustratos de la ECA, pero no verdaderos inhibidores, por lo que mostrarian actividades IECA aparentes en el ensayo in vitro (H. Fujita y M. Yoshikawa, LKPNM: a prodrug-type ACE-inhibitory peptide derived from fish protein, Immunopharmacology, 1999, 44:123-127). Estas observaciones ponen de manifiesto que la determinación de la actividad IECA in vitro, si bien es un buen punto de partida de trabajo, no puede convertirse en el único criterio de selección, al no tener en consideración las transformaciones fisiológicas en el organismo que determinan la biodisponibilidad de los péptidos (digestión y paso a través de la barrera gastrointestinal para llegar a la sangre en forma activa).

Se han descrito dos péptidos con actividad vasodilatadora, que provienen de la misma región de la ovoalbúmina hidrolizada con diferentes enzimas. H. Fujita, H. Usui, K. Kurahashi y M. Yoshikawa (Isolation and characterization of ovokinin, a bradykinin B1 agonist peptide derived from ovoalbumin, Peptides, 1995, 16: 785-790) encontraron que la ovokinina, un octapéptido aislado de un hidrolizado de ovoalbúmina con pepsina (FRADHPFL), mostraba actividad vasorelajadora en arterias mesentéricas caninas, pero no poseía actividad IECA. La ovokinina poseía actividad antihipertensiva cuando se administraba oralmente a ratas espontáneamente hipertensas (SHR) a dosis de 100 mg/kg (H. Fujita, R. Sasaki y M. Yoshikawa, Potentiation of the antihypertensive activity of orally administerrd ovokinin, a vasorelaxing peptide derived from ovalbumin, by emulsification in egg phosphatidyl-choline, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1995, 59: 2344-2345). N. Matoba, H. Usui, H. Fujita y M. Yoshikawa (A novel anti- hipertensive peptide derived from ovalbumin induces nitric oxide-mediated vasorelaxation in an isolated SHR mesenteric artery, FEBS Letters, 1999, 452:181-184), purificaron a partir de un hidrolizado de ovoalbúmina con quimotripsina, un hexapéptido correspondiente al fragmento 2-7 de la ovokinina (RADHPF, ovokinina (2-7)) que ejercía una potente acción vasodilatadora en SHR a dosis de 10 mg/kg.

Posteriormente, se sintetizaron análogos de la ovokinina (2-7) con el objetivo de aumentar su actividad antihipertensiva. Entre ellos, RPFHPF y RPLKPW, mostraron, respectivamente 10 y 100 veces más actividad que la ovokinina (2-7) tras su administración oral a SHRs (dosis mínimas efectivas de 1 y 0.1 mg/kg), lo que se atribuyó a una mayor resistencia a las proteasas del tracto digestivo (N. Matoba, Y. Yamada, H. Usui, R. Nakagiri y M. Yoshikawa, Designing potent derivatives of ovokinin (2-7), an anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2001, 65: 736-739 y Y. Yamada, N. Matoba, H. Usui y K. Onishi, Design of a highly potent anti-hypertensive peptide based on ovokinin (2-7), Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2002, 66: 1213-1217). Debe destacarse que, de acuerdo con estos autores y a diferencia de la mayoria de los péptidos antihipertensores de origen alimentario, ni la ovokinina (2-7), ni sus derivados RPFHPF o RPLKPW poseerían actividad IECA. Se ha postulado que disminuirian la presión arterial a través de su interacción con receptores del tracto gastrointestinal o debido a efectos en el sistema nervioso central.

Dada la alta calidad biológica de las proteínas del huevo, es de gran interés obtener, a partir de éstas, péptidos bioactivos que consumidos como parte de la dieta, además de ejercer sus funciones nutricionales básicas, sean capaces de producir efectos metabólicos o fisiológicos, útiles en el mantenimiento de la salud. La producción de péptidos bioactivos a partir de las proteínas de la clara de huevo permitiria encontrar nuevos usos al huevo de gallina, más allá de su valor alimenticio clásico, incluyendo la producción de bioproductos medicinales y nutracéuticos. Esto contribuiria al desarrollo de alimentos saludables, seguros y de alta calidad, contribuyendo al aprovechamiento y revalorización de los ovoproductos.

Descripción de la invención Breve descripción de la invención

La presente invención consiste en la producción de ovoproductos que contienen péptidos bioactivos con actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante, mediante hidrólisis enzimática de proteínas de huevo.

Los péptidos bioactivos se producen mediante la hidrólisis de una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos, que contengan la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos bioactivos (preferentemente que contengan ovoalbúmina), empleando enzimas (preferentemente pepsina) y condiciones de hidrólisis que permitan la ruptura de la cadena proteica en los lugares adecuados para su liberación. También pueden obtenerse mediante síntesis química o enzimática o mediante métodos recombinantes etc. Dichos péptidos pueden consumirse como tales, o a partir de los hidrolizados crudos, de concentrados de bajo peso molecular o de otras subfracciones activas obtenidas mediante métodos de separación por tamaño o métodos cromatográficos.

Además de formar parte de productos alimenticios, tales hidrolizados, sus fracciones o los péptidos también podrian formar parte de productos farmacéuticos. Así, podrian auxiliar en el tratamiento y prevención de enfermedades, particularmente, en el control de la presión arterial. La invención amplía las aplicaciones de las proteínas del huevo, contribuyendo a su aprovechamiento y revalorización.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un método para producir péptidos bioactivos a partir de proteínas de clara de huevo. Dichos péptidos bioactivos son los identificados con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8 (tabla 1), algunos de los cuales poseen actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante.

El material de partida de la presente invención sería cualquier sustrato apropiado que comprendiese una o más proteínas o péptidos, de origen animal, vegetal o procedentes de microoganismos, que contengan la secuencia de aminoácidos de los péptidos bioactivos de interés (SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8, tabla 1), preferiblemente ovoalbúmina o clara de huevo. Dado que todos ellos pertenecen a la secuencia de la ovoalbúmina, resulta obvio que podría usarse cualquier preparado que contenga ovoalbúmina o péptidos o fragmentos de ovoalbúmina de cualquier tamaño, solos o mezclados con otras proteínas. Por ejemplo: ovoalbúmina pura, clara de huevo y huevo entero en sus diferentes formas de presentación, ovoproductos destinados a hostelería y restauración, complementos dietéticos para deportistas ovoproductos para alimentación animal etc.

Dicho material de partida se disuelve o dispersa, a una concentración apropiada, en agua o en una disolución tampón, a un pH adecuado para la actuación de la enzima proteolítica. Puede emplearse cualquier enzima proteolítica capaz de romper la proteína presente en el material de partida y proporcionar los péptidos de interés, pero preferiblemente pepsina a pH 2-0-3.0. También podrían emplearse microorganismos proteolíticos que llevaran a cabo una fermentación del sustrato.

Las condiciones de hidrólisis: pH, temperatura, presión, relación enzima-sustrato, interrupción de la reacción etc., se optimizan con el fin de seleccionar los hidrolizados más activos. En una realización particular, se obtienen los péptidos bioactivos empleando pepsina a pH 2.0, en una relación enzima/sustrato 1/100, p/p y realizando la hidrólisis a 37°C y a presión atmosférica (0.1 MPa), durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 min y 24 horas, pero, preferiblemente durante un tiempo inferior a 3 horas. El empleo de altas presiones hidrostáticas, hasta 400 MPa, acelera la hidrólisis del sustrato sin inhibir la enzima proteolítica y modifica el perfil de los péptidos obtenidos.

A continuación, si se desea concentrar los péptidos bioactivos y dado que los péptidos con actividad IECA contienen de 3 a 6-7 aminoácidos, aproximadamente (A. Pihlanto-Leppälä, T. Rokka y H. Korhonen, Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine milk proteins, International Dairy Journal, 1998, 8:325-331), se pueden obtener, a partir de los hidrolizados, fracciones de bajo peso molecular mediante métodos tales como ultrafiltración, diálisis, electrodiálisis con membranas de tamaño de poro adecuado, cromatografia de filtración por gel, etc. En una realización particular, se obtienen las fracciones de peso molecular menor de 3000 Da de los hidrolizados mediante ultrafiltración a través de una membrana hidrofilica de 3000 Da. Dichas fracciones muestran mayor actividad IECA y antihipertensiva que los hidrolizados de partida. A partir de las fracciones de bajo peso molecular de los hidrolizados pueden aislarse subfracciones activas mediante cromatografia de interacción hidrofóbica, cromatografia de intercambio iónico o, preferiblemente cromatografia de alta eficacia en fase inversa.

Además de los hidrolizado completos y sus fracciones, los péptidos mostrados en la tabla 1 y señalados con las SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8, poseen propiedades bioactivas, fundamentalmente actividad IECA y/o antihipertensiva y/o antioxidante y son también objeto de la presente invención. En concreto, los péptidos identificados con las secuencias SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 5 y SEQ. ID. N°. 6 muestran una potente actividad IECA in vitro y las secuencias SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3 y SEQ. ID. N°. 6 poseen actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas (SHR), pero no así en ratas normotensas Wistar-Kyoto (WKY) cuando se administran por via oral. Por otra parte, al menos el péptido identificado como SEQ. ID. N°. 6, posee actividad antioxidante frente a radicales libres. Debe destacarse que se trata de péptidos naturales de los que cabe esperar pocos efectos secundarios y buena tolerancia.

Asimismo, los péptidos bioactivos identificados en los hidrolizados (SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8) pueden obtenerse por síntesis química y/o enzimática de péptidos o por métodos recombinantes.

TABLA 1 Secuencias de los péptidos bioactivos identificados

	YQIGL	SEQ. ID. N°. 1
	IVF	SEQ. ID. N°. 2
	RADHPFL	SEQ. ID. N°. 3
	FSL	SEQ. ID. N°. 4
	FRADHPFL*	SEQ. ID. N°. 5
	YAEERYPIL	SEQ. ID. N°. 6
	RDILNQ	SEQ. ID. N°. 7
	SALAM	SEQ. ID. N°. 8
* \begin{minipage}[t]{140mm} Secuencia previamente identificada como ovokinina (H. Fujita; H. Usui; K. Kurahashi y M. Yoshikawa, Isolation and characterization of ovokinin, a bradykinin B1 agonist peptide derived from ovoalbumin, Peptides, 1995, 16: 785-790). Debe destacarse que estos autores comprobaron su actividad vasodilatadora en arterias mesentéricas caninas, pero afirman que no posee actividad IECA.\end{minipage}

No se había descrito previamente la obtención de péptidos bioactivos a partir de hidrolizados de clara de huevo con pepsina, aunque ya se había puesto de manifiesto la actividad IECA in vitro de hidrolizados de ovoalbúmina (H. Fujita, K Yokoyama, y M. Yoshikawa, Classification and antihypertensive activity of antiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins, Journal of Food Science, 2000, 65: 564-569). La clara de huevo resulta un sustrato proteico barato y fácilmente asequible para producir péptidos bioactivos. Por otra parte, tampoco se había demostrado la actividad antihipertensiva in vivo de los hidrolizados de ovoalbúmina. Como ya se ha explicado, debe destacarse que con frecuencia, muchos péptidos que se muestran como potentes inhibidores de la ECA in vitro pierden toda o parte de su actividad cuando son ensayados in vivo, o incluso, péptidos que in vitro no presentan gran actividad como inhibidores de la ECA la adquieran in vivo debido a la actuación de enzimas digestivas (M. Maeno, N. Yamamoto y T. Takano, Identification of an anti-hypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus helveticus CP790, Journal of Dairy Science, 1996, 79: 1316-1321).

Estos ovoproductos: los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos de bajo peso molecular, o uno o más de sus péptidos bioactivos constituyentes (incluyendo sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas), podrían utilizarse como sustancias terapéuticas con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante. Dichos ovoproductos pueden ser sometidos a un tratamiento térmico, como la pasteurización, o bien someterse a secado o liofilización etc., para emplearse como productos alimentarios funcionales, aditivos o ingredientes alimentarios, o productos farmacéuticos, para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas, principalmente en seres humanos, aunque también en animales. La cantidad de hidrolizado, fracción de bajo peso molecular, péptidos, sus derivados o sales farmaceúticamente aceptables y sus mezclas, así como su dosificación para el tratamiento de alguna patología variará dependiendo de numerosos factores, como la edad, severidad de la patología o disfunción, vía de administración y frecuencia de la dosis. Estos compuestos podrían presentarse en cualquier forma de administración, sólido ó líquido, y administrarse por cualquier vía apropiada oral, respiratoria, rectal o tópica, aunque particularmente están diseñados para una administración sólida o líquida por vía oral.

En general, el proceso de obtención de estos ovoproductos: los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos de bajo peso molecular y sus péptidos constituyentes, se podrá optimizar, dirigiéndolo a la producción de la mayor cantidad posible de péptidos bioactivos o para controlar en lo posible la aparición de amargor, originado normalmente por una elevada concentración de péptidos hidrófobos de peso molecular intermedio o bajo.

Procedimientos analíticos Medida de la actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (IECA)

La actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) se mide in vitro de acuerdo con el método de D. W. Cushman y H. S. Cheung (Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung, Biochemical Pharmacology, 1971, 20:1637-1648), modificado posteriormente por Y. K. Kim, S. Yoon, D. Y. Yu., B. Lönnerdal y B. H. Chung (Novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from recombinant human \alpha_{s1}-casein expressed in Escherichia coli. Journal of Dairy Research 1999, 66, 431-439).

El sustrato hipuril histidil leucina (HHL, Sigma, Chemicals Co, St. Louis, MO, USA) se disuelve en tampón borato 0.1 M con NaCl 0.3 M, pH 8.3, para obtener una concentración final 5 mM. A 100 \mul de sustrato se le añaden 40 \mul de cada una de las muestras cuya actividad IECA se quiere determinar. Se adiciona la enzima ECA (EC 3.4.15.1, Sigma), disuelta en glicerol al 50%, y diluida en el momento de realizar el ensayo 1/10 en agua bidestilada. La reacción se lleva a cabo a 37°C, durante 30 minutos en un baño de agua. La enzima se inactiva descendiendo el pH con 150 \mul de HCl IN. El ácido hipúrico formado se extrae con 1000 \mul de acetato de etilo. Tras agitación en vórtex durante 20 segundos, se centrifuga a 4000 rpm durante 10 min y a temperatura ambiente. Se toman 750 \mul de la fase orgánica que se evapora por calentamiento a 95°C durante 10 minutos. El residuo de ácido hipúrico se redisuelve en 800 \mul de agua bidestilada y, tras agitar durante 20 segundos, se mide la absorbancia a 228 nm en un espectrofotómetro Dur-70 de Beckman Instruments, Inc., Fullerton, EEUU.

Para calcular el porcentaje de IECA se emplea la fórmula siguiente:

% IECA = \frac{Acontrol-Amuestra}{Acontrol-Ablanco} * 100

El blanco se utiliza para corregir la absorbancia de fondo. Este contiene sustrato, enzima y 20 \mul de agua bidestilada en lugar de muestra, y la reacción se para a tiempo cero. El control supone el cien por cien de la acción enzimática sobre el sustrato en ausencia de inhibidores, y contiene 20 \mul de agua en lugar de muestra y se incuba el mismo tiempo que la muestra.

Los resultados se presentan como el IC_{50} (\muM o \mug/ml) o concentración a la que se inhibe el 50% de la actividad de la enzima. La concentración de proteína se determina mediante el ensayo del ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EEUU) empleando como patrón seroalbúmina bovina.

Medida de la actividad antioxidante

Para la medida de la actividad antioxidante, se utiliza el método desarrollado por R. Re, N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M. Yang y C. Rice-Evans (Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay, Free Radical Biological Medicine, 1999, 26: 1231-1237). El método se basa en la desaparición del radical ABTS^{\bullet+} (ácido 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) debido a la acción reductora de diferentes muestras con actividad antioxidante. El radical ABTS^{\bullet+} presenta un máximo de absorbancia a 734 nm. La actividad antioxidante se detecta por la disminución en el tiempo de la absorbancia de 734 nm.

Para generar el radical ABTS^{\bullet+}, el compuesto ABTS (Sigma), disuelto en agua a una concentración 7 mM, se pone en contacto con persulfato potásico 2.45 mM en una relación 1:2 durante 24 horas evitando la luz. Después de 24 horas, la absorbancia a 734 nm se ajusta a un valor de 0.70 \pm0.02 con tampón fosfato salino (PBS) 5 mM, 138 mM de NaCl, pH = 7.4. En un experimento típico, 1 ml de esta solución se añade a 10 \mul de la muestra (1.5 mM), disuelta en tampón fosfato sódico 0,02 M, pH= 6,5. El experimento se realiza por triplicado, incubando cada muestra con el radical ABTS^{\bullet+} durante 10 minutos a 37°C, haciendo lecturas de la absorbancia a 734 nm en el minuto 1, 6 y 10. Como blanco se utiliza tampón fosfato sódico 0.02 M, pH= 6.5 y al mismo tiempo que se realiza la incubación de las muestras, se incuba el radical ABTS^{\bullet+} sin agente antioxidante (control). La actividad antioxidante de cada muestra se calcula con respecto a la absorbancia a 734 nm que presenta el control. La actividad antioxidante de la muestra se expresa en relación a la actividad antioxidante del Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico) (Sigma), análogo de la vitamina E, mediante un valor TEAC (capacidad antioxidante equivalente al Trolox) a un determinado tiempo.

Se han desarrollado diferentes maneras de calcular el valor TEAC. Utilizamos el método descrito por F.W.P.C. van Overlveld, G.R.M.M. Haenen, J. Rhemrev, J.P.W. Vermeiden y A. Bast (Tyrosine as important contributor to the antioxidant capacity of seminal plasma, Chemical and Biological Interactions, 2000, 127: 151-161), que es válido para calcular el valor TEAC de un compuesto puro, el cual provoca una disminución de la absorbancia que aumenta linealmente al aumentar la concentración. En este caso solo haría falta calcular una concentración determinada de un compuesto para poder calcular su valor TEAC.

TEAC_{compuesto} = \frac{Variación \ de \ la \ Abs_{734 \ nm}}{0\text{.}28045 \ x \ [Concentración \ de \ compuesto]}

El valor 0.28045 representa la disminución de la absorbancia que provoca 1 mM de Trolox.

Aislamiento de fracciones peptídicas mediante cromatografia líquida de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) a escala semi-preparativa

Se utiliza un equipo formado por dos bombas programables modelo Waters Delta 600, un detector de diodos alineados modelo 966, un inyector automático modelo 717 plus, y un colector de fracciones automático (Waters Corp., Mildford, MA, EEUU) Se usa una columna C_{18} Prep NovaPack® HR, 7.8 x 300 mm y 6 \mum de tamaño de poro (Waters), con un cartucho C_{18} (Waters) como guardacolumna. Los análisis se realizan a 30°C y la detección a 214 y 280 nm. La adquisición de los datos se lleva a cabo con el Software Millennium versión 3.2 (Waters). Para la elución de las muestras se utiliza un gradiente binario de agua (fase A) y acetonitrilo (fase B) con 0.1% de TFA en cada uno de ellos y un flujo de 4 ml/min. El gradiente de fase B es del 2% al 10% en 15 min, del 10% al 20% durante 35 min, del 20% al 30% durante 20 min, se lava la columna con 70% de B y finalmente se acondiciona en las condiciones iniciales durante 15 min. El volumen de muestra inyectado es de 200 \mul. Antes de la inyección, las muestras se pasan por un filtro Millipore (Waters) de 0.45 \mum.

Análisis mediante espectrometría de masas en tandem (off-line)

Se emplea un equipo de trampa fónica Esquire 3000 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). La muestra se inyecta en el nebulizador de electrospray a un flujo de 4 \mul/min, utilizando una bomba de jeringa tipo 22 (Harvard Apparatus, South Natick, MA, EEUU). El equipo emplea nitrógeno como gas nebulizador y de secado, y opera con una presión de helio de 5 x 10^{-3} bar. Los espectros de masas se adquieren en un intervalo de 50-1500 m/z y a una velocidad de 13000 Da/segundo. La interpretación de los espectros de MS en tandem para la identificación de las secuencias peptídicas se realiza con el programa Biotools 2.1 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania).

Análisis mediante RP-HPLC acoplado on-line a espectrometría de masas en tandem (RP-HPLC-MS/MS)

Se emplea un equipo Esquire-LC (Bruker Daltonik GMBH, Bremen, Alemania). El equipo de HPLC (serie 1100) está formado por una bomba cuaternaria, un inyector automático, un sistema de desgasificación de eluyentes y un detector ultravioleta de longitud de onda variable (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) acoplado en línea a un espectrómetro de masas de trampa iónica Esquire 3000 (Bruker Daltonik). La columna es una columna Hi-Pore C18 (250 x 4,6 mm d.i., 5 \mum de tamaño de partícula) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EEUU). El disolvente A es una mezcla de agua y ácido trifluoroacético (1000:0.37) y el disolvente B una mezcla de acetonitrilo y ácido trifluoroacético (1000:0.27). Se inyectan 50 \mul de muestra, a una concentración de 1-2 mg/ml. Se emplea un flujo de 0.8 ml/minuto, con un gradiente lineal de 0% al 30% del disolvente B en A en 25 minutos. El eluyente se monitoriza a 214 nm, mediante espectrofotometría de masas, bajo las mismas condiciones que las indicadas en el apartado anterior, salvo que el flujo de inyección de la muestra a través del nebulizador es de 60 \mul/min.

Estudio de la actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas

Se estudia el efecto de varios de los péptidos identificados y de algunos productos que los contienen (por ejemplo el hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante 3 horas y la fracción del mismo menor de 3000 Da) sobre la presión arterial de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y de ratas Wistar-Kyoto (WKY), que son el control normotenso de las SHR.

Este estudio se realiza con SHR (10) y WKY de 17-24 semanas de edad y peso comprendido entre 300 y 350 g, procedentes de Charles River Laboratories España S.A. Las ratas se almacenan en jaulas de cinco en cinco y se mantienen a una temperatura estable de 25°C con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, ingiriendo agua y comida a libre disposición. Para realizar las medidas de presión arterial sistólica (PAS) se utiliza un equipo de “tail cuff” (método del manguito en la cola) (Le5001, Letica) que proporciona un valor digital de la PAS automáticamente y registra y facilita la frecuencia cardiaca de los animales. Se realizan varias medidas, y se obtiene la media de todas ellas para conseguir un valor fiable de la PAS. Antes de colocar el manguito y el transductor en la cola de las ratas, éstas se exponen a una temperatura próxima a los 30°C para facilitar la dilatación de la arteria caudal. Además, para asegurar la fiabilidad de la medida, los animales se acostumbran al procedimiento 2 semanas antes de llevar a cabo el ensayo en cuestión.

La administración de los productos a ensayar se realiza mediante sonda intragástrica en un margen de tiempo comprendido entre las 9 y las 10 h de la mañana. Las SHR utilizadas para el estudio tenían valores de PAS comprendidos entre 230 y 280 mm Hg. Las WKY utilizadas para el estudio tenían en ese momento valores de PAS comprendidos entre 160 y 200 mm Hg. Se toman medidas de la PAS de los animales periódicamente, cada 2 horas, hasta las 8 horas post-administración de los productos a ensayar; adicionalmente se toma una medida de la PAS 24 horas después de la administración de dichos productos. Como control negativo (para establecer la variación circadiana de la PAS en ratas sondadas) se utilizan las medidas de la PAS obtenidas en ratas a las que se les administra mediante sonda intragástrica 1 ml de agua. Como control positivo, se utilizan las medidas de la PAS obtenidas en ratas a las que se les administra mediante sonda intragástrica 50 mg/kg de Captopril (fármaco IECA prototipo). Esta dosis de Captopril se administra a cada rata en un volumen de 1 ml. Para establecer el efecto de la clara de huevo no hidrolizada sobre la presión arterial de los animales, se llevan a cabo ensayos semejantes a los descritos anteriormente, en los que los animales se tratan por el mismo procedimiento con 200 mg/kg de clara de huevo previamente liofilizada (testigo).

Los resultados obtenidos se agrupan y se obtiene la media \pm el error estándar de la media (ESM) para un mínimo de 9 ensayos homogéneos. Los datos de los animales tratados se comparan siempre con los datos que se consideran control negativo. Para compararlos y obtener la significación estadística se utiliza el test de la "t" de "Student" para datos no apareados y se considera significativa la diferencia para valores de p<0.05.

Breve descripción del contenido de las figuras

La figura 1 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (\medcirc), 50 mg/kg de Captopril (\Box), 200 mg/kg de clara de huevo (CH) (X), y diferentes dosis del hidrolizado de clara de huevo (HCH): 100 mg/kg (\blacklozenge), 150 mg/kg (\blacktriangle), 200 mg/kg (\blacksquare), y 400 mg/kg (\Delta). Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales. En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcurrido desde la administración.

La figura 2 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (\medcirc), 50 mg/kg de Captopril (\Box) y diferentes dosis de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo (F<3000 Da): 25 mg/kg (\blacklozenge), 50 mg/kg (\blacktriangle) y 100 mg/kg (\blacksquare). Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales. En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcurrido desde la administración.

La figura 3A es un cromatograma obtenido utilizando cromatograma de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) a escala preparativa de la fracción menor de 3000 Da producida mediante hidrólisis de clara de huevo con pepsina durante 3 h, en el que se seleccionan 9 fracciones (F 1-F9), que fueron recogidas automáticamente. En el eje de abscisas se representa el tiempo en minutos.

La figura 3B representa la capacidad IECA, expresada como la concentración proteica necesaria para inhibir el 50% de la enzima (IC_{50}), correspondiente a cada una de las 9 fracciones recogidas mediante el RP-HPLC a escala preparativa.

La figura 4 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (\medcirc), 50 mg/kg de Captopril (\Box) y diferentes dosis del péptido YAEERYPIL: 0.5 mg/kg (\blacklozenge), 1 mg/kg (\blacktriangle) y 2 mg/kg (\blacksquare). Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales. En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcurrido desde la administración.

La figura 5 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (\medcirc), 50 mg/kg de Captopril (\Box) y diferentes dosis del péptido RADHPFL: 0.5 mg/kg (\blacklozenge), 1 mg/kg (\blacktriangle) y 2 mg/kg (\blacksquare). Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales. En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcurrido desde la administración.

La figura 6 representa la disminución de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (X), 50 mg/kg de Captopril (\Box) y diferentes dosis del péptido IVF: 1 mg/kg (\blacklozenge), 2 mg/kg (\blacktriangle) y 4 mg/kg (\blacksquare). Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales. En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcurrido desde la adminis-
tración.

La figura 7 representa la variación de la presión arterial sistólica (PAS), obtenida en ratas Wistar-Kyoto normotensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (\medcirc), 50 mg/kg de Captopril (\Box), 200 mg/kg de CH (X), 400 mg/kg de HCH (\bullet), 100 mg/kg de la fracción menor de 3000 Da de HCH (F<3000 Da) (\Delta), 2 mg/kg del péptido YAEERYPIL (\blacklozenge), 2 mg/kg del péptido RADHPFL (\blacktriangle) y 4 mg/kg péptido IVF (\blacksquare). Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales. En el eje de abscisas se representa el tiempo, en horas, transcurrido desde la administración.

Ejemplos de realización de la invención

Los siguientes ejemplos ilustran la invención, aunque no deben considerarse como limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Obtención de péptidos bioactivos, con actividad IECA y antihipertensiva, a partir de clara de huevo hidrolizada con pepsina a presión atmosférica

El hidrolizado se obtuvo empleando como sustrato clara de huevo de gallina, procedente de huevos frescos, separada de la yema y liofilizada. Como enzima, se utilizó pepsina (E.C. 3.4.23.1. tipo A, 10000 U/mg de proteína), procedente de estómago de cerdo (Sigma). El sustrato se disolvió en agua a una concentración de 100 mg/ml y el pH se ajustó a 2.0 añadiendo HCl 1 N. Se añadió pepsina (relación enzima/sustrato 1/100, p/p). La hidrólisis se realizó a una temperatura de 37°C durante 24 horas, a presión atmosférica (0.1 MPa). La inactivación de la pepsina se consiguió elevando el pH a 7.0 con NaOH 1 N.

Se midió la actividad IECA en alícuotas recogidas tras diferentes tiempos de hidrólisis, 0, 30 minutos, 3, 5, 8 y 24 horas. Los resultados mostraron que la clara de huevo sin hidrolizar no posee actividad IECA (IC_{50} > 750 \mug/ml), pero inhibe a la ECA activamente tras distintos tiempos de hidrólisis con pepsina, alcanzándose una importante inhibición tras 3 horas de hidrólisis (IC_{50} = 200.9 \pm 1.5 \mug/ml; 55.3 \pm 2.1 \mug/ml; 72.2 \pm 2.3 \mug/ml; 43.07 \pm 1.4 \mug/ml; 40.2 \pm 0.9 \mug/ml; a los 30 min, 3, 5, 8 y 24 horas, respectivamente).

La fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante 3 horas se obtuvo mediante ultrafiltración a través de una membrana hidrofilica de 3000 Da (Centriprep, Amicon, Inc., Beverly, MA, EEUU), centrifugando a 1900 g durante 40 minutos. Se midió la actividad IECA en el retenido (fracción de tamaño >3000 Da) y en el permeado (fracción de tamaño <3000 Da). Los valores de IC_{50} fueron, respectivamente de 298.4 y 34.5 \mug/ml. Esto pone de manifiesto que el permeado posee aproximadamente 10 veces más actividad IECA y que, por tanto, la actividad se debe fundamentalmente a péptidos de pequeño tamaño.

Se ensayó la actividad antihipertensiva del hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante 3 horas y su fracción menor de 3000 Da en ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y en ratas normotensas Wistar-Kyoto (WKY). Se administraron distintas concentraciones de ambos ovoproductos liofilizados a los animales que, en el caso del hidrolizado, estaban comprendidas entre 100 y 400 mg/kg, y en el caso de la fracción menor de 3000 Da, entre 25 y 100 mg/kg.

Las Figuras 1 y 2 muestran, respectivamente, la disminución de la PAS obtenida en SHR en distintos momentos tras la administración de diferentes dosis del hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante 3 horas, y tras la administración de diferentes dosis de la fracción menor de 3000 Da de dicho hidrolizado. Los resultados de estos ensayos con clara de huevo no hidrolizada (testigo) (200 mg/kg) se representan en la figura 1. En ella puede observarse que los valores de PAS correspondientes al testigo son semejantes a los valores de PAS de los animales a los que se administra agua. En estas figuras se incluye, además, la disminución de la PAS observada tras la administración de Captopril. El Captopril produce una pronunciada disminución de la PAS en las SHR. La disminución de la PAS es máxima 6 horas después de la administración del fármaco. El hidrolizado de clara de huevo y la fracción menor de 3000 Da ocasionan significativas disminuciones dosis-dependientes de la PAS en los animales. Los menores valores de la PAS después de administrar el hidrolizado de clara de huevo y la fracción menor de 3000 Da de este hidrolizado, se observan también 6 horas después de su administración. Los valores de la PAS observados 24 horas después de las distintas administraciones son semejantes a los que tenían los animales antes de las mismas.

Con objeto de identificar los péptidos responsables de la actividad IECA y/o antihipertensiva, la fracción menor de 3000 Da obtenida tras la hidrólisis de clara de huevo con pepsina durante 3 horas se liofilizó y redisolvió en agua a una concentración de 50 mg/ml y se fraccionó mediante RP-HPLC a escala semipreparativa. Tal y como se muestra en la Figura 3 A, se recogieron 9 fracciones (tras, aproximadamente, 10-12 análisis), que se congelaron, liofilizaron y se mantuvieron a -20°C hasta su utilización. Cada fracción se redisolvió en agua milli-Q y se midió la actividad IECA.

Como se muestra en la Figura 3 B, las subfracciones más activas fueron la 6, 7 y 8, que se analizaron por espectrometria de masas en tandem para determinar sus péptidos constituyentes. Con ese fin, las subfracciones peptidicas 6, 7 y 8, recogidas mediante RP-HPLC preparativo, se liofilizaron y se disolvieron a una concentración de 5-10 \mug/ml en una mezcla de acetonitrilo al 50% en agua conteniendo 0.3% de ácido fórmico. Los péptidos identificados se muestran en la tabla 2. Debe destacarse que todos los péptidos procedían de la ovoalbúmina.

TABLA 2 Péptidos identificados en las subfracciones 6, 7 y 8 de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante tres horas

Fracción.	Masa	Masa	Proteína	Posición	Aminoácidos	Secuencia n°
n°.	experimental	teórica
6	592.3	592.32	Ovoalbúmina	212-216	YQIGL	SEQ. ID. N°. 1
6	377.2	377.23	Ovoalbúmina	178-180	IVF	SEQ. ID. N°. 2
6	854.4	854.44	Ovoalbúmina	359-365	RADHPFL	SEQ. ID. N°. 3
6	365.2	365.20	Ovoalbúmina	99-101	FSL	SEQ. ID. N°. 4
7	721.3	721.37	Ovoalbúmina	256-261	ESIINF
7	1001.4	1001.51	Ovoalbúmina	358-365	FRADHPFL	SEQ. ID. N°. 5
7	1152.3	1152.58	Ovoalbúmina	106-114	YAEERYPIL	SEQ. ID. N°. 6
8	757.2	757.41	Ovoalbúmina	84-89	RDILNQ	SEQ. ID. N°. 7
8	1040.2	1040.58	Ovoalbúmina	243-252	VLLPDEVSGL
8	491.1	491.24	Ovoalbúmina	36-40	SALAM	SEQ. ID. N°. 8
8	487.1	487.26	Ovoalbúmina	144-147	ELIN
8	1164.2	1164.59	Ovoalbúmina	125-134	YRGGLEPINF

Ejemplo 2 Péptidos obtenidos mediante síntesis química con actividad IECA y antihipertensiva

Se sintetizaron químicamente todos los péptidos identificados, mencionados en la Tabla 2 del ejemplo 1, mediante el método Fmoc en fase sólida con un sintetizador modelo 431A de Applied Biosystems Inc. (Überlingen, Alemania). La pureza de los péptidos sintéticos se verificó mediante RP-HPLC-MS/MS.

Se midió la actividad IECA de los péptidos sintéticos. La actividad encontrada se muestra en la tabla 3. Destacan por su actividad 8 péptidos con IC_{50} inferiores a 450 \muM y, sobre todo, las secuencias: SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 5 y SEQ. ID. N°. 6, con IC_{50} inferiores a 34 \muM.

TABLA 3 Actividad IECA de los péptidos identificados en las subfracciones 6, 7 y 8 de la fracción menor de 3000 Da hidrolizado de clara de huevo con pepsina durante tres horas

Secuencia n°	Aminoácidos	IC_{50} (\muM)
SEQ. ID. N°. 1	YQIGL	173.8
SEQ. ID. N°. 2	IVF	33.9
SEQ. ID. N°. 3	RADHPFL	6.2
SEQ. ID. N°. 4	FSL	172.9
	ESIINF	> 1000
SEQ. ID. N°. 5	FRADHPFL	3.2
SEQ. ID. N°. 6	YAEERYPIL	4.7
SEQ. ID. N°. 7	RDILNQ	435.7
	VLLPDEVSGL	> 1000
SEQ. ID. N°. 8	SALAM	229.1
	ELIN	> 1000
	YRGGLEPINF	> 1000

Se ensayó la actividad antihipertensiva de los péptidos SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. W. 3 y SEQ. ID. N°. 6, para lo cual se administraron diferentes dosis de los mismos a SHR y a WKY, siendo la dosis máxima utilizada siempre equivalente en unidades de actividad IECA a la dosis 50 mg/kg de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado de clara de huevo. Los péptidos se disolvieron en agua destilada y la dosis correspondiente se administró a cada rata en un volumen de 1 ml.

Las Figuras 4, 5 y 6 muestran las disminuciones de la PAS obtenidas en SHR en distintos momentos, tras la administración de distintas dosis de los péptidos SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 3 y SEQ. ID. N°. 2. Se puede observar que la administración de estos péptidos ocasiona una disminución dosis-dependiente significativa de la PAS en estos animales. La disminución de la PAS es máxima 6 horas después de la administración de estos péptidos, y la disminución máxima obtenida es además similar con los diferentes péptidos.

La Figura 7 muestra, los cambios de la PAS obtenidos en ratas WKY en distintos momentos, tras la administración de los siguientes compuestos: 400 mg/kg del hidrolizado de clara de huevo, 100 mg/kg de la fracción menor de 3000 Da del hidrolizado, 2 mg/kg del péptido SEQ.ID.N°. 6, 2 mg/kg del péptido SEQ. ID. N°. 3, y 4 mg/kg del péptido SEQ. ID. N°. 2. También se incluyen los resultados obtenidos tras la administración de 50 mg/kg de Captopril. Puede apreciarse, que ninguno de estos compuestos modifica la PAS de las ratas WKY cuando se administra la dosis mas alta utilizada. Estos resultados permiten descartar posibles efectos indeseables de los productos ensayados sobre la presión arterial de sujetos normotensos.

Los resultados presentados demuestran que los péptidos identificados por las secuencias SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3 y SEQ. ID. N°. 6, tienen un claro y pronunciado efecto antihipertensivo, que tras su administración aguda sigue un curso temporal semejante al efecto antihipertensivo que se aprecia cuando se administra el hidrolizado de clara de huevo o la fracción menor de 3000 Da de dicho hidrolizado.

Ejemplo 3 Péptidos obtenidos mediante síntesis química con actividad antioxidante

Se midió la actividad antioxidante de uno de los péptidos identificados, concretamente la secuencia SEQ. ID. N°. 6, mencionada en el ejemplo 1. La actividad encontrada se muestra a continuación:

TEAC_{YAEERYPIL \ (1 \ minuto)} = 0.8

TEAC_{YAEERYPIL \ (6 \ minutos)} = 1.2

TEAC_{YAEERYPIL \ (10 \ minutos)} = 1.3

Los resultados muestran, por tanto, que 1 mg de YAEERYPIL (SEQ. ID. N°. 6) presenta 1.3 veces más actividad antioxidante que 1 mg de Trolox.

Ejemplo 4 Obtención de péptidos bioactivos a partir de ovoalbúmina hidrolizada con pepsina a presión atmosférica

El hidrolizado se obtuvo empleando como sustrato ovoalbúmina grado VI (99% de pureza) (Sigma). El sustrato se disolvió en agua a una concentración de 100 mg/ml y el pH se ajustó a 2.0 añadiendo HCl 1 N. En ésta realización particular de la invención se añadió pepsina (E.C. 3.4.23.1. tipo A, 10000 U/mg de proteína), procedente de estómago de cerdo (Sigma) a una relación enzima/sustrato 1/100, p/p. La hidrólisis se realizó a una temperatura de 37°C durante 3 horas, a presión atmosférica (0.1 MPa). La inactivación de la pepsina se consiguió elevando el pH a 7.0 con NaOH 1 N.

La medida de la actividad IECA demostró que la ovoalbúmina sin hidrolizar no posee actividad IECA (IC_{50} > 750 \mug/ml), pero inhibe a la enzima tras 3 horas de hidrólisis con pepsina (IC_{50} = 129.0 \pm 0.6 \mug/ml). El hidrolizado así obtenido se analizó mediante RP-HPLC-MS/MS. Se encontraron, al menos, las secuencias: SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8. Entre ellas, las secuencias SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 5 y SEQ. ID. N°. 6 poseen IC_{50} inferiores a 34 \muM (ejemplo 2). Las SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3 y SEQ. ID. N°. 6 presentan, además actividad antihipertensiva en ratas (ejemplo 2), y la SEQ. ID. N°. 6 posee actividad antioxidante frente a radicales libres (ejemplo 3).

Ejemplo 5 Obtención de péptidos bioactivos a partir de ovoalbúmina hidrolizada con pepsina bajo condiciones de alta presión hidrostática

El hidrolizado se obtuvo empleando como sustrato ovoalbúmina grado VI (99% de pureza) (Sigma). Como enzima, se utilizó pepsina (E.C. 3.4.23.1. tipo A, 10000 U/mg de proteína), procedente de estómago de cerdo (Sigma). El sustrato se disolvió en agua a una concentración de 2 mg/ml y el pH se ajustó a 2.0 añadiendo HCl 1 N. Se añadió pepsina (relación enzima/sustrato 1/20, p/p). La hidrólisis se realizó a una temperatura de 37°C durante 30 min, a distintas presiones hidrostáticas (100, 200, 300) y 400 MPa). La inactivación de la pepsina se consiguió elevando el pH a 7.0 con NaOH 1 N.

Los tratamientos con alta presión se realizaron en un equipo discontinuo de presión hidrostática (900 HP Eurotherm Automation) con capacidad para 2350 ml, que alcanza una presión de 500 MPa. La cámara de alta presión está constituida por un cilindro de acero inoxidable, llena del medio transmisor de la presión (agua), en cuyo interior se introduce la mezcla de sustrato y enzima, envasada en un tubo de plástico Eppendorf sin dejar cámara de aire. El equipo alcanza la presión deseada a una velocidad de 2.5 MPa/segundo y, tras el tratamiento, desciende a cero a la misma velocidad. El equipo va a acompañado de un baño auxiliar que, mediante la circulación de agua a través de una camisa exterior que rodea al cilindro, permite realizar tratamientos a temperaturas desde -20°C hasta 95°C. La temperatura del proceso se controla mediante un termopar sumergido en el medio transmisor de la presión.

Los hidrolizados así obtenidos se analizaron mediante RP-HPLC-MS/MS. Se encontraron, al menos, las secuencias: SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 5 y SEQ. ID. N°. 6 que, como se indicó en el ejemplo 2, poseen IC_{50} inferiores a 7 \muM. Las SEQ. ID. N°. 3 y SEQ. ID. N°. 6 presentan, además actividad antihipertensiva en ratas (ejemplo 2), y la SEQ. ID. N°. 6 posee actividad antioxidante frente a radicales libres (ejemplo 3). Este ejemplo muestra como el empleo de altas presiones hidrostáticas permite obtener hidrolizados conteniendo péptidos activos más rápidamente que efectuando las hidrólisis a presión atmosférica. Cabe destacar que no se obtuvo, bajo estas condiciones, la SEQ. ID. N°. 2, lo que podría tener incidencia en la aplicabilidad industrial de los hidrolizados.

<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

\hskip1cm

López-Alonso Fandiño, Rosina

\hskip1cm

Ramos González, Mercedes

\hskip1cm

Recio Sánchez, Isidra

\hskip1cm

Miguel Castro, Marta

\hskip1cm

Aleixandre de Artiñano, Amaya

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<120> PÉPTIDOS BIACTIVOS DERIVADOS DE PROTEÍNAS DE LA CLARA DE HUEVO MEDIANTE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

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<130> BIOHCH

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<160> 8

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<170> PatentIn versión 3.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 1

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\sa{Tyr Gln Ile Gly Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 3

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 2

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\sa{Ile Val Phe}

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<210> 3

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\sa{Arg Ala Asp His Pro Phe Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\sa{Phe Ser Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Ala Asp His Pro Leu Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ala Glu Glu Arg Tyr Pro Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\sa{Arg Asp Ile Leu Asn Gln}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\sa{Ser Ala Leu Ala Met}

Claims

1. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis enzimática de proteínas de la clara de huevo caracterizado por

a.: poseer actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante.

b.: tener un peso molecular comprendido entre 365,2 y 1152,58

c.: ser péptido identificado con las secuencias de aminoácidos del grupo siguiente: SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7 y SEQ. ID. N°. 8.

2. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis enzimática de proteínas de la clara de huevo según la reivindicación 1 caracterizado por obtenerse mediante un procedimiento de síntesis química o enzimática o mediante métodos recombinantes.

3. Procedimiento para producir productos bioactivos según la reivindicación 1 y 2 caracterizado por

a.: obtenerse por hidrólisis del material de partida que seria cualquier sustrato apropiado que contenga una o más proteínas o péptidos, de origen animal, vegetal o procedentes de microoganismos, preferiblemente ovoalbúmina o clara de huevo que cuya secuencia de aminoácidos comprendiese la secuencia de aminoácidos de alguno de los péptidos bioactivos de interés indicados en la reivindicación 1,

b.: disolverse o dispersarse dicho material de partida, a una concentración apropiada, en agua o en una disolución tampón, a un pH adecuado para la actuación de la enzima proteolítica,

c.: emplearse cualquier enzima proteolítica capaz de romper la proteína presente en el material de partida y proporcionar los péptidos de interés, pero preferiblemente pepsina a pH 2-0-3.0; o microorganismos proteolíticos que llevaran a cabo una fermentación del sustrato, y

d.: el tiempo de reacción estaría comprendido entre 10 min y 24 horas, pero, preferiblemente durante un tiempo inferior a 3 horas.

4. Procedimiento para producir productos bioactivos según la reivindicación 3 caracterizado por emplear altas presiones hidrostáticas entre 100 y 1000 MPa, preferentemente 400 MPa, para acelerar la hidrólisis del sustrato sin inhibir la enzima proteolítica y/o modificar el perfil de los péptidos obtenidos.

5. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis enzimática de proteínas de la clara de huevo caracterizado porque para su obtención se emplean los procedimientos indicados en la reivindicaciones 3 y 4.

6. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis enzimática de proteínas de la clara de huevo según la reivindicación 5 caracterizado porque el material de partida es entre otros, ovoalbúmina pura, clara de huevo y huevo entero en sus diferentes formas de presentación, u ovoproductos destinados a hostelería y restauración, complementos dietéticos para deportistas ovoproductos para alimentación animal.

7. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis enzimática de proteínas de la clara de huevo según la reivindicación 6 caracterizado porque se trata del hidrolizado enzimático, cualquiera de sus fracciones, o una purificación de los mismos que contenga al menos alguno de los péptidos indicados en la reivindicación 1.

8. Producto bioactivo identificado a partir de hidrólisis enzimática de proteínas de la clara de huevo caracterizados por ser derivados o sales farmacéuticamente aceptables o sus mezclas de cualquiera de los productos bioactivos indicados en las reivindicaciones 1, 2, 5, 6 y 7.

9. Composición farmacéutica caracterizada por comprender al menos alguno de los productos bioactivos con actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante según las reivindicaciones 1, 2, 5, 6 y 7.

10. Aditivo, ingrediente o suplemento alimentario funcional caracterizada por comprender al menos alguno de los productos bioactivos con actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante según las reivindicaciones 1, 2, 5, 6 y 7.

11. Producto alimentario funcional caracterizada por comprender al menos alguno de los productos bioactivos con actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante según las reivindicaciones 1, 2, 5, 6 y 7.

\newpage

12. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 9 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión.

13. Uso de aditivo, ingrediente, alimentario funcional según la reivindicación 9 en la elaboración de un producto alimentario funcional favorable para reducir la hipertensión.