ES2252302T3 - Amidasa de glutaril cefalosporina a partir de pseudomonas diminuta bs-203. - Google Patents
Amidasa de glutaril cefalosporina a partir de pseudomonas diminuta bs-203.Info
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Abstract
Un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: (a) un ácido nucleico que codifica la amidasa de glutaril 7-ACA y tiene la secuencia de ácido nucleico de ID SEC Nº 2; (b) un ácido nucleico según (a) en el que dicho ácido nucleico consiste en la secuencia ID SEC Nº 1; (c) un ácido nucleico que codifica una amidasa de glutaril 7-ACA y tiene las siguientes características: es aislable de la Pseudomonas diminuta BS-203 (ATCC PTA- 2517), cataliza la hidrólisis del ácido 7-a-(4- carboxibutanamido)-cefalosporánico a ácido 7- aminocefalosporánico y a ácido glutárico y se compone de dos subunidades con unos pesos moleculares aparentes de 43 kd y 26 kd respectivamente a partir de electroforesis SDS PAGE; (d) el ácido nucleico que codifica la amidasa de glutaril 7-ACA según (c), en el que dicha amidasa comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en ID SEC Nº 2; (e) el ácido nucleico que codifica la amidasa de glutaril 7-ACA según (c), en el que dicha amidasa consiste en la secuencia deaminoácidos mostrada en ID SEC Nº 2; (f) el ácido nucleico que codifica la amidasa de glutaril 7-ACA y coincide al menos en un 80% con la amidasa de (e). (g) el ácido nucleico que codifica la amidasa de glutaril 7-ACA según (f), en el que dicha secuencia de aminoácidos comprende ID SEC Nº 2 con hasta 113 sustituciones conservadoras de aminoácidos; (h) el ácido nucleico que codifica la amidasa de glutaril 7-ACA según (f), en el que dicha secuencia de aminoácidos comprende ID SEC Nº 2 con la adición o la eliminación de hasta 20 residuos de amino.
Description
Amidasa de glutaril cefalosporina a partir de
pseudomonas diminuta BS-203.
La presente invención se refiere a una novedosa
enzima amidasa de glutaril cefalosporina (amidasa de glutaril
7-ACA ) que se obtiene de la Pseudomonas
diminuta BS-203, que cataliza la hidrólisis de
ácido
7-(4-carboxibutanamido)-3-acetoximetilo-3-cefem-4-carboxílico
(glutaril 7-ACA) para producir ácido
7-aminocefalosporánico (7-ACA) y
ácido glutárico. La invención también se refiere a ácidos
nuncleicos con secuencias que codifican el enzima glutaril
7-ACA, incluyendo las secuencias de ácidos
nuncleicos del gen de la amidasa de glutaril 7-ACA
obtenido de P. diminuta BS-203 y secuencias
de ácidos núcleicos derivadas de estos. La invención también se
refiere a vectores y células hospedadoras que contienen estas
secuencias de ácidos núcleicos y a procedimientos para producir
amidasa de glutaril 7-ACA con estos vectores y
células hospedadoras. La invención también se refiere a un
procedimiento para preparar 7-ACA mediante el uso
de amidasa de glutaril 7-ACA a partir de P.
diminuta BS-203.
El ácido 3-acetoximetilo
7-amino-3-cefem-4-carboxílico
(ácido 7-aminocefalosporánico,
7-ACA) es el material de partida para la síntesis
de muchos antibióticos de cefalosporina semisintética. El
7-ACA puede producirse a partir de cefalosporina C
(un producto fermentado fácilmente disponible) mediante un proceso
enzimático en dos etapas (esquema 1), usando en primer lugar una
oxidasa de ácido D-amino junto con una
decarboxilación oxidativa para producir glutaril
7-ACA (etapa A) y, a continuación, usando acilasa
glutaril 7-ACA para eliminar el grupo glutaril para
producir 7-ACA (etapa B).
Esquema
1
Las etapas A y B también pueden llevarse a cabo
mediante procesos químicos. Los procesos químicos que suponen el
uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos y químicos
tóxicos tienen inconvenientes desde el punto de vista de la
seguridad y el medio ambiente. Al efectuar procesos enzimáticos, por
otro lado, se obtiene 7-ACA en condiciones suaves
en un sistema disolvente acuoso. Los enzimas que catalizan la
hidrólisis de glutaril 7-ACA a
7-ACA (etapa B) se encuentran fácilmente en el
mercado pero no así los enzimas que catalizan de forma eficiente la
hidrólisis directa de cefalosporina cefalosporina a
7-ACA (etapa C). Consiguientemente, se ha usado
generalmente un proceso de dos etapas en el que la etapa A se lleva
a cabo química o enzimáticamente y la etapa B se lleva a cabo
enzimáticamente. Véase, por ejemplo, Cambiaghi y col., U.S.
5.424.196 y las referencias incluidas en el presente documento.
La etapa A se lleva habitualmente a cabo con
transaminasas de ácido D-amino (también conocida
como oxidasa de ácido D-amino,
EC-1.4.3.3) (Aretz y col., patente
estadounidense 4.745.061) para oxidar el grupo amino de la cadena
lateral del ácido D-amino a un grupo ceto seguido de
un tratamiento con peróxido de hidrógeno para provocar una
decarboxilación y proporcionar glutaril 7-ACA.
Se han realizado grandes esfuerzos a fin de
desarrollar procedimientos eficaces para llevar a cabo la etapa B.
Crawford y col., en el documento U.S. 5.104.800 proporcionan
un breve resumen de trabajos anteriores en el campo de la síntesis
de 7-ACA. Matsuda y col., en el documento
U.S. 3.960.662 describen la actividad de la amidasa de glutaril
7-ACA partiendo de cultivos de Comamonas sp.
y Pseudomonas ovalis. Trabajadores de Fujisawa
Pharmaceutical Co. (Aramori y col., documento US 5.310.659 y
documento EP 048244; Aramori y col. 1991, J. Bacteriol,
173:7848-7855) describen una acilasa glutaril
7-ACA aislada del Bacillus (Brevibacillus)
laterosporus. Chu y col. (documento U.S. 5.766.871)
describen una acilasa glutaril 7-ACA aislada de
Pseudomonas nitroreducens. Battistel y col., en el
documento EP 0525861, describen las acilasas glutaril
7-ACA de diferentes variedades de Pseudomonas,
Bacillus y Achromobacter.
Se ha descrito un número de enzimas capaces de
catalizar directamente la hidrólisis de cefalosporina C a
7-ACA (esquema 1, etapa C). Por ejemplo,
trabajadores de Asahi Chemical (Ichikawa y col. Documento
US4.774.179; Matsuda y col., J. Bact., 1987
169:5815-5820 y 5821-5826)
describieron la cepa SE-495 de Pseudomonas
diminuta y la cepa SE83 de una variedad de Pseudomonas
estrechamente relacionada y ambas productoras de enzimas capaces de
provocar la conversión directa de cefalosporina C a
7-ACA. Lein, en el documento US 4.981.789 y la
patente europea EP 0283218 describieron una amidasa cefalosporina C
a partir de Arthrobacter viscous. Lein, en el documento EP
0322032, describió una amidasa cefalosporina C a partir de
Bacillus megaterium, al igual que Crawford y col. en
el documento US 5.104.800 (y la patente divisional estadounidense
5.229.247) y documento EP 0405846. Iwami y col., en el
documento US 5.192.678 (y la patente divisional estadounidense
5.320.948) y el documento EP 0475652 describieron posteriormente una
acilasa cefalosporina C a partir de Pseudomonas diminuta
N-176 que es capaz de llevar a cabo la etapa C
directamente, pero es más hábil en catalizar la conversión de
glutaril 7-ACA a 7-ACA. Aún no se ha
probado que estos enzimas sean económicamente viables para la
producción de 7-ACA.
En numerosos trabajos se ha descrito la
preparación de células hospedadoras recombinantes que expresan
diferentes amidasas de glutaril 7-ACA. Véase, por
ejemplo, M. Ishiye y M. Niwa, Biochim. Biophys. Acta, 1992,
1132:233-239; Croux y col., documento EP
0469919; Aramori y col., documento U.S. 5.310.659; Iwami y col.,
documento U.S. 5,192,678; y Honda y col., Biosci.
Biotechnol. Biochem., 1997, 61:948-955.
En vista del valor que tiene la
7-ACA como intermedio farmacéutico existe la
necesidad de amidasas 7-ACA mejoradas que
proporcionen resultados superiores en lo que se refiere a factores
como el coste de los enzimas, la velocidad de reacción y la
producción y la estabilidad de los enzimas.
La invención proporciona un ácido nucleico
seleccionado de entre un grupo que consiste en:
(a) un ácido nucleico que codifica la amidasa de
glutaril 7-ACA que tiene la secuencia de aminoácido
de ID SEC Nº:2;
(b) el ácido nucleico según (a) consistiendo
dicho ácido nucleico en la secuencia de aminoácido de ID SEC
Nº:1;
(c) un ácido nucleico que codifica una amidasa de
glutaril 7-ACA con las siguientes características:
se puede aislar de Pseudomonas diminuta
BS-203 (ATCC PTA-2517), cataliza la
hidrólisis de ácido
7-\beta-(4-carboxibutanamido)-cefalosporánico
a ácido 7-aminocefalosporánico y ácido glutárico, y
está compuesto de dos subunidades cuyos pesos moleculares aparentes
son de 42 kd y 26 kd a partir de la electroforesis SDS PAGE;
(d) el ácido nucleico que codifica la amidasa de
glutaril 7-ACA según (c), en el que dicha amidasa
comprende la secuencia de aminoácido mostrada en ID SEC Nº:2;
(e) el ácido nucleico que codifica la amidasa de
glutaril 7-ACA según (c), consistiendo dicha amidasa
en la secuencia de aminoácido mostrada en ID SEC Nº:2;
(f) un ácido nucleico que codifica una amidasa de
glutaril 7-ACA, coincidiendo al menos en un 80% con
la amidasa de (e);
(g) el ácido nucleico que codifica la amidasa de
glutaril 7-ACA de (f), comprendiendo dicha secuencia
de aminoácido la ID SEC Nº:2 con hasta 113 sustituciones
conservadoras de aminoácido;
(h) el ácido nucleico que codifica la amidasa de
glutaril 7-ACA de (f), comprendiendo dicha secuencia
de aminoácido la ID SEC Nº:2 con la adición o eliminación de hasta
20 residuos de amino.
La presente invención también se refiere a
vectores y células hospedadoras que comprenden los ácidos nucleicos
de la invención.
La presente invención también se refiere a una
amidasa de glutaril 7-ACA novedosa codificada por el
ácido nucleico descrito previamente o aislado de la cepa de
bacterias Pseudomonas diminuta BS-203 u
obtenido mediante el cultivo de las células hospedadoras
mencionadas anteriormente.
La invención también proporciona proteínas
homólogas que coinciden al menos en un 80% con la amidasa de
glutaril 7-ACA de Pseudomonas diminuta
BS-203. Se contemplan como parte de la invención las
proteínas que tienen hasta 113 sustituciones conservadoras de
aminoácido y/o hasta 20 adiciones o eliminaciones de aminoácido.
También se consideran parte de la invención las secuencias de ácido
nucleico que codifican tales proteínas homólogas.
Además de esto, la invención hace referencia a
procedimientos para la obtención de amidasa de Pseudomonas
diminuta BS-203 cultivando Pseudomonas
diminuta BS-203 en un medio adecuado y para la
recuperación de una fracción de proteína que contiene actividad de
amidasa de glutaril 7-ACA. La invención también hace
referencia a procedimientos que usan los ácidos nucleicos, los
vectores y las células hospedadoras de la invención para producir
la amidasa de glutaril 7-ACA de la invención.
Además de esto, la invención hace referencia a un
procedimiento para la obtención de ácido
7-aminocefalosporánico (7-ACA) a
partir de ácido
7-\beta-(4-carboxibutanamido)cefalosporánico
glutaril 7-ACA y otros ácidos
7-\beta-(acilamido)cefalosporánicos al
poner en contacto este tipo de substratos con una amidasa de
glutaril 7-ACA de la invención. La invención
también hace referencia a un proceso para producir desacetil
7-ACA a partir de derivados de desacetilo de ácido
7-\beta-(4-carboxibutanamido)cefalosporánico
(glutaril 7-ACA) y otros ácidos
7-\beta-(acilamido)cefalosporánicos
poniendo en contacto ese tipo de substratos con una amidasa de
glutaril 7-ACA de la invención.
Además de esto, la invención hace referencia al
uso de un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en
(a) un ácido nucleico de entre 10 y 1722
nucleótidos que se hibrida bajos condiciones estrictas bien con una
molécula de ADN que consiste en ID SEC Nº:1 o en una molécula de ADN
que consiste en el complemento de ID SEC Nº:1;
(b) el ácido nucleico de (a), con una longitud de
entre 17 y 1722 nucleótidos; y
(c), el ácido nucleico de (a), con una longitud
de entre 20 y 1722 nucleótidos;
para la detección de la secuencia de ID SEC
Nº:1.
La figura 1 muestra el mapa de restricción del
plásmido de expresión en E. coli pBMS200GCA. Las abreviaturas
utilizadas son:
Ptac: promotor de transcripción tac
groES: gen chaperón groES
MCS: lugar de clonación múltiple
ori: origen de replicación de ADN
neo^{r}: gen resistente a la neomicina
lac i^{q}: gen represor de la transcripción
GCA: gen g.
La figura 2 muestra una secuencia de 10
aminoácidos a partir de amidasa de glutaril 7-ACA de
Pseudomonas diminuta BS-203 (ID SEC Nº 3),
un subconjunto de 6 aminoácidos de esta secuencia, una secuencia de
nucleótido genérico que podría codificar estos seis aminoácidos (ID
SEC Nº 4), la secuencia complementaria (la secuencia complementaria
genérica; ID SEC Nº 5) y las secuencias nucleótidas de dieciséis
sondas de oligonucleótidos degenerados (ID SEC Nº
6-21) correspondientes a la secuencia genérica
complementaria. En la figura, X=A, C,G o T; Y=C o T R=A o G.
La figura 3 muestra una secuencia de aminoácido
amidasa de glutaril 7-ACA (una porción de ID SEC Nº
2) y la secuencia nucleótida de una sonda de par de 77 bases
"guess-mer" (mero indicador) (ID SEC Nº
22).
La figura 4 muestra una secuencia nucleótida
completa del gen amidasa de glutaril 7-ACA a partir
de Pseudomonas diminuta BS-203 (ID SEC Nº
1). Los lugares de inicio y final de la traducción se indican
mediante flechas. Las zonas complementarias de una de las sondas
degeneradas (ID SEC Nº 8) y la sonda de mero indicador (ID SEC Nº
22) están subrayadas.
La figura 5 muestra la secuencia completa del
aminoácido de la proteína precursora de la amidasa de glutaril
7-ACA a partir de Pseudomonas diminuta
BS-203 (ID SEC Nº 2) codificada por la secuencia
nucleótida de la figura 4. La flecha muestra el lugar probable de
clivaje en subunidades.
La figura 6 muestra el procedimiento de
construcción del plásmido pWB70. Abreviaturas utilizadas: cos es el
extremo cohesivo bacteriófago lambda; Neo r, Amp r y Tet r son los
genes que codifican la resistencia a la neomicina, ampicilina y
tetraciclina, respectivamente.
\newpage
La invención hace referencia al aislamiento y la
caracterización de una amidasa de glutaril 7-ACA
novedosa. En particular, la invención hace referencia a una amidasa
de glutaril 7-ACA a partir de Pseudomonas
diminuta BS-203 con la secuencia de aminoácidos
mostrada en ID SEC Nº 2. La secuencia alineada muestra
aproximadamente un 56% de coincidencia (320 aciertos) con la
secuencia de la "acil" cefalosporina acilasa a partir de la
cepa de Pseudomonas sp. SE 83 (Matsuda y col., J.Bact. 1987
169:5821-58-26) y del enzima casi
idéntico aislado de la cepa V22 de Pseudomonas sp. (M.
Ishiye y M. Niwa, Biochim. Biophys. Acta, 1992,
1132:233-239. Es interesante el hecho de que sólo
hay aproximadamente un 20% de coincidencia entre el enzima P.
diminuta BS-203 de la presente invención y el
enzima P. diminuta N-176 de Iwami y
col. (documento US 5.192.678). La invención proporciona
composiciones que contienen amidasa de glutaril
7-ACA de P. diminuta BS-203
cruda o parcialmente purificada y también proporciona amidasa de
glutaril 7-ACA de P. diminuta
BS-203 aislada y purificada.
La amidasa de glutaril 7-ACA de
la invención es capaz de catalizar la hidrólisis de glutaril
7-ACA a 7-ACA. Está compuesta de
una subunidad de 42.000 daltons de gran tamaño y de una subunidad
pequeña de 26.000 dalton. El clivaje de la proteína precursora (ID
SEC Nº 2) en subunidades tiene lugar con mayor probabilidad en el
sitio que se describe en la figura 5 en vista del clivaje de la
acilasa de acil cefalosporina SE83 en la posición homóloga (Matsuda
y col., J Bact 1987
169:5821-58-26).
La amidasa de glutaril 7-ACA de
la invención se caracteriza por su facilidad de unirse a
polietileneimina (PEI), que se podrá usar consiguientemente en los
procesos de purificación e inmovilización de enzimas, tal como se
describe más adelante.
La invención también hace referencia a las
proteínas que son idénticas en al menos un 80% a la ID SEC Nº 2 o a
una porción de la misma, lo que tendrá probablemente una actividad
enzimática similar mientras la zona activa del enzima no se altere
sustancialmente.
La amidasa de glutaril 7-ACA de
la invención se ha aislado y purificado a partir de una cepa
bacteriana obtenida del suelo con la designación
BS-203. La bacteria BS-203, que
contiene una actividad de amidasa significativa comparada con
glutaril 7-ACA, parece pertenecer a la especie
diminuta del género Pseudomonas. Otras
características adicionales de la cepa BS-203
se describen en el Ejemplo 1.
La invención también hace referencia a los ácidos
aislados y purificados que codifican la amidasa de glutaril
7-ACA de la invención, tales como los ácidos
nucleicos que tienen una secuencia nucleótida de ID SEC Nº 1, así
como fragmentos (o secuencias parciales) de la misma. La invención
también hace referencia a los ácidos nucleicos que codifican
proteínas que son idénticas en al menos un 80% a ID SEC Nº 2 y que
tienen actividad de amidasa de glutaril 7-ACA.
La invención también describe ácidos que tienen
secuencias complementarias (o antisentido) de la secuencia mostrada
en ID SEC Nº 1, preferentemente secuencias totalmente
complementarias, así como fragmentos (o secuencias parciales) de
las mismas. Puede obtenerse polinucleótidos con secuencias parciales
con diversos procedimientos, incluyendo la digestión restrictiva de
la secuencia nucleótida completa del gen amidasa de glutaril
7-ACA, amplificación PCR y síntesis directa.
La invención también proporciona el uso de
moléculas de ácido nucleico de entre 10 y 1722 nucleótidos,
preferentemente entre 17 y 1722 nucleótidos, más preferentemente
entre 20 y 1722 nucleótidos, que se hibridan con una molécula de
ADN con ID SEC Nº 1 o con una molécula de ADN que consiste en el
complemento de ID SEC Nº 1 para detectar ID SEC Nº 1.
Preferentemente, dichas moléculas de ácido nucleico se hibridan con
ID SEC Nº 1 o su complemento cuando la hibridación se realiza en
condiciones estrictas, que son idénticas o equivalentes a 4X SSPE,
10% PEG 6000, 0,5% SDS 5X de Denhardt y 50 \mug/ml de ADN de
esperma de salmón desnaturalizado, tamponado a 42ºC durante 72
horas. Los fragmentos preferentes son aquellos que son
complementarios de una parte de los residuos
293-1993 de la ID SEC Nº 1, que es la región
codificadora para la proteína glutaril 7-ACA. Se
prefiere, en especial, los fragmentos que son complementarios en,
al menos, un 74%, más preferentemente los que son complementarios
en un 84%, y más preferentemente aún, los que son complementarios en
un 94%, de una parte de los residuos 293-1993 de ID
SEC Nº 1. La sonda nº 7 (ID SEC Nº 12) por ejemplo, era
complementaria en un 94% (16 concordancias de 17 bases). La sonda
de mero indicador de 77 bases (ID SEC Nº 22) era complementaria en
un 74% (57 concordancias), lo que demuestra la utilidad de las
sondas que tienen este nivel de
homología.
homología.
La identidad de secuencia porcentual con respecto
a las secuencias de aminoácidos y nucleótidos se define como el
porcentaje de residuos en una secuencia que son idénticos a los
residuos de una segunda secuencia, tras alinear las secuencias e
incluir espacios si es necesario para aproximarse o alcanzar la
identidad de secuencia porcentual máxima. Las sustituciones
conservadoras no se considera que contribuyen a la identidad de
secuencia en las secuencias de aminoácidos. El alineamiento a
efectos de determinar la identidad de secuencia porcentual puede
lograrse de diversas formas que son conocidas para los expertos en
la técnica como, por ejemplo, por medio de programas de ordenador
disponibles en el mercado tales como BLAST (S. Altschul y col.,
Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402) o ALIGN (E.
Myers y W. Miller, 1989, CABIOS 4:11-27). Los
expertos en la técnica pueden determinar los parámetros y
algoritmos apropiados que se necesitan para alcanzar un alineamiento
máximo a lo largo de todas las secuencias comparadas.
El grado de homología o complementariedad de las
secuencias cortas puede determinarse fácilmente por medio de
inspección, o usando el programa BLAST o ALIGN cuando se trata de
secuencias más largas. Por ejemplo, este último programa (versión
2.0 u) se usó con matriz de ponderación BLOSUM 50 y ponderación de
espacio final, usando una penalización de apertura de espacio
Smith-Waterman de -16 y una penalización de
extensión de espacio de -4 para comparar ID SEC Nº 1 con los genes
de 7-ACA amidasa conocidos. Con una penalización de
apertura de espacio de -12 y una penalización de extensión de
espacio de -2, el mismo programa se usó para comparar las
secuencias de aminoácidos correspondientes.
Las secuencias de nucleótidos descritas en esta
patente representan sólo una forma de realización de la presente
invención. Debido a la degeneración del código genético, se
entenderá que pueden realizarse numerosas opciones de nucleótidos
que conduzcan a una secuencia capaz de dirigir la producción de las
amidasas de glutaril 7-ACA de la invención, o las
subunidades o fragmentos de péptidos de la misma. Como tales, las
secuencias de ácidos nucleicos que son equivalentes funcionalmente
a las secuencias descritas en esta patente se pretende que estén
incluidas en la presente invención. Puede llegarse a dichas
secuencias, por ejemplo, sustituyendo los codones que son usados
preferentemente por el organismo hospedador. Los ácidos nucleicos de
la invención pueden también aislarse y purificarse sustancialmente
por medio de procedimientos conocidos en la técnica.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden estar
presentes en vectores y/o células hospedadoras cultivadas. Por lo
tanto, la presente invención se refiere también a vectores y células
hospedadoras que constan de los ácidos nucleicos de la
invención.
La invención proporciona procedimientos para
obtener composiciones con actividad de amidasa de glutaril
7-ACA tal como se define en la página 4, cultivando
Pseudomonas diminuta BS-203 en un medio adecuado en
condiciones apropiadas para la expresion de la amidasa de glutaril
7-ACA, y opcionalmente recuperando una fracción de
proteína con actividad de amidasa. La invención se refiere también a
procedimientos de utilización de los ácidos nucleicos, vectores y
células hospedadoras de la invención para producir la amidasa de
glutaril 7-ACA de la invención. La invención se
refiere además a un procedimiento para obtener ácido
7-aminocefalosporánico (7-ACA) o
desacetil 7-ACA a partir de ácido
7-\beta-(4-carboxibutanamido)-cefalosporánico
o ácido desacetil
7-\beta-(4-carboxibutanamido)-cefalosporánico
poniendo en contacto dichos sustratos con una amidasa de glutaril
7-ACA de la invención.
Las amidasas de glutaril 7-ACA de
la invención pueden prepararse cultivando una célula hospedadora
transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia
de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la enzima, p.
ej., una secuencia de ADN que codifica ID SEC Nº 2. Las células
hospedadoras pueden cultivarse en un medio nutriente y
posteriormente puede recuperarse la amidasa de glutaril
7-ACA de las células y/o el medio. Las células
hospedadoras cuyo uso se contempla en la presente invención pueden
ser líneas celulares de microorganismos, levaduras, hongos,
plantas, insectos o animales. En general, se podrá usar cualquier
hospedador capaz de expresar la enzima amidasa de glutaril
7-ACA de forma activa.
Entre las células hospedadoras apropiadas se
incluyen los microorganismos (p.ej, Escherichia coli,
Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae), líneas
celulares animales y células de plantas cultivadas. Los
microrganismos preferentes son las bacterias, con mayor preferencia
las cepas que pertenecen al género Escherichia (p.ej. E.
coli, JM109 ATCC 53323; E. coli HB101, ATCC 33694; E.
coli HB101-16, FERM BP-1872;
E. coli 294, ATCC 31446), o el género Bacillus
(p.ej., Bacillus subtilis ISW 1214). Las levaduras
hospedadoras preferentes incluyen las cepas que pertenecen al
género Saccharomyces (p.ej., Saccharomyces cerevisiae
AH22). Las líneas celulares animales apropiadas incluyen las células
de ratón L929, las células de ovario de hamster chino (CHO), y
similares. Algunos ejemplos de células de insecto son aquellas
derivadas de Spodoptera (p.ej., Sf9, Sf21),
Tricholplusia (p.ej. High Five^{TM}, Tn), Drosophila y
Heliothis. Cuando se usan bacterias como células hospedadoras el
vector de expresión se compone normalmente de al menos un promotor,
un codón de iniciación, una secuencia de ADN que codifica ID SEC Nº
2 (o una parte de la misma), un codón de paro, una zona terminadora
y una unidad de replicación. Cuando se usan las células de levadura
o las células animales como células huesped el vector de expresión
puede incluir una secuencia de control, zonas de unión
exón-intrón y un lugar de poliadenilación.
El promotor de la expresión en las bacterias
comprende normalmente una secuencia Shine-Dalgarno.
Los promotores preferentes para la expresión bacteriana son los
promotores disponibles en el mercado empleados convencionalmente,
tales como el promotor PL y el promotor trp para E. coli. Los
promotores apropiados para la expresión en las levaduras incluyen
el promotor del gen trp1, los genes ADHI o ADHII, y el gen de
fosfatasa ácida (PH05) para S. cerevisiae. El promotor para
la expresión en las células de mamíferos pueden incluir el promotor
temprano o tardío SV40, el promotor HTLV-LTR, el
promotor de metalotioneína de ratón I (MMT), el promotor de
Vaccinia, y similares. Muchos otros promotores adecuados son
conocidos por los expertos en la materia.
Los vectores cuyo uso se contempla en la presente
invención incluyen cualquier vector en el cual pueda insertarse una
secuencia de ácidos nucleicos tal como se ha descrito anteriormente
junto con cualquier elemento operativo preferente o necesario,
vector que posteriormente puede transferirse a una célula
hospedadora y, preferentemente, replicarse en dicha célula. Los
vectores preferentes son aquellos cuyos lugares de restricción han
sido bien documentados y que contienen los elementos operativos
preferentes o necesarios para la transcripción de la secuencia de
ácido nucleico. Puede usarse también vectores para preparar grandes
cantidades de ácidos nucleicos de la invención, que pueden usarse,
por ejemplo, para preparar sondas u otras construcciones de ácido
nucleico. Dichas sondas pueden usarse para identificar las enzimas
de amidasa de glutaril 7-ACA homólogas de otras
especies bacterianas.
Los vectores de esta invención pueden funcionar
en células bacterianas y/o eucariotas. Los plásmidos apropiados
incluyen el plásmido pBR322 o modificaciones del mismo para E.
coli, el plásmido de levadura 2 \mu o el ADN cromosómico de
levadura para la levadura, el plásmido pRSVneo ATCC 37198, el
plásmido pSV2dhfr ATCC 37145, el plásmido
pdBPV-MMTneo ATCC 37224, y el plásmido pSV2neo ATCC
37149 para las células de mamífero. Para las células de mamífero la
secuencia de control, el sitio de poliadenilación y las zonas de
unión exón-intrón pueden deducirse de SV40. Los
vectores, opcionalmente, pueden modificar un péptido de señal
divisible para aumentar la secreción.
El promotor, codón de iniciación, secuencia de
codificación de ADN, codón o codones de terminación y zona
terminadora, así como las secuencias adicionales apropiadas para la
célula hospedadora pueden incorporarse a una unidad de replicación
apropiada (por ejemplo, un plásmido) por medio, por ejemplo, de
conectores y lugares de restricción de un modo convencional (por
ejemplo, digestión con enzimas de restricción, ligadura con ligasa
de ADN de T4) para producir un vector de expresión. Las célula
hospedadora pueden transformarse (transfectarse) con el vector de
expresión por medio de procedimientos conocidos en la técnica (por
ejemplo, precipitación de fosfato cálcico, microinyección,
electroporación, etc.)
La invención se refiere también a procedimientos
de utilización de los ácidos nucleicos de la invención para
producir la amidasa de glutaril 7-ACA de la
invención. En una realización de la invención, la amidasa de
glutaril 7-ACA se prepara por medio de un
procedimiento recombinante que comprende:
a) la preparación de un ácido nucleico capaz de
dirigir una célula hospedadora para que produzca la amidasa de
glutaril 7-ACA de la invención;
b) la clonación de ácido nucleico en un vector
capaz de trasferirse a una célula hospedadora y replicarse en la
misma, conteniendo dicho vector elementos operativos para expresar
el ácido nucleico, si es necesario;
c) la transferencia del vector que contiene el
ácido nucleico y los elementos operativos a una célula hospedadora
capaz de expresar la amidasa de glutaril 7-ACA;
d) el cultivo del hospedador en condiciones
apropiadas para la expresión de la amidasa de glutaril
7-ACA y;
e) el aislamiento de la amidasa de glutaril
7-ACA.
En otra forma de realización la amidasa de
glutaril 7-ACA de la invención se aísla a partir de
un cultivo de Pseudomonas diminuta. En los siguientes
ejemplos se describe un ejemplo del procedimiento para aislar la
amidasa de glutaril 7-ACA a partir de P.
diminuta.
La invención se refiere además a un proceso para
obtener ácido
7-\beta-aminocefalosporánico
(7-ACA) de un ácido
7-\beta-(acilamido)cefalosporánico (por
ejemplo, glutaril 7-ACA) por medio de una amidasa de
glutaril 7-ACA de la invención. El proceso se lleva
a cabo tratando la glutaril 7-ACA o un sustrato
equivalente de acilo 7-ACA con una amidasa de
glutaril 7-ACA de la invención en condiciones que
permiten la hidrólisis del acilo 7-ACA en
7-ACA. Las amidasas de glutaril
7-ACA de la invención pueden emplearse en solución,
o pueden inmovilizarse por medio de entrecruzamiento, o por
fijación, o por inmovilización en un soporte insoluble por
procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo,
Cambiaghi y col., documento US 5.424.196; J. Woodward, documento US
5.846.762; M. Bigwood, documento US 4.612.288; y M. Navia, documento
US 5.618.710.
Las amidasas de glutaril 7-ACA de
la invención pueden ser secretadas al medio de cultivo por las
células hospedadoras. En estas formas de realización la enzima se
aísla fácilmente por medio de los procedimientos habituales si se
desea. Composiciones representativas de la invención que son útiles
para preparar 7-ACA son el caldo de cultivo en sí,
y concentrados, precipitados y fracciones de péptidos derivados de
los mismos que contienen la actividad de la amidasa de glutaril
7-ACA. Si la amidasa 7-ACA expresada
permanece dentro de las células hospedadoras, las siguientes
composiciones son formas de realización de la invención
representativas:
(1) células hospedadoras; separadas del caldo de
cultivo de manera convencional, como puede ser filtrado o
centrifugado;
(2) células desecadas; obtenidas por secado de
las células hospedadoras referidas, de formas convencionales;
(3) extracto libre de células; obtenidas
destruyendo las células hospedadoras referidas de manera
convencional (por ejemplo, lisis con un disolvente orgánico,
homogenización, molido o irradiación ultrasónica) y, opcionalmente,
eliminando los desechos por filtrado o centrifugado;
(4) enzima precipitada, obtenida tratando el
extracto libre de célula referido con un precipitante (por ejemplo,
sulfato sódico, ácido tricloracético, poli(etileneimina),
etc.);
(5) solución enzimática; obtenida por
purificación o purificación parcial del extracto libre de células
referido de manera convencional (por ejemplo, intercambio de iones
o cromatografía de interacción hidrófoba);
(6) células o enzima inmovilizados; preparados
mediante la inmovilización de células hospedadoras o una enzima de
manera convencional (por ejemplo, fijación o inmovilización dentro
de un polímero, fijación a un soporte formado de partículas,
entrecruzamiento, etc.)
El procedimiento de poner en contacto la amidasa
de glutaril 7-ACA de la invención con glutaril
7-ACA puede llevarse a cabo en cualquier disolvente
apropiado, es decir, un disolvente en el que el sustrato sea soluble
y la enzima sea activa. El disolvente es preferentemente un medio
acuoso, como puede ser el agua, o una solución tampón. De manera
típica, el proceso se lleva a cabo disolviendo o suspendiendo el
caldo, o una de las composiciones representativas en una solución
tampón que contiene glutaril 7-ACA o un sustrato
equivalente. El pH de la mezcla de reacción, la concentración del
sustrato, el tiempo de reacción y la temperatura de reacción pueden
variar con las propiedades de un caldo cultivado o su material
procesado que va a usarse. Preferentemente la reacción se lleva a
cabo a un pH entre 6 y 10, más preferentemente entre pH 7 y 9, y
preferentemente entre 0ºC y 40ºC, más preferentemente entre 4ºC y
15ºC, durante 0,5 a 5 horas. La concentración del sustrato en la
mezcla de reacción es preferentemente entre 1 mg/ml y 100 mg/ml. El
7-ACA producido puede purificarse y aislarse de la
mezcla de la reacción con los procedimientos conocidos en la
técnica.
Se espera que, al igual que las amidasas de
glutaril 7-ACA conocidas, las enzimas de la presente
invención sean capaces de efectuar la hidrólisis de otros sustratos
acil 7-ACA, como por ejemplo, succinil
7-ACA y malonil 7-ACA, y por lo
tanto serán útiles para la conversión de dicha alternativa y los
sustratos equivalentes a 7-ACA. El término ácido
7-\beta-(acilamido)cefalosporánico se
refiere a derivados de 7-ACA que son sustratos
conocidos para otras amidasas y acilasa de cefaloesporina (E.C.
3.5.1.11). En general esta clase consiste en compuestos en los que
el acilamido es un grupo acilamido sustituido por carboxi de 3 a 6
carbonos; más concretamente, incluye compuestos en los que el
acilamido se selecciona del grupo que consta de malonilamido,
succinilamido, glutarilamido y
5-carboxi-5-oxopentanamido.
Las enzimas de la presente invención son capaces
también de efectuar la hidrólisis de los derivados de desacetilo
del glutaril 7-ACA y otros ácidos
7-\beta-(acilamido)cefalosporánicos,
produciendo de ese modo desacetil 7-ACA. La
invención, en consecuencia, proporciona también procedimientos para
producir desacetil 7-ACA a partir de estos
derivados.
La presente invención se describirá a
continuación con la ayuda de ejemplos, que deben ilustrar, aunque no
de forma limitativa, el alcance de la invención.
La bacteria denominada
BS-203 fue aislada del suelo durante el curso
de una investigación de microrganismos con actividad de amidasa de
glutaril 7-ACA. La bacteria ha sido depositada en la
colección American Type Culture Collection según las disposiciones
del Tratado de Budapest con la referencia ATCC nº
PTA-2517.
Esta bacteria, que contenía una actividad de
amidasa significativa frente al ácido glutaril cefaloesporánico,
tenía las siguientes características:
Esta bacteria es un bastón motriz estrictamente
aeróbico, gram-negativo, no esporulado. Mide
0,5-0,8 x 2-4 \mum, tiene los
extremos redondeados y un solo flagelo polar.
Las colonias en un agar nutriente son circulares,
convexas, suaves y no tienen color. La glucosa se metaboliza
oxidativamente y la producción de indol es negativa. Se observa
crecimiento a 20ºC y 28ºC, pero no a 5ºC o 37ºC. Además, la cepa no
crece en medios sintéticos, lo que sugiere que se requiere un factor
de crecimiento (Tabla 1). Cuando los medios sintéticos son
complementados con extracto de levadura la cepa crece bien. Las
propiedades fisiológicas se resumen en la Tabla 2.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Medio \+ \hskip2cm \+ Crecimiento \cr Extracto de
levadura - agar de extracto de malta \+ \+ +\cr Agar de harina de
avena \+ \+ -\cr Sales inorgánicas - agar de almidón \+ \+ -\cr
Glicerol - agar de asparagina \+ \+ -\cr Peptona - extracto de
levadura - agar de hierro \+ \+ +\cr Agar de tirosina \+ \+ -\cr
Agar czapek \+ \+ -\cr Glucosa - agar de asparagina \+ \+ -\cr
Agar de zumo V-8 \+ \+
+\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Reacción catalasa \+ \hskip2cm \+ +\cr Reacción oxidasa \+ \+
+\cr Producción de indol \+ \+ -\cr Ensayo OF \+ \+ oxidativo\cr
Temperatura de crecimiento \+ \+ de 15ºC a 30ºC\cr Formación de
pigmentos fluorescentes \+ \+ -\cr Acumulación de
polihidroxibutirato \+ \+ -\cr Arginina dihidrolasa \+ \+ -\cr
Desnitrificación \+ \+ -\cr Hidrólisis del almidón \+ \+ -\cr
Factor de crecimiento \+ \+ requerido\cr Fijación del nitrógeno
atmosférico \+ \+ -\cr Naturaleza halofílica \+ \+ -\cr
Crecimiento a un valor de pH extremo (p.ej., pH 3,5) \+ \+ -\cr
Oxidación de etanol o metanol \+ \+ -\cr Naturaleza anaeróbica \+
\+
-\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ \hskip0,5cm \+ BS-203 \+ \hskip0,5cm
\+ P. Diminuta \+ \hskip0,5cm \+ P.
vesicularis \+ P. Iners \cr Colonias,
amarillas \+ \+ - \+ \+ - \+ \+ + \+ -\cr Número de flagelos \+ \+
1 \+ \+ 1 \+ \+ 1 \+ 1\cr Reacción de oxidasa \+ \+ + \+ \+ + \+ \+
+ \+ -\cr Hidrólisis del almidón \+ \+ - \+ \+ \+ \+ \+ -\cr
Desnitrificación \+ \+ - \+ \+ - \+ \+ - \+ -\cr Acumulación de PHB
\+ \+ + \+ \+ + \+ \+ +\+\cr Requisitos del factor \+ \+ medios
complejos \+ \+ pantotenato biotina \+ \+ pantotenato biotina \+
?\cr de crecimiento \+ \+ (tabla 1) \+ \+ vitamina B _{12} \+ \+
vitamina B _{12} \+\cr \+ \+ \+ \+
metionina\+\+\+\cr}
Las características taxonómicas de la cepa
BS-203 indican que la cepa puede situarse en el
género Pseudomonas (N. Palleroni, Family I.
Pseudomonadeaceae, págs.141-199, en N. Krieg
(ed.) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9ª ed.,
vol. I, (1986), Williams & Wilkins, Baltimore; H. Stolp y D.
Gadkari, Nonpathogenic members of the genus Pseudomonas, pp.
719-741, en M.P. Starr y col. (eds.) The
Prokaryotes: a handbook on habitats, isolation and identification
of bacteria, vol.I (1981), Springer Verlag, Berlin). La cepa
BS-203 parece estar estrechamente
relacionada con el grupo P. diminuta, que requiere factores
de crecimiento específico (Palleroni, supra, p. 184) (Tabla
3).
Se cultivó BS-203 en 500
litros de medio que contenía un 1% de hidrolisato de caseína
(NZAmina A, Sheffield), un 1% de extracto de levadura (Amberex
1003), un 1% de hidrolisato de caseína (CER90C, Deltown) pH 7,0 a
28ºC usando 0,2 VVM de flujo de aire a 5PSIG agitando con fuerza.
Tras un crecimiento de 44 horas se cosechó 1 kg de células por
centrifugado.
Las células se pusieron de nuevo en suspensión en
2,5 l de agua y se homogeneizaron por medio de un homogeneizador de
marca TISSUEMIZER TM (Tekmar) funcionando a máxima velocidad. La
viscosidad del tejido homogeneizado se controló añadiendo 100 mg de
ADNasa (Sigma). Los restos de células se eliminaron por centrifugado
(7000 x amidasa de glutaril 7-ACA durante 20
minutos) en presencia del 0,1% de poli(etileneimina). Se
añadió un 0,3% adicional de poli(etileneimina) y la activad
de la amidasa de glutaril 7-ACA precipitante se
eliminó por medio de un centrifugado adicional.
La amidasa activa se puso de nuevo en suspensión
disolviendo la pastilla en 80 mg de una solución tampón de 0,6 M
NaCl, 20 mM Tris (pH 8,0). Esta suspensión se diluyó tres veces con
agua y se centrifugó para aclarar la solución. El líquido
sobrenadante claro se cargó sobre una columna de intercambio de
iones de 40 ml de Q-sefarosa equilIbrada con 0,15 M
NaCl 50 mM Tris-Cl (pH 8,5). La actividad se eluyó
por medio de un gradiente salino de 0,15 a 0,75 M NaCl. Se
agruparon, concentraron y cargaron fracciones activas máximas que
eluaban casi 300 mM NaCl sobre una columna pg
S-200. La columna se eluyó con 0,25 M NaCl, 0,05 M
Tris -Cl (pH 8). Las fracciones que contenían actividad de amidasa
de glutaril 7-ACA fueron concentradas, dializadas
frente a un tampón de fosfato potásico de 10 mM y cargadas en una
columna de 13 ml de hidroxiapatita (Biorad HTP). La amidasa se
eluyó con un gradiente de fosfato potásico (10 a 600 mM). Las
fracciones que contenían actividad de amidasa máximas fueron
cargadas en una columna de intercambio de iones DEAE Trisacryl TM
equilibrda en 30 mM Tris-Cl (pH 8,4). Esta columna
pulidora se eluyó con un gradiente salino (0 a 600 mM) que contenía
30 mM Tris-HCl. Las fracciones pico que se eluaban
de esta columna seguían conteniendo cantidades significativas de
proteínas contaminantes por lo que se llevó a cabo una purificación
adicional mediante una electroforesis preparativa con gel nativo
según el procedimiento de Davis (Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1964,
121:404-427).
La electroforesis con gel nativo de la amidasa
semipurificada a partir de la segunda DEAE-Trisacryl
separó las proteínas contaminantes de la amidasa. La identidad se
confirmó por medio de un ensayo de actividad de proteína eluada a
partir de rodajas del gel nativo. La homogeneidad se confirmó por
medio de electroforesis de gel tanto nativo como de gel SDS de la
proteína eluada. Se efectuó una electroforesis preparativa de gel
SDS en la amidasa nativa eluada a partir del gel nativo para separar
las dos subunidades de esta proteína. Tanto la unidad grande, que
tiene un peso molecular de 42.000 dalton, como la subunidad pequeña,
que tiene un peso molecular de 26.000 dalton, se eluaron,
dializaron y concentraron a partir del gel SDS preparativo. Estas
preparaciones se digirieron con tripsina y fragmentos aislados
usados para determinar las secuencias de aminoácidos
N-terminales de los fragmentos procedentes de las
dos subunidades. Estas secuencias de aminoácidos se muestran en las
figuras 2 y 3.
Se inoculó 100 ml de medios Luria Bertani (LB)
con 1 ml de un cultivo confluente de BS-203.
El cultivo se agitó a 28ºC durante 24 horas a 200 rpm. Las células
se comprimieron durante 15 minutos en una centrifugadora de
sobremesa TJ-6 Beckman a 6000 rpm. Las células se
pusieron de nuevo en suspensión en 4 ml de 50 mM de glucosa / 10 mM
EDTA / 25 mM Tris-HCl pH 8,0 y se incubaron con 10
mg de lisozima potenciada (Sigma) durante 15 minutos a 37ºC. Las
células se sometieron a lisis añadiendo 1 ml de dodecil sulfato con
un 2% de sodio (SDS) y 50 \mug / ml de proteinasa K a 50ºC
durante 3 horas. La suspensión se extrajo sucesivamente con 1 ml de
fenol, 1 ml de cloroformo y 1 ml de éter. Se precipitó luego
añadiendo 30 \mul de 5 M NaCl, 2 ml de etanol al 100% y se mezcló
cuidadosamente por inversión hasta que se formó una costra. La
costra de ADN se eliminó usando una pipeta Pasteur sellada y en
forma de gancho y se enjuagó sucesivamente en soluciones de etanol
al 70%, 85% y 100%. Las soluciones de etanol al 70% y al 85% se
diluyeron con 10 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA y 150 mM NaCl. Se dejó
disolver el ADN 0,5 ml de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0,
1 mM EDTA pH 8,0) a 22ºC durante 16 horas. Se añadió RNasa A a 50
\mug / ml y se incubó a 37ºC durante 2 horas, seguido por una
segunda digestión en SDS al 0,5% y 50 \mug / ml de proteinasa K a
37ºC durante 16 horas. Las extracciones orgánicas y la precipitación
de etanol se repitieron. La costra de ADN final se disolvió en 0,4
ml de TE. La concentración de ADN se determinó por medios
espectrofotométricos a 260 nm.
Para construir una biblioteca de cósmido genómico
de BS-203 se usó un nuevo vector de cósmido,
pWB70. El vector se construyó a partir de los plásmidos pNEO (R.A.
Jorgensen y col., Mol. Gene Genet. 177:65-72 (1979))
y pJP1A (J.J. Portmore y col., Biotech. Letters
9:7-12 (1987)), tal como se muestra en la figura 6.
El plásmido pNEO se digirió parcialmente con Pst I y se digirió
completamente mediante Eco RI. Un fragmento de 4,2 kilobas (Kb) se
aisló mediante una electroforesis preparativa de gel agarosa y se
purificó utilizando Geneclean^{TM} (BIO 101). Se digirió pJP1A
con Pst I y Eco RI, y se aisló un fragmento de 1,1 Kb que contenía
el lugar cos de la lambda bacteriófaga, que permite que el ADN sea
empaquetado en cabezas de fago lambda. Ambos fragmentos se ligaron
y los transformadores se examinaron para comprobar la resistencia a
la neomicina y la sensibilidad a la ampicilina. Este vector, que no
produce actividad de \beta-lactamasa y confiere
resistencia a la neomicina, permite que se inserten grandes
fragmentos de ADN cromosómico (30-45 Kb) en la E.
coli, con lo que se genera una biblioteca genómica de
cósmidos.
El procedimiento siguiente se utilizó para
generar una biblioteca genómica de cósmidos a partir de
BS-203: Se digirió cósmido pWB70 mediante
Bam HI y se desfosforilizó con fosfatasa bacterial alcalina (BAP)
para prevenir una autoligación. Para establecer unas condiciones
óptimas para generar los fragmentos de ADN entre
30-45 Kb necesarios para la clonación mediante
cósmidos, se digirió ADN cromosómico de BS-203 de
alto peso molecular mediante diferentes cantidades de Sau 3 A1 a lo
largo de una hora a 37ºC. Sau 3 A1 reconoce la secuencia GATC de 4
pares de bases (bp) y genera un final cohesivo que puede ser ligado
a un final cohesivo Bam HI. Una concentración de enzimas de 0,016
unidades / \mug de ADN proporcionó la concentración máxima de
fragmentos de ADN en el segmento 30-45 Kb. Estas
fueron las condiciones usadas para preparar una gran cantidad de ADN
BS-203 parcialmente digerido. El ADN se fraccionó
mediante un gradiente al 10-40% de sacarosa para
obtener un enriquecimiento de fragmentos de ADN entre
30-45 Kb. Las fracciones (0,4 ml) se recogieron y
cada tercera fracción se analizó mediante electroforesis de gel de
agarosa al 0,4%. Las fracciones que contenían los fragmentos del
tamaño adecuado se agruparon y se precipitaron dos veces con
etanol. Un análisis final mediante electroforesis con gel de agarosa
indicó que el ADN tiene el tamaño adecuado para la clonación
mediante cósmidos.
Los fragmentos enriquecidos de ADN de
BS-203 (30-45 Kb) se ligaron
a pWB70 digerido por Bam HI con ligasa de ADN T4 (BRL) a 22ºC
durante 16 horas. Según las instrucciones del fabricante la mezcla
de ligadura se empaquetó in vitro utilizando el juego
Gigapack II Gold TM (Stratagene). Los transfectantes se
seleccionaron de un agar LB que contenía 30 \mug/ml de neomicina.
La eficacia del empaquetado fue de unos 7,2 x 10^{3}
transfectantes/\mug de ADN insertado.
Se preparó costras de la colonia de la biblioteca
genómica de cósmidos de BS-203 para examinar el gen
de la amidasa de glutaril 7-ACA. Los transfectantes
se trasfirieron a un filtro de nitrocelulosa de 82 mm y 0,45 \mum
(Schleicher & Schuell). A continuación, se ampliaron los
transfectantes mediante la transferencia del filtro a una placa de
agar LB con 170 \mug/ml de cloranfenicol y se incubó a 37ºC
durante 16 horas. El ADN se ligó al filtro mediante la
transferencia del filtro (con el lado de la colonia hacia arriba) a
un papel de 3 MM saturado con las siguientes soluciones: un 10% de
SDS durante 3 minutos, 0,5 M de NaCl durante 5 minutos, 1,5 M de
NaCl/0,5 M Tris-Cl pH 7,5 durante 5 minutos y 2X
SSPE durante 5 minutos. Se secó el filtro con aire durante 30
minutos y, a continuación, se horneó a 80ºC durante 30 minutos en un
horno al vacío. Para eliminar los restos de bacterias se incubó el
filtro en 1 X SSPE / 0,5% SDS / 50 \mug/ml de proteinasa K durante
30 minutos a 42ºC. Los restos de las bacterias se eliminaron
frotando con suavidad el filtro, con la mano enguantada, en 2X
SSPE/ 0,1% SDS precalentado a 65ºC. A continuación se lavó el filtro
dos veces en 2X SSPE durante 5 minutos cada vez, se secó con aire y
se cubrió hasta la hibridización.
Dieciséis sondas oligonucleótidas degenerativas
de 17 meros derivadas de la secuencia de aminoácido de amidasa de
glutaril 7-ACA se sintetizaron con un
PCR-MATE TM (Figura 2) con etiquetado al final de
[Y-P] ATP (Amersham) y usado para sondar un coágulo
de Southern (Southern, E.M. 1975, J.Mol.Biol.
98:503-517) de ADN cromosómico de
BS-203 digerido con endonucleasas de
restricción HindIII y Pst I. La hibridización se llevó a cabo en 4X
SSPE, 10% PEG 6000, 0,5% SDS, 5X Denhardt's (0,1% Ficoll,1%
polivinilpirroidona, 0,1% de albúmina de suero bovino) y 50 \mug
/ml de tampón de ADN de esperma desnaturalizado de salmón a 42ºC
durante 72 horas. Las condiciones de lavado de hibridización fueron
las siguientes: dos veces en 5X SSPE / 0,1% SDS a
20-25ºC (temperatura ambiente) cada una durante 5
minutos, dos veces en 5X SSPE / 0,1% SDS a 45ºC (temperatura
ambiente) cada una durante 5 minutos, y en dos veces en 5X SSPE a
20-25ºC (temperatura ambiente) cada una durante 5
minutos. Nueve de las sondas se hibridaron a Southern blots. De
estas nueve sondas, se seleccionaron cuatro para examinar coágulos
de colonia de la biblioteca genómica de cósmidos. Cada sonda se usó
para examinar cuatro coágulos de colonia con unos 200
transfectantes cada uno usando las mismas condiciones de hibridación
y lavado que las explicadas previamente, excepto que se acortó la
duración de la hibridación a 48 horas. Se seleccionó doce
transfectantes identificados como sonda nº 3 (ID SEC Nº 8) y sonda
nº 7 (DE12) para una evaluación posterior. Se aisló ADN plásmido de
cada uno de los transformantes mediante el procedimiento de
minielaboración TELT (He y col., 1990, Nucl. Acids
Res., 18:1660). El análisis de Southern de estos clones
identificó cinco clones cósmidos que se hibridaron tanto en sondas
oligonucleótidas de 17-meros como en las sondas de
base de 77 mer indicador (Lathe, R., 1985, J. Mol.Biol.
183:1-12). La sonda de base de 77 mer indicador
(figura 3) se diseñó y sintetizó basándose en la secuencia de
aminoácido descrita en la figura 2. La hibridación se llevó a cabo
en 2X SSC, 5X Denhardt's, 0,5% de SDS y 100 \mug/ml de tampón de
ADN de esperma desnaturalizado de salmón a 50ºC durante 48 horas.
Las condiciones de lavado de la hibridación fueron las siguientes:
dos veces en 2X SSC /0,5% SDS a 20-25ºC cada una
durante diez minutos, una vez en 2X SSC / 0,5% SDS a 60ºC durante
veinte minutos, y una vez
2X SSC a 20-25ºC durante cinco minutos. Estos cinco clones cósmidos se analizaron más adelante para comprobar si había actividad de amidasa de glutaril 7-ACA. Tres de ellos mostraron una cantidad importante de actividad y un clon 7.10 mostró la máxima actividad.
2X SSC a 20-25ºC durante cinco minutos. Estos cinco clones cósmidos se analizaron más adelante para comprobar si había actividad de amidasa de glutaril 7-ACA. Tres de ellos mostraron una cantidad importante de actividad y un clon 7.10 mostró la máxima actividad.
Debido a que su tamaño era adecuado, se aisló un
fragmento de Pst I de 2,3 Kb del clon cósmido 7.10 que se había
hibridado con la sonda oligonucleótida y se subclonó al vector
bacteriófago M13mp, que había sido dividido mediante Pst I y había
sido desfosforilatado con BAP. La secuenciación nucleótida del
fragmento Pst de 2,3 Kb del clon cósmido 7.10 identificó las
secuencias complementarias de las sondas 17 meros y base 77 mero
indicador que se habían usado para identificar el gen. La
traducción de la secuencia de ADN adyacente proporcionó una
secuencia de aminoácidos que era idéntica a las secuencias de
aminoácidos que se había determinado previamente
(Figuras 2 y 3).
(Figuras 2 y 3).
Al traducir la secuencia nucleótida del fragmento
entero Pst I de 2,3 Kb se observó que faltaba el final 3' del
amidasa de glutaril 7-ACA de la amidasa de glutaril
7-ACA. Por lo tanto, se tuvo que subclonar el final
3'para secuenciar el final 3' del gen y reconstruir el gen en toda
su longitud. La secuenciación identificó un sitio Hind III situado
a unos 100 pares de bases corriente arriba del lugar de inicio de la
traducción. Por ello, se aisló un fragmento de Hind III de 11 Kb
del clon cósmido 7.10 que se había hibridado tanto con la sonda
oligonucleótida de 17 meros como con la sonda base de 77 meros
indicadores y se subclonó a pUC19 que había sido dividido con Hind
III. Se examinó los transformantes y se seleccionó uno para la
evaluación posterior. Para recortar la zona no codificadora del
final 3' de este clon que contenía el fragmento Hind III de 11 Kb,
se digirió el clon para completarlo con Ban HI y luego se digirió
parcialmente con Sau 3A1. Se tomó las porciones alícuotas a los 5,
10 y 20 minutos y se combinó y separó mediante electroforesis por
medio de un gel preparativo de agarosa. Se extirpó un segmento de
4,8-5,8 Kb del gel y se aisló. El fragmento de
4,8-5,8 Kb se ligó de nuevo a sí mismo y se usó
para transformar células DH\alpha. Se preparó un minipreparado de
ADN a partir de 12 transformantes y se examinó mediante EcoRI
digestiones. El clon nº 6 contenía un fragmento EcoRI de 1,8 Kb que
contenía 1000 bases adicionales de la secuencia corriente abajo del
lugar de Pst I. Se aisló este fragmento, se clonó a M13mp19 y se
usó para secuenciar el final 3' del
gen.
gen.
La secuencia nucleótida del gen de la amidasa de
glutaril 7-ACA codificado en los fragmentos Pst de
2,3 Kb y EcoRI de 1,8 Kb se determinó mediante el procedimiento de
terminación de cadenas dideoxi (Sanger y col., 1977, Proc. Natl.
Sci. U.S.A. 74:5463-5467) utilizando el sistema
de secuenciación TAQ TRACK^{TM} (Promega). Se identificó dos
clones que contenían el fragmento Pst I de 2,3 Kb en orientación
opuesta. Se generó un grupo de deleciones unidireccionales,
anidadas en un extremo del inserto, usando exonucleasa III. ADN
monocatenario (M13 Cloning/ Dideoxy Sequencing Instruction Manual,
Bethesda Research Laboratories Life technologies, Inc. form nº
19541:44-49) se aisló de las deleciones y se usó
para secuenciación. También se aisló ADN monocatenario del
fragmento clonado EcoRI de 1,8 Kb dentro de M13mp19 y se usó para la
secuenciación del final 3' del gen. Se usó el M13(-20) primer
5'-GTAAAACGACGGCCAGT -3'(ID SEC Nº 23) (STRATAGENE)
e imprimaciones sintetizadas de forma interna para secuenciar el
gen entero de ambas cadenas.
Se llevó a cabo una electroforesis en un gel del
8% de poliacrilamida con 8M de urea en un tampón TBE (0,098 M
Tris-borato, =,089 M de ácido bórico, 0,003 M de
EDTA) y un gel de poliacrilamida al 5% de HYDROLINK LONG RANGER TM
(FMC BioProducts, U.S.A) con 7M de urea en el tampón de TBE a 2700
voltios.
La secuencia nucleótida completa se muestra en la
figura 4. La zona codificadora tiene 1701 pares de bases de
longitud y códigos para una proteína de aminoácidos de 567 (MW=60
kD). Las secuencias utilizadas de forma complementaria a las sondas
de 17 mer y 77 base guess-mer para identificar el
gen están subrayadas en la Figura 4.
La secuencia de proteína (ID SEC Nº 2)
determinada por la traducción de la secuencia del ADN contiene
secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de aminoácidos
identificadas en las figuras 2 y 3.
Para facilitar la subclonación del gen amidasa de
glutaril 7-ACA en plásmidos vectores para la
expresión enzimática en E. coli, se realizó una mutagénesis
dirigida por oligonucleótidos específica del sitio en el clon
genómico amidasa de glutaril 7-ACA a fin de
introducir un sitio enzima de restricción en el codón de iniciación
de la traducción (ATG del gen) usando el procedimiento de Morinaga
(Morinaga y col., 1984, Bio/Technology 7:636-639).
El mutágeno oligonucleótido sintético que contiene un cambio
sencillo de base (de A a T) y que da lugar a un sitio BspHI
(TCATGA) se ilustra a continuación:
a) la secuencia de amidasa de glutaril
7-ACA que va a ser mutagenizada:
- 5'...TTGAGATCCGACATGACCCGT ...3' (ID SEC Nº 24).
b) oligonucleótido sintético (21 mer):
- 5' TTGAGATCCGTCATGACCCGT 3' (ID SEC Nº 25).
El ADN de la amidasa de glutaril
7-ACA mutagenizada con éxito se identificó mediante
clivaje con el enzima de restricción BspHI y se confirmó mediante
el análisis de secuencia del ADN. A continuación, se aisló el gen
amidasa de glutaril 7-ACA del clon plásmido genómico
por digestión con enzimas de restricción BspHI y BamHI ligadas a
plásmido de expresión pBMS2000 (figura 1) y transformadas en cepa
BL21 de E. coli. Se desarrollaron cultivos recombinantes
seleccionados sobre placas de agar LB (al 1% de
bacto-triptona, 0,5% deNaCl,0,5% de extracto de
levadura y 1,5% de agar, complementado con 30 \mug/ml de
neomicina) en un medio LB más 30 \mug/ml de neomicina y fueron
inducidos durante el crecimiento exponencial con 60 \muM de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida
(IPTG) durante 4 horas. Los lisatos de E. coli BL21
recombinante inducidos por IPTG que albergaban plásmido
pBMS2000/GCA convirtieron con éxito el glutaril
7-ACA en ácido
7-aminocefalosporánico, lo que indica actividad
enzimática de amidasa de glutaril 7-ACA activa (el
BL21 no transformado no tiene actividad de amidasa de glutaril
7-ACA ). Los mismos lisatos sometidos a análisis
SDS-PAGE (reducido) revelaron nuevas bandas de
proteínas de 26 y 42 kilodaltons (kd) correspondientes a las
subunidades pequeñas y grandes de amidasa de glutaril
7-ACA.
Para una producción a mayor escala, un proceso de
fermentación preferente es el siguiente: el E. coli
recombinante BL21 se cultiva en un medio que contiene 3 g/l de
fosfato dipotásico; 2 g/l de fosfato monopotásico; 2 g/l de fosfato
monopotásico; 2 g/l de sulfato magnésico; 3 g/l de extracto de
levadura; 0,5 g/l de sulfato de amonio; 0,03 g/l de sulfato de
hierro; y 0,03 g/l de canamicina. La fermentación se lleva a cabo a
30ºC con un flujo de aire a 1,0 VVM@47,6 kPam; el pH se mantiene a
7,0 con gas de amoniaco. El cultivo se alimenta en una solución de
20% de hidrolisato de caseína y 20% de glucosa para mantener una
tasa de crecimiento lineal. La producción de amidas es inducida con
150 \muM IPTG tras 10 horas de fermentación. La fermentación se
detiene cuando el título de amidasa alcanza un máximo, normalmente
a una densidad celular de aproximadamente 40 gramos por litro (peso
de células secas) tras aproximadamente 45 horas. la totalidad del
caldo se homogeneiza para liberar la amidasa y se aclara por medio
de filtrado.
Para efectuar la inmovilización de la enzima, un
procedimiento preferente es tratar el filtrado activo con un 5% de
tierra diatomácea, 0,5% de polialilamina y 0,2% de polietileneimina.
A continuación, se trata la mezcla con 0,15% de glutaraldehido a un
pH de 8,0 para inmovilizar la amidasa sobre la tierra diatomácea.
La amidasa puede luego recuperarse por medio de filtrado.
La amidasa inmovilizada puede usarse para
transformar glutaril 7-ACA en 7-ACA
agitando una suspensión acuosa a 4ºC con el pH mantenido en 9,0 con
amoniaco con una concentración de sustrato de 100g/l de glutaril
7-ACA. La producción es aproximadamente del 90% con
un 95% de balance de masa.
<110> Bristol-Myers Squibb
Company
\vskip0.400000\baselineskip
<120> AMIDASA DE GLUTARIL CEFALOSPORINA A
PARTIR DE PSEUDOMONAS DIMINUTA BS-203
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DB25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 09/959,960
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-09-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/234,532
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
20.00-09-22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2190
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 567
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Val Met Gly Asp Tyr Ala Glu Ser
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtnatgggng aytaygc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcrtartcnc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcataatcac ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcataatccc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcataatcgc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15) .. (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcataatctc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatagtcac ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatagtccc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15) .. (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatagtcgc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatagtctc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtaatcac ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtaatccc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtaatcgc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtagtcac ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtagtcac ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<231> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtagtccc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtagtcgc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo heterogéneo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c a t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtagtctc ccatnac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda oligonucleótida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttttgctg tcacgcatta tctcagtggt gctattggtg aggctgctgg tgagctcagt
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggatgctg agattgc
\hfill77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Coliphage M13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaacgac ggccagt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgagatccg acatgacccg t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleotide containing BspHI
restriction enzyme site
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgagatccg tcatgacccg t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Un ácido nucleico seleccionado del grupo que
consiste en:
(a) un ácido nucleico que codifica la amidasa de
glutaril 7-ACA y tiene la secuencia de ácido
nucleico de ID SEC Nº 2;
(b) un ácido nucleico según (a) en el que dicho
ácido nucleico consiste en la secuencia ID SEC Nº 1;
(c) un ácido nucleico que codifica una amidasa de
glutaril 7-ACA y tiene las siguientes
características: es aislable de la Pseudomonas diminuta
BS-203 (ATCC PTA-2517), cataliza la
hidrólisis del ácido
7-\beta-(4-carboxibutanamido)-cefalosporánico
a ácido 7-aminocefalosporánico y a ácido glutárico y
se compone de dos subunidades con unos pesos moleculares aparentes
de 43 kd y 26 kd respectivamente a partir de electroforesis SDS
PAGE;
(d) el ácido nucleico que codifica la amidasa de
glutaril 7-ACA según (c), en el que dicha amidasa
comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en ID SEC Nº 2;
(e) el ácido nucleico que codifica la amidasa de
glutaril 7-ACA según (c), en el que dicha amidasa
consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en ID SEC Nº
2;
(f) el ácido nucleico que codifica la amidasa de
glutaril 7-ACA y coincide al menos en un 80% con la
amidasa de (e).
(g) el ácido nucleico que codifica la amidasa de
glutaril 7-ACA según (f), en el que dicha secuencia
de aminoácidos comprende ID SEC Nº 2 con hasta 113 sustituciones
conservadoras de aminoácidos;
(h) el ácido nucleico que codifica la amidasa de
glutaril 7-ACA según (f), en el que dicha secuencia
de aminoácidos comprende ID SEC Nº 2 con la adición o la
eliminación de hasta 20 residuos de amino.
2. Un vector que comprende una secuencia de ácido
nucleico según la reivindicación 1.
3. Una célula hospedadora transformada con el
vector de la reivindicación 2.
4. La célula hospedadora de la reivindicación 3,
en la que la célula hospedadora es una bacteria.
5. Un procedimiento para preparar la amidasa de
glutaril 7-ACA de la reivindicación 7 a partir de
Pseudomonas diminuta BS-203, comprendiendo
dicho procedimiento
(a) cultivar la bacteria (ATCC
PTA-2517) Pseudomonas diminuta
BS-203 bajo condiciones aeróbicas en un medio
adecuado; y
(b) recuperar del cultivo obtenido una fracción
de proteína con actividad de amidasa de glutaril
7-ACA.
6. Un procedimiento para preparar amidasa de
glutaril 7-ACA, comprendiendo dicho
procedimiento:
(a) cultivar células hospedadoras según la
reivindicación 3 en condiciones adecuadas para la expresión de la
amidasa de glutaril 7-ACA; y
(b) recuperar del cultivo obtenido una fracción
de proteína con actividad de amidasa de glutaril
7-ACA.
7. Una amidasa de glutaril 7-ACA
codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 1 u obtenible
mediante los procedimientos descritos en la reivindicación 6.
8. La amidasa de glutaril 7-ACA
de la reivindicación 7, en la que la amidasa de glutaril
7-ACA se inmoviliza sobre un soporte insoluble.
9. Un proceso para la obtención de ácido
7-aminocefalosporánico a partir de un ácido
7-\beta-(acilamido)cefalosporánico, que
comprende el contacto de un ácido
7-\beta-(acilamido)cefalosporánico con la
amidasa de glutaril 7-ACA según la reivindicación 7
o la reivindicación 8 en un disolvente adecuado.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que el ácido
7-\beta-(acilamido)cefalosporánico es ácido
7-\beta-(4-carboxibutanamido)-cefalosporánico.
11. Un procedimiento para la obtención de ácido
desatecil 7-aminocefalosporánico a partir de un
ácido desatecil
7-\beta-(acilamido)cefalosporánico, que
comprende el contacto de un ácido desacetil
7-\beta-(acilamido)cefalosporánico con la
amidasa de glutaril 7-ACA, según la reivindicación 7
o la reivindicación 8 en un disolvente adecuado.
12. El proceso de la reivindicación 11, en el que
el ácido desatecil
7-\beta-acilamido-cefalosporánico
es ácido desatecil
7-\beta-(4-carboxibutanamido)-cefalosporánico.
13. Uso de un ácido nucleico seleccionado del
grupo que consiste en
(a) un ácido nucleico de entre 10 y 1722
nucleótidos que se hibrida bajos condiciones estrictas bien con una
molécula de ADN que consiste en ID SEC Nº:1 o en una molécula de ADN
que consiste en el complemento de ID SEC Nº:1;
(b) el ácido nucleico de (a) en el que el ácido
nucleico tiene una longitud de entre 17 y 1722 nucleótidos; y
(c), el ácido nucleico de (a) en el que el ácido
nucleico tiene una longitud de entre 20 y 1722 nucleótidos;
para la detección de la secuencia de ID SEC
Nº:1.
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