ES2243047T3 - Deteccion sistematica diferencial cualitativa. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para identificar y/o clonar regiones de ácidos nucleicos representativas de diferencias genéticas cualitativas entre dos muestras biológicas, que comprende una etapa de hibridación entre los ARN o ADNc de doble hebra, que provienen de una primera muestra biológica, y los ADNc que provienen de una segunda muestra biológica, e identificar y/o clonar, a partir de complejos formados mediante hibridación, regiones de ácidos nucleicos no emparejadas, comprendiendo dichas regiones ácidos nucleicos representativos de diferencias genéticas cualitativas entre las dos muestras.

Description

Detección sistemática diferencial cualitativa.

La presente invención se refiere a los campos técnicos de la biotecnología, de la medicina, de la biología y de la bioquímica. Sus aplicaciones se refieren a los campos de la salud humana, animal y vegetal. Más particularmente, la invención permite identificar secuencias de ácidos nucleicos que permiten realizar nuevas detecciones sistemáticas para moléculas de interés terapéutico, nuevas herramientas de ingeniería genética, así como aportar indicaciones sobre el potencial tóxico y el seguimiento de la eficacia de moléculas y de las informaciones farmacogenómicas.

La presente invención describe especialmente una serie de técnicas originales de identificación de secuencias de ácidos nucleicos basada en la puesta en evidencia de las diferencias cualitativas entre los ARN que provienen de dos contextos distintos que se desean comparar, en particular que provienen de un tejido o de un órgano enfermo y sus equivalentes sanos. Más precisamente, estas técnicas están destinadas a clonar específicamente los intrones y los exones alternativos cortados y empalmados diferencialmente entre una situación patológica y un estado sano, o entre dos situaciones fisiológicas que se desean comparar. Estas diferencias cualitativas en los ARN pueden provenir igualmente de una alteración o alteraciones del genoma, de tipo inserciones o supresiones en regiones que se transcribirán en ARN. Esta serie de técnicas se identifica mediante el acrónimo DATAS: Análisis diferencial de transcritos con corte y empalme alternativo (Differential Analysis of Transcripts with Alternative Splicing, en inglés).

La caracterización de las alteraciones de la expresión genética que presiden o que están asociadas con una patología dada suscita una esperanza importante de descubrir nuevas dianas terapéuticas y nuevas herramientas de diagnóstico. Sin embargo, la identificación de una secuencia de ADN genómico o complementario, hecha mediante clonación posicional o mediante técnicas de detección sistemática diferencial cuantitativa, aporta poca o ninguna información sobre la función y, menos aún, sobre los dominios funcionales empleados en las desregulaciones relacionadas con la patología estudiada. La presente invención describe una serie de técnicas originales que tienen como objetivo identificar las diferencias de cortes y empalmes de los ARN que existen entre dos situaciones fisiopatológicas distintas. La identificación de estas diferencias aporta informaciones sobre las diferencias cualitativas y no sobre las diferencias cuantitativas, como es el caso para las técnicas descritas hasta ahora. El conjunto de las técnicas presentadas en la presente invención se agrupa, por lo tanto, bajo la denominación "detección sistemática diferencial cualitativa" o DATAS. Los métodos de la invención son utilizables para la identificación de nuevas dianas o productos terapéuticos, para la preparación de herramientas de búsqueda genética y/o de herramientas para el diagnóstico, para la construcción de bancos de ácidos nucleicos, y en métodos de determinación del perfil toxicológico o de la eficacia de un compuesto, por ejemplo.

Un primer objeto de la invención reside más particularmente en un procedimiento para identificar y/o clonar regiones de ácidos nucleicos representativas de diferencias genéticas cualitativas entre dos muestras biológicas, que comprende una etapa de hibridación de una población de ARN o de ADNc de doble hebra, que proviene de una primera muestra biológica, con una población de ADNc que proviene de una segunda muestra biológica (Figura 1A).

Como se indica aquí anteriormente, las diferencias genéticas cualitativas pueden ser debidas a modificaciones de corte y empalme de los ARN, o a supresiones y/o inserciones en regiones del genoma que se transcriben en ARN.

En un primer modo de realización, se trata de una hibridación entre una población de ARN que proviene de una primera muestra biológica y una población de ADNc (de hebra simple, o de doble hebra) que proviene de una segunda muestra biológica.

En otro modo de realización, se trata de una hibridación entre una población de ADNc de doble hebra, que proviene de una primera muestra biológica, y de una población de ADNc (de doble hebra o, preferentemente, de hebra simple) que proviene de una segunda muestra biológica.

Un objeto más particular de la invención reside en un procedimiento para identificar regiones de ácidos nucleicos cortadas y empalmadas diferencialmente entre dos situaciones fisiológicas, que comprende hibridar una población de ARN o de ADNc de doble hebra, que proviene de una situación de ensayo, con una población de ADNc que proviene de una situación de referencia, e identificar ácidos nucleicos que corresponden a cortes y empalmes diferenciales.

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento para clonar ácidos nucleicos cortados y empalmados diferencialmente entre dos situaciones fisiológicas, que comprende hibridar una población de ARN o de ADNc de doble hebra, que proviene de la situación de ensayo, con una población de ADNc que proviene de la situación de referencia, y clonar ácidos nucleicos que corresponden a cortes y empalmes diferenciales.

En un modo particular de realización, el procedimiento para identificar y/o clonar ácidos nucleicos de la invención comprende dos hibridaciones paralelas:

(a) la hibridación de los ARN que provienen de la primera muestra (situación de ensayo) con los ADNc que provienen de la segunda muestra (situación de referencia);

\newpage

(b) la hibridación de los ARN que provienen de la segunda muestra (situación de referencia) con los ADNc que provienen de la primera muestra (situación de ensayo); y

(c) la identificación y/o la clonación, a partir de los híbridos formados en (a) y (b), de ácidos nucleicos que corresponden a diferencias genéticas cualitativas.

La presente invención se refiere igualmente a la preparación de bancos de ácidos nucleicos, a los ácidos nucleicos y a los bancos así obtenidos, así como a los usos de estos materiales en cualquier campo de la biología/biotecnología, como se ilustra más adelante.

Con este objetivo, la invención se refiere igualmente a un procedimiento para preparar composiciones o bancos de ácidos nucleicos perfilados, representativos de las diferencias cualitativas que existen entre dos muestras biológicas, que comprende una etapa de hibridación de una población de ARN, que proviene de una primera muestra biológica, con una población de ADNc que proviene de una segunda muestra biológica.

La invención se refiere además a un método de perfilado ("profiling", en inglés) de una composición de ADNc, que comprende una etapa de hibridación de esta composición con una población de ARN, o a la inversa.

Como se indica anteriormente, la presente invención se refiere en particular a métodos para identificar y clonar ácidos nucleicos representativos de un estado fisiológico. Además, los ácidos nucleicos identificados y/o clonados representan las cualidades de un estado fisiológico en el sentido en el que estos ácidos nucleicos están, en su mayor parte, implicados generalmente en el estado fisiológico observado. Por ello, los métodos cualitativos de la invención dan acceso directamente a los elementos genéticos o a su producto proteico, que tiene un papel funcional en el desarrollo de un estado fisiopatológico.

Los métodos según la invención se refieren en parte a una etapa original de hibridación cruzada entre los ARN y los ADNc de situaciones fisiológicas distintas. Esta o estas hibridaciones cruzadas permiten ventajosamente poner en evidencia, en los híbridos formados, regiones no emparejadas, es decir, regiones presentes en los ARN en una situación fisiológica dada y no en los ARN en otra situación fisiológica. Estas regiones corresponden esencialmente a cortes y empalmes alternativos característicos de un estado fisiológico, pero pueden igualmente reflejar alteraciones genéticas de tipo inserciones o supresiones, y constituyen así elementos genéticos particularmente útiles en el plano terapéutico o de diagnóstico como se explica a continuación. Por lo tanto, la invención consiste esencialmente en conservar los complejos formados tras la(s) hibridación(es) cruzada(s), a fin de extraer de ella(s) las regiones que corresponden a diferencias cualitativas. Esta metodología se diferencia de las técnicas de substracciones cuantitativas, conocidas por el experto en la técnica (Sargent y Dawid (1983), Science, 222, 135-139; Davis et al. (1984), PNAS, 81, 2194-2198; Duguid y Dinauer (1990) Nuc. Acid Res., 18, 2789-2792; Diatchenko et al. (1996) PNAS, 93, 6025-6030; documento WO 98/42781; Hubank et al., Nucleic Acid Res. 22 (1994) Vol. 22, No 25, p. 5640-5648), las cuales, tras la(s) hibridación(es), eliminan los híbridos formados para conservar solamente los ácidos nucleicos no complejados. Además, Pret et al. (Gene 208 (1998) p. 103-115), al contrario de la invención, se refiere únicamente al estudio de los niveles de expresión de genes en una muestra biológica, y no enseña en absoluto el análisis de regiones no emparejadas en híbridos formados entre dos muestras. El documento EP-A-0791660 se refiere a la detección de un único sitio de corte y empalme, y no enseña ningún procedimiento para identificar regiones cualitativas ni los métodos ni las herramientas de análisis según la invención.

Por lo tanto, la invención se refiere en primer lugar a un procedimiento para identificar ácidos nucleicos de interés, que comprende hibridar los ARN de una muestra de ensayo y los ADNc de una muestra de referencia. Esta hibridación permite poner en evidencia, en el seno de los complejos formados, diferencias genéticas cualitativas entre las situaciones ensayadas, y así identificar y/o clonar, por ejemplo, los cortes y empalmes característicos de la situación de ensayo.

Según una primera variante de la invención, el procedimiento permite entonces generar una población de ácidos nucleicos característicos de los cortes y empalmes del estado fisiológico de ensayo, con relación al estado de referencia (Figura 1A, 1B). Como se indica a continuación, esta población se puede utilizar para la clonación y la caracterización de los ácidos nucleicos, para su uso en diagnósticos, para detección sistemática, terapéutica, o para la producción de anticuerpos o de fragmentos proteicos o de proteínas enteras. Esta población puede servir igualmente para constituir bancos utilizables en distintos campos de aplicaciones ilustrados más adelante, y para la obtención de sondas marcadas (Figura 1D).

Según otra variante de la invención, el procedimiento comprende una primera hibridación, tal como se describe aquí anteriormente, y una segunda hibridación, en paralelo, entre los ARN que provienen de la situación de referencia y los ADNc que provienen de la situación de ensayo. Esta variante es particularmente ventajosa puesto que permite generar dos poblaciones de ácidos nucleicos, representando una las cualidades de la situación de ensayo con relación a la situación de referencia, y la otra las cualidades de la situación de referencia con relación a la situación de ensayo (Figura 1C). Estas dos poblaciones se pueden igualmente utilizar como fuente de ácidos nucleicos, así como bancos testigo de la huella genética de una situación fisiológica dada, como se detalla más adelante (Figura
1D).

La presente invención se puede aplicar a cualquier tipo de muestras biológicas. En particular, la muestra biológica puede ser cualquier célula, órgano, tejido, muestra, biopsia, etc., que contenga ácidos nucleicos. Con respecto a un órgano, tejido o biopsia, se ponen eventualmente en cultivo, a fin de permitir el acceso a las células que los componen. Se puede tratar de muestras que provienen de mamíferos (en particular, del ser humano), de vegetales, de bacterias o de células eucariotas inferiores (levaduras, células fúngicas, etc.). Ejemplos de materiales son, en particular, una biopsia de tumor, una biopsia de placas neurodegenerativas o de áreas cerebrales que presentan ataques neurodegenerativos, una muestra de piel, una muestra de células sanguíneas obtenidas después de una toma de sangre, una biopsia colorrectal, biopsias que provienen de lavados pulmonares, etc. Ejemplos de células son especialmente las células musculares, hepáticas, fibroblastos, nerviosas, epidérmicas, dérmicas, las células sanguíneas como los linfocitos B, T, los mastocitos, los monocitos, los granulocitos, los macrófagos.

Como se indica aquí anteriormente, la detección sistemática diferencial cualitativa según la presente invención permite identificar ácidos nucleicos característicos de una situación fisiológica dada (situación B), con relación a una situación fisiológica de referencia (situación A), con vistas a su clonación u otros usos. A título ilustrativo, las situaciones fisiológicas A y B estudiadas pueden ser las siguientes:

Situación A	Situación B
muestra sana	muestra patológica
muestra sana	muestra apoptótica
muestra sana	muestra después de una infección vírica
muestra sensible a x	muestra resistente a x
muestra no tratada	muestra tratada (por ejemplo mediante compuesto tóxico)
muestra no diferenciada	muestra que ha sufrido una diferenciación celular o del tejido

Poblaciones de ARN

Para la realización de la presente invención, es posible utilizar ARN totales o los ARN mensajeros. Estos ARN se pueden preparar mediante cualquier método clásico de biología molecular, bien conocido por el experto en la técnica. Estos métodos comprenden generalmente una lisis de las células o tejido o muestras, y el aislamiento de los ARN mediante técnicas de extracción. Puede tratarse, en particular, de un tratamiento por medio de agentes caotrópicos, tales como el tiocianato de guanidinio (que destruye a las células y protege los ARN), seguido de una extracción de los ARN por medio de disolventes (por ejemplo, fenol, cloroformo). Tales métodos son bien conocidos por el experto en la técnica (véase Maniatis et al., Chomczynski et al., Anal. Biochem: 162 (1987) 156). Estos métodos se pueden practicar fácilmente utilizando kits disponibles en el comercio, tales como, por ejemplo, el kit US73750 (Amersham) o el kit Rneasy (Quiagen) para los ARN totales. No es necesario que los ARN utilizados sean perfectamente puros, y especialmente no importa que existan trazas de ADN genómico u otros componentes celulares (proteína, etc.) en las preparaciones, en tanto que no afecten significativamente a la estabilidad de los ARN, y que los modos de preparación entre las distintas muestras a comparar sean los mismos. Además, de manera facultativa, es posible utilizar preparaciones de ARN mensajeros en lugar de preparaciones de ARN totales. Estos se pueden aislar directamente a partir de la muestra biológica, o bien a partir de los ARN totales, por medio de secuencias PolyT, según los métodos clásicos. Para ello, la obtención de ARN mensajeros se puede realizar por medio de kits comerciales tales como, por ejemplo, el kit US72700 (Amersham) o el kit que utiliza perlas oligo-(dT) (Dynal). Un modo ventajoso de preparación de ARN consiste en extraer los ARN citosólicos y después los ARN polyA+ citosólicos. Hay disponibles en el comercio kits que permiten la preparación selectiva de ARN citosólicos no contaminados con ARN pre-mensajeros portadores de exones y de intrones no cortados y empalmados. Es el caso especialmente de los kits Rneasy, comercializados por Qiagen (ejemplo de referencia: 74103). Igualmente, los ARN se pueden obtener directamente a partir de bancos o de otras muestras, preparados de antemano y/o accesibles en colecciones, conservados en condiciones
apropiadas.

Generalmente, las preparaciones de ARN utilizadas comprenden ventajosamente al menos 0,1 \mug de ARN, preferentemente al menos 0,5 \mug de ARN. Las cantidades pueden variar según las células y los métodos utilizados, sin modificar la realización de la presente invención. Para obtener cantidades de ARN suficientes (preferentemente al menos 0,1 \mug), se recomienda generalmente utilizar una muestra biológica que comprende al menos 10^{5} células. Para ello, una biopsia clásica comprende generalmente entre 10^{5} y 10^{8} células, y un cultivo celular sobre placa de Petri clásica (diámetro 6-10 cm) comporta del orden de 10^{6} células, lo que permite obtener fácilmente cantidades de ARN suficientes.

Las preparaciones de ARN se pueden utilizar extemporáneamente o se pueden conservar, preferentemente en frío, en disolución o congeladas, para usos posteriores.

Poblaciones de ADNc

Los ADNc utilizados en el ámbito de la presente invención se pueden obtener mediante retrotranscripción según las técnicas clásicas de biología molecular. Se puede hacer referencia especialmente a Maniatis et al. Generalmente, la retrotranscripción se realiza utilizando una enzima, la retrotranscriptasa ("reverse transcriptase", en inglés), y un cebador.

Para ello, se han descrito numerosas retrotranscriptasas en la bibliografía, y están disponibles en el comercio (kit 1483188, Boehringer). A título de ejemplo, se pueden citar las retrotranscriptasas más frecuentemente utilizadas como las del virus aviar AMV (Virus de la mieloblastosis aviar (Avian Myeloblastosis Virus, en inglés)), y del virus de la leucemia murina MMLV (virus de la leucemia murina de Moloney (Moloney Murine Leukemia Virus, en inglés). Conviene igualmente citar algunas ADN polimerasas termoestables, dotadas de actividad retrotranscriptasa, tales como las aisladas de Thermus flavus y de Thermus thermophilus HB-8 (disponibles comercialmente; referencias Promega M1941 y M2101). Según una variante ventajosa, para la realización de la presente invención se utiliza la retrotranscriptasa de AMV puesto que esta enzima, que funciona a 42ºC (al contrario que la de MMLV, que funciona a 37ºC), desestabiliza algunas estructuras secundarias de los ARN que podrían bloquear el alargamiento, y permite así la retrotranscripción de ARN de gran longitud, y permite obtener preparaciones de ADNc que representan los ARN con una gran fidelidad y una gran eficacia.

Según otra variante ventajosa de la invención, se utiliza una retrotranscriptasa desprovista de actividad RNasaH. La utilización de este tipo de enzima ofrece varias ventajas, y especialmente la de aumentar el rendimiento de síntesis de los ADNc y de prevenir cualquier degradación de los ARN, que a continuación se introducen en heterodúplex con los ADNc neosintetizados, permitiendo así eventualmente omitir la extracción fenólica de estos. Las retrotranscriptasas desprovistas de actividad RNasaH se pueden preparar a partir de cualquier retrotranscriptasa mediante supresión(es) y/o mutagénesis. Además, tales enzimas están igualmente disponibles en el comercio (por ejemplo Life Technologies, referencia 18053-017).

Las condiciones de utilización de las retrotranscriptasas (concentración y temperatura) son bien conocidas por el experto en la técnica. En particular, se utilizan generalmente de 10 a 30 unidades de enzima por reacción, en presencia de una concentración óptima de Mg^{2+} de 10 mM.

El o los cebadores utilizados para la retrotranscripción pueden ser de distinta naturaleza. Puede ser, en particular, un oligonucleótido aleatorio ("random", en inglés), que comprende preferentemente entre 4 y 10 nucleótidos, ventajosamente un hexanucleótido. El uso de este tipo de cebador aleatorio se ha descrito en la bibliografía, y permite iniciar la retrotranscripción en distintas posiciones al azar en el seno de las moléculas de ARN. Esta técnica se utiliza esencialmente para la retrotranscripción de ARN totales (es decir, que comprenden especialmente los ARNm, los ARNt y los ARNr). En el caso en el que se desee solamente realizar la retrotranscripción de los ARNm, es ventajoso utilizar, como cebador, un oligonucleótido oligo dT, que permite iniciar la retrotranscripción a partir de las colas polyA específicas de los ARN mensajeros. El oligonucleótido oligo dT puede comprender de 4 a 20-mer, ventajosamente 15-mer aproximadamente. El uso de este tipo de cebador constituye un modo de realización preferido de la invención. Por otra parte, puede ser ventajoso utilizar, para la retrotranscripción, un cebador marcado. En efecto, esto puede permitir reconocer y/o seleccionar y/o clasificar posteriormente los ARN de los ADNc. Esto puede igualmente permitir aislar los heterodúplex ARN/ADN, cuya formación representa una etapa clave de la invención. La marcación del cebador puede consistir en cualquier sistema de tipo ligando-receptor, es decir, que permite, por afinidad, separar las moléculas que portan el cebador. Puede ser, por ejemplo, una marcación mediante la biotina, que se puede separar mediante cualquier soporte (perla, columna, placas, etc.) sobre el que se fija la estreptavidina. De manera equivalente, se puede utilizar cualquier otro sistema de marcación que permita esta separación si afectar a las propiedades del cebador.

En las condiciones habituales de realización, esta retrotranscripción genera ADN complementarios (ADNc) de hebra simple. Esto constituye un primer modo ventajoso de la presente invención.

En una segunda variante de realización, la retrotranscripción se realiza a fin de preparar ADNc de doble hebra. Para ello, después de la transcripción de la primera hebra de ADNc, se puede generar la segunda hebra según las técnicas clásicas de biología molecular, haciendo intervenir enzimas de modificación del ADN como la ADN ligasa del fago T4, la ADN polimerasa I, y la ADN polimerasa del fago T4.

Las preparaciones de ADNc se pueden utilizar extemporáneamente, o pueden ser conservadas, preferentemente en frío, en disolución o congeladas, para usos posteriores.

Hibridaciones

Como se explica aquí anteriormente, los métodos según la invención se refieren en parte a una etapa original de hibridación cruzada entre los ARN y los ADNc que provienen de muestras biológicas en situaciones fisiológicas o de orígenes distintos. En un modo de realización preferido, la hibridación según la invención se realiza ventajosamente en fase líquida. Además, se puede efectuar en cualquier dispositivo apropiado, tal como por ejemplo tubos (Eppendorff, por ejemplo), en placas, o en cualquier otro soporte adaptado y corrientemente utilizado en biología molecular. La hibridación se realiza ventajosamente en volúmenes comprendidos entre 10 y 1000 \mul, por ejemplo entre 10 y 500 \mul. Está claro que el dispositivo utilizado y los volúmenes utilizados se pueden adaptar fácilmente por el experto en la técnica. Las cantidades de ácidos nucleicos utilizadas para la hibridación se conocen igualmente por el experto en la técnica. Generalmente, basta con utilizar microgramos de ácidos nucleicos, por ejemplo del orden de 0,1 a 100 \mug.

Un elemento más importante en la realización de las hibridaciones reside en las cantidades respectivas de ácidos nucleicos utilizadas. Así, es posible utilizar los ácidos nucleicos en una relación ADNc/ARN que varía de 50 a 0,02 aproximadamente, preferentemente de 40 a 0,1. De manera más particularmente ventajosa, se prefiere que la relación ADNc/ARN esté próxima o sea mayor que 1. En efecto, en estos experimentos, el ARN constituye el compuesto de ensayo ("tester", en inglés), y el ADNc constituye el portador ("driver", en inglés). De hecho, con el objetivo de mejorar la especificidad del método, es preferible operar en condiciones en las que el "portador" se encuentra en exceso con relación al "compuesto de ensayo". En efecto, en estas condiciones, el efecto de co-operatividad entre los ácidos nucleicos es importante, y los emparejamientos no perfectos están fuertemente desfavorecidos. De hecho, los únicos desemparejamientos que aparecen son generalmente debidos a la presencia de regiones en los ARN "de ensayo" que no existen en el ADNc "portador", y que, por lo tanto, son específicas. Para favorecer la especificidad del procedimiento, la hibridación se realiza por lo tanto ventajosamente con una relación ADNc/ARN comprendida entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10. Se entiende, por supuesto, que esta relación se puede adaptar por el experto en la técnica según las condiciones del procedimiento (cantidades de ácidos nucleicos disponibles, situaciones fisiológicas, objetivos perseguidos, etc.). Los demás parámetros de la hibridación (tiempo, temperatura, fuerza iónica) son igualmente adaptables por el experto en la técnica. De manera general, después de la desnaturalización de los "compuestos de ensayos" y de los "portadores" (por ejemplo, mediante calentamiento), la hibridación se realiza durante aproximadamente 2 a 24 horas, a una temperatura de aproximadamente 37ºC (eventualmente sometida a saltos de temperaturas como se describe más adelante), y en condiciones estándares de fuerza iónica (que puede variar de 0,1 a 5 M NaCl, por ejemplo). Es sabido que la fuerza iónica es uno de los factores que determina la restricción de una hibridación, especialmente en el caso de hibridación sobre soporte sólido.

Según un modo de realización particular de la invención, la hibridación se realiza en emulsión fenólica, por ejemplo según la técnica PERT (Técnica de reasociación de ADN en emulsión fenólica; "Phenol Emulsion DNA Reassociation Technique", en inglés)) descrita por Kohne D.E. et al. (Biochemistry, Vol. 16, Nº 24, p. 5329-5341, 1977). Ventajosamente, en el ámbito de la presente invención, la hibridación se utiliza en emulsión fenólica mantenida por termociclos (saltos de temperatura de aproximadamente 37ºC hasta aproximadamente 60/65ºC), y no mediante agitación, según la técnica descrita por Miller y Riblet (NAR23 (1995) 2339). En el ámbito de la presente invención, se puede utilizar cualquier otra técnica de hibridación en fase líquida, especialmente en emulsión. Así, en otro modo particularmente ventajoso, la hibridación se realiza en una disolución que contiene 80% de formamida, a una temperatura de 40ºC, por ejemplo.

La hibridación se puede realizar igualmente con una de las parejas inmovilizada sobre un soporte. Ventajosamente, el que se inmoviliza es el ADNc. Esto se puede realizar aprovechando el marcaje del que pueden haber sido objeto los ADNc (véase aquí arriba), especialmente gracias a cebadores biotinilados. Los agrupamientos de biotina se ponen en presencia de perlas magnéticas sobre las cuales se fijan moléculas de estreptavidina. Después, los ADNc se pueden mantener gracias a un imán en contacto con un filtro o con un pocillo de placas de microtitulación. Después, los ARN, en condiciones de fuerza iónica requeridas, se ponen en presencia de los ADNc. Los ARN no emparejados se eliminan mediante lavado. Los ARN hibridados, así como los ADNc, se recuperan deteniendo el campo magnético.

En el caso en el que el ADNc sea de doble hebra, las condiciones de hibridación utilizadas son esencialmente similares a las descritas aquí arriba, y adaptables por el experto en la técnica. En este caso, se prefiere proviener a la hibridación en presencia de formamida, y los complejos se exponen a un intervalo de temperatura de, por ejemplo, 60 hasta 40ºC, preferentemente de 56ºC hasta 44ºC, con el fin de favorecer la formación de complejos de tipo bucle R. Además, es deseable añadir, después de la hibridación, un agente estabilizador de los tríplex formados, una vez se retire la formamida del medio, tal como por ejemplo el glioxal (Kaback et al. (1979) Nuc. Acid Res., 6, 2499-2517).

Estas hibridaciones cruzadas según la invención generan así composiciones que comprenden heterodúplex o heterotríplex ADNc/ARN, que representan las cualidades de cada una de las situaciones fisiológica ensayadas. Como se indica aquí anteriormente, en cada una de estas composiciones, se pueden identificar y/o clonar ácidos nucleicos que corresponden esencialmente a cortes y empalmes alternativos diferenciales, o a otras alteraciones genéticas, específicas de cada situación fisiológica.

Por lo tanto, la invención se refiere ventajosamente a un procedimiento para identificar y/o clonar de regiones de ácidos representativas de diferencias genéticas entre dos situaciones fisiológicas, que comprende una etapa de hibridación entre los ARN, que provienen de una muestra biológica en una primera situación fisiológica, y los ADNc de hebra simple, que provienen de una muestra biológica en una segunda situación fisiológica, e identificar y/o clonar, a partir de los híbridos así formados, las regiones de ARN no emparejadas.

Esta primera variante se basa más particularmente en la formación de heterodúplex entre los ARN y los ADNc de hebra simple (véanse las Figuras 2-4). Esta variante se realiza ventajosamente utilizando ARN mensajeros o ADNc producidos mediante retrotranscripción de los ARN mensajeros esencialmente, es decir, en presencia de un cebador oligo dT.

En un modo de realización particular, el procedimiento para identificar y/o clonar ácidos nucleicos de la invención comprende:

(a) hibridar ARN, que provienen de la situación de ensayo, con los ADNc de hebra simple, que provienen de la situación de referencia;

(b) hibridar ARN, que provienen de la situación de referencia, con los ADNc de hebra simple, que provienen de la situación de ensayo; e

(c) identificar y/o clonar, a partir de los híbridos formados en (a) y (b), regiones de ARN no emparejadas.

En una variante particular de realización, el procedimiento de la invención comprende las etapas siguientes:

(a) obtener ARN a partir de una muestra biológica en una situación fisiológica A (rA);

(b) obtener ARN a partir de una misma muestra biológica en una situación fisiológica B (rB);

(c) preparar ADNc a partir de una parte de los ARN rA, obtenidos en (a) (ADN cA), y a partir de una parte de los ARN rB, obtenidos en (b) (ADN cB), por medio de cebadores PolyT,

(d) hibridar, en fase líquida, una parte de los ARN rA con una parte de los ADN cB (para generar heterodúplex rA/cB),

(e) hibridar, en fase líquida, una parte de los ARN rB con una parte de los ADN cA (para generar heterodúplex rB/cA),

(f) identificar y/o clonar regiones de ARN no emparejadas en los heterodúplex rA/cB y rB/cA obtenidos en (d) y en (e).

En otra variante particular de realización, el procedimiento de la invención comprende hibridar los ARN, que provienen de la situación de ensayo, con los ADNc de doble hebra, que provienen de la situación de referencia, e identificar y/o clonar las regiones de ADN de doble hebra conservadas. Esta segunda variante se basa más particularmente en la formación de heterotríplex entre los ARN y los ADNc de doble hebra, que deriva de las estructuras de tipo bucle R (véase Figura 5). Igualmente, esta variante se realiza preferentemente utilizando ARN mensajeros o ADNc producidos esencialmente mediante retrotranscripción de los ARN mensajeros, es decir, en presencia de un cebador PolyT. Igualmente, en esta variante, un modo de realización particular comprende dos hibridaciones paralelas, que generan dos poblaciones de ácidos nucleicos según la invención. En esta variante, las regiones buscadas, específicas de los cortes y empalmes alternativos, no son las regiones de ARN no emparejadas, sino las regiones de ADN de doble hebra que no se han podido desplazar mediante una secuencia ARN homóloga (véase Figura 5).

En otra variante de la invención, el procedimiento comprende, para aislar las diferencias genéticas cualitativas (por ejemplo, las diferencias de corte y empalme) que existen entre dos muestras, hibridar una población de ADNc de doble hebra, que proviene de una primera muestra biológica, y una población de ADNc (de doble hebra o, preferentemente, de hebra simple) que proviene de una segunda muestra biológica (figura 6).

A diferencia de las variantes presentadas anteriormente, ésta no utiliza heterodúplex o heterotríplex ADN/ARN, sino homodúplex ADN/ADN. Esta variante es ventajosa puesto que no solamente da acceso a los exones y a los intrones alternativos, sino igualmente, y en el interior de un mismo banco de ácidos nucleicos, a las uniones específicas creadas mediante supresión de un exón o de un intrón. Además, las secuencias en tal banco dan acceso a las secuencias flanqueantes de los exones e intrones alternativos.

Para las dos muestras (es decir, condiciones fisiopatológicas) estudiadas, los ARN citosólicos polyA+ se extraen según las técnicas conocidas por el experto en la técnica, y descritas anteriormente. Estos se convierten en ADNc mediante la acción de una retrotranscriptasa, desprovista o no de actividad RNasa H intrínseca, como se describe anteriormente. Después, uno de estos ADNc de hebra simple se convierte en ADNc de doble hebra mediante cebado, con la ayuda de hexámeros aleatorios, y según las técnicas conocidas por el experto en la técnica. Para una de las situaciones estudiadas, se dispone por lo tanto de un ADNc de hebra simple (denominado "portador") y, para la otra situación, de un ADNc de doble hebra (denominado "compuesto de ensayo"). Estos ADNc se desnaturalizan mediante calentamiento, y después se mezclan de tal forma que el portador esté en exceso con relación al compuesto de ensayo. Este exceso se elige entre 1 y 50 veces, ventajosamente 10 veces. En un experimento dado, realizado a partir de dos situaciones fisiopatológicas, la elección de la situación de la que resulta el portador es arbitraria y no debe influir en la naturaleza de las informaciones recolectadas. En efecto, como en el caso de los enfoques anteriormente presentados, la estrategia de identificación de las diferencias cualitativas que existen entre dos poblaciones de ARNm se basa en la clonación de estas diferencias presentes en mensajeros comunes: la estrategia se basa en la clonación de secuencias presentes en el seno de los dúplex y no de hebras simples, que corresponden a secuencias singulares o en exceso en una de las situaciones estudiadas. La mezcla de las poblaciones de ADNc se hace precipitar, y después se recoge en una disolución que contiene formamida (por ejemplo, 80%). La hibridación dura de 16 horas hasta 48 horas, ventajosamente 24 horas. Los productos de esta hibridación se hacen precipitar, y después se someten a la acción de una endonucleasa de restricción que tiene un sitio de reconocimiento del ADN de doble hebra dictado por 4 bases. Por lo tanto, tal enzima de restricción va a romper el ADNc de doble hebra formado durante la hibridación de cada 256 bases, por término medio. Esta enzima se selecciona ventajosamente para generar sitios cohesivos. Los ejemplos de tales enzimas se suministran mediante enzimas de restricción tales como Sau3Al, Hpall, Taql y Msel. Los fragmentos de doble hebra digeridos por estas enzimas son, por lo tanto, accesibles para una estrategia de clonación que utiliza los sitios de restricción rotos. Estos fragmentos son de dos tipos: fragmentos perfectamente hibridados, de los cuales las dos hebras son perfectamente complementarias; y fragmentos cuya hibridación es parcial, es decir, que comprenden un bucle de hebra simple rodeado por regiones de doble hebra (Figura 6A). Estos últimos fragmentos, minoritarios, contienen las informaciones de interés. Con el fin de separarlos de los fragmentos perfectamente hibridados, mayoritarios (puesto que derivan de la mayoría de la longitud de los ADNc), se utilizan técnicas de separación sobre gel o sobre cualquier otra matriz apropiada. Estas técnicas aprovechan el retraso de la migración electroforética, o especialmente durante la filtración en gel, de fragmentos de ADN que contienen un bucle de ADN de hebra simple. Así, las poblaciones de fragmentos minoritarios, que contienen las informaciones deseadas, se pueden separar de manera preparativa de las poblaciones de fragmentos mayoritarios, que corresponden a las regiones de ADN idénticas en las dos poblaciones. Esta variante, que permite aislar en el seno de una misma población las huellas positivas y negativas relacionadas con diferencias cualitativas, se puede igualmente aplicar a heterodúplex ARN/ADN. Para ello, en el modelo grb2/grb33 descrito en los ejemplos (véase especialmente la figura 8, pocillos 2 y 3), se ilustra un ejemplo de retraso de migración de un heterodúplex ARN/ADN, en el que una parte del ARN no está emparejada, con relación a un heterodúplex homólogo, en el que todas las secuencias están emparejadas.

Identificación y/o clonación

A partir de las poblaciones de ácidos nucleicos generadas mediante hibridación, se pueden identificar las regiones características de las diferencias cualitativas (por ejemplo, de los cortes y empalmes alternativos diferenciales), mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica.

\bullet Identificación y/o clonación a partir de los heterodúplex ARN/ADN.

Así, en el caso de los heterodúplex ARN/ADN (primera variante del procedimiento), estas regiones se presentan esencialmente en forma de regiones de ARN no emparejadas (bucles de ARN), como se representa en la Figura 3. Por lo tanto, estas regiones se pueden identificar y clonar mediante separación de los heterodúplex, y de los ácidos nucleicos de hebra simple (ADN, ARN) (exceso de ácido nucleico que no ha reaccionado), mediante digestión selectiva de los ARN de doble hebra (dominios introducidos en los heterodúplex), y después mediante separación de los ARN de hebra simple resultantes y de los ADN de hebra simple.

Para ello, según un primer enfoque ilustrado en la Figura 3, las regiones de ARN no emparejadas se identifican mediante tratamiento de los heterodúplex mediante una enzima capaz de digerir selectivamente los dominios de los ARN introducidos en los heterodúplex ARN/ADN. En la técnica anterior se describen enzimas dotadas de esta propiedad, y están disponibles en el comercio. Son las RNasas H, tales como, en particular, la de E. Coli, producida en forma recombinante y disponible en el comercio (Promega, Ref. M4281; Life Technologies, Ref. 18021). Este primer tratamiento genera, por lo tanto, una mezcla que comprende las regiones de ARN no emparejadas de hebra simple y los ADNc de hebra simple. Los ARN se pueden separar de los ADNc mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, y especialmente basándose en el marcaje de los cebadores utilizados para la preparación de los ADNc (véase aquí arriba). Estos ARN se pueden utilizar como fuente de material para la identificación de dianas, de productos genéticos de interés, o para cualquier otra aplicación. Igualmente, estos ARN se pueden convertir en ADNc, y después se pueden clonar en vectores, como se describe a continuación.

Para ello, la clonación de los ARN se puede realizar de distintas maneras. Una consiste en insertar, en cada extremo de los ARN, oligonucleótidos que sirven de matriz para una reacción de retrotranscripción en presencia de los cebadores correspondientes. Esta adición de cebadores se hace según las técnicas bien conocidas por el experto en la técnica gracias a una enzima, tal como, por ejemplo, la ARN ligasa que proviene del fago T4 y que cataliza la formación de uniones fosfodiéster intermoleculares entre el fosfato en 5' de una molécula donante y el hidroxilo en 3' de una molécula receptora. Tal ARN ligasa está disponible comercialmente (por ejemplo, Life Technologies - GIBCO BRL Ref. 18003). Después, los ADNc así obtenidos se pueden amplificar mediante las técnicas clásicas (PCR, por ejemplo) utilizando los cebadores apropiados, como se ilustra en la Figura 3. Esta técnica se adapta particularmente a la clonación de los ARN de pequeño tamaño (menores que 1000 b).

Otro enfoque para la clonación y/o la identificación de las regiones de ARN específicas consiste, por ejemplo, en realizar una retrotranscripción sobre el producto de digestión mediante una enzima específica de los ARN introducidos en las hebras dobles, tal como la Rnasa H, utilizando cebadores aleatorios, que iniciarán la transcripción al azar en el interior de los ARN. Después, los ADNc obtenidos se amplifican según las técnicas clásicas de biología molecular, por ejemplo mediante PCR utilizando cebadores, gracias a oligonucleótidos añadidos en los extremos de los ADNc gracias a la acción de la ARN ligasa del fago T4 (disponible comercialmente; por ejemplo en Life Technologies - GIBCO BRL ref. 18003). Esta segunda técnica se ilustra en la Figura 4 y en los ejemplos. Esta técnica se adapta más particularmente a los ARN de tamaño importante, y permite obtener una parte de la información de secuencia, suficiente para reconstituir después la totalidad de la secuencia de partida.

Otro enfoque para la clonación y/o la identificación de las regiones de ARN específicas se basa igualmente en la realización de una retrotranscripción utilizando cebadores aleatorios (figura 4). Sin embargo, según esta variante, los cebadores utilizados son, al menos en parte, cebadores semialeatorios, es decir oligonucleótidos que comprenden:

- una región aleatoria (de degeneración),

- una zona mínima de cebado que presenta un grado de restricción definido, y

- una zona estabilizadora.

Preferentemente, se trata de oligonucleótidos que comprenden, en el sentido 5'\rightarrow 3':

- una zona estabilizadora que comprende 8 a 24 nucleótidos determinados, preferentemente de 10 a 18 nucleótidos. Esta zona estabilizadora puede corresponder ella misma a la secuencia de un oligonucleótido utilizado para reamplificar los fragmentos que provienen de las primeras amplificaciones realizadas con la ayudad de los cebadores semialeatorios de la invención. Además, la zona estabilizadora puede comprender la secuencia de uno o varios sitios, preferentemente no palindrómicos, que corresponden a enzimas de restricción. Esto permite por ejemplo facilitar la clonación de los fragmentos así amplificados. Un ejemplo particular de zona estabilizadora se representa por la secuencia GAG AAG CGT TAT (restos 1 a 12 de SEQ ID NO: 1);

- una región aleatoria, que tiene de 3 a 8 nucleótidos, más particularmente de 5 a 7 nucleótidos, y

- una zona mínima de cebado definida de manera que el oligonucleótido se híbrida, por término medio, cada 60 pb aproximadamente, preferentemente cada 250 pb aproximadamente. Más preferentemente, la zona de cebado comprende de 2 a 4 nucleótidos definidos, preferentemente 3 ó 4, tales como, por ejemplo, AGGX, en el que X representa una de las cuatro bases A, C, G o T. La presencia de tal zona de cebado confiere al oligonucleótido la capacidad de hibridar, por término medio, cada 256 pares de bases aproximadamente.

De manera particularmente preferida, se trata de oligonucleótidos de fórmula:

GAGAAGCGTTATNNNNNNNAGGX (SEQ ID NO: 1) en la que las bases fijadas se han ordenado a fin de minimizar el ruido de fondo debido a auto-emparejamientos en experimentos de PCR, en la que N indica que las cuatro bases pueden estar presentes de manera aleatoria en la posición indicada, y en la que X representa una de las bases A, C, G o T. Tales oligonucleótidos constituyen igualmente un objeto de la presente invención.

Para ello, a fin de aumentar las posibilidades de cebado sobre los ARN a clonar, se pueden efectuar reacciones en paralelo con oligonucleótidos tales como:

GAGAAGCGTTATNNNNNNNAGGT (oligonucleótido A)

GAGAAGCGTTATNNNNNNNAGGA (oligonucleótido B)

GAGAAGCGTTATNNNNNNNAGGC (oligonucleótido C)

GAGAAGCGTTATNNNNNNNAGGG (oligonucleótido D),

pudiendo ser utilizada cada población de oligonucleótidos (A, B, C, D) individualmente o en combinación con otra.

Después de la etapa de retrotranscripción, los ADNc se amplifican mediante PCR utilizando los oligonucleótidos A o B o C o D.

Como se indica aquí anteriormente, según la complejidad y la especificidad de la población de los oligonucleótidos deseada, el número de posiciones degeneradas puede variar de 3 a 8, preferentemente de 5 a 7. Por debajo de 3, las hibridaciones están restringidas, y, por encima de 8, la población de oligonucleótidos es demasiado compleja para asegurar una buena amplificación de bandas específicas.

Por otra parte, se puede modificar igualmente la longitud del extremo 3' fija (la zona de cebado restringida) de estos oligonucleótidos: si los cebadores descritos más arriba, con 4 bases fijas, permiten amplificar por término medio fragmentos de 256 pares de bases, los cebadores con 3 bases fijas permiten amplificar fragmento más cortos (64 pares de bases, por término medio). En un primer modo preferido de la invención, se utilizan oligonucleótidos en los que la zona de cebado comprende 4 bases fijas. En otro modo preferido de la invención, se utilizan oligonucleótidos que tienen una zona de cebado de tres bases fijas. En efecto, teniendo los exones un tamaño medio de 137 bases, estos se amplifican ventajosamente con tales oligonucleótidos. Para ello, véanse igualmente los oligonucleótidos de secuencias SEQ ID NO: 2, 3 y 4, por ejemplo.

Finalmente, en general, la etapa de identificación y/o de clonación de los ARN utiliza los distintos métodos de PCR y de clonación, a fin de obtener la información más completa.

\bullet Identificación y/o clonación a partir de los heterotríplex.

En el caso de los heterotríplex (otra variante del procedimiento), las regiones de diferencias cualitativas (inserciones, supresiones, cortes y empalmes diferenciales) se presentan esencialmente en forma de regiones de ADN de doble hebra, como se representa en la Figura 5. Por lo tanto, estas regiones se pueden identificar y clonar mediante tratamiento en presencia de enzimas apropiadas, tales como una enzima que permite digerir los ARN, y después una enzima que permita digerir los ADN de hebra simple. Los ácidos nucleicos así obtenidos están por lo tanto directamente en forma de ADN de doble hebra, y se pueden clonar en cualquier vector apropiado, tal como por ejemplo el vector pMos-Blue (Amersham, RPN 5110). Esta metodología se diferencia de los enfoques ya descritos, que utilizan ARN u oligonucleótidos de secuencias predeterminadas, modificados para ejercer una actividad nucleásica (Landgraf et al. (1994) Biochemistry, 33, 10607-10615).

\bullet Identificación y/o clonación a partir de los homodúplex ADN/ADN (figura 6)

Después, a los fragmentos aislados por sus estructuras atípicas se le añaden, en cada uno de sus extremos, adaptadores o ligadores (linkers, en inglés) que tienen sitios de restricción rotos en uno de sus extremos. Esta etapa se puede realizar según las técnicas conocidas por el experto en la técnica, por ejemplo mediante unión con la ADN ligasa del fago T4. Los sitios de restricción así introducidos se eligen para que sean compatibles con los sitios de los fragmentos de ADNc. Los ligadores introducidos son secuencias de ADNc de doble hebra, de secuencias conocidas, que permiten derivar cebadores para realizar amplificaciones enzimáticas (PCR). Puesto que la etapa siguiente consiste en amplificar las dos hebras que presentan entre sí las diferencias cualitativas a identificar, es necesario utilizar ligadores cuyos extremos 5' están fosforilados. Así, después de la desnaturalización térmica de los ADNc de doble hebra, a los que se les han añadido ligadores, cada uno de los extremos de estos ADNc se enlaza de manera covalente con una secuencia de cebado específica. Tras la PCR con la ayuda de los cebadores específicos apropiados, se obtienen dos categorías de ADNc de doble hebra: fragmentos que contienen secuencias específicas de diferencias cualitativas que distinguen las dos situaciones fisiopatológicas, y fragmentos que comprenden la huella negativa de estos sucesos de cortes y empalmes. La clonación de estos fragmentos permite obtener un banco de cortes y empalmes alternativos en el que, para cada suceso de corte y empalme, están presentes huellas positivas y negativas. Por lo tanto, en este banco son accesibles no sólo los exones y los intrones alternativos, sino también las uniones específicas creadas por escisión de estas secuencias cortadas y empalmadas. En un mismo banco, estas distintas informaciones genéticas pueden proviener de dos situaciones fisiopatológicas sin discriminación. Por otra parte, a fin de verificar el carácter diferencial de los cortes y empalmes identificados, y a fin de determinar en cuál situación se encuentran específicamente, los clones del banco se pueden hibridar con sondas que derivan de cada una de las poblaciones totales de los ARNm.

Se pueden prever dos usos principales para los fragmentos de ADN que provienen de las diferencias cualitativas identificadas:

- Su clonación en vectores apropiados a fin de constituir bancos representativos de las diferencias cualitativas que existen entre las dos situaciones fisiopatológicas estudiadas,

- Su uso como sondas, a fin de identificar sistemáticamente un banco de ADN que permita identificar los sucesos cortados y empalmados de manera diferencial.

Los vectores utilizados en la invención pueden ser especialmente plásmidos, cósmidos, fagos, YAC, HAC, etc. Así, estos ácidos nucleicos se pueden conservar tal cual, o se pueden introducir en microorganismos adaptados al vector de clonación utilizado, a fin de ser multiplicados y/o conservados en forma de cultivos.

Los métodos tales como los descritos aquí arriba se realizan generalmente, para cada muestra, en un periodo de tiempo de menos de dos meses, particularmente menos de 6 semanas. Por otra parte, estos métodos distintos se pueden automatizar a fin de reducir el tiempo total y de facilitar numerosas muestras.

Por ello, otro objeto de la invención se refiere a los ácidos nucleicos identificados y/o clonados mediante los métodos de la invención. Como se indica aquí arriba, estos ácidos nucleicos pueden ser ARN o ADNc. Más particularmente, la invención se refiere a una composición de ácidos nucleicos que comprende esencialmente ácidos nucleicos que corresponden a los cortes y empalmes alternativos que distinga dos situaciones fisiológicas. Más particularmente, estos ácidos nucleicos corresponden a los cortes y empalmes alternativos identificados en una muestra biológica de ensayo y no presentes en la misma muestra biológica en una situación de referencia. La invención tiene igualmente por objeto la utilización de los ácidos nucleicos así clonados como producto terapéutico o de diagnóstico, o como herramienta de identificación sistemática de moléculas activas, como se indica a continuación.

Por lo tanto, los diferentes métodos expuestos aquí arriba acaban todos en la clonación de secuencias de ADNc que representa la información genética cortada y empalmada diferencialmente entre dos situaciones fisiopatológicas. El conjunto de los clones que provienen de uno de estos métodos permite por lo tanto la constitución de un banco representativo de las diferencias cualitativas que existen entre dos situaciones estudiadas.

Generación de bancos cualitativos

Para ello, la invención se refiere además a un procedimiento de preparación de un banco de ácidos nucleicos representativos de un estado fisiológico dado de una muestra química. Este procedimiento comprende ventajosamente la clonación de ácidos nucleicos representativos de los marcadores cualitativos de expresión genéticas (por ejemplo cortes y empalmes alternativos) de dicho estado fisiológico y no presentes en un estado de referencia, en bancos específicos de diferencias cualitativas que existen entre los 2 estadios estudiados.

Estos bancos están constituidos de ADNc insertados en vectores plasmídicos o fágicos. Estos bancos se pueden presentar sobre filtros de nitrocelulosa o cualquier otro soporte conocido por el experto en la técnica, tales como chips o biopastillas.

Una de las características y al mismo tiempo una de las originalidades de la detección sistemática diferencial cualitativa es que esta técnica lleva no a uno sino ventajosamente a dos bancos diferenciales que representan el conjunto de las diferencias cualitativas que existen entre dos situaciones dadas: Pares de bancos (véase la figura 1D).

Así, la invención se refiere preferentemente a cualquier composición o banco de ácidos nucleicos, susceptible de ser obtenido mediante hibridación entre dos poblaciones de ARN que provienen de una primera muestra biológica y una población de ADNc que proviene de una segunda muestra biológica. Más preferentemente, los bancos o composiciones de la invención comprenden ácidos nucleicos representativos de las diferencias cualitativas de expresión entre dos muestras biológicas, y se producen mediante un procedimiento (i) que comprende una etapa al menos de hibridación entre una población de ARN que proviene de una primera muestra biológica y una población de ADNc que proviene de una segunda muestra biológica, (ii) la selección de los ácidos nucleicos representativos de las diferencias cualitativas de expresión y, eventualmente (iii) la clonación de dichos ácidos nucleicos.

Además, tras la constitución de tales bancos, es posible efectuar una etapa de selección de los clones para mejorar la especificidad de los bancos obtenidos. En efecto, es posible que algunos desemparejamientos observados no sean únicamente debidos a diferencias cualitativas (por ejemplo, a cortes y empalmes alternativos diferenciales), sino puedan resultar de defecto(s) de la transición inversa, por ejemplo. Aunque estos acontecimientos no son generalmente significativos, es preferible eliminarles o reducirles con anterioridad a la clonación de los ácidos nucleicos. Para ello, los clones del banco se pueden hibridar con poblaciones de ADNc de las dos situaciones fisiológicas estudiadas (véase (c) aquí arriba). Los clones que hibridan de manera no diferencial con las dos poblaciones se pueden considerar como no específicos y eventualmente ser eliminados o tratados en segunda prioridad (en efecto, la aparición de una nueva isoforma en la muestra de ensayo no significa siempre que la isoforma inicial presente en la muestra de referencia haya desaparecido de esta muestra de ensayo). Los clones que hibridan solo con una de las dos poblaciones, o que hibridan de manera preferida con una de las poblaciones, se consideran como específicos y se pueden seleccionar en primera prioridad para constituir bancos enriquecidos o afinados.

Se puede igualmente realizar un afinado mediante hibridación y validación de clones con sondas que provienen de un número estadísticamente relevante de muestras patológicas.

La presente solicitud describe igualmente cualquier banco de ácidos nucleico que comprende ácidos nucleico constituidos de ADNc, generalmente de hebras dobles, que corresponden a las regiones de ARN específicas de un corte y empalme alternativo. Estos bancos pueden estar constituidos por los ácidos nucleicos, generalmente en un vector de clonación o de cultivo celular que contiene dichos ácidos nucleicos.

La elección de los ARN de partida determina en parte las características de los bancos obtenidos:

- los ARN de las dos situaciones A y B son ARNm o ARN totales maduros aislados según las técnicas conocidas por el experto en la técnica. Entonces, los bancos son bancos de detección sistemática diferencial cualitativa, denominados restringidos, porque están restringidos a las diferencias cualitativas que caracterizan los ARN maduros de dos situaciones fisiopatológicas.

- los ARN de una de las situaciones son ARNm o totales maduros, mientras que los ARN de la otra situación son ARN pre-mensajeros, no madurados mediante corte y empalme, aislados según las técnicas conocidas por el experto en la técnica, a partir de núcleos celulares. En este caso, los bancos obtenidos son bancos de detección sistemática diferencial, denominados complejos, puesto que no están restringidos a las diferencias entre ARN maduros, pero que comprenden todo el repertorio de los cortes y empalmes transcritos en una situación y eliminados en la otra, incluso todos los intrones.

Finalmente, los ARN pueden provenir de una sola situación fisiopatológica y, en este caso, la detección sistemática diferencial implica los ARN maduros y los pre-mensajeros de una misma muestra. En este caso, los bancos obtenidos son bancos de detección sistemática diferencial cualitativa autólogos. El interés de tales bancos es que junta exclusivamente el repertorio de los intrones transcritos en una situación dada. Su hibridación con una sonda que proviene de ARN maduros de otra situación determina rápidamente si esta situación se caracteriza por una retención de intrones permitiendo fácilmente su identificación.

Generalmente, los bancos se generan mediante exposición, en medio sólido (especialmente sobre medio gelificado), de un cultivo celular transformado mediante los ácidos nucleicos formados. La transformación se realiza mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica (transfección, fosfato de calcio, electroporación, infección mediante bacteriófagos, etc.). Generalmente, el cultivo celular es un cultivo de bacterias, tales como, por ejemplo, las bacterias de E. coli. Igualmente, puede ser cultivos de células eucariotas, especialmente de células eucariotas inferiores (por ejemplo, levadura). Esta exposición se puede realizar sobre caja o cualquier otro soporte adaptado, en condiciones estériles. Además, estos cultivos expuestos en medio gelificado se pueden almacenar en forma congelada, por ejemplo (en glicerol u otro agente adaptado). Naturalmente, estos bancos se pueden utilizar para la producción de "réplicas", es decir, de copias según las técnicas habituales detalladas a continuación. Además, estos bancos sirven generalmente para preparar un banco amplificado, es decir, un banco que comprende cada clon en forma amplificada. Un banco amplificado se prepara según lo siguiente: a partir del cultivo expuesto, se recuperan todos los clones celulares y se acondicionan para ser conservados en forma congelada o en frío, en cualquier medio adaptado. Este banco amplificado se realiza ventajosamente a partir de cultivos de bacterias de E. coli, y se conserva a 4ºC, en condiciones estériles. Este banco amplificado permite la preparación y la reproducción ilimitada de cualquier banco posterior que contenga estos clones, sobre soportes distintos, para aplicaciones distintas. Tal banco permite además el aislamiento y la caracterización de cualquier clon de interés. Efectivamente, cada uno de los clones que constituyen los bancos de la invención es un elemento característico de una situación fisiológica, y constituye por lo tanto una diana particularmente interesante para distintos estudios tales como la búsqueda de marcadores, la preparación de anticuerpos, el diagnóstico, el tratamiento para transferencia de genes, etc. Se describen estas diferentes aplicaciones más adelante. Generalmente, el banco se prepara como se describe aquí arriba, mediante exposición de los cultivos en un medio gelificado, sobre un soporte adaptado (caja de petri por ejemplo). El interés de utilizar un medio gelificado es que cada colonia se puede separar e individualizar. A partir de este cultivo, se pueden preparar réplicas idénticas en cantidades importantes mediante "réplica" sencilla sobre cualquier soporte apropiado según las técnicas al alcance del experto en la técnica. Así, la replicación se puede realizar por medio de filtros, membranas (nailon, nitrocelulosa, etc.), permitiendo el encuentro de los cultivos. Después, los filtros se pueden almacenar tal cual, por ejemplo a 4ºC, en forma seca, en cualquier tipo de acondicionamiento que no altere los ácidos nucleicos. Igualmente, los filtros se pueden tratar a fin de eliminar las células, proteínas, etc., y conservar solamente componentes tales como los ácidos nucleicos. Estos tratamientos pueden comprender especialmente proteasas, detergentes, etc. Los filtros tratados se pueden igualmente conservar en cualquier dispositivo o cualquier condición adaptada para los ácidos
nucleicos.

Igualmente, los bancos de ácidos nucleicos se pueden preparar directamente a partir de los ácidos nucleicos, por deposito sobre biochips o cualquier otro dispositivo apropiado.

La presente solicitud describe igualmente cualquier banco que comprende oligonucleótidos específicos de cortes y empalmes alternativos que distinga dos situaciones fisiológicas. Se trata ventajosamente de oligonucleótidos de hebra simple, que comprende de 5 a 100-mer, preferentemente menos de 50-mer, por ejemplo alrededor de 25-mer aproximadamente.

Estos oligonucleótidos son específicos de cortes y empalmes alternativos representativos de una situación o de un tipo de situación fisiológica. Así, tales oligonucleótidos pueden ser, por ejemplo, oligonucleótidos representativos de sucesos de cortes y empalmes alternativos característicos de situaciones de apoptosis. En efecto, se ha descrito en la bibliografía que algunos cortes y empalmes alternativos se observaban en el ámbito de situaciones apoptóticas. Se trata, por ejemplo, de cortes y empalmes alternativos en los genes Bclx, Bax, Fas o Grb2 especialmente. A partir de los datos publicados y de las secuencias accesibles en la bibliografía y/o en bases de datos, es posible crear oligonucleótidos específicos de las formas cortadas y empalmadas, y no cortadas y empalmadas. Estos oligonucleótidos se pueden, por ejemplo, crear según la estrategia siguiente:

(a)

identificación de una proteína o de un evento de corte y empalme característico de una situación de apoptosis y de la secuencia del campo cortado y empalmado. Esta identificación se puede basar en datos publicados o mediante compilación de secuencias accesibles en bases de datos;

(b)

síntesis artificial de uno o varios oligonucleótido de corte y empalme que corresponde a una o varias regiones de este campo, que permiten por lo tanto, mediante hibridación, destacar la forma no cortada y empalmada en los ARN de una muestra de ensayo;

(c)

síntesis artificial de uno o varios oligonucleótidos que corresponden a la región de unión entre los dos campos separados por el campo cortado y empalmado. Estos oligonucleótidos permiten por lo tanto, mediante hibridación, destacar la forma cortada y empalmada en los ARN de una muestra de ensayo;

(d)

reproducción de las etapas (a) a (c) aquí arriba con otras proteínas o sucesos de cortes y empalmes característicos de una situación de apoptosis;

(e)

transferencia sobre un primer soporte apropiado del o de los oligonucleótidos específicos de las formas apoptóticas de los mensajeros identificados aquí antes, sobre otro soporte apropiado, del o de los oligonucleótidos específicos de las formas no apoptóticas.

Los dos soportes así obtenidos se pueden utilizar para ensayar el estado fisiológico de células o muestras de ensayos, y especialmente su estado apoptótico, mediante hibridación de una preparación de ácidos nucleicos de estas células o muestras.

Se pueden generar otros bancos similares con oligonucleótidos específicos de distintos estados fisiopatológicos (neurodegeneración, toxicidad, proliferación, etc.), y así permitir una amplificación de los campos de aplicaciones.

Bancos de intrones o de exones alternativos pueden también ser bancos de datos informáticos constituidos mediante análisis sistemática de los bancos de datos que juntan las informaciones relativas al genoma de tal o cual organismo, tejido o cultivo celular. En este caso, los datos obtenidos mediante constitución de tales bancos virtuales se pueden utilizar para generar cebadores oligonucleotídicos que se utilizarán para ensayar en paralelo dos situaciones fisiopatológicas.

Los datos de los bancos informáticos pueden igualmente ser utilizados para derivar sondas nucleotídicas generales, representativas de una clase de proteínas o también específicas de una secuencia definida. Después, estas sondas se pueden aplicar sobre los bancos de clones que provienen de las diferentes técnicas de clonación de los intrones y exones alternativos con el fin de obtener una imagen de la complejidad de estos bancos moleculares y de determinar rápidamente si tal o cual clase de proteínas, o tal o cual secuencia determinada, está cortada y empalmada diferencialmente entre dos estados fisiopatológicos distintos.

Otro banco o composiciones de ácidos nucleicos según la invención es un banco antisentido, realizado a partir de las secuencias identificadas según los métodos de la invención (DATAS). Para la realización de este tipo de bancos, estas secuencias se clonan a fin de ser expresadas en fragmentos de ARN que corresponden a una orientación antisentido con relación a los ARN mensajeros sobre los cuales se han realizado DATAS. Se llega así a un banco denominado antisentido. Este enfoque utiliza preferentemente la variante de clonación que permite una orientación de los fragmentos clonados. El interés de tal banco antisentido es de permitir la transfección de líneas celulares y de seguir la alteración de cualquier fenotipo que sea del orden morfológico, enzimático o seguido por el uso de genes informadores o de resistencia a un agente de selección. El análisis de las variaciones fenotípicas consecutivas con la introducción de un vector de expresión antisentido se realiza generalmente tras la selección de clones denominados estables, es decir, que permitan una replicación coordinada del vector de expresión y del genoma del hospedante. Esta coordinación está permitida mediante la integración del vector de expresión en el genoma celular o, cuando el vector de expresión es episómico, mediante presión de selección. Esta presión de selección se realiza mediante tratamiento del cultivo celular transfectado con un agente tóxico que se puede destoxificar que cuando el producto de un gen portado por el vector de expresión se expresa en la célula. Después le sigue una sincronización entre la replicación del hospedante y la del transgen. Ventajosamente, se utilizan vectores episómicos derivados del virus de Epstein-Barr, que permiten la expresión en una misma célula de 50 a 100 copias del vector (Deiss et al, 1996, EMBO J., 15, 3861-3870; Kissil et al, 1995, J. Biol. Chem, 270, 27932-27936).

El interés de estos bancos antisentido aliados con las secuencias DATAS que contienen, es de identificar no solamente cuál gen ha tenido su expresión inhibida para llegar al fenotipo seleccionado, sino también de identificar cual isoforma de corte y empalme de este gen ha sido afectada. Cuando el fragmento antisentido sleecciona un exón dado como diana, se puede deducir que el campo proteico, y por lo tanto la función que implica este campo, se opone al fenotipo observado. Aquí, el acoplamiento de DATAS con un enfoque antisentido representa un atajo hacia la genómica funcional.

Chips con ADN

La invención se refiere igualmente a cualquier soporte (membrana, filtro, biochip, chip, etc.) que comprende un banco o una composición de ácidos nucleicos tal como se define aquí arriba. Se puede tratar más particularmente de un banco celular o de un banco de ácidos nucleicos. La invención se refiere igualmente a cualquier kit o soporte que comprende varios bancos según la invención. Particularmente, puede ser ventajoso utilizar en paralelo un banco representativo de la cualidades de un estado fisiológico de ensayo con relación a un estado fisiológico de referencia y, como control, un banco representativo de las cualidades del estado fisiológico de referencia con relación al estado fisiológico de ensayo ("par de bancos"). Un kit ventajoso según la invención comprende por lo tanto dos bancos cualitativos diferenciales de dos situaciones fisiológicas (un "par de bancos"). Según un modo de realización particular, los kits de la invención comprenden varios pares de bancos tales como se definen aquí arriba, que corresponden a diferentes estados fisológicos o a diferentes muestras biológicas, por ejemplo. Los kits pueden comprender por ejemplo estos distintos pares de bancos dispuestos en serie sobre un mismo soporte.

Generación de sondas

Otro uso de las composiciones de ADNc según la invención, representativos de las diferencias cualitativas que existen entre dos estados fisiopatológicos, consiste en derivar sondas. Tales sondas pueden, en efecto, ser utilizadas para detectar sistemáticamente los sucesos cortados y empalmados de manera diferencial entre dos situaciones fisopatológicas.

Estas sondas (véase figura 1D) se pueden preparar mediante marcación de las poblaciones o bancos de ácidos nucleicos según las técnicas clásicas conocidas por el experto en la técnica. Así, puede tratarse de marcación enzimática, radioactiva, fluorescente, inmunológica, etc. Preferentemente, se trata de una marcación radioactiva o fluorescente. Este tipo de marcación se puede realizar por ejemplo introduciendo sobre la población de ácidos nucleicos (bien después de la síntesis o bien durante su síntesis) nucleótidos marcados, que permiten su revelación mediante los métodos convencionales.

Una de las aplicaciones es por lo tanto detectar sistemáticamente un banco genómico clásico. Tal banco puede comprender según el vector, derivado de un fago o de un cósmido, fragmentos de ADN de 10 kb a 40 kb. El número de clones que hibridan con las sondas generadas por DATAS y representativas de las diferencias de corte y empalme que existen entre dos situaciones refleja por lo tanto más o menos el número de genes afectados por variaciones de corte y empalme, según se expresan en una u otra de las situaciones estudiadas.

Preferentemente, las sondas de la invención se utilizan para detectar sistemáticamente un banco de ADN genómico (generalmente humano) adaptado a la identificación de sucesos de corte y empalme. Preferentemente, tal banco genómico está compuesto de fragmentos de ADN de tamaño restringido (generalmente clonado en vectores), a fin de recubrir estadísticamente sólo un solo elemento cortable y empalmable diferencialmente, es decir un solo exón o un solo intrón. Por lo tanto, el banco de ADN genómico se prepara mediante digestión de ADN genómico con una enzima que tiene un sitio de reconocimiento restringido por 4 bases, asegurando así la posibilidad de obtener mediante digestión cuidadosa de fragmentos de ADN de tamaño medio de 1 kb. Tales fragmentos necesitan la obtención de 10^{7} clones para constituir un banco de ADN representativo de un genoma de organismo eucariota superior. Tal banco constituye igualmente un objeto de la presente solicitud. Después, este banco se hibrida con las sondas derivadas de la detección sistemática diferencial cualitativa. Precisamente, se obtienen de cada experimentación considerada y que compara dos situaciones fisiopatológicas A y B, dos sondas (par de sondas). Una sonda enriquecida en sucesos de cortes y empalmes característicos de la situación A, y una sonda enriquecida en marcadores de corte y empalme B. Los clones del banco genómico que hibridan preferentemente con una u otra sonda portan secuencias preferentemente cortadas y empalmadas en las situaciones fisiopatológicas correspondientes.

Los métodos de la invención permiten así la identificación sistemática de diferencias cualitativas de expresión génica. Estos métodos presentan numerosas aplicaciones, en la identificación y/o la clonación de moléculas de interés, en toxicología, en farmacología o también en farmacogenómica, por ejemplo.

Aplicaciones

Por lo tanto, la invención se refiere igualmente al uso de métodos, ácidos nucleicos o bancos descritos aquí arriba, para la identificación de moléculas de interés terapéutico o de diagnóstico. Más particularmente, la invención se refiere al uso de los métodos, ácidos nucleicos o bancos descritos aquí arriba, para la identificación de proteínas o de campos proteínicos afectados en una patología.

Uno de los éxitos de estas técnicas es el de identificar, en el interior de un mensajero, y por consiguiente de la proteína correspondiente, los campos funcionales que están afectados en una patología dada. Esto permite asignar a un campo dado una importancia en el desarrollo o el mantenimiento de una etapa patológica. La ventaja inmediata de restringir a un campo preciso de una proteína el impacto de una desregulación patológica es de proponer éste como una diana relevante para una detección sistemática de pequeñas moléculas con objetivo terapéutico. Estas informaciones constituyen igualmente llaves que permiten concebir polipéptidos con actividad terapéutica suministrable mediante terapia génica; especialmente, estos polipéptidos pueden ser anticuerpos de cadena simple derivados de anticuerpos neutralizantes dirigidos en contra de los campos identificados mediante las técnicas descritas aquí antes.

Más específicamente, los métodos según la invención permiten obtener moléculas que pueden:

- ser secuencias codificantes que derivan de exones alternativos,

- corresponder a secuencias no codificantes portadas por intrones cortados y empalmados diferencialmente de un estado fisiopatológico a otro.

De estos dos puntos, se pueden sacar distintas enseñanzas.

Los cortes y empalmes alternativos de exones que diferencian dos estados fisiopatológicos traducen un nivel de regulación de la expresión genética que permite modular (más precisamente abolir o instaurar) una o varias funciones de una proteína dada. Así, siendo codificados la mayoría de los dominios estructurales y funcionales (SH2, SH3, PTB, PDZ y los dominios catalíticos de distintas enzimas, etc.) por varios exones contiguos, se puede presentar dos configuraciones:

i)

Los dominios están truncados en la situación patológica (Zhu, Q. Et al, 1994, J. Exp. Med., vol 180, nº 2, p 461-470); esto indica que los caminos de señalización que implican estos dominios deben ser restaurados en un objetivo terapéutico.

ii)

Los dominios se mantienen durante una patología mientras que están ausentes en una situación sana; estos dominios se pueden considerar como diana de detección sistemática de pequeñas moléculas químicas destinadas a antagonizar las señales transducidas por medio de estos dominios.

Las secuencias cortadas y empalmadas diferencialmente pueden corresponder a regiones no codificantes situadas en 5' o en 3' de la secuencia codificante, o a intrones que intervienen entre dos exones codificantes. En las regiones no codificantes, estos cortes y empalmes diferenciales pueden traducir una modificación de la estabilidad o de la traducibilidad del mensaje (Bloom, T.J., y Beavo, J.A., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 93, nº 24, p 14188-14192; Ambartsumian, N. Et al., 1995, Gene, vol 159, nº 1, p 125-130). Por lo tanto, estos fenómenos se deben de buscar en base a estas informaciones y pueden poner en evidencia que la acumulación o la desaparición de la proteína correspondiente la designa así como diana de interés. Cuando la retención de un intrón se produce en una secuencia codificante, frecuentemente, sigue un truncamiento de la proteína natural mediante introducción de codón de parada en la fase de lectura (Varesco, L., et al, 1994, Hum, Genet., vol 93, nº 3, p 281-286; Canton, H., et al., 1996, Mol. Pharmacol., vol50, nº 4, p 799-807, Ion, A., et al, 1996, Am. J. Hum. Genet., vol 58, nº 6, p 1185-1191). Antes de encontrar este codón de parada, se produce generalmente una lectura de varios codones suplementarios, lo que lleva a adjuntar a la parte ya traducida una secuencia específica, testigo proteico del corte y empalme alternativo. Estos aminoácidos suplementarios se pueden utilizar para generar anticuerpos específicos de la forma alternativa característica de la situación patológica. Después, estos anticuerpos se pueden utilizar como herramientas de diagnóstico. La proteína truncada ve sus propiedades modificadas, incluso alteradas. Así, se pueden amputar enzimas de sus dominios catalíticos o de sus dominios reguladores, volviéndose inactivas o constitutivamente activadas. Adaptadores pueden perder su capacidad para conectar a diferentes parejas de una cascada de señalización (Watanabe, K. Et al, 1995, J. Biol. Chem., vol 270, nº 23, p 13733-13739). Los resultados de corte y empalme de los receptores pueden llegar a receptores que han perdido su capacidad a unir sus ligandos (Nakajima, T. et al, 1996, Life Sci., vol 58, nº 9, p 761-768), y pueden igualmente generar formas de receptores solubles mediante reabandono de su dominio extracelular (Cheng J., 1994, Science, vol 263, nº 5154, p 1759-1762). En este caso, se pueden prever ensayos diagnósticos, basados en la circulación en los distintos fluidos fisiológicos de forma soluble de receptor a un ligando dado.

La invención se refiere más particularmente a la utilización de los métodos, ácidos nucleicos o bancos descritos aquí arriba, para la identificación de dominios antigénicos específicos de proteínas implicadas en una patología. La invención se refiere igualmente a la utilización de los ácidos nucleicos, proteínas o péptidos tales como descritos anteriormente para el diagnóstico de patologías.

La invención se refiere igualmente a un método de identificación y/o de producción de proteínas o de dominios proteicos implicados en una patología que comprende:

(a)

la hibridación de los ARN mensajeros de una muestra patológica con los ADNc de una muestra sana, o inversamente, o los dos en paralelos,

(b)

la identificación, en los híbridos formados, de las regiones que corresponden a las diferencias cualitativas (no emparejadas (ARN) o emparejadas (ADN doble hebra)), específicas del estado patológico con relación al estado sano,

(c)

la identificación y/o la producción de la proteína o del dominio proteico que corresponde a una o varias regiones identificadas en (b).

Las regiones identificadas corresponden generalmente a cortes y empalmes diferenciales, pero puede igualmente tratarse de otras alteraciones genéticas tales como inserción(es) o supresión(es), por ejemplo.

La o las proteínas o dominios proteicos se pueden aislar, secuenciar y utilizar en aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico, especialmente para la preparación de anticuerpos.

A título de ejemplo más específico, la detección sistemática diferencial cualitativa de la invención permite ventajosamente poner en evidencia genes supresores de tumores. En efecto, numerosos ejemplos indican que uno de los modos de desactivación de los genes supresores durante la progresión tumoral, es una desactivación mediante modulación del corte y empalme de formas alternativas.

Así, en los carcinomas pulmonares con células pequeñas, el gen de la proteína p130 que pertenece a la familia RB (proteína del retinoblastoma) se muta a un sitio de consenso de corte y empalme. La secuencia de esta mutación es la eliminación del exón 2 y una no síntesis de proteína debido a la presencia de un codón de parada precoz. Esta observación a sido la primera a subrayar la importancia de los miembros de la familia RB en la tumorigénesis. Igualmente, en algunos cánceres del pulmón no de pequeñas células, el gen de la proteína p161NK4A, proteína que es un inhibidor de las cdk4 y cdk6 dependientes de ciclina quinasas, se muta en un sitio donante de corte y empalme. El resultado de esta mutación es la producción de una proteína tronqueada con semivida corta, lo que tiene por consecuencia la acumulación de las formas fosforiladas, inactivas, de RB. Por otra parte, WT1, el gen supresor de tumor de Wilms, se transcribe en varios ARN mensajeros generados mediante cortes y empalmes alternativos. En el cáncer de mama, las proporciones relativas de las diferentes variantes son modificadas con relación al tejido sano, suministrando herramientas de diagnóstico y pistas para comprender la importancia de los diferentes dominios funcionales de WT1 en la progresión tumoral. Este mismo fenómeno de modificación de las relaciones entre diferentes formas de ARN mensajeros y de isoformas proteicas durante la transformación celular se vuelve a encontrar para la neurofibrina NF1. Además, esta noción de modulación de los fenómenos de corte y empalme que firma la progresión tumoral se sostiene igualmente por el ejemplo de HDM2, cuyos 5 cortes y empalmes alternativos se detectan en los carcinomas ovárico y pancreáticas, y cuyas expresiones aumentan según el estado tumoral. Por otra parte, en los cánceres de la cabeza y del cuello, uno de los mecanismos de desactivación de p53 implica una mutación en un sitio de consenso de corte y empalme.

Estos cualesquiera ejemplos listados ilustran todo el interés de las técnicas de la invención basadas en la búsqueda sistemática de variaciones de corte y empalme que distingan un tumor dado del tejido sano cercano. Los resultados permiten en efecto, no solamente la caracterización de genes supresores de tumores ya conocidos, pero igualmente, teniendo en cuenta el aspecto original y sistemático de las técnicas de detección sistemática diferencial cualitativa, la identificación de nuevas variaciones de cortes y empalmes específicos de tumores que afectan aparentemente nuevos genes supresores de tumores.

La invención tiene por lo tanto igualmente por objeto un procedimiento de identificación y/o de clonación de genes supresores de tumores o de alteraciones genéticas (por ejemplo, de cortes y empalmes) en el seno de genes supresores de tumores, tal como se define aquí anteriormente. Este procedimiento puede ventajosamente comprender las etapas siguientes:

(a)

la hibridación de los ARN mensajeros de una muestra de tumor con los ADNc de una muestra sana, o inversamente, o los dos paralelamente,

(b)

la identificación, en los híbridos formados, de las regiones específicas de la muestra tumoral con relación al estado sano,

(c)

la identificación y/o la clonación de la proteína o dominio proteico que corresponde a una o varias regiones identificadas en (b).

Las propiedades supresoras de tumor de las proteínas o dominios identificados se puede después ensayar en distintos modelos conocidos. Después, estas proteínas o su forma nativa (que posee el corte y empalme observado en el tejido sano), pueden ser utilizadas en aplicaciones terapéuticas o diagnósticas, especialmente en terapia génica antitumoral.

La presente solicitud tiene por lo tanto igualmente por objeto no solamente los distintos aspectos de realización de la tecnología, sino también la explotación de las informaciones que resultan con fines de búsqueda, de desarrollo de detección sistemática de pequeñas moléculas químicas, de desarrollo de herramientas de terapia génica o de diagnóstico.

Por ello, la invención se refiere igualmente a la utilización de los métodos, ácidos nucleicos o bancos descritos aquí arriba en genotoxicología, es decir, para anticipar (predecir) el potencial tóxico de compuestos ensayos.

Los programas genéticos introducidos durante el tratamiento de células o de tejidos mediante agentes tóxicos se correlacionan, en gran parte, con los fenómenos de apoptosis o muerte celular programada. La importancia de los fenómenos de corte y empalme alternativo en la regulación de estas vías apoptóticas se ilustra bien en la bibliografía. Sin embargo, ninguna tecnología genómica descrita hasta ahora permitía buscar sistemáticamente y aislar de manera exhaustiva las variaciones de secuencias debidas a cortes y empalmes alternativos, y que distinga dos situaciones fisiopatológicas dadas. Las técnicas de detección sistemática diferencial cualitativa desarrolladas en la presente invención permiten agrupar el conjunto de las diferencias de corte y empalme que existen entre dos situaciones en los bancos de ADNc. La comparación de las secuencias de ARN (por ejemplo los ARN mensajeros) de un tejido (o de un cultivo celular) tratado o no con un compuesto tóxico de referencia, permite establecer bancos de ADNc que agrupan las diferencias cualitativas de la expresión génica que caracterizan la acción tóxica estudiada. Después, estos bancos de ADNc se pueden hibridar con sondas derivadas de ARN extraído de los mismos tejidos, o células tratadas con un producto químico del cual se quiere evaluar el potencial tóxico. La más o menos grande capacidad de estas sondas a hibridarse con las informaciones genéticas específicas de una situación tóxica de referencia, permite asignarle un potencial tóxico. Por otra parte, además de la aplicación de DATAS a la generación y a la utilización de bancos de diferencias cualitativas inducidas por agentes tóxicos, una parte de la invención consiste igualmente en demostrar que desregulaciones en el corte y empalme de algunos ARN mensajeros pueden ser inducidas por ciertos agentes tóxicos, con dosis menores que IC50 medidas en ensayos de citotoxicidad y de apoptosis conocidos por el experto en la técnica. Tales desregulaciones (o disregulaciones) se pueden utilizar como marcadores para el seguimiento de la toxicidad y/o de la eficacia de moléculas (químicas o genéticas).

La invención se refiere por lo tanto igualmente a cualquier método de detección o de seguimiento del potencial tóxico y/o terapéutico de un compuesto basado en la detección de formas y/o de perfiles de cortes y empalmes inducidas mediante este compuesto sobre una muestra biológica. Se refiere además a la utilización de cualquier modificación de formas y/o de perfiles de cortes y empalmes como marcador para el seguimiento de la toxicidad y/o de la eficacia de moléculas.

La evaluación o el seguimiento del potencial tóxico se puede efectuar más particularmente según dos enfoques:

Según el primer enfoque, la detección sistemática diferencial cualitativa se puede realizar entre un tejido o un cultivo celular de referencia, por una parte no tratado y por otra parte tratado mediante el producto del cual se desea evaluar la toxicidad. El análisis de los clones que representan las diferencias cualitativas específicamente inducidas mediante el producto permite a continuación, eventualmente, detectar en estos clones eventos característicos de ADNc implicados en los fenómenos relacionados con la toxicidad como la apoptosis.

La aparición de estos marcadores se sigue según la dosis y el tiempo del tratamiento por el producto y permite un enfoque de su perfil toxicológico.

La presente solicitud tiene por lo tanto igualmente por objeto un procedimiento de identificación, mediante detección sistemática diferencial cualitativa según las técnicas presentadas aquí arriba, de marcadores de toxicidad inducidos en un sistema biológico modelo mediante un compuesto químico del cual se quiere ensayar el potencial tóxico. Para ello, la invención se refiere especialmente a un procedimiento de identificación y/o de clonación de ácidos nucleicos específicos de un estado tóxico de una muestra biológica dada que comprende la preparación de bancos diferenciales cualitativos entre los ADNc y los ARN de la muestra después o sin tratamiento mediante un compuesto tóxico de ensayo, y la búsqueda de marcadores de toxicidad específicas de las calidades de la muestra tras el tratamiento.

Según un segundo enfoque, ábacos para diferentes clases de productos tóxicos reúnen su perfil de toxicidad según las dosis utilizadas y según las duraciones de los tratamientos para un tejido o un modelo celular de referencia. En cada punto de estos ábacos, se pueden establecer bancos de ADNc característicos de las diferencias genéticas cualitativas. Estos bancos son bancos diferenciales cualitativos, por ejemplo, se obtienen mediante extracción de las informaciones genéticas del punto elegido en los ábacos y del punto que corresponde al modelo del tejido o celular control. Como se ilustra en los ejemplos, la detección sistemática diferencial cualitativa descansa sobre la hibridación de ARNm extraídos de una situación con los ADNc que provienen de otra. Como indicado más arriba, la detección sistemática diferencial cualitativa se puede igualmente llevar a partir de ARN totales o ARN nucleares que contienen los pre-mensajeros.

Para ello, la invención se refiere a un procedimiento de determinación o de evaluación de la toxicidad de un compuesto de ensayo sobre una muestra biológica dada que comprende la hibridación:

-

de bancos diferenciales entre los ADNc y los ARN de dicha muestra biológica en el estado sano y con uno o diferentes estados de toxicidad resultante de un tratamiento de dicha muestra con un compuesto tóxico de referencia, con,

-

una preparación de ácidos nucleicos de la muestra biológica tratada mediante dicho compuesto de ensayo, y

-

la evaluación del potencial tóxico del compuesto de ensayo mediante análisis del grado de hibridación con los distintos bancos.

Según este procedimiento, para cada situación (dosis de compuesto y/o tiempo de incubación), se realizan ventajosamente dos hibridaciones recíprocas, entre:

-

los ARN de la situación A (ensayo) y los ADNc de la situación B (referencia) (rA/cB)

-

los ARN de la situación B (referencia) y los ADNc de la situación A (ensayo) (rB/cA).

En cada situación tóxica de referencia, en cada punto de los ábacos, corresponden por lo tanto dos bancos de detección sistemática diferencial cualitativa. Uno de estos bancos reúne las variaciones cualitativas, es decir especialmente los cortes y empalmes alternativos, específicos de la situación normal de referencia mientras que el otro banco reúne los cortes y empalmes específicos de eventos tóxicos. Estos bancos se replican sobre soportes sólidos tales como filtros de nylon o de nitrocelulosa, o ventajosamente sobre chips. Estos bancos formados inicialmente por fragmentos de ADNc de longitud variable (según los eventos de cortes y empalmes concernidos) se puede optimizar mediante el uso de oligonucleótidos derivados de las secuencias aisladas inicialmente.

Cuando un compuesto químico se propone para un desarrollo farmacéutico, éste se puede aplicar sobre los mismos modelos de tejidos o celulares que los clasificados en los ábacos de toxicidad. Después, se puede realizar sondas moleculares a partir de ARNm extraídos de las muestras biológicas tratadas mediante el compuesto químico de interés. Después, estas sondas se hibridan a filtros que llevan el ADNc de los bancos rA/cB y rB/cA. Por ejemplo, el banco rA/cB puede contener las secuencias específicamente presentes en la situación normal y el banco rB/cA los elementos de corte y empalme alternativo específicos de la situación de toxicidad. La inocuidad o la toxicidad del compuesto químico se evalúa entonces fácilmente en función de los perfiles de hibridación de una sonda derivada de ARNm extraídos del modelo de tejido o celular de referencia tratado mediante el compuesto ensayado:

-

una hibridación eficaz con el banco rA/cB y ninguna señal sobre el banco rB/cA revela una ausencia de toxicidad del compuesto sobre el modelo estudiado,

-

la hibridación de la sonda con clones del banco rB/cA indica una toxicidad inducida por el compuesto ensayado.

Ejemplos de aplicación de constituciones de tales bancos se pueden suministrar mediante modelos de cultivo de hepatocitos, tal como la línea HepG2, de células epiteliales renales, tal como la línea HK-2, o de células endoteliales, tal como la línea ECV304, tratadas mediante agentes tóxicos tal como etanol, camptotecina o PMA.

Se puede igualmente suministrar un buen ejemplo mediante el uso en cosmetología de modelos de cultivo de pieles tratadas o no mediante agentes tóxicos o irritantes.

Por lo tanto, la presente solicitud tiene igualmente por objeto bancos de detección sistemática diferencial (entre los ADNc y los ARN), realizados a partir de órganos, de tejidos o de cultivos celulares de referencia tratados con compuestos químicos representativos de grandes clases de agentes tóxicos según los ábacos descritos en la bibliografía. La invención se refiere igualmente a la exposición de estos bancos sobre filtros o sobre soportes conocidos por el experto en la técnica (nitrocelulosa, nailon, etc.). Ventajosamente, estos soportes pueden ser chips, o chips que definen así chips de genotoxocidad. La invención se refiere además a la explotación que se puede hacer de la secuenciación de los diferentes clones que constituyen estos bancos con el objetivo de elucidar los mecanismos utilizados por acción de los diferentes tóxicos, así como el uso de estos bancos para hibridarles con sondas que provienen de células o de tejidos tratados mediante un compuesto químico, o un producto farmacéutico del cual se quiere evaluar la toxicidad. Ventajosamente, la invención se refiere a bancos de ácidos nucleicos tales como se definen aquí anteriormente, preparados a partir de células de la piel tratadas en diferentes condiciones tóxicas. La invención se refiere además a un kit que comprende estos distintos bancos diferenciales de la piel.

La invención se refiere igualmente al uso de los métodos, ácidos nucleicos o bancos descritos aquí arriba, para evaluar (predecir) o mejorar el potencial terapéutico de compuestos de ensayo (genofarmacología).

En este uso, el principio utilizado es muy cercano al principio utilizado anteriormente. Se establecen bancos diferenciales de referencia entre los ADNc y los ARN de un cultivo celular o de un órgano en una situación de control y de sus equivalentes miméticos un modelo de patología. Entonces, la eficacia terapéutica de un producto se puede evaluar siguiendo su capacidad a antagonizar las variaciones cualitativas de la expresión génica que son específicas del modelo patológico. Esto se pone en evidencia mediante la modificación del perfil de hibridación de una sonda que proviene del modelo patológico sobre los bancos de referencias: sin tratamiento, la sonda híbrida solamente con el banco que contiene las firmas específicas de la enfermedad. Tras tratamiento con un producto eficaz, la sonda aunque proviene del modelo patológico híbrida preferentemente con el otro banco, que lleva las firmas del modelo equivalente sano.

Para ello, la invención se refiere igualmente a un procedimiento de determinación o de evaluación de la eficacia terapéutica de un compuesto de ensayo sobre una muestra biológica dada que comprende la hibridación:

- de bancos diferenciales entre los ADNc y los ARN de dicha muestra biológica en estado sano, y en (diferentes estados de desarrollo de) estado patológico con,

- una preparación de ácidos nucleicos de la muestra biológica tratada mediante dicho compuesto de ensayo, y

- la evaluación del potencial terapéutico del compuesto mediante análisis del grado de hibridación con los distintos bancos.

Un ejemplo de tal aplicación se puede suministrar mediante un modelo de apoptosis mimético de algunos aspectos de la neurodegeneración que son antagonizados por factores tróficos de referencia. Así, las células derivadas de feocromocitomas PC12 diferenciadas en cuerpos neurales en presencia de NGF entran en apoptosis mediante eliminación de este factor de crecimiento. Esta apoptosis se acompaña mediante expresión de numerosos marcadores de muerte celular programada del cual varios se regulan mediante corte y empalme alternativo y cuya aparición se inhibe mediante acción de IGF1. Dos bancos que provienen de detección sistemática diferencial cualitativa se establecen a partir de ARNm extraídos de células PC12 diferenciadas entradas en apoptosis mediante eliminación de NGF por una parte, y a partir de PC12 diferenciadas salvaguardadas de la apoptosis mediante añado de IGF por otra parte. En estos bancos se pueden hibridar sondas realizadas a partir de ARNm extraídos de PC12 diferenciadas entradas en apoptosis y cuya supervivencia se mejora mediante tratamiento con un producto neuroprotector a ensayar. La eficacia de la inversión de las características cualitativas inducidas por el compuesto de ensayo se puede por lo tanto apreciar mediante la capacidad de la sonda en hibridar específicamente los clones específicos del banco representativo de las células cuya supervivencia está mejorada. Después, este ensayo se puede utilizar para probar la eficacia de derivados del compuesto o de cualquier otra nueva familia de compuestos neuroprotectores, y mejorar el perfil farmacológico de estos.

En un modo de realización particular, el procedimiento de la invención permite evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo neuroprotector mediante hibridación con un banco diferencial según la invención, entre una célula nerviosa sana, y presentando está célula un modelo de neurodegeneración.

En otro modo, se trata de ensatar un compuesto antitumoral sobre bancos diferenciales establecidos a partir de una muestra de células tumorales y una muestra sana.

Como se indica anteriormente, el procedimiento de la invención puede además ser utilizado para mejorar las propiedades de un compuesto, ensayando diferentes derivados por su capacidad a inducir un perfil de hibridación cercano del banco representativo de la muestra sana.

La invención se refiere igualmente al uso de los métodos, ácidos nucleicos o bancos descritos aquí arriba en farmacogenómica, por ejemplo, para evaluar (predecir) la respuesta de un paciente a un compuesto o tratamiento de ensayo.

La farmacogenómica tiene como ambición establecer perfiles genéticos de pacientes a fin de determinar cuál tratamiento es susceptible de tener más rendimiento para una patología dada. Las técnicas descritas en la presente invención permiten para eso establecer bancos de ADNc representativos de las diferencias cualitativas que existen entre una situación patológica que responde a un tratamiento dado y otra que responde poco o mal, susceptible de ser el objeto de otra estrategia terapéutica. Estos bancos de referencias establecidos se pueden hibridar con sondas realizadas a partir de ARN mensajeros de pacientes. Los resultados de hibridación permiten saber cual paciente tiene un perfil de hibridación que corresponde a la situación de respuesta o de no respuesta y así afinar la elección del tratamiento.

En esas aplicaciones, el objetivo es, por una parte, proponer en función del paciente el tratamiento más apropiado, más susceptible de ser premiado y, por otra parte, enrolar en un tratamiento los pacientes más susceptibles de responder con éxito. Como en las demás aplicaciones, dos bancos de detección sistemática diferencial cualitativa se realizan: uno a partir de un modelo o de una muestra patológica conocida por responder a un tratamiento, el otro a partir de otro modelo o muestra patológica que responde poco o mal a la acción terapéutica. Después, estos dos bancos se hibridan con sondas que provienen de ARNm extraídos de biopsias de distintos pacientes. Según que estas sondas hibriden preferentemente con los cortes y empalmes alternativos específicos de una u otra situación, los pacientes se pueden repartir en respondedores o en no respondedores al tratamiento de referencia que ha definido los modelos de partida.

Para ello, la invención se refiere igualmente a un procedimiento de determinación o de evaluación de la respuesta de un paciente a un compuesto o un tratamiento de ensayo que comprende la hibridación:

- de bancos diferenciales entre los ADNc y los ARN de una muestra biológica respondedora a dicho compuesto/tratamiento, y una muestra biológica no respondedora o mal respondedora a dicho compuesto/tratamiento, con

- una preparación de ácidos nucleicos de una muestra biológica patológica del paciente, y

- la evaluación del potencial respondedor del paciente mediante análisis del grado de hibridación con los distintos bancos.

Un ejemplo bueno de la aportación de la detección sistemática diferencial cualitativa a la farmacogenómica está constituido por una detección sistemática diferencial cualitativa entre dos tumores del mismo origen histológico, una regresión durante el tratamiento mediante un compuesto antitumoral (por ejemplo una transferencia de una ADNc que codifica la proteína p53 salvaje por una terapia génica), la otra mostrándose refractaria a este tratamiento. El primer resultado de la constitución de bancos de diferencias cualitativas entre estas dos situaciones es de determinar, mediante análisis de los clones que constituyen estos bancos, cuales mecanismos moleculares se movilizan durante la regresión del primer modelo y no estén presentes en la segunda.

Después, el uso de filtros o cualquier otro soporte que presenten los ADNc de estos bancos permite realizar hibridaciones con sondas derivadas de ARNm de biopsias de tumores de las cuales se quiere anticipar la respuesta a dicho tratamiento. Estos resultados permiten así proponer una inserción optimizada de los pacientes en un protocolo clínico.

Un ejemplo particular de este procedimiento consiste en determinar la respuesta de tumores a un tratamiento mediante el gen supresor de tumor p53. En efecto, se ha decrito que algunos pacientes y algunos tumores responden más o menos bien a este tipo de tratamiento (Roth et al., Nature Medicine, 2 (1995) 958). Por lo tanto, es importante poder determinar cuales tipos de tumores y/o cuales pacientes son sensibles a un tratamiento mediante terapia génica por p53 salvaje, con el fin de optimizar el tratamiento y favorecer el enrolamiento de los pacientes en los ensayos clínicos en curso. El procedimiento de la invención permite ventajosamente facilitar estas etapas proponiendo bancos específicos de las calidades de células respondedoras y de células no respondedoras a p53. Ejemplos de modelos celulares sensibles o resistentes a p53 se describen por ejemplo por Sabbatini et al. (Genes Dev. 9 (1995) 2184) o por Roemer et al. (Oncogene 12 (1996) 2069). La hibridación de estos bancos con sondas derivadas de biopsias de pacientes permite fácilmente evaluar su potencial de respuesta. Además, los bancos específicos permiten igualmente identificar ácidos nucleicos implicados en la respuesta a p53.

Por lo tanto, la presente solicitud se refiere igualmente al establecimiento de bancos de detección sistemática diferencial a partir de muestras patológicas, o de modelos de patología, que responden diferentemente a al menos un agente farmacológico. Estos bancos pueden ser bancos restringidos, complejos o autólogos como se definen aquí arriba. Se refiere igualmente a la exposición de estos bancos sobre filtros o sobre soportes conocidos por el experto en la técnica (nitrocelulosa, nylon, etc.). Ventajosamente, estos soportes pueden ser chips o chips que definen así chips de farmacogenómica. La invención se refiere igualmente a la explotación que se puede hacer de la secuenciación de los diferentes clones que constituyen estos bancos con el objetivo de elucidar los mecanismos que presidan a las diferencias de respuestas de muestras patológicas hacia distintos tratamientos, así como el uso de estos bancos para hibridarlos con sondas que provienen de biopsias que provienen de situaciones patológicas de las cuales se quiere anticipar la respuesta al tratamiento de referencia que define los bancos.

La presente invención describe así que variaciones en las formas y/o perfiles de cortes y empalmes constituyen fuentes de marcadores de farmacogenómica, es decir fuentes de marcadores que permiten la puesta en evidencia de la capacidad y de la manera de un paciente a responder a tratamientos. Para ello, la invención tiene igualmente por objeto el uso de la intervariabilidad, entre individuos, isoformas generadas mediante corte y empalme alternativo (análisis del espliceoma) como fuente de marcadores de farmacogenómica. La invención se refiere igualmente al uso de modificaciones de corte y empalme inducidas mediante tratamientos como fuente de marcadores de farmacogenómica. Así, como se explica anteriormente, las metodologías DATA de la invención permiten generar ácidos nucleicos representativos de las diferencias cualitativas entre dos muestras biológicas. Estos ácidos nucleicos, o formas derivadas (sondas, cebadores, ácidos complementarios, etc.) se pueden utilizar para el análisis del espliceoma de sujetos, en vista a poner en evidencia sus capacidades/maneras a responder a tratamientos, o sus predisposiciones a tal tratamiento/patología, etc.

Estos distintos ejemplos generales ilustran el interés de bancos de detección sistemática diferencial cualitativa en estos estudios de genotoxicidad, genofarmacología, farmacogenomía así como en búsqueda de dianas de interés diagnósticas o terapéuticas. Estos bancos provienen de la clonación de las diferencias cualitativas que existen entre dos situaciones fisiopatológicas. Puesto que otro uso de los ADNc representativos de estas diferencias cualitativas es constituir sondas destinadas a detectar sistemáticamente un banco de ADN genómico cuyas características se han descritas aquí anteriormente, tal enfoque se puede igualmente realizar para cualquier estudio de genotoxicidad, genofarmacología y farmacogenomía, así como la identificación de gen. En los estudios de genotocitidad por ejemplo, los clones genómicos restringidos por el tamaño de sus inserciones estadísticamente con un solo intrón o con un solo exón, se clasifican sobre filtros en función de sus hibridaciones con sondas DATAS que provienen de el análisis diferencial cualitativa entre una población celular o un tejido de referencia y las mismas células o tejido tratados mediante un compuesto tóxico de referencia. Siendo seleccionados estos clones representativos de las diferentes clases de toxicidad, se puede a continuación proviener a una hibridación de estos clones con una sonda derivada de los ARN mensajeros totales de una misma población celular o de un mismo tejido tratado mediante un compuesto de cual se quiere apreciar el potencial tóxico.

Otras ventajas y aplicaciones de la presente invención aparecerán a la lectura de los ejemplos siguientes, que se deben de considerar como ilustrativos y no limitativos. Los campos de aplicación de la invención se representan en la figura 7.

Leyenda de las figuras

Figura 1. Representación esquemática de las detecciones sistemáticas diferenciales según la invención (figura 1A) utilizando una (figura 1B) o dos (figura 1C) hibridaciones, y uso de los ácidos nucleicos (figura 1D).

Figura 2. Representación esquemática que describe la obtención de híbridos ARN/ADN que permiten caracterizar las secuencias de ARN de hebra simple, firmas específicas del estado patológico o del estado sano.

Figura 3. Representación esquemática que describe un medio que permite aislar y caracterizar mediante secuenciación las secuencias de ARN de hebra simple específicas de una situación patológica o de una situación sana.

Figura 4. Representación esquemática que describe otro medio que permite caracterizar mediante secuenciación todo o parte de los ARN de hebra simple específicas de una situación patológica o de una situación sana.

Figura 5. Representación esquemática que permite aislar los productos de cortes y empalmes alternativos gracias a estructuras R-loop.

Figura 6. Representación esquemática de la detección sistemática diferencial cualitativa mediante restricción de bucles (formación de homodúplex ADNcdb/ADNc y extracciones de las informaciones, Figura 6A), y descripción de las informaciones obtenidas (Figura 6B).

Figura 7. Aportaciones de la detección sistemática diferencial cualitativa en las distintas etapas de la búsqueda y del desarrollo farmacéutico.

Figura 8. Aislamiento de un dominio diferencialmente cortado y empalmado en el modelo grb2/grb33. A) Producción de los ARN sintéticos de grb2 y de grb33. B) Seguimiento de las primeras etapas DATAS que conducen a la caracterización de un fragmento ARN que corresponde al dominio diferencialmente cortao y empalmado; 1: ARN de grb2, 2: Hibridación entre el ARN de grb2 y del ADNc de grb33, 3: Hibridación entre el ARN de grb2 y del ADNc de grb2, 4: Hibridación entre el ARN de grb2 y agua, 5: Sobrenadante tras paso sobre perlas estreptavidina de (2), 6: Sobrenadante tras paso sobre perlas estreptavidina de (3), 7: Sobrenadante tras paso sobre perlas estreptavidina de (4), 8: Digestión del dúplex ARN grb2 / ADNc grb33 con la Rnasa H, 9: Digestión del dúplex ARN grb2 / ADNc grb2 con la Rnasa H, 10: Digestión del ARN grb2 con la Rnasa H, 11: igual que (8) tras paso sobre columna de exclusión, 12: igual que (9) tras paso sobre columna de exclusión, 13: igual que (10) tras paso sobre columna de
exclusión.

Figura 9. Representación de las poblaciones de ARN no aparentados que provienen de la digestión mediante la Rnasa H a partir de dúplex ARN / ADNc de hebra simple que provienen de células HepG2 tratadas o no con etanol.

Figura 10. Representación de las poblaciones de ADN doble hebra generadas mediante una de las variantes de DATAS. 1 a 12: PCR a partir de poblaciones de bucles de ARN que provienen de la digestión con la Rnasa H, 13: PCR a partir de ADNc total.

Figura 11. Aplicación de la variante de DATAS haciendo intervenir los ADNc doble hebra sobre el modelo grb2/grb33. A) análisis sobre gel de agarosa de los complejos tras hibridación: 1: ADNc de doble hebra grb2 / ARN grb33, 2: ADNc doble hebra grb2 / ARN grb2, 3: ADNc de doble hebra grb2 / agua. B) digestión de las muestras 1, 2 y 3 de A) mediante la nucleasa S1 y la nucleasa "Mung Bean": 1 a 3: complejos 1 a 3 antes del tratamiento con glioxal; 4 a 6: complejos 1 a 3 antes del tratamiento con glioxal; 7 a 9: Digestiones de 1 a 3 mediante nucleasa S1; 10 a 12: Digestiones de 1 a 3 mediante nucleasa Mung Bean.

Figura 12. Aplicación de la variante DATAS haciendo intervenir los ADNc doble hebra y la Rnasa H sobre un sistema de células HepG2 tratadas o no con etanol 0,1M durante 18 horas. Los insertos clonados se han transferido sobre membrana tras electroforesis sobre gel de agarosa, y se han sometido a la hibridación con la ayuda de sondas que corresponden a las situaciones tratadas (Tr) o no (NT).

Figura 13. Modo operatorio para evaluar el potencial tóxico de un producto.

Figura 14. Modo operatorio para seguir la eficacia de un producto.

Figura 15. Modo operatorio para estudiar la susceptibilidad de una situación patológica a un tratamiento.

Figura 16. Análisis de hibridación diferencial de clones que provienen de DATAS a partir de ARN extraídos de células inducidas y de ADNc extraídos de células no inducidas. A) Uso de colonias bacterianas depositadas y lisadas sobre membrana. B) transferencia Southern efectuada a partir de una selección de clones de A.

Figura 17. Secuencia nucleotídica y peptídica de \DeltaSHC (SEQ ID NO: 9 y 10).

Figura 18. Ensayos de citotoxicidad y de apoptosis sobre células HepG2 tratadas A) con etanol; B) con camptotecina; C) con PMA.

Figura 19. Reacciones de RT-PCR efectuadas a partir de ARN extraídos de células HepG2 tratadas o no (N.T) mediante etanol (Eth.), camptotecina (Camp.) y PMA (PMA) permitiendo la amplificación de fragmentos que corresponden a dominios de MACH-a, BCL-X, FASR y beta-actina como control de normalización.

En los ejemplos y la descripción de la invención, se hace referencia a las secuencias de la Lista de Secuencias, que contiene el texto libre siguiente:

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Ejemplos 1. Clonación diferencial de los cortes y empalmes alternativos y otras modificaciones cualitativas de los ARN utilizando ADNc de hebra simple

Los ARN mensajeros que corresponden a dos situaciones, una normal (mN) y la otra patológica (mO), se aíslan a partir de biopsias o de células en cultivo. Estos ARN mensajeros se convierten en ADN complementarios (vN) u (cP) con la ayuda de la retrotranscriptasa (RT). Después, se realizan híbridos mN/cP y cN/mP en fase líquida (véase el esquema de la figura 2 que ilustra uno de los dos caso que lleva a la formación de cN/mP).

Estos híbridos se realizan ventajosamente en emulsión fenólica (técnica PERT o Phenol Emulsion DNA Reassociation Technique) mantenida por termociclos (Miller, R., D. Y Riblet, R., 1995, Nucleic Acids Research, vol 23, nº 12, p 2339-2340). Típicamente, esta etapa de hibridación se realiza entre 0,1 a 1 \mug de ARN polyA^{+} y 0,1 a 2 \mug de ADN complementario en una emulsión formada de una fase acuosa (tampón fosfato de sodio 120 mM, NaCl 2,5M, EDTA 10 mM) y de una fase orgánica que representa 8% de la fase acuosa y constituida de fenol bidestilado.

Igualmente, se usa ventajosamente otra técnica a fin de obtener heteroduplex: al final de la retrotranscriptasa, el ADNc neosintetizado se separa del cebador oligodT biotinilado sobre columna de exclusión. Se coprecipita 0,1 a 2 \mug de este ADNc con 0,1 a 1 \mug de ARN polyA^{+} en presencia de 0,3M de acetato de sodio y de dos volumen de etanol. Estos ácidos nucleicos coprecipitados se recogen en 30 \mul de un tampón de hibridación que contiene 80% de formamida, 40 mM de PIPES (ácido de piperazinbis(2-etanosulfónico)) pH 6,4, 0,4 M de NaCl y 1 mM de EDTA.

Los ácidos nucleicos en disolución se desnaturalizan mediante calentamiento 10 min. a 85ºC, después se realiza su hibridación durante al menos 16h y hasta 48h a 40ºC.

El interés de la técnica de hibridación en formamida es permitir condiciones de selectividad más grande durante el emparedamiento de las hebras de ADNc y de ARN.

Al final de cada una de estas dos técnicas de hibridación, se dispone de heterodúplex ARN/ADN cuya perfección de emparejamiento depende de la eficacia de la RT a sintetizar la longitud total de los ADNc. Las regiones de ARN (y de ADN) que corresponden a los cortes y empalmes alternativos que diferencian los dos estados fisiopatológico estudiados siguen siendo igualmente en forma de simples hebras.

Después, el objetivo del método es de caracterizar la información genética llevada por estos bucles de corte y empalme.

Para ello, los heterodúplex se purifican mediante captura de los ADNc (cebadores con oligodT biotinilados) gracias a perlas que llevan agrupamientos estreptavidinas. Ventajosamente, estas perlas son perlas que tienen propiedades magnéticas, lo que permite separarlas de los ARN no introducidos en los heterodúplex mediante acción de un separador magnético. Tales perlas y tales separadores son disponibles comercialmente.

Los heterodúplex están asilados en este momento del procedimiento así como los ADNc no introducidos en hibridaciones con ARN. Después, este material se somete a la acción de la RNasaH que va específicamente a hidrolizar las regiones de ARN hibridadas con los ADNc. Los productos resultantes de esta hidrólisis son por una parte los ADNc y por otra parte los fragmentos de ARN que corresponden a los bucles de corte y empalme o a las regiones no hibridadas por el hecho del rendimiento parcial de la retrotranscriptasa. Los fragmentos de ARN se separan del ADN mediante separación magnética según el mismo modo de realización que el mencionado más arriba y mediante digestión con una Dnasa libre de cualquier contaminación mediante una actividad Rnasa.

1.1. Validación de la técnica DATAS sobre las variantes de corte y empalme del gen Grb2

Se realizó una puesta en evidencia de la factibilidad de este enfoque sobre un sistema in vitro utilizando un ARN que corresponde a la región que codifica Grb2 por una parte y, un ADNc de hebra simple complementario a la región que codifica Grb33. Grb2 es un gen que posee una fase que codifica 651 pares de bases. Grb33 es una isoforma de grb2 generada mediante corte y empalme alternativo y que comprende una supresión de 121 pares de bases en el dominio funcional SH2 de grb2 (Fath et al., Science (1994), 264, 971-4). Los ARN de Grb2 y de Grb33 se sintetizan según las técnicas conocidas por el experto en la técnica a partir de un plásmido que contiene la secuencia que codifica Grb2 o Grb33, bajo control del promotor T7 con la ayuda del kit RiboMax (Promega). El análisis de los productos demuestra una síntesis homogénea (figura 8A). Con un objetivo de visualización, el ARN de Grb2 ha sido igualmente hecho radioactivo mediante incorporación de una base marcada durante la transcripción in vitro con la ayuda del kit RiboProbe (Promega). Los ADNc de Grb2 y Grb33 han sido sintetizados mediante retrotranscripción a partir de los ARN sintéticos producidos aquí arriba, del kit Superscript II (Life Technologies) y mediante un cebador oligonucleotídico biotinilado común a Grb2 y Grb33 que corresponde al complementario de la secuencia (618-639) de Grb2. Los ARN y ADN han sido tratados según las indicaciones de los fabricantes (Promega, Life Technologies), purificados sobre columna de exclusión (Rnasa free sephadex G25 o G50, 5 Prime, 3 Prime) y cuantificados mediante espectrometría.

Las primeras etapas de DATAS se han aplicadas asociando, en suspensión 10 ng de ARN marcado de Grb2 con:

1. 100 ng de ADNc de Grb33 biotinilado,

2. 100 ng de ADNc de Grb2 biotinilado,

3. agua

en 30 \mul de tampón de hibridación que contiene 80% de formamida, 40 mM PIPES (pH 6,4), 0,4 M NaCl, 1 mM EDTA. Los ácidos nucleicos se desnaturalizan mediante calentamiento 10 min. a 85ºC, después, la hibridación se realiza durante 16 horas a 40ºC. Tras la captura con la ayuda de perlas de estreptavidina, las muestras se tratan con la Rnasa H como descrito anteriormente.

El análisis de estas etapas se realiza mediante electroforesis sobre gel de acrilamida al 6% seguido por un tratamiento de los geles con la ayuda de un Instant imager (Packard Instruments) permitiendo la calificación y la cuantificación de las especies que provienen del ARN de Grb2 marcado (figura 8B). Así, los pocillos 2, 3 y 4 indican que los dúplex Grb2/Grb33 y Grb2/Grb2 se han formado de manera cuantitativa. La migración del complejo Grb2/Grb33 se retrasa con relación a la del ARN de Grb2 (pocillo 2) mientras que la del complejo Grb2/Grb2 se aumenta (pocillo 3). Los pocillos 5, 6 y 7 corresponden a las muestras no retenidas por las perlas de estreptavidina demostrando que 80% de los complejos Grb2/Grb33 y Grb2/Grb2 han sido retenidos sobre las perlas mientras que el ARN de Grb2 solo, no biotinilado, se encuentra exclusivamente en el sobrenadante de las perlas. El tratamiento con la Rnasa H libera, además de los nucleótidos libres que inmigran más rápidamente que el azul de Bromofenol (BPB) una especie migrante debajo del azul de xileno Cianol (XC) (marcado mediante una flecha en la figura) y eso, específicamente en el pocillo 8 que corresponde al complejo Grb2/Grb33 con relación a los pocillos 9 y 10 que corresponden al complejo Grb2/Grb2 y al ARN de Grb2. Los pocillos 11, 12 y 13 corresponden a los pocillos 8, 9 y 10 tras paso de las muestras sobre columna de exclusión para eliminar los nucleótidos libres. La migración observada en los pocillos 8 y 11 es la esperada para una molécula de ARN que corresponde a la supresión de 121 nucleótidos que diferencian Grb2 de Grb33.

Estos resultados muestran bien la posibilidad de obtener los bucles de ARN generados mediante la formación de heterodúplex entre dos secuencias derivadas de dos isoformas de corte y empalme.

1.2. Aplicación de la técnica DATAS para la generación de bancos cualitativos de células hepáticas en un estado sano y tóxico

Se estudió una situación más compleja. En el ámbito de la aplicación de la tecnología DATAS como herramienta de predicción de toxicidad de moléculas, se trataron células humanas de tipo hepatocitarias, HepG2 mediante etanol 0,1M durante 18 horas. Los ARN han sido extraídos a partir de células tratadas o no. La variante de DATAS descrita aquí arriba (preparación de ADNc sb biotinilados, hibridaciones cruzadas en fase líquida, aplicación de un campo magnético para separar las especies, tratamiento con RnasaH) se ha aplicada con las células no tratadas en situación de referencia (o situación A), y las células tratadas en situación de ensayo (situación B) (figura 9). No estando los ARN extraídos marcados radioactivamente, la visualización de las poblaciones de ARN generadas mediante digestión con la RnasaH se realiza efectuando una reacción de intercambio del fosfato en 5' de los ARN por un fosfato marcado, con la ayuda de polinucleótido quinasa de T4 y de gamma-P^{32}ATP. Después, estas marcaciones se disponen sobre gel de acrilamida/urea, y analizadas mediante exposición con la ayuda de un Instant Imager (Packard Instruments). Entonces, se pueden visualizar firmas complejas que provienen de las hibridaciones A(B y B/A con un primer grupo de señales migrantes débilmente en el gel y que corresponden a secuencias de ácidos nucleicos de tamaño importante, y un segundo grupo de señales migrantes entre 25 y 500 nucleótidos. Estas firmas son de intensidad mucho más débil a partir de la situación A/A lo que sugiere que el etanol puede inducir una reprogramación del corte y empalme de los ARN, traducida por la existencia de señales en A/B y B/A.

1.3. Clonación y preparación de bancos a partir de los ácidos nucleicos identificados

Después, varias variantes experimentales se pueden prever para clonar estos fragmentos de ARN resistente a la acción de la Rnasa H:

A. Un primer enfoque consiste en aislar estos bucles y en clonarles (figura 3).

Según este enfoque, se proviene a una ligación de oligonucleótidos en cada uno de sus extremos mediante acción de la RNA ligasa según las condiciones conocidas por el experto en la técnica. Después, estos oligonucleótidos se utilizan como cebadores para efectuar una RT PCR. Los productos de PCR se clonan y se detectan sistemáticamente con sondas de ADN complementarias totales que corresponden a las dos situaciones fisiopatológica de interés. Solamente los clones que hibridan preferentemente con una sola de las dos sondas contienen los bucles de corte y empalme que a continuación se secuencian y/o se utilizan para generar bancos.

B. El segundo enfoque (figura 4) consiste en efectuar una retrotranscripción sobre el ARN de hebra simple liberado de los heterodúplex tras acción de la RnasaH, iniciada con la ayuda de cebadores al menos en parte aleatorios. Así, puede tratarse de cebadores aleatorios en 3' y 5', de cebadores aleatorios en 3' y determinados en 5', o también de oligonucleótidos semi-aleatorios, es decir que comprenden una zona de degeneración y una zona definida.

Según esta estrategia, los cebadores son por lo tanto susceptibles de hibridarse bien en cualquier sitio en el ARN de hebra simple, o bien en cada sucesión de bases fijada por la elección del cebador sem-aleatorio. Una PCR con cebadores que corresponden a los oligonucleótidos descritos aquí arriba, permite a continuación obtener secuencias derivadas de los bucles de corte y empalme.

La figura 10 (pocillos 1 a 12) muestra el análisis sobre gel de acrilamida de los fragmentos de PCR obtenidos a partir de varios ensayos DATAS y acoplados al uso de los oligonucleótidos semialeatorios siguientes:

GAGAAGCGTTATNNNNNNNAGGT (SEQ IN NO: 1, X=T)

GAGAAGCGTTATNNNNNNNAGGA (SEQ ID NO: 1, X=A)

GAGAAGCGTTATNNNNNNNAGGC (SEQ ID NO: 1, X=C)

GAGAAGCGTTATNNNNNNNAGGG (SEQ ID NO: 1, X= G)

La comparación con la complejidad de las señales obtenidas utilizando los mismos oligonucleótidos, pero ADNc total como matriz (pocillo 13) demuestra que DATAS ha permitido filtrar ("perfilar") informaciones que corresponden a diferencias cualitativas.

Esta variante se utilizó con el fin de clonar un evento que corresponde al dominio ARN de Grb2 generado por acción de la Rnasa H a partir del dúplex ARN Grb2 / ADNc de hebra simple de Grb33 según el protocolo descrito anteriormente (ejemplo 1.1.). Con este fin, se utilizó un oligonucleótido de secuencia: GAGAAGCGTTATNNNNNNNNTCCC (SEQ ID NO: 2), elegido sobre el modelo GAGAAGCGTTATNNNNNNNWXYZ (en el que N se define como anteriormente, W, X y Y representan cada uno una base fija determinada, y Z representa bien una base determinada o bien un grupo 3'-OH, SEQ ID NO: 3) y seleccionado para amplificar un fragmento en la supresión de Grb2, permitiendo generar un fragmento PCR del cual la clonación y la secuenciación ha demostrado que provenía efectivamente del dominio suprimido de Grb2 (194-281 en Grb2).

Estos dos enfoques permiten por lo tanto la producción de composiciones de ácidos nucleico representativos de los cortes y empalmes diferenciales en las dos situaciones ensayadas que se pueden utilizar como sondas o para construir bancos de ADNc de diferencias cualitativas. La capacidad de la tecnología DATAS a generar bancos perfilados de ADNc representativos de diferencias cualitativas se ilutra igualmente por el ejemplo 1.4.

1.4. Producción de bancos perfilados representativos de células endioteliales humanas

Este ejemplo se realizó a partir de una línea de células endioteliales humanas (ECV304). El análisis cualitativa de la expresión genética se realizó a partir de ARN citosólicos extraídos de células en proliferación, por una parte, y de células en anoikis (apoptosis mediante privación de soporte de unión), por otra parte.

Las células ECV se cultivaron en medio 199 con un suplemento de sales de Earle (Life Sciences). Su puesta en anoikis se realizó mediante paso durante 4 horas sobre cajas de cultivo tratadas con polyHEMA. Durante la preparación de los ARN, las células se lisaron en un tampón que contiene Nonidet P-40. Después, se apartan los núcleos mediante centrifugación. Después, la disolución de extracto citoplásmico se ajusto a fin de fijar de manera específica el ARN a la matriz de sílice Rneasy según las instrucciones de la empresa Qiagen. Tras lavar, los ARN totales se eluyen en agua tratada con DEPC. Los ARN mensajeros se preparan a partir de los ARN totales mediante separación sobre perlas magnéticas Dynabeads oligo (dT)_{25} (Dynal). Tras haber puesto en suspensión las perlas en un tampón de fijación, el ARN total se incuba durante 5 min. a temperatura ambiente. Después de la separación magnética y el lavado, las perlas se recogen en un tampón de elusión para una incubación a 65ºC que libera los ARN mensajeros.

Las síntesis de ADN primer hebra se efectúan a partir de los ARN mensajeros utilizando la retrotranscriptasa SuperScript II o ThermoScript (Life Technologies) con la ayuda de cebadores olido (dT). Después de RnasaH, los nucleótidos libres se eliminan mediante paso sobre columna Sephadex G50 (5 Prime- 3 Prime). Tras extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, las muestras se cuantifican mediante absorbancia UV.

Las cantidades requeridas de ARN y de ADNc (en ocurrencia 200 ng de cada uno) se combinan y se precipitan con etanol. Las muestras se recogen en un volumen de 30 \mul en un tampón de hibridación (Hepes (pH 7,2) 40 mM, NaCl 400 mM, EDTA 1mM) con un suplemento de formamida desionizada (80% (v/v), salvo indicación contraria). Tras desnaturalización 5 min. a 70ºC, las muestras se incuban en la noche a 40ºC.

Las perlas Streptavidina (Dynal) se lavan y después se reacondicionan en un tampón de fijación (2X = Tris-HCI (pH 7,5) 10 mM, NaCl 2M, EDTA 1mM. Las muestras de hibridación se llevan a un volumen de 200 \mul con agua, después se ajustan a 200 \mul de perlas para una incubación de 60 min. a 30ºC. Tras captura sobre imán y lavados de las perlas, estas se recogen en 150 \mul de tampón RnasaH y después se incuban durante 20 min. a 37ºC. Tras captura imán, las regiones no hibridadas se han rechazado en el sobrenadante que se trata con la Dnasa, después se extrae con fenol ácido /cloroformo, y después se precipita con etanol. Las precipitaciones con etanol de baja cantidades de ácidos nucleicos se efectúan con la ayuda de un polímero comercial SeeDNA (Amersham Pharmacia Biotech) permitiendo recuperar de manera cuantitativa ácidos nucleicos a partir de disoluciones muy diluidas (del orden del ng/ml).

La síntesis de ADNc a partir de las muestras de ARN que provienen de la acción de la RnasaH se efectúa a partir de hexanucleótidos aleatorios con la ayuda de Superscript II retrotranscriptasa. Después, el ARN se degrada con la ayuda de una mezcladora de RnasaH y de Rnasa T1. El cebador, los nucleótidos no incorporados y las enzimas se separan del ADNc con la ayuda de un cartucho "GlassMAX Spin". Después, el ADNc que corresponde a los bucles de corte y empalme se somete a una reacción de PCR utilizando oligonucleótidos de tipo semialeatorios ya descrito más arriba en la invención.

En ocurrencia los oligonucleótidos elegidos son:

GAGAAGCGTTATNNNNNCCA (SEQ ID NO: 4)

La reacción de PCR se realiza con la ayuda de Taq Polimerasa sobre 30 ciclos:

\bullet Desnaturalización inicial: 94ºC durante 1 min.

\bullet 94ºC durante 30 seg.

\bullet 55ºC durante 30 seg.

\bullet 72ºC durante 30 seg.

\bullet Extensión final: 72ºC durante 5 min.

Los productos de PCR se clonaron en el vector pGEN-T (Promega) que posee un T flotante en los extremos 3' a fin de facilitar la clonación de fragmentos que provienen de la actividad de la Taq Polimerasa. Tras transformación en las bacterias JM109 competentes (Promega), las colonias obtenidas se repican sobre filtro de nitrocelulosa, y se hibridan con sondas derivadas de productos de PCR efectuadas sobre ADNc totales de las células en proliferación por una parte, y en anoikis por otra parte. Para estos PCR se utilizan los mismos oligonucleótidos GAGAAGCGTTATNNNNNCCA. En una primera realización experimental, se aislaron 34 clones que hibridan preferentemente con la sonda de las células en apoptosis y 13 clones que hibridan preferentemente con la sonda de las células en proliferación.

Entre estos 13 clones, 3 clones contienen el mismo fragmento de ADNc que deriva del dominio SH2 de la proteína SHC.

La secuencia de este fragmento es la siguiente:

CCACACCTGGCCAGTATGTGCTCACTGGCTTGCAGAGTGGGCAGCCAGCCTAAGCATTTGCAC- TGG (SEQ ID NO: 5)

El uso de cebadores de PCR que encuadran el dominio SH2 de SHC (oligo5': GGGACCTGTTTGACATGAAG-
CCC (SEQ ID NO: 6); oligo3': CAGTTTCCGCTCCACAGGTTGC (SEQ ID NO: 7)) ha permitido caracterizar la supresión del dominio SH2 de SHC que se observa específicamente en las células ECV en anoikis. Con esta pareja de cebador, un solo producto de amplificación que corresponde a un fragmento de ADNc de 382 pares de bases que contiene el dominio SH2 integro se obtiene a partir de ARN de células ECV en fase exponencial. Un fragmento adicional de 287 pares de bases se observa cuando la PCR se realiza a partir de ARN de células en anoikis. Este fragmento suplementario deriva de un ARN mensajero derivado del mensajero de SHC pero presenta una supresión.

La secuencia de esta supresión es la siguiente:

GTACGGGAGAGCACGACCACACCTGGCCAGTATGTGCTCACTGG

CTTGCAGAGTGGGCAGCCTAAGCATTTGCTACTGGTGGACCCTGAGGGTGTG (SEQ ID no: 8).

Esta supresión corresponde a las bases 1198 a 1293 de la fase abierta del mensajero que codifica las formas de 52kda y 46kDa de la proteína SHC (Pelicci, G. Et al., 1992, Cell, 70, p 93-104).

Los datos estructurales de los dominios SH2 así como la bibliografía indican que tal supresión lleva a la perdida de la afinidad para las fosfotirosinas puesto que engloba los aminoácidos implicados en las interacciones con la tirosina fosforiladas (Waksman, G. Et al, Nature, vol 358, p 646-653). Siendo las proteínas SHC adaptadores que conectan distintas parejas mediante sus dominios SH2 y PBT (FosfoTirosina Binding domain), esta supresión genera por lo tanto un dominante negativo natural de SHC que se denomina \DeltaSHC. Estando los dominios SH2 de las proteínas cuyos genes se secuencian portados por dos exones, es posible que la supresión identificada mediante el método DATAS corresponde a un exón alternativo del gen SHC.

Las secuencias proteicas y nucleicas de \DeltaSHC son las representadas en la Figura 17 (SEQ ID NO: 9 y 10).

Estando el dominio SH2 de SHC implicado en la transducción de numerosas señales implicadas en la proliferación y la viabilidad celulares, el examen de la secuencia de \DeltaSHC permite anticipar sus propiedades de dominante negativo sobre la proteína SHC y su capacidad de interferir con distintas señales celulares.

La invención se refiere igualmente a esta nueva forma cortada y empalmada de SHC, el dominio proteico que corresponde al corte y empalme, cualquier anticuerpo o sonda nucleica que permita su detección en una muestra biológica, y sus usos diagnóstico o terapéutico, por ejemplo.

La invención se refiere particularmente a cualquier variante de SHC que comprende al menos una supresión que corresponde a las bases 1198 a 1293, más particularmente una supresión de la secuencia SEQ ID NO: 8. La invención se refiere más específicamente a la variante \DeltaSHC que tiene las secuencia SEQ ID NO: 9, codificada por la secuencia SEQ ID NO: 10.

La invención se refiere también a cualquier sonda nucleica, oligonucleótido o anticuerpo que permita identificar la variante \DeltaSHC aquí arriba, y/o cualquier alteración de la relación SHC/\DeltaSHC en una muestra biológica. Puede tratarse especialmente de una sonda u oligonucleótido complementario de todo o parte de la secuencia SEQ ID NO: 8, o de un anticuerpo dirigido contra el dominio proteico codificado por esta secuencia. Tales sondas, oligonucleótidos o anticuerpos permiten detectar la presencia de la forma no cortada y empalmada (por ejemplo, SHC) en una muestra biológica.

Los materiales pueden además ser utilizados en paralelo con sondas, oligonucleótidos y/o anticuerpos específicos de la forma cortada y empalmada (por ejemplo, \DeltaSHC), es decir que corresponde por ejemplo a la región de junción resultante del corte y empalmado (localizado alrededor del nucleótido 1198 de la secuencia SEQ ID NO: 10).

Tales materiales se pueden utilizar para el diagnóstico de patologías relacionadas con una inmunodepresión (cáncer, tratamiento inmunosupresores, SIDA, etc.).

La invención se refiere también a cualquier procedimiento de detección sistemática de moléculas basado sobre el bloqueo (i) del dominio cortado y empalmado en la proteína SHC (especialmente para inducir un estado de tolerancia inmunitaria por ejemplo en las enfermedades auto-inmunes o los rechazos de injertos, y los cánceres) o (ii) ganancias de función adquiridas mediante la proteína \DeltaSHC.

La invención se refiere además al uso terapéutico de \DeltaSHC, y especialmente para el tratamiento de células cancerigenas o de cánceres (ex vivo o in vivo) en los que una hiperfosforilación de la proteína SHC se puede poner en evidencia, por ejemplo. Para ello, la invención se refiere también a cualquier vector capaz de transfectar células cancerigenas o en proliferación, tales como células musculares lisas, células endoteliales (restenosis), fibroblastos (fibrosis), preferentemente de origen mamífera, especialmente humana. Como vector vírico, se pueden citar especialmente vectores adenovíricos, retrovíricos, AAV, herpes, etc.

2. Clonación diferencial de los cortes y empalmes alternativos y otras modificaciones cualitativas de los ARN utilizando ADNc doble hebra (figura 5)

Se producen los ARN mensajeros que corresponden a las situaciones normales (mN) y patológicas (mP), así como los ADN complementarios doble hebra correspondientes (dsN y dsP) mediante protocolos clásicos de biología molecular. Entonces, se obtienen estructuras de tipo "R-loop" hibridando mN con dsP y mP con dsN en una disolución que contiene 70% de formamida. Los dominios nucleicos diferencialmente cortados y empalmados entre la situación N y P quedarán en forma de ADN doble hebra. Entonces, las simples hebras de ADN desplazadas se tratan con glioxal con el fin de evitar el redesplazamiento de la hebra de ARN durante la retirada de la formamida. Tras la retirada de la formamida y del glioxal y tras tratamiento con RnasaH, se encuentra con estructuras de tipo abeja, los ADN de hebra simple no emparejados representan las alas de la abeja y el dominio de doble hebra equipado de interés representa el cuerpo de la abeja. El uso de enzimas que deteriora específicamente el ADN de hebra simple como la nucleasa S1 o la Mung Bean nucleasa permite el aislamiento del ADN que quedo en forma doble hebra que a continuación se clona y después se secuencia. Esta segunda técnica permite la obtención directa de una huela ADN doble hebra del dominio de interés en comparación con el primer protocolo que produce una huela ARN de este dominio.

Este enfoque se realizo sobre el modelo Grb2/Grb33 descrito anteriormente. El AND doble hebra se produzco mediante amplificación PCR a partir del ADNc de hebra simple de Grb2 y de dos cebadores nucleotídicos que corresponden a la secuencia (1-22) de Grb2 y a la secuencia complementaria de (618-639) Grb2. Este fragmento PCR se purifico sobre gel de agarosa, se limpio sobre columna de afinidad (JetQuick, Genomed) y se cuantifico mediante espectrofotometría. Al mismo tiempo, dos ARN sintéticos que corresponden a las fases de lectura de Grb2 y de Grb33 se produjeron a partir de vectores plasmídicos que comportan los ADNc de Grb2 y de Grb33 bajo control del promotor T7, con la ayuda del kit RiboMax (Promega). Los ARN se purificaron según las instrucciones del fabricante y se limpiaron sobre columna de exclusión (Sephadex G50, 5 prime- 3 prime). Se asociaron 600 ng del ADN doble hebra de Grb2 (1-639) con:

1.

3 \mug de ARN de Grb33

2.

3 \mug de ARN de Grb2

3.

agua

en tres reacciones distintas, en el tampón siguiente:

100 mM PIPES (pH 7,2), 35 mM NaCl, 10 mM EDTA, 70% formamida desionizada (Sigma).

Las muestras se llevaron a 56ºC y después se enfriaron a 44ºC mediante incremento de -0,2ºC cada 10 minutos. Después, se conservaron a 4ºC. El análisis sobre gel de agarosa revela modificaciones de migraciones en los pocillos 1 y 2 con relación al pocillo 3 de control (Figura 11A) indicando la formación de nuevos complejos. Después, las muestras se tratan con glioxal desionizado (Sigma) (5% v/v o 1M) durante 2h a 12ºC. Después, los complejos se precipitan con etanol (0,1M NaCl, 2 volumen de etanol), se lavan con etanol 70%, se secan y después se recogen en agua. Finalmente, se tratan mediante la RnasaH (Life Technologies), y después mediante una enzima capaz de deteriorar específicamente el ADN de hebra simple. La nucleasa S1 y la nucleasa "mung Bean" presentan esta propiedad y son disponibles comercialmente (Life Technologies, Amersham). Tales digestiones (incubaciones de 5 minutos en los tampones suministrados con las enzimas) se analizaron sobre gel de agarosa (figura 11B). Se obtienes digestiones significativas únicamente a partir de los complejos que provienen de la reacción 1 (Grb2/Grb33) (figura 11B, pocillo 7 y 10). Estas digestiones parecen más completas con la nucleasa S1 (pocillo 7) que con la nucleasa "Mung Bean" (pocillo 10). Así, la banda que corresponde a un tamaño ligeramente mayor que 100 pares de bases (indicada mediante una flecha en el pocillo 7) se purifico, se clono en el vector pMos-Blue (Amersham), y después se secuencio. Este fragmento corresponde al dominio de 120 pares de bases de Grb2, suprimido en Grb33.

Este enfoque se puede efectuar ahora a partir de una población total de ARN mensajero y de una población total de ADNc doble hebra producida según las técnicas conocidas por el experto en la técnica. La población de ARN de la situación de referencia se híbrida a la población de ADNc doble hebra de la situación de ensayo y recíprocamente. Tras aplicación del protocolo descrito aquí arriba, las digestiones se disponen sobre gel de agarosa con el fin de aislar y purificar las bandas que corresponden a tamaños que varían entre 50 y 300 pares de bases. Después, estas bandas se clonan en un vector (pMos-Blue, Amersham) para dar lugar a un banco de insertados enriquecidos en eventos de diferencias cualitativas.

3. Construcción de bancos que provienen de detección sistemática diferenciales cualitativas

Los dos ejemplos descritos aquí arriba llevan a la clonación de ADNc representativos de todo o parte de las secuencias cortaas y empalmadas diferencialmente entre dos situaciones fisiopatológicas dadas. Estos ADNc permiten la constitución de bancos mediante inserción de estos ADNc en vectores plasmídicos o fágicos. Estos bancos pueden ser presentados sobre filtros de nitrocelulosa o cualquier otro soporte conocido por el experto en la técnica, tales como chips o biochips o membranas. Estos bancos se pueden conservar en frío, protegido de la luz. Estos bancos, una vez dispuestos y fijados sobre soportes mediante técnicas clásicas, se pueden tratar mediante compuestos para eliminar las bacterias hospedantes que permiten la producción de los plásmidos o de los fagos. Igualmente, estos bancos pueden estar constituidos ventajosamente de fragmentos de ADNc que corresponden a los ADNc clonados pero preparados mediante PCR a fin de disponer solo en el filtro las secuencias derivadas de los eventos de cortes y empalmes alternativos.

Una de las características y al mismo tiempo una de las originalidades de la detección sistemática diferencial cualitativa es que esta técnica lleva de manera ventajosa no a uno sino a dos bancos diferenciales ("par de banco") que representan el conjunto de las diferencias cualitativas que existen entre dos situaciones dadas. Particularmente, uno de los bancos de corte y empalme diferencial de la invención representa la firma de las calidades de la situación fisiológica de ensayo con relación a la situación fisiológica de referencia, y el otro banco representa la firma de las calidades de la situación fisiológica de referencia con relación a la situación de ensayo. Esta pareja de bancos es igualmente denominada par de bancos o "banco diferencial de corte y empalme".

Siendo uno de los aportes del corte y empalme diferencial permitir la evaluación del potencial tóxico de un compuesto, tal como se indica en el capítulo siguiente, un buen ejemplo de realización de la tecnología es la obtención mediante DATAS de clones de ADNc que corresponden a secuencias específicas de células HepG2 sin tratamiento, por una parte, y tratadas con etanol, por otra parte. Estas células presentan firmas de citotoxicidad y una degradación de su ADN mediante fragmento internucleosómico a partir de 18h en presencia de 1M de etanol. Con el fin de obtener marcadores precoces de la toxicidad etanólica, los ARN mensajeros se prepararon a partir de células sin tratamiento y de células tratadas durante 18h con etanol con una concentración de 0,1M. Tras realizar la variante de DATAS que utiliza el ADNc de hebra simple y la Rnasa H, los ADNc clonados obtenidos se amplificaron mediante PCR, se sometieron a una electroforesis sobre gel de agarosa y después se transfirieron sobre un filtro de nylon según las técnicas conocidas por el experto en la técnica. Para cada conjunto de clones específicos por una parte de las diferencias cualitativas específicas del estado sin tratamiento y, por otra parte de las secuencias específicas de las células tratadas con etanol, se efectuaron dos réplicas idénticas de filtros. Así, las huelas de cada conjunto de clones se hibridan por una parte con una sonda específica de las células no tratadas y, por otra parte con una sonda específica de las células tratadas con 0,1M de etanol durante 18h.

El perfil de hibridación diferencial obtenido y presentado en la figura 12, permite apreciar la calidad de la sustracción efectuada durante la realización de la técnica DATAS. Así, los clones que provienen de la hibridación del ARNm de células no tratadas (NT) con el ADNc de células tratadas (Tr) y que deben corresponder a diferencias cualitativas específicas de la situación sin tratamiento hibridan preferentemente con una sonda que representa la población total de los ARN mensajeros de las células no tratadas. Recíprocamente, los clones que provienen de los productos resistentes a la Rnasa H habiendo actuado sobre los heterodúplex ARN(Tr)/ADNc(NT) hibridan preferentemente con una sonda derivada de la población total de los ARN mensajeros de las células tratadas.

Los dos conjuntos de clones específicos por una parte de la situación tratada y por otra parte de la situación no tratada representan un ejemplo de bancos de diferencias cualitativas característicos de dos estados celulares distintos.

4. Uso y aportación de los bancos diferenciales cualitativos

Las posibilidades de uso de los bancos diferenciales de corte y empalme de la invención se ilustran especialmente en las Figuras 13 a 15. Así, estos bancos son utilizables para:

4.1. La evaluación del potencial tóxico de un compuesto (figura 13)

En este ejemplo, la situación de referencia se designa por A y la situación tóxica se designa por B. Se obtienen ábacos de toxicidad mediante tratamiento de la situación A en presencia de distintas concentraciones de un compuesto tóxico de referencia, durante periodos variables. En distintos puntos de los ábacos de toxicidad, de bancos diferenciales cualitativos (pares de bancos) se construyen, en este ejemplo, bancos restringidos rA/cB y rB/cA. Los pares de bancos se disponen ventajosamente sobre un soporte. Después, el soporte se híbrida con sondas que provienen de la muestra biológica inicial tratada mediante distintas dosis de compuestos de ensayo: Productos X, Y y Z. La hibridación se revela y hace aparecer el potencial tóxico de los productos de ensayo: en este ejemplo, el producto Z presenta una toxicidad fuerte y el producto Y ofrece un perfil intermedio. La factibilidad de esta constitución de ábacos de toxicidad se ilustra bien por el ejemplo de constitución de bancos de detección sistemática diferencial cualitativo descrito aquí anteriormente y que utiliza el etanol y células HepG2.

4.2. La evaluación de la eficacia de una composición farmacéutica (figura 14)

En este ejemplo, se realiza un par de bancos restringidos según la invención a partir de un modelo patológico B y de un modelo sano A (o del modelo patológico tratado con un producto activo de referencia). Los bancos diferenciales rA/cB son, llegado el caso, dispuestos sobre un soporte. Este par de bancos agrupa las diferencias de corte y empalme entre las dos situaciones. Este par de bancos permite evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo, es decir de determinar su capacidad a generar un perfil de tipo "sano" /rA/cB) a partir del perfil de tipo patológico (rB/cA). En este ejemplo, el par de bancos se híbrida con sondas preparadas a partir de las situaciones A y B con o sin tratamiento mediante el compuesto de ensayo. El perfil de hibridación que se puede obtener se presenta en la figura 14. La factibilidad de esta aplicación es la misma que la de la constitución de bancos de diferencias cualitativas características de situaciones sanas o tóxicas presentadas más arriba. La situación tóxica se sustituye por el estado patológico y se puede apreciar la capacidad de un compuesto de ensayo en producir una sonda que híbrida con más o menos preferencia con las situaciones de referencias o patológicas.

4.3. La anticipación de la respuesta de una muestra patológica a un tratamiento (figura 15)

En este ejemplo, se realiza una par de bancos restringida según la invención a partir de dos modelos patológicos, de los cuales uno responde a un tratamiento mediante un producto dado (el gen p53 salvaje por ejemplo): situación A; y el otro es refractario: situación B. Este par de bancos (rA/cB; rB/cA) se dispone sobre un soporte.

Después, este par de bancos se utiliza para determinar la sensibilidad de una muestra patológica de ensayo a este mismo producto. Para ello, este par de bancos se híbrida con sondas que provienen de biopsias de pacientes de los cuales se quiere anticipar la respuesta al tratamiento de referencia. El perfil de hibridación de una biopsia de respondedor y de una biopsia de no-respondedor se presenta en la figura 15.

4.4. La identificación de ligandos para receptores huérfanos

La activación de receptores membranarios o nucleares mediante sus ligandos podría inducir específicamente desregulaciones en el corte y empalme de algunos ARN. La identificación de estos eventos mediante los métodos DATAS de la invención permite disponer de herramientas (marcadores, bancos, kits, etc.) de seguimiento de activaciones de receptores, utilizables para la búsqueda de ligandos naturales o sintéticos de receptores, en particular huérfanos. Según esta aplicación, se identifican marcadores asociados a las desregulaciones y dispuestas sobre soportes. El ARN total de células, que (sobre)expresan el receptor estudiado, tratadas o no mediante distintas composiciones y/o compuestos de ensayos, se extrae y se utiliza como sonda en una hibridación con los soportes. La puesta en evidencia de una hibridación con algunos, incluso con la totalidad de los marcadores dispuestos sobre el soporte, indica que el receptor estudiado ha sido activado, y por lo tanto la composición/compuesto correspondiente constituye o comprende un ligando de dicho receptor.

4.5. La identificación de dianas de interés terapéutico

Esta se realiza mediante identificación de genes cuyo corte y empalmo se modifica en una patología o en un modelo de patología, y más precisamente la identificación de exones o intrones modificados. Este enfoque debe permitir dar acceso a las secuencias que codifican los dominios funcionales alterados durante patologías o cualquier fenómeno fisiopatológico que dirigen los fenómenos de proliferación, diferenciación o apoptosis, por ejemplo.

Un ejemplo de la aportación de la detección sistemática diferencial cualitativa para la identificación de genes diferencialmente cortados y empalmados se suministra mediante la aplicación de DATAS a un modelo de inducción de apoptosis mediante inducción de la expresión de la forma salvaje de p53. Este modelo celular se estableció mediante transfección de un sistema de expresión inducible para el gen supresor de tumor p53. Con el fin de identificar las diferencias cualitativas asociadas específicamente a la apoptosis inducida por p52, DATAS se realizó a partir de los ARN mensajeros extraídos de células inducidas y no inducidas. Para estos experimentos, se utilizaron 200 ng de ARN polyA+ y 200 ng de ADNc durante la formación de los heterodúplex. Se obtuvieron una centena de clones a partir de cada una de las hibridaciones cruzadas. La hibridación de estos clones bacterianos y después de los fragmentos de ADNc que contienen, con sondas representativas de los ARN mensajeros totales de las situaciones de comienzo ha permitido la identificación de secuencias específicamente expresadas durante la fuerte inducción de p52 que lleva a la muerte celular (figura 16).

Estos fragmentos derivan de secuencias exónicas o intrónicas que modulan la calidad del mensaje presente y permite proponer los dominios funcionales a los cuales participan o que interrumpen como dianas de intervención para inducir o inhibir la muerte celular.

Tal enfoque lleva igualmente a la constitución de un par de bancos que reúnen eventos diferencialmente cortados y empalmados entre una situación no apoptótica y una situación apoptótica. Este par de bancos se puede utilizar para ensayar el poder de hibridación de una sonda derivada de otra situación fisiopatológica o de un tratamiento particular. El resultado de tal hibridación dará indicaciones sobre la inserción eventual del programa de expresión genético de la situación ensayada hacia el apoptosis.

Como destaca de la descripción aquí anteriormente, la invención se refiere igualmente:

-

a cualquier sonda nucleica, cualquier oligonucleótido, cualquier anticuerpo dirigido contra una secuencia identificada mediante la técnica descrita en la presente solicitud, y caracterizados porque permiten caracterizar una situación patológica,

-

al uso de las informaciones que provienen del uso de las técnicas descritas para la búsqueda de moléculas orgánicas con objetivo terapéutico mediante la realización de detección sistemática, caracterizadas porque cogen como diana dominios cortados y empalmados diferencialmente entre una situación sana y una situación patológica, o bien caracterizados porque se basan en la inhibición de las ganancias de funciones adquiridas mediante la proteína que resulta de un corte y empalme diferencial,

-

al uso de las informaciones que provienen de las técnicas descritas en la presente solicitud para aplicaciones de terapia génica,

-

al uso de ADNc transferidos mediante terapia génica, caracterizados porque tienen propiedades antagonistas o agonistas sobre vías de señalización celulares definidas,

-

a cualquier constitución y cualquier utilización de bancos moleculares de exones o de intrones alternativos con fines:

\bullet de diagnóstico o reactivos comerciales para la búsqueda,

\bullet de crear o de buscar moléculas, polipéptidos, ácidos nucleicos para aplicación terapéutica.

-

a cualquier constitución y cualquier utilización de bancos virtuales informáticos que reúnen exones o intrones alternativos, caracterizados porque estos bancos permiten concebir sondas nucleicas o cebadores oligonucleotídicos con el objetivo de caracterizar los cortes y empalmes alternativos que diferencian dos estados fisiopatológicos distintos.

-

a cualquier composición farmacéutica o diagnóstica que comprende polipéptidos, ácidos nucleicos sentido o antisentido, o moléculas químicas capaces de interferir con los productos de corte y empalme alternativos puesto en evidencia y clonados mediante las técnicas de la invención,

-

a cualquier composición farmacéutica o diagnóstica que comprende polipéptidos, ácidos nucleicos sentido o antisentido, o moléculas químicas capaces de restaurar un cortado y empalmado representativo de una situación normal mediante oposición al evento alternativo característico de una situación patológica.

5. Desregulaciones de los mecanismos de corte y empalme de los ARN mediante agentes tóxicos

Este ejemplo muestra que las diferencias de formas y/o de perfiles de cortes y empalmes se pueden utilizar como marcadores para el seguimiento y/o la supresión de toxicidad y/o de eficacia de compuestos.

Los efectos de agentes tóxicos sobre las desregulaciones de cortes y empalmes de los ARN se ensayaron de la manera siguiente. Células hepatocitarias, HepG2, se trataron mediante distintas dosis de tres compuestos tóxicos (etanolm, camptotecina, PMA (forbol 12-miristato 13-acetato)). Dos ensayos de citotoxicidad (Azul de Trypan, MTT) se realizaron en distintos momentos: 4h y 18h para el etanol; 4h y 18h para la camptotecina; 18h y 40h para el PMA.

El Azul de Trypan es un colorante que se puede incorporar mediante las células vivas. Un sencillo cálculo de las células "azules" y "blancas" con microscopio permite determinar el porcentaje de células vivas tras tratamiento o porcentaje de superviviente. Los puntos se efectúan por triplicado.

El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico que mide la capacidad de las células vivas en convertir las sales solubles de tetrazolio (MTT) en un precipitado insoluble de formazano. Estos cristales de formazano, azul oscuro, se pueden disolver y su concentración se puede determinar mediante medida de absorbancia con 550 nm. Así, tras sembrar placas de 24 pocillos mediante 150000 células en la noche, y tras tratamiento de las células mediante los compuestos tóxicos, se añaden 50 \mul de MTT con CO2 (37ºC, 5% CO2, 95% humedad). Tras adición de 500 \mul de disolución de solubilización (Hcl 0,1N en isopropanol-Triton X-100 (10%)), los cristales se disuelven bajo agitación y se miden las absorbencias con 550 a 660 nm. Los puntos se efectúan por triplicado con controles (viabilidad, muerte celular, blancos) apropiados.

Se realizó igualmente un ensayo de apoptosis o muerte celular programada mediante medida de la fragmentación de ADN vía el uso de anticuerpos anti-histona y medidas de ELISA. El ensayo utilizado es el Cell Death ELISA Plus de Roche.

Los resultados de estos tres ensayos /Figuras 18 A, B, C) han permitido determinar que las dosis siguientes:

\bullet etanol: 0,1M

\bullet camptotecina: 1 \mug/ml

\bullet PMA: 50 ng/ml

eran mucho menores que los IC50 medidos.

Así, las células HepG2 se trataron mediante estos tres compuesto con estas tres dosis durante 4h para el etanol y la camptotecina y 18h para PMA. Los ARN mensajeros se purificaron mediante perlas Dynal-Oligo-(dT) a partir de ARN totales purificados según el kit Rneasy (Quiagen). Síntesis de ADNc se efectuaron a partir de estos ARN mensajeros y de la retrotranscriptasa Superscript (Life Technologies) utilizando hexámeros aleatorios como cebadores.

Estas primeras hebras han servido de matrices para reacciones de amplificación mediante PCR (94ºC 1 mn, 55ºC 1 mn, 72ºC 1 mn, 30 ciclos)con la ayuda de los cebadores oligonucleotídicos siguientes:

MACH-\alpha:

5'-TGCCCAAATCAACAAGAGC-3' (SEQ ID NO: 11)

5'-CCCCTGACAAGCCTGAATA-3' (SEQ ID NO: 12)

Estos cebadores corresponden a regiones comunes a las distintas isoformas descritos de MACH-\alpha (1, 2 y 3, amplificando 595, 550 y 343 pares de bases respectivamente). MACH-\alpha (Caspase-8) es una proteasa implicada en la muerte celular programada (Boldin et. al., Cell (1996), 85, 803-815).

BCL-X:

5'-ATGTCTCAGAGCAACCGGAGCTG 3' (SEQ ID NO: 13)

5'-GTGGCTCCATTCACCGCGGGGCTG 3' (SEQ ID NO: 14)

Estos cebadores corresponden a regiones comunes a las distintas isoformas descritos de bcl-X (bcl-X), bcl-Xs, BCL-X\beta) (Boise et al., Cell (1993) 74, 597-608; U72398 (Genbank)), y deben amplificar un fragmento único para estas tres isoformas de 204 pares de bases.

FASR:

5'-TGCCAAGAAGGGAAGGAGT-3' (SEQ ID NO: 15)

5'-TGTCATGACTCCAGCAATAG-3' (SEQ ID NO: 16)

Estos cebadores corresponden a regiones comunes a algunas isoformas de FASR y deben amplificar un fragmento de 478 pares de bases para la forma salvaje de FasR, 452 para la isoforma \Delta8 y 415 para la isoforma \DeltaTM.

Los resultados reportados en la figura 19 indican que:

\bullet

la camptotecina induce una disminución de la expresión de la isoforma MACH-\alpha1 y un aumento de la isoforma MACH-\alpha3.

\bullet

la camptotecina induce la aparición de una nueva isoforma de bcl-X (banda superior del doblete que migra hacia 200 pares de bases).

\bullet

la camptotecina induce una disminución de la forma salvaje del receptor de fas, sustituido por una expresión de una isoforma más corta que puede corresponder a Fas \DeltaTM.

\bullet

el etanol induce la desaparición de bcl-x, sustituido por una isoforma más corta.

\bullet

el etanol induce una aumento de la forma larga, salvaje, del receptor de fas, esto a costa de la isoforma más corta.

Estos resultados demuestran que tratamientos mediante agentes tóxicos con dosis débiles pueden inducir desregulaciones de cortes y empalmes alternativos de algunos ARNs, esto de manera específica. La identificación de estas desregulaciones al nivel post-transcripcional, especialmente mediante la aplicación de la tecnología DATAS permite así definir una herramienta de predicción de la toxicidad de moléculas.

<110> EXONHIT THERAPEUTICS SA

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<120> DETECCIÓN SISTEMÁTICA DIFERENCIAL CUALITATIVA

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<130> B3898B - PB/KM

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<140>

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<141>

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<150> 9802997

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<151> 1998-03-11

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<160> 16

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGO

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagaagcgtt atnnnnnnna ggn

\hfill

23

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<210> 2

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<211> 24

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<212> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGO

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<400> 2

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gagaagcgtt atnnnnnnnn tccc

\hfill

24

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<210> 3

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGO

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<400> 3

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gagaagcgtt atnnnnnnnn nnn

\hfill

23

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<210> 4

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGO

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<400> 4

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gagaagcgtt atnnnnncca

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20

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<210> 5

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<211> 66

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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ccacacctgg ccagtatgtg ctcactggct tgcagagtgg gcagccagcc taagcatttg

\hfill

60

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cactgg

\hfill

66

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<210> 6

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGO

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<400> 6

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gggacctgtt tgacatgaag ccc

\hfill

23

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<210> 7

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGO

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagtttccgc tccacaggtt gc

\hfill

22

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<210> 8

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<211> 96

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtacgggaga gcacgaccac acctggccag tatgtgctca ctggcttgca gagtgggcag

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

cctaagcatt tgctactggt ggaccctgag ggtgtg

\hfill

96

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 441

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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1

2

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<210> 10

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<211> 1326

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

3

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<210> 11

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGO

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgcccaaatc aacaagagc

\hfill

19

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<210> 12

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGO

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

cccctgacaa gcctgaata

\hfill

19

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<210> 13

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGO

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgtctcaga gcaaccggga gctg

\hfill

24

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<210> 14

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGO

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtggctccat tcaccgcggg gctg

\hfill

24

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<210> 15

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial; OLIGO

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgccaagaag ggaaggagt

\hfill

19

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<210> 16

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: OLIGO

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<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgtcatgact ccagcaatag

\hfill

20

Claims (39)

1. Procedimiento para identificar y/o clonar regiones de ácidos nucleicos representativas de diferencias genéticas cualitativas entre dos muestras biológicas, que comprende una etapa de hibridación entre los ARN o ADNc de doble hebra, que provienen de una primera muestra biológica, y los ADNc que provienen de una segunda muestra biológica, e identificar y/o clonar, a partir de complejos formados mediante hibridación, regiones de ácidos nucleicos no emparejadas, comprendiendo dichas regiones ácidos nucleicos representativos de diferencias genéticas cualitativas entre las dos muestras.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende:

(a)

hibridar los ARN que provienen de la primera muestra (situación de ensayo) con los ADNc que provienen de la segunda muestra (situación de referencia);

(b)

hibridar los ARN que provienen de la segunda muestra (situación de referencia) con los ADNc que provienen de la primera muestra (situación de ensayo); e

(c)

identificar y/o clonar, a partir de los híbridos formados en (a) y (b), ácidos nucleicos que corresponden a diferencias genéticas cualitativas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las hibridaciones se realizan entre ARN y ADNc de hebra simple, y porque comprende identificar y/o clonar regiones de ARN no emparejadas.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende hibridar los ADNc de doble hebra, que provienen de una primera muestra biológica, y los ADNc de hebra simple, que provienen de una segunda muestra biológica.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque la clonación de los ácidos nucleicos comprende la retrotranscripción y/o la amplificación por medio de cebadores aleatorios o semialeatorios, en particular de cebadores de secuencia GAGAAGCGTTATNNNNNNNWXYZ, en la que N indica que cada una de las cuatro bases puede estar presente de manera aleatoria en la posición indicada, W, X e Y designan cada uno una base determinada, y Z designa una base determinada o bien un grupo 3'-OH.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la muestra biológica está compuesta de células, de un tejido, de un órgano o de una biopsia.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, para identificar y/o clonar cortes y empalmes alternativos diferenciales entre células tumorales y células no tumorales.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, para identificar y/o clonar cortes y empalmes alternativos diferenciales entre células tratadas mediante un compuesto de ensayo y células no tratadas.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, para identificar y/o clonar cortes y empalmes alternativos diferenciales entre células en apoptosis y células no apoptópicas.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la hibridación se realiza en fase líquida.

11. Procedimiento para identificar y/o clonar regiones de ácidos nucleicos cortadas y empalmadas diferencialmente entre dos situaciones fisiológicas A y B, que comprende:

(a) por una parte, formar heterodúplex en fase líquida entre los ARN mensajeros que provienen de la situación A y los ADNc que provienen de la situación B;

(b) por otra parte, formar heterodúplex en fase líquida entre los ARN mensajeros que provienen de la situación B y los ADNc que provienen de la situación A; y

(c) identificar y/o clonar las regiones de ARN no emparejadas en los heterodúplex obtenidos en (a) y en (b).

12. Procedimiento para identificar y/o clonar regiones de ácidos nucleicos cortadas y empalmadas diferencialmente entre dos situaciones fisiológicas A y B, que comprende:

(a) por una parte, formar heterodúplex entre los ARN mensajeros que provienen de la situación A y los ADNc que provienen de la situación B, estando los ARN o los ADNc inmovilizados sobre un soporte;

(b) por otra parte, formar heterodúplex entre los ARN mensajeros que provienen de la situación B y los ADNc que provienen de la situación A, estando los ARN o los ADNc inmovilizados sobre un soporte; y

(c) identificar y/o clonar las regiones de ARN no emparejadas en los heterodúplex obtenidos en (a) y en (b).

13. Procedimiento para preparar una composición que comprende un soporte sobre el cual se presentan ácidos nucleicos, que comprende:

-

preparar ácidos nucleicos distintos que comprenden una secuencia complementaria y específica de exones o de intrones alternativos distintos de genes o de ARNm característicos de una situación fisiológica, siendo dichos exones o intrones identificables especialmente según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y

-

presentar estos ácidos nucleicos sobre un soporte.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque los ácidos nucleicos comprenden ADNc.

15. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque los ácidos nucleicos comprenden oligonucleótidos.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque los ácidos nucleicos comprenden oligonucleótidos específicos de regiones de unión entre dos dominios separados mediante un dominio cortado y empalmado.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque los oligonucleótidos son de hebra simple, y poseen una longitud comprendida entre 5 y 100 mer.

18. Procedimiento según la reivindicación 15, 16 ó 17, caracterizado porque dichos oligonucleótidos se obtienen mediante un procedimiento que comprende:

(a) identificar un suceso de corte y empalme característico de una situación fisiopatológica, y la secuencia del dominio cortado y empalmado;

(b) sintetizar artificialmente uno o varios oligonucleótidos que corresponden a una o varias regiones de este dominio;

(c) sintetizar artificialmente uno o varios oligonucleótidos que corresponden a la región de unión entre los dos dominios separados mediante el dominio cortado y empalmado; y

(d) repetir las etapas (a) a (c) anteriores con otros sucesos de corte y empalme característicos de dicha situación fisiopatológica.

19. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque los ácidos nucleicos se clonan en vectores.

20. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque la situación fisiopatológica se selecciona de entre la apoptosis, la neurodegeneración, la toxicidad y la proliferación.

21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 20, caracterizado porque el soporte está compuesto de un filtro, de una membrana o de un chip.

22. Uso de una composición obtenida mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 21 para identificar moléculas de interés terapéutico o diagnóstico.

23. Uso de una composición obtenida mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 21 para identificar proteínas o dominios proteicos afectados en una patología.

24. Uso según la reivindicación 13, para identificar dominios antigénicos específicos de proteínas implicadas en una patología.

25. Uso según la reivindicación 22, para evaluar la toxicidad de un compuesto.

26. Uso según la reivindicación 22, para evaluar la eficacia terapéutica de un compuesto.

27. Uso según la reivindicación 22, para evaluar la respuesta de un paciente a un compuesto o tratamiento de ensayo.

28. Uso de una composición que comprende un conjunto de oligonucleótidos de hebra simple distintos, de una longitud comprendida entre 5 y 100 mer, que comprende una secuencia complementaria y específica de exones o de intrones alternativos distintos de genes o de ARNm característicos de una situación fisiológica, siendo dichos exones o intrones identificables especialmente según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para determinar la capacidad de un sujeto para responder a un compuesto o tratamiento dado.

29. Uso de una composición que comprende un conjunto de oligonucleótidos de hebra simple distintos, de una longitud comprendida entre 5 y 100 mer, que comprende una secuencia complementaria y específica de exones o de intrones alternativos distintos de genes o de ARNm característicos de una situación fisiológica, siendo dichos exones o intrones identificables especialmente según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para determinar la predisposición de un sujeto a una patología.

30. Uso de una composición que comprende un conjunto de oligonucleótidos de hebra simple distintos, de una longitud comprendida entre 5 y 100 mer, que comprende una secuencia complementaria y específica de exones o de intrones alternativos distintos de genes o de ARNm característicos de una situación fisiológica, siendo dichos exones o intrones identificables especialmente según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para determinar la toxicidad de un compuesto o tratamiento.

31. Uso según una de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque los oligonucleótidos se utilizan como cebadores.

32. Uso según una de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizado porque los oligonucleótidos son específicos de regiones de unión entre dos dominios separados mediante un dominio cortado y empalmado.

33. Procedimiento para determinar o evaluar la toxicidad de un compuesto de ensayo sobre una muestra biológica dada, que comprende hibridar:

-

una composición obtenida mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 21, comprendiendo dicha composición ácidos nucleicos específicos de exones o de intrones alternativos de genes o de ARNm característicos de dicha muestra biológica no tratada y en estado sano, y de dicha muestra biológica en uno o distintos estados de toxicidad que resulta de un tratamiento de dicha muestra con un compuesto tóxico de referencia, con

-

una preparación de ácidos nucleicos de la muestra biológica tratada mediante dicho compuesto de ensayo, y

-

evaluar el potencial tóxico del compuesto de ensayo analizando el grado de hibridación de dicha preparación con dicha composición.

34. Procedimiento según la reivindicación 33, caracterizado porque la muestra biológica es un cultivo de hepatocitos, de células epiteliales renales o de células endoteliales, tratada o no mediante un agente tóxico.

35. Procedimiento según la reivindicación 33, caracterizado porque la muestra biológica es un cultivo de piel tratado o no mediante agentes tóxicos o irritantes.

36. Procedimiento para determinar o evaluar la eficacia terapéutica de un compuesto de ensayo sobre una muestra biológica dada, que comprende hibridar:

-

una composición obtenida mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 21, comprendiendo dicha composición ácidos nucleicos específicos de exones o de intrones alternativos de genes o de ARNm característicos de dicha muestra biológica no tratada, y de una muestra biológica tratada con un compuesto terapéutico de referencia, con

-

una preparación de ácidos nucleicos de la muestra biológica tratada mediante dicho compuesto de ensayo, y

-

evaluar el potencial terapéutico del compuesto de ensayo analizando el grado de hibridación de dicha preparación con dicha composición.

37. Procedimiento para determinar o evaluar la respuesta de un paciente a un compuesto o tratamiento de ensayo, que comprende:

-

hibridar una preparación de ácidos nucleicos de una muestra biológica patológica de dicho paciente con una composición obtenida mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 21, comprendiendo dicha composición ácidos nucleicos específicos de exones o de intrones alternativos de genes o de ARNm característicos de una muestra biológica que responde a dicho compuesto/tratamiento, y de una muestra biológica que no responde o que responde mal a dicho compuesto/tratamiento, y

-

evaluar la respuesta del paciente analizando el grado de hibridación de dicha preparación con dicha composición.

\newpage

38. Procedimiento según la reivindicación 37, para determinar o evaluar la respuesta de un paciente a un compuesto o tratamiento antitumoral.

39. Procedimiento según la reivindicación 38, para determinar o evaluar la respuesta de un paciente a un tratamiento antitumoral mediante transferencia del gen p53 salvaje.