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EP3475750B1 - Beleuchtungsvorrichtung für ein mikroskop - Google Patents

Beleuchtungsvorrichtung für ein mikroskop Download PDF

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Publication number
EP3475750B1
EP3475750B1 EP17730519.0A EP17730519A EP3475750B1 EP 3475750 B1 EP3475750 B1 EP 3475750B1 EP 17730519 A EP17730519 A EP 17730519A EP 3475750 B1 EP3475750 B1 EP 3475750B1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
illumination light
partial
light beams
excitation
partial illumination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
EP17730519.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
EP3475750A1 (de
Inventor
Florian Fahrbach
Lars Friedrich
Werner Knebel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Publication of EP3475750A1 publication Critical patent/EP3475750A1/de
Application granted granted Critical
Publication of EP3475750B1 publication Critical patent/EP3475750B1/de
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/10—Beam splitting or combining systems

Definitions

  • the invention relates to a lighting device for a microscope for generating a de-excitation or switching light distribution with a light source which generates a primary illuminating light beam.
  • the invention also relates to a microscope with such an illumination device and a method for imaging, in particular for super-resolution imaging, of a sample using a microscope of such an illumination device.
  • the SPIM technology Single Plane Illumination Microscopy
  • the sample is illuminated in layers perpendicular to the detection axis
  • a well-known area of application for SPIM technology is in fluorescence microscopy, where fluorophores in the sample are excited with laser light.
  • an excitation takes place only in one of an illuminating light sheet (also known as a "light strip"). This avoids damage to the sample by illuminating light in other planes.
  • An optical device operating according to the SPIM method is shown in DE 102 57 423 A1 described.
  • a specimen is illuminated with a thin sheet of light while the observation is made from a direction perpendicular to the plane of the sheet of light that illuminates.
  • the lighting and the detection take place via two separate optical beam paths, each with separate optics.
  • the light sheet is generated by a cylinder lens.
  • the sample is moved through the light sheet, which is fixed with respect to the detector, in order to record fluorescent and / or scattered light in layers with a flat detector.
  • the slice image data obtained in this way can then be combined to form a data record corresponding to a three-dimensional image of the sample.
  • Out DE 10 2007 015 063 A1 is an optical arrangement with a light source for Emission of a light beam and known with optical elements for converting this light beam into the shape of a light sheet.
  • the optical arrangement is particularly suitable for illuminating individual planes of a three-dimensional sample in Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM).
  • SPIM Selective Plane Illumination Microscopy
  • a SPIM microscope which is provided with a y-direction illumination source and a z-direction detection light camera.
  • An x-scanner creates a sequential lightsheet (light sheet) by scanning the illuminating light beam in the x-direction.
  • the focal length of the illuminating light beam can be varied by means of illuminating optics with zoom optics arranged in the beam path of the illuminating light beam.
  • de-excitation beam It is preferably a de-excitation beam whose cross-section has been changed in such a way that it has 2 maxima, which are in the z-direction seen in front of and behind the center of the excitation beam and the de-excitation beam has a zero point there.
  • a laser scanning microscope is known with an illumination device which emits a pulsed illumination beam.
  • a polarization beam splitter is provided which generates two partial beam paths which have different light paths.
  • the partial beams propagating in the two partial beam paths are recombined by means of a combining element.
  • a phase element is arranged in one of the two partial beam paths, which has at least two areas with different phase influences.
  • US 2011/215258 A1 describes a method for collimated microscope imaging in which, in a first step, a sample area is excited to emit fluorescence radiation. In a second step, the aforementioned sample area is separated into several sub-areas by means of appropriate illumination, this separation being carried out by intermediate areas in which the intensity of the fluorescence radiation is reduced or the fluorescence radiation has other properties.
  • STED-like approaches such as GSD (ground state depletion) or RESOLFT (reversible saturable optical (fluorescence) transitions) also aim to achieve imaging or structure production below the diffraction limit with visible light by emitting fluorescence in the edge area of the Excitation light bundle is suppressed by switching or transferring the fluorophores into the dark state.
  • GSD ground state depletion
  • RESOLFT reversible saturable optical (fluorescence) transitions
  • a symmetrical, ring-shaped beam is usually generated with the fluorophores through stimulated emission (STED), ground state depletion / conversion of the fluorophores into a (dark) triplet state (GSD) , or prevented by molecular conformational change / switching (RESOLFT) from absorbing the photons irradiated with a second wavelength and / or then emitting fluorescence.
  • STED stimulated emission
  • GSD ground state depletion / conversion of the fluorophores into a (dark) triplet state
  • RESOLFT molecular conformational change / switching
  • an element located centrally on the optical axis is usually used, which manipulates the de-excitation or switching beam in such a way that the result is a symmetrical, ring-shaped beam in the area of the sample.
  • the object is achieved according to claim 1 by a lighting device of the type mentioned at the beginning.
  • the lighting device according to the invention has the very special advantage that the de-excitation or switching light distribution generated with it in the area of the sample can be easily and efficiently adapted to the respective specific requirements, in particular in the case of a SPIM microscope .
  • An essential idea of the invention here is to generate the de-excitation or switching light distribution through the interference of two partial illuminating light bundles, which run separately from one another through the entrance pupil of the illuminating objective and which, after passing through the illuminating objective, are spatially superimposed on and / or in the sample.
  • the spatial distance between the partial illuminating light bundles in the area of the entrance pupil results in the partial illuminating light bundles being tilted towards one another after passing through the illumination objective and thus into the Penetrate the sample volume. Due to the relative phase shift of the partial illuminating light bundles by ⁇ , the interference pattern that occurs in the area of the superposition has a zero point along the optical axis.
  • de-energizing or switching dyes in SPIM microscopy design the de-energizing or switching light distribution in such a way that in the area of the spatial superimposition of the partial illuminating light bundles along a plane, in which lies the optical axis, has a flat zero point.
  • the invention is based in particular on the idea of minimizing the number of fluorophores to be de-energized (intensity minimum). In the following, an intensity minimum is therefore sometimes used synonymously instead of a zero.
  • phase shift by ⁇ is preferably not impressed centrally on a single illuminating light beam.
  • two initially spatially separated partial illuminating light bundles are generated from a primary illuminating light bundle, which have a phase offset of ⁇ to one another in the entrance pupil of the illuminating objective and which then interfere on the sample or in the sample volume.
  • phase influencing means and the beam splitting device are formed by the same optical component, and it can also be provided in particular that the optical component effects both the division of the primary illumination light bundle into the two partial illumination light bundles and the relative phase offset of the partial illumination light bundles to one another .
  • phase influencing means as a separate component from the beam splitting device in the beam path of one of the Partial illuminating light bundle is arranged.
  • a correspondingly suitable optical element only needs to be arranged in the beam path of one of the partial illuminating light bundles.
  • each of the partial illuminating light bundles runs through its own of two crescent-shaped parts of the entrance pupil.
  • the crescent-shaped part is illuminated with the respective partial illuminating light bundle, which can be achieved, for example, in that each partial illuminating light bundle has a diameter in the area of the entrance pupil that is smaller than the radius of the entrance pupil.
  • the entrance pupil is preferably not fully illuminated.
  • phase difference by ⁇ can, as will be explained in more detail below, for example by a phase plate, especially arranged in the entrance pupil, with two optically differently retarding segments, one of the partial illuminating light bundles through one segment and the other of the partial illuminating light bundles through the other Segment runs.
  • the phase plate can be permanently installed in the illumination objective.
  • this structural integration is possible in particular because - unlike in confocal microscopy - the illumination objective is typically not also used for detection.
  • the phase plate would otherwise have an adverse effect on the image quality if it is installed in an objective that is used for detection.
  • An embodiment is particularly easy to implement in which the partial illuminating light bundles in the area of the entrance pupil are parallel to one another run and / or in which the directions of propagation of the partial illuminating light bundles are aligned parallel to one another in the region of the entrance pupil.
  • the partial illuminating light bundles do not run parallel to one another in the area of the entrance pupil. If the partial illuminating light bundles in the pupil do not run parallel to the optical axis, then they also do not interfere in the focal plane of the illuminating objective (in the Fourier plane), but in front of or behind it. In this respect, an axial shift of the focus can advantageously be achieved by tilting the partial illuminating light bundles.
  • the partial illuminating light bundles can be coupled into the illuminating objective not symmetrically with respect to the optical axis and / or in a tilted manner with respect to one another. In this way, an asymmetrical interference pattern can be achieved, which can be desirable for certain examination situations.
  • At least one setting means is present with which the position of the partial illumination light bundles in the area of the entrance pupil and / or the position of at least one of the partial illumination pupil relative to the optical axis of the illumination light objective and / or the shape of the partial illumination light bundle in the area of the Entry pupil and / or the divergence of the partial illumination light bundles in the area of the entrance pupil and / or the distance between the partial illumination light bundles in the area of the entrance pupil and / or the diameter of the partial illumination light bundle in the area of the entrance pupil is adjustable.
  • the two partial beams form a strip-shaped interference pattern.
  • the distance and the dimensions of the partial beams in the pupil can in particular be selected to be fixed or freely adjustable.
  • the diameter and the spacing of the partial illuminating light bundles are matched to one another in such a way that the interference pattern of the two partial beams consists of only two symmetrically located around a zero point Intensity maxima exist.
  • the beam diameter can be increased in order to increase the width of the interference pattern.
  • the number of intensity maxima and zeros increases, with the intensity reached in the maxima decreasing symmetrically towards the edge.
  • the distance between the two partial illuminating light bundles in the area of the pupil can be adjusted.
  • the de-excitation or switching light distribution can be tilted relative to the optical axis of the illumination objective.
  • the setting means in particular for setting the distance and / or the positions of the partial illuminating light bundles, has at least one beam-deflecting element that can be adjusted with regard to the deflection angle that causes it.
  • This can be a tiltable mirror, for example.
  • An embodiment in which the beam-deflecting element has at least one remotely controlled, motor-driven mirror is particularly advantageous.
  • the setting means in particular for setting the distance and / or the positions of the partial illuminating light bundles, has at least one tiltably mounted and / or remotely controlled motorized movable grid.
  • the setting means can be designed to effect a beam offset, in particular a parallel offset.
  • the setting means can have, for example, a rotatably mounted, plane-parallel plate in the beam path of one of the partial illuminating light bundles, or two tiltable mirrors connected one behind the other.
  • the setting means in particular for setting the distance and / or the positions of the partial illuminating light bundles, has at least one active optical element.
  • This can be, for example, an SLM (spatial light modulator) or a DMD (digital micromirror device).
  • the setting means in particular for setting the distance and / or the position of the partial illuminating light bundles, has at least one acousto-optical component.
  • the acousto-optical component can be designed as an AOD (acoustooptical deflector) or as an AOM (acoustooptical modulator).
  • the setting means can also have an AOTF (acoustooptical tunable filter) which is controlled in such a way that a polarization-dependent phase delay occurs by means of a birefringent material due to a change in polarization of the first diffraction order compared to the zeroth diffraction order.
  • the setting means in particular for setting the distance and / or the position of the partial illumination light bundles, to have two diaphragms which can be adjusted with regard to their distance and / or position, which are in the entrance pupil of the illumination objective or in one to the entrance pupil conjugate plane are arranged.
  • the procedure here can advantageously be such that the diaphragms are overlit with the partial illuminating light bundles, so that only the part of the partial illuminating light bundles passing through the diaphragms reaches the illuminating objective.
  • the part of the respective partial illuminating light bundle that reaches the illuminating lens is also displaced.
  • the diaphragms can also be designed to be adjustable with regard to their opening diameter.
  • it can be iris diaphragms.
  • the lateral dimensions of the partial illuminating light bundles can advantageously also be adjusted with such diaphragms.
  • the diaphragms, in particular iris diaphragms, can also be integrated into the illumination objective.
  • the setting means in particular for setting the lateral dimensions, in particular the diameter, of the partial illuminating light bundles, has one with regard to the magnification, in particular remotely controlled, adjustable beam expander in the beam path at least one of the partial illuminating light bundles.
  • setting means in particular for setting the lateral dimensions of the partial illuminating light bundles, to have at least one lens with a variable focal length.
  • the partial illuminating light bundles are collimated in the area of the entrance pupil.
  • An embodiment of the lighting device is particularly advantageous in which the convergence or divergence of the partial illuminating light bundles can be adjusted by means of an adjusting means. By adjusting the convergence or divergence of the partial illumination light bundles, the position of the beam waist of the de-excitation or switching light distribution can be shifted relative to the focal plane of the illumination objective.
  • the partial illumination light bundles can be designed as Gaussian light bundles, in particular in the entrance pupil. However, this is not absolutely necessary.
  • the partial illuminating light bundles can alternatively also be designed as flat-top beams.
  • a particularly robust and easy-to-implement procedure for generating the two partial illuminating light bundles consists in arranging a binary grating in a plane conjugate to the focal plane of the illuminating objective.
  • the binary grid can be imagined as a superposition of two blazed grids (blazed grids), the phase of which is opposite to each other and shifted by ⁇ against each other.
  • Such binary grids can be produced simply as static, diffractive elements, a spacing of the partial illuminating light bundles that is suitable for the desired application can be generated by appropriately selecting and / or setting the period of the grating.
  • Such a grating in an embodiment as a modulator (e.g.
  • LCoS-SLM or ferroelectric SLM represents a particularly flexible solution for setting the distance between the partial illumination light bundles in the pupil To change the amplitude of the partial illuminating light beam.
  • the depth of focus of the de-excitation or switching light distribution could therefore be flexibly adjusted by means of a modulator.
  • the beam splitting device has at least one grating and / or that the beam splitting device has at least one phase grating.
  • the beam splitting device has a binary grating and / or that the beam splitting device has a superposition grating which corresponds to the superposition of two grids oriented in opposite directions with regard to their phase delay distribution.
  • An embodiment in which the beam splitting device has a grating that can be adjusted with regard to the grating period is particularly advantageous.
  • the partial illuminating light bundles in the area of the sample and / or area of the entrance pupil can be elliptical in cross section and / or as a light sheet. This can be achieved, for example, by using anamorphic optics in the beam path.
  • a laser beam can be imaged onto the grid with a cylindrical lens.
  • a microscope which has an illumination device according to the invention is particularly advantageous.
  • Such a microscope can have a further light source (2) which generates an excitation light beam for illuminating the sample.
  • the excitation light bundle is used to excite fluorescence in the sample.
  • the light source (2) which already provides the light for the de-excitation or switching light distribution, also generates the excitation light.
  • the light source (2) for this purpose can be designed as a multi-wavelength light source, in particular as a white light source.
  • the excitation light bundle can in particular be designed as an excitation light sheet.
  • the de-excitation or switching light distribution has two de-excitation or switching light light sheets parallel to the excitation light sheet, which are arranged on both sides of the excitation light sheet.
  • the distance between these two de-excitation or switching light sheets can be adjusted by adjusting the distance between the partial illumination light bundles, the depth of field being that of the De-excitation light sheet can be compensated for by appropriately changing the diameter of the partial illumination light bundle in the pupil.
  • the excitation light bundle in particular designed as an excitation light sheet, causes fluorescence excitation of the sample, while with the de-excitation or switching light distribution, a stimulated emission and / or a ground state depletion or a change in conformity or a switching of fluorophores (im Edge area of the excitation light sheet) is effected.
  • Figure 1 shows a schematic representation of an embodiment of a lighting device according to the invention for a microscope for generating a de-excitation or switching light distribution 1.
  • the lighting device contains a light source 2, which can be designed as a laser, for example, and which generates a primary illuminating light bundle 3.
  • the light source 2 is followed by a variable beam expander 4 and cylinder optics 5.
  • the cylinder optics 5 forms the primary illumination light bundle 3 like a light sheet.
  • the cylinder optics 5 is followed by a beam splitting device 6 which spatially divides the primary illuminating light bundle 3 into a first partial illuminating light bundle 7 and a second partial illuminating light bundle 8.
  • a phase influencing means 9 is arranged in the beam path of the first partial illuminating light bundle 7, which influences the phase of the first partial illuminating light bundle 7 in such a way that the two partial illuminating light bundles 7, 8 have a phase offset of ⁇ in the area of their later spatial superposition.
  • the lighting device has an illumination objective 10, which has the partial illumination light bundles 7, 8 and / or in a (in Figure 1 (not shown) focused sample, wherein the partial illuminating light bundles 7, 8 run spatially separated from one another through the entrance pupil of the illuminating objective 10 and, after passing through the illuminating objective 10, are spatially superimposed on and / or in the sample, so that the desired de-excitation or switching light distribution 1 occurs Interference arises.
  • the lighting device shown schematically is particularly suitable for use in a SPIM microscope. It is of course also possible to generate a de-excitation or switching light distribution for a line scanning system (DSLM). In particular, cylinder optics 5 can be dispensed with here.
  • DSLM line scanning system
  • FIG. 2 shows an exemplary embodiment relating to the generation of a de-excitation or switching light distribution 1 for a line-scanning system
  • FIG Figure 2a schematically, the phase plate 11 arranged in the entrance pupil of the illumination objective is shown.
  • the phase plate 11 has two segments 12, 13, the segments 12, 13 being designed differently relative to one another, namely in such a way that light that passes through the first segment 12 has a phase difference of ⁇ relative to light that passes through the segment 13 having.
  • phase 0 can be assigned to first segment 12 and phase ⁇ to second segment 13.
  • Figure 2b shows a plan view of the plane of the entrance pupil of the illumination objective 10 and illustrates the intensity distribution of the partial illumination light bundles 7, 8 at the location of the entry pupil of the illumination objective 10 second segment 13 of the phase plate 11. It can be clearly seen that each partial illumination light bundle 7, 8 in the area of the entrance pupil has a diameter that is smaller than the radius of the entrance pupil 14. The partial illumination light bundles 7, 8 have a relative spacing in the z-direction 15 to each other.
  • Figure 2c shows the intensity distribution of the de-excitation or switching light distribution resulting from the interference of the two partial illuminating light bundles 7, 8 after passing through the illuminating objective (perpendicular to the direction of propagation along the y-axis).
  • the de-excitation or switching light distribution 1 has two intensity maxima 16, 17 between which there is an intensity minimum 18.
  • the distance 19 of the intensity maxima 16, 17 can be adjusted by changing the distance between the partial illumination light bundles 7, 8 at the location of the entrance pupil 14.
  • the width of the intensity maxima 16, 17 of the de-excitation or switching light distribution adjoining the central intensity minimum 18 can be adjusted.
  • the Figures 3a to 3c illustrate by way of example the generation of a de-excitation or switching light distribution 1 for static lighting, in particular in SPIM microscopy.
  • a phase plate 11 is used, which has two segments 12, 13 and one Phase difference of the partial illuminating light bundles 7, 8 caused by ⁇ .
  • light sheet-like partial illuminating light bundles 7, 8 can be generated in the entrance pupil 14.
  • Figure 3c shows the intensity distribution of the de-excitation or switching light distribution 1, which results from the interference of the partial illuminating light bundles 7, 8 after passing through the illuminating objective in the sample.
  • the de-excitation or switching light distribution has two intensity maxima 16, 17, which are designed like a light sheet (parallel to the XY plane). Between the two intensity maxima 16, 17 there is an area-like intensity minimum 18.
  • a sample is illuminated with an excitation light sheet to cause fluorescence excitation, which is arranged in the area of the intensity minimum 18 of the de-excitation or switching light distribution 1 and which is to is superimposed on both sides by the parallel arranged intensity maxima 16, 17 of the de-excitation or switching light distribution 1 in order to limit the emission of fluorescent light along z and in particular to achieve over-resolution, i.e. a resolution that goes beyond the classic limitation of light microscopy, along z.
  • the distance 19 of the intensity maxima can be set by adjusting the distance 15 between the partial illuminating light bundles 7, 8.
  • Figure 4 shows an example of an advantageous combination of excitation light distribution 20 and de-excitation or switching light distribution 1.
  • the intensity is plotted as a function of location. It can be seen that the width of the de-excitation or switching light distribution 1 covers the entire width of the excitation light distribution 20.
  • FIG. 5 shows Figure 5 a suboptimal adaptation of the distribution of excitation light 20 on the one hand and of de-excitation or switching light 1. It can be seen that the width of the too narrow de-excitation or switching light distribution 1 does not cover the entire width of the excitation light distribution 20, so that of the Areas laterally outside the two intensity maxima of the de-excitation or switching light distribution 1, disadvantageously, fluorescence radiation caused by the excitation light is to be expected, which negatively affects the goal of achieving over-resolution.
  • the distance between the maxima 16, 17 of the de-excitation or switching light distribution 1 and the steepness of the edges of the de-excitation or switching light distribution 1 can be adjusted.
  • a very special advantage of this is that the depth of field can be set independently of the distance between the maxima 16, 17.
  • Figure 6 shows a very schematic representation of a possible structure for generating two partial illuminating light bundles 7, 8, which have a phase difference of ⁇ relative to one another.
  • the phase influencing means 9 and the beam splitting device 6 are formed by the same optical component, namely by a rectangular phase grating 22, the rectangular phase grating 22 both dividing the primary illuminating light bundle 3 (not shown in this figure) into the two partial illuminating light bundles 7, 8 as well as the relative phase shift of the partial illuminating light bundles 7, 8 to one another.
  • the rectangular phase grating 22 is arranged in a first plane 23.
  • the rectangular phase grating 22 can be designed as a binary grating.
  • the binary grid can be imagined as the superposition of two blazed gratings, whose phase runs in opposite directions and is shifted by ⁇ from one another, which is shown in Figure 7 is shown.
  • the first plane 23 is a plane corresponding to the focal plane 24 of the illumination objective 10, while the plane 21 of the entrance pupil of the illumination objective 10 is a Fourier plane to the first plane 23 and to the focal plane 24.
  • the mode of operation of the rectangular phase grating 22 can be clearly illustrated as follows: If, in a first step, one imagines a prism instead of the rectangular phase grating 22, it becomes clear that such a prism would deflect the incident primary illuminating light beam away from the optical axis.
  • the prism can be replaced by a Fresnel prism, which consists of a large number of shorter prisms of the same size. As a result, there is the same effect of deflecting the primary illuminating light beam away from the optical axis.
  • a Fresnel prism rotated by 180 ° would deflect the incident primary illuminating light bundle in the opposite direction away from the optical axis.
  • Rectangular phase grating 22 shown on the right, which is arranged in plane 23.
  • an acousto-optical grating which can be generated with an AOD, for example, could also be used.
  • the de-excitation or switching light distribution 1 is shown in the focal plane 24 on the far right. It can be seen that the generated de-excitation or switching light distribution 1 has two intensity maxima 16, 17, between which an intensity minimum 18 is arranged.

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Description

  • Die Erfindung betrifft eine Beleuchtungsvorrichtung für ein Mikroskop zum Erzeugen einer Abregungs- oder Schaltlichtverteilung mit einer Lichtquelle, die ein Primärbeleuchtungslichtbündel erzeugt.
  • Die Erfindung betrifft außerdem ein Mikroskop mit einer solchen Beleuchtungsvorrichtung und ein Verfahren zum Abbilden, insbesondere zum überauflösenden Abbilden, einer Probe unter Verwendung eines Mikroskops einer solchen Beleuchtungsvorrichtung.
  • Die SPIM-Technik (Single Plane Illumination Microscopy), bei der eine schichtweise Beleuchtung der Probe senkrecht zur Detektionsachse erfolgt, erlaubt eine schnellere und probenschonendere Erfassung von Bilddaten, als beispielsweise bei einer punktweisen Abtastung einer Probe. Ein bekanntes Einsatzgebiet der SPIM-Technologie ist der Bereich der Fluoreszenz-Mikroskopie, wobei Fluorophore in der Probe mit Laserlicht angeregt werden. Bei der SPIM-Technologie findet hierbei eine Anregung nur in einer von einem Beleuchtungslichtblatt (auch "Lichtstreifen" genannt) statt. Eine Schädigung der Probe durch Beleuchtungslicht in anderen Ebenen ist hierdurch vermieden.
  • Eine nach dem SPIM-Verfahren arbeitende optische Vorrichtung ist in DE 102 57 423 A1 beschrieben. Bei diesem Mikroskop wird eine Probe mit einem dünnen Lichtblatt beleuchtet, während die Beobachtung aus einer zu der Ebene des beleuchtenden Lichtblattes senkrechten Richtung erfolgt. Hierbei erfolgen die Beleuchtung und die Detektion über zwei separate optische Strahlengänge mit jeweils separater Optik. Das Lichtblatt wird von einer Zylinderlinse erzeugt. Für die Bildaufnahme wird die Probe durch das bezüglich des Detektors feststehende Lichtblatt bewegt, um schichtweise Fluoreszenz- und/oder Streulicht mit einem flächigen Detektor aufzunehmen. Die so gewonnenen Schichtbilddaten lassen sich anschließend zu einem aus einer dreidimensionalen Abbildung der Probe entsprechenden Datensatz zusammensetzen.
  • Aus DE 10 2007 015 063 A1 ist eine optische Anordnung mit einer Lichtquelle zum Abstrahlen eines Lichtbündels und mit optischen Elementen zur Umwandlung dieses Lichtbündels in die Form eines Lichtblattes bekannt. Die optische Anordnung ist insbesondere geeignet zur Beleuchtung einzelner Ebenen einer dreidimensionalen Probe bei der Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM). Es sind Mittel zur Variation des Querschnittes des Lichtblattes, zur Variation der Länge des Lichtblattes und/oder zur Beeinflussung der Richtung, der innerhalb des Lichtblattes verlaufenden Strahlungsanteile vorhanden, um die Geometrie des Lichtblattes an die Beleuchtungserfordernisse bei der Beobachtung ein und derselben Probenebene mit mehreren verschiedenartigen Objektiven zu ermöglichen.
  • Eine Anordnung zur Steigerung des Auflösungsvermögens für Fluoreszenzanwendungen ist aus der DE 44 16 558 bekannt. Hierbei werden die lateralen Randbereiche des Fokusvolumens des Anregungslichtstrahls mit einem Lichtstrahl einer anderen Wellenlänge, dem sog. Stimulationslichtstrahl oder Abregungsstrahl, der von einem zweiten Laser emittiert wird, beleuchtet, um dort die vom Licht des ersten Lasers angeregten Probenbereiche durch stimulierte Emission in den Grundzustand zurück zu bringen. Detektiert wird dann nur das spontan emittierte Licht aus den nicht vom zweiten Laser beleuchteten Bereichen, so dass insgesamt eine Auflösungsverbesserung erreicht wird. Für dieses Verfahren hat sich die Bezeichnung STED (Stimulated Emission Depletion) eingebürgert.
  • Aus DE102010060121A1 ist ein SPIM-Mikroskop bekannt, welches mit einer y-Richtungs-Beleuchtungsquelle und einer z-Richtungs-Detektionslicht-Kamera versehen ist. Ein x-Scanner erzeugt durch Scannen des Beleuchtungs-Lichtstrahls in x-Richtung ein sequentielles Lightsheet (Lichtblatt). Mittels einer Beleuchtungsoptik mit einer im Strahlengang des Beleuchtungs-Lichtstrahls angeordneten Zoomoptik ist die Fokuslänge des Beleuchtungslichtstrahls variierbar. Gemäß einer Ausführungsform kann wahlweise ein STED-Abregungsstrahl (STED = Stimulated Emission Depletion) zugeschaltet werden, wozu eine Abregungslichtquelle vorgesehen ist, welche einen das sequentiell erzeugte Lightsheet in z-Richtung verdünnenden Abregungs-Lichtstrahl aus der y-Richtung auf das abzubildende Objekt sendet, wobei der Abregungs-Lichtstrahl in z-Richtung seitlich versetzt zum Beleuchtungs-Lichtstrahl auf das Objekt gesendet wird und parallel zu dem Beleuchtungs-Lichtstrahl in x-Richtung gescannt wird. Bevorzugt handelt sich um einen Abregungsstrahl, welcher in seinem Querschnitt so verändert wurde, dass dieser 2 Maxima aufweist, welche in z-Richtung gesehen vor und hinter dem Zentrum des Anregungsstrahls liegen und der Abregungsstrahl dort eine Nullstelle aufweist. Es ist jedoch auch möglich, zwei getrennte Laserstrahlen als Abregungsstrahlen auf beiden Seiten des Anregungsstrahls vorzusehen, oder das Lightsheet mit nur einem Abregungsstrahl auf nur einer Seite zu verdünnen, d. h. in z-Richtung gesehen nur entweder vor oder hinter dem Anregungsstrahl einen Abregungsstrahl anzuwenden.
  • Aus DE 10 2012 010 207 A1 ist ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsvorrichtung bekannt, die einen gepulsten Beleuchtungsstrahl abgibt. In dem Beleuchtungsstrahlengang vor dem Mikroskopobjektiv ist ein Polarisationsstrahlteiler vorgesehen, der zwei Teilstrahlengänge erzeugt, die unterschiedliche Lichtwege aufweisen. Mittels eines Vereinigungselementes werden die in den beiden Teilstrahlengängen propagierenden Teilstrahlen wiedervereinigt. In einen der beiden Teilstrahlengänge ist ein Phasenelement angeordnet, das mindestens zwei Bereiche mit unterschiedlicher Phasenbeeinflussung aufweist.
  • In US 2011/215258 A1 ist ein Verfahren zur kollimierten Mikroskopbildgebung beschrieben, bei dem in einem ersten Schritt ein Probenbereich zur Emission von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird. In einem zweiten Schritt wird der vorgenannte Probenbereich durch eine entsprechende Beleuchtung in mehrere Teilbereiche separiert, wobei diese Separierung durch Zwischenbereiche erfolgt, in denen die Intensität der Fluoreszenzstrahlung reduziert ist oder die Fluoreszenzstrahlung andere Eigenschaften aufweist.
  • STED-ähnliche Ansätze, wie beispielsweise GSD (ground state depletion) oder RESOLFT (reversible saturable optical (fluorescence) transitions) zielen ebenfalls darauf ab, eine Bildgebung oder eine Strukturherstellung unterhalb der Beugungsgrenze mit sichtbarem Licht zu erreichen indem die Emission von Fluoreszenz im Randbereich des Anregungslichtsbündels durch Schalten bzw. Überführen der Fluorophore in dunklen Zustand unterdrückt wird.
  • Um mittels der STED/RESOLFT/GSD-Mikroskopie Überauflösung zu erreichen, wird üblicherweise ein symmetrischer, ringförmiger Strahl erzeugt mit dem Fluorophore durch stimulierte Emission (STED), ground state depletion / Überführung der Fluorophore in einen (dunklen) Tripplet-Zustand (GSD), oder durch molekulare Konformationsänderung/Schaltung (RESOLFT) daran gehindert werden, die mit einer zweiten Wellenlänge eingestrahlten Photonen zu absorbieren und/oder dann Fluoreszenz zu emittieren. Hierbei wird üblicher Weise ein zentral auf der optischen Achse befindliches Element verwendet, das den Abregungs- bzw. Schaltstrahl entsprechend so manipuliert, dass im Ergebnis ein symmetrischer, ringförmiger Strahl im Bereich der Probe entsteht.
  • Bisher wurde keine Methode vorgestellt, die einen Abregungs- bzw. Schaltstrahl so erzeugt, dass dieser für die besonderen Anforderungen in einem SPIM-Mikroskop optimiert sind. Diese wären einerseits die Abregung bzw. das Schalten nur auf zwei Seiten des Anregungsstrahls (also ausschließlich oberhalb und unterhalb des Lightsheets) vorzugsweise in Verbindung mit einer Beleuchtungsrichtung senkrecht zur Detektionsachse und eine große, insbesondere flexibel einstellbare Tiefenschärfe und davon unabhängig eine einstellbare Dicke und ein einstellbarer Abstand der beiden Abregungs/Schaltstrahlen, die an die Geometrie des (Anregungs-)Lichtblattes angepasst sind.
  • Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Beleuchtungsvorrichtung zum Erzeugen einer Abregungs- oder Schaltlichtverteilung anzugeben, die flexibel einstellbar und insbesondere an die besonderen Anforderungen eines SPIM-Mikroskops anpassbar ist.
  • Die Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 durch eine Beleuchtungsvorrichtung der eingangs genannten Art gelöst.
  • Wie im Folgenden noch im Detail ausgeführt wird, hat die erfindungsgemäße Beleuchtungsvorrichtung den ganz besonderen Vorteil, dass die mit ihr erzeugte Abregungs- oder Schaltlichtverteilung im Bereich der Probe einfach und effizient an die jeweiligen spezifischen Anforderungen, insbesondere bei einem SPIM-Mikroskop, angepasst werden kann.
  • Ein wesentlicher Erfindungsgedanke ist hierbei, die Abregungs- oder Schaltlichtverteilung durch Interferenz zweier Teilbeleuchtungslichtbündel zu erzeugen, die getrennt voneinander durch die Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs verlaufen und die sich nach dem Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs auf und/oder in der Probe räumlich überlagern. Der räumliche Abstand zwischen den Teilbeleuchtungslichtbündeln im Bereich der Eintrittspupille führt dazu, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel nach dem Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs gegeneinander verkippt verlaufen und so in das Probenvolumen eindringen. Durch den relativen Phasenversatz der Teilbeleuchtungslichtbündel um π weist das im Bereich der Überlagerung entstehende Interferenzmuster entlang der optischen Achse eine Nullstelle auf. Es ist, was im Folgenden noch im Detail erläutert wird, insbesondere auch möglich, für ein Abregen oder Schalten von Farbstoffen in der SPIM-Mikroskopie die Abregungs- oder Schaltlichtverteilung so auszubilden, dass sie im Bereich der räumlichen Überlagerung der Teilbeleuchtungslichtbündel entlang einer Ebene, in der die optische Achse liegt, eine flächenartige Nullstelle aufweist.
  • Es ist zumeist so, dass lediglich das Fluoreszenzlicht detektiert werden soll, das aus dem Bereich stammt, in dem das Interferenzmuster bzw. die Abregungs- und/oder Schaltlichtverteilung eine Nullstelle aufweist, wobei im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere auch dann eine Nullstelle vorliegt, wenn die Lichtintensität auf Grund technischer Imperfektionen nicht genau Null beträgt. Der Erfindung liegt insoweit insbesondere die Idee zu Grunde, die Zahl der abzuregenden Fluorophore zu minimieren (Intensitätsminimum). Im Folgenden wird deshalb gleichbedeutend anstatt von einer Nullstelle teilweise auch von einem Intensitätsminimum gesprochen.
  • Im Gegensatz zu bekannten Vorgehensweisen wird der Phasenversatz um π vorzugsweise nicht mittig auf ein einziges Beleuchtungslichtstrahlenbündel aufgeprägt. Vielmehr werden erfindungsgemäß aus einem Primärbeleuchtungslichtbündel zwei zunächst räumlich getrennte Teilbeleuchtungslichtbündel erzeugt, die in der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs zueinander einen Phasenversatz von π aufweisen, und die dann auf der Probe oder in dem Probenvolumen zur Interferenz gebracht.
  • Hierbei ist es beispielsweise möglich, dass das Phasenbeeinflussungsmittel und die Strahlteilungsvorrichtung durch dasselbe optische Bauteil gebildet sind, wobei darüber hinaus insbesondere vorgesehen sein kann, dass das optische Bauteil sowohl die Aufteilung des Primärbeleuchtungslichtbündels in die zwei Teilbeleuchtungslichtbündel, als auch den relativen Phasenversatz der Teilbeleuchtungslichtbündel zueinander bewirkt.
  • Alternativ ist es auch möglich, dass das Phasenbeeinflussungsmittel als ein von der Strahlteilungsvorrichtung separates Bauteil im Strahlengang eines der Teilbeleuchtungslichtbündel angeordnet ist. Beispielsweise braucht hierfür lediglich im Strahlengang eines der Teilbeleuchtungslichtbündel ein entsprechend geeignetes optisches Element angeordnet zu sein.
  • Bei einer besonderen Ausführung verläuft jedes der Teilbeleuchtungslichtbündel durch jeweils einen eigenen von zwei halbmondförmigen Teilen der Eintrittspupille. Hierbei kann insbesondere vorteilhaft vorgesehen sein, dass der halbmondförmige Teil mit dem jeweiligen Teilbeleuchtungslichtbündel unterleuchtet wird, was beispielsweise dadurch erreichbar ist, dass jedes Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Eintrittspupille einen Durchmesser aufweist, der kleiner ist, als der Radius der Eintrittspupille. Vorzugsweise wird die Eintrittspupille nicht voll ausgeleuchtet.
  • Der Phasenunterschied um π kann, was weiter unten noch im Detail erläutert ist, beispielsweise durch eine, insbesondere in der Eintrittspupille angeordnete, Phasenplatte mit zwei optisch unterschiedlich verzögernden Segmenten bewirkt werden, wobei eines der Teilbeleuchtungslichtbündel durch ein Segment und das andere der Teilbeleuchtungslichtbündel durch das andere Segment verläuft.
  • In besonders vorteilhafter Weise kann die Phasenplatte fest im Beleuchtungsobjektiv verbaut sein. Bei der Lichtblattmikroskopie ist diese bauliche Integration insbesondere dadurch möglich, dass - anders als bei der konfokalen Mikroskopie - das Beleuchtungsobjektiv typischerweise nicht auch zur Detektion verwendet wird. Die Phasenplatte hätte ansonsten einen nachteiligen Effekt auf die Bildqualität wenn sie in einem Objektiv verbaut wird, das zur Detektion verwendet wird.
  • Es ist beispielsweise auch möglich, was ebenfalls weiter unten noch im Detail erläutert ist, einen Phasenversatz der beiden Teilbeleuchtungslichtbündel um π dadurch zu erzeugen, dass die beiden Teilbeleuchtungslichtbündel relativ zueinander eine um eine ungerade Zahl, insbesondere um Eins, verschiedene Anzahl von Reflektionen an jeweils einer Metalloberfläche oder Totalreflektionen absolvieren. Hierbei wird ausgenutzt, dass Licht, das an einer Metallfläche reflektiert wird eine Phasenverschiebung um π erfährt.
  • Besonders einfach realisierbar ist eine Ausführung, bei der die Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Eintrittspupille parallel zueinander verlaufen und/oder bei der die Ausbreitungsrichtungen der Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Eintrittspupille parallel zueinander ausgerichtet sind.
  • Allerdings ist es auch möglich, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Eintrittspupille nicht parallel zueinander verlaufen. Verlaufen die Teilbeleuchtungslichtbündel in der Pupille nicht parallel zur optischen Achse dann interferieren sie auch nicht in der Fokusebene des Beleuchtungsobjektivs (in der Fourierebene), sondern davor oder dahinter. Insoweit kann durch ein Verkippen der Teilbeleuchtungslichtbündel vorteilhaft eine axiale Verschiebung des Fokus erreicht werden.
  • Es ist vorteilhaft auch möglich, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel nicht symmetrisch gegenüber der optischen Achse und/oder zueinander verkippt in das Beleuchtungsobjektiv eingekoppelt werden. Auf diese Weise kann ein unsymmetrisches Interferenzmuster erreicht werden, was für bestimmte Untersuchungssituationen wünschenswert sein kann.
  • Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung der erfindungsgemäßen Beleuchtungsvorrichtung ist wenigstens ein Einstellmittel vorhanden, mit dem die Position der Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Eintrittspupille und/oder die Position wenigstens eines der Teilbeleuchtungspupille relativ zur optischen Achse des Beleuchtungslichtobjektivs und/oder die Form der Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Eintrittspupille und/oder die Divergenz der Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Eintrittspupille und/oder der Abstand der Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Eintrittspupille und/oder der Durchmesser der Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Eintrittspupille einstellbar ist.
  • Im Bereich der Probe bilden die beiden Teilstrahlen ein streifenförmiges Interferenzmuster. Der Abstand und die Abmessungen der Teilstrahlen in der Pupille kann insbesondere fest gewählt werden oder frei einstellbar sein.
  • In einem besonderen Fall werden der Durchmesser und der Abstand der Teilbeleuchtungslichtbündel so aufeinander abgestimmt, dass das Interferenzmuster der beiden Teilstrahlen nur aus zwei symmetrisch um eine Nullstelle liegenden Intensitätsmaxima besteht.
  • Beispielsweise kann der Strahldurchmesser erhöht werden um die Breite des Interferenzmusters zu erhöhen. Es steigt die Zahl der Intensitätsmaxima und Nullstellen, wobei die in den Maxima erreichte Intensität symmetrisch zum Rand hin abnimmt.
  • Beispielsweise kann durch das Einstellen des Abstandes der beiden Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Pupille der Abstand der benachbarten Maxima bzw. die Periode des Interferenz-Musters der beiden Teilstrahlen eingestellt werden.
  • Durch die Wahl der Position der beiden Teilestrahlenbündel relativ zur Mitte der Eintrittspupille kann die Abregungs- oder Schaltlichtverteilung relativ zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs verkippt werden.
  • Darüber hinaus ist es beispielsweise möglich, durch ein Einstellen des Strahldurchmessers wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel die Schärfentiefe der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung einzustellen.
  • Bei einer vorteilhaften Ausführung weist das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel, wenigstens ein hinsichtlich des bewirkenden Ablenkwinkels einstellbares, strahlablenkendes Element auf. Hierbei kann es sich beispielsweise um einen kippbar gelagerten Spiegel handeln. Von besonderem Vorteil ist eine Ausführung, bei der das strahlablenkende Element wenigstens einen ferngesteuerten, motorisch bewegbaren Spiegel aufweist. Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, dass das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel, wenigstens ein kippbar gelagertes und/oder ferngesteuertes motorisch bewegbares Gitter aufweist. Insbesondere kann das Einstellmittel dazu ausgebildet sein, einen Strahlversatz, insbesondere einen Parallelversatz, zu bewirken. Zu diesem Zweck kann das Einstellmittel beispielsweise eine im Strahlengang eines der Teilbeleuchtungslichtbündel eine drehbar gelagerte, planparallele Platte oder zwei hintereinander geschaltete kippbare Spiegel aufweisen.
  • Bei einer besonderen Ausführung weist das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel, wenigstens ein aktives optisches Element auf. Hierbei kann es sich beispielsweise um ein SLM (spatial light modulator) oder um ein DMD (digital micromirror device) handeln.
  • Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung, die ein schnelles und flexibles Einstellen erlaubt, weist das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes und/oder der Position der Teilbeleuchtungslichtbündel, wenigstens ein akustooptisches Bauteil auf. Beispielsweise kann das akustooptische Bauteil als AOD (acoustooptical deflector) oder als AOM (acoustooptical modulator) ausgebildet sein. Insbesondere kann das Einstellmittel auch einen AOTF (acoustooptical tunable filter) aufweisen, der derart gesteuert ist, dass durch eine Polarisationsänderung der ersten Beugungsordnung gegenüber der nullten Beugungsordnung eine folgende polarisationsabhängige Phasenverzögerung mittels eines doppelbrechenden Materials erfolgt.
  • Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, dass das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes und/oder der Position der Teilbeleuchtungslichtbündel, zwei hinsichtlich ihres Abstandes und/oder hinsichtlich ihrer Position einstellbare Blenden aufweist, die in der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs oder in einer zur Eintrittspupille konjugierten Ebene angeordnet sind. Hierbei kann vorteilhaft in der Weise vorgegangen werden, dass die Blenden mit den Teilbeleuchtungslichtbündeln überleuchtet werden, so dass lediglich der durch die Blenden tretende Teil der Teilbeleuchtungslichtbündel zum Beleuchtungsobjektiv gelangt. Mit einem Verschieben einer der Blenden verschiebt sich somit auch der jeweils zum Beleuchtungsobjektiv gelangende Teil des jeweiligen Teilbeleuchtungslichtbündels. Insbesondere können die Blenden zusätzlich auch hinsichtlich ihres Öffnungsdurchmessers einstellbar ausgebildet sein. Beispielsweise kann es sich um Irisblenden handeln. Mit derartigen Blenden können vorteilhaft auch die lateralen Abmessungen der Teilbeleuchtungslichtbündel eingestellt werden. Die Blenden, insbesondere Irisblenden, können auch in das Beleuchtungsobjektiv integriert sein.
  • Bei einer besonderen Ausführung weist das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen der lateralen Abmessungen, insbesondere des Durchmessers, der Teilbeleuchtungslichtbündel, einen hinsichtlich der Vergrößerung, insbesondere ferngesteuert, einstellbaren Strahlaufweiter im Strahlengang wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel auf. Alternativ oder zusätzlich kann auch vorgesehen sei, dass Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen der lateralen Abmessungen der Teilbeleuchtungslichtbündel, wenigstens eine Linse mit variabler Brennweite aufweist.
  • Bei einer besonderen Ausführung sind die Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Eintrittspupille kollimiert. Es ist jedoch auch möglich, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Eintrittspupille konvergent oder divergent verlaufen. Von besonderem Vorteil ist eine Ausführung der Beleuchtungsvorrichtung, bei der die Konvergenz beziehungsweise Divergenz der Teilbeleuchtungslichtbündel mittels eines Einstellmittels einstellbar ist. Durch ein Einstellen der Konvergenz beziehungsweise Divergenz der Teilbeleuchtungslichtbündel kann die Lage der Strahltaille der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung relativ zur Brennebene des Beleuchtungsobjektivs verschoben werden.
  • Die Teilbeleuchtungslichtbündel können, insbesondere in der Eintrittspupille, als Gaußsche-Lichtbündel ausgebildet sein. Allerdings ist dies nicht zwingend notwendig. Beispielsweise können die Teilbeleuchtungslichtbündel alternativ auch als Flat-Top-Beams ausgebildet sein.
  • Eine besonders robuste und einfach zu realisierende Vorgehensweise zur Erzeugung der beiden Teilbeleuchtungslichtbündel besteht darin, ein binäres Gitter in einer zur Fokusebene des Beleuchtungsobjektivs konjugierten Ebene anzuordnen. Das binäre Gitter kann man sich als Überlagerung von zwei geblazten Gittern (Blazegittern) vorstellen, deren Phase gegenläufig und um π gegeneinander verschoben ist. Derartige binäre Gitter können einfach als statische, diffraktive Elemente hergestellt werden, wobei ein für die gewünschte Anwendung geeigneter Abstand der Teilbeleuchtungslichtbündel erzeugt werden kann, indem die Periode des Gitters entsprechend gewählt und/oder eingestellt wird. Ein solches Gitter in einer Ausgestaltung als Modulator (z.B. LCoS-SLM oder ferroelektrischer SLM) stellt eine besonders flexible Lösung zur Einstellung des Abstands der Teilbeleuchtungslichtbündel in der Pupille dar. Darüber hinaus kann der Modular bei geeigneter technischer Ausführung auch dazu in der Lage sein, die Amplitude der Teilbeleuchtungslichtbündel zu verändern. Durch einen Modulator könnte also die Schärfentiefe der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung flexibel eingestellt werden.
  • Ganz allgemein kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass die Strahlteilungsvorrichtung wenigstens ein Gitter aufweist und/oder dass die Strahlteilungsvorrichtung wenigstens ein Phasengitter aufweist. Insbesondere kann vorteilhaft auch vorgesehen sein, dass die Strahlteilungsvorrichtung ein binäres Gitter aufweist und/oder dass die Strahlteilungsvorrichtung ein Überlagerungsgitter aufweist, das der Überlagerung von zwei hinsichtlich ihrer Phasenverzögerungsverteilung gegenläufig orientierten Gittern entspricht. Von besonderem Vorteil ist eine Ausführung, bei der die Strahlteilungsvorrichtung ein hinsichtlich der Gitterperiode einstellbares Gitter aufweist.
  • Insbesondere für SPIM-Anwendungen können die Teilbeleuchtungslichtbündel im Bereich der Probe und/oder Bereich der Eintrittspupille im Querschnitt elliptisch und/oder als Lichtblatt ausgebildet sein. Dies kann zum Beispiel durch die Verwendung anamorphotischer Optiken im Strahlengang erreicht werden. Beispielsweise kann ein Laserstrahl mit einer Zylinderlinse auf das Gitter abgebildet werden.
  • Von ganz besonderem Vorteil ist ein Mikroskop, das eine erfindungsgemäße Beleuchtungsvorrichtung aufweist. Ein solches Mikroskop kann eine weitere Lichtquelle (2) aufweisen, die ein Anregungslichtbündel zum Beleuchten der Probe erzeugt. Das Anregungslichtbündel dient dazu, in der Probe eine Fluoreszenzanregung zu bewirken. Alternativ zu einer weiteren Lichtquelle (2) kann auch vorgesehen sein, dass die Lichtquelle (2), die bereits das Licht für die Abregungs- oder Schaltlichtverteilung bereitstellt, zusätzlich auch das Anregungslicht erzeugt. Insbesondere kann die Lichtquelle (2) hierfür als Mehrwellenlängenlichtquelle, insbesondere als Weißlichtquelle, ausgebildet sein.
  • Das Anregungslichtbündel kann insbesondere als Anregungslichtblatt ausgebildet sein. Zum Erzeugen einer Überauflösung kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass die Abregungs- oder Schaltlichtverteilung zwei zum Anregungslichtblatt als parallele Abregungs- oder Schaltlicht- Lichtblätter aufweist, die beidseitig des Anregungslichtblattes angeordnet sind. Wie bereits erwähnt kann der Abstand dieser beiden Abregungs- oder Schaltlicht- Lichtblätter durch Einstellen des Abstandes der Teilbeleuchtungslichtbündel eingestellt werden wobei die Schärfentiefe der des Abregungslichtblatts durch geeignete Änderung der Durchmesser der Teilbeleuchtungslichtbündel in der Pupille kompensiert werden kann.
  • Zum Erzeugen einer überaufgelösten Abbildung einer Probe wird mit dem, insbesondere als Anregungslichtblatt ausgebildeten, Anregungslichtbündel eine Fluoreszenzanregung der Probe bewirkt, während mit der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung eine stimulierte Emission und/oder ein ground state depletion oder eine Konformitätsänderung oder ein Schalten von Fluorphoren (im Randbereich des Anregungslichtblatts) bewirkt wird.
  • In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand beispielhaft und schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder gleich wirkende Elemente auch in unterschiedlichen Ausführungsbeispielen zumeist mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
    • Fig. 1
    eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsvorrichtung,
    Fig. 2
    ein Ausführungsbeispiel betreffend die Erzeugung einer Abregungs- oder Schaltlichtverteilung für linienscannende Systeme (DSLM),
    Fig. 3
    ein Ausführungsbeispiel bezüglich der Erzeugung einer Abregungs- oder Schaltlichtverteilung für eine statische Beleuchtung (SPIM),
    Fig. 4
    eine vorteilhafte Intensitätsverteilung von Anregungslicht und Abregungs- oder Schaltlicht,
    Fig. 5
    eine suboptimale Intensitätsverteilung von Anregungslicht und Abregungs- oder Schaltlicht,
    Fig. 6
    eine schematische Darstellung eines möglichen Aufbaus zur Erzeugung von zwei Teilbeleuchtungslichtbündel mit dem Phasenunterschied π,
    Fig. 7
    eine Illustration zur Erläuterung der Funktionsweise des in Fig. 6 gezeigten Phasengitters, und
    Fig. 8
    die Intensitätsverteilungen in unterschiedlichen Querschnittsebenen bezüglich des in Fig. 6 dargestellten Ausführungsbeispiels.
  • Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsvorrichtung für ein Mikroskop zum Erzeugen einer Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1. Die Beleuchtungsvorrichtung beinhaltet eine Lichtquelle 2, die beispielsweise als Laser ausgebildet sein kann und die ein Primärbeleuchtungslichtbündel 3 erzeugt. Der Lichtquelle 2 ist ein variabler Strahlaufweiter 4 und eine Zylinderoptik 5 nachgeordnet. Die Zylinderoptik 5 formt das Primärbeleuchtungslichtbündel 3 lichtblattartig.
  • Der Zylinderoptik 5 ist eine Strahlteilungsvorrichtung 6 nachgeordnet, die das Primärbeleuchtungslichtbündel 3 in ein erstes Teilbeleuchtungslichtbündel 7 und ein zweites Teilbeleuchtungslichtbündel 8 räumlich aufteilt. Im Strahlengang des ersten Teilbeleuchtungslichtbündels 7 ist ein Phasenbeeinflussungsmittel 9 angeordnet, das die Phase des ersten Teilbeleuchtungslichtbündels 7 derart beeinflusst, dass die beiden Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 im Bereich ihrer späteren räumlichen Überlagerung einen Phasenversatz von π aufweisen. Die Beleuchtungsvorrichtung weist ein Beleuchtungsobjektiv 10 auf, das die Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 auf und/oder in eine (in Figur 1 nicht dargestellte) Probe fokussiert, wobei die Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 räumlich getrennt voneinander durch die Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs 10 verlaufen und sich nach dem Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs 10 auf und/oder in der Probe räumlich überlagern, so dass die gewünschte Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 durch Interferenz entsteht.
  • Die schematisch dargestellte Beleuchtungsvorrichtung eignet sich insbesondere zur Anwendung in einem SPIM-Mikroskop. Es ist natürlich auch möglich eine Abregungs- oder Schaltlichtverteilung für ein linienscannendes System (DSLM) zu erzeugen. Hierbei kann insbesondere auf eine Zylinderoptik 5 verzichtet werden.
  • Figur 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel betreffend die Erzeugung einer Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 für ein linienscannendes System, wobei in Figur 2a schematisch die in der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs angeordnete Phasenplatte 11 dargestellt ist. Die Phasenplatte 11 weist zwei Segmente 12, 13 auf, wobei die Segmente 12, 13 relativ zueinander unterschiedlich ausgebildet sind, nämlich so, dass Licht, das durch das erste Segment 12 verläuft relativ zu Licht, das durch das Segment 13 verläuft einen Phasenunterschied von π aufweist. Insoweit kann dem ersten Segment 12 die Phase 0 und dem zweiten Segment 13 die Phase π zugeordnet sein.
  • Figur 2b zeigt eine Aufsicht auf die Ebene der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs 10 und illustriert die Intensitätsverteilung der Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 am Ort der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs 10. Während das erste Teilbeleuchtungslichtbündel 7 durch das erste Segment 12 der Phasenplatte 11 verläuft, verläuft das zweite Teilbeleuchtungslichtbündel 8 durch das zweite Segment 13 der Phasenplatte 11. Es ist deutlich zu erkennen, dass jedes Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 im Bereich der Eintrittspupille einen Durchmesser aufweist, der kleiner ist, als der Radius der Eintrittspupille 14. Die Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 weisen in z-Richtung einen Relativabstand 15 zueinander auf.
  • Figur 2c zeigt die Intensitätsverteilung der durch Interferenz der beiden Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 nach Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs entstehenden Abregungs- oder Schaltlichtverteilung (senkrecht zur Ausbreitungsrichtung entlang der y-Achse). Es ist zu erkennen, dass die Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 zwei Intensitätsmaxima 16, 17 aufweist zwischen denen sich ein Intensitätsminimum 18 befindet. Der Abstand 19 der Intensitätsmaxima 16, 17 lässt sich durch Verändern des Abstandes der Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 am Ort der Eintrittspupille 14 einstellen. Durch das Einstellen der Durchmesser der Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 im Bereich der Eintrittspupille 14 kann die Breite der an das zentrale Intensitätsminimum 18 angrenzenden Intensitätsmaxima 16, 17 der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung eingestellt werden.
  • Die Figuren 3a bis 3c illustrieren beispielhaft die Erzeugung einer Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 für eine statische Beleuchtung, insbesondere in der SPIM-Mikroskopie. Hierzu wird genauso wie in Bezug auf das Ausführungsbeispiel gemäß den Figuren 2a bis 2c in der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs 10 eine Phasenplatte 11 verwendet, die zwei Segmente 12, 13 aufweist und einen Phasenunterschied der Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 um π bewirkt. Durch die Verwendung einer Zylinderoptik können in der Eintrittspupille 14 lichtblattartige Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 erzeugt werden. Alternativ ist es auch möglich, im Querschnitt kreisrunde Teilbeleuchtungslichtbündel mittels wenigstens einer hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbaren Strahlablenkeinrichtung so schnell hin und her zu wedeln, dass sie de facto nicht von einem mit einer Zylinderoptik erzeugten Lichtblatt zu unterscheiden sind.
  • Figur 3c zeigt die Intensitätsverteilung der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1, die durch Interferenz der Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 nach Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs in der Probe entsteht. Die Abregungs- oder Schaltlichtverteilung weist zwei Intensitätsmaxima 16, 17, auf, die lichtblattartig (parallel zur X-Y-Ebene) ausgebildet sind. Zwischen den beiden Intensitätsmaxima 16, 17 befindet sich ein flächenartiges Intensitätsminimum 18. Insbesondere kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass eine Probe mit einem Anregungslichtblatt zum Bewirken einer Fluoreszenzanregung beleuchtet wird, das im Bereich des Intensitätsminimums 18 der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 angeordnet ist und das zu beiden Seiten von den parallel angeordneten Intensitätsmaxima 16, 17 der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 überlagert wird, um die Emission von Fluoreszenzlicht entlang z einzuschränken und insbesondere um Überauflösung, also eine über die klassische Begrenzung der Lichtmikroskopie hinaus gehende Auflösung, entlang z zu erreichen. Auch hier gilt, dass durch Einstellen des Abstandes 15 der Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 der Abstand 19 der Intensitätsmaxima eingestellt werden kann.
  • Figur 4 zeigt exemplarisch eine vorteilhafte Kombination von Anregungslichtverteilung 20 und von Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1. Aufgetragen ist die Intensität in Abhängigkeit vom Ort. Es ist zu erkennen, dass die Breite der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 die gesamte Breite der Anregungslichtverteilung 20 überdeckt.
  • Im Gegensatz hierzu zeigt Figur 5 eine suboptimale Anpassung der Verteilung von Anregungslicht 20 einerseits und von Abregungs- oder Schaltlicht 1. Es ist zu erkennen, dass die Breite der zu schmalen Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 nicht die gesamte Breite der Anregungslichtverteilung 20 überdeckt, so dass von den Bereichen lateral außerhalb der beiden Intensitätsmaxima der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 nachteiligerweise durch das Anregungslicht hervorgerufene Fluoreszenzstrahlung zu erwarten ist, was das Ziel des Erreichens einer Überauflösung negativ beeinflusst.
  • Durch Einstellen des Abstandes der Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 in der Eintrittspupille 14 des Beleuchtungsobjektivs 10 lässt sich der Abstand der Maxima 16, 17 der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 und die Steilheit der Flanken der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 einstellen. Ein ganz besonderer Vorteil hiervon liegt darin, dass sich die Tiefenschärfe unabhängig vom Abstand der Maxima 16, 17 einstellen lässt.
  • Figur 6 zeigt eine ganz schematische Darstellung eines möglichen Aufbaus zur Erzeugung von zwei Teilbeleuchtungslichtbündeln 7, 8, die relativ zueinander einen Phasenunterschied von π aufweisen.
  • Bei diesem Aufbau sind das Phasenbeeinflussungsmittel 9 und die Strahlteilungsvorrichtung 6 durch dasselbe optische Bauteil, nämlich durch ein Rechteck-Phasengitter 22 gebildet, wobei das Rechteck-Phasengitter 22 sowohl die Aufteilung des (in dieser Figur nicht dargestellten) Primärbeleuchtungslichtbündels 3 in die zwei Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 als auch den relativen Phasenversatz der Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 zueinander bewirkt. Das Rechteck-Phasengitter 22 ist in einer ersten Ebene 23 angeordnet.
  • Das Rechteck-Phasengitter 22 kann als binäres Gitter ausgebildet sein. Das binäre Gitter kann man sich als Überlagerung von zwei geblazten Gittern vorstellen, deren Phase gegenläufig verläuft und um π gegeneinander verschoben ist, was in Figur 7 dargestellt ist. Die erste Ebene 23 ist eine zur Fokusebene 24 des Beleuchtungsobjektivs 10 korrespondierende Ebene, während die Ebene 21 der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs 10 zu der ersten Ebene 23 und zu der Fokusebene 24 eine Fourierebene ist.
  • Anschaulich kann man sich die Funktionsweise des Rechteck-Phasengitters 22 wie folgt verdeutlichen: Stellt man sich in einem ersten Gedankenschritt statt des Rechteck-Phasengitters 22 ein Prisma vor, so wird deutlich, dass ein solches Prisma das einfallende Primärbeleuchtungslichtbündel von der optischen Achse weglenken würde. In einem nächsten Gedankenschritt kann man das Prisma durch ein Fresnel-Prisma, das aus einer Vielzahl von gleichgroßen kürzeren Prismen besteht, ersetzen. Im Ergebnis ergibt sich derselbe Effekt der Ablenkung des Primärbeleuchtungslichtbündels von der optischen Achse weg. Ein um 180° gedreht angeordnetes Fresnel-Prisma würde das einfallende Primärbeleuchtungslichtbündel in die entgegengesetzte Richtung von der optischen Achse weglenken.
  • Die Fresnel-Prismen können durch Phasengitter ersetzt werden, die hinsichtlich der von ihr erzeugten Phasenverzögerung so dargestellt werden wie in Figur 7, wobei unterschiedliche Graustufen eine unterschiedliche Phasenverzögerung darstellen (schwarz = Phasenverzögerung π, weiß = Phasenverzögerung 0). Die Addition dieser Phasenverteilungen ergibt das in Figur 7 rechts dargestellte Rechteck-Phasengitter 22, das in Ebene 23 angeordnet ist.
  • Anstelle des Rechteck-Phasengitters 22 könnte auch ein akustooptisches Gitter, das beispielsweise mit einem AOD erzeugt werden kann, verwendet werden.
  • In Figur 8 ist ganz links die Intensitätsverteilung des Primärbeleuchtungslichtbündels in der ersten Ebene 23 dargestellt, während die mittlere Darstellung der Figur 8 die Intensitätsverteilung der reltiv zueinander um π phasenverschobenen Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8 illustriert.
  • In der Figur 8 ist ganz rechts die Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 in der Fokusebene 24 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die erzeugte Abregungs- oder Schaltlichtverteilung 1 zwei Intensitätsmaxima 16, 17 aufweist, zwischen denen ein Intensitätsminimum 18 angeordnet ist.
    • Bezugszeichenliste:
    • 1
    Abregungs- oder Schaltlichtverteilung
    2
    Lichtquelle
    3
    Primärbeleuchtungslichtbündel
    4
    Variabler Strahlaufweiter
    5
    Zylinderoptik
    6
    Strahteilungsvorrichtung
    7
    Erstes Teilbeleuchtungslichtbündel
    8
    Zweites Teilbeleuchtungslichtbündel
    9
    Phasenbeeinflussungsmittel
    10
    Beleuchtungsobjektiv
    11
    Phasenplatte
    12
    Erstes Segment
    13
    Zweites Segment
    14
    Eintrittspupille
    15
    Abstand der Teilbeleuchtungslichtbündel 7, 8
    16
    Intensitätsmaximum
    17
    Intensitätsmaximum
    18
    Intensitätisminimum
    19
    Abstand der Intensitätsmaxima 16, 17
    20
    Intensitätsverteilung des Anregungslichts
    21
    Ebene der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs 10
    22
    Rechteck-Phasengitter
    23
    Erste Ebene
    24
    Fokusebene

Claims (15)

  1. Beleuchtungsvorrichtung für ein Mikroskop zum Erzeugen einer Abregungs- oder Schaltlichtverteilung (1), wobei die Beleuchtungsvorrichtung eine Lichtquelle (2) hat, die ausgebildet ist, ein Primörbeleuchtungslichtbündel (3) zu erzeugen, wobei die Beleuchtungsvorrichtung umfasst:
    a. eine Strahlteilungsvorrichtung (6), die ausgebildet ist, das Primärbeleuchtungslichtbündel (3) in zwei Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) aufzuteilen,
    b. ein Beleuchtungsobjektiv (10), das ausgebildet ist, die Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) auf und/oder in eine Probe zu fokussieren, wobei die Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) räumlich getrennt voneinander durch eine Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs (10) verlaufen und sich nach dem Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs (10) auf und/oder in der Probe räumlich überlagern, und
    c. wenigstens ein Phasenbeeinflussungsmittel (9), das ausgebildet ist, einen relativen Phasenversatz der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) zueinander zu bewirken derart, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) in der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs einen Phasenversatz von π aufweisen.
  2. Beleuchtungsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
    a. die Beleuchtungsvorrichtung derart ausgebildet ist, dass jedes Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) durch jeweils einen eigenen von zwei halbmondförmigen Teilen der Eintrittspupille (14) verläuft, und/oder dass
    b. die Beleuchtungsvorrichtung derart ausgebildet ist, dass jedes Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) durch jeweils einen halbmondförmigen Teil der Eintrittspupille (14) verläuft, wobei jeweils der halbmondförmige Teil von dem Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) unterleuchtet wird, und/oder dass
    c. die Beleuchtungsvorrichtung derart ausgebildet ist, dass jedes Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) im Bereich der Eintrittspupille (14) einen Durchmesser aufweist, der kleiner ist, als der Radius der Eintrittspupille (14), und/oder dass
    d. die Beleuchtungsvorrichtung derart ausgebildet ist, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) die Eintrittspupille (14) nicht voll ausleuchten.
  3. Beleuchtungsvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Einstellmittel vorhanden ist, mit dem
    a. die Position der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) im Bereich der Eintrittspupille (14), und/oder
    b. die Position wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) relativ zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs (10), und/oder
    c. die Form der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) im Bereich der Eintrittspupille (14), und/oder
    d. die Divergenz der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) im Bereich der Eintrittspupille (14), und/oder
    e. der Abstand der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) im Bereich der Eintrittspupille (14), und/oder
    f. der Durchmesser der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) im Bereich der Eintrittspupille (14), einstellbar ist.
  4. Beleuchtungsvorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass
    a. das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes (15) und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), wenigstens ein hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbares, strahlablenkendes Element aufweist, und/oder dass
    b. das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes (15) und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), wenigstens einen kippbar gelagerten und/oder ferngesteuert, motorisch bewegbaren Spiegel aufweist, und/oder dass
    c. das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes (15) und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), wenigstens ein kippbar gelagertes und/oder ferngesteuert, motorisch bewegbares Gitter aufweist, und/oder dass
    d. das Einstellmittel, insbesondere zum Einsteilen des Abstandes (15) und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), wenigstens ein aktives optisches Element aufweist, und/oder dass
    e. das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes (15) und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), wenigstens ein aktives optisches Element aufweist, das als SLM (spatial light modulator) oder als DMD (digital micromirror device) ausgebildet ist, und/oder dass
    f. das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes (15) und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), wenigstens akustoptisches Bauteil aufweist, und/oder dass
    g. das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes (15) und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), wenigstens akustooptisches Bauteil aufweist, das als AOD (acoustooptical deflector) ausgebildet ist, und/oder dass
    h. das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes (15) und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), wenigstens akustooptisches Bauteil aufweist, das als AOM (acoustooptical modulator) ausgebildet ist, und/oder dass
    i. das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes (15) und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), einen AOTF (acoustooptical tunable filter) aufweist, der derart gesteuert ist, dass durch eine Polarisationsänderung der ersten Beugungsordnung gegenüber der nullten Beugungsordnung eine folgende polarisationsabhängige Phasenverzögerung mittels eines doppelbrechenden Materials erfolgt, und/oder dass
    j. das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Abstandes (15) und/oder der Positionen der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), zwei hinsichtlich ihres Abstandes und/oder hinsichtlich ihrer Position einstellbare Blenden, insbesondere im Durchmesser einstellbare Irisblenden, aufweist, die in der Eintrittspupille (14) des Beleuchtungsobjektivs (10) oder in einer zur Eintrittspupille (14) konjugierten Ebene angeordnet sind, und/oder dass
    k. das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Durchmessers der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), einen hinsichtlich der Vergrößerung, insbesondere ferngesteuert, einstellbaren Strahlaufweiter im Strahlengang wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) aufweist, und/oder dass
    l. das Einstellmittel, insbesondere zum Einstellen des Durchmessers der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), wenigstens eine Linse mit variabler Brennweite im Strahlengang wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel (7,8) aufweist.
  5. Beleuchtungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser und der Abstand der Teilbeleuchtungslichtbündel so aufeinander abgestimmt sind, dass das Interferenzmuster der beiden Teilstrahlen nur aus zwei symmetrisch um eine Nullstelle liegenden Intensitätsmaxima besteht.
  6. Beleuchtungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass
    a. die Abregungs- oder Schaltlichtverteilung (1) der im Bereich ihrer räumlichen Überlagerung interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) entlang der optischen Achse eine Nullstelle aufweist,
    b. die Abregungs- oder Schaltlichtverteilung (1) der im Bereich ihrer räumlichen Überlagerung interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) entlang einer Ebene, in der die optische Achse liegt, eine Nullstelle aufweist.
  7. Beleuchtungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass
    a. das Phasenbeeinflussungsmittel (9) und die Strahlteilungsvorrichtung (6) durch dasselbe optische Bauteil gebildet sind und/oder dass
    b. das Phasenbeeinflussungsmittel (9) und die Strahlteilungsvorrichtung (6) durch dasselbe optische Bauteil gebildet sind, wobei das optische Bauteil sowohl die Aufteilung des Primärbeleuchtungslichtbündels (3) in die zwei Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8), als auch den relativen Phasenversatz der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) zueinander bewirkt.
  8. Beleuchtungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Strahlteilungsvorrichtung (6) wenigstens ein Gitter aufweist und/oder dass die Strahlteilungsvorrichtung (6) wenigstens ein Phasengitter aufweist und/oder dass die Strahlteilungsvorrichtung (6) ein binäres Gitter aufweist und/oder dass die Strahlteilungsvorrichtung (6) ein Überlagerungsgitter aufweist, das der Überlagerung von zwei hinsichtlich ihrer Phasenverzögerungsverteilung gegenläufig orientierten und/oder geblazten Gittern entspricht und/oder dass die Strahlteilungsvorrichtung (6) ein hinsichtlich der Gitterperiode einstellbares Gitter aufweist.
  9. Mikroskop mit einer Beleuchtungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
  10. Mikroskop nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (2) oder eine weitere Lichtquelle (2) wenigstens ein Anregungslichtbündel zum Beleuchten der Probe erzeugt.
  11. Mikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslichtbündel im Bereich der Probe mit der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung (1) räumlich und/oder zeitlich überlagert ist.
  12. Mikroskop nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass
    a. das Mikroskop als SPIM-Mikroskop ausgebildet ist, und/oder dass
    b. das Anregungslichtbündel als Anregungslichtblatt ausgebildet ist und dass die Abregungs- oder Schaltlichtverteilung (1) zwei zum Anregungslichtblatt jeweils parallele Abregungs- oder Schaltlicht-Lichtblötter aufweist, die beidseitig des Anregungslichtblattes angeordnet sind.
  13. Verfahren zum Abbilden, insbesondere zum überauflösenden Abbilden, einer Probe unter Verwendung eines Mikroskops nach einem der Ansprüche 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem Anregungslichtbündel eine Fluoreszenzanregung der Probe bewirkt wird, während mit der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung (1) eine stimulierte Emission und/oder ein ground state depletion und/oder ein Konformitätsänderung und/oder ein Schalten von Fluorophoren bewirkt wird.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausrichtung und/oder die Position der Abregungs- oder Schaltlichtverteilung (1) relativ zur Probe und/oder relativ zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs (10) durch Einstellen der Position der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) relativ zueinander und/oder relativ zur Eintrittspupille (14) eingestellt wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Breite des zentralen Intensitätsminimums der Abregungs- oder Scholtlichtverteilung (1) durch Einstellen des Abstandes der Teilbeleuchtungslichtbündel (7, 8) in der Eintrittspupille (14) des Beleuchtungsobjektivs (10) eingestellt wird.
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