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EP1285273A1 - Il-6 detection for predicting risks of preterm delivery - Google Patents

Il-6 detection for predicting risks of preterm delivery

Info

Publication number
EP1285273A1
EP1285273A1 EP01936584A EP01936584A EP1285273A1 EP 1285273 A1 EP1285273 A1 EP 1285273A1 EP 01936584 A EP01936584 A EP 01936584A EP 01936584 A EP01936584 A EP 01936584A EP 1285273 A1 EP1285273 A1 EP 1285273A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
detection
antibody
cervico
vaginal secretions
delivery
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01936584A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Frédéric BATTEUX
Emmanuel Claret
Hélène TREBEDEN
Claudine Vermot-Desroches
Bernard Weill
John Wijdenes
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Paris 5 Rene Descartes
Original Assignee
Universite Paris 5 Rene Descartes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Paris 5 Rene Descartes filed Critical Universite Paris 5 Rene Descartes
Publication of EP1285273A1 publication Critical patent/EP1285273A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin

Definitions

  • the invention relates to a method for diagnosing imminent premature deliveries by detecting IL ⁇ in cervico-vaginal secretions.
  • premature delivery defines a delivery before 34 weeks of gestation; "Very premature delivery” means a delivery before 32 weeks of gestation, and by: “imminent delivery” delivery within 14 days, preferably within 7 days of the diagnostic test.
  • Premature deliveries occur in about 10% of pregnancies and are responsible for 75% to 90% of morbidity and neonatal mortality, in the absence of congenital anomalies.
  • MAP premature birth
  • Intrauterine infection is one of the identified causes of premature birth, which however represents only 10% to 40% of the cases observed.
  • cytokines IL8, ILl ⁇ , .116 and TNF ⁇
  • INKLER et al. report that the extracellular matrix of the cervix plays an essential role in the maintenance of pregnancy.
  • vaginal secretions are composed of: a solid phase containing exfoliated epithelial cells and leukocytes as well as polymerized glycoproteins secreted in the cervical mucus and bacteria, and a liquid phase containing electrolytes and transsuded proteins or secreted (immunoglobulins, glycoproteins (cytokines), albumin and lactoferrin), [BELEC et al. , Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2, 57-61, (1995)].
  • the inventors sought, by RT-PCR, the presence of the mRNAs of the cytokines IL6, IL8, IL10 and IL13, in cell pellets obtained from the cervico-vaginal secretions of the 2 groups of patients. They thus found that the IL8 and IL10 mRNAs were detectable both in the controls (33.3% and 16.7%) and in the patients at risk of PAD (40.3% and 48, 1%), but on the other hand, IL6 and IL13 mRNAs were present in 10.9% and 6.2% of patients, respectively, but were not detected in patients in the control group.
  • IL8 is correlated with maternal and neonatal infection, but it is not correlated with imminent delivery.
  • vaginal secretions constitute a complex, not very homogeneous medium, where the “background noise” arising in particular from the turbidity of the sample, can interfere with ELISA assays.
  • the inventors therefore chose to search for IL6 in the cervico-vaginal secretions, by using immunodetection methods on solid support, which unlike ELISA techniques, are not disturbed by background noise problems.
  • the results obtained confirmed the absence of IL6 in the cervico-vaginal secretions of patients without MAP, and the correlation between the presence of IL6 and the imminence of childbirth.
  • IL6 is detected in the cervico-vaginal secretions even in the absence of rupture of the placental membranes, causing the passage of IL6 from the amniotic fluid. They thus found that, surprisingly, there was a local production of IL6 by leukocytes of the mucous membranes of the vagina and of the cervix, correlated with the threat of imminent preterm delivery.
  • the present invention relates to a method for predicting the imminence of a premature delivery, characterized in that it comprises the detection of the presence or absence of the expression of IL6 in a sample of cervical secretions.
  • -vaginal obtained from a patient to be tested.
  • the collection of cervico-vaginal secretions is carried out at the level of the exocervix and the posterior vaginal sac.
  • the detection of the presence or absence of IL ⁇ in the cervico-vaginal secretions can in particular be carried out:
  • Detection of IL6 mRNA can be carried out by conventional methods of molecular biology, using oligonucleotides specific for the sequence encoding IL6, for example from mRNA extracted from a pellet cell obtained by centrifugation of cervico-vaginal secretions.
  • a detection method comprising the specific amplification, after retrotranscription, of the IL6 mRNA will be chosen.
  • the direct detection of IL ⁇ can be carried out in particular by immunodetection, preferably from a supernatant of centrifugation of the cervico-vaginal secretions.
  • immunodetection preferably from a supernatant of centrifugation of the cervico-vaginal secretions.
  • the ELISA type immunoenzymatic assay techniques described in the prior art do not allow reliable detection, for the reasons of background noise mentioned above.
  • the sample likely to contain the analyte sought is put in the presence of a first antibody
  • the mixture thus formed is deposited on a chromatography support on which is fixed a second antibody (capture antibody), also directed against said analyte. If the analyte is present in the sample, the labeled analyte / revealing antibody complex is detected at the point where its migration is stopped by the formation of a second complex with the capture antibody.
  • a second antibody capture antibody
  • two anti-IL6 antibodies recognizing different epitopes of the IL6 molecule will be chosen as revealing antibody and capture antibody respectively.
  • Antibodies particularly suitable are chosen from the monoclonal antibodies BE-4 (CNCM 1-911), BF-6 (CNCM I-912), and BE-8 (CNCM 1-913) described in Application EP 0 430 193 in the name of NATIONAL BLOOD TRANSFUSION CENTER of Besan affair and BIOTEST PHARMA GMBH.
  • the antibody BE-8 will be chosen as capture antibody and the antibody BE-4 as the revealing antibody.
  • the labeling of the revealing antibody, as well as the fixing of the capture antibody on the chromatography support are carried out according to methods known in themselves to those skilled in the art.
  • the revealing antibody can for example be labeled with microparticles of colored gelatin, liposomes, microparticles of metal, in particular colloidal gold, etc.
  • ready-to-use immunochromatography detection devices can be used, which are commercially available and can be combined with selected antibodies for the detection of a given analyte.
  • these devices are in the form of strips comprising a chromatography support (for example a nitrocellulose membrane) to which the capture antibody can be fixed, a deposition zone intended to receive the sample to be analyzed; between the area of attachment of the capture antibody and the deposition area and adjacent to the latter, there is an area intended to receive the labeled revealing antibody.
  • the device After fixing the capture antibody on the chromatography support, and impregnation with the revealing antibody of the zone intended to receive it, the device is ready to be used for the analysis. This is done simply by depositing the sample to be analyzed in the area provided for this purpose; the possible formation of the analyte / revealing antibody complex takes place during the migration of the sample through the area impregnated with this revelation antibody; this complex is then detected visually, after rinsing the chromatography support, in the form of a colored band at the level where the capture antibody has been fixed. Detection can be done in a few minutes.
  • EXAMPLE 1 EXPRESSION OF INFLAMMATORY CYTOKINE RNAMS IN CERVICO-VAGINAL SECRETIONS OF PATIENTS WITH A PREMATURE DELIVERY THREAT
  • the population studied consists of 307 patients hospitalized at Port Royal Maternity Hospital (Paris), admitted for threat of premature birth between 13 and 35 weeks of gestation (SA).
  • the control group is composed of thirty pregnant women (more than a quarter) without threat of premature delivery.
  • the inclusion criteria are defined according to the clinical and ultrasound examination.
  • prematurity ⁇ 32 weeks of gestation (very premature) or ⁇ 34 weeks of gestation (prematurity)
  • the cervico-vaginal secretions were collected by aspiration from the exocervix and the posterior vaginal sac using a sterile plastic pipette with a foam end. Macroscopically haemorrhagic samples were excluded at this stage. The cells were centrifuged at 1500 rpm / 5 min and washed twice in PBS buffer. Epithelial cells and leukocytes were counted on Malassez cells. The cell pellet was then resuspended in 500 ⁇ l of TRI-REAGENT (EUROMEDEX, Souffelmeyersheim, France), with a view to the extraction of total RNA. 4-Extraction of total RNA and reverse transcription
  • RNAs of the cells of the vaginal secretions were extracted by the technique with guanidine-phenol isothiocyanate, then treated with DNAse I (BOEHRINGER MANHEIM, Meylan, France) in order to eliminate any trace of genomic DNA. 3 ⁇ g of RNA were transcribed into cDNA for two hours at 42 ° C., in the presence of 6 IU of Reverse Transcriptase (PROMEGA, Charbonippos, France), in a final volume of 40 ⁇ l.
  • DNAse I BOEHRINGER MANHEIM, Meylan, France
  • 5-PCR 100 ng of cDNA were then amplified by PCR, in the presence of 2 IU of Taq DNA polymerase (ATGC, noisysy le Large) and specific oligonucleotides: human actin, IL6, IL8, IL10 or IL13.
  • ATGC Taq DNA polymerase
  • specific oligonucleotides human actin, IL6, IL8, IL10 or IL13.
  • 35 amplification cycles were carried out under the following conditions (elongation: 30 sec at 72 ° C, denaturation: 30 sec at 94 ° C and hybridization: 30 sec at 57 ° C), followed by an elongation of 7 min at 72 ° C and the maintenance of the products at 4 ° C.
  • a quantification of the messengers is then carried out by competitive PCR, using a known number of copies of the competing plasmid.
  • PQA1 for IL ⁇ or PQB2 for actin After separation of the products by electrophoresis in 2% agarose gel in the presence of ethidium bromide, the gel is photographed and the intensity of the bands is measured using a densitometer (Vilbert-Loumat, Marne la Vallée , France) .
  • Serum CRP is measured by nephelometry and fetal fibronectin is quantified in the cervico-vaginal secretions, by classical immunoenzymatic techniques (ELISA), using commercial kits.
  • ELISA immunoenzymatic techniques
  • IL13 was analyzed by RT-PCR in the vaginal secretions of 129 patients at risk of PAD and 30 pregnant control patients without risk of PAD. The presence or absence of these cytokines in the samples of the 2 groups was determined and the results obtained, expressed as a percentage are presented in Table I below.
  • IL13 The signal observed in RT-PCR with IL13 being much weaker than that observed with IL6. IL6 was therefore chosen as a more sensitive and therefore potentially more interesting marker for diagnostic application.
  • the number of IL ⁇ messengers was determined by quantitative PCR, an average number of 230,000 copies per positive sample was observed, which corresponds to 100 to 1,000 times more copies than for actin.
  • the chromatography support consists of a polyethersulfone membrane, which is more resistant and gives greater detection sensitivity than the nitrocellullose conventionally used.
  • the 2 rectangles of absorbent paper are cut (L: 16 mm X 1: 4 mm and L: 18 mm X 1: 4 mm).
  • a membrane strip is cut out (L:
  • Example 1 The population studied, the clinical parameters analyzed, and the procedures for collecting cervico-vaginal secretions are described in Example 1, above.
  • immunochromatography is as sensitive as RT-PCR, for the detection of IL6 in the cervico-vaginal secretions.
  • the method of detecting IL6 in cervico-vaginal secretions by immunochromatography of the invention is as sensitive as the method of detecting mRNA of IL6 by RT-PCR.

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Abstract

The invention concerns a method for forecasting impending preterm delivery by detecting the presence or absence of IL-6 in a cervicovaginal secretion sample, in particular by detecting IL-6 mRNA by PCR or by direct detection of IL-6 through immuno-chromatography.

Description

DETECTION DE 1 IL-β POUR LA PREVISION DES RISQUES D'ACCOUCHEMENT PREMATURE DETECTION OF 1 IL-β FOR THE PREDICTION OF PREMATURE DELIVERY RISKS
L' invention est relative à une méthode de diagnostic des accouchements prématurés imminents par détection d' ILβ dans les sécrétions cervico-vaginales.The invention relates to a method for diagnosing imminent premature deliveries by detecting ILβ in cervico-vaginal secretions.
Dans l'exposé de la présente invention, on définit par : « accouchement prématuré » un accouchement avant 34 semaines d'aménorrhée ; « accouchement très prématuré » un accouchement avant 32 semaines d'aménorrhée, et par : « accouchement imminent » un accouchement dans les 14 jours, de préférence dans les 7 jours suivant le test de diagnostic.In the description of the present invention, the term “premature delivery” defines a delivery before 34 weeks of gestation; "Very premature delivery" means a delivery before 32 weeks of gestation, and by: "imminent delivery" delivery within 14 days, preferably within 7 days of the diagnostic test.
Les accouchements prématurés interviennent dans environ 10% des grossesses et sont responsables de 75% à 90% de la morbidité et de la mortalité néonatale, en absence d'anomalies congénitales. En dépit des progrès réalisés ces dernières décennies dans la surveillance obstétrique et néonatale, le nombre de naissances prématurées est demeuré constant, ou a augmenté. En effet, le diagnostic et la prise en charge thérapeutique d'une menace d'accouchement prématuré (MAP) restent des problèmes cliniques non résolus. L'identification rapide des patientes à risque est difficile. Les méthodes traditionnelles de pronostic qui reposent sur l'analyse des antécédents obstétriques, de facteurs démographiques et de symptômes prémonitoires ne sont ni objectives, ni sensibles, ni spécifiques. D'autre part, du fait que les traitements préventifs proposés, basés sur l'utilisation massive d'agents tocolytiques, capables de retarder l'accouchement, s'avèrent peu efficaces, il est essentiel en cas de diagnostic de MAP, de prévoir également l'imminence de l'accouchement afin de programmer tout le dispositif de soin néonatal intensif permettant d'assurer la survie du prématuré.Premature deliveries occur in about 10% of pregnancies and are responsible for 75% to 90% of morbidity and neonatal mortality, in the absence of congenital anomalies. Despite advances in obstetric and neonatal surveillance in recent decades, the number of preterm births has remained constant, or has increased. Indeed, the diagnosis and the therapeutic management of a threat of premature birth (MAP) remain unresolved clinical problems. The rapid identification of patients at risk is difficult. The traditional methods of prognosis which rely on the analysis of obstetric history, demographic factors and premonitory symptoms are neither objective, nor sensitive, nor specific. On the other hand, since the preventive treatments proposed, based on the massive use of tocolytic agents, capable of delaying childbirth, prove to be ineffective, it is essential in the event of a diagnosis of PAD, to also plan the impending birth in order to program the entire intensive neonatal care system to ensure the survival of the premature infant.
De nombreux travaux ont été effectués, afin de rechercher des marqueurs biochimiques corrélés à une MAP, qui permettraient un diagnostic fiable et rapide, utilisable pour effectuer le suivi des patientes à risques. L'infection intra-utérine est une des causes identifiées d'accouchement prématuré qui ne représente cependant que 10 % à 40 % des cas observés. Le rôle de l'inflammation et l'implication de certaines cytokines (IL8, ILlβ, .116 et TNFα) , dans le déclenchement de l'accouchement, qu'il soit à terme ou prématuré, est maintenant clairement établi. Par exemple, dans une revue récente INKLER et al . [J. Perinat. Med. , 27, 45-60, (1999)] rapportent que la matrice extracellulaire du col de l'utérus joue un rôle essentiel dans le maintien de la grossesse. La dilatation rapide du col qui précède l'accouchement serait liée à la dégradation rapide de cette matrice, par des protéases induites par une réaction inflammatoire locale celle-ci s'accompagnerait de l' extravasation de neutrophiles et de leucocytes ainsi que de l'augmentation de la concentration de certaines cytokines (IL8, ILlβ, 116 et TNFα) .Numerous studies have been carried out in order to search for biochemical markers correlated to a PAD, which would allow a reliable and rapid diagnosis, usable for monitoring patients at risk. Intrauterine infection is one of the identified causes of premature birth, which however represents only 10% to 40% of the cases observed. The role of inflammation and the involvement of certain cytokines (IL8, ILlβ, .116 and TNFα) in triggering childbirth, whether term or premature, is now clearly established. For example, in a recent review INKLER et al. [J. Perinat. Med. , 27, 45-60, (1999)] report that the extracellular matrix of the cervix plays an essential role in the maintenance of pregnancy. The rapid dilation of the cervix preceding childbirth would be linked to the rapid degradation of this matrix, by proteases induced by a local inflammatory reaction, this would be accompanied by the extravasation of neutrophils and leukocytes as well as the increase the concentration of certain cytokines (IL8, ILlβ, 116 and TNFα).
Il a été proposé de doser ces cytokines, ainsi que des protéines de l'inflammation (fibronectine) dans le liquide amniotique afin de diagnostiquer le risque d'accouchement prématuré et/ou imminent. Par exemple, HILLIER et al . [Obstetrics & Gynecology, 6, 941-948, (1993)] rapportent que des valeurs élevées d' IL6 dans le liquide amniotique permettent le diagnostic d'un accouchement imminent (< 7jours), avec une sensibilité de 85%. Cependant, l' amniocentèse est une technique invasive et potentiellement risquée, mal adaptée à un suivi médical des patientes à risque qui nécessite d'effectuer des tests réguliers (toutes les semaines) . On a donc recherché si ces marqueurs étaient également présents dans les sécrétion cervico-vaginales, et si leur dosage permettrait d'évaluer le risque d'accouchement prématuré et/ou imminent.It has been proposed to assay these cytokines, as well as inflammation proteins (fibronectin) in the amniotic fluid in order to diagnose the risk of premature and / or imminent childbirth. For example, HILLIER et al. [Obstetrics & Gynecology, 6, 941-948, (1993)] report that high values of IL6 in the amniotic fluid allow the diagnosis of an imminent delivery (<7 days), with a sensitivity of 85%. However, amniocentesis is an invasive and potentially risky technique, ill-suited to medical monitoring of patients at risk which requires regular tests (every week). It was therefore investigated whether these markers were also present in the cervico-vaginal secretion, and whether their dosage would make it possible to assess the risk of premature and / or imminent childbirth.
Les résultats rapportés sont divergents. Dans le cas de la fibronectine, INGLIS et al . [Am. J. Obst Gynecol., 171, 5-10, (1994)] ont étudié le dosage immunoenzymatique de la fibronectine totale et/ou de la fibronectine fœtale, dans les sécrétions vaginales. Les résultats obtenus ont montré que le dosage de la fibronectine totale permet de pronostiquer la survenue d' un accouchement dans les 2 à 3 semaines (délai trop long pour présenter un intérêt pour les cliniciens), et qu'il n'est pas spécifique d'un accouchement prématuré. Quant à la fibronectine fœtale qui est normalement présente uniquement dans le liquide amniotique et le placenta, son dosage dans les sécrétions cervico-vaginales ne peut être utilisé que dans les cas de MAP où les membranes ont été rompues ou endommagées .The reported results are divergent. In the case of fibronectin, INGLIS et al. [Am. J. Obst Gynecol., 171, 5-10, (1994)] studied the immunoenzymatic assay of total fibronectin and / or fetal fibronectin in vaginal secretions. The results obtained showed that the determination of total fibronectin makes it possible to predict the onset of childbirth in 2 to 3 weeks (time too long to be of interest to clinicians), and that it is not specific to preterm delivery. As for fetal fibronectin, which is normally present only in amniotic fluid and the placenta, its determination in cervico-vaginal secretions can only be used in cases of PAD where the membranes have been ruptured or damaged.
Dans le cas de l'IL8, TANAKA et al . [Am. J. Obstet. Gynecol., 179, 644-649, (1998)] considèrent que son augmentation, ainsi que celle de l'ILl, dans les sécrétions cervico-vaginales est associée à un risque d'accouchement prématuré. Il a cependant été également rapporté que des quantités importantes d' IL-8 dans les sécrétions cervico- vaginales permettaient de diagnostiquer une infection intra- utérine avec une sensibilité élevée (80%), [RIZZO et al . , J. Perinat. Med. , 25, 461-468, (1997) ; RIZZO et al . , Ultrasound Obstet. Gynecol., 12, 86-92, (1998)], mais ne semblaient pas constituer un marqueur fiable pour la prédiction d' un accouchement prématuré [RIZZO et al . , 1997, précité). En ce qui concerne l'IL6, plusieurs étudesIn the case of IL8, TANAKA et al. [Am. J. Obstet. Gynecol., 179, 644-649, (1998)] consider that its increase, as well as that of IL1, in cervico-vaginal secretions is associated with a risk of premature birth. However, it has also been reported that large amounts of IL-8 in the cervico-vaginal secretions make it possible to diagnose an intrauterine infection with high sensitivity (80%), [RIZZO et al. , J. Perinat. Med. , 25, 461-468, (1997); RIZZO et al. , Ultrasound Obstet. Gynecol., 12, 86-92, (1998)], but did not seem to constitute a reliable marker for the prediction of a premature birth [RIZZO et al. , 1997, supra). Regarding IL6, several studies
[LOCK OOD et al . , Am. J. Obst. Gynecol., 171, 1097-1102,[LOCK OOD et al. , Am. J. Obst. Gynecol., 171, 1097-1102,
(1994) ; INGLIS et al . , Am. J. Obst. Gynecol., 171, 5-10,(1994); INGLIS et al. , Am. J. Obst. Gynecol., 171, 5-10,
(1994)] s'accordent pour conclure à une augmentation de la quantité d' IL6 dans les sécrétions cervico-vaginales en cas d'accouchement prématuré mais divergent en ce qui concerne la valeur seuil à retenir. RIZZO et al . [Am. J. Obstet. Gynecol., 175, 812-817, (1996)] considèrent d'autre part que la quantité d' IL6 dans les sécrétions cervico-vaginales constitue un marqueur de l'infection du liquide amniotique. Aucun lien n'a été établi entre la quantité d' IL6 dans les sécrétions cervico-vaginales et l'imminence de l'accouchement. L'interprétation des résultats est dans tous les cas, rendue difficile par le fait que des quantités variables, et parfois élevées d' IL6 ont été détectées dans les prélèvements effectués sur les patientes contrôle.(1994)] agree that there is an increase in the amount of IL6 in the cervico-vaginal secretions in the event of premature birth, but diverge as regards the threshold value to be used. RIZZO et al. [Am. J. Obstet. Gynecol., 175, 812-817, (1996)] also consider that the amount of IL6 in the cervico-vaginal secretions constitutes a marker for the infection of the amniotic fluid. No link has been established between the amount of IL6 in the cervico-vaginal secretions and the imminence of childbirth. The interpretation of the results is in all cases made difficult by the fact that variable, and sometimes high, amounts of IL6 have been detected in the samples taken from the control patients.
Les Inventeurs ont entrepris d'étudier l'activation locale de l'immunité cellulaire chez des patientes, par rapport à des patientes témoins présentant une grossesse normale, sans risque de MAP, afin notamment de déterminer si des cytokines spécifiques présentes dans les sécrétions cervico-vaginales étaient produites localement. En effet, les sécrétions vaginales sont composées : d'une phase solide contenant des cellules épithéliales exfoliées et des leucocytes ainsi que des glycoprotéines polymérisées sécrétées dans le mucus cervical et des bactéries, et d'une phase liquide contenant des électrolytes ainsi que des protéines transsudées ou sécrétées (immunoglobulines, glycoprotéines (cytokines) , albumine et lactoferrine) , [BELEC et al . , Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2, 57- 61, (1995)].The inventors undertook to study the local activation of cellular immunity in patients, compared to control patients with normal pregnancy, without risk of PAD, in particular to determine if specific cytokines present in the cervico-vaginal secretions were produced locally. In fact, vaginal secretions are composed of: a solid phase containing exfoliated epithelial cells and leukocytes as well as polymerized glycoproteins secreted in the cervical mucus and bacteria, and a liquid phase containing electrolytes and transsuded proteins or secreted (immunoglobulins, glycoproteins (cytokines), albumin and lactoferrin), [BELEC et al. , Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2, 57-61, (1995)].
Dans ce but les Inventeurs ont recherché, par RT- PCR, la présence des ARNms des cytokines IL6, IL8, IL10 et IL13, dans des culots cellulaires obtenus à partir des sécrétions cervico-vaginales des 2 groupes de patientes . Ils ont ainsi constaté que les ARNms de l'IL8 et de l'ILlO étaient détectables aussi bien chez les témoins (33,3% et 16,7%) que chez les patientes à risque de MAP (40,3% et 48,1%), mais qu'en revanche, les ARNms de l'IL6 et de l'IL13 étaient présents chez respectivement 10,9% et 6,2% des patientes, mais n'étaient pas détectés chez les patientes du groupe témoin. Les inventeurs ont également constaté que l'expression d' IL6 dans les sécrétions cervico-vaginales était un marqueur corrélé avec la prématurité (accouchement avant la 34ème semaine de gestation p=0,02) et la grande prématurité (accouchement avant la 32eme semaine de gestation p=0,049), et permettant le diagnostic d'un accouchement prématuré imminent dans un délai inférieur à 14 jours (p=0,001), voire dans un délai inférieur à 7 jours (p=0,036). En revanche, l'IL8 est corrélée avec l'infection de la mère et l'infection néonatale mais elle n'est pas corrélée avec un accouchement imminent .To this end, the inventors sought, by RT-PCR, the presence of the mRNAs of the cytokines IL6, IL8, IL10 and IL13, in cell pellets obtained from the cervico-vaginal secretions of the 2 groups of patients. They thus found that the IL8 and IL10 mRNAs were detectable both in the controls (33.3% and 16.7%) and in the patients at risk of PAD (40.3% and 48, 1%), but on the other hand, IL6 and IL13 mRNAs were present in 10.9% and 6.2% of patients, respectively, but were not detected in patients in the control group. The inventors also found that the expression of IL-6 in the cervicovaginal secretions was a marker correlated with prematurity (birth before 34 weeks of gestation p = 0.02) and very preterm birth (delivery before 32 th week of gestation p = 0.049), and allowing the diagnosis of an imminent premature delivery in less than 14 days (p = 0.001), or even in less than 7 days (p = 0.036). In contrast, IL8 is correlated with maternal and neonatal infection, but it is not correlated with imminent delivery.
Comme ces résultats, et notamment l'absence d' IL6 chez les patientes du groupe témoin, ne concordaient pas avec les observations de l'art antérieur, qui rapportent la présence d' IL6 dans les sécrétions cervico-vaginales, y compris dans le cas de patientes présentant une grossesse normale, les Inventeurs ont recherché les raisons de cette discordance. Ils ont supposé qu'elle pouvait être due à l'utilisation, dans l'art antérieur, de méthodes immunoenzymatiques de dosage de type ELISA. En effet, les sécrétions vaginales constituent un milieu complexe, peu homogène, où le « bruit de fond » découlant notamment de la turbidité de l'échantillon, peut interférer avec les dosages ELISA.As these results, and in particular the absence of IL6 in the patients of the control group, did not agree with the observations of the prior art, which report the presence of IL6 in the cervico-vaginal secretions, including in the case of patients with pregnancy normal, the Inventors sought the reasons for this discrepancy. They assumed that it could be due to the use, in the prior art, of enzyme-linked immunosorbent assays of the ELISA type. In fact, vaginal secretions constitute a complex, not very homogeneous medium, where the “background noise” arising in particular from the turbidity of the sample, can interfere with ELISA assays.
Les Inventeurs ont donc choisi de rechercher l'IL6 dans les sécrétions cervico-vaginales, en faisant appel à des méthodes d' immunodétection sur support solide, qui contrairement aux techniques ELISA, ne sont pas perturbées par des problèmes de bruit de fond. Les résultats obtenus ont confirmé l'absence d' IL6 dans les sécrétions cervico- vaginales des patientes ne présentant pas de MAP, et la corrélation entre la présence d' IL6 et l'imminence de 1 ' accouchement .The inventors therefore chose to search for IL6 in the cervico-vaginal secretions, by using immunodetection methods on solid support, which unlike ELISA techniques, are not disturbed by background noise problems. The results obtained confirmed the absence of IL6 in the cervico-vaginal secretions of patients without MAP, and the correlation between the presence of IL6 and the imminence of childbirth.
Les inventeurs ont en outre observé que de l'IL6 était détectée dans les sécrétions cervico-vaginales même en l'absence de rupture des membranes placentaires, entraînant le passage de l'IL6 provenant du liquide amniotique. Ils ont ainsi constaté, que de manière surprenante, il existait une production .locale d' IL6 par les leucocytes des muqueuses du vagin .et du col de l'utérus, corrélée à la menace d'accouchement prématuré imminent.The inventors have further observed that IL6 is detected in the cervico-vaginal secretions even in the absence of rupture of the placental membranes, causing the passage of IL6 from the amniotic fluid. They thus found that, surprisingly, there was a local production of IL6 by leukocytes of the mucous membranes of the vagina and of the cervix, correlated with the threat of imminent preterm delivery.
Ces résultats permettent de proposer une nouvelle méthode de prévision des risques d'accouchement prématuré, et notamment d'un accouchement prématuré imminent.These results make it possible to propose a new method for predicting the risks of premature delivery, and in particular of imminent preterm delivery.
La présente invention a pour objet un procédé de pronostic de l'imminence d'un accouchement prématuré, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence ou de l'absence de l'expression d' IL6 dans un prélèvement de sécrétions cervico-vaginales obtenu à partir d'une patiente à tester. Classiquement le prélèvement des sécrétions cervico- vaginales est effectué au niveau de l'exocol et du cul de sac vaginal postérieur. Conformément à l'invention, la détection de la présence ou de l'absence d'ILδ dans les sécrétions cervico- vaginales peut notamment être effectuée :The present invention relates to a method for predicting the imminence of a premature delivery, characterized in that it comprises the detection of the presence or absence of the expression of IL6 in a sample of cervical secretions. -vaginal obtained from a patient to be tested. Conventionally, the collection of cervico-vaginal secretions is carried out at the level of the exocervix and the posterior vaginal sac. In accordance with the invention, the detection of the presence or absence of ILδ in the cervico-vaginal secretions can in particular be carried out:
- par détection d'ARNm de l'ILδ, ou - par détection directe de l'IL6.- by detection of ILδ mRNA, or - by direct detection of IL6.
La détection d'ARNm de l' IL6 peut s'effectuer par des méthodes classiques de biologie moléculaire, à l'aide d' oligonucléotides spécifiques de la séquence codant l'IL6, par exemple à partir de l'ARNm extrait d'un culot cellulaire obtenu par centrifugation des sécrétions cervico-vaginales. Avantageusement, on choisira une méthode de détection comprenant l'amplification spécifique, après rétrotranscription, de l'ARNm de l'IL6.Detection of IL6 mRNA can be carried out by conventional methods of molecular biology, using oligonucleotides specific for the sequence encoding IL6, for example from mRNA extracted from a pellet cell obtained by centrifugation of cervico-vaginal secretions. Advantageously, a detection method comprising the specific amplification, after retrotranscription, of the IL6 mRNA will be chosen.
La détection directe de l'ILδ peut s'effectuer notamment par immunodetection, de préférence à partir d'un surnageant de centrifugation des sécrétions cervico- vaginales. Les techniques de dosage immunoenzymatique de type ELISA décrites dans l'art antérieur ne permettent pas une détection fiable, pour les raisons de bruit de fond mentionnées ci-dessus.The direct detection of ILδ can be carried out in particular by immunodetection, preferably from a supernatant of centrifugation of the cervico-vaginal secretions. The ELISA type immunoenzymatic assay techniques described in the prior art do not allow reliable detection, for the reasons of background noise mentioned above.
On choisira donc une technique de détection sur support solide par immunochromatographie, dont le principe général, connu en lui-même, est le suivant :We therefore choose a detection technique on solid support by immunochromatography, the general principle of which is known in itself, is as follows:
L'échantillon susceptible de contenir l'analyte recherché est mis en présence d'un premier anticorpsThe sample likely to contain the analyte sought is put in the presence of a first antibody
(anticorps de révélation) , dirigé contre ledit analyte, et marqué (généralement à l'aide de microparticules colorées).(revealing antibody), directed against said analyte, and labeled (generally using colored microparticles).
Le mélange ainsi formé est déposé sur un support de chromatographie sur lequel est fixé un second anticorps (anticorps de capture) , également dirigé contre ledit analyte. En cas de présence de l'analyte dans l'échantillon, le complexe analyte/anticorps de révélation marqué est détecté à l'endroit où sa migration est stoppée par formation d'un second complexe avec l'anticorps de capture. Pour la mise en œuvre de la présente invention on choisira respectivement comme anticorps de révélation et anticorps de capture deux anticorps anti-IL6 reconnaissant des épitopes différents de la molécule d'IL6. Des anticorps convenant tout particulièrement sont choisis parmi les anticorps monoclonaux BE-4 (C.N.C.M 1-911), BF-6 (C.N.C.M I- 912), et BE-8 (C.N.C.M 1-913) décrits dans la Demande EP 0 430 193 au nom du CENTRE NATIONAL DE TRANSFUSION SANGUINE de Besançon et de BIOTEST PHARMA GMBH. Avantageusement, on choisira comme anticorps de capture l'anticorps BE-8 et comme anticorps de révélation l'anticorps BE-4.The mixture thus formed is deposited on a chromatography support on which is fixed a second antibody (capture antibody), also directed against said analyte. If the analyte is present in the sample, the labeled analyte / revealing antibody complex is detected at the point where its migration is stopped by the formation of a second complex with the capture antibody. For the implementation of the present invention, two anti-IL6 antibodies recognizing different epitopes of the IL6 molecule will be chosen as revealing antibody and capture antibody respectively. Antibodies particularly suitable are chosen from the monoclonal antibodies BE-4 (CNCM 1-911), BF-6 (CNCM I-912), and BE-8 (CNCM 1-913) described in Application EP 0 430 193 in the name of NATIONAL BLOOD TRANSFUSION CENTER of Besançon and BIOTEST PHARMA GMBH. Advantageously, the antibody BE-8 will be chosen as capture antibody and the antibody BE-4 as the revealing antibody.
Le marquage de l'anticorps de révélation, ainsi que la fixation de l'anticorps de capture sur le support de chromatographie se font selon des méthodes connues en elles- mêmes de l'homme de l'art.The labeling of the revealing antibody, as well as the fixing of the capture antibody on the chromatography support are carried out according to methods known in themselves to those skilled in the art.
L'anticorps de révélation peut par exemple être marqué par des microparticules de gélatine colorée, des liposomes, des microparticules de métal, notamment d'or colloidal, etc.The revealing antibody can for example be labeled with microparticles of colored gelatin, liposomes, microparticles of metal, in particular colloidal gold, etc.
Dans le cadre de la présente invention, on peut utiliser différentes variantes et différents perfectionnements de la détection par immunochromatographie mentionnée ci-dessus. Par exemple, on peut utiliser des dispositifs prêts à l'emploi de détection par immunochromatographie, qui sont disponibles dans le commerce et peuvent être associés avec des anticorps choisis pour la détection d'un analyte donné. Généralement ces dispositifs se présentent sous forme de bandelettes comprenant un support de chromatographie (par exemple une membrane de nitrocellulose) auquel on peut fixer l'anticorps de capture, une zone de dépôt destinée à recevoir l'échantillon à analyser ; entre la zone de fixation de l'anticorps de capture et la zone de dépôt et adjacente à cette dernière, se trouve une zone destinée à recevoir l'anticorps de révélation marqué. Après fixation de l'anticorps de capture sur le support de chromatographie, et imprégnation avec l'anticorps de révélation de la zone destinée à le recevoir, le dispositif est prêt à être utilisé pour l'analyse. Celle ci s'effectue simplement par le dépôt de l'échantillon à analyser sur la zone prévue à cet effet ; la formation éventuelle du complexe analyte/anticorps de révélation s'effectue lors de la migration de l'échantillon à travers la zone imprégnée avec cet anticorps de révélation ; ce complexe est ensuite détecté visuellement, après rinçage du support de chromatographie, sous forme d'une bande colorée au niveau où a été fixé l'anticorps de capture. La détection peut s'effectuer ainsi en quelques minutes .Within the framework of the present invention, it is possible to use different variants and different improvements of the detection by immunochromatography mentioned above. For example, ready-to-use immunochromatography detection devices can be used, which are commercially available and can be combined with selected antibodies for the detection of a given analyte. Generally, these devices are in the form of strips comprising a chromatography support (for example a nitrocellulose membrane) to which the capture antibody can be fixed, a deposition zone intended to receive the sample to be analyzed; between the area of attachment of the capture antibody and the deposition area and adjacent to the latter, there is an area intended to receive the labeled revealing antibody. After fixing the capture antibody on the chromatography support, and impregnation with the revealing antibody of the zone intended to receive it, the device is ready to be used for the analysis. This is done simply by depositing the sample to be analyzed in the area provided for this purpose; the possible formation of the analyte / revealing antibody complex takes place during the migration of the sample through the area impregnated with this revelation antibody; this complex is then detected visually, after rinsing the chromatography support, in the form of a colored band at the level where the capture antibody has been fixed. Detection can be done in a few minutes.
La détection de l'IL6 par immunochromatographie, selon les modalités définies ci-dessus, constitue un mode de mise en œuvre de l'invention particulièrement bien adapté au suivi des patientes à risque, car il ne nécessite pas d'équipement encombrant et coûteux, est facile à mettre en œuvre par le médecin ou le personnel médical au lit de la patiente et permet d'obtenir rapidement une réponse, et de prendre ainsi les mesures nécessaires en cas de pronostic d'accouchement imminent. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de la méthode objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.The detection of IL6 by immunochromatography, according to the methods defined above, constitutes a mode of implementation of the invention particularly well suited to the monitoring of patients at risk, since it does not require bulky and expensive equipment, is easy to implement by the doctor or the medical staff at the patient's bed and allows a rapid response to be obtained, and thus to take the necessary measures in the event of an imminent childbirth prognosis. In addition to the foregoing arrangements, the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
EXEMPLE 1: EXPRESSION DES ARNM DE CYTOKINES INFLAMMATOIRES DANS LES SECRETIONS CERVICO-VAGINALES DE PATIENTES PRESENTANT UNE MENACE D'ACCOUCHEMENT PREMATUREEXAMPLE 1 EXPRESSION OF INFLAMMATORY CYTOKINE RNAMS IN CERVICO-VAGINAL SECRETIONS OF PATIENTS WITH A PREMATURE DELIVERY THREAT
A-Matériels et méthodesA-Materials and methods
1-Description de la population étudiée1-Description of the population studied
La population étudiée est constituée de 307 patientes hospitalisées à la Maternité Port Royal (Paris), admises pour menace d'accouchement prématuré entre 13 et 35 semaines d'aménorrhée (SA) . Le groupe témoin est composé de trente femmes enceinte (de plus d'un trimestre) sans menace d'accouchement prématuré.The population studied consists of 307 patients hospitalized at Port Royal Maternity Hospital (Paris), admitted for threat of premature birth between 13 and 35 weeks of gestation (SA). The control group is composed of thirty pregnant women (more than a quarter) without threat of premature delivery.
Les critères d'inclusion sont définis d'après l'examen clinique et échographique .The inclusion criteria are defined according to the clinical and ultrasound examination.
Parmi ces patientes, 258 (84%) ont des membranes intactes . 2-Caractéristiques obstétricales de la population étudiéeAmong these patients, 258 (84%) have intact membranes. 2-Obstetric characteristics of the population studied
Ces patientes ont été suivies jusqu'à l'accouchement pour déterminer :These patients were followed until delivery to determine:
- le délai entre le jour du prélèvement et la date de l'accouchement, la prématurité (< 32 semaines d'aménorrhée (grande prématurité) ou < 34 semaines d'aménorrhée (prématurité) ) .- the time between the day of the sample and the date of delivery, prematurity (<32 weeks of gestation (very premature) or <34 weeks of gestation (prematurity)).
Dans la population étudiée, 30,9% des patientes ont accouché prématurément (< 34SA) et 10,7% ont accouché dans les sept jours après l'admission. 18,9% ont accouché dans les quatorze jours suivant l'admission.In the study population, 30.9% of patients gave birth prematurely (<34SA) and 10.7% delivered within seven days of admission. 18.9% gave birth within 14 days of admission.
3-Prélèvement cervico-vaginal3-Cervico-vaginal sample
Les sécrétions cervico-vaginales ont été recueillies par aspiration au niveau de l'exocol et du cul de sac vaginal postérieur à l'aide d'une pipette plastique de prélèvement stérile à extrémité mousse. Les prélèvements hémorragiques macroscopiquement ont été exclus à cette étape. Les cellules ont été centrifugées à 1500rpm/5 min et lavées deux fois en tampon PBS. Les cellules epitheliales et les leucocytes ont été comptées sur cellules de Malassez. Le culot cellulaire a été ensuite resuspendu dans 500 μl de TRI- REAGENT (EUROMEDEX, Souffelmeyersheim, France) , en vue de l'extraction des ARN totaux. 4-Extraction des ARN totaux et transcription inverseThe cervico-vaginal secretions were collected by aspiration from the exocervix and the posterior vaginal sac using a sterile plastic pipette with a foam end. Macroscopically haemorrhagic samples were excluded at this stage. The cells were centrifuged at 1500 rpm / 5 min and washed twice in PBS buffer. Epithelial cells and leukocytes were counted on Malassez cells. The cell pellet was then resuspended in 500 μl of TRI-REAGENT (EUROMEDEX, Souffelmeyersheim, France), with a view to the extraction of total RNA. 4-Extraction of total RNA and reverse transcription
Les ARN totaux des cellules des sécrétions vaginales ont été extraits par la technique à l' isothiocyanate de guanidine-phénol, puis traités à la DNAse I (BOEHRINGER MANHEIM, Meylan, France) afin d'éliminer toute trace d'ADN génomique. 3 μg d'ARN ont été transcrits en ADNc pendant deux heures à 42 °C, en présence de 6 UI de Reverse Transcriptase (PROMEGA, Charbonnières, France), dans un volume final de 40 μl .The total RNAs of the cells of the vaginal secretions were extracted by the technique with guanidine-phenol isothiocyanate, then treated with DNAse I (BOEHRINGER MANHEIM, Meylan, France) in order to eliminate any trace of genomic DNA. 3 μg of RNA were transcribed into cDNA for two hours at 42 ° C., in the presence of 6 IU of Reverse Transcriptase (PROMEGA, Charbonnières, France), in a final volume of 40 μl.
5-PCR 100 ng d'ADNc ont été ensuite amplifiés par PCR, en présence de 2 UI de Taq DNA polymérase (ATGC, Noisy le Grand) et d' oligonucléotides spécifiques : de l'actine humaine, de l'IL6, de l'IL8, de l'ILlO ou de l'IL13. Après une dénaturation initiale de 5 min à 94 °C et 3 min d'hybridation à 57 °C, 35 cycles d'amplification ont été réalisés dans les conditions suivantes (élongation : 30 sec à 72 °C, dénaturation : 30 sec à 94 °C et hybridation : 30 sec à 57°C), suivis d'une élongation de 7 min à 72°C et du maintien des produits à 4°C.5-PCR 100 ng of cDNA were then amplified by PCR, in the presence of 2 IU of Taq DNA polymerase (ATGC, Noisy le Large) and specific oligonucleotides: human actin, IL6, IL8, IL10 or IL13. After an initial denaturation of 5 min at 94 ° C and 3 min of hybridization at 57 ° C, 35 amplification cycles were carried out under the following conditions (elongation: 30 sec at 72 ° C, denaturation: 30 sec at 94 ° C and hybridization: 30 sec at 57 ° C), followed by an elongation of 7 min at 72 ° C and the maintenance of the products at 4 ° C.
Pour les échantillons positifs une quantification des messagers est alors effectuée par PCR compétitive, à l'aide d'un nombre connu de copies du plasmide compétiteurFor the positive samples, a quantification of the messengers is then carried out by competitive PCR, using a known number of copies of the competing plasmid.
(PQA1 pour l'ILδ ou PQB2 pour l'actine). Après séparation des produits par électrophorèse en gel d'agarose à 2% en présence de bromure d' éthidium, le gel est photographié et l'intensité des bandes est mesurée à l'aide d'un densitométre (Vilbert- Loumat, Marne la Vallée, France) .(PQA1 for ILδ or PQB2 for actin). After separation of the products by electrophoresis in 2% agarose gel in the presence of ethidium bromide, the gel is photographed and the intensity of the bands is measured using a densitometer (Vilbert-Loumat, Marne la Vallée , France) .
6-Recherche d'une infection chez la mère et l'enfant6-Search for an infection in mother and child
L'infection chez la mère est appréciée sur la température, l'examen cyto-bactériologique des urines, la CRP sérique, la numération formule sanguine (leucocytose) , et le prélèvement vaginal. L'infection néonatale est appréciée par la fièvre, la CRP sérique, la numération formule sanguine, et les prélèvements au niveau des orifices pour étude ' bactériologique. 7-Dosage de paramètres de l'inflammation (CRP et fibronectine totale)Infection in the mother is assessed on temperature, cyto-bacteriological examination of the urine, serum CRP, blood count (leukocytosis), and vaginal sampling. Neonatal infection is appreciated by fever, serum CRP, blood count, and levies at the orifices to study bacteriological. 7-Determination of inflammation parameters (CRP and total fibronectin)
La CRP sérique est dosé par néphélométrie et la fibronectine foetale est quantifiée dans les sécrétions cervico-vaginales, par des techniques immunoenzymatiques classiques (ELISA), à l'aide de kits commerciaux.Serum CRP is measured by nephelometry and fetal fibronectin is quantified in the cervico-vaginal secretions, by classical immunoenzymatic techniques (ELISA), using commercial kits.
8-Analyse statistique8-Statistical analysis
L'association des cytokines des sécrétions cervico-vaginales, à la prématurité, et au délai entre le jour du prélèvement et la date de l'accouchement a été effectuée par régression multiple. Les différences entre les groupes ont été déterminées à l'aide du χ2 et du test exact de Fischer. B-RésultatsThe association of cytokines of cervico-vaginal secretions, prematurity, and the time between the day of the sample and the date of delivery was performed by multiple regression. The differences between the groups were determined using χ 2 and the exact Fischer test. B-Results
1-Mise en évidence des marqueurs spécifiques de MAP1-Highlighting specific markers of MAP
La production des cytokines IL6 , IL8 , IL10 etProduction of cytokines IL6, IL8, IL10 and
IL13 a été analysée par RT-PCR dans les sécrétions vaginales de 129 patientes à risque de MAP et de 30 patientes témoins enceintes sans risque de MAP . La présence ou l ' absence de ces cytokines dans les échantillons des 2 groupes a été déterminée et les résultats obtenus , exprimés en pourcentage sont présentés dans le Tableau I ci-dessous .IL13 was analyzed by RT-PCR in the vaginal secretions of 129 patients at risk of PAD and 30 pregnant control patients without risk of PAD. The presence or absence of these cytokines in the samples of the 2 groups was determined and the results obtained, expressed as a percentage are presented in Table I below.
Tableau ITable I
.Ces résultats montrent que l'ILδ et l' IL13 sont des cytokines spécifiques de MAP, potentiellement utilisables pour le diagnostic.These results show that ILδ and IL13 are specific MAP cytokines, potentially usable for diagnosis.
Le signal observé en RT-PCR avec l' IL13 étant beaucoup plus faible que celui observé avec l'IL6. L' IL6 a donc été retenue comme un marqueur plus sensible et donc potentiellement plus intéressant pour une application diagnostique. Le nombre de messagers de l'ILδ a été déterminé par PCR quantitative, un nombre moyen de 230000 copies par échantillon positif a été observé, ce qui correspond à 100 à 1000 fois plus de copies que pour l'actine.The signal observed in RT-PCR with IL13 being much weaker than that observed with IL6. IL6 was therefore chosen as a more sensitive and therefore potentially more interesting marker for diagnostic application. The number of ILδ messengers was determined by quantitative PCR, an average number of 230,000 copies per positive sample was observed, which corresponds to 100 to 1,000 times more copies than for actin.
2-Association des différentes cytokines à l'accouchement prématuré2-Association of different cytokines with premature delivery
Les résultats sont présentés dans le Tableau II, ci-dessous ; les associations significatives sont indiquées en gras avec leur seuil de signifiance.The results are presented in Table II, below; significant associations are indicated in bold with their significance level.
Les résultats montrent une association significative entre la présence d'IL6, d'IL8, d'ILlO dans les sécrétions cervico-vaginales et la grande prématurité (< 32SA) . En revanche, seule la présence d' IL6 est associée à la fois à la grande prématurité (< 32SA) et à la prématurité (< 34SA) .The results show a significant association between the presence of IL6, IL8, IL10 in cervico-vaginal secretions and very premature birth (<32SA). On the other hand, only the presence of IL6 is associated with both at great prematurity (<32SA) and at prematurity (<34SA).
3-Association des cytokines à l'accouchement dans les 7 jours ou les 14 jours après l'admission.3-Association of cytokines at delivery within 7 days or 14 days after admission.
Les résultats sont présentés dans le tableau III, ci-dessous ; les associations significatives sont indiquées en gras avec leur seuil de signifiance.The results are presented in Table III, below; significant associations are indicated in bold with their significance level.
Tableau IIITable III
Les résultats montrent une association significative entre la présence d' IL6 dans les sécrétions cervico-vaginales et l'accouchement dans les 7 jours ou lesThe results show a significant association between the presence of IL6 in the cervico-vaginal secretions and childbirth within 7 days or
14 jours suivant l'admission.14 days after admission.
En outre, dans la population de 258 patientes ayant des membranes intactes, la présence d' IL6 dans les sécrétions cervico-vaginales est associée significativement à un délai d'accouchement inférieur à 14 jours (p=0,003)'.In addition, in the population of 258 patients with intact membranes, the presence of IL6 in cervico-vaginal secretions is significantly associated with a delivery period of less than 14 days (p = 0.003) '.
L'ensemble des résultats démontre que la détection de l'ARNm de l'IL6, par RT-PCR, dans les sécrétions cervico-vaginales de patientes à risque de MAP représente donc un procédé fiable pour le pronostic d'un accouchement prématuré imminent [< 7 jours (p=0,001 ; < 14 joursAll the results show that the detection of IL6 mRNA, by RT-PCR, in the cervico-vaginal secretions of patients at risk of PAD therefore represents a reliable method for the prognosis of an imminent preterm delivery [ <7 days (p = 0.001; <14 days
(p=0,001)].(P = 0.001)].
EXEMPLE 2 : DETECTION DE L' IL6 PAR IMMUNOCHROMATOGRAPHIE POUREXAMPLE 2 DETECTION OF IL6 BY IMMUNOCHROMATOGRAPHY FOR
LE DIAGNOSTIC D'UN ACCOUCHEMENT PREMATURE. A-Matériels et méthodesTHE DIAGNOSIS OF A PREMATURE DELIVERY. A-Materials and methods
1-Préparation du dispositif d' immunochromatographie1-Preparation of the immunochromatography device
Un dispositif d' immunochromatographie commercialisé par GELMAN SCIENCES a été utilisé. Le support de chromatographie est constitué par une membrane en polyéthersulfone, plus résistante, et donnant une plus grande sensibilité de détection que la nitrocellullose classiquement utilisée . RéactifsAn immunochromatography device marketed by GELMAN SCIENCES was used. The chromatography support consists of a polyethersulfone membrane, which is more resistant and gives greater detection sensitivity than the nitrocellullose conventionally used. Reagents
- Membrane (PREDATOR, PALL Gelman Sciences)- Membrane (PREDATOR, PALL Gelman Sciences)
- Laine de verre (PALL Gelman Sciences)- Glass wool (PALL Gelman Sciences)
- Papier absorbant (PALL Gelman Sciences) - Anticorps de révélation (BE-4, C.N.C.M. 1-911)- Absorbent paper (PALL Gelman Sciences) - Disclosure antibodies (BE-4, C.N.C.M. 1-911)
- Anticorps de capture (BE-8, C.N.C.M. 1-913)- Capture antibodies (BE-8, C.N.C.M. 1-913)
- Anticorps de chèvre anti-IgG de souris (contrôle)- Goat anti-mouse IgG antibodies (control)
- Citrate de sodium- Sodium citrate
- Tampon Borax (20 mM ou 2mM Na2B407-2H20, pH 9,3) - BSA- Borax buffer (20 mM or 2mM Na 2 B 4 0 7 -2H 2 0, pH 9.3) - BSA
- T een 20- T een 20
2 Préparation de l'anticorps de révélation (anticorps couplé à l'or colloïdal) a -Préparât ion de l ' or colloïdal La solution est préparée dans un Erlenmeyer de2 Preparation of the revealing antibody (antibody coupled to colloidal gold) a -Preparation of colloidal gold The solution is prepared in an Erlenmeyer flask
500 ml. 4 ml d'une solution de chlorure d'or à 1% sont ajoutés à 200 ml d'eau distillée bouillante. Puis 12 ml d'une solution de citrate de sodium à 1% sont ajoutés en agitant vigoureusement. La solution obtenue est de nouveau portée à ébullition jusqu'à l'obtention d'une couleur se rapprochant de celle du vin (environ 3 minutes) . La solution est ensuite stockée à température ambiante et à l'abri de la lumière. b-Préparation de 1 ' anticorps à coupler à l ' or colloïdal (anticorps de révéla tion) . L'anticorps BE-4 est dialyse une nuit contre de l'eau distillée, puis son contenu en protéines est dosé et il est conservé à -80°C. c-Couplage de l 'anticorps à l 'or colloïdal500 ml. 4 ml of a 1% gold chloride solution are added to 200 ml of boiling distilled water. Then 12 ml of a 1% sodium citrate solution are added with vigorous stirring. The solution obtained is again brought to a boil until a color approaching that of wine (approximately 3 minutes). The solution is then stored at room temperature and protected from light. b — Preparation of the antibody to be coupled to colloidal gold (revealing antibody). The BE-4 antibody is dialyzed overnight against distilled water, then its protein content is assayed and it is stored at -80 ° C. c-Coupling of the antibody to colloidal gold
A 1 ml d'or colloïdal, sont ajoutés 25 μg d'anticorps BE-4 puis 100 μl de tampon 20 mM BORAX. La solution obtenue est incubée 1 h à température ambiante. 100 μl de tampon 20 mM BORAX, 1% BSA sont ajoutés et la solution est centrifugée 50 min à 1500 rpm. Après élimination du surnageant, le culot est resuspendu dans 1 ml de tampon 2 mM BORAX, 0,1% BSA et la solution est centrifugée 50 min à 1500 rpm. Après élimination du surnageant, le culot est repris dans 250 μl de tampon 2 mM BORAX, 0,1% BSA. L'anticorps conjugué à l'or colloïdal est conservé à 4°C, à l'abri de la lumière.To 1 ml of colloidal gold are added 25 μg of BE-4 antibody then 100 μl of 20 mM BORAX buffer. The solution obtained is incubated for 1 h at room temperature. 100 μl of 20 mM BORAX buffer, 1% BSA are added and the solution is centrifuged 50 min at 1500 rpm. After removal of the supernatant, the pellet is resuspended in 1 ml of 2 mM BORAX buffer, 0.1% BSA and the solution is centrifuged 50 min at 1500 rpm. After removal of the supernatant, the pellet is taken up in 250 μl of 2 mM BORAX buffer, 0.1% BSA. The antibody conjugated to colloidal gold is stored at 4 ° C, protected from light.
3 Montage du dispositif d' immunochromatographie a-Préparation de la laine de verre contenant 1 ' anticorps de révélation3 Assembly of the immunochromatography device a-Preparation of glass wool containing the revealing antibody
250 μl de l'anticorps BE-4 couplé à l'or colloïdal sont ajoutés à 1 ml de tampon 100 mM Tris HC1 pH 8,0 ; 0,5% BSA ; 0,1% Tween 20 et 5% sucrose. Les rectangles de laine de verre (L : 20 mm X 1 :250 μl of the BE-4 antibody coupled to colloidal gold are added to 1 ml of 100 mM Tris HC1 buffer pH 8.0; 0.5% BSA; 0.1% Tween 20 and 5% sucrose. Glass wool rectangles (L: 20 mm X 1:
5 mm) sont plongés dans la solution d'anticorps couplé à l'or colloïdal puis séchés au four à 58 °C, pendant 30 min et conservés sous vide, à l'abri de l'humidité, à température ambiante. b-Assemblage du dispositif5 mm) are immersed in the antibody solution coupled to colloidal gold and then dried in an oven at 58 ° C for 30 min and stored under vacuum, protected from moisture, at room temperature. b-Assembly of the device
Les 2 rectangles de papier absorbant sont découpés (L : 16 mm X 1 : 4 mm et L : 18 mm X 1 : 4 mm) .The 2 rectangles of absorbent paper are cut (L: 16 mm X 1: 4 mm and L: 18 mm X 1: 4 mm).
Une bandelette de membrane est découpée (L :A membrane strip is cut out (L:
59 mm X 1 : 25 mm), 8 μl d'anticorps de capture (BE-8) et d'anticorps contrôle (anti-IgG de souris), à 1 mg/ml, sont déposés sur une ligne perpendiculaire à la membrane, puis la membrane est séchée au déssicateur. Des bandelettes de 4 mm de largeur sont découpées et les différents éléments du dispositif d' immunochromatographie sont assemblés selon les instructions du fabricant.59 mm X 1: 25 mm), 8 μl of capture antibody (BE-8) and control antibody (anti-mouse IgG), at 1 mg / ml, are deposited on a line perpendicular to the membrane, then the membrane is dried in a desiccator. Strips 4 mm wide are cut and the different elements of the immunochromatography device are assembled according to the manufacturer 's instructions.
4- Détection d' IL6 dans les sécrétions cervico-vaginales, par immunochromatographie4- Detection of IL6 in the cervico-vaginal secretions, by immunochromatography
La population étudiée, les paramètres cliniques analysés, et les modalités du prélèvement des sécrétions cervico-vaginales sont décrits dans l'exemple 1, ci-dessus.The population studied, the clinical parameters analyzed, and the procedures for collecting cervico-vaginal secretions are described in Example 1, above.
Les sécrétions sont diluées dans -300 μl de tamponSecretions are diluted in -300 μl of buffer
PBS pH 7,4, le mélange est agité puis centrifugé 5 min àPBS pH 7.4, the mixture is stirred and then centrifuged for 5 min at
2500 rpm. 200 μl du surnageant sont déposés sur la zone du dispositif d' immunochromatographie prévue à cet effet. On laisse la migration s'effectuer pendant2500 rpm. 200 μl of the supernatant are deposited on the zone of the immunochromatography device provided for this purpose. The migration is allowed to take place for
60 min ; après rinçage de la membrane, l'apparition d'une bande brune à l'endroit où a été fixé l'anticorps de capture révèle la présence d' IL6 dans l'échantillon.60 min; after rinsing the membrane, the appearance of a brown band where the capture antibody was attached reveals the presence of IL6 in the sample.
B-RésultatsB-Results
La présence d' IL6 a été analysée sur 41 échantillons de patientes présentant une menace d'accouchement prématuré, incluses dans l'étude de l'exempleThe presence of IL6 was analyzed on 41 samples of patients presenting a threat of preterm delivery, included in the study of the example
1. Parmi ces patientes, 37 ont des membranes intactes et 4 présentent une rupture des membranes.1. Among these patients, 37 have intact membranes and 4 have a rupture of the membranes.
4 échantillons de patientes présentant une rupture des membranes donnent des résultats négatifs en RT- PCR et positifs en immunochromatographie.4 samples of patients with ruptured membranes give negative results in RT-PCR and positive in immunochromatography.
Ces résultats montrent une corrélation de 95% entre l' immunochromatographie et la RT-PCR.These results show a 95% correlation between immunochromatography and RT-PCR.
En l'absence de rupture des membranes, 1' immunochromatographie est aussi sensible que la RT-PCR, pour la détection d' IL6 dans les sécrétions cervico- vaginales .In the absence of rupture of the membranes, immunochromatography is as sensitive as RT-PCR, for the detection of IL6 in the cervico-vaginal secretions.
En conséquence, le procédé de détection d' IL6 dans les sécrétions cervico-vaginales par immunochromatographie, de l'invention, est aussi sensible que le procédé de détection de l'ARNm de l'IL6 par RT-PCR. Consequently, the method of detecting IL6 in cervico-vaginal secretions by immunochromatography of the invention is as sensitive as the method of detecting mRNA of IL6 by RT-PCR.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de pronostic de l'imminence d'un accouchement prématuré, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence ou de l'absence d' IL6 dans un prélèvement de sécrétions cervico-vaginales obtenu à partir d'une patiente à tester.1) Method for predicting the imminence of a premature delivery, characterized in that it comprises the detection of the presence or absence of IL6 in a sample of cervico-vaginal secretions obtained from a patient to test.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la détection de l'ARNm de l'ILδ.2) Method according to claim 1, characterized in that one carries out the detection of the ILδ mRNA.
3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la détection directe de l'IL6.3) Method according to claim 1, characterized in that one carries out the direct detection of IL6.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'ILδ est détectée par immunochromatographie.4) Method according to claim 3, characterized in that the ILδ is detected by immunochromatography.
5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il met en œuvre au moins deux anticorps monoclonaux anti-ILδ choisis parmi : BE-4 (C.N.C.M 1-911), BF-6 (C.N.C.M 1-912), et BE-8 (C.N.C.M 1-913).5) Method according to claim 4, characterized in that it implements at least two anti-ILδ monoclonal antibodies chosen from: BE-4 (CNCM 1-911), BF-6 (CNCM 1-912), and BE -8 (CNCM 1-913).
6) Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que l'anticorps de capture est l'anticorps BE-8.6) Method according to claim 5 characterized in that the capture antibody is the antibody BE-8.
7) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'anticorps de révélation est l'anticorps BE-4.7) Method according to claim 5, characterized in that the revealing antibody is the antibody BE-4.
8) Utilisation d'un dispositif de détection par immunochromatographie, pour la détection d' IL6 dans les sécrétions cervico-vaginales en vue du pronostic d' un accouchement prématuré imminent . 8) Use of a detection device by immunochromatography, for the detection of IL6 in the cervico-vaginal secretions for the prognosis of an imminent preterm delivery.
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