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EP1255841A2 - Verwendung von palatinase- und trehalulase-sequenzen als nutritive marker in transformierten zellen - Google Patents

Verwendung von palatinase- und trehalulase-sequenzen als nutritive marker in transformierten zellen

Info

Publication number
EP1255841A2
EP1255841A2 EP01909747A EP01909747A EP1255841A2 EP 1255841 A2 EP1255841 A2 EP 1255841A2 EP 01909747 A EP01909747 A EP 01909747A EP 01909747 A EP01909747 A EP 01909747A EP 1255841 A2 EP1255841 A2 EP 1255841A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
protein
recombinant nucleic
dna
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01909747A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Frederik BÖRNKE
Uwe Sonnewald
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Original Assignee
Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10045182A external-priority patent/DE10045182A1/de
Application filed by Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung filed Critical Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Publication of EP1255841A2 publication Critical patent/EP1255841A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/27—Erwinia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)

Definitions

  • the present invention relates to recombinant nucleic acid molecules which contain a DNA sequence which contains a protein with the enzymatic activity of a palatinose hydrolase. also called palatinase, or a trehalulose hydrolase, also called trehalulase, encodes, and the use of these nucleic acid molecules as selection markers in transformed cells.
  • the invention relates to recombinant nucleic acid molecules which contain a DNA sequence which encodes a protein with the enzymatic activity of a palatinase or a trehalulase, and in which this DNA sequence is under the control of regulatory sequences of a promoter active in plants.
  • the invention further relates to vectors and host cells which contain the recombinant nucleic acid molecules according to the invention. Methods for producing transformed plant cells and plants using the recombinant nucleic acid molecules and vectors are also provided.
  • the invention further relates to transgenic plants, their harvest products and propagation material and transgenic plant cells which contain the nucleic acid molecules or vectors according to the invention or are produced by the method according to the invention.
  • the invention also relates to the use of DNA sequences which encode a protein with the enzymatic activity of a palatinose hydrolase or a trehalulose hydrolase as a nutritional selection marker in plant cells for the selection of transformed plant cells and plants. Furthermore, the invention relates to a method for the selection of microorganisms on a medium containing palatinose or trehalulose.
  • Plant protection measures are: i) herbicide-tolerant plants, ii) insect-resistant, virus-resistant and fungus-resistant plants and iii) ozone-resistant plants.
  • quality increases are: i) increasing the shelf life of fruit, ii) increasing the starch production in potato tubers, iii) changing the carbohydrate and lipid composition and iv) producing non-plant polymers.
  • the basic prerequisite for the generation of transgenic plants is the availability of suitable transformation systems and the presence of selectable markers that enable the identification of successfully transformed plant cells.
  • the target gene that is to say, is produced in a conventional manner gene interested in agronomic view, a selectable marker gene integrated into the plant genome, which enables the identification of transgenic cells in a relatively simple and efficient manner.
  • Genes that mediate herbicide or antibiotic tolerance are currently used to select transformed plant cells. Suitable resistance genes are for example the bar gene from Streptomyces hygroscopicus which confers resistance to the herbicide phosphinotricin Total (BASTA ®) mediates (De Block et al (1987) EMBO J. 6:. 2513- 2518).
  • Further selection markers which are used in plant transformation impart resistance to G 418, bleomycin, hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin, sulfonylurea and gentamycin to the transformed plant cells.
  • Metabolic processes require the manipulation of several enzymatic steps. This means that the possibility of transforming transgenic plants several times is essential in the area of "metabolism modeling". The reasons mentioned have led to the search for further selectable markers being intensified. Despite intensive efforts, only a few new markers for the selection of transformed plant cells have been successfully used. For example, by expressing a mannose-6-phosphate isomerase, a positive selection for mannose-containing nutrient medium for transformed plant cells could be established. Another method takes advantage of the ability of an Aspergillus terreus deaminase to detoxify the insecticide Blasticidin S.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a new marker for the selection of transformed plant cells and plants.
  • DNA sequences which encode a protein with the enzymatic activity of a palatinase or a trehalulase are suitable for the selection of transformed plant cells and plants.
  • the selection according to the invention on or in medium containing palatinose or medium containing trehalulose does not lead to the death of untransformed cells.
  • the transformed cells according to the invention can metabolize the palatinose or trehalulose and thus have a selection advantage.
  • mannose system mentioned above.
  • mannose marker cannot be used in all crop plants.
  • the invention thus relates to a recombinant nucleic acid molecule, comprising a) regulatory sequences of a promoter active in plant cells; b) operatively linked to a DNA sequence that encodes a protein with the enzymatic activity of a palatinase or a trehalulase: and c) operatively linked to regulatory sequences that are used as transcription, termination and / or polyadenylation signals in
  • Plant cells can serve.
  • a protein with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase is understood to be a protein which is able to cleave palatinose or trehalulose, in particular that
  • disaccharide palatinose or trehalulose to catalyze the monosaccharides fructose and glucose.
  • the two monosaccharide units are present in an ⁇ 1-6 glycosidic bond, while in trehalulose fructose and glucose are linked via a cd> glycosidic bond.
  • PCT / EP 95/00165 discloses the sequence of a palatinase gene from the Protaminobacter rubrum bacterium and the sequence of a palatinase gene from the Pseudomonas mesoacidophila MX-45 bacterium.
  • Nucleic acid molecules in which a DNA sequence encoding a palatinase is under the control of a plant promoter, and the expression of a protein with palatinase activity in plants are just as new as the DNA sequence from Erwinia rhapontici, which has now been disclosed for the first time in the context of this invention
  • Protein encoded with the enzymatic activity of a palatinase This sequence is in the attached sequence listing under SEQ ID No. 1, the deduced amino acid sequence is given under SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3 specified.
  • a DNA sequence which encodes a protein with the enzymatic activity of a trehalulase.
  • SEQ ID No. 25 the deduced amino acid sequence is given under SEQ ID No. 26 and 27 respectively.
  • the invention thus also relates to those in SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 25 specified nucleotide sequences which encode a protein with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase, and the use of
  • Nucleic acid molecules encode the proteins with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase, for the selection of transformed plant cells and plants.
  • transformed plant cells or plants which express a palatinase or trehalulase can grow and regenerate on or in medium containing palatinose or trehalulose due to this new enzymatic property, while wild-type plant cells or plants are not able to utilize palatinose or trehalulose as a carbohydrate source and therefore neither grow nor regenerate on or in medium containing palatinose or trehalulose.
  • This observation can be used ideally for the selection of transformed plant cells and plants.
  • Palatinase and trehalulase can be used as new nutritional markers in all plants that naturally cannot convert and utilize the disaccharides palatinose or trehalulose.
  • the present invention comprises both the possibility of transforming plants alternatively with a palatinase gene or a trehalulose gene and the possibility of transforming plants with a palatinase gene and with a trehalulase gene.
  • palatinase sequences or trehalulase sequences as a nutritional selection marker, which has now been observed for plant cells for the first time, can also be successfully used for other transformed cells.
  • the principle according to the invention of utilizing the non-usable sugars palatinose or trehalulose can be applied to any cell or organism that is naturally unable to utilize palatinose or trehalulose.
  • the invention thus also relates to the use of DNA sequences which encode a protein with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase, as a marker for the selection of transformed cells which are not plant cells but other eukaryotic or prokaryotic cells or Organisms. These are preferably microorganisms such as bacteria. Viruses, fungi, yeasts and algae.
  • a secreted palatinase or trehalulase can be expressed in E. coli, for example, and successfully transformed bacterial cells can then be selected on medium containing palatinose or trehalulose.
  • the specialist is familiar with the cloning, expression and transformation techniques required for this.
  • the palatinase can also be expressed inside the cell of the cell to be selected, e.g. in the cytosol of an E. coli cell. This has the advantage that neither the palatinase nor the hexoses resulting from the palatinase activity can diffuse into the medium.
  • the additional expression of the palatinose transporter isolated and characterized for the first time in the context of this invention lends itself. The above statements apply analogously to the expression of a trehalulase.
  • palatinose operon was cloned from Erwinia rhapontici in the context of this invention, comprising the following genes:
  • the transfer of the entire operon or at least the genes palE, palF, palG and palK involved in the ABC transport system leads to the expression of the palatinose transporter in the transformed cells, preferably microorganisms.
  • the cells expressing the transporter can take up the palatinose or trehalulose from the medium, so that the hydrolysis by the selection marker palatinase or trehalulase can take place in the cytosol of the cell.
  • DNA sequence encoding a protein with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase can be isolated from natural sources or synthesized by conventional methods. Using common molecular biological techniques (see for example Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) it is possible to prepare or produce desired constructs for the transformation of plant cells. The cloning, mutagenizing, sequence analysis, and commonly used for genetic engineering manipulation in prokaryonti cells
  • deletion mutants in which the synthesis of correspondingly shortened proteins can be achieved by progressive deletion from the 5 'or from the 3' end of the coding DNA sequence.
  • enzymes that are localized in certain compartments of the plant cell by adding corresponding signal sequences.
  • Such sequences are described in the literature and are well known to those of ordinary skill in the art (see, for example, Braun et al. (1992) EMBO J. 11: 3219-3227; Wolter F. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 846-850; Sonnewald U. et al. (1991) Plant J. 1: 95-106).
  • mutants can be produced which have an altered substrate or product specificity. Furthermore, mutants can be produced which have a changed activity, temperature and / or pH profile.
  • nucleic acid molecules according to the invention or parts thereof can be used in the genetic engineering manipulation in prokaryotic cells.
  • the recombinant nucleic acid molecules according to the invention or parts thereof can be used in the genetic engineering manipulation in prokaryotic cells.
  • Plasmids are introduced which allow mutagenesis or a sequence change by recombining DNA sequences. With the help of standard procedures (see e.g. Sambrook et al. (1989), vide supra), base exchanges can be made or natural or synthetic sequences can be added. To connect the DNA fragments to one another, adapters or linkers can be added to the fragments where necessary. Appropriate restriction sites can also be provided by means of enzymatic and other manipulations, or superfluous DNA or restriction sites can be removed. Where insertions, deletions or substitutions are possible, in vitro mutagenesis, "primer repair", restriction or ligation can be used. Sequence analysis, restriction analysis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as analysis methods.
  • the person skilled in the art can find further DNA sequences which encode proteins with palatinase or trehalulase activity from other organisms by means of conventional molecular biological techniques and use them in the context of the present invention.
  • the person skilled in the art can derive suitable hybridization probes from the known palatinase sequences and use them for the screening of cDNA and / or genomic banks of the desired organism from which a new palatinase gene is to be isolated.
  • the person skilled in the art can fall back on common hybridization, cloning and sequencing methods which are well known and established in every biotechnological or genetic engineering laboratory (see, for example, Sambrook et al (1989). Vide supra).
  • the DNA sequence which encodes a protein with the enzymatic activity of a palatinase is selected from the group consisting of a) DNA sequences which comprise a nucleotide sequence which has the sequence shown in SEQ ID NO. 3 encode specified amino acid sequence or fragments thereof, b) DNA sequences which contain the sequence shown in SEQ ID No. 1 specified nucleotide sequence or parts thereof, c) DNA sequences comprising a nucleotide sequence.
  • DNA sequences which comprise a nucleotide sequence which has been degenerated to a nucleotide sequence of c), or comprise parts of this nucleotide sequence e) DNA - Sequences that are a derivative, analogue or fragment of a nucleotide sequence of a). b). c) or d).
  • the DNA sequence encoding a protein with the enzymatic activity of a palatinase is selected from those in PCT / EP 95/00165 in SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 15 indicated DNA sequences as well as DNA sequences which comprise a nucleic acid sequence which hybridize with a complementary strand of these DNA sequences, as well as DNA sequences which comprise a nucleic acid sequence which is degenerate to one of the aforementioned nucleic acid sequences and DNA sequences, which represent a derivative, analog or fragment of one of the preceding nucleic acid sequences and encode a protein with palatinase activity.
  • the DNA sequence encoding a protein with the enzymatic activity of a trehalulase is selected from the group consisting of
  • DNA sequences which comprise a nucleotide sequence which the in SEQ ID NO. 27 encode the amino acid sequence indicated or fragments thereof b) DNA sequences which the SEQ ID No. 25 specified nucleotide sequence or parts thereof, c) DNA sequences which comprise a nucleotide sequence which hybridizes with a complementary strand of the nucleotide sequence of a) or b), or parts thereof
  • Nucleotide sequence comprise, d) DNA sequences which comprise a nucleotide sequence which is degenerate to a nucleotide sequence of c) or parts of this nucleotide sequence, e) DNA sequences which are a derivative, analog or fragment of a nucleotide sequence of a). b), c) or d).
  • a DNA sequence is thus provided which encodes a protein with the enzymatic activity of a palatinase and / or a trehalulase, wherein in the protein with the enzymatic activity of a palatinase and / or the protein with the enzymatic Activity of a trehalulase is inactivated by at least one amino acid exchange for the wild protein a glycosylation site.
  • hybridization means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as described, for example, in Sambrook et al. (1989. vide supra).
  • the stringent conditions are particularly preferred as follows: 1 x SSC, 0.1% SDS at a hybridization temperature of 55 ° C. for a period of 1 h.
  • DNA sequences that hybridize with the DNA sequences that encode a protein with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase can, for example, from genomic or cDNA libraries of any organism, the palatinase DNA sequences or trehalulase DNA Sequences naturally has to be isolated. Such DNA sequences can be identified and isolated, for example, using DNA sequences which are exactly or essentially those in SEQ ID No. 1 or SEQ ID No.
  • the fragments used as the hybridization probe can also be synthetic fragments which have been produced with the aid of conventional synthesis techniques and whose sequence essentially corresponds to one of the abovementioned palatinase DNA sequences or trehalulase DNA sequences or a part thereof.
  • the DNA sequences which encode a protein with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase also comprise DNA sequences whose nucleotide sequences are degenerate to that of one of the DNA sequences described above.
  • the degeneration of the genetic code offers the person skilled in the art the possibility, among other things, of adapting the nucleotide sequence of the DNA sequence to the codon preference (codon usage) of the target plant, ie the adapt the selectable plant or plant cell based on the expression of the palatinase DNA sequence on or in the palatinose-containing medium and thereby optimize the expression.
  • the DNA sequences described above also include fragments, derivatives and allelic variants of the DNA sequences described above, which encode a protein with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase.
  • “Fragments” are understood to mean parts of the DNA sequence that are long enough to encode one of the proteins described.
  • the term “derivative” in this context means that the sequences differ from the DNA sequences described above in one or more positions, but have a high degree of homology to these sequences.
  • Homology means a sequence identity of at least 40 percent, in particular an identity of at least 60 percent, preferably over 80 percent and particularly preferably over 90 percent.
  • the proteins encoded by these DNA sequences have a sequence identity to that in SEQ ID No. 2 and 3 or SEQ ID No.
  • 26 and 27 indicated amino acid sequence of at least 80 percent, preferably 85 percent and particularly preferably over 90 percent, 95 percent and 98 percent.
  • the deviations from the DNA sequences described above can be caused, for example, by deletion. Substitution, insertion or recombination have arisen.
  • DNA sequences which are homologous to the sequences described above and which are derivatives of these sequences are generally variations of these sequences which are modifications which have the same biological function. These can be both naturally occurring variations, for example sequences from other organisms, or mutations, these mutations occurring naturally may have occurred or were introduced through targeted mutagenesis. Furthermore, the variations can be synthetically produced sequences.
  • allelic variants can be both naturally occurring variants and also synthetically produced variants or those produced by recombinant DNA techniques. The above, in connection with palatinase or
  • Trehalulase DNA sequences also apply to the other Erwinia rhapontici DNA sequences made available for the first time in the context of this invention.
  • the described DNA sequences coding for a palatinase or trehalulase originate from Erwinia rhapontici.
  • the promoter can be selected so that the expression is constitutive or only in a certain tissue or organ, at a certain time in plant development and / or at a time determined by external influences, biotic or abiotic stimuli (induced gene expression).
  • the promoter can be homologous or heterologous with respect to the plant to be transformed.
  • Suitable promoters are, for example, the 35S RNA promoter of the Cauliflower Mosaic Virus and the ubiquitin promoter from maize for constitutive expression, a promoter which is only expressed in photosynthetically active tissues guaranteed.
  • the ST-LS1 promoter Stockhaus et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7943-7947; Stockhaus et al. (1989) EMBO J. 8: 2445-2451
  • a promoter which is active during plant transformation, plant regeneration or certain stages of these processes, such as cell division-specific promoters such as the histone H3 promoter (Kapros et al. (1993) InVitro Cell Cev.
  • the promoter is the 35S RNA promoter from CaMV.
  • transcription or termination sequence which serves to correctly terminate the transcription and can also be used to add a polyA tail to the transcript, which is assigned a function in stabilizing the transcripts.
  • Such elements are described in the literature (e.g. Gielen (1989) EMBO J. 8: 23-29) and are interchangeable, e.g. the terminator of the octopine synthase gene from Agrobacterium tumefaciens.
  • the invention further relates to vectors which contain nucleic acid molecules according to the invention and whose use enables the selection of transformed plant cells and plants.
  • vectors which contain nucleic acid molecules according to the invention and whose use enables the selection of transformed plant cells and plants.
  • These are in particular plasmids, cosmids. Viruses, bacteriophages and other vectors commonly used in genetic engineering.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is then used for the transformation of E. co / z ' cells.
  • Transformed E. coli cells are grown in an appropriate medium and then harvested and lysed, and the plasmid is recovered. Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analytical method for characterizing the plasmid DNA obtained. After each manipulation, the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences.
  • the recombinant nucleic acid molecule according to the invention which contains a DNA sequence encoding a palatinase or trehalulase, or the vector according to the invention, containing a nucleic acid molecule according to the invention with a palatinase or trehalulase DNA sequence, contains at least one further recombinant nucleic acid molecule, that carries any genetic information that is to be transferred together with the palatinase DNA sequence to plant cells or plants.
  • any information contained in the further recombinant nucleic acid molecule can be obtained.
  • the additional genetic information which is to be transferred to plant cells does not necessarily have to be present on the same vector together with the selection markers palatinase and trehalulase. Rather, the nucleic acid molecule that bears the selection marker on the one hand and the nucleic acid molecule that bears the additional information on the other hand can also be introduced into a plant cell separately, so-called co-transformation. This procedure is particularly useful in cases where a physical coupling of the marker gene and the information to be transmitted is not desired. In this case, after the selection of the primary transformants, the marker gene and the desired information can segregate independently of one another in subsequent crossings.
  • the further recombinant nucleic acid molecule contains a DNA sequence which encodes a peptide, a protein, an antisense RNA, a sense RNA, a viral RNA or a ribozyme.
  • Herbers and Sonnewald (1996, TIBTECH 14: 198-205) summarize some examples of heterologous expression or overexpression and of antisense inhibition with the aim of manipulating metabolic pathways in transgenic plants. Other goals are in particular the transfer of resistance, the use of plants as
  • Production facility for proteins Carbohydrates, fats, renewable raw materials and other substances that can be synthesized by plants.
  • the vectors and nucleic acid molecules according to the invention can have further regulatory sequences and / or functional units which e.g. as
  • Enhancers act or stabilize the vector in the host cell.
  • the coding sequences can also be signal sequences be supplemented, which ensure the transport of the gene product, in this case the protein with palatinase or trehalulase activity, to a specific compartment.
  • signal sequences ensure that the palatinase or trehalulase is transformed into the cell wall of the
  • Plant cells is transported. i.e. the transformed plants express a chimeric palatinase or trehalulase. which comprises a signal peptide for transport into the cell wall.
  • the respective enzyme cleaves the palatinose or trehalulose offered in the medium into glucose and fructose, which are taken up and metabolized in the cell.
  • Suitable signal sequences which ensure inclusion in the endoplasmic reticulum can be found in the relevant literature by the person skilled in the art.
  • sequence coding for the signal peptide of the proteinase inhibitor II gene from potato is particularly suitable (Keil et al. (1996) Nucl. Acids Res. 14: 5641-5650; Genbank Accession No. X041 18).
  • the invention also relates to host cells which contain the recombinant nucleic acid molecules or vectors according to the invention, it being possible for the molecules or vectors to be transient or stable. Every cell and everyone can host cells
  • prokaryotic and eukaryotic cells or organisms come into question, in particular microorganisms such as bacteria.
  • Viruses Fungi, yeasts and algae, but also plant cells, which contain the nucleic acid molecules according to the invention or vectors or parts or derivatives thereof.
  • plant cells are preferably a palatinase or trehalulase due to the absorption of the invention coding DNA sequences able to synthesize proteins with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase.
  • kits which i) contain a recombinant nucleic acid molecule or a vector according to the invention, the nucleic acid molecule or the vector can also be present in a host cell, and ii) optionally contain palatinose or a carbohydrate equivalent to palatinose.
  • the carbohydrate equivalent to palatinose can generally be a disaccharide in which a fructose and a glucose molecule are linked via an ⁇ -glycosidic bond, such as, for example, turanose (3-O- ⁇ -D-glucopyranosyl-D-fructose ) or trehalulose (1-O- ⁇ -D-glucopyranosyl-D-fructose).
  • turanose 3-O- ⁇ -D-glucopyranosyl-D-fructose
  • trehalulose 1-O- ⁇ -D-glucopyranosyl-D-fructose
  • the present invention thus also relates to a method for selecting transformed plant cells, comprising the steps: i) introduction of a recombinant nucleic acid molecule, comprising a) regulatory sequences of a promoter active in plant cells; b) operatively linked to it a DNA sequence which encodes a protein with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase; and c) operationally linked regulatory sequences which can serve as transcription, termination and / or polyadenylation signals in plant cells, or a vector containing such a recombinant nucleic acid molecule in plant cells; and ii) selection of the transformed plant cells on or in palatinose or trehalulose or a medium containing carbohydrate equivalent to palatinose.
  • a prerequisite for the introduction of the recombinant nucleic acid molecules and vectors according to the invention in plant cells is the availability of suitable transformation systems.
  • transformation methods have been developed and established here over the past two decades. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent, diffusion of protoplasts, the direct gene transfer of isolated DNA to protoplasts, the injection and electroporation of DNA into plant cells, the introduction of DNA by means of the biolistic Methods and other possibilities, whereby the person skilled in the art can easily determine the most suitable method. All transformation processes have been well established for many years and are undoubtedly part of the standard repertoire of the specialist in plant molecular biology, plant biotechnology and cell and tissue culture.
  • plasmids When injecting and electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements per se for the plasmids used. The same applies to direct gene transfer. Simple plasmids, such as pUC derivatives, can be used. However, whole plants should be made from cells transformed in this way the presence of a selectable marker gene is recommended.
  • the plant cell uses the Ti or Ri plasmid, at least the right boundary, but often the right and left boundary of the T-DNA contained in the Ti or Ri plasmid, must be connected as a flank region to the genes to be introduced.
  • Agrobacteria are used for the transformation, the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria on the basis of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria.
  • the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation).
  • Binary vectors can replicate in E. coli as well as in Agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir region. The vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA may be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. From the infected plant material (e.g. leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension cultivated
  • Plant cells can then be regenerated again in a suitable medium containing palatinose or trehalulose or an equivalent carbohydrate for the selection of transformed plant cells.
  • the selection medium should generally contain at least 0.1% palatinose or trehalulose, if possible between 0.1 and 3.0% palatinose or trehalulose.
  • the palatinose or trehalulose concentration is preferably between 0.8 and 2.4% and particularly preferably between 1.0 and 2.0%.
  • a palatinose or trehalulose content in the medium of 1.6% is most preferred.
  • Palatinose or trehalulose as the selection media are the only carbon sources in the medium.
  • the regeneration of the transgenic plants from transgenic plant cells is carried out according to customary regeneration methods using conventional nutrient medium and phytohormones, with the difference that palatinose or trehalulose is present as a selection agent.
  • sequence-specific recombinases can be used, for example in the form of the retransformation of a starting line expressing recombinase and outcrossing of the recombinase after removal of the Selection markers (see e.g. Reiss et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3094-3098; Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353-361; Lloyd et al. (1994 ) Mol. Gen. Genet.
  • the selection marker can also be removed by cotransformation followed by outcrossing.
  • the invention further relates to plant cells which contain a nucleic acid molecule according to the invention or a vector according to the invention with palatinase or trehalulase DNA sequences.
  • the plant cell according to the invention contains at least one further foreign gene.
  • the invention also relates to the transgenic plants obtainable by regeneration of the plant cells according to the invention.
  • the transgenic plant or the transgenic plant cells can be any monocot or dicot plant or plant cell, preferably it is useful plants or cells of useful plants.
  • the invention also relates to harvest products and propagation material of transgenic plants, the cells or tissues of which contain a nucleic acid molecule according to the invention.
  • the harvested products and the propagation material are in particular fruits, seeds, tubers, rhizomes, seedlings, cuttings, etc. If the expression of the palatinase or trehalulase in the transgenic plant cells and plants is under the control of a constitutive promoter, the plants, parts of plants, harvested products and propagation material can also utilize the ability to utilize palatinose or trehalulose and therefore on or in palatinose-containing Medium or trehalulose-containing medium to be identified.
  • palatinase or trehalulase DNA sequence is under the control of, for example, an inducible or cell or tissue-specific promoter
  • the plants, parts of plants, harvested products and propagation material may have to be identified by means of molecular biological or biochemical methods.
  • a broad spectrum of molecular biological and / or biochemical methods is available to the person skilled in the art for the analysis of the transformed plant cells, transgenic plants, plant parts, crop products and propagation material , eg PCR, Northern blot analysis for the detection of palatinase-specific RNA or for determining the level of accumulation of palatinase-specific RNA, southern blot analysis for the identification of palatinase-coding DNA sequences or Western blot analysis for the detection of the nucleic acid molecules according to the invention encoded palatinase.
  • PCR Northern blot analysis for the detection of palatinase-specific RNA or for determining the level of accumulation of palatinase-specific RNA
  • southern blot analysis for the identification of palatinase-coding DNA sequences
  • Western blot analysis for the detection of the nucleic acid molecules according to the invention encoded palatinase.
  • the detection of the enzymatic activity of palatinase can also be determined by a person skilled in the art using protocols available in the literature.
  • the seeds obtained by self-cultivation or crossings can be laid out on medium containing palatinose and conclusions can be drawn on the genotype of the respective plant based on the germination capacity and the growth of the daughter generation (s) and the segregation pattern.
  • the above statements apply analogously to the analysis of plant cells and plants transformed with trehalulase DNA sequences.
  • the invention also relates to the use of DNA sequences which encode a protein with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase as a selection marker in plant transformation or cell and tissue culture.
  • a recombinant nucleic acid molecule or vector according to the invention is used as a selection marker in the production of transgenic plant cells and plants.
  • the invention is based on the observation that DNA sequences which encode a protein with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase can be used as selection markers in plant transformation, which is shown in the following examples, which serve only to illustrate the invention and in are in no way to be understood as a limitation.
  • Cloning methods such as: restriction cleavage, DNA isolation, agarose gel electrophoresis. Purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells. Cultivation of bacteria, sequence analysis of recombinant DNA were carried out according to Sambrook et al (1989. vide supra). The transformation of Agrobacterium tumefaciens was carried out according to the Höfgen and Willmitzer method (1988. Nucl. Acids Res. 16: 9877). Agrobacteria were grown in YEB medium (Vervliet et al. (1975) Gen. Virol. 26:33).
  • chromosomal DNA was isolated from the cells of a 50 ml overnight culture according to the standard protocol. Then approximately 300 ⁇ g of the DNA was partially digested with the restriction enzyme Sau3A and separated on a preparative agarose gel. Fragments between 5 and 12 kb were eluted from the gel using the Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden). The DNA fragments obtained in this way were ligated into BamHI-digested Lambda ZAP-Express arms (Stratagene, La Jolla, USA) and then packaged in vitro (Gigapack III Gold Packaging Extract, Stratagene, according to the manufacturer's instructions). E. co // bacteria of the strain XL-MRF '(Stratagene) were infected with recombinant lambda phages, the titer of the bank determined and finally the bank amplified.
  • E. coli Bacterial strains and plasmids E. coli (XL-1 Blue, XL-MRF 'and XLOLR) bacteria were obtained from Stratagene. Erwinia rhapontici (DSM 4484) was obtained from the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH (Braunschweig, Germany). The Agrobacterium used for plant transformation Strain (C58C1 with plasmid pGV 3850kan) was developed by Debleare et al. (1985, Nucl. Acids Res. 13: 4777).
  • the vectors pCR-Blunt (Invitrogen, Netherlands), pMAL-c2 (New England Biolabs), pUC 19 (Yanish-Perron (1985) Gene 33: 103-1 19) and Binl9 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12: 871 1-8720) was used.
  • sucrose isomerase A subfragment of sucrose isomerase was cloned by means of polymerase chain reaction (PCR). Genomic DNA from E. rhapontici, which according to Standard protocol was isolated. The amplification was carried out using the specific primers
  • Primer FB 84 5'-GTCGACGTCTTGCCAAAAACCTT-3 ', which were derived from a sucrose isomerase sequence of the prior art.
  • Primer FB 83 comprises bases 109-127 and primer FB 84 bases 1289-1306 of the coding region of the sucrose isomerase gene from E. rhapontici.
  • the PCR reaction mixture (100 ⁇ l) contained chromosomal bacteria DNA (1 ⁇ g), primers FB 83 and FB 84 (250 ng each), Pfu DNA polymerase reaction buffer (10 ⁇ l, Stratagene), 200 ⁇ M dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 2.5 units of Pfu DNA polymerase (Stratagene).
  • the mixture was heated to 95 ° C. for 5 min.
  • the polymerization steps (30 cycles) were carried out in an automatic T3 thermal cycler (Biometra) according to the following program: denaturation 95 ° C (1 minute), attachment of the primers at 55 ° C (40 seconds), polymerase reaction at 72 ° C ( 2 minutes).
  • the fragment obtained was cloned into the vector pCR blunt (Invitrogen). The identity of the amplified DNA was verified by sequence analysis.
  • Example 2 To isolate the palatinose operon, a genomic library with a subfragment of sucrose isomerase (see Example 1) was screened. Several positive clones were isolated. By completely sequencing and assembling these clones, several open reading frames could be identified which code for enzymes of the palatinose metabolism (see above overview of the genes of the palatinose operon and the associated gene products).
  • the sketch below shows a schematic overview of the cloned palatinose gene cluster from Erwinia rhapontici. The position of the open reading frame and the direction of transcription are shown by arrows.
  • the complete open reading frame of the palatinase was cloned by means of the polymerase chain reaction (PCR). Genomic DNA from E. rhapontici, which was isolated according to the standard protocol, was used as template material. The amplification was carried out using the specific primers
  • Primer FB 180 comprises bases 2-21, primer FB 176 bases 1638-1656 of the coding region of the palatinase gene.
  • the primers additionally carry the following restriction cloning sites: Primer FB 180 Bglll; Primer FB 176 Sall.
  • the PCR reaction mixture (100 ⁇ l) contained chromosomal bacterial DNA (1 ⁇ g), primers FB 180 and FB 176 (250 ng each), Pfu DNA polymerase reaction buffer (10 ⁇ l, Stratagene), 200 ⁇ M dNTPs (dATP, dCTP, dGTP.dTTP) and 2.5 units of Pfu DNA polymerase (Stratagene).
  • the DNA sequence which codes for a palatinase, was fused with a signal peptide of a plant gene (proteinase inhibitor II gene from potato (Solanum tuberosum, Keil et al (1986, vide supra)) required for inclusion in the endoplasmic reticulum) and under brought the control of the 35S RNA promoter, whereby the plasmid p35S-cwp ⁇ / ⁇ ) was formed.
  • a plant gene proteinase inhibitor II gene from potato (Solanum tuberosum, Keil et al (1986, vide supra) required for inclusion in the endoplasmic reticulum
  • the palatinase fragment was cut out of the construct pCR-palQ via the restriction sites BglII and Sall and ligated into a pMA vector opened in BamHI / Sall.
  • the vector pMA represents a modified form of the vector pBinAR (Höfgen and Willmitzer (1990) Plant Sci.66: 221-230), which contains the 35S promoter of the Cauliflower mosaic virus, which mediates constitutive expression in transgenic plants Signal peptide of the proteinase inhibitor II from potato (Keil et al. 1986, vide supra)), which mediates the targeting of the fusion protein into the cell wall, and contains a plant termination signal.
  • the plant termination signal includes the 3 'end of the polyadenylation site of the octopine synthase gene. Interfaces for the restriction enzymes BamHI are located between the partial sequence of the proteinase inhibitors and the termination signal.
  • Xbal, Sall, PstI and SphI in this order, which allow the insertion of corresponding DNA fragments, so that a fusion protein is formed between the proteinase inhibitor and the inserted protein, which is then in the cell wall of transgenic plants or plant cells that express this protein (see Figure 2).
  • Fragment A contains the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S RNA promoter. It contains a fragment which comprises nucleotides 6909 to 7437 of the CaMV (Franck (1980) Cell 21, 285.
  • CaMV Cauliflower Mosaic Virus
  • Fragment B contains nucleotides 923-1059 of a proteinase inhibitor II gene from the potato (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra), which targets the palatinase gene via a linker with the sequence ACC GAA TTG GG Erwinia rhapontici, which comprises nucleotides 2-1656, is fused.
  • a signal peptide of a vegetable protein necessary for the uptake of proteins into the endoplasmic reticulum is fused to the palatinase sequence at the N-terminal.
  • Fragment C contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), nucleotides 11749-11939.
  • the functional characterization of the palatinase gene was carried out by expression of the recombinant protein in E. coli.
  • the plasmid pQE-palQ was transformed into E. coli (XL-I blue, Stratagene).
  • the recombinant protein was expressed in one according to the manufacturer's instructions (Qiagen, Hilden, Germany) Culture scale of 50 ml. After harvesting the cells by centrifugation, the pellet was resuspended in 1 ml of 30 mM HEPES (pH 7.5) and the soluble protein fraction was released by ultrasound treatment. 20 ⁇ l of the crude extract were mixed with 80 ⁇ l 100 mM palatinose and incubated at 30 ° C. for 40 minutes. To detect the palatinase activity, the glucose released was determined in an aliquot of the mixture by a coupled optical-enzymatic test. The palatinase activity of the recombinant enzyme was clearly demonstrated.
  • the enzyme shows its highest activity at a reaction temperature of 30 ° C and a pH of 7.0.
  • a K m value for palatinose of 10 mM and a maximum reaction rate for a substrate concentration of 90 mM palatinose could be determined.
  • Figure 3 shows the cultivation of tobacco leaf discs on MS medium with palatinose as the sole carbon source (Fig. 3A: with 0.8% palatinose.
  • Fig. 3B with 1.6% palatinose
  • leaf disks do not form calli on a medium with palatinose as the only carbon source.
  • the addition of palatinose has no toxic effect on the plant cells.
  • tobacco was transformed using Agrobacterium-mediated gene transfer with the construct p35S-cwPal (see Example 4) (leaf disk transformation) and the leaf disks following the infection and incubation with Agrobacteria on MS regeneration medium with 1.6% palatinose cultivated as the only carbon source. After about 3 weeks, transformed shoots were visible, which were rooted with palatinose on hormone-free MS medium.
  • the complete open reading frame of the trehalulase was cloned by means of the polymerase chain reaction (PCR). Genomic DNA from E. rhapontici, which was isolated according to the standard protocol, was used as template material. The amplification was carried out using the specific primers
  • Primers FBI 84 and FBI 85 comprise bases 4-23 and 1638-1659, respectively, of the coding region of the trehalulase gene.
  • the primers additionally carry the following restriction cloning sites: primers FB 96 or FBI 84, BamHI; primer
  • the PCR reaction mixture (100 ⁇ l) contained chromosomal bacteria
  • DNA (1 ⁇ g), primers FB184 and FB185 (each 250 ng), Pfu DNA polymerase reaction buffer (10 ⁇ l, Stratagene), 200 ⁇ M dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 2.5 units Pfu DNA polymerase (Stratagene).
  • Pfu DNA polymerase reaction buffer 10 ⁇ l, Stratagene
  • 200 ⁇ M dNTPs dATP, dCTP, dGTP, dTTP
  • 2.5 units Pfu DNA polymerase (Stratagene).
  • the polymerization steps (30 cycles) were carried out in an automatic T3 thermal cycler (Biometra) according to the following program: denaturation 95 ° C (1 minute), attachment of the primers at 55 ° C (40 seconds), polymerase reaction at 72 ° C ( 2 minutes).
  • Fragment A contains the sequence of an E. rhapontici trehalulase that extends from nucleotide 4 - 1659 of the trehalulase gene.
  • the DNA sequence which codes for a trehalulase, was fused with a signal peptide of a plant gene (proteinase inhibitor II gene from potato (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra)) necessary for inclusion in the endoplasmic reticulum and under brought the control of the 35S RNA promoter, whereby the plasmid p35 S-cwpalZ was formed.
  • a plant gene proteinase inhibitor II gene from potato (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra)
  • the trehalulase fragment was cut out of the construct pCR-palZ via the restriction sites BamHI and Sall and ligated into a pMA vector opened in BamHI / Sall.
  • the pMA represents a modified form of the vector pBinAR (Höfgen and Willmitzer 1990, vide supra), which is the 35S promoter of the Cauliflower mosaic virus, which mediates constitutive expression in transgenic plants, a signal peptide of the proteinase inhibitor II from potato (Keil et al. 1986, vide supra), which mediates the targeting of the fusion protein into the cell wall, and contains a plant termination signal.
  • the plant termination signal contains the 3 'end of the polyadenylation site of the octopine synthase gene. Between the partial sequence of the proteinase inhibitor and the termination signal there are interfaces for restriction enzymes BamHI, Xbal, Sall, PstI and SphI (in this order), which allow the insertion of corresponding DNA fragments, so that a fusion protein between the proteinase inhibitor and the pasted Protein is formed, which is then transported into the cell wall of transgenic plants or plant cells that express this protein.
  • restriction enzymes BamHI, Xbal, Sall, PstI and SphI in this order
  • Fragment A contains the 35S promoter of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV). It contains a fragment which comprises the nucleotides 6909 to 7437 of the CaMV (Franck (1980) Cell 21: 285).
  • CaMV Cauliflower Mosaic Virus
  • Fragment B contains nucleotides 923-1059 of a proteinase inhibitor II gene from the potato (Solanum tuberosum) (Keil et al. 1986, vide supra), which targets the trehalulase gene via a linker with the sequence ACC GAA TTG GG
  • Erwinia rhapontici which comprises nucleotides 4 - 1659, is fused.
  • a signal peptide of a vegetable protein necessary for the uptake of proteins into the endoplasmic reticulum is fused to the trehalulase sequence at the N-terminal.
  • Fragment C contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), nucleotides 1 1749-1 1939.
  • pQE-palO corresponds to what the palatinase sequence relates to pCK-palQ, but is suitable for the expression of the palatinase sequence in E. coli.
  • the reaction mixture (50 ⁇ l) for PCR-based mutagenesis was composed as follows: 50 ng pQE-palO DNA, each 250 ng 5′- or 3′-primer, Pfu-DNA polymerase reaction buffer (5 ⁇ l.
  • the mutation event was verified in each case by sequencing the corresponding region of the palatinase sequence. Functional expression of the mutagenized enzyme in E. coli has shown in all cases that the respective amino acid substitution does not have a negative effect on the enzymatic activity. The mutations were then combined with one another using the strategy described above, so that ultimately a palatinase was produced which no longer has any putative glycosylation sites. This enzyme, too, had no adverse catalytic properties after expression in E. coli.
  • the mutated palatinase sequence was then cloned into a plant transformation vector and expressed in plants.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinose-Hydrolase, auch als Palatinase bezeichnet, bzw. einer Trehalulose-Hydrolase, auch als Trehalulase bezeichnet, kodiert, und die Verwendung dieser Nukleinsäuremoleküle als Selektionsmarker in transformierten Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. einer Trehalulase kodiert, und worin diese DNA-Sequenz unter Kontrolle von regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors steht. Weiter betrifft die Erfindung Vektoren und Wirtszellen, die die erfindungsgemässen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle enthalten. Weiter werden Verfahren zur Herstellung transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen unter Verwendung der rekombinanten Nukleinsäuremoleküle und Vektoren bereitgestellt. Weiter betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, deren Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial sowie transgene Pflanzenzellen, die die erfindungsgemässen Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten oder durch das erfindungsgemässen Verfahren hergestellt werden. Die Erfindung betrifft insbesondere auch die Verwendung von DNA-Sequenze, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinose-Hydrolase bzw. einer Trehalulose-Hydrolase kodieren, als nutritiver Selektionsmarker in Pflanzenzellen zur Selektion transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Selektion von Mikroorganismen auf Palatinose- bzw. Trehalulose-haltigem Medium.

Description

Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Nukleinsauremolekule, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinose-Hydrolase. auch als Palatinase bezeichnet, bzw. einer Trehalulose- Hydrolase, auch als Trehalulase bezeichnet, kodiert, und die Verwendung dieser Nukleinsauremolekule als Selektionsmarker in transformierten Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung rekombinante Nukleinsäuremolelüle, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. einer Trehalulase kodiert, und worin diese DNA-Sequenz unter Kontrolle von regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors steht. Weiter betrifft die Erfindung Vektoren und Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule enthalten. Weiter werden Verfahren zur Herstellung transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen unter Verwendung der rekombinanten Nukleinsauremolekule und Vektoren bereitgestellt. Weiter betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, deren Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial sowie transgene Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule oder Vektoren enthalten oder durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden. Die
Erfindung betrifft insbesondere auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinose-Hydrolase bzw. einer Trehalulose-Hydrolase kodieren, als nutritive Selektionsmarker in Pflanzenzellen zur Selektion transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Selektion von Mikroorganismen auf Palatinose- bzw. Trehalulose-haltigem Medium.
Mittels gentechnischer Verfahren ist es möglich, gezielt Fremdgene in das pflanzliche Genom einzuführen. Dieser Prozeß wird als Transformation und die resultierende Pflanzenzelle bzw. Pflanze als transformiert oder transgen oder auch als Transformante bezeichnet. Die vornehmlichen Ziele der klassischen wie der modernen, auf gentechnischen Methoden basierenden Pflanzenzüchtung sind zum einen der Pflanzenschutz, also insbesondere die Steigerung der pflanzlichen Widerstandskraft gegenüber Phytopathogenen. und zum anderen eine Verbesserung der Qualität der Ernteprodukte. Beispiele für Pflanzenschutzmaßnahmen sind: i) herbizidtolerante Pflanzen, ii) insektenresistente, virusresistente und pilzresistente Pflanzen und iii) ozonresistente Pflanzen. Beispiele für Qualitätssteigerungen sind: i) die Erhöhung der Haltbarkeit von Früchten, ii) die Erhöhung der Stärkeproduktion in Kartoffelknollen, iii) die Veränderung der Kohlenhydrat- und Lipid- zusammensetzung und iv) die Produktion pflanzenfremder Polymere.
Grundvoraussetzung für die Erzeugung transgener Pflanzen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme und das Vorhandensein selektionierbarer Marker, die die Identifizierung erfolgreich transformierter Pflanzenzellen ermöglichen.
Zur Transformation stehen derzeit mehrere Verfahren zur Verfügung. Die am häufigsten eingesetzte Methode zur Pflanzentransformation ist der Agrobakterium- vermittelte Gentransfer. Hierbei wird die Fähigkeit des Bodenbakteriums ausgenutzt, genetisches Material in das pflanzliche Genom zu integrieren. Weitere geeignete Verfahren sind beispielsweise die Transformation von Protoplasten durch PEG- induzierte DNA- Aufnahme, die Elektroporation, die Sonikation oder Mikroinjektion sowie die Transformation intakter Zellen oder Gewebe durch Mikro- oder Makroinjektion in Gewebe oder Embryonen, Gewebeelektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, Vakuuminfiltration von Samen und der biolistische Gentransfer.
Da unabhängig vom Transformationsverfahren nur wenige Zellen die gewünschten Eigenschaften tragen, wird herkömmlicher Weise neben dem Zielgen, also dem aus agronomischer Sicht interessierenden Gen, ein selektionierbares Markergen in das pflanzliche Genom integriert, das die Identifizierung transgener Zellen auf relativ einfache und effiziente Weise ermöglicht. Derzeit werden zur Selektion transformierter Pflanzenzellen vornehmlich Gene eingesetzt, die eine Herbizid- oder Antibiotikatoleranz vermitteln. Geeignete Resistenzgene sind beispielsweise das bar- Gen aus Streptomyces hygroscopicus, das Resistenz gegen das Totalherbizid Phosphinotricin (BASTA®) vermittelt (De Block et al. (1987) EMBO J. 6:2513- 2518). oder das nptll-Gen aus dem Transposon Tn5 von Escherichia coli, das Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Kanamycin bewirkt (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-995).
Weitere Selektionsmarker, die in der Pflanzentransformation Verwendung finden, vermitteln den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff und Gentamycin.
Allerdings sind je nach Pflanzenart die genannten Selektionsmaßnahmen nicht immer effektiv und beeinflussen häufig die Pflanzenregeneration negativ. Darüber hinaus ist der Einsatz von Genen, die Antibiotikaresistenz vermitteln, im Lebensmittelbereich unerwünscht. Des weiteren ist zur Steuerung komplexer
Stoffwechselprozesse die Manipulation mehrerer enzymatischer Schritte notwendig. D.h. die Möglichkeit transgene Pflanzen mehrfach zu transformieren ist im Bereich des „Metabolie Modellings'' essentiell. Die genannten Gründe haben dazu geführt, dass die Suche nach weiteren selektionierbaren Markern verstärkt vorangetrieben wird. Trotz intensiver Bemühungen sind nur wenige neue Marker zur Selektion transformierter Pflanzenzellen erfolgreich eingesetzt worden. So konnte bspw. durch Expression einer Mannose-6-Phosphat-Isomerase eine positive Selektion auf Mannose-haltigem Nährmedium für transformierte Pflanzenzellen etabliert werden. Ein weiteres Verfahren nutzt die Fähigkeit einer Deaminase aus Aspergillus terreus aus, das Insektizid Blasticidin S zu detoxifizieren.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen neuen Marker für die Selektion transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen bereitzustellen. Diese und weitere Aufgaben werden durch die in den Patentansprüchen definierten Ausführungsformen gelöst.
Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass sich DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. einer Trehalulase, auch als Palatinose-Hydrolase bzw. Trehalulose-Hydrolase bezeichnet, kodieren, für die Selektion transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen eignen.
Während Antibiotika und Herbizide zum Absterben nicht-transformierter Zellen führen, was auch negative Auswirkungen auf die Regenerationsfähigkeit transformierter Zellen hat, führt die erfindungsgemäße Selektion auf bzw. in Palatinose-haltigem Medium bzw. Trehalulose-haltigem Medium nicht zum Absterben nicht-transformierter Zellen. Die erfindungsgemäßen, transformierten Zellen können anders als die nicht-transformierten Zellen die Palatinose bzw. Trehalulose verstoffwechseln und haben somit einen Selektionsvorteil. Ähnliches gilt für das oben erwähnte Mannosesystem. Da allerdings viele Pflanzen Mannose natürlicherweise verstoffwechseln können, kann der Mannose-Marker nicht in allen Nutzpflanzen eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft somit ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors; b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. einer Trehalulase kodiert: und c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in
Pflanzenzellen dienen können.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase ein Protein verstanden, das in der Lage ist, Palatinose bzw. Trehalulose zu spalten, insbesondere die
Umsetzung des Disaccharids Palatinose bzw. Trehalulose in die Monosaccharide Fructose und Glucose zu katalysieren. In dem Disaccharid Palatinose liegen die beiden Monosaccharideinheiten in einer αl- 6 glykosidischen Bindung vor, während in Trehalulose Fructose und Glucose über eine cd— > \ glykosidische Bindung verknüpft sind.
Sequenzen, die eine Palatinase kodieren, sind im Stand der Technik beschrieben worden. So offenbart PCT/EP 95/00165 die Sequenz eines Palatinase-Gens aus dem Bakterium Protaminobacter rubrum sowie die Sequenz eines Palatinase-Gens aus dem Bakterium Pseudomonas mesoacidophila MX-45.
Nukleinsauremolekule, in denen eine eine Palatinase kodierende DNA-Sequenz unter Kontrolle eines pflanzlichen Promotors steht, und die Expression eines Proteins mit Palatinase-Aktivität in Pflanzen sind ebenso neu wie die im Rahmen dieser Erfindung jetzt erstmals offenbarte DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodiert. Diese Sequenz ist im beigefügten Sequenzprotokoll unter SEQ ID No. 1 angegeben, die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3 angegeben. Ferner wird bei der vorliegenden Erfindung erstmals eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert. Diese Sequenz ist im beigefügten Sequenzprotokoll unter SEQ ID No. 25 angegeben, die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID No. 26 bzw. 27 angegeben.
Die Erfindung betrifft somit auch die in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 25 angegebenen Nukleotidsequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, sowie die Verwendung von
Nukleinsäuremolekülen. die Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, zur Selektion von transformierten Pflanzenzellen und Pflanzen.
Es wurde jetzt überraschenderweise beobachtet, dass transformierte Pflanzenzellen bzw. Pflanzen, die eine Palatinase bzw. Trehalulase exprimieren, aufgrund dieser neuen enzymatischen Eigenschaft auf bzw. in Palatinose- bzw. Trehalulose-haltigem Medium wachsen und regenerieren können, während Wildtyp-Pflanzenzellen bzw. Pflanzen nicht in der Lage sind, Palatinose bzw. Trehalulose als Kohlenhydratquelle zu verwerten, und daher auf bzw. in Palatinose- bzw. Trehalulose-haltigem Medium weder wachsen noch regenerieren. Diese Beobachtung läßt sich in idealer Weise für die Selektion transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen nutzen. Dabei sind Palatinase und Trehalulase als neue nutritive Marker in allen Pflanzen einsetzbar, die die Disaccharide Palatinose bzw. Trehalulose natürlicherweise nicht umsetzen und verwerten können. Da bislang Pflanzen, die Palatinose bzw. Trehalulose verwerten können, nicht bekannt sind, können die neuen Selektionsmarker ubiquitär eingesetzt werden. Die auf der Grundlage ihrer neuen Palatinase-Aktivität bzw. neuen Trehalulose-Aktivität selektionierten Pflanzenzellen und Pflanzen sind phänotypisch normal.
Dabei umfasst die vorliegende Erfindung sowohl die Möglichkeit, Pflanzen alternativ mit einem Palatinase-Gen oder einem Trehalulose-Gen zu transformieren als auch die Möglichkeit, Pflanzen mit einem Palatinase-Gen und mit einem Trehalulase-Gen zu transformieren.
Die jetzt erstmals für Pflanzenzellen beobachtete Nützlichkeit von Palatinase- Sequenzen bzw. Trehalulase-Sequenzen als nutritive Selektionsmarker, lässt sich auch erfolgreich für andere transformierte Zellen nutzen. Grundsätzlich kann das erfindungsgemäße Prinzip der Nutzbarmachung der nicht verwertbaren Zucker Palatinose bzw. Trehalulose auf jede Zelle bzw. jeden Organismus übertragen werden, der natürlicherweise nicht in der Lage ist, Palatinose bzw. Trehalulose zu verwerten.
Die Erfindung betrifft somit auch den Einsatz von DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, als Marker für die Selektion transformierter Zellen, bei denen es sich nicht um Pflanzenzellen, sondern andere eukaryontische oder prokaryontische Zellen bzw. Organismen handelt. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Mikroorganismen wie Bakterien. Viren, Pilze, Hefen und Algen.
So kann z.B. eine sekretierte Palatinase bzw. Trehalulase in beispielsweise E. coli zur Expression gebracht und erfolgreich transformierte Bakterienzellen anschließend auf Palatinose-haltigem bzw. Trehalulose-haltigem Medium selektioniert werden. Gleiches gilt natürlich auch für andere Zellen bzw. Organismen. Der Fachmann ist mit den hierfür erforderlichen Klonierungs-, Expressions- und Transformationstechniken wohl vertraut.
Die Palatinase kann auch im Zellinneren der zu selektionierenden Zelle exprimiert werden, also z.B. im Cytosol einer E. coli-Zelle. Dies hat den Vorteil, dass weder die Palatinase noch die durch die Palatinase-Aktivität entstehenden Hexosen in das Medium diffundieren können. Hier bietet sich die zusätzliche Expression des im Rahmen dieser Erfindung erstmals isolierten und charakterisierten Palatinosetransporters an. Die vorstehenden Ausführungen gelten analog für die Expression einer Trehalulase.
Wie in den beigefügten Beispielen im Detail erläutert wird, wurde im Rahmen dieser Erfindung der gesamte Palatinose-Gencluster, auch als Palatinose-Operon bezeichnet, aus Erwinia rhapontici kloniert, das folgende Gene umfasst:
Entsprechend führt die Übertragung des gesamten Operons oder zumindest der am ABC-Transportsystem beteiligten Gene palE, palF, palG und palK zur Expression des Palatinose-Transporters in den transformierten Zellen, vorzugsweise Mikroorganismen. Die den Transporter exprimierenden Zellen können die Palatinose bzw. Trehalulose aus dem Medium aufnehmen, so dass die Hydrolyse durch den Selektionsmarker Palatinase bzw. Trehalulase im Cytosol der Zelle erfolgen kann.
Die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzenzellen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die für die gentechnische Manipulation in prokaryonti sehen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse-,
Restriktionsanalyse- und weitere biochemisch-molekularbiologischen Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. So können nicht nur geeignete chimäre Genkonstrukte mit der gewünschten Fusion von Promotor und Palatinase- bzw. Trehalulase-DNA-Sequenz und ggf. weiteren Regulations- und/oder Signalsequenzen hergestellt werden, vielmehr kann der Fachmann, falls erwünscht, zusätzlich mittels Routinetechniken, verschiedenartige Mutationen in die die Palatinase bzw. Trehalulase kodierende DNA-Sequenz einführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt.
Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletion vom 5'- oder vom 3 '-Ende der kodierenden DNA- Sequenz die Synthese entsprechend verkürzter Proteine erreicht werden kann. Ferner ist es möglich, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Addition entsprechender Signalsequenzen in bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisiert sind. Derartige Sequenzen sind in der Literatur beschrieben und dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt (siehe z.B. Braun et al. (1992) EMBO J. 11 :3219-3227; Wolter F. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:846-850; Sonnewald U. et al. (1991) Plant J. 1 :95-106).
Weiterhin ist auch die Einführung von Punktmutationen denkbar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluss beispielsweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z.B. Mutanten hergestellt werden, die nicht mehr den normalerweise in der Zelle herrschenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen.
Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-, Temperatur- und/oder pH-Profil aufweisen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule oder Teile davon in
Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al. (1989), vide supra) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente, wo erforderlich, Adapter oder Linker angefügt werden. Ferner können mittels enzymatischer und anderer Manipulationen passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung gestellt oder überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, „primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethoden werden im allgemeinen Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden durchgeführt.
Wie oben erwähnt, wird im Rahmen dieser Erfindung eine neue Palatinase-DNA- Sequenz aus Erwinia rhapontici bereitgestellt. Weitere im Rahmen dieser Erfindung geeignete DNA-Sequenzen, die ein Protein mit Palatinase-Aktivität kodieren, sind in PCT/EP 95/00165 beschrieben. Auf die Offenbarung dieser Patentanmeldung wird hiermit Bezug genommen, sowohl hinsichtlich der offenbarten Sequenzen selbst, als auch im Hinblick auf die Auffindung und Charakterisierung dieser Palatinase- Sequenzen.
Weiterhin werden im Rahmen dieser Erfindung neben einer neuen Palatinase-DNA- Sequenz und einer neuen Trehalulase-DNA-Sequenz weitere für die Palatinoseaufnahme in Zellen notwendige Gene eines Palatinose-Transportersystems aus Erwinia rhapontici bereitgestellt.
Darüber hinaus kann der Fachmann weitere DNA-Sequenzen, die Proteine mit
Palatinase- bzw. Trehalulase-Aktivität kodieren, der einschlägigen Literatur und den Gendatenbanken unter Verwendung geeigneter Suchprofile und Computerprogramme für das Screening nach homologen Sequenzen bzw. für Sequenzvergleiche entnehmen.
Darüber hinaus kann der Fachmann weitere DNA- Sequenzen, die Proteine mit Palatinase- bzw. Trehalulase-Aktivität kodieren, aus anderen Organismen mittels herkömmlicher molekularbiologischer Techniken selbst auffinden und im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzen. So kann der Fachmann bspw. geeignete Hybridisierungssonden von den bekannten Palatinase-Sequenzen ableiten und für das Screening von cDNA- und/oder genomischen Banken des jeweils gewünschten Organismus, aus dem ein neues Palatinase-Gen isoliert werden soll, einsetzen. Hierbei kann der Fachmann auf geläufige Hybridisierungs-, Klonierungs- und Sequenzierungsmethoden zurückgreifen, die in jedem bio- oder gentechnologischen Labor wohl bekannt und etabliert sind (siehe z.B. Sambrook et al (1989). vide supra). Diese im Zusammenhang mit Palatinase-DNA-Sequenzen gemachten Ausfuhrungen gelten auch für die übrigen, im Rahmen dieser Erfindung erstmals zur Verfügung gestellten DNA-Sequenzen aus Erwinia rhapontici, insbesondere für die erfindungsgemäße Trehalulase-DNA-Sequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID NO. 3 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 1 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen, c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz. die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisieren, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen, d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen, e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a). b). c) oder d) darstellen.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodiert, ausgewählt aus den in PCT/EP 95/00165 in SEQ ID No. 7 und SEQ ID No. 15 angegebenen DNA- Sequenzen sowie DNA-Sequenzen, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die mit einem komplementären Strang dieser DNA-Sequenzen hybridisieren, sowie DNA- Sequenzen, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die zu einer der vorangehend genannten Nukleinsäuresequenzen degeneriert ist und DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer der vorangehenden Nukleinsäuresequenzen darstellen und ein Protein mit Palatinase-Aktivität kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID NO. 27 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 25 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen, c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisieren, oder Teile dieser
Nukleotidsequenz umfassen, d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen, e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a). b), c) oder d) darstellen.
Um Glykosylierungen der Palatinase bzw. der Trehalulase in transgenen Pflanzen zu vermeiden, kann es vorteilhaft sein, bestimmte Aminosäuren der Palatinase bzw. Trehalulase durch ortsgerichtete Mutagenese auszutauschen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird somit eine DNA- Sequenz bereitgestellt, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder einer Trehalulase kodiert, wobei in dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase durch mindestens einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyprotein eine Glykosylierungsstelle inaktiviert ist. Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989. vide supra) beschrieben sind. Besonders bevorzugt sind die stringenten Bedingungen wie folgt: 1 x SSC, 0,1% SDS bei einer Hybridisierungstemperatur von 55 °C für eine Dauer von 1 h.
DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen hybridisieren, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, können z.B. aus genomischen oder cDNA-Bibliotheken eines beliebigen Organismus, der Palatinase- DNA-Sequenzen bzw. Trehalulase-DNA-Sequenzen natürlicherweise besitzt, isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger DNA-Sequenzen kann dabei z.B. unter Verwendung von DNA-Sequenzen erfolgen, die exakt oder im wesentlichen die in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 25 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon oder eine der oben erwähnten eine Palatinase bzw. Trehalulase kodierenden Nukleotidsequenzen des Standes der Technik oder Teile dieser Sequenzen aufweisen, bzw. der reversen Komplemente dieser DNA- Sequenzen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al. (1989), vide supra). Bei den als Hybridisierungssonde verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe üblicher Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit einer der oben erwähnten Palatinase-DNA-Sequenzen bzw. Trehalulase-DNA- Sequenzen oder einem Teil davon übereinstimmt. Die DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymaischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, umfassen auch DNA-Sequenzen, deren Nukleotidsequenzen zu der einer der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen degeneriert ist. Die Degeneration des genetischen Codes bietet dem Fachmann u.a. die Möglichkeit, die Nukleotidsequenz der DNA-Sequenz an die Codonpräferenz (codon usage) der Zielpflanze, also der aufgrund der Expression der Palatinase-DNA-Sequenz auf bzw. in Palatinose- haltigem Medium selektionierbaren Pflanze bzw. Pflanzenzelle anzupassen und die Expression dadurch zu optimieren.
Die oben beschriebenen DNA-Sequenzen umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren. Unter "Fragmenten" werden dabei Teile der DNA-Sequenz verstanden, die lang genug sind, um eines der beschriebenen Proteine zu kodieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Sequenzen sich von den oben beschriebenen DNA-Sequenzen an einer oder mehreren Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40 Prozent, insbesondere eine Identität von mindestens 60 Prozent, vorzugsweise über 80 Prozent und besonders bevorzugt über 90 Prozent. Dabei weisen die durch diese DNA-Sequenzen kodierten Proteine eine Sequenzidentität zu der in SEQ ID No. 2 und 3 bzw. SEQ ID No. 26 und 27 angegebenen Aminosäuresequenz von mindestens 80 Prozent, vorzugsweise 85 Prozent und besonders bevorzugt über 90 Prozent, 95 Prozent und 98 Prozent auf. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen DNA-Sequenzen können dabei beispielsweise durch Deletion. Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Bei den DNA-Sequenzen, die homolog zu den oben beschriebenen Sequenzen sind und Derivate dieser Sequenzen darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Sequenzen, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA- Techniken erzeugte Varianten. Obige, im Zusammenhang mit Palatinase- bzw.
Trehalulase-DNA-Sequenzen gemachten Ausführungen gelten auch für die übrigen, im Rahmen dieser Erfindung erstmals zur Verfügung gestellten DNA-Sequenzen aus Erwinia rhapontici.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammen die beschriebenen, für eine Palatinase bzw. Trehalulase kodierenden DNA-Sequenzen aus Erwinia rhapontici.
Für die Expression der in den erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremolekülen enthaltenen DNA-Sequenz in pflanzlichen Zellen ist diese mit regulatorischen Sequenzen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hier kommt jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage.
Dabei kann der Promotor so gewählt sein, dass die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe oder Organ, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung und/oder zu einem durch äußere Einflüsse, biotische oder abiotische Stimuli bestimmten Zeitpunkt (induzierte Genexpression). In Bezug auf die zu transformierende Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein.
Geeignete Promotoren sind z.B. der 35S RNA-Promotor des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben garantiert. z.B. der ST-LS1 -Promotor (Stockhaus et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7943-7947; Stockhaus et al. (1989) EMBO J. 8:2445-2451) oder ein Promotor, der während der Pflanzentransformation, der Pflanzenregeneration oder bestimmten Stadien dieser Prozesse aktiv ist, wie z.B. zellteilungsspezifische Promotoren wie der Histon H3-Promotor (Kapros et al. (1993) InVitro Cell Cev.
Biol. Plant 29:27-32) oder das chemisch induzierbare Tet-Repressor-System (Ganz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Weitere geeignete Promotoren können der Literatur. z.B. Ward (1993, Plant Mol. Biol. 22:361-366), entnomen werden. Gleiches gilt für induzierbare und zell- bzw. gewebespezifische Promotoren, wie Meristem-spezifische Promotoren, die ebenfalls in der Literatur beschrieben worden sind und im Rahmen der Erfindung ebenfalls geeignet sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor der 35S RNA-Promotor von CaMV.
Ferner sind Transkriptions- bzw. Terminationssequenz vorhanden, die der korrekten Beendigung der Transkription dient, sowie der Addition eines polyA-Schwanzes an das Transkript dienen kann, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (z.B. Gielen (1989) EMBO J. 8:23-29) und beliebig austauschbar, z.B. der Terminator des Octopinsynthasegens aus Agrobacterium tumefaciens.
Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren, die erfindungsgemäße Nukleinsauremolekule enthalten und deren Verwendung die Selektion transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen ermöglicht. Dabei handelt es sich insbesondere um Plasmide, Cosmide. Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien. M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. co/z'-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße rekombinante Nukleinsäuremolekül, das eine eine Palatinase bzw. Trehalulase kodierende DNA- Sequenz enthält, oder der erfindungsgemäße Vektor, enthaltend ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül mit einer Palatinase- bzw. Trehalulase- DNA-Sequenz, mindestens ein weiteres rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das eine beliebige genetische Information trägt, die zusammen mit der Palatinase-DNA- Sequenz auf Pflanzenzellen bzw. Pflanzen übertragen werden soll. Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule und Vektoren kann jede beliebige Information, die in dem weiteren rekombinanten Nukleinsäuremolekül enthalten ist. auf pflanzen und Pflanzenzellen übertragen und anschließend mittels Selektion auf Palatinose- bzw. Trehalulose-haltigem Medium auf die gewünschte Information selektioniert werden. Dem auf dem Gebiet der pflanzlichen Molekularbiologie tätigen Fachmann ist daneben auch bekannt, dass die zusätzliche genetische Information, die auf Pflanzenzellen transferiert werden soll, nicht unbedingt zusammen mit den Selektionsmarkern Palatinase und Trehalulase auf demselben Vektor vorliegen muß. Vielmehr können das Nukleinsäuremolekül, das den Selektionsmarker trägt, einerseits und das Nukleinsäuremolekül, das die zusätzliche Information trägt, andererseits auch getrennt voneinander in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, sog. Co-Transformation. Dieses Vorgehen bietet sich besonders in den Fällen an, in denen eine physikalische Kopplung des Markergens und der zu übertragenen Information nicht gewünscht wird. In diesem Fall können nach der Selektion der Primärtransformanten das Markergen und die gewünschte Information in nachfolgenden Kreuzungen unabhängig voneinander segregieren.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform enthält das weitere rekombinante Nukleinsäuremolekül eine DNA-Sequenz, die ein Peptid, ein Protein, eine Antisense- RNA, eine Sense-RNA, eine virale RNA oder ein Ribozym kodiert. Einige Beispiele zur heterologen Expression bzw. Überexpression und zur Antisense-Inhibierung mit dem Ziel, Stoffwechselwege in transgenen Pflanzen zu manipulieren, sind in Herbers and Sonnewald (1996, TIBTECH 14: 198-205) zusammengefaßt. Andere Ziele sind insbesondere die Übertragung von Resistenzen, die Nutzung von Pflanzen als
Produktionsstätte für Proteine. Kohlenhydrate, Fette, nachwachsende Rohstoffe und andere, von Pflanzen synthetisierbaren Stoffen.
Die erfindungsgemäßen Vektoren und Nukleinsauremolekule können weitere regulatorische Sequenzen und/oder Funktionseinheiten besitzen, die z.B. als
Enhancer wirken oder eine Stabilisierung des Vektors in der Wirtszelle bewirken. Wie oben erwähnt, können die kodierenden Sequenzen auch durch Signalsequenzen ergänzt sein, die für den Transport des Genprodukts, also vorliegend des Proteins mit Palatinase- bzw. Trehalulase-Aktivität, zu einem bestimmten Kompartiment sorgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sorgen Signalsequenzen dafür, das die Palatinase bzw. Trehalulase in die Zellwand der transformierten
Pflanzenzellen transportiert wird. d.h. die transformierten Pflanzen exprimieren eine chimäre Palatinase bzw. Trehalulase. die ein Signalpeptid für den Transport in die Zellwand umfasst. In der Zellwand spaltet das jeweilige Enzym die im Medium angebotene Palatinose bzw. Trehalulose zu Glukose und Fruktose, welche in die Zelle aufgenommen und verstoffwechselt werden.
Geeignete Signalsequenzen, die die Aufnahme in das Endoplasmatische Retikulum gewährleisten, kann der Fachmann der einschlägigen Literatur entnehmen. Besonders geeignet ist bspw. die für das Signalpeptid des Proteinase-Inhibitor II- Gens aus Kartoffel kodierende Sequenz (Keil et al. (1996) Nucl. Acids Res. 14:5641- 5650; Genbank Accession No. X041 18).
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule oder Vektoren enthalten, wobei die Moleküle oder Vektoren transient oder stabil vorliegen können. Wirtszelle kann dabei jede Zelle und jeder
Organismus sein, die bzw. der in der Lage ist, rekombinante DNA aufzunehmen und ggf. aufgenommene DNA-Sequenz zu exprimieren. Hier kommen prokaryontische und eukaryontische Zellen bzw. Organismen in Frage, insbesondere Mikroorganismen wie Bakterien. Viren. Pilze, Hefen und Algen, aber auch Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule oder Vektoren oder Teile oder Derivate davon enthalten. Vorzugsweise sind diese Pflanzenzellen aufgrund der Aufnahme der erfindungsgemäßen, eine Palatinase bzw. Trehalulase kodierenden DNA-Sequenzen in der Lage, Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase zu synthetisieren.
In einer weiteren Ausf hrungsform betrifft die Erfindung Kits, die i) ein erfindungsgemäßes rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor, wobei das Nukleinsäuremolekül oder der Vektor auch in einer Wirtszelle vorliegen können, und ii) ggf. Palatinose oder ein zu Palatinose äquivalentes Kohlenhydrat enthalten.
Bei dem zu Palatinose äquivalenten Kohlenhydrat kann es sich allgemein um ein Disaccharid handeln, bei dem ein Fructose- und ein Glucosemolekül über eine α- glykosidische Bindung verknüpft sind, wie bspw. Turanose (3-O-α-D- glucopyranosyl-D-fructose) oder Trehalulose (1-O-α-D-glucopyranosyl-D-fructose). Die Gewinnung und Reinigung von Trehalulose ist beispielsweise in T. Veronese et al., Biotechnology Techniques (1999) 13: 43-48 beschrieben.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule und Vektoren ist es möglich. Palatinase bzw. Trehalulase als nutritive Selektionsmarker und Palatinose bzw. Trehalulose als nutritive Selektionsmittel für die Pflanzentransformation einzusetzen. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Selektion transformierter Pflanzenzellen, umfassend die Schritte: i) Einführung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors; b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodiert; und c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions- , Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können, oder eines Vektors, enthaltend ein solches rekombinantes Nukleinsäuremolekül in Pflanzenzellen; und ii) Selektion der transformierten Pflanzenzellen auf bzw. in Palatinose bzw. Trehalulose oder ein zu Palatinose äquivalentes Kohlenhydrat enthaltendem Medium.
Voraussetzung für die Einführung der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule und Vektoren in Pflanzenzellen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transformationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, Diffusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methoden sowie weitere Möglichkeiten, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode problemlos ermitteln kann. Sämtliche Transformationsverfahren sind seit vielen Jahren gut etabliert und gehören zweifelsohne zum Standardrepertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie, Pflanzenbiotechnologie und Zell- und Gewebekultur.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z.B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der
Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte
Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Palatinose bzw. Trehalulose oder ein äquivalentes Kohlenhydrat zur Selektion transformierter Pflanzenzellen enthält, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Das Selektionsmedium sollte allgemein mindestens 0,1 % Palatinose bzw. Trehalulose, möglichst zwischen 0.1 und 3,0 % Palatinose bzw. Trehalulose enthalten. Bevorzugt liegt die Palatinose- bzw. Trehalulose-Konzentration zwischen 0,8 und 2,4 % und besonders bevorzugt zwischen 1 ,0 und 2,0 %. Am meisten bevorzugt wird ein Palatinose- bzw. Trehalulose-Gehalt im Medium von 1 ,6%. Dabei sind Palatinose bzw. Trehalulose als Selektionsmedien die einzigen Kohlenstoffquellen im Medium.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung üblicher Nährmedium und Phytohormone, mit der Abweichung, dass Palatinose bzw. Trehalulose als Selektionsmittel anwesend ist.
Falls die Selektionsmarker Palatinase bzw. Trehalulase nach erfolgter Transformation und Identifizierung erfolgreich transformierter Zellen bzw. Pflanzen wieder entfernt werden soll, stehen dem Fachmann hierfür verschiedene Strategien zur Verfügung. So können z.B. sequenzspezifische Rekombinasen verwendet werden, z.B. in Form der Retransformation einer Rekombinase-exprimierenden Ausgangslinie und Auskreuzung der Rekombinase nach erfolgter Entfernung des Selektionsmarkers (siehe z.B. Reiss et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:3094-3098; Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:353-361; Lloyd et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 242:653-657; Maser et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 230:170-176; Onouchi et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19:6373-6378). Der Selektionsmarker kann auch, wie oben erwähnt, durch Cotransformation mit anschließender Auskreuzung entfernt werden.
Des weiteren betrifft die Erfindung Pflanzenzellen, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor mit Palatinase- bzw. Trehalulase-DNA-Sequenzen enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Pflanzenzelle mindestens ein weiteres Fremdgen. Wie bereits oben erwähnt, ist für die Möglichkeit der Beeinflussung komplexer Stoffwechselwege die Manipulation mehrerer enzymatischer Schritte notwendig und daher die Möglichkeit transgene Pflanzen mehrfach zu transformieren essentiell. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule und Vektoren stehen dem Fachmann jetzt neue Marker zur Selektion transformierter, insbesondere mehrfach transformierter Pflanzenzellen zur Verfügung.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Regeneration der erfindungsgemäßen Pflanzenzellen erhältlichen transgenen Pflanzen. Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln, vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen, deren Zellen oder Geweben ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten. Bei den Ernteprodukten und dem Vermehrungsmaterial handelt es sich insbesondere um Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc. Wenn die Expression der Palatinase bzw. Trehalulase in den transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors steht, können auch die Pflanzen, Pflanzenteile, Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial anhand der Fähigkeit, Palatinose bzw. Trehalulose zu verwerten und daher auf bzw. in Palatinose-haltigem Medium bzw. Trehalulose-haltigem Medium zu wachsen, identifiziert werden. Steht die Palatinase- bzw. Trehalulase-DNA-Sequenz unter Kontrolle eines z.B. induzierbaren oder zell- bzw. gewebespezifischen Promotor müssen die Pflanzen, Pflanzenteile, Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial ggf. mittels molekularbiologischer oder biochemischer Methoden identifiziert werden.
Unabhängig von den verwendeten regulatorischen Sequenzen, unter deren Kontrolle die Expression der Palatinase-DNA-Sequenzen steht, steht dem Fachmann ein breites Spektrum an molekularbiologischen und/oder biochemischen Verfahren für die Analyse der transformierten Pflanzenzellen, transgenen Pflanzen, Pflanzenteile, Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial zur Verfügung, z.B. PCR, Northern Blot- Analyse zum Nachweis Palatinase-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von Palatinase-spezifischer RNA, Southern Blot-Analyse zur Identifizierung von Palatinase-kodierenden DNA-Sequenzen oder Western Blot- Analyse zum Nachweis des durch die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule kodierten Palatinase. Selbstverständlich kann der Nachweis der enzymatischen Aktivität der Palatinase auch vom Fachmann mittels in der Literatur erhältlicher Protokolle bestimmt werden. Weiter kann man z.B. den durch Selbstung oder Kreuzungen erhaltenen Samen auf Palatinose-haltigem Medium auslegen und anhand der Keimfähigkeit und des Wachstums der Tochtergeneration(en) und des Segregationsmusters Rückschlüsse auf den Genotyp der jeweiligen Pflanze schließen. Die vorstehenden Ausführungen gelten analog für die Analyse von mit Trehalulase- DNA-Sequenzen transformierten Pflanzenzellen und Pflanzen.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von DNA- Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, als Selektionsmarker in der Pflanzentransformation bzw. der Zeil- und Gewebekultur. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um die Verwendung eines erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors als Selektionsmarker in der Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen.
Die Erfindung basiert auf der Beobachtung, dass sich DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, als Selektionsmarker in der Pflanzentransformation nutzen lassen, was in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert wird.
Beispiele
Gentechnische Verfahren, die den Ausführungsbeispielen zugrunde liegen:
1. Allgemeine Klonierungsverfahren
Klonierungsverfahren wie z.B.: Restriktionsspaltungen, DNA-Isolierung, Agarose- Gelelektrophorese. Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen. Anzucht von Bakterien, Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden nach Sambrook et al (1989. vide supra) durchgeführt. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen und Willmitzer ( 1988. Nucl. Acids Res. 16:9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobacterien erfolgte in YEB Medium (Vervliet et al. (1975) Gen. Virol. 26:33).
2. Erzeugung einer genomischen Bank von Erwinia rhapontici
Zur Herstellung einer genomischen Bank aus Erwinia rhapontici (DSM 4484) wurde chromosomale DNA aus den Zellen einer 50 ml-Übernachtkultur nach Standardprotokoll isoliert. Anschließend wurden ca. 300 μg der DNA mit dem Restriktionsenzym Sau3A partial verdaut und auf einem präparativen Agarosegel aufgetrennt. Fragmente zwischen 5 und 12 kb wurden mittels Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aus dem Gel eluiert. Die so erhaltenen DNA- Fragmente wurden in BamHI-verdaute Lambda ZAP-Express-Arme (Stratagene, La Jolla, USA) ligiert und anschließend in vitro verpackt (Gigapack III Gold Packaging Extract, Stratagene, nach Herstellerangaben). E. co//-Bakterien des Stammes XL- MRF' (Stratagene) wurden mit rekombinanten Lambda-Phagen infiziert, der Titer der Bank bestimmt und schließlich die Bank amplifiziert.
3. Durchmusterung einer genomischen Bank
Zur Isolierung von genomischen Klonen wurden ca. 105 Phagen plattiert. Nach Transfer der Phagen auf Nylonfilter (Genescreen, NEN) wurden die Filter mit einem radioaktiv markierten DNA-Fragment hybridisiert. Positive Signale wurden mittels Autoradio graphie sichtbar gemacht und vereinzelt.
4. Bakterienstämme und Plasmide E. coli (XL-1 Blue, XL-MRF' und XLOLR)-Bakterien wurden von der Firma Stratagene bezogen. Erwinia rhapontici (DSM 4484) wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Deutschland) bezogen. Der zur Pflanzentransformation eingesetzte Agrobacterium- Stamm (C58C1 mit dem Plasmid pGV 3850kan) wurde von Debleare et al. (1985, Nucl. Acids Res. 13:4777) beschrieben.
Zur Klonierung wurden die Vektoren pCR-Blunt (Invitrogen, Niederlande), pMAL- c2 (New England Biolabs), pUC 19 (Yanish-Perron (1985) Gene 33:103-1 19) und Binl9 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12:871 1-8720) verwendet.
5. Tabaktransformation
Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) wurden 10ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen, und die
Bakterien im gleichen Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (Durchmesser ca. 1cm) in dieser Bakterienlösung gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant 15:473) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach 2-tägiger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 500 mg/1 Claforan, lmg/1 Benzylaminopurin (BAP), 0.2mg/l Naphthylessigsäure (NAA), 1 ,6% Palatinose bzw. 1,6% Trehalulose und 0,8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 250 mg/1 Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt.
Beispiel 1
PCR-Amplifikation eines Subfragments der Saccharoseisomerase aus Erwinia rhaponitici
Die Klonierung eines Subfragments der Saccharoseisomerase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici, die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FB 83 5'-GGATCCGGTACCGTTCAGCAATCAAAT-3' und
• FB 84 5'-GTCGACGTCTTGCCAAAAACCTT-3', die von einer Saccharoseisomerase-Sequenz des Standes der Technik abgeleitet wurden. Primer FB 83 umfaßt die Basen 109 - 127 und Primer FB 84 die Basen 1289 - 1306 der kodierenden Region des Saccharoseisomerase-Gens von E. rhapontici. Das PCR- Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 μg), Primer FB 83 und FB 84 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das erhaltene Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Beispiel 2
Isolierung und Sequenzierung des Palatinose-Operons aus E. rhapontici
Zur Isolierung des Palatinose-Operons wurde eine genomische Bank mit einem Subfragment der Saccharoseisomerase (siehe Beispiel 1) durchmustert. Dabei wurden mehrere positive Klone isoliert. Durch vollständige Sequenzierung und Zusammensetzen dieser Klone konnten mehrere offene Leserahmen identifiziert werden, welche für Enzyme des Palatinose-Stoffwechsels kodieren (siehe obige Übersicht der Gene des Palatinose-Operons und der dazugehörigen Genprodukte). Die untenstehende Skizze zeigt eine schematische Übersicht des klonierten Palatinose-Genclusters aus Erwinia rhapontici. Die Position der offenen Leserahmen und die Richtung der Transkription sind durch Pfeile dargestellt.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 15 kb
palZ palQ palK palH palG palF palE palR pall
Die DNA- und Aminosäuresequenzen der verschiedenen Gene sind im beigefügten Sequenzprotokoll wie folgt angegeben:
Gen SEO ID No. palQ 1-3 pall 4-6 palR 7-9 palE 10-12 palF 13-15 palG 16-18 palK 19-21 palH 22-24 palZ 25-27 Beispiel 3
PCR-Amplifikation einer Palatinase aus Erwinia rhaponitici
Die Klonierung des vollständingen offenen Leserasters der Palatinase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici, die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FB180 5'-GAGATCTTGCGCAGCACACCGCACTGG-3' • FBI 76 5 '-GTCGACTC ACAGCCTCTCAATAAG-3 '
Primer FB 180 umfaßt die Basen 2 - 21, Primer FB 176 die Basen 1638 - 1656 der kodierenden Region des Palatinase-Gens. Zur Klonierung der DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktonsschnittstellen: Primer FB 180 Bglll; Primer FB 176 Sall. Das PCR Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt chromosomale Bakterien-DNA (1 μg), Primer FB 180 und FB 176 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP. dTTP) und 2.5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute). Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das entsprechende Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert. wodurch das Plasmid pCR-palO erhalten wurde (siehe Abbildung 1). Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert. Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Palatinase aus E. rhapontici, die sich von Nukleotid 2 - 1656 des Palatinase Gens erstreckt (siehe SEQ ID No. 1).
Beispiel 4
Herstellung von Plasmid p35S-cw/_>α/<2
Die DNA-Sequenz, die für eine Palatinase kodiert, wurde mit einem für die Aufnahme in das endoplasmatische Retikulum notwendigen Signalpeptides eines pflanzlichen Gens (Proteinase Inhibitor II Gen aus Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al (1986, vide supra)) fusioniert und unter die Kontrolle des 35S RNA- Promotors gebracht, wodurch das Plasmid p35S-cwpα/ζ) entstand.
Dazu wurde das Palatinase-Fragment aus dem Konstrukt pCR-palQ über die Restriktionsschnittstellen Bglll und Sall herausgeschnitten und in einen BamHI/Sall geöffneten pMA Vektor ligiert. Der Vektor pMA stellt eine modifizierte Form des Vektors pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci.66: 221 - 230) dar, welche den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik- Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzen vermittelt, ein Signalpeptid des Proteinase- Inhibitors II aus Kartoffel (Keil et al. 1986, vide supra)), welches die Zielsteuerung des Fusionsproteins in die Zellwand vermittelt, sowie ein pflanzliches Terminationssignal enthält. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3 '- Ende der Polyadenylierungsstelle des Octopin-Synthase Gens. Zwischen der Teilsequenz der Proteinase-Inhibitors und dem Terminationsignal befinden sich Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI. Xbal, Sall, PstI und SphI (in dieser Reihenfolge), welche die Insertion entsprechender DNA-Fragmente ermöglichen, so dass ein Fusionsprotein zwischen dem Proteinase-Inhibitor und dem eingefügten Protein entsteht, welches dann in die Zellwand von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen befördert wird, die dieses Protein exprimieren (siehe Abbildung 2).
Das Fragment A beinhaltet den 35S RNA-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Es enthält ein Fragment, welches die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV umfaßt (Franck (1980) Cell 21, 285.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 - 1059 eines Proteinase-Inhibitor II- Gens aus der Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Palatinase-Gen aus Erwinia rhapontici, welches die Nukleotide 2 - 1656 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Palatinase- Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 11749 - 11939.
Beispiel 5
Funktioneller Nachweis und biochemische Charakterisierung der Palatinaseaktivität in E. coli
Die funktionelle Charakterisierung des Palatinase-Gens erfolgte durch Expression des rekombinanten Proteins in E. coli. Dazu wurde das Plasmid pQE-palQ in E. coli (XL-I blue, Stratagene) transformiert. Die Expression des rekombinanten Proteins erfolgte nach Herstellerangaben (Qiagen, Hilden, Deutschland) in einem Kulturmaßstab von 50 ml. Nach Ernte der Zellen durch Zentrifugation wurde das Pellet in 1 ml 30 mM HEPES (pH 7,5) resuspendiert und die lösliche Proteinfraktion durch Ultraschallbehandlung freigesetzt. 20 μl des Rohextraktes wurden mit 80 μl 100 mM Palatinose gemischt und für 40 Minuten bei 30 °C inkubiert. Zum Nachweis der Palatinaseaktivität wurde in einem Aliquot des Ansatzes die freigesetzte Glucose durch einen gekoppelten optisch-enzymatischen Test bestimmt. Dabei konnte die Palatinaseaktivität des rekombinanten Enzyms eindeutig nachgewiesen werden.
In weiteren Experimenten wurde gezeigt, daß das Enzym seine höchste Aktivität bei einer Reaktionstemperatur von 30 °C und einem pH von 7,0 entfaltet. Bei der Untersuchung der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration konnte ein Km- Wert für Palatinose von 10 mM und eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei einer Substratkonzentration von 90 mM Palatinose bestimmt werden.
Beispiel 6
Nachweis der Nichtmetabolisierbarkeit von Palatinose für Pflanzenzellen
Um nachzuweisen, dass Pflanzenzellen mit Palatinose als einziger Kohlenstoffquelle nicht regeneriert werden können, wurden Blattstücke von sterilen Tabakpflanzen auf MS-Medium (Murashige and Skoog 1962, vide supra; 500 mg/1 Claforan, 1 mg/1 Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/1 Naphthylessigsäure (NAA)), dem 0,8% bzw. 1.6% Palatinose als einzige Kohlenstoffquelle zugesetzt wurden, für vier Wochen kultiviert.
Abbildung 3 zeigt die Kultivierung von Tabakblattscheiben auf MS-Medium mit Palatinose als alleiniger Kohlenstoffquelle (Abb. 3A: mit 0,8% Palatinose. Abb. 3B: mit 1,6% Palatinose) im Vergleich zu einer Blattscheibe, welche auf MS-Medium mit 1,6% Glukose kultiviert wurde (Abb. 3C). Es ist ersichtlich, das Blattscheiben auf einem Medium mit Palatinose als einziger Kohlenstoffquelle keine Kalli bilden. Der Zusatz von Palatinose hat jedoch keinen toxischen Effekt auf die Pflanzenzellen.
Beispiel 7
Selektion transformierter Pflanzenzellen anhand ihrer Fähigkeit. Palatinose zu spalten
Tabak wurde wie oben beschrieben mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer mit dem Konstrukt p35S-cwPal (siehe Beispiel 4) transformiert (Leaf Disk- Transformation) und die Blattscheiben im Anschluß an die Infektion und Inkubation mit Agrobakterien auf MS-Regenerationsmedium mit 1,6% Palatinose als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert. Nach ca. 3 Wochen waren transformierte Sprosse sichtbar, die auf hormonfreiem MS-Medium mit Palatinose bewurzelt wurden.
Von den bewurzelten Sprossen wurden 20 Sprosse im Northern Blot unter Verwendung des Palatinase-Gens als Hybridisierungssonde (BamHI/Sall-Fragment aus pCR-Pal) auf die Anwesenheit des Palatinase-Gens analysiert. Sämtliche untersuchten Sprosse zeigten Akkumulation Palatinase-spezifischer mRNA und somit Expression der Palatinase.
Aus den erfolgreich selektionierten Sprossen wurden vollständige Pflanzen regeneriert. Die erhaltenen transgenen Pflanzen waren phänotypisch normal. Beispiel 8
PCR-Amplifikation einer Trehalulase aus Erwinia rhapontici
Die Klonierung des vollständigen offenen Leserasters der Trehalulase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici, die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FBI 84 5 ' -GGGATCCGTGC AAACTGGTGGAAAGAG-3 '
• FB185 5'-GT_CGACTTACCGCTGATAAATTTGTGC-3'
Die Primer FBI 84 und FBI 85 umfassen die Basen 4 - 23 bzw. 1638 - 1659 der kodierenden Region des Trehalulase-Gens.
Zur Klonierung der DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktonsschnittstellen: Primer FB 96 bzw. FBI 84, BamHI; Primer
FB185, Sall. Das PCR-Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt chromosomale Bakterien
DNA (1 μg), Primer FB184 und FB185 (jeweils 250 ng), Pfu DNA Polymerase Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2.5 Einheiten Pfu DNA Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3- Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase- Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das entsprechende Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert, wodurch das Plasmid pCR-PalZ erhalten wurde (siehe Abbildung 4). Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert. Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Trehalulase aus E. rhapontici, die sich von Nukleotid 4 - 1659 des Trehalulase Gens erstreckt.
Beispiel 9
Herstellung des Plasmids p35S-cw .α/Z
Die DNA-Sequenz, die für eine Trehalulase kodiert, wurde mit einem für die Aufnahme in das endoplasmatische Retikulum notwendigen Signalpeptides eines pflanzlichen Gens (Proteinase Inhibitor II Gen aus Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra)) fusioniert und unter die Kontrolle des 35S RNA- Promotors gebracht, wodurch das Plasmid p35 S-cwpalZ entstand.
Dazu wurde das Trehalulase-Fragment aus dem Konstrukt pCR-palZ über die Restriktionsschnittstellen BamHI und Sall herausgeschnitten und in einen BamHI/Sall geöffneten pMA Vektor ligiert. Der pMA stellt eine modifizierte Form des Vektors pBinAR (Höfgen und Willmitzer 1990, vide supra) dar, welcher den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzen vermittelt, ein Signalpeptid des Proteinase-lnhibitors II aus Kartoffel (Keil et al. 1986, vide supra), welches die Zielsteuerung des Fusionsproteins in die Zellwand vermittelt, sowie ein pflanzliches Terminationssignal enthält. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3'- Ende der Polyadenylierungsstelle des Octopin-Synthasegens. Zwischen der Teilsequenz des Proteinase-lnhibitors und dem Terminationssignal befinden sich Schnittstellen für Restriktionsenzyme BamHI, Xbal, Sall, PstI und SphI (in dieser Reihenfolge), welche die Insertion entsprechender DNA-Fragment ermöglichen, so dass ein Fusionsprotein zwischen dem Proteinase-Inhibitor und dem eingefügten Protein entsteht, welches dann in die Zellwand von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen befördert wird, die dieses Protein exprimieren.
Das Fragment A beinhaltet den 35S Promotor des Cauliflower-Mosaik- Virus (CaMV). Es enthält ein Fragment, welches die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV umfaßt (Franck (1980) Cell 21 : 285).
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 - 1059 eines Proteinase Inhibitor II Gens aus der Kartoffel (Solanum tuberosum) (Keil et al. 1986, vide supra), welches über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Trehalulase-Gen aus
Erwinia rhapontici, das die Nukleotide 4 - 1659 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Trehalulase Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 1 1749 - 1 1939.
Beispiel 10
Ortsgerichtete Mutagenese der Palatinase aus E. rhapontici zur Optimierung der
Palatinase-Expression in transgenen Pflanzen
Um eine Glykosylierung der Palatinase aus E. rhapontici in transgenen Pflanzen zu vermeiden, wurden geeignete Aminosäuren im Bereich potentieller Glykosylierungsstellen durch ortsgerichtete Mutagenese ausgetauscht. Als Template diente das Plasmid pQE-palO. pQE-palO entspricht, was die Palatinase-Sequenz betrifft, pCK-palQ, ist aber für die Expression der Palatinase-Sequenz in E. coli geeignet. Der Reaktionsansatz (50 μl) zur PCR-gestützten Mutagenese war wie folgt zusammengesetzt: 50 ng pQE-palO DNA, jeweils 250 ng 5'- bzw. 3'-Primer, Pfu- DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (5 μl. Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene). Die Polymerisierungsschritte (15 Zyklen) wurden in einem automatisierten T3- Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (30 Sekunden), Anlagerung der Primer bei 55 °C (1 Minute). Polymerasereaktion bei 72 °C (15 Minuten). Nach Beendigung der Reaktion wurde die parentale DNA mit 1 Einheit Dpnl-Restriktionsenzym für 1 Stunde bei 37 °C verdaut. Anschließend wurde 1 μl des Ansatzes zur Transformation von E. coli eingesetzt.
Für die Mutation 1 wurde Threonin an Position 105 gegen Alanin ausgetauscht, wodurch das Plasmid pQE-palQ T 105 A erzeugt wurde.
5'-Primer: SL 365'-CTG GTG GTC AAC CAT GCC TCT GAC GAA CAT CCC-
3'
3 '-Primer: SL 37 5'-GGG ATG TTC GTC AGA GGC ATG GTT GAC CAC CAG-
3'
Für die Mutation 2 wurde Threonin an Position 248 gegen Alanin ausgetauscht, wodurch das Plasmid pQE-palQ T248A entstand.
5'-Primer: SL 395'-GAG ACG TGG AGC GCA GCG CCA GAA GAC GCC CTG-
3' 3'-Primer: SL 405'-CAG GGC GTC TTC TGG CGC TGC GCT CCA CGT CTC-3' Für die Mutation 3 wurde Threonin an Position 502 gegen Alanin ausgetauscht, wodurch Plasmid pQE-palQ T502A entstand.
5'-Primer: SL 425'-G GTG ATC AAT AAC TTC GCG CGA GAC GCT GTG ATG C-3'
3'-Primer: SL 435'-G CAT CAC AGC GTC TCG CGC GAA GTT ATT GAT CAC C-3'
Das Mutationsereignis wurde jeweils durch Sequenzierung des entsprechenden Bereiches der Palatinase-Sequenz verifiziert. Durch funktionelle Expression des mutagenisierten Enzyms in E. coli konnte in allen Fällen gezeigt werden, daß sich die jeweilige Aminosäure- Substitution nicht nachteilig auf die enzymatische Aktivität auswirkt. Anschließend wurden die Mutationen durch oben beschriebene Strategie mit einander kombiniert, so daß letztendlich eine Palatinase erzeugt wurde, welche keine putativen Glykosylierungsstellen mehr aufweist. Auch dieses Enzym wies nach Expression in E. coli keine nachteiligen katalytischen Eigenschaften auf.
(a) palQ Wildtyp 100 105 1 10
Aminosauresequenz Leu Val Val Asn His Thr Ser Asp Glu His Pro
Nucleotidsequenz CTG GTG GTC AAC CAT ACC TCT GAC GAA CAT CCC (b)palQ T105A
Aminosauresequenz • • • • • Ala • • • • •
Nucleotidsequenz GCC
(c) _-/ρ Wιldtyp 243 248 253
Amino acid sequence Glu Thr Trp Ser Ala Thr Pro Glu Asp Ala Leu Nucleotide sequence GAG ACG TGG AGC GCA ACG CCA GAA GAC GCC CTG
(d) palQ T248A
Aminosauresequenz • • • • • Ala • • • • •
Nucleotide sequence GCG
(e) p--.ρ Wιldtyp 497 502 507 Aminosauresequenz Val lle Asn Asn Phe Thr Arg Asp Ala Val Met
Nucleotidsequenz GTG ATC AAT AAC TTC ACG CGA GAC GCT GTG ATG
(i) palQ T502A
Aminosauresequenz • • • • • Ala • • • • •
Nucleotidsequenz GCG
Die mutierte Palatinase-Sequenz wurde anschließend in einen Vektor für Pflanzentransformation umkloniert und in Pflanzen exprimiert.

Claims

Ansprüche
1. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors; b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder einer Trehalulase kodiert; und c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-. Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
2. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die DNA- Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID NO. 3 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 1 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen, c) DNA- Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID NO. 27 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, d) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 25 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen, e) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) hybridisieren, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen, f) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von e) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen, g) DNA- Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c), d), e) oder f) darstellen.
3. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei in dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und oder dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase durch mindestens einen Aminosäureaustausch, insbesondere durch einen Aminosäureaustausch Threonin gegen Alanin an den Positionen 105, 248 und/oder 502 der in SEQ ID Nr. 3 angegebenen Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtypprotein eine Glykosylierungsstelle inaktiviert ist.
4. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Promotor ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise der 35S
RNA-Promotor von CaMV ist.
5. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die DNA-Sequenz durch Signalsequenzen ergänzt ist, die den Transport des Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase zu einem bestimmten Zellkompartiment oder einer bestimmten Zellorganelle gewährleisten.
6. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, wobei das Zellkompartiment oder die Zellorganelle die Zellwand ist.
7. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei die Signalsequenzen aus einem pflanzlichen Proteinase-Inhibitor-Gen stammen.
8. Vektor, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche.
9. Vektor nach Anspruch 8, der mindestens ein weiteres rekombinantes Nukleinsäuremolekül enthält.
10. Vektor nach Anspruch 9, wobei das weitere rekombinante Nukleinsäuremolekül eine DNA-Sequenz enthält, die für ein Peptid, Protein, eine Antisense-RNA, eine Sense-RNA, eine virale RNA oder ein Ribozym kodiert.
11. Wirtszelle, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach einem der vorangehenden Ansprüche.
12. Kit, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und ggf. Palatinose, Trehalulose oder ein zu Palatinose bzw. Trehalulose äquivalentes Kohlenhydrat.
13. Verfahren zur Selektion transformierter Pflanzenzellen, umfassend die
Schritte: i) Einführung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in Pflanzenzellen; und ii) Selektion der transformierten Pflanzenzellen auf bzw. in Palatinose bzw. Trehalulose oder ein zu Palatinose bzw. Trehalulose äquivalentem Kohlenhydrat enthaltendem Medium.
14. Transgene Pflanzenzellen, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 13.
15. Pflanzenzelle nach Anspruch 14, die mindestens ein weiteres Fremdgen enthält.
16. Transgene Pflanzen, enthaltend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 14 oder 15 oder hergestellt nach Anspruch 13, sowie Teile dieser Pflanzen, transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanzen.
17. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodiert, als Selektionsmarker.
18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei in dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase durch mindestens einen Aminosäureaustausch gegen dem Wildtypprotein eine Glykosylierungsstelle inaktiviert ist.
19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18 für die Selektion transformierter Pflanzenzellen.
20. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18 für die Selektion transformierter Mikroorganismen.
21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei zusätzlich die für einen Palatinose-Transporter kodierenden DNA-Sequenzen auf den Mikroorganismus übertragen werden.
22. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 1 angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodieren.
23. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 7 angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität eines Regulatorproteins der LysR-Familie kodieren.
24. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 10 angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen
Aktivität eines Palatinose-bindenden Proteins kodieren.
25. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 13 angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Permease kodieren.
26. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 16 angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Permease kodieren.
27. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 19 angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität eines ATP -bindenden Proteins kodieren.
28. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend die in SEQ ID No. 22 angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Hydrolase kodieren.
29. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül. enthaltend die in SEQ ID No. 25 angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon, die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Trehalulase kodieren.
30. Verfahren zur Selektion transformierter Mikroorganismen, umfassend die
Schritte: i) Einführung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls enthaltend eine DNA- Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodiert; und ii) Selektion der transformierten Mikroorganismen auf bzw. in Palatinose bzw. Trehalulose oder ein zu Palatinose äquivalentes Kohlenhydrat enthaltendem Medium.
31. Verfahren zur Selektion transformierter Mikroorganismen nach Anspruch 30, wobei zusätzlich die in SEQ ID No. 10, 13, 16 und 19 angegebenen DNA- Sequenzen eingeführt und coexprimiert werden.
32. Isolierte DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID NO. 27 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 25 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen, c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisieren, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen. d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz \ on c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen, e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) darstellen.
33. DNA-Sequenz nach Anspruch 32, wobei die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen erfolgt.
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