Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

EA042291B1 - BISPECIFIC ANTIBODY CONSTRUCTS BINDING TO MESOTHELIN AND CD3 (CD3) - Google Patents

BISPECIFIC ANTIBODY CONSTRUCTS BINDING TO MESOTHELIN AND CD3 (CD3) Download PDF

Info

Publication number
EA042291B1
EA042291B1 EA201890383 EA042291B1 EA 042291 B1 EA042291 B1 EA 042291B1 EA 201890383 EA201890383 EA 201890383 EA 042291 B1 EA042291 B1 EA 042291B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
cdr
amino acid
polypeptide
acid sequence
Prior art date
Application number
EA201890383
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Тобиас Раум
Петер КУФЕР
Дорис РАУ
Йонас Анлар
Клаудиа БЛЮМЕЛЬ
Патрик Хоффманн
Элизабет Нарвольд
Джули Бейлис
Маркус Мюнц
Йоханнес Брози
Маттиас Фридрих
Бенно Раттель
Памела Богнер
Андреас Вольф
Корнелиус Помпе
Original Assignee
Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх
Эмджен Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх, Эмджен Инк. filed Critical Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх
Publication of EA042291B1 publication Critical patent/EA042291B1/en

Links

Description

Данное изобретение относится к конструкции биспецифического антитела, содержащей первый связывающий домен, который связывается с МЗЛН (MSLN) человека на поверхности клетки-мишени, и второй связывающий домен, который связывается с кластером дифференцировки 3, КД3 (CD3) человека на поверхности T-клетки. Кроме того, в изобретении предложен полинуклеотид, кодирующий конструкцию антитела, вектор, содержащий указанный полинуклеотид, и клетка-хозяин, трансформированная или трансфектированная указанным полинуклеотидом или вектором. Кроме того, в изобретении предложен способ получения конструкции антитела по изобретению, медицинское применение указанной конструкции антитела и набор, содержащий указанную конструкцию антитела.The present invention relates to a bispecific antibody construct comprising a first binding domain that binds to human MSLNs on the surface of a target cell and a second binding domain that binds to human CD3 differentiation cassette 3 on the surface of a T cell. In addition, the invention provides a polynucleotide encoding an antibody construct, a vector containing said polynucleotide, and a host cell transformed or transfected with said polynucleotide or vector. In addition, the invention provides a method for producing an antibody construct of the invention, a medical application of said antibody construct, and a kit containing said antibody construct.

ВведениеIntroduction

Мезотелин представляет собой белок клеточной поверхности, который первоначально был обнаружен как антиген, распознаваемый K1, моноклональным антителом, полученным иммунизацией мышей с клеточной линией рака яичника человека OVCAR-3 (Chang et al., Int. J. Cancer 1992). Для идентификации кДНК мезотелина из библиотеки HeLa применяли экспрессионное клонирование (Chang et al., PNAS 1996). Молекулярный анализ показал, что ген мезотелина кодируется в пределах белка-прекурсора размером 69 кДа, который расщепляется фурином с образованием двух разных белков: потенцирующего фактора мегакариоцитов, ПФМ (MPF), белка размером 31 кДа, который выбрасывается, и мезотелина, белка размером 40 кДа, который ассоциируется с клеточной мембраной через гликофосфатидилинозитоловую связь (якорь GPI) (Chang et al., PNAS, 1996). Белок мезотелина организован в виде суперспиральных доменов с повторами по типу армадила (броненосца), APM (ARM).Mesothelin is a cell surface protein that was originally discovered as an antigen recognized by K1, a monoclonal antibody obtained by immunizing mice with the human ovarian cancer cell line OVCAR-3 (Chang et al., Int. J. Cancer 1992). Expression cloning was used to identify the mesothelin cDNA from the HeLa library (Chang et al., PNAS 1996). Molecular analysis showed that the mesothelin gene is encoded within a 69 kDa precursor protein that is cleaved by furin to form two different proteins: megakaryocyte potentiating factor, MPF, a 31 kDa protein that is discarded, and mesothelin, a 40 kDa protein. , which associates with the cell membrane via a glycophosphatidylinositol bond (GPI anchor) (Chang et al., PNAS, 1996). The mesothelin protein is organized in the form of supercoiled domains with armadil (armadillo) repeats, APM (ARM).

Мезотелин экспрессируется с высокими уровнями при раке яичника, а также в других видах опухолей, включая рак поджелудочной железы, мезотелиому, рак легких, рак желудка и тройной отрицательный рак молочной железы. В нормальных тканях мезотелин в основном экспрессируется в слое мезотелиальных клеток плевральной, перикардиальной и брюшной полостей. Кроме того, мезотелин экспрессируется на поверхности эпителия нормального яичника, фаллопиевой трубы и миндалины.Mesothelin is expressed at high levels in ovarian cancer, as well as in other types of tumors, including pancreatic cancer, mesothelioma, lung cancer, gastric cancer, and triple negative breast cancer. In normal tissues, mesothelin is mainly expressed in the mesothelial cell layer of the pleural, pericardial, and abdominal cavities. In addition, mesothelin is expressed on the surface of the epithelium of the normal ovary, fallopian tube, and tonsil.

В дополнение к экспрессии на клеточной поверхности мезотелин также выбрасывается в сыворотку посредством действия АДАМ17/ФАПФ (ADAM17/TACE, домена 17 дезинтегрина и металлопротеиназы:фермента, превращающего фактор некроза опухоли альфа). Уровни выброшенного мезотелина в сыворотке повышаются у пациентов с раком яичников и другими видами рака. MESOMARK®, твердофазный иммуноферментный анализ, ТИФА (ELISA) для сывороточного мезотелина, одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для применения у человека в целях диагностики или мониторинга мезотелиомы. Кроме того, мезотелин применяли, в отдельности или вместе с другими маркерами, в целях диагностики или прогнозирования при других видах рака.In addition to cell surface expression, mesothelin is also released into serum by the action of ADAM17/FAPF (ADAM17/TACE, disintegrin domain 17 and metalloproteinase: tumor necrosis factor alpha converting enzyme). Serum levels of ejected mesothelin are elevated in patients with ovarian and other cancers. MESOMARK®, enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA for serum mesothelin, is approved by the Food and Drug Administration (FDA) for use in humans for the diagnosis or monitoring of mesothelioma. In addition, mesothelin has been used, alone or in combination with other markers, for diagnostic or prognostic purposes in other cancers.

Корреляция уровней мезотелина в сыворотке с заболеванием навела на мысль о потенциальной роли белка мезотелина в прогрессировании рака. В то время как биологическая функция мезотелина не совсем понятна - мыши с нокаутом выглядят нормально - мезотелин, как было показано, связывается с муцином MUC16/CA-125. Была предположена роль взаимодействия мезотелина-CA-125 в клеточной адгезии, инвазии и метастазировании.The correlation of serum mesothelin levels with disease has suggested a potential role for the mesothelin protein in cancer progression. While the biological function of mesothelin is not well understood - knockout mice appear normal - mesothelin has been shown to bind to the mucin MUC16/CA-125. A role for the mesothelin-CA-125 interaction in cell adhesion, invasion and metastasis has been proposed.

Первые антитела, полученные против мезотелина для целей терапевтического вмешательства, были сконструированы таким образом, чтобы воспрепятствовать взаимодействию между мезотелином и CA125. Фаговый дисплей идентифицировал Fv синдрома Шегрена, СШ (SS), который после оптимизации аффинности применяли для создания рекомбинантного иммунотоксина, нацеленного на мезотелин, SS1P. Антитело MORAb-009 аматуксимаб, в котором также применяется SS1, распознает нелинейный эпитоп в пределах 64 аминоконцевых аминокислот мезотелина. Кроме того, SS1 Fv применяли для создания модифицированных химерным рецептором антигена T-клеток. Антитела против мезотелина также применяли для получения конъюгатов лекарственных средств, таких как Анетумаб равтанзин, содержащих антитело MF-T, связанное с DM4, и антитело 7D9, конъюгированное с монометилауристатином E. Эти антитела против мезотелина также распознают аминоконцевую область белка (аминокислоты 296390), хотя они не конкурируют с ними. Указанные антимезотелиновые нацеленные терапевтические средства, которые в настоящее время находятся в стадии клинических испытаний, показали ограниченную эффективность в качестве агентов для монотерапии.The first antibodies raised against mesothelin for therapeutic intervention purposes were designed to interfere with the interaction between mesothelin and CA125. Phage display identified Sjögren's Syndrome Fv, SS (SS), which, after affinity optimization, was used to generate a recombinant mesothelin-targeted immunotoxin, SS1P. The MORAb-009 antibody amatuximab, which also uses SS1, recognizes a non-linear epitope within the amino-terminal 64 amino acids of mesothelin. In addition, SS1 Fv has been used to generate chimeric antigen receptor-modified T cells. Anti-mesothelin antibodies have also been used to prepare drug conjugates such as Anetumab ravtansine containing the DM4-bound MF-T antibody and the monomethylauristatin E-conjugated 7D9 antibody. These anti-mesothelin antibodies also recognize the amino-terminal region of the protein (amino acids 296390), although they don't compete with them. These anti-mesothelin targeted therapeutics, which are currently in clinical trials, have shown limited efficacy as monotherapy agents.

Совсем недавно сообщалось о новых антимезолиновых антителах, которые распознают другие участки белка мезотелина. Все еще остается необходимость в понимании того, будут ли антитела против иных эпитопов мезотелина, чем SS1/MORAb-009 (например, антитела, которые не конкурируют с выброшенным мезотелином или выброшенным CA-125), проявлять лучшую эффективность у пациентов.More recently, novel anti-mesoline antibodies have been reported that recognize other regions of the mesothelin protein. There is still a need to understand whether antibodies against epitopes of mesothelin other than SS1/MORAb-009 (eg, antibodies that do not compete with shed mesothelin or shed CA-125) will perform better in patients.

Поскольку по-прежнему существует потребность в дополнительных вариантах лечения заболеваний в форме солидных опухолей, связанных с избыточной экспрессией МЗЛН (MSLN), таких как рак яичника, рак поджелудочной железы, мезотелиома, рак легкого, рак желудка и тройной отрицательный рак молочной железы, в данном изобретении предложены средства и способы решения этой проблемы в форме конструкции биспецифического антитела, содержащей связывающий домен, нацеленный на МЗЛН (MSLN) на поверхности опухолевых клеток-мишеней, и второй связывающий домен, нацеленный на CD3 на поверхности T-клеток.Because there is still a need for additional treatment options for diseases in the form of MSLN overexpressing solid tumors (MSLN), such as ovarian cancer, pancreatic cancer, mesothelioma, lung cancer, gastric cancer and triple negative breast cancer, in this The invention provides means and methods for solving this problem in the form of a bispecific antibody construct comprising a binding domain targeted to MSLN (MSLN) on the surface of tumor target cells and a second binding domain targeted to CD3 on the surface of T cells.

- 1 042291- 1 042291

Таким образом, в первом аспекте данное изобретение относится к конструкции биспецифического антитела, содержащей первый связывающий домен, который связывается с МЗЛН (MSLN) человека на поверхности клетки-мишени, и второй связывающий домен, который связывается с CD3 человека на поверхности T-клетки, причем первый связывающий домен связывается с эпитопом МЗЛН (MSLN), который содержится в вариантах МЗЛН (MSLN), представленных в SEQ ID NO: 231, 232 и 233, и дополнительно связывается с МЗЛН (MSLN) Macaca fascicularis, представленным в SEQ ID NO: 234.Thus, in a first aspect, the invention relates to a bispecific antibody construct comprising a first binding domain that binds to human MSLNs on the surface of a target cell and a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell, wherein the first binding domain binds to the MSLN epitope (MSLN) that is contained in the MSLN variants shown in SEQ ID NOs: 231, 232 and 233 and further binds to the Macaca fascicularis MSLN shown in SEQ ID NO: 234 .

Следует отметить, что, как используется в данном документе, формы единственного числа включают в себя ссылки на множественное число, если обратное прямо не указано в тексте. Так, например, ссылка на реагент включает один или большее количество таких различных реагентов, а ссылка на способ включает ссылку на эквивалентные стадии и способы, известные специалистам в данной области техники, которые могут быть модифицированы или заменены способами, описанными в данном изобретении.It should be noted that, as used herein, singular forms include references to the plural unless otherwise expressly indicated in the text. Thus, for example, reference to a reagent includes one or more of these various reagents, and reference to a method includes reference to equivalent steps and methods known to those skilled in the art, which may be modified or replaced by the methods described in this invention.

Если обратное прямо не указано в тексте, термин по меньшей мере, предшествующий ряду элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу ряда. Специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, с применением не более чем шаблонных экспериментов, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в данном документе. Такие эквиваленты включены в данное изобретение.Unless expressly stated otherwise in the text, a term at least preceding a series of elements is to be understood as referring to each element of the series. Those skilled in the art will recognize or be able to ascertain, using no more than routine experimentation, many equivalents to the particular embodiments of the invention described herein. Such equivalents are included in this invention.

Термин и/или везде, где он используется, включает в себя значение и, или и все или любая другая комбинация элементов, связанных указанным термином.The term, and/or wherever it is used, includes the meaning of and, or and all or any other combination of the elements associated with the specified term.

Используемый в данном изобретении термин около или приблизительно означает в пределах плюс/минус 20%, предпочтительно в пределах плюс/минус 15%, более предпочтительно в пределах плюс/минус 10% и наиболее предпочтительно в пределах плюс/минус 5% от заданного значения или диапазона.As used herein, the term about or approximately means within plus/minus 20%, preferably within plus/minus 15%, more preferably within plus/minus 10%, and most preferably within plus/minus 5% of a given value or range. .

Во всех местах данного документа и последующей формулы изобретения, если обратное прямо не указано в тексте, слово содержать и вариации, такие как содержит и содержащий, следует понимать как включающие указанное целое число или стадию или группу целых чисел или стадий, но не исключающее любое другое целое число или стадию или группу целых чисел или стадий. При использовании в данном документе термин содержащий может быть заменен термином в том числе или включающий или иногда, когда он используется в данном изобретении, термином обладающий.Throughout this document and the following claims, unless otherwise expressly stated in the text, the word contain and variations such as contains and containing are to be understood as including the specified integer or step or group of integers or steps, but not excluding any other an integer or a stage or a group of integers or stages. As used herein, the term containing may be replaced by the term including or including, or sometimes, when used in this invention, the term having.

При использовании в данном документе состоящий из исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанные в пункте формулы. При использовании в данном документе термин по существу состоящий из не исключает материалов или стадий, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые признаки пункта формулы.As used herein, consisting of excludes any element, step, or ingredient not listed in a claim. As used herein, the term essentially consisting of does not exclude materials or steps that do not significantly affect the essential and novel features of a claim.

В каждом случае в данном документе любой из терминов содержащий, по существу состоящий из и состоящий из, может быть заменен любым из двух других терминов.In each instance in this document, any of the terms containing, essentially consisting of, and consisting of may be replaced by any of the other two terms.

Термин конструкция антитела относится к молекуле, в которой структура и/или функция основана(ы) на структуре и/или функции антитела, например, полноразмерной или цельной молекуле иммуноглобулина. Таким образом, конструкция антитела способна связываться с ее специфической мишенью или антигеном. Кроме того, конструкция антитела в соответствии с изобретением содержит минимальные структурные требования к антителу, которые позволяют связывание с мишенью. Это минимальное требование может быть, например, определено наличием по меньшей мере трех участков, определяющих комплементарность (CDR), легкой цепи (т.е., CDR1, CDR2 и CDR3 области VL) и/или трех CDR тяжелой цепи (т.е., CDR1, CDR2 и CDR3 области VH), предпочтительно всех шести CDR. Антитела, на которых основаны конструкции в соответствии с изобретением, включают в себя, например, моноклональные, рекомбинантные, химерные, деиммунизированные, гуманизированные и человеческие антитела.The term antibody design refers to a molecule in which the structure and/or function is(s) based on the structure and/or function of an antibody, eg, a full length or whole immunoglobulin molecule. Thus, an antibody construct is capable of binding to its specific target or antigen. In addition, the design of the antibody in accordance with the invention contains the minimum structural requirements for the antibody, which allow binding to the target. This minimum requirement can be, for example, defined by having at least three complementarity determining regions (CDRs), a light chain (i.e., CDR1, CDR2, and CDR3 of the VL region) and/or three heavy chain CDRs (i.e., , CDR1, CDR2 and CDR3 of the VH region), preferably all six CDRs. Antibodies on which the constructs of the invention are based include, for example, monoclonal, recombinant, chimeric, deimmunized, humanized and human antibodies.

В определение конструкций антител в соответствии с изобретением включены полноразмерные или цельные антитела, включая также антитела верблюдовых и другие иммуноглобулиновые антитела, полученные биотехнологическими методами или способами или методами или способами инженерии белка. Эти полноразмерные антитела могут представлять собой, например, моноклональные, рекомбинантные, химерные, деиммунизированные, гуманизированные и человеческие антитела. Кроме того, в определение конструкций антител включены фрагменты полноразмерных антител, такие как VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 или r IgG, (полуантитело). Кроме того, конструкции антител в соответствии с изобретением могут представлять собой модифицированные фрагменты антител, которые также называют вариантами антител, такие как scFv, di-scFv или bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-зиппер, scFab, Fab2, Fab3, диатела, одноцепочечные диатела, тандемные диатела (Tandab), тандемные ди-scFv, тандемные три-scFv, мини-антитела, типичная структура которых выглядит следующим образом: (VH-VLCH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2- CH3+CH3), ((scFv)2-CH3) или (scFv-CH3-scFv)2, мультитела, такие как триатела или тетратела, и однодоменные антитела, такие как нанотела или антитела с одним вариабельным доменом, содержащие только один вариабельный домен, который может представлять собой VHH, VH или VL, которые специфически связываются с антигеном или эпитопом независимо от других Vучастков или доменов.Included within the definition of antibody constructs according to the invention are full length or whole antibodies, including also camelid antibodies and other immunoglobulin antibodies produced by biotechnological or protein engineering methods or methods or methods. These full length antibodies can be, for example, monoclonal, recombinant, chimeric, deimmunized, humanized and human antibodies. Also included in the definition of antibody constructs are fragments of full length antibodies such as VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 or r IgG, (half-antibody). In addition, antibody constructs according to the invention may be modified antibody fragments, also referred to as antibody variants, such as scFv, di-scFv or bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-zipper, scFab, Fab2, Fab3 , diabodies, single chain diabodies, tandem diabodies (Tandab), tandem di-scFv, tandem tri-scFv, mini-antibodies, the typical structure of which is as follows: (VH-VLCH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv )2-CH3+CH3), ((scFv)2-CH3) or (scFv-CH3-scFv)2, multibodies such as triabodies or tetrabodies, and single domain antibodies such as nanobodies or single variable domain antibodies containing only one variable domain, which may be a VHH, VH, or VL, that binds specifically to an antigen or epitope independently of other V regions or domains.

Связывающий домен обычно может содержать вариабельный участок легкой цепи антитела (VL) иThe binding domain may typically comprise an antibody light chain variable region (VL) and

- 2 042291 вариабельный участок тяжелой цепи антитела (VH); однако он не должен содержать оба. Фрагменты Fd, например, содержат два участка VH и часто сохраняют некоторую антигенсвязывающую функцию интактного антигенсвязывающего домена. Дополнительные примеры формата фрагментов антител, вариантов антител или связывающих доменов включают в себя (1) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, содержащий домены VL, VH, CL и CH1; (2) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (3) фрагмент Fd, содержащий два домена VH и CH1; (4) фрагмент Fv, содержащий домены VL и VH одного плеча антитела, (5) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), который содержит домен VH; (6) выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR) и (7) одноцепочечный Fv (scFv), причем последний является предпочтительным (например, полученный из библиотеки scFV). Примеры вариантов конструкций антител в соответствии с изобретением описаны, например, в WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, WO 2014/144722, WO 2014/151910 и WO 2015/048272.- 2 042291 variable region of the heavy chain of the antibody (VH); however, it must not contain both. Fd fragments, for example, contain two VH regions and often retain some of the antigen-binding function of an intact antigen-binding domain. Additional examples of the format of antibody fragments, antibody variants, or binding domains include (1) a Fab fragment, a monovalent fragment containing the VL, VH, CL, and CH1 domains; (2) an F(ab')2 fragment, a divalent fragment containing two Fab fragments connected by a disulfide bridge in the hinge region; (3) Fd fragment containing two VH and CH1 domains; (4) an Fv fragment containing the VL and VH domains of one antibody arm, (5) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546) which contains a VH domain; (6) isolated complementarity determining region (CDR); and (7) single chain Fv (scFv), the latter being preferred (eg, derived from an scFV library). Examples of antibody constructs according to the invention are described, for example, in WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014 /0302037, WO 2014/144722, WO 2014/151910 and WO 2015/048272.

Кроме того, определение термина конструкция антитела включает одновалентные, двухвалентные и поливалентные/мультивалентные конструкции и, таким образом, моноспецифические конструкции, специфически связывающиеся только с одной антигенной структурой, а также биспецифические и полиспецифические/мультиспецифические конструкции, которые специфически связываются с более, чем одной антигенной структурой, например, двумя, тремя или более, посредством различных связывающих доменов. Более того, определение термина конструкция антитела включает в себя молекулы, состоящие только из одной полипептидной цепи, а также молекулы, состоящие из более чем одной полипептидной цепи, причем цепи могут быть идентичными (гомодимеры, гомотримеры или гомогенные олигомеры) или разными (гетеродимер, гетеротример или гетероолигомер). Примеры вышеуказанных идентифицированных антител и их вариантов или их производных описаны, среди прочего, в Harlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) и Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010 и Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.In addition, the definition of the term antibody construct includes monovalent, divalent, and polyvalent/multivalent constructs, and thus monospecific constructs that specifically bind to only one antigenic construct, as well as bispecific and polyspecific/multispecific constructs that specifically bind to more than one antigenic construct. structure, for example, two, three or more, through different binding domains. Moreover, the definition of the term antibody construct includes molecules consisting of only one polypeptide chain, as well as molecules consisting of more than one polypeptide chain, and the chains may be identical (homodimers, homotrimers or homogeneous oligomers) or different (heterodimer, heterotrimer or heterooligomer). Examples of the above identified antibodies and variants or derivatives thereof are described in, inter alia, Harlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) and Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann and Dubel, Antibody Engineering Springer, 2nd ed. 2010 and Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

Конструкции антител по данному изобретению предпочтительно представляют собой конструкции антител, полученные in vitro. Этот термин относится к конструкции антитела в соответствии с вышеприведенным определением, в которой весь или часть вариабельного участка (например по меньшей мере один CDR) получена путем селекции в неиммунной клетке, например, фаговый дисплей in vitro, белковый чип или любой другой способ, в котором потенциальные последовательности могут быть испытаны на их способность связываться с антигеном. Таким образом, этот термин предпочтительно исключает последовательности, полученные исключительно геномной перегруппировкой в иммунной клетке животного. Рекомбинантное антитело представляет собой антитело, полученное с применением технологии рекомбинантной ДНК или генной инженерии.The antibody constructs of this invention are preferably in vitro antibody constructs. This term refers to an antibody construct as defined above, in which all or part of the variable region (e.g., at least one CDR) is obtained by selection in a non-immune cell, e.g., in vitro phage display, protein chip, or any other method in which potential sequences can be tested for their ability to bind to an antigen. Thus, this term preferably excludes sequences obtained exclusively by genomic rearrangement in an animal's immune cell. A recombinant antibody is an antibody produced using recombinant DNA technology or genetic engineering.

Термин моноклональное антитело (mAb) или конструкция моноклонального антитела, как используется в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е., составляющие популяцию отдельные антитела являются идентичными, за исключением возможных естественных мутаций и/или посттрансляционных модификаций (например, изомеризации, амидирования), которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направленными против одного антигенного сайта или детерминанты на антигене, в отличие от обычных (поликлональных) антител, которые обычно включают в себя различные антитела, направленные против различных детерминант (или эпитопов). В дополнение к их специфичности моноклональные антитела выгодны тем, что они синтезируются гибридомной культурой, поэтому не загрязнены другими иммуноглобулинами. Модификатор моноклональный указывает на характер антитела, как полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом.The term monoclonal antibody (mAb) or monoclonal antibody construct as used herein refers to an antibody derived from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies constituting the population are identical except for possible natural mutations and/or or post-translational modifications (eg, isomerization, amidation), which may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site or determinant on an antigen, in contrast to conventional (polyclonal) antibodies, which typically include different antibodies directed against different determinants (or epitopes). In addition to their specificity, monoclonal antibodies have the advantage that they are synthesized by hybridoma culture and therefore are not contaminated with other immunoglobulins. The monoclonal modifier indicates the nature of the antibody as derived from a substantially homogeneous population of antibodies and should not be construed as requiring the production of the antibody by any particular method.

Для получения моноклональных антител можно применять любую технологию, обеспечивающую антитела, вырабатываемые непрерывными культурами клеточных линий. Например, моноклональные антитела для применения могут быть получены при помощи метода гибридомы, впервые описанного Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975) или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). Примеры дополнительных технологий получения человеческих моноклональных антител включают в себя метод триомы, метод гибридомы B-клеток человека (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) и метод гибридомы вируса Эпштейна-Барр, ВЭБ (EBV)-гибридомы (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).To obtain monoclonal antibodies, you can use any technology that provides antibodies produced by continuous cultures of cell lines. For example, monoclonal antibodies for use can be made using the hybridoma method first described by Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975) or can be made by recombinant DNA techniques (see, for example, US Pat. No. 4,816,567). Examples of additional technologies for the production of human monoclonal antibodies include the trioma method, the human B-cell hybridoma method (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72), and the Epstein-Barr virus hybridoma method, EBV hybridoma (Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

В дальнейшем гибридомы могут быть подвергнуты скринингу с применением стандартных методов, таких как твердофазный иммуноферментный анализ, ТИФА (ELISA) и анализ методом поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE™), для идентификации одной или большего количества гибридом, которые вырабатывают антитело, специфически связывающееся с указанным антигеном. В качестве иммуногена можно применять любую форму соответствующего антигена, например рекомбинантный антиген, природные формы, любые их варианты или фрагменты, а также их антигенный пептид. Поверхностный плазмонный резонанс, применяемый в системе BIAcore, может быть применен для повышенияFurther, hybridomas can be screened using standard methods such as enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA, and surface plasmon resonance assay (BIACORE™) to identify one or more hybridomas that produce an antibody that specifically binds to the indicated antigen. . As an immunogen, any form of the corresponding antigen can be used, for example, a recombinant antigen, natural forms, any variants or fragments thereof, as well as their antigenic peptide. Surface plasmon resonance used in the BIAcore system can be used to increase

- 3 042291 эффективности фаговых антител, которые связываются с эпитопом целевого антигена, такого как МЗЛН (MSLN) или КД3 (CD3)-ипсилон (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J.- 3 042291 efficacy of phage antibodies that bind to an epitope of the target antigen, such as MSLN or CD3-upsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J.

Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

Другой типичный способ получения моноклональных антител включает в себя скрининговые библиотеки экспрессии белка, например фаговый дисплей или библиотеки рибосомного дисплея. Фаговый дисплей описан, например, в Ladner et al., патент США № 5223409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).Another exemplary method for preparing monoclonal antibodies involves protein expression screening libraries, such as phage display or ribosomal display libraries. Phage display is described, for example, in Ladner et al., US patent No. 5223409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

В дополнение к применению библиотек дисплея соответствующий антиген может быть применен для иммунизации животного, не относящегося к человеку, например, грызуна (такого как мышь, хомяк, кролик или крыса). В одном варианте осуществления изобретения животное, не относящееся к человеку, включает в себя по меньшей мере часть гена человеческого иммуноглобулина. Например, можно сконструировать породы мышей с недостаточностью выработки мышиных антител, с большими фрагментами локусов Ig (иммуноглобулина) человека. С применением технологии гибридомы можно получать и отбирать антигенспецифические моноклональные антитела, полученные из генов с желаемой специфичностью. См., например, XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096 и WO 96/33735.In addition to using display libraries, an appropriate antigen can be used to immunize a non-human animal, such as a rodent (such as a mouse, hamster, rabbit, or rat). In one embodiment, the non-human animal includes at least a portion of the human immunoglobulin gene. For example, mice can be engineered to be deficient in mouse antibody production, with large fragments of human Ig (immunoglobulin) loci. Using hybridoma technology, antigen-specific monoclonal antibodies derived from genes with the desired specificity can be generated and selected. See, for example, XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096 and WO 96/33735.

Моноклональное антитело также может быть получено из организма животного, не относящегося к человеку, а затем модифицировано, например, гуманизировано, деиммунизировано, сделано химерным и т.д., с применением технологий рекомбинантной ДНК, известных в данной области техники. Примеры модифицированных конструкций антител включают в себя гуманизированные варианты антител, не относящихся к человеку, антитела с созревшей аффинностью (см., например, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 254, 889-896 (1992) и Lowman et al. Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) и антитела-мутанты с модифицированной(ыми) эффекторной(ыми) функцией(ями) (см., например, патент США 5648260, Kontermann and Dubel (2010), в приводившейся выше цитате, и Little (2009), в приводившейся выше цитате).The monoclonal antibody can also be derived from a non-human animal and then modified, eg, humanized, deimmunized, made chimeric, etc., using recombinant DNA technologies known in the art. Examples of modified antibody constructs include humanized non-human antibody variants, affinity matured antibodies (see, e.g., Hawkins et al., J. Mol. Biol., 254, 889-896 (1992) and Lowman et al. Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) and mutant antibodies with modified effector function(s) (see, for example, US Pat. and Little (2009) in the quotation above).

В иммунологии созревание аффинности представляет собой процесс, при помощи которого Bклетки вырабатывают антитела с повышенной аффинностью к антигену в ходе иммунного ответа. При повторном контакте с тем же антигеном хозяин будет вырабатывать антитела с последовательно более высокой аффинностью. Как и естественный прототип, созревание аффинности in vitro основано на принципах мутации и селекции. Созревание аффинности in vitro было успешно применено для оптимизации антител, конструкций антител и фрагментов антител. Случайные мутации внутри CDR вводят с применением излучения, химических мутагенов или ПЦР с применением неточной полимеразы. Кроме того, генетическое разнообразие может быть увеличено путем перестановки цепей. Два или три раунда мутации и отбора с применением методов дисплея, таких как фаговый дисплей, обычно дают фрагменты антител с аффинностью в области низких наномолярных значений.In immunology, affinity maturation is the process by which B cells produce antibodies with increased affinity for an antigen during an immune response. Upon repeated exposure to the same antigen, the host will produce antibodies with consistently higher affinity. Like the natural prototype, in vitro affinity maturation is based on the principles of mutation and selection. In vitro affinity maturation has been successfully applied to optimize antibodies, antibody constructs, and antibody fragments. Random mutations within the CDR are introduced using radiation, chemical mutagens, or PCR using an inaccurate polymerase. In addition, genetic diversity can be increased by strand shuffling. Two or three rounds of mutation and selection using display techniques such as phage display typically yield antibody fragments with low nanomolar affinities.

Предпочтительный тип получения вариантов (varianation) с заменой аминокислот для конструкций антител включает в себя замену одного или большего количества остатков гипервариабельного участка исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(е) вариант(ы), отобранный(е) для дальнейшей разработки, будет(ут) иметь улучшенные биологические свойства относительно исходного антитела, из которого они получены. Удобный способ генерации таких вариантов с заменой включает в себя созревание аффинности с применением фагового дисплея. Вкратце, несколько сайтов гипервариабельного участка (например, 6-7 сайтов) подвергают мутации, чтобы получить все возможные аминокислотные замены в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антител показывают одновалентным способом из частиц нитчатого фага в виде слияний с продуктом гена III M13, упакованным в каждую частицу. Показанные на фаге варианты в дальнейшем подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как описано в данном документе. С целью идентификации потенциальных сайтов гипервариабельных участков для модификации, может быть выполнен аланинсканирующий мутагенез, чтобы идентифицировать остатки гипервариабельного участка, в значительной мере способствующие связыванию с антигеном. В качестве альтернативы или дополнительно, может быть полезным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между связывающим доменом и, например, МЗЛН (MSLN) человека. Такие контактирующие остатки и соседние остатки являются кандидатами на замену в соответствии со способами, разработанными в данном изобретении. После получения таких вариантов, панель вариантов подвергают скринингу, как описано в данном документе, и антитела с превосходящими свойствами по данным одного или большего количества релевантных анализов могут быть выбраны для дальнейшей разработки.A preferred type of amino acid substitution variation for antibody constructs involves substitution of one or more hypervariable region residues of the parent antibody (eg, humanized or human antibody). Typically, the resulting(e) variant(s), selected(e) for further development, will(ut) have improved biological properties relative to the original antibody from which they are derived. A convenient way to generate such substitution variants involves affinity maturation using phage display. Briefly, several hypervariable region sites (eg, 6-7 sites) are mutated to obtain all possible amino acid substitutions at each site. The antibody variants thus obtained are shown in a univalent fashion from filamentous phage particles as fusions with the M13 gene III product packaged in each particle. Variants shown on phage are further screened for their biological activity (eg, binding affinity) as described herein. In order to identify potential hypervariable region sites for modification, alanine scanning mutagenesis can be performed to identify hypervariable region residues highly conducive to antigen binding. Alternatively or additionally, it may be useful to analyze the crystal structure of the antigen-antibody complex to identify points of contact between the binding domain and, for example, human MSLN. Such contact residues and adjacent residues are candidates for replacement in accordance with the methods developed in this invention. Once such variants are generated, a panel of variants is screened as described herein, and antibodies with superior properties in one or more of the relevant assays can be selected for further development.

Моноклональные антитела и конструкции антител по данному изобретению конкретно включают в себя химерные антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида, или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная(ые) цепь(и) идентична(ы) или гомологична(ы) соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США №The monoclonal antibodies and antibody constructs of this invention specifically include chimeric antibodies (immunoglobulins) in which the heavy and/or light chain portion is identical or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from a particular species, or belonging to a particular class or subclass of antibodies, in while the remainder(s) of the chain(s) are(s) identical(s) or homologous(s) to the corresponding sequences in antibodies derived from another species or belonging to another class or subclass of antibodies, as well as fragments of such antibodies, provided that they exhibit desired biological activity (U.S. Patent No.

- 4 042291- 4 042291

4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Предложенные в данном изобретении химерные антитела включают в себя примитивизированые (primitized) антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные от приматов, не относящихся к человеку (например, старосветская мартышка, человекообразная обезьяна и т.д.) и человеческие последовательности константного участка. Описаны различные подходы к созданию химерных антител. См., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., патент США № 4816567; Boss et al., патент США № 4816397; Tanaguchi et al., EP 0171496; EP 0173494 и GB 2177096.4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). The chimeric antibodies provided herein include primitized antibodies containing variable domain antigen-binding sequences derived from non-human primates (eg, marmoset, ape, etc.) and human constant region sequences. Various approaches to the creation of chimeric antibodies have been described. See, for example, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA. 81: 6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., US Pat. No. 4,816,567; Boss et al., US patent No. 4816397; Tanaguchi et al., EP 0171496; EP 0173494 and GB 2177096.

Кроме того, антитело, конструкция антитела, фрагмент антитела или вариант антитела могут быть модифицированы путем специфической делеции эпитопов T-клеток человека (метод под названием деиммунизация) способами, описанными, например, в WO 98/52976 или WO 00/34317. Вкратце вариабельные домены тяжелой и легкой цепи антитела могут быть проанализированы для пептидов, которые связываются с главным комплексом гистосовместимости, ГКГ (MHC) класса II; эти пептиды представляют собой потенциальные T-клеточные эпитопы (как определено в WO 98/52976 и WO 00/34317). Для обнаружения потенциальных T-клеточных эпитопов может быть применен подход компьютерного моделирования под названием белковая нить, и, кроме того, в базе данных пептидов, связывающихся с ГКГ (MHC) класса II человека, можно провести поиск мотивов, присутствующих в последовательностях VH и VL, как описано в WO 98/52976 и WO 00/34317. Эти мотивы связываются с любым из 18 основных аллотипов DR ГКГ (MHC) класса II и, таким образом, представляют собой потенциальные T-клеточные эпитопы. Найденные потенциальные T-клеточные эпитопы могут быть удалены путем замены небольшого количества аминокислотных остатков в вариабельных доменах или, предпочтительно, путем замены одной аминокислоты. Как правило, производятся консервативные замены. Часто, но не исключительно, можно использовать аминокислоту, общую для положения в последовательностях антител зародышевой линии человека. Последовательности зародышевой линии человека раскрыты, например, в Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; и Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14: 4628-4638. Каталог V BASE представляет собой полный каталог последовательностей вариабельных участков иммуноглобулина человека (составленный Tomlinson, LA. et al., Центр белковой инженерии MRC, Кембридж, Великобритания). Эти последовательности могут быть применены как источник последовательности человека, например, для каркасных участков и CDR. Кроме того, можно использовать консенсусные каркасные участки человека, например, как описано в патенте США № 6300064.In addition, an antibody, antibody construct, antibody fragment, or antibody variant can be modified by specific deletion of human T cell epitopes (a technique called deimmunization) by the methods described, for example, in WO 98/52976 or WO 00/34317. Briefly, the heavy and light chain variable domains of an antibody can be analyzed for peptides that bind to the major histocompatibility complex, MHC class II; these peptides are potential T cell epitopes (as defined in WO 98/52976 and WO 00/34317). A computer modeling approach called protein filament can be used to detect potential T-cell epitopes, and in addition, a database of human MHC (MHC) class II binding peptides can be searched for motifs present in VH and VL sequences, as described in WO 98/52976 and WO 00/34317. These motifs bind to any of the 18 major class II MHC (MHC) DR allotypes and thus represent potential T-cell epitopes. Found potential T-cell epitopes can be removed by replacing a small number of amino acid residues in the variable domains, or, preferably, by replacing a single amino acid. As a rule, conservative substitutions are made. Often, but not exclusively, an amino acid common to a position in human germline antibody sequences can be used. Human germline sequences are disclosed in, for example, Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16(5): 237-242; and Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:14:4628-4638. The VBASE catalog is a complete catalog of human immunoglobulin variable region sequences (compiled by Tomlinson, LA. et al., MRC Protein Engineering Center, Cambridge, UK). These sequences can be used as a source of human sequence, for example for framework regions and CDRs. In addition, human consensus frameworks can be used, for example, as described in US Pat. No. 6,300,064.

Гуманизированные антитела, конструкции антител, их варианты или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие субпоследовательности антител) представляют собой антитела или иммуноглобулины, в основном с человеческими последовательностями, которые содержат (а) минимальную(ые) последовательность(и), полученную(ые) из иммуноглобулина, не относящегося к человеку. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельного участка (также CDR) реципиента заменены остатками гипервариабельного участка вида, не относящегося к человеку (например, грызуна) (антитело-донор), такого как мышь, крыса, хомяк или кролик, обладающими требуемой специфичностью, аффинностью и способностью. В некоторых случаях остатки Fv каркасного участка, КУ (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не относящимися к человеку. Кроме того, гуманизированные антитела, как используется в данном документе, могут дополнительно содержать остатки, которые не найдены ни в антителе-реципиенте, ни в антителе-доноре. Такие модификации осуществляют с целью дальнейшего совершенствования и оптимизации эффективности антитела. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), как правило, из иммуноглобулина человека. Для получения дополнительной информации см. Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).Humanized antibodies, antibody constructs, variants thereof, or fragments thereof (such as Fv, Fab, Fab', F(ab')2 or other antigen-binding antibody subsequences) are antibodies or immunoglobulins, primarily with human sequences, that contain (a) the minimum sequence(s) derived from a non-human immunoglobulin. For the most part, humanized antibodies are human immunoglobulins (recipient antibody) in which hypervariable region (also CDR) residues of the recipient are replaced by hypervariable region residues of a non-human (e.g., rodent) species (donor antibody) such as a mouse , rat, hamster or rabbit having the required specificity, affinity and ability. In some cases, Fv framework region, KU (FR) residues of human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. In addition, humanized antibodies as used herein may additionally contain residues that are not found in either the recipient antibody or the donor antibody. Such modifications are made to further improve and optimize antibody performance. In addition, the humanized antibody may comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically from a human immunoglobulin. For more information, see Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

Гуманизированные антитела или их фрагменты могут быть получены путем замены последовательностей вариабельного домена Fv, которые не имеют непосредственного отношения к связыванию с антигеном, эквивалентными последовательностями из вариабельных доменов Fv человека. Типичные способы получения гуманизированных антител или их фрагментов предложены Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; и в US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 5859205; и US 6407213. Эти способы включают в себя выделение, манипулирование и экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют все или часть вариабельных доменов Fv иммуноглобулина по меньшей мере из одной тяжелой или легкой цепи. Такие нуклеиновые кислоты могут быть получены из гибридомы, вырабатывающей антитело против заданной мишени, как описано выше, а также из других источников. Рекомбинантную ДНК, кодирующую молекулу гуманизированного антитела, в дальнейшем можно клонировать в подходящий вектор экспрессии.Humanized antibodies or fragments thereof can be generated by replacing Fv variable domain sequences that are not directly related to antigen binding with equivalent sequences from human Fv variable domains. Exemplary methods for preparing humanized antibodies or fragments thereof are provided by Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; and in US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 5859205; and US 6,407,213. These methods include isolating, manipulating, and expressing nucleic acid sequences that encode all or part of an immunoglobulin Fv variable domain from at least one heavy or light chain. Such nucleic acids can be obtained from a hybridoma that produces an antibody against a given target, as described above, as well as from other sources. The recombinant DNA encoding the humanized antibody molecule can then be cloned into a suitable expression vector.

Кроме того, гуманизированные антитела могут быть получены с применением трансгенных животных, таких как мыши, которые экспрессируют гены тяжелой и легкой цепи человека, но неспособны экспрессировать эндогенные гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина мыши. Winter описывает ти- 5 042291 пичный способ пересадки CDR, который может быть применен для получения гуманизированных антител, описанных в данном изобретении (патент США № 5225539). Все CDR конкретного антитела человека могут быть заменены по меньшей мере частью CDR, не относящихся к человеку, или только некоторые из CDR могут быть заменены CDR, не относящимися к человеку. Необходимо только заменить количество CDR, необходимых для связывания гуманизированного антитела с заданным антигеном.In addition, humanized antibodies can be generated using transgenic animals such as mice that express human heavy and light chain genes but are unable to express endogenous mouse immunoglobulin heavy and light chain genes. Winter describes an exemplary CDR grafting method that can be used to produce the humanized antibodies described in this invention (US Pat. No. 5,225,539). All of the CDRs of a particular human antibody may be replaced with at least a portion of the non-human CDRs, or only some of the CDRs may be replaced with non-human CDRs. It is only necessary to change the number of CDRs needed to bind a humanized antibody to a given antigen.

Гуманизированное антитело может быть оптимизировано путем введения консервативных замен, замен консенсусной последовательности, замен зародышевой линии и/или обратных мутаций. Такие модифицированные молекулы иммуноглобулина могут быть получены по любой из нескольких технологий, известных в данной области техники (например, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 73087312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, и EP 239400).A humanized antibody can be optimized by introducing conservative substitutions, consensus sequence substitutions, germline substitutions, and/or back mutations. Such modified immunoglobulin molecules can be prepared by any of several technologies known in the art (e.g., Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 73087312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, and EP 239400).

Термин человеческое антитело, конструкция человеческого антитела и связывающий домен человека включает в себя антитела, конструкции антител и связывающие домены, которые содержат участки антитела, такие как вариабельные и константные участки или домены, которые по существу соответствуют последовательностям иммуноглобулина зародышевой линии человека, известным в данной области техники, включая в себя, например, те, которые описаны Kabat et al. (1991) (в приводившейся выше цитате). Антитела человека, конструкции антител или связывающие домены по изобретению могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. Человеческие антитела, конструкции антител или связывающие домены могут содержать по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять или более положений, замененных аминокислотным остатком, который не кодируется последовательностью иммуноглобулина зародышевой линии человека. Определение человеческих антител, конструкций антител и связывающих доменов, как используется в данном документе, дополнительно включает полностью человеческие антитела, которые включают в себя только последовательности человеческих антител, не являющиеся искусственно и/или генетически модифицированными, как те, которые могут быть получены с применением таких технологий или систем, как Xenomouse.The term human antibody, human antibody construct, and human binding domain includes antibodies, antibody constructs, and binding domains that contain antibody regions, such as variable and constant regions or domains, that substantially correspond to human germline immunoglobulin sequences known in the art. techniques, including, for example, those described by Kabat et al. (1991) (in the quotation above). Human antibodies, antibody constructs, or binding domains of the invention may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by in vitro random or site-specific mutagenesis or in vivo somatic mutation), for example, in CDRs and , in particular, in CDR3. Human antibodies, antibody constructs, or binding domains may contain at least one, two, three, four, five, or more positions replaced by an amino acid residue that is not encoded by a human germline immunoglobulin sequence. The definition of human antibodies, antibody constructs, and binding domains as used herein further includes fully human antibodies, which include only human antibody sequences that are not artificially and/or genetically modified, such as those that can be produced using such technologies or systems like Xenomouse.

В некоторых вариантах осуществления изобретения конструкции антитела по изобретению представляют собой выделенные или по существу чистые конструкции антител. Выделенный или по существу чистый, при использовании для описания конструкций антител, раскрытых в данном изобретении, означает конструкцию антитела, которая была идентифицирована, отделена и/или выделена из компонента среды, в которой она была продуцирована.In some embodiments, the antibody constructs of the invention are isolated or substantially pure antibody constructs. Isolated or substantially pure, when used to describe antibody constructs disclosed herein, means an antibody construct that has been identified, separated, and/or isolated from a component of the environment in which it was produced.

Предпочтительно конструкция антитела является свободной или по существу свободной от всех других компонентов среды, в которой она была продуцирована. Загрязняющие компоненты среды, в которой она была продуцирована, такие как рекомбинантные трансфектированные клетки, представляют собой материалы, которые обычно могли бы препятствовать диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие растворенные вещества белковой или небелковой природы. Содержание конструкций антител может составлять, например, по меньшей мере примерно 5% или по меньшей мере примерно 50 мас.% от общего белка в конкретном образце. Необходимо понимать, что, в зависимости от обстоятельств, содержание выделенного белка может составлять от 5 до 99,9 мас.% от содержания общего белка. Полипептид может быть получен в значительно более высокой концентрации за счет применения индуцибельного промотора или промотора с высоким уровнем экспрессии, таким образом, что он вырабатывается с повышенными уровнями концентрации. Определение включает в себя получение конструкции антитела в широком спектре организмов и/или клеток-хозяев, которые известны в данной области техники. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения конструкция антитела будет очищена (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с применением секвенатора с вращающимся стаканом, или (2) до гомогенности при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, ДНС-ПААГ (SDS-PAGE) в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с применением Кумасси синего или предпочтительно серебрянки. Обычно, однако, выделенная конструкция антитела будет получена при помощи по меньшей мере одной стадии очистки.Preferably, the antibody construct is free or substantially free of all other components of the environment in which it was produced. Contaminant components of the environment in which it was produced, such as recombinant transfected cells, are materials that would normally interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide and may include enzymes, hormones, and other solutes of a proteinaceous or non-proteinaceous nature. The content of antibody constructs can be, for example, at least about 5% or at least about 50 wt.% of the total protein in a particular sample. It should be understood that, depending on the circumstances, the content of the isolated protein may be from 5 to 99.9 wt.% of the content of the total protein. The polypeptide can be produced at significantly higher concentrations by using an inducible or highly expressed promoter such that it is produced at elevated concentration levels. The definition includes the generation of an antibody construct in a wide variety of organisms and/or host cells that are known in the art. In preferred embodiments, the antibody construct will be purified (1) to a degree sufficient to obtain at least 15 residues of the N-terminal or internal amino acid sequence using a rotating beaker sequencer, or (2) to homogeneity using polyacrylamide gel electrophoresis in in the presence of sodium dodecyl sulfate, SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using Coomassie blue or preferably silver. Typically, however, an isolated antibody construct will be obtained by at least one purification step.

Термин связывающий домен описывает в связи с данным изобретением домен, который (специфически) связывается/взаимодействует с/распознает конкретный целевой эпитоп или конкретный целевой сайт на молекулах-мишенях (антигенах), в данном изобретении: МЗЛН (MSLN) и КД3 (CD3), соответственно. Структура и функция первого связывающего домена (распознающего МЗЛН (MSLN)) и предпочтительно также структура и/или функция второго связывающего домена (распознающего КД3 (CD3)) основана(ы) на структуре и/или функции антитела, например, полноразмерной или цельной молекулы иммуноглобулина. Согласно изобретению первый связывающий домен характеризуется наличием трех CDR легкой цепи (т.е., CDR1, CDR2 и CDR3 участки VL) и/или трех CDR тяжелой цепи (т.е., CDR1, CDR2 и CDR3 участки VH). Кроме того, второй связывающий домен предпочтительно содержит минимальные структурные требования к антителу, которые позволяют связывание с мишенью. Более пред- 6 042291 почтительно второй связывающий домен содержит по меньшей мере три CDR легкой цепи (т.е., CDR1,The term binding domain describes in connection with this invention a domain that (specifically) binds/interacts with/recognizes a specific target epitope or specific target site on target molecules (antigens), in this invention: MSLN (MSLN) and CD3 (CD3), respectively. The structure and function of the first binding domain (recognizing MSLN (MSLN)) and preferably also the structure and/or function of the second binding domain (recognizing CD3 (CD3)) is(are) based on the structure and/or function of an antibody, for example, a full-length or whole immunoglobulin molecule . According to the invention, the first binding domain is characterized by having three light chain CDRs (i.e., CDR1, CDR2 and CDR3 VL regions) and/or three heavy chain CDRs (i.e., CDR1, CDR2 and CDR3 VH regions). In addition, the second binding domain preferably contains the minimum structural requirements for the antibody, which allow binding to the target. More preferably, the second binding domain contains at least three light chain CDRs (i.e., CDR1,

CDR2 и CDR3 участки VL) и/или три CDR тяжелой цепи (т.е., CDR1, CDR2 и CDR3 участки VH). Предполагается, что первый и/или второй связывающий домен получен или может быть получен при помощи скрининговых методов фагового дисплея или библиотеки, а не путем пересадки последовательностейCDR2 and CDR3 VL regions) and/or three heavy chain CDRs (i.e., CDR1, CDR2 and CDR3 VH regions). It is believed that the first and/or second binding domain is or can be obtained by phage display or library screening methods and not by sequence transplantation.

CDR из ранее существовавшего (моноклонального) антитела в каркас.CDR from a pre-existing (monoclonal) antibody into a scaffold.

В соответствии с данным изобретением связывающие домены находятся в форме одного или большего количества полипептидов. Такие полипептиды могут содержать белковые части и небелковые части (например, химические линкеры или химические поперечно-сшивающие агенты, такие как глутаровый альдегид). Белки (включая их фрагменты, предпочтительно биологически активные фрагменты и пептиды, обычно содержащие менее чем 30 аминокислот) содержат две или более аминокислот, связанных друг с другом посредством ковалентной пептидной связи (с образованием цепи аминокислот). Как используется в данном изобретении, термин полипептид описывает группу молекул, которые обычно состоят из более чем 30 аминокислот. Полипептиды могут дополнительно образовывать мультимеры, такие как димеры, тримеры и высшие олигомеры, т.е., состоящие из более чем одной молекулы полипептида. Молекулы полипептидов, образующие такие димеры, тримеры и т.д., могут быть идентичными или неидентичными. Соответствующие структуры таких мультимеров более высокого порядка, следовательно, называются гомо- или гетеродимерами, гомо- или гетеротримерами и т.д. Примером гетеромультимера является молекула антитела, которая в своей естественной форме состоит из двух идентичных легких полипептидных цепей и двух идентичных тяжелых полипептидных цепей. Термины пептид, полипептид и белок дополнительно относятся к естественно модифицированным пептидам/полипептидам/белкам, в которых модификация осуществляется, например, посредством посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и тому подобное. Кроме того, пептид, полипептид или белок, упоминаемый в данном изобретении, может быть химически модифицирован, например, пегилирован. Такие модификации хорошо известны в данной области техники и описаны ниже.In accordance with this invention, the binding domains are in the form of one or more polypeptides. Such polypeptides may contain proteinaceous parts and non-proteinaceous parts (for example, chemical linkers or chemical cross-linking agents such as glutaraldehyde). Proteins (including their fragments, preferably biologically active fragments and peptides, usually containing less than 30 amino acids) contain two or more amino acids linked to each other through a covalent peptide bond (to form a chain of amino acids). As used in this invention, the term polypeptide describes a group of molecules that typically consist of more than 30 amino acids. Polypeptides can further form multimers such as dimers, trimers and higher oligomers, ie, consisting of more than one polypeptide molecule. The polypeptide molecules forming such dimers, trimers, etc. may be identical or non-identical. The corresponding structures of such higher order multimers are therefore called homo- or heterodimers, homo- or heterotrimers, etc. An example of a heteromultimer is an antibody molecule, which in its natural form consists of two identical light polypeptide chains and two identical heavy polypeptide chains. The terms peptide, polypeptide and protein further refer to naturally modified peptides/polypeptides/proteins in which the modification is carried out, for example, by post-translational modifications such as glycosylation, acetylation, phosphorylation and the like. In addition, the peptide, polypeptide or protein referred to in this invention may be chemically modified, for example, pegylated. Such modifications are well known in the art and are described below.

Предпочтительно связывающий домен, который связывается с МЗЛН (MSLN), и/или связывающий домен, который связывается с КД3 (CD3), является(ются) человеческими связывающими доменами. Антитела и конструкции антител, содержащие по меньшей мере один человеческий связывающий домен, позволяют избежать некоторых проблем, связанных с антителами или конструкциями антител, которые содержат вариабельные и/или константные участки, не относящиеся к человеку, например, грызуна (например, мышевидного, крысы, хомяка или кролика). Наличие таких белков, полученных из организма грызуна, может приводить к быстрому клиренсу антител или конструкций антител или может приводить к возникновению иммунного ответа против антитела или конструкции антитела у пациента. Чтобы избежать применения антител или конструкций антител, полученных из организма грызуна, человеческие или полностью человеческие антитела/конструкции антител могут быть получены путем введения функции человеческого антитела в организм грызуна, таким образом, что грызун вырабатывает полностью человеческие антитела.Preferably, the binding domain that binds to MSLN (MSLN) and/or the binding domain that binds to CD3 (CD3) are(are) human binding domains. Antibodies and antibody constructs containing at least one human binding domain avoid some of the problems associated with antibodies or antibody constructs that contain non-human variable and/or constant regions, such as a rodent (e.g., murine, rat, hamster or rabbit). The presence of such rodent-derived proteins may result in rapid clearance of the antibody or antibody construct, or may result in an immune response against the antibody or antibody construct in the patient. To avoid the use of antibodies or antibody constructs derived from a rodent, human or fully human antibodies/antibody constructs can be obtained by introducing the function of a human antibody into the rodent such that the rodent produces fully human antibodies.

Возможность клонировать и реконструировать человеческие локусы размером миллионы оснований в искусственной дрожжевой хромосоме, ИДХ (YAC) и вводить их в зародышевую линию мыши обеспечивает мощный подход к прояснению функциональных компонентов очень больших или грубо картированных локусов, а также к созданию полезных моделей заболеваний человека. Кроме того, применение такой технологии для замены локусов мыши их человеческими эквивалентами может обеспечить уникальное понимание экспрессии и регуляции генных продуктов человека во время развития, их коммуникации с другими системами и их участия в индукции и развитии заболевания.The ability to clone and reverse engineer millions of base human loci in the Artificial Yeast Chromosome, YAC (YAC) and introduce them into the mouse germline provides a powerful approach to elucidating the functional components of very large or roughly mapped loci, as well as creating useful models of human disease. In addition, the use of such technology to replace mouse loci with their human equivalents could provide unique insights into the expression and regulation of human gene products during development, their communication with other systems, and their involvement in disease induction and progression.

Важным практическим применением такой стратегии является гуманизация гуморальной иммунной системы мыши. Введение локусов иммуноглобулина человека (Ig) в организм мышей, у которых инактивированы эндогенные гены Ig, дает возможность изучить механизмы, лежащие в основе запрограммированной экспрессии и сборки антител, а также их роль в развитии B-клеток. Более того, такая стратегия могла бы стать идеальным источником для производства полностью человеческих моноклональных антител (mAb) - важной вехой в направлении выполнения обещания относительно лечения антителами заболеваний человека. Ожидается, что полностью человеческие антитела или конструкции антител минимизируют иммуногенные и аллергические реакции, присущие mAb мыши или дериватизированным mAb мыши и, таким образом, повысят эффективность и безопасность вводимых антител/конструкций антител. Можно ожидать, что применение полностью человеческих антител или конструкций антител обеспечит существенное преимущество при лечении хронических и рецидивирующих заболеваний человека, таких как воспаление, аутоиммунные реакции и рак, которые требуют повторного введения соединения.An important practical application of such a strategy is the humanization of the mouse humoral immune system. The introduction of human immunoglobulin (Ig) loci into mice with inactivated endogenous Ig genes provides an opportunity to study the mechanisms underlying the programmed expression and assembly of antibodies, as well as their role in the development of B-cells. Moreover, such a strategy could be an ideal source for the production of fully human monoclonal antibodies (mAbs), a milestone towards fulfilling the promise of antibody treatment of human diseases. Fully human antibodies or antibody constructs are expected to minimize the immunogenic and allergic reactions inherent in mouse mAbs or derivatized mouse mAbs and thus increase the efficacy and safety of administered antibodies/antibody constructs. It can be expected that the use of fully human antibodies or antibody constructs will provide a significant advantage in the treatment of chronic and recurrent human diseases such as inflammation, autoimmune reactions and cancer, which require repeated administration of the compound.

Один из подходов к этой цели заключался в том, чтобы сконструировать породы мышей с недостаточной выработкой антител мыши, с большими фрагментами локусов Ig человека, в ожидании того, что такие мыши могли бы вырабатывать большой репертуар антител человека в отсутствие мышиных антител. Большие фрагменты Ig человека сохраняли бы большое разнообразие вариабельных генов, а также надлежащую регуляцию выработки и экспрессии антител. Путем применения аппарата мыши для дивер- 7 042291 сификации и селекции антител и отсутствия иммунологической толерантности к белкам человека воспроизводимый репродуктор человеческих антител у этих пород мышей должен давать антитела с высокой аффинностью против любого антигена, представляющего интерес, включая человеческие антигены. С применением технологии гибридомы могут быть легко получены и отобраны антигенспецифические человеческие mAb с желаемой специфичностью. Эта общая стратегия была продемонстрирована в связи с получением первых пород мышей XenoMouse (см. Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994)). Штаммы XenoMouse были сконструированы при помощи искусственных дрожжевых хромосом, ИДХ (YAC), содержащих фрагменты конфигурации зародышевой линии размером 245 тыс. о. и 190 тыс. о. в локусе тяжелой цепи человека и локусе легкой цепи каппа, соответственно, которые содержали ключевые последовательности вариабельного и константного участка. ИДХ (YAC), содержащая человеческий Ig, оказалась совместимой с системой мыши как для перегруппировки, так и для экспрессии антител и была способна заменить инактивированные гены Ig мыши. Это было продемонстрировано их способностью индуцировать развитие B-клеток, вырабатывать подобный взрослым человеческий репертуар полностью человеческих антител и генерировать антигенспецифические человеческие mAb. Эти результаты также наводили на мысль о том, что введение больших порций локусов Ig человека, содержащих большее количество V-генов, дополнительные регуляторные элементы и константные участки Ig человека, может воспроизвести по существу полный репертуар, характерный для гуморального ответа человека на инфекцию и иммунизацию. Работа Green et al. недавно была распространена на введение более чем около 80% репертуара человеческих антител посредством введения фрагментов ИДХ (YAC) конфигурации зародышевой линии размером в миллионы оснований локусов тяжелой цепи человека и локусов легкой цепи каппа, соответственно. См. Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) и патентную заявку США сер. № 08/759620.One approach to this goal has been to design mouse antibody-deficient breeds with large fragments of human Ig loci, in the expectation that such mice could produce a large repertoire of human antibodies in the absence of mouse antibodies. Large fragments of human Ig would retain a wide variety of variable genes as well as proper regulation of antibody production and expression. By using a murine antibody diversification and selection apparatus and lacking immunological tolerance to human proteins, a reproducible human antibody reproducer in these breeds of mice should produce antibodies with high affinity against any antigen of interest, including human antigens. Using hybridoma technology, antigen-specific human mAbs with the desired specificity can be easily generated and selected. This general strategy has been demonstrated in connection with the development of early breeds of XenoMouse mice (see Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994)). XenoMouse strains were constructed using artificial yeast chromosomes, IDC (YAC), containing 245 kb germline configuration fragments. and 190 thousand about. at the human heavy chain locus and the kappa light chain locus, respectively, which contained variable and constant region key sequences. YAC containing human Ig was found to be compatible with the mouse system for both rearrangement and antibody expression and was able to replace inactivated mouse Ig genes. This has been demonstrated by their ability to induce B-cell development, produce an adult-like human repertoire of fully human antibodies, and generate antigen-specific human mAbs. These results also suggested that the introduction of large portions of human Ig loci containing more V genes, additional regulatory elements and human Ig constant regions could reproduce a substantially complete repertoire characteristic of the human humoral response to infection and immunization. The work of Green et al. has recently been extended to administer more than about 80% of the human antibody repertoire by introducing million-base germline configuration IDC (YAC) fragments of human heavy chain loci and kappa light chain loci, respectively. See Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) and US Patent Application Ser. No. 08/759620.

Получение мышей XenoMouse дополнительно обсуждается и охарактеризовано в патентных заявках США сер. № 07/4 66008, сер. № 07/610515, сер. № 07/919297, сер. № 07/922649, сер. № 08/031801, сер. № 08/112848, сер. № 08/234145, сер. № 08/376279, сер. № 08/430938, сер. № 08/464584, сер. № 08/464582, сер. № 08/463191, сер. № 08/462837, сер. № 08/486853, сер. № 08/486857, сер. № 08/486859, сер. № 08/462513, сер. № 08/724752 и сер. № 08/759620; и патентах США №№ 6162963; 6150584; 6114598; 6075181 и 5939598 и патентах Японии №№ 3068180 B2, 3068506 B2 и 3068507 B2. См. также Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) и Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), EP 0463151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 и WO 03/47336.The production of XenoMouse mice is further discussed and characterized in US Patent Application Ser. no. 07/4 66008, ser. No. 07/610515, Ser. No. 07/919297, Ser. No. 07/922649, Ser. No. 08/031801, Ser. No. 08/112848, Ser. No. 08/234145, Ser. No. 08/376279, Ser. No. 08/430938, Ser. No. 08/464584, Ser. No. 08/464582, Ser. No. 08/463191, Ser. No. 08/462837, Ser. No. 08/486853, Ser. No. 08/486857, Ser. No. 08/486859, Ser. No. 08/462513, Ser. No. 08/724752 and ser. No. 08/759620; and US Pat. Nos. 6,162,963; 6150584; 6114598; 6075181 and 5939598 and Japanese Patent Nos. 3068180 B2, 3068506 B2 and 3068507 B2. See also Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) and Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), EP 0463151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 and WO 03/47336.

В альтернативном подходе другие, включая GenPharm International, Inc., применили подход минилокуса. В подходе мини-локуса экзогенный локус Ig имитируется путем включения фрагментов (отдельных генов) локуса Ig. Таким образом, один или большее количество VH-генов, один или большее количество DH-генов, один или большее количество JH-генов, константный участок мю и второй константный участок (предпочтительно константный участок гамма) формируются в конструкции для введения животному. Этот подход описан в патенте США № 5545807, Surani et al., и патентах США №№ 5545806; 5625825; 5625126; 5633425; 5661016; 5770429; 5789650; 5814318; 5877397; 5874299; и 6255458, каждый выдан Lonberg и Kay, патентах США №№ 5591669 и 6023010, выданных Krimpenfort и Berns, патентах США №№ 5612205; 5721367 и 5789215, выданных Berns et al., и патенте США № 5643763, выданном Choi и Dunn, а также в патентной заявке США GenPharm International сер. № 07/574748, сер. № 07/575962, сер. № 07/810279, сер. № 07/853408, сер. № 07/904068, сер. № 07/990860, сер. № 08/053131, сер. № 08/096762, сер. № 08/155301, сер. № 08/161739, сер. № 08/165699, сер. № 08/209741. См. также EP 0546073 B1 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 и WO 98/24884 и патент США № 5981175. Дополнительно см. Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994) и Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).In an alternative approach, others, including GenPharm International, Inc., have taken the minilocus approach. In the mini-locus approach, an exogenous Ig locus is mimicked by incorporating fragments (individual genes) of the Ig locus. Thus, one or more VH genes, one or more DH genes, one or more JH genes, a mu constant region, and a second constant region (preferably a gamma constant region) are formed into a construct for administration to an animal. This approach is described in US Pat. No. 5,545,807 to Surani et al. and US Pat. Nos. 5,545,806; 5625825; 5625126; 5633425; 5661016; 5770429; 5789650; 5814318; 5877397; 5874299; and 6,255,458 each issued to Lonberg and Kay, U.S. Patent Nos. 5,591,669 and 6,023,010 to Krimpenfort and Berns, U.S. Patent Nos. 5,612,205; 5,721,367 and 5,789,215 to Berns et al. and U.S. Patent No. 5,643,763 to Choi and Dunn and U.S. Patent Application GenPharm International Ser. No. 07/574748, Ser. No. 07/575962, Ser. No. 07/810279, Ser. No. 07/853408, Ser. No. 07/904068, Ser. No. 07/990860, Ser. No. 08/053131, Ser. No. 08/096762, Ser. No. 08/155301, Ser. No. 08/161739, Ser. No. 08/165699, Ser. No. 08/209741. See also EP 0546073 B1 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 and WO 98/24884 and US Pat. No. 5,981,175. See additionally Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994) and Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).

Kirin также продемонстрировал выработку человеческих антител у мышей, в организм которых посредством микроклеточного слияния были введены большие фрагменты хромосом или целые хромосомы. См. Европейские патентные заявки №№ 773288 и 843961. Xenerex Biosciences разрабатывает технологию для потенциальной генерации человеческих антител. В этой технологии организм мышей SCID преобразуют при помощи лимфатических клеток человека, например, B- и/или T-клеток. Затем мышей иммунизируют антигеном, причем они способны генерировать иммунный ответ против антигена. См. патенты США №№ 5476996; 5698767; и 5958765.Kirin has also demonstrated the production of human antibodies in mice in which large fragments of chromosomes or whole chromosomes have been introduced through microcellular fusion. See European Patent Applications Nos. 773288 and 843961. Xenerex Biosciences is developing technology for the potential generation of human antibodies. In this technology, SCID mice are transformed with human lymphatic cells, such as B and/or T cells. The mice are then immunized with the antigen and are capable of generating an immune response against the antigen. See U.S. Patent Nos. 5,476,996; 5698767; and 5958765.

Реакция в форме человеческого антимышиного антитела, ЧАМА (HAMA) привела к тому, что в промышленности стали получать химерные или иным способом гуманизированные антитела. Тем не менее, ожидается, что некоторые реакции человека против химерного антитела, ЧПХА (HACA) будут наблюдаться, особенно при хроническом или многократном применении антитела. Таким образом, было бы желательно предложить конструкции антител, содержащие человеческий связывающий домен против МЗЛН (MSLN) и человеческий связывающий домен против КД3 (CD3), чтобы устранить озабоченность и/или влияние реакции ЧАМА (HAMA) или ЧПХА (HACA).The reaction in the form of a human anti-mouse antibody, HAMA, has led to the commercial production of chimeric or otherwise humanized antibodies. However, it is expected that some human reactions against the chimeric antibody, HACA, will be observed, especially with chronic or repeated use of the antibody. Thus, it would be desirable to provide antibody constructs containing a human anti-MSLN binding domain (MSLN) and a human anti-CD3 binding domain (CD3) to eliminate concerns and/or the impact of a HAMA or HACA reaction.

Термины (специфически) связывается с, (специфически) распознает, (специфически) направлен на и (специфически) реагирует с в соответствии с данным изобретением означают, что связываю- 8 042291 щий домен взаимодействует или специфически взаимодействует с данным эпитопом или данным целевым сайтом на молекуле-мишени (антигенами), в данном изобретении: МЗЛН (MSLN) и КД3 (CD3), соответственно.The terms (specifically) binds to, (specifically) recognizes, (specifically) targets, and (specifically) reacts with in accordance with this invention means that the binding domain interacts or specifically interacts with a given epitope or a given target site on a molecule. -targets (antigens), in this invention: MSLN (MSLN) and CD3 (CD3), respectively.

Термин эпитоп относится к сайту на антигене, с которым специфически связывается связывающий домен, такой как антитело или иммуноглобулин или производное, фрагмент или вариант антитела или иммуноглобулина. Эпитоп является антигенным, и поэтому термин эпитоп в данном изобретении иногда дополнительно относится к антигенной структуре или антигенной детерминанте. Таким образом, связывающий домен является сайтом взаимодействия с антигеном. Указанное связывание/взаимодействие также понимается как определяющее специфическое распознавание.The term epitope refers to a site on an antigen to which a binding domain specifically binds, such as an antibody or immunoglobulin or a derivative, fragment or variant of an antibody or immunoglobulin. An epitope is antigenic, and so the term epitope in this invention sometimes additionally refers to an antigenic structure or antigenic determinant. Thus, the binding domain is the site of interaction with the antigen. Said binding/interaction is also understood to be indicative of specific recognition.

Эпитопы могут образовываться как смежными аминокислотами, так и несмежными аминокислотами, которые сближены в результате третичного свертывания белка. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, в котором первичная последовательность аминокислот составляет распознаваемый эпитоп. Линейный эпитоп обычно содержит по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 и более обычно по меньшей мере 5 или по меньшей мере 6 или по меньшей мере 7, например, от 8 до 10 аминокислот в уникальной последовательности.Epitopes can be formed by both adjacent amino acids and non-adjacent amino acids that are brought together as a result of tertiary folding of the protein. A linear epitope is an epitope in which the primary amino acid sequence constitutes a recognizable epitope. A linear epitope usually contains at least 3 or at least 4 and more usually at least 5 or at least 6 or at least 7, for example 8 to 10 amino acids in a unique sequence.

Конформационный эпитоп, в отличие от линейного эпитопа, представляет собой эпитоп, в котором первичная последовательность аминокислот, составляющая эпитоп, не является единственным определяющим компонентом распознаваемого эпитопа (например, эпитопа, в котором первичная последовательность аминокислот не обязательно распознается связывающим доменом). Обычно конформационный эпитоп содержит большее количество аминокислот, чем линейный эпитоп. Что касается распознавания конформационных эпитопов, связывающий домен распознает трехмерную структуру антигена, предпочтительно пептида или белка или его фрагмента (в контексте данного изобретения антигенная структура для одного из связывающих доменов находится в пределах белка МЗЛН (MSLN)). Например, если молекула белка сворачивается с образованием трехмерной структуры, некоторые аминокислоты и/или полипептидный скелет, образующие конформационный эпитоп, сближаются, позволяя антителу распознавать эпитоп. Методы определения конформации эпитопов включают в себя, но не ограничиваясь этим, рентгеновскую кристаллографию, двумерную спектроскопию ядерного магнитного резонанса, 2М-ЯМР (2D-NMR) и сайт-направленную спектроскопию со спиновой меткой и спектроскопию электронного парамагнитного резонанса, ЭПР (EPR).A conformational epitope, as opposed to a linear epitope, is an epitope in which the primary amino acid sequence constituting the epitope is not the only defining component of a recognized epitope (eg, an epitope in which the primary amino acid sequence is not necessarily recognized by the binding domain). Typically, a conformational epitope contains more amino acids than a linear epitope. With regard to the recognition of conformational epitopes, the binding domain recognizes the three-dimensional structure of an antigen, preferably a peptide or protein or fragment thereof (in the context of the present invention, the antigenic structure for one of the binding domains is within the MSLN protein (MSLN)). For example, if a protein molecule folds into a three-dimensional structure, some of the amino acids and/or the polypeptide backbone that form the conformational epitope come together, allowing the antibody to recognize the epitope. Techniques for determining epitope conformation include, but are not limited to, X-ray crystallography, two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy, 2D-NMR (2D-NMR) and spin label site-directed spectroscopy and electron spin resonance spectroscopy, EPR (EPR).

Способ картирования эпитопов описан следующим образом: если участок (непрерывный отрезок аминокислот) в белке МЗЛН (MSLN) человека заменяется соответствующим участком антигена МЗЛН (MSLN), не относящимся к человеку и не относящимся к примату (например, МЗЛН (MSLN) мыши, хотя другие, такие как цыпленок, крыса, хомяк, кролик и т.д., также могут быть подходящими), ожидается уменьшение связывания связывающего домена, если только связывающий домен не является перекрестно-реагирующим на применяемый МЗЛН (MSLN), не относящийся к человеку и не относящийся к примату. Указанное снижение предпочтительно составляет по меньшей мере 10, 20, 30, 40 или 50%; более предпочтительно по меньшей мере 60, 70 или 80% и наиболее предпочтительно 90, 95 или даже 100% по сравнению со связыванием с соответствующим участком белка МЗЛН (MSLN) человека, притом, что связывание с соответствующим участком белка МЗЛН (MSLN) человека принимается за 100%. Предполагается, что вышеуказанные химеры МЗЛН (MSLN) человека/МЗЛН (MSLN), не относящегося к человеку, экспрессируются в клетках яичника китайского хомяка, ЯКХ (CHO). Кроме того, химеры МЗЛН (MSLN) человека/МЗЛН (MSLN), не относящегося к человеку, могут быть слиты с трансмембранным доменом и/или цитоплазматическим доменом другого связанного с мембраной белка, такого как адгезивная молекула эпителиальных клеток, АМЭК (EpCAM), хотя такая технология не была необходимой для способа, описанного в примерах 1 и 2.The epitope mapping method is described as follows: if a region (contiguous stretch of amino acids) in the human MSLN protein is replaced by a corresponding non-human, non-primate region of the MSLN antigen (MSLN) (e.g., mouse MSLN, although others , such as chicken, rat, hamster, rabbit, etc. may also be suitable), a decrease in binding domain binding is expected, unless the binding domain is cross-reactive to the applied MSLN, which is not human and not primate. Said reduction is preferably at least 10%, 20%, 30%, 40% or 50%; more preferably at least 60%, 70% or 80% and most preferably 90%, 95% or even 100% compared to the binding to the corresponding region of the human MSLN protein, with the binding to the corresponding region of the human MSLN protein being taken as 100%. The above human MSLN/non-human MSLN chimeras are believed to be expressed in Chinese Hamster Ovary, CHO cells. In addition, human MSLN/non-human MSLN chimeras can be fused to the transmembrane domain and/or the cytoplasmic domain of another membrane-associated protein such as the epithelial cell adhesion molecule, AMEK (EpCAM), although such technology was not necessary for the method described in examples 1 and 2.

В альтернативном или дополнительном способе картирования эпитопов могут быть сгенерированы несколько укороченных версий внеклеточного домена МЗЛН (MSLN) человека, чтобы определить конкретный участок, который распознается связывающим доменом. В этих укороченных версиях различные внеклеточные домены/субдомены или участки МЗЛН (MSLN) поэтапно удаляются, начиная с N-конца. Укороченные версии МЗЛН (MSLN) могут быть экспрессированы в клетках ЯКХ (CHO). Кроме того, предполагается, что укороченные версии МЗЛН (MSLN) могут быть слиты с трансмембранным доменом и/или цитоплазматическим доменом другого связанного с мембраной белка, такого как АМЭК (EpCAM). Дополнительно предполагается, что укороченные версии МЗЛН (MSLN) могут содержать на N-конце домен сигнального пептида, например, сигнальный пептид, полученный из сигнального пептида тяжелой цепи IgG мыши. Кроме того, предполагается, что укороченные версии МЗЛН (MSLN) содержат на Nконце домен v5 (после сигнального пептида), который позволяет проверить правильность их экспрессии на поверхности клетки. Ожидается, что произойдет снижение или утрата связывания с этими укороченными версиями МЗЛН (MSLN), которые больше не содержат участка МЗЛН (MSLN), распознаваемого связывающим доменом. Уменьшение связывания предпочтительно составляет по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50%; более предпочтительно по меньшей мере 60, 70, 80% и наиболее предпочтительно 90, 95 или даже 100%, при этом связывание с полноразмерным белком МЗЛН (MSLN) человека (или его внеклеточным участком или доменом) принимается за 100%.In an alternative or additional epitope mapping method, multiple truncated versions of the human MSLN extracellular domain (MSLN) can be generated to determine the specific site that is recognized by the binding domain. In these truncated versions, various extracellular domains/subdomains or regions of the MSLN (MSLN) are removed stepwise starting from the N-terminus. Shortened versions of MSLNs (MSLNs) can be expressed in CHO cells. In addition, it is contemplated that truncated versions of MSLNs (MSLNs) may be fused to the transmembrane domain and/or the cytoplasmic domain of another membrane-associated protein such as AMEK (EpCAM). It is further contemplated that truncated versions of MSLNs (MSLNs) may contain a signal peptide domain at the N-terminus, for example a signal peptide derived from a mouse IgG heavy chain signal peptide. In addition, it is assumed that the truncated versions of MSLNs (MSLNs) contain a v5 domain at the N-terminus (after the signal peptide), which allows checking the correctness of their expression on the cell surface. It is expected that there will be a decrease or loss of binding to these truncated versions of the MSLN (MSLN), which no longer contain the MSLN region recognized by the binding domain. The binding reduction is preferably at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; more preferably at least 60%, 70%, 80% and most preferably 90%, 95% or even 100%, with binding to the full-length human MSLN protein (or its extracellular region or domain) being taken as 100%.

- 9 042291- 9 042291

Другим методом определения вклада конкретного остатка целевого антигена в распознавание конструкцией антитела или связывающим доменом является аланиновое сканирование (см., например, Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001 Jun; 5(3): 302-7), при котором каждый остаток, подлежащий анализу, заменяется аланином, например, путем сайт-направленного мутагенеза. Алании применяется из-за его необъемной, химически инертной, метильной функциональной группы, тем не менее имитирующей ссылки вторичной структуры, которыми обладают многие другие аминокислоты. Иногда объемные аминокислоты, такие как валин или лейцин, можно применять в тех случаях, когда желательно сохранить размер мутантных остатков. Аланиновое сканирование представляет собой развитую технологию, которая применяется в течение длительного периода времени.Another method for determining the contribution of a particular target antigen residue to recognition by an antibody construct or binding domain is the alanine scan (see, e.g., Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001 Jun; 5(3): 302-7), in which each residue to be analyzed is replaced by an alanine, for example by site-directed mutagenesis. Alanya is used because of its non-bulky, chemically inert, methyl functional group, yet mimics the secondary structure references that many other amino acids have. Sometimes bulky amino acids such as valine or leucine can be used in cases where it is desirable to maintain the size of the mutated residues. Alanine scanning is an advanced technology that has been used for a long period of time.

Взаимодействие между связывающим доменом и эпитопом или участком, содержащим эпитоп, подразумевает, что связывающий домен проявляет заметную аффинность к эпитопу/участку, содержащему эпитоп, на конкретном белке или антигене (в данном изобретении: МЗЛН (MSLN) и КД3 (CD3), соответственно) и, как правило, не проявляет значительной реакционной способности в отношении белков или антигенов, отличных от МЗЛН (MSLN) или КД3 (CD3). Заметная аффинность включает в себя связывание с аффинностью около 10-6 М (константа диссоциации, KD), или сильнее. Предпочтительно связывание считается специфическим, если аффинность связывания составляет от 10-12 до 10-8 М, от 10-12 до 10-9 М, от 10-12 до 10-10 М, от 10-11 до 10-8 М, предпочтительно от 10-11 до 10-9 М. Специфически ли связывающий домен реагирует с или связывается с мишенью, можно с легкостью проверить, среди прочего, путем сравнения реакции указанного связывающего домена с целевым белком или антигеном с реакцией указанного связывающего домена с белками или антигенами, отличными от МЗЛН (MSLN) или КД3 (CD3). Предпочтительно связывающий домен по данному изобретению по существу или в существенной мере не связывается с белками или антигенами, отличными от МЗЛН (MSLN) или КД3 (CD3) (т.е., первый связывающий домен не способен связываться с белками, отличными от МЗЛН (MSLN), а второй связывающий домен не способен связываться к белкам, отличным от КД3 (CD3)).An interaction between a binding domain and an epitope or epitope-containing site implies that the binding domain exhibits a marked affinity for the epitope/epitope-containing site on a particular protein or antigen (in this invention: MSLN and CD3, respectively) and, as a rule, does not show significant reactivity against proteins or antigens other than MSLN (MSLN) or CD3 (CD3). Appreciable affinity includes binding with an affinity of about 10 -6 M (dissociation constant, KD), or greater. Preferably, a binding is considered specific if the binding affinity is 10 -12 to 10 -8 M, 10 -12 to 10 -9 M, 10 -12 to 10 -10 M, 10 -11 to 10 -8 M, preferably from 10 -11 to 10 -9 M. Whether a binding domain specifically reacts with or binds to a target can be easily checked, among other things, by comparing the reaction of said binding domain with a target protein or antigen with the reaction of said binding domain with proteins or antigens, other than MSLN (MSLN) or CD3 (CD3). Preferably, the binding domain of the invention does not substantially or substantially bind to proteins or antigens other than MSLN or CD3 (i.e., the first binding domain is unable to bind to proteins other than MSLN ), and the second binding domain is unable to bind to proteins other than CD3 (CD3)).

Термин по существу/в существенной мере не связывается или не способен к связыванию означает, что связывающий домен по данному изобретению не связывается с белком или антигеном, отличным от МЗЛН (MSLN) или КД3 (CD3), т.е., не проявляет реакционной способности более чем 30%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, особенно предпочтительно не более чем 9, 8, 7, 6 или 5% в отношении белков или антигенов, отличных от МЗЛН (MSLN) или КД3 (CD3), причем связывание с МЗЛН (MSLN) или КД3 (CD3), соответственно, принимается за 100%.The term substantially/substantially does not bind or is unable to bind means that the binding domain of the invention does not bind to a protein or antigen other than MSLN or CD3, i.e., is not reactive more than 30%, preferably not more than 20%, more preferably not more than 10%, particularly preferably not more than 9%, 8%, 7%, 6% or 5% for proteins or antigens other than MSLN or KD3 ( CD3), with binding to MSLN (MSLN) or CD3 (CD3), respectively, taken as 100%.

Считается, что специфическое связывание осуществляется конкретными мотивами в аминокислотной последовательности связывающего домена и антигена. Таким образом, связывание достигается в результате их первичной, вторичной и/или третичной структуры, а также в результате вторичных модификаций указанных структур. Специфическое взаимодействие сайта взаимодействия с антигеном с его специфическим антигеном может привести к простому связыванию указанного сайта с антигеном. Кроме того, специфическое взаимодействие сайта взаимодействия с антигеном с его специфическим антигеном может, в качестве альтернативы или дополнительно, приводить к инициированию сигнала, например, вследствие индукции изменения конформации антигена, олигомеризации антигена и т.д.Specific binding is believed to be mediated by specific motifs in the amino acid sequence of the binding domain and antigen. Thus, binding is achieved as a result of their primary, secondary and/or tertiary structure, as well as secondary modifications of these structures. The specific interaction of an antigen interaction site with its specific antigen may result in a simple binding of said site to the antigen. In addition, the specific interaction of an antigen interaction site with its specific antigen may alternatively or additionally lead to signal initiation, for example due to the induction of a conformational change in the antigen, oligomerization of the antigen, etc.

Кроме того, в одном варианте реализации изобретения второй связывающий домен предпочтительно связывается с CD3-ипсилон человека и с CD3 ипсилон Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus или Saimiri sciureus.In addition, in one embodiment, the second binding domain preferentially binds to human CD3 upsilon and to Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus or Saimiri sciureus upsilon CD3.

В другом аспекте данное изобретение относится к конструкции биспецифического антитела, содержащей первый связывающий домен, который связывается с МЗЛН (MSLN) человека на поверхности клетки-мишени, и второй связывающий домен, который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности T-клетки, причем первый связывающий домен связывается с эпитопом МЗЛН (MSLN), находящимся в пределах участка МЗЛН (MSLN) человека, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO, выбранной из группы, состоящей из представленного в SEQ ID NO: 244 (кластер 1 плюс 2),. SEQ ID NO: 245 (кластер 2 плюс 3) и SEQ ID NO: 241 (кластер 4).In another aspect, the invention relates to a bispecific antibody construct comprising a first binding domain that binds to human MSLN on the surface of a target cell and a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell, wherein the first binding domain binds to an MSLN epitope (MSLN) located within a human MSLN region having the sequence shown in SEQ ID NO selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 244 (cluster 1 plus 2), . SEQ ID NO: 245 (cluster 2 plus 3) and SEQ ID NO: 241 (cluster 4).

Предпочтительно первый связывающий домен конструкции биспецифического антитела по изобретению содержит участок VH, содержащий CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, и участок VL, который содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, выбранные из группы, состоящей из следующего:Preferably, the first binding domain of the bispecific antibody construct of the invention comprises a VH region containing CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 and a VL region which contains CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 selected from the group consisting of next:

a) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 151, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 152, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 153, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 154, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 155 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 156;a) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 151, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 152, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 153, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 154, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 155 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 156;

b) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 161, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 162, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 163, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 164, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 165 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 166;b) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 161, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 162, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 163, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 164, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 165 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 166;

c) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 171, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 172, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 173, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 174, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 175 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 176;c) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 171, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 172, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 173, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 174, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 175 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 176;

d) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 181, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 182, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 183, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 184, CDR-L2, представ-d) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 181, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 182, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 183, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 184, CDR- L2, represent-

- 10 042291 ленного в SEQ ID NO: 185 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 186;- 10 042291 lenin in SEQ ID NO: 185 and CDR-L3, presented in SEQ ID NO: 186;

e) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 191, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 192, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 193, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 194, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 195 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 196;e) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 191, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 192, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 193, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 194, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 195 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 196;

f) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 201, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 202, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 203, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 204, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 205 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 206;f) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 201, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 202, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 203, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 204, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 205 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 206;

g) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 211, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 212, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 213, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 214, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 215 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 216; а такжеg) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 211, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 212, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 213, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 214, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 215 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 216; and

h) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 221, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 222, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 223, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 224, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 225 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 226.h) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 221, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 222, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 223, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 224, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 225; and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 226.

Термин вариабельный относится к частям антитела или доменам иммуноглобулина, которые проявляют изменчивость последовательности и которые принимают участие в определении специфичности и аффинности связывания конкретного антитела (т.е., вариабельный(ые) домена(ы)). Спаривание вариабельной тяжелой цепи (VH) с вариабельной легкой цепью (VL) образует один антигенсвязывающий сайт.The term variable refers to parts of an antibody or domains of an immunoglobulin that exhibit sequence variability and that are involved in determining the specificity and binding affinity of a particular antibody (i.e., the variable domain(s)). Pairing of the variable heavy chain (VH) with the variable light chain (VL) forms one antigen binding site.

Изменчивость распределяется неравномерно по вариабельным доменам антител; она сосредоточена в субдоменах каждого из вариабельных участков тяжелой и легкой цепей. Эти субдомены называются гипервариабельными участками или участками, определяющими комплементарность (CDR). Более консервативные (т.е., не гипервариабельные) части вариабельных доменов называются каркасными участками, КУ (FRM или FR) и обеспечивают каркас для шести CDR в трехмерном пространстве для образования антигенсвязывающей поверхности. Вариабельнные домены встречающихся в природе тяжелых и легких цепей содержат четыре участка FRM (FR1, FR2, FR3 и FR4), в основном принимающих конфигурацию β-листа, соединенную тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие часть структуры β-листа. Гипервариабельные участки в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости от FRM и вместе с гипервариабельными участками другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта (см. Kabat et al., в приводившейся выше цитате).Variability is distributed unevenly across the variable domains of antibodies; it is concentrated in the subdomains of each of the heavy and light chain variable regions. These subdomains are called hypervariable regions or complementarity determining regions (CDRs). The more conserved (ie, non-hypervariable) portions of the variable domains are called framework regions, KU (FRM or FR), and provide a framework for six CDRs in three-dimensional space to form an antigen-binding surface. The variable domains of naturally occurring heavy and light chains contain four FRM regions (FR1, FR2, FR3, and FR4) generally adopting a β-sheet configuration connected by three hypervariable regions that form loops connecting, and in some cases forming part of, the β structure -list. The hypervariable regions in each chain are held together in close proximity to the FRM and together with the hypervariable regions of the other chain contribute to the formation of an antigen binding site (see Kabat et al., in the above citation).

Термин CDR в единственном и множественном числе относится к участку, определяющему комплементарность, который в количестве трех определяет связывающий характер вариабельного участка легкой цепи (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3) и в количестве трех определяет связывающий характер вариабельного участка тяжелой цепи (CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3). CDR содержат большую часть остатков, ответственных за специфическое взаимодействие антитела с антигеном, и, следовательно, способствуют функциональной активности молекулы антитела: они являются основными детерминантами антигенной специфичности.The term CDR, singular and plural, refers to the complementarity determining region, which in number three determines the binding character of the light chain variable region (CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3) and in the number of three determines the binding character of the heavy chain variable region ( CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3). CDRs contain most of the residues responsible for the specific interaction of an antibody with an antigen, and therefore contribute to the functional activity of the antibody molecule: they are the main determinants of antigen specificity.

Конкретные границы определения CDR и их длина определяются в разных системах классификации и нумерации. Поэтому CDR могут ссылаться на Kabat, Chothia, контактное или любые другие определения границ, включая описанную в данном документе систему нумерации. Несмотря на варьирующие границы, каждой из этих систем присуща некоторую степень перекрытия в том, что составляет так называемые гипервариабельные участки в вариабельных последовательностях. Таким образом, определения CDR в соответствии с этими системами могут различаться по длине и граничным областям относительно смежного каркасного участка. См. например, Kabat (подход, основанный на изменчивости перекрестновидовой последовательности), Chothia (подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антигена-антитела) и/или MacCallum (Kabat et al., в приводившейся выше цитате, Chothia et al., J. Mol, Biol, 1987, 196: 901-917 и MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Еще одним стандартом для характеристики сайта связывания с антигеном является определение AbM, используемое в программном обеспечении для моделирования антител AbM Oxford Molecular. См., например, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. B: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). В той мере, в которой две методологии идентификации остатков определяют области перекрывающихся, но не идентичных участков, их можно объединить для определения гибридного CDR. Однако нумерация в соответствии с так называемой системой Kabat является предпочтительной.The specific boundaries of the CDR definition and their length are defined in different classification and numbering systems. Therefore, CDRs may refer to Kabat, Chothia, contact, or any other boundary definition, including the numbering system described in this document. Despite varying boundaries, each of these systems has some degree of overlap in what constitutes the so-called hypervariable regions in variable sequences. Thus, CDR definitions according to these systems may differ in length and boundary regions relative to an adjacent frame region. See, for example, Kabat (cross-species sequence variability approach), Chothia (antigen-antibody complex crystallographic approach), and/or MacCallum (Kabat et al., in the citation above, Chothia et al., J. Mol, Biol, 1987, 196: 901-917 and MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Another standard for characterizing an antigen binding site is the AbM detection used in Oxford Molecular's AbM antibody modeling software. See, for example, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. B: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). To the extent that the two residue identification methodologies define regions of overlapping but not identical regions, they can be combined to define a hybrid CDR. However, numbering according to the so-called Kabat system is preferred.

Как правило, CDR образуют петлевую структуру, которая может быть классифицирована как каноническая структура. Термин каноническая структура относится к конформации основной цепи, которая принимается антигенсвязывающими петлями (CDR). В сравнительных структурных исследованиях было установлено, что пять из шести антигенсвязывающих петель имеют только ограниченный репертуар доступных конформации. Каждая каноническая структура может быть охарактеризована углами поворота полипептидного скелета. Таким образом, соответствующие петли в антителах могут иметь очень похожую трехмерную структуру, несмотря на высокую вариабельность аминокислотных последовательно- 11 042291 стей в большинстве частей петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Кроме того, существует взаимосвязь между принимаемой петлей структурой и окружающими ее аминокислотными последовательностями. Конформация конкретного канонического класса определяется длиной петли и аминокислотными остатками, находящимися в ключевых положениях внутри петли, а также в пределах консервативного каркаса (т.е., за пределами петли). Таким образом, отнесение к конкретному каноническому классу может быть основано на наличии этих ключевых аминокислотных остатков.As a rule, CDRs form a loop structure, which can be classified as a canonical structure. The term canonical structure refers to the backbone conformation that is accepted by antigen-binding loops (CDRs). In comparative structural studies, five of the six antigen-binding loops were found to have only a limited repertoire of available conformations. Each canonical structure can be characterized by the angles of rotation of the polypeptide backbone. Thus, corresponding loops in antibodies can have a very similar three-dimensional structure, despite the high variability in amino acid sequences in most parts of the loops (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al. , Nature, 1989, 342:877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263:800). In addition, there is a relationship between the structure received by the loop and its surrounding amino acid sequences. The conformation of a particular canonical class is determined by the length of the loop and the amino acid residues found at key positions within the loop as well as within the conserved framework (ie, outside the loop). Thus assignment to a particular canonical class can be based on the presence of these key amino acid residues.

Термин каноническая структура может также включать в себя соображения относительно линейной последовательности антитела, например, как каталогизировано Kabat (Kabat et al., в приводившейся выше цитате). Схема (система) нумерации Kabat является широко признанным стандартом нумерации аминокислотных остатков вариабельного домена антитела систематическим образом и является предпочтительной схемой, применяемой в данном изобретении, как упоминалось в другом месте данного документа. Дополнительные структурные соображения также могут быть применены для определения канонической структуры антитела. Например, эти различия, не полностью отраженные нумерацией Kabat, могут быть описаны системой нумерации Chothia et al. и/или выявлены другими методами, например, кристаллографией и двух- или трехмерным вычислительным моделированием. Соответственно, данная последовательность антител может быть отнесена к каноническому классу, который позволяет, среди прочего, идентифицировать подходящие последовательности шасси (например, на основе желания включить в библиотеку множество канонических структур). Нумерация Kabat аминокислотных последовательностей антитела, структурные соображения, описанные Chothia et al., в приводившейся выше цитате и их влияние на толкование канонических аспектов структуры антитела описаны в литературе. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны в данной области техники. Обзор структуры антител см. в Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.The term canonical structure may also include considerations regarding the linear sequence of an antibody, such as as cataloged by Kabat (Kabat et al., in the quotation above). The Kabat numbering scheme is a widely accepted standard for numbering the amino acid residues of an antibody variable domain in a systematic manner and is the preferred scheme used in this invention, as mentioned elsewhere in this document. Additional structural considerations may also be applied to determine the canonical structure of an antibody. For example, these differences, not fully reflected by Kabat's numbering, can be described by the numbering system of Chothia et al. and/or identified by other methods, such as crystallography and two- or three-dimensional computational modeling. Accordingly, a given antibody sequence can be assigned to a canonical class that allows, among other things, the identification of suitable chassis sequences (eg, based on the desire to include multiple canonical structures in a library). The Kabat numbering of antibody amino acid sequences, the structural considerations described by Chothia et al. in the above citation, and their impact on the interpretation of canonical aspects of antibody structure are described in the literature. The subunit structures and three-dimensional configurations of the various classes of immunoglobulins are well known in the art. For a review of the structure of antibodies, see Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.

CDR3 легкой цепи и особенно CDR3 тяжелой цепи могут составлять наиболее важные детерминанты связывания с антигеном в вариабельных участках легкой и тяжелой цепи. В некоторых конструкциях антител CDR3 тяжелой цепи, по-видимому, составляет основную область контакта между антигеном и антителом. Схемы отбора in vitro, в которых варьируют только CDR3, могут быть применены для варьирования связывающих свойств антитела или определения того, какие остатки вносят вклад в связывание с антигеном. Следовательно, CDR3, как правило, является самым большим источником молекулярного разнообразия в связывающем сайте антитела. H3, например, может быть очень коротким, всего два аминокислотных остатка, или содержать более чем 26 аминокислот.The light chain CDR3 and especially the heavy chain CDR3 may constitute the most important determinants of antigen binding in the light and heavy chain variable regions. In some antibody constructs, the heavy chain CDR3 appears to constitute the major site of contact between antigen and antibody. In vitro selection schemes that vary only CDR3 can be used to vary the binding properties of an antibody or determine which residues contribute to antigen binding. Therefore, CDR3 is typically the largest source of molecular diversity in an antibody binding site. H3, for example, can be very short, only two amino acid residues, or contain more than 26 amino acids.

В классическом полноразмерном антителе или иммуноглобулине каждая легкая (L) цепь связана с тяжелой (H) цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как две цепи H связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями в зависимости от изотипа цепи H. Домен CH, наиболее близкий к VH, обычно обозначается как CH1. Константные (C) домены непосредственно не принимают участие в связывании с антигеном, но выполняют различные эффекторные функции, такие как антителозависимая, клеточно-опосредованная цитотоксичность и активация комплемента. Участок Fc антитела входит в константные домены тяжелой цепи и, например, способен взаимодействовать с рецепторами Fc, расположенными на клеточной поверхности.In a classic full-length antibody or immunoglobulin, each light (L) chain is linked to the heavy (H) chain by a single covalent disulfide bond, while the two H chains are linked to each other by one or more disulfide bonds, depending on the isotype of the H chain. to VH, usually referred to as CH1. The constant (C) domains are not directly involved in antigen binding but perform various effector functions such as antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity and complement activation. The Fc region of an antibody is included in the constant domains of the heavy chain and, for example, is able to interact with Fc receptors located on the cell surface.

Последовательность генов антител после сборки и соматической мутации значительно варьирует, и, согласно оценкам, такие варьирующие гены кодируют 1010 различных молекул антител (Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Соответственно иммунная система обеспечивает репертуар иммуноглобулинов. Термин репертуар относится по меньшей мере к одной нуклеотидной последовательности, полученной полностью или частично из по меньшей мере одной последовательности, кодирующей по меньшей мере один иммуноглобулин. Последовательность(и) может(гут) быть получена(ы) путем перегруппировки in vivo сегментов тяжелых цепей V, D и J и сегментов легких цепей V и J. В качестве альтернативы, последовательность(и) может(гут) быть получена(ы) из клетки, в ответ на которую происходит перегруппировка, например, стимуляция in vitro. В качестве альтернативы, часть или вся последовательность(и) может(гут) быть получена(ы) путем сплайсинга ДНК, синтеза нуклеотидов, мутагенеза и других способов, см., например, патент США 5565332. Репертуар может включать в себя только одну последовательность или может включать в себя множество последовательностей, в том числе в генетически разнообразной коллекции.The sequence of antibody genes after assembly and somatic mutation varies greatly, and such variable genes are estimated to encode 10 to 10 different antibody molecules (Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995 ). Accordingly, the immune system provides a repertoire of immunoglobulins. The term repertoire refers to at least one nucleotide sequence derived in whole or in part from at least one sequence encoding at least one immunoglobulin. The sequence(s) can(may) be obtained by in vivo rearrangement of the heavy chain segments V, D and J and the light chain segments V and J. Alternatively, the sequence(s) can(may) be obtained(s) from the cell in response to which the rearrangement occurs, for example, stimulation in vitro. Alternatively, part or all of the sequence(s) may be obtained(s) by DNA splicing, nucleotide synthesis, mutagenesis and other methods, see, for example, US patent 5565332. The repertoire may include only one sequence or may include many sequences, including in a genetically diverse collection.

Предпочтительная конструкция антитела согласно изобретению также может быть определена как конструкция биспецифического антитела, содержащая первый (предпочтительно человеческий) связывающий домен, который связывается с МЗЛН (MSLN) человека на поверхности клетки-мишени, и второй связывающий домен, который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности T-клетки, причем первый связывающий домен связывается с тем же эпитопом МЗЛН (MSLN), что и антитело, выбранное из группы, состоящей из MS_1-MS_8, т.е., антитело, содержащее участок VH, который содержит CDRH1, CDR-H2 и CDR-H3, и участок VL, который содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, выбранные из группы, состоящей из:A preferred antibody construct of the invention can also be defined as a bispecific antibody construct comprising a first (preferably human) binding domain that binds to a human MSLN on the target cell surface and a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of the T cell, wherein the first binding domain binds to the same MSLN epitope (MSLN) as an antibody selected from the group consisting of MS_1-MS_8, i.e., an antibody containing a VH region that contains CDRH1, CDR -H2 and CDR-H3, and a VL region which contains CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 selected from the group consisting of:

a) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 151, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 152, CDR-a) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 151, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 152, CDR-

- 12 042291- 12 042291

H3, представленного в SEQ ID NO: 153, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 154, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 155 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 156;H3, shown in SEQ ID NO: 153, CDR-L1, shown in SEQ ID NO: 154, CDR-L2, shown in SEQ ID NO: 155 and CDR-L3, shown in SEQ ID NO: 156;

b) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 161, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 162, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 163, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 164, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 165 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 166;b) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 161, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 162, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 163, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 164, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 165 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 166;

c) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 171, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 172, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 173, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 174, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 175 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 176;c) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 171, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 172, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 173, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 174, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 175 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 176;

d) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 181, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 182, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 183, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 184, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 185 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 186;d) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 181, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 182, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 183, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 184, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 185 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 186;

e) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 191, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 192, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 193, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 194, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 195 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 196;e) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 191, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 192, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 193, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 194, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 195 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 196;

f) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 201, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 202, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 203, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 204, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 205 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 206;f) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 201, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 202, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 203, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 204, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 205 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 206;

g) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 211, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 212, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 213, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 214, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 215 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 216; а такжеg) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 211, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 212, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 213, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 214, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 215 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 216; and

h) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 221, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 222, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 223, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 224, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 225 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 226.h) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 221, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 222, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 223, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 224, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 225; and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 226.

Связывается ли конструкция антитела с тем же эпитопом МЗЛН (MSLN), что и другая заданная конструкция антитела, можно определить, например, путем картирования эпитопа с химерными или укороченными молекулами-мишенями, например, как описано в данном документе выше и в прилагаемых примерах 1 и 2.Whether an antibody construct binds to the same MSLN (MSLN) epitope as another given antibody construct can be determined, for example, by epitope mapping with chimeric or truncated target molecules, for example, as described herein above and in the accompanying examples 1 and 2.

Предпочтительная конструкция антитела согласно изобретению также может быть определена как конструкция биспецифического антитела, содержащая первый (предпочтительно человеческий) связывающий домен, который связывается с МЗЛН (MSLN) человека на поверхности клетки-мишени, и второй связывающий домен, который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности T-клетки, причем первый связывающий домен конкурирует за связывание с антителом, выбранным из группы, состоящей из MS_1-MS_8, т.е., антителом, содержащим участок VH, который содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDRH3, и участок VL, который содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, выбранные из группы, состоящей из описанных выше.A preferred antibody construct of the invention can also be defined as a bispecific antibody construct comprising a first (preferably human) binding domain that binds to a human MSLN on the target cell surface and a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of the T cell, wherein the first binding domain competes for binding with an antibody selected from the group consisting of MS_1-MS_8, i.e., an antibody containing a VH region that contains CDR-H1, CDR-H2 and CDRH3, and a VL region that contains CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 selected from the group consisting of those described above.

Конкурирует ли конструкция антитела за связывание с другой заданной конструкцией антитела, можно определить в конкурентном анализе, таком как конкурентный ТИФА (ELISA) или конкурентный анализ на основе клеток. Кроме того, можно применять связанные с авидином микрочастицы (шарики). Подобно покрытому авидином планшету ТИФА (ELISA) при взаимодействии с биотинилированным белком каждый из этих шариков может быть применен в качестве субстрата, на котором может быть проведен анализ. Антиген наносится на шарик, который затем предварительно покрывают первым антителом. Добавляют второе антитело и определяют любое дополнительное связывание. Возможные средства для считывания включают проточную цитометрию.Whether an antibody construct competes for binding with another given antibody construct can be determined in a competitive assay, such as a competitive ELISA or cell-based competitive assay. In addition, avidin-bound microparticles (beads) can be used. Like an avidin-coated ELISA plate, when interacting with a biotinylated protein, each of these beads can be used as a substrate on which the assay can be performed. The antigen is applied to the bead, which is then pre-coated with the first antibody. A second antibody is added and any additional binding determined. Possible means for reading include flow cytometry.

В одном варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит участок VH, выбранный из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217 и SEQ ID NO: 227.In one embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises a VH region selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217 and SEQ ID NO: 227.

В дополнительном варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит участок VL, выбранный из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218 и SEQ ID NO: 228.In a further embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises a VL region selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218 and SEQ ID NO: 228.

В другом варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит участок VH и участок VL, выбранные из группы, состоящей из пар участков VH и участков VL, представленных в SEQ ID NO: 157 плюс 158, SEQ ID NO: ID NO: 167 плюс 168, SEQ ID NO: 177 плюс 178, SEQ ID NO: 187 плюс 188, SEQ ID NO: 197 плюс 198, SEQ ID NO: 207 плюс 208, SEQ ID NO: 217 плюс 218 и SEQ ID NO: 227 плюс 228.In another embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises a VH region and a VL region selected from the group consisting of pairs of VH regions and VL regions shown in SEQ ID NO: 157 plus 158, SEQ ID NO: ID NO: 167 plus 168, SEQ ID NO: 177 plus 178, SEQ ID NO: 187 plus 188, SEQ ID NO: 197 plus 198, SEQ ID NO: 207 plus 208, SEQ ID NO: 217 plus 218 and SEQ ID NO: 227 plus 228 .

В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 229.In yet another further embodiment of the invention, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises a polypeptide selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 and SEQ ID NO: 229.

Вышеуказанные первые связывающие домены (обозначенные по их CDR, участку VH и участку VL и их комбинациям) характеризуются как связывающие домены, которые связываются с эпитопом МЗЛНThe above first binding domains (denoted by their CDR, VH region and VL region and combinations thereof) are characterized as binding domains that bind to an MDLP epitope.

- 13 042291 (MSLN), представленным в SEQ ID NO: 231, 232 и 233.- 13 042291 (MSLN), shown in SEQ ID NOS: 231, 232 and 233.

Как используется в данном изобретении, термин биспецифический относится к конструкции антитела, которая является по меньшей мере биспецифической, т.е., она содержит, по меньшей мере, первый связывающий домен и второй связывающий домен, причем первый связывающий домен связывается с одним антигеном или мишенью (в данном изобретении: МЗЛН (MSLN)), а второй связывающий домен связывается с другим антигеном или мишенью (в данном изобретении: КД3 (CD3)). Соответственно конструкции антител в соответствии с изобретением обладают специфичностью по меньшей мере в отношении двух разных антигенов или мишеней. Кроме того, термин конструкция биспецифического антитела по изобретению включает конструкции полиспецифических антител, такие как конструкции триспецифических антител, притом, что последние содержат три связывающих домена, или конструкции, обладающие более чем тремя (например, четырьмя, пятью...) видами специфичности.As used herein, the term bispecific refers to an antibody construct that is at least bispecific, i.e., it contains at least a first binding domain and a second binding domain, where the first binding domain binds to one antigen or target. (in this invention: MSLN (MSLN)), and the second binding domain binds to another antigen or target (in this invention: CD3 (CD3)). Accordingly, the antibody constructs of the invention have specificity for at least two different antigens or targets. In addition, the term bispecific antibody construct of the invention includes polyspecific antibody constructs, such as trispecific antibody constructs, the latter having three binding domains, or constructs having more than three (e.g., four, five...) specificities.

Учитывая, что конструкции антител в соответствии с изобретением являются (по меньшей мере) биспецифическими, они не встречаются в природе, и они заметно отличаются от естественных продуктов. Таким образом, биспецифическая конструкция антитела или иммуноглобулина является искусственным гибридным антителом или иммуноглобулином, содержащим по меньшей мере два различных сайта связывания с разной специфичностью. Биспецифические конструкции антител могут быть получены различными способами, включая слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов (См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)).Given that the antibody constructs according to the invention are (at least) bispecific, they do not occur in nature and they differ markedly from natural products. Thus, a bispecific antibody or immunoglobulin construct is an artificial fusion antibody or immunoglobulin containing at least two different binding sites with different specificities. Bispecific antibody constructs can be generated by a variety of methods, including hybridoma fusion or Fab' binding (See, for example, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)).

По меньшей мере два связывающих домена и вариабельных домена конструкции антитела по данному изобретению могут содержать или не содержать пептидных линкеров (спейсерные пептиды). Термин пептидный линкер в соответствии с данным изобретением включает в себя аминокислотную последовательность, посредством которой аминокислотные последовательности одного (вариабельного и/или связывающего) домена и другого (вариабельного и/или связывающего) домена в конструкции антитела по изобретению связаны друг с другом. Существенным техническим признаком такого пептидного линкера является то, что он не обладает полимеризационной активностью. В числе подходящих пептидных линкеров находятся те, которые описаны в патентах США 4751180 и 4935233 или WO 88/09344. Кроме того, пептидные линкеры могут быть применены для присоединения других доменов или модулей или участков (например, доменов, удлиняющих период полувыведения) к конструкции антитела по изобретению.The at least two binding domains and variable domains of an antibody construct of the invention may or may not contain peptidic linkers (spacer peptides). The term peptide linker according to the invention includes an amino acid sequence by which the amino acid sequences of one (variable and/or binding) domain and another (variable and/or binding) domain in an antibody construct of the invention are linked to each other. An essential technical feature of such a peptide linker is that it does not have polymerization activity. Suitable peptide linkers include those described in US Pat. Nos. 4,751,180 and 4,935,233 or WO 88/09344. In addition, peptide linkers can be used to attach other domains or modules or regions (eg, half-life-prolonging domains) to an antibody construct of the invention.

В том случае, если используется линкер, длина и последовательность этого линкера предпочтительно являются достаточными, чтобы гарантировать, что каждый из первого и второго доменов сможет независимо друг от друга сохранять свою отличающуюся специфичность связывания. Для пептидных линкеров, которые соединяют по меньшей мере два связывающих домена (или два вариабельных домена) в конструкции антитела по изобретению, предпочтительными являются указанные пептидные линкеры, которые содержат только несколько аминокислотных остатков, например, 12 аминокислотных остатков или менее. Таким образом, предпочтительными являются пептидные линкеры из 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислотных остатков. Предполагаемый пептидный линкер с менее чем 5 аминокислотами содержит 4, 3, 2 или одну аминокислоту, причем богатые Gly линкеры являются предпочтительными. Особенно предпочтительной единственной аминокислотой в контексте указанного пептидного линкера является Gly. Соответственно указанный пептидный линкер может состоять из одной аминокислоты Gly. Другой предпочтительный вариант пептидного линкера характеризуется аминокислотной последовательностью Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, т.е., Gly4Ser (SEQ ID NO: 1), или их полимерами, т.е., (Gly4Ser)x, где x представляет собой целое число 1 или больше (например, 2 или 3). Предпочтительные линкеры представлены в SEQ ID NO: 1-9. Характеристики указанного пептидного линкера, которые включают в себя отсутствие содействия образованию вторичных структур, известны в данной области техники и описаны, например, в Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) и Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Предпочтительными являются пептидные линкеры, которые, кроме того, не способствуют образованию каких-либо вторичных структур. Связывание указанных доменов друг с другом может быть обеспечено, например, при помощи генной инженерии, как описано в примерах. Способы получения слитых и функционально связанных биспецифических одноцепочечные конструкции и экспрессия их в клетках млекопитающих или бактерий хорошо известны в данной области техники (например, WO 99/54440 или Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).In the event that a linker is used, the length and sequence of the linker is preferably sufficient to ensure that each of the first and second domains can independently maintain their different binding specificity. For peptide linkers that connect at least two binding domains (or two variable domains) in an antibody construct of the invention, those peptide linkers that contain only a few amino acid residues, such as 12 amino acid residues or less, are preferred. Thus, peptide linkers of 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 or 5 amino acid residues are preferred. A putative peptide linker with less than 5 amino acids contains 4, 3, 2, or one amino acid, with Gly-rich linkers being preferred. A particularly preferred single amino acid in the context of said peptide linker is Gly. Accordingly, said peptide linker may consist of a single Gly amino acid. Another preferred peptide linker is characterized by the amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, i.e., Gly 4 Ser (SEQ ID NO: 1), or their polymers, i.e., (Gly 4 Ser) x . where x is an integer 1 or greater (eg 2 or 3). Preferred linkers are shown in SEQ ID NOs: 1-9. The characteristics of said peptide linker, which include not promoting the formation of secondary structures, are known in the art and are described, for example, in Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) and Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Preferred are peptide linkers, which, moreover, do not contribute to the formation of any secondary structures. Linking these domains to each other can be achieved, for example, using genetic engineering, as described in the examples. Methods for making fused and operably linked bispecific single chain constructs and expressing them in mammalian or bacterial cells are well known in the art (e.g., WO 99/54440 or Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).

Как описано выше, в изобретении предложен предпочтительный вариант осуществления изобретения, в котором конструкция антитела находится в формате, выбранном из группы, состоящей из (scFv)2, scFv-однодоменного mAb, диател и олигомеров любого из указанных форматов.As described above, the invention provides a preferred embodiment of the invention wherein the antibody construct is in a format selected from the group consisting of (scFv) 2 , scFv single domain mAb, diabodies, and oligomers of any of these formats.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления изобретения и как описано в прилагаемых примерах, конструкция антитела по изобретению представляет собой биспецифическую одноцепочечную конструкцию антитела, более предпочтительно биспецифический одноцепочечный Fv (scFv). Хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно объединить с применением рекомбинантных методов, при помощи синтетического линкера, как описано выше, что позволяет превратить их в одну белковую цепь в которой пары участков VL и VH образуютAccording to a particularly preferred embodiment of the invention and as described in the accompanying examples, the antibody construct of the invention is a bispecific single chain antibody construct, more preferably a bispecific single chain Fv (scFv). Although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are encoded by separate genes, they can be recombinantly combined using a synthetic linker as described above, which allows them to be converted into a single protein chain in which the pairs of VL and VH regions form

- 14 042291 одновалентную молекулу (см., например, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Эти фрагменты антител получают с применением обычных методов, известных специалистам в данной области техники, и оценивают функцию фрагментов таким же образом, как в случае цельных или полноразмерных антител. Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) является, следовательно, слитым белком вариабельного участка тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL) иммуноглобулинов, обычно связанного коротким линкерным пептидом длиной от около 10 до около 25 аминокислот, предпочтительно приблизительно от 15 до 20 аминокислот. Линкер обычно богат глицином для обеспечения гибкости, а также серином или треонином для обеспечения растворимости и может соединять N-конец VH с Cконцом VL или наоборот. Этот белок сохраняет специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на удаление константных участков и введение линкера.- 14 042291 monovalent molecule (see, for example, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). These antibody fragments are prepared using conventional methods known to those skilled in the art and the function of the fragments is evaluated in the same manner as for whole or full length antibodies. A single chain variable fragment (scFv) is therefore a fusion protein between the heavy chain (VH) and light chain (VL) immunoglobulin variable region, typically linked by a short linker peptide of about 10 to about 25 amino acids in length, preferably about 15 to 20 amino acids in length. The linker is typically rich in glycine for flexibility and serine or threonine for solubility, and may connect the N-terminus of the VH to the C-terminus of the VL, or vice versa. This protein retains the specificity of the original immunoglobulin despite the removal of constant regions and the introduction of a linker.

Биспецифические одноцепочечные молекулы известны в данной области техники и описаны в WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Bruhl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Описаны технологии получения одноцепочечных антител (см., среди прочего, патент США 4946778, Kontermann and Dubel (2010), в приводившейся выше цитате, и Little (2009), в приводившейся выше цитате) могут быть адаптированы для получения конструкций одноцепочечных антител, специфически распознающих выбранную(ые) мишень(и).Bispecific single chain molecules are known in the art and are described in WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Bruhl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Technologies for producing single chain antibodies (see, inter alia, US Pat. selected target(s).

Бивалентные (также называемые двухвалентными) или биспецифические одноцепочечные вариабельные фрагменты (би-scFv или ди-scFv, имеющие формат (scFv)2, могут быть сконструированы путем связывания двух молекул scFv (например, при помощи линкеров, как описано в данном документе выше). Если эти две молекулы scFv обладают одинаковой специфичностью связывания, то полученная молекула (scFv)2 предпочтительно будет называться двухвалентной (т.е., в ней присутствуют две валентности для одного и того же целевого эпитопа). Если две молекулы scFv обладают разной специфичностью связывания, то полученная молекула (scFv)2 предпочтительно будет называться биспецифической. Связывание может быть осуществлено путем создания одной пептидной цепи с двумя участками VH и двумя участками VL, с получением тандемных scFv (см., например, Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5): 238-244). Другой возможностью является создание молекул scFv с линкерными пептидами, слишком короткими для свертывания двух вариабельных областей со сближением (например, около пяти аминокислот), что заставляет scFv димеризоваться. Этот тип известен как диатела (см., например, Hollinger, Philipp et al. (July 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8).Bivalent (also referred to as bivalent) or bispecific single chain variable fragments (bi-scFv or di-scFv having the (scFv) 2 format can be constructed by linking two scFv molecules (eg, using linkers as described herein above). If the two scFv molecules have the same binding specificity, then the resulting (scFv) 2 molecule will preferably be referred to as divalent (i.e., it has two valences for the same target epitope.) If the two scFv molecules have different binding specificities, then the resulting (scFv)2 molecule will preferably be referred to as bispecific Coupling can be done by creating a single peptide chain with two VH regions and two VL regions to form tandem scFvs (see e.g. Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5): 238-244) Another possibility is to design scFv molecules with linker peptides too short to fold two y variable regions with convergence (eg, about five amino acids), which causes the scFv to dimerize. This type is known as a diabody (see, for example, Hollinger, Philipp et al. (July 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8).

В соответствии с другим предпочтительным вариантом конструкции антитела по изобретению тяжелая цепь (VH) и легкая цепь (VL) связывающего домена, связывающаяся с целевым антигеном МЗЛН (MSLN) или КД3 (CD3), непосредственно не связаны посредством описанного выше пептидного линкера, как описано выше, а связывающий домен образуются в результате образования биспецифической молекулы, как описано для диатела. Таким образом, цепь VH связывающего домена против КД3 (CD3) может быть слита с VL связывающего домена против МЗЛН (MSLN) посредством пептидного линкера, тогда как цепь VH связывающего домена против МЗЛН (MSLN) слита с VL связывающего домена против КД3 (CD3) посредством такого пептидного линкера.According to another preferred design of an antibody of the invention, the heavy chain (VH) and light chain (VL) of the binding domain that binds to the target MSLN or CD3 antigen are not directly linked via the above described peptide linker as described above. , and the binding domain are formed as a result of the formation of a bispecific molecule, as described for the diabody. Thus, the VH chain of the anti-CD3 (CD3) binding domain can be fused to the VL of the anti-MDLN (MSLN) binding domain by a peptide linker, while the VH chain of the anti-MDLN (MSLN) binding domain is fused to the VL of the anti-CD3 (CD3) binding domain by such a peptide linker.

Однодоменные антитела содержат только один (мономерный) вариабельный домен антитела, который способен избирательно связываться с определенным антигеном независимо от других V участков или доменов. Первые однодоменные антитела были сконструированы из антител с тяжелой цепью, найденных у верблюдовых, и они называются VHH фрагментами. У хрящевых рыб также есть антитела тяжелой цепи (IgNAR), из которых могут быть получены однодоменные антитела, называемые фрагментами VNAR. Альтернативный подход заключается в расщеплении димерных вариабельных доменов из обычных иммуноглобулинов, например, из организма человека или грызунов, на мономеры с получением таким образом VH или VL в виде однодоменного Ab. Хотя в настоящее время большинство исследований в области однодоменных антител основаны на вариабельных доменах тяжелой цепи, было показано, что наночастицы, полученные из легких цепей, специфически связываются с целевыми эпитопами. Примеры однодоменных антител называются sdAb, наночастицами или антителами с одним вариабельным доменом.Single domain antibodies contain only one (monomeric) antibody variable domain that is capable of selectively binding to a particular antigen independently of other V regions or domains. The first single domain antibodies were constructed from heavy chain antibodies found in camelids and are called VHH fragments. Cartilaginous fish also have heavy chain antibodies (IgNARs) from which single-domain antibodies called V NAR fragments can be derived. An alternative approach is to cleave dimeric variable domains from conventional immunoglobulins, eg, from humans or rodents, into monomers, thereby producing VH or VL as a single domain Ab. Although most research in the field of single-domain antibodies is currently based on heavy chain variable domains, light chain-derived nanoparticles have been shown to specifically bind to target epitopes. Examples of single domain antibodies are called sdAbs, nanoparticles, or single variable domain antibodies.

Таким образом, (однодоменное mAb)2 представляет собой конструкцию моноклонального антитела, состоящую из (по меньшей мере) двух моноклональных однодоменных антител, которые индивидуально выбраны из группы, включающей VH, VL, VHH и VNAR. Линкер предпочтительно имеет форму пептидного линкера. Аналогично scFv-однодоменное mAb представляет собой конструкцию моноклонального антитела, состоящую из, по меньшей мере, одного однодоменного антитела, как описано выше, и одной молекулы scFv, как описано выше. Снова линкер предпочтительно имеет форму пептидного линкера.Thus, (single domain mAb) 2 is a monoclonal antibody construct consisting of (at least) two monoclonal single domain antibodies that are individually selected from the group consisting of VH, VL, VHH and V NAR . The linker is preferably in the form of a peptide linker. Similarly, a scFv single domain mAb is a monoclonal antibody construct consisting of at least one single domain antibody as described above and one scFv molecule as described above. Again, the linker is preferably in the form of a peptide linker.

Дополнительно предусмотрено, что данное изобретение относится к конструкции биспецифического антитела, содержащей первый связывающий домен, который связывается с МЗЛН (MSLN) человека на поверхности клетки-мишени, и второй связывающий домен, который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности T-клетки, причем первый связывающий домен связывается с эпитопом МЗЛНIt is further contemplated that the invention relates to a bispecific antibody construct comprising a first binding domain that binds to a human MSLN on the surface of a target cell and a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell, wherein the first binding domain binds to the MDLN epitope

- 15 042291 (MSLN), находящимся в пределах участка, представленного SEQ ID NO: 245 (кластер 2 плюс 3).- 15 042291 (MSLN), located within the area represented by SEQ ID NO: 245 (cluster 2 plus 3).

Соответственно в дополнительном аспекте изобретения первый связывающий домен конструкции биспецифического антитела содержит участок VH, который содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, и участок VL, который содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR- L3, выбранные из группы, состоящей из:Accordingly, in a further aspect of the invention, the first binding domain of the bispecific antibody construct comprises a VH region that contains CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3, and a VL region that contains CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 selected from the group , consisting of:

a) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 161, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 162, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 163, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 164, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 165 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 166;a) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 161, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 162, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 163, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 164, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 165 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 166;

b) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 171, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 172, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 173, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 174, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 175 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 176;b) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 171, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 172, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 173, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 174, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 175 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 176;

c) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 181, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 182, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 183, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 184, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 185 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 186;c) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 181, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 182, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 183, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 184, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 185 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 186;

d) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 191, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 192, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 193, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 194, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 195 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 196;d) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 191, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 192, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 193, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 194, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 195 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 196;

e) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 201, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 202, CDRH 3, представленного в SEQ ID NO: 203, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 204, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 205 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 206.e) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 201, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 202, CDRH 3 as shown in SEQ ID NO: 203, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 204, CDR -L2 shown in SEQ ID NO: 205; and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 206.

В одном варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит участок VH, выбранный из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197 и SEQ ID NO: 207.In one embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises a VH region selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, and SEQ ID NO: 207.

В следующем варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит область VL, выбранную из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198 и SEQ ID NO: 208.In a further embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises a VL region selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, and SEQ ID NO: 208.

В другом варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит область VH и область VL, выбранную из группы, состоящей из пар VHобласти и области VL, представленного в SEQ ID NO: 167 плюс 168, SEQ ID NO: ID NO: 177 плюс 178, SEQ ID NO: 187 плюс 188, SEQ ID NO: 197 плюс 198 и SEQ ID NO: 207 плюс 208.In another embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises a VH region and a VL region selected from the group consisting of pairs of VH region and VL region shown in SEQ ID NO: 167 plus 168, SEQ ID NO: ID NO: 177 plus 178, SEQ ID NO: 187 plus 188, SEQ ID NO: 197 plus 198, and SEQ ID NO: 207 plus 208.

В следующем варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 209.In a further embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises a polypeptide selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, and SEQ ID NO: :209.

Кроме того, данное изобретение относится к конструкции биспецифического антитела, содержащей первый связывающий домен, который связывается с МЗЛН (MSLN) человека на поверхности клеткимишени, и второй связывающий домен, который связывается с CD3 человека на поверхности T-клетки, причем первый связывающий домен связывается с эпитопом МЗЛН (MSLN), находящимся в пределах участка, представленного в SEQ ID NO: 244 (кластер 1 плюс 2).In addition, the present invention provides a bispecific antibody construct comprising a first binding domain that binds to human MSLNs on the surface of a target cell and a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell, the first binding domain binding to an MSLN epitope (MSLN) located within the region shown in SEQ ID NO: 244 (cluster 1 plus 2).

Соответственно, в следующем аспекте изобретения первый связывающий домен конструкции биспецифического антитела содержит участок VH, содержащий CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, и участок VL, содержащий CDR-L1, CDR-L2 и CDR- L3, следующим образом:Accordingly, in a further aspect of the invention, the first binding domain of the bispecific antibody construct comprises a VH region containing CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3, and a VL region containing CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, as follows:

(a) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 151, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 152, CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 153, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 154, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 155 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 156; или (b) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 221, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 222, CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 223, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 224, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 225 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 226.(a) CDR-H1 shown in SEQ ID NO: 151, CDR-H2 shown in SEQ ID NO: 152, CDR-H3 shown in SEQ ID NO: 153, CDR-L1 shown in SEQ ID NO: 154 , CDR-L2 shown in SEQ ID NO: 155 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 156; or (b) CDR-H1 shown in SEQ ID NO: 221, CDR-H2 shown in SEQ ID NO: 222, CDR-H3 shown in SEQ ID NO: 223, CDR-L1 shown in SEQ ID NO: 224, CDR-L2 shown in SEQ ID NO: 225 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 226.

В одном варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит участок VH, представленный в SEQ ID NO: 157 или SEQ ID NO: 227.In one embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises the VH region shown in SEQ ID NO: 157 or SEQ ID NO: 227.

В следующем варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит участок VL, представленный в SEQ ID NO: 158 и SEQ ID NO: 228.In a further embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises the VL region shown in SEQ ID NO: 158 and SEQ ID NO: 228.

В другом варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит участок VH и участок VL, выбранные из группы, состоящей из пар участка VH и участка VL, представленных в SEQ ID NO: 157 плюс 158, и SEQ ID NO: 227 плюс 228.In another embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises a VH region and a VL region selected from the group consisting of the VH region and VL region pairs shown in SEQ ID NO: 157 plus 158 and SEQ ID NO: 227 plus 228 .

В следующем варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 159 и SEQ ID NO: 229.In a further embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises a polypeptide selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 159 and SEQ ID NO: 229.

Кроме того, в данном изобретении предложена конструкция биспецифического антитела, содержащая первый связывающий домен, который связывается с МЗЛН (MSLN) человека на поверхности клетки-мишени, и второй связывающий домен, который связывается с CD3 человека на поверхности Tклетки, причем первый связывающий домен связывается с эпитопом МЗЛН (MSLN), находящимся в пределах участка, представленного в SEQ ID NO: 241 (кластер 4).In addition, the present invention provides a bispecific antibody construct comprising a first binding domain that binds to human MSLNs on the surface of a target cell and a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell, the first binding domain binding to an MSLN epitope (MSLN) located within the region shown in SEQ ID NO: 241 (cluster 4).

Соответственно в дополнительном аспекте изобретения первый связывающий домен конструкцииAccordingly, in a further aspect of the invention, the first binding domain of the construct

- 16 042291 биспецифического антитела содержит участок VH, содержащий CDR-H1, представленный в SEQ ID NO:- 16 042291 of the bispecific antibody contains a VH region containing the CDR-H1 shown in SEQ ID NO:

211, CDR-H2, представленный в SEQ ID NO: 212, CDR-H3, представленный в SEQ ID NO: 213, CDR-L1, представленный в SEQ ID NO: 214, CDR-L2, представленный в SEQ ID NO: 215 и CDR-L3, представленный в SEQ ID NO: 216.211, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 212, CDR-H3 as shown in SEQ ID NO: 213, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 214, CDR-L2 as shown in SEQ ID NO: 215, and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 216.

В одном варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит участок VH, представленный в SEQ ID NO: 217.In one embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises the VH region shown in SEQ ID NO: 217.

В следующем варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит участок VL, представленный в SEQ ID NO: 218.In a further embodiment of the invention, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises the VL region shown in SEQ ID NO: 218.

В другом варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит участок VH и участок VL, представленные в SEQ ID NO: 217 плюс 218.In another embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises a VH region and a VL region as shown in SEQ ID NO: 217 plus 218.

В следующем варианте осуществления изобретения первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению содержит полипептид, представленный в SEQ ID NO: 219.In a further embodiment, the first binding domain of an antibody construct of the invention comprises the polypeptide shown in SEQ ID NO: 219.

Кроме того, другая предпочтительная конструкция антитела в соответствии с изобретением может быть определена как конструкция биспецифического антитела, содержащая первый (предпочтительно человеческий) связывающий домен, который связывается с МЗЛН (MSLN) человека на поверхности клетки-мишени, и второй связывающий домен, который связывается с CD3 человека на поверхности Tклетки, причем первый связывающий участок конкурирует за связывание с антителом, выбранным из группы, состоящей из MS-3, MS-4 и MS-5, т.е., антителом, содержащим участок VH, содержащий CDRH1, CDR-H2 и CDR-H3, и участок VL, содержащий CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, выбранные из группы, состоящей из описанных выше.In addition, another preferred antibody construct according to the invention can be defined as a bispecific antibody construct comprising a first (preferably human) binding domain that binds to a human MSLN on the surface of a target cell and a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell, wherein the first binding site competes for binding with an antibody selected from the group consisting of MS-3, MS-4, and MS-5, i.e., an antibody containing a VH region containing CDRH1, CDR- H2 and CDR-H3, and a VL region containing CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 selected from the group consisting of those described above.

Т-клетки или T-лимфоциты представляют собой вид лимфоцитов (которые сами по себе являются видом белых кровяных клеток), который играет центральную роль в клеточно-опосредованном иммунитете. Существует несколько подмножеств T-клеток, каждое из которых выполняет собственную функцию. T-клетки можно отличить от других лимфоцитов, таких как B-клетки и ПК (NK)-клетки, по наличию T-клеточного рецептора, ТКР (TCR) на поверхности клетки. TKP (TCR) отвечает за распознавание антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости, ГКГ (MHC), и состоит из двух различных белковых цепей. В 95% T-клеток ТКР (TCR) состоит из альфа (α) и бета (β) цепей. При взаимодействии ТКР (TCR) с антигенным пептидом и ГКГ (MHC) (комплекс пептида/ГКГ (MHC)), Tлимфоцит активизируется посредством ряда биохимических событий, опосредуемых связанными ферментами, корецепторами, специализированными адаптивными молекулами и активируемыми или высвобождаемыми транскрипционными факторами.T cells or T lymphocytes are a type of lymphocyte (which is itself a type of white blood cell) that plays a central role in cell-mediated immunity. There are several subsets of T cells, each with its own function. T cells can be distinguished from other lymphocytes such as B cells and NK cells by the presence of a T cell receptor, TCR, on the cell surface. TKP (TCR) is responsible for the recognition of antigens associated with molecules of the major histocompatibility complex, MHC (MHC), and consists of two different protein chains. In 95% of T cells, TCR (TCR) consists of alpha (α) and beta (β) chains. When TCR interacts with antigenic peptide and MHC (peptide/MHC complex (MHC)), T lymphocyte is activated through a series of biochemical events mediated by associated enzymes, co-receptors, specialized adaptive molecules, and activated or released transcription factors.

Рецепторный комплекс КД3 (CD3) представляет собой белковый комплекс и состоит из четырех цепей. У млекопитающих комплекс содержит цепь (CD3)y (гамма), цепь (CD3)δ (дельта) и две цепи (CD3)ε (ипсилон). Эти цепи связываются с T-клеточным рецептором, ТКР (TCR) и так называемой ζ (дзета) цепью с образованием комплекса T-клеточного рецептора-КД3 (CD3) и генерируют сигнал активации в T-лимфоцитах. Цепи (CD3)y (гамма), (CD3)δ (дельта) и (CD3)ε (ипсилон) представляют собой белки клеточной поверхности, в высокой степени родственные суперсемейству иммуноглобулина, содержащему один внеклеточный домен иммуноглобулина.The CD3 receptor complex (CD3) is a protein complex and consists of four chains. In mammals, the complex contains a (CD3)y (gamma) chain, a (CD3)δ (delta) chain, and two (CD3)ε (upsilon) chains. These chains bind to the T cell receptor, TCR and the so-called ζ (zeta) chain to form a T cell receptor-CD3 (CD3) complex and generate an activation signal in T lymphocytes. The (CD3)y (gamma), (CD3)δ (delta) and (CD3)ε (upsilon) chains are cell surface proteins highly related to the immunoglobulin superfamily containing a single immunoglobulin extracellular domain.

Внутриклеточные хвосты молекул КД3 (CD3) содержат один консервативный мотив, известный как мотив активации иммунорецептора на основе тирозина или сокращенно МАИТ (ITAM), который необходим для способности ТКР (TCR) к проведению сигнала. Молекула CD3 ипсилон представляет собой полипептид, который у человека кодируется геном CD3E, находящемся на хромосоме 11. Наиболее предпочтительный эпитоп CD3 ипсилон содержится в пределах аминокислотных остатков 1-27 внеклеточного домена CD3 ипсилон человека.The intracellular tails of CD3 molecules contain one conserved motif, known as the tyrosine-based immunoreceptor activation motif, or ITAM for short, which is required for signal transduction capability of the TCR. The CD3 upsilon molecule is a polypeptide that in humans is encoded by the CD3E gene located on chromosome 11. The most preferred epitope of CD3 upsilon is found within amino acid residues 1-27 of the extracellular domain of human CD3 upsilon.

Переадресованный лизис клеток-мишеней посредством рекрутинга T-клеток при помощи конструкции полиспецифического, по меньшей мере биспецифического антитела включает в себя образование цитолитического синапса и доставку перфорина и гранзимов. Задействованные T-клетки способны к серийному лизису клеток-мишеней и на них не влияют механизмы ускользания от иммунного ответа, препятствующие процессированию и презентации пептидного антигена или клональной дифференцировке T-клеток (см., например, WO 2007/042261).Redirected lysis of target cells by recruiting T cells with a polyspecific, at least bispecific antibody construct, involves formation of a cytolytic synapse and delivery of perforin and granzymes. Engaged T cells are capable of serial lysis of target cells and are not affected by immune evasion mechanisms that interfere with peptide antigen processing and presentation or T cell clonal differentiation (see, for example, WO 2007/042261).

Цитотоксичность, опосредованная конструкциями биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3), может быть измерена различными способами (см. Пример 5). Эффекторными клетками могут быть, например, стимулированные обогащенные (человеческие) CD8-позитивные T-клетки или нестимулированные (человеческие) мононуклеарные клетки периферической крови, МКПК (PBMC). Если клетки-мишени получены от макака или экспрессируются или трансфектированы при помощи МЗЛН (MSLN) макака, то эффекторные клетки также должны быть получены от макака, например, линия T-клеток макака, например, 4119LnPx. Клетки-мишени должны экспрессировать (по меньшей мере, внеклеточный домен) МЗЛН (MSLN), например, МЗЛН (MSLN) человека или макака. Клетки-мишени могут быть клеточной линией (такой как ЯКХ (CHO)), которая стабильно или временно трансфектирована МЗЛН (MSLN), например, МЗЛН (MSLN) человека или макака. В качестве альтернативы, клеткимишени могут представлять собой линию клеток, естественным образом экспрессирующих МЗЛНCytotoxicity mediated by anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs can be measured in various ways (see Example 5). Effector cells can be, for example, stimulated enriched (human) CD8-positive T cells or unstimulated (human) peripheral blood mononuclear cells, PBMCs. If the target cells are derived from macaque or are expressed or transfected with macaque MSLN, then effector cells must also be derived from macaque, for example, a macaque T cell line, for example, 4119LnPx. Target cells must express (at least the extracellular domain) MSLNs (MSLNs), eg human or macaque MSLNs. The target cells can be a cell line (such as CHO) that is stably or transiently transfected with MSLNs, eg, human or macaque MSLNs. Alternatively, the target cells can be a cell line that naturally expresses MDLP.

- 17 042291 (MSLN), такую как клеточная линия человека OVCAR-8. Как правило, ожидается, что значения EC50 будут ниже для линий клеток-мишеней, экспрессирующих более высокие уровни МЗЛН (MSLN) на поверхности клетки. Соотношение эффекторов и клеток-мишеней (Э:М) обычно составляет около 10:1, но может также варьировать. Цитотоксическую активность конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) можно измерить в анализе высвобождения хрома-51 (время инкубации около 18 ч) или в анализе цитотоксичности на основе СКАФ (FACS) (время инкубации около 48 ч). Изменения времени инкубации в анализе (цитотоксическая реакция) также возможны. Другие методы измерения цитотоксичности хорошо известны специалисту в данной области техники и включают в себя колориметрические анализы для оценки метаболической активности клеток MTT или MTS, анализы на основе АТФ, включая биолюминесцентные анализы, анализ с сульфородамином B, СРВ (SRB), анализ с реагентом клеточной пролиферации WST-1 (анализ WST), клоногенный анализ и технологию электрического клетки с субстратом импеданса, ЭКСИ (ECIS).- 17 042291 (MSLN), such as the human cell line OVCAR-8. Generally, EC 50 values are expected to be lower for target cell lines expressing higher levels of MSLNs on the cell surface. The ratio of effectors to target cells (E:M) is usually around 10:1, but can also vary. The cytotoxic activity of anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs can be measured in a chromium-51 release assay (incubation time about 18 hours) or in a SCAF-based cytotoxicity assay (FACS) (incubation time about 48 hours). Changes in the incubation time in the assay (cytotoxic reaction) are also possible. Other methods for measuring cytotoxicity are well known to those skilled in the art and include colorimetric assays to assess the metabolic activity of MTT or MTS cells, ATP-based assays including bioluminescent assays, sulforhodamine B, CRP (SRB) assay, cell proliferation reagent assay WST-1 (WST assay), clonogenic assay and impedance substrate electrical cell technology, EXI (ECIS).

Цитотоксическую активность, опосредованную конструкциями биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) по данному изобретению, предпочтительно измеряют в анализе цитотоксичности на клеточной основе. Кроме того, ее можно измерить в анализе высвобождения хрома-51. Ее выражают как значение EC50, что соответствует концентрации, обеспечивающей 50% от максимально эффективной концентрации (концентрация конструкции антитела, которая индуцирует цитотоксический ответ с половинной интенсивностью между фоновым значением и максимумом). Предпочтительно значение EC50 для конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) составляет меньше или равно 5000 пМ или меньше или равно 4000 пМ, более предпочтительно меньше или равно 3000 пМ или меньше или равно 2000 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 1000 пМ или меньше или равно 500 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 400 пМ или меньше или равно 300 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 200 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 100 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 50 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 20 пМ или меньше или равно 10 пМ и наиболее предпочтительно меньше или равно 5 пМ.Cytotoxic activity mediated by the anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs of the present invention is preferably measured in a cell-based cytotoxicity assay. In addition, it can be measured in the analysis of the release of chromium-51. It is expressed as an EC 50 value, which corresponds to a concentration that provides 50% of the maximum effective concentration (the concentration of the antibody construct that induces a cytotoxic response with half the intensity between background and maximum). Preferably, the EC 50 value for the bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs is less than or equal to 5000 pM or less than or equal to 4000 pM, more preferably less than or equal to 3000 pM or less than or equal to 2000 pM, even more preferably less than or equal to is equal to 1000 pM or less than or equal to 500 pM, even more preferably less than or equal to 400 pM or less than or equal to 300 pM, even more preferably less than or equal to 200 pM, even more preferably less than or equal to 100 pM, even more preferably less than or equal to 50 pM, even more preferably less than or equal to 20 pM or less than or equal to 10 pM, and most preferably less than or equal to 5 pM.

Вышеуказанные значения EC50 могут быть измерены в разных анализах. Специалист в данной области техники будет понимать, что ожидается меньшее значение EC50, если стимулированные/обогащенные CD8+ T-клетки применяются в качестве эффекторных клеток, по сравнению с нестимулированными МКПК (PBMC). Кроме того, можно ожидать, что значение EC50 будет ниже, если клетки-мишени экспрессируют большее количество целевого антигена по сравнению с крысой с низким уровнем экспрессии мишени. Например, если стимулированные/обогащенные CD8+ T-клетки человека применяют в качестве эффекторных клеток (и трансфектированные МЗЛН (MSLN) клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка, ЯКХ (CHO) или МЗЛН (MSLN)-положительную клеточную линию человека OVCAR-8 применяют в качестве клеток-мишеней), то значение EC50 конструкции биспецифического антитела против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) предпочтительно составляет меньше или равно 1000 пМ, более предпочтительно меньше или равно 500 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 250 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 100 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 50 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 10 пМ и наиболее предпочтительно меньше или равно 5 пМ. Если МКПК (PBMC) человека применяют в качестве эффекторных клеток, то значение EC50 конструкции биспецифического антитела против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) предпочтительно составляет меньше или равно 5000 пМ или меньше или равно 4000 пМ (в частности, если клеткимишени представляют собой МЗЛН (MSLN)-положительную клеточную линию человека OVCAR-8), более предпочтительно меньше или равно 2000 пМ (в частности, если клетки-мишени представляют собой трансфектированные МЗЛН (MSLN) клетки, такие как клетки ЯКХ (CHO)), более предпочтительно меньше или равно 1000 пМ или меньше или равно 500 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 200 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 150 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 100 пМ и наиболее предпочтительно меньше или равно 50 пМ или ниже. Если линия T-клеток макака, такая как LnPx4119, применяется в качестве эффекторных клеток, а клетки, трансфектированные МЗЛН (MSLN) макака, такие как клетки ЯКХ (CHO), применяются в качестве линии клеток-мишеней, то значение EC50 конструкции биспецифического антитела против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) предпочтительно составляет меньше или равно 2000 пМ или меньше или равно 1500 пМ, более предпочтительно меньше или равно 1000 пМ или меньше или равно 500 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 300 пМ или меньше или равно 250 пМ, еще более предпочтительно меньше или равно 100 пМ и наиболее предпочтительно меньше или равно 50 пМ.The above EC 50 values can be measured in different assays. One skilled in the art will appreciate that a lower EC 50 is expected when stimulated/enriched CD8+ T cells are used as effector cells compared to unstimulated PBMCs. In addition, the EC 50 value can be expected to be lower if the target cells express more of the target antigen compared to a low target expression rat. For example, if stimulated/enriched human CD8+ T cells are used as effector cells (and transfected MSLN cells such as Chinese Hamster Ovary, CHO) or MSLN-positive human OVCAR-8 cell line is used as target cells), then the EC50 value of the bispecific antibody against MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) construct is preferably less than or equal to 1000 pM, more preferably less than or equal to 500 pM, even more preferably less than or equal to 250 pM, even more preferably less than or equal to 100 pM, even more preferably less than or equal to 50 pM, even more preferably less than or equal to 10 pM, and most preferably less than or equal to 5 pM. When human PBMCs are used as effector cells, the EC50 of the anti-MSLN x CD3 bispecific antibody construct is preferably less than or equal to 5000 pM or less than or equal to 4000 pM (particularly if the target cells are MSLN (MSLN)-positive human cell line OVCAR-8), more preferably less than or equal to 2000 pM (in particular, if the target cells are transfected MSLN (MSLN) cells, such as cells YCH (CHO)), more preferably less than or equal to 1000 pM or less than or equal to 500 pM, even more preferably less than or equal to 200 pM, even more preferably less than or equal to 150 pM, even more preferably less than or equal to 100 pM, and most preferably less than or equal to 50 pM or less. If a macaque T cell line, such as LnPx4119, is used as effector cells, and macaque MSLN transfected cells, such as CHO cells, are used as target cell lines, then the EC 50 value of the bispecific antibody construct against MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) is preferably less than or equal to 2000 pM or less than or equal to 1500 pM, more preferably less than or equal to 1000 pM or less than or equal to 500 pM, even more preferably less than or equal to 300 pM or less than or equal to 250 pM, even more preferably less than or equal to 100 pM, and most preferably less than or equal to 50 pM.

Предпочтительно конструкции биспецифического антитела против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) по данному изобретению не вызывают/не опосредуют лизис или по существу не вызывают/не опосредуют лизис МЗЛН (MSLN)-отрицательных клеток, таких как клетки ЯКХ (CHO). Термин не вызывать лизиса, по существу не вызывать лизиса, не опосредовать лизис или по существу не опосредовать лизис означает, что конструкция антитела по данному изобретению не вызывает или не опосредует лизис более чем 30%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, особенно предпочтительно не более чем 9, 8, 7, 6 или 5% МЗЛН (MSLN)-отрицательных клеток, причем лизисPreferably, the anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs of the present invention do not induce/mediate lysis or substantially do not induce/mediate lysis of MSLN-negative cells such as CHO cells. The term do not cause lysis, substantially do not cause lysis, do not mediate lysis, or substantially do not mediate lysis means that the antibody construct of this invention does not cause or mediate lysis of more than 30%, preferably not more than 20%, more preferably not more than than 10%, particularly preferably not more than 9%, 8%, 7%, 6% or 5% MSLN-negative cells, with lysis

- 18 042291- 18 042291

МЗЛН (MSLN)-положительной клеточной линии человека OVCAR-8 (см. выше) принимается за 100%.MSLN (MSLN)-positive human cell line OVCAR-8 (see above) is taken as 100%.

Это обычно применимо к концентрациям конструкции антитела до 500 нМ. Специалисту в данной области техники известно, как измерить лизис клеток без ненужного экспериментирования. Кроме того, в данном документе приведены конкретные инструкции по измерению лизиса клеток.This is generally applicable to antibody construct concentrations up to 500 nM. One skilled in the art will know how to measure cell lysis without undue experimentation. In addition, this document provides specific instructions for measuring cell lysis.

Различие в цитотоксической активности между мономерной и димерной изоформами отдельных конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) называется зазором активности. Такой зазор активности может быть, например, вычислен как соотношение между значениями EC50 мономерной и димерной форм молекул (см. Пример 5.8). Зазоры активности конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) по данному изобретению предпочтительно составляют меньше или равно 5, более предпочтительно меньше или равно 4, еще более предпочтительно меньше или равно 3, еще более предпочтительно меньше или равно 2, далее предпочтительно меньше или равно 1 и наиболее предпочтительно меньше или равно 0,3.The difference in cytotoxic activity between the monomeric and dimeric isoforms of individual anti-MDLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs is referred to as the activity gap. Such an activity gap can be, for example, calculated as the ratio between the EC 50 values of the monomeric and dimeric forms of the molecules (see Example 5.8). The activity gaps of the MSLN x CD3 bispecific antibody constructs of this invention are preferably less than or equal to 5, more preferably less than or equal to 4, even more preferably less than or equal to 3, even more preferably less than or equal to 2, further preferably less than or equal to 1 and most preferably less than or equal to 0.3.

Первый и/или второй (или любой другой) связывающий(е) домен(ы) конструкции антитела по изобретению предпочтительно обладает(ют) перекрестно-видовой специфичностью в отношении членов порядка приматов млекопитающих. Обладающие перекрестно-видовой специфичностью КД3 (CD3)связывающие домены, например, описаны в WO 2008/119567. Согласно одному варианту осуществления изобретения первый и/или второй связывающий домен в дополнение к связыванию с МЗЛН (MSLN) человека и КД3 (CD3) человека, соответственно, будет также связываться с МЗЛН (MSLN)/КД3 (CD3) приматов, включая (но не ограничиваясь этим) приматов Нового Света (таких как Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus или Saimiri sciureus), приматов Старого Света (таких как бабуины и макаки), гиббонов, орангутангов и представителей семейства гоминид, не относящихся к человеку. Предполагается, что первый связывающий домен конструкции антитела по изобретению, который связывается с МЗЛН (MSLN) человека на поверхности клетки-мишени, также связывается по меньшей мере с МЗЛН (MSLN) макака, и/или второй связывающий домен, который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности Tклетки, также связывает по меньшей мере с КД3 (CD3) макака. Предпочтительным макаком является Macaca fascicularis. Кроме того, включен Macaca mulatta (резус).The first and/or second (or any other) binding domain(s) of an antibody construct of the invention preferably has cross-species specificity for members of the mammalian primate order. Cross-species specific CD3 (CD3) binding domains are, for example, described in WO 2008/119567. In one embodiment, the first and/or second binding domain, in addition to binding to human MSLN and human CD3, respectively, will also bind to primate MSLN/CD3, including (but not limited to) New World primates (such as Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus, or Saimiri sciureus), Old World primates (such as baboons and macaques), gibbons, orangutans, and non-human hominids. It is contemplated that a first binding domain of an antibody construct of the invention that binds to a human MSLN on the surface of a target cell also binds to at least a macaque MSLN and/or a second binding domain that binds to CD3 ) human on the T cell surface also binds to at least macaque CD3. The preferred macaque is Macaca fascicularis. In addition, Macaca mulatta (rhesus) is included.

В одном аспекте изобретения первый связывающий домен связывается с МЗЛН (MSLN) человека и дополнительно связывается с МЗЛН (MSLN) макака, таким как МЗЛН (MSLN) Macaca fascicularis и более предпочтительно, с МЗЛН (MSLN), экспрессирующимся на поверхности клеток макака. Предпочтительный МЗЛН (MSLN) Macaca fascicularis представлен в SEQ ID NO: 234. Аффинность первого связывающего домена в отношении МЗЛН (MSLN) макака предпочтительно составляет меньше или равно 15 нМ, более предпочтительно меньше или равно 10 нМ, еще более предпочтительно меньше или равно 5 нМ, еще более предпочтительно меньше или равно 1 нМ, еще более предпочтительно меньше или равно 0,5 нМ, еще более предпочтительно меньше или равно 0,1 нМ и наиболее предпочтительно меньше или равно 0,05 нМ или даже меньше или равно 0,01 нМ.In one aspect of the invention, the first binding domain binds to a human MSLN and further binds to a macaque MSLN such as Macaca fascicularis MSLN and more preferably an MSLN expressed on the surface of macaque cells. A preferred Macaca fascicularis MSLN is shown in SEQ ID NO: 234. The affinity of the first binding domain for the macaque MSLN is preferably less than or equal to 15 nM, more preferably less than or equal to 10 nM, even more preferably less than or equal to 5 nM , even more preferably less than or equal to 1 nM, even more preferably less than or equal to 0.5 nM, even more preferably less than or equal to 0.1 nM, and most preferably less than or equal to 0.05 nM, or even less than or equal to 0.01 nM .

Предпочтительно зазор аффинности для конструкций антител в соответствии с изобретением для связывания МЗЛН (MSLN) макака и МЗЛН (MSLN) [ma МЗЛН (MSLN):hu МЗЛН (MSLN)] (по данным, например, анализа BiaCore или Scatchard) составляет менее чем 100, предпочтительно менее чем 20, более предпочтительно менее чем 15, далее предпочтительно менее чем 10, даже более предпочтительно менее чем 8, более предпочтительно менее чем 6 и наиболее предпочтительно менее чем 2. Предпочтительные диапазоны зазора аффинности конструкций антител в соответствии с данным изобретением для связывания с МЗЛН (MSLN) макака против МЗЛН (MSLN) человека составляют от 0,1 до 20, более предпочтительно от 0,2 до 10, еще более предпочтительно от 0,3 до 6, еще более предпочтительно от 0,5 до 3 или от 0,5 до 2,5 и наиболее предпочтительно от 0,5 до 2 или от 0,6 до 2 (см. Пример 3).Preferably, the affinity gap for antibody constructs according to the invention for binding macaque MSLN and MSLN [ma MSLN:hu MSLN (MSLN)] (according to, for example, BiaCore or Scatchard assay) is less than 100 , preferably less than 20, more preferably less than 15, further preferably less than 10, even more preferably less than 8, more preferably less than 6, and most preferably less than 2. Preferred affinity gap ranges for antibody constructs according to the invention for binding with MSLN (MSLN) macaque against MSLN (MSLN) human are from 0.1 to 20, more preferably from 0.2 to 10, even more preferably from 0.3 to 6, even more preferably from 0.5 to 3 or from 0.5 to 2.5 and most preferably 0.5 to 2 or 0.6 to 2 (see Example 3).

Таким образом, предпочтительная конструкция антитела в соответствии с данным изобретением содержит агент связывания с МЗЛН (MSLN) для эпитопного кластера 2 плюс 3, аффинный зазор для которого, как было показано, составляет меньше или равно 15. Кроме того, предпочтительной является конструкция антитела, содержащая агент связывания с МЗЛН (MSLN) для эпитопного кластера 2 плюс 3 с аффинным зазором меньше или равно 6, такой как конструкции биспецифических антител на основе MS-3, MS-4 или MS-5.Thus, a preferred antibody construct according to the invention contains an MSLN binding agent (MSLN) for the 2 plus 3 epitope cluster, which has been shown to have an affinity gap of less than or equal to 15. Further preferred is an antibody construct containing an MSLN binding agent (MSLN) for a 2 plus 3 epitope cluster with an affinity gap less than or equal to 6, such as MS-3, MS-4 or MS-5 based bispecific antibody constructs.

В одном варианте конструкции антитела по изобретению второй связывающий домен связывается с CD3 ипсилон человека и с CD3 ипсилон Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus или Saimiri sciureus. Предпочтительно, второй связывающий домен связывается с внеклеточным эпитопом этих цепей CD3 ипсилон. Также предполагается, что второй связывающий домен связывается с внеклеточным эпитопом цепи CD3 ипсилон человека и Macaca. Наиболее предпочтительный эпитоп CD3 ипсилон содержится в пределах аминокислотных остатков 1-27 внеклеточного домена CD3 ипсилон человека. Даже более конкретно эпитоп содержит, по меньшей мере, аминокислотную последовательность Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Callithrix jacchus и Saguinus oedipus оба являются приматами Нового Света, принадлежащими к семейству Callitrichidae, тогда как Saimiri sciureus является приматом Нового Света, принадлежащим к семейству Cebidae.In one embodiment of an antibody of the invention, the second binding domain binds to human CD3 upsilon and to Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus, or Saimiri sciureus upsilon CD3. Preferably, the second binding domain binds to the extracellular epitope of these CD3 upsilon chains. It is also expected that the second binding domain binds to the extracellular epitope of the human and Macaca upsilon CD3 chain. The most preferred epitope of CD3 upsilon is found within amino acid residues 1-27 of the extracellular domain of human CD3 upsilon. Even more specifically, the epitope contains at least the amino acid sequence Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Callithrix jacchus and Saguinus oedipus are both New World primates belonging to the family Callitrichidae while Saimiri sciureus is a New World primate belonging to the family Cebidae.

Особенно предпочтительно в конструкции антитела по данному изобретению второй связывающий домен, который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности T-клетки, содержит участок VL, ко- 19 042291 торый содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, выбранные из:Particularly preferably, in the antibody construct of the invention, the second binding domain that binds to human CD3 on the surface of the T cell contains a VL region that contains CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 selected from :

(a) CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 27 WO 2008/119567, CDR-L2, представленного в SEQ(a) CDR-L1 shown in SEQ ID NO: 27 of WO 2008/119567, CDR-L2 shown in SEQ

ID NO: 28 WO 2008/119567 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 29 WO 2008/119567;ID NO: 28 WO 2008/119567 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 29 WO 2008/119567;

(b) CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 117 WO 2008/119567, CDR-L2, представленного в SEQ(b) CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 117 of WO 2008/119567, CDR-L2 as shown in SEQ

ID NO: 118 WO 2008/119567 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 119 WO 2008/119567; и (c) CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 153 WO 2008/119567, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 154 WO 2008/119567 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 155 WO 2008/119567.ID NO: 118 WO 2008/119567 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 119 WO 2008/119567; and (c) CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 153 WO 2008/119567, CDR-L2 as shown in SEQ ID NO: 154 WO 2008/119567 and CDR-L3 as shown in SEQ ID NO: 155 WO 2008/ 119567.

В альтернативном предпочтительном варианте конструкции антитела по данному изобретению второй связывающий домен, который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности T-клетки, содержит участок VH, который содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, выбранные из:In an alternative preferred embodiment of an antibody of the invention, the second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell contains a VH region that contains CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 selected from:

(a) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 12 WO 2008/119567, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 13 WO 2008/119567 и CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 14 WO 2008/119567;(a) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 12 of WO 2008/119567, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 13 of WO 2008/119567 and CDR-H3 as shown in SEQ ID NO: 14 of WO 2008/119567 ;

(b) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 30 WO 2008/119567, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 31 WO 2008/119567 и CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 32 WO 2008/119567;(b) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 30 of WO 2008/119567, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 31 of WO 2008/119567 and CDR-H3 as shown in SEQ ID NO: 32 of WO 2008/119567 ;

(c) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 48 WO 2008/119567, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 49 WO 2008/119567 и CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 50 WO 2008/119567;(c) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 48 of WO 2008/119567, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 49 of WO 2008/119567 and CDR-H3 as shown in SEQ ID NO: 50 of WO 2008/119567 ;

(d) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 66 WO 2008/119567, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 67 WO 2008/119567 и CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 68 WO 2008/119567;(d) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 66 of WO 2008/119567, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 67 of WO 2008/119567 and CDR-H3 as shown in SEQ ID NO: 68 of WO 2008/119567 ;

(e) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 84 WO 2008/119567, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 85 WO 2008/119567 и CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 86 WO 2008/119567;(e) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 84 of WO 2008/119567, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 85 of WO 2008/119567 and CDR-H3 as shown in SEQ ID NO: 86 of WO 2008/119567 ;

(f) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 102 WO 2008/119567, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 103 WO 2008/119567 и CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 104 WO 2008/119567;(f) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 102 WO 2008/119567, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 103 WO 2008/119567 and CDR-H3 as shown in SEQ ID NO: 104 WO 2008/119567 ;

(g) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 120 WO 2008/119567, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 121 WO 2008/119567 и CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 122 WO 2008/119567;(g) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 120 WO 2008/119567, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 121 WO 2008/119567 and CDR-H3 as shown in SEQ ID NO: 122 WO 2008/119567 ;

(h) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 138 WO 2008/119567, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 139 WO 2008/119567 и CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 140 WO 2008/119567;(h) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 138 WO 2008/119567, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 139 WO 2008/119567 and CDR-H3 as shown in SEQ ID NO: 140 WO 2008/119567 ;

(i) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 156 WO 2008/119567, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 157 WO 2008/119567 и CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 158 WO 2008/119567; и (j) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 174 WO 2008/119567, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 175 WO 2008/119567 и CDR-H3, представленного в SEQ ID NO: 176 WO 2008/119567.(i) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 156 of WO 2008/119567, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 157 of WO 2008/119567 and CDR-H3 as shown in SEQ ID NO: 158 of WO 2008/119567 ; and (j) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 174 WO 2008/119567, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 175 WO 2008/119567 and CDR-H3 as shown in SEQ ID NO: 176 WO 2008/ 119567.

Кроме того в конструкциях антитела по данному изобретению второй связывающий домен, который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности T-клетки, предпочтительно содержит участок VL, выбранный из группы, состоящей из участка VL, представленного в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 и SEQ ID NO: 102 (см. также SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 или 165 WO 2008/119567).In addition, in the antibody constructs of this invention, the second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell preferably contains a VL region selected from the group consisting of the VL region shown in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO: 102 (see also SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 or 165 of WO 2008/119567).

В качестве альтернативы, второй связывающий домен, который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности T-клетки, предпочтительно содержит участок VH, выбранный из группы, состоящей из участка VH, представленного в SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 101 (см. также SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 или 181 WO 2008/119567.Alternatively, the second binding domain that binds to human CD3 on the surface of the T cell preferably contains a VH region selected from the group consisting of the VH region shown in SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 and SEQ ID NO: 101 (see also SEQ ID NOs: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 or 181 WO 2008/119567.

Более предпочтительно конструкция антитела по данному изобретению характеризуется вторым связывающим доменом, который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности T-клетки, содержащим участок VL и участок VH, выбранные из группы, состоящей из:More preferably, the antibody construct of the invention is characterized by a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell, comprising a VL region and a VH region selected from the group consisting of:

(a) участка VL, представленного в SEQ ID NO: 17 или 21 WO 2008/119567, и участка VH, представленного в SEQ ID NO: 15 или 19 WO 2008/119567;(a) the VL region shown in SEQ ID NO: 17 or 21 of WO 2008/119567 and the VH region shown in SEQ ID NO: 15 or 19 of WO 2008/119567;

(b) участка VL, представленного в SEQ ID NO: 35 или 39 WO 2008/119567, и участка VH, представленного в SEQ ID NO: 33 или 37 WO 2008/119567;(b) the VL section shown in SEQ ID NO: 35 or 39 of WO 2008/119567 and the VH section shown in SEQ ID NO: 33 or 37 of WO 2008/119567;

(c) участка VL, представленного в SEQ ID NO: 53 или 57 WO 2008/119567, и участка VH, представленного в SEQ ID NO: 51 или 55 WO 2008/119567;(c) the VL section shown in SEQ ID NO: 53 or 57 of WO 2008/119567 and the VH section shown in SEQ ID NO: 51 or 55 of WO 2008/119567;

(d) участка VL, представленного в SEQ ID NO: 71 или 75 WO 2008/119567, и участка VH, представленного в SEQ ID NO: 69 или 73 WO 2008/119567;(d) the VL section shown in SEQ ID NO: 71 or 75 of WO 2008/119567 and the VH section shown in SEQ ID NO: 69 or 73 of WO 2008/119567;

(e) участка VL, представленного в SEQ ID NO: 89 или 93 WO 2008/119567, и участка VH, представленного в SEQ ID NO: 87 или 91 WO 2008/119567;(e) the VL section shown in SEQ ID NO: 89 or 93 of WO 2008/119567 and the VH section shown in SEQ ID NO: 87 or 91 of WO 2008/119567;

(f) участка VL, представленного в SEQ ID NO: 107 или 111 WO 2008/119567, и участка VH, представленного в SEQ ID NO: 105 или 109 WO 2008/119567;(f) the VL region shown in SEQ ID NO: 107 or 111 of WO 2008/119567 and the VH region shown in SEQ ID NO: 105 or 109 of WO 2008/119567;

(g) участка VL, представленного в SEQ ID NO: 125 или 129 WO 2008/119567, и участка VH, представленного в SEQ ID NO: 123 или 127 WO 2008/119567;(g) the VL region shown in SEQ ID NO: 125 or 129 of WO 2008/119567 and the VH region shown in SEQ ID NO: 123 or 127 of WO 2008/119567;

(h) участка VL, представленного в SEQ ID NO: 143 или 147 WO 2008/119567, и участка VH, представленного в SEQ ID NO: 141 или 145 WO 2008/119567;(h) the VL section shown in SEQ ID NO: 143 or 147 of WO 2008/119567 and the VH section shown in SEQ ID NO: 141 or 145 of WO 2008/119567;

(i) участка VL, представленного в SEQ ID NO: 161 или 165 WO 2008/119567, и участка VH, пред-(i) the VL region shown in SEQ ID NO: 161 or 165 of WO 2008/119567 and the VH region

- 20 042291 ставленного в SEQ ID NO: 159 или 163 WO 2008/119567; и (j) участка VL, представленного в SEQ ID NO: 179 или 183 WO 2008/119567, и участка VH, представленного в SEQ ID NO: 177 или 181 WO 2008/119567.- 20 042291 set in SEQ ID NO: 159 or 163 WO 2008/119567; and (j) a VL region shown in SEQ ID NO: 179 or 183 of WO 2008/119567 and a VH region shown in SEQ ID NO: 177 or 181 of WO 2008/119567.

В связи с конструкцией антитела по данному изобретению дополнительно предпочтительным является второй связывающий домен, который связывается с CD3 человека на поверхности T-клетки, содержащий участок VL, представленный SEQ ID NO: 102, и участок VH, представленный SEQ ID NO: 101.In connection with the design of the antibody of this invention, a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell is further preferred, comprising a VL region represented by SEQ ID NO: 102 and a VH region represented by SEQ ID NO: 101.

Согласно предпочтительному варианту конструкции антитела по данному изобретению связывающие домены и, в частности, второй связывающий домен (который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности T-клетки) имеют следующий формат: пары VH-участков и VL- участков находятся в формате одноцепочечного антитела (scFv). Участки VH и VL расположены в порядке VH-VL или VL-VH. Предпочтительно VH-участок расположен на N-конце линкерной последовательности, а VL-участок расположен на C-конце линкерной последовательности.In a preferred embodiment of the antibody of this invention, the binding domains, and in particular the second binding domain (which binds to human CD3 on the surface of a T cell) are in the following format: the pairs of VH regions and VL regions are in the format of a single chain antibody (scFv). The VH and VL sections are arranged in the order VH-VL or VL-VH. Preferably, the VH region is located at the N-terminus of the linker sequence and the VL region is located at the C-terminus of the linker sequence.

Предпочтительный вариант описанной выше конструкции антитела по данному изобретению характеризуется вторым связывающим доменом, который связывается с КД3 (CD3) человека на поверхности Т-клетки, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103 (см. также SEQ ID NO 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 или 187 WO 2008/119567.A preferred embodiment of the above antibody construct of the present invention is characterized by a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell, comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID WO 2008/119567.

Кроме того, предполагается, что конструкция антитела по изобретению, помимо своей функции связывание с молекулами-мишенями МЗЛН (MSLN) и КД3 (CD3), выполняет еще одну функцию. В этом формате конструкция антитела действует как трехфункциональная или многофункциональная конструкциа антитела путем нацеливания на клетки-мишени посредством связывания с МЗЛН (MSLN), опосредующую активность цитотоксических T-клеток посредством связывания с КД3 (CD3) и обеспечивающую дополнительную функцию, например, посредством полностью функционального константного домена Fc, опосредующего антителозависимую клеточную цитотоксичность путем рекрутинга эффекторных клеток, таких как природные клетки-киллеры, ПК (NK)-клетки, метки (флуоресцентная и т.д.), терапевтического агента, такого как токсин или радионуклид, и/или средств для увеличения периода полувыведения из сыворотки и т.д.In addition, the antibody construct of the invention is expected to perform another function in addition to its function of binding to MSLN and CD3 target molecules. In this format, the antibody construct acts as a trifunctional or multifunctional antibody construct by targeting target cells via binding to MSLNs, mediating cytotoxic T cell activity via binding to CD3 and providing an additional function, e.g., through a fully functional constant an Fc domain mediating antibody-dependent cellular cytotoxicity by recruiting effector cells such as natural killer cells, PK (NK) cells, labels (fluorescent, etc.), a therapeutic agent such as a toxin or radionuclide, and/or agents for increase in serum half-life, etc.

Примеры способов продления периода полувыведения из сыворотки конструкций антител по изобретению включают в себя пептиды, белки или белковые домены, которые слиты или иным образом присоединены к конструкциям антител. Группа пептидов, белков или белковых доменов включает в себя пептиды, связывающиеся с другими белками с предпочтительным фармакокинетическим профилем в организме человека, такими как сывороточный альбумин (см. WO 2009/127691). Альтернативная концепция таких пептидов, увеличивающих период полувыведения, включает в себя пептиды, связывающиеся с рецептором Fc новорожденных (FcRn, см. WO 2007/098420), которые также можно применять в конструкциях по данному изобретению. Концепция присоединения более крупных белковых доменов или полноразмерных белков включает в себя, например, слияние человеческого сывороточного альбумина, вариантов или мутантов человеческого сывороточного альбумина (см. WO 2011/051489, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2013/135896, WO 2014/072481, WO 2013/075066) или их доменов, а также слияние константного участка иммуноглобулинов (доменов Fc) и их вариантов. Такие варианты доменов Fc могут быть оптимизированы/модифицированы для обеспечения желаемого спаривания димеров или мультимеров, для устранения связывания с рецептором Fc (например, рецептором Fcy) или по другим причинам. Еще одной концепцией, известной в данной области техники для увеличения периода полувыведения белковых соединений небольшого размера из организма человека, является пегилирование этих соединений, таких как конструкция антитела по данному изобретению.Examples of methods for extending the serum half-life of the antibody constructs of the invention include peptides, proteins, or protein domains that are fused or otherwise attached to the antibody constructs. The group of peptides, proteins or protein domains includes peptides that bind to other proteins with a preferred pharmacokinetic profile in the human body, such as serum albumin (see WO 2009/127691). An alternative concept for such half-life increasing peptides includes peptides that bind to the neonatal Fc receptor (FcRn, see WO 2007/098420), which can also be used in the constructs of this invention. The concept of attaching larger protein domains or full-length proteins includes, for example, fusion of human serum albumin, variants or mutants of human serum albumin (see WO 2011/051489, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2013/135896, WO 2014/072481, WO 2013/075066) or their domains, as well as the fusion of the constant region of immunoglobulins (Fc domains) and their variants. Such Fc domain variants may be optimized/modified to provide the desired pairing of dimers or multimers, to eliminate binding to an Fc receptor (eg, Fcy receptor), or for other reasons. Another concept known in the art for increasing the half-life of small size protein compounds from the human body is the pegylation of these compounds, such as the antibody construct of the present invention.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения конструкция антитела по изобретению описывается следующим образом:In a preferred embodiment of the invention, the antibody construct of the invention is described as follows:

(a) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(a) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus:

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 229;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 and SEQ ID NO: 229;

пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-9; а также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103; а также необязательно метку His, такую как представлена в SEQ ID NO 10;a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-9; and a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; and optionally a His tag such as shown in SEQ ID NO 10;

(b) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(b) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus:

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 229;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 and SEQ ID NO: 229;

пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, со- 21 042291 стоящей из SEQ ID NO: 1-9;a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-9;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей изa polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of

SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ IDSEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID

NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103;NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103;

необязательно пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-9;optionally a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-9;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 104-134; а также необязательную метку His, такую как представлена в SEQ ID NO 10;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 104-134; as well as an optional His tag, such as shown in SEQ ID NO 10;

(c) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(c) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus:

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность QRFVTGHFGGLX1Pang (SEQ ID NO: 135), где X1 представляет собой Y или H; а также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 229;a polypeptide having the amino acid sequence QRFVTGHFGGLX1Pang (SEQ ID NO: 135), where X1 is Y or H; and a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 and SEQ ID NO: 229;

пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-9;a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-9;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) или QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); а также необязательную метку His, такую как представлена в SEQ ID NO 10;a polypeptide having the amino acid sequence QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) or QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); as well as an optional His tag, such as shown in SEQ ID NO 10;

(d) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(d) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus:

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 101;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 and SEQ ID NO: 101;

пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8;a peptide linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218 и SEQ ID NO: 228, и остаток серина на C-конце;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218 and SEQ ID NO: 228, and a serine residue at the C-terminus;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 140; и полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 140; and a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus:

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217 и SEQ ID NO: 227;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217 and SEQ ID NO: 227;

пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8;a peptide linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 и SEQ ID NO: 102, и остаток серина на C-конце;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO: 102, and a serine residue at the C-terminus;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 141;a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 141;

(e) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(e) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus:

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 101;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 and SEQ ID NO: 101;

пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8;a peptide linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218 и SEQ ID NO: 228;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218 and SEQ ID NO: 228;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 142; и полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 142; and a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus:

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217 и SEQ ID NO: 227;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217 and SEQ ID NO: 227;

пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO: 8;a peptide linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 и SEQ ID NO: 102, и остаток серина на C-конце;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO: 102, and a serine residue at the C-terminus;

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 143;a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 143;

(f) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(f) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus:

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209,a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209,

- 22 042291- 22 042291

SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 229;SEQ ID NO: 219 and SEQ ID NO: 229;

пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-9; а также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103; а также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 144; а также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 145;a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-9; and a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; as well as a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 144; as well as a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 145;

(g) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(g) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus:

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 229; а также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 146; и полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103; а также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 147;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 and SEQ ID NO: 229; as well as a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 146; and a polypeptide comprising, in the following order, starting from the N-terminus, a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; as well as a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 147;

(h) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(h) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus:

полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 229; а также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 148; и полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103; а также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 149; или (i) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 and SEQ ID NO: 229; as well as a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 148; and a polypeptide comprising, in the following order, starting from the N-terminus, a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; as well as a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 149; or (i) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus:

пол ипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 229;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 and SEQ ID NO: 229;

пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-9; а также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103; а также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO: 150.a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-9; and a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; and a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 150.

Как описано выше, несколько предпочтительных конструкций антител по изобретению модифицированы путем слияния с другим фрагментом, таким как альбумин или варианты альбумина. Если эти химерные конструкции характеризуются такими свойствами, в частности, аффинностью к мишени или цитотоксической активностью, специалист в данной области техники будет понимать, что подобные слитые конструкции или немодифицированные конструкции биспецифических антител могут обладать сходными (или даже лучшими) свойствами. Например, если конструкция биспецифического антитела, слитая с альбумином, обладает значительной или желательной цитотоксической активностью или аффинностью к мишени, можно ожидать, такая же/сходная или даже более высокая цитотоксическая активность/аффинность к мишени будет наблюдаться для конструкции без альбумина.As described above, several preferred antibody constructs of the invention are modified by fusion with another moiety, such as albumin or albumin variants. If these chimeric constructs are characterized by such properties, in particular target affinity or cytotoxic activity, one skilled in the art will appreciate that such fusion constructs or unmodified bispecific antibody constructs may have similar (or even better) properties. For example, if a bispecific antibody construct fused to albumin has significant or desirable cytotoxic activity or target affinity, the same/similar or even higher cytotoxic activity/target affinity would be expected for the construct without albumin.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения конструкция биспецифического антитела по изобретению содержит (в дополнение к двум связывающим доменам) третий домен, который содержит два полипептидных мономера, каждый из которых содержит шарнир, CH2 и домен CH3, причем указанные два полипептида (или полипептидные мономеры) слиты друг с другом при помощи пептидного линкера. Предпочтительно указанный третий домен содержит в порядке от N-к С-концу: шарнир-CH2-CH3-линкер-шарнир-CH2-CH3.In accordance with another preferred embodiment of the invention, the bispecific antibody construct of the invention comprises (in addition to the two binding domains) a third domain that contains two polypeptide monomers each containing a hinge, a CH2 and a CH3 domain, said two polypeptides (or polypeptide monomers ) are fused to each other using a peptide linker. Preferably, said third domain comprises, in order N-to C-terminus: hinge-CH2-CH3-linker-hinge-CH2-CH3.

Предпочтительные аминокислотные последовательности для указанного третьего домена представлены в SEQ ID NO: 260-267. Каждый из указанных двух полипептидных мономеров предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 252259, или которая по меньшей мере на 90% идентична этим последовательностям. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения первый и второй связывающие домены конструкции биспецифического антитела по изобретению слиты с третьим доменом посредством пептидного линкера, который, например, выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9.Preferred amino acid sequences for this third domain are shown in SEQ ID NOs: 260-267. Each of these two polypeptide monomers preferably has an amino acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 252259, or which is at least 90% identical to these sequences. In another preferred embodiment of the invention, the first and second binding domains of the bispecific antibody construct of the invention are fused to the third domain via a peptide linker which, for example, is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 and 9.

- 23 042291- 23 042291

В соответствии с данным изобретением шарнир представляет собой шарнирный участок IgG. Этот участок может быть идентифицирован по аналогии с применением нумерации Kabat, см. положения Kabat 223-243. В соответствии с вышеизложенным, минимальное требование для шарнира представляет собой аминокислотные остатки, соответствующие участку последовательности IgG1 с D231 по P243 в соответствии с нумерацией Kabat. Термины CH2 и CH3 относятся к константным участкам тяжелой цепи иммуноглобулина 2 и 3. Эти участки также можно идентифицировать по аналогии с применением нумерации Kabat, см. положения Kabat 244-360 для CH2 и положения Kabat 361-478 для CH3. Подразумевается, что существует некоторая вариация между иммуноглобулинами в отношении их участка Fc IgG1, участка Fc IgG2, участка Fc IgG3, участка Fc IgG4, участка Fc IgM, участка Fc IgA, участка Fc IgD и участка Fc IgE (см., например, Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)). Термин мономер Fc относится к последним двум константным участкам тяжелой цепи IgA, IgD и IgG и к последним трем константным участкам тяжелой цепи IgE и IgM. Кроме того, мономер Fc может включать в себя гибкий шарнирный N-конец к указанным доменам. В случае IgA и IgM мономер Fc может включать в себя J-цепь. Для IgG часть Fc содержит иммуноглобулиновые домены CH2 и CH3 и шарнир между первыми двумя доменами и CH2. Хотя границы части Fc иммуноглобулина могут варьировать, пример для участка Fc тяжелой цепи IgG человека, включающего функциональный шарнир, домены CH2 и CH3, может быть определен, например, как содержащий остатки с D231 (шарнирный участок) по P476 (C-конца домена CH3) или с D231 по L476, соответственно, для IgG4, где нумерация соответствует Kabat.In accordance with the present invention, the hinge is an IgG hinge region. This site can be identified by analogy with Kabat numbering, see Kabat provisions 223-243. As stated above, the minimum requirement for a hinge is amino acid residues corresponding to the IgG1 sequence region D231 to P243 according to Kabat numbering. The terms CH2 and CH3 refer to immunoglobulin heavy chain constant regions 2 and 3. These regions can also be identified by analogy using Kabat numbering, see Kabat positions 244-360 for CH2 and Kabat positions 361-478 for CH3. It is understood that there is some variation between immunoglobulins with respect to their IgG1 Fc region, IgG 2 Fc region, IgG 3 Fc region, IgG 4 Fc region, IgM Fc region, IgA Fc region, IgD Fc region, and IgE Fc region (see e.g. , Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)). The term Fc monomer refers to the last two heavy chain constant regions of IgA, IgD and IgG, and to the last three heavy chain constant regions of IgE and IgM. In addition, the Fc monomer may include a flexible N-terminal hinge to said domains. In the case of IgA and IgM, the Fc monomer may include a J chain. For IgG, the Fc portion contains the CH2 and CH3 immunoglobulin domains and a hinge between the first two domains and CH2. Although the boundaries of the Fc portion of an immunoglobulin may vary, an example for a human IgG heavy chain Fc region comprising a functional hinge, CH2 and CH3 domains can be defined, for example, as containing residues D231 (hinge region) to P476 (C-terminus of CH3 domain) or from D231 to L476, respectively, for IgG 4 where the numbering corresponds to Kabat.

Конструкция антитела по изобретению может, следовательно, содержать в порядке от N- к C-концу:An antibody construct of the invention may therefore contain, in order from N- to C-terminus:

(a) первый связывающий домен;(a) a first binding domain;

(b) пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 8 и 9;(b) a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 8 and 9;

(c) второй связывающий домен;(c) a second binding domain;

(d) пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8 и 9;(d) a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 6, 8 and 9;

(e) первый полипептидный мономер третьего домена (содержащий шарнир, CH2 и домен CH3);(e) a first third domain polypeptide monomer (comprising a hinge, CH2 and a CH3 domain);

(f) пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 301, 302, 303 и 304; и (g) второй полипептидный мономер третьего домена (содержащий шарнир, CH2 и домен CH3).(f) a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 301, 302, 303 and 304; and (g) a second third domain polypeptide monomer (comprising a hinge, CH2 and a CH3 domain).

Кроме того, конструкция антитела по изобретению предпочтительно содержит в порядке от Nконца к C-концу пер вый связывающий домен, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 и SEQ ID NO: 229;In addition, the antibody construct of the invention preferably contains, in N-terminal to C-terminal order, a first binding domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219 and SEQ ID NO: 229;

пеп тидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 8 и 9;a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 8 and 9;

вто рой связывающий домен, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103 (см. также SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 или 187 WO 2008/119567);a second binding domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64 , SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103 (see also SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 or 187 of WO 2008/119567);

пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8 и 9; и третий домен, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 260-267.a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 6, 8 and 9; and a third domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 260-267.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения конструкция антитела по данному изобретению содержит или состоит из полипептида, выбранного из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 268-299.Therefore, in a preferred embodiment, the antibody construct of the invention comprises or consists of a polypeptide selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NOs: 268-299.

Кроме того, в одном варианте осуществления изобретения конструкция антитела по данному изобретению предпочтительно содержит или состоит из полипептида, выбранного из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 276-287.In addition, in one embodiment of the invention, the antibody construct of the present invention preferably comprises or consists of a polypeptide selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NOs: 276-287.

Дополнительно в предпочтительном варианте осуществления изобретения конструкция антитела по данному изобретению содержит или состоит из полипептида, выбранного из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 276, 280 и 284, более предпочтительно содержит или состоит из полипептида, представленного в SEQ ID NO: 280.Additionally, in a preferred embodiment of the invention, the antibody construct of the present invention comprises or consists of a polypeptide selected from the group consisting of those set forth in SEQ ID NO: 276, 280 and 284, more preferably contains or consists of a polypeptide set forth in SEQ ID NO: 280 .

Ковалентные модификации конструкций антител также включены в данное изобретение и обычно, но не всегда, осуществляются посттрансляционно. Например, несколько типов ковалентных модификаций конструкции антитела вводятся в молекулу путем взаимодействия конкретных аминокислотных остатков конструкции антитела с органическим дериватизирующим агентом, который способен вступать в реакцию с выбранными боковыми цепями или N-или C-концевыми остатками.Covalent modifications of antibody constructs are also included in this invention and are usually, but not always, carried out post-translationally. For example, several types of covalent modifications to an antibody construct are introduced into a molecule by reacting specific amino acid residues of the antibody construct with an organic derivatizing agent that is capable of reacting with selected side chains or N- or C-terminal residues.

Остатки цистеина чаще всего вводят в реакцию с α-галогенацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, с получением карбоксиметильных или карбок- 24 042291 сиамидометильных производных. Кроме того, остатки цистеина дериватизируют введением в реакцию с бромтрифторацетоном, а-бром-в-(5-имидазоил) пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, Nалкилмалеинимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлорртутьбензоатом, 2-хлорртуть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом.Most often, cysteine residues are reacted with α-haloacetates (and the corresponding amines), such as chloroacetic acid or chloroacetamide, to give carboxymethyl or carboxymethyl or carboxyamidomethyl derivatives. In addition, cysteine residues are derivatized by reaction with bromotrifluoroacetone, a-bromo-b-(5-imidazoyl) propionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkylmaleimides, 3-nitro-2-pyridyl disulfide, methyl-2-pyridyl disulfide, p-chloromercury benzoate, 2- chlormercury-4-nitrophenol or chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole.

Гистидиновые остатки дериватизируют введением в реакцию с диэтилпирокарбонатом при pH 5,57,0, поскольку этот агент относительно специфичен в отношении гистидиновой боковой цепи. Подходящим является также пара-бромфенацилбромид; реакцию предпочтительно проводят в 0,1 М какодилате натрия при pH 6,0. Лизиновые и аминоконцевые остатки вводят в реакцию с ангидридами янтарной или других карбоновых кислот. Дериватизация при помощи этих агентов приводит к изменению заряда остатков лизина на противоположный. Другие подходящие реагенты для дериватизации альфааминосодержащих остатков включают в себя имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборгидрид; тринитробензолсульфоновую кислоту; O-метилизомочевину; 2,4-пентандион; и катализируемую трансаминазой реакцию с глиоксилатом.Histidine residues are derivatized by reacting with diethyl pyrocarbonate at pH 5.57.0 because this agent is relatively specific for the histidine side chain. Para-bromophenacyl bromide is also suitable; the reaction is preferably carried out in 0.1 M sodium cacodylate at pH 6.0. Lysine and amino-terminal residues are reacted with anhydrides of succinic or other carboxylic acids. Derivatization with these agents reverses the charge of lysine residues. Other suitable reagents for derivatizing alpha-amino residues include imidoesters such as methyl picolinimidate; pyridoxal phosphate; pyridoxal; chloroborohydride; trinitrobenzenesulfonic acid; O-methylisourea; 2,4-pentanedione; and a transaminase-catalyzed reaction with glyoxylate.

Остатки аргинина модифицируют введением в реакцию с одним или несколькими обычными реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Дериватизация остатков аргинина требует, чтобы реакция проводилась в щелочных условиях из-за высокого значения pKa гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, эти реагенты могут вступать в реакцию с группами лизина, а также с ипсилон-аминогруппой аргинина.The arginine residues are modified by reacting with one or more common reagents, including phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione, and ninhydrin. Derivatization of arginine residues requires that the reaction be carried out under alkaline conditions due to the high pKa value of the guanidine functional group. In addition, these reagents can react with lysine groups, as well as with the upsilon-amino group of arginine.

Конкретную модификацию тирозильных остатков можно осуществить с конкретной целью введения спектральных меток в тирозильные остатки путем введения в реакцию с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Чаще всего N-ацетилимидазол и тетранитрометан применяют для образования O-ацетилтирозильных соединений и 3-нитропроизводных соответственно. Тирозильные остатки йодируют с применением 125I или 131I, получая меченые белки для применения в радиоиммунологическом анализе, причем подходящим является описанный выше способ с применением хлорамина T.Specific modification of tyrosyl residues can be carried out for the specific purpose of introducing spectral labels on tyrosyl residues by reaction with aromatic diazonium compounds or tetranitromethane. Most often, N-acetylimidazole and tetranitromethane are used to form O-acetyltyrosyl compounds and 3-nitro derivatives, respectively. Tyrosyl residues are iodinated using 125 I or 131 I to produce labeled proteins for use in radioimmunoassay, the chloramine T method described above being suitable.

Карбоксильные боковые группы (аспартил или глутамил) избирательно модифицируют введением в реакцию с карбодиимидами (R'-N=C=N-R'), где R и R' представляют собой необязательно разные алкильные группы, такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4азоний-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, аспартильные и глутамильные остатки превращают в аспарагинильные и глутаминильные остатки введением в реакцию с ионами аммония.Carboxyl side groups (aspartyl or glutamyl) are selectively modified by reaction with carbodiimides (R'-N=C=N-R'), where R and R' are optionally different alkyl groups such as 1-cyclohexyl-3-( 2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimide or 1-ethyl-3-(4azonium-4,4-dimethylpentyl)carbodiimide. In addition, aspartyl and glutamyl residues are converted into asparaginyl and glutaminyl residues by reaction with ammonium ions.

Дериватизация при помощи бифункциональных агентов пригодна для поперечного сшивания конструкций антител по данному изобретению с нерастворимой в воде матрицей подложки или поверхностью для применения различными способами. Обычно применяемые поперечно-сшивающие агенты включают в себя, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаровый альдегид, эфиры Nгидроксисукцинимида, например, сложные эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые сложные эфиры, такие как 3,3'дитиобис(сукцинимидилпропионат) и бифункциональные малеинимиды, такие как бис-Н-малеинимидо1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат, дают промежуточные фотоактивируемые соединения, которые способны образовывать поперечные связи под действием света. В качестве альтернативы, реакционноспособные нерастворимые в воде матрицы, такие как активированные цианогена бромидом углеводы и реакционноспособные субстраты, описанные в патентах США №№ 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 и 4330440 применяются для иммобилизации белка.Derivatization with bifunctional agents is suitable for cross-linking antibody constructs of this invention to a water-insoluble support matrix or surface for use in a variety of ways. Commonly used cross-linking agents include, for example, 1,1-bis(diazoacetyl)-2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters, for example 4-azidosalicylic acid esters, homobifunctional imidoesters including disuccinimidyl esters such as 3,3'dithiobis(succinimidyl propionate) and difunctional maleimides such as bis-H-maleimido 1,8-octane. Derivatizing agents such as methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidate provide photoactivated intermediates that are capable of crosslinking when exposed to light. Alternatively, reactive water-insoluble matrices such as cyanogen bromide-activated carbohydrates and reactive substrates are described in US Pat. Nos. 3,969,287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 and 4330440 are used for protein immobilization.

Глутаминильные и аспарагинильные остатки часто дезамидируют до соответствующих глутамильных и аспартильных остатков. В качестве альтернативы, эти остатки дезамидируют в слабокислых условиях. Любая форма этих остатков включена в данное изобретение.Glutaminyl and asparaginyl residues are often deamidated to the corresponding glutamyl and aspartyl residues. Alternatively, these residues are deamidated under mildly acidic conditions. Any form of these residues is included in this invention.

Другие модификации включают в себя гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серина или треонина, метилирование а-аминогрупп в боковых цепях лизина, аргинина и гистидина (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), ацетилирование N-концевого амина и амидирование любой Cконцевой карбоксильной группы.Other modifications include hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of serine or threonine residues, methylation of a-amino groups in the side chains of lysine, arginine, and histidine (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), acetylation of the N-terminal amine, and amidation of any C-terminal carboxyl group.

Другой вид ковалентной модификации конструкций антител, включенных в данное изобретение, включает в себя модификацию характера гликозилирования белка. Как известно в данной области техники, характер гликозилирования может зависеть как от последовательности белка (например, наличия или отсутствия гликозилирования отдельных аминокислотных остатков, обсуждаемых ниже), так и от клетки-хозяина или организма, в котором образуется белок. Конкретные системы экспрессии рассмотрены ниже.Another type of covalent modification of antibody constructs included in this invention involves modification of the glycosylation pattern of a protein. As is known in the art, the pattern of glycosylation can depend both on the sequence of the protein (eg, the presence or absence of glycosylation of individual amino acid residues, discussed below) and on the host cell or organism in which the protein is formed. Specific expression systems are discussed below.

Гликозилирование полипептидов обычно является N-связанным или О-связанным. N-связанный относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина, являются распознаваемыми последовательностями для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирова- 25 042291 ния. O-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров Nацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также могут применяться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.Glycosylation of polypeptides is usually N-linked or O-linked. N-linked refers to the attachment of a carbohydrate moiety to the side chain of an aspartic residue. The tripeptide sequences asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, where X is any amino acid other than proline, are recognizable sequences for enzymatic attachment of a carbohydrate moiety to the asparagine side chain. Thus, the presence of any of these tripeptide sequences in a polypeptide creates a potential glycosylation site. O-linked glycosylation refers to the addition of one of the sugars Nacetylgalactosamine, galactose, or xylose to a hydroxyamino acid, most commonly serine or threonine, although 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine may also be used.

Добавление сайтов гликозилирования к конструкции антитела обычно осуществляют путем модификации аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или большее количество описанных выше трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанного гликозилирования). Кроме того, модификация может быть осуществлена путем добавления или замещения одного или большего количества остатков серина или треонина в исходной последовательности (для сайтов, связанных с O-гликозилированием). Для удобства аминокислотную последовательность конструкции антитела предпочтительно модифицируют при помощи изменений на уровне ДНК, в частности, путем мутации ДНК, кодирующей полипептид, в заранее выбранных основаниях, таким образом, что образуются кодоны, которые будут транслироваться в необходимые аминокислоты.The addition of glycosylation sites to an antibody construct is typically accomplished by modifying the amino acid sequence to contain one or more of the tripeptide sequences described above (for N-linked glycosylation sites). In addition, the modification can be carried out by adding or replacing one or more serine or threonine residues in the original sequence (for sites associated with O-glycosylation). For convenience, the amino acid sequence of the antibody construct is preferably modified by changes at the DNA level, in particular by mutating the DNA encoding the polypeptide at preselected bases such that codons are generated that will translate into the required amino acids.

Другой способ увеличения количества углеводных фрагментов на конструкции антитела представляет собой химическое или ферментативное связывание гликозидов с белком. Преимущество таких методик состоит в том, что они не требуют продуцирования белка в клетке-хозяине, которая обладает способностью к гликозилированию для N- и О-связанного гликозилирования. В зависимости от применяемого способа связи сахар(а) может(гут) быть присоединен(ы) к (a) аргинину и гистидину, (b) свободным карбоксильным группам, (c) свободным сульфгидрильным группам, таким как в цистеине, (d) свободным гидроксильным группам, таким как группы серина, треонина или гидроксипролина, (e) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана, или (f) амидной группе глутамина. Эти способы описаны в WO 87/05330, и в Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306.Another way to increase the number of carbohydrate moieties on an antibody construct is to chemically or enzymatically link glycosides to a protein. The advantage of such techniques is that they do not require the production of a protein in the host cell that is glycosylated for N- and O-linked glycosylation. Depending on the method of linkage used, the sugar(s) may be attached to (a) arginine and histidine, (b) free carboxyl groups, (c) free sulfhydryl groups such as in cysteine, (d) free hydroxyl groups such as serine, threonine or hydroxyproline groups, (e) aromatic residues such as phenylalanine, tyrosine or tryptophan residues, or (f) glutamine amide group. These methods are described in WO 87/05330, and in Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306.

Удаление углеводных фрагментов, присутствующих в исходной конструкции антитела, может быть осуществлено химически или ферментативно. Химическое дегликозилирование требует воздействия на белок соединения трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентного соединения. Такая обработка приводит к расщеплению большинства или всех сахаров, за исключением линкерного сахара (Nацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина), оставляя полипептид интактным. Химическое дегликозилирование описано Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 и Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118: 131. Ферментативное расщепление углеводных фрагментов на полипептидах может быть достигнуто путем применения множества эндо- и экзогликозидаз, как описано Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350. Гликозилирование на потенциальных сайтах гликозилирования может быть предотвращено при помощи соединения туникамицина, как описано Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 3105. Туникамицин блокирует образование белок-N-гликозидных связей.Removal of carbohydrate moieties present in the original antibody construct may be carried out chemically or enzymatically. Chemical deglycosylation requires exposure of the protein to a trifluoromethanesulfonic acid compound or equivalent. This treatment results in the breakdown of most or all of the sugars except for the linker sugar (Nacetylglucosamine or N-acetylgalactosamine), leaving the polypeptide intact. Chemical deglycosylation is described by Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 and Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. Enzymatic cleavage of carbohydrate moieties on polypeptides can be achieved by using a variety of endo- and exoglycosidases as described by Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. Glycosylation at potential glycosylation sites can be prevented by using the tunicamycin compound as described by Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 3105. Tunikamicin blocks the formation of protein-N-glycosidic bonds.

Другие модификации конструкции антитела также включены в данное изобретение. Например, другой вид ковалентной модификации конструкции антитела включает в себя связывание конструкции антитела с различными небелковыми полимерами, включая, но не ограничиваясь этим, различные полиолы, такие как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, способом, описанным в патентах США №№ 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337. Кроме того, как известно в данной области техники, замены аминокислот могут быть произведены в различных положениях внутри конструкции антитела, например, для упрощения добавления полимеров, таких как ПЭГ.Other modifications to the design of the antibody are also included in this invention. For example, another kind of covalent modification of an antibody construct involves linking the antibody construct to various non-protein polymers, including, but not limited to, various polyols such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyoxyalkylenes, or copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol, in the manner described in U.S. Patent Nos. 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4,791,192 or 4,179,337. In addition, as is known in the art, amino acid substitutions can be made at various positions within an antibody construct, for example, to facilitate the addition of polymers such as PEG.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ковалентная модификация конструкций антител по изобретению включает в себя добавление одной или большего количества меток. Группа метки может быть соединена с конструкцией антитела посредством спейсерных плеч различной длины, чтобы уменьшить потенциальное стерическое затруднение. Различные способы введения меток в белки известны в данной области техники и могут применяться при реализации данного изобретения. Термин метка или маркерная группа относится к любой обнаруживаемой метке. В общем, метки делятся на различные классы, в зависимости от анализа, в котором они должны быть обнаружены, -следующие примеры включают в себя, но не ограничиваясь этим:In some embodiments of the invention, covalent modification of antibody constructs of the invention includes the addition of one or more labels. The label group can be coupled to the antibody construct via spacer arms of various lengths to reduce potential steric hindrance. Various methods for labeling proteins are known in the art and may be used in the practice of this invention. The term label or marker group refers to any detectable label. In general, labels are divided into different classes, depending on the analysis in which they are to be detected - the following examples include, but are not limited to:

a) изотопные метки, которые могут быть радиоактивными или тяжелыми изотопами, такими как радиоизотопы или радионуклиды (например, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, n1In, 1251,131I);a) isotopic labels, which may be radioactive or heavy isotopes such as radioisotopes or radionuclides (e.g. 3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 89 Zr, 90 Y, 99 Tc, n1 In, 125 1, 131 I );

b) магнитные метки (например, магнитные частицы);b) magnetic marks (eg magnetic particles);

c) группы с окислительно-восстановительной активностью;c) groups with redox activity;

d) оптические красители (включая, но не ограничиваясь этим, хромофоры, люминофоры и флуорофоры), такие как флуоресцентные группы (например, флуоресцеин изотиоцианат, ФИТЦ (FITC), родамин, лантаноидные люминофоры), хемилюминесцентные группы и флуорофоры, которые могут представлять собой низкомолекулярные -форы или белковые -форы;d) optical dyes (including, but not limited to, chromophores, luminophores, and fluorophores) such as fluorescent groups (e.g., fluorescein isothiocyanate, FITC (FITC), rhodamine, lanthanide phosphors), chemiluminescent groups, and fluorophores, which may be low molecular weight - handicap or protein - handicap;

e) ферментативные группы (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза)e) enzymatic groups (e.g. horseradish peroxidase, β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase)

f) биотинилированные группыf) biotinylated groups

g) предопределенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательности пар лейцинового зиппера, сайты связывания для вторичных антител, связывающиеся с металлами домены, метки эпитопа и т.д.).g) predefined polypeptide epitopes recognized by the secondary reporter (eg, leucine zipper pair sequences, binding sites for secondary antibodies, metal binding domains, epitope tags, etc.).

- 26 042291- 26 042291

Под флуоресцентной меткой понимается любая молекула, которая может быть обнаружена вследствие присущих ей флуоресцентных свойств. Подходящие флуоресцентные метки включают в себя, но не ограничиваясь этим, флуоресцеин, родамин, тетраметилборамин, эозин, эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирен, малахитовый зеленый, стильбен, Люцифер желтый, Каскадный голубой, Техасский красный, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Красный 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Красный 705, Орегонский зеленый, красители Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Каскадный голубой, Каскадный желтый и R-фикоэритрин, ФЭ (PE) (Molecular Probes, Юджин, штат Орегон), ФИТЦ (FITC), родамин и Техасский красный (Pierce, Рокфорд, штат Иллинойс), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Питтсбург, Пенсильвания). Подходящие оптические красители, включая флуорофоры, описаны Richard P. Haugland в Molecular Probes Handbook.By fluorescent label is meant any molecule that can be detected due to its inherent fluorescent properties. Suitable fluorescent labels include, but are not limited to, fluorescein, rhodamine, tetramethylboramine, eosin, erythrosin, coumarin, methylcoumarins, pyrene, malachite green, stilbene, Lucifer yellow, Cascade blue, Texas red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon Green, Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow, and R-Phycoerythrin, PE (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC (FITC), Rhodamine, and Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Suitable optical dyes, including fluorophores, are described by Richard P. Haugland in the Molecular Probes Handbook.

Кроме того, подходящие белковые флуоресцентные метки включают в себя, но не ограничиваясь этим, зеленый флуоресцентный белок, в том числе ЗФБ (GFP) видов Renilla, Ptilosarcus или Aequorea (Chalfie et al., 1994, Science 263: 802-805), усиленный зеленый флуоресцентный белок, УЗФБ (EGFP) (Clontech Laboratories, Inc., учетный номер Genbank U55762), синий флуоресцентный белок, СФБ (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24: 462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), усиленный желтый флуоресцентный белок, УЖФБ (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), люциферазу (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150: 5408-5417) β-галактозидазу (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2603-2607) и Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO 98/14605, WO 98/26277, WO 99/49019, патенты США №№ 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558).In addition, suitable protein fluorescent labels include, but are not limited to, green fluorescent protein, including GFP (GFP) of Renilla, Ptilosarcus or Aequorea species (Chalfie et al., 1994, Science 263: 802-805), amplified green fluorescent protein, EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank accession U55762), blue fluorescent protein, SFB (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24: 462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), enhanced yellow fluorescent protein, UGFB (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferase (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150: 5408-5417) β-galactosidase (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2603-2607) and Renilla (WO92/15673, WO95 /07463, WO 98/14605, WO 98/26277, WO 99/49019, US Pat.

Домены лейцинового зиппера представляют собой пептиды, которые способствуют олигомеризации белков, в которых они обнаружены. Лейциновые зипперы первоначально были идентифицированы в нескольких ДНК-связывающих белках (Landschulz et al., 1988, Science 240: 1759) и с тех пор обнаружены во множестве различных белков. Среди известных лейциновых зипперов встречающиеся в природе пептиды и их производные, которые димеризуют или тримеризуют. Примеры доменов лейцинового зиппера, подходящих для получения растворимых олигомерных белков, описаны в заявке PCT WO 94/10308, а лейциновый зиппер, полученный из белка D сурфактанта легких, БСД (SPD), описан в Hoope et al., 1994, FEBS Letters 344: 191. Применение модифицированного лейцинового зиппера, который обеспечивает стабильную тримеризацию слитого с ним гетерологичного белка, описано в Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267-78. В одном из подходов рекомбинантные слитые белки, содержащие фрагмент или производное антитела против МЗЛН (MSLN), слитые с пептидом лейцинового зиппера, экспрессируются в подходящих клетках-хозяевах, а растворимые олигомерные фрагменты антитела против МЗЛН (MSLN) или производные, которые образуются, выделяют из супернатанта культуры.Leucine zipper domains are peptides that promote oligomerization of the proteins in which they are found. Leucine zippers were originally identified in several DNA-binding proteins (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759) and have since been found in a variety of different proteins. Known leucine zippers include naturally occurring peptides and derivatives thereof that dimerize or trimerize. Examples of leucine zipper domains suitable for making soluble oligomeric proteins are described in PCT application WO 94/10308, and a leucine zipper derived from lung surfactant protein D, SPD, is described in Hoope et al., 1994, FEBS Letters 344: 191. The use of a modified leucine zipper that provides stable trimerization of a heterologous protein fused to it is described in Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. In one approach, recombinant fusion proteins containing an anti-MDLN antibody (MSLN) fragment or derivative fused to a leucine zipper peptide are expressed in suitable host cells, and the soluble anti-MDLN antibody (MSLN) oligomeric fragments or derivatives that form are isolated from culture supernatant.

Кроме того, конструкция антитела по изобретению может содержать дополнительные домены, которые, например, являются полезными для выделения молекулы или имеют отношение к адаптированному фармакокинетическому профилю молекулы. Домены, полезные для выделения конструкции антитела, могут быть выбраны из пептидных мотивов или вторично введенных фрагментов, которые могут быть захвачены в способе выделения, например, колонкой для выделения. Неограничивающие варианты таких дополнительных доменов включают в себя пептидные мотивы, известные как маркер Myc, маркер HAT, маркер HA, маркер TAP, маркер GST, связывающий домен хитина, СДХ (маркер CBD), мальтозосвязывающий белок, МСБ (маркер МВР), маркер Flag, маркер Strep и их варианты (например, маркер StrepII) и маркер His. Все описанные в данном изобретении конструкции антител, характеризующиеся идентифицированными CDR, предпочтительно содержат домен маркера His, который обычно известен как повтор последовательных остатков His в аминокислотной последовательности молекулы, предпочтительно пяти, и более предпочтительно шести остатков His (гексагистидин). Маркер His может быть расположен, например, на N- или C-конце конструкции антитела, предпочтительно он расположен на Сконце. Наиболее предпочтительно гексагистидиновый маркер (HHHHHH) (SEQ ID NO: 10) соединен посредством пептидной связи с C-концом конструкции антитела в соответствии с изобретением.In addition, the antibody construct of the invention may contain additional domains which, for example, are useful for isolating the molecule or are relevant to the tailored pharmacokinetic profile of the molecule. Domains useful for isolating an antibody construct can be selected from peptide motifs or reintroduced fragments that can be captured in a recovery method, eg, a recovery column. Non-limiting variants of such additional domains include peptide motifs known as Myc marker, HAT marker, HA marker, TAP marker, GST marker, chitin binding domain, SDH (CBD marker), maltose binding protein, MBP (MBP marker), Flag marker, the Strep marker and variants thereof (eg, the StrepII marker); and the His marker. All antibody constructs described herein, characterized by identified CDRs, preferably contain a His marker domain, which is commonly known as a repeat of consecutive His residues in the amino acid sequence of the molecule, preferably five, and more preferably six His residues (hexahistidine). The His marker may be located, for example, at the N- or C-terminus of the antibody construct, preferably at the C-terminus. Most preferably, a hexahistidine marker (HHHHHH) (SEQ ID NO: 10) is linked via a peptide bond to the C-terminus of an antibody construct of the invention.

Первый связывающий домен конструкции антитела по данному изобретению связывается с МЗЛН (MSLN) человека на поверхности клетки-мишени. Предпочтительная аминокислотная последовательность МЗЛН (MSLN) человека представлена в SEQ ID NO: 231, 232 и 233. Следовательно, первый связывающий домен в соответствии с изобретением предпочтительно связывается с МЗЛН (MSLN), когда последний экспрессируется естественным образом экспрессирующими клетками или клеточными линиями и/или клетками или клеточными линиями, трансформированными или (стабильно/временно) трансфектированными МЗЛН (MSLN). В предпочтительном варианте осуществления изобретения первый связывающий домен дополнительно связывается с МЗЛН (MSLN), когда МЗЛН (MSLN) применяется в качестве молекулы мишени или лиганда в анализе связывания in vitro, таком как BIAcore или Scatchard. Клетка-мишень может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой, экспрессирующей МЗЛН (MSLN) на своей поверхности; предпочтительно клетка-мишень представляет собой клетку, которая является частью организма человека или животного, такую как клетка рака яичника, клетка рака поджелудочной железы, клетка мезотелиомы, клетка рака легкого, клетка рака желудка и клетка тройноThe first binding domain of the antibody construct of the invention binds to the human MSLN on the surface of the target cell. The preferred amino acid sequence of the human MSLN is shown in SEQ ID NOs: 231, 232 and 233. Therefore, the first binding domain according to the invention preferentially binds to the MSLN when the latter is naturally expressed by expressing cells or cell lines and/or cells or cell lines transformed or (stably/temporarily) transfected with MSLNs (MSLNs). In a preferred embodiment of the invention, the first binding domain further binds to MSLN (MSLN) when MSLN (MSLN) is used as a target molecule or ligand in an in vitro binding assay such as BIAcore or Scatchard. The target cell can be any prokaryotic or eukaryotic cell that expresses MSLNs (MSLN) on its surface; preferably, the target cell is a cell that is part of the human or animal body, such as an ovarian cancer cell, a pancreatic cancer cell, a mesothelioma cell, a lung cancer cell, a gastric cancer cell, and a triple

- 27 042291 го отрицательного рака молочной железы.- 27 042291 negative breast cancer.

Аффинность первого связывающего домена против МЗЛН (MSLN) человека предпочтительно составляет меньше или равно 20 нМ, более предпочтительно меньше или равно 10 нМ, еще более предпочтительно меньше или равно 5 нМ, еще более предпочтительно меньше или равно 2 нМ, еще более предпочтительно меньше или равно 1 нМ, еще более предпочтительно меньше или равно 0,6 нМ, еще более предпочтительно меньше или равно 0,5 нМ и наиболее предпочтительно меньше или равно 0,4 нМ. Аффинность может быть измерена, например, в анализе BIAcore или в анализе Scatchard, например, как описано в примерах. Кроме того, специалисту в данной области техники хорошо известны другие способы определения аффинности; см., например, прилагаемый пример 3.The affinity of the first human MSLN binding domain is preferably less than or equal to 20 nM, more preferably less than or equal to 10 nM, even more preferably less than or equal to 5 nM, even more preferably less than or equal to 2 nM, even more preferably less than or equal to 1 nM, even more preferably less than or equal to 0.6 nM, even more preferably less than or equal to 0.5 nM, and most preferably less than or equal to 0.4 nM. Affinity can be measured, for example, in the analysis of BIAcore or in the analysis of Scatchard, for example, as described in the examples. In addition, one skilled in the art is well aware of other methods for determining affinity; see, for example, attached example 3.

Кроме того, включены модификации аминокислотных последовательностей конструкций антител, описанных в данном документе. Например, может быть желательно улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства конструкции антитела. Варианты аминокислотных последовательностей конструкций антител получают путем введения соответствующих модификаций нуклеотидов в нуклеиновую кислоту конструкции антитела или путем синтеза пептидов. Все описанные ниже модификации аминокислотной последовательности должны приводить к созданию конструкции антитела, которое сохраняет желаемую биологическую активность (связывание с МЗЛН (MSLN) и КД3 (CD3)) немодифицированной родительской молекулы.Also included are modifications to the amino acid sequences of the antibody constructs described herein. For example, it may be desirable to improve the binding affinity and/or other biological properties of an antibody construct. Variants of the amino acid sequences of antibody constructs are obtained by introducing appropriate nucleotide modifications into the nucleic acid of the antibody construct or by synthesizing peptides. All amino acid sequence modifications described below should result in an antibody construct that retains the desired biological activity (binding to MSLN and CD3) of the unmodified parent molecule.

Термин аминокислота или аминокислотный остаток обычно относится к аминокислоте, соответствующей признанному в данной области техники определению, такому как аминокислота, выбранная из группы, состоящей из: аланина (Ala или A); аргинина (Arg или R); аспарагина (Asn или N); аспарагиновой кислоты (Asp или D); цистеина (Cys или C); глутамина (Gln или G); глутаминовой кислоты (Glu или E); глицина (Gly или G); гистидина (His или H); изолейцина (He или I); лейцина (Leu или L); лизина (Lys или K); метионина (Met или M); фенилаланина (Phe или F); пролина (Pro или P); серина (Ser или S); треонина (Thr или T); триптофана (Trp или W); тирозина (Tyr или Y); и валина (Val или V), хотя по желанию могут применяться модифицированные, синтетические или редкие аминокислоты. Как правило, аминокислоты могут быть сгруппированы как содержащие неполярную боковую цепь (например, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); отрицательно заряженную боковую цепь (например, Asp, Glu); положительно заряженную боковую цепь (например, Arg, His, Lys); или незаряженную полярную боковую цепь (например, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp и Tyr).The term amino acid or amino acid residue generally refers to an amino acid according to a definition recognized in the art, such as an amino acid selected from the group consisting of: alanine (Ala or A); arginine (Arg or R); asparagine (Asn or N); aspartic acid (Asp or D); cysteine (Cys or C); glutamine (Gln or G); glutamic acid (Glu or E); glycine (Gly or G); histidine (His or H); isoleucine (He or I); leucine (Leu or L); lysine (Lys or K); methionine (Met or M); phenylalanine (Phe or F); proline (Pro or P); serine (Ser or S); threonine (Thr or T); tryptophan (Trp or W); tyrosine (Tyr or Y); and valine (Val or V), although modified, synthetic or rare amino acids may be used if desired. Generally, amino acids can be grouped as having a non-polar side chain (eg, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); a negatively charged side chain (eg Asp, Glu); a positively charged side chain (eg Arg, His, Lys); or an uncharged polar side chain (eg Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp and Tyr).

Модификации аминокислот включают в себя, например, делеции и/или инсерции и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях конструкций антител. Любая комбинация делеции, инсерции и замены производится для получения окончательной конструкции при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками. Кроме того, модификации аминокислот могут изменять посттрансляционные процессы для конструкций антител, такие как модификация количества или положения сайтов гликозилирования.Amino acid modifications include, for example, deletions and/or insertions and/or substitutions of residues in the amino acid sequences of antibody constructs. Any combination of deletion, insertion, and substitution is made to produce the final construct, provided that the final construct has the desired characteristics. In addition, amino acid modifications can alter post-translational processes for antibody constructs, such as modifying the number or position of glycosylation sites.

Например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот могут быть вставлены или удалены в каждом из CDR (конечно, в зависимости от их длины), в то время как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 25 аминокислот могут быть вставлены или удалены в каждом из FR. Предпочтительно инсерции аминокислотной последовательности включают в себя амино- и/или карбоксиконцевое слияние с длиной в диапазоне от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков до полипептидов, содержащих сто или большее количество остатков, а также инсерции одного или большего количества аминокислотных остатков внутри последовательности. Инсерционный вариант конструкции антитела по изобретению включает в себя слияние фермента с N-концом или C-концом конструкции антитела или слияние с полипептидом, который увеличивает период полувыведения конструкции антитела из сыворотки.For example, 1, 2, 3, 4, 5, or 6 amino acids can be inserted or deleted in each of the CDRs (depending on their length, of course), while 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, or 25 amino acids may be inserted or deleted in each of the FRs. Preferably, amino acid sequence insertions comprise an amino- and/or carboxy-terminal fusion ranging from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 residues in length to polypeptides containing one hundred or more residues, and also insertions of one or more amino acid residues within a sequence. An insertion variant of an antibody construct of the invention comprises fusion of an enzyme to the N-terminus or C-terminus of the antibody construct, or fusion to a polypeptide that increases the serum half-life of the antibody construct.

Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают в себя CDR тяжелой и/или легкой цепи, в частности гипервариабельные участки, но также включены модификации FR тяжелой и/или легкой цепей. Замены предпочтительно представляют собой консервативные замены, как описано в данном изобретении. Предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот могут быть заменены в CDR, тогда как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2 0 или 2 5 аминокислот могут быть заменены в каркасных участках, КУ (FR) в зависимости от длины CDR или FR. Например, если последовательность CDR содержит 6 аминокислот, то предполагается, что одна, две или три из этих аминокислот заменены. Аналогично, если последовательность CDR содержит 15 аминокислот, предполагается, что одна, две, три, четыре, пять или шесть из этих аминокислот заменены.Sites of greatest interest for substitutional mutagenesis include heavy and/or light chain CDRs, in particular hypervariable regions, but heavy and/or light chain FR modifications are also included. The substitutions are preferably conservative substitutions as described herein. Preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids may be substituted in the CDR, while 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or 25 amino acids can be substituted in the framework regions, KU (FR) depending on the length of the CDR or FR. For example, if the CDR sequence contains 6 amino acids, then one, two, or three of those amino acids are assumed to be replaced. Similarly, if the CDR sequence contains 15 amino acids, one, two, three, four, five, or six of these amino acids are assumed to have been replaced.

Подходящий способ идентификации определенных остатков или участков конструкций антител, которые являются предпочтительными сайтами для мутагенеза, называется аланин-сканирующим мутагенезом, как описано Cunningham и Wells в Science, 244: 1081-1085 (1989). Остаток или группу целевых остатков в конструкции антитела идентифицируют (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином), чтобы повлиять на взаимодействие аминокислот с эпитопом.A suitable method for identifying certain residues or regions of antibody constructs that are preferred sites for mutagenesis is called alanine scanning mutagenesis, as described by Cunningham and Wells in Science, 244: 1081-1085 (1989). A residue or group of target residues in the antibody construct is identified (e.g., charged residues such as arg, asp, his, lys, and glu) and replaced with a neutral or negatively charged amino acid (most preferably alanine or polyalanine) to influence the interaction of the amino acids with the epitope.

Положения аминокислот, демонстрирующие функциональную чувствительность к заменам, затем уточняют путем введения дальнейших или других вариантов на или в сайтах замены. Таким образом, хотя сайт или участок для введения вариации аминокислотной последовательности определен заранее,Amino acid positions demonstrating functional sensitivity to substitutions are then refined by introducing further or other variants at or at substitution sites. Thus, although the site or site for introducing an amino acid sequence variation is predetermined,

- 28 042291 природа мутации сама по себе не должна быть предопределена. Например, для анализа или оптимизации эффективности мутации в заданном сайте аланиновое сканирование или случайный мутагенез можно осуществлять в целевом кодоне или участке, а варианты конструкции экспрессируемых антител подвергают скринингу на предмет оптимальной комбинации желаемой активности. Способы осуществления мутаций с заменой в предварительно определенных участках ДНК с известной последовательностью хорошо известны, например мутагенез с праймером M13 и мутагенез ПЦР. Скрининг мутантов проводят с применением анализов антигенсвязывающей активности, таких как связывание с МЗЛН (MSLN) или КД3 (CD3).- 28 042291 the nature of the mutation itself should not be predetermined. For example, to analyze or optimize the efficiency of a mutation at a given site, alanine scanning or random mutagenesis can be performed at the target codon or site, and expressible antibody constructs screened for the optimal combination of desired activity. Methods for performing substitution mutations in predetermined DNA regions of known sequence are well known, such as M13 primer mutagenesis and PCR mutagenesis. Mutant screening is performed using antigen-binding activity assays such as binding to MSLN (MSLN) or CD3 (CD3).

Как правило, если аминокислоты заменены в одном или большем количестве или всех CDR тяжелой и/или легкой цепи, предпочтительно, чтобы полученная таким образом последовательность, содержащая замены, была по меньшей мере на 60 или 65%, более предпочтительно на 70 или 75%, еще более предпочтительно на 80 или 85% и особенно предпочтительно на 90 или 95% идентична оригинальной последовательности CDR. Это означает, что от длины CDR зависит, до какой степени он идентичен последовательности, содержащей замены. Например, CDR, содержащий 5 аминокислот, предпочтительно на 80% идентичен его последовательности, содержащей замены, что соответствует замене по меньшей мере одной аминокислоты. Соответственно CDR конструкции антитела могут иметь разную степень идентичности с их последовательностями, содержащими замены, например, для CDRL1 этот показатель может составлять 80%, тогда как для CDRL3 90%.In general, if amino acids are substituted in one or more or all of the heavy and/or light chain CDRs, it is preferred that the sequence thus obtained containing the substitutions be at least 60% or 65%, more preferably 70% or 75%, even more preferably 80% or 85% and especially preferably 90% or 95% identical to the original CDR sequence. This means that the length of the CDR determines to what extent it is identical to the sequence containing the substitutions. For example, a CDR containing 5 amino acids is preferably 80% identical to its sequence containing substitutions, which corresponds to a substitution of at least one amino acid. Accordingly, the CDRs of an antibody construct may have varying degrees of identity with their sequences containing substitutions, for example, for CDRL1 this figure may be 80%, while for CDRL3 90%.

Предпочтительные замены являются консервативными заменами. Однако любая замена (включая неконсервативную замену или одну или большее количество типичных замен, перечисленных в табл. 1 ниже) предусматривается при условии, что конструкция антитела сохраняет свою способность связываться с МЗЛН (MSLN) посредством первого связывающего домена и с КД3 (CD3) или КД3 (CD3) ипсилон посредством второго связывающего домена, и/или его CDR идентичны последовательности, содержащей замены (по меньшей мере на 60 или 65%, более предпочтительно на 70 или 75%, еще более предпочтительно на 80 или 85% и особенно предпочтительно на 90 или 95% идентичны оригинальной CDR-последовательности).Preferred substitutions are conservative substitutions. However, any substitution (including non-conservative substitution or one or more of the exemplary substitutions listed in Table 1 below) is contemplated provided that the antibody construct retains its ability to bind to MSLN via the first binding domain and to CD3 (CD3) or CD3 (CD3) upsilon through the second binding domain, and/or its CDRs are identical to the sequence containing the substitutions (at least 60 or 65%, more preferably 70 or 75%, even more preferably 80 or 85% and especially preferably 90 or 95% identical to the original CDR sequence).

Консервативные замены приведены в табл. 1 под заголовком предпочтительные замены. Если такие замены приводят к модификации биологической активности, то могут быть введены более существенные модификации, обозначенные в табл. 1 как типичные замены, или, как дополнительно описано ниже, применительно к классам аминокислот, продукты подвергают скринингу на предмет желаемой характеристики.Conservative substitutions are given in table. 1 under the heading preferred replacements. If such substitutions lead to a modification of biological activity, then more significant modifications can be introduced, indicated in table. 1 as exemplary substitutions, or as further described below in relation to amino acid classes, the products are screened for the desired characteristic.

Таблица 1. Замены аминокислотTable 1. Amino acid substitutions

Исходная Initial Типичные Замены Typical Substitutions Предпочтительные Замены Preferred Substitutions Ala Ala (A) (A) val, val, leu, leu, ile ile Val Val Arg Arg (R) (R) lys , lys, gin, gin, asn asn Lys Lys Asn Asn (N) (N) gin, gin, his, his, asp, asp, lys , lys, arg arg Gin gin Asp asp (D) (D) glu, glue, asn asn Glu Glu Cys Cys (C) (C) ser, ser, ala ala Ser Ser Gin gin (Q) (Q) asn, asn, glu glu Asn Asn Glu Glu (E) (E) asp. asp. gin gin Asp asp Gly gly (G) (G) ala ala Ala Ala His His (H) (H) asn, asn, gin, gin, lys , lys, arg arg Arg Arg Ile ile (I) (I) leu, leu, val, val, met, met, ala, ala, phe phe Leu Leu Leu Leu (L) (L) норлейцин norleucine ile ile val val met, met, ala ala lie lie Lys Lys (K) (K) arg, arg, gin, gin, asn asn Arg Arg Met Met (M) (M) leu, leu, phe, phe, ile ile Leu Leu Phe Phe (F) (F) leu, leu, val, val, ile, ile, ala, ala, tyr tyr Tyr Tyr Pro Pro (P) (P) Ala Ala Ala Ala Ser Ser (S) (S) Thr Thr Thr Thr Thr Thr (T) (T) Ser Ser Ser Ser Trp trp (W) (W) tyr, tyr, phe phe Tyr Tyr Tyr Tyr (Y) (Y) trp, trp, phe, phe, thr, thr, ser ser phe phe Val Val (V) (V) ile, ile, leu, leu, met, met, phe, phe, ala ala leu leu

Значительные модификации биологических свойств конструкции антитела по данному изобретению осуществляют путем выбора замен, которые существенно различаются по их влиянию на сохранение (a) структуры полипептидного скелета на участке замены, например, в виде листа или спиральной конформации или (b) заряда или гидрофобности молекулы на целевом участке или (c) объема боковой цепи. Встречающиеся в природе остатки делятся на группы, на основании общих свойств боковой цепи: (1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; (2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr; (3) кислые:Significant modifications to the biological properties of an antibody construct of the invention are made by selecting substitutions that differ substantially in their effect on maintaining (a) the structure of the polypeptide backbone at the site of the substitution, e.g., in a sheet or helical conformation, or (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site or (c) the volume of the side chain. Naturally occurring residues are divided into groups based on common side chain properties: (1) hydrophobic: norleucine, met, ala, val, leu, ile; (2) neutral hydrophilic: cys, ser, thr; (3) sour:

- 29 042291 asp, glu; (4) основные: asn, gin, his, lys, arg; (5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и (6) ароматические: trp, tyr, phe.- 29 042291 asp, glu; (4) basic: asn, gin, his, lys, arg; (5) residues that affect chain orientation: gly, pro; and (6) aromatic: trp, tyr, phe.

Неконсервативные замены означают обмен члена одного из этих классов на другой класс. Любой цистеиновый остаток, не участвующий в поддержании надлежащей конформации конструкции антитела, может быть заменен, как правило, серином, для улучшения устойчивости молекулы к окислению и предотвращения аберрантного поперечного сшивания. Напротив, цистеиновая(ые) связь(и) может(гут) быть введена(ы) в антитело для улучшения его стабильности (в частности, если антитело является фрагментом антитела, таким как фрагмент Fv).Non-conservative substitutions mean exchanging a member of one of these classes for another class. Any cysteine residue not involved in maintaining the proper conformation of the antibody construct can be replaced, typically with serine, to improve the oxidative stability of the molecule and prevent aberrant crosslinking. On the contrary, cysteine(s) connection(s) may be introduced(s) into the antibody to improve its stability (in particular, if the antibody is an antibody fragment, such as an Fv fragment).

Для аминокислотных последовательностей идентичность и/или сходство последовательностей определяют с применением стандартных методов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, алгоритм идентификации локальной последовательности Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482, алгоритм выравнивания для определения идентичности последовательностей Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, метод поиска сходства Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444, компьютеризованные реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), программу последовательностей Best Fit, описанная Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12: 387-395, предпочтительно с настройками по умолчанию, или путем проверки. Предпочтительно, процент идентичности вычисляют при помощи FastDB на основе следующих параметров: штраф за рассогласование 1; штраф за внесение гэпа 1; штраф за размер гэпа 0,33; и штраф за воссоединение 30, Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.For amino acid sequences, sequence identity and/or similarity is determined using standard methods known in the art, including, but not limited to, the local sequence identification algorithm of Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, an alignment algorithm for determining sequence identity Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, similarity search method Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. sci. U.S.A. 85:2444, computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), Best Fit sequence program described by Devereux et al., 1984 , Nucl. Acid Res. 12:387-395, preferably with default settings, or by checking. Preferably, percent identity is calculated by FastDB based on the following parameters: mismatch penalty 1; gap penalty 1; gap size penalty 0.33; and Reunion Penalty 30, Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Примером подходящего алгоритма является PILEUP. PILEUP осуществляет множественное выравнивание последовательностей из группы связанных последовательностей с применением прогрессивного попарного выравнивания. Он также может отображать дерево, иллюстрирующее отношения кластеризации, применяемые для осуществления выравнивания. В PILEUP применяется упрощение метода прогрессивного выравнивания Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35: 351-360; данный метод аналогичен методу, описанному Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5: 151-153. Подходящие параметры PILEUP, включая штраф за внесение гэпа по умолчанию 3,00, штраф за продление гэпа по умолчанию 0,10, и взвешенные концевые гэпы.An example of a suitable algorithm is PILEUP. PILEUP performs multiple sequence alignment from a group of related sequences using progressive pairwise alignment. It may also display a tree illustrating the clustering relationships used to perform the alignment. PILEUP uses a simplification of the progressive alignment method Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360; this method is similar to that described by Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5: 151-153. Suitable PILEUP parameters include a default gap insertion penalty of 3.00, a default gap extension penalty of 0.10, and weighted end gaps.

Другим примером подходящего алгоритма является алгоритм BLAST, описанный в Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; и Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5787. Особенно подходящей программой BLAST является программа WU-BLAST-2, полученная из Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266: 460-480. В WU-BLAST2 применяются несколько параметров поиска, большинство из которых имеют значения по умолчанию. Регулируемые параметры задаются со следующими значениями: длина перекрывания равна 1, доля перекрывания равна 0,125, пороговая длина слова (T) равна II. Параметры HSP S и HSP S2 являются динамическими значениями и определяются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных, в которой осуществляется поиск последовательности, представляющей интерес; однако значения могут быть скорректированы для повышения чувствительности.Another example of a suitable algorithm is the BLAST algorithm described in Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; and Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A. 90:5873-5787. A particularly suitable BLAST program is the WU-BLAST-2 program obtained from Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266: 460-480. WU-BLAST2 uses several search options, most of which have default values. The adjustable parameters are set with the following values: the overlap length is 1, the overlap fraction is 0.125, the threshold word length (T) is II. The parameters HSP S and HSP S2 are dynamic values and are determined by the program itself, depending on the composition of a particular sequence and the composition of a particular database in which the sequence of interest is searched; however, the values can be adjusted to improve sensitivity.

Дополнительным подходящим алгоритмом является гэппированный BLAST, описанный Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402. В гэппированном BLAST применяются баллы замены BLOSUM62; пороговый параметр T установлен на уровне 9; метод с двумя ударами для запуска удлинений без гэпа, начисляет гэпы в размере к со штрафом 10 плюс к; Xu установлен на уровне 16, а Xg установлен на уровне 40 для этапа поиска базы данных и на уровне 67 для выходной стадии алгоритмов. Выравнивание с гэпами запускается оценкой, соответствующей примерно 22 битам.An additional suitable algorithm is the gapped BLAST described by Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. Gapped BLAST uses BLOSUM62 substitution scores; the threshold parameter T is set at level 9; 2-hit method for triggering non-gapped extensions, gapping k at a penalty of 10 plus k; Xu is set to 16 and Xg is set to 40 for the database search stage and 67 for the output stage of the algorithms. Gap alignment is triggered by an estimate corresponding to about 22 bits.

Как правило, гомология аминокислот, сходство или идентичность между отдельными вариантами CDR составляют по меньшей мере 60% для последовательностей, представленных в данном изобретении, и более типично с предпочтительно возрастающей гомологией или идентичностью по меньшей мере 65 или 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75 или 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и почти 100%. Аналогичным образом, процент идентичности последовательности нуклеиновой кислоты (%) в отношении последовательности нуклеиновой кислоты связывающихся белков, определенных в данном изобретении, определяется как процентное содержание нуклеотидных остатков в потенциальной последовательности, которые идентичны остаткам нуклеотидов в кодирующей последовательности конструкции антитела. В конкретном методе применяется модуль BLASTN WU-BLAST-2 с параметрами по умолчанию, с длиной перекрывания и долей перекрывания, установленными на уровне 1 и 0,125, соответственно.Typically, amino acid homology, similarity or identity between individual CDR variants is at least 60% for the sequences provided in this invention, and more typically with preferably increasing homology or identity of at least 65% or 70%, more preferably at least 75%. or 80%, even more preferably at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% and almost 100%. Similarly, percent nucleic acid sequence identity (%) with respect to the nucleic acid sequence of the binding proteins defined in this invention is defined as the percentage of nucleotide residues in the candidate sequence that are identical to the nucleotide residues in the coding sequence of the antibody construct. The specific method uses the WU-BLAST-2 BLASTN module with default parameters, with the overlap length and overlap ratio set to 1 and 0.125, respectively.

Как правило, гомология, сходство или идентичность последовательностей нуклеиновой кислоты между нуклеотидными последовательностями, кодирующими отдельные варианты CDR, и нуклеотидными последовательностями, представленными в данном изобретении, составляет по меньшей мере 60% и более типично с предпочтительно возрастающей гомологией или идентичностью по меньшей мере 65%, 70% 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,Typically, the homology, similarity or identity of the nucleic acid sequences between the nucleotide sequences encoding individual CDR variants and the nucleotide sequences provided in this invention is at least 60% and more typically with preferably increasing homology or identity of at least 65%, 70% 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%

- 30 042291- 30 042291

96%, 97%, 98% или 99% и почти 100%. Таким образом, вариант CDR представляет собой вариант с указанной гомологией, сходством или идентичностью с родительским CDR по изобретению и разделяет биологическую функцию, включая, но не ограничиваясь этим, по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%,96%, 97%, 98% or 99% and almost 100%. Thus, a CDR variant is one with specified homology, similarity, or identity to the parent CDR of the invention and shares a biological function, including but not limited to at least 60%, 65%, 70%, 75%,

80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% специфичности и/или активности родительского CDR.80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% or 99% specificity and/or activity of the parent CDR.

В одном варианте осуществления изобретения процент идентичности конструкций антител в соответствии с изобретением человеческой зародышевой линии составляет больше или равно 7 0% или больше или равно 75%, более предпочтительно больше или равно 80% или больше или равно 85%, еще более предпочтительно больше или равно 90% и наиболее предпочтительно больше или равно 91%, больше или равно 92%, больше или равно 93%, больше или равно 94%, больше или равно 95% или даже больше или равно 96%. Считается, что идентичность генным продуктам зародышевой линии человека в форме антител является важным признаком с точки зрения снижения риска того, что терапевтические белки будут вызывать иммунный ответ против лекарственного средства у пациента во время лечения. Hwang & Foote (Immunogenicity of engineered antibodies; Methods 36 (2005) 3-10) продемонстрировали, что уменьшение количества не относящихся к человеку частей в конструкциях антител приводит к снижению риска индуцирования антител к лекарственным средствам у пациентов во время лечения, Путем сравнения исчерпывающего количества клинически оцениваемых лекарственных средств в форме антител и соответствующих данных иммуногенности, показана тенденция к снижению иммуногенности белка при гуманизации V-участков антител (в среднем 5,1% пациентов) по сравнению с антителами, несущими немодифицированные не относящиеся к человеку V-участки (в среднем 23,59% пациентов). Следовательно, более высокая степень идентичности последовательностям человека является желательной для белковых терапевтических средств V-участков в форме конструкций антител. Для указанной цели определения идентичности зародышевой линии V-участки VL могут быть выровнены с аминокислотными последовательностями сегментов V и сегментов J зародышевой линии человека (http: //vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) при помощи программного обеспечения Vector NTI, и аминокислотная последовательность вычислена в процентах путем деления количества идентичных аминокислотных остатков на общее количество аминокислотных остатков VL. То же самое можно сделать для сегментов VH (http: //vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), за исключением того, что VH CDR3 может быть исключен из-за его большого разнообразия и отсутствия партнеров по выравниванию из числа VH CDR3 зародышевой линии человека. Далее можно применить рекомбинантные методы для повышения степени идентичности последовательностей генам антител зародышевой линии человека.In one embodiment of the invention, the percent identity of antibody constructs according to the invention to human germline is greater than or equal to 70% or greater than or equal to 75%, more preferably greater than or equal to 80% or greater than or equal to 85%, even more preferably greater than or equal to 90% and most preferably greater than or equal to 91%, greater than or equal to 92%, greater than or equal to 93%, greater than or equal to 94%, greater than or equal to 95%, or even greater than or equal to 96%. It is believed that the identity of human germline gene products in antibody form is an important feature in terms of reducing the risk that therapeutic proteins will elicit an immune response against the drug in the patient during treatment. Hwang & Foote (Immunogenicity of engineered antibodies; Methods 36 (2005) 3-10) demonstrated that reducing the number of non-human parts in antibody constructs resulted in a reduced risk of inducing anti-drug antibodies in patients during treatment. clinically evaluated antibody formulations and associated immunogenicity data, showed a trend towards reduced protein immunogenicity when antibody V regions were humanized (average 5.1% of patients) compared to antibodies carrying unmodified non-human V regions (average 23.59% of patients). Therefore, a higher degree of human sequence identity is desirable for V-region protein therapeutics in the form of antibody constructs. For this purpose of determining germline identity, VL V regions can be aligned to the amino acid sequences of human germline V and J segments (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) using the Vector NTI software, and the amino acid the sequence is calculated as a percentage by dividing the number of identical amino acid residues by the total number of VL amino acid residues. The same can be done for VH segments (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), except that VH CDR3 may be excluded due to its high diversity and lack of alignment partners from among VH CDR3 human germline. Further, recombinant techniques can be applied to increase the degree of sequence identity to human germline antibody genes.

В дополнительном варианте осуществления изобретения конструкции биспецифических антител по данному изобретению демонстрируют высокие выходы мономера в стандартных условиях исследования, например, в стандартном двухстадийном способе очистки. Предпочтительно выход мономера конструкций антител согласно изобретению составляет больше или равно 0,25 мг/л супернатанта, более предпочтительно больше или равно 0,5 мг/л, еще более предпочтительно больше или равно 1 мг/л и наиболее предпочтительно больше или равно 3 мг/л супернатанта.In a further embodiment of the invention, the bispecific antibody constructs of the invention exhibit high monomer yields under standard assay conditions, eg, in a standard two-step purification process. Preferably, the monomer yield of the antibody constructs of the invention is greater than or equal to 0.25 mg/l of supernatant, more preferably greater than or equal to 0.5 mg/l, even more preferably greater than or equal to 1 mg/l, and most preferably greater than or equal to 3 mg/l. l supernatant.

Аналогично может быть определен выход димерных изоформ конструкции антитела и, следовательно, процент мономера (т.е., мономер: (мономер плюс димер)). Продуктивность мономерных и димерных конструкций антител и вычисленный процент мономера могут быть, например, получены на стадии очистки эксклюзионной хроматографией, ЭХ (SEC) в супернатанте культуры, полученном в результате стандартизированного производства в лабораторном масштабе в роллерных флаконах. В одном варианте осуществления изобретения процент мономера конструкций антител составляет больше или равно 80%, более предпочтительно больше или равно 85%, еще более предпочтительно больше или равно 90% и наиболее предпочтительно больше или равно 95%.Similarly, the yield of dimeric isoforms of an antibody construct and hence the percentage of monomer (ie, monomer: (monomer plus dimer)) can be determined. The productivity of the monomeric and dimeric antibody constructs and the calculated percentage of monomer can, for example, be obtained from a Size Exclusion Chromatography (SEC) purification step in culture supernatant resulting from standardized laboratory scale production in roller bottles. In one embodiment of the invention, the percentage of antibody construct monomer is greater than or equal to 80%, more preferably greater than or equal to 85%, even more preferably greater than or equal to 90%, and most preferably greater than or equal to 95%.

В одном варианте осуществления изобретения предпочтительная стабильность конструкций антител в плазме (соотношение EC50 с плазмой и EC50 без плазмы) составляет меньше или равно 5 или меньше или равно 4, более предпочтительно меньше или равно 3,5 или меньше или равно 3, еще более предпочтительно меньше или равно 2,5 или меньше или равно 2, и наиболее предпочтительно меньше или равно 1,5 или меньше или равно 1. Стабильность конструкции антитела в плазме можно протестировать путем инкубации конструкции в плазме человека при 37°C в течение 24 ч с последующим определением EC50 в анализе цитотоксичности с высвобождением хрома-51. Эффекторные клетки в анализе цитотоксичности могут быть стимулированными обогащенными CD8-положительными T-клетками человека. Клетки-мишени могут быть, например, клетками ЯКХ (CHO), трансфектированными МЗЛН (MSLN) человека. Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней (Э:М) можно выбрать как 10:1. Пул плазмы человека, применяемый для этой цели, получают из крови здоровых доноров, собранной в шприцы, покрытые ЭДТА. Клеточные компоненты удаляют центрифугированием, верхнюю фракцию плазмы собирают и объединяют в пул. В качестве контроля конструкции антител разбавляют непосредственно перед анализом цитотоксичности средой RPMI-1640. Стабильность в плазме вычисляют как соотношение EC50 (после инкубации в плазме) и EC50 (контроль) (См. Пример 6).In one embodiment of the invention, the preferred stability of antibody constructs in plasma (ratio of EC 50 with plasma to EC 50 without plasma) is less than or equal to 5 or less than or equal to 4, more preferably less than or equal to 3.5 or less than or equal to 3, even more preferably less than or equal to 2.5 or less than or equal to 2, and most preferably less than or equal to 1.5 or less than or equal to 1. Plasma stability of the antibody construct can be tested by incubating the construct in human plasma at 37° C. for 24 h. followed by determination of EC 50 in a chromium-51 release cytotoxicity assay. The effector cells in the cytotoxicity assay can be stimulated with enriched human CD8-positive T cells. Target cells can be, for example, CHO cells transfected with human MSLNs. The ratio of effector cells to target cells (E:M) can be selected as 10:1. The pool of human plasma used for this purpose is obtained from the blood of healthy donors collected in syringes coated with EDTA. Cellular components are removed by centrifugation, the upper plasma fraction is collected and pooled. As a control, antibody constructs are diluted with RPMI-1640 medium just prior to cytotoxicity assay. Plasma stability is calculated as the ratio of EC 50 (after plasma incubation) and EC 50 (control) (See Example 6).

Кроме того, степень превращения конструкции антител по изобретению из мономера в димер предпочтительно является низкой. Превращение может быть измерено в разных условиях и проанализирова- 31 042291 но при помощи высокоэффективной эксклюзионной хроматографии. См. Пример 9. Например, инкубацию мономерных изоформ конструкций антител можно проводить в течение 7 дней при температуре 37°C и концентрациях, например, 100 мкг/мл или 250 мкг/мл в инкубаторе. В этих условиях конструкции антител по изобретению предпочтительно демонстрируют процентное содержание димера, составляющее меньше или равно 5%, более предпочтительно меньше или равно 4%, еще более предпочтительно меньше или равно 3%, еще более предпочтительно меньше или равно 2,5%, еще более предпочтительно меньше или равно 2%, еще более предпочтительно меньше или равно 1,5% и наиболее предпочтительно меньше или равно 1% или меньше или равно 0,5% или даже 0%.In addition, the conversion rate of the antibody construct of the invention from monomer to dimer is preferably low. The conversion can be measured under various conditions and analyzed using high performance size exclusion chromatography. See Example 9. For example, incubation of monomeric isoforms of antibody constructs can be carried out for 7 days at 37° C. and concentrations of, for example, 100 μg/ml or 250 μg/ml in an incubator. Under these conditions, the antibody constructs of the invention preferably exhibit a dimer percentage of less than or equal to 5%, more preferably less than or equal to 4%, even more preferably less than or equal to 3%, even more preferably less than or equal to 2.5%, even more preferably less than or equal to 2%, even more preferably less than or equal to 1.5%, and most preferably less than or equal to 1% or less than or equal to 0.5% or even 0%.

Кроме того, конструкциям биспецифических антител по данному изобретению предпочтительно свойственна очень низкая степень превращения в димер после ряда циклов замораживания/оттаивания. Например, содержание мономера конструкции антитела доводят до концентрации 250 мкг/мл, например, в буфере препарата для приготовления и подвергают трем циклам замораживания/оттаивания (замораживание при минус 80°C в течение 30 мин с последующим оттаиванием в течение 30 мин при комнатной температуре), а затем анализируют высокоэффективной ЭХ (SEC) для определения процента изначально мономерной конструкции антитела, которая была превращена в димерную конструкцию антитела.In addition, the bispecific antibody constructs of the invention preferably exhibit very low dimer conversion after a number of freeze/thaw cycles. For example, the monomer content of the antibody construct is adjusted to a concentration of 250 μg/ml, for example, in preparation buffer and subjected to three freeze/thaw cycles (freeze at -80°C for 30 min followed by thawing for 30 min at room temperature) and then analyzed by high performance SEC (SEC) to determine the percentage of the originally monomeric antibody construct that has been converted to a dimeric antibody construct.

Предпочтительно процентное содержание димерных конструкций биспецифических антител составляет меньше или равно 5%, более предпочтительно меньше или равно 4%, еще более предпочтительно меньше или равно 3%, еще более предпочтительно меньше или равно 2,5%, еще более предпочтительно меньше или равно 2%, еще более предпочтительно меньше или равно 1,5%, и наиболее предпочтительно меньше или равно 1% или даже меньше или равно 0,5%, например, после трех циклов замораживания/оттаивания.Preferably the percentage of dimeric bispecific antibody constructs is less than or equal to 5%, more preferably less than or equal to 4%, even more preferably less than or equal to 3%, even more preferably less than or equal to 2.5%, even more preferably less than or equal to 2%. , even more preferably less than or equal to 1.5%, and most preferably less than or equal to 1% or even less than or equal to 0.5%, for example after three freeze/thaw cycles.

Конструкции биспецифических антител по данному изобретению предпочтительно демонстрируют благоприятную термостабильность с температурой агрегации больше или равно 45°C или больше или равно 50°C, более предпочтительно больше или равно 51°C, больше или равно 52°C, больше или равно 53°C или больше или равно 54°C, еще более предпочтительно больше или равно 56°C или больше или равно 57°C и наиболее предпочтительно больше или равно 58°C или больше или равно 59°C. Показатель термостабильности может быть определен в терминах температуры агрегации антител следующим образом: раствор антитела с концентрацией 250 мкг/мл переносят в одноразовую кювету и помещают в устройство динамического рассеяния света, ДРС (DLS). Образец нагревают от 40 до 70°C со скоростью нагрева 0,5°С/мин с постоянным определением измеряемого радиуса. Для вычисления температуры агрегации антитела применяют увеличение радиуса, указывающего на плавление белка и агрегацию (См. Пример 10).The bispecific antibody constructs of this invention preferably exhibit favorable thermal stability with an aggregation temperature greater than or equal to 45°C or greater than or equal to 50°C, more preferably greater than or equal to 51°C, greater than or equal to 52°C, greater than or equal to 53°C, or greater than or equal to 54°C, even more preferably greater than or equal to 56°C or greater than or equal to 57°C, and most preferably greater than or equal to 58°C or greater than or equal to 59°C. The thermal stability index can be determined in terms of antibody aggregation temperature as follows: A 250 μg/mL antibody solution is transferred into a disposable cuvette and placed in a Dynamic Light Scattering Device (DLS). The sample is heated from 40 to 70°C at a heating rate of 0.5°C/min with a constant determination of the measured radius. To calculate the aggregation temperature of an antibody, an increase in radius is used, indicating protein melting and aggregation (See Example 10).

В качестве альтернативы, кривые температуры плавления могут быть определены при помощи дифференциальной сканирующий калориметрии, ДСК (DSC), чтобы определить, присущую белку биофизическую стабильность для конструкций антител. Эти эксперименты выполняют с применением устройства VP-DSC MicroCal LLC (Нортгемптон, штат Массачусетс, США). Поглощение энергии образцом, содержащим конструкцию антитела, регистрируют при температуре от 20 до 90°C по сравнению с образцом, содержащим только буфер препарата. Конечную концентрацию конструкций антител доводят до 250 мкг/мл, например, в буфере анализа ЭХ (SEC). Для регистрации соответствующей кривой плавления общую температуру образца повышают ступенчато. При каждой температуре T регистрируется поглощение энергии образцом и буферным раствором препарата. Зависимость разницы в поглощении энергии Cp (кКал/моль/°С) образцом минус эталонная величина от соответствующей температуры наносят на график. Температуру плавления определяют как температуру первого максимума поглощения энергии.Alternatively, melting temperature curves can be determined using differential scanning calorimetry, DSC (DSC), to determine the inherent biophysical stability of a protein for antibody constructs. These experiments are performed using a VP-DSC MicroCal LLC device (Northampton, Massachusetts, USA). The energy absorption of the sample containing the antibody construct is recorded at a temperature of 20 to 90°C compared to the sample containing only the preparation buffer. The final concentration of the antibody constructs is adjusted to 250 μg/ml, eg in SEC assay buffer. To record the appropriate melting curve, the total temperature of the sample is raised in steps. At each temperature T, the energy absorption of the sample and the buffer solution of the drug is recorded. The difference in energy absorption Cp (kcal/mol/°C) of the sample minus the reference value is plotted against the corresponding temperature. The melting point is defined as the temperature of the first energy absorption maximum.

Кроме того, предполагается, что мутность (измеренная по данным оптической плотности на длине волны 340 нм, (OD340) после концентрирования очищенной мономерной конструкции антитела до 2,5 мг/мл и инкубации на протяжении ночи) конструкции биспецифического антитела против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) по изобретению будет составлять меньше или равно 0,2, предпочтительно меньше или равно 0,15, более предпочтительно меньше или равно 0,12, еще более предпочтительно меньше или равно 0,1 или даже меньше или равно 0,09 и наиболее предпочтительно меньше или равно 0,08 или меньше или равно 0,07 (см. Пример 11).In addition, the turbidity (measured by optical density at 340 nm, (OD340) after concentration of the purified monomeric antibody construct to 2.5 mg/mL and overnight incubation) of the anti-MDLN bispecific antibody (MSLN) construct is expected to be x CD3 (CD3) according to the invention will be less than or equal to 0.2, preferably less than or equal to 0.15, more preferably less than or equal to 0.12, even more preferably less than or equal to 0.1 or even less than or equal to 0.09 and most preferably less than or equal to 0.08 or less than or equal to 0.07 (see Example 11).

В дополнительном варианте осуществления изобретения конструкция антитела в соответствии с изобретением является стабильной при кислых значениях pH. Чем более толерантно конструкция антитела ведет себя при нефизиологических значениях pH, таких как pH 5,5 (значение pH, которое требуется для запуска, например, катионообменной хроматографии), тем выше степень выделения конструкции антитела, элюируемой из ионообменной колонки, относительно общего количества загруженного белка. Выход конструкции антитела из ионообменной (например, катионообменной) колонки при pH 5,5 предпочтительно составляет больше или равно 30%, более предпочтительно больше или равно 40%, более предпочтительно больше или равно 50%, еще более предпочтительно больше или равно 60%, еще более предпочтительно больше или равно 70% еще более предпочтительно больше или равно 80%, еще более предпочтительно больше или равно 90%, еще более предпочтительно больше или равно 95% и наиболее предпочтительно больше или равно 99% (см. Пример 7).In a further embodiment of the invention, the antibody construct of the invention is stable at acidic pH values. The more tolerant the antibody construct behaves at non-physiological pH values, such as pH 5.5 (the pH value required to run, for example, cation exchange chromatography), the higher the recovery of the antibody construct eluted from the ion exchange column relative to the total amount of protein loaded . The yield of the antibody construct from an ion exchange (e.g., cation exchange) column at pH 5.5 is preferably greater than or equal to 30%, more preferably greater than or equal to 40%, more preferably greater than or equal to 50%, even more preferably greater than or equal to 60%, still more preferably greater than or equal to 70%, more preferably greater than or equal to 80%, even more preferably greater than or equal to 90%, even more preferably greater than or equal to 95%, and most preferably greater than or equal to 99% (see Example 7).

Кроме того, предполагается, что конструкции биспецифического антитела по данному изобретениюIn addition, it is contemplated that the bispecific antibody constructs of this invention

- 32 042291 проявляют терапевтическую эффективность или противоопухолевую активность. Это можно оценить, например, в ходе исследования, описанного в дополнительном примере модели ксенотрансплантации опухоли человека в поздней стадии:- 32 042291 exhibit therapeutic efficacy or antitumor activity. This can be assessed, for example, in the course of the study described in the Supplementary Example of the Late Stage Human Tumor Xenotransplantation Model:

В 1 день исследования 5х106 клеток МЗЛН (MSLN)-положительной клеточной линии рака человека (например, OVCAR-8) подкожно вводят в дорсальную часть правого бока спины самок мышей NOD/SCID. Когда средний объем опухоли достигает около 100 мм3, разведенные in vitro КД3 (CD3)положительные T-клетки человека трансплантируют мышам путем инъекции примерно 2х107 клеток в брюшную полость животных. Мыши контрольной группы основы 1 не получают эффекторных клеток и используются как контроль без трансплантации для сравнения с контрольной группой основы 2 (получающей эффекторные клетки) для контроля влияния только T-клеток на рост опухоли. Лечение антител начинают, когда средний объем опухоли достигает около 200 мм3. Средний размер опухоли в каждой группе лечения в день начала лечения не должен быть статистически отличным от любой другой группы (дисперсионный анализ). Мышей лечат 0,5 мг/кг/день конструкции биспецифического антитела против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) путем внутривенной инъекции болюса в течение примерно 15-20 дней. Опухоли измеряют штангенциркулем во время исследования и прогресс оценивают путем межгруппового сравнения объемов опухоли, ОО (TV). Подавление роста опухоли T/C [%] определяют путем вычисления TV в виде T/C %=100 х (медиана TV анализируемой группы)/(медиана TV контрольной группы 2).On day 1 of the study, 5x10 6 cells of MSLN (MSLN)-positive human cancer cell line (eg, OVCAR-8) are injected subcutaneously into the dorsal part of the right flank of the back of female NOD/SCID mice. When the average tumor volume reaches about 100 mm 3 , in vitro diluted human CD3 (CD3) positive T cells are transplanted into mice by injecting about 2x10 7 cells into the abdominal cavity of the animals. Base 1 control group mice do not receive effector cells and are used as a non-transplant control for comparison with Base 2 control group (receiving effector cells) to control the effect of T cells alone on tumor growth. Antibody treatment is started when the average tumor volume reaches about 200 mm 3 . The mean tumor size in each treatment group on the day of treatment initiation should not be statistically different from any other group (ANOVA). Mice are treated with 0.5 mg/kg/day of an anti-MSLN (MSLN) x CD3 bispecific antibody construct by intravenous bolus injection for about 15-20 days. Tumors are measured with calipers during the study and progress is assessed by intergroup comparison of tumor volumes, VR (TV). Tumor growth suppression T/C [%] is determined by calculating TV as T/C %=100 x (median TV of the analysis group)/(median TV of the control group 2).

Специалисту в данной области техники известно, каким образом модифицировать или адаптировать некоторые параметры этого исследования, такие как количество инъекционно введенных опухолевых клеток, место инъекции, количество трансплантированных Т-клеток человека, количество биспецифических конструкций антител для введения, и сроки, при этом достигая значимого и воспроизводимого результата. Предпочтительно подавление роста опухоли T/C [%] составляет меньше или равно 70 или меньше или равно 60, более предпочтительно меньше или равно 50 или меньше или равно 40, еще более предпочтительно меньше или равно 30 или меньше или равно 20 и наиболее предпочтительно меньше или равно 10 или меньше или равно 5 или даже меньше или равно 2,5.One skilled in the art would know how to modify or tailor some of the parameters of this assay, such as the number of tumor cells injected, injection site, number of transplanted human T cells, number of bispecific antibody constructs to inject, and timing, while achieving meaningful and reproducible result. Preferably, the tumor growth inhibition T/C [%] is less than or equal to 70 or less than or equal to 60, more preferably less than or equal to 50 or less than or equal to 40, even more preferably less than or equal to 30 or less than or equal to 20, and most preferably less than or equal to 20. is equal to 10 or less than or equal to 5 or even less than or equal to 2.5.

Дополнительно изобретение относится к молекуле полинуклеотида/нуклеиновой кислоты, кодирующей конструкцию антитела по изобретению.Additionally, the invention relates to a polynucleotide/nucleic acid molecule encoding an antibody construct of the invention.

Полинуклеотид представляет собой биополимер, состоящий из 13 или большего количества нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в нить. ДНК (такая как кДНК) и РНК (такая как мРНК) представляют собой примеры полинуклеотидов с разной биологической функцией. Нуклеотиды являются органическими молекулами, которые служат мономерами или субъединицами молекул нуклеиновых кислот, таких как ДНК или РНК. Молекула нуклеиновой кислоты или полинуклеотида может быть двухнитевой и однонитевой, линейной и круговой. Она предпочтительно состоит из вектора, который предпочтительно содержится в клетке-хозяине. Указанная клетка-хозяин представляет собой, например, клетку после трансформации или трансфекции вектором или полинуклеотидом по изобретению, способным экспрессировать конструкцию антитела. Для этой цели молекула полинуклеотида или нуклеиновой кислоты функционально связана с контрольными последовательностями.A polynucleotide is a biopolymer consisting of 13 or more nucleotide monomers covalently linked into a strand. DNA (such as cDNA) and RNA (such as mRNA) are examples of polynucleotides with different biological functions. Nucleotides are organic molecules that serve as monomers or subunits of nucleic acid molecules such as DNA or RNA. A nucleic acid or polynucleotide molecule can be double-stranded and single-stranded, linear and circular. It preferably consists of a vector, which is preferably contained in the host cell. Said host cell is, for example, a cell after transformation or transfection with a vector or polynucleotide of the invention capable of expressing an antibody construct. For this purpose, the polynucleotide or nucleic acid molecule is operably linked to control sequences.

Генетический код представляет собой набор правил, при помощи которых информация, закодированная в пределах генетического материала (нуклеиновых кислот) транслируется в белки. Биологическое декодирование в живых клетках осуществляется рибосомой, которая связывает аминокислоты в порядке, определенном мРНК, с применением молекул тРНК для переноса аминокислот и считывания трех нуклеотидов мРНК за один раз. Код определяет, каким образом последовательности этих нуклеотидных триплетов, называемых кодонами, определяют, какая аминокислота будет добавляться во время синтеза белка. За некоторыми исключениями, трехнуклеотидный кодон в последовательности нуклеиновой кислоты определяет одну аминокислоту. Поскольку подавляющее большинство генов кодируется в точности одинаковым кодом, этот конкретный код часто называют каноническим или стандартным генетическим кодом. Хотя генетический код определяет последовательность белка для данного кодирующего участка, другие геномные участки могут влиять на то, когда и где вырабатываются эти белки.The genetic code is a set of rules by which the information encoded within the genetic material (nucleic acids) is translated into proteins. Biological decoding in living cells is carried out by the ribosome, which links the amino acids in the order determined by the mRNA, using tRNA molecules to carry the amino acids and read three nucleotides of the mRNA at a time. The code specifies how the sequences of these nucleotide triplets, called codons, determine which amino acid will be added during protein synthesis. With few exceptions, a three-nucleotide codon in a nucleic acid sequence specifies one amino acid. Since the vast majority of genes are encoded with exactly the same code, this particular code is often referred to as the canonical or standard genetic code. While the genetic code determines the protein sequence for a given coding region, other genomic regions can influence when and where these proteins are made.

Кроме того, в изобретении предложен вектор, содержащий молекулу полинуклеотида/нуклеиновой кислоты по изобретению.In addition, the invention provides a vector containing the polynucleotide/nucleic acid molecule of the invention.

Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, применяемую в качестве носителя для переноса (чужеродного) генетического материала в клетку. Термин вектор включает, но не ограничиваясь этим, плазмиды, вирусы, космиды и искусственные хромосомы. В общем, сконструированные векторы содержат источник репликации, сайт множественного клонирования и селекционный маркер. Сам вектор, как правило, представляет собой нуклеотидную последовательность, обычно последовательность ДНК, которая содержит инсерцию (трансген) и последовательность большего размера, которая служит в качестве скелета вектора. Современные векторы могут обладать дополнительными признаками, помимо трансгенной инсерции и скелета: промотор, генетический маркер, устойчивость к антибиотикам, репортерный ген, нацеливающая последовательность, маркер очистки белка. Векторы, называемые векторами экспрессии (конструкции экспрессии), специально предназначены для экспрессии трансгена в клетке-мишени и, как правило, содержат контрольные последовательности.A vector is a nucleic acid molecule used as a carrier to transfer (foreign) genetic material into a cell. The term vector includes, but is not limited to, plasmids, viruses, cosmids, and artificial chromosomes. In general, the constructed vectors contain an origin of replication, a multiple cloning site, and a selection marker. The vector itself is typically a nucleotide sequence, usually a DNA sequence, that contains an insertion (transgene) and a larger sequence that serves as the backbone of the vector. Modern vectors may have additional features, in addition to the transgenic insertion and backbone: a promoter, a genetic marker, antibiotic resistance, a reporter gene, a targeting sequence, a protein purification marker. Vectors, referred to as expression vectors (expression constructs), are specifically designed to express a transgene in a target cell and typically contain control sequences.

- 33 042291- 33 042291

Термин контрольные последовательности относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организмехозяине. Контрольные последовательности, которые подходят для прокариотов, например, включают в себя промотор, необязательно последовательность оператора и сайт связывания с рибосомой. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.The term control sequences refers to DNA sequences necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism. Control sequences that are suitable for prokaryotes include, for example, a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to use promoters, polyadenylation signals, and enhancers.

Нуклеиновая кислота является функционально связанной, если она размещена в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК прекурсора или секреторного лидера функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется в виде белкапрекурсора, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания с рибосомой функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, чтобы упростить трансляцию. Как правило, функционально связанный означает, что связанные с ним последовательности ДНК являются непрерывными, а в случае секреторного лидера являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными. Связывание осуществляется путем лигирования в подходящих рестрикционных сайтах. Если такие сайты отсутствуют, то применяются синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с обычной практикой.A nucleic acid is operably linked if it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, a precursor or secretory leader DNA is operably linked to a polypeptide's DNA if it is expressed as a precursor protein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is located in such a way as to facilitate translation. In general, operably linked means that the DNA sequences associated with it are contiguous, and in the case of a secretory leader, are contiguous and in reading frame. However, enhancers do not need to be contiguous. Linking is accomplished by ligation at suitable restriction sites. If such sites are not present, then synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with common practice.

Трансфекция представляет собой процесс преднамеренного введения молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов (включая векторы) в клетки-мишени. Этот термин в основном используется для невирусных методов в эукариотических клетках. Трансдукция часто используется для описания опосредованного вирусом переноса молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов. Трансфекция животных клеток обычно включает в себя кратковременное открытие пор или отверстий в клеточной мембране, что позволяет захват материала. Трансфекцию можно осуществлять с применением фосфата кальция, путем электропорации, путем сдавливания клеток или путем смешивания катионного липида с материалом для получения липосом, которые сливаются с клеточной мембраной и переносят свой груз внутрь.Transfection is the process of intentionally introducing nucleic acid molecules or polynucleotides (including vectors) into target cells. This term is mainly used for non-viral methods in eukaryotic cells. Transduction is often used to describe the virus-mediated transfer of nucleic acid molecules or polynucleotides. Transfection of animal cells typically involves the transient opening of pores or holes in the cell membrane to allow material to be taken up. Transfection can be done using calcium phosphate, by electroporation, by squeezing cells, or by mixing a cationic lipid with material to produce liposomes that fuse with the cell membrane and carry their cargo inward.

Термин трансформация используется для описания невирусного переноса молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов (включая векторы) в бактерии, а также в клетки, не являющиеся животными эукариотическими клетками, в том числе в растительные клетки. Таким образом, трансформация представляет собой генетическую модификацию бактериальной или неживотной эукариотической клетки, являющуюся результатом прямого поглощения из окружающей среды сквозь клеточную(ые) мембрану(ы) и последующей инкорпорации экзогенного генетического материала (молекул нуклеиновой кислоты). Трансформация может быть осуществлена при помощи искусственных средств. Чтобы произошла трансформация, клетки или бактерии должны находиться в состоянии компетентности, которое может возникать как ограниченный по времени ответ на условия окружающей среды, такие как голодание и плотность клеток.The term transformation is used to describe the non-viral transfer of nucleic acid molecules or polynucleotides (including vectors) into bacteria, as well as into non-animal eukaryotic cells, including plant cells. Thus, transformation is a genetic modification of a bacterial or non-animal eukaryotic cell resulting from direct uptake from the environment through the cell membrane(s) and subsequent incorporation of exogenous genetic material (nucleic acid molecules). Transformation can be brought about by artificial means. For transformation to occur, cells or bacteria must be in a state of competence, which can occur as a time-limited response to environmental conditions such as starvation and cell density.

Кроме того, в изобретении предложена клетка-хозяин, трансформированная или трансфектированная молекулой полинуклеотида/нуклеиновой кислоты или вектором по изобретению.In addition, the invention provides a host cell transformed or transfected with a polynucleotide/nucleic acid molecule or a vector of the invention.

Как используется в данном документе, термины клетка-хозяин или клетка-реципиент предназначены для включения любой отдельной клетки или клеточной культуры, которые могут быть или стать реципиентами векторов, экзогенных молекул нуклеиновой кислоты и полинуклеотидов, кодирующих конструкцию антитела по данному изобретению; и/или реципиентами самой конструкции антитела. Введение соответствующего материала в клетку осуществляют посредством трансформации, трансфекции и т.п. Кроме того, термин клетка-хозяин включает потомства или потенциальное потомство одной клетки. Поскольку определенные модификации могут произойти в последующих поколениях из-за естественной, случайной или преднамеренной мутации или из-за воздействия окружающей среды, такое потомство фактически не может быть полностью идентичным (с точки зрения морфологии или геномного или полного комплемента ДНК) родительской клетке, но все еще включено в определение термина, используемого в данном документе. Подходящие клетки-хозяева включают в себя прокариотические или эукариотические клетки, а также включают в себя, но не ограничиваясь этим, бактерии, дрожжевые клетки, клетки грибов, растительные клетки и животные клетки, такие как клетки насекомых и клетки млекопитающих, например, мыши, крысы, макака или человека.As used herein, the terms host cell or recipient cell are intended to include any individual cell or cell culture that can be or become recipients of vectors, exogenous nucleic acid molecules, and polynucleotides encoding an antibody construct of the invention; and/or recipients of the antibody construct itself. The introduction of the appropriate material into the cell is carried out by transformation, transfection, and the like. In addition, the term host cell includes progeny or potential progeny of a single cell. Since certain modifications may occur in subsequent generations due to natural, accidental or intentional mutation, or due to environmental influences, such progeny cannot actually be completely identical (in terms of morphology or genomic or complete DNA complement) to the parent cell, but all still included in the definition of the term used in this document. Suitable host cells include prokaryotic or eukaryotic cells, and include, but are not limited to, bacteria, yeast cells, fungal cells, plant cells, and animal cells such as insect cells and mammalian cells, e.g., mice, rats. , macaque or human.

Конструкция антитела по изобретению может вырабатываться бактериями. После экспрессии конструкцию антитела по изобретению выделяют из клеточной пасты E.coli в растворимой фракции, и она может быть очищена посредством, например, аффинной и/или эксклюзионной хроматографии. Окончательная очистка может быть проведена аналогично способу очистки антитела, экспрессируемого, например, в клетках ЯКХ (CHO).The antibody construct of the invention may be produced by bacteria. After expression, the antibody construct of the invention is isolated from the E. coli cell paste in the soluble fraction and can be purified by, for example, affinity and/or size exclusion chromatography. The final purification can be carried out in a manner analogous to the purification of an antibody expressed in, for example, CHO cells.

В дополнение к прокариотам эукариотические микробы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими хозяевами клонирования или экспрессии конструкции антитела по изобретению. Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи наиболее часто используются из числа микроорганизмов-хозяев низших эукариотов. Тем не менее, ряд других родов, видов и штаммов общедоступны и пригодны согласно данному изобретению, такие как Schizosaccharomyces pombe, хозяева Kluyveromy- 34 042291 ces, такие как K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178),In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeasts are suitable hosts for cloning or expression of an antibody construct of the invention. Saccharomyces cerevisiae or common baker's yeast is the most commonly used host microorganism in lower eukaryotes. However, a number of other genera, species and strains are commonly available and useful in the present invention, such as Schizosaccharomyces pombe, hosts of Kluyveromy- 34 042291 ces, such as K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045 ), K. wickeramii (ATCC 24178),

K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans и K. marxianus; yarrowia (EPK. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans and K. marxianus; yarrowia (EP

402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и нитчатые грибы, такие как Neurospora, Penicillium,402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces such as Schwanniomyces occidentalis; and filamentous fungi such as Neurospora, Penicillium,

Tolypocladium, и хозяева Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger.Tolypocladium, and Aspergillus hosts such as A. nidulans and A. niger.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии конструкции гликозилированного антитела по изобретению получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают в себя клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы и варианты и соответствующие разрешающие клетки-хозяева насекомых из организма хозяев, таких как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комары), Aedes albopictus (москиты), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori. Доступны различные вирусные штаммы для трансфекции, например, вариант L-1 вируса нуклеополиэдроза, ВНП (NPV) Autographa californica и штамм Bm-5 ВНП (NPV) Bombyx mori, притом, что такие вирусы могут применяться в качестве вируса в соответствии с данным изобретением, в частности для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.Suitable host cells for expression of the glycosylated antibody construct of the invention are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculovirus strains and variants and corresponding resolving insect host cells from hosts have been identified, such as Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquitoes), Aedes albopictus (mosquitoes), Drosophila melanogaster (fruit fly) and Bombyx mori. Various viral strains are available for transfection, such as nucleopolyhedrosis virus L-1 variant, Autographa californica GNP (NPV) and Bombyx mori GNP (NPV) strain Bm-5, while such viruses can be used as a virus in accordance with this invention, in particular for transfection of Spodoptera frugiperda cells.

Дополнительно в качестве хозяев могут использоваться культуры растительных клеток хлопка, кукурузы, картофеля, сои, петунии, томатов, арабидопсиса и табака. Специалистам в данной области техники известны векторы клонирования и экспрессии, подходящие для выработки белков в культуре растительных клеток. См., например, Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, и Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.Additionally, plant cell cultures of cotton, corn, potato, soybean, petunia, tomato, Arabidopsis, and tobacco can be used as hosts. Those skilled in the art are aware of cloning and expression vectors suitable for the production of proteins in plant cell culture. See, for example, Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, and Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

Однако наибольший интерес проявляется к клеткам позвоночных, а разведение клеток позвоночных в культуре (тканевая культура) стало шаблонной процедурой. Примерами подходящих линий клетокхозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7, Американская коллекция типовых культур, АКТК, ATCC CRL 1651); эмбриональная линия почки человека (293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); клетки почки детеныша хомяка, ПДХ (ВНК, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомяка/-дигидрофолатредуктаза, ДГФР (DHFR) (ЯКХ (CHO), Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CVI ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы линии Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2,1413 8065); опухоль молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL5 1); клетки TRI (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); клетки MRC 5; клетки FS4 и линия гепатомы человека (Hep G2).However, the greatest interest is in vertebrate cells, and the cultivation of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a routine procedure. Examples of suitable mammalian host cell lines are CV1 monkey kidney cell line transformed with SV40 (COS-7, American Type Culture Collection, AKTC, ATCC CRL 1651); human kidney embryonic line (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); baby hamster kidney cells, PDH (BHK, ATCC CCL 10); Chinese hamster ovary cells /-dihydrofolate reductase, DHFR (DHFR) (JCH (CHO), Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); monkey kidney cells (CVI ATCC CCL 70); African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL1587); human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); dog kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34); Buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human liver cells (Hep G2,1413 8065); mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL5 1); TRI cells (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); MRC 5 cells; FS4 cells and a human hepatoma line (Hep G2).

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения конструкции антитела по изобретению, причем указанный способ включает в себя культивирование клеткихозяина по изобретению в условиях, позволяющих экспрессию конструкции антитела по изобретению и выделение продуцированной конструкции антитела из культуры.In a further embodiment, the invention relates to a method for producing an antibody construct of the invention, said method comprising culturing a host cell of the invention under conditions allowing expression of the antibody construct of the invention and isolating the produced antibody construct from the culture.

Как используется в данном документе, термин культивирование относится к содержанию, дифференцировке, росту, пролиферации и/или разведению клеток in vitro в среде в подходящих условиях. Термин экспрессия включает в себя любую стадию, принимающую участие в выработке конструкции антитела по изобретению, включая, но не ограничиваясь этим, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.As used herein, the term culture refers to the maintenance, differentiation, growth, proliferation and/or breeding of cells in vitro in a medium under suitable conditions. The term expression includes any step involved in generating an antibody construct of the invention, including, but not limited to, transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion.

При применении рекомбинантных методов конструкция антитела может вырабатываться внутриклеточно, в периплазматическом пространстве, или непосредственно секретироваться в среду. Если конструкцию антитела получают внутри клетки, то на первой стадии удаляются дебрис частиц, клеткихозяева или лизированные фрагменты, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) описывают методику выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство Е.coli. Вкратце, клеточную пасту размораживают в присутствии ацетата натрия (pH 3,5), ЭДТА и фенилметилсульфонилфторида, ФМСФ (PMSF) в течение примерно 30 минут. Клеточный дебрис можно удалить центрифугированием. Если антитело секретируется в среду, то супернатанты из таких систем экспрессии обычно вначале концентрируют с применением коммерчески доступного фильтра для концентрации белка, например, ультрафильтрационной установки Amicon или Millipore Pellicon. Ингибитор протеазы, такой как ФМСФ (PMSF), может быть включен на любой из вышеперечисленных стадий для ингибирования протеолиза, а антибиотики могут быть включены для предотвращения роста случайных загрязнителей.When using recombinant methods, the antibody construct can be produced intracellularly, in the periplasmic space, or directly secreted into the environment. If the antibody construct is produced intracellularly, then the particle debris, host cells, or lysed fragments are removed in the first step, for example, by centrifugation or ultrafiltration. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describe a procedure for isolating antibodies that are secreted into the periplasmic space of E. coli. Briefly, the cell paste is thawed in the presence of sodium acetate (pH 3.5), EDTA and phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF for about 30 minutes. Cellular debris can be removed by centrifugation. If the antibody is secreted into the medium, supernatants from such expression systems are usually first concentrated using a commercially available protein concentration filter, such as an Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration unit. A protease inhibitor such as PMSF may be included in any of the above steps to inhibit proteolysis, and antibiotics may be included to prevent the growth of incidental contaminants.

Конструкция антитела по изобретению, полученная из клеток-хозяев, может быть выделена или очищена с применением, например, гидроксиапатитовой хроматографии, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии. Кроме того, доступны другие способы очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на кремния диоксиде, хроматография на гепарине SEPHAROSE™, хроматография на анионо- или катионообменной смоле (такой как колонка с полиаспарагиновой кислотой), хромато-фокусировка, ДНС-ПААГ (SDS-PAGE) и осаждение сульфатом аммония, в зависимости от антитела, подлежащего выделению. Ес- 35 042291 ли конструкция антитела по изобретению содержит домен CH3, то для очистки подходит смола Bakerbond ABX (JT Baker, Филлипсберг, штат Нью-Джерси).An antibody construct of the invention derived from host cells can be isolated or purified using, for example, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, and affinity chromatography. In addition, other protein purification methods are available such as ion exchange column fractionation, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, silica chromatography, SEPHAROSE™ heparin chromatography, anion or cation exchange resin chromatography (such as a polyaspartic acid column) , chromato-focusing, SDS-PAGE and ammonium sulfate precipitation, depending on the antibody to be isolated. If an antibody construct of the invention contains a CH3 domain, Bakerbond ABX resin (JT Baker, Phillipsburg, NJ) is suitable for purification.

Предпочтительной технологией очистки является аффинная хроматография. Матрица, к которой присоединен аффинный лиганд, чаще всего является агарозной, но доступны другие матрицы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с заданным размером пор или поли(стиролдивинил)бензол позволяют более высокие скорости потока и более короткое время обработки, чем те, которые могут быть достигнуты при помощи агарозы.The preferred purification technology is affinity chromatography. The matrix to which the affinity ligand is attached is most often agarose, but other matrices are available. Mechanically stable matrices such as pore size glass or poly(styrenedivinyl)benzene allow higher flow rates and shorter processing times than can be achieved with agarose.

Кроме того, в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая конструкцию антитела по изобретению или конструкцию антитела, полученную в соответствии со способом по изобретению. Предпочтительно, гомогенность конструкции антитела в фармацевтической композиции по изобретению составляет больше или равно 80%, более предпочтительно больше или равно 81%, больше или равно 82%, больше или равно 83%, больше или равно 84% или больше или равно 85%, далее предпочтительно больше или равно 86%, больше или равно 87%, больше или равно 88%, больше или равно 89% или больше или равно 90%, еще далее предпочтительно больше или равно 91%, больше или равно 92%, больше или равно 93%, больше или равно 94% или больше или равно 95% и наиболее предпочтительно больше или равно 96%, больше или равно 97%, больше или равно 98% или больше или равно 99%.In addition, the invention provides a pharmaceutical composition containing an antibody construct of the invention or an antibody construct produced in accordance with the method of the invention. Preferably, the homogeneity of the antibody construct in the pharmaceutical composition of the invention is greater than or equal to 80%, more preferably greater than or equal to 81%, greater than or equal to 82%, greater than or equal to 83%, greater than or equal to 84%, or greater than or equal to 85%, further preferably greater than or equal to 86%, greater than or equal to 87%, greater than or equal to 88%, greater than or equal to 89% or greater than or equal to 90%, even more preferably greater than or equal to 91%, greater than or equal to 92%, greater than or equal to 93 %, greater than or equal to 94%, or greater than or equal to 95%, and most preferably greater than or equal to 96%, greater than or equal to 97%, greater than or equal to 98%, or greater than or equal to 99%.

Как используется в данном изобретении, термин фармацевтическая композиция относится к композиции, которая подходит для введения пациенту, предпочтительно человеку. Особенно предпочтительная фармацевтическая композиция по данному изобретению содержит одну или большее количество конструкций антитела по изобретению, предпочтительно в терапевтически эффективном количестве. Предпочтительно фармацевтическая композиция дополнительно содержит подходящие препараты одного или большего количества (фармацевтически эффективных) носителей, стабилизаторов, вспомогательных веществ, разбавителей, солюбилизаторов, поверхностно-активных веществ, эмульгаторов, консервантов и/или адъювантов. Приемлемые компоненты композиции предпочтительно являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях. Фармацевтические композиции по изобретению включают в себя, но не ограничиваясь этим, жидкие, замороженные и лиофилизированные композиции.As used in this invention, the term pharmaceutical composition refers to a composition that is suitable for administration to a patient, preferably a human. A particularly preferred pharmaceutical composition of the invention comprises one or more antibody constructs of the invention, preferably in a therapeutically effective amount. Preferably, the pharmaceutical composition further comprises suitable formulations of one or more (pharmaceutically effective) carriers, stabilizers, excipients, diluents, solubilizers, surfactants, emulsifiers, preservatives and/or adjuvants. Acceptable components of the composition are preferably non-toxic to recipients at the doses and concentrations used. Pharmaceutical compositions of the invention include, but are not limited to, liquid, frozen, and lyophilized compositions.

Композиции по изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый носитель. В общем, как используется в данном документе, термин фармацевтически приемлемый носитель означает любой и все водные и неводные растворы, стерильные растворы, растворители, буферы, например, фосфатносолевой буфер, ФСБ (PBS), воду, суспензии, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы увлажняющих агентов, липосомы, дисперсионные среды и покрытия, которые совместимы с фармацевтическим введением, в частности, с парентеральным введением. Применение таких сред и агентов в фармацевтических композициях хорошо известно в данной области техники, и композиции, содержащие такие носители, могут быть составлены при помощи хорошо известных общепринятых способов.Compositions of the invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier. In general, as used herein, the term pharmaceutically acceptable carrier means any and all aqueous and non-aqueous solutions, sterile solutions, diluents, buffers, e.g. phosphate buffered saline, PBS, water, suspensions, emulsions such as oil/ water, various types of wetting agents, liposomes, dispersion media and coatings that are compatible with pharmaceutical administration, in particular parenteral administration. The use of such media and agents in pharmaceutical compositions is well known in the art, and compositions containing such carriers can be formulated using well known conventional methods.

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие конструкцию антитела по изобретению, и дополнительно одно или большее количество вспомогательных веществ, таких как те, которые иллюстративно описаны в этом разделе и в любом другом месте данного документа. В этом отношении вспомогательные вещества могут применяться в изобретении для самых разных целей, таких как регулирование физических, химических или биологических свойств композиций, таких как регулирование вязкости, и/или в способах по изобретению для повышения эффективности и/или стабилизации таких препаратов и способов против деградации и ухудшения качества, связанных, например, со стрессовыми воздействиями, возникающими при изготовлении, транспортировке, хранении, предварительном приготовлении, введении и после этого.In some embodiments, the invention provides pharmaceutical compositions comprising an antibody construct of the invention and additionally one or more excipients, such as those illustratively described in this section and elsewhere herein. In this regard, excipients can be used in the invention for a wide variety of purposes such as adjusting the physical, chemical or biological properties of the compositions, such as adjusting the viscosity, and/or in the methods of the invention to increase the effectiveness and/or stabilize such preparations and methods against degradation. and deterioration in quality associated, for example, with stresses arising during manufacture, transportation, storage, pre-cooking, administration and thereafter.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция может содержать материалы препарата для модификации, поддержания или сохранения, например, pH, осмотического давления, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, адсорбции или проникновения композиции (см. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18 Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company). В таких вариантах осуществления изобретения подходящие материалы препарата могут включать в себя, но не ограничиваясь этим аминокислоты, такие как глицин, аланин, глутамин, аспарагин, треонин, пролин, 2-фенилаланин, включая заряженные аминокислоты, предпочтительно лизин, ацетат лизина, аргинин, глутамат и/или гистидин;In some embodiments, a pharmaceutical composition may contain formulation materials to modify, maintain, or maintain, for example, pH, osmotic pressure, viscosity, clarity, color, isotonicity, odor, sterility, stability, rate of dissolution or release, adsorption, or permeation of the composition (see REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18 Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company). In such embodiments, suitable formulation materials may include, but are not limited to, amino acids such as glycine, alanine, glutamine, asparagine, threonine, proline, 2-phenylalanine, including charged amino acids, preferably lysine, lysine acetate, arginine, glutamate and/or histidine;

противомикробные средства, такие как антибактериальные и противогрибковые средства;antimicrobial agents such as antibacterial and antifungal agents;

антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, метионин, сульфит натрия или гидросульфит натрия;antioxidants such as ascorbic acid, methionine, sodium sulfite or sodium hydrosulfite;

буферные агенты, буферные системы и буферные агенты, которые применяются для поддержания физиологического значения pH композиции или несколько более низкого значения pH, как правило, в диапазоне pH от около 5 до около 8 или 9; примерами буферных агентов являются борат, бикарбонат, трис-HCl, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты, сукцинат, фосфат, гистидин и ацетат;buffering agents, buffering systems and buffering agents that are used to maintain the physiological pH of the composition or a somewhat lower pH, typically in the pH range of about 5 to about 8 or 9; examples of buffering agents are borate, bicarbonate, tris-HCl, citrates, phosphates or other organic acids, succinate, phosphate, histidine and acetate;

- 36 042291 например, Трис-буфер с pH около 7,0-8,5, или ацетатный буфер с pH около 4,0-5,5;- 36 042291 for example, Tris buffer with a pH of about 7.0-8.5, or acetate buffer with a pH of about 4.0-5.5;

неводные растворители, такие как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат;non-aqueous solvents such as propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate;

водные носители, включая воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевые и буферные среды;aqueous vehicles, including water, alcoholic/aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffer media;

биоразлагаемые полимеры, такие как сложные полиэфиры;biodegradable polymers such as polyesters;

наполнители, такие как маннит или глицин;fillers such as mannitol or glycine;

хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА);chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA);

изотонические и абсорбирующие агенты;isotonic and absorbent agents;

комплексообразующие агенты, такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин);complexing agents such as caffeine, polyvinylpyrrolidone, beta-cyclodextrin or hydroxypropyl-beta-cyclodextrin);

наполнители;fillers;

моносахариды; дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины), углеводы могут быть невосстанавливающими сахарами, предпочтительно трегалозой, сахарозой, октасульфатом, сорбитом или ксилитом;monosaccharides; disaccharides and other carbohydrates (such as glucose, mannose or dextrins), carbohydrates may be non-reducing sugars, preferably trehalose, sucrose, octasulfate, sorbitol or xylitol;

(низкомолекулярные) белки, полипептиды или белковые носители, такие как человеческий или бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, предпочтительно человеческого происхождения;(low molecular weight) proteins, polypeptides or protein carriers such as human or bovine serum albumin, gelatin or immunoglobulins, preferably of human origin;

красители и ароматизаторы;dyes and flavors;

серосодержащие восстановители, такие как глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолят натрия, тиоглицерин, [альфа]-монотиоглицерин и тиосульфат натрия;sulfur reducing agents such as glutathione, thioctic acid, sodium thioglycolate, thioglycerol, [alpha]-monothioglycerol and sodium thiosulfate;

разбавители;diluents;

эмульгаторы;emulsifiers;

гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон;hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone;

солеобразующие противоионы, такие как натрий;salt-forming counterions such as sodium;

консерванты, такие как противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и т.п.; примерами являются бензалкония хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или пероксид водорода;preservatives such as antimicrobials, antioxidants, chelating agents, inert gases, and the like; examples are benzalkonium chloride, benzoic acid, salicylic acid, thimerosal, phenethyl alcohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidine, sorbic acid or hydrogen peroxide;

комплексы металлов, такие как Zn-белковые комплексы;metal complexes such as Zn-protein complexes;

растворители и сорастворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль);solvents and co-solvents (such as glycerin, propylene glycol or polyethylene glycol);

сахара и сахарные спирты, такие как трегалоза, сахароза, октасульфат, маннит, сорбит или ксилит, стахиоза, манноза, сорбоза, ксилоза, рибоза, миоинозитоза, галактоза, лактит, рибит, миоинозит, галактит, глицерин, циклитолы (например, инозит), полиэтиленгликоль; и многоатомные сахарные спирты;sugars and sugar alcohols such as trehalose, sucrose, octasulfate, mannitol, sorbitol or xylitol, stachyose, mannose, sorbose, xylose, ribose, myoinositose, galactose, lactitol, ribitol, myoinositol, galactitol, glycerol, cyclitols (e.g. inositol), polyethylene glycol; and polyhydric sugar alcohols;

суспендирующие агенты;suspending agents;

поверхностно-активные вещества или увлажняющие агенты, такие как плюроники, ПЭГ, сложные эфиры сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат, тритон, трометамин, лецитин, холестерин, тилоксапал; поверхностно-активные вещества могут быть детергентами, предпочтительно с молекулярной массой более чем 1,2 кДа и/или полиэфиром, предпочтительно с молекулярной массой более чем 3 кДа; неограничивающие примеры предпочтительных детергентов представляют собой Твин 20, Твин 40, Твин 60, Твин 80 и Твин 85; неограничивающими примерами предпочтительных полиэфиров являются ПЭГ 3000, ПЭГ 3350, ПЭГ 4000 и ПЭГ 5000;surfactants or wetting agents such as pluronics, PEGs, sorbitan esters, polysorbates such as polysorbate 20, polysorbate, triton, tromethamine, lecithin, cholesterol, tyloxapal; surfactants can be detergents, preferably with a molecular weight of more than 1.2 kDa and/or polyester, preferably with a molecular weight of more than 3 kDa; non-limiting examples of preferred detergents are Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 and Tween 85; non-limiting examples of preferred polyesters are PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 and PEG 5000;

агенты, улучшающие стабильность, такие как сахароза или сорбит;stability improving agents such as sucrose or sorbitol;

агенты, повышающие осмотическое давление, такие как галогениды щелочных металлов, предпочтительно натрия или калия хлорид, маннит, сорбит;osmotic agents such as alkali metal halides, preferably sodium or potassium chloride, mannitol, sorbitol;

основы для парентерального введения, включая раствор хлорида натрия, раствор Рингера с глюкозой, раствор глюкозы и хлорида натрия, растворы Рингера с лактатом или нелетучие масла;bases for parenteral administration, including sodium chloride solution, Ringer's solution with glucose, glucose and sodium chloride solution, Ringer's solutions with lactate or fixed oils;

основы для внутривенного введения, в том числе средства для восполнения жидкости и питательных веществ, средства для восполнения электролитов (например, на основе раствора Рингера с глюкозой).intravenous bases, including fluid and nutrient replenishers, electrolyte replenishers (eg, based on Ringer's solution with glucose).

Для специалистов в данной области техники будет очевидно, что различные компоненты фармацевтической композиции (например, перечисленные выше) могут оказывать различное влияние, например аминокислота может действовать как буфер, стабилизатор и/или антиоксидант; маннит может действовать как наполнитель и/или агент, повышающий осмотическое давление; хлорид натрия может действовать как основа для введения и/или агент, повышающий осмотическое давление; и т.п.It will be apparent to those skilled in the art that the various components of a pharmaceutical composition (eg, those listed above) may have different effects, for example, an amino acid may act as a buffer, stabilizer, and/or antioxidant; the mannitol may act as a bulking agent and/or an osmotic agent; sodium chloride can act as an injection base and/or an osmotic pressure increasing agent; and so on.

Предполагается, что композиция по изобретению может содержать, в дополнение к полипептиду по изобретению, определенному в данном документе, другие биологически активные агенты в зависимости от предполагаемого применения композиции. Такими агентами могут быть лекарственные средства, воздействующие на пищеварительную систему, лекарственные средства, действующие как цитостатические средства, лекарственные средства, предотвращающие гиперурикемию, лекарственные средства, подавляющие иммунные реакции (например, кортикостероиды), лекарственные средства, модулирующие воспалительный ответ, лекарственные средства, воздействующие на систему кровообращения и/или такиеIt is contemplated that the composition of the invention may contain, in addition to the polypeptide of the invention as defined herein, other biologically active agents, depending on the intended use of the composition. These agents may include drugs that act on the digestive system, drugs that act as cytostatics, drugs that prevent hyperuricemia, drugs that suppress immune responses (eg, corticosteroids), drugs that modulate the inflammatory response, drugs that act on circulatory system and/or such

- 37 042291 агенты, как известные в данной области техники цитокины. Кроме того, предполагается, что конструкция антитела по данному изобретению пригодна для комбинированной терапии, т.е., в сочетании с другим противораковым лекарственным средством.- 37 042291 agents known in the art as cytokines. Furthermore, the antibody construct of the present invention is expected to be suitable for combination therapy, ie, in combination with another anti-cancer drug.

В некоторых вариантах осуществления изобретения оптимальная фармацевтическая композиция будет определяться специалистом в данной области техники в зависимости, например, от предполагаемого способа введения, формата доставки и желаемой дозировки. См., например, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo конструкции антитела по изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения первичная основа или носитель в фармацевтической композиции может быть водным или неводным по своей природе. Например, подходящей основой или носителем может быть вода для инъекций, физиологический раствор хлорида натрия или искусственная спинномозговая жидкость, возможно, с добавлением других материалов, обычно применяемых в композициях для парентерального введения. Нейтральный буферный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином, представляют собой еще более типичные основы. В некоторых вариантах осуществления изобретения конструкция антитела по изобретению может быть приготовлена для хранения путем смешивания выбранной композиции с требуемой степенью чистоты с необязательными вспомогательными веществами (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, въше) в форме лиофилизированной таблетки или водного раствора. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения конструкция антитела по изобретению может быть составлена в виде лиофилизата с применением подходящих вспомогательных веществ, таких как сахароза.In some embodiments of the invention, the optimal pharmaceutical composition will be determined by a person skilled in the art depending on, for example, the intended route of administration, delivery format and desired dosage. See, for example, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. In some embodiments of the invention, such compositions can affect the physical state, stability, in vivo release rate, and in vivo clearance rate of an antibody construct of the invention. In some embodiments, the primary base or carrier in the pharmaceutical composition may be aqueous or non-aqueous in nature. For example, a suitable vehicle or carrier may be water for injection, saline sodium chloride solution, or artificial cerebrospinal fluid, optionally with the addition of other materials commonly used in parenteral compositions. Neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin are even more typical bases. In some embodiments, an antibody construct of the invention may be prepared for storage by mixing the selected composition, at the desired purity, with optional excipients (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) in the form of a lyophilized tablet or aqueous solution. In addition, in some embodiments, the antibody construct of the invention may be formulated as a lyophilisate using suitable excipients such as sucrose.

Если предполагается парентеральное введение, то терапевтические композиции для применения в данном изобретении могут быть представлены в виде апирогенного, подходящего для парентерального введения водного раствора, содержащего желаемую конструкцию антитела по изобретению в фармацевтически приемлемой основе. Особенно подходящим средством для парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная вода, в которой конструкция антитела по изобретению составлена в виде стерильного изотонического раствора, с надлежащими консервантами. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат может включать в себя препарат желаемой молекулы с агентом, таким как подходящие для инъекций микросферы, биоразлагаемые частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), шарики или липосомы, способные обеспечивать контролируемое или устойчивое высвобождение продукта, который может быть доставлен посредством инъекции депо. В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть дополнительно применена гиалуроновая кислота, которая влияет на продолжительность нахождения в кровотоке. В некоторых вариантах осуществления изобретения для введения желаемой конструкции антитела могут применяться имплантируемые устройства для доставки лекарственного средства.If parenteral administration is contemplated, then the therapeutic compositions for use in the present invention may be presented as a pyrogen-free, parenterally acceptable aqueous solution containing the desired antibody construct of the invention in a pharmaceutically acceptable base. A particularly suitable vehicle for parenteral injection is sterile distilled water in which the antibody construct of the invention is formulated as a sterile isotonic solution, with appropriate preservatives. In some embodiments, the formulation may include formulation of the desired molecule with an agent such as injectable microspheres, biodegradable particles, polymeric compounds (such as polylactic acid or polyglycolic acid), beads, or liposomes capable of providing a controlled or sustained release of the product, which can be delivered via depot injection. In some embodiments of the invention, hyaluronic acid can be additionally used, which affects the duration of stay in the bloodstream. In some embodiments, implantable drug delivery devices may be used to administer the desired antibody construct.

Для специалистов в данной области техники будут очевидны дополнительные фармацевтические композиции, в том числе препараты, содержащие конструкцию антитела по изобретению в препаратах с пролонгированной или контролируемой доставкой/высвобождением. Кроме того, специалистам в данной области техники известны способы разработки множества других средств пролонгированной или контролируемой доставки, таких как липосомные носители, биоразлагаемые микрочастицы или пористые шарики и инъекции депо. См., например, Международную патентную заявку № PCT/US93/00829, в которой описано контролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций. Препараты с пролонгированным высвобождением могут включать в себя полупроницаемые полимерные матрицы в форме профилированных изделий, например, пленок или микрокапсул. Матрицы с пролонгированным высвобождением могут включать в себя полиэфиры, гидрогели, полилактиды (как описано в патенте США № 3773919 и публикации Европейской патентной заявки № EP 058481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Е-глутамата (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2: 547-556), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Langer et al., 1981, J. Biomed, Mater. Res. 15: 167277 и Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), этиленвинилацетат (Langer et al., 1981, выше) или поли-О(-)3-гидроксимасляную кислоту (публикация Европейской патентной заявки № EP 133988). Кроме того, композиции с пролонгированным высвобождением могут включать в себя липосомы, которые могут быть получены любым из нескольких способов, известных в данной области техники. См., например, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-3692; Публикации Европейских патентных заявок №№ EP 036676; EP 088046 и EP 143949.Additional pharmaceutical compositions will be apparent to those skilled in the art, including formulations containing an antibody construct of the invention in sustained or controlled delivery/release formulations. In addition, many other sustained or controlled delivery means are known to those skilled in the art, such as liposome carriers, biodegradable microparticles or porous beads, and depot injections. See, for example, International Patent Application No. PCT/US93/00829 which describes the controlled release of porous polymeric microparticles for the delivery of pharmaceutical compositions. Extended release formulations may include semi-permeable polymeric matrices in the form of shaped articles such as films or microcapsules. Extended release matrices may include polyesters, hydrogels, polylactides (as described in US Pat. No. 3,773,919 and European Patent Application Publication No. EP 058481), copolymers of L-glutamic acid and gamma-ethyl-E-glutamate (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2: 547-556), poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Langer et al., 1981, J. Biomed, Mater. Res. 15: 167277 and Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105) , ethylene vinyl acetate (Langer et al., 1981, supra), or poly-O(-)3-hydroxybutyric acid (European Patent Application Publication No. EP 133988). In addition, sustained release formulations may include liposomes, which may be prepared by any of several methods known in the art. See, for example, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A. 82: 3688-3692; European Patent Application Publication Nos. EP 036676; EP 088046 and EP 143949.

Дополнительно конструкцию антитела можно захватывать в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или путем межфазной полимеризации (например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно), в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие методы раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).Additionally, the antibody construct can be captured in microcapsules prepared, for example, by coacervation or interfacial polymerization techniques (e.g., hydroxymethylcellulose or gelatin microcapsules and poly(methyl methacrylate) microcapsules, respectively), in colloidal drug delivery systems (e.g., liposomes, albumin microspheres, microemulsions). , nanoparticles and nanocapsules) or in macroemulsions. Such methods are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).

Фармацевтические композиции, применяемые для введения in vivo, обычно предоставляются в виде стерильных препаратов. Стерилизацию можно осуществлять путем фильтрации сквозь мембраны дляPharmaceutical compositions used for in vivo administration are generally provided as sterile preparations. Sterilization can be carried out by filtration through membranes for

- 38 042291 стерильной фильтрации. Если композицию лиофилизируют, то стерилизация с применением этого метода может быть проведена до или после лиофилизации и разведения. Композиции для парентерального введения могут храниться в лиофилизированной форме или в растворе. Композиции для парентерального введения обычно помещают в емкость, снабженную стерильным портом доступа, например, пакет для внутривенного раствора или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожной инъекции.- 38 042291 sterile filtration. If the composition is lyophilized, then sterilization using this method can be carried out before or after lyophilization and dilution. Compositions for parenteral administration may be stored in lyophilized form or in solution. Compositions for parenteral administration are usually placed in a container provided with a sterile access port, such as an intravenous solution bag or vial with a stopper pierceable by a hypodermic needle.

Другой аспект изобретения включает в себя самобуферизованную конструкцию антитела по изобретению, которая может быть применена в качестве фармацевтических композиций, как описано в международной патентной заявке WO 06138181A2 (PCT/US 2006/022599). Разнообразный выбор доступен в отношении материалов и способов для стабилизации и составления белка, подходящих в этом отношении, например, Arakawa et al., Solvent interactions in pharmaceutical formulations, Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., Physical stabilization of proteins in aqueous solution в: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002) и Randolph et al., Surfactant-protein interactions, Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), см., в частности, разделы, относящиеся к вспомогательным веществам и способам их получения для самобуферизованных белковых составов в соответствии с данным изобретением, особенно в отношении белковых фармацевтических продуктов и способов для ветеринарного и/или медицинского применения.Another aspect of the invention includes a self-buffered antibody construct of the invention which can be used as pharmaceutical compositions as described in International Patent Application WO 06138181A2 (PCT/US 2006/022599). A variety of choices are available regarding materials and methods for protein stabilization and formulation suitable in this regard, for example, Arakawa et al., Solvent interactions in pharmaceutical formulations, Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., Physical stabilization of proteins in aqueous solution in: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002) and Randolph et al., Surfactant-protein interactions, Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), see in particular sections relating to excipients and methods for their preparation for self-buffered protein formulations in accordance with this invention, especially in relation to protein pharmaceutical products and methods for veterinary and/or medical use. .

Соли могут применяться в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, например, для регулирования ионной силы и/или осмотического давления препарата и/или для улучшения растворимости и/или физической стабильности белка или другого ингредиента композиции в соответствии с изобретением. Как известно, ионы могут стабилизировать нативное состояние белков путем связывания с заряженными остатками на поверхности белка и путем экранирования заряженных и полярных групп в белке и снижения силы их электростатических взаимодействий, взаимодействий притяжения и отталкивания. Дополнительно, ионы могут стабилизировать денатурированное состояние белка путем связывания, в частности, с денатурированными пептидными связями (-CONH) белка. Кроме того, ионное взаимодействие с заряженными и полярными группами в белке может уменьшать межмолекулярные электростатические взаимодействия и тем самым предотвращать или уменьшать агрегацию белка и нерастворимость.Salts can be used in accordance with some embodiments of the invention, for example, to adjust the ionic strength and/or osmotic pressure of the drug and/or to improve the solubility and/or physical stability of the protein or other ingredient of the composition in accordance with the invention. As is known, ions can stabilize the native state of proteins by binding to charged residues on the protein surface and by shielding charged and polar groups in the protein and reducing the strength of their electrostatic interactions, interactions of attraction and repulsion. Additionally, the ions can stabilize the denatured state of the protein by binding, in particular, to the denatured peptide bonds (-CONH) of the protein. In addition, ionic interaction with charged and polar groups in a protein can reduce intermolecular electrostatic interactions and thereby prevent or reduce protein aggregation and insolubility.

Виды ионов значительно различаются по их воздействию на белки. Был разработан ряд категориальных ранжировок ионов и их влияния на белки, которые могут быть применены при разработке фармацевтических композиций в соответствии с изобретением. Одним из примеров является ряд Гофмейстера, в котором ионные и полярные неионные растворенные вещества ранжированы по их влиянию на конформационную стабильность белков в растворе. Стабилизирующие растворенные вещества называются космотропными. Дестабилизирующие растворенные вещества называются хаотропными. Космотропы обычно применяются в высоких концентрациях (например, больше чем 1 молярный сульфат аммония) для осаждения белков из раствора (высаливание). Хаотропы обычно применяются для денатурации и/или для солюбилизации белков (всаливание). Относительная эффективность ионов с точки зрения всаливания и высаливания определяет их положение в ряду Гофмейстера.Ion species vary considerably in their effect on proteins. A number of categorical rankings of ions and their effect on proteins have been developed that can be used in the development of pharmaceutical compositions in accordance with the invention. One example is the Hofmeister series, in which ionic and polar non-ionic solutes are ranked by their effect on the conformational stability of proteins in solution. Stabilizing solutes are called cosmotropic. Destabilizing solutes are called chaotropic. Cosmotropes are typically used at high concentrations (eg, greater than 1 molar ammonium sulfate) to precipitate proteins out of solution (salting out). Chaotropes are usually used for denaturation and/or solubilization of proteins (salting-in). The relative effectiveness of ions in terms of salting in and salting out determines their position in the Hofmeister series.

Свободные аминокислоты могут быть применены в препаратах конструкции антитела по изобретению в соответствии с различными вариантами осуществления изобретения в качестве наполнителей, стабилизаторов и антиоксидантов, а также для других стандартных целей. Лизин, пролин, серин и аланин могут быть применены для стабилизации белков в препарате. Глицин пригоден для лиофилизации, чтобы обеспечить правильную структуру и свойства таблетки. Аргинин может быть пригоден для подавления агрегации белка в жидких и лиофилизированных препаратах. Метионин пригоден в качестве антиоксиданта.Free amino acids can be used in formulations of the antibody construct of the invention in accordance with various embodiments of the invention as excipients, stabilizers, and antioxidants, as well as for other standard purposes. Lysine, proline, serine and alanine can be used to stabilize the proteins in the formulation. Glycine is suitable for lyophilization to ensure the correct structure and properties of the tablet. Arginine may be useful for inhibiting protein aggregation in liquid and lyophilized formulations. Methionine is useful as an antioxidant.

Полиолы включают в себя сахара, например маннит, сахарозу и сорбит, и многоатомные спирты, например, такие как глицерин и пропиленгликоль, и для целей данного документа также полиэтиленгликоль (ПЭГ) и родственные вещества. Полиолы являются космотропами. Они представляют собой подходящие стабилизирующие агенты как в жидких, так и в лиофилизированных препаратах для защиты белков от процессов физической и химической деградации. Кроме того, полиолы подходят для регулирования осмотического давления препаратов. Среди полиолов, пригодных для отдельных вариантов осуществления изобретения, маннит, обычно применяемый для обеспечения структурной стабильности таблетки в лиофилизированных препаратах. Он обеспечивает структурную стабильность таблетки. Обычно его применяют с лиопротектором, например, сахарозой. Сорбитол и сахароза являются одними из предпочтительных агентов для регулирования осмотического давления и в качестве стабилизаторов для защиты от стрессов, связанных с замораживанием-оттаиванием во время транспортировки или подготовки балка в ходе производственного процесса. Восстанавливающие сахара (содержащие свободные альдегидные или кетоновые группы), такие как глюкоза и лактоза, могут гликировать поверхностные остатки лизина и аргинина. Поэтому они обычно не входят в число предпочтительных полиолов для применения в соответствии с изобретением. Кроме того, сахара, которые образуют такие реакционноспособные вещества, такие как сахароза, которая в кислых условиях гидролизуется до фруктозы и глюкозы и, следовательно, вызывают гликирование, также не входят в число предпочтительных в этом отношении полиолов по изо- 39 042291 бретению. ПЭГ пригоден для стабилизации белков и в качестве криопротектора и в этом отношении может применяться в изобретении.Polyols include sugars such as mannitol, sucrose and sorbitol, and polyhydric alcohols such as glycerol and propylene glycol, and for the purposes of this document also polyethylene glycol (PEG) and related substances. Polyols are cosmotropes. They are suitable stabilizing agents in both liquid and lyophilized formulations to protect proteins from physical and chemical degradation processes. In addition, polyols are suitable for regulating the osmotic pressure of formulations. Among the polyols suitable for certain embodiments of the invention is mannitol, commonly used to provide structural stability to the tablet in lyophilized preparations. It provides structural stability to the tablet. It is usually used with a lyoprotectant, such as sucrose. Sorbitol and sucrose are among the preferred agents for regulating osmotic pressure and as stabilizers to protect against freeze-thaw stresses during transport or beam preparation during the manufacturing process. Reducing sugars (containing free aldehyde or ketone groups), such as glucose and lactose, can glycate surface lysine and arginine residues. Therefore, they are generally not among the preferred polyols for use in accordance with the invention. In addition, sugars which form reactive species such as sucrose, which hydrolyzes to fructose and glucose under acidic conditions and hence causes glycation, are also not among the preferred polyols of the invention in this respect. PEG is useful for stabilizing proteins and as a cryoprotectant, and in this regard can be used in the invention.

Варианты препаратов конструкции антитела по изобретению дополнительно содержат поверхностно-активные вещества. Молекулы белка могут быть восприимчивы к адсорбции на поверхностях и денатурации с последующей агрегацией на границах воздуха-жидкости, твердого вещества-жидкости и жидкости-жидкости. Масштаб этих эффектов обычно обратно пропорционален концентрации белка. Масштаб таких вредных взаимодействий обычно обратно пропорционален концентрации белка, причем они обычно усугубляются физическим перемешиванием, например, возникающим во время транспортировки и обращения с продуктом. Поверхностно-активные вещества обычно применяются для предотвращения, минимизации или уменьшения адсорбции на поверхности. Подходящие в этом отношении поверхностноактивные вещества по изобретению включают в себя полисорбат 20, полисорбат 80, другие сложные эфиры жирных кислот и полиэтоксилатов сорбитана и полоксамер 188. Кроме того, поверхностноактивные вещества обычно применяются для контроля конформационной стабильности белка. Применение поверхностно-активных веществ в этом отношении специфично для белка, поскольку любое конкретное поверхностно-активное вещество обычно стабилизирует некоторые белки и дестабилизирует другие.Variant formulations of the antibody construct of the invention further comprise surfactants. Protein molecules may be susceptible to adsorption to surfaces and denaturation followed by aggregation at air-liquid, solid-liquid, and liquid-liquid interfaces. The magnitude of these effects is usually inversely proportional to protein concentration. The magnitude of such adverse interactions is usually inversely proportional to protein concentration, and they are usually exacerbated by physical agitation, such as occurs during transport and handling of the product. Surfactants are typically used to prevent, minimize, or reduce adsorption to a surface. Suitable surfactants of the invention include polysorbate 20, polysorbate 80, other fatty acid esters of sorbitan polyethoxylates, and poloxamer 188. In addition, surfactants are commonly used to control protein conformational stability. The use of surfactants in this regard is specific to the protein, since any particular surfactant will generally stabilize some proteins and destabilize others.

Полисорбаты восприимчивы к окислительной деградации и часто поставляются содержащими достаточное количество пероксидов, чтобы вызвать окисление боковых цепей остатков белка, особенно метионина. Следовательно, полисорбаты следует применять с осторожностью, а в случае их применения следует применять наименьшую эффективную концентрацию. В этом отношении полисорбаты представляют общее правило, согласно которому вспомогательные вещества следует применять в наименьших эффективных концентрациях.Polysorbates are susceptible to oxidative degradation and are often supplied containing sufficient peroxides to cause oxidation of the side chains of protein residues, especially methionine. Therefore, polysorbates should be used with caution and, if used, the lowest effective concentration should be used. In this regard, polysorbates represent the general rule that excipients should be used at the lowest effective concentrations.

Варианты препаратов конструкции антитела по изобретению дополнительно содержат один или большее количество антиоксидантов. Вредное окисление белков в фармацевтических композициях в определенной степени можно предотвратить, поддерживая надлежащие уровни кислорода в окружающей среде и температуру и избегая воздействия света. Кроме того, антиоксидантные вспомогательные вещества могут применяться для предотвращения окислительной деградации белков. Среди полезных в этом отношении антиоксидантов восстановители, поглотители кислорода/свободных радикалов и хелатирующие агенты. Антиоксиданты для применения в композициях терапевтических белков в соответствии с изобретением предпочтительно являются водорастворимыми и сохраняют свою активность на протяжении всего срока годности продукта. В этом отношении ЭДТА является предпочтительным антиоксидантом в соответствии с изобретением. Антиоксиданты могут повреждать белки. Например, восстанавливающие агенты, в частности, такие как глутатион, могут разрывать внутримолекулярные дисульфидные связи. Таким образом, антиоксиданты для применения в изобретении отбираются, среди прочего, с тем, чтобы устранить или в достаточной степени уменьшить вероятность того, что они сами повредят белки в препарате.Variant formulations of the antibody construct of the invention further comprise one or more antioxidants. Harmful oxidation of proteins in pharmaceutical compositions can be prevented to a certain extent by maintaining appropriate ambient oxygen levels and temperatures and avoiding exposure to light. In addition, antioxidant excipients can be used to prevent oxidative degradation of proteins. Antioxidants useful in this regard include reducing agents, oxygen/free radical scavengers, and chelating agents. Antioxidants for use in therapeutic protein compositions according to the invention are preferably water soluble and retain their activity throughout the shelf life of the product. In this regard, EDTA is the preferred antioxidant according to the invention. Antioxidants can damage proteins. For example, reducing agents such as glutathione in particular can break intramolecular disulfide bonds. Thus, the antioxidants for use in the invention are selected, among other things, to eliminate or sufficiently reduce the likelihood that they themselves will damage the proteins in the formulation.

Композиции в соответствии с изобретением могут содержать ионы металлов, которые являются кофакторами белка и которые необходимы для образования координационных комплексов белка, такие как цинк, необходимый для образования некоторых суспензий инсулина. Кроме того, ионы металлов могут подавлять некоторые процессы, в результате которых происходит деградация белка. Однако ионы металлов также катализируют физические и химические процессы, в результате которых происходит деградация белка. Ионы магния (10-120 мМ) могут применяться для подавления изомеризации аспарагиновой кислоты в изоаспарагиновую кислоту. Ионы Ca+2 (до 100 мМ) могут повысить стабильность дезоксирибонуклеазы человека. Однако Mg+2, Mn+2 и Zn+2, могут дестабилизировать рекомбинантную человеческую ДНКазу (rhDNase). Аналогично, Ca+2 и Sr+2 могут стабилизировать фактор VIII, который может быть дестабилизирован Mg+2, Mn+2 и Zn+2, Cu+2 и Fe+2, а его агрегация может быть усилена ионами Al+3. Варианты препаратов конструкции антитела по изобретению содержат также один или большее количество консервантов. Консерванты необходимы при разработке многодозовых препаратов для парентерального применения, которые предусматривают более одного извлечения из одной и той же емкости. Их основная функция заключается в подавлении роста микроорганизмов и обеспечении стерильности продукта на протяжении всего срока хранения или срока применения лекарственного продукта. Обычно применяемые консерванты включают в себя бензиловый спирт, фенол и м-крезол. Хотя консерванты имеют долгую историю применения в низкомолекулярных средствах для парентерального применения, разработка белковых препаратов, содержащих консерванты, может быть сложной задачей. Консерванты почти всегда оказывают дестабилизирующее воздействие (агрегация) на белки, и это стало основным фактором, ограничивающим их применения в многодозовых препаратах белка. На сегодняшний день большинство белковых лекарственных средств составлено только для одноразового применения. Однако, если возможны многодозовые препараты, у них есть дополнительное преимущество, обеспечивающее удобство для пациента и повышенную конкурентоспособность. Хорошим примером является гормон роста человека (hGH), для которого разработка препаратов с консервантами привела к коммерциализации более удобных, многоразовых инъекционных форм в виде ручки. В настоящее время на рынке доступно по меньшей мере четыре таких устройства в виде ручки, содержащие препараты hGH с консерван- 40 042291 тами. Norditropin (жидкий, Novo Nordisk), Nutropin AQ (жидкий, Genentech) & Genotropin (лиофилизированный-двухкамерный картридж, Pharmacia & Upjohn) содержат фенол, тогда как Somatrope (Eli Lilly) составлен с м-крезолом. При составлении и разработке лекарственных форм с консервантами необходимо учитывать несколько аспектов. Эффективная концентрация консерванта в лекарственном продукте должна быть оптимизирована. Это требует тестирования конкретного консерванта в лекарственной форме с диапазонами концентраций, которые обеспечивают противомикробное действие без ущерба для стабильности белка.Compositions according to the invention may contain metal ions which are protein cofactors and which are necessary for the formation of protein coordination complexes, such as zinc which is necessary for the formation of certain insulin suspensions. In addition, metal ions can inhibit some of the processes that result in protein degradation. However, metal ions also catalyze the physical and chemical processes that result in protein degradation. Magnesium ions (10-120 mM) can be used to suppress the isomerization of aspartic acid to isoaspartic acid. Ions Ca +2 (up to 100 mm) can increase the stability of human deoxyribonuclease. However, Mg +2 , Mn +2 and Zn +2 can destabilize recombinant human DNase (rhDNase). Similarly, Ca +2 and Sr +2 can stabilize factor VIII, which can be destabilized by Mg +2 , Mn +2 and Zn +2 , Cu +2 and Fe +2 and its aggregation can be enhanced by Al +3 ions. Variant formulations of the antibody construct of the invention also contain one or more preservatives. Preservatives are essential in the development of multi-dose parenteral formulations that involve more than one extraction from the same container. Their main function is to inhibit the growth of microorganisms and ensure the sterility of the product throughout the entire period of storage or use of the medicinal product. Commonly used preservatives include benzyl alcohol, phenol and m-cresol. Although preservatives have a long history of use in small molecule parenteral formulations, the development of preservative-containing protein formulations can be challenging. Preservatives almost always have a destabilizing effect (aggregation) on proteins, and this has become a major factor limiting their use in multi-dose protein preparations. To date, most protein drugs are formulated for single use only. However, if multi-dose formulations are possible, they have the added benefit of providing patient convenience and increased competitiveness. A good example is human growth hormone (hGH), for which the development of preparations with preservatives has led to the commercialization of more convenient, reusable pen-shaped injectables. There are currently at least four such pen-shaped devices available on the market containing hGH preparations with preservatives. Norditropin (liquid, Novo Nordisk), Nutropin AQ (liquid, Genentech) & Genotropin (lyophilized-two-chamber cartridge, Pharmacia & Upjohn) contain phenol, while Somatrope (Eli Lilly) is formulated with m-cresol. When formulating and developing dosage forms with preservatives, several aspects must be considered. The effective concentration of the preservative in the drug product must be optimized. This requires testing a specific preservative in a dosage form with concentration ranges that provide antimicrobial activity without compromising protein stability.

Как и следовало ожидать, разработка жидких препаратов, содержащих консерванты, более сложна, чем лиофилизированных препаратов. Лиофилизированные продукты можно лиофилизировать без консерванта и разводить разбавителем, содержащим консервант, во время применения. Это сокращает время, в течение которого консервант контактирует с белком, что значительно минимизирует связанные с этим риски для стабильности. При применении жидких препаратов эффективность и стабильность консерванта должны сохраняться в течение всего срока хранения продукта (приблизительно от 18 до 24 месяцев). Важно отметить, что эффективность консерванта должна быть продемонстрирована в конечном препарате, содержащем активное лекарственное средство и все вспомогательные компоненты.As might be expected, the development of liquid formulations containing preservatives is more complex than lyophilized formulations. Freeze-dried products can be freeze-dried without preservative and diluted with a preservative-containing diluent at the time of use. This reduces the time the preservative is in contact with the protein, greatly minimizing the associated stability risks. When using liquid preparations, the effectiveness and stability of the preservative must be maintained throughout the shelf life of the product (approximately 18 to 24 months). It is important to note that the effectiveness of the preservative must be demonstrated in the final formulation containing the active drug and all excipients.

Дополнительно конструкции антител, описанные в данном изобретении, могут быть составлены в виде иммунолипосом. Липосома представляет собой небольшую везикулу, состоящую из различных видов липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, подходящую для введения лекарственного средства млекопитающему. Компоненты липосомы обычно располагаются в двухслойном пласте, аналогично расположению липидов биологических мембран. Липосомы, содержащие конструкцию антитела, получают способами, известными в данной области техники, такими как описано в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); патенты США №№ 4485045 и 4544545; и WO 97/38731. Липосомы с увеличенным временем нахождения в кровотоке описаны в патенте США № 5013556. Особенно подходящие липосомы могут быть получены методом обращенно-фазового испарения с липидной композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и дериватизированный фосфатидилэтаноламин ПЭГ, ПЭГ-ФЭ (PEG-РЕ). Липосомы экструдируют сквозь фильтры с определенным размером пор, чтобы получить липосомы требуемого диаметра. Фрагменты Fab' конструкции антитела по данному изобретению могут быть конъюгированы с липосомами, как описано в Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982), посредством введения в реакцию дисульфидного обмена. В липосоме необязательно содержится химиотерапевтическое средство (См. Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)).Additionally, the antibody constructs described herein can be formulated as immunoliposomes. A liposome is a small vesicle composed of various kinds of lipids, phospholipids and/or a surfactant suitable for administering a drug to a mammal. The components of a liposome are usually arranged in a bilayer sheet, similar to the arrangement of lipids in biological membranes. Liposomes containing the antibody construct are prepared by methods known in the art, such as those described in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. sci. USA 77: 4030 (1980); US Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545; and WO 97/38731. Liposomes with extended circulation time are described in US Pat. No. 5,013,556. Particularly suitable liposomes can be prepared by reverse phase evaporation with a lipid composition containing phosphatidylcholine, cholesterol and derivatized phosphatidylethanolamine PEG, PEG-PE (PEG-PE). Liposomes are extruded through filters of a certain pore size to obtain liposomes of the required diameter. Fab' fragments of an antibody construct of the invention can be conjugated to liposomes as described in Martin et al. J Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) by introducing a disulfide exchange into the reaction. The liposome optionally contains a chemotherapeutic agent (See Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)).

После того, как фармацевтическая композиция была составлена, ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества, кристалла или в виде обезвоженного или лиофилизированного порошка. Такие препараты могут храниться в готовой к употреблению форме или в форме (например, лиофилизированной), которую разводят перед введением.Once a pharmaceutical composition has been formulated, it can be stored in sterile vials as a solution, suspension, gel, emulsion, solid, crystal, or as a dehydrated or lyophilized powder. Such formulations may be stored in a ready-to-use form or in a form (eg, lyophilized) that is reconstituted prior to administration.

Биологическая активность фармацевтической композиции, определенной в данном изобретении, может быть определена, например, в анализе цитотоксичности, как описано в следующих примерах, в WO 99/54440 или Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother., 20 (2005), 1-12). Эффективность или эффективность in vivo, как используется в данном документе, относится к реакции на терапию фармацевтической композицией по изобретению, оцененной с применением, например, стандартизированных критериев ответа Национального Института рака, НИР (NCI). Эффективность или эффективность in vivo терапии с применением фармацевтической композиции по изобретению относится к эффективности композиции по прямому назначению, т.е., к способности композиции вызывать желаемый эффект, т.е., истощение патологических клеток, например опухолевых клеток. Эффективность in vivo можно контролировать при помощи проверенных стандартных методов для соответствующих нозологических единиц, в том числе, но не ограничиваясь этим, при помощи подсчета лейкоцитов, дифференциалов, сортировки клеток с активированной флуоресценцией, аспирации костного мозга. Дополнительно могут использоваться различные, специфические для заболевания показатели клинической химии и другие проверенные стандартные методы. Кроме того, могут быть применены компьютерная томография, рентгеновская томография, ядерная магнитно-резонансная томография (например, для оценки ответа на основе критериев Национального Института рака [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4): 1244]), сканирующая позитронно-эмиссионная томография, подсчет количества лейкоцитов, дифференциалы, сортировка клеток с активированной флуоресценцией, аспирация костного мозга, биопсия/гистология лимфатических узлов и различные показатели клинической химии, специфические для лимфомы (например, лактатдегидрогеназа), и другие проверенные стандартные методы.The biological activity of the pharmaceutical composition defined in this invention can be determined, for example, in the analysis of cytotoxicity, as described in the following examples, in WO 99/54440 or Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother., 20 (2005), 1-12). Efficacy or in vivo efficacy, as used herein, refers to response to therapy with a pharmaceutical composition of the invention as assessed using, for example, National Cancer Institute, NCI (NCI) standardized response criteria. The efficacy or in vivo efficacy of a therapy using a pharmaceutical composition of the invention refers to the efficacy of the composition for its intended purpose, i.e., the ability of the composition to produce the desired effect, i.e., the depletion of pathological cells, such as tumor cells. In vivo efficacy can be monitored using validated standard methods for appropriate entities including, but not limited to, leukocyte counts, differentials, fluorescence-activated cell sorting, bone marrow aspiration. In addition, various disease-specific clinical chemistries and other validated standard methods can be used. In addition, computed tomography, X-ray tomography, nuclear magnetic resonance imaging (for example, to assess response based on the criteria of the National Cancer Institute [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA , Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP Report of an international workshop to standardize response criteria for non - Hodgkin's lymphomas NCI Sponsored International Working Group J Clin Oncol 1999 Apr;17(4): 1244]), scanning positron emission tomography, leukocyte count, differentials, fluorescence-activated cell sorting, bone marrow aspiration, biopsy/ lymph node histology and various lymphoma-specific clinical chemistries (eg, lactate dehydrogenase) and other validated standard methods.

Другой важной задачей при разработке лекарственных средств, таких как фармацевтическая композиция по изобретению, является предсказуемая модуляция фармакокинетических свойств. С этой целью может быть установлен фармакокинетический профиль потенциального лекарственного средства, т.е., профиль фармакокинетических показателей, которые влияют на способность конкретного лекарственно- 41 042291 го средства лечить данное состояние. Фармакокинетические показатели лекарственного средства, влияющие на способность лекарственного средства лечить определенное заболевание, включают в себя, но не ограничиваясь этим: период полувыведения, объем распределения, пресистемный метаболизм в печени и степень связывания с сывороткой крови. Каждый из указанных выше показателей может влиять на эффективность конкретного лекарственного агента.Another important issue in drug development, such as the pharmaceutical composition of the invention, is the predictable modulation of pharmacokinetic properties. To this end, a pharmacokinetic profile of a potential drug can be established, ie, a profile of pharmacokinetic parameters that affect the ability of a particular drug to treat a given condition. Pharmacokinetic parameters of a drug that affect the ability of a drug to treat a particular disease include, but are not limited to: half-life, volume of distribution, first pass metabolism in the liver, and degree of serum binding. Each of the above indicators can affect the effectiveness of a particular drug agent.

Период полувыведения означает время, за которое 50% вводимого лекарственного средства элиминируется посредством биологических процессов, например, метаболизма, экскреции и т.д. Под пресистемным метаболизмом в печени подразумевается склонность лекарственного средства метаболизироваться при первом контакте с печенью, т.е., во время первого прохождения через печень. Объем распределения означает степень удерживания лекарственного средства во всех биологических купе организма, таких как, например, внутриклеточные и внеклеточные пространства, ткани и органы и т.д., а также распределение препарата в этих биологических купе. Степень связывания с сывороткой крови означает склонность лекарственного средства к взаимодействию с белками сыворотки крови и его связывание с белками сыворотки крови, такими как альбумин, что приводит к снижению или потере биологической активности лекарственного средства.Half-life refers to the time during which 50% of an administered drug is eliminated through biological processes such as metabolism, excretion, etc. By first pass metabolism in the liver is meant the propensity of a drug to be metabolized upon first contact with the liver, i.e., during the first passage through the liver. The volume of distribution means the degree of retention of the drug in all biological compartments of the body, such as, for example, intracellular and extracellular spaces, tissues and organs, etc., as well as the distribution of the drug in these biological compartments. The degree of serum binding refers to the propensity of a drug to interact with serum proteins and bind to serum proteins such as albumin, resulting in a reduction or loss of the biological activity of the drug.

Кроме того, фармакокинетические параметры включают в себя биодоступность, латентный период (Tlag), Tmax, скорость абсорбции, в большей степени момент начала действия и/или Cmax для данного количества вводимого лекарственного средства. Биодоступность означает количество лекарственного средства в биологическом купе крови. Латентный период означает временную задержку между введением лекарственного средства и его обнаружением и измеримостью в крови или плазме. Tmax представляет собой время, в течение которого достигается максимальная концентрация лекарственного средства в крови, а Cmax представляет собой максимальную концентрацию в крови, полученную при применении данного лекарственного средства. На время достижения концентрации лекарственного средства в крови или ткани, которая требуется для его биологического действия, влияют все показатели. Фармакокинетические параметры конструкций биспецифических антител, проявляющих перекрестно-видовую специфичность, которые могут быть определены в доклиническом тестировании на животных у приматов, не относящихся к шимпанзе, как описано выше, дополнительно изложены, например, в публикации Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother., 20 (2005), 1-12).In addition, pharmacokinetic parameters include bioavailability, latency period (Tlag), Tmax, rate of absorption, to a greater extent the time of onset of action and/or Cmax for a given amount of drug administered. Bioavailability refers to the amount of a drug in the biological blood compartment. Latent period refers to the time delay between administration of a drug and its detection and measurability in blood or plasma. Tmax is the time during which the maximum concentration of the drug in the blood is reached, and Cmax is the maximum concentration in the blood obtained with the use of this drug. All indicators affect the time to reach the concentration of the drug in the blood or tissue, which is required for its biological action. Pharmacokinetic parameters of cross-species specific bispecific antibody constructs that can be determined in preclinical animal testing in non-chimpanzee primates as described above are further set forth, for example, in Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother., 20 (2005), 1-12).

Один вариант осуществления изобретения предусматривает конструкцию антитела по изобретению или конструкцию антитела, полученную в соответствии со способом по изобретению, для применения при предупреждении, лечении или облегчении состояния при опухоли или раковом заболевании или метастатическом раковом заболевании.One embodiment of the invention provides an antibody construct of the invention, or an antibody construct prepared according to the method of the invention, for use in the prevention, treatment, or amelioration of a tumor or cancer or metastatic cancer.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения указанная опухоль или раковое заболевание представляет собой заболевание в форме солидной опухоли.According to a preferred embodiment of the invention, said tumor or cancer is a disease in the form of a solid tumor.

Препараты, описанные в данном документе изобретения, пригодны в качестве фармацевтических композиций при лечении, улучшении и/или предупреждении патологического медицинского состояния, как описано в данном изобретении, у пациента, нуждающегося в этом. Термин лечение относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Лечение включает в себя применение или введение препарата в организм, выделенную ткань или клетку пациента, у которого присутствует заболевание/расстройство, симптом заболевания/расстройства или предрасположенность к заболеванию/расстройству, с целью излечения, лечения, смягчения, облегчения, модификации, устранения, улучшения, ослабления или влияния на заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию.The formulations described herein are useful as pharmaceutical compositions in the treatment, amelioration and/or prevention of a medical condition as described herein in a patient in need thereof. The term treatment refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventive measures. Treatment involves the use or administration of a drug into the body, isolated tissue, or cell of a patient who has a disease/disorder, a symptom of a disease/disorder, or a predisposition to a disease/disorder, for the purpose of curing, curing, alleviating, alleviating, modifying, eliminating, ameliorating , weakening or affecting a disease, a symptom of a disease, or a predisposition to a disease.

Как используется в данном изобретении, термин улучшение относится к любому улучшению состояния при заболевании у пациента с опухолью или раком или метастатическим раком, как указано в данном документе ниже, путем введения конструкции антитела согласно изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. Такое улучшение дополнительно можно рассматривать как замедление или остановку прогресса опухоли или рака или метастатического рака у пациента. Как используется в данном изобретении, термин предупреждение означает предотвращение возникновения или рецидива у пациента с опухолью или раком или метастатическим раком, как указано в данном документе ниже, путем введения конструкции антитела в соответствии с изобретением субъекту, нуждающемуся в этом.As used herein, the term improvement refers to any improvement in disease in a patient with a tumor or cancer or metastatic cancer, as defined herein below, by administering an antibody construct of the invention to a subject in need thereof. Such an improvement can further be considered as slowing or stopping the progress of a tumor or cancer or metastatic cancer in a patient. As used herein, the term prevention means preventing the occurrence or recurrence of a patient with a tumor or cancer or metastatic cancer as defined herein below by administering an antibody construct according to the invention to a subject in need thereof.

Термин заболевание относится к любому состоянию, при котором лечение описанной в данном изобретении конструкцией антитела или фармацевтической композицией могло бы принести пользу. Это включает в себя хронические и острые расстройства или заболевания, включая те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому заболеванию.The term disease refers to any condition that would benefit from treatment with an antibody construct or pharmaceutical composition as described herein. This includes chronic and acute disorders or diseases, including those pathological conditions which predispose the mammal to the disease in question.

Новообразование представляет собой аномальный рост ткани, обычно, но не всегда образующей опухолевое образование. Если также образуется опухолевое образование, его обычно называют опухолью. Новообразования или опухоли могут быть доброкачественными, потенциально злокачественными (предраковыми) или злокачественными. Злокачественные новообразования обычно называют раком. Они обычно вторгаются и разрушают окружающую ткань и могут образовывать метастазы, т.е. они распространяются на другие части, ткани или органы организма. Следовательно, термин метастатический рак включает в себя метастазы в другие ткани или органы, кроме исходной опухоли. Лимфомы и лейкозыA neoplasm is an abnormal growth of tissue, usually but not always forming a tumor. If a tumor also forms, it is usually referred to as a tumour. Neoplasms or tumors can be benign, potentially malignant (precancerous), or malignant. Malignant neoplasms are commonly referred to as cancer. They usually invade and destroy surrounding tissue and may form metastases, i.e. they spread to other parts, tissues, or organs of the body. Therefore, the term metastatic cancer includes metastases to tissues or organs other than the original tumor. Lymphomas and leukemias

- 42 042291 представляют собой лимфоидные новообразования. Для целей данного изобретения они также включены в термины опухоль или рак.- 42 042291 are lymphoid neoplasms. For the purposes of this invention, they are also included in the terms tumor or cancer.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения опухолевое или раковое заболевание представляет собой заболевание в форме солидной опухоли и метастатическое раковое заболевание, происходящее из вышеперечисленных.In a preferred embodiment, the tumor or cancer disease is a solid tumor disease and a metastatic cancer derived from the above.

Предпочтительные опухолевые или раковые заболевания в связи с данным изобретением выбраны из группы, состоящей из рака молочной железы, карциноида, рака шейки матки, рака колоректального отдела, рака эндометрия, рака желудка, рака головы и шеи, мезотелиомы, рака печени, рака легких, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака кожи, рака почек и рака желудка. Более предпочтительно опухолевое или раковое заболевание, которое предпочтительно является заболеванием в форме солидной опухоли, может быть выбрано из группы, состоящей из рака яичников, рака поджелудочной железы, мезотелиомы, рака легких, рака желудка и тройного отрицательного рака молочной железы. Метастатическое раковое заболевание может происходить из любого из вышеперечисленных.Preferred neoplastic or cancerous diseases in connection with this invention are selected from the group consisting of breast cancer, carcinoid, cervical cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, gastric cancer, head and neck cancer, mesothelioma, liver cancer, lung cancer, cancer ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, skin cancer, kidney cancer and stomach cancer. More preferably, the neoplastic or cancerous disease, which is preferably a solid tumor disease, may be selected from the group consisting of ovarian cancer, pancreatic cancer, mesothelioma, lung cancer, gastric cancer, and triple negative breast cancer. Metastatic cancer may be from any of the above.

Кроме того, изобретение относится к способу лечения или облегчения опухоли или онкологического заболевания или метастатического ракового заболевания, включающему стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, конструкции антитела по изобретению или конструкции антитела, полученной в соответствии со способом по изобретению.In addition, the invention relates to a method of treating or alleviating a tumor or oncological disease or metastatic cancer, comprising the step of administering to a subject in need thereof, an antibody construct of the invention or an antibody construct obtained in accordance with the method of the invention.

Термины субъект, нуждающийся в этом или нуждающиеся в лечении включают в себя тех, у кого уже присутствует расстройство, а также тех, у кого это расстройство должно быть предотвращено. Субъект, нуждающийся в этом, или пациент, включает в себя человека и других млекопитающих субъектов, которые получают профилактическое или терапевтическое лечение.The terms subject in need or in need of treatment include those who already have the disorder as well as those in whom the disorder is to be prevented. The subject in need thereof, or patient, includes human and other mammalian subjects who are receiving prophylactic or therapeutic treatment.

Конструкция антитела по изобретению, как правило, предназначена для конкретных путей и способов введения, для конкретных дозировок и частоты введения, для конкретного лечения конкретных заболеваний, с диапазонами биологической доступности и устойчивости, среди прочего. Материалы композиции предпочтительно составлены в концентрациях, приемлемых для места введения.The antibody design of the invention is generally designed for specific routes and routes of administration, for specific dosages and frequencies of administration, for specific treatment of specific diseases, with ranges of bioavailability and resistance, among others. The materials of the composition are preferably formulated in concentrations suitable for the site of administration.

Таким образом, препараты и композиции могут быть разработаны в соответствии с изобретением для введения любым подходящим способом введения. В контексте данного изобретения способы введения включают в себя, но не ограничиваясь этим, местные способы (такие как накожный, ингаляционный, назальный, офтальмологический, аурикулярный/ушной, вагинальный, на слизистую оболочку);Thus, preparations and compositions can be designed in accordance with the invention for administration by any suitable route of administration. In the context of this invention, routes of administration include, but are not limited to, topical routes (such as dermal, inhalation, nasal, ophthalmic, auricular/auricular, vaginal, mucosal);

энтеральные способы (такие как пероральный, гастроинтестинальный, сублингвальный, сублабиальный, буккальный, ректальный) и парентеральные способы (такие как внутривенный, внутриартериальный, внутрикостный, внутримышечный, внутримозговой, интрацеребровентрикулярный, эпидуральный, интратекальный, подкожный, внутрибрюшинный, экстраамниотический, внутрисуставный, внутрисердечный, внутрикожный, внутриочаговый, внутриматочный, внутрипузырный, интравитреальный, трансдермальный, интраназальный, трансмукозальный, внутрисуставной, интралюминальный).enteral routes (such as oral, gastrointestinal, sublingual, sublabial, buccal, rectal); and parenteral routes (such as intravenous, intraarterial, intraosseous, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular, epidural, intrathecal, subcutaneous, intraperitoneal, extraamniotic, intraarticular, intracardiac, intradermal intralesional, intrauterine, intravesical, intravitreal, transdermal, intranasal, transmucosal, intraarticular, intraluminal).

Фармацевтические композиции и конструкция антитела по данному изобретению особенно пригодны для парентерального введения, например, подкожного или внутривенного введения, например, путем инъекции, такой как инъекция болюса, или путем инфузии, такой как непрерывная инфузия. Фармацевтические композиции можно вводить с применением медицинского устройства. Примеры медицинских устройств для введения фармацевтических композиций описаны в патентах США №№ 4475196; 4439196; 4447224; 4447233; 4486194; 4487603; 4596556; 4790824; 4941880; 5064413; 5312335; 5312335; 5383851; и 5399163.Pharmaceutical compositions and antibody constructs of this invention are particularly suitable for parenteral administration, such as subcutaneous or intravenous administration, for example, by injection, such as bolus injection, or by infusion, such as continuous infusion. Pharmaceutical compositions can be administered using a medical device. Examples of medical devices for administering pharmaceutical compositions are described in US Pat. Nos. 4,475,196; 4439196; 4447224; 4447233; 4486194; 4487603; 4596556; 4790824; 4941880; 5064413; 5312335; 5312335; 5383851; and 5399163.

В частности, в данном изобретении предложен непрерывное введение подходящей композиции. В качестве неограничивающего примера непрерывное или практически непрерывное, т.е., длительное введение, может быть реализовано при помощи небольшой насосной системы, которую носит пациент, для измерения притока терапевтического агента в организм пациента. Фармацевтическую композицию, содержащую конструкцию антитела по изобретению, можно вводить с применением указанных насосных систем. Такие насосные системы обычно известны в данной области техники и обычно предполагают периодическую замену картриджей, содержащих терапевтический агент для введения. При замене картриджа в такой насосной системе может произойти временное прерывание в противном случае непрерывного потока терапевтического агента в организм пациента. В таком случае фаза введения перед заменой картриджа и фаза введения после замены картриджа все еще будут рассматриваться в значении фармацевтических средств и способов согласно изобретению, вместе составляющих одно непрерывное введение такого терапевтического агента.In particular, the present invention provides for the continuous administration of a suitable composition. As a non-limiting example, continuous or substantially continuous, i.e., prolonged administration, can be achieved using a small pump system worn by the patient to measure the influx of the therapeutic agent into the patient's body. A pharmaceutical composition containing an antibody construct of the invention may be administered using said pumping systems. Such pumping systems are generally known in the art and typically involve the periodic replacement of cartridges containing the therapeutic agent to be administered. When replacing a cartridge in such a pumping system, a temporary interruption of the otherwise uninterrupted flow of the therapeutic agent to the patient may occur. In such a case, the administration phase before the cartridge change and the administration phase after the cartridge change will still be considered in the sense of the pharmaceutical agents and methods of the invention together constituting one continuous administration of such a therapeutic agent.

Непрерывное или беспрерывное введение конструкций антител по изобретению может осуществляться внутривенно или подкожно посредством устройства для введения жидкости или небольшой насосной системы, оснащенной механизмом подачи жидкости, который выводит жидкость из резервуара, и пусковым механизмом для приведения в действие механизма для подачи. Системы насосов для подкожного введения могут быть оборудованы иглой или канюлей для проникновения сквозь кожу пациента иContinuous or uninterrupted administration of the antibody constructs of the invention may be administered intravenously or subcutaneously via a fluid delivery device or a small pumping system equipped with a fluid delivery mechanism that draws fluid out of a reservoir and a trigger to actuate the delivery mechanism. Subcutaneous pump systems can be equipped with a needle or cannula to penetrate the patient's skin and

- 43 042291 введения подходящей композиции в организм пациента. Указанные насосные системы могут быть непосредственно закреплены или прикреплены к коже пациента независимо от вены, артерии или кровеносного сосуда, тем самым обеспечивая прямой контакт между насосной системой и кожей пациента. Насосная система может быть прикреплена к коже пациента в течение периода от 24 ч до нескольких дней. Насосная система может быть небольшого размера с резервуаром для небольших объемов. В качестве неограничивающего примера, объем резервуара для подходящей фармацевтической композиции для введения может составлять от 0,1 до 50 мл.- 43 042291 introduction of a suitable composition into the patient's body. Said pumping systems can be directly fixed or affixed to the patient's skin independently of a vein, artery or blood vessel, thereby providing direct contact between the pumping system and the patient's skin. The pump system may be attached to the patient's skin for a period of 24 hours to several days. The pumping system can be small in size with a reservoir for small volumes. As a non-limiting example, the volume of the reservoir for a suitable pharmaceutical composition for administration may be from 0.1 to 50 ml.

Кроме того, непрерывное введение может осуществляться трансдермально при помощи пластыря, закрепленного на коже и периодически заменяемого. Специалисту в данной области техники известны системы пластырей для доставки лекарственных средств, подходящие для этой цели. Следует отметить, что трансдермальное введение особенно подходит для непрерывного введения, поскольку замена первого израсходованного пластыря может быть успешно произведена одновременно с размещением нового второго пластыря, например, на поверхности кожи, непосредственно примыкающей к первому израсходованному пластырю, и непосредственно перед удалением первого израсходованного пластыря. Не возникает проблем с прерыванием потока или сбоем элемента питания.In addition, continuous administration can be carried out transdermally using a patch attached to the skin and periodically replaced. One skilled in the art will be aware of drug delivery patch systems suitable for this purpose. It should be noted that transdermal administration is particularly suitable for continuous administration, since the replacement of the first expended patch can be successfully performed simultaneously with the placement of a new second patch, for example, on the surface of the skin immediately adjacent to the first expended patch, and immediately before the removal of the first expended patch. There are no problems with flow interruption or battery failure.

Если фармацевтическая композиция лиофилизирована, то лиофилизированный материал сначала разводят в соответствующей жидкости перед введением. Лиофилизированный материал может быть разведен, например, в бактериостатической воде для инъекций, БВИ (BWFI), физиологическом растворе, фосфатно-солевом буфере, ФСБ (PBS) или в том же препарате, что и белок до лиофилизации.If the pharmaceutical composition is lyophilized, then the lyophilized material is first diluted in an appropriate liquid prior to administration. The lyophilized material can be reconstituted, for example, in bacteriostatic water for injection, BVI (BWFI), saline, phosphate buffered saline, PBS, or in the same preparation as the protein prior to lyophilization.

Композиции по данному изобретению можно вводить субъекту в подходящей дозе, которая может быть определена, например, путем исследований с повышением дозы при введения увеличивающихся доз конструкции антитела по изобретению, которая проявляет перекрестно-видовую специфичность, описанной в данном изобретении, приматам, не относящимся к шимпанзе, например, макаку. Как указано выше, конструкция антитела по изобретению, проявляющая перекрестно-видовую специфичность, описанная в данном изобретении, преимущественно может быть применена в идентичной форме при доклиническом тестировании на приматах, не относящимся к шимпанзе, и в качестве лекарственного средства у человека. Схема введения будет определяться лечащим врачом и клиническими факторами. Как известно в области медицины, дозы для любого конкретного пациента зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное вводимое соединение, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые параллельно.Compositions of the invention may be administered to a subject at a suitable dose, which can be determined, for example, by dose escalation studies with increasing doses of an antibody construct of the invention that exhibits cross-species specificity as described herein to non-chimpanzee primates. e.g. macaque. As indicated above, the cross-species specific antibody construct of the invention described herein can advantageously be used in identical form in preclinical testing in non-chimpanzee primates and as a drug in humans. The administration schedule will be determined by the attending physician and clinical factors. As known in the medical field, dosages for any particular patient depend on many factors, including patient size, body surface area, age, particular compound administered, sex, time and route of administration, general health, and other drugs administered concomitantly.

Термин эффективная доза или эффективная дозировка определяется как количество, достаточное для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения желаемого эффекта. Термин терапевтически эффективная доза определяется как количество, достаточное для излечения или, по меньшей мере, частичной остановки заболевания и его осложнений у пациента, уже страдающего этим заболеванием. Количества или дозы, эффективные для такого применения, будут зависеть от состояния, подлежащего лечению (показание), вводимой конструкции антитела, терапевтического контекста и целей, тяжести заболевания, предшествующей терапии, анамнеза пациента и реакции на терапевтический агент, способа введения, размера (масса тела, поверхность тела или размер органа) и/или состояния (возраст и общее состояние здоровья) пациента, а также общего состояния собственной иммунной системы пациента. Надлежащая доза может быть скорректирована по решению лечащего врача, таким образом, что ее можно вводить пациенту один раз или в виде серии доз и до достижения оптимального терапевтического эффекта.The term effective dose or effective dosage is defined as an amount sufficient to achieve or at least partially achieve the desired effect. The term therapeutically effective dose is defined as an amount sufficient to cure or at least partially arrest a disease and its complications in a patient already suffering from the disease. Amounts or doses effective for such use will depend on the condition being treated (indication), antibody construct administered, therapeutic context and goals, disease severity, prior therapy, patient history and response to the therapeutic agent, route of administration, size (body weight , body surface or organ size) and/or condition (age and general health) of the patient, as well as the general condition of the patient's own immune system. The appropriate dose may be adjusted at the discretion of the attending physician so that it may be administered to the patient once or in a series of doses until the optimum therapeutic effect is achieved.

Типичная доза может варьироваться от около 0,1 мкг/кг до около 30 мг/кг или более, в зависимости от факторов, указанных выше. В конкретных вариантах осуществления изобретения доза может варьироваться от 1,0 мкг/кг до примерно 20 мг/кг, необязательно, от 10 мкг/кг до около 10 мг/кг или от 100 мкг/кг до около 5 мг/кг.A typical dose may vary from about 0.1 μg/kg to about 30 mg/kg or more, depending on the factors noted above. In specific embodiments, the dosage may vary from 1.0 μg/kg to about 20 mg/kg, optionally from 10 μg/kg to about 10 mg/kg, or from 100 μg/kg to about 5 mg/kg.

Терапевтически эффективное количество конструкции антитела по изобретению предпочтительно приводит к снижению тяжести симптомов заболевания, увеличению частоты или продолжительности периодов без симптомов заболевания или предотвращению ухудшения или инвалидности вследствие заболевания. При лечении опухолей, экспрессирующих МЗЛН (MSLN), терапевтически эффективное количество конструкции антитела по изобретению, например, конструкции антитела против МЗЛН (MSLN)/против КД3 (CD3), предпочтительно подавляет рост клеток или рост опухоли по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80% или по меньшей мере около 90% относительно нелеченных пациентов. Способность соединения подавлять рост опухоли можно оценить на животной модели, позволяющей прогнозировать эффективность в отношении опухолей человека.A therapeutically effective amount of an antibody construct of the invention preferably results in a reduction in the severity of the symptoms of the disease, an increase in the frequency or duration of periods without symptoms of the disease, or the prevention of aggravation or disability due to the disease. In the treatment of MSLN-expressing tumors, a therapeutically effective amount of an antibody construct of the invention, e.g., an anti-MSLN (MSLN)/anti-CD3 (CD3) antibody construct, preferably inhibits cell growth or tumor growth by at least about 20%, by at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, or at least about 90% relative to untreated patients. The ability of a compound to inhibit tumor growth can be evaluated in an animal model to predict efficacy in human tumors.

Фармацевтическую композицию можно вводить в качестве монотерапии или, при необходимости, в сочетании с дополнительными терапевтическими средствами, такими как противораковые терапевтические средства, например, другие белковые и небелковые препараты. Эти лекарственные средства можно вводить одновременно с композицией, содержащей конструкцию антитела по изобретению, как определено в данном изобретении, или по отдельности, до или после введения указанной конструкции антитеThe pharmaceutical composition can be administered as monotherapy or, if necessary, in combination with additional therapeutic agents, such as anti-cancer therapeutics, for example, other proteinaceous and non-proteinaceous drugs. These drugs can be administered simultaneously with a composition containing an antibody construct of the invention as defined herein, or separately, before or after administration of said antibody construct.

- 44 042291 ла, в пределах определенных промежутков и доз.- 44 042291 la, within certain intervals and doses.

Как используется в данном изобретении, термин эффективная и нетоксичная доза относится к переносимой дозе конструкции антитела по изобретению, которая достаточно высока, чтобы вызвать истощение патологических клеток, ликвидацию опухоли, уменьшение размера опухоли или стабилизацию заболевания без или по существу без значительных токсических эффектов. Такие эффективные и нетоксичные дозы могут быть определены, например, в исследованиях с повышением дозы, описанных в данной области техники, и должны быть ниже дозы, вызывающей серьезные побочные эффекты (ограничивающая дозу токсичность, ОДТ (DLT)).As used herein, the term effective and non-toxic dose refers to a tolerated dose of an antibody construct of the invention that is high enough to cause depletion of pathological cells, eradication of a tumor, reduction in tumor size, or stabilization of a disease without or substantially without significant toxic effects. Such effective and non-toxic doses can be determined, for example, in dose escalation studies described in the art, and should be below the dose that causes serious side effects (dose-limiting toxicity, DLT (DLT)).

Как используется в данном изобретении, термин токсичность относится к токсическому воздействию препарата, проявляющемуся побочными эффектами или тяжелыми побочными эффектами. Такие побочные эффекты могут относиться к непереносимости препарата в целом и/или к местной непереносимости после введения. Кроме того, токсичность может включать в себя тератогенный или канцерогенный эффект лекарственного средства.As used in this invention, the term toxicity refers to the toxic effect of a drug, manifested by side effects or severe side effects. Such side effects may relate to drug intolerance in general and/or local intolerance after administration. In addition, toxicity may include the teratogenic or carcinogenic effect of the drug.

Термины безопасность, безопасность in vivo или переносимость, как они используются в данном документе, определяют введение лекарственного средства, которое не вызывает тяжелых побочных эффектов непосредственно после введения (местная переносимость) и в течение периода последующего наблюдения препарата. Безопасность, безопасность in vivo или переносимость можно оценивать, например, через регулярные промежутки времени в ходе лечения и в течение периода наблюдения. Показатели включают в себя клиническую оценку, например, проявления со стороны органов, и скрининг на предмет отклонений лабораторных показателей. Может быть проведена клиническая оценка, и отклонения от нормальных результатов, зарегистрированы/классифицированы в соответствии со стандартами Общих критериев токсичности Национального института рака, ОКТ-НИР (NCI-CTC) и/или Медицинского словаря регуляторной деятельности, МСРД (MedDRA). Проявления со стороны органов могут включать в себя такие критерии, как аллергия/иммунология, кровь/костный мозг, сердечная аритмия, коагуляция и т.п., как указано, например, в Общих критериях терминологии для побочных эффектов версии 3.0, ОКТПЭ (CTCAE). Лабораторные показатели, которые могут быть проверены, включают в себя, например, гематологию, клиническую химию, профиль коагуляции, анализ мочи и исследование других жидкостей организма, таких как сыворотка, плазма, лимфоидная или спинномозговая жидкость, ликвор и т.п. Таким образом, безопасность может быть оценена, например, путем медицинского осмотра, методами визуализации (например, ультразвуковым, рентгенографическим, компьютерной томографией, магнитно-резонансной томографией, MPT (MRI), другими способами с применением технических устройств (например, электрокардиограмма), по основным показателям жизнедеятельности, путем измерения лабораторных показателей и регистрации побочных эффектов Например, побочные эффекты у приматов, не относящихся к шимпанзе, при применении и в способах согласно изобретению могут быть исследованы гистопатологическими и/или гистохимическими методами.The terms safety, in vivo safety, or tolerability, as used herein, define administration of a drug that does not cause severe side effects immediately after administration (local tolerance) and during the follow-up period of the drug. Safety, in vivo safety or tolerability can be assessed, for example, at regular intervals during treatment and during the observation period. Indicators include clinical evaluation, such as organ manifestations, and screening for laboratory abnormalities. Clinical evaluation can be performed and abnormalities recorded/classified according to the National Cancer Institute's General Toxicity Criteria, OCT-NIR (NCI-CTC) and/or Medical Regulatory Dictionary, MedDRA. Organ manifestations may include criteria such as allergy/immunology, blood/bone marrow, cardiac arrhythmias, coagulation, etc., as specified, for example, in the Common Terminology Criteria for Adverse Effects Version 3.0, CTCAE . Laboratory values that may be tested include, for example, hematology, clinical chemistry, coagulation profile, urinalysis, and examination of other body fluids such as serum, plasma, lymphoid or cerebrospinal fluid, cerebrospinal fluid, and the like. Thus, safety can be assessed, for example, by physical examination, imaging techniques (e.g. ultrasound, radiography, computed tomography, magnetic resonance imaging, MPT (MRI), other methods using technical devices (e.g. electrocardiogram), according to the main vital signs, by measuring laboratory parameters and reporting side effects. For example, side effects in non-chimpanzee primates with the use and methods of the invention can be investigated by histopathological and/or histochemical methods.

Кроме того, вышеуказанные термины упоминаются, например, в Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived Pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997.In addition, the above terms are mentioned, for example, in Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived Pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997.

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к набору, содержащему конструкцию антитела по изобретению, конструкцию антитела, полученную в соответствии со способом по изобретению, полинуклеотид по изобретению, вектор по изобретению и/или клетку-хозяина по изобретению.In a further embodiment, the invention relates to a kit containing an antibody construct of the invention, an antibody construct prepared according to the method of the invention, a polynucleotide of the invention, a vector of the invention, and/or a host cell of the invention.

В контексте данного изобретения термин набор означает два или большее количество компонентов, один из которых соответствует конструкции антитела, фармацевтической композиции, вектору или клетке-хозяину по изобретению, совместно упакованных в емкость-реципиент или иначе. Таким образом, набор можно описать как набор продуктов и/или емкостей, достаточных для достижения определенной цели, который может продаваться как единое целое.In the context of this invention, the term kit means two or more components, one of which corresponds to the antibody construct, pharmaceutical composition, vector or host cell of the invention, packaged together in a recipient container or otherwise. Thus, a set can be described as a set of products and/or containers sufficient to achieve a certain purpose, which can be sold as a whole.

Набор может содержать один или большее количество реципиентов (таких как флаконы, ампулы, емкости, шприцы, бутыли, пакеты) любой подходящей формы, размера и из любого подходящего материала (предпочтительно водонепроницаемого, например, пластик или стекло), содержащие конструкцию антитела или фармацевтическую композицию по данному изобретению в соответствующей дозировке для введения (см. выше). Набор может дополнительно содержать указания по применению (например, в виде брошюры или инструкции по применению), средства для введения конструкции антитела по данному изобретению, такие как шприц, насос, инфузор и т.п., средства для разведения конструкции антитела по изобретению и/или средства для разведения конструкции антитела по изобретению.The kit may contain one or more recipients (such as vials, ampoules, containers, syringes, bottles, bags) of any suitable shape, size, and of any suitable material (preferably waterproof, such as plastic or glass) containing the antibody construct or pharmaceutical composition. according to this invention in the appropriate dosage for administration (see above). The kit may additionally contain instructions for use (for example, in the form of a brochure or instructions for use), means for administering the antibody construct of this invention, such as a syringe, pump, infusor, etc., means for reconstituting the antibody construct of the invention, and/ or means for diluting an antibody construct of the invention.

Кроме того, в изобретении предложены наборы для модуля одноразового введения. Набор по изобретению может дополнительно содержать первый реципиент, содержащий сухую/лиофилизированную конструкцию антитела, и второй реципиент, содержащий водный препарат. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предложены комплекты, содержащие предварительно заполненные однокамерные и многокамерные шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).In addition, the invention provides kits for a single injection module. The kit of the invention may further comprise a first recipient containing a dry/lyophilized antibody construct and a second recipient containing an aqueous formulation. In some embodiments, implementation of the present invention proposed kits containing pre-filled single-chamber and multi-chamber syringes (eg, syringes with liquid and syringes with lyophilisate).

На чертежах проиллюстрированы:The drawings show:

Фиг. 1: Схематическое представление химеры МЗЛН (MSLN) человека-мыши. Химера МЗЛНFig. 1: Schematic representation of the MSLN chimera (MSLN) human-mouse. Chimera MZLN

- 45 042291 (MSLN) была сгенерирована с 6-мя различными обменами на протяжении последовательности от МЗЛН (MSLN) человека к мыши. Соответствующие варианты экспрессированы на поверхности клонов клеток- 45 042291 (MSLN) was generated with 6 different exchanges throughout the human-to-mouse MSLN sequence. The corresponding variants are expressed on the surface of cell clones.

ЯКХ (CHO) (E1-E6) (см. Пример 1).YKH (CHO) (E1-E6) (see Example 1).

Фиг. 2: Перекрестная реактивность конструкций антител против МЗЛН (MSLN) по данным проточной цитометрии: связывание с МЗЛН (MSLN) и КД3 (CD3) человека и макака (см. Пример 4).Fig. 2: Cross-reactivity of anti-MSLN antibody constructs (MSLN) by flow cytometry: binding to human and macaque MSLN and CD3 (see Example 4).

Фиг. 3: Анализ конструкций антител против МЗЛН (MSLN) методом проточной цитометрии: связывание с вариантами v2 и v6 человека (см. Пример 4).Fig. 3: Analysis of anti-MSLN antibody constructs (MSLN) by flow cytometry: binding to human variants v2 and v6 (see Example 4).

Фиг. 4: Активность перенацеливания конструкциями биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) стимулированных CD8+ эффекторных T-клеток человека против трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO), измеренная в 18-часовом анализе высвобождения 51Cr (соотношение эффектора к мишени 10:1).Fig. 4: Retargeting activity of anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs of stimulated human CD8+ effector T cells against transfected human MSLN (MSLN) NCC (CHO) cells measured in an 18-hour 51 Cr release assay (effector to targets 10:1).

Фиг. 5: Активность перенацеливания конструкциями биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) стимулированных CD8+ эффекторных T-клеток человека против МЗЛН (MSLN)положительного OVCAR-8, измеренная в 18-часовом анализе с высвобождением 51Cr (соотношение эффектора к мишени 10:1).Fig. 5: Retargeting activity of anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs stimulated human CD8+ effector T cells against MDLN (MSLN) positive OVCAR-8 measured in an 18-hour assay with 51 Cr release (effector to target ratio 10 :1).

Фиг. 6: Активность перенацеливания конструкциями биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) T-клеток в нестимулированных МКПК (PBMC) человека (CD147CD56) против трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) в отсутствие и в присутствии растворимого МЗЛН (MSLN), измеренная в 48-часовом анализе цитотоксичности на основе СКАФ (FACS) (соотношение эффектора к мишени 10:1).Fig. 6: Retargeting activity of bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) T-cell antibody constructs in unstimulated human PBMC (CD147CD56) against transfected human MSLN (MSLN) CHO cells in the absence and presence of soluble MDLN ( MSLN) measured in a 48-hour SCAF-based cytotoxicity assay (FACS) (effector to target ratio 10:1).

Фиг. 7: Активность перенацеливания конструкциями биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) T-клеток в нестимулированных МКПК (PBMC) человека (CD147CD56) против МЗЛН (MSLN)-положительной клеточной линии человека OVCAR-8, измеренная в 48-часовом анализе цитотоксичности на основе СКАФ (FACS).Fig. 7: Retargeting activity of bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) T-cell antibody constructs in unstimulated human PBMC (CD147CD56) against the MSLN (MSLN)-positive human cell line OVCAR-8 measured in a 48-hour assay SCAF-based cytotoxicity (FACS).

Фиг. 8: Подтверждение способности перекрестно реагирующих конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) перенацеливать T-клетки макака против трансфектированных МЗЛН (MSLN) макака клеток ЯКХ (CHO) в 48-часовом анализе цитотоксичности на основе СКАФ (FACS), проведенное с применением линии T-клеток макака LnPx4119 в качестве эффекторных T-клеток (соотношение эффектора к мишени 10:1).Fig. 8: Confirmation of the ability of cross-reactive anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs to retarget macaque T cells against transfected MSLN (MSLN) macaque YCC (CHO) cells in a 48-hour SCAF-based cytotoxicity (FACS) assay performed using the macaque T cell line LnPx4119 as effector T cells (effector to target ratio 10:1).

Фиг. 9: Зазор активности между мономерной и димерной изоформами конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) при перенацеливании T-клеток в стимулированных CD8+ человека эффекторных T-клетках против трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO), измеренный в 18-часовом анализе высвобождения 51Cr (соотношение эффектора к мишени 10:1).Fig. 9: Gap of activity between monomeric and dimeric isoform constructs of bispecific antibodies against MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) when retargeting T cells in stimulated human CD8+ effector T cells against transfected MSLN (MSLN) human HCC (CHO) cells measured in 18 hour 51 Cr release assay (effector to target ratio 10:1).

Фиг. 10: Стабильность конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) после инкубации в течение 96 ч в плазме крови человека. 18-часовой анализ на основе 51Cr. Эффекторные клетки: стимулированные обогащенные CD8 T-клетки человека. Клетки-мишени: трансфектированные hu МЗЛН (MSLN) клетки ЯКХ (CHO). Соотношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням (Э:М): 10:1. BiTE, как указано.Fig. 10: Stability of bispecific antibody constructs against MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) after incubation for 96 hours in human plasma. 18 hour analysis based on 51 Cr. Effector cells: stimulated human CD8 enriched T cells. Target cells: transfected hu MSLN (MSLN) cells YAKH (CHO). The ratio of effector cells to target cells (E:M): 10:1. BiTE as stated.

Фиг. 11: Гомогенность белка для конструкций антител по изобретению, проанализированная при помощи высокоэффективной катионообменной хроматографии, КОХ (CIEX).Fig. 11: Protein homogeneity for antibody constructs of the invention analyzed by high performance cation exchange chromatography, KOX (CIEX).

Фиг. 12: Поверхностная гидрофобность конструкций биспецифических антител по изобретению, проанализированная при помощи хроматографии с гидрофобным взаимодействием, ХГВ (HIC) в проточном режиме.Fig. 12: Surface hydrophobicity of the bispecific antibody constructs of the invention as analyzed by hydrophobic interaction chromatography, CHB (HIC) in flow mode.

Фиг. 13: Превращение мономера в димер после трех циклов замораживания/оттаивания.Fig. 13: Monomer to dimer conversion after three freeze/thaw cycles.

Фиг. 14: Превращение мономера в димер после 7 дней инкубации с концентрацией 250 мкг/мл.Fig. 14: Monomer to dimer conversion after 7 days of incubation at 250 µg/ml.

Фиг. 15: Оценка независимой от мишени активации T-клеток конструкциями антител против Мезотелина, МЗ (MS) HLE BiTE®. 2(a) конструкция антитела по изобретению в 48-часовом анализе активации с МКПК (PBMC) человека (3x); HLE Bite ® серийные разведения (начиная с 20 нМ; 1:5, 7x плюс холостой); без или с блокировкой FcR [10 мг/мл huIgG (Kiovog, Baxter)]; определение при помощи СКАФ (FACS) экспрессии CD69 и CD25 [не показано] на CD4+ , CD8+ T-клетках. 2 (b) Конструкция антитела гетеро-Fc в 48-часовом анализе активации с МКПК (PBMC) человека и обедненными CD14+/CD33+ клетками МКПК (PBMC) (3x); HLEBite ® серийные разведения (начиная с 20 нМ; 1:5, 7x плюс холостой); определение при помощи СКАФ (FACS) экспрессии CD69 и CD25 [не показано] на CD4+, CD8+ T-клетках.Fig. 15: Evaluation of target-independent T-cell activation by anti-Mesothelin, MH (MS) HLE BiTE® antibody constructs. 2(a) construction of an antibody of the invention in a 48 hour human PBMC activation assay (3x); HLE Bite® serial dilutions (starting at 20 nM; 1:5, 7x plus blank); without or with FcR blocking [10 mg/mL huIgG (Kiovog, Baxter)]; determination using SCAF (FACS) expression of CD69 and CD25 [not shown] on CD4+, CD8+ T-cells. 2 (b) Hetero-Fc antibody construct in a 48-hour activation assay with human PBMCs and CD14+/CD33+-depleted PBMCs (3x); HLEBite® serial dilutions (starting at 20 nM; 1:5, 7x plus blank); determination using SCAF (FACS) expression of CD69 and CD25 [not shown] on CD4+, CD8+ T-cells.

Фиг. 16: Оценка независимой от мишени активации T-клеток конструкциями антител против CDH19 HLE BiTE®. 3 (a) конструкция антитела по изобретению в 48-часовом анализе активации с МКПК (PBMC) человека (3x); HLE Bite ® серийные разведения (начиная с 20 нМ; 1:5, 7x плюс холостой); без или с блокировкой FcR [10 мг/мл huIgG (Kiovog, Baxter)]; определение при помощи СКАФ (FACS) экспрессии CD69 и CD25 [не показано] на CD4+ , CD8+ T-клетках. 3 (b) Конструкция антитела гетеро-Fc в 48-часовом анализе активации с МКПК (PBMC) человека и обедненными CD14+/CD33+ клет- 46 042291 ками МКПК (PBMC) (3x); HLEBite ® серийные разведения (начиная с 20 нМ; 1:5, 7x плюс холостой); определение при помощи СКАФ (FACS) экспрессии CD69 и CD25 [не показано] на CD4+, CD8+ Tклетках. 3 (c) Конструкция X-тела в 48-часовом анализе активации с МКПК (PBMC) человека и обедненными CD14+/CD33+ клетками МКПК (PBMC) (3x); HLEBite ® серийные разведения (начиная с 20 нМ; 1:5, 7x плюс холостой); определение при помощи СКАФ (FACS) экспрессии CD69 и CD25 [не показано] на CD4+, CD8+ T-клетках.Fig. 16: Evaluation of target-independent T-cell activation by anti-CDH19 HLE BiTE® antibody constructs. 3 (a) construct of an antibody of the invention in a 48 hour human PBMC activation assay (3x); HLE Bite® serial dilutions (starting at 20 nM; 1:5, 7x plus blank); without or with FcR blocking [10 mg/mL huIgG (Kiovog, Baxter)]; determination using SCAF (FACS) expression of CD69 and CD25 [not shown] on CD4+, CD8+ T-cells. 3 (b) Hetero-Fc antibody construct in a 48-hour activation assay with human PBMC and CD14+/CD33+ depleted PBMC cells (3x); HLEBite® serial dilutions (starting at 20 nM; 1:5, 7x plus blank); determination using SCAF (FACS) expression of CD69 and CD25 [not shown] on CD4 + , CD8 + T cells. 3 (c) X-body construction in a 48-hour activation assay with human PBMCs and CD14+/CD33+ cell-depleted PBMCs (3x); HLEBite® serial dilutions (starting at 20 nM; 1:5, 7x plus blank); determination using SCAF (FACS) expression of CD69 and CD25 [not shown] on CD4 + , CD8 + T-cells.

Фиг. 17: Связывание с комплементом C1q химерных конструкций антител BiTE® Fc. Химерными конструкциями антител BiTE® Fc (BiTE® одноцепочечный Fc (треугольник), BiTE® гетеро Fc (квадраты), канонический BiTE ® (круг)) покрывали планшет Maxisorp (в серийных разведениях) перед инкубацией с объединенной в пул сывороткой человека и инкубацией с поликлональным мышиным антителом против CC1q человека, визуализируемым при помощи конъюгатом козьего анти-мышиного Fc-AP.Fig. 17: Complement binding C1q of chimeric BiTE® Fc antibody constructs. BiTE® Fc chimeric antibody constructs (BiTE® single chain Fc (triangle), BiTE® hetero Fc (squares), canonical BiTE® (circle)) were coated on a Maxisorp plate (at serial dilutions) prior to incubation with pooled human serum and incubation with polyclonal a mouse anti-human CC1q antibody visualized with a goat anti-mouse Fc-AP conjugate.

Фиг. 18: Средние фармакокинетические, ФК (PK) профили для четырех пар химерных белков BiTE®-HLE после однократного введения яванским макакам. Из соображений сопоставимости концентрации в сыворотке были нормализованы на дозу до 15 мкг/кг и указаны в нмоль.Fig. 18: Mean pharmacokinetic, PK (PK) profiles for four pairs of BiTE®-HLE chimeric proteins after a single administration to cynomolgus monkeys. For reasons of comparability, serum concentrations have been normalized to doses up to 15 µg/kg and are reported in nmol.

Фиг. 19: Средние ФК (PK) профили для пяти различных конструкций антител BiTE®, каждая из которых слита с фрагментом scFc, увеличивающим период полувыведения. Из соображений сопоставимости концентрации в сыворотке были нормализованы на дозу до 15 мкг/кг и указаны в нмоль.Fig. 19: Mean PK (PK) profiles for five different BiTE® antibody constructs, each fused to an scFc fragment that increases half-life. For reasons of comparability, serum concentrations have been normalized to doses up to 15 µg/kg and are reported in nmol.

ПримерыExamples

Следующие примеры иллюстрируют изобретение. Эти примеры не должны толковаться как ограничивающие объем данного изобретения. Данное изобретение ограничивается только формулой изобретения.The following examples illustrate the invention. These examples are not to be construed as limiting the scope of the present invention. This invention is limited only by the claims.

Пример 1. Генерация клеток CHO, экспрессирующих МЗЛН (MSLN) дикого типа и химерныйExample 1 Generation of wild-type and chimeric MSLN-expressing CHO cells

Антиген МЗЛН (MSLN) можно разделить на шесть различных субдоменов или участков, которые определены для целей примеров 1 и 2. Аминокислотная, ак (aa) последовательность этих шести субдоменов представлена в SEQ ID NO: 238-243.The MSLN antigen (MSLN) can be divided into six different subdomains or regions, which are defined for the purposes of examples 1 and 2. The amino acid, aa (aa) sequence of these six subdomains is shown in SEQ ID NOS: 238-243.

Были получены следующие молекулы; см. также фиг. 1:The following molecules were obtained; see also FIG. 1:

hu orl МЗЛН (MSLN)-E1 mu SEQ ID NO: 246 hu orl МЗЛН (mSLn)-E2 mu SEQ ID NO: 247 hu orl МЗЛН (MSLN)-E3 mu SEQ ID NO: 248 hu orl МЗЛН (MSLN)-E4 mu SEQ ID NO: 249 hu orl МЗЛН (mSLn)-E5 mu SEQ ID NO: 250 hu orl МЗЛН (MSLN)-E6 mu SEQ ID NO: 251 hu orl МЗЛН (MSLN)-полноразмерный человеческий SEQ ID NO: 231hu orl MSLN (MSLN)-E1 mu SEQ ID NO: 246 hu orl MSLN (mSLn)-E2 mu SEQ ID NO: 247 hu orl MSLN (MSLN)-E3 mu SEQ ID NO: 248 hu orl MSLN (MSLN)-E4 mu SEQ ID NO: 249 hu orl MSLN (mSLn)-E5 mu SEQ ID NO: 250 hu orl MSLN (MSLN)-E6 mu SEQ ID NO: 251 hu orl MSLN (MSLN)-full length human SEQ ID NO: 231

Для получения клеток ЯКХ (CHO), экспрессирующих МЗЛН (MSLN) человека, яванского макака (яванца) и укороченный N-концевой МЗЛН (MSLN) с маркером V5 на N-конце, соответствующие кодирующие последовательности для MSLN (МЗЛН) человека (SEQ ID NO: 231, см. также учетный номер GeneBank NM_005823), МЗЛН (MSLN) яванского макака (SEQ ID NO: 234, см. LMR C52457) и шесть химерных версий МЗЛН (MSLN) человека/мыши (см. выше) клонируют в плазмиду, обозначенную pEFDHFR (pEF-DHFR описана в Raum et al., Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Для экспрессии на клеточной поверхности МЗЛН (MSLN) человека и яванца применяют исходный сигнальный пептид. Все процедуры клонирования выполняют в соответствии со стандартными протоколами (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Для каждой конструкции соответствующую плазмиду трансфектируют в ДГФР (DHFR)-дефицитные клетки ЯКХ (CHO) для эукариотической экспрессии, как описано Kaufman RJ (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566.To generate CHO cells expressing human MSLN, cynomolgus monkey and truncated N-terminal MSLN (MSLN) with a V5 marker at the N-terminus, the corresponding coding sequences for human MSLN (SEQ ID NO : 231, see also GeneBank accession number NM_005823), the cynomolgus macaque MSLN (SEQ ID NO: 234, see LMR C52457) and six human/mouse chimeric MSLNs (see above) were cloned into a plasmid, designated pEFDHFR (pEF-DHFR is described in Raum et al., Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). For cell surface expression of human and Javanese MSLNs, the parent signal peptide is used. All cloning procedures are performed according to standard protocols (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). For each construct, the appropriate plasmid is transfected into DHFR (DHFR)-deficient HCH (CHO) cells for eukaryotic expression as described by Kaufman RJ (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566.

Экспрессию МЗЛН (MSLN) человека, химерного и яванца на клетках ЯКХ (CHO) проверяют в анализе СКАФ (FACS) с применением моноклонального мышиного IgG2b антитела против МЗЛН (MSLN) человека. В качестве отрицательного контроля клетки инкубируют с антителом контрольного изотипа вместо первого антитела. Образцы анализируют при помощи проточной цитометрии.Expression of human, chimeric and Javan MSLNs on CHO cells was tested in a FACS assay using a monoclonal mouse IgG2b anti-human MSLN antibody. As a negative control, cells are incubated with an isotype control antibody in place of the first antibody. Samples are analyzed by flow cytometry.

Пример 2. Картирование эпитопов для конструкций антител против МЗЛН (MSLN)Example 2 Epitope Mapping for Anti-MSLN Antibody Constructs (MSLN)

Клетки, трансфектированные МЗЛН (MSLN) человека и химерными молекулами МЗЛН (MSLN) человека (см. Пример 1), окрашивают неочищенным, неразбавленным периплазматическим экстрактом, содержащим конструкции биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) (с CD3связывающим доменом, обозначенным как I2C), слитыми с альбумином человека (вариант 1) в ФСБ (PBS)/1,5% фетальной телячьей сыворотки, ФТС (FCS). Связанные молекулы обнаруживают при помощи мышиного моноклонального антитела против CD3-связывающего домена (50 мкл), а затем при помощи Fc-гамма-ФЭ против мышиного IgG (1:100, 50 мкл, Jackson Immunoresearch № 115-116-071) Все антитела разводят в ФСБ (PBS)/1,5% ФТС (FCS). В качестве отрицательного контроля клетки инкубируют с ФСБ (PBS)/2% ФТС (FCS) вместо периплазматического экстракта. Образцы анализируют методом проточной цитометрии.Cells transfected with human MSLN and human MSLN chimeric molecules (see Example 1) are stained with a crude, undiluted periplasmic extract containing bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs (with the CD3 binding domain designated as I2C) fused with human albumin (option 1) in FBS (PBS)/1.5% fetal calf serum, FCS (FCS). Bound molecules are detected with mouse anti-CD3 binding domain monoclonal antibody (50 µl) followed by anti-mouse IgG Fc-gamma-PE (1:100, 50 µl, Jackson Immunoresearch #115-116-071) All antibodies are diluted in the FSB (PBS) / 1.5% FCS (FCS). As a negative control, cells are incubated with PBS/2% FCS instead of periplasmic extract. Samples are analyzed by flow cytometry.

Участки, которые были распознаны соответствующими связывающими доменами МЗЛН (MSLN),Regions that have been recognized by the corresponding MSLN binding domains (MSLNs)

- 47 042291 приведены в таблице последовательностей (табл. 2). Потеря сигнала FACS в соответствующих химерных конструкциях МЗЛН (MSLN), содержащих кластер мышиного эпитопа, была считана на предмет релевантности соответствующего кластера связыванию. В случае, если на сигнал СКАФ (FACS) отрицательно повлиял более чем один, соответственно два, химерный клон МЗЛН (MSLN), делалось заключение о том, что оба кластера являются релевантными.- 47 042291 are listed in the sequence table (Table 2). Loss of FACS signal in the respective MSLN chimeric constructs (MSLN) containing the murine epitope cluster was read for the relevance of the respective binding cassette. In the event that the SCAF signal (FACS) was negatively affected by more than one, respectively two, chimeric clone MSLN (MSLN), it was concluded that both clusters are relevant.

Таблица 2. Картирование кластеров эпитопа для MS-1-MS-8Table 2. Mapping of epitope clusters for MS-1-MS-8

Кластер эпитопа Epitope cluster Связывающий агент Coupling agent Е 1+2 E 1+2 MS-1 MS-1 Е 2+3 E 2+3 MS-2 MS-2 Е 2+3 E 2+3 MS-3 MS-3 Е 2+3 E 2+3 MS-4 MS-4 Е 2+3 E 2+3 MS-5 MS-5 Е 2+3 E 2+3 MS-6 MS-6 Е 4 E 4 MS-7 MS-7 Е 1+2 E 1+2 MS-8 MS-8

Пример 3. Анализ аффинности биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) к МЗЛН (MSLN) человека и макака на целевых антигенположительных клетках и определение межвидового зазора аффинности при помощи ScatchardExample 3 Affinity Analysis of Human and Macaque MSLN Bispecific Antibodies (MSLN) x CD3 (CD3) on Target Antigen-Positive Cells and Determination of Interspecies Affinity Gap Using Scatchard

Значения аффинности конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) к клеткам ЯКХ (CHO), трансфектированным МЗЛН (MSLN) человека или макака, также были определены при помощи анализа Scatchard как наиболее надежного метода для определения потенциальных зазоров аффинности между МЗЛН (MSLN) человека и макака. Для анализа Scatchard эксперименты по насыщению связывания выполняют с применением системы одновалентного обнаружения для точного определения одновалентного связывания конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) с соответствующей клеточной линией.The affinity values of bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs for human or macaque MSLN transfected CHO cells were also determined using the Scatchard assay as the most reliable method to determine potential affinity gaps between MDLNs ( MSLN) of humans and macaques. For the Scatchard assay, binding saturation experiments are performed using a monovalent detection system to accurately determine the monovalent binding of anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs to the appropriate cell line.

2х104 клеток соответствующей клеточной линии (рекомбинантно экспрессирующая МЗЛН (MSLN) человека клеточная линия ЯКХ (CHO), рекомбинантный экспрессирующая МЗЛН (MSLN) макака клеточная линия ЯКХ (CHO)) инкубируют в каждом случае с 50 мкл серий триплетных разведений (двенадцать разведений 1:2) соответствующей конструкции биспецифического антитела против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) (до достижения насыщения), начиная с 10-20 нМ, с последующей инкубацией в течение 16 часов при 4°C с перемешиванием и одной стадией остаточного промывания. Затем клетки инкубируют в течение еще 1 ч с 30 мкл раствора конъюгата CD3 х ALEXA488. После одностадийного промывания клетки ресуспендируют в 150 мкл буфера СКАФ (FACS), содержащего 3,5% формальдегида, инкубируют еще в течение 15 мин, центрифугируют, ресуспендируют в буфере СКАФ (FACS) и анализируют с применением аппарата СКАФ (FACS) CantoII и программного обеспечения FACS Diva. Данные получены из двух независимых наборов экспериментов, каждый из которых включал три параллельных эксперимента. Проводят вычисления для соответствующего анализа Scatchard с целью экстраполяции максимального связывания (Bmax). Определяют концентрации конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) при полумаксимальном связывании, которые отражают соответствующие значения KD. Значения измерений в трех параллельных экспериментах нанесены на график в виде гиперболических кривых и в виде S-образных кривых, чтобы продемонстрировать надлежащие диапазоны концентрации от минимального до оптимального связывания.2 x 10 4 cells of the respective cell line (recombinant human MSLN-expressing HKH (CHO) cell line, recombinant MSLN-expressing macaque YKH (CHO) cell line) are incubated in each case with 50 µl of a triplet dilution series (twelve dilutions of 1: 2) an appropriate anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody construct (until saturation) starting at 10-20 nM, followed by a 16 hour incubation at 4°C with shaking and one residual wash step. The cells are then incubated for another 1 hour with 30 µl of CD3 x ALEXA488 conjugate solution. After a one-step wash, cells are resuspended in 150 µl of FACS buffer containing 3.5% formaldehyde, incubated for an additional 15 min, centrifuged, resuspended in FACS buffer and analyzed using Canto II FACS apparatus and software FACS Diva. The data are obtained from two independent sets of experiments, each of which included three parallel experiments. Calculate for the appropriate Scatchard assay to extrapolate the maximum binding (Bmax). The concentrations of the bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs are determined at half-maximal binding, which reflect the respective KD values. Measurement values from three replicate experiments are plotted as hyperbolic curves and as S-curves to demonstrate appropriate concentration ranges from minimal to optimal binding.

Значения, приведенные в табл. 3, получены из двух независимых экспериментов на основе конструкции биспецифического антитела против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3). Исследование на клетках с применением Scatchard подтвердило, что значения аффинности конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) по изобретению к МЗЛН (MSLN) человека и к МЗЛН (MSLN) макака находятся в субнаномолярном диапазоне и представлены с небольшим межвидовым яванца/человека зазором аффинности около 1.The values given in table. 3 are derived from two independent experiments based on the anti-MDLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody construct. A study on cells using Scatchard confirmed that the affinity values of the bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs of the invention for human MSLN (MSLN) and macaque MSLN are in the subnanomolar range and are presented with a small interspecies Java/ human affinity gap of about 1.

- 48 042291- 48 042291

Таблица 3. Значения аффинности (KD) конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3), определенные в исследовании на клетках с применением Scatchard, с вычисленным зазором аффинности KD МЗЛН (MSLN) макака/KD МЗЛН (MSLN) человека. Конструкции антител анализировали в двух независимых экспериментах, каждый из которых проводили в виде трех параллельных экспериментов.Table 3. Affinity values (KD) of bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs determined in a cell assay using Scatchard, with calculated affinity gap KD of macaque MSLN/KD of human MSLN. The antibody constructs were analyzed in two independent experiments, each of which was carried out in three parallel experiments.

Антитело BiTE против М3 х I2C-HALB Antibody BiTE against M3 x I2C-HALB Аффинность к hu MSLN* в исследовании на клетках [нМ] Affinity for hu MSLN* in cell assay [nM] Аффинность к mac MSLN* в исследовании на клетках [нМ] Affinity for mac MSLN* in cell assay [nM] Зазор аффинности KDmaC/KD hu MSLNAffinity Gap KD ma C / KD h u MSLN MS-1 MS-1 1,25 ± 0,8 1.25±0.8 13,86 ± 2,9 13.86±2.9 11,08 11.08 MS-8 MS-8 4,68 ± 0,4 4.68±0.4 85,86 ± 16,7 85.86 ± 16.7 18,35 18.35 MS-2 MS-2 1,40 ±0,9 1.40±0.9 10,16 ±3,5 10.16±3.5 7,28 7.28 MS-3 MS-3 0,74 ±0,8 0.74±0.8 0,82 ±0,5 0.82±0.5 1,12 1.12 MS-4 MS-4 0,91 ±1,0 0.91±1.0 0,77 ± 0,7 0.77 ± 0.7 0,85 0.85 MS-5 MS-5 0,39 ± 0,3 0.39±0.3 2,31 ± 3,7 2.31 ± 3.7 5,91 5.91 MS-6 MS-6 0,60 ±0,3 0.60±0.3 9,03 ±3,7 9.03±3.7 15,04 15.04 MS-7 MS-7 1,06 ±0.5 1.06±0.5 4,07 ± 1.0 4.07 ± 1.0 3,86 3.86

Пример 4. Биспецифическое связывание и межвидовая перекрестная реактивностьExample 4 Bispecific Binding and Cross-Species Cross-Reactivity

Для подтверждения связывания с МЗЛН (MSLN) и КД3 (CD3) человека и МЗЛН (MSLN) и КД3 (CD3) яванца конструкции биспецифического антитела по изобретению тестируют при помощи проточной цитометрии с применением клеток ЯКХ (CHO), трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека, с изоформой МЗЛН (MSLN) человека (NM_013404 равно SEQ ID NO: 232 и AY743922 равно SEQ ID NO: 233) и с МЗЛН (MSLN) макака соответственно,To confirm binding to human MSLN and CD3 and Javanese MSLN and CD3, the bispecific antibody constructs of the invention are tested by flow cytometry using CHO cells transfected with human MSLN, with human MSLN isoform (NM_013404 is equal to SEQ ID NO: 232 and AY743922 is equal to SEQ ID NO: 233) and with macaque MSLN, respectively,

МЗЛН (MSLN) человека-положительной клеточной линии человека 0VCAR-8, экспрессирующей КД3 (CD3) клеточной линии T-клеточного лейкоза человека HPB-all (DSMZ, Braunschweig, ACC483) и экспрессирующей КД3 (CD3) яванского макака T-клеточной линии LnPx 4119.MSLN of human-positive human cell line 0VCAR-8, CD3-expressing human T-cell leukemia cell line HPB-all (DSMZ, Braunschweig, ACC483), and CD3-expressing cynomolgus monkey T-cell line LnPx 4119 .

Для проточной цитометрии 200000 клеток соответствующих клеточных линий инкубируют в течение 60 мин при 4°C с 50 мкл очищенной конструкции биспецифического антитела в концентрации 5 мкг/мл. Клетки дважды промывают ФСБ (PBS)/2% ФТС (FCS) и затем инкубируют с самостоятельно полученным мышиным антителом (2 мкг/мл), специфическим в отношении КД3 (CD3)-связывающей части конструкций биспецифических антител, в течение 30 мин при 4°C. После промывания связанные мышиные антитела обнаруживают при помощи козьего антимышиного Fcy-ФЭ (1:100) в течение 30 мин при 4°C. Образцы анализируют при помощи проточной цитометрии. В качестве отрицательного контроля применяют нетрансфектированные клетки ЯКХ (CHO).For flow cytometry, 200,000 cells of the respective cell lines are incubated for 60 min at 4° C. with 50 μl of the purified bispecific antibody construct at 5 μg/ml. Cells are washed twice with PBS/2% FCS and then incubated with a self-produced mouse antibody (2 μg/ml) specific for the CD3 (CD3)-binding portion of the bispecific antibody constructs for 30 min at 4°C. C. After washing, bound mouse antibodies are detected using goat anti-mouse Fcy-PE (1:100) for 30 min at 4°C. Samples are analyzed by flow cytometry. Non-transfected JCC cells (CHO) are used as a negative control.

Результаты проиллюстрированы на фиг. 2 и 3. Конструкции биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) по изобретению окрашивают клетки ЯКХ (CHO), трансфектированные МЗЛН (MSLN) человека, искусственной изоформой МЗЛН (MSLN) и МЗЛН (MSLN) яванца, а также окрашивают МЗЛН (MSLN) человека-положительную клеточную линию человека OVCAR-8 (в которой присутствует естественная экспрессия). Кроме того, экспрессирующие КД3 (CD3) линии T-клеток были распознаны конструкциями биспецифических антител. Дополнительно, не наблюдалось окрашивания клеток отрицательного контроля (нетрансфектированных ЯКХ (CHO)).The results are illustrated in FIG. 2 and 3. Bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs according to the invention stain CHO cells transfected with human MSLN (MSLN), artificial isoform of MSLN (MSLN) and Javanese MSLN (MSLN), and also stain with MDLN (MSLN) human-positive human cell line OVCAR-8 (which is naturally expressed). In addition, CD3-expressing T cell lines were recognized by bispecific antibody constructs. Additionally, no staining was observed in negative control cells (non-transfected NCC (CHO)).

Пример 5. Цитотоксическая активностьExample 5 Cytotoxic Activity

Активность конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) по изобретению с точки зрения перенацеливания эффекторных T-клеток против экспрессирующих МЗЛН (MSLN) клеток-мишеней анализировали в пяти анализах цитотоксичности in vitro:The activity of the bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs of the invention in retargeting effector T cells against MSLN-expressing target cells was analyzed in five in vitro cytotoxicity assays:

Активность конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) с точки зрения перенацеливания стимулированных CD8+ эффекторных T-клеток человека против трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) была измерена в 18-часовом анализе высвобождения 51Cr. (Соотношение эффектор:мишень 10:1). (Фиг. 4 и табл. 4).The activity of bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs in retargeting stimulated human CD8+ effector T cells against transfected human MSLN (MSLN) HCC (CHO) cells was measured in an 18-hour 51 Cr release assay. (Ratio effector:target 10:1). (Fig. 4 and table. 4).

Активность конструкций биспецифических антител МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) с точки зрения перенацеливания стимулированных CD8+ эффекторных T-клеток человека против МЗЛН (MSLN)положительной клеточной линии OVCAR-8 была измерена в 18-часовом анализе высвобождения 51Cr. (Соотношение эффектор:мишень 10:1). Фиг. 5 и табл. 5.The activity of MSLN x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs in retargeting stimulated human CD8+ effector T cells against the MSLN (MSLN) positive OVCAR-8 cell line was measured in an 18 hour 51 Cr release assay. (Ratio effector:target 10:1). Fig. 5 and tab. 5.

Эффективность конструкций биспецифических антител МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) с точки зрения перенацеливания T-клеток в нестимулированных МКПК (PBMC) человека (CD14-/CD56-) против трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) в отсутствие и в присутствии растворимого МЗЛН (MSLN) измеряли в 48-часовом анализе цитотоксичности на основе СКАФ (FACS). (СоотношениеEfficacy of MSLN x CD3 (CD3) Bispecific Antibody Constructs in Retargeting T Cells in Unstimulated Human PBMCs (CD14-/CD56-) Against Transfected Human MSLNs (MSLNs) CHO Cells in the absence and in the presence of soluble MSLN (MSLN) was measured in a 48-hour SCAF-based cytotoxicity assay (FACS). (Ratio

- 49 042291 эффектор:мишень 10:1) (Фиг. 6 и табл. 6).- 49 042291 effector:target 10:1) (Fig. 6 and table. 6).

Эффективность конструкций биспецифических антител МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) с точки зрения перенацеливания T-клеток в нестимулированных МКПК (PBMC) человека (CD147CD56-) против МЗЛН (MSLN)-положительной клеточной линии человека OVCAR-8 измеряли в 48-часовом анализе цитотоксичности на основе СКАФ (FACS) (Фиг. 7).The efficacy of MSLN x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs in retargeting T cells in unstimulated human PBMCs (CD147CD56 - ) against the MSLN (MSLN)-positive human cell line OVCAR-8 was measured in a 48 hour assay SCAF-based cytotoxicity (FACS) (Figure 7).

Для подтверждения того, что конструкции биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) с перекрестной реактивностью способны перенацеливать T-клетки макака против трансфектированных МЗЛН (MSLN) макака клеток ЯКХ (CHO), проводили 48-часовой анализ цитотоксичности на основе СКАФ (FACS) с применением линии T-клеток макака LnPx4119 в качестве эффекторных Tклеток (Соотношение эффектор:мишень 10:1) (Фиг. 8).To confirm that cross-reactive anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs are able to retarget macaque T cells against transfected MSLN (MSLN) macaque YCC (CHO) cells, a 48-hour SCAF-based cytotoxicity assay was performed ( FACS) using the macaque T cell line LnPx4119 as effector T cells (Ratio effector:target 10:1) (FIG. 8).

Зазор активности перенацеливания T-клеток в стимулированных CD8+ человека эффекторных Tклетках против трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) между мономерной и димерной изоформами конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) был измерен в 18-часовом анализе высвобождения 51Cr (Соотношение эффектор:мишень 10:1) (Фиг. 9).The gap of T cell retargeting activity in human CD8+ stimulated effector T cells against transfected human MSLN (MSLN) human HCLN (CHO) cells between the monomeric and dimeric isoforms of anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs was measured in an 18-hour release assay 51 Cr (Ratio effector:target 10:1) (Fig. 9).

Пример 5.1. Анализ высвобождения хрома с применением стимулированных T-клеток человекаExample 5.1. Chromium release assay using stimulated human T cells

Стимулированные T-клетки, обогащенные CD8+ T-клетками, получают, как описано ниже. Чашку Петри (диаметр 145 мм, Greiner bio-one GmbH, Кремсмюнстер) покрывают коммерчески доступным анти-CD3-специфическим антителом (ОКТЗ, Orthoclone) в конечной концентрации 1 мкг/мл в течение 1 ч при 37°C. Несвязанный белок удаляют одностадийным промыванием ФСБ (PBS). 3-5х107 МКПК (PBMC) человека помещают на предварительно покрытую чашку Петри в 120 мл RPMI 164 0 со стабилизированным глутамином/10% ФТС (FCS)/IL-220 Ед/мл (Proleukin®, Chiron) и стимулируют в течение 2 дней. На третий день клетки собирают и промывают один раз RPMI 1640. IL-2 добавляют до конечной концентрации 20 Ед/мл, и клетки снова культивируют в течение одного дня в той же среде для культивирования клеток, что указана выше. CD8+ цитотоксические T-лимфоциты (ЦТЛ (CTL)) обогащают путем истощения CD4+ T-клеток и CD56+ ПК ЩК)-клеток с применением Dynal-Beads в соответствии с протоколом производителя.Stimulated T cells enriched in CD8+ T cells are prepared as described below. A Petri dish (diameter 145 mm, Greiner bio-one GmbH, Kremsmuenster) is coated with a commercially available anti-CD3 specific antibody (OCTS, Orthoclone) at a final concentration of 1 μg/ml for 1 h at 37°C. Unbound protein is removed by one-step washing with PBS. 3-5 x 10 7 human PBMCs are placed on a pre-coated petri dish in 120 ml RPMI 164 0 stabilized glutamine/10% FCS (FCS)/IL-220 U/ml (Proleukin®, Chiron) and stimulated for 2 days . On the third day, the cells are harvested and washed once with RPMI 1640. IL-2 is added to a final concentration of 20 U/ml and the cells are cultured again for one day in the same cell culture medium as above. CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs (CTL)) are enriched by depletion of CD4+ T cells and CD56+ PK (JJ) cells using Dynal-Beads according to the manufacturer's protocol.

Трансфектированные МЗЛН (MSLN) яванца или МЗЛН (MSLN) человека клетки-мишени ЯКХ (CHO) дважды промывают ФСБ (PBS) и маркируют 11,1 МБк 51Cr в конечном объеме 100 мкл RPMI с 50% ФТС (FCS) в течение 60 мин при 37°C. После этого меченые клетки-мишени промывают 3 раза по 5 мл RPMI и затем используют в анализе цитотоксичности. Анализ проводят на 96-луночном планшете в общем объеме 200 мкл RPMI с добавками, с соотношением Э:М (Э:М) 10:1. Применяют начальную концентрацию 0,01-1 мкг/мл очищенной конструкции биспецифического антитела и трехкратные разведения. Время инкубации для анализа составляет 18 ч. Цитотоксичность определяют как относительные значения высвобожденного хрома в супернатанте относительно разности максимального лизиса (добавление Тритона-X) и спонтанного лизиса (без эффекторных клеток). Все измерения проводят в 4 параллельных экспериментах. Активность хрома в супернатантах измеряют на гамма-счетчике Wizard 3'' (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Кельн, Германия). Анализ результатов выполняют при помощи Prism 5 для Windows (версия 5.0, GraphPad Software Inc., Сан-Диего, штат Калифорния, США). Значения EC50, вычисленные программой анализа на основе сигмоидальных кривых дозы-реакции, используют для сравнения цитотоксической активности.Transfected Javanese MSLN or Human MSLN (CHO) target cells are washed twice with PBS and labeled with 11.1 MBq 51 Cr in a final volume of 100 μl RPMI with 50% FCS (FCS) for 60 min at 37°C. After that, the labeled target cells are washed 3 times with 5 ml of RPMI and then used in the analysis of cytotoxicity. The assay is performed on a 96-well plate in a total volume of 200 μl of RPMI supplemented, with an E:M (E:M) ratio of 10:1. An initial concentration of 0.01-1 μg/ml of the purified bispecific antibody construct and three-fold dilutions are used. The incubation time for the assay is 18 hours. Cytotoxicity is defined as the relative values of chromium released in the supernatant relative to the difference between maximum lysis (addition of Triton-X) and spontaneous lysis (no effector cells). All measurements are carried out in 4 parallel experiments. Chromium activity in the supernatants was measured on a Wizard 3'' gamma counter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Cologne, Germany). Analysis of the results is performed using Prism 5 for Windows (version 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). The EC 50 values calculated by the analysis program from sigmoidal dose-response curves are used to compare cytotoxic activity.

Пример 5.2. Эффективность перенацеливания стимулированных эффекторных T-клеток человека против трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO)Example 5.2. Retargeting Efficacy of Stimulated Human Effector T Cells Against Transfected Human MSLNs (MSLNs) of Human CHO Cells

Цитотоксическую активность конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) в соответствии с изобретением изучали в анализе цитотоксичности с высвобождением хрома-51 (51Cr) с применением трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) в качестве клеток-мишеней и стимулированных CD8+ T-клеток человека в качестве эффекторных клеток. Эксперимент проводили, как описано в примере 8.1.The cytotoxic activity of the bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs according to the invention was studied in a chromium-51 ( 51 Cr) releasing cytotoxicity assay using transfected human MSLN (MSLN) HCC (CHO) cells as target cells. and stimulated human CD8+ T cells as effector cells. The experiment was carried out as described in example 8.1.

Результаты приведены в табл. 4. Конструкции биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) продемонстрировали очень высокую цитотоксическую активность против трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) в диапазоне однозначных пикомолярных значений.The results are shown in table. 4. Bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs showed very high cytotoxic activity against transfected human MSLN (MSLN) HCC cells (CHO) in the unambiguous picomolar range.

- 50 042291- 50 042291

Таблица 4. Значения EC50 [пМ] конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) хTable 4. EC50 values [pM] of bispecific antibody constructs against MDLN (MSLN) x

КД3 (CD3), изученных в анализе цитотоксичности с высвобождением хрома-51 (51Cr) с применением трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) в качестве клеток-мишеней и стимулированных CD8 T-клеток человека в качестве эффекторных клетокCD3 assayed in a chromium-51 ( 51 Cr) releasing cytotoxicity assay using transfected human MSLN (CHO) cells as target cells and stimulated human CD8 T cells as effector cells

Пример 5.3. Активность перенацеливания стимулированных эффекторных T-клеток человека против МЗЛН (MSLN)-положительной клеточной линии человека OVCAR-8Example 5.3. Retargeting activity of stimulated human effector T cells against MSLN-positive human cell line OVCAR-8

Цитотоксическую активность конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) изучали в анализе цитотоксичности с высвобождением хрома-51 (51Cr) с применением МЗЛН (MSLN) - положительной клеточной линии человека OVCAR-8 в качестве источника клеток-мишеней и стимулированных CD8+ T-клеток человека в качестве эффекторных клеток. Анализ проводили, как описано в примере 8.1.The cytotoxic activity of bispecific antibody constructs against MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) was studied in a cytotoxicity assay with the release of chromium-51 ( 51 Cr) using MSLN (MSLN), a positive human cell line OVCAR-8, as a source of target cells and stimulated Human CD8+ T cells as effector cells. The analysis was carried out as described in example 8.1.

В соответствии с результатами исследований высвобождения хрома-51 с применением стимулированных обогащенных CD8+ T-лимфоцитов человека в качестве эффекторных клеток и трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) в качестве клеток-мишеней, конструкции биспецифических антител против DLB3 х КД3 (CD3) по данному изобретению также оказывают выраженное влияние на цитотоксическую активность против клеток-мишеней с естественной экспрессией (см. табл. 5).According to the results of chromium-51 release studies using stimulated human CD8+ enriched T-lymphocytes as effector cells and transfected human MSLN (MSLN) HCC cells (CHO) as target cells, anti-DLB3 x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs according to this invention also have a pronounced effect on cytotoxic activity against target cells with natural expression (see table. 5).

Таблица 5. Значения EC50 [ПМ] конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) определяли в 18-часовом анализе цитотоксичности с высвобождением хрома-51 (51Cr) с применением МЗЛН (MSLN)-положительной клеточной линии человека OVCAR-8 в качестве источника клеток-мишеней и стимулированных обогащенных CD8 T-клеток человека в качестве эффекторных клеток.Table 5. EC50 [PM] values of anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs were determined in an 18-hour chromium-51 ( 51 Cr) releasing cytotoxicity assay using the MSLN (MSLN)-positive human cell line OVCAR- 8 as a source of target cells and stimulated enriched human CD8 T cells as effector cells.

Пример 5.4. Анализ цитотоксичности на основе СКАФ (FACS) с применением нестимулированных МКПК (PBMC) человекаExample 5.4. SCAF-based cytotoxicity assay (FACS) using unstimulated human PBMCs

Выделение эффекторных клетокIsolation of effector cells

Мононуклеарные клетки периферической крови человека МКПК (PBMC) получают центрифугированием с градиентом плотности Ficoll из обогащенных лимфоцитами препаратов (лейкоцитарные пленки), побочного продукта банков крови, собирающих кровь для переливания. Лейкоцитарные пленки поставлялись местным банком крови, и МКПК (PBMC) получали в день сбора крови. После центрифугирования с градиентом плотности Ficoll и тщательного промывания ФСБ (PBS) Dulbecco (Gibco) оставшиеся эритроциты удаляют из МКПК (PBMC) путем инкубации с буфером для лизиса эритроцитов (155 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3, 100 мкМ ЭДТА). Тромбоциты удаляют с супернатантом при центрифугировании МКПК (PBMC) при 100 х g. Оставшиеся лимфоциты в основном включают B- и T-лимфоциты, ПК (NK)клетки и моноциты. МКПК (PBMC) содержат в культуре при 37°C/5% CO2 в среде RPMI (Gibco) с 10% ФТС (FCS) (Gibco).Human peripheral blood mononuclear cells PBMCs (PBMCs) are obtained by Ficoll density gradient centrifugation from lymphocyte-enriched preparations (buffy coats), a by-product of blood banks that collect blood for transfusion. The buffy coats were supplied by the local blood bank and PBMCs were obtained on the day of blood collection. After centrifugation with a Ficoll density gradient and thorough washing with Dulbecco (Gibco) PBS, the remaining erythrocytes are removed from the PBMC by incubation with erythrocyte lysis buffer (155 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 , 100 μM EDTA). Platelets are removed with the supernatant by centrifugation of PBMCs at 100 x g. The remaining lymphocytes mainly include B- and T-lymphocytes, PC (NK) cells and monocytes. PBMCs are cultured at 37°C/5% CO2 in RPMI medium (Gibco) with 10% FCS (Gibco).

Истощение CD14+ и CD56+ клетокDepletion of CD14+ and CD56+ cells

Для истощения CD14+ клеток применяют микрошарики MicroBeads CD14 человека (Milteny Biotec, MACS, № 130-050-201), для истощения ПК (NK)-клеток - микрошарики MicroBeads CD56 человека (MACS, № 130-050-401). МКПК (PBMC) подсчитывают и центрифугируют в течение 10 мин при комнатной температуре и 300 х g. Супернатант отбрасывают, а осадок клеток ресуспендируют в буфере для выделения MACS [80 мкл/107 клеток; ФСБ (PBS) (Invitrogen, № 20012-043), 0,5% (об./об.) ФСБ (FBS)Human CD14 MicroBeads (Milteny Biotec, MACS, no. 130-050-201) are used to deplete CD14+ cells, and human CD56 MicroBeads (MACS, no. 130-050-401) are used to deplete PC (NK) cells. PBMCs are counted and centrifuged for 10 min at room temperature and 300 xg. The supernatant is discarded and the cell pellet is resuspended in MACS isolation buffer [80 μl/10 7 cells; FBS (PBS) (Invitrogen, #20012-043), 0.5% (v/v) FBS (FBS)

- 51 042291 (Gibco, № 10270-106), 2 мМ ЭДТА (Sigma-Aldrich, № E-6511)]. Добавляют MicroBeads CD14 и MicroBeads CD56 (20 мкл/107 клеток) и инкубируют в течение 15 мин при 4-8°C. Клетки промывают буфером для выделения MACS (1-2 мл/107 клеток). После центрифугирования (см. выше) супернатант отбрасывают и клетки ресуспендируют в буфере для выделения MACS (500 мкл/108 клеток). Затем CD14/CD56 отрицательные клетки выделяют с применением колонок LS (Miltenyi Biotec, № 130-042401). МКПК (PBMC) без клеток CD14+/CD56+ культивируют в полной среде RPMI, т.е., RPMI1640 (Biochrom AG, № FG1215), содержащей 10% ФТС (FBS) (Biochrom AG, № S0115), 1x незаменимых аминокислот (Biochrom AG, № K0293), 10 мМ (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (буфер ГЭПЭС (Hepes)) (Biochrom AG, № L1613), 1 мМ пирувата натрия (Biochrom AG, № L0473) и 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина (Biochrom AG, № A2213) при 37°C в инкубаторе до использования.- 51 042291 (Gibco, no. 10270-106), 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich, no. E-6511)]. MicroBeads CD14 and MicroBeads CD56 (20 µl/10 7 cells) are added and incubated for 15 min at 4-8°C. Cells are washed with MACS isolation buffer (1-2 ml/10 7 cells). After centrifugation (see above), the supernatant is discarded and the cells are resuspended in MACS isolation buffer (500 μl/10 8 cells). The CD14/CD56 negative cells are then isolated using LS columns (Miltenyi Biotec, no. 130-042401). PBMCs without CD14+/CD56+ cells are cultured in complete RPMI medium, i.e., RPMI1640 (Biochrom AG, no. FG1215) containing 10% FBS (Biochrom AG, no. S0115), 1x essential amino acids (Biochrom AG , no. K0293), 10 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES buffer (Hepes)) (Biochrom AG, no. L1613), 1 mM sodium pyruvate (Biochrom AG, no. L0473) and 100 U/ ml penicillin/streptomycin (Biochrom AG, no. A2213) at 37°C in an incubator until use.

Маркировка целевых клетокTarget cell labeling

С целью анализа лизиса клеток методом проточной цитометрии применяют флуоресцентный мембранный краситель DiOC18 (DiO) (Molecular Probes, № V22886), чтобы маркировать трансфектированные МЗЛН (MSLN) человека или МЗЛН (MSLN) макака клетки ЯКХ (CHO) в качестве клеток-мишеней и отличить их от эффекторных клеток, Вкратце, клетки собирают, один раз промывают ФСБ (PBS) и их количество доводят до 106 клеток/мл ФСБ (PBS), содержащим 2% (об./об.) ФТС (FBS) и мембранный краситель DiO (5 мкл/106 клеток). После инкубации в течение 3 мин при 37°C клетки дважды промывают полной средой RPMI, и количество клеток доводят до 1,2x105 клеток/мл. Жизнеспособность клеток определяют с применением 0,5% (об./об.) изотонического раствора Эозина G (Roth, № 45380).In order to analyze cell lysis by flow cytometry, the fluorescent membrane dye DiOC 18 (DiO) (Molecular Probes, no. V22886) is used to label transfected human MSLNs or macaque MSLNs (CHO) cells as target cells and distinguish them from effector cells. Briefly, cells are harvested, washed once with PBS and adjusted to 106 cells/mL with PBS containing 2% (v/v) FBS and membrane dye DiO (5 µl/10 6 cells). After incubation for 3 min at 37°C, the cells are washed twice with complete RPMI medium and the cell count is adjusted to 1.2x105 cells/ml. Cell viability is determined using a 0.5% (v/v) isotonic solution of Eosin G (Roth, no. 45380).

Анализ на основе проточной цитометрииFlow cytometric analysis

Этот анализ разработан для количественной оценки лизиса клеток ЯКХ (CHO), трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека или ямайца, в присутствии серийных разведений конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN). Равные объемы меченых DiO клеток-мишеней и эффекторных клеток (т.е., МКПК (PBMC) без клеток CD14+) смешивают, в результате чего соотношение клеток Э:М составляет 10:1. 160 мкл этой суспензии переносят в каждую лунку 96-луночного планшета. Добавляют 40 мкл серийных разведений конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) и добавляют отрицательную контрольную биспецифическую (конструкция биспецифического антитела на основе КД3 (CD3), распознающая нерелевантный целевой антиген) или полную среду RPMI в качестве дополнительного отрицательного контроля. Опосредованная биспецифическим антителом цитотоксическая реакция протекает в течение 48 ч в увлажненном инкубаторе, содержащем 7% CO2. Затем клетки переносят на новый 96-луночный планшет и осуществляют проверку целостности клеточной мембраны мишени путем добавления пропидия йодида, ПЙ (PI) в конечной концентрации 1 мкг/мл. ПЙ (PI) представляет собой не проникающий сквозь мембрану краситель, который обычно исключается из жизнеспособных клеток, тогда как мертвые клетки захватывают его и становятся различимыми благодаря флуоресцентной эмиссии.This assay is designed to quantify the lysis of CHO cells transfected with human or Jamaican MSLNs in the presence of serial dilutions of anti-MSLN bispecific antibody (MSLN) constructs. Equal volumes of DiO-labeled target cells and effector cells (ie, PBMCs without CD14+ cells) are mixed resulting in a 10:1 E:M cell ratio. 160 μl of this suspension is transferred to each well of a 96-well plate. 40 µl serial dilutions of anti-MSLN x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs are added and a negative control bispecific (CD3-based bispecific antibody construct recognizing an irrelevant target antigen) or complete RPMI medium is added as an additional negative control. The bispecific antibody-mediated cytotoxic reaction proceeds for 48 hours in a humidified incubator containing 7% CO2. The cells are then transferred to a new 96-well plate and the integrity of the target cell membrane is checked by adding propidium iodide, PI (PI) at a final concentration of 1 μg/ml. PI (PI) is a non-membrane-permeable dye that is usually eliminated from viable cells, while dead cells take it up and become visible due to fluorescent emission.

Измерение образцов проводят проточной цитометрией на приборе СКАФ (FACS) Canto II и анализируют при помощи программного обеспечения FACSDiva (оба производства Becton Dickinson). Клеткимишени идентифицируют как DiO-положительные клетки. ПЙ (PI)-отрицательные клетки-мишени классифицируют как живые клетки-мишени. Процент цитотоксичности вычисляют по следующей формуле:Samples were measured by flow cytometry on a SCAF Canto II FACS instrument and analyzed using FACSDiva software (both manufactured by Becton Dickinson). The target cells are identified as DiO-positive cells. PI-negative target cells are classified as live target cells. The percentage of cytotoxicity is calculated using the following formula:

т т гп т мертвые клетки-мишени , г. г. t t gp t dead target cells, g. g.

Цитотоксичность |%J = —£-----------х 100 П клетки-мишени , где n=количество событий.Cytotoxicity |%J = - £ -----------x 100 P target cells, where n=number of events.

С применением программного обеспечения GraphPad Prism 5 (программное обеспечение GraphPad Software, Сан-Диего), на график наносят зависимость процента цитотоксичности от соответствующих концентраций конструкции биспецифического антитела. Кривые зависимости дозы-реакции анализируют при помощи моделей четырехпараметрической логистической регрессии для оценки сигмовидных кривых зависимости дозы-реакции с фиксированным угловым коэффициентом Хилла и вычисляют значения EC50.Using GraphPad Prism 5 software (GraphPad Software, San Diego), percent cytotoxicity is plotted against respective concentrations of the bispecific antibody construct. Dose-response curves are analyzed using four-parameter logistic regression models to evaluate sigmoid fixed-slope dose-response curves and EC 50 values are calculated.

Пример 5.5. Потенциал перенацеливания нестимулированных МКПК (PBMC) человека против трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) в отсутствие или в присутствии растворимого МЗЛН (MSLN)Example 5.5. Retargeting Potential of Unstimulated Human PBMCs Against Transfected Human MSLNs (MSLNs) of Human CHO Cells in the Absence or Presence of Soluble MSLNs (MSLN)

Цитотоксическую активность конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) изучали в анализе цитотоксичности на основе СКАФ (FACS) с применением трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) в качестве клеток-мишеней и нестимулированных МКПК (PBMC) человека в качестве эффекторных клеток. Анализ проводили, как описано в примере 8.4 выше.The cytotoxic activity of anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs was studied in a SCAF-based cytotoxicity assay (FACS) using transfected human MSLN (MSLN) human CHO cells as target cells and unstimulated human PBMC as effector cells. The analysis was carried out as described in example 8.4 above.

Результаты анализов цитотоксичности на основе СКАФ (FACS) с нестимулированными МКПК (PBMC) человека в качестве эффекторных клеток и трансфектированными МЗЛН (MSLN) человека клетками ЯКХ (CHO) в качестве мишеней приведены в табл. 7.The results of SCAF-based cytotoxicity assays (FACS) with unstimulated human PBMCs as effector cells and transfected human MSLNs (MSLNs) as targets are shown in Table 1. 7.

- 52 042291- 52 042291

Таблица 6. Цитотоксическая активность нестимулированных МКПК (PBMC) человека против трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) в отсутствие и в присутствии _____________________растворимого МЗЛН (MSLN)_________________Table 6 Cytotoxic activity of unstimulated human PBMCs against transfected human MSLNs (MSLNs) of human CHO cells in the absence and presence of _____________________soluble MSLNs (MSLN)_________________

Без sMSLN Without sMSLN С 50 нг/мл sMSLN With 50 ng/ml sMSLN С 400 нг/мл sMSLN With 400 ng/ml sMSLN BiTE х I2C-HALB BiTE x I2C-HALB ЕС50 [пМ] EC50 [pM] ЕС50 [пМ] EC50 [pM] ЕС50 [пМ] EC50 [pM] MS-1 MS-1 12 12 53 53 215 215 MS-8 MS-8 3,4 3.4 8,3 8.3 39 39 MS-2 MS-2 2,4 2.4 2,9 2.9 6, 3 6, 3 MS-3 MS-3 1,2 1.2 3,0 3.0 16 16 MS-4 MS-4 1,5 1.5 3,9 3.9 11 eleven MS-5 MS-5 1,0 1.0 2,2 2.2 11 eleven MS-6 MS-6 1,1 1.1 2,6 2.6 12 12 MS-7 MS-7 8,1 8.1 28 28 166 166

Как и ожидалось, значения EC50 в целом были выше в анализах цитотоксичности с нестимулированными МКПК (PBMC) в качестве эффекторных клеток по сравнению с анализами цитотоксичности с применением стимулированных CD8+ T-клеток человека (см. Пример 8.2).As expected, EC50 values were generally higher in cytotoxicity assays with unstimulated PBMCs as effector cells compared to cytotoxicity assays using stimulated human CD8+ T cells (see Example 8.2).

Пример 5.6. Активность перенацеливания нестимулированных МКПК (PBMC) человека против МЗЛН (MSLN)-положительной клеточной линии клеток OVCAR-8Example 5.6. Retargeting activity of unstimulated human PBMCs against MSLN (MSLN)-positive OVCAR-8 cell line

Дополнительно, цитотоксическую активность конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) изучали в анализе цитотоксичности на основе СКАФ (FACS) с применением МЗЛН (MSLN)-положительной клеточной линии человека OVCAR-8 в качестве источника клетокмишеней и нестимулированных МКПК (PBMC) человека в качестве эффекторных клеток. Анализ проводили, как описано в примере 8.4 выше. Результаты приведены в табл. 7.Additionally, the cytotoxic activity of anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs was studied in a SCAF-based cytotoxicity assay (FACS) using the MSLN-positive human cell line OVCAR-8 as a source of target cells and unstimulated PBMCs (PBMCs). ) human as effector cells. The analysis was carried out as described in example 8.4 above. The results are shown in table. 7.

Таблица 7. Значения EC50 [пМ] конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3), определенные в 48-часовом анализе цитотоксичности на основе СКАФ (FACS) с нестимулированными МКПК (PBMC) человека в качестве эффекторных клеток и клеточной линии OVCAR-8 человека в качестве источника клеток-мишенейTable 7. EC50 values [pM] of anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs determined in a 48-hour SCAF-based cytotoxicity assay (FACS) with unstimulated human PBMCs as effector cells and the OVCAR cell line -8 human as a source of target cells

BiTE х I2C-HALB BiTE x I2C-HALB EC50 [nM] EC50 [nM] MS 1 MS 1 5,9 5.9 MS 8 MS 8 13 13 MS 2 MS 2 18 18 MS 3 MS 3 1,5 1.5 MS 4 MS 4 2,0 2.0 MS 5 MS 5 1,9 1.9 MS 6 MS 6 2,3 2.3 MS 7 MS 7 9,7 9.7

Пример 5.7. Активность перенацеливания T-клеток макака против экспрессирующих Example 5.7. Retargeting activity of macaque T cells against expressing МЗЛН MZLN

(MSLN) макака клеток ЯКХ (CHO)(MSLN) macaque cell YCH (CHO)

Цитотоксическую активность конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) изучали в анализе цитотоксичности на основе СКАФ (FACS) с применением клеток ЯКХ (CHO), трансфектированных МЗЛН (MSLN) макака (яванца), в качестве клеток-мишеней, и линии T-клеток макака 4119LnPx (Knappe et al., Blood 95: 3256-61 (2000)) в качестве источника эффекторных клеток. Маркировку клеток-мишеней для трансфектированных МЗЛН (MSLN) макака клеток ЯКХ (CHO) и анализ цитотоксической активности на основе проточной цитометрии проводили, как описано выше.The cytotoxic activity of anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs was studied in a SCAF-based cytotoxicity assay (FACS) using Macaque (Javanese) MSLN (MSLN) cells as target cells, and macaque T cell line 4119LnPx (Knappe et al., Blood 95: 3256-61 (2000)) as source of effector cells. Target cell labeling for macaque transfected MSLN (MSLN) YCC cells (CHO) and analysis of cytotoxic activity based on flow cytometry were performed as described above.

Результаты приведены в табл. 8. T-клетки макака из клеточной линии 4119LnPx были индуцированы для эффективного уничтожения трансфектированных МЗЛН (MSLN) макака клеток ЯКХ (CHO) конструкциями биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) по изобретению.The results are shown in table. 8. Macaque T cells from the 4119LnPx cell line were induced to efficiently kill transfected macaque MSLN (MSLN) YCC (CHO) cells with the bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs of the invention.

Таблица 8. Значения EC50 [пМ] конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3), определенные в 48-часовом анализе цитотоксичности на основе СКАФ (FACS) с линией Tклеток макака 4119LnPx в качестве эффекторных клеток и трансфектированными МЗЛН (MSLN) макака клетками ЯКХ (CHO) в качестве клеток-мишенейTable 8. EC50 values [pM] of anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs determined in a 48-hour SCAF-based cytotoxicity assay (FACS) with the 4119LnPx macaque T cell line as effector cells and transfected MSLNs (MSLN) macaque with CHO cells as target cells

BiTE x I2C-HALB BiTE x I2C-HALB EC50 [nM] EC50 [nM] MS 1 MS 1 434 434 MS 8 MS 8 1589 1589 MS 2 MS 2 583 583

- 53 042291- 53 042291

Пример 5.8. Зазор активности между мономерной и димерной изоформой конструкций биспецифи-Example 5.8. The activity gap between the monomeric and dimeric isoform of the bispecific constructs

MS 3 MS 3 56 56 MS 4 MS 4 67 67 MS 5 MS 5 85 85 MS 6 MS 6 100 100 MS 7 MS 7 1791 1791

ческих антителic antibodies

С целью определения разницы в цитотоксической активности между мономерной и димерной изоформой отдельных конструкций биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) (которая называется зазором активности), проводили 18-часовое исследование цитотоксичности с высвобождением хрома-51, как описано выше (пример 8.1) с мономером и димером очищенного биспецифического антитела. Эффекторные клетки представляют собой стимулированные обогащенные CD8+ T-клетки человека. Клетки-мишени представляют собой трансфектированные hu МЗЛН (MSLN) клетки ЯКХ (CHO). Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней (Э:М) составляет 10:1. Зазор активности вычисляют как соотношение между значениями EC50.In order to determine the difference in cytotoxic activity between the monomeric and dimeric isoform of individual anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody constructs (referred to as activity gap), an 18-hour chromium-51 releasing cytotoxicity study was performed as described above (Example 8.1) with the monomer and dimer of the purified bispecific antibody. The effector cells are stimulated enriched human CD8+ T cells. The target cells are hu-transfected MSLN (MSLN) cells of CHO. The ratio of effector cells to target cells (E:M) is 10:1. The activity gap is calculated as the ratio between the EC 50 values.

Результаты анализов, проведенных со стимулированными обогащенными CD+ T-клетками человека в роли эффекторных клеток и трансфектированными МЗЛН (MSLN) человека клетками ЯКХ (CHO) в качестве мишеней приведены в табл. 9.The results of assays performed with stimulated human CD+ T cells as effector cells and transfected human MSLN (MSLN) human HCC (CHO) cells as targets are shown in Table 1. 9.

Таблица 9. Цитотоксическая активность нестимулированных МКПК (PBMC) человека против трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) с применением мономерных и димерных конструкций биспецифических антител МЗЛН (MSLN) х КД3 (C D3)Table 9. Cytotoxic activity of unstimulated human PBMCs against transfected human MSLNs (MSLN) of human HCC (CHO) cells using monomeric and dimeric constructs of bispecific antibodies MSLN (MSLN) x CD3 (C D3)

BiTE x I2C-HALB BiTE x I2C-HALB EC50 [пМ] мономер димерEC 50 [pM] monomer dimer Соотношение мономера к димеру (ЕС50 мономера /ЕС50 димера)Monomer to dimer ratio (EU 50 monomer/EC 50 dimer) MS 1 MS 1 1,5 1.5 1,7 1.7 0,9 0.9 MS 8 MS 8 6,5 6.5 9,5 9.5 0,7 0.7 MS 2 MS 2 2,0 2.0 2,0 2.0 1,0 1.0 MS 3 MS 3 0,2 0.2 0,7 0.7 0,3 0.3 MS 4 MS 4 ο,ι ο,ι 0,9 0.9 0,1 0.1 MS 5 MS 5 0,2 0.2 1,1 1.1 0,2 0.2 MS 6 MS 6 0,5 0.5 3,4 3.4 0,1 0.1 MS 7 MS 7 6, 0 6.0 21 21 0,3 0.3

Пример 6. Стабильность после инкубации в плазме человека в течение 24 чExample 6 Stability after incubation in human plasma for 24 hours

Очищенные конструкции биспецифических антител инкубируют в соотношении 1:5 в пуле плазмы человека при 37°C в течение 96 ч при конечной концентрации 2-20 мкг/мл. После инкубации в плазме конструкции антител сравнивают в анализе высвобождения хрома-51 с применением стимулированных обогащенных CD8+ T-клеток человека и трансфектированных МЗЛН (MSLN) человека клеток ЯКХ (CHO) при начальной концентрации 0,01-0,1 мкг/мл с соотношением эффекторных клеток и клетокмишеней (Э:М) 10:1 (анализ проводят, как описано в примере 8.1). В качестве контроля включают неинкубированные, недавно размороженные конструкции биспецифических антител.Purified bispecific antibody constructs are incubated 1:5 in pooled human plasma at 37°C for 96 hours at a final concentration of 2-20 μg/mL. Following plasma incubation, antibody constructs are compared in a chromium-51 release assay using stimulated enriched human CD8+ T cells and transfected human MSLN (CHO) cells at an initial concentration of 0.01-0.1 μg/mL with an effector ratio of cells and target cells (E:M) 10:1 (analysis carried out as described in example 8.1). Unincubated, freshly thawed bispecific antibody constructs are included as controls.

Результаты приведены в табл. 10 ниже. Все протестированные конструкции антител продемонстрировали в высокой степени благоприятную стабильность в плазме (EC50 плазма/EC50 контроль) меньше или равно 4.The results are shown in table. 10 below. All antibody constructs tested showed highly favorable plasma stability (EC 50 plasma/EC 50 control) less than or equal to 4.

Таблица 10. Значения EC50 конструкций антител с инкубацией в плазме и без нее и _____________вычисленное значение соотношения плазмы/контроля________Table 10. EC 50 values of antibody constructs with and without plasma incubation and ______ calculated plasma/control ratio _______

BiTE х I2C-HALB BiTE x I2C-HALB EC50 [nM] с плазмой без плазмыEC 50 [nM] with plasma without plasma Соотношение плазмы к контролю (ЕС50 плазма /ЕС50 контроль)Plasma to control ratio (EC 50 plasma /EC 50 control) MS 1 MS 1 3,0 3.0 1,5 1.5 2,0 2.0 MS 8 MS 8 4,8 4.8 6,5 6.5 0,7 0.7 MS 2 MS 2 6,7 6.7 2,0 2.0 3,4 3.4 MS 3 MS 3 0,3 0.3 0,2 0.2 1,5 1.5 MS 4 MS 4 0,4 0.4 0,1 0.1 4 4 MS 5 MS 5 0,3 0.3 0,2 0.2 1,5 1.5 MS 6 MS 6 0,6 0.6 0,5 0.5 1,2 1.2 MS 7 MS 7 11,4 11.4 6, 0 6.0 1,9 1.9

Пример 7. Гомогенность белка по данным высокоэффективной катионообменной хроматографии Гомогенность белка для конструкций антител по изобретению анализируют при помощи высоко- 54 042291 эффективной катионообменной хроматографии, КОХ (CIEX).Example 7 Protein Homogeneity Based on High Performance Cation Exchange Chromatography Protein homogeneity for antibody constructs of the invention was analyzed using high performance cation exchange chromatography, KOC (CIEX).

мкг мономера конструкции антитела разбавляют 50 мл буфера связывания A (20 мМ дигидрофосфата натрия, 30 мМ NaCl, 0,01% октаната натрия, pH 5,5) и 40 мл полученного раствора наносят на колонку BioPro SP-F 1 мл (YMC, Германия), подключенную к устройству Akta Micro FPLC (GE Healthcare, Германия). После связывания образца проводят стадию промывания дополнительным количеством буфера связывания. Для элюации белка применяют линейный понижающий градиент соли с применением буфера B (20 мМ дигидрофосфата натрия, 1000 мМ NaCl, 0,01% октаната натрия, pH 5,5) до 50% буфера B в течение 10 объемов колонки. Весь прогон контролируют по оптической плотности на длине волны 280, 254 и 210 нм. Анализ проводят путем интеграции пиков сигнала на длине волны 280 нм, зарегистрированных на оценочном листе прогона программным обеспечением Akta Unicorn.μg of the antibody construct monomer is diluted with 50 ml of binding buffer A (20 mM sodium dihydrogen phosphate, 30 mM NaCl, 0.01% sodium octanate, pH 5.5) and 40 ml of the resulting solution is applied to a 1 ml BioPro SP-F column (YMC, Germany ) connected to an Akta Micro FPLC device (GE Healthcare, Germany). After binding the sample, a washing step is carried out with additional binding buffer. A linear salt gradient was used to elute the protein using buffer B (20 mM sodium dihydrogen phosphate, 1000 mM NaCl, 0.01% sodium octanate, pH 5.5) to 50% buffer B over 10 column volumes. The entire run is controlled by optical density at a wavelength of 280, 254 and 210 nm. The analysis is performed by integrating the signal peaks at 280 nm recorded on the run score sheet by the Akta Unicorn software.

Результаты приведены в табл. 11 ниже. Почти все протестированные конструкции антител продемонстрировали в высокой степени благоприятную гомогенность больше или равно 80% (площадь под кривой (= AUC) основного пика). Единственным исключением является биспецифическая конструкция MS-2xCD3-HALB, с гомогенностью всего 67%.The results are shown in table. 11 below. Nearly all antibody constructs tested showed highly favorable homogeneity greater than or equal to 80% (area under the curve (=AUC) of the main peak). The only exception is the MS-2xCD3-HALB bispecific construct, with only 67% homogeneity.

Таблица 11. Гомогенность белка для конструкций антител (% AUC основного пика)Table 11. Protein homogeneity for antibody constructs (% AUC of the main peak)

MSLN HALB BiTE MSLN HALB BiTE AUC основного пика [%] Main Peak AUC [%] MS 1 MS 1 100 100 MS 8 MS 8 93 93 MS 2 MS 2 67 67 MS 3 MS 3 87 87 MS 4 MS 4 80 80 MS 5 MS 5 89 89 MS 6 MS 6 81 81 MS 7 MS 7 100 100

Пример 8. Гидрофобность поверхности, измеренная методом ХГВ (HIC)Example 8 Surface Hydrophobicity Measured by the CHB Method (HIC)

БутилButyl

Гидрофобность поверхности конструкций биспецифических антител по изобретению тестировали методом хроматографии с гидрофобным взаимодействием, ХГВ (HIC) в проточном режиме.The surface hydrophobicity of the bispecific antibody constructs of the invention was tested by hydrophobic interaction chromatography, CHB (HIC) in flow mode.

мкг мономера конструкции антитела разбавляют генерическим буфером препарата до конечного объема 500 мкл (10 мМ лимонной кислоты, 75 мМ лизина HCl, 4% трегалозы, pH 7,0) и наносят на колонку с бутилсефарозой FF 1 мл (GE Healthcare, Германия), подключенную к системе FPLC Akta Purifier (GE Healthcare, Германия). Весь прогон контролируют по оптической плотности на длине волны 280, 254 и 210 нм. Анализ проводят путем интеграции пиков сигнала на длине волны 280 нм, зарегистрированных на оценочном листе прогона программным обеспечением Akta Unicorn. Поведение при элюации оценивают путем сравнения площади и скорости нарастания и снижения сигнала белка, что указывает на прочность взаимодействия химеры BiTE альбумина с матрицей.μg of the monomer of the antibody construct is diluted with the generic preparation buffer to a final volume of 500 μl (10 mM citric acid, 75 mM lysine HCl, 4% trehalose, pH 7.0) and applied to a 1 ml butylsepharose FF column (GE Healthcare, Germany) connected to the FPLC Akta Purifier system (GE Healthcare, Germany). The entire run is controlled by optical density at a wavelength of 280, 254 and 210 nm. The analysis is performed by integrating the signal peaks at 280 nm recorded on the run score sheet by the Akta Unicorn software. The elution behavior is assessed by comparing the area and rate of rise and fall of the protein signal, which indicates the strength of the interaction of the BiTE albumin chimera with the matrix.

Конструкции антител демонстрировали благоприятное поведение при элюации, которая в основном была быстрой и полной (см. табл. 12).The antibody constructs exhibited favorable elution behavior, which was generally fast and complete (see Table 12).

Таблица 12. Гидрофобность поверхности конструкций биспецифических антителTable 12. Surface hydrophobicity of bispecific antibody constructs

Пример 9. Превращение мономера в димер после (i) трех циклов замораживания/оттаивания и (ii) 7 дней инкубации в концентрации 250 мкг/млExample 9 Monomer to dimer conversion after (i) three freeze/thaw cycles and (ii) 7 days of incubation at 250 µg/ml

Мономерную конструкцию биспецифического антитела против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) подвергали воздействию различных стрессовых условий, с последующим анализом методом высокоэффективной ЭХ (SEC), чтобы определить процент первоначально мономерной конструкции антитела, которая превратилась димерную конструкцию антитела.The monomeric anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) bispecific antibody construct was subjected to various stress conditions, followed by high performance SEC (SEC) analysis to determine the percentage of the originally monomeric antibody construct that evolved into a dimeric antibody construct.

(i) 25 мкг мономерной конструкции антитела доводят до концентрации 250 мкг/мл при помощи генерического буфера препарата, после чего замораживают при минус 80°C в течение 30 мин с последующим оттаиванием в течение 30 мин при комнатной температуре. После трех циклов замораживания/оттаивания содержание димера определяют методом ВЭ-ЭХ (HP-SEC).(i) 25 μg of the monomeric antibody construct is adjusted to a concentration of 250 μg/ml with generic formulation buffer, and then frozen at -80°C for 30 min followed by thawing for 30 min at room temperature. After three freeze/thaw cycles, the dimer content is determined by HP-SEC.

- 55 042291 (ii) 25 мкг мономерной конструкции антитела доводят до концентрации 250 мкг/мл при помощи генерического буфера препарата, после чего инкубируют при 37°C в течение 7 дней. Содержание димера определяют методом ВЭ-ЭХ (HP-SEC).- 55 042291 (ii) 25 μg of the monomeric antibody construct is adjusted to a concentration of 250 μg/ml with generic formulation buffer and then incubated at 37° C. for 7 days. The content of the dimer is determined by HP-SEC (HP-SEC).

Высокоэффективную колонку для ЭХ (SEC) TSK Gel G3000 SWXL (Tosoh, Токио, Япония) подключают к Akta Purifier 10 FPLC (GE Lifesciences), оснащенному автосемплером A905. Колонку уравновешивают, а буфер анализа состоит из 100 мМ KH2PO4-200 мМ Na2SO4, с коррекцией pH до 6,6. Раствор антитела (25 мкг белка) наносят на уравновешенную колонку и осуществляют элюацию со скоростью потока 0,75 мл/мин при максимальном давлении 7 МПа. Весь прогон контролируют по оптической плотности на длине волны 280, 254 и 210 нм. Анализ проводят путем интеграции пиков сигнала на длине волны 210 нм, зарегистрированных на оценочном листе прогона программным обеспечением Akta Unicorn. Содержание димера вычисляют путем деления площади пика димера на общую площадь пика мономера плюс димера.A TSK Gel G3000 SWXL high performance SEC column (Tosoh, Tokyo, Japan) was connected to an Akta Purifier 10 FPLC (GE Lifesciences) equipped with an A905 autosampler. The column is equilibrated and the assay buffer consists of 100 mM KH2PO 4 -200 mM Na 2 SO 4 adjusted to pH 6.6. The antibody solution (25 μg of protein) is applied to a balanced column and eluted at a flow rate of 0.75 ml/min at a maximum pressure of 7 MPa. The entire run is controlled by optical density at a wavelength of 280, 254 and 210 nm. The analysis is performed by integrating the signal peaks at 210 nm recorded on the run score sheet by the Akta Unicorn software. The dimer content is calculated by dividing the dimer peak area by the total monomer plus dimer peak area.

Результаты приведены в табл. 13 ниже. Конструкции биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) х КД3 (CD3) по изобретению представлены с процентным содержанием димера 0,0% после трех циклов замораживания/оттаивания и с содержанием димера меньше или равно 2% после 7 дней инкубации при 37°C.The results are shown in table. 13 below. The bispecific anti-MSLN (MSLN) x CD3 (CD3) antibody constructs of the invention are provided with a percentage of dimer of 0.0% after three freeze/thaw cycles and with a dimer content of less than or equal to 2% after 7 days of incubation at 37°C.

Таблица 13. Процент мономерных и димерных конструкций биспецифических антител противTable 13. Percentage of monomeric and dimeric constructs of bispecific antibodies against

Пример 10. ТермостабильностьExample 10 Thermal Stability

Температуру агрегации антитела определяют следующим образом: 40 мкл раствора конструкции антитела с концентрацией 250 мкг/мл переносят в одноразовую кювету и помещают в устройство динамического рассеяния света Wyatt DynaPro Nanostar (Wyatt). Образец нагревают от 40 до 70°C со скоростью нагрева 0,5°С/мин с постоянным получением измеренного радиуса. Увеличение радиуса, указывающее на плавление белка и агрегацию, используется программным пакетом, поставляемым с устройством ДРС (DLS), для вычисления температуры агрегации конструкции антитела.The antibody aggregation temperature is determined as follows: 40 μl of a 250 μg/ml antibody construct solution is transferred into a disposable cuvette and placed in a Wyatt DynaPro Nanostar dynamic light scattering device (Wyatt). The sample is heated from 40 to 70° C. at a heating rate of 0.5° C./min, continuously obtaining a measured radius. The increase in radius, indicating protein melting and aggregation, is used by the software package supplied with the DLS device to calculate the aggregation temperature of the antibody construct.

Все протестированные конструкции биспецифических антител против МЗЛН (MSLN) x КД3 (CD3) по изобретению демонстрируют термическую стабильность с температурами агрегации больше или равно 49°C, как показано в табл. 14 ниже. Термическая стабильность группы конструкций антител, связывающихся с кластером эпитопа 2 плюс 3 даже составляет больше или равно 51°C и до больше или равно 56°C.All tested designs bispecific antibodies against MSLN (MSLN) x KD3 (CD3) according to the invention show thermal stability with aggregation temperatures greater than or equal to 49°C, as shown in table. 14 below. The thermal stability of a group of antibody constructs that bind to the 2 plus 3 epitope cluster is even greater than or equal to 51°C and up to greater than or equal to 56°C.

Таблица 14. Термостабильность конструкций биспецифических антител, определенная ______при помощи ДРС (DLS) (динамическое рассеяние света)Table 14. Thermal stability of bispecific antibody constructs determined by ______ using DLS (dynamic light scattering)

MSLN HALB BiTE MSLN HALB BiTE Термостабильность ДРС TA [°C]Thermal stability DRS T A [°C] MS 1 MS 1 49,3 49.3 MS 8 MS 8 51,0 51.0 MS 2 MS 2 53,1 53.1 MS 3 MS 3 51,6 51.6 MS 4 MS 4 56, 5 56.5 MS 5 MS 5 54,4 54.4 MS 6 MS 6 53, 9 53, 9 MS 7 MS 7 51,4 51.4

Пример 11. Мутность при концентрации антитела 2500 мкг/мл мл раствора очищенной конструкции антитела в концентрации 250 мкг/мл концентрируют при помощи модулей спин-концентрации до 2500 мкг/мл. После 16-часового хранения при 5°C мутность раствора антитела определяют по оптической плотности OD340 нм, проводя измерения против генерического буфера препарата.Example 11 Turbidity at an antibody concentration of 2500 μg/ml ml of a solution of the purified antibody construct at a concentration of 250 μg/ml was concentrated using spin modules to 2500 μg/ml. After 16 hours storage at 5°C, the turbidity of the antibody solution is determined by the optical density OD340 nm, measured against the generic buffer of the drug.

Результаты приведены в табл. 15 ниже. Все тестируемые конструкции антител демонстрируют вThe results are shown in table. 15 below. All tested antibody constructs are shown in

- 56 042291 высокой степени благоприятную мутность меньше или равно 0,09.- 56 042291 highly favorable turbidity less than or equal to 0.09.

Таблица 15. Мутность конструкций антител после концентрирования до 2,5 мг/мл в течение ночиTable 15. Turbidity of antibody constructs after concentration to 2.5 mg/mL overnight

MSLN HALB BiTE MSLN HALB BiTE Мутность через 16 час при 2500 мкг/мл [OD340] Turbidity at 16 hours at 2500 µg/mL [OD340] MS 1 MS 1 0,080 0.080 MS 8 MS 8 0,079 0.079 MS 2 MS 2 0,070 0.070 MS 3 MS 3 0,087 0.087 MS 4 MS 4 0,076 0.076 MS 5 MS 5 0,071 0.071 MS 6 MS 6 0,070 0.070 MS 7 MS 7 0,066 0.066

Пример 12. Экспрессия CD69, индуцированная BiTE® на T-клетках в отсутствие клеток-мишенейExample 12 BiTE®-Induced CD69 Expression on T Cells in the Absence of Target Cells

Выделенные МКПК (PBMC) здоровых людей-доноров культивировали с увеличивающимися концентрациями CDH19/CD3 или MSLN/CD3 HLE биспецифических антител в течение 48 ч. Экспрессию активационного маркера CD69 на T-клетках определяли путем иммуноокрашивания и проточной цитометрии и антигенспецифических конъюгатов mAb.Isolated PBMCs from healthy human donors were cultured with increasing concentrations of CDH19/CD3 or MSLN/CD3 HLE bispecific antibodies for 48 hours. Expression of the activation marker CD69 on T cells was determined by immunostaining and flow cytometry and antigen-specific mAb conjugates.

Независимая от мишени активация T-клеток в показателях активации CD69 наблюдалась для всех конструкций анти-CDH 19, но была наиболее выражена для молекул гетеро-Fc и кросс-тел. Активация CD69 анти-CDH19-scFc происходила при более высоких концентрациях, и амплитуда была частично ниже по сравнению с двумя другими конструкциями на основе Fc.Target-independent T-cell activation in terms of CD69 activation was observed for all anti-CDH 19 constructs, but was most pronounced for hetero-Fc molecules and cross-bodies. CD69 activation by anti-CDH19-scFc occurred at higher concentrations and the amplitude was partially lower compared to the other two Fc-based constructs.

В случае анти-МЗЛН (MSLN) почти не наблюдалось независимой от мишени активации T-клеток для scFc-содержащей молекулы, в то время как конструкция гетеро-Fc индуцировала выраженную активацию CD69 на клеточной поверхности T-клеток в отсутствие клеток-мишеней.In the case of anti-MLN (MSLN), almost no target-independent T cell activation was observed for the scFc-containing molecule, while the hetero-Fc construct induced pronounced CD69 activation on the cell surface of T cells in the absence of target cells.

Оценку независимой от мишени активации T-клеток, индуцированной конструкциями BiTE®, содержащими одноцепочечный Fc или слияние гетеро-Fc на C-конце, проводили для следующих конструкций:Target-independent T-cell activation induced by BiTE® constructs containing a single-stranded Fc or hetero-Fc fusion at the C-terminus was assessed for the following constructs:

Конструкции BiTE® (серийные разведения: 0,1 пМ - 2 мкМ)BiTE® constructs (serial dilutions: 0.1 pM - 2 μM)

a) MSLN scFc; 1,14 мг/мл;a) MSLN scFc; 1.14 mg/ml;

b) MSLN гетеро-Fc; 1,02 мг/b) MSLN hetero-Fc; 1.02 mg/

Эффекторные клетки МКПК (PBMC) человека (3 донора, № 065, № 823, № 836 (scFc) № 401, № 415, № 433 (гетеро-Fc), № 590, № 595, 598, № 605 (X-тело)).Human PBMC effector cells (3 donors, #065, #823, #836 (scFc) #401, #415, #433 (hetero-Fc), #590, #595, 598, #605 (X-body) )).

Время инкубации 48 ч.Incubation time 48 hours.

Определение экспрессии CD69 на CD4+ и CD8+ T-клетках при помощи проточного цитометра и антигенспецифических конъюгатов mAb. Результаты представлены на фиг. 15.Determination of CD69 expression on CD4+ and CD8+ T cells using a flow cytometer and antigen-specific mAb conjugates. The results are shown in FIG. 15.

Проведена оценка независимой от мишени активации T-клеток, индуцированной конструкциями антител BiTE®, содержащими одноцепочечное Fc, слияние гетеро-Fc или кросс-тело на C-конце, для следующих конструкций:Target-independent T-cell activation induced by BiTE® antibody constructs containing a single-stranded Fc, a hetero-Fc fusion, or a cross-body at the C-terminus was evaluated for the following constructs:

Конструкции BiTE® (серийные разведения: 0,1 пМ - 2 мкМ)BiTE® constructs (serial dilutions: 0.1 pM - 2 μM)

c) CDH19 scFc; 245,3 мкг/млc) CDH19 scFc; 245.3 µg/ml

d) CDH-19 гетеро-Fc; 1 мг/млd) CDH-19 hetero-Fc; 1 mg/ml

e) CDH19 X-тело; 6,3 мг/млe) CDH19 X body; 6.3 mg/ml

Эффекторные клетки МКПК (PBMC) человека (от 3 до 4 доноров, № 386, № 392, № 401 (scFc) № 282, № 284, № 287 (гетеро-Fc)).Human PBMC effector cells (3 to 4 donors, #386, #392, #401 (scFc) #282, #284, #287 (hetero-Fc)).

Время инкубации 48 ч.Incubation time 48 hours.

Определение экспрессии CD69 на CD4+ и CD8+ T-клетках при помощи проточного цитометра и антигенспецифических конъюгатов mAb. Результаты представлены на фиг. 16.Determination of CD69 expression on CD4+ and CD8+ T cells using a flow cytometer and antigen-specific mAb conjugates. The results are shown in FIG. 16.

Пример 13.Example 13

Очищенными конструкциями антител BiTE® покрывают планшет Maxisorb с понижающейся концентрацией (растворы 100 нм, разведение 1:4). После 3x промывания ФСБ-Т (PBS-T) и блокирования ФСБ (PBS)/3% (мас./об) альбумина телячьей сыворотки, АТС (BSA) (60 мин, 37°C) объединенную в пул плазму человека инкубируют в течение 60 мин при 80 об/мин и комнатной температуре. После 3x промывания добавляют мышиное моноклональное антитело, специфическое в отношении субъединицы A C1q человека (CC1q) (Thermo MA1-83963, 1:500) на 60 мин, 80 об/мин, комнатная температура и после описанных стадий промывания инкубируют с козьим антимышиным Fc-POX mAb (1:5000) в течение 60 мин, 80 об/мин, при комнатной температуре. После дополнительного промывания инкубируют с субстратом ТМБ (TMB, 3,3',5,5'-тетраметилбензидином) и после протекания колориметрической реакции останавливают добавлением H2SO4. Определяют поглощение при 450 нм.Purified BiTE® antibody constructs are coated on a decreasing concentration Maxisorb plate (100 nm solutions, 1:4 dilution). After washing 3x with PBS-T and blocking with PBS/3% (w/v) bovine serum albumin, ATC (BSA) (60 min, 37°C), pooled human plasma was incubated for 60 min at 80 rpm and room temperature. After washing 3 times, a mouse monoclonal antibody specific for human C1q subunit A (CC1q) (Thermo MA1-83963, 1:500) is added for 60 min, 80 rpm, room temperature and after the washing steps described, incubated with goat anti-mouse Fc- POX mAb (1:5000) for 60 min, 80 rpm, at room temperature. After additional washing, incubate with TMB substrate (TMB, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) and stop after a colorimetric reaction by adding H2SO4. Determine the absorbance at 450 nm.

Результат: Как представлено на фиг. 17 при высоких концентрациях, конструкция BiTE® гетеро-Fc (квадраты) продемонстрировала более высокие сигналы связывания для CC1q человека по сравнению с конструкцией одноцепочечного Fc (треугольник) BiTE®. В качестве отрицательного контроля применяют канонической Bite® (круг), который не продемонстрировал значительного связывания с CC1q.Result: As shown in FIG. 17 at high concentrations, the BiTE® hetero-Fc construct (squares) showed higher binding signals for human CC1q compared to the BiTE® single-stranded Fc (triangle) construct. As a negative control, the canonical Bite® (circle) was used, which showed no significant binding to CC1q.

- 57 042291- 57 042291

Пример 14. Фармакокинетика конструкций антител BiTE®, слитых с одноцепочечными Fc (scFc) и гетеро-Fc (hetFc) белкамиExample 14 Pharmacokinetics of BiTE® Antibody Constructs Fusion to Single Chain Fc (scFc) and Hetero-Fc (hetFc) Proteins

Осуществляют слияние различных антител BiTE®, связывающихся с мишенью, с двумя разными фрагментами, увеличивающими период полувыведения. Два различных HLE-варианта на антитело Bite®, впоследствии названные Bite®-scFc и Bite®-hetFc, были испытаны на яванских макаках в контексте фармакокинетических, ФК (PK) исследований. Соответствующая номенклатура указанных молекул кратко суммирована в табл. 16 ниже.Carry out the fusion of different BiTE® antibodies that bind to the target, with two different fragments that increase the half-life. Two different HLE variants of the Bite® antibody, subsequently named Bite®-scFc and Bite®-hetFc, were tested in cynomolgus monkeys in the context of pharmacokinetic, PK (PK) studies. The corresponding nomenclature of these molecules is briefly summarized in Table 1. 16 below.

Таблица 16. Номенклатура соединений для девяти однократно вводимых _________________конструкций антител Bite® HLE____________Table 16. Compound Nomenclature for Nine Single Injection _________________ Bite® HLE Antibody Constructs____________

Синоним соединения Connection Synonym Название испытуемого соединения Test compound name Соединение 1а Compound 1a CD33cc-scFc CD33cc-scFc Соединение 1b Compound 1b CD33cc-hetFc CD33cc-hetFc Соединение 2а Compound 2a MSLN-scFc MSLN-scFc Соединение 2Ь Compound 2b MSLN-hetFc MSLN-hetFc Соединение За Connection Per CDH19-scFc CDH19-scFc Соединение ЗЬ Compound 3b CH19-hetFc CH19-hetFc Соединение 4 Compound 4 CD20-scFc CD20-scFc Соединение 5а Compound 5a DLL3-scFc DLL3-scFc Соединение 5Ь Compound 5b DLL3-hetFc DLL3-hetFc

Конструкцию антитела BiTE® HLE вводят в виде внутривенного болюса (соединения 1b-5b) и внутривенной инфузии (соединение 1a, 30 минут) в дозе 6 мкг/кг (соединение 2b), 12 мкг/кг (соединения 2a и 3a-5b) и 15 мкг/кг (соединения 1a и 1b) соответственно. Для каждого из вышеуказанных соединений используют группу по меньшей мере от двух до трех животных. Отбирают образцы крови и готовят сыворотку для определения концентрации в сыворотке. Уровни конструкций антител в сыворотке Bite® измеряют при помощи иммуноанализа. Анализ проводят путем захвата BiTE® через его фрагментмишень, тогда как для обнаружения применяется антитело, нацеленное против КД3 (CD3) - связывающей части конструкции. Профили концентрации в сыворотке-времени используют для определения параметров ФК (PK). Временные точки отбора образцов крови приведены в табл. 17 ниже.The BiTE® HLE antibody construct is administered as an intravenous bolus (compounds 1b-5b) and intravenous infusion (compound 1a, 30 minutes) at a dose of 6 μg/kg (compound 2b), 12 μg/kg (compounds 2a and 3a-5b) and 15 μg/kg (compounds 1a and 1b), respectively. For each of the above compounds, a group of at least two to three animals is used. Blood samples are taken and serum is prepared to determine the serum concentration. Bite® serum levels of antibody constructs are measured by immunoassay. The assay is performed by trapping BiTE® through its target fragment, while detection uses an antibody directed against CD3 (CD3), the binding portion of the construct. Serum concentration-time profiles are used to determine PK parameters. Time points for blood sampling are given in Table. 17 below.

Таблица 17. Временные точки отбора образцов крови во время исследования ФК (PK)Table 17 Time points for blood sampling during the PK study

Временные точки отбора образцов крови для соед. 1а [час] Temporary blood sampling points for conn. 1a [hour] Временные точки отбора образцов крови для соед. 1Ь [час] Temporary blood sampling points for conn. 1b [hour] Временные точки отбора образцов крови для соед. 2а-5Ь [час] Temporary blood sampling points for conn. 2a-5b [hour] 0,085 0.085 0, 085 0.085 0,05 0.05 4,00 4.00 1 1 0,25 0.25 24,00 24.00 4 4 0,5 0.5 48,00 48.00 12 12 1 1 72,00 72.00 24 24 4 4 96, 00 96.00 48 48 8 8 120,00 120.00 72 72 24 24 144,00 144.00 96 96 48 48 168 168 144 144 72 72 168 168 168 168 240 240 336 336

Типичная фармакокинетика четырех парных конструкций антитела BiTE®-HLE представлена на фиг. 18. Каждая пара соответствует одному и тому же белку BiTE®, слитому с расширением scFc- или hetFc. Для всех белков уровни в сыворотке измеряли во всех точках времени у всех животных после введения BiTE®-HLE. Профили ФК (PK) описывают двухфазное экспоненциальное снижение после каждого однократного введения испытуемого продукта.Representative pharmacokinetics of four paired BiTE®-HLE antibody constructs are shown in FIG. 18. Each pair corresponds to the same BiTE® protein fused to the scFc- or hetFc extension. For all proteins, serum levels were measured at all time points in all animals after administration of BiTE®-HLE. The PK (PK) profiles describe a biphasic exponential decline after each single administration of the test product.

Фармакокинетические параметры определяли с применением стандартных методов некомпартментального анализа, НКА (NCA). С применении некомпартментального анализа были оценены следующие параметры ФК (PK): AUCinf (площадь под кривой концентрации в сыворотке-времени), Vss (объем распределения в стационарной фазе), CL (системный клиренс) и терминальный t1/2 (терминальный период полувыведения),Pharmacokinetic parameters were determined using standard methods of non-compartmental analysis, NCA (NCA). Using non-compartmental analysis, the following PK parameters were evaluated: AUCinf (area under the serum concentration-time curve), Vss (volume of distribution in the stationary phase), CL (systemic clearance) and terminal t 1/2 (terminal half-life) ,

Параметр ФК (PK) для каждого испытуемого соединения суммирован как среднее значение n=2 и n=3, соответственно, в табл. 18 ниже.The PK parameter (PK) for each test compound is summarized as the mean of n=2 and n=3, respectively, in Table 1. 18 below.

- 58 042291- 58 042291

Таблица 18. Фармакокинетический параметр scFc- и гетеро-Тс-вариантов разных BiTE®, ______________связывающихся с мишенью, у яванских макак ________Table 18. Pharmacokinetic parameter of scFc- and hetero-Tc-variants of different BiTE®, ______________ binding to the target, in cynomolgus monkeys ________

Испытуемый продукт Test product Терминальный t1/2 [час]Terminal t 1/2 [h] AUCinf [час*нг/мл]AUC inf [h*ng/ml] С1 [мл/час/кг] C1 [ml/h/kg] Vss [мл/кг] Vss [ml/kg] Соединение 1а Compound 1a 167 167 6645 6645 1,4 1.4 256 256 Соединение 1Ь Compound 1b 95 95 4955 4955 2,6 2.6 261 261 Соединение 2а Compound 2a 213 213 12072 12072 0,73 0.73 179 179 Соединение 2Ь Compound 2b 116 116 6971 6971 0,8 0.8 78 78 Соединение За Connection Per 61 61 3293 3293 3,6 3.6 129 129 Соединение ЗЬ Compound 3b 59 59 3633 3633 3,3 3.3 79 79 Соединение 4 Compound 4 97 97 6266 6266 1,9 1.9 180 180 Соединение 5а Compound 5a 234 234 24769 24769 0,48 0.48 144 144 Соединение 5Ь Compound 5b 173 173 14639 14639 0,82 0.82 166 166

В целом, AUCinf для различных пар BiTE®-HLE, связывающихся с мишенью, слитых с фрагментом -scFc или -hetFc, соответственно, составляет от 3293 час-нг/мл до 24769 час-нг/мл, в зависимости от контекста мишени BiTE®, Все анализируемые химеры HLE достигали значений системного клиренса от 0,48 до 3,6 мл/ч/кг. Соответствующие объемы распределения находились в диапазоне от 78 до 261 мл/кг.Overall, the AUCinf for various target-binding BiTE®-HLE pairs fused to either -scFc or -hetFc fragment, respectively, ranges from 3293 h-ng/mL to 24769 h-ng/mL, depending on the context of the BiTE® target , All analyzed HLE chimeras achieved systemic clearance values from 0.48 to 3.6 ml/h/kg. The corresponding distribution volumes ranged from 78 to 261 ml/kg.

Пример 15.Example 15

Осуществляют обмен против буфера предварительно составленных субстанций лекарственных средств, содержащих очищенные MSLN-hALB, MSLN-hFc и MSLN-scFc, соответственно, посредством ультрафильтрации/диафильтрации с применением мембран с порогом молекулярной массы, ПММ (MWCO) 10 кДа. Окончательное составление проводят путем добавления концентрированных запасных растворов. Полученные препараты для каждой конструкции приведены в табл. 19 и включают K60RTrT, состоящий из 20 мМ фосфата калия, 150 мМ гидрохлорида L-аргинина, 6% (мас./об) трегалозы дигидрата, 0,9% (мас./об) полисорбата 80 при pH 6,0, и G40MSuT, состоящий из 10 мМ глутамата, 4% (мас./об) маннита, 2% (мас./об) сахарозы, 0,01% (мас./об) полисорбата 80, при pH 4,0. Концентрация белкамишени составляет 1,0 мг/мл. Препаратами конструкций МЗЛН (MSLN) заполняют в объеме 1 мл стеклянные флаконы типа I, которые закупоривают пробками из бутилового каучука и алюминиевыми колпачками под обкатку. Заполненные флаконы инкубируют при -20, 5, 25 и 37°С. Один флакон каждой версии подвергают пяти циклам замораживания и оттаивания, 3/0 (F/Т). Температура замораживания составляет -29°С. Целевая температура оттаивания составляет 2°С. Скорость повышения составляет приблизительно 0,3 К/мин.An exchange is carried out against a buffer of preformulated drug substances containing purified MSLN-hALB, MSLN-hFc and MSLN-scFc, respectively, by ultrafiltration/diafiltration using membranes with a molecular weight threshold, PMM (MWCO) of 10 kDa. The final composition is carried out by adding concentrated stock solutions. The resulting preparations for each design are given in table. 19 and includes K60RTrT consisting of 20 mM potassium phosphate, 150 mM L-arginine hydrochloride, 6% (w/v) trehalose dihydrate, 0.9% (w/v) polysorbate 80 at pH 6.0, and G40MSuT , consisting of 10 mM glutamate, 4% (w/v) mannitol, 2% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) polysorbate 80, at pH 4.0. The target protein concentration is 1.0 mg/ml. The MSLN preparations are filled in a volume of 1 ml into glass vials of type I, which are sealed with butyl rubber stoppers and aluminum caps for running. The filled vials are incubated at -20, 5, 25 and 37°C. One vial of each version is subjected to five freeze and thaw cycles, 3/0 (F/T). The freezing temperature is -29°C. The target defrosting temperature is 2°C. The rate of increase is approximately 0.3 K/min.

Видимые механические включения оценивают обученные операторы в соответствии со способом, описанным в Европ. Фарм. 2.9.20. Количество видимых механических включений на флакон указано в табл. 7. Количество видимых (больше 125 мкм) частиц белка было выше для MSLN-hFc по сравнению с MSLN-hALB и MSLN-scFc.Visible particles are assessed by trained operators in accordance with the method described in Europ. Pharm. 2.9.20. The number of visible mechanical inclusions per vial is indicated in Table. 7. The number of visible (greater than 125 µm) protein particles was higher for MSLN-hFc compared to MSLN-hALB and MSLN-scFc.

Таблица 19. Количество видимых частиц белка на флакон для подвергавшихся и не подвергавшихся стрессу (ТО) образцов, содержащих различные конструкции антимезотелинового (МЗЛН (MSLN)) BiTE® с увеличенным периодом полувыведения. K60RTrT обозначает препарат, содержащий 20 мМ фосфата калия, 150 мМ гидрохлорида L-аргинина, 6% (мас./об) трегалозы дигидрата, 0,01% (мас./об) полисорбата 80, pH 6,0. G40MSuT обозначает препарат, содержащий 10 мМ глутамата, 4% (мас./об) маннита, 2% (мас./об) сахарозы, 0,01% (мас./об) полисорбата 80, pH 4,0________________________________Table 19. Number of visible protein particles per vial for stressed and unstressed (TO) samples containing various extended half-life anti-mesothelin (MSLN) BiTE® constructs. K60RTrT refers to a preparation containing 20 mM potassium phosphate, 150 mM L-arginine hydrochloride, 6% (w/v) trehalose dihydrate, 0.01% (w/v) polysorbate 80, pH 6.0. G40MSuT refers to a preparation containing 10 mM glutamate, 4% (w/v) mannitol, 2% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) polysorbate 80, pH 4.0________________________________

Конструкция Design hALB hALB hFc hFc scFc scFc Препарат A drug K60RTrT K60RTrT K60RTrT K60RTrT G40MSuT G40MSuT K60RTrT K60RTrT G40MSuT G40MSuT Количество видимых (больше 125 мкм) частиц белка на флакон Number of visible (greater than 125 µm) protein particles per vial ТО THAT 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 5 циклов 3/0 (F/T) 5 cycles 3/0 (F/T) 0 0 2 2 2 2 0 0 1 1 2 нед 5°С 2 weeks 5°C 0 0 2 2 2 2 0 0 0 0 2 нед 25°С 2 weeks 25°С 0 0 2 2 1 1 0 0 0 0 2 нед 37°С 2 weeks 37°C 0 0 2 2 2 2 0 0 0 0 4 нед -20°С 4 weeks -20°C 0 0 2 2 1 1 0 0 0 0 4 нед 5°С 4 weeks 5°С 0 0 1 1 2 2 0 0 0 0 4 нед 25°С 4 weeks 25°C 0 0 2 2 2 2 0 0 0 0 4 нед 37°С 4 weeks 37°C 0 0 2 2 2 2 0 0 0 0

Описанные выше образцы дополнительно анализировали при помощи сверхвысокоэффективнойThe samples described above were further analyzed using an ultra high performance

-59042291 эксклюзионной, ЭХ-СВЭХ (SE-UPLC) с целью количественного определения процентного содержания высокомолекулярных форм, ВМФ (HMWS). ЭХ-СВЭХ (SE-UPLC) проводят на системе СВЭХ (UPLC) AcquityH-Class (Waters) с применением колонки Acquity UPLC ВЕН200 SEC 150 мм (Waters). Температуру колонки устанавливают на уровне 25°С. Разделение вариантов по размеру достигается применением изократического метода со скоростью потока 0,4 мл/мин. Подвижная фаза состоит из 100 мМ фосфата натрия, 250 мМ NaCI при pH 6,8. Время прогона составляет 6,0 мин. До проведения анализа образцы хранят при температуре 8°С в автосемплере. Вводят общее количество белка 3 мкг. Во избежание переноса промежуточную инъекцию 40% ацетонитрила проводят после прогона каждого образца. Обнаружение осуществляют на основе флуоресцентного излучения (возбуждение при 280 нм, эмиссия при 325 нм). Интеграцию пиков осуществляют с применением программного обеспечения Empower®. Представлена относительная площадь под кривой ВМФ (HMWS) (табл. 20).-59042291 size-exclusion, EC-SVEC (SE-UPLC) to quantify the percentage of high molecular weight forms, HMF (HMWS). EC-SWEC (SE-UPLC) is carried out on the system UPLC (UPLC) AcquityH-Class (Waters) using column Acquity UPLC BEN200 SEC 150 mm (Waters). The temperature of the column is set at 25°C. Separation of variants by size is achieved using an isocratic method with a flow rate of 0.4 ml/min. The mobile phase consists of 100 mM sodium phosphate, 250 mM NaCl at pH 6.8. The run time is 6.0 min. Prior to analysis, the samples are stored at 8°C in the autosampler. Enter the total amount of protein 3 mcg. To avoid carryover, an intermediate injection of 40% acetonitrile is given after each sample run. The detection is based on fluorescent emission (excitation at 280 nm, emission at 325 nm). Peak integration is performed using Empower® software. Relative area under the HMF curve (HMWS) is shown (Table 20).

Конструкции на основе Fc демонстрировали более низкое содержание ВМФ (HMWS) в варианте препарата G40MSuT, чем в K60RTrT, независимо от стрессовых условий. Стало очевидным, что MSLNscFc содержит меньше ВМФ (HMWS), чем МЗЛН (MSLN)-hFc, как в G40MSuT, так и в K60RTrT препаратах. MSLN-scFc в предпочтительном препарате (G40MSuT) был менее подвержен образованию ВМФ (HMWS), чем MSLN-hALB, составленный в K60RTrT. В предыдущих экспериментах этот буфер продемонстрировал улучшенный стабилизирующий потенциал для конструкций на основе hALB по сравнению с препаратами, имеющими более кислые значения pH.The Fc-based constructs showed lower HMF content (HMWS) in the G40MSuT formulation than in K60RTrT, regardless of stress conditions. It became apparent that MSLNscFc contains less HMWS than MSLN (MSLN)-hFc in both G40MSuT and K60RTrT preparations. The MSLN-scFc in the preferred formulation (G40MSuT) was less prone to HMF formation (HMWS) than the MSLN-hALB formulated in K60RTrT. In previous experiments, this buffer has shown an improved stabilizing potential for hALB-based constructs compared to preparations having more acidic pH values.

Таблица 20. Обзор содержания ВМФ (HMWS) в подвергавшихся и не подвергавшихся стрессу (ТО) препаратах MSLN-hALB, -hFc и -scFc, по данным ЭХ-ВСЭХ (SE-UPLC)Table 20 Overview of HMWS content in stressed and unstressed (TO) MSLN-hALB, -hFc and -scFc preparations by SE-UPLC

Конструкция Design hALB hALB hFc hFc scFc scFc Препарат A drug K60RTrT K60RTrT K60RTrT 1 K60RTrT 1 G40MSuT G40MSuT K60RTrT K60RTrT G40MSuT G40MSuT % ВМФ (HMWS) % Navy (HMWS) ТО THAT 1,8 1.8 6,7 6.7 3,3 3.3 2,5 2.5 1,3 1.3 5 циклов 3/0 (F/T) 5 cycles 3/0 (F/T) 2,0 2.0 7,2 7.2 4,1 4.1 3,0 3.0 1,5 1.5 2 нед 5°С 2 weeks 5°С Η . О . Η . ABOUT . H . О . H. ABOUT . Η . О . Η . ABOUT . 2,9 2.9 1,1 1.1 2 нед 25°С 2 weeks 25°С Η . о . Η . O . 6,6 6.6 2,7 2.7 2,4 2.4 0,5 0.5 2 нед 37°С 2 weeks 37°C 2,6 2.6 6,3 6.3 2,1 2.1 2,7 2.7 0,3 0.3 4 нед -20°С 4 weeks -20°С 5,9 5.9 θ,7 θ,7 1,6 1.6 6, 6 6, 6 0,3 0.3 4 нед 5°С 4 weeks 5°С 2,0 2.0 8,2 8.2 2,8 2.8 3,6 3.6 0,6 0.6 4 нед 25°С 4 weeks 25°C 2,2 2.2 6, 8 6, 8 2,6 2.6 2,7 2.7 0,4 0.4 4 нед 37°С 4 weeks 37°C 3,5 3.5 7,6 7.6 1,9 1.9 4,3 4.3 0,3 0.3

н.о.=не определялиn.d.=not determined

Частоту химических модификаций при термическом стрессе (инкубация при 37°С) контролируют путем картирования пептидов. Образцы белка ферментативно расщепляют, и полученные пептиды разделяют при помощи обращенно-фазовой хроматографии. Элюат колонки непосредственно вводят в источник ионизации масс-спектрометра для идентификации и количественного определения пептидов.The frequency of chemical modifications under thermal stress (incubation at 37° C.) is monitored by peptide mapping. Protein samples are enzymatically digested and the resulting peptides are separated using reverse phase chromatography. The column eluate is directly injected into the ionization source of the mass spectrometer for identification and quantification of peptides.

Для достижения максимального охвата выполняют два отдельных ферментативных расщепления: один раз с трипсином и один раз с химотрипсином. В каждом случае белки денатурируют хлоридом гуанидина и затем восстанавливают дитиотрейтолом, ДТТ (DTT). После инкубации в ДТТ (DTT) свободные остатки цистеина алкилируют добавлением йодуксусной кислоты. Затем осуществляют обмен образцов с буфером в 50 мМ Трис, pH 7,8, для расщепления. Трипсин и химотрипсин добавляют в отдельные реакционные пробирки в соотношении 1:10 (образец:фермент) каждый. Образцы расщепляют в течение 30 мин при 37°С и реакцию гасят добавлением трифторуксусной кислоты.To achieve maximum coverage, two separate enzymatic digestions are performed: once with trypsin and once with chymotrypsin. In each case, the proteins are denatured with guanidine chloride and then reduced with dithiothreitol, DTT (DTT). After incubation in DTT (DTT), free cysteine residues are alkylated by adding iodoacetic acid. The samples are then exchanged with 50 mM Tris, pH 7.8 buffer for digestion. Trypsin and chymotrypsin are added to separate reaction tubes at a ratio of 1:10 (sample:enzyme) each. The samples are digested for 30 min at 37° C. and the reaction is quenched by the addition of trifluoroacetic acid.

Отдельно осуществляют инжекцию порции 5 мкг каждого продукта расщепления в обращеннофазовую колонку Zorbax SB-C18 (Agilent № 859700-902), уравновешенную в 0,1% (об./об) муравьиной кислоте, МК (FA). Градиент длиной 156 мин до 90% ацетонитрила, содержащего 0,1% МК (FA) применяют для элюации пептидов непосредственно в источник электрораспыления ионов масс-спектрометра Q-Exactive Plus (Thermo Scientific). Данные регистрируют в режиме, зависящем от данных, с применением метода топ 12, в котором полное сканирование (разрешение 70000, диапазон сканирования 200-2000 м/з (m/z)) сопровождается диссоциацией с высокой энергией столкновения, ВЭС (HCD) 12 наиболее распространенных ионов (разрешения 17 500).Separately, a 5 μg portion of each digest was injected into a Zorbax SB-C18 reverse phase column (Agilent No. 859700-902) equilibrated in 0.1% (v/v) formic acid, FA. A 156 min gradient to 90% acetonitrile containing 0.1% FA is used to elute peptides directly into the electrospray source of a Q-Exactive Plus mass spectrometer (Thermo Scientific). Data is acquired in a data dependent mode using the top 12 method, in which full scan (resolution 70000, scan range 200-2000 m/s (m/z)) is accompanied by high collision energy dissociation, HCD 12 most common ions (resolution 17,500).

Пептиды идентифицируют на основе точной массы и тандемного масс-спектра с применением собственного программного обеспечения. Идентификаторы верифицируют вручную. Относительные количества модифицированных и немодифицированных пептидов вычисляют на основе распространенности ионов с применением программного обеспечения Pinpoint (Thermo Scientific).Peptides are identified based on accurate mass and tandem mass spectrum using proprietary software. Identifiers are verified manually. The relative amounts of modified and unmodified peptides are calculated from ion abundance using Pinpoint software (Thermo Scientific).

Процент химических модификаций участков определения комплементарности, УОК (CDR) и части, продлевающей период полувыведения (hALB или Fc), обнаружений в препаратах MSLN-hALB, -hFc и -scFc, приведен в табл. 21. При сравнении аналогичных условий составления стало очевидно, что в целомThe percentage of chemical modifications of the complementarity determining regions, CDRs, and the half-life prolonging portion (hALB or Fc) found in the MSLN-hALB, -hFc and -scFc preparations are shown in Table 1. 21. When comparing similar drafting conditions, it became clear that, in general,

-60042291 химические модификации наименее распространены в конструкциях scFc.-60042291 chemical modifications are the least common in scFc constructs.

Таблица 21. Обзор химических модификаций в подвергавшихся и не подвергавшихся (T0) стрессу препаратах MSLN-hALB, -hFc и -scFc по данным картирования пептидовTable 21 Overview of chemical modifications in stressed and unstressed (T0) MSLN-hALB, -hFc and -scFc preparations by peptide mapping

Конструкция Design hALB hALB hFc hFc scFc scFc Препарат A drug K60RTrT K60RTrT K60RTrT K60RTrT G40MSUT G40MSUT K60RTrT K60RTrT G40MSuT G40MSuT % дезамидирования N101 (УОК % deamidation N101 (SCV (CDR)) (CDR)) ТО THAT о,1 oh 1 0,2 0.2 0,2 0.2 0,2 0.2 0,2 0.2 2 нед 37°С 2 weeks 37°С 0,7 0.7 0,8 0.8 3,0 3.0 0,7 0.7 3,2 3.2 4 нед 37°С 4 weeks 37°С 1,3 1.3 Η . О . Η . ABOUT . 8,5 8.5 Η . Ο . Η . Ο . 6,4 6.4 % дезамидирования N162 (УОК % deamidation N162 (SCV (CDR)) (CDR)) ТО THAT 3,0 3.0 1,7 1.7 1,9 1.9 2,3 2.3 2,5 2.5 2 нед 37°С 2 weeks 37°С 15,9 15.9 11,6 11.6 2,7 2.7 15,0 15.0 3,3 3.3 4 нед 37°С 4 weeks 37°C 26, 8 26, 8 H . О . H. ABOUT . 3,7 3.7 Η . Ο . Η . Ο . 4,1 4.1 % окисления М2 7 % oxidation M2 7 9 (УОК, (CDR)) 9 (WOK, (CDR)) ТО THAT 0,6 0.6 1,4 1.4 1,6 1.6 0,6 0.6 1,0 1.0 2 нед 37°С 2 weeks 37°С 1,2 1.2 0,8 0.8 0,8 0.8 0,6 0.6 1,0 1.0 4 нед 37°С 4 weeks 37°C 0,9 0.9 Η . О . Η . ABOUT . 0,8 0.8 Η . ο . Η . ο . 0,6 0.6 % дезамидирования N348 (УОК % deamidation N348 (UV (CDR)) (CDR)) ТО THAT 0,5 0.5 3,2 3.2 3,3 3.3 0,5 0.5 0,9 0.9 2 нед 37°С 2 weeks 37°C 20,5 20.5 21,6 21.6 1,9 1.9 9,4 9.4 1,3 1.3 4 нед 37°С 4 weeks 37°С 22,8 22.8 Η . О . Η . ABOUT . 2,0 2.0 Η . Ο . Η . Ο . 2,9 2.9 % дезамидирования N351 (УОК % deamidation N351 (UV (CDR)) (CDR)) ТО THAT 0,2 0.2 2,9 2.9 2,6 2.6 0,5 0.5 1,0 1.0 2 нед 37°С 2 weeks 37°C 6, 6 6, 6 12,7 12.7 0,9 0.9 3,8 3.8 0,4 0.4 4 нед 37°С 4 weeks 37°С 8,7 8.7 H . О . H. ABOUT . 0,8 0.8 Η . Ο . Η . Ο . 0,8 0.8 % окисления М530 (Fc) % oxidation M530 (Fc) ТО THAT н.д. n.a. 3,9 3.9 4,1 4.1 2,6 2.6 3,2 3.2 2 нед 37°С 2 weeks 37°С Н.П. N.P. 9,0 9.0 3,1 3.1 4,0 4.0 4,3 4.3 4 нед 37°С 4 weeks 37°С н.п. n.p. Η . О . Η . ABOUT . 3,4 3.4 Η . Ο . Η . Ο . 3,5 3.5 % дезамидирования N603 (Fc) % Deamidation N603 (Fc) ТО THAT н.п. n.p. 1,3 1.3 1,9 1.9 1,3 1.3 1,4 1.4 2 нед 37°С 2 weeks 37°C н.п. n.p. 7,9 7.9 4,6 4.6 7,0 7.0 5,6 5.6 4 нед 37°С 4 weeks 37°C н.п. n.p. Η . О . Η . ABOUT . 6, 9 6, 9 Η . Ο . Η . Ο . 8,1 8.1 % окисления М70 % oxidation M70 6 (Fc) 6 (Fc) ТО THAT Н.П. N.P. 3,2 3.2 3,6 3.6 1,5 1.5 2,1 2.1 2 нед 37°С 2 weeks 37°C н.п. n.p. 6, 0 6.0 2,8 2.8 2,1 2.1 2,5 2.5 4 нед 37°С 4 weeks 37°C н.п. n.p. Η . О . Η . ABOUT . 2,6 2.6 Η . Ο . Η . Ο . 2,0 2.0 % окисления М587 (hALB) % oxidation M587 (hALB) ТО THAT 1,0 1.0 Η . п . Η . P . Η . Π . Η . P . Η . π . Η . π . Η . Π . Η . P . 2 нед 37°С 2 weeks 37°C 2,2 2.2 Η . π . Η . π . Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. 4 нед 37°С 4 weeks 37°С 2,3 2.3 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. % окисления М623 (hALB) % oxidation M623 (hALB) ТО THAT 1,9 1.9 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. 2 нед 37°С 2 weeks 37°С 2,4 2.4 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. 4 нед 37°С 4 weeks 37°C 3,0 3.0 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. % окисления М798 (hALB) % oxidation M798 (hALB) ТО THAT 1,4 1.4 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. 2 нед 37°С 2 weeks 37°C 3,3 3.3 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. 4 нед 37°С 4 weeks 37°С 3,5 3.5 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. % окисления М829 (hALB) % oxidation M829 (hALB) ТО THAT 8,9 8.9 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. 2 нед 37°С 2 weeks 37°C 42,9 42.9 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. 4 нед 37°С 4 weeks 37°C 44,1 44.1 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π.

н.п.=неприменимо; н.о.=не определялиn.a.=not applicable; n.d.=not determined

Пример 16.Example 16

МЗЛН (MSLN)-hALB, -hFc, -scFc, составленные так, как описано в примере 15, подвергали эксперименту с прыжком pH. Концентрация исходных веществ составляет 1,0 мг/мл. В стеклянный флаконMSLN (MSLN)-hALB, -hFc, -scFc formulated as described in Example 15 were subjected to a pH jump experiment. The concentration of the starting substances is 1.0 mg/ml. In a glass bottle

- 61 042291 помещают объем 0,38 мл каждого исходного материала. После предварительной обработки при 37°C растворы нагружают 20-кратным фосфатно-солевым буфером, ФСБ (PBS), который состоит из 0,090 М фосфата калия, 0,480 М фосфата натрия (оба двухосновные), 0,052 М хлорида калия и 2,76 М NaCl. Нагруженные образцы инкубируют при 37°C в течение двух недель. После инкубации их анализируют при помощи ЭХ-ВСЭХ (SE-UPLC) с применением способа, описанного в примере 15, и регистрируют процентное содержание ВМФ (HMWS) (табл. 22). При сравнении всех конструкций, составленных в K60RTrT, содержание ВМФ (HMWS) увеличивалось в следующем порядке: hALB меньше чем scFc меньше чем hFc. Кроме того, MSLN-scFc продемонстрировал более низкое содержание ВМФ (HMWS), чем MSLN-hFc, если он был составлен в G40MSuT.- 61 042291 place a volume of 0.38 ml of each starting material. After pretreatment at 37°C, the solutions are loaded with 20x phosphate buffered saline, PBS, which consists of 0.090 M potassium phosphate, 0.480 M sodium phosphate (both dibasic), 0.052 M potassium chloride, and 2.76 M NaCl. Loaded samples are incubated at 37°C for two weeks. After incubation, they were analyzed by SEC-HMSEC (SE-UPLC) using the method described in example 15, and the percentage of HMF (HMWS) was recorded (Table 22). When comparing all constructs compiled in K60RTrT, HMF content (HMWS) increased in the following order: hALB less than scFc less than hFc. In addition, MSLN-scFc showed lower HMWS content than MSLN-hFc when formulated in G40MSuT.

Таблица 22. Обзор содержания ВМФ (HMWS) в подвергавшихся стрессу препаратах (pH-скачок плюс 2 нед 37°C) МЗЛН (MSLN)-hALB, -hFc и -scFc по данным ЭХ-ВСЭХ (SE-UPLC)Table 22 Overview of HMWS content in stressed preparations (pH jump plus 2 weeks 37°C) MSLN-hALB, -hFc and -scFc by SE-UPLC

Конструкция Design hALB hALB hFc hFc scFc scFc Препарат A drug K60RTrT K60RTrT K60RTrT K60RTrT G40MSuT G40MSuT K60RTrT K60RTrT G40MSUT G40MSUT % ВМФ (HMWS) % Navy (HMWS) 2 нед 37°С 2 weeks 37°С 1,5 1.5 8,3 8.3 7,1 7.1 5,4 5.4 5,1 5.1

Пример 17.Example 17.

МЗЛН (MSLN)-hALB, -hFc и -scFc, составленные, как описано в примере 15, подвергают стрессу при перемешивании. Концентрация исходных веществ составляет 1,0 мг/мл. Объем 0,5 мл каждого раствора фильтруют сквозь соответствующий фильтр с размером пор 0,22 мкм и помещают в стеклянные флаконы емкостью 3 см. Флаконы помещают в пластиковую коробку таким образом, чтобы флаконы не перемещались внутри коробки во время взбалтывания. Коробку помещают на орбитальный шейкер. Образцы перемешивают при 500 об/минут в течение 65 ч. Видимые механические включения оценивают в соответствии со способом, описанным в Европ. Фарм. 2.9.20. Способ осуществляется обученными операторами. Количество видимых механических включений на флакон указано в табл. 23. Видимые частицы белка наблюдались только в препаратах MSLN-hFc.MSLN (MSLN)-hALB, -hFc and -scFc, formulated as described in example 15, subjected to stress with stirring. The concentration of the starting substances is 1.0 mg/ml. A volume of 0.5 ml of each solution is filtered through an appropriate filter with a pore size of 0.22 μm and placed in 3 cm glass vials. The vials are placed in a plastic box so that the vials do not move inside the box during agitation. The box is placed on an orbital shaker. The samples are stirred at 500 rpm for 65 hours. Visible particulate matter is evaluated according to the method described in Europ. Pharm. 2.9.20. The method is carried out by trained operators. The number of visible mechanical inclusions per vial is indicated in Table. 23. Visible protein particles were observed only in MSLN-hFc preparations.

Таблица 23. Количество видимых частиц белка на флакон в перемешиваемых образцахTable 23. Number of Visible Protein Particles per Vial in Mixed Samples

Конструкция Design hALB hALB hFc hFc scFc scFc Препарат A drug K60RTrT K60RTrT K60RTrT 1 G40MSuT K60RTrT 1 G40MSuT K60RTrT I G40MSuT K60RTrT I G40MSuT Количество видимых (больше 125 мкм) частиц белка на флакон Number of visible (greater than 125 µm) protein particles per vial 65 час, 500 об/мин 65 hours, 500 rpm Р R 1 I1 1 I 1 0 10 0 10

Кроме того, вышеуказанные образцы анализировали при помощи сверхвысокоэффективной эксклюзионной хроматографии (ЭХ-ВСЭХ (SE-UPLC)) с количественной оценкой процентного содержания высокомолекулярных форм (ВМФ (HMWS)). Применяют тот же способ, что и в примере 15. Содержание ВМФ (HMWS) в перемешиваемых образцах приведено в табл. 24. При сравнении препаратов K60RTrT образование ВМФ (HMWS) было наиболее выраженным в MSLN-hFc. Для конструкций на основе Fc содержание ВМФ (HMWS) можно уменьшить, снизив pH препарата (G40MSuT). Но ВМФ (HMWS) также были более распространенными в MSLN-hFc, чем в MLSN-scFc.In addition, the above samples were analyzed by ultra high performance size exclusion chromatography (SEC-HPSC (SE-UPLC)) quantifying the percentage of high molecular weight forms (HMWS)). Apply the same method as in example 15. The content of HMF (HMWS) in the stirred samples are given in table. 24. When comparing preparations of K60RTrT, HMW formation (HMWS) was most pronounced in MSLN-hFc. For Fc-based constructs, the content of HMF (HMWS) can be reduced by lowering the pH of the preparation (G40MSuT). But HMWS were also more common in MSLN-hFc than in MLSN-scFc.

Таблица 24. Обзор содержания ВМФ (HMWS) в подвергавшихся стрессу (скачок pH плюс 2 нед 37°C) , препаратах MSLN-hALB, -hFc и -scFc по данным ЭХ-ВСЭХ (SE-UPLC)Table 24 Overview of HMWS content in stressed (pH jump plus 2 weeks 37°C) MSLN-hALB, -hFc and -scFc preparations by SE-UPLC

Конструкция Design hALB hALB hFc hFc scFc scFc Препарат A drug K60RTrT K60RTrT K60RTrT I G40MSuT K60RTrT I G40MSuT K60RTrT I G40MSuT K60RTrT I G40MSuT % ВМФ (HMWS) % Navy (HMWS) 65 час, 500 об/мин 65 hours, 500 rpm υ8υ8 1 5'8 1 2'4 1 5 ' 8 1 2 ' 4 1,8 | 0,3 1.8 | 0.3

Пример 17.Example 17.

МЗЛН (MSLN)-hALB, -hFc и -scFc, составленные, как описано в примере 15, подвергают воздействию видимого и ультрафиолетового спектра A, УФА (UVA) света (фотостресс). Во всех препаратах концентрация белка составляет 1 мг/мл. Растворы белка фильтруют сквозь фильтр с размером пор 0,22 мкм и помещают в объеме 0,5 мл в стеклянные флаконы типа I. MSLN-hALB и -scFc подвергают двум различным испытаниям, включая 0,2 Люкс видимого света/25 Вт-час/м2 света УФА (UVA) и 1,2 МЛюкс видимого света/173 Вт-час/м2 соответственно. MSLN-hFc подвергают двум различным испытаниям, включая 0,2 МЛюкс видимого света без света УФА (UVA) и 1,2 МЛюкс видимого света /30 Вт*час/м2, соответственно. Температуру камеры доводят до 25°C. После облучения образцы анализируют при помощи визуальной инспекции (табл. 25), ЭХ-ВСЭХ (SE-UPLC) (табл. 26) и пептидного картирования (табл. 27). Вышеупомянутые способы осуществляют в соответствии с методиками, описанными в примере 15. Хотя MSLN-hALB и -scFc подвергались воздействию более высоких доз УФА (UVA)-света, не наблюдалось видимых белковых частиц, тогда как в образцах MSLN-hFc наблюдалась одна видимая белковая частица на флакон в обоих испытаниях, независимо от препарата.MSLN (MSLN)-hALB, -hFc and -scFc, formulated as described in example 15, exposed to visible and ultraviolet A, UVA (UVA) light (photostress). In all preparations, the protein concentration is 1 mg / ml. The protein solutions are filtered through a 0.22 µm filter and placed in a 0.5 ml volume in Type I glass vials. m 2 of UVA light (UVA) and 1.2 MLux of visible light / 173 Wh / m 2 , respectively. MSLN-hFc is subjected to two different tests, including 0.2 Mlux of visible light without UVA light (UVA) and 1.2 Mlux of visible light /30 Wh/m 2 , respectively. The temperature of the chamber is brought to 25°C. After irradiation, the samples were analyzed by visual inspection (Table 25), SE-UPLC (Table 26) and peptide mapping (Table 27). The above methods were carried out in accordance with the procedures described in Example 15. Although MSLN-hALB and -scFc were exposed to higher doses of UVA (UVA) light, no visible protein particles were observed, while one visible protein particle was observed in the MSLN-hFc samples. per vial in both trials, regardless of formulation.

- 62 042291- 62 042291

Таблица 25. Обзор количества видимых белковых частиц на флакон в препаратах MSLN-hALB, _________-hFc и -scFc, определенного после воздействия света_________Table 25 Overview of visible protein particles per vial in MSLN-hALB, _________-hFc and -scFc preparations determined after light exposure_________

Конструкция Design hALB hALB hFc hFc scFc scFc Препарат A drug K60RTrT K60RTrT K60RTrT K60RTrT G40MSUT G40MSUT K60RTrT K60RTrT G40MSUT G40MSUT Количество видимых (больше 125 мкм) частиц белка на флакон Number of visible (greater than 125 µm) protein particles per vial ТО THAT 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 Испытание 1 Trial 1 О11 About 11 12) 1 2) 12) 12) О11 About 11 О11 About 11 Испытание 2 Trial 2 О31 About 31 14) 1 4) 14) 14 ) О31 About 31 О31 About 31

1) 0,2 МЛюкс видимого света /25 Вт-час/м2 свет УФА (UVA), 2) 0,2 МЛюкс видимого света без света УФА (UVA), 3) 1,2 МЛюкс видимого света /173 Вт-час/м2, 4) 1,2 МЛюкс видимого света/30 Вт-час/м2 1) 0.2 Mlux of visible light /25 Wh/ m2 UVA light, 2) 0.2 Mlux of visible light without UVA light (UVA), 3) 1.2 Mlux of visible light /173 Wh /m 2 , 4) 1.2 MLux visible light/30 Wh/m 2

Содержание ВМФ (HMWS) увеличивается в следующем порядке MSLN-hALB меньше чем -scFc меньше чем -hFc, если белок был составлен в K60RTrT. Содержание ВМФ (HMWS) может быть снижено для конструкций на основе Fc, если они составлены в G40MSuT. Однако ВМФ (HMWS) также были менее распространенными в MSLN-scFc. MSLN-hFc продемонстрировал особенную чувствительность к воздействию УФА (UVA) света.HMF content (HMWS) increases in the following order: MSLN-hALB less than -scFc less than -hFc if the protein was composed in K60RTrT. The HMWS content may be reduced for Fc-based constructs if formulated in G40MSuT. However, HMWS were also less abundant in MSLN-scFc. MSLN-hFc has shown particular sensitivity to exposure to UVA (UVA) light.

Таблица 26. Обзор содержания ВМФ (HMWS) в препаратах MSLN-hALB, -hFc и -scFc _______после воздействия света по данным ЭХ-ВСЭХ (SE-UPLC)Table 26. Overview of HMWS content in MSLN-hALB, -hFc and -scFc preparations _______ after light exposure according to SE-UPLC data

Конструкция Design hALB hALB hFc hFc scFc scFc Препарат A drug K60RTrT K60RTrT K60RTrT K60RTrT G40MSuT G40MSuT K60RTrT K60RTrT G40MSuT G40MSuT % ВМФ (HMWS) % Navy (HMWS) ТО THAT 1,8 1.8 6, 7 6, 7 3,3 3.3 2,5 2.5 1,3 1.3 Испытание 1 Trial 1 1,811 1.8 11 6, 32>6, 3 2 > 2,52) 2.5 2) 2,111 2.1 11 0,411 0.4 11 Испытание 2 Trial 2 2,031 2.0 31 11,04) 11.0 4) 2,14) 2.1 4) 2,431 2.4 31 0,33>0.3 3 >

1) 0,2 МЛюкс видимого света /25 Вт-час/м2 свет УФА (UVA), 2) 0,2 МЛюкс видимого света без света УФА (UVA), 3) 1,2 МЛюкс видимого света /173 Вт-час/м2, 4) 1,2 МЛюкс видимого света/30 Вт-час/м2 1) 0.2 Mlux of visible light /25 Wh/ m2 UVA light, 2) 0.2 Mlux of visible light without UVA light (UVA), 3) 1.2 Mlux of visible light /173 Wh /m 2 , 4) 1.2 MLux visible light/30 Wh/m 2

Процент химической модификации участков определения комплементарности, УОК (CDR) и части, увеличивающей период полувыведения (или hALB или Fc), обнаруженный в препаратах MSLN-hALB, -hFc и -scFc, приведен в табл. 27. При сравнении аналогичных условий составления, стало очевидно, что в целом химические модификации наименее распространены в конструкциях scFc.The percent chemical modification of the complementarity determining regions, CDRs, and the half-life increasing portion (either hALB or Fc) found in the MSLN-hALB, -hFc and -scFc preparations is shown in Table 1. 27. When comparing similar formulation conditions, it became apparent that, in general, chemical modifications are the least common in scFc constructs.

- 63 042291- 63 042291

Таблица 27. Обзор химических модификаций в препаратах МЗЛН (MSLN)-hALB, -hFc и -scFc после ______воздействия света по данным картирования пептидов______Table 27. Overview of chemical modifications in MSLN-hALB, -hFc and -scFc preparations after ______light exposure according to peptide mapping data______

Конструкция Design hALB hALB hFc hFc scFc scFc Препарат A drug K60RTrT K60RTrT K60RTrT K60RTrT G40MSuT G40MSuT K60RTrT K60RTrT G40MSuT G40MSuT % дезамидирования N101 (УОК (CDR)) % Deamidation N101 (CDR) ТО THAT о, 1 oh 1 0,2 0.2 0,2 0.2 0,2 0.2 0,2 0.2 Испытание 1 Trial 1 0,211 0.2 11 H . О . H. ABOUT . 0,32) 0.3 2) Η . Ο . Η . Ο . 0,511 0.5 11 Испытание 2 Trial 2 0,23>0.2 3 > Η . о . Η . O . 0,64>0.6 4 > Η . ο . Η . ο . 0,73>0.7 3 > % дезамидирования N162 (УОК (CDR)) % deamidation N162 (CDR) ТО THAT 3, 0 thirty 1,7 1.7 1,9 1.9 2,3 2.3 2,5 2.5 Испытание 1 Trial 1 3, о11 3, about 11 Η . О . Η . ABOUT . 2,12) 2.1 2) Η . Ο . Η . Ο . 2,711 2.7 11 Испытание 2 Trial 2 3, 63) 3, 6 3) Η . о . Η . O . 3,14) 3.1 4) Η . ο . Η . ο . 2,83) 2.8 3) % окисления М279 (УОК (CDR)) % oxidation M279 (UOC (CDR)) ТО THAT 0, 6 0.6 1,4 1.4 1,6 1.6 0,6 0.6 1,0 1.0 Испытание 1 Trial 1 0, 81 0.81 ' Η . О . Η . ABOUT . 2,62) 2.6 2) Η . ο . Η . ο . 0,611 0.6 11 Испытание 2 Trial 2 1, 03>1, 0 3 > Η . о . Η . O . 6,34>6.3 4 > Η . ο . Η . ο . 0,73>0.7 3 > % дезамидирования N348 (УОК (CDR)) % Deamidation N348 (CDR) ТО THAT 0, 5 0.5 3,2 3.2 3,3 3.3 0,5 0.5 0,9 0.9 Испытание 1 Trial 1 0,41)0.4 1 ) Η . О . Η . ABOUT . 2,72>2.7 2 > Η . Ο . Η . Ο . 0,211 0.2 11 Испытание 2 Trial 2 0, 93) 0.9 3) Η . о . Η . O . 3,94) 3.9 4) Η . ο . Η . ο . 0,23) 0.2 3) % дезамидирования N351 (УОК (CDR)) % Deamidation N351 (CDR) ТО THAT 0,2 0.2 2,9 2.9 2,6 2.6 0,5 0.5 1,0 1.0 Испытание 1 Trial 1 0, 411 0.4 11 Η . О . Η . ABOUT . 2,02>2.0 2 > Η . Ο . Η . Ο . 0,34) 0.3 4) Испытание 2 Trial 2 0,53) 0.5 3) Η . о . Η . O . 2,64) 2.6 4) Η . ο . Η . ο . 0,33) 0.3 3) % окисления М530 (Fc) % oxidation M530 (Fc) ТО THAT Н.П. N.P. 3,9 3.9 4,1 4.1 2,6 2.6 3,2 3.2 Испытание 1 Trial 1 н.п. n.p. Η . О . Η . ABOUT . 7,62>7.6 2 > Η . Ο . Η . Ο . 3, I13, I 1 ' Испытание 2 Trial 2 н.п. n.p. Η . о . Η . O . 21,84) 21.8 4) Η . ο . Η . ο . 4,13) 4.1 3) % окисления М706 (Fc) % oxidation M706 (Fc) ТО THAT н.п. n.p. 3,2 3.2 3,6 3.6 1,5 1.5 2,1 2.1 Испытание 1 Trial 1 н.п. n.p. Η . О . Η . ABOUT . 6, 52) 6, 5 2) Η . Ο . Η . Ο . 1,811 1.8 11 Испытание 2 Trial 2 н.п. n.p. Η . о . Η . O . 17,84) 17.8 4) Η . ο . Η . ο . 2,73) 2.7 3) % окисления М587 (hALB) % oxidation M587 (hALB) ТО THAT 1, 0 10 Η . п . Η . P . Η . Π . Η . P . Η . π . Η . π . Η . Π . Η . P . Испытание 1 Trial 1 1,5 1.5 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Испытание 2 Trial 2 2,4 2.4 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. % окисления М62 3 (hALB) % oxidation M62 3 (hALB) ТО THAT 1, 9 19 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Испытание 1 Trial 1 4,0 4.0 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Испытание 2 Trial 2 4,1 4.1 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. % окисления М7 % oxidation M7 98 (hALB) 98 (hALB) ТО THAT 1, 4 14 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Испытание 1 Trial 1 2,1 2.1 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Испытание 2 Trial 2 3, 1 3, 1 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. % окисления М8 % oxidation M8 29 (hALB) 29 (hALB) ТО THAT θ,9 θ.9 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Испытание 1 Trial 1 31,0 31.0 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Испытание 2 Trial 2 25,2 25.2 Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π. Η . π.

н.п.=неприменимо;n.a.=not applicable;

н.о.=не определялиn.d.=not determined

Пример 18.Example 18.

MSLN-hALB был составлен в K60RTrT, a MSLN-scFc был составлен в G40MSuT в соответствии с методикой, описанной в примере 15. Концентрации белка составляют 0,05 мг/мл. В стеклянные (боросиликатное, тип I, флакон 13 мм вместимостью 3 см3 производства West, арт. № 68000375) и полипропиленовые (2 мл с 0-кольцом, например, производства Sarstedt, арт. № 72.694.005) испытательные емкости помещают 500 мкл испытуемого раствора. Испытуемый раствор оставляют на 5 мин в первой испытательной емкости. Затем для анализа отбирают аликвоты 150 мкл. Оставшийся испытуемый раствор (350 мкл) последовательно переносят из одной испытательной емкости в следующую (всего пять емкостей). В каждом флаконе раствор оставляют на 5 мин до следующего переноса. Один и тот же наконечник пипетки используют для каждой стадии переноса. Такое же испытания проводят с применением 30 мл поликарбонатных бутылей (Nalgene, PCS-000295 с крышкой, PP/20-415/ZTPE). Для этого вида емкостей в первую емкость помещают 5 мл. После отбирания аликвоты по 150 мкл остаточный объем переносят из одной испытательной емкости в следующую (в соответствии с методикой, описанной выше). Образцы,MSLN-hALB was formulated in K60RTrT and MSLN-scFc was formulated in G40MSuT according to the procedure described in Example 15. Protein concentrations were 0.05 mg/ml. Into glass (borosilicate, type I, 13 mm, 3 cc vial, West, art. no. 68000375) and polypropylene (2 ml with 0-ring, e.g., Sarstedt, art. no. test solution. The test solution is left for 5 min in the first test container. Then, aliquots of 150 μl are taken for analysis. The remaining test solution (350 µl) is sequentially transferred from one test container to the next (five containers in total). In each vial, the solution is left for 5 minutes before the next transfer. The same pipette tip is used for each transfer step. The same test is carried out using 30 ml polycarbonate bottles (Nalgene, PCS-000295 with cap, PP/20-415/ZTPE). For this type of container, 5 ml is placed in the first container. After taking a 150 µl aliquot, the residual volume is transferred from one test container to the next (according to the procedure described above). samples,

- 64 042291 извлеченные из емкостей № 1 и № 5, анализируют при помощи ЭХ-ВСЭХ (SE-UPLC) (способ описан в примере 15). Кроме того, для определения концентрации белка проводят обнаружение белка при помощи детектора с фотодиодной матрицей, ДФМ (PDA) (280 нм). Процентный выход белка из каждой испытательной емкости приведен в табл. 28. Было показано, что извлечение белка было более выраженным для- 64 042291 recovered from containers No. 1 and No. 5, analyzed using SEC-HSEC (SE-UPLC) (the method is described in example 15). In addition, to determine the protein concentration, protein detection is carried out using a photodiode array detector, PDA (280 nm). The percentage yield of protein from each test container is given in table. 28. It was shown that protein extraction was more pronounced for

MSLN-scFc, чем для MSLN-hALB, независимо от вида емкости.MSLN-scFc than for MSLN-hALB regardless of container type.

Таблица 28. Выделение белка из разных видов емкостей для MSLN-hALB и -scFc __________по данным ЭХ-ВСЭХ (SE-UPLC)______Table 28. Protein isolation from different types of containers for MSLN-hALB and -scFc __________ according to SE-UPLC data ______

Конструкция Design hALB hALB scFc scFc Препарат A drug K60RTrT K60RTrT G40MSuT G40MSuT % Выделения белка (от теоретического) % Protein Recovery (from Theoretical) Стекло типа I Type I glass 80,0 80.0 92,0 92.0 Полипропилен Polypropylene 87,0 87.0 97,3 97.3 Поликарбонат Polycarbonate 87,0 87.0 96, 0 96.0

Пример 19.Example 19.

MSLN-hALB составляют в K60RTrT, a MSLN-scFc составляют в K60RTrT и G40MSuT в соответствии с методикой, описанной в примере 15. Концентрация белка составляет 1,0 мг/мл. 1950 мкл каждого испытуемого раствора нагружают 50 мкл стандартного раствора кремния 1000 пропромилле (Specpure производства AlfaAesar, арт. № 38717), что дает нагрузку 25 пропромилле. Контрольным образцом служит ненагруженный испытуемый раствор. Нагруженный испытуемый раствор, а также контрольный образец помещают в стеклянные флаконы емкостью 3 см3 типа I и инкубируют при 37°С в течение 24 ч. Все образцы анализируют при помощи ЭХ-ВСЭХ (SE-UPLC) в соответствии со способом, описанным в примере 15, для количественного определения ВМФ (HMWS) (табл. 29). При составлении в K60RTrT MSLN-hALB и -scFc демонстрируют аналогичное повышение содержания ВМФ (HMWS) при нагрузке кремнием. Для конструкции scFc можно было увидеть, что степень выраженности такого повышения может быть уменьшена путем снижения pH композиции до 4,0. Согласно предварительным экспериментам, этот подход не был возможным для MLSN-hALB, так как обнаружено, что он подвергается фрагментации при значениях pH препарата 5,0 и ниже.MSLN-hALB is formulated in K60RTrT and MSLN-scFc is formulated in K60RTrT and G40MSuT according to the procedure described in Example 15. The protein concentration is 1.0 mg/ml. 1950 µl of each test solution is loaded with 50 µl of a 1000 ppm silicon standard solution (Specpure manufactured by AlfaAesar, part no. 38717), giving a load of 25 ppm. The control sample is an unloaded test solution. The loaded test solution as well as the control sample are placed in 3 cc Type I glass vials and incubated at 37° C. for 24 hours. All samples are analyzed by SE-UPLC according to the method described in Example 15 for HMW quantification (HMWS) (Table 29). When formulated in K60RTrT, MSLN-hALB and -scFc show a similar increase in HMF content (HMWS) upon silicon loading. For the scFc construct, it can be seen that the extent of this increase can be reduced by lowering the pH of the composition to 4.0. According to preliminary experiments, this approach was not possible for MLSN-hALB, as it was found to undergo fragmentation at formulation pH values of 5.0 and below.

Таблица 29. Обзор содержания ВМФ (HMWS) в препаратах MSLN-hALB и -scFc по данным ЭХ-ВСЭХ (SE-UPLC) после нагрузки 25 пропромилле кремнияTable 29 Overview of HMWS content in MSLN-hALB and -scFc preparations by SE-UPLC after 25 ppm silicon loading

Конструкция Design hALB hALB scFc scFc Препарат A drug K60RTrT K60RTrT K60RTrT K60RTrT I G40MSuT I G40MSuT Δ % ВМФ (HMWS) (по сравнению с ненагруженным контролем) Δ% HMWS (compared to unloaded control) Нагрузка 25 пропромилле Load 25 ppm 1,01.0 I1'0 I 1'0 1 0,2 1 0.2

Таблица 30. Перечень последовательностейTable 30 Sequence Listing

SEQ ID NO: SEQ ID NO: Описание Description Источник Source Последовательность Subsequence 1. 1. Пептидный линкер Peptide linker искусственный artificial GGGG GGGG 2 . 2. Пептидный линкер Peptide linker искусственный artificial GGGGS GGGGS 3 . 3 . Пептидный линкер Peptide linker искусственный artificial GGGGQ GGGGQ 4. 4. Пептидный линкер Peptide linker искусственный artificial PGGGGS PGGGGS 5. 5. Пептидный линкер Peptide linker искусственный artificial PGGDGS PGGDGS 6. 6. Пептидный линкер Peptide linker искусственный artificial SGGGGS SGGGGS 7 . 7. Пептидный линкер Peptide linker искусственный artificial GGGGSGGGS GGGGSGGGS 8. 8. Пептидный линкер Peptide linker искусственный artificial GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS 9 . 9 . Пептидный линкер Peptide linker искусственный artificial GGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGS 10. 10. Гекса- гистидин Hexa- histidine искусственный artificial НННННН NNNN 11. eleven. CDR-Ll F6A CDR-Ll F6A искусственный artificial GSSTGAVTSGYYPN GSSTGAVTSGYYPN 12 . 12 . CDR-L2 F6A CDR-L2 F6A искусственный artificial GTKFLAP GTKFLAP 13. 13. CDR-L3 F6A CDR-L3F6A искусственный artificial ALWYSNRWV ALWYSNRWV 14 . 14 . CDR-H1 F6A CDR-H1F6A искусственный artificial IYAMN IYAMN

-65042291-65042291

15 . 15 . CDR-H2 F6A CDR-H2 F6A искусственный artificial RIRS KYNNYATYYADSVKS RIRS KYNNYATYYADSVKS 16. 16. CDR-H3 F6A CDR-H3 F6A искусственный artificial HGNFGNSYVSFFAY HGNFGNSYVSFFAY 17 . 17 . VH F6A VH-F6A искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNIYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSFFAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNIYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSFFAYWGQGTLVTVSS 18 . 18 . VL F6A VL-F6A искусственный artificial QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 19 . 19 . VH-VL F6A VH-VL F6A искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNIYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSFFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNIYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSFFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 20 . 20 . CDR-L1 H2C CDR-L1 H2C искусственный artificial GSSTGAVTSGYYPN GSSTGAVTSGYYPN 21. 21. CDR-L2 H2C CDR-L2 H2C искусственный artificial GTKFLAP GTKFLAP 22 . 22. CDR-L3 H2C CDR-L3 H2C искусственный artificial ALWYSNRWV ALWYSNRWV 23. 23. CDR-H1 H2C CDR-H1 H2C искусственный artificial KYAMN KYAMN 24 . 24. CDR-H2 H2C CDR-H2 H2C искусственный artificial RIRS KYNNYATYYADSVKD RIRS KYNNYATYYADSVKD 25 . 25 . CDR-H3 H2C CDR-H3 H2C искусственный artificial HGNFGNSYISYWAY HGNFGNSYISYWAY 26. 26. VH H2C VH H2C искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS 27 . 27 . VL H2C VL H2C искусственный artificial QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 28 . 28. VH-VL H2C VH-VL H2C искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 29. 29. CDR-L1 HIE CDR-L1HIE искусственный artificial GSSTGAVTSGYYPN GSSTGAVTSGYYPN 30 . thirty . CDR-L2 HIE CDR-L2 HIE искусственный artificial GTKFLAP GTKFLAP 31. 31. CDR-L3 HIE CDR-L3HIE искусственный artificial ALWYSNRWV ALWYSNRWV 32. 32. CDR-H1 HIE CDR-H1HIE искусственный artificial SYAMN SYAMN 33. 33. CDR-H2 HIE CDR-H2HIE искусственный artificial RIRSKYNNYATYYADSVKG RIRSKYNNYATYYADSVKG 34. 34. CDR-H3 HIE CDR-H3HIE искусственный artificial HGNFGNSYLSFWAY HGNFGNSYLSFWAY 35. 35. VH HIE VH HIE искусственный artificial EVQLVESGGGLEQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSFWAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLEQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSFWAYWGQGTLVTVSS 36. 36. VL HIE VL HIE искусственный artificial QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 37. 37. VH-VL HIE VH-VL HIE искусственный artificial EVQLVESGGGLEQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSFWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLEQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSFWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 38. 38. CDR-L1 G4H CDR-L1G4H искусственный artificial GSSTGAVTSGYYPN GSSTGAVTSGYYPN 39. 39. CDR-L2 G4H CDR-L2 G4H искусственный artificial GTKFLAP GTKFLAP 40. 40. CDR-L3 G4H CDR-L3G4H искусственный artificial ALWYSNRWV ALWYSNRWV 41. 41. CDR-H1 G4H CDR-H1 G4H искусственный artificial RYAMN RYAMN 42. 42. CDR-H2 G4H CDR-H2 G4H искусственный artificial RIRSKYNNYATYYADSVKG RIRSKYNNYATYYADSVKG 43. 43. CDR-H3 G4H CDR-H3G4H искусственный artificial HGNFGNSYLSYFAY HGNFGNSYLSYFAY 44 . 44 . VH G4H VH G4H искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNRYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSYFAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNRYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSYFAYWGQGTLVTVSS 45. 45. VL G4H VL G4H искусственный artificial QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 46. 46. VH-VL G4H VH-VL G4H искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNRYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSYFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNRYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSYFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 47. 47. CDR-L1 A2J CDR-L1 A2J искусственный artificial RSSTGAVTSGYYPN RSSTGAVTSGYYPN 48 . 48. CDR-L2 A2J CDR-L2 A2J искусственный artificial ATDMRPS ATDMRPS

-66042291-66042291

49. 49. CDR-L3 A2J CDR-L3 A2J искусственный artificial ALWYSNRWV ALWYSNRWV 50. 50. CDR-H1 A2J CDR-H1 A2J искусственный artificial VYAMN VYAMN 51. 51. CDR-H2 A2J CDR-H2 A2J искусственный artificial RIRSKYNNYATYYADSVKK RIRSKYNNYATYYADSVKK 52. 52. CDR-H3 A2J CDR-H3 A2J искусственный artificial HGNFGNSYLSWWAY HGNFGNSYLSWWAY 53. 53. VH A2J VH A2J искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSWWAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSWWAYWGQGTLVTVSS 54. 54. VL A2J VL A2J искусственный artificial QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 55. 55. VH-VL A2J VH-VL A2J искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYLSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 56. 56. CDR-L1 EIL CDR-L1 EIL искусственный artificial GSSTGAVTSGYYPN GSSTGAVTSGYYPN 57. 57. CDR-L2 EIL CDR-L2 EIL искусственный artificial GTKFLAP GTKFLAP 58. 58. CDR-L3 EIL CDR-L3 EIL искусственный artificial ALWYSNRWV ALWYSNRWV 59. 59. CDR-H1 EIL CDR-H1 EIL искусственный artificial KYAMN KYAMN 60. 60. CDR-H2 EIL CDR-H2 EIL искусственный artificial RIRSKYNNYATYYADSVKS RIRSKYNNYATYYADSVKS 61. 61. CDR-H3 EIL CDR-H3 EIL искусственный artificial HGNFGNSYTSYYAY HGNFGNSYTSYYAY 62. 62. VH EIL VH EIL искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYTSYYAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYTSYYAYWGQGTLVTVSS 63. 63. VL EIL VL EIL искусственный artificial QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 64. 64. VH-VL EIL VH-VL EIL искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYTSYYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKSRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYTSYYAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 65. 65. CDR-L1 E2M CDR-L1E2M искусственный artificial RSSTGAVTSGYYPN RSSTGAVTSGYYPN 66. 66. CDR-L2 E2M CDR-L2 E2M искусственный artificial ATDMRPS ATDMRPS 67. 67. CDR-L3 E2M CDR-L3 E2M искусственный artificial ALWYSNRWV ALWYSNRWV 68. 68. CDR-H1 E2M CDR-H1E2M искусственный artificial GYAMN GYAMN 69. 69. CDR-H2 E2M CDR-H2 E2M искусственный artificial RIRSKYNNYATYYADSVKE RIRSKYNNYATYYADSVKE 70. 70. CDR-H3 E2M CDR-H3 E2M искусственный artificial HRNFGNSYLSWFAY HRNFGNSYLSWFAY 71. 71. VH E2M VH E2M искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKERFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHRNFGNSYLSWFAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKERFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHRNFGNSYLSWFAYWGQGTLVTVSS 72 . 72 . VL E2M VL E2M искусственный artificial QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 73. 73. VH-VL E2M VH-VL E2M искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKERFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHRNFGNSYLSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNGYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKERFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHRNFGNSYLSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCRSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGATDMRPSGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 74. 74. CDR-L1 F7O CDR-L1 F7O искусственный artificial GSSTGAVTSGYYPN GSSTGAVTSGYYPN 75. 75. CDR-L2 F7O CDR-L2 F7O искусственный artificial GTKFLAP GTKFLAP 76. 76. CDR-L3 F7O CDR-L3 F7O искусственный artificial ALWYSNRWV ALWYSNRWV 77. 77. CDR-H1 F7O CDR-H1F7O искусственный artificial VYAMN VYAMN 78 . 78 . CDR-H2 F7O CDR-H2 F7O искусственный artificial RIRSKYNNYATYYADSVKK RIRSKYNNYATYYADSVKK 79. 79. CDR-H3 F7O CDR-H3 F7O искусственный artificial HGNFGNSYISWWAY HGNFGNSYISWWAY 80. 80. VH F7O VH F7O искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISWWAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISWWAYWGQGTLVTVSS 81. 81. VL F7O VL F7O искусственный artificial QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL 82 . 82 . VH-VL F7O VH-VL F7O искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNVYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKKRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCALWYSNRWVFGGGTKLTVL

-67042291-67042291

83. 83. CDR-L1 F12Q CDR-L1F12Q искусственный artificial GSSTGAVTSGNYPN GSSTGAVTSGNYPN 84. 84. CDR-L2 F12Q CDR-L2 F12Q искусственный artificial GTKFLAP GTKFLAP 85. 85. CDR-L3 F12Q CDR-L3 F12Q искусственный artificial VLWYSNRWV VLWYSNRWV 86. 86. CDR-H1 F12Q CDR-H1F12Q искусственный artificial SYAMN SYAMN 87 . 87 . CDR-H2 F12Q CDR-H2 F12Q искусственный artificial RIRSKYNNYATYYADSVKG RIRSKYNNYATYYADSVKG 88. 88. CDR-H3 F12Q CDR-H3 F12Q искусственный artificial HGNFGNSYVSWWAY HGNFGNSYVSWWAY 89. 89. VH F12Q VH F12Q искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSS 90. 90. VL F12Q VL F12Q искусственный artificial QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 91. 91. VH-VL F12Q VH-VL F12Q искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 92. 92. CDR-L1 I2C CDR-L1 I2C искусственный artificial GSSTGAVTSGNYPN GSSTGAVTSGNYPN 93. 93. CDR-L2 I2C CDR-L2 I2C искусственный artificial GTKFLAP GTKFLAP 94. 94. CDR-L3 I2C CDR-L3 I2C искусственный artificial VLWYSNRWV VLWYSNRWV 95. 95. CDR-H1 I2C CDR-H1 I2C искусственный artificial KYAMN KYAMN 96. 96. CDR-H2 I2C CDR-H2 I2C искусственный artificial RIRSKYNNYATYYADSVKD RIRSKYNNYATYYADSVKD 97 . 97 . CDR-H3 I2C CDR-H3 I2C искусственный artificial HGNFGNSYISYWAY HGNFGNSYISYWAY 98. 98. VH I2C VH I2C искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS 99. 99. VL I2C VL I2C искусственный artificial QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 100. 100. VH-VL I2C VH-VL I2C искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL YCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 101. 101. VH F12q VH F12q искусственный artificial EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSS 102. 102. VL F12q VL F12q искусственный artificial QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALT LSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 103. 103. F12q F12q scFv scFv EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDD SKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTV SPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEY YCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 104 . 104 . HAL В HAL B человек Human DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL 105. 105. HAL В 7 HAL B 7 искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAGTFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAAMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAGTFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAAMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL 106. 106. HALB098 HALB098 искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP

-68042291-68042291

107 . 107 . HALB114 HALB114 искусственный artificial AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL 108 . 108 . HALB254 HALB254 искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALGVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALGVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL 109. 109. HALB253 HALB253 искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL 110. 110. HALB131 HALB131 искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASQAALGL 111. 111. HALB135 HALB135 искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL 112 . 112 . HALB133 HALB133 искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL 113. 113. HALB234 HALB234 искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP

- 69 042291- 69 042291

AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL 114 . 114 . HALB C34S HALB C34S искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL 115. 115. HALB7 C34S HALB7C34S искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAGTFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAAMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAGTFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAAMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL 116. 116. HALB098 C34S HALB098 C34S искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL

VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL 117 . 117 . HALB114 C34S HALB114 C34S искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL 118 . 118 . HALB254 C34S HALB254 C34S искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALGVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALGVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL 119. 119. HALB253 C34S HALB253C34S искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL 120. 120. HALB131 C34S HALB131C34S искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSEFAKQRLKAFKASLQKFGER

- 70 042291- 70 042291

121. 121. HALB135 HALB135 C34S C34S искусственный artificial AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL 122 . 123. 122 . 123. HALB133 HALB234 HALB133 HALB234 C34S C34S C34S C34S искусственный искусственный artificial artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL 124 . 124 . HALB C34A HALB C34A искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL 125 . 125 . HALB7 C34A HALB7C34A искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAGTFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAAMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAGTFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAAMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL 126. 126. HALB098 HALB098 C34A C34A искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL 127 . 127 . HALB114 HALB114 C34A C34A искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP

- 71 042291- 71 042291

AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL 128 . 128 . HALB254 C34A HALB254C34A искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALGVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALGVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL 129. 129. HALB253 C34A HALB253C34A искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASQAALGL 130. 130. HALB131 C34A HALB131C34A искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASQAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASQAALGL 131. 131. HALB135 C34A HALB135C34A искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPHLVAASKAALGL 132 . 132 . HALB133 C34A HALB133C34A искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDKFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL 133. 133. HALB234 C34A HALB234C34A искусственный artificial DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCT VATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSW LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALDVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGPKLVAASKAALGL 134. 134. АЫ56 AI56 искусственный artificial RDWDFDVFGGGTPVGG RDWDFDVFGGGTPVGG 135. 135. линейный FcRn связывающий linear FcRn binding искусственный artificial QRFVTGHFGGLXPANG QRFVTGHFGGLXPANG

- 72 042291- 72 042291

пептид peptide 136. 136. линейный FcRn связывающий пептид Y linear FcRn binding peptide Y искусственный artificial QRFVTGHFGGLYPANG QRFVTGHFGGLYPANG 137 . 137 . линейный FcRn связывающий пептид Н linear FcRn binding peptide H искусственный artificial QRFVTGHFGGLHPANG QRFVTGHFGGLHPANG 138 . 138 . ядерный FcRn связывающий пептид Н nuclear FcRn binding peptide H искусственный artificial TGHFGGLHP TGHFGGLHP 139. 139. циклический FcRn связывающий пептид Н cyclical FcRn binding peptide H искусственный artificial QRFCTGHFGGLHPCNG QRFCTGHFGGLHPCNG 140. 140. Кросс-тело 1 НС Cross body 1 NS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 141. 141. Кросс-тело 1 LC Cross body 1 LC GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTP EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTP EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 142. 142. Кросс-тело 2 НС cross body 2 NS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNF GTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGN ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNF GTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 143. 143. Кросс-тело 2 LC cross body 2 LC GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTP EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTP EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 144 . 144 . Гетеро-Fc связывающий агент Fc Hetero-Fc binding agent Fc DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY 145. 145. Гетеро-Fc партнер Fc Hetero-Fc Fc partner DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY 146. 146. Макситело 1 целевой Fc Maxitelo 1 target Fc EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP CEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP CEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK 147. 147. Макситело 1 CD3 Fc Maxitelo 1 CD3 Fc EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP CEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP CEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK 148 . 148 . Макситело 2 целевой Fc Maxitelo 2 target Fc EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK 149. 149. Макситело 2 CD3 Fc Maxitelo 2 CD3 Fc EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK

-73 042291-73 042291

150. 150. Моно Fc Mono Fc APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVTTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVTTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVLSTCSHEALHNPTFSK 151. 151. MS_1 MS_1 VH CDR1 VH CDR1 SSSYYWG SSSYYWG 152 . 152 . MS_1 MS_1 VH CDR2 VH CDR2 SIYYSGITNYNPSLKS SIYYSGITNYNPSLKS 153. 153. MS_1 MS_1 VH CDR3 VH CDR3 PSNYDAFDI PSNYDAFDI 154 . 154 . MS_1 MS_1 VL CDR1 VL CDR1 TGSSSNIGAGYDVH TGSSSNIGAGYDVH 155. 155. MS_1 MS_1 VL CDR2 VL CDR2 GNSKRPS GNSKRPS 156. 156. MS_1 MS_1 VL CDR3 VL CDR3 QSYDSSLGGWV QSYDSSLGGWV 157. 157. MS_1 MS_1 VH vh QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSS 158. 158. MS_1 MS_1 VL VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLA ITGLQAEDEADYYCQSYDSSLGGWVFGGGTKLTVL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLA ITGLQAEDEADYYCQSYDSSLGGWVFGGGTKLTVL 159. 159. MS_1 MS_1 scFv scFv QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGGGTKLTVL QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGGGTKLTVL 160. 160. MS_1 MS_1 Биспецифическая молекула Bispecific molecule QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRS KYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFS GSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRS KYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFS GSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 161. 161. MS_2 MS_2 VH CDR1 VH CDR1 DHYMS DHYMS 162. 162. MS_2 MS_2 VH CDR2 VH CDR2 YISSSGSTIYYADSVKG YISSGSTIYYADSVKG 163. 164 . 165. 166. 167. 168 . 169. 170. 171. 172 . 173. 174. 175. 163. 164 . 165. 166. 167. 168 . 169. 170. 171. 172 . 173. 174. 175. MS_2 MS_2 MS_2 MS_2 MS_2 MS_2 MS_2 MS_2 MS_3 MS_3 MS_3 MS_3 MS_3 MS_2 MS_2 MS_2 MS_2 MS_2 MS_2 MS_2 MS_2 MS_3 MS_3 MS_3 MS_3 MS_3 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 VH VL scFv Биспецифическая молекула VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 vh VL scFv Bispecific molecule VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 DLGPSFDY RASQGISSWLA AASRLQS QQANSFPRT QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSS DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQANSFPRTFGQGTKVEIK QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVEIK QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL DYYMT YISSSGSTIYYADSVKG DRNSHFDY RASQGITRWLA AASVLQS DLGPSFDY RASQGISSWLA AASRLQS QQANSFPRT QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSS DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQANSFPRTFGQGTKVEIK QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVEIK QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL DYYMT YISSGSTIYYADSVKG DRNSHFDY RASQGITRWLA AASVLQS 176. 176. MS_3 MS_3 VL CDR3 VL CDR3 QQSNSFPRT QQSNSFPRT 177. 177. MS_3 MS_3 VH vh QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSS QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSS 178. 178. MS_3 MS_3 VL VL DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS

- 74 042291- 74 042291

SLQPEDFATYYCQQSNSFPRTFGQGTKVEIK SLQPEDFATYYCQQSNSFPRTFGQGTKVEIK 179 . 179 . MS_3 MS_3 scFv scFv QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGQGTKVEIK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGQGTKVEIK 180 . 180 . MS_3 MS_3 Биспецифическая молекула Bispecific molecule QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 181. 181. MS_4 MS_4 VH CDR1 VH CDR1 DYYMT DYYMT 182 . 182 . MS_4 MS_4 VH CDR2 VH CDR2 YISSSGSTIYYADSVKG YISSGSTIYYADSVKG 183 . 183 . MS_4 MS_4 VH CDR3 VH CDR3 DRNSHFDY DRNSHFDY 184 . 184 . MS_4 MS_4 VL CDR1 VL CDR1 RASQGINTWLA RASQGINTWLA 185 . 185 . MS_4 MS_4 VL CDR2 VL CDR2 GASGLQS GASGLQS 186. 186. MS_4 MS_4 VL CDR3 VL CDR3 QQAKSFPRT QQAKSFPRT 187 . 187 . MS_4 MS_4 VH vh QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSS QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSS 188 . 188 . MS_4 MS_4 VL VL DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQAKSFPRTFGQGTKVEIK DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQAKSFPRTFGQGTKVEIK 189 . 189 . MS_4 MS_4 scFv scFv QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIK 190 . 190 . MS_4 MS_4 Биспецифичес- Bispecific QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK кая молекула which molecule NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 191. 191. MS_5 MS_5 VH CDR1 VH CDR1 DHYMS DHYMS 192 . 192 . MS_5 MS_5 VH CDR2 VH CDR2 YISSSGGIIYYADSVKG YISSSGGIIYYADSVKG 193. 193. MS_5 MS_5 VH CDR3 VH CDR3 DVGSHFDY DVGSHFDY 194. 194. MS_5 MS_5 VL CDR1 VL CDR1 RASQDISRWLA RASQDISRWLA 195. 195. MS_5 MS_5 VL CDR2 VL CDR2 AASRLQS AASRLQS 196. 196. MS_5 MS_5 VL CDR3 VL CDR3 QQAKSFPRT QQAKSFPRT 197 . 197 . MS_5 MS_5 VH vh QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSS QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFFDYWGQGTLVTVSS 198 . 198 . MS_5 MS_5 VL VL DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFAIYYCQQAKSFPRTFGQGTKVEIK DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFAIYYCQQAKSFPRTFGQGTKVEIK 199. 199. MS_5 MS_5 scFv scFv QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIK 200. 200. MS_5 MS_5 Биспецифическая молекула Bispecific molecule QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL

-75 042291-75 042291

201. MS_6 VH CDR1 202. MS_6 VH CDR2 203. MS_6 VH CDR3 204. MS_6 VL CDR1 205. MS_6 VL CDR2 206. MS_6 VL CDR3 207. MS 6 “ VH 208. MS 6 “ VL 209. MS_6 scFv 210. MS_6 Биспецифическая молекула 211. MS_7 VH CDR1 212. MS_7 VH CDR2 213. MS_7 VH CDR3 214. MS_7 VL CDR1 215. MS_7 VL CDR2 216. MS_7 VL CDR3 201. MS_6 VH CDR1 202. MS_6 VH CDR2 203. MS_6 VH CDR3 204. MS_6 VL CDR1 205. MS_6 VL CDR2 206. MS_6 VL CDR3 207 MS 6 VH 208 MS 6 “VL 209. MS_6 scFv 210. MS_6 Bispecific molecule 211. MS_7 VH CDR1 212. MS_7 VH CDR2 213. MS_7 VH CDR3 214. MS_7 VL CDR1 215. MS_7 VL CDR2 216. MS_7 VL CDR3 DHYMS YISNSGSIIYYVDSVKG DVRTAFDY RASQSIGSWLA AASSLQS QQANSFPRT QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQANSFPRTFGQGTKVDIK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVDIK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVDIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL SKFMT VIYSGGKTYYADSVKG DSGGWGYFDY KSSQSVLYSSNNKNYLA WASTRES QQYYSTPPT DHYMS YISNSGSIIYYVDSVKG DVRTAFDY RASQSIGSWLA AASSLQS QQANSFPRT QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQANSFPRTFGQGTKVDIK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVDIK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVDIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL SKFMT VIYSGGKTYYADSVKG DSGGWGYFDY KSSQSVLYSSNNKNYLA WASTRES QQYYSTPPPT 217 . 217 . MS_7 MS_7 VH vh EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSS 218. 218. MS_7 MS_7 VL VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTD FTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPPTFGQGTKVEIK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTD FTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPPTFGQGTKVEIK 219. 219. MS_7 MS_7 scFv scFv EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGQGTKVEIK EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGQGTKVEIK 220. 220. MS_7 MS_7 Биспецифическая молекула Bispecific molecule EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIR SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARF SGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIR SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARF SGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 221. 221. MS_8 MS_8 VH CDR1 VH CDR1 SYYWN SYYWN 222. 222. MS_8 MS_8 VH CDR2 VH CDR2 RIYYNGNTYYNPSLKS RIYYNGNTYYNPSLKS 223. 223. MS_8 MS_8 VH CDR3 VH CDR3 PKLGIDAFDI PKLGIDAFDI 224. 224. MS_8 MS_8 VL CDR1 VL CDR1 TGSSSNIGAGYDVH TGSSSNIGAGYDVH 225. 225. MS_8 MS_8 VL CDR2 VL CDR2 GNSNRPS GNSNRPS 226. 226. MS_8 MS_8 VL CDR3 VL CDR3 QSYDSSLSGWV QSYDSSLSGWV 227. 227. MS_8 MS_8 VH vh QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKGLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKGLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSS 228. 228. MS_8 MS_8 VL VL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLA ITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLA ITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL 229. 229. MS_8 MS_8 scFv scFv QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKGLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKGLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT

- 76 042291- 76 042291

ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGGGTKLTVL ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGGGTKLTVL 230. 230. MS_8 MS_8 Биспецифическая молекула Bispecific molecule QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKGLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSK YNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSG SLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKGLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSK YNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSG SLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 231. 231. MSLN vl NM_005823 человека MSLNvl NM_005823 human человек Human MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA 232. 232. MSLN v2 NM_013404 человека MSLNv2 NM_013404 human человек Human MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQAPRRPLPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEE LSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFM KLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGT PCLLGPGPVLTVLALLLASTLA MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQAPRRPLPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEE LSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFM KLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGT PCLLGPGPVLTVLALLLASTLA 233. 233. MSLN v6 MSLN v6 человек Human MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG

AY743922 человека AY743922 human LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTHFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSVQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTHFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSVQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA 234. 234. MSLN vl LMR С52457 яванца MSLN vl LMR C52457 Javanese макак macaques MALPMARPLSGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRVLAGETRQEAAPLDGILTNAPDIASLSPRQLLGFTCVEVSG LSTELVQELAVALGQKNVKLSAEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTHFFSRVAKANVDLL PRGAPERQRLLPAALTCWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEWLPRLVRCLGPLDQDQQEAARAALQ RGGPPYGPPSTWSISTLDDLQSLLPVLGQPVIHSIPQGILAAWRQRSSRDPSWQQPEQTVLRPRFRRDVERTTCPP EKEVHEIDENLIFYKKRELEACVDAALLAAQMDRVDAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIRHLGHLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLKVSKGHEMSAQVATLIDRVWGRGQLDKDTADTLTAFCPGCLCSLSPERLSSVPPSV IGAVRPQDLDTCGPRQLDVLYPKARLAFQNMSGSEYFVKIRPFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRREAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKVEEQHSPVRDWILKQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLILDLSVREALSGTPCLLGPGP VLTILALLLASTLA MALPMARPLSGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRVLAGETRQEAAPLDGILTNAPDIASLSPRQLLGFTCVEVSG LSTELVQELAVALGQKNVKLSAEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTHFFSRVAKANVDLL PRGAPERQRLLPAALTCWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEWLPRLVRCLGPLDQDQQEAARAALQ RGGPPYGPPSTWSISTLDDLQSLLPVLGQPVIHSIPQGILAAWRQRSSRDPSWQQPEQTVLRPRFRRDVERTTCPP EKEVHEIDENLIFYKKRELEACVDAALLAAQMDRVDAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIRHLGHLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLKVSKGHEMSAQVATLIDRVWGRGQLDKDTADTLTAFCPGCLCSLSPERLSSVPPSV IGAVRPQDLDTCGPRQLDVLYPKARLAFQNMSGSEYFVKIRPFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRREAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKVEEQHSPVRDWILKQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLILDLSVREALSGTPCLLGPGP VLTILALLLASTLA 235. 235. Потенцирующий мегакариоциты фактор NM_005823 Megakaryocyte potentiating factor NM_005823 человек Human MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPER MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPER 236. 236. МЗЛН (MSLN), расщепленная форма NM_005823 MZLN (MSLN), split form NM_005823 человек Human EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQH LGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPE ELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATF MKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALS EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQH LGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPE ELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATF MKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALS 237. 237. С-концевое расщепление NM_005823 C-terminal splitting NM_005823 человек Human GTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA GTPCLLGGPPVLTVLALLLASTLA

- 77 042291- 77 042291

238 . 238 . MSLN-E 1 MSLN-E 1 человек Human EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTY EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTY 239. 239. MSLN-E 2 MSLN-E 2 человек Human EQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDI EQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDI 240. 240. MSLN-E 3 MSLN-E 3 человек Human RKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVP RKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVP 241. 241. MSLN-E 4 MSLN-E 4 человек Human PSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLG PSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLG 242 . 242 . MSLN-E 5 MSLN-E 5 человек Human GAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGP GAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGP 243. 243. MSLN-E 6 MSLN-E 6 человек Human HVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEAL HVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEAL 244 . 244 . MSLN-E 1+2 MSLN-E 1+2 человек Human EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQH LGYLFLKMSPEDI EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQH LGYLFLKMSPEDI 245. 245. MSLN-E 2+3 MSLN-E 2+3 человек Human EQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGR GQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVP EQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGR GQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVP 246. 246. hu orl MSLN- E1 mu hu orl MSLN- E1mu искусственный artificial MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRRDAEQKACPP GKEPYKVDEDLIFYQNWELEACVDGTMLARQMDLVNEIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRRDAEQKACPP GKEPYKVDEDLIFYQNWELEACVDGTMLARQMDLVNEIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA 247 . 247 . hu orl MSLN- E2 mu hu orl MSLN- E2mu искусственный artificial MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLSIFKHKLDKTYPQGYPESLIQQLGHFFRYVS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLSIFKHKLDKTYPQGYPESLIQQLGHFFRYVS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA 248 . 248 . hu orl MSLN- E3 mu hu orl MSLN- E3mu искусственный artificial MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIHQWNVTSPDTVKTLLKVSKGQKMNAQAIALVACYLRGGGQLDEDMVKALGDIPLSYLCDFSPQDLHSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIHQWNVTSPDTVKTLLKVSKGQKMNAQAIALVACYLRGGGQLDEDMVKALGDIPLSYLCDFSPQDLHSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA 249. 249. hu orl MSLN- E4 mu hu orl MSLN- E4mu искусственный artificial MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPSSV MWLVGPQDLDKCSQRHLGLLYQKACSAFQNVSGLEYFEKIKTFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPSSV MWLVGPQDLDKCSQRHLGLLYQKACSAFQNVSGLEYFEKIKTFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA 250. 250. hu orl MSLN- E5 mu hu orl MSLN- E5mu искусственный artificial MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGASVKDLRALSQHNVSMDIATFKRLQVDSLV GLSVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGASVKDLRALSQHNVSMDIATFKRLQVDSLV GLSVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA 251. 251. hu orl MSLN- hu orl MSLN- искусственный artificial MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSG

- 78 042291- 78 042291

E6 mu E6mu LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPNIVDLKTEEDKSPVRDWLFRQHQKDLDRLGLGLQGGIPNGYLVLDFNVREAFSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA LSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLL PRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQ GGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPS GKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMS PEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSS IWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVL PLTVAEVQKLLGPNIVDLKTEEDKSPVRDWLFRQHQKDLDRLGLGLQGGIPNGYLVLDFNVREAFSGTPCLLGPGP VLTVLALLLASTLA 252. 252. Fc мономер-1 +c/-g Fc monomer-1 +c/-g DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY 253. 253. Fc мономер-2 +c/-g/delGK Fc monomer-2 +c/-g/delGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY 254. 254. Fc мономер-3 -c/+g Fc monomer-3 -c/+g DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTVMTVKSLDGSFFLYSKLTVLSNKSRWQQQ 255. 255. Fc мономер-4 -c/+g/delGK Fc monomer-4 -c/+g/delGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTVMTVLDSDGSSPHFFLYSKLTVDKSRWQQQQALGNSL 256. 256. Fc мономер-5 -c/-g Fc monomer-5 -c/-g DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY GSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY 257 . 257 . Fc мономер-6 -c/-g/delGK Fc monomer-6 -c/-g/delGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY GSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY 258. 258. Fc мономер-7 +c/+g Fc monomer-7 +c/+g DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY NSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY NSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 259. 259. Fc мономер-8 +c/+g/delGK Fc monomer-8 +c/+g/delGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY NSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY NSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 260. 260. scFc-1 scFc-1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 261. 261. scFc-2 scFc-2 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 262 . 262 . scFc-3 scFc-3 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 263. 263. scFc-4 scFc-4 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGG DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

- 79 042291- 79 042291

GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 264. 264. scFc-5 scFc-5 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY GSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY GSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 265. 265. scFc-б scFc-b DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY GSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY GSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 266. 266. scFc-7 scFc-7 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY NSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYNSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY NSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYNSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 267. 267. scFc-8 scFc-8 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY NSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGG DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYNSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYNSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 268 . 268 . MS_lxCD3-scFc MS_lxCD3-scFc Биспецифическ ая молекула HLE Bispecific th molecule HLE QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRS KYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFS GSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQ YGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRS KYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFS GSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQ YGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 269. 269. MS_lxCD3scFc_delGK MS_lxCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRS KYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFS GSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYG QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRS KYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFS GSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYG

- 80 042291- 80 042291

STYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK STYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 270. 270. MS_l_CCxCD3scFc MS_l_CCxCD3scFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKCLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRS KYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFS GSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQ YGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKCLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRS KYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFS GSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQ YGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 271. 271. MS_l_CCxCD3scFc_delGK MS_l_CCxCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKCLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRS KYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFS GSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYG STYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKCLEWIGSIYYSGITNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPSNYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRV TISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYD SSLGGWVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRS KYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGG SGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFS GSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYG STYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 272. 272. MS_2xCD3-scFc MS_2xCD3-scFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 273. 273. MS_2xCD3scFc_delGK MS_2xCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 274. 274. MS_2_CCxCD3scFc MS_2_CCxCD3scFc Биспецифичес- кая молекула Bispecific which molecule QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKCLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKCLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT

- 81 042291- 81 042291

HLE HLE ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 275. 275. MS_2_CCxCD3scFc_delGK MS_2_CCxCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKCLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQTPGKCLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGPSFDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIDAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 276. 276. MS_3xCD3-scFc MS_3xCD3-scFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 277 . 277 . MS_3xCD3scFc_delGK MS_3xCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 278 . 278 . MS_3_CCxCD3s cFc MS_3_CCxCD3s cFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKCLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKCLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG

- 82 042291- 82 042291

KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 279. 279. MS_3_CCxCD3scFc_delGK MS_3_CCxCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKCLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKCLEWISYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGITRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 280. 280. MS_4xCD3-scFc MS_4xCD3-scFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 281. 281. MS_4xCD3scFc_delGK MS_4xCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 282 . 282 . MS_4_CCxCD3scFc MS_4_CCxCD3scFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKCLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKCLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT

- 83 042291- 83 042291

CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 283. 283. МЗ_4_ССхСОЭscFc_delGK МЗ_4_СхСОЭscFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKCLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKCLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 284. 284. MS_5xCD3-scFc MS_5xCD3-scFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 285. 285. MS_5xCD3scFc_delGK MS_5xCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 286. 286. МЗ_5_ССхСОЭscFc МЗ_5_СхСОЭscFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKCLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKCLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 287 . 287 . MS_5_CCxCD3-MS_5_CCxCD 3 - Биспецифичес- Bispecific QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKCLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKCLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAK

- 84 042291- 84 042291

scFc_delGK scFc_delGK кая молекула HLE which molecule HLE NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPR TFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 288 . 288 . MS_6xCD3-scFc MS_6xCD3-scFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVDIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGQGTKVDIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 289. 289. MS_6xCD3scFc_delGK MS_6xCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQFAKPGKAPNLLIYAASSLQTDSGQPRTSFSYQ TFGQGTKVDIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK TFGQGTKVDIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 290. 290. МЗ_6_ССхСОЭscFc МЗ_6_СхСОЭscFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKCLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGCGTKVDIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKCLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGCGTKVDIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYR CVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 291. 291. MS_6_CCxCDSscFc_delGK MS_6_CCxCDSscFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKCLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGCGTKVDIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKCLEWISYISNSGSIIYYVDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRTAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVT ITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPR TFGCGTKVDIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS

- 85 042291- 85 042291

GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGG KAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 292. 292. MS_7xCD3-scFc MS_7xCD3-scFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIR SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARF SGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEE QYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIR SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARF SGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEE QYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К 293. 293. MS_7xCD3scFc_delGK MS_7xCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIR SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARF EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIR SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARF SGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 294. 294. MS_7_CCxCD3scFc MS_7_CCxCD3scFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKCLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIR SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARF SGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEE QYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKCLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIR SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARF SGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEE QYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К 295. 295. MS_7_CCxCD3scFc_delGK MS_7_CCxCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKCLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIR SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARF SGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSSKFMTWVRQAPGKCLEWVSVIYSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGGWGYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPPTFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIR SKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARF SGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP

- 86 042291- 86 042291

KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 296. 296. MS_8xCD3-scFc MS_8xCD3-scFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKGLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSK YNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSG SLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKGLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSK YNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSG SLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 297. 297. MS_8xCD3scFc_delGK MS_8xCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKGLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSK YNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSG SLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKGLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSK YNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSG SLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGS TYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGS TYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 298 . 298 . MS_8_CCxCD3scFc MS_8_CCxCD3scFc Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKCLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSK YNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSG SLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKCLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSK YNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSG SLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQY GSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 299. 299. MS_8_CCxCD3scFc_delGK MS_8_CCxCD3scFc_delGK Биспецифичес- кая молекула HLE Bispecific which molecule HLE QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKCLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSK YNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSG SLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWNWIRQPPGKCLEWIGRIYYNGNTYYNPSLKSRVTISGDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARPKLGIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSGAPGQRVT ISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDS SLSGWVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSK YNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSQTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSG SLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGS TYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK TYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 300. 300. Пептидный линкер Peptide linker (G4S)4 линкер(G 4 S) 4 linker GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 301. 301. Пептидный линкер Peptide linker (G4S)5 линкер(G 4 S) 5 linker GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 302 . 302 . Пептидный линкер Peptide linker (G4S)6 линкер(G 4 S) 6 linker GGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 303. 303. Пептидный линкер Peptide linker (G4S)7 линкер(G 4 S)7 linker GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 304 . 304 . Пептидный линкер Peptide linker (G4S)8 линкер(G 4 S) 8 linker GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

-87042291-87042291

Claims (21)

1. Биспецифическая конструкция, связывающаяся с CD3 и мезотелином (MSLN), содержащая первый связывающий домен, который связывается с MSLN человека на поверхности клетки-мишени, и второй связывающий домен, который связывается с CD3 человека на поверхности T-клетки, причем первый связывающий домен связывается с эпитопом MSLN, находящимся в пределах участка, представленного SEQ ID NO: 245, где первый связывающий домен содержит участок VH, содержащий CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, и участок VL, содержащий CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, выбранные из группы, состоящей из:1. A bispecific construct that binds to CD3 and mesothelin (MSLN) comprising a first binding domain that binds to human MSLN on the surface of a target cell and a second binding domain that binds to human CD3 on the surface of a T cell, the first binding domain binds to an MSLN epitope located within the region represented by SEQ ID NO: 245, where the first binding domain contains a VH region containing CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 and a VL region containing CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 selected from the group consisting of: a) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 161, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 162, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 163, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 164, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 165 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 166;a) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 161, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 162, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 163, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 164, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 165 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 166; b) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 171, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 172, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 173, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 174, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 175 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 176;b) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 171, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 172, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 173, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 174, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 175 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 176; c) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 181, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 182, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 183, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 184, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 185 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 186;c) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 181, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 182, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 183, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 184, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 185 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 186; d) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 191, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 192, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 193, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 194, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 195 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 196; иd) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 191, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 192, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 193, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 194, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 195 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 196; And e) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 201, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 202, CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 203, CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 204, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 205 и CDR-L3, представленного в SEQ ID NO: 206;e) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 201, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 202, CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 203, CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 204, CDR- L2 shown in SEQ ID NO: 205 and CDR-L3 shown in SEQ ID NO: 206; где второй связывающий домен содержит участок VH и участок VL, где участок VH содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, выбранные из:where the second binding domain contains a VH region and a VL region, where the VH region contains CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 selected from: (a) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 14, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 15, и CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 16;(a) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 14, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 15, and CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 16; (b) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 23, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 24, и CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 25;(b) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 23, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 24, and CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 25; (c) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 32, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 33, и CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 34;(c) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 32, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 33, and CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 34; (d) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 41, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 42, и CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 43;(d) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 41, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 42, and CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 43; (e) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 50, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 51, и CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 52;(e) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 50, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 51, and CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 52; (f) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 59, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 60, и CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 61;(f) CDR-H1 shown in SEQ ID NO: 59, CDR-H2 shown in SEQ ID NO: 60, and CDRH3 shown in SEQ ID NO: 61; (g) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 68, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 69, и CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 70;(g) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 68, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 69, and CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 70; (h) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 77, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 78, и CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 79;(h) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 77, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 78, and CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 79; (i) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 86, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 87, и CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 89; и (j) CDR-H1, представленного в SEQ ID NO: 95, CDR-H2, представленного в SEQ ID NO: 96, и CDRH3, представленного в SEQ ID NO: 97;(i) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 86, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 87, and CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 89; and (j) CDR-H1 as shown in SEQ ID NO: 95, CDR-H2 as shown in SEQ ID NO: 96, and CDRH3 as shown in SEQ ID NO: 97; и участок VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, выбранные из:and the VL region contains CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 selected from: (a) CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 20, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 21, и CDRL3, представленного в SEQ ID NO: 22;(a) CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 20, CDR-L2 as shown in SEQ ID NO: 21, and CDRL3 as shown in SEQ ID NO: 22; (b) CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 65, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 66, и CDRL3, представленного в SEQ ID NO: 67; и (c) CDR-L1, представленного в SEQ ID NO: 92, CDR-L2, представленного в SEQ ID NO: 93, и CDRL3, представленного в SEQ ID NO: 94.(b) CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 65, CDR-L2 as shown in SEQ ID NO: 66, and CDRL3 as shown in SEQ ID NO: 67; and (c) CDR-L1 as shown in SEQ ID NO: 92, CDR-L2 as shown in SEQ ID NO: 93, and CDRL3 as shown in SEQ ID NO: 94. 2. Конструкция по п.1, в которой первый связывающий домен также связывается с MSLN макаки.2. The construct of claim 1, wherein the first binding domain also binds to the macaque MSLN. 3. Конструкция по п.1 или 2, в которой второй связывающий домен связывается с CD3 эпсилон человека и с CD3 эпсилон Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus или Saimiri sciureus.3. A construct according to claim 1 or 2, wherein the second binding domain binds to human CD3 epsilon and to Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus or Saimiri sciureus CD3 epsilon. 4. Конструкция по любому из предшествующих пунктов, в которой конструкция находится в формате, выбранном из группы, состоящей из (scFv)2, scFv-однодоменного mAb, диател и олигомеров указанных форматов.4. A construct according to any one of the preceding claims, wherein the construct is in a format selected from the group consisting of (scFv) 2 , scFv single domain mAb, diabodies, and oligomers of the indicated formats. 5. Конструкция по любому из предшествующих пунктов, в которой первый связывающий домен содержит участок VH, выбранный из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197 и SEQ ID NO: 207.5. A construct according to any one of the preceding claims, wherein the first binding domain comprises a VH region selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, and SEQ ID NO: 207. - 88 042291- 88 042291 6. Конструкция по любому из предшествующих пунктов, в которой первый связывающий домен содержит участок VL, выбранный из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 168, SEQ ID6. The construct according to any one of the preceding claims, wherein the first binding domain comprises a VL region selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198 и SEQ ID NO: 208.NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198 and SEQ ID NO: 208. 7. Конструкция по любому из предшествующих пунктов, где первый связывающий домен содержит участок VH и участок VL, выбранные из группы, состоящей из пар участка VH и участка VL, представленных в SEQ ID NO: 167 и 168, SEQ ID NO: 177 и 178, SEQ ID NO: 187 и 188, SEQ ID NO: 197 и 198 и SEQ ID NO: 207 и 208.7. The construct according to any one of the preceding claims, wherein the first binding domain comprises a VH region and a VL region selected from the group consisting of the VH region and VL region pairs shown in SEQ ID NOs: 167 and 168, SEQ ID NOs: 177 and 178 , SEQ ID NOs: 187 and 188, SEQ ID NOs: 197 and 198, and SEQ ID NOs: 207 and 208. 8. Конструкция по любому из предшествующих пунктов, в которой первый связывающий домен содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из представленных в SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 209.8. A construct according to any one of the preceding claims, wherein the first binding domain comprises a polypeptide selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, and SEQ ID NO: 209. 9. Конструкция по любому из предшествующих пунктов, содержащая:9. Construction according to any one of the preceding paragraphs, containing: (a) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(a) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 209;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, and SEQ ID NO: 209; пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-9; и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103;a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-9; and a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; (b) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(b) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 209;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, and SEQ ID NO: 209; пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-9;a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-9; полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; дополнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 104-134;additionally a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 104-134; (c) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(c) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: дополнительный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность QRFVTGHFGGLX1PANG (SEQ ID NO: 135), где X1 представляет собой Y или H; и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 209;an additional polypeptide having the amino acid sequence QRFVTGHFGGLX1PANG (SEQ ID NO: 135), where X1 is Y or H; and a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, and SEQ ID NO: 209; пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-9;a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-9; полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; дополнительный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) или QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139);an additional polypeptide having the amino acid sequence QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 137) or QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 139); (d) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 101;(d) a polypeptide comprising, in the following order, starting from the N-terminus, a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44 , SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98, and SEQ ID NO: 101; пеп тидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8;a peptide linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; пол ипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198 и SEQ ID NO: 208, и остаток серина на C-конце;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198 and SEQ ID NO: 208, and a serine residue at the C-terminus ; дополнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 140; и полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:additionally, a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 140; and a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: пол ипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197 и SEQ ID NO: 207;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, and SEQ ID NO: 207; пеп тидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8;a peptide linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; пол ипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 и SEQ ID NO: 102, и остаток серина на C-конце;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO: 102, and a serine residue at the C-terminus; доп олнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 141;additionally, a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 141; (e) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(e) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей изa polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of - 89 042291- 89 042291 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ IDSEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 101;NO: 71, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 98 and SEQ ID NO: 101; пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8;a peptide linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей изa polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198 и SEQ ID NO: 208;SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198 and SEQ ID NO: 208; дополнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 142; и полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:additionally, a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 142; and a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197 и SEQ ID NO: 207;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, and SEQ ID NO: 207; пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8;a peptide linker having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 и SEQ ID NO: 102, и остаток серина на C-конце;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO: 102, and a serine residue at the C-terminus; дополнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 143;additionally, a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 143; (f) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(f) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 209;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, and SEQ ID NO: 209; пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-9; и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103; и дополнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 144; и дополнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 145;a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-9; and a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; and additionally a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 144; and additionally a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 145; (g) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(g) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 209; и дополнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 146; и полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, and SEQ ID NO: 209; and additionally a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 146; and a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103; и дополнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 147;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; and additionally a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 147; (h) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:(h) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 209; и дополнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 148; и полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, and SEQ ID NO: 209; and additionally a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 148; and a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103; и дополнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 149; или (i) полипептид, содержащий в следующем порядке, начиная с N-конца:a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; and additionally a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 149; or (i) a polypeptide containing, in the following order, starting from the N-terminus: полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 209;a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, and SEQ ID NO: 209; пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-9; и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103; и дополнительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 150.a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-9; and a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; and additionally a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 150. 10. Конструкция по любому из пп.1-8, дополнительно содержащая в порядке от N- к C-концу первый связывающий домен, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из груп-10. The construct according to any one of claims 1-8, additionally containing, in order from N- to C-terminus, the first binding domain having an amino acid sequence selected from the group - 90 042291 пы, состоящей из SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 209;- 90 042291 py, consisting of SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199 and SEQ ID NO: 209; пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 8 и 9;a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 8 and 9; второй связывающий домен, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 103;a second binding domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 103; пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 8 и 9; и третий домен, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 260-267.a peptide linker having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 6, 8 and 9; and a third domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 260-267. 11. Конструкция по п.10, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: от 276 до 287.11. The construct of claim 10, comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 276 to 287. 12. Конструкция по любому из пп.1-11, в которой соотношение аффинности связывания первого связывающего домена с MSLN макака/MSLN человека (по данным анализа Scatchard) составляет меньше чем 100 или меньше чем 20, или меньше чем 15, или меньше чем 10, или меньше чем 8, или меньше чем 6, или меньше чем 2.12. A construct according to any one of claims 1-11, wherein the first binding affinity ratio of the first binding domain to macaque MSLN/human MSLN (as measured by Scatchard analysis) is less than 100, or less than 20, or less than 15, or less than 10 , or less than 8, or less than 6, or less than 2. 13. Полинуклеотид, кодирующий конструкцию, как определено в любом из предшествующих пунктов.13. A polynucleotide encoding a construct as defined in any of the preceding paragraphs. 14. Вектор для переноса, содержащий полинуклеотид, как определено в п.13.14. A transfer vector containing a polynucleotide as defined in claim 13. 15. Клетка-хозяин для экспрессии конструкции, трансформированная или трансфектированная полинуклеотидом по п.13 или вектором, как определено в п.14.15. A host cell for expressing a construct transformed or transfected with a polynucleotide according to claim 13 or a vector as defined in claim 14. 16. Способ получения конструкции по любому из пп.1-12, включающий культивирование клеткихозяина по п.15 в условиях, позволяющих экспрессию конструкции по любому из пп.1-12, и выделение продуцированной конструкции из культуры.16. A method for producing a construct according to any one of claims 1 to 12, comprising culturing the host cell according to claim 15 under conditions allowing expression of the construct according to any one of claims 1 to 12, and isolating the produced construct from the culture. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая конструкцию по любому из пп.1-12 или полученную по способу согласно п.16.17. A pharmaceutical composition containing a construct according to any one of claims 1 to 12 or obtained by a method according to claim 16. 18. Применение конструкции по любому из пп.1-12 или полученной по способу по п.16 для профилактики, лечения или облегчения заболевания в форме солидной опухоли или метастатического ракового заболевания, при которых экспрессируется MSLN.18. The use of a construct according to any one of claims 1 to 12 or obtained according to the method of claim 16 for the prevention, treatment or amelioration of a disease in the form of a solid tumor or metastatic cancer in which MSLN is expressed. 19. Способ лечения или облегчения заболевания в форме солидной опухоли или заболевания в форме метастатического рака, при которых экспрессируется MSLN, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, конструкции по любому из пп.1-12 или полученной по способу по п.16.19. A method of treating or alleviating a disease in the form of a solid tumor or a disease in the form of metastatic cancer in which MSLN is expressed, comprising the step of administering to a subject in need thereof a construct according to any one of claims 1 to 12 or obtained by the method according to claim 16. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что заболевание в форме солидной опухоли выбрано из группы, состоящей из рака яичников, рака поджелудочной железы, мезотелиомы, рака легкого, рака желудка и заболевания в форме тройного отрицательного рака молочной железы или метастатического ракового заболевания, происходящего из любого из вышеперечисленного.20. The method of claim 19, wherein the solid tumor disease is selected from the group consisting of ovarian cancer, pancreatic cancer, mesothelioma, lung cancer, gastric cancer, and triple negative breast cancer or metastatic cancer. derived from any of the above. 21. Фармацевтический набор, содержащий инструкции по применению, отличающийся тем, что указанный набор содержит конструкцию по любому из пп.1-12, конструкцию, полученную по способу по п.16, полинуклеотид по п.13, вектор по п.14 и/или клетку-хозяин по п.15.21. Pharmaceutical kit containing instructions for use, characterized in that said kit contains a construct according to any one of claims 1 to 12, a construct obtained by the method according to claim 16, a polynucleotide according to claim 13, a vector according to claim 14 and/ or a host cell according to claim 15.
EA201890383 2015-07-31 2016-08-01 BISPECIFIC ANTIBODY CONSTRUCTS BINDING TO MESOTHELIN AND CD3 (CD3) EA042291B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/199,939 2015-07-31
US62/290,861 2016-02-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA042291B1 true EA042291B1 (en) 2023-01-31

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11155629B2 (en) Method for treating glioblastoma or glioma with antibody constructs for EGFRVIII and CD3
US20230192884A1 (en) Bispecific t cell engaging antibody constructs
EP3328893B1 (en) Bispecific antibody constructs binding mesothelin and cd3
US20210070878A1 (en) PSMA and CD3 Bispecific T Cell Engaging Antibody Constructs
EP4039709A1 (en) Bcma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
CA3114802A1 (en) Downstream processing of bispecific antibody constructs
EA042291B1 (en) BISPECIFIC ANTIBODY CONSTRUCTS BINDING TO MESOTHELIN AND CD3 (CD3)
WO2024059675A2 (en) Bispecific molecule stabilizing composition
JP2024518369A (en) CD20 and CD22 targeted antigen binding molecules for use in proliferative diseases
EA046123B1 (en) BISPECIFIC ANTIBODY CONSTRUCTION TARGETS MUC17 AND CD3
EA043696B1 (en) BISPECIFIC ANTIBODY CONSTRUCTIONS TO PSMA AND CD3 ENGAGING T CELLS
EA043309B1 (en) BISPECIFIC ANTIBODY CONSTRUCTS ENGAGING T CELLS
EA039325B1 (en) Bispecific antibody constructs binding dll3 and cd3