EA045724B1

EA045724B1 - Циклические пептидные тирозин–тирозиновые соединения в качестве модуляторов рецепторов нейропептида y

Info

Publication number: EA045724B1
Application number: EA201991048
Authority: EA
Inventors: Марк Мэсилаг; Рэймонд Дж. Патч; Жуй Чжан; Мартин А. Кейс; Марк УОЛЛ; Юэ-мэй Чжан
Original assignee: Янссен Фармацевтика Нв
Priority date: 2016-10-27
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2023-12-20

Description

Область применения изобретения

Настоящее изобретение в основном относится к новым циклическим пептидным тирозинтирозиновым (PYY) соединениям, которые являются модуляторами рецептора нейропептида Y2. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям и способам их применения. Новые соединения являются полезными для предотвращения, лечения или облегчения заболеваний и расстройств, таких как, среди прочих, ожирение, диабет 2 типа, метаболический синдром, резистентность к инсулину и дислипидемия.

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Заявка на данное изобретение испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/413,613, поданной 27 октября 2016 г., и предварительной заявке на патент США № 62/413,586, поданной 27 октября 2016 г. Каждое описание включено в настоящий документ посредством ссылки.

Ссылка на перечень последовательностей, поданный в электронном виде

Данный документ содержит перечень последовательностей, представленный в электронном виде с помощью EFS-Web как перечень последовательностей в формате ASCII, с именем файла PRD3411 Sequence Listing и датой создания 23 октября 2017 г., имеющий размер 96 кб. Перечень последовательностей, представленный с помощью EFS-Web, является частью описания и полностью включен в настоящий документ путем ссылки. В случае возникновения любого несоответствия в отношении структур для SEQ ID NO: 1-111 между информацией, описанной в настоящем документе, и перечнем последовательностей, представленным в электронном виде с помощью EFS Web с именем файла PRD3411 Sequence Listing, будет иметь приоритет информация, приведенная в настоящем документе.

Предпосылки создания изобретения

Рецепторы нейропептида Y (NPY) активируются близкородственной группой пептидных агонистов, называемой семейством NPY, которые имеют разные аффинности для каждого подтипа рецептора. NPY, пептидный тирозин-тирозиновый (PYY) и панкреатический полипептид (РР), все из которых имеют длину 36 аминокислот, являются агонистами семейства рецепторов NPY. NPY представляет собой нейротрансмиттер, который синтезируется, совместно хранится и высвобождается совместно с норэпинефрином и эпинефрином. NPY является одним из наиболее часто встречающихся и широко распространенных пептидов в центральной нервной системе (ЦНС) людей и грызунов и экспрессируется в областях головного мозга, связанных с питанием и стрессом. В периферической нервной системе нейроны, содержащие NPY, преимущественно являются симпатическими. PYY преимущественно синтезируется и высвобождается эндокринными клетками кишечника. Расщепление NPY и PYY эндотелиальной серинпротеазой, дипептидилпептидазой IV (DPP-IV), генерирует NPY3.36 и PYY3.36, которые являются селективными лигандами для подтипов Y2 и Y5 семейства рецепторов NPY. РР главным образом встречается в клетках панкреатических островков, отличных от тех, которые содержат инсулин, глюкагон или соматостатин.

На сегодняшний день установлено пять различных рецепторов NPY, четыре из которых, как известно, относятся к физиологии человека. Рецепторы Y1, Y2 и Y5 предпочтительно связывают NPY и PYY, тогда как рецептор Y4 предпочтительно связывает PP. Рецепторы Y2 и Y5 также активно активируются с помощью NPY3.36 ^и PYY3-36. В основном семейство лигандов NPY обладает переменной селективностью к каждой изоформе рецептора NPY, причем ранее сообщалось, что PYY_3-36 имеет от умеренной до сильной селективности к изоформе Y2. Каждый из этих рецепторов сочетается с ингибированием аденилатциклазы посредством чувствительного к токсину коклюша Gai.

PYY секретируется из эндокринных L-клеток в качестве отклика на пищу и, в частности, после приема жира. PYY1.36 доминирует в состоянии натощак, причем PYY3.36 является основной формой, обнаруживаемой после приема пищи у людей, при этом концентрации в плазме отрицательно коррелирует с количеством потребляемых калорий. Показано, что PYY3-36 снижает потребление пищи у людей, обезьян, крыс, кроликов и мышей (Batterham R.L. et al. Nature, 2002 Aug 8; 418(6898):650-4; Batterham R.L. et al. N. Engl. J. Med. 2003 Sep 4; 349(10):941-8; Challis B.G. et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 2003 Nov 28; 311(4):915-9). Считается, что анорексигенные эффекты PYY3.36 формируются с помощью Y2 на основе предпочтительного связывания с этим рецептором и потери эффективности питания у мышей с дефицитом Y2 (Batterham R.L., et al. Nature, 2002 Aug 8; 418(6898):650-4). Внутридуговая инъекция PYY₃_₃₆снижает потребление пищи у крыс и мышей (Batterham et al. Nature, 2002 Aug 8; 418(6898):650-4), что указывает на то, что взаимодействие гипоталамических рецепторов Y2 может обусловливать эти эффекты. Также показано, что острые эффекты в качестве отклика на питание приводят к дозозависимым эффектам в отношении массы тела у мышей линий ob/ob, мышей DIO и мышей Zucker fa/fa (Pittner R.A. et al. Int. J. Obes relat Metab. Disord. 2004 Aug; 28(8):963-71). Кроме того, показано, что PYY₃-₃₆ также улучшает опосредованное инсулином удаление глюкозы и чувствительность к инсулину у грызунов DIO (Vrang N. et al., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. Aug; 291(2):R367-75). Бариатрическая хирургия приводит к увеличению иммунореактивности по отношению к циркулирующему PYY (le Roux C.W. et al., Ann Surg, 2006 Jan; 243(1):108-14), которая, по-видимому, играет роль в потере массы после операции.

Учитывая его роль в контроле аппетита и потреблении пищи, а также его антисекреторные эффекты

- 1 045724 и эффекты, стимулирующие всасывание в желудочно-кишечном тракте у млекопитающих, PYY3.36 может быть эффективен при лечении ожирения и связанных с ним состояний, а также в случае ряда желудочно-кишечных расстройств. Однако терапевтическая полезность самого PYY3-36 в качестве лечебного средства ограничена его быстрым метаболизмом и результирующим коротким периодом полувыведения из крови (Torang et al., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 310:R866-R874 (2016)).

Таким образом, желательным является получение аналога или производного PYY с улучшенными метаболической стабильностью и фармакокинетическим профилем по сравнению с PYY_3-36. Такие производные с длительным периодом полувыведения in vivo обеспечат модуляцию рецептора Y2 с большей продолжительностью действия, что делает их приемлемыми в качестве терапевтических средств для субъектов, нуждающихся в такой модуляции.

Приведенное выше описание представлено исключительно для лучшего понимания природы проблем, стоящих перед данной областью техники, и не должно толковаться каким-либо образом как признание предшествующего уровня техники; а также цитирование какой-либо ссылки в настоящем документе не должно толковаться как признание того, что такая ссылка представляет собой предшествующий уровень техники в сравнении с настоящим изобретением.

Изложение сущности изобретения

Один общий аспект настоящего изобретения относится к соединению формулы I

Z₄PEZ₇PZ₉EZ₁₁ASPEELNRYYZ22Z23LRZ_2eYLNZ₃₀

I^/ 1 ^HN ,° и

.....ς \x(CH₂)_m-----МОСТИК------(CH₂)_n [V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH₂

Λ °

Формула I где р составляет 0 или 1;

m равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5;

n равно 1, 2, 3 или 4;

q равно 0 или 1;

при условии, что q равно 1, только если Z₃₀ отсутствует;

МОСТИК представляет -Ph-CH₂-S-, -триазолил-, -NHC(O)CH₂S-, -SCH₂C(O)NH-,

- (OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- или -CH2S-;

Z₄ представляет собой K, А, Е, S или R;

Z₇ представляет собой А или K, где аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацилирована

где i представляет собой целое число от 0 до 24, a X=Br, I или Cl, -C(O)CH₂Br, -C(O)CH₂I или -C(O)CH₂Cl;

Z9 представляет собой G или K, где аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацилирована

где t равно 0, 1 или 2;

- 2 045724 u равно 0 или 1;

v равно 14, 16 или 18;

где i представляет собой целое число от 0 до 24, a X=Br, I или Cl, -C(O)CH₂Br, -C(O)CH₂I или -C(O)CH2Cl;

Zu представляет собой D или K, причем аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацилирована

где w равно 0, 1, 2 или 4;

х равно 0 или 1;

у равен 14, 16 или 18;

О _н СОаН О tCH₂)₁₄CH₃

где i представляет собой целое число от 0 до 24, a X=Br, I или Cl,

- 3 045724

-C(O)CH2Br, -C(O)CH2I или -C(O)CHCl;

Z₂₂ представляет собой А или K, где аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацилирована

где i представляет собой целое число от 0 до 24, a X=Br, I или Cl, -C(O)CH₂Br, -C(O)CH₂I или -C(O)CH2C1;

Z₂₃ представляет собой S или K, где аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацилирована

- 4 045724

Z₂₆ представляет собой А или Н;

Z₃₀ представляет собой L, W, отсутствует или K, при условии, что Z₃₀ отсутствует, только если q равно 1, причем аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацилирована

где r равно 0, 1 или 2;

s=0 или 1;

q равно 14, 16 или 18; или

- 5 045724

Z₃₅ представляет собой

CF₃

Z₃₄ представляет собой

(CH2CH2O)₁₂CH₃ .

(CH₂)₁₅OH или его фармацевтически приемлемую соль.

В настоящем изобретении также предложены способы предотвращения, лечения, задержки возникновения или облегчения синдрома, расстройства или заболевания или одного, или большего числа симптомов указанного синдрома, расстройства или заболевания, где указанный синдром, расстройство или заболевание выбраны из группы, состоящей из ожирения, диабета 2 типа, метаболического синдрома (например, синдрома X), резистентности к инсулину, нарушения переносимости глюкозы (например, непереносимость глюкозы), гипергликемии, гиперинсулинемии, гипертриглицеридемии, дислипидемии, атеросклероза, диабетической нефропатии и других факторов риска для сердечно-сосудистой системы, таких как гипертензия и факторы риска для сердечно-сосудистой системы, относящиеся к неуправляемым уровням холестерина и/или липидов, остеопороз, воспаление и экзему, включающие введение субъекту, нуждающемуся в них, эффективного количества соединения формулы I, его производного или фармацевтически приемлемой соли, или его формы, композиции или лекарственного средства, или лю

- 6 045724 бой комбинации описанного выше.

Настоящее изобретение также предполагает предотвращение, лечение, отсрочку возникновения или облегчение любого из заболеваний, расстройств, синдромов или симптомов, описанных в настоящем документе, с помощью комбинированной терапии, которая включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения формулы I, его производного или фармацевтически приемлемой соли или его формы, композиции или лекарственного средства в комбинации с любым одним или большим числом из следующих дополнительных соединений: ингибитор дипептидилпептидазы-4 (DPP-4) (например, ситаглиптин, саксаглиптин, линаглиптин, алоглиптин и т.д.); агонист рецептора GLP-1 (например, агонисты GLP-1 непродолжительного действия, такие как экзенатид и ликсисенатид; агонисты рецептора GLP-1 средней продолжительности действия, такие как лираглутид; агонисты рецептора GLP-1 длительного действия, такие как эксенатид с замедленным высвобождением, альбиглутид, дилаглутид); ингибиторы котранспортера-2 натрия глюконата (SGLT-2) (например, канаглифозин, дапаглифозин, эмпаглифозин и т.д.); усилители экскреции желчных кислот (например, колесевелам и т.д.) и агонисты дофаминового рецептора (например, бромокриптин быстрого высвобождения). В некоторых вариантах осуществления дозу дополнительного соединения снижают при его введении в комбинации с соединением формулы I, его производным или его фармацевтически приемлемой солью. В некоторых вариантах осуществления, при использовании в комбинации с соединением формулы I, дополнительные соединения можно применять в более низких дозах, чем когда каждый из них используется по отдельности.

Настоящее изобретение предусматривает предотвращение, лечение, отсрочку возникновения или облегчение любого из заболеваний, расстройств, синдромов или симптомов, описанных в настоящем документе, с помощью комбинированной терапии, которая включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения формулы I, его производного или его фармацевтически приемлемой соли или его формы, композиции или лекарственного средства, в комбинации с одним или большим числом следующих дополнительных соединений: бигуаниды (например, метформин и т.д.); инсулин; оксинтомодулин; сульфонилмочевины (например, хлорпропамид, глимепирид, глипизид, глибурид, глибенкламид, глиборнурид, глизоксепид, гликопирамид, толазамид, толбутамид, ацетогексамид, карбутамид и т.д.) и тиазолидиндионы (например; пиоглитазон, розиглитазон, лобеглитазон, циглитазон, дарглитазон, энглитазон, нетоглитазон, ривоглитазон, троглитазон и т.д.). В некоторых вариантах осуществления, при использовании в комбинации с соединением формулы I, его производным или фармацевтически приемлемой солью, дополнительные соединения можно использовать в более низких дозах, чем когда каждый из них применяется по отдельности.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает предотвращение, лечение, отсрочку возникновения или облегчение любого из заболеваний, расстройств, синдромов или симптомов, описанных в настоящем документе, с помощью комбинированной терапии, которая включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения формулы I, его производного или его фармацевтически приемлемой соли или его формы, композиции или лекарственного средства, в комбинации с хирургическим лечением, таким как бариатрическая хирургия (например, операция шунтирования желудка, такая как шунтирование желудка с гастроэнтероанастомозом по Ру); рукавная гастрэктомия; регулируемое бандажирование желудка; билиопанкреатическое шунтирование с выключением двенадцатиперстной кишки; внутрижелудочный баллон; пликация желудка и их комбинации).

Дополнительные аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут более понятны после прочтения представленного ниже подробного описания настоящего изобретения и формулы изобретения.

Подробное описание изобретения

В разделе Предпосылки создания изобретения и в тексте настоящего документа приведены цитаты или описания различных публикаций, статей и патентов; каждая из этих ссылок полностью включена в настоящее описание путем ссылки. Обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий и т.п., которые были включены в настоящее описание, приведено в качестве контекста для настоящего изобретения. Такое обсуждение не является допущением того, что любой из или все такие источники являются частью предшествующего состояния знаний в отношении каких-либо описываемых или заявленных изобретений.

Все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, если не указано иное, имеют общепринятое значение, понятное любому специалисту, работающему в области, к которой относится данное изобретение. В противном случае определенные термины, применяемые в настоящем документе, имеют значения, изложенные в описании.

Следует отметить, что в настоящем документе и в приложенной формуле изобретения форма единственного числа включает объекты и во множественном числе, если из контекста явно не следует иное.

Если не указано иное, любые числовые значения, такие как концентрация или диапазон концентраций, описанные в настоящем документе, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином около. Таким образом, числовое значение, как правило, включает в себя ±10% от указанного

- 7 045724 значения. Например, концентрация 1 мг/мл включает в себя от 0,9 до 1,1 мг/мл. Аналогичным образом, диапазон концентраций от 1 до 10% (мас./об.) включает от 0,9 до 11% (мас./об.). В контексте настоящего документа использование числового диапазона явным образом включает все возможные поддиапазоны, все отдельные числовые значения в пределах этого диапазона, включая целые числа в пределах таких диапазонов и дробные значения, если из контекста явно не следует иное.

Если не указано иное, следует понимать, что термин по меньшей мере перед серией элементов относится к каждому элементу в серии. Специалисты в данной области смогут определить либо будут способны установить с помощью стандартных экспериментов множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охвачены настоящим изобретением.

Используемые в настоящем документе термины содержит, содержащий, включает, включающий, имеет, имеющий, содержит или содержащий или любая другая их вариация подразумевают включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение из него какоголибо другого целого числа или группы целых чисел и являются не исключающими или неограничивающими. Например, композиция, смесь, процесс, способ, изделие или устройство, которое содержит перечень элементов, необязательно ограничивается только этими элементами, но может включать в себя другие элементы, не перечисленные прямо или присущие такой композиции, смеси, процессу, способу, изделию или устройству. Кроме того, если явно не указано иное, термин или относится к включающему, а не к исключающему или. Например, условие А или В удовлетворяется любым из следующих условий: А истинно (или присутствует), а В ложно (или отсутствует), А ложно (или отсутствует), а В истинно (или присутствует), и оба элемента А и В истинны (или присутствуют).

Следует также понимать, что термины около, приблизительно, в основном, главным образом и подобные термины, используемые в настоящем документе при упоминании размера или характеристики компонента предпочтительного изобретения, указывают на то, что описанные размер/характеристика не являются строгой границей или параметром и не исключают незначительных отклонений от них, которые функционально одинаковы или сходны, как будет понятно обычному специалисту в данной области. Как минимум, такие ссылки, содержащие числовой параметр, будут включать в себя отклонения, которые при использовании математических и промышленных принципов, принятых в данной области техники (например, округление, измерение или другие систематические ошибки, производственные допуски и т.д.), не изменят наименьшую значащую цифру.

Термины идентичный или процентная идентичность в контексте двух или большего числа нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей (например, циклических полипептидных последовательностей PYY3-36) относятся к двум или большему числу последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми или имеют указанную долю аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, по результатам измерения с применением одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального контроля, с применением способов, известных в данной области техники, в свете настоящего описания.

Для сравнения последовательностей, как правило, одна последовательность служит эталонной последовательностью, с которой сравнивают испытуемую последовательность. При использовании алгоритма сравнения последовательностей в компьютер вводят испытуемую и эталонную последовательности, при необходимости определяют координаты подпоследовательности и определяют параметры программы алгоритма последовательности. Затем алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает процентную идентичность последовательности для испытуемой последовательности(ей) по отношению к эталонной последовательности на основе заданных параметров программы.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по Smith Waterman &, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), с использованием алгоритма выравнивания областей гомологии по Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью способа поиска подобия по Pearson Lipman &, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988), с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, WI) или путем визуального контроля (см. в основном Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, совместное предприятие компаний Greene Publishing Associates, Inc. и John Wiley & Sons, Inc., (Дополнение, 1995) (Ausubel)).

Примерами алгоритмов, подходящих для определения процентной идентичности последовательности и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, описанные в работе Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215; 403-410 и Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 соответственно. Программное обеспечение для проведения анализов с помощью алгоритма BLAST общедоступно в Национальном центре биотехнологической информации.

Следующим показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот или два полипептида являются по существу идентичными, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, иммунологически перекрестно реагирует с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой

- 8 045724 кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид, как правило, по существу идентичен второму полипептиду, например, когда два пептида отличаются только консервативными заменами. Другим признаком того, что две последовательности нуклеиновых кислот по существу идентичны, является то, что эти две молекулы гибридизируются друг с другом в строгих условиях, как описано ниже.

В настоящем документе термин субъект означает любое животное, предпочтительно млекопитающее, наиболее предпочтительно человека. Используемый в настоящем документе термин млекопитающее охватывает любое млекопитающее. Примеры млекопитающих включают, без ограничения, коров, лошадей, овец, свиней, кошек, собак, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, обезьян, людей и т.д., более предпочтительно человека.

Термин введение применительно к способам настоящего изобретения означает способ терапевтического или профилактического предотвращения, лечения или облегчения синдрома, расстройства или заболевания, как описано в настоящем документе, с применением соединения настоящего изобретения или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно, конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения; или его формы, композиции или лекарственного средства. Такие способы включают в себя введение эффективного количества указанного соединения, формы соединения, композиции или лекарственного средства в разное время в течение курса лечения или одновременно с другими соединениями в комбинированной форме. Способы изобретения следует понимать как включающие все известные терапевтические схемы лечения.

Термин эффективное количество означает такое количество активного соединения или фармацевтического средства, которое вызывает биологический или медицинский отклик системы тканей, животного или человека, к которому стремится исследователь, ветеринар, врач или иной специалист, который включает в себя предотвращение, лечение или облегчение синдрома, расстройства или заболевания, на которые направлено лечение, или симптомов синдрома, расстройства или заболевания, на которые на правлено лечение.

Подразумевается, что используемый в настоящем документе термин композиция охватывает продукт, содержащий установленные ингредиенты в установленных количествах, а также к любому продукту, который можно получить, прямо или косвенно, из комбинаций установленных ингредиентов в установленных количествах.

Соединения

В одном общем аспекте настоящее изобретение включает соединение формулы I

где р составляет 0 или 1;

m равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5;

n равно 1, 2, 3 или 4;

q равно 0 или 1;

-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- или -CH2S-;

Z₄ представляет собой K, А, Е, S или R;

- 9 045724 где i представляет собой целое число от 0 до 24, a X=Br, I или Cl, -C(O)CH₂Br, -C(O)CH₂I или -C(O)CH2Cl;

Z9 представляет собой G или K, где аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацилирована где t равно 0, 1 или 2; u равно 0 или 1; и v равно 14, 16 или 18;

N дсн₂)_1Вср2Н

6. А ЛСН₂)₁₀СО₂Н где i представляет собой целое число от 0 до 24, a X=Br, I или Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I или -C(O)CH2Cl;

где w равно 0, 1, 2 или 4;

х равно 0 или 1;

у равен 14, 16 или 18;

- 10 045724 где i представляет собой целое число от 0 до 24, a X=Br, I или Cl,

ЛСН2)_1вСО_яН

-C(O)CH2Br, -C(O)CH2I или -C(O)CH2Cl;

Z₂₂ представляет собой А или K, где аминогруппа боковой цепи указанного К необязательно ацилирована

L ЛСНЛ_1вСО₂Н где i представляет собой целое число от 0 до 24, a X=Br, I или Cl, -C(O)CH₂Br, -C(O)CH₂I или -C(O)CH2Cl;

- 11 045724

Z₂₆ представляет собой А или Н;

где r равно 0, 1 или 2;

s=0 или 1;

q равно 14, 16 или 18; или

- 12 045724

Z₃₄ представляет собой

Z₃₅ представляет собой ci

Cl

CFj

0O₂H

CO₂H .

CF₃

CO_?H

CO₂H

CF-

(CH₂)₁₀CF₃ . СО₂Н ₀ О^(СН₂)₁₅ОСН₂СН_Э

СО₂Н (ch₂)₁₃cf₃

СО₂Н ^ΝΗ Со₂н °у( ^ΝΗ

СО₂Н о

£^(СН₂СН₂О)_1бСН₃ .

О . Х^(СН₂СН₂О)₁₂СН₃ . г г ₀ О_(СН₂)₁₅ОН

CO₂H

или его фармацевтически приемлемой соли.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает соединение формулы I или его производное, где:

р составляет 0 или 1;

m равно 0, 1, 2, 3 или 5;

n равно 1, 2 или 4;

q равно 0 или 1;

МОСТИК представляет собой -Ph-CH2-S-, -триазолил-, -NHC(O)CH2S-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- или -CH2S-;

Z₄ представляет собой K, А, Е, S или R;

Z₇ представляет собой А или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на

О _нΝ (СН^СС^Н ^Н hoV ? Н ._nA^4^N_(CH₂)₁₄CH₃ “ ДА или

О

И.

'ВГ;

- 13 045724

Z₉ представляет собой G или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на и».

где t равно 0;

uравно 1;

v равно 14;

Zn представляет собой D или K, причем боковая аминная цепь указанного K необязательно замещена на где w равно 0 или 4;

х равен 1;

у равен 14;

COjH о ^Λ N^(CH₂)₁₄CH₃

Вг

I о

'Вг,

О N' ’Мп;

, -С(О)СН₂ВГ,

О и СО₂Н О

ИЛИ

Z22 представляет собой А или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на о

у(СН₂)₁₄СН₃о о

Н НО

(СН₂)₁₀СО₂Н о

й.

'ВГ ;

Z₂₃ представляет собой S или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на

- 14 045724

Z₂₆ представляет собой А или Н;

Z₃₀ представляет собой L, W, отсутствует или K, при условии, что Z₃₀ отсутствует, только если q равно 1, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на

где r равно 0 или 2;

s равно 1;

q равно 14, 16 или 18; или

Z₃₄ представляет собой

- 15 045724

Z₃₅ представляет собой

или его фармацевтически приемлемую соль.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение содержит соединение формулы I или его производное, где:

р составляет 0 или 1;

m равно 0, 1, 2, 3 или 5;

n равно 1, 2 или 4;

q равно 0 или 1;

Z₄ представляет собой K, А, Е, S или R;

Z9 представляет собой G или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на

где t равно 0;

u равно 1;

v равно 14;

Z11 представляет собой D или K, причем боковая аминная цепь указанного K необязательно замещена на где w равно 0 или 4;

х равен 1;

у равен 14;

Z₂₂ представляет собой А или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на

- 16 045724

Z26 представляет собой А или Н;

где r равно 0 или 2;

sравно 1;

q равно 14, 16 или 18; или

- 17 045724

Z₃₄ представляет собой

Z₃₅ представляет собой

или его фармацевтически приемлемую соль.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение формулы I или его производное, выбранное из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 110, или его фармацевтически приемлемую соль.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой соединение формулы I или его производное, выбранное из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 до SEQ ID NO: 72, или его фар мацевтически приемлемую соль.

Другой общий аспект настоящего изобретения относится к конъюгату, содержащему соединение формулы I, его производное или его фармацевтически приемлемую соль и конъюгированный с ним фрагмент для продления периода полувыведения. В контексте настоящего документа термин конъюгированный относится к соединению настоящего изобретения, ковалентно связанному или ковалентно соединенному с фрагментом для продления периода полувыведения, непосредственно или с помощью линкера. В настоящем описании применительно к соединению формулы I, его производному или его фармацевтически приемлемой соли фраза конъюгат, содержащий соединение и конъюгированный с ним фрагмент для продления периода полувыведения используется взаимозаменяемо с фразой соединение, конъюгированное с фрагментом для продления периода полувыведения.

В контексте настоящего документа термин линкер относится к химическому модулю, содержащему ковалентную или атомную цепь, которая ковалентно соединяет соединение настоящего изобретения, с фрагментом для продления периода полувыведения. Линкер может, например, включать, без ограничений, пептидный линкер, углеводородный линкер, полиэтиленгликолевый (PEG) линкер, полипропиленгликолевый (PPG) линкер, полисахаридный линкер, полиэфирный линкер, гибридный линкер, состоящий из PEG и внедренного гетероцикла, и углеводородную цепь. Линкер может быть, например, сначала ковалентно соединен с соединением настоящего изобретения, а затем ковалентно соединен с фрагментом для продления периода полувыведения.

В контексте настоящего документа термин фрагмент для продления периода полувыведения используется взаимозаменяемо с термином фрагмент, продлевающий период полувыведения. Примеры фрагментов для продления периода полувыведения включают, без ограничений, моноклональные антитела или их фрагменты, альбумин, варианты альбумина, альбумин-связывающие белки и/или домены, трансферрин и их фрагменты и аналоги. Дополнительные фрагменты для продления периода полувыведения, которые могут быть введены в конъюгаты настоящего изобретения, включают, например, молекулы полиэтиленгликоля (PEG), такие как PEG5000 или PEG20,000, α-токоферолил, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот с различной длиной цепи, например, лаурат, миристат, стеарат, арахидат, бегенат, олеат, арахидонат, октандикарбоновая кислота, тетрадекандикарбоновая кислота, октадекандикарбоновая кислота, докозандикарбоновая кислота и т.п., полилизин, октан, углеводы (декстран, целлюлоза, олиго- или полисахариды) для получения желаемых свойств.

Соединения, составляющие предмет настоящего изобретения, могут быть ковалентно связаны с одним или большим числом фрагментов для продления периода полувыведения с применением способов, известных специалистам в данной области техники, в контексте настоящего описания. Например, как показано в примерах ниже, фрагмент для продления периода полувыведения, такой как фрагмент PEG или липофильный фрагмент, можно присоединить к молекуле пептида настоящего изобретения, например, путем введения остатка цистеина или лизина в молекулу и присоединения фрагмента для продления периода полувыведения к цистеину или лизину с помощью хорошо известных способов. Примеры со

- 18 045724 единений настоящего изобретения, конъюгированных с моноклональным антителом в качестве фрагмента для продления периода полувыведения, также описаны в предварительной заявке на патент США № 62/413,586, поданной 27 октября 2016 г., и в заявке на патент США, озаглавленной Циклические пептидные тирозин-тирозиновые соединения, подвергнутые связыванию с антителами, в качестве модуляторов нейропептидных рецепторов, поданной в тот же день, что и заявка на данное изобретение, с регистрационным номером PRD3436; содержание обеих заявок включено в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, электрофил вводят в боковую цепь циклического PYY настоящего изобретения, такого как бромацетамид или малеимид, который сайт-специфически реагирует с сульфгидрильной группой остатка Cys, встроенного в фрагмент для продления периода полувыведения, такой как моноклональное антитело или его фрагмент, таким образом создавая ковалентную связь между циклическим PYY и фрагментом для продления периода полувыведения. Соединение, составляющее предмет настоящего изобретения, может быть ковалентно связано с одним или большим числом фрагментов для продления периода полувыведения непосредственно или с помощью линкера. К линкерам, подходящим для настоящего изобретения, относятся, без ограничений, пептидный линкер, углеводородный линкер, полиэтиленгликолевый (PEG) линкер, полипропиленгликолевый (PPG) линкер, полисахаридный линкер, полиэфирный линкер или гибридный линкер, состоящий из PEG и встроенного гетероцикла. В некоторых вариантах осуществления фрагмент для продления периода полувыведения с линкером может быть конъюгирован с соединением, составляющим предмет настоящего изобретения, в одном или большем числе положений аминокислот циклического PYY, такого как аминокислотный остаток 4, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 30 или 31 PYY, с применением способов, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления фрагмент для продления периода полувыведения без линкера может быть конъюгирован с соединением, составляющим предмет настоящего изобретения, в одном или большем числе положений аминокислот циклического PYY, такого как аминокислотный остаток 4, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 30 или 31 PYY, с применением способов, известных в данной области техники. Нумерация аминокислотных остатков соответствует нумерации hPYY_3-36. Любое из соединений, составляющих предмет настоящего изобретения, включая, без ограничений, SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 110, может быть конъюгировано с фрагментом для продления периода полувыведения, непосредственно или опосредованно, с помощью линкера. Согласно вариантам осуществления настоящего изобретения, соединение, выбранное из группы, состоящей из SEQ ID NO: 74, 95, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 и 110, или его фармацевтически приемлемая соль может быть ковалентно связано с фрагментом для продления периода полувыведения, таким как моноклональное антитело или его фрагмент, посредством линкера.

Пептидную молекулу настоящего изобретения или конъюгат, содержащий пептидную молекулу, ковалентно связанную с одним или большим числом фрагментов для продления периода полувыведения, можно проанализировать на функциональность с помощью известных способов анализа в свете настоящего описания. Например, биологическую или фармакокинетическую активность пептидной молекулы настоящего изобретения, отдельно или в конъюгате, в соответствии с настоящим изобретением, можно проанализировать с применением известных анализов in vitro или in vivo и сравнить.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение включает соединение формулы II

где р составляет 0 или 1;

m равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5;

n равно 1, 2, 3 или 4;

МОСТИК представляет собой -Ph-CH₂-S-, -триазолил- или NHC(O)CH₂S-;

Z₄ представляет собой K, А, Е или S;

Z₉ представляет собой G или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на

1.».

где t равно 0, 1 или 2;

u равно 0 или 1;

v равно 14, 16 или 18;

- 19 045724

Z_n представляет собой D или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на

СН^СНз где w равно 0, 1 или 2;

х равно 0 или 1;

у равен 14, 16 или 18;

(СНя)_1вСО_гН

Z₂₆ представляет собой А или Н;

Z₃₀ представляет собой L или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на

где r равно 0, 1 или 2;

- 20 045724 s=0 или 1;

q равно 14, 16 или 18; или

Z₃₄ представляет собой

Z₃₅ представляет собой

или его фармацевтически приемлемую соль.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает соединение формулы II, где: р составляет 0 или 1;

m равно 0, 2, 3 или 5;

n равно 1, 2 или 4;

МОСТИК представляет собой -Ph-CH₂-S-, -триазолил- или -NHC(O)CH₂S-;

Z₄ представляет собой K, А, Е или S;

Z₁₁ представляет собой D или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на ί н ¹¹ “ (CHzJuCHg

но

Z₂₆ представляет собой А или Н;

- 21 045724

где r равно 0 или 2;

s=0 или 1;

q равно 14, 16 или 18;

Z₃₄ представляет собой _u о I о

VyS* ^yS* _или

Z₃₅ представляет собой и ? I ? । н ^NH ^NH ^NH ^NH η^Αιη, h₂n^nh^ h₂nAjh_mj1m η₂νΑ или его фармацевтически приемлемой соли.

m равно 0, 2, 3 или 5;

n равно 1, 2 или 4;

Z₄ представляет собой K, А, Е или S;

Zu представляет собой D или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на

- 22 045724

Z26 представляет собой А или Н;

где r равно 0 или 2;

s=0 или 1;

q равно 14, 16 или 18;

Z₃₄ представляет собой

Z₃₅ представляет собой

или его фармацевтически приемлемой соли.

m равно 0, 2, 3 или 5;

n равно 1, 2 или 4;

Z₄ представляет собой K, А, Е или S;

- 23 045724

Z₂₆ представляет собой А или Н;

где q равно 14, 16 или 18; Z₃₄ представляет собой

Z₃₅ представляет собой или его фармацевтически приемлемой соли.

m равно 0, 2, 3 или 5;

n равно 1, 2 или 4;

Z₄ представляет собой K, А, Е или S;

- 24 045724

Z₂₆ представляет собой А или Н;

где q равно 14, 16 или 18;

Z₃₄ представляет собой

Z₃₅ представляет собой

или его фармацевтически приемлемой соли.

m равно 0, 2, 3 или 5;

n равно 1, 2 или 4;

Z₄ представляет собой K, А, Е или S;

Z9 представляет собой G; Z11 представляет собой D;

Z₂₆ представляет собой А или Н;

Z₃₀ представляет собой L или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на где q равно 14, 16 или 18; Z34 представляет собой

Z₃₅ представляет собой н но^о

или его фармацевтически приемлемой соли.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает соединение формулы II, выбранное из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 до SEQ ID NO: 46.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает N-концы с циклическими аналогами PYY боковой цепи, демонстрирующие по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% идентичности последовательности по отношению к hPYY(_3-36). В качестве примера способа определения идентичности последовательности между двумя аналогами, два пептида

- 25 045724

(SEQ ID NO: 111) выровнены относительно друг друга.

Идентичность последовательности аналога по отношению к hPYY(_3-36) выражается общим числом выровненных остатков за вычетом числа отличных остатков (т.е. числом выровненных идентичных остатков), поделенным на общее число остатков в hPYY_3-36. В данном примере отличными остатками являются D11, которые заменили на замещенный К11, затем на V31, который заменили на hC31, и, наконец, R35 декарбонилировали. Соответственно, в указанном примере идентичность последовательности составляет (34-3)/34х100.

Циклические PYY пептиды.

PYY_3-36 представляет собой эндогенный гормон, секретируемый L клетками в дистальном отделе кишечника, который выступает в качестве агониста рецептора Y2 для ингибирования потребления пищи. Учитывая его роль в контроле аппетита и потребления пищи, а также его антисекреторные эффекты и эффекты, стимулирующие всасывание, в желудочно-кишечном тракте у млекопитающих, PYY_3-36 может быть эффективен при лечении ожирения и связанных с ним состояний, а также при ряде желудочнокишечных расстройств. Однако терапевтическая полезность самого PYY_3-36 в качестве лечебного средства ограничена его быстрым метаболизмом и коротким периодом полувыведения. Таким образом, настоящее изобретение по существу относится к модифицированным конъюгатам PYY_3-36, которые продлевают период полувыведения пептида PYY_3-36 и снижают метаболизм пептида in vivo.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения модифицированные пептиды PYY_3-36 представляют собой циклические пептиды PYY. Термины циклический пептид PYY, циклический аналог PYY_3-36 и циклический аналог пептида PYY_3-36 могут использоваться взаимозаменяемо.

В контексте настоящего документа, термин NTSC-PYY предназначен для описания циклических аналогов PYY между N-концом и боковой цепью.

Пептидные последовательности, описанные в настоящем документе, написаны в соответствии с обычной процедурой, где N-концевая область пептида находится слева, а С-концевая область расположена справа. Хотя известны изомерные формы аминокислот, они представляют собой L-форму представленной аминокислоты, если явно не указано иное. Для удобства описания молекул настоящего изобретения используются традиционные и нетрадиционные аббревиатуры различных аминокислот (включающие кодировку как одной, так и тремя буквами) и функциональных фрагментов. Эти сокращения хорошо известны специалистам в данной области техники, но для ясности они перечислены следующим образом: А = Ala = аланин; R = Arg = аргинин; N = Asn = аспарагин; D = Asp = аспарагиновая кислота; βΆ = eAla = бета-аланин; С = Cys = цистеин; hC = hCys = гомоцистеин; Е = Glu = глутаминовая кислота; Q = Gln = глутамин; С = Gly = глицин; Н = His = гистидин; I = Ile = изолейцин; L = Leu = лейцин; K = Lys = лизин; Nle = норлейцин; F = Phe = фенилаланин; Р = Pro = пролин; S = Ser = серин; Т = Thr = треонин; W = Trp = триптофан; Y = Tyr = тирозин и V = Val = валин.

Для удобства, порядок нумерации аминокислотных остатков, используемый для наименования пептидов NTSC-PYY, составляющих предмет настоящего изобретения, соответствует порядку нумерации hPYY_3-36. Специфические замены аминокислот, которые были введены в пептиды NTSC-PYY, по отношению к нативным остаткам в соответствующих положениях в hPYY_3-36, обозначаются соответствующим кодом аминокислоты, за которым следует положение замещения. Таким образом, S4 в пептиде NTSC-PYY относится к пептиду, в котором соответствующий нативный остаток lys4 hPYY_3-36 заменили серином. Аналогичным образом, hC31 в пептиде NTSC-PYY относится к пептиду, в котором соответствующий нативный остаток val31 hPYY_3-36 заменили гомоцистеином. Дополнительные замены аминокислот, имеющие место в пептидах NTSC-PYY, описаны в соответствии с данным порядком и будут признаны специалистами в данной области техники как таковые.

Также для удобства, порядок наименования, используемый для пептидов NTSC-PYY настоящего изобретения, включает аминокислотные остатки, включенные в цикл вместе со связывающей группой(ами) между ними, в направлении слева направо, начиная с N-концевого остатка, включенного в цикл. Во всех случаях N-концевой аминокислотный остаток цикла связан посредством своей α-аминной функциональной группы со связывающей группой, которая, в свою очередь, соединяется с остатком бо

- 26 045724 ковой цепи аминокислоты в положении 31 пептида NTSC-PYY. Таким образом, цикло-(I3-m-COPhCH₂hC31) используется для описания цикла пептида NTSC-PYY, в котором α-аминная функциональная группа Ile3 ацилирована с остатком метатолуоловой кислоты, чья метильная группа дополнительно связана посредством тиоэфирной связи с боковой цепью остатка hCys31. Аналогичным образом, термин цикло-(K4-СО(СН₂)₂NHCOCH₂-hC31) используется для описания цикла пептида NTSC-PYY, в котором удален нативный остаток Ile3 и чья (теперь N-концевая) α-аминная функциональная группа lys4 ацилирована 3-ацетамидопропаноильной группой, в которой ацетамидометиленовый атом углерода присоединен к боковой цепи остатка hCys31 посредством тиоэфирной связи.

Остатки лизина могут быть введены в различные положения последовательности hPYY₃_₃₆ для обеспечения удобной функциональной подцепи для дополнительной дериватизации. Лизиновые остатки можно модифицировать как для прямого, так и для непрямого связывания с моноклональным антителом. В непрямом связывании с моноклональным антителом лизиновый остаток можно модифицировать таким образом, чтобы он содержал линкер, который позволит подвергнуть связыванию циклический пептид PYY с моноклональным антителом. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в качестве таковых также можно эффективно использовать соответствующие ортологи, рассмотренные в настоящем документе.

Термин K(y-Glu), присутствующий в пептидной последовательности, представляет собой лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована γ-карбоксильной группой глутаминовой кислоты.

Термин K^-Glu-Pal (пальмитоил)) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована γ-карбоксильной группой N-гексадекан-1-оилглутаминовой кислоты.

Термин K^-Glu-Stear (стеароил)) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована γ-карбоксильной группой N-октадекан-1-оилглутаминовой кислоты.

Термин K(γ-Glu-Arach (арахидоил)) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована γ-карбоксильной группой N-додекан-1-оилглутаминовой кислоты.

Термин K(OEG) (8-амино-3,6-диоксаоктаноил) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислотой.

Термин (OEG)₂ означает два OEG-звена, последовательно связанных друг с другом посредством амидной связи (т.е. 17-амино-10-оксо-3,6,12,15-тетраокса-9-азагептадекановую кислоту).

Термин K(OEG)₂ означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована 17-амино- 10-оксо-3,6,12,15-тетраокса-9-азагептадекановой кислотой.

Термин K((OEG)₂-y-G1u означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована (22S)-22-амино-10,19-диоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазатрикозандикарбоновой кислотой посредством ее 1-карбокислотной функциональной группы.

Термин K((OEG)₂-γ-Glu-Stear) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована (22S)-10,19-диоксо-22-стеарамидо-3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазатрикозандикарбоновой кислотой посредством ее 1-карбокислотной функциональной группы.

Термин K((OEG)₂-y-G1u-COC₁₆CO₂H) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована (21S)-9,18,23-триоксо-2,5,11,14-тетраокса-8,17,22-триазанонантриаконтан1,21,39-трикарбоновой кислотой посредством ее 1-карбокислотной функциональной группы.

Аналогичным образом, термин K((OEG)₂-y-G1u-COC₁₈CO₂H) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована (21S)-9,18,23-триоксо-2,5,11,14-тетрαоксα-8,17,22триазагентетраконтан-1,21,41-трикарбоновой кислотой посредством ее 1-карбокислотной функциональной группы.

Термин K((OEG)₂-COC₁₆CO₂H) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована 10,19-диоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазагексатриаконтандикарбоновой кислотой посредством ее 1-карбокислотной функциональной группы.

Термин K(PEG24-AcBr) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована N-бромацетил-75-амино4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73-тетракозаоксапентагептаконтановой кислотой посредством ее 1-карбокислотной функциональной группы.

Термин K(PEG12-AcBr) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована N-бромацетил-39-амино-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-додекаоксанонатриаконтановой кислотой посредством ее 1-карбокислотной функциональной группы.

Термин K(PEG6-AcBr) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована N-бромацетил-3-[(17-амино-3,6,9,12,15-пентаоксагептадец-1 -ил)окси] -пропановой кислотой посредством ее 1-карбокислотной функциональной группы.

Термин K(PEG8-триазолил-СН₂СН₂СО-PEG₄-AcBr) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована 27-[4-[2-[3-[2-[2-[3-(М-бромацетиламино)пропокси]этокси]этокси]пропиламинокарбонил]этил]тетразол-1-ил]-4,7,10,13,16,19,22,25-октагепта

- 27 045724 козановой кислотой посредством ее 1-карбокислотной функциональной группы.

Термин K(mPEG16) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49-гексаоксапентаконтановой кислотой посредством ее 1-карбокислотной функциональной группы.

Термин K(mPEG12) означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-додекаоксаоктатриаконтановой кислотой посредством ее 1-карбокислотной функциональной группы.

Термин VitE означает α-токоферолильное звено в молекуле.

Термин AcVitE означает α-токоферолильное звено, фенольная группа которого имеет метиленилкарбоксильную функциональную группу, связанную с эфиром.

Термин K-Y-Glu-AcVitE означает лизинильный остаток, ε-аминогруппа боковой цепи которого ацилирована (2-(((2R)-2,5,7,8-тетраметил-2-((4R,8R)-4,8,12-триметилтридецил)хроман-6-ил)окси)αцетил)L-глутаминовой кислотой посредством ее γ-карбокислотной функциональной группы.

Многие из соединений настоящего изобретения включают в себя восстановленную амидную связь между С-концевым остатком последовательности, Y36 и смежным с ним остатком R35. Эта восстановленная амидная связь представлена термином psi-(R35,Y36).

Различные аминокислотные остатки, содержащие определенные последовательности, составляющие предмет настоящего изобретения, содержат метилированные α-аминогруппы. Таким образом, термины N-Me-Q34 или N-Me-R35 означают a-N-метилированный глутамин в положении 34 последовательности, и a-N-метилированный аргинин в положении 35 последовательности соответственно.

Термин N-Me-Q34, psi-(R35,Y36) в описании последовательности относится к последовательности, содержащей как a-метилглутаминовый остаток в положении 34, так и восстановленную амидную связь между остатками R35 и Y36.

Аналогичным образом, термин N-Me-R35, psi-(R35,Y36) в описании последовательности относится к последовательности, содержащей как a-метиларгининовый остаток в положении 35, так и восстановленную амидную связь между этим остатком и Y36.

В контексте настоящего документа термин пегилирование относится к ковалентным конъюгатам одного или большего числа молекул полиэтиленгликоля (PEG) и одного или большего числа пептидов NTSC-PYY. Указанные конъюгаты могут включать, без ограничений, от 1 до 24 молекул PEG на одном пептиде NTSC-PYY. Указанные конъюгаты могут дополнительно включать подходящие линкеры между молекулами PEG и молекулой NTSC-PYY, включая, без ограничений, γ-глутамат, -NHC(O), С(О) и С(1_₄)алкил.

В настоящем документе фраза липидизация относится к ковалентным конъюгатам пептида NTSC-PYY и одной или большего числа липофильных групп. Предпочтительные липофильные группы включают длинноцепочечные углеводородные группы. Другие липофильные группы включают стероиды, терпены, жирорастворимые витамины, фитостеролы, терпеноиды, фосфолипиды, глицерины и натуральные или синтетические жирные кислоты. Примеры липофильных групп, без ограничений, включают a-токоферолил, стеариновую кислоту, пальмитиновую кислоту и арахидиновую кислоту. Указанные конъюгаты могут дополнительно включать подходящие линкеры между липофильными молекулами и молекулой NTSC-PYY, включая, без ограничений, γ-глутамат, -NHC(O), С(О) и С^-^алкил.

Термин PYY₃-₃₆ относится к следующему соединению (SEQ ID NO: 111):

он

Фармацевтические композиции.

В еще одном общем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгаты и соединения настоящего изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель. Термин фармацевтическая композиция в контексте настоящего документа означает продукт, содержащий конъюгат настоящего изобретения, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Конъюгаты и соединения настоящего изобретения и содержащие их композиции также можно использовать при производстве лекарственного средства для терапевтических целей, упомянутых в настоящем документе.

В контексте настоящего документа термин носитель относится к любому вспомогательному веществу, разбавителю, наполнителю, соли, буферу, стабилизатору, солюбилизатору, маслу, липиду, пузырьку, содержащему липид, микросфере, липосомальной инкапсуляции или другому материалу, хорошо известному в данной области техники, для применения в фармацевтических составах. Следует понимать, что характеристики носителя, вспомогательного вещества или разбавителя будут зависеть от способа введения для конкретного применения.

- 28 045724

В контексте настоящего документа термин фармацевтически приемлемый носитель относится к нетоксичному материалу, который не препятствует эффективности композиции, соответствующей настоящему изобретению, или биологической активности композиции, соответствующей настоящему изобретению. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, в свете настоящего описания, в настоящем изобретении можно использовать любой фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для применения в фармацевтической композиции на основе антитела.

Фармацевтически приемлемые кислые/анионные соли включают, без ограничений, ацетат, бензолсульфонат, бензоат, бикарбонат, битартрат, бромид, кальция эдетат, камзилат, карбонат, хлорид, цитрат, дигидрохлорид, эдетат, эдисилат, эстолат, эзилат, фумарат, глицептат, глюконат, глутамат, гликолиларсанилат, гексилрезорцинат, гидрабамин, гидробромид, гидрохлорид, гидроксинафтоат, йодид, изетионат, лактат, лактобионат, малат, малеат, манделат, мезилат, метилбромид, метилнитрат, метилсульфат, мукат, напсилат, нитрат, памоат, пантотенат, фосфат/дифосфат, полигалактуронат, салицилат, стеарат, субацетат, сукцинат, сульфат, таннат, тартрат, теоклат, тозилат и триэтиодид. Органические или неорганические кислоты также включают в себя, без ограничений, йодистоводородную, перхлорную, серную, фосфорную, пропионовую, гликолевую, метансульфоновую, гидроксиэтансульфоновую, щавелевую, 2-нафталинсульфоновую, п-толуолсульфоновую, циклогексансульфаминовую, сахариновую или трифторуксусную кислоту.

Фармацевтически приемлемые основные/катионные соли включают, без ограничений, соли алюминия, 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол (также известен как трис-(гидроксиметил)аминометан, трометан или ТРИС), соли аммония, бензатин, трет-бутиламин, соли кальция, хлоропрокаин, холин, циклогексиламин, диэтаноламин, этилендиамин, соли лития, L-лизин, соли магния, меглумин, N-метилD-глюкамин, пиперидин, соли калия, прокаин, хинин, соли натрия, триэтиноламин или соли цинка.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложены фармацевтические составы, содержащие соединения настоящего изобретения, в количестве от около 0,001 до около 100 мг/мл, от около 0,01 до около 50 мг/мл или от около 0,1 до около 25 мг/мл. Фармацевтические составы могут иметь рН от около 3,0 до около 10, например, от около 3 до около 7 или от около 5 до около 9. Состав может дополнительно содержать по меньшей мере один ингредиент, выбранный из группы, состоящей из буферной системы, консерванта(ов), регулятора(ов) тоничности, хелатирующего агента(ов), стабилизатора(ов) и поверхностно-активного вещества(в).

Состав, содержащий фармацевтически активные ингредиенты с фармацевтически приемлемыми носителями, известен в данной области техники, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy (например, издание 21 (2005) и любые последующие издания). Не имеющие ограничительного характера примеры дополнительных ингредиентов включают буферные растворы, разбавители, растворители, регуляторы тоничности, консерванты, стабилизаторы и хелатирующие агенты. Один или большее число фармацевтически приемлемых носителей могут применяться при составлении фармацевтических композиций настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция представляет собой жидкий состав. Предпочтительным примером жидкого состава является водный состав, т.е. состав, содержащий воду. Жидкий состав может содержать раствор, суспензию, эмульсию, микроэмульсию, гель и т.п. Водный состав обычно содержит по меньшей мере 50% мас./мас. воды, или по меньшей мере 60, 70, 75, 80, 85, 90 или по меньшей мере 95% мас./мас. воды.

В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию можно приготовить в виде инъекционного препарата, который можно вводить, например, посредством инъекционного устройства (например, шприца или инфузионного насоса). Инъекция может быть, например, доставлена подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно или внутривенно.

В еще одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой твердый состав, например, лиофилизированную или высушенную распылением композицию, которую можно применять в состоянии как есть или к которой врач или пациент добавляет растворители и/или разбавители перед применением. Твердые лекарственные формы могут включать таблетки, такие как прессованные таблетки, и/или таблетки, покрытые оболочкой, и капсулы (например, твердые или мягкие желатиновые капсулы). Фармацевтическая композиция может также быть в форме, например, саше, драже, порошков, гранул, пастилок или порошков для растворения.

Лекарственные формы могут быть немедленного высвобождения, в этом случае они могут содержать водорастворимый или диспергируемый носитель, или они могут быть отсроченного высвобождения, замедленного высвобождения или модифицированного высвобождения, и в этом случае они могут содержать нерастворимые в воде полимеры, которые регулируют скорость растворения лекарственной формы в желудочно-кишечном тракте.

В других вариантах осуществления фармацевтическую композицию можно доставить интраназально, внутрибрюшинно или сублингвально.

Значение рН в водном составе может находиться в диапазоне от 3 до 10. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рН состава равняется от около 7,0 до около 9,5. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения рН состава равняется от около 3,0 до около 7,0.

- 29 045724

В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит буфер. Не имеющие ограничительного характера примеры буферов включают аргинин, аспарагиновую кислоту, бицин, цитрат, двузамещенный натрия гидрофосфат, фумаровую кислоту, глицин, глицилглицин, гистидин, лизин, малеиновую кислоту, яблочную кислоту, натрия ацетат, натрия карбонат, натрия дигидрофосфат, натрия фосфат, сукцинат, винную кислоту, трицин и трис-(гидроксиметил)аминометан и их смеси. Буфер может присутствовать по отдельности или в составе агрегата в концентрации от около 0,01 до около 50 мг/мл, например от около 0,1 до около 20 мг/мл. Фармацевтические композиции, содержащие каждый из этих специфических буферов, представляют собой альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит консервант. Не имеющие ограничительного характера примеры буферов включают бензетония хлорид, бензойную кислоту, бензиловый спирт, бронопол, бутил-4-гидроксибензоат, хлорбутанол, хлоркрезол, хлоргексидин, хлорфенезин, о-крезол, м-крезол, п-крезол, этил-4-гидроксибензоат, имидомочевину, метил-4-гидроксибензоат, фенол, 2-феноксиэтанол, 2-фенилэтанол, пропил-4-гидроксибензоат, натрия дегидроацетат, тиомерсал и их смеси. Консервант может присутствовать индивидуально или в составе агрегата в концентрации от около 0,01 до около 50 мг/мл, например от около 0,1 до около 20 мг/мл. Фармацевтические композиции, содержащие каждый из этих специфических консервантов, представляют собой альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит изотонический агент. Неограничивающие примеры данного варианта осуществления включают соль (такую как натрия хлорид), аминокислоту (такую как глицин, гистидин, аргинин, лизин, изолейцин, аспарагиновую кислоту, триптофан и треонин), альдит (такой как глицерин, 1,2-пропандиол, пропиленгликоль, 1,3-пропандиол, 1,3-бутандиол), полиэтиленгликоль (например PEG400) и их смеси. Другой пример изотонического агента включает сахар. Не имеющие ограничительного характера примеры сахаров могут представлять собой моно-, ди- или полисахариды или водорастворимые глюканы, включая, например, фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, декстран, пуллулан, декстрин, циклодекстрин, альфа- и бета-ГПЦД, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал и натрия карбоксиметилцеллюлозу. Другим примером изотонического агента является сахарный спирт, в котором термин сахарный спирт определяется как С(₄.₈)углеводород, имеющий по меньшей мере одну группу -ОН. Не имеющие ограничительного характера примеры сахарных спиртов включают маннит, сорбит, инозит, галактит, дульцит, ксилит и арабит. Фармацевтические композиции, содержащие каждый изотонический агент, указанный в данном параграфе, представляют собой альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения. Изотонический агент может присутствовать индивидуально или в составе агрегата в концентрации от около 0,01 до около 50 мг/мл, например от около 0,1 до около 20 мг/мл. Фармацевтические композиции, содержащие каждый из этих специфических изотонических агентов, представляют собой альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит хелатирующий агент. Не имеющие ограничительного характера примеры хелатирующих агентов включают лимонную кислоту, аспарагиновую кислоту, соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и их смеси. Хелатирующий агент может присутствовать индивидуально или в составе агрегата в концентрации от около 0,01 до около 50 мг/мл, например от около 0,1 до около 20 мг/мл. Фармацевтические композиции, содержащие каждый из этих специфических хелатирующих агентов, представляют собой альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит стабилизатор. Не имеющие ограничительного характера примеры стабилизаторов включают один или большее число ингибиторов агрегации, один или большее число ингибиторов окисления, одно или большее число поверхностно-активных веществ и/или один или большее число ингибиторов протеазы.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит стабилизатор, причем указанный стабилизатор представляет собой карбокси-/гидроксипропилцеллюлозу и ее производные (такие как ГПЦ, ГПЦ-SL, ГПЦ-L и ГПМЦ), циклодекстрины, 2-метилтиоэтанол, полиэтиленгликоль (такой как PEG 3350), поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон, соли (такие как натрия хлорид), серосодержащие соединения, такие как монотиоглицерин) или тиогликолевую кислоту. Стабилизатор может присутствовать индивидуально или в составе агрегата в концентрации от около 0,01 до около 50 мг/мл, например от около 0, до около 20 мг/мл. Фармацевтические композиции, содержащие каждый из этих конкретных стабилизаторов, представляют собой альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит одно или большее число поверхностно-активных веществ, предпочтительно одно поверхностно-активное вещество, по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество или два различных поверхностно-активных вещества. Термин поверхностно-активное вещество относится к любым молекулам или ионам, которые образованы из водорастворимой (гидрофильной) части и жирорастворимой

- 30 045724 (липофильной) части. Поверхностно-активное вещество может, например, быть выбрано из группы, состоящей из анионных поверхностно-активных веществ, катионных поверхностно-активных веществ, неионогенных поверхностно-активных веществ и/или цвиттерионных поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активное вещество может присутствовать индивидуально или в составе агрегата в концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/мл. Фармацевтические композиции, содержащие каждое из этих конкретных поверхностно-активных веществ, представляют собой альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит один или большее число ингибиторов протеазы, таких как, например, ЭДТА и/или бензамидина гидрохлорид (HCl). Ингибитор протеазы может присутствовать индивидуально или в составе агрегата в концентрации от около 0,1 до около 20 мг/мл. Фармацевтические композиции, содержащие каждый из этих конкретных ингибиторов протеазы, представляют собой альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать количество аминокислотного основания, достаточное для уменьшения образования агрегатов полипептида во время хранения композиции. Термин аминокислотное основание относится к одной или большему числу аминокислот (таких как метионин, гистидин, имидазол, аргинин, лизин, изолейцин, аспарагиновая кислота, триптофан, треонин) или их аналогам. Любая аминокислота может присутствовать либо в форме свободного основания, либо в форме соли. Может присутствовать любой стереоизомер (т.е. L, D или их смесь) аминокислотного основания. Аминокислотное основание может присутствовать индивидуально или в комбинации с другими аминокислотными основаниями в концентрации от около 0,01 до около 50 мг/мл, например от около 0,1 до около 20 мг/мл. Фармацевтические композиции, содержащие каждое из этих специфических аминокислотных оснований, представляют собой альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения.

Специалисту в данной области также очевидно, что терапевтически эффективная доза соединений настоящего изобретения или их фармацевтической композиции будет варьировать в зависимости от желаемого эффекта. Следовательно, специалист в данной области может легко определить оптимальные дозы для введения, и они будут варьировать в зависимости от конкретного применяемого соединения, способа введения, концентрации препарата и степени прогрессирования состояния заболевания. Кроме того, факторы, связанные с конкретным субъектом, получающим лечение, включая возраст субъекта, массу тела, рацион питания и время введения, приводят к необходимости корректировки дозы до соответствующего терапевтического уровня.

Для всех показаний, соединения настоящего изобретения, предпочтительно вводят периферически в дозе от около 1 мкг до около 5 мг в сутки в однократных или разделенных дозах (например, однократную дозу можно разделить на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 поддоз) или от около 0,01 до приблизительно 500 мкг/кг, более предпочтительно от около 0,05 до около 250 мкг/кг, наиболее предпочтительно ниже около 50 мкг/кг. Дозировки в этих диапазонах будут различаться по активности каждого агониста и могут быть легко определены специалистом в данной области техники. Следовательно, приведенные выше дозы представляют собой примеры для среднего случая. Несомненно, возможны индивидуальные обстоятельства, требующие применения более высоких или более низких диапазонов доз, которые входят в объем данного изобретения.

В некоторых вариантах осуществления, соединения настоящего изобретения, вводят в дозе от около 1 мкг до около 5 мг или в дозе от около 0,01 мкг/кг до около 500 мкг/кг, более предпочтительно в дозе от около 0,05 мкг/кг до около 250 мкг/кг, наиболее предпочтительно в дозе ниже около 50 мкг/кг с дозой второго терапевтического средства (например, лираглутид) в дозе от около 1 мкг до около 5 мг или в дозе от около 0,01 до около 500 мкг/кг, более предпочтительно в дозе от около 0,05 до около 250 мкг/кг, наиболее предпочтительно в дозе около 50 мкг/кг.

Фармацевтически приемлемые соли соединений, составляющих предмет настоящего изобретения, включают традиционные нетоксичные соли или четвертичные аммониевые соли, образованные из неорганических или органических кислот или оснований. Примеры таких кислотно-аддитивных солей включают в себя ацетат, адипат, бензоат, бензолсульфонат, цитрат, камфорат, додецилсульфат, гидрохлорид, гидробромид, лактат, малеат, метансульфонат, нитрат, оксалат, пивалат, пропионат, сукцинат, сульфат и тартрат. Основные соли включают в себя соли аммония, соли щелочных металлов, таких как натрий и калий, соли щелочноземельных металлов, таких как кальций и магний, соли органических оснований, такие как дициклогексаминовые соли, а также соли аминокислот, таких как аргинин. Кроме того, основные азотсодержащие группы могут переводиться в четвертичное состояние с помощью, например, алкилгалогенидов.

Фармацевтические композиции изобретения можно вводить любыми способами, подходящими для намеченной цели. Примеры включают в себя парентеральное, подкожное, внутривенное, внутримышечное, интраперитонеальное, трансдермальное, буккальное введение или закапывание в глаза. Введение может осуществляться пероральным путем. Приемлемые составы для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например, водорастворимые

- 31 045724 соли, кислые растворы, щелочные растворы, растворы в воде с добавлением декстрозы, изотонические углеводные растворы и комплексы включения с циклодекстрином.

Настоящее изобретение также охватывает способ получения фармацевтической композиции, включающий в себя смешивание фармацевтически приемлемого носителя с любым из соединений настоящего изобретения. Дополнительно, настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, полученные путем смешивания одного или большего числа фармацевтически приемлемых носителей с любым из соединений настоящего изобретения.

Дополнительно соединения настоящего изобретения могут существовать в одной или более полиморфных или аморфных кристаллических формах, и подразумевается, что они включены в объем изобретения. Кроме того, соединения могут образовывать сольваты, например, с водой (т.е. гидраты) или обычными органическими растворителями. В настоящем документе термин сольват означает физическую ассоциацию соединений настоящего изобретения, с одной или большим числом молекул растворителя. Такое физическое связывание включает в себя разные степени ионной и ковалентной связи, включая водородную связь. В определенных случаях существует возможность выделять сольват, например, если одна или более молекул растворителя включены в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. Подразумевается, что термин сольват охватывает как сольваты в фазе раствора, так и сольваты со способностью к выделению. Не имеющие ограничительного характера примеры приемлемых сольватов включают в себя этанолаты, метанолаты и т.п.

Подразумевается, что в объем настоящего изобретения включены полиморфы и сольваты конъюгатов настоящего изобретения. Таким образом, в способах лечения, составляющих предмет настоящего изобретения, термин введение охватывает средства лечения, облегчения или предотвращения синдрома, расстройства или заболевания, описанного в настоящем документе, с помощью конъюгатов, составляющих предмет настоящего изобретения или их полиморфа или сольвата, который очевидно включен в объем настоящего изобретения, хотя и не описан конкретно.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям настоящего изобретения, для применения в качестве лекарственного средства.

В объем настоящего изобретения включены пролекарства соединений настоящего изобретения. В целом такие пролекарства представляют собой функциональные производные соединений, которые in vivo легко превращаются в требуемое соединение. Таким образом, в способах лечения настоящего изобретения термин введение охватывает лечение различных описанных расстройств с использованием конкретного описанного соединения или с использованием соединения, которое не было конкретно описано, но которое превращается в установленное соединение in vivo после введения пациенту. Традиционные процедуры выбора и получения приемлемых производных пролекарств описаны, например, в публикации Design of Prodrugs, ed. Bundgaard, Elsevier, 1985.

Более того, предполагается, что в объеме настоящего изобретения любой элемент, в особенности упоминаемый применительно к соединениям настоящего изобретения, будет включать в себя все изотопы и смеси изотопов указанного элемента, которые встречаются в природе или получены синтетически, с природной распространенностью или в обогащенной изотопами форме. Например, ссылка на водород также охватывает 1Н, ²Н (D) и ³Н (Т). Аналогично ссылки на углерод и кислород охватывают ¹²С, ¹³С, и ¹⁴С, и ¹⁶O, и ¹⁸O соответственно. Изотопы могут быть радиоактивными или нерадиоактивными. Содержащие радиоактивную метку соединения настоящего изобретения, могут содержать радиоактивный изотоп, выбранный из группы, состоящей из ³Н, ^ПС, ¹⁸F, ¹²²I, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br и ⁸²Br. Предпочтительно радиоактивный изотоп выбран из группы, состоящей из ³Н, ^ПС и ¹⁸F.

Некоторые соединения настоящего изобретения могут существовать в виде атропоизомеров. Атропоизомеры представляют собой стереоизомеры, полученные путем затрудненного поворота вокруг одинарных связей, причем барьер стерической деформации при повороте достаточно высок, чтобы можно было выделить конформеры. Следует понимать, что все такие конформеры и их смеси входят в объем настоящего изобретения.

Когда соединения в соответствии с настоящим изобретением имеют по меньшей мере один стереоцентр, они могут соответственно существовать в виде энантиомеров или диастереомеров. Следует понимать, что все такие изомеры и их смеси входят в объем настоящего изобретения.

Если в ходе способов получения соединений в соответствии с изобретением образуются смеси стереоизомеров, эти стереоизомеры можно выделить традиционными методиками, такими как препаративная хроматография. Соединения можно получить в рацемической форме или отдельные энантиомеры можно получить в результате энантиоспецифического синтеза или посредством разделения. Соединения можно, например, разделить на составляющие их энантиомеры стандартными методиками, такими как формирование диастереомерных пар посредством формирования соли с оптически активной кислотой, такой как (-)-ди-п-толуоил-D-виннαя кислота и/или (+)-ди-п-толуоил-L-винная кислота, с последующей фракционной кристаллизацией и регенерацией свободного основания. Соединения также можно разделить посредством образования диастереомерных сложных эфиров или амидов с последующим хроматографическим разделением и удалением хирального вспомогательного соединения. Альтернативно, соединения могут быть разделены с применением хиральной колонки посредством высокоэффективной

- 32 045724 жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или СФХ. В некоторых случаях могут существовать ротамеры соединений, наблюдаемые на 1Н ЯМР, приводящие к появлению сложных мультиплетов и объединению пиков на спектре 1Н ЯМР.

В ходе любого из способов получения соединений настоящего изобретения может возникнуть необходимость и/или желание защитить чувствительные или реакционноспособные группы на любой из рассматриваемых молекул. Для данных целей можно использовать стандартные защитные группы, такие как группы, описанные в публикациях Protective Groups in Organic Chemistry, ed. J.F.W. McOmie, Plenum Press, 1973; и T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991, каждая из которых включена во всей своей полноте в текст настоящего документа посредством ссылки для всех целей. Защитные группы можно впоследствии удалить на любой удобной для этого стадии с помощью способов, известных в данной области техники.

Способы применения

Настоящее изобретение относится к способу предотвращения, лечения или облегчения синдрома, расстройства или заболевания, обусловленного рецептором Y2, у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения.

В настоящем изобретении также предложен способ предотвращения, лечения, задержки появления или облегчения расстройства, заболевания или состояния или любого одного или большего числа симптомов указанного расстройства, заболевания или состояния у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления заболевание расстройство или состояние выбрано из группы, состоящей из ожирения, диабета типа I или II, метаболического синдрома (т.е. синдрома X), резистентности к инсулину, нарушения переносимости глюкозы (например, непереносимость глюкозы), гипергликемии, гиперинсулинемии, гипертриглицеридемии, гипогликемии, обусловленной врожденным гиперинсулинизмом (CHI), дислипидемии, атеросклероза, диабетической нефропатии и других факторов риска для сердечно-сосудистой системы, таких как гипертензия и факторы риска для сердечно-сосудистой системы, связанные с неуправляемыми уровнями холестерина и/или липидов, остеопороза, воспаления, неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), неалкогольного стеатогепатита (NASH), болезни почек и/или экземы.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления терапевтически эффективное количество относится к количеству препарата, которое является достаточным для достижения одного, двух, трех, четырех или большего числа из следующих эффектов: (i) снижение или облегчение серьезности заболевания, расстройства или состояния, подлежащего лечению, или связанного с ним симптома; (ii) сокращение продолжительности заболевания, расстройства или состояния, подлежащего лечению, или симптома, связанного с ним; (iii) предотвращение развития заболевания, расстройства или состояния, подлежащего лечению, или связанного с ним симптома; (iv) регрессия причины заболевания, расстройства или состояния, подлежащего лечению, или связанного с ним симптома; (v) предотвращение развития или появления заболевания, расстройства или состояния, подлежащего лечению, или связанного с ним симптома; (vi) предотвращение повторения заболевания, расстройства или состояния, подлежащего лечению, или связанного с ним симптома; (vii) снижение необходимости госпитализации субъекта, имеющего заболевание, расстройство или состояние, подлежащее лечению, или связанный с ним симптом; (viii) снижение продолжительности госпитализации субъекта, имеющего заболевание, расстройство или состояние, подлежащее лечению, или связанный с ним симптом; (ix) повышение выживаемости субъекта с заболеванием, расстройством или состоянием, подлежащим лечению, или симптомом, связанным с ним; (xi) торможение или подавление заболевания, расстройства или состояния, подлежащего лечению, или симптома, связанного с ним у субъекта; и/или (xii) усиление или улучшение профилактического или терапевтического эффекта(ов) другой терапии.

Терапевтически эффективное количество или дозировка могут варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как заболевание, расстройство или состояние, подлежащее лечению, средства введения, участка-мишени, физиологического состояния субъекта (включая, например, возраст, массу тела, здоровье), является ли субъект человеком или животным, других введенных лекарственных средств и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Дозировки лечения оптимально титровали для оптимизации безопасности и эффективности.

В контексте настоящего документа, термины лечить, лечащий и лечение относятся к облегчению или возврату в исходное состояние по меньшей мере одного измеряемого физического параметра, связанного с заболеванием, расстройством или состоянием, который не обязательно очевиден у субъекта, но может быть видимым у субъекта. Термины лечить, лечащий и лечение также могут относиться к вызыванию регрессии, предотвращению прогрессирования или по меньшей мере замедлению прогрессирования заболевания, расстройства или состояния. В конкретном варианте осуществления лечить, ле

- 33 045724 чащий и лечение относятся к облегчению, предотвращению развития или появления, или уменьшению продолжительности одного или большего числа симптомов, связанных с заболеванием, расстройством или состоянием. В конкретном варианте осуществления лечить, лечащий и лечение относятся к предотвращению рецидива заболевания, расстройства или состояния. В конкретном варианте осуществления лечить, лечащий и лечение относятся к повышению выживаемости субъекта, имеющего заболевание, расстройство или состояние. В конкретном варианте осуществления термины лечить, лечащий и лечение относятся к устранению заболевания, расстройства или состояния у субъекта.

В одном варианте осуществления в изобретении предложен способ предотвращения, лечения, задержки появления или облегчения ожирения или любого одного или большего числа симптомов ожирения у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления масса тела субъекта уменьшается, например, между от около 0,01 до около 0,1%, между от около 0,1 до около 0,5%, между от около 0,5 до около 1%, между от около 1 до около 5%, между от около 2 до около 3%, между от около 5 до около 10%, между от около 10 до около 15%, между от около 15 до около 20%, между от около 20 до около 25%, между от около 25 до около 30%, между от около 30 до около 35%, между от около 35 до около 40%, между от около 40 до около 45% или между от около 45 до около 50%, по отношению к массе тела субъекта до введения любого из конъюгатов, соединений, фармацевтических композиций, форм или лекарственных средств настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, или в сравнении с контрольными субъектами, не получающими конъюгатов, композиций, форм, лекарственных средств или комбинаций настоящего изобретения, описанных в настоящем документе.

В определенных вариантах осуществления, снижение массы тела поддерживается в течение, например, около 1 недели, в течение около 2 недель, в течение около 3 недель, в течение около 1 месяца, в течение около 2 месяцев, в течение около 3 месяцев, в течение около 4 месяцев, в течение около 5 месяцев, в течение около 6 месяцев, в течение около 7 месяцев, в течение около 8 месяцев, в течение около 9 месяцев, в течение около 10 месяцев, в течение около 11 месяцев, в течение около 1 года, в течение около 1,5 лет, в течение около 2 лет, в течение около 2,5 лет, в течение около 3 лет, в течение около 3,5 лет, в течение около 4 лет, в течение около 4,5 лет, в течение около 5 лет, в течение около 6 лет, в течение около 7 лет, в течение около 8 лет, в течение около 9 лет, в течение около 10 лет, в течение около 15 лет или в течение около 20 лет.

В настоящем изобретении предложен способ предотвращения, лечения, задержки возникновения или облегчения синдрома, расстройства или заболевания или любого одного или большего числа симптомов указанного синдрома, расстройства или заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем упомянутый синдром, расстройство или заболевание выбраны из группы, состоящей из ожирения, диабетов типа I или типа II, метаболического синдрома (т.е., синдром X), резистентности к инсулину, нарушения переносимости глюкозы (например, непереносимость глюкозы), гипергликемии, гиперинсулинемии, гипертриглицеридемии, гипогликемии, обусловленной врожденным гиперинсулинизмом (CHI), дислипидемии, атеросклероза, диабетической нефропатии и других факторов риска для сердечно-сосудистой системы, таких как гипертензия и факторы риска для сердечно-сосудистой системы, связанные с неуправляемыми уровнями холестерина и/или липидов, остеопороза, воспаления, неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), неалкогольного стеатогепатита (NASH), болезни почек и экземы, предусматривающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, его производного или фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения.

В контексте настоящего документа, метаболический синдром относится к субъекту, имеющему одно или большее число из следующего: высокий уровень сахара в крови (например, высокий уровень сахара в крови в состоянии натощак), высокое кровяное давление, аномальный уровень холестерина (например, низкие уровни HDL), аномальные уровни триглицеридов (например, высокие уровни триглицеридов), большая талия (т.е. окружность талии), повышенное отложение жира в абдоминальной области, резистентность к инсулину, непереносимость глюкозы, повышенные уровни С-реакционноспособного белка (т.е. провоспалительное состояние) и повышенные уровни ингибитора-1 активатора плазминогена плазмы и фибриногена (т.е. протромботическое состояние).

В настоящем изобретении предложен способ снижения потребления пищи у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления потребление пищи субъектом уменьшается, например, между от около 0,01 до около 0,1%, между от около 0,1 до около 0,5%, между от около 0,5 до около 1%, между от около 1 до около 5%, между от около 2 до около 3%, между от около 5 до около 10%, между от около 10 до около 15%, между от около 15 до около 20%, между

- 34 045724 от около 20 до около 25%, между от около 25 до около 30%, между от около 30 до около 35%, между от около 35 до около 40%, между от около 40 до около 45% или между от около 45 до около 50% по отношению к потреблению пищи субъектом до введения любого из конъюгатов, соединений, композиций, форм, лекарственных средств или комбинаций настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, или в сравнении с контрольными субъектами, не получающими конъюгатов, соединений, композиций, форм, лекарственных средств или комбинаций настоящего изобретения, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления уменьшение потребления пищи поддерживается, например, в течение около 1 недели, в течение около 2 недель, в течение около 3 недель, в течение около 1 месяца, в течение около 2 месяцев, в течение около 3 месяцев, в течение около 4 месяцев, в течение около 5 месяцев, в течение около 6 месяцев, в течение около 7 месяцев, в течение около 8 месяцев, в течение около 9 месяцев, в течение около 10 месяцев, в течение около 11 месяцев, в течение около 1 года, в течение около 1,5 лет, в течение около 2 лет, в течение около 2,5 лет, в течение около 3 лет, в течение около 3,5 лет, в течение около 4 лет, в течение около 4,5 лет, в течение около 5 лет, в течение около 6 лет, в течение около 7 лет, в течение около 8 лет, в течение около 9 лет, в течение около 10 лет, в течение около 15 лет или в течение около 20 лет.

В настоящем изобретении предложен способ снижения гликемического гемоглобина (А1С) у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления А1С субъекта снижается, например, на между от около 0,001 до около 0,01%, между от около 0,01 до около 0,1%, между от около 0,1 до около 0,2%, между от около 0,2 до около 0,3%, между от около 0,3 до около 0,4%, между от около 0,4 до около 0,5%, между от около 0,5 до около 1%, между от около 1 до около 1,5%, между от около 1,5 до около 2%, между от около 2 до около 2,5%, между от около 2,5 до около 3%, между от около 3 до около 4%, между от около 4 до около 5%, между от около 5 до около 6%, между от около 6 до около 7%, между от около 7 до около 8%, между от около 8 до около 9% или между от около 9 до около 10% по отношению к А1С субъекта до введения любого из конъюгатов, соединений, композиций, форм, лекарственных средств или комбинаций настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, или в сравнении с контрольными субъектами, не получающими конъюгатов, соединений, композиций, форм, лекарственных средств или комбинаций настоящего изобретения, описанных в на стоящем документе.

В других вариантах осуществления предложены способы снижения уровней глюкозы в крови в состоянии натощак у нуждающегося в этом субъекта, причем способы включают введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения. Уровни глюкозы в крови в состоянии натощак могут быть снижены до менее, чем от около 140 до около 150 мг/дл, менее чем от около 140 до около 130 мг/дл, менее чем от около 130 до около 120 мг/дл, менее чем от около 120 до около 110 мг/дл, менее чем от около 110 до около 100 мг/дл, менее чем от около 100 до около 90 мг/дл или менее чем от около 90 до около 80 мг/дл, по отношению к уровням глюкозы в крови в состоянии натощак у субъекта до введения любого из конъюгатов, соединений, композиций, форм, лекарственных средств или комбинаций настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, или в сравнении с контрольными субъектами, не получающими конъюгатов, соединений, композиций, форм, лекарственных средств или комбинаций настоящего изобретения, описанных в настоящем документе.

В настоящем изобретении предложен способ модуляции активности рецептора Y2 у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения. В контексте настоящего документа, термин модулирование относится к увеличению или уменьшению активности рецептора.

В некоторых вариантах осуществления эффективное количество соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения вводят нуждающемуся в этом субъекту один раз в день, дважды в день, три раза в день, четыре раза в день, пять раз в день, шесть раз в день, семь раз в день или восемь раз в день. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированных с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения вводят нуждающемуся в этом субъекту через день, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, два раза в месяц, три раза в месяц или четыре раза в месяц.

- 35 045724

Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает способ предотвращения, лечения, задержки появления или облегчения заболевания, расстройства или синдрома, или одного или большего числа симптомов любого из указанных заболеваний, расстройств или синдромов у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения в комбинированной терапии. В некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия представляет собой второе терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия представляет собой хирургическую терапию.

В настоящем документе термин в комбинации, в контексте введения субъекту двух или большего числа лекарственных средств, относится к применению более чем одной терапии.

В контексте настоящего документа комбинированная терапия относится к введению нуждающемуся в этом субъекту одного или большего числа дополнительных терапевтических средств или одной или большему числу хирургических терапий, совместно с эффективным количеством соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления один или большее число дополнительных терапевтических средств или хирургических терапевтических средств можно вводить в один и тот же день в виде эффективного количества соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения, и в других вариантах осуществления один или большее число дополнительных терапевтических средств или хирургических терапевтических средств можно вводить в одну неделю или в один и тот же месяц в виде эффективного количества соединения, производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления, в которых заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из ожирения, диабета типа II, метаболического синдрома, резистентности к инсулину и дислипидемии, второе терапевтическое средство может представлять собой противодиабетическое средство. В некоторых вариантах осуществления противодиабетическое средство может представлять собой модулятор рецептора глюкагон-подобного пептида-1 (GLP-1).

Настоящее изобретение также предусматривает предотвращение, лечение, отсрочку возникновения или облегчение любого из заболеваний, расстройств, синдромов или симптомов, описанных в настоящем документе, у нуждающегося в этом субъекта с помощью комбинированной терапии, которая включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения в комбинации с одним или большим числом следующих терапевтических средств: ингибитор дипептидил-пептидазы-4 (DPP-4) (например, ситаглиптин, саксаглиптин, линаглиптин, алоглиптин и т.д.); агонист рецептора GLP-1 (например, агонисты GLP-1 непродолжительного действия, такие как экзенатид и ликсисенатид; агонисты рецептора GLP-1 средней продолжительности действия, такие как лираглутид; агонисты рецептора GLP-1 длительного действия, такие как эксенатид с замедленным высвобождением, альбиглутид, дилаглутид); ингибиторы котранспортера-2 натрия глюконата (SGLT-2) (например, канаглифозин, дапаглифозин, эмпаглифозин и т.д.); усилители экскреции желчных кислот (например, колесевелам и т.д.); агонисты дофаминового рецептора (например, бромпираптин быстрого высвобождения); бигуаниды (например, метформин и т.д.); инсулин; оксинтомодулин; сульфонилмочевины (например, хлорпропамид, глимепирид, глипизид, глибурид, глибенкламид, глиборнурид, глизоксепид, гликопирамид, толазамид, толбутамид, ацетогексамид, карбутамид и т.д.); и тиазолидиндионы (например; пиоглитазон, розиглитазон, лобеглитазон, циглитазон, дарглитазон, энглитазон, нетоглитазон, ривоглитазон, троглитазон и т.д.). В некоторых вариантах осуществления доза дополнительного терапевтического средства(-в) уменьшается при введении в комбинации с соединением, его производным или его фармацевтически приемлемой солью, необязательно конъюгированным с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композицией изобретения. В некоторых вариантах осуществления при использовании в комбинации с конъюгатом или соединением настоящего изобретения, дополнительное терапевтическое средство(а) можно применять в более низких дозах, чем когда каждый используется отдельно.

В определенных вариантах осуществления, где заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из ожирения, диабета типа I или типа II, метаболического синдрома (т.е. синдрома X), резистентности к инсулину, нарушения переносимости глюкозы (например, непереносимость глюкозы), гипергликемии, гиперинсулинемии, гипертриглицеридемии, гипогликемии, обусловленной врожденным гиперинсулинизмом (CHI), дислипидемии, атеросклероза, диабетической нефропатии и других факторов риска для сердечно-сосудистой системы, таких как гипертензия и факторы риска для сердечнососудистой системы, связанные с неуправляемыми уровнями холестерина и/или липидов, остеопороза,

- 36 045724 воспаления, неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), неалкогольного стеатогепатита (NASH), болезни почек и экземы, второе терапевтическое средство может представлять собой лираглутид.

Настоящее изобретение предусматривает предотвращение, лечение, отсрочку возникновения или облегчение любого из заболеваний, расстройств, синдромов или симптомов, описанных в настоящем документе, у нуждающегося в этом субъекта с помощью комбинированной терапии, которая включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, его производного или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно конъюгированного с фрагментом для продления периода полувыведения, или фармацевтической композиции настоящего изобретения, в комбинации с хирургической терапией. В некоторых вариантах осуществления хирургическая терапия может представлять собой бариатрическую хирургию (например, операция шунтирования желудка, такая как шунтирование желудка с гастроэнтероанастомозом по Ру; рукавная гастрэктомия; регулируемое бандажирование желудка; билиопанкреатическое шунтирование с выключением двенадцатиперстной кишки; внутрижелудочный баллон; пликация желудка и их комбинации).

В вариантах осуществления, в которых один или большее число дополнительных терапевтических средств или хирургических терапевтических средств вводят в тот же день, что и эффективное количество конъюгата или соединения настоящего изобретения, конъюгат или соединение настоящего изобретения, можно вводить до, после или одновременно с дополнительным терапевтическим средством или хирургическим терапевтическим средством. Применение термина в комбинации не ограничивает порядок, в котором лекарственные средства вводят субъекту. Например, первое терапевтическое средство (например, описанную в настоящем документе композицию) можно вводить перед (например, за 5, 15, 30, 45 мин, 1, 2, 4, 6, 12, 16, 24, 48, 72, 96 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 12 недель), совместно с или после (например, через 5, 15, 30, 45 мин, 1, 2, 4, 6, 12, 16, 24, 48, 72, 96 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 12 недель) введения второго терапевтического средства нуждающемуся в этом субъекту.

Сокращения

Здесь и в остальном тексте заявки могут применяться приведенные ниже сокращения:

Abu: 4-аминомасляная кислота;

Ac₂O: уксусный ангидрид;

водн.: водный;

alloc: аллилоксикарбонил;

arach: арахидил;

Boc: трет-бутоксикарбонил;

БСА: альбумин бычьей сыворотки;

КДИ: 1,1'-карбонилдиимидазол;

ДХМ: дихлорметан;

Dde: 1 -(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1 -илиден)этил;

DIBAL-H: диизобутилалюминия гидрид;

ДИК: диизопропилкарбодиимид;

ДИЭА: диизопропилэтиламин;

ДМА: К,К-диметилацетамид;

ДМФ: К,К-диметилформамид;

ДМСО: метилсульфоксид;

ДОДТ: 2,2'-(этилендиокси)диэтантиол;

ЭДК: К-(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимид;

ЭДКИ: 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид;

Et: этил;

EtOAc: этилацетат;

EtOH: этиловый спирт;

ФБС: эмбриональная телячья сыворотка;

Fmoc: 9-фторенилметоксикарбонил;

г: грамм(ы);

ч: час(ы);

HATU: 2-(1 H-7 -азабензотриазол-1 -ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния гексафторфосфат;

HBSS: Сбалансированное солевой раствор Хэнка;

HBTU: 2-(1 H-бензотриазол-1 -ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат);

HCTU: 2-(6-хлоро-1 H-бензтриазол-1 -ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния гексафторфосфат;

HCl: соляная кислота;

HEPES: 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота;

НОВТ: 1-гидроксибензтриазол;

ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография;

ivDde: 1-(4,4-диметил-2,6-диоксициклогекс-1-илиден)-3-метилбутил;

LAH: литийалюминийгидрид;

ЖХМС: жидкостная хроматография высокого давления с масс-спектрометрией;

- 37 045724

Me: метил;

MeCN: ацетонитрил;

МеОН: метиловый спирт;

мг: миллиграмм;

мин: минута(ы);

Mmt: 4-метокситритил;

мл/мин: 1 мл в минуту;

Mtt: 4-метилтритил;

NHS: N-гидроксисукцинимид;

NMP: 1-метил-2-пирролидон;

OEG: 8-амино-3,6-диоксаоктаноил;

Оксима: этилциано(гидроксиимино)ацетат;

Pal: пальмитоил;

Pbf: 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил;

Pd(PPh₃)₄: тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0);

PhSiH₃: фенилсилан;

psi: восстановленная амидная связь (между соседними аминокислотами);

PyBroP: бром-трис-пирролидинофосфония гексафторфосфат;

Pyoxim: 1 -циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси-трис-пирролидинофосфония гексафторфосфат; к.т.: комнатная температура;

RT: время удерживания;

насыщ.: насыщенный;

SPPS: твердофазный синтез пептидов;

Stear: стеароил;

t-Bu: трет-бутил;

TBTU: 2-(1 H-бензотриазол-1 -ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния тетрафторборат;

ТФУ: трифторуксусная кислота;

ТГФ: тетрагидрофуран;

ТГП: тетрагидропиранил;

ТИПС: триизопропилсилан;

Tris: трис-(гидроксиметил)аминометан;

Trt: трифенилметил.

Синтез.

Соединения формулы I в настоящем изобретении можно синтезировать в соответствии с общими способами синтеза, известными специалистам в данной области. Приведенное ниже описание синтеза приводится в качестве примера и никоим образом не направлено на ограничение настоящего изобретения.

Аналоги или производные NTSC циклического PYY (NTSC-PYY) можно синтезировать с помощью различных известных стандартных методик образования последовательных пептидных связей между аминокислотами и предпочтительно осуществляются посредством твердофазного пептидного синтеза (SPPS), как в общем описано в работе Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154), с использованием автоматизированного синтезатора пептидов, традиционного лабораторного синтеза или комбинации обоих подходов. Традиционные методики пептидного синтеза включают конденсацию свободной аминогруппы одного аминокислотного остатка, другие реакционно-способные функциональные группы которой надлежащим образом защищены, и свободной карбоксильной группы другой аминокислоты, реакционно-способные функциональные группы которой также надлежащим образом защищены. Примеры агентов конденсации, обычно используемых для образования пептидной связи, включают диизопропилкарбодиимид (ДИК) с или без 1-гидроксибензтриазола (НОВТ) или этилциано(гидроксиамино)ацетатом (оксима чистая), 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния гексафторфосфат (HBTU), 2-(1H-7-азабензтриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламинuя гексафторфосфат (HATU), 2-(6-хлоро-1H-бензтриазол-1 -ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния гексафторфосфат (HCTU), 1 -циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси-трис-пирролидинофосфония гексафторфосфат (PyOxim), 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3тетраметиламиния тетрафторборат (TBTU), бром-трис-пирролидинфосфония гексафторфосфат (PyBroP) и т.п.

Методологию автоматизированного синтеза пептидов можно осуществлять при комнатной температуре или при повышенных температурах, предпочтительно путем применения микроволнового нагревания, как описано в Yu (J. Org. Chem., 1992, 57, 4781-4784) и позднее усовершенствовано в Palasek (J. Pept. Sci., (2007), 13, 143-148).

Соединения настоящего изобретения, (С-концевые амиды), можно удобно получить с применением N-a-Fmoc-защищенной аминокислотной методологии, при которой карбоксиконец соответствующим образом N-a-Fmoc-защищенной аминокислоты подвергают связыванию с обычной твердофазной смолой

- 38 045724 с применением подходящего агента связывания. Подходящие традиционные коммерчески доступные твердофазные смолы включают смолу амидную МВНА-смолу Ринка, амидную AM-смолу Ринка, смолу Tentagel S RAM, смолу Fmoc-PAL-PEG PS, амидную смолу Ринка SpheriTide, смолу Ринка ChemMatrix, амидную смолу Зибера TG, смолу Зибера TG и т.п. Затем можно снять защиту со связанной со смолой Fmoc-аминокислоты посредством воздействия 20% пиперидина в ДМФ или NMP, обработка которым служит для избирательного удаления защитной группы Fmoc. Дополнительные Fmoc-защищенные аминокислоты затем последовательно подвергают связыванию и последовательно снимают с них защиту, таким образом генерируя желаемый защищенный пептид, связанный со смолой. В определенных случаях может быть необходимо использовать ортогонально реакционноспособную защитную группу для другого амина в пептидной последовательности, которая будет выдерживать условия снятия защиты Fmoc. Защитные группы, такие как 4-метилтритил (Mtt) или 4-метокситритил (Mmt), обе из которых удаляются посредством обработки 1% ТФУ/ДХМ, или предпочтительно аллоксикарбонил (alloc; который удаляется посредством обработки Pd(PPh₃)₄/PhSiH₃), 1-(4,4-диметил-2,6-диоксициклогекс-1-илиден)этил (Dde; который удаляется посредством обработки 2-3% гидразином/ДМФ) и 1-(4,4-диметил-2,6-диоксициклогекс1-илиден)-3-метилбутил (ivDde; который удаляется посредством обработки 2-3% гидразином/ДМФ), могут эффективно применяться в таких случаях.

В традиционных методологиях синтеза пептидов реакционноспособные боковые цепи альфааминокислот в основном защищены в течение всего процесса синтеза с помощью подходящих защитных групп, чтобы сделать их инертными по отношению к протоколам связывания и снятия защиты. Хотя в данной области техники известно множество защитных групп для боковых цепей аминокислот, в настоящем документе наиболее предпочтительны следующие защитные группы: трет-бутил (t-Bu) для серина, треонина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и тирозина; тритил (Trt) для аспарагина, глутамина, цистеина, гомоцистеина и гистидина; трет-бутоксикарбонил (Boc) для триптофана и ε-аминогруппы лизина; и 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил (Pbf) для аргинина. Эти защитные группы удаляются после обработки сильной кислотой, например с помощью высоких концентраций трифторуксусной кислоты (ТФУ).

После завершения SPPS, со связанного со смолой пептида с защищенной боковой цепью снимают защиту и одновременно отщепляют от смолы с помощью смеси для расщепления, которая состоит преимущественно из (ТФУ) вместе с различными комбинациями поглотителей карбокатионов, таких как триизопропилсилан (ТИПС), вода, фенол и анизол. Неочищенный твердый пептид затем выделяют путем осаждения фильтрата пептида/смеси холодным эфиром. В частном случае связанных со смолой Зибера защищенных пептидов, отщепление защищенного пептида от смолы может быть эффективно реализовано после многократной обработки 1-2% ТФУ в ДХМ без нарушения защиты боковой цепи. После выделения, дополнительные манипуляции с защищенным пептидом могут проводиться посредством реакций в растворе. Наконец, с защищенного пептида можно снять общую защиту с помощью отдельной обработки смесью для расщепления, и осадить его, как описано выше. Полученный таким образом неочищенный пептид затем растворяют до низкой концентрации (приблизительно <4 мг/мл) в преимущественно водной системе растворителей, содержащей органический сорастворитель, такой как ацетонитрил или этанол. После повышения рН раствора до >5 пептид затем подвергают реакции внутримолекулярной циклизации с образованием соответствующего неочищенного аналога NTSC PYY настоящего изобретения. Образованные таким образом аналоги NTSC PYY можно очистить с помощью методик очистки, общеизвестных в данной области техники. Предпочтительным способом очистки пептида, применяемым в настоящем документе, является обращенно-фазовая жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ). Затем выполняют анализ очищенных пептидов с помощью метода жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХМС).

Общие схемы.

Общая синтетическая методика для синтеза С-концевых амидов NTSC-PYY, в которой МОСТИК представляет собой -Ph-CH₂-S-, показана на Схеме 1.

- 39 045724

Схема 1

Синтез толуоил-тиоэфир-связанных NTSC-PYY пептидов: С-концевые амиды

Fmoc-смола Ринка (смола PAL-PEG PS; -0,16-0,2 ммоль/г)

Автоматизированный SPPS этап А этап В экв. Ртос-АА(защищенный)-ОН, ДИК/Оксима или HBTU/ДИЭА

[l]_pZ_4PEZ₇PZ₉EZ₁₁AS_PEELNRY_YZ₂₂Z₂3LRZ_26YLNZ3₀Z3₁[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH-Q nh₂

I 20 экв. ХСН₂РЬСОгН, 10 экв. ДИК, микроволновое

I облучение, 75 °C, 15 мин

[l]_pZ_4pE_Z7PZ₉EZ₁₁AS_PEELNR_YYZ₂₂Z₂₃LRZ_26YLNZ₃₀Z₃₁[V₃₁]_qTR_Z34Z₃₅Y-NH-Q

HN

этап С

ТФУ/Н₂О/фенол/ТИПС (88:5:5:2)

[l]_pZ₄PEZ₇PZ₉EZ₁₁ASPEELNR_YYZ₂₂Z₂3LRZ₂₆yLNZ3oZ3₁[V3₁]_qTRZ3₄Z_35Y-NH₂

этап D

MeCN/H₂O или EtOH/H,O, ph ~7 - 9 [< 4 мг/мл]

H

[I1PZ4PEZ7PZ9EZHASPEELNRYYZ22Z23LRZ26YLNZ3Q-N

I ___

О --------------------------s^x (V₃₁]_qTRZ₃₄Z_35Y-NH₂ * Аминокислоты защищены, Z₃j = Cys, гомоСу s

X представляет собой Cl или Br

А) Синтез связанного со смолой С-концевого амидного пептида.

Защищенную пептидильную смолу можно синтезировать с применением стратегии Fmoc, как описано выше, на микроволновом синтезаторе пептидов СЕМ Liberty Blue, с применением амидных смол Ринка низкой загрузки, предпочтительно, смолы Fmoc-PAL-PEG PS (приблизительно 0,16-0,2 м-экв/г, поставляемой компанией Applied Biosystems) в масштабе 0,1 ммоль, как изображено на Схеме 1. Стандартные Fmoc-защищенные аминокислоты (поставляемые компаниями Novabiochem (EMD Millipore), Bachem, Peptides International или Chem-Impex) можно подвергнуть связыванию в 5-кратном избытке по отношению к загрузке смолы с применением ДИК/оксима в качестве агентов связывания и температуры реакции приблизительно 90°C в течение 4 мин. Можно выполнить двойное связывание Fmoc-Arg (Pbf)-ОН при 90°C в течение 4 мин для каждой, и Fmoc-His(Trt)-ОН можно подвергнуть связыванию с применением двухстадийного протокола: 4 мин при к.т., затем 8 мин при 50°C. Индивидуальные снятия Fmoc можно проводить с применением 20% пиперидина в ДМФ (раствор для снятия защиты) при 90°C в течение 1,5 мин.

B) Методика связывания галометилбензойных кислот.

Пептидную смолу со снятой Fmoc-защитой (0,1 ммоль) можно обработать раствором желаемого изомера (мета или пара) либо хлоро-, либо бромметилбензойной кислоты (20 экв.) и ДИК (10 экв.) в ДМФ (4 мл) в микроволновом реакторе при 75°C в течение 15 мин. Полноту реакции можно определить с помощью нингидринового теста Кайзера (Kaiser, et al., Anal. Biochem., 1970, 34, 595-598). В случаях, когда связывание определили как неполное, связывание можно повторить со свежими реагентами.

C) Методика отщепления пептидов от смолы.

После завершения SPPS смолу можно интенсивно промыть с помощью ДМФ и затем ДХМ, и высушить. Затем смолу можно обработать смесью для расщепления (в масштабе 10 мл/0,1 ммоль), состоящей из ТФУ/вода/ТИПС (95:2,5:2,5) (смесь для расщепления А) или более предпочтительно с помощью ТФУ/вода/фенол/ТИПС (88:5:5:2) (смесь для расщепления В) и нагревать в микроволновом реакторе при 38°C в течение 40 мин, после чего профильтровать. Смолу можно промыть с помощью ТФУ и объединенные фильтраты сконцентрировать под потоком азота до объема приблизительно 2,5 мл, и затем пеп

- 40 045724 тид можно осадить путем добавления холодного диэтилового эфира (40 мл). Суспензию пептид/эфир можно центрифугировать и декантировать слой эфира. Осадок пептида можно ресуспендировать в эфире, центрифугировать и декантировать, и этот процесс можно повторить третий раз. Полученный таким образом неочищенный пептид затем можно высушить под мягким потоком азота.

D) Методика циклизации пептида (образование тиоэфира).

Неочищенный цистеин- или гомоцистеин-содержащий пептид можно растворить в бескислородный MeCN/вода (50-60% MeCN) или EtOH/вода (60% EtOH) в концентрации <4 мг/мл. Затем рН раствора пептида можно повысить до приблизительно 7-9 путем добавления либо твердого NaHCO₃, либо насыщенного водн. NaHCO₃ или 1 М водн. Буфер Трис (рН 7,5), и полученный раствор можно перемешивать при к.т. в течение 3-16 ч. Обычно циклизация завершается в течение 3-4 ч, что определяют с помощью анализа методом ЖХМС.

E) Методика очистки пептида.

Реакционную смесь для циклизации можно подкислить до рН 1,5-3 путем добавления ТФУ, а раствор сконцентрировать для удаления большей части органического растворителя (MeCN или EtOH) до точки, в которой происходит незначительное помутнение. При необходимости, можно добавить обратно минимальное количество сорастворителя, для достижения однородности смеси, и затем итоговый раствор можно непосредственно очистить с помощью препаративной ВЭЖХ с многократными инъекциями. Очистку можно выполнять либо на системе для ВЭЖХ Agilent PrepStar, либо на системе для ВЭЖХ Gilson 2020 Personal Purification System, с применением обращенно-фазовой С18 или С8 колонки, выбранной из следующего: Varian Pursuit XRs C18 (21x250 мм, 100 А, 5 мкм); Varian Pursuit XRs Diphenyl (30x100 мм, 100 А, 5 мкм); Zorbax 300 SB-C8 (21x250 мм, 300 А, 5 мкм); Waters Atlantis T3 С18 (19x250 мм, 100 А, 5 мкм); Agilent Polaris 5 C18-A (30x250 мм, 180 А, 5 мкм). Подвижная фаза может состоять из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 10-20% В до конечных концентраций 40-90% В со значениями времени выполнения в диапазоне 36-80 мин. УФ-детектирование можно контролировать при 220 и 254 нм. Фракции, содержащие продукт, можно проанализировать с помощью аналитической ВЭЖХ на системе для ВЭЖХ Agilent 1100, с применением соответствующего типа колонки из приведенных выше (4,6x250 мм, 5 мкм). Чистые фракции можно объединить, сконцентрировать для удаления большей части органической фазы, а затем лиофилизировать. После этого можно осуществить солевой обмен ТФУ/HCl путем троекратной лиофилизации из 2 мМ HCl согласно методике, описанной в Andrushchenko, et al., (J. Pept. Sci., 2006, 13, 37-43).

Общий метод синтеза для синтеза С-концевых амидных NTSC-PYY пептидов, где МОСТИК представляет собой -NHC(O)CH2S-показан на Схеме 2.

- 41 045724

Схема 2

Синтез ацетамидоил-тиоэфир-связанных NTSC-PYY пептидов: С-концевые амиды Ртос-смола Ринка (смола PAL-PEG PS; -0,16-0,2 ммоль/г)

Автоматизированный SPPS этап А экв. Ртос-АА(защищенный)-ОН, ДИК/Оксима или HBTU/ДИЭА

[l]_pZ4PEZ₇PZ₉EZ₁₁ASPEELNRY¥Z₂₂Z₂₃LRZ₂₆YLNZ₃oZ₃₁[V3₁]_qTRZ₃4Z₃₅Y-NH-Q

HN_x.(CH₂)_iy”NH₂ этап В > (6 экв.) (ВгСН₃СО)₂О, микроволновое облучение, 50 °C, 5 мин

[l]_pZ₄PEZ₇PZ₉EZ₁₁ASPEELNRYYZ₂₂Z₂₃LRZ₂₆YLNZ₃₀Z₃₁[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH-Q

I н

HN.ACH₂)-N

Br

О этап С

ТФУ/Н₂О/фенол/ТИПС (88:5:5:2)

[l]pZ₄PEZ₇PZ₉EZ₁₁ASPEELNRYYZ₂₂Z23LRZ₂₆YLNZ3₀Z₃₁[V3₁]qTRZ₃4Z3₅Y-NH₂ этап I )

[l]_pZ4PEZ₇PZ₉EZ_uASPEELNRYYZ₂₂Z₂3LRZ₂₆YLNZ₃₀-N

MeCN/HjO или EtOH/H₂O, ph -7 - 9 [< 4 мг/мл]

Н ?

[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH₂ ,(СН₂)_П

S * Аминокислоты защищены, Ζ_3ί = Cys, гомоСув

Этапы А, С, D и очистка Е по существу идентичны этапам, описанным на Схеме 1. Однако на этапе В можно ввести альтернативный МОСТИК, как описано ниже.

Пептидную смолу, с которой сняли защиту Fmoc, (0,1 ммоль) можно обрабатывать раствором бромуксусного ангидрида (6-20 экв.) в ДМФ (5 мл) в микроволновом реакторе при 50°C в течение 5 мин; по истечении данного времени реакцию обычно определяют как завершенную согласно нингидриновому тесту Кайзера. В случаях, когда связывание определили как неполное, связывание можно повторить со свежими реагентами.

Общий метод синтеза для синтеза С-концевых амидных NTSC-PYY пептидов, где Z₃₅ представляет собой

показан на Схеме 3.

- 42 045724

Схема 3

Загрузка структурного элемента psi-(R35,Y36) на смолу Зибера.

Fmoc-смола Зибера (смола Зибера NovaSyn TG; -0,19 ммоль/г)

Fmoc(вручную) этап А 2,5 3KB.Fmoc-Arg(Pbf)T[CH₂N(Boc)]Tyr(t-Bu)-OH,

НАТи/ДИЭА или ДИК/Оксима/ДИЭА, к.т., в течение ночи

Fmoc-Z₃₅Y-NH- Q (автоматизированный) ^лап 5 экв. Fmoc-AA, [щущдцэд, микроволновое облучение, 50 °C, 15 мин

Fmoc-NH-[l]pZ₄PEZ₇PZ₉EZ₁₁ASPEELNRY¥Z2₂Z₂3LRZ₂₆¥LNZ₃₀Z₃₁[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH-Q * Аминокислоты защищены; Z₃₁= Cys, гомоСуз, Glue, азидо-Lys

А) Связывание, опосредованное HATU.

В оплавленном микроволновом реакционном сосуде (поставляемом компанией СЕМ Corporation) смолу Зибера NovaSyn TG (поставляемую компанией Novabiochem) (0,1 ммоль) можно обработать раствором для снятия защиты (5 мл) и нагревать при 50°C в течение 2,5 мин. Реакционную смесь сливают, промывают с помощью ДМФ и снова обрабатывают раствором для снятия защиты при 50°C в течение 5 мин. После сливания и промывания смолы с помощью ДМФ, выполняют третью обработку для снятия защиты при 50°C в течение 5 мин. Смолу сливают и интенсивно промывают ДМФ, а затем ДХМ. Затем смолу обрабатывают раствором Fmoc-Arg(Pbf)-psi-(N-Boc)Tyr(tBu)-ОН из Схемы 14 (3-5 экв.), HATU (2,75-4,5 экв.) и ДИЭА (6-10 экв.) в ДМФ (4 мл) и перемешивают при к.т. в течение 24 ч. Смесь сливают и смолу интенсивно промывают с помощью ДМФ. Затем смолу кэпируют путем обработки с помощью 20% Ac₂O в ДМФ (5 мл) в условиях микроволнового облучения при 50°C в течение 5 мин. Реакционную смесь сливают и смолу интенсивно промывают с помощью ДМФ, а затем ДХМ.

A) (альтернативный вариант) Связывание, опосредованное с помощью ДИК/оксима.

В оплавленном микроволновом реакционном сосуде можно снять защиту со смолы Зибера NovaSyn TG (0,1 ммоль), как описано на этапе А выше, затем обработать раствором moc-Arg(Pbf)-psi-(NBoc)Tyr(tBu)-ОН (2,75 экв.), ДИК (2,75 экв.), Оксима (2,75 экв.) и ДИЭЕ (0,275 экв.) в MeCN (4 мл) и перемешивать при к.т. в течение 24 ч. Реакционную смесь сливают и смолу интенсивно промывают с помощью ДМФ, а затем ДХМ, и ее можно применять напрямую, без кэпирования.

B) Усовершенствование восстановленного амидного (psi-R35,Y36) пептида на предварительно загруженной смоле Зибера.

Дополнительные аминокислотные удлинения на предварительно загруженной смоле Зибера (psi-R35,Y36) можно осуществить на микроволновом синтезаторе пептидов СЕМ Liberty Blue. Стандартные Fmoc-защищенные аминокислоты подвергали связыванию в 5-кратном избытке по отношению к исходной загрузке смолы с применением HBTU/ДИЭА в качестве агентов связывания, и температуры реакции приблизительно 50°C в течение 15 мин. Двойное связывание Fmoc-Arg(Pbf)-ОН можно осуществить с применением двухстадийного протокола для каждого связывания: 25 мин при к.т., затем 15 мин при 50°C и двойное связывание Fmoc-His(Trt)-ОН можно осуществить с применением двухстадийного протокола для каждого связывания: 4 мин при к.т., затем 8 мин при 50°C. Снятие защиты Fmoc можно осуществить в две стадии, с применением свежего раствора для снятия защиты для каждой стадии: 1) 50°C в течение 2,5 мин и 2) 50°C в течение 5 мин. В некоторых случаях можно эффективно применять двойные связывания в течение всего процесса для улучшения качества выделенного неочищенного пептида.

Установка тиоэфирного МОСТИК-фрагмента может протекать также путем связывания бромметилбензойной кислотой, показанного на Схеме 1, этап В, с температурой реакции 50°C. Альтернативно, тиоэфирный МОСТИК-фрагмент можно ввести с помощью связывания путем бромацетилирования, показанного на Схеме 2, этап В.

После завершения SPPS смолу интенсивно промывают ДМФ, а затем ДХМ и высушивают. Затем можно осуществить отщепление защищенного пептида от смолы Зибера с помощью раствора 1-2% ТФУ в ДХМ (в масштабе 10 мл/0,1 ммоль), перемешивать в течение приблизительно 10 мин и профильтровать. Эту обработку можно повторить дополнительных 9 раз, используя свежую смесь при каждой обработке. Объединенные фильтраты затем концентрируют с получением неочищенного защищенного пептида в виде сиропа/твердого вещества желтого цвета, который можно применять напрямую для после

- 43 045724 дующего снятия общей защиты. Полученный выше защищенный пептид обрабатывают смесью для расщепления В (10 мл) при к.т. в течение 2,5 ч, а затем концентрируют под потоком азота до объема приблизительно 2,5 мл. Неочищенный пептид можно осадить путем добавления холодного диэтилового эфира (40 мл). Суспензию пептид/эфир можно центрифугировать и слой эфира декантировать. Осадок пептида можно ресуспендировать в эфире, центрифугировать и декантировать, и этот процесс можно повторить третий раз. Полученный таким образом неочищенный пептид можно высушить под мягким потоком азота. Циклизацию и очистку восстановленных амидных пептидов (psi-R35,Y36) можно осуществить согласно методикам, описанным на Схеме 1, этап D и этап Е.

Синтез липированных с-концевых амидных NTSC-PYY пептидов можно осуществить согласно Схеме 4.

Схема 4

Методика введения липидированных лизиновых остатков в пептидные последовательности, синтезированные на амидной смоле Ринка PAL-PEG PS

Fmoc-смола Ринка (смола PAL-PEG PS; ~0,16-0,2 ммоль/г)

Fmoc-O

Автоматизированный SPPS экв. Ртос-АА(защищенный)-ОН, ДИК / оксима, 90 °C, 4 мин.

ivDde-K(Fmoc)- Z₃₁ [V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH-Q*

1) 5 экв. FMOC-OEG-CO₂H, ДИК/Оксима, микроволновое облучение, 90 °C, 4 мин и/или ^гап А 5 экв. FMOC-Glu-CO₂tBu, ДИК/Оксима, микроволновое облучение, 90 °C, 4 мин

2) 5 экв. Липофильная кислота, ДИК/Оксима, или , HBTU/ДИЭА микроволновое облучение, 75 °C, 15 мин ivDde-Z3₀Z3₁[V₃₁]_qTRZ34Z3₅Y-NH-Q* этап В этап С (вручную)

[2-3% H₂NNH₂ в ДМФ; 90 °C, 3,5 мин] х 3

H2N-Z30Z31 [V₃₁]_qTRZ₃₄Z3sY-NH- Q* (автоматизированная) экв. Fmoc-AA, ДИК/Оксима, микроволновое облучение, 90 °C, 4 мин.

Fmoc-NH-[l]_pZ₄PEZ₇PZ_gEZ₁₁ASPEELNRYYZ₂₂Z₂3LRZ₂₆YLNZ₃₀Z₃₁[V₃₁]_qTRZ₃4Z₃₅Y-NH-Q * Аминокислоты защищены; Z_3i= Cys, roMoCys, Glue, азидо-Lys

А) Методика введения дериватизированных лизиновых остатков в пептидные последовательности, построенные на стандартной амидной смоле Ринка.

Соединенный со смолой С-концевой амидный пептид, усовершенствованный до точки, предшествующей желаемой точке дериватизации, и полученный как описано на Схеме 1, этап А, можно последовательно подвергнуть связыванию с Dde-Lys(Fmoc)-ОН или ivDde-Lys(Fmoc)-ОН и затем Fmoc-Glu-OtBu (все поставляются компанией Novabiochem) в условиях микроволнового облучения (либо вручную, либо на синтезаторе пептидов Liberty Blue) с применением способов связывания с использованием ДИК/оксима, как описано на Схеме 1, этап А. После снятия защиты Fmoc, смолу можно обработать раствором липофильной кислоты [пальмитиновая кислота или α-токоферилоксиуксусная кислота (AcVitE)] (5-10 экв.), ДИК (5-10 экв.) и либо НОВТ, либо Оксима (5-10 экв.) в ДМФ в условиях микроволнового облучения при 90°C в течение 10 мин. Затем реакционную смесь сливают и смолу промывают с помощью ДМФ.

B) Методика снятия защиты с Dole- или ivDde-защищенного лизинильного пептида.

Смолу дериватизированного лизинильного пептида можно обрабатывать раствором 3% гидразина в ДМФ (6 мл/0,1 ммоль смолы) в условиях микроволнового облучения при 90°C в течение 3,5 мин. Реакционную смесь сливают, и данную процедуру можно повторить еще два раза. Реакционную смесь сливают и смолу интенсивно промывают ДМФ, а затем ДХМ.

C) Методика прямого включения остатка Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-ОН.

В случаях, когда пальмитоилированный-γ-Glu-лизинильный остаток должен быть включен в последовательность, Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-ОН (поставляемый компанией Peptides International или ActivePeptide) можно использовать непосредственно в методике, описанной на Схеме 1, этап А.

Соединения настоящего изобретения, с липидированными лизиновыми остатками можно получить

- 44 045724 следуя методикам, представленным на Схеме 1, этапы В, С, D и Е.

Синтез липидированного, восстановленного амида (psi-R35,Y36), С-концевого амида, NTSC-PYY пептидов можно осуществить в соответствии со Схемой 5.

Схема 5

Методика введения дериватизированных лизиновых остатков в последовательности пептидов, синтезированные на предварительно загруженной (psi-R35,Y36) смоле Зибера.

Fmoc-Z_3SY-NH- Смола Зибера (автоматизированная) экв. Fmoc-AA, HBTU/ДИЭА, микроволновое облучение, 50 °C, 15 мин

Alloc-K(Fmoc)-Z3₁[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH-Q этап А

1) 5 экв. FMOC-OEG-CO₂H

HATU/ДИЭА, микроволновое облучение, 50 °C, 15 мин, и/или экв. FMOC-Glu-CO₂tBu, HATU/ДИЭА, микроволновое облучение, 50 °C, 15 мин.

2) 5 экв. Липофильная кислота, HAUT/ДИЭА, микроволновое облучение, 50 °C, 15 мин.

Alloc-Z₃₀Z₃₁[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH- Q* (вручную)

[Pd(PPhJ₄ / Ph₃SiH, ДХМ; к.г., 30 мин] х 2

H₂N-Z₃₀Z₃₁[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH- Q* (автоматизированная) экв. Fmoc-AA, HBTU/ДИЭА, микроволновое облучение, 50 °C, 15 мин

Fmoc-NH-[l]pZ4PEZ₇RZ₉EZ₁₁ASREELNRYYZ₂2Z₂₃LRZ₂₆YLNZ3₀Z₃₁[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH *Аминокислоты защищены; Z₃, = Cys, гомоСуя, азидо-Lys

А) Методика введения дериватизированных лизиновых остатков в последовательности пептидов, построенные на предварительно загруженной (psi-R35,Y36) смоле Зибера.

Частично усовершенствованный восстановленный амидный (psi-R35,Y36) пептид, полученный как описано на Схеме 3, этап А, можно последовательно подвергнуть связыванию с Alloc-Lys(Fmoc)-ОН (доступный у компании Chem-Impex или ААРРТес, LLC), а затем с Fmoc-Glu-OtBu и после пальмитиновой кислотой (каждая при 5 экв., с применением способов связывания либо HATU/ДИЭА, либо HBTU/ДИЭА при 50°C в течение 15 мин. Когда липофильная кислота, подлежащая связыванию, представляет собой стеариновую кислоту, арахидиновую кислоту, октадекандикарбоновую кислоту, моно-трет-бутиловый эфир (доступный у компании AstaTech, Inc.) или 20-(трет-бутокси)-20-оксоикозановую кислоту (доступную у компании Key Organics, Inc.), в качестве растворителя можно применять NMP по причине лучшей растворимости реагентов, и реакцию связывания можно опосредовать с помощью HATU/ДИЭА при 50°C в течение 30 мин. Альтернативно, для арахидиновой кислоты связывание можно осуществить с применением методики, предусматривающей опосредование с помощью ДИК/оксима, описанной на Схеме 1, этап А, но с концентрациями реагентов 5 экв. и ТГФ в качестве реакционного растворителя.

В) Методика снятия защиты Alloc.

Вышеуказанную смолу (0,1 ммоль) промывают бескислородным ДХМ и затем обрабатывают с помощью PhSiH₃ (12,5 экв.) в бескислородном ДХМ (5 мл). Через 2 мин можно добавить раствор Pd(PPh₃)₄(0,25 экв) в бескислородном ДХМ (5 мл) и перемешивать реакционную смесь в течение 0,5 ч в атмосфере азота. Реакционную смесь сливают и смолу промывают 1х с помощью бескислородного ДХМ. Смолу снова обрабатывают с помощью PhSiH₃ (12,5 экв.) и Pd(PPh₃)₄ (0,25 экв.), как описано выше, и она участвует в реакции в течение дополнительных 0,5 ч. Реакционную смесь сливают и смолу последовательно интенсивно промывают ДХМ, ДМФ и ДХМ.

Дальнейшее усовершенствование и завершение пептида можно выполнить как описано выше в настоящем документе, начиная со Схемы 3, этап В.

Синтез С-концевых амидных аналогов NTSC-PYY, в которых МОСТИК представляет собой триазолил, показан на Схеме 6.

- 45 045724

Схема 6

Синтез триазол-связанных аналогов NTSC-PYY: С-концевые амидные пептиды

Fmoc-смола Ринка (смола PAL-PEG PS; -0,16-0,2 ммоль/г)

Fmoc-θ	(Автоматизированный SPPS) 1) 5 экв. Рптос-АА(защищенный)-ОН,
этап А	ДИК/Оксима, 90 °C, 4 мин. 2) 5 экв. 4-Пентиновая кислота, ДИК/Оксима, 90 °C, 4 мин, двойное связывание

[llpZ4PEZ₇PZ9EZ₁₁ASPEELNRY¥Z2₂Z2₃LRZ₂₆YLNK(Dde)Z₃₁TRZ₃₄Z₃₅Y-NH-Q

О (вручную)

1) [2-3% H₂NNH₂ в ДМФ; к.т., 5 мин] х 7 этап В

2) 5 экв. FMOC-Glu-CO₂tBu, ДИК/Оксима, микроволновое облучение, 90 °C, 4 min

3) 5 экв. Липофильная кислота, ДИК/Оксима или HBTU/ДИЭА, микроволновое облучение, 75 °C, 15 _0]pZ4p_EZ7p_Z9EZiiASp_EELNRYY_Z22Z23LRZ26Y_LN^^

ТФУ/ вода/ТИПС/DODT (92,5:2,5:2,5:2,5), микроволновое облучение, 38 °C, 40 мин.

этап С этап D

О

Η 9

ASPEELNRYYZ₂₂Z₂₃LRZ₂₆YLNZ₃₀-N

TRZ₃₄Z₃₅Y-NH_z.(СН₂)₄

1) CuSO₄, ТВТА, вода/EtOH/MeCN

2) натрия аскорбат в воде

Η Η

[l]pZ₄PEZ₇PZ₉EZ₁₁ASPEELNRYYZ₂₂Z23LRZ₂₆YLNZ₃₀-N^A

TRZ34Z35Y-NH2 .(СН)₄

HN n=n * Аминокислоты защищены; Z_3l = к-азидо-Nle;

А) Синтез азидо- и алкинил-содержащих С-концевых амидных пептидов, связанных со смолой.

Связанный со смолой ε-азидонорлейцин-содержащий защищенный пептид, кэпированный на N-конце 4-пентиноевой кислотой, можно получить в соответствии со Схемой 1, этап А. Для включения 4-пентиноевой кислоты можно использовать протокол двойного связывания.

B) Методика введения дериватизированных лизиновых остатков в азидо- и алкинил-содержащие С-концевые амидные пептиды, связанные со смолой.

Fmoc-Lys(Dde)-ОН можно ввести в SPPS в положение последовательности, подлежащее дериватизации, следуя методике, описанной на Схеме 1, этап А. После завершения линейной последовательности (после введения 4-пентоновой кислоты), смолу можно обрабатывать с помощью 3% гидразина в ДМФ (в масштабе 8 мл/0,1 ммоль) в течение 5 мин при к.т., после чего смесь сливают. Данную процедуру можно повторять приблизительно 6х, после чего смолу интенсивно промывают ДМФ, а затем ДХМ. Затем Fmoc-Glu-OtBu последовательно подвергают связыванию на смоле, с которой сняли Dde-защиту, следуя методике, описанной в Примере 6А.

C) Методика отщепления азидо- и алкинил-содержащего пептида от смолы.

После завершения SPPS смолу можно интенсивно промыть с помощью ДМФ и затем ДХМ, и высушить. Затем смолу обрабатывают смесью для расщепления (в масштабе 10 мл/0,1 ммоль), состоящей из ТФУ/вода/ДОДТ/ТИПС (92,5:2,5:2,5:2,5) (смесь для расщепления С) и нагревают в микроволновом реакторе при 38°C в течение 40 мин, затем фильтруют. Смолу промывают с помощью ТФУ и объединенные фильтраты концентрируют под потоком азота до объема приблизительно 2,5 мл и пептид можно осадить путем добавления холодного диэтилового эфира (40 мл). Суспензию пептид/эфир можно центрифугировать и слой эфира декантировать. Осадок пептида можно ресуспендировать в эфире, центрифугировать и декантировать, и этот процесс можно повторить третий раз. Полученный таким образом неочищенный пептид можно высушить под мягким потоком азота.

- 46 045724

D) Методика циклизации пептида (образование триазола).

Следующие растворы можно получить с применением бескислородной воды:

1) CuSO₄ (7 мг в 2 мл воды),

2) 30 мг ТВТА в 5,4 мл EtOH и 0,6 мл MeCN,

3) раствор премикса 1 (943 мкл) и раствор 2 (4,8 мл),

4) натрия аскорбат (30 мг в 3 мл воды).

К раствору неочищенного пептида из этапа С (0,021 ммоль) либо в бескислородной воде, либо в буферном растворе HEPES (рН 7,4) (20 мл) можно добавить раствор 3, затем раствор 4 (2,4 мл) и полученный раствор молочного цвета нагревают до 35-40°C до завершения циклизации, как определяют методом ЖХМС (приблизительно 1-5 ч). Реакционный раствор можно разбавить до 40 мл либо водой (0,1% ТФУ), либо смесью 60% MeCN/вода (0,1% ТФУ), профильтровать и очистить непосредственно препаративной ВЭЖХ с применением множественных инъекций, как описано на Схеме 1, этап Е.

Синтез С-концевых амидных аналогов NTSC-PYY, в которых МОСТИК представляет собой лактам, показан на Схеме 7.

Схема 7

Синтез лактам-мостиковых циклических пептидов

Fmoc-смола Зибера или Ринка (смола PAL-PEG PS; -0,16-0,2 ммоль/г)

Fmoc(Автоматизированный SPPS) (6 экв.) Ртос-АА(защищенный)-ОН

НATU/NMM 25 °C, 10 мин этап С этап В

[l]_pZ₄PEZ₇PZ₉EZii ASPEELNRYYZ₂₂Z₂₃LRZ;

HN

О

НЬЕ ,О

[l]_pZ₄PEZ₇PZ₉EZ₁₁ASPEELNRYYZ₂₂Z₂₃LRZ₂₆YLNZ₃₀E(OAII)[V3₁]_qTRZ3₄Z3₅Y-NHQ*

NH (вручную)

1) [0,2% Pd(PPh₃)₄, фенилсилан (15 экв), ДХМ, 25 °C, 10 мин] х 2

2) [N-гидроксисукцинимид, НАТи/ДИЭА 25 °C, 20 мин] х 2

О ¹

О

1) ТФУ/ТИПС/вода (95%/2,5% 2,5%) 2 ч, 25 °C

2) ДМСО, ТЭА(10 экв.), 20 мин., 25 °C

3) 2% гидразина, ДМФ, 10 мин., 25 °C, х 2

[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y₃₆-NH₂

[l]_pZ₄PEZ₇PZ₉EZ^ AS РЕ ELN RYYZ22Z2₃LRZ_2eYLNZ₃₀

* Аминокислоты защищены; Lys защищен как Dde

А) Синтез С-концевого амидного пептида, связанного со смолой.

Защищенную пептидильную смолу можно синтезировать с применением стратегии Fmoc на синтезаторе пептидов Symphony X компании Protein Technologies. Связывания можно осуществлять либо на амидных смолах Ринка, либо на смолах Зибера с применением HATU и NMM в ДМФ в течение 10 мин при к.т. Аминокислоты Fmoc можно применять в 6-кратном избытке и подвергать двойному связыванию. Для пептидов, содержащих psi-(R35,Y36) модификацию, Fmoc-Arg(Pbf)Ψ[CH₂N(Boc)]Tyr(t-Bu)-ОН подвергали связыванию в тройном избытке с применением HATU и NMM в ДМФ в течение 1 ч при к.т. α-аминогруппу концевого остатка линейной последовательности можно защитить с помощью Boc и γ-концевую группу остатка глутаминовой кислоты, который образует лактамовый мостик, можно защитить с помощью аллила. Лизин(ы) в пептиде можно ортогонально защитить с помощью Dole.

B) Синтез γ-глутамат-N-гидроксисукцинимидного эфира.

После завершения линейной последовательности аллильную защитную группу глутаматной боковой цепи можно удалить с применением Pd(PPh₃)₄ и PhSiH₃ в ДХМ. N-Гидроксисукцинимид (NHS) можно затем синтезировать путем двойного связывания NHS с применением HATU и ДИЭА в течение

- 47 045724 мин при к.т.

C) Методика циклизации лактама.

Пептид можно отщепить от смолы и снять с него общую защиту путем обработки с помощью ТФУ/ТИПС/вода (95:2,5:2,5) в течение 2 ч при к.т., затем осадить в эфире и собрать центрифугированием, и высушить. Неочищенный продукт можно растворить в ДМСО; Добавляют ТЭА (10 экв.) и продолжают циклизацию в течение 1 ч при к.т. Неочищенный продукт можно разбавить водой и очистить с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ. С лизинов, ортогонально защищенных с помощью dde, можно снять защиту путем растворения пептида в 2% гидразин/ДМФ (в концентрации 5 мМ) и перемешивания в течение 1 ч при к.т. Реакционную смесь можно разбавить водой и довести рН до 2 путем добавления 10% ТФУ/вода и раствор можно непосредственно очистить препаративной ОФ-ВЭЖХ, как описано на Схеме 1, этап Е. Синтез липидированных С-концевых амидных аналогов NTSC-PYY, в которых МОСТИК представляет собой лактам, в фазе раствора показан на Схеме 8.

Синтез липидированных С-концевых амидных аналогов NTSC-PYY, в которых МОСТИК представляет собой лактам, в фазе раствора показан на Схеме 8.

Схема 8

Липидизация лактам-мостиковых С-концевых амидных циклических пептидов в фазе раствора показано для Zu лизина

Только один из Z_4> Z₇, Z₉, Zu, Z₂₂, Z₂₃, или Z₃₀ может представлять собой лизин; Показан для Zn=Lys

Пептид, полученный выше на Схеме 7, в котором только один из Z₄, Z₇, Z₉, Zu, Z₂₂, Z₂₃ или Z₃₀ может представлять собой лизин, растворяют в ДМФ (в концентрации 5 мМ), добавляют ТЭА (5 экв.), а затем N-гидроксиэфир защищенного липида (2 экв). Реакцию можно осуществлять в течение ночи при к.т., а затем очистить препаративной ВЭЖХ. Защиту с т-бутиловых эфиров можно снять в ТФУ/ТИПС/вода (95:2,5:2,5) в течение 30 мин при к.т., и реакционную смесь сконцентрировать и очистить препаративной ОФ-ВЭЖХ, как описано на Схеме 1, этап Е.

Общие методики синтеза бромацетилированных циклических тиоэфирных пептидов.

Каждая из Схем 9-11 демонстрирует различные пути получения бромацетилированных циклических тиоэфирных пептидо настоящего изобретения. На Схеме 9 тиоэфирный мостик образуется в результате реакции тиол-содержащей аминокислотной боковой цепи в пептидной последовательности с бромацетильной группой на аминоконце пептида. На Схеме 10 представлен аналогичный подход, подобный Схеме 9, но с дискретным разделителем PEG, введенным между боковой лизиновой цепью и бромацетильной группой. Схема 11 иллюстрирует стратегию синтеза другого класса бромацетилированных циклических тиоэфирных пептидов, в которой мостик образуется в результате реакции тиолового нуклеофила на аминоконце пептида с бромацетильной группой, ковалентно присоединенной к боковой лизиновой цепи в пределах пептидной последовательности.

A. Синтез С-концевого амидного пептида, связанного со смолой.

Защищенный пептид на смоле можно синтезировать на амидных смолах Зибера или амидных смолах Ринга с применением стратегии FMOC. Стандартные FMOC-защищенные аминокислоты (поставляемые компаниями Novabiochem (EMD Millipore), Bachem, Peptides International или Chem-Impex) можно подвергнуть связыванию в 3-6-кратном избытке по отношению к загрузке смолы, с применением

- 48 045724

ДИК/оксима, HBTU/DIPEA или HATU/NMM в качестве агентов связывания при к.т. или повышенной температуре. Для повышения чистоты можно осуществить двойное связывание, и особенно для аминокислоты, подвергнутой связыванию с a-N-алкилированными аминокислотами. Для пептидов, содержащих psi-(R35,Y36) модификацию, Fmoc-Arg(Pbf)Ψ[CH₂N(Boc)]Tyr(t-Bu)-ОН можно подвергнуть связыванию в 3-кратном избытке с применением HATU и NMM в ДМФ в течение 1 ч при к.т.

B. Методика бромацетилирования пептида, связанного со смолой.

Лизин, который необходимо подвергнуть бромацетилированию, можно ортогонально защитить с помощью защитной группы alloc, ivDDE или DDE. После завершения линейной последовательности на смоле, с ортогонально защищенного лизина можно снять защиту (для alloc, Pd(Ph₃)₄ и фенилсилана в ДХМ; для DDE или ivDDE, 2% гидразина в ДМФ) и аминогруппу можно подвергнуть бромацетилированию в различных условиях, таких как 1) путем реакции с большим избытком бромуксусного ангидрида в ДМФ в микроволновом реакторе при 50°C в течение 5 мин, к этому моменту реакцию можно определить как в основном завершенную в соответствии с нингидринным тестом Кайзера; 2) путем реакции с большим избытком бромуксусного ангидрида в ДМФ или ДХМ в присутствии основания, такого как ТЭА или DIPEA, при комнатной температуре; или 3) путем связывания с бромуксусной кислотой с применением ДИК или смеси ДИК/оксима.

C. Методика отщепления пептида от смолы.

После завершения SPPS смолу можно интенсивно промыть с помощью ДМФ и затем ДХМ, и высушить. В случае пептида, связанного с амидной смолой Зибера, высушенную смолу можно обработать раствором 1-2% ТФУ в ДХМ (10 мл) в течение 5-10 мин, затем профильтровать. Эту обработку можно повторить еще несколько раз с применением свежей смеси для каждой обработки. Затем фильтраты объединяют и концентрируют с получением неочищенного защищенного пептида в виде пены желтого цвета. Затем эту пену можно обработать смесью для расщепления ТФУ/фенол/H₂O/ТИПС (88/5/5/2), или ТФУ/вода/ТИПС (95:2,5:2,5), или ТФУ/фенол/H₂O/ТИПС/ДТТ (84/10/2,5/2,5/1) и нагревать в микроволновом реакторе при 38°C в течение 30-45 мин или при комнатной температуре в течение 2-3.5 ч. Неочищенный пептид можно осадить в холодном диэтиловом эфире. Суспензию пептид/эфир можно центрифугировать и слой эфира декантировать. Осадок пептида можно ресуспендировать в эфире, центрифугировать и декантировать, и этот процесс можно повторить третий раз. Полученный таким образом неочищенный пептид можно высушить под мягким потоком азота.

Альтернативно, пептид, связанный с амидной смолой Зибера или амидной смолой Ринка, можно обработать смесью для расщепления как описано выше, без предварительной обработки с помощью 1-2% ТФУ в ДХМ с получением полностью незащищенного пептида.

D. Методика циклизации пептида (образование тиоэфира).

Неочищенный свободный тиол и бромацетамид-содержащий пептид можно растворить в бескислородном MeCN/вода или EtOH/вода в концентрации от 4 до 10 мг/мл с необязательным добавлением ЭДТА. Затем рН раствора пептида можно повысить до приблизительно 7-9 путем добавления основания, такого как NaHCO₃, NaOH, DIPEA или ТЭА, и полученный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 0,25-2,5 ч.

Альтернативно, неочищенный пептид можно очистить с помощью ВЭЖХ, фракции пептида объединить и подщелочить до приблизительно рН 7-9 и перемешивать при комнатной температуре, необязательно в присутствии ЭДТА, в течение 0,25-2,5 ч. После подкисления реакционный раствор можно сконцентрировать при комнатной температуре для удаления органического растворителя, а затем подвергнуть очистке с помощью ВЭЖХ.

Е. Методика очистки пептида.

Реакционную смесь для циклизации можно подкислить с помощью ТФУ, и раствор сконцентрировать для удаления большей части органического растворителя (MeCN или EtOH), и полученный раствор можно затем непосредственно очистить с помощью препаративной ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой. Подвижная фаза состоит из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходных концентраций 0-20% В до итоговых концентраций 40-90% В при продолжительности операции 20-60 мин. УФ-детектирование можно контролировать при 220 и 254 нм. Фракции, содержащие продукт, можно проанализировать с помощью ВЭЖХ на системе ВЭЖХ Agilent 1100 с применением колонки Waters ТЗ Atlantis C18 (4,6x250 мм, 5 мкм). Чистые фракции можно объединить, сконцентрировать для удаления большей части органической фазы, а затем лиофилизировать.

- 49 045724

Схема 9

Синтез бромацетилированных циклических тиоэфирных С-концевых амидных пептидов, в которых тиоэфирный мостик образуется путем реакции тиол-содержащей аминокислотной боковой цепи в пептидной последовательности с бромацетильной группой на амино-конце пептида. В данной схеме защитную группу dde используют для защиты лизиновой боковой цепи и удаляют путем обработки с помощью 2% гидразина в ДМФ.

Fmoc-смола Зибера или Ринка (смола PAL-PEG PS; -0,16-0,2 ммоль/г) (Автоматизированный SPPS) (6 экв.) Ртос-АА(защищенный)-ОН,

HATU/NMM 25 °C, 10 мин

[l]_pZ₄PEZ₇PZ₉EZ₁₁ASPEELNRYYZ₂₂Z₂₃LRZ₂₆YLNZ₃₀-N^V(V₃₁]_qTRZ_MZ₃₅Y-NH-Q*

I н о

NH cr η νη₂

1) 2% гидразина, ДМФ, 10 мин., 25 °C, к 2

2) бромуксусный ангидрид; ДИЭА, ДМФ, 15 мин., 25 °C о

U _Rr(CH₂)₄--N'^^^BrΗ (Trt)S

[I] z₄pez₇pz₉e-n

I Н

NH

ASPEELNRYYZ₂₂Z₂₃LRZ₂₆YLNZ₃₀-N' о ^й (СН₂)_П

О cr η

ΗΝ. Br

О

I 1) ТФУ/ТИПС/вода (95% 2,5%/2,5%) 2 ч, 25 °C

I 2) pH 7-7,5, 30% ACN/вода, 20 мин., 25 °C

[Ι]_ρΖ₄ΡΕΖ₇ΡΖ₉Ε-Ν

I ^н F н

ASPEELNRYYZ₂₂Z₂3LRZ₂₆YLNZ₃₀TI^JL[V3₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH₂о а

JCH₂), S * Аминокислоты защищены; Zn=Lys(dde)

- 50 045724

Схема 10

Синтез бромацетилированных циклических тиоэфирных пептидов, в которых тиоэфирный мостик образуется путем реакции тиол-содержащей аминокислотной боковой цепи в пептидной последовательности с бромацетильной группой на амино-конце пептида, и между бромацетильной группой и боковой лизиновой цепью вводят дискретный разделитель PEG. В данной схеме защитную группу alloc используют для защиты лизиновой боковой цепи и удаляют путем обработки с помощью Pd(PPh₃)₄ и фенилсилана (Trt)S.

(СН₂)_П

Fmoc-(p-Ala)-[l]_pZ₄PEZ₇PZ₉EKASPEELNRYYZ22Z23LRZ2₆YLNZ3o-N>T—(V₃₁]_qTRZ3₄Z3₅Y-NH-Q* I ₍ ^A о (9^H2>4 I 1. Pd(PPh₃)₄, PhSiH₃

2. Fmoc-PEGi2-OH, HATU/DIPEA

NH(Alloc) (Trt)s.

(CH₂)_n

Fmoc-O}-Ala)-[l]pZ4REZ₇RZ₉EpSPEELNRYYZ22Z₂3LRZ2₆YLNZ₃₀-b^jp [V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH-Q (СН₂)₄

HN. JPEG12)—Fmoc

Вг О

1. 20% пиперидина

2. Бромуксусный ангидрид

HN—(P-AlaHI]_pZ₄PEZ₇PZ₉EKASPEELNRYYZ₂₂Z₂₃LRZ₂₆YLNZ₃₀-N^XJ]-[V3₁]_qTRZ34Z3₅Y-NH-Q I H _o (СН₂)₄ hn^Upegi2)— nh

О Вг

Снятие общей защиты

1. 1-2%ТФУвДХМ,к.т, 1 ч

2. TFA-ЩО-ТИПС-фенол (88-5-2-5%)

Вг ,0 ^HSlCH₂)_n

HN—(3-Ala)-[l]pZ₄PEZ₇PZ₉EKASPEELNRYYZ2₂Z₂3LRZ₂₆YLNZ₃₀-^ %HV₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH₂I H o (СН₂)₄

HN^JpEG12PnH

О Вг

NaHCO₃, pH -7,5 (CH₂),

HN— (p-Ala)-[l]_pZ₄PEZ₇PZ₉EKASPEELNRYYZ₂2Z₂3LRZ₂₆YLNZ

I о nh₂ * Аминокислоты защищены (CH₂)₄

HN.

О Вг

- 51 045724

Схема 11

Синтез бромацетилированных циклических тиоэфирных пептидов, в которых тиоэфирный мостик образуется путем реакции тиольной группы на аминоконце пептида с бромацетилированной боковой лизиновой цепью в пептидной последовательности, и между бромацетильной группой и другой боковой лизиновой цепью вводят дискретный разделитель PEG

Dde-HN.

CKx—S-Trt

Η N— (l]_pZ₄PEZ₇PZ₉EKAS PE ELN RYYZ₂₂Z23LRZ₂₆YLNZ3₀I H (CH₂)₄ *

[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH-O

О

0,. S-Trt (СН₂)₄

HN

moc

О

1. 20% пиперидина

2. NH₂NH₂ (2%) в ДМФ

3. Бромуксусный ангидрид

Вт

HN—[l]pZ₄PEZ₇PZ₉E|<ASPEELNRYYZ22Z23LRZ₂₆YLNZ₃₀-N ° _H (CH₂)₄

(СН₂)₄

Вг

[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH-Q о

HN

Снятие общей защиты

1. 1 - 2% ТФУ в ДХМ, к.т., 1 ч

2. ТРА-Н₂О-ТИПС-фенол (88-5-2-5%) о

О

NaHCOj, pH -7,5

[V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH₂ ♦ Аминокислоты защищены

Общие методики синтеза бромацетилированных циклических лактамных пептидов

Циклические лактамные пептиды можно синтезировать в соответствии с методиками, представленными на Схеме 12. Циклический лактамный пептид сначала синтезируют согласно Схеме 7, где только один из Z₄, Z₇, Z₉, Zu, Z₂₂, Z₂₃ или Z₃₀ представляет собой лизин. Затем лизин подвергают бромацетилированию с применением N-гидроксисукцинимидного эфира бромуксусной кислоты (3-7 экв) в смеси 10% ACN/вода при рН 10, к.т., 20 мин. Итоговый бромацетилированный пептид можно очистить с помощью ОФ-ВЭЖХ, как описано для циклических тиоэфирных пептидов.

- 52 045724

Схема 12

Синтез бромацетилированных циклических лактамных С-концевых амидных пептидов

Н II

[IIAPEZ^EZ^ASPEELNRYYZ^^^

бромуксусной кислоты N-гидроксисукцинимидный эфир, 10% ACN/вода, pH 10,20 мин., 25 °C

О

[I^PEZ^E-N^^SPEELNRYYZ^L^

Проиллюстрировано для Zu = Lys, только один из Z₄, Z₇, Z₉, Z_lb Z₂₂, Z₂₃, Z₃₀ может представлять собой Lys

Общие методики синтеза бромацетилированных циклических триазол-связанных пептидов.

Бромацетилированные циклические триазол-связанные пептиды можно синтезировать в соответствии с методикой, показанной на Схеме 13. Линейный защищенный пептид на смоле можно синтезировать способом, сходным с описанным для циклических тиоэфирных пептидов на Схеме 10, за исключением того, что L-азидолизин можно ввести для образования триазола, и N-концевой остаток может представлять собой 4-пентиноевую кислоту. Fmoc можно удалить с помощью 20% пиперидина в ДМФ, а затем подвергнуть реакции с бромуксусным ангидридом. С линейной последовательности можно снять общую защиту (ТФУ/ТИПС вода: 95%/2,5%/2,5%), и неочищенный пептид можно осадить в холодном эфире, собрать центрифугированием и очистить с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ. Очищенный линейный пептид можно подвергнуть циклизации в присутствии CUSO4/TBTA и NaASrb в буферном растворе (HEPES, MOPS и т.д.) с получением циклических триазол-связанных пептидов, которые можно очистить с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ, как описано на Схеме 1, этап Е.

Альтернативный класс циклических триазол-связанных пептидов может быть синтезирован специалистами в данной области техники начиная с линейной последовательности, в которой N-концевой остаток представляет собой азидокарбоновую кислоту (например, 5-азидопентановая кислота) и остаток в положении 30 или 31 представляет собой алкинильную аминокислоту (например, 2-амино-7-октиновая кислота), путем, сходным описанному выше.

- 53 045724

Схема 13

Синтез бромацетилированных циклических триазол-связанных С-концевых амидных пептидов

О %—[i]pZ₄PEZ₇PZ₉EKASPEELNRYYZ₂₂Z₂₃LRZ₂₆YLNZ3₀(Lys(N₃))[V₃₁]_qTRZ34Z35Y-NH-Q (СН₂)₄

HN ^JPEG12j—Fmoc

О

1.20% пиперидина

2. Бромуксусный ангидрид

N—[l]pZ4PEZ₇PZ₉EKASPEELNRY¥Z₂₂Z₂3LRZ₂₆YLNZ₃₀(Lys(N₃))[V3₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH-O ^н I „ (СН₂)₄

HN^ApEG12Pn-4

Снятие общей защиты

1.1- 2% ТФУ в ДХМ, к.т., 2 ч

2. ТФУ-Н₂О-ТИПС(95-2,5-2,5%)

N—[l]pZ₄PEZ₇PZ₉EKASPEELNRYYZ₂₂Z₂₃LRZ₂₆YLNZ3₀(Lys(N₃))[V₃₁]_qTRZ3₄Z3₅Y-NH₂

Н (СН₂)₄

HN^JPEG12>-N· О

Вг

CuSO₄/TBTA, NaAsrb, HEPES

N=N

HN %СН₂)₂ (СН₂)₃

[l]pZ₄PEZ₇PZ₉EKASPEELNRYYZ₂₂Z₂₃LRZ₂₆YLNZ3o N [V₃₁l_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH ₂

I _ ^н О (СН₂)₄

HN. J PEG1 * Аминокислоты защищены

Анализ и характеризация пептида.

Очищенные пептиды анализировали с помощью ЖХМС на системе Hewlett Packard серии 1100 MSD, оснащенной ВЭЖХ серии HP 1100, с применением колонки Waters Atlantis T3 С18 (4,6x250 мм, 300 А, 5 мкм). В зависимости от полярной/неполярной природы пептида применяли один из трех градиентов (буферы A и В, как описано выше) со скоростью потока 1 мл/мин и температурой колонки 35°C: Способ 1) 15-60% В в течение 22 мин; Способ 2) 30-60% В в течение 22 мин; Способ 3) 40-90% В в течение 22 мин. Анализ масс для каждого пептида выполнили с применением анализа электрораспыления (ES-API, сканирование положительных ионов). Во всех случаях наблюдали многозарядные частицы с характеристическими, наиболее четко наблюдаемыми ионами 1/3[М+3]+ и 1/4[М+4]+. Все продукты давали ожидаемые многозарядные ионы в допустимых пределах. Результаты масс-спектрального анализа пептидов и наблюдаемые значения времени удерживания ЖХ (КТ) показаны в табл. 1.

- 54 045724

Аналитические данные для соединений NTSC-PYY

Таблица 1

Seq. I.D. №	Mol. Формула	ММ	1/3[М+3]⁺(Рассчита иное)	1/3⁺[М+3]⁺(Измерены ое)	1/4[М+4]⁺(Рассчита иное)	1/4[М+4]⁺(Измерены ое)	Мет. ВЭЖХ.	ВУ (мин. )
1	C21sH345BrN5gOg7S	4898,41	1633,80	1633,8	1225,60	1225,4	1	12,48
2	C187H281N53O55S	4183,66	1395,55	1395,4	1046,92	1046,6	1	11,7
3	CiegHaeiNggOgg	4184,63	1395,88	1395,6	1047,16	1047,0	1	11,1
4	C210H325N53O57S	4564,27	1522,42	1522,2	1142,07	1141,9	2	17,0
5	C-225B345N55O59S	4796,59	1599,86	1599,6	1200,15	1199,9	3	15, 8
6	C224H348N58O59	4797,56	1600,19	1600,1	1200,39	1200,3	3	15,7
7	C212H327N55O59S	4622,31	1541,77	1541,8	1156,58	1156,7	2	15, 8
8	C208H319N55O59S	4566,20	1523,07	1522,8	1142,55	1142,4	2	14,7
9	C187H283N53O54S	4169,68	1390,89	1390,6	1043,42	1043,3	1	11,3
10	C₂₂₃H₃₃₉N₅₅O₆₁S	4798,52	1600,51	1600,4	1200,63	1200,6	3	13,4
11	C₂23H341N55O₆₀S	4784,54	1595,85	1595,7	1197,14	1197,1	3	12,8
12	C188H283N53O55S	4197,69	1400,23	1400,2	1050,42	1050,3	1	11, 9
13	C208H321N55O58S	4552,22	1518,41	1518,2	1139,06	1139,0	2	13, 8
14	C209H321N55O59S	4580,23	1527,74	1527,8	1146,06	1145,9	2	15,2
15	C199H309N55O59S	4448,02	1483,67	1483,7	1113,01	1112,9	2	14,1
16	C202H308N54O58S	4453,04	1485,35	1485,1	1114,26	1114,2	2	13, 9
17	C205H312N54O59S	4509,10	1504,03	1503,9	1128,28	1128,2	2	16, 6
18	C₂₀₇H₃₁₄N₅₄O₆₁S	4567,14	1523,38	1523,2	1142,79	1142,7	2	16, 4
19	C₂₀₈H₃₁₉N550₅₉S	4566,20	1523,07	1523,1	1142,55	1142,5	2	15, 0
20	c₂o₈h₃₁₉n₅50₅₉s	4566,20	1523,07	1522,8	1142,55	1142,4	2	15,1
21	c₂02H₃₁0N5₂o₅₉s	4443,04	1482,01	1481,9	1111,76	1111,6	2	17,2
22	С₂0₄Н₃1₂И₅₂О₆₁3	4501,08	1501,36	1501,2	1126,27	1126,2	2	16, 8
23	С222Нз45М₅₇О₆₆3	4900,57	1634,52	1634,4	1226,14	1225,9	2	16,7
24	C₂₂₄H₃₄₉N₅₇OggS	4928,62	1643,87	1643,4	1233,16	1233,0	2	18,4
25	C210H325N55O58S	4580,27	1527,76	1527,7	1146,07	1146,1	2	17,0
26	C212H329N55O58S	4608,32	1537,11	1537,1	1153,08	1153,0	2	19,7
27	C₂₁₇H₃₃₈N₅₆O₆₃S	4771,45	1591,48	1591,3	1193,86	1193,8	2	12,0
28	C202H310N54O57S	4439,06	1480,69	1480,6	1110,77	1110,8	2	13,3
29	C199H311N55O58S	4434,04	1479,01	1478,9	1109,51	1109,3	2	13,7
30	C199H311N55O58S	4434,04	1479,01	1479,0	1109,51	1109,3	2	14,2
31	C₂₂₂H₃₄₇N₅₇O₆₄S	4870,58	1624,53	1624,6	1218,65	1218,6	2	18,5

- 55 045724

32	C205H314N54O58S	4495,12	1499,37	1499,3	1124,78	1124,8	2	15, 9
33	C209H323N55O58S	4566,24	1523,08	1522,9	1142,56	1142,4	2	14,6
34	C201H315N55O58S	4462,09	1488,36	1488,0	1116,52	1116,4	2	13, 9
35	C209H323N55O58S	4566,24	1523,08	1522,8	1142,56	1142,5	2	14,4
36	C200H313N55O58S	4448,07	1483,69	1483,5	1113,02	1112,9	2	13, 8
37	C205H322N56O59S	4547,20	1516,73	1516,6	1137,80	1137,7	2	14,2
38	C206H324N56O59S	4561,22	1521,41	1521,7	1141,31	1141,3	2	13,7
39	C209H322N54O59S	4567,23	1523,41	1523,2	1142,81	1142,7	3	10,3
40	С21эНз4бМбоОб4	4843,52	1615,50	1615,4	1211,9	1211,8	2	15,1
41	C207H324N58O58	4553,20	1518,70	1518,4	1139,3	1139,3	2	13, 6
42	C221H348N₆₀O₆₍5	4901,56	1634,90	1634,8	1226,4	1226,4	2	11, 0
43	C-220H343N57O64S	4842,53	1615,18	1615,0	1211,63	1211,5	2	15,5
44	C224H351N₅₇O₆4S	4898,64	1633,88	1633,9	1225,66	1225,6	2	12,7
45	C261H428N₅₆O81S	5678,63	1893,88	1893,4	1420,66	1420,6	2	19,4
46	C205H322N56O59S	4547,20	1516,73	1516,6	1137,80	1137,6	2	13,7
47	C225H351N₅₇O₆₆S	4942,65	1648,55	1648,2	1236,66	1236,6	2	11,7
48	C225H351N₅₇O₆₆S	4942,65	1648,55	1648,6	1236,66	1236,6	2	11, 8
49	C208H321N55O59S	4568,22	1523,74	1523,6	1143,06	1142,9	1	15,2
50	C225H351N5₇O₆₅S	4926,65	1643,22	1643,2	1232,66	1232,5	2	11, 6
51	C205H314N54O59S	4511,12	1504,71	1504,6	1128,78	1128,6	2	15, 6
52	C237H380N56O69S	5150,00	1717,67	1717,5	1288,50	1288,4	2	18,6
53	C234H371N59O₆₈S	5130,92	1711,31	1710,9	1283,73	1283,6	2	16, 6
54	C222H349N₅₇O₆₂S	4840,60	1614,53	1614,3	1211,15	1211,1	2	16, 6
55	C223H349N₅₇O₆₃S	4868,61	1623,87	1623,6	1218,15	1218,0	2	14,9
56	C206H300CIN55O58S	4542,48	1515,16	1515,0	1136,62	1136,4	1	13, 6
57	C207H301CI2N55O59 s	4606,95	1536,65	1536,3	1152,74	1152,5	1	14,5
58	C209H314FN55O58S	4576,17	1526,39	1526,2	1145,04	1144,9	2	10, 9
59	С22зНз49М₅₇О₆43	4884,61	1629,20	1629,0	1222,15	1221,9	2	15,5
60	С22зНз49М₅₇О₆43	4884,61	1629,20	1629,1	1222,15	1222,1	2	15,4
61	C210H314F3N55O58S	4626,18	1543,06	1542,7	1157,55	1157,4	2	12,7
62	C204H310F3N55O58S	4550,08	1517,69	1517,6	1138,52	1138,3	2	9,1
63	C207H316F3N55O58S	4592,16	1531,72	1531,7	1149,04	1149,0	2	12,1
64	C210H325N55O59S	4596,27	1533,09	1532,7	1150,07	1150,0	2	11, 8
65	C208H312D9N55O58S	4561,15	1521,38	1521,3	1141,29	1141,2	2	14,1
66	СгиНзхзГбЫззОззЗ	4694,17	1565,72	1565,4	1174,54	1174,6	2	14,1
67	СгиНзхзЕбЫззОззЗ	4694,17	1565,72	1565,6	1174,54	1174,4	2	14,2
68	C219H348N58O65S	4865,57	1622,86	1622,7	1217,39	1217,3	1	17,3
69	C181H280N54O54	4076,53	1359,84	1359,7	1020,13	1020	1	11,4
70	C180H278N54O54	4062,50	1355,17	1355	1016,63	1016,7	1	12,2

- 56 045724

71	C181H278N54O55	4090,51	1364,50	1364,4	1023,63	1023,5	1	12,8
72	C215H339N57O66	4778,38	1593,79	1593,4	1195,60	1195,6	1	15,8
73	C₂03H3₂₁BrN₅₆O₆₁S	4634,09	1545,70	1545,4	1159,52	1159,6	1	12,12
74	C188H292BrN5₅O₅4S	4298,69	1433,90	1433,9	1075,67	1075,6	1	11,96
75	C₂₁₁H338BrN₅₅O_6SS	4813,30	1605,43	1605,5	1204,32	1204,4	1	12,27
76	C₂4₉H4₂₂Bl?N 57O84S	5660,31	1887,77	1887,4	1416,08	1416,0	1	13,15
77	C₂₁4H34 3BrN₅₆O₆7S	4884,38	1629,13	1629,1	1222,09	1222,1	1	12,24
78	С21бНз4 7ВгМ5₆О₆73	4912,44	1638,48	1638,4	1229,11	1229,1	1	12,49
79	C₂lgH34₇BrN₅gOg₇S	4912,44	1638,48	1638,1	1229,11	1228,9	1	12,58
80	С₂₂₀Нз4 4ВгН₅₉О₆₇3	4999,48	1667,49	1667,3	1250,87	1250,8	1	12,55
81	C₂₂₀H344BrN₅₉O₆₇S	4999,48	1667,49	1667,4	1250,87	1250,7	1	12,43
82	C₂iiH33₈BrN₅5O₆₈S	4845,30	1616,10	1616,0	1212,32	1212,4	1	12,44
83	C217H₃4₇BrN5₈O₆₆	4904,39	1635,80	1635,9	1227,10	1227,0	1	12,55
84	С₂25Нз54ВгЦ5₉ОббЗ	5053,61	1685,54	1685,4	1264,40	1264,3	1	12,80
85	С21бНз45ВгЦ₅₆О₆₈3	4926,42	1643,14	1642,9	1232,61	1232,6	1	11,72
86	С21бНз4 5ВгЦ5бОб₉3	4942,42	1648,47	1648,3	1236,61	1236,5	1	11,92
87	C₂₁gH3₄₅BrN₅gOg₉S	4942,42	1648,47	1648,3	1236,61	1236,4	1	11,82
88	C₂₁₂H₃3₉BrN₅₆O₆₇S	4856,33	1619,78	1619,5	1215,08	1214,9	1	12,43
89	C₂i3H₃3₉BrN₅₆O₆gS	4884,32	1629,11	1629,0	1222,08	1222,0	1	НО
90	С₂14Нз41ВгЦ₅₆О₆₈3	4898,32	1633,77	1633,7	1225,58	1225,5	1	НО
91	C₂44H34₂BrN5gOggS	4898,32	1633,77	1633,3	1225,58	1225,5	1	НО
92	C₂₁gH345BrN₅gOggS	4926,42	1643,14	1642,7	1232,61	1232,6	1	НО
93	С₂1зНз41ВгЦ5₆О₆₇3	4870,35	1624,3	1624,1	1218,5	1218,4	1	12,67
94	С₂1зНз41ВгЦ₅₆О₆₇3	4870,35	1624,3	1624,3	1218,5	1218,4	1	12,42
95	C₁₈₂H₂₇₉BrN54O55	4183,45	1395,5	1395,3	1046,9	1046,7	1	13,41
96	С₂зэНз₉зВгЦ_5бО₇₉3	5427,04	1810,0	1809,7	1357,8	1357,8	1	12,44
97	С₂1₄Нз4зВгЦ₅бОб₇3	4884,4	1629,1	1628,8	1222,1	1221,9	1	11,74
98	С18бН28бВгЦ₅5О₅₅3	4284,6	1429,2	1428,9	1072,1	1071,9	1	12,28
99	C187H₂8 8BrN55O₅₅S	4298,6	1433,9	1433,6	1075,6	1075,6	1	12,03
100	С18бН₂8 8ВгЦ55О5₄3	4270,6	1424,5	1424,3	1068,6	1068,6	1	12,59

Промежуточные соединения.

Предполагается, что следующие примеры и варианты осуществления, описанные в настоящем документе, приведены только в иллюстративных целях и что различные изменения и модификации в них будут понятны специалистам в данной области техники, и подлежат включению в объем и сферу действия данной заявки и в объем прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем документе, настоящим включены посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

Промежуточное соединение 1.

Синтез α-токоферилуксусной кислоты (AcVitE) (8).

А) трет-Бутил-а-токоферилоксиацетат (7):

Смесь а-токоферола (1,14 г, 2,65 ммоль), трет-бутилбромацетата (470 мкл, 3,18 ммоль) и K₂CO₃(1,1 г, 7,94 ммоль) в ацетоне (10 мл) перемешивали при к.т. в течение 2-3 дней. Затем смесь фильтровали через маленький тампон K₂CO₃ и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, элюируя с помощью EtOAc/смесь гептанов (0-5%) с получением трет-бутил-а-токоферилоксиацетата (7) в виде бесцветного масла.

¹Н ЯМР (CDCl3) δ 4,17 (s, 2Н), 2,56 (t, J=6,57 Гц, 2Н), 2,18 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 1,65-1,86 (m, 2H), 1,52 (s, 9H), 0,98-1,46 (т, 22Н), 0,80-0,90 (m, 14Н).

В) α-Токоферилоксиуксусная кислота (AcVitE) (8)

- 57 045724

К раствору трет-бутил-а-токоферилоксиацетата (7) (1,4 г, 2,57 ммоль) в ДХМ (12 мл) добавляли ТФУ (6 мл) и полученный раствор перемешивали при к.т. Через 2 ч раствор концентрировали при пониженном давлении и полученное темное масло очищали с помощью хроматографии на силикагеле, элюируя с помощью МеОН/ДХМ (0-2,5%, содержащего 0,5% НОАс), с получением а-токофероксиуксусной кислоты (AcVitE) (8) в виде сиропа янтарного цвета, который медленно затвердевал в вакууме.

1Н ЯМР (CDClj) δ 4,34 (s, 2Н), 2,57 (t, J=6,82 Гц, 2Н), 2,16 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 1,79 (qt, J=6,76, 13,01 Гц, 2Н), 1,48-1,59 (m, 3H), 1,18-1,48 (m, 12H), 1,01-1,17 (m, 7H), 0,77-0,93 (m, 14H).

ЖХМС: масса, рассчитанная для С₃₁Н₅2О₄: 488,75; измеренная: 489,5 [М+Н]+.

Промежуточное соединение 2.

1. Синтез (S)-22-(трет-бутоксикарбонил)-43,43-диметил-10,19,24,41 -тетраоксо-3,6,12,15,42- пентаокса-9,18,23-триазатетраконтан-1-карбоновой кислоты (16).

А) Бензил-2,2-диметил-4-оксо-3,8,11-триокса-5-азатридекан-13-оат (9)

В круглодонную колбу объемом 100 мл помещали 2,2-диметил-4-оксо-3,8,11-триокса-5азатридекан-13-карбоновую кислоту (18 г, 68,366 ммоль), бензилбромид (23,386 г, 136,732 ммоль), калия карбонат (28,346 г, 205,099 ммоль) и ДМФ (200 мл). Полученный раствор перемешивали при к.т. в течение ночи и экстрагировали с помощью EtOAc (500 мл). Смесь промывали водой (300 мл) и высококонцентрированным солевым раствором (2x150 мл). Органическую фазу выпаривали и очищали с помощью колонки с силикагелем (EtOAc/пропиловый эфир, 1:5) с получением бензил-2,2-диметил-4-оксо-3,8,11триокса-5-азатридекан-13-оата в виде бесцветного масла (9).

ЖХМС: масса, рассчитанная для C₁₈H₂₇NO₆: 353,2, измеренная: 354,05 [М+Н]+.

В) Бензил-2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)ацетат (10) о н9

Й η м ТФУ Π ПMU

ВпСГ^ ----- ВпСГ^

9Ю

В круглодонную колбу объемом 500 мл помещали бензил-2,2-диметил-4-оксо-3,8,11-триокса-5азатридекан-13-оат (12 г, 33,955 ммоль), ТФУ (19,358 г, 169,774 ммоль) и ДХМ (150 мл). Полученный раствор перемешивали при к.т. в течение ночи. Смесь выпаривали и сушили с получением бензил-2-(2(2-аминоэтокси)этокси)ацетата в виде масла светло-желтого цвета (10).

ЖХМС: масса, рассчитанная для C₁₃H₁₉NO₄: 253,13, измеренная: 254,05 [М+Н]+.

С) . Бензил-2,2-диметил-4,13-диоксо-3,8,11,17,20-пентаокса-5,14-диазадокозан-22-оат (11)

В круглодонную колбу объемом 250 мл помещали 2,2-диметил-4-оксо-3,8,11-триокса-5азатридекан-13-карбоновую кислоту (8,835 г, 33,558 ммоль), бензил-2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)ацетат (8,5 г, 33,558 ммоль), HATU (15,312 г, 40,270 ммоль), ДИЭА (8,674 г, 67,116 ммоль) и ДМФ (100 мл). Полученный раствор перемешивали при к.т. в течение ночи и экстрагировали с помощью EtOAc (500 мл). Органическую фазу промывали водой (200 мл) и высококонцентрированным солевым раствором (2x100 мл). Органическую фазу выпаривали и очищали с помощью колонки с силикагелем (ДХМ/МеОН, 10:1) с получением бензил-2,2-диметил-4,13-диоксо-3,8,11,17,20-пентаокса-5,14диазадокозан-22-оата в виде масла светло-желтого цвета (11).

ЖХМС: масса, рассчитанная для C₂₄H₃₈N₂O₉: 498,26, измеренная: 499,50 [М+Н]+.

D) Бензил-17-амино-10-оксо-3,6,12,15 -тетраокса-9-азагептадекан-1 -оат (12)

О U

ВпО^⁰'^'^^

Η н ДХМ:

В круглодонную колбу объемом 500 мл помещали бензил-2,2-диметил-4,13-диоксо-3,8,11,17,20пентаокса-5,14-диазадокозан-22-оат (15 г, 30,086 ммоль), ТФУ (17,153 г, 150,431 ммоль) и ДХМ (200 мл). Полученный раствор перемешивали при к.т. в течение ночи. Смесь выпаривали и сушили с получением бензил-17-амино-10-оксо-3,6,12,15-тетраокса-9-азагептадекан-1-оата в виде масла светло-желтого цвета (12).

ЖХМС: масса, рассчитанная для C₁₉H₃₀N₂O₇: 398,21, измеренная: 399,2 [М+Н]+.

Е) (S)-1 -Бензил-23-трет-бутил-22-(((9H-флуорен-9-ил)метоkси)kарбониламино)-10,19-диоксо-

- 58 045724

3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазатрикозан-1,23-диоат (13)

В круглодонную колбу объемом 250 мл помещали бензил-17-амино-10-оксо-3,6,12,15-тетраокса-9азагептадекан-1-оат (11 г, 27,607 ммоль), (S)-4-(((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-3-третбутокси-3-оксопентановую кислоту (11,746 г, 27,607 ммоль), HATU (12,596 г, 33,128 ммоль), ДИЭА (7,136 г, 55,214 ммоль) и ДМФ (100 мл). Полученный раствор перемешивали при к.т. в течение ночи и экстрагировали с помощью EtOAc (500 мл). Органический слой промывали водой (2x200 мл) и высококонцентрированным солевым раствором (200 мл). Органическую фазу выпаривали и очищали с помощью хроматографии на силикагеле (ДХМ/МеОН, 10:1) с получением ^)-1-бензил-23-трет-бутил-22(((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-10,19-диоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазатрикозан- 1,23диоата в виде масла светло-желтого цвета (13).

ЖХМС: масса, рассчитанная для C₄₃H₅₅N₃O₁₂: 805,38, измеренная: 806,80 [М+Н]+.

F) (S)-1 -Бензил-23-трет-бутил-22-амино-10,19-диоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазатрикозан-1,23диоат (14)

В круглодонную колбу объемом 250 мл помещали (S)-1-бензил-23-трет-бутил-22-(((9H-флуорен-9ил)метокси)карбониламино)-10,19-диоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазатрикозан-1,23-диоат (10 г, 12,408 ммоль) и ДБУ в ДХМ (3%, 100 мл). Полученный раствор перемешивали при к.т. в течение ночи, затем промывали водой (2x200 мл). Органическую фазу концентрировали. Остаток растворяли водой (200 мл) и экстрагировали эфиром (2x200 мл). Водную фазу экстрагировали ДХМ (200 мл). Органическую фазу выпаривали и сушили с получением (S)-1-бензил-23-трет-бутил-22-амино-10,19-диоксо3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазатрикозан-1,23-диоата в виде масла светло-желтого цвета (14).

ЖХМС: масса, рассчитанная для C₂₈H₄₅N₃O₁₀: 583,31, измеренная: 584,65 [М+Н]+.

G) (S)-1 -Бензил-21,39-ди-трет-бутил-9,18,23-триоксо-2,5,11,14-тетраокса-8,17,22-триазанонантриаконтан-1,21,39-трикарбоксилат (15) ^ΒηΟγ-σ ο

Η Ο^^Ν

о ⁰ HO₂C(CH₂)_ieCO₂-tBu

HATU

ΝΗ₂ -------ДИЭА, ДМФ

В круглодонную колбу объемом 50 мл помещали (S)-1-бензил-23-трет-бутил-22-амино-10,19диоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазатрикозан-1,23-диоат (1,575 г, 2,699 ммоль), 18-трет-бутокси-18оксооатадекановую кислоту (1 г, 2,699 ммоль), HATU (1,231 г, 3,239 ммоль), ДИЭА (697,654 мг, 5,398 ммоль, 2 экв) и ДМФ (15 мл). Полученный раствор перемешивали при к.т. в течение ночи и разбавляли EtOAc (200 мл). Органическую фазу промывали водой (2x100 мл) и высококонцентрированным солевым раствором (100 мл). Органическую фазу концентрировали и очищали с помощью хроматографии на силикагеле (ДХМ/МеОН, 10:1) с получением (S)-1-бензил-21,39-ди-трет-бутил-9,18,23-триоксо2,5,11,14-тетраокса-8,17,22-триазанонатриаконтан-1,21,39-трикарбоксилата в виде масла светло-желтого цвета (15).

ЖХМС: масса, рассчитанная для C₅₀H₈₅N₃O₁₃: 935,61, измеренная: 936,6 [М+Н]+.

Н) (S)-22-(трет-Бутоксикарбонил)-43,43-диметил-10,19,24,41-тетраоксо-3,6,12,15,42-пентаокса- 59 045724

9,18,23-триазатетратетраконтан-1-овая кислота (16)

В круглодонную колбу объемом 100 мл помещали (S)-1-бензил-21,39-ди-трет-бутил-9,18,23триоксо-2,5,11,14-тетраокса-8,17,22-триазанонантриаконтан-1,21,39-трикарбоксилат (2,5 г, 3,041 ммоль), Pd/C (10 мас.%, 500 мг) и МеОН (50 мл). Полученный раствор перемешивали при к.т. в течение ночи в атмосфере H₂ (3,5 атм). Остаток фильтровали, концентрировали и очищали с помощью обращеннофазовой хроматографии на силикагеле (NH₄HCO₃/H₂O, 0,05%) с получением (S)-22-(третбутоксикарбонил)-43,43-диметил-10,19,24,41 -тетраоксо-3,6,12,15,42-пентаокса-9,18,23-триазатетратетраконтан-1-овой кислоты в виде полутвердого вещества светло-желтого цвета (16).

ЖХМС: масса, рассчитанная для C₄₃H₇₉N₃O₁₃: 845,56, измеренная: 846,55 [М+Н]+.

Ή ЯМР (300 МГц, CD3OD) δ: 4,24-4,29 (m, 1H), 4,07 (s, 2H), 4,03 (s, 2H), 3,69-3,72 (m, 8Н), 3,57-3,67 (m, 4Н), 3,45-3,49 (m, 2Н), 3,34-3,42 (m, 2Н), 2,23-2,35 (m, 6Н), 2,12-2,21 (m, 1Н), 1,93-1,96 (m, 1Н), 1,521,70 (m, 4Н), 1,45-1,51 (m, 18Н), 1,33 (s, 24H).

Примеры

Соединения настоящего изобретения можно получить с помощью способов, известных специалистам в данной области. Подразумевается, что следующие примеры представляют собой только репрезентативные примеры настоящего изобретения и ни в коей мере не ограничивают изобретение.

Пример 1. Синтез циклического аналога PYY SEQ ID NO: 1.

Схема 14

Синтез Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH

Fmoc'

2) NaBH₃CN,

FmocHN

Pd(PPh₃)₄, PhNHMe

Fmoc

H

1) NH₂-Tyr(tBu)-Oall HOAc, THF-MeOH

- 60 045724

1. Синтез Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH.

А. Синтез H2N-Tyr(tBu)-OAll.

К охлажденному на ледяной бане раствору Fmoc-Tpyr(tBu)-O (69 г, 150,15 ммоль) и K2CO3 (62 г, 445,36 ммоль) в ДМФ (500 мл) добавляли аллилбромид (72 г, 595,16 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 3 ч. Затем добавляли смесь лед/вода (1 л) и смесь экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические экстракты осушили (Na₂SO₄) и концентрировали при пониженном давлении с получением Fmoc-Tyr(tBu)-OAll в виде масла желтого цвета. К охлажденному на ледяной бане раствору Fmoc-Tyr(tBu)-OAll (70 г, 140,1 ммоль) в ДМФ (600 мл) по каплям добавляли пиперидин (150 мл) в течение 20 мин. Через 3 ч реакционный раствор приливали к смеси вода/лед (1 л) и экстрагировали с помощью EtOAc (2x2 л). Объединенные органические экстракты сушили над Na₂SO₄ и концентрировали под пониженным давлением. Полученный таким образом остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, элюируя с помощью EtOAc/петролейный эфир (10:1) с получением 34 г H₂N-Tyr(tBu)-OAll в виде масла желтого цвета.

B. Синтез Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe (2).

К охлажденной на ледяной бане смеси Fmoc-Arg(Pbf)-ОН (1) (64,8 г, 99,88 ммоль), N,О-диметилгидроксиламина гидрохлорида (20 г, 206,2 ммоль) и HATU (57 г, 149,91 ммоль) в ДХМ (500 мл) по каплям добавляли ДИЭА (52 г, 402,2 ммоль) в течение 10 мин и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем реакционную смесь приливали к смеси вода/лед (1 л) и экстрагировали с помощью (1 л). Органические экстракты осушили (Na₂SO₄) и концентрировали при пониженном давлении с получением 70 г неочищенного Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe (2) в виде твердого вещества желтого цвета, который затем применяли без дополнительной очистки.

C. Синтез Fmoc-Arg(Pbf)-CHO (3).

К охлажденному (-78°C) раствору ЛАГ в ТГФ (1 М, 107 мл, 0,107 ммоль) в инертной атмосфере азота по каплям добавляли через полую иглу охлажденный (-50°C) раствор Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe (2) (50 г, 72,3 ммоль) в ТГФ (100 мл) в течение 1 ч. После перемешивания при -78°C в течение 5 ч смесь приливали к 1н. раствору HCl (300 мл) и дополнительно добавляли 1н. HCl, по необходимости, для доведения рН до 4, затем экстрагировали с помощью EtOAc (2x2 л). Объединенный органические экстракты сушили (Na2SO4) и концентрировали при пониженном давлении с получением 45 г неочищенного Fmoc-Arg(Pbf)-CHO (3) в виде твердого вещества желтого цвета, который применяли без дополнительной очистки.

D. Синтез Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)]-OAll (4).

К охлажденному на ледяной бане раствору Fmoc-Arg(Pbf)-CHO (3) из этапа С (45 г, 71,12 ммоль) и H₂N-Tyr(tBu)-OAll из этапа А (32 г, 115,37 ммоль) в ТГФ (200 мл), МеОН (200 мл) и НОАс (15 мл) по порциям добавляли натрия цианоборгидрид (18,0 г, 286,4 ммоль) в течение 30 мин и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию гасили добавлением насыщенного водного раствора NaHCO₃ (500 мл) и смесь экстрагировали с помощью EtOAc (2x2 л). Объединенные органические экстракты сушили над Na2SO4 и концентрировали под пониженным давлением. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, элюируя с помощью смеси EtOAc/петролейный эфир (10:1) с получением 40 г Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)]-OAll (4) в виде твердого вещества желтого цвета.

E. Синтез Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll (5).

К раствору Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OAll] (4) (53 г, 59,28 ммоль) в MeCN (240 мл) добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (20 г, 91,3 ммоль) и полученный раствор перемешивали при 50°C в течение ночи. Затем смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, элюируя смесью EtOAc/петролейный эфир (1:1) с получением 32 г Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll (5) в виде твердого вещества желтого цвета.

F. Синтез Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-ОН (6).

К охлажденному (-30°C) раствору Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll (5) (32 г, 32 ммоль) в ДХМ (600 мл) в инертной атмосфере азота добавляли Pd(PPh₃)₄ (3,0 г, 4,33 ммоль) с последующим добавлением по каплям N-метиланилина (10 г, 93 ммоль) в течение 30 мин. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, элюируя смесью EtOAc/петролейный эфир (1:1) с получением 26,8 г Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-ОН (6) в виде твердого вещества желтого цвета.

1Н ЯМР (300 МГц, CD3OD) δ 7,75-7,77 (2Н, m), 7,59-7,60 (2Н, m), 7,32-7,33 (4Н, m), 7,09-7,11 (2Н, m), 6,87-7,00 (2Н, m), 4,27-4,50 (3H, m), 3,30-3,50 (4Н, m), 3,02-3,23 (3H, m), 2,75-2,98 (3H, m), 2,57 (3H, s), 2,48 (3H, s), 2,00 (3H, s), 1,31-1,41 (28Н, m).

ЖХМС (ЭС, m/z): масса, рассчитанная для C₅₂H₆₇N₅O₁₀S: 953,46, измеренная: 954,55 [М+Н]+.

2. Загрузка дипептида Fmoc-psi-(R35-N(Boc)-Y36) на смолу Зибера.

В оплавленном микроволновом реакционном сосуде (поставляется компанией СЕМ Corporation), смолу Зибера NovaSyn TG (поставляется компанией Novabiochem) (0,2 ммоль) обрабатывали с помощью 20% пиперидина в ДМФ (10 мл) и нагревали при 50°C в течение 2,5 мин в микроволновом реакторе

- 61 045724

СЕМ. Реакционную смесь сливали и смолу промывали с помощью ДМФ и снова обрабатывали с помощью 20% пиперидина в ДМФ при 50°C в течение 5 мин в микроволновом реакторе СЕМ. После сливания и промывки смолы с помощью ДМФ обработку для снятия защиты повторяли еще один раз. Затем смолу обрабатывали раствором Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH, полученным выше (3-5 экв.), HATU (2,75-4,8 экв.) и ДИЭА (6-10 экв.) в ДМФ (4 мл) и перемешивали при к.т. в течение 6-24 ч. Смесь сливали и смолу интенсивно промывали с помощью ДМФ и затем кэпировали путем обработки с помощью 20% Ac₂O в ДМФ (5 мл) в условиях микроволнового облучения при 50°C в течение 5 мин. Реакционную смесь сливали и смолу интенсивно промывали с помощью ДМФ и ДХМ.

3. Синтез Fmoc-βA-IKPEAPGEK(Alloc)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Удлинение аминокислот на предварительно загруженной (psi-R35,Y36)-смоле Зибера (0,2 ммоль) осуществляли на микроволновом синтезаторе пептидов СЕМ Liberty Blue. Стандартные Fmocзащищенные α-аминокислоты подвергали двойному связыванию в 3,8-кратном избытке по отношению к исходной загрузке смолы при 50°C в течение 15 мин с применением HBTU/ДИЭА в качестве агентов связывания. Fmoc-Arg(Pbf)-ОН подвергали двойному связыванию с применением двухстадийного протокола: 25 мин при к.т., затем 15 мин при 50°C и Fmoc-His (Trt)-ОН подвергали двойному связыванию с применением двухстадийного протокола: 4 мин при к.т., затем 8 мин при 50°C.

4. Синтез Fmoc-βA-IKPEAPGEK(NH₂)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера: Снятие защитной группы Alloc.

Смолу, полученную выше, обрабатывали раствором фенилсилана (25 экв.) в бескислородном ДХМ (10 мл). После перемешивания в течение ~2 мин добавляли раствор Pd(PPh₃)₄ (0,5 экв.) в ДХМ (10 мл) и смесь смолы перемешивали в течение 30 в атмосфере аргона. Реакционную смесь сливали и смолу промывали бескислородным ДХМ. Снятие защиты повторяли с применением свежих реагентов, после чего реакционную смесь сливали и смолу интенсивно промывали с помощью ДХМ и ДМФ.

5. Синтез Fmoc-eA-IKPEAPGEK(NH-dPEG₁₂-NHFmoc)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(psiR35Y36)-смолы Зибера: связывание N-Fmoc dPEG₁₂-карбоновых кислот на 11K.

Приведенную выше пептидную смолу Зибера, с которой сняли защиту Alloc, обрабатывали раствором N-Fmoc-dPEG12-карбоновой кислоты (5 экв), HBTU (4,8 экв.) и ДИЭА (10 экв.) в ДМФ (7 мл) в микроволновом реакторе СЕМ при 50°C в течение 15 мин; по истечении данного времени реакция демонстрировала негативный результат теста Кайзера. Реакционную смесь сливали и смолу интенсивно промывали с помощью ДМФ и ДХМ.

6. Синтез BrCH₂COHN-eA-IKPEAPGEK(NH-dPEG₁₂-NHCOCH₂Br)ASPEELNRYYASLRHY-

LNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера: бис-бромацетилирование при вА и dPEG₁₂.

Вышеуказанную смолу подвергали снятию защиты Fmoc с применением свежего 20% пиперидина в ДМФ при 50°C в течение 5 мин в микроволновом реакторе СЕМ. Снятие защиты повторяли дважды. Полученную таким образом пептидную смолу, с которой сняли защиту Fmoc, обрабатывали раствором бромуксусного ангидрида (20 экв.) в ДМФ (5 мл) в микроволновом реакторе СЕМ при 50°C в течение 10 мин; по истечении данного времени реакция демонстрировала негативный результат теста Кайзера. Реакционную смесь сливали и смолу интенсивно промывали с помощью ДМФ и ДХМ, и затем сушили.

7. Синтез BrCH₂COHN-eA-IKPEAPGEK(NH-dPEG₁₂-NHCOCH₂Br)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)-CONH₂: отщепление от смолы и снятие общей защиты.

Высушенную смолу обрабатывали раствором 1,5% ТФУ в ДХМ (10 мл) и перемешивали в 5-10 течение мин, затем фильтровали. Эту обработку повторяли еще 9 раз, применяя свежую смесь для каждой обработки. Объединенные фильтраты затем объединяли и концентрировали с получением неочищенного защищенного пептида в виде пены желтого цвета. Эту пену обрабатывали с помощью 20 мл смеси для расщепления (ТФУ/фенол/H₂O/ТИПС = 88/5/5/2) при комнатной температуре в течение 2,5 ч и затем концентрировали в потоке азота до объема ~2,5 мл, после чего добавляли холодный эфир (40 мл) для осаждения пептида. Смесь центрифугировали (5 мин; 5000 об/мин) и декантировали. Этот процесс повторяли еще 2 раза с получением неочищенного пептида в виде порошка почти белого цвета.

Альтернативно, смолу обрабатывали смесью для расщепления без предварительной обработки с помощью 1-2% ТФУ в ДХМ с получением полностью незащищенного пептида.

8. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 1: Методика циклизации А и очистка.

Неочищенный пептид, описанный выше, растворяли в бескислородный 50% MeCN/вода (5-10 мг/мл), необязательно добавляли ЭДТА (1 мМ). Затем рН реакционного раствора повышали до приблизительно 8 путем добавления 7,5 мас./об.% раствора NaHCO₃. Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 0,5-2,5 ч, а затем подкисляли до рН <1 путем добавления ТФУ. Затем раствор концентрировали при пониженном давлении при к.т. до приблизительно половины исходного объема (~24 мл). Полученный раствор очищали с помощью обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ. Очистку выполняли на системе для ВЭЖХ Gilson 2020 Personal Purification System с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 A, 5 мкм). Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной кон

- 62 045724 центрации 20% В до конечной концентрации 50% В в течение 36 мин. УФ-детектирование контролировали при 220 и 254 нм. Фракции, содержащие продукт, анализировали с помощью аналитической ВЭЖХ на системе для ВЭЖХ Agilent 1100 с применением того же типа колонки, что и выше (4,6x250 мм, 5 мкм). Чистые фракции объединили и затем лиофилизировали с получением продукта в виде твердого хлопкоподобного вещества.

ЖХМС: 1225,5 (М+4Н)/4, 1633,4 (М+ЗН)/3 и 2450,0 (М+2Н)/2 для пика продукта при 12,27 мин (ЖХ: Колонка Atlantis T3 С18, 5 мкм, 4,6x250 мм, 1,0 мл/мин, градиент 15-60%).

Пример 2. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 2.

1. Синтез смолы H₂N-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG.

Защитную пептидильную смолу синтезировали с применением стратегии Fmoc, как описано выше, на микроволновом синтезаторе пептидов СЕМ Liberty Blue с применением амидных смол Ринка низкой загрузки, предпочтительно, смолы Fmoc-PAL-PEG PS (приблизительно 0,16-0,2 мэкв/г, поставляемой компанией Applied Biosysterns) в масштабе 0,1 ммоль, как изображено на Схеме 1. Стандартные Fmocзащищенные аминокислоты подвергали связыванию в 5-кратном избытке по отношению к загрузке смолы, с применением ДИК/оксима в качестве агентов связывания, и температуры реакции приблизительно 90°C в течение 4 мин. Fmoc-Arg(Pbf)-ОН подвергали двойному связыванию при 90°C в течение 4 мин каждую, и Fmoc-His(Trt)-ОН подвергали связыванию с применением двухстадийного протокола: 4 мин при к.т., затем 8 мин при 50°C. Снятие индивидуальных Fmoc-защит осуществляли с применением 20% пиперидина в ДМФ (раствор для снятия защиты) при 90°C в течение 1,5 мин.

2. Синтез смолы m-BrCH2PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PALPEG.

Пептидную смолу, с которой сняли защиту Fmoc, (0,1 ммоль), описанную выше, обрабатывали раствором м-бромметилбензойной кислоты (20 экв.) и ДИК (10 экв.) в ДМФ (4 мл) в микроволновом реакторе при 75°C в течение 15 мин; по истечении данного времени реакцию в целом определяли как завершенную, согласно нингидриновому тесту Кайзера (Kaiser, et al., Anal. Biochem., 1970, 34, 595-598). В случаях, когда связывание было определено как неполное, связывание повторяли со свежими реагентами. Реакционную смесь сливали и смолу интенсивно промывали ДМФ и ДХМ.

3. Синтез m-BrCH2PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-CONH2: снятие защиты и отщепление от смолы.

Затем смолу, упомянутую выше, обрабатывали смесью для расщепления (масштаб 10 мл/0,1 ммоль), состоящей из ТФУ/воды/фенола/ТИПС (88:5:5:2) и нагревали в микроволновом реакторе при 38°C в течение 40 мин, затем фильтровали. Смолу промывали с помощью ТФУ и объединенные фильтраты концентрировали под потоком азота до объема приблизительно 2,5 мл и пептид осаждали путем добавления холодного диэтилового эфира (40 мл). Суспензию пептид/эфир центрифугировали и декантировали слой эфира. Пептидную таблетку ресуспендировали в эфире, центрифугировали и декантировали, и этот процесс повторяли в третий раз. Полученный таким образом неочищенный пептид высушивали в мягком потоке азота.

4. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 2: Методика циклизации А и очистка.

Неочищенный пептид, упомянутый выше, растворяли в бескислородном MeCN/воде (60% MeCN) в концентрации <4 мг/мл. Затем рН раствора пептида повышали до приблизительно 7-9 путем добавления водн. NH₄OAc (200 мМ, рН 8,4) и полученный раствор перемешивали при к.т. до завершения циклизации, согласно ЖХМС (обычно 3-4 ч). Реакционную смесь циклизации подкисляли до рН 1,5-3 путем добавления ТФУ и раствор концентрировали для удаления большей части органического сорастворителя до точки, в которой происходило легкое помутнение. Для придания смеси однородности, по необходимости, минимальное количество MeCN добавляли обратно и затем полученный раствор непосредственно очищали с помощью препаративной ВЭЖХ в многократных инъекциях, с применением колонки С18 Varian Pursuit XRS C18 (21x250 мм, 100 А, 5 мкм). Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 20% В до конечной концентрации 40% В в течение 45 мин. УФ-детектирование контролировали при 220 и 254 нм. Фракции, содержащие продукт, анализировали с помощью аналитической ВЭЖХ на системе для ВЭЖХ Agilent 1100 с применением соответствующей колонки, как приведено в табл. 1. Чистые фракции объединяли, концентрировали для удаления большей части органической фазы и затем лиофилизировали.

Пример 3. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 3.

1. Синтез смолы (H₂N)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(азидо-нор-Leu)-TRQRYPALPEG.

Пептид, связанный со смолой, получали в масштабе 0,1 ммоль в соответствии со способом, описанным в Примере 2, этап 1, заменив Fmoc-hCys(trt)-ОН на Fmoc-изидо-нор-Leu-ОН в положении 31.

2. Синтез смолы (НССН(СН₂)₂CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(азидо-нор-Leu)TRQRYPAL-PEG.

4-Пентиновую кислоту подвергали связыванию со смолой, упомянутой выше, в условиях микро

- 63 045724 волнового облучения с применением протокола ДИК/НОВТ (75°C, 10 мин). Реакционную смесь сливали и смолу интенсивно промывали с помощью ДМФ и ДХМ.

3. Синтез (HCCH(CH₂)₂CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(азидо-нор-Leu)-

TRQRYPAL-CONH2.

Смолу, упомянутую выше, обрабатывали с помощью 10 мл смеси для расщепления, состоящей из ТФУ/DODT/Н₂О/TIS (92,5:2,5:2,5:2,5) в условиях микроволнового облучения (38°C, 40 мин). Реакционную смесь сливали и смолу промывали с помощью ТФУ (10 мл). Затем объединенный фильтрат концентрировали под потоком азота до объема ~2,5 мл. Затем добавляли холодный эфир (40 мл) для осаждения пептида и смесь центрифугировали (5 мин; 5000 об/мин) и декантировали. Этот процесс повторяли еще 2 раза с получением неочищенного пептида в виде порошка почти белого цвета.

4. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 3.

Готовят 7 мг CuSO₄ в 2 мл бескислородной H2O. Готовят 30 мг ТВТА в 5,4 мл EtOH и 0,6 мл MeCN. Предварительно смешивают 0,94 мл раствора CuSO₄ и 4,8 мл раствора ТВТА. Готовят 30 мг Na аскорбата в 3 мл бескислородной H2O.

К раствору неочищенного азидсодержащего пептида из Этапа 3 (100 мг) в 20 мл добавляли предварительно смешанный раствор CuSO4/TBTA, после чего добавляли 2,4 мл раствора Na аскорбата (раствор немедленно принимал молочное окрашивание). Смесь нагревали до 40°C и перемешивали в течение 1,5 ч, после чего анализ ЖХМС указывал на завершение реакции. Смесь разбавляли до ~40 мл водой (0,1% ТФУ); смесь центрифугировали и супернатант очищали с помощью обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ. Очистку проводили с применением колонки Varian Pursuit XRs С18 (21x250 мм, 100 А, 5 мкм) при 35°C. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 10% В до промежуточной концентрации 18% В (21 мл/мин), а затем до конечной концентрации 33% В (10,5 мл/мин) в течение 35 мин. УФ-детектирование контролировали при 220 и 254 нм. Фракции, содержащие продукт, анализировали с помощью аналитической ВЭЖХ на системе для ВЭЖХ Agilent 1100 с применением того же типа колонки, что и выше (4,6x250 мм, 5 мкм). Чистые фракции объединили и затем лиофилизировали с получением продукта в виде твердого хлопкоподобного вещества.

Пр имер 4. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 4.

1. Синтез смолы (Dde)K(NH₂)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG.

Пептид, связанный со смолой, получали с применением способа, описанного в Примере 2, этап 1.

2. Синтез смолы (Dde)K(NH-Glu-(OtBu)NH2)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG.

Fmoc-Glu-OtBu (5 экв.) подвергали связыванию со смолой, упомянутой выше, в условиях микроволнового облучения с применением способов связывания ДИК/оксима (90°C, 6 мин; двойное связывание). Смолу сливали и промывали с помощью ДМФ. После этого снимали защиту Fmoc с применением 20% пиперидина в ДМФ с использованием 3-стадийного протокола (75°C в течение 0,5 мин; 75°C в течение 3 мин; 75°C в течение 3 мин), выполняя промывание с помощью ДМФ на каждой стадии.

3. Синтез смолы (Dde)K(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG.

Пальмитиновую кислоту (5 экв.) подвергали связыванию со смолой, упомянутой выше, в условиях микроволнового облучения с применением способов связывания ДИК/оксима (90°C, 5 мин). Смолу сливали и интенсивно промывали с помощью ДМФ и ДХМ.

4. Синтез смолы (H2N)K(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG.

После промывания смолы, упомянутой выше, с помощью ДМФ ее обрабатывали раствором 2% гидразина в ДМФ (6 мл/0,1 ммоль смолы) при к.т. в течение 5 мин, затем сливали и промывали с помощью ДМФ. Обработку повторяли еще 5 раз.

5. Синтез смолы (H2N)IKPEAPGEK(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG.

Оставшиеся аминокислотные связывания осуществляли с применением способа, описанного в Примере 2, этап 1.

6. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 4.

Остаток синтеза проводили с применением способов, описанных в Примере 2, этапы 2-4. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRS C18 (21x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от 23% В до промежуточной концентрации 33% В (21 мл/мин) в течение 5 мин и затем до конечной концентрации 48% В (10,5 мл/мин) в течение 55 мин.

Пример 5. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 5.

Соединение, указанное в заголовке, получали согласно методике, описанной в Примере 4, заменив пальмитиновую кислоту α-токоферилоксиуксусной кислотой (AcVitE) (8) на этапе 3.

Очистку продукта проводили с помощью колонки Agilent 300SB С8 (21x250 мм, 100 А, 5мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 35% В до промежуточной концентрации 45% В (21 мл/мин) в течение 5 мин, а затем до конечной концентрации 60% В (10,5 мл/мин) в течение

- 64 045724 мин.

Пример 6. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 6.

1. Синтез смолы (HCCH(CH₂)₂CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(Dde)-(азидо-норLeu)-TRQRY-PAL-PEG.

Пептид, связанный со смолой, получали, как описано в Примере 3, этап 1, заменив Fmoc-Leu-OH на Fmoc-Lys(Dde)-ОН в положении 30 и введя 4-пентиновую кислоту (подвергнутую связыванию в два этапа) на данном этапе в положении 2, а затем Fmoc-Ile-OH в положении 3.

2. Синтез смолы (НССН(СН₂)₂CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH₂)-(азидо-норLeu)-TRQRY-PAL-PEG.

Вышеуказанную смолу обрабатывали 3% гидразином в ДМФ (в масштабе 8 мл/0,1 ммоль) в течение 5 мин при к.т. и затем смесь сливали и промывали с помощью ДМФ. Эту процедуру повторяли приблизительно 5x, после чего смолу интенсивно промывали с помощью ДМФ и затем ДХМ.

3. Синтез смолы (НССН(СН₂)₂CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH-γ-Glu-

AcVitE)-(азидо-HopLeu)-TRQRY-PAL-PEG.

Fmoc-Glu-OtBu подвергали связыванию со смолой, упомянутой выше, с применением протокола связывания, описанного в Примере 2, этап 1 с временем связывания 5 мин. Защиту со смолы снимали путем обработки 20% пиперидином в ДМФ с применением 3-стадийного микроволнового протокола (75°C, 0,5 мин; 75°C, 3 мин; 75°C, 0,3 мин), после чего смолу интенсивно промывали с помощью ДМФ и ДХМ. Затем α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) подвергали связыванию со смолой с применением той же самой методики, которая применялась для связывания Fmoc-Glu-OtBu.

4. Синтез (НССН(СН₂)₂CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH-γ-Glu-AcVitE)- (азидо-нор-Leu)-TRQRY-CONH2.

Отщепление пептида от смолы, упомянутой выше, и его осаждение осуществляли с применением методики, описанной в Примере 3, этап 3.

5. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 6.

Соединение, указанное в заголовке, получали с применением методики, описанной в Примере 3, этап 4. Очистку продукта выполняли на колонке arian Pursuit XRs C8 (21x250 мм, 100 A, 5 мкм) при 35°C. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 35% В до промежуточной концентрации 48% В (21 мл/мин) в течение 5 мин, а затем до конечной концентрации 63% В (10,5 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 7. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 7.

Соединение, указанное в заголовке, получали с применением методики, описанной в Примере 4, с остатком K(NH-y-Glu-Pal), введенным в положение 9 вместо положения 11. Очистку продукта проводили с помощью колонки Agilent 300SB С8 (21x250 мм, 100 A, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 23% В до промежуточной концентрации 43% В (21 мл/мин) и затем до итоговой концентрации 43% В (10,5 мл/мин) в течение 40 мин. Загрязненные фракции, содержащие продукт, подвергали повторной очистке на колонке Waters T3 С18 (250x19 мм, 100 A, 5 мкм) при к.т. с применением градиента от исходной концентрации 25% В до промежуточной концентрации 35% В (21 мл/мин) и затем до конечной концентрации 45% В (10,5 мл/мин) в течение 80 мин.

Пример 8. Синтез аналога циклического PYYy SEQ ID NO: 8.

Соединение, указанное в заголовке, получали с применением методики, описанной в Примере 4, с остатком K(NH-y-Glu-Pal), введенным в положение 30 вместо положения 11. Очистку продукта выполняли с применением колонки Agilent 300SB С8 (21x250 мм, 100 A, 5 мкм) при 35°C. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 21% В до промежуточной концентрации 31% В (21 мл/мин) и затем до конечной концентрации 41% В (10,5 мл/мин) в течение 40 мин. Загрязненные фракции, содержащие продукт, повторно очищали на колонке Waters T3 С18 (250x19 мм, 100 A, 5 мкм) при к.т. с применением градиента от исходной концентрации 21% В до промежуточной концентрации 31% В (21 мл/мин) и затем до конечной концентрации 40% В (10,5 мл/мин) в течение 80 мин.

Пример 9. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 9.

1. Синтез H₂N-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Удлинение аминокислот на предварительно загруженной (psi-R35, Y36)-смоле Зибера из Примера 1, этап 2 (0,1 ммоль) осуществляли, как описано в Примере 1, этап 3, с модификацией, заключавшейся в применении 5-кратного избытка защищенных аминокислот.

2. Синтез m-BrCH₂PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

м-Бромметилбензойную кислоту подвергали связыванию со смолой, упомянутой выше, в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, с той модификацией, что связывание осуществляли при 50°C вместо 75°C.

- 65 045724

3. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 9.

Соединение, указанное в заголовке, получали из смолы, упомянутой выше, в соответствии с методиками, описанными в Примере 1, этапы 7 и 8. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (21x250 мм, 100 А, 5 мкм) при 35°C. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 10% В до промежуточной концентрации 18% В (21 мл/мин) в течение 10 мин и затем до конечной концентрации 33% В (10,5 мл/мин) в течение 35 мин.

Пример 10. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 10.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 4, заменив Fmoc-Leu-OH на Dde-Lys(Fmoc)-ОН в положении 30 и пальмитиновую кислоту на α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на этапе 3. Очистку продукта проводили с помощью колонки Agilent 300SB С8 (21x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 30% В до промежуточной концентрации 40% В (21 мл/мин) в течение 10 мин и затем до конечной концентрации 55% В (21 мл/мин) в течение 35 мин. Загрязненные фракции, содержащие продукт, повторно очищали с применением модифицированного градиента от исходной концентрации 35% В до промежуточной концентрации 43% В (21 мл/мин) в течение 5 мин и затем до конечной концентрации 58% В (10,5 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 11. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 11.

1. Синтез (AΠoc)K(NH2)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Смолу, упомянутую выше, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 9, этап 1, с применением Alloc-Lys(Fmoc)-ОН вместо Fmoc-Leu-OH в положении 30.

2. Синтез (Alloc)K(NH-γ-Glu-AcVitE)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Fmoc-Glu-OtBu и α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) (5 экв. каждая) последовательно подвергали связыванию со смолой, упомянутой выше, с применением связываний, опосредованных с помощью HBTU/ДИЭА, в условиях микроволнового облучения при 50°C в течение 15-20 мин.

3. Синтез H2N-K(NH-Y-Glu-AcVitE)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Защитную группу alloc удаляли, следуя методике, описанной в Примере 1, этап 4.

4. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 11.

Соединение, указанное в заголовке, получали из смолы, упомянутой выше, в соответствии с методиками, описанными в Примере 9, этапы 1-3, с той модификацией, что буфер 1М ТРИС/HCl, рН 7,5, применялся вместо буфера NH4OAc для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (21x250 мм, 100 А, 5 мкм) при 35°C. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 10% В до промежуточной концентрации 18% В (21 мл/мин) в течение 10 мин и затем до конечной концентрации 33% В (10,5 мл/мин) в течение 35 мин.

Пример 12. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 12.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 2, заменив Fmoc-Arg(pbf)-OH на Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH в положении 35 на этапе 1 и с той модификацией, что буфер 1 М NaHCO₃ применялся вместо буфера NH₄OAc для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 10-60% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 13. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 13.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, применяя пальмитиновую кислоту вместо α-токоферилоксиуксусной кислоты (AcVitE) (8) на этапе 2, и с той модификацией, что 60% EtOH/H₂O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H₂O и насыщенный водн. NaHCO₃ применяли вместо буфера NH4OAc для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 15% В до промежуточной концентрации 20% В (100 мл/мин) в течение 5 мин, а затем до конечной концентрации 35% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 14. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 14.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 4, с остатком Lys(NH-y-Glu-Pal), введенным в положение 30 вместо положения 11, и с Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-ОН вместо Fmoc-Arg(pbf)-ОН в положении 35 на этапе 1, и с той модификацией, что буфер 1 М NaHCO₃ применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 6, для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 20-70% Н (30 мл/мин) в течение 36 мин. Загрязненные фракции повтор

- 66 045724 но очищали на колонке с дифенилом Varian Pursuit XRs (30x100 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. с применением градиента 30-50% В (30 мл/мин) в течение 25 мин.

Пример 15. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 15.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 4, с остатком Lys(NH-y-Glu-Pal), введенным в положение 30 вместо положения 11, заменив связывание Fmoc-Ile-OH на Fmoc-eAla-OH в положении 3, и с теми модификациями, что буфер 1 М NaHCO₃ применяли вместо буфера NH₄OAc для осуществления циклизации, и связывание с бромуксусным ангидридом применяли вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 6 (этап 2 из Примера 2) с применением следующей методики: Пептидную смолу, с которой сняли защиту Fmoc, (0,1 ммоль) обрабатывали раствором бромуксусного ангидрида (10 экв.) в ДМФ (5 мл) в микроволновом реакторе при 50°C в течение 5-10 мин; по истечении данного времени реакцию обычно определяли как завершенную, согласно нингидринному тесту Кайзера. В случаях, когда связывание было определено как неполное, связывание повторяли со свежими реагентами. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 20-60% В (30 мл/мин) в течение 36 мин. Загрязненные фракции повторно очищали на колонке с дифенилом Varian Pursuit XRs (30x100 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. с применением градиента 30-50% В (30 мл/мин) в течение 25 мин.

Пример 16. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 16.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 4, с остатком Lys(NH-y-Glu-Pal), введенным в положение 30 вместо положения 11, опуская связывание Fmoc-Ile-OH в положении 3, и с применением п-бромметилбензойной кислоты вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 6 (этап 2 из Примера 2). Кроме того, вместо буфера 1 М NaHCO₃ применяли буфер 3 М буфер NH4OAc для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т.

Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 20-70% Н (30 мл/мин) в течение 36 мин. Загрязненные фракции повторно очищали на колонке с дифенилом Varian Pursuit XRs (30x100 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. с применением градиента 30-50% В (30 мл/мин) в течение 25 мин.

Пример 17. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 17.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 4, с остатком Lys(NH-y-Glu-Pal), введенным в положение 30 вместо положения 11 и Fmoc-Ala-OH, применяемым вместо Fmoc-Lys(Boc)-OH в положении 4 на этапе 1. Буфер ТРИС/HCl (1 М, рН 7,5) применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 6 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Agilent Polaris C18-A (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 20% В до промежуточной концентрации 35% В (40 мл/мин) в течение 5 мин и затем до конечной концентрации 45% В (40 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 18. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 18.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 4, с остатком Lys(NH-y-Glu-Pal), введенным в положение 30 вместо положения 11, и Fmoc-Glu(OtBu)-OH, применяемым вместо Fmoc-Lys(Boc)-OH в положении 4 на этапе 1. Буфер ТРИС/HCl (1 М, рН 7,5) применяли вместо буфера NH4OAc на этапе 6 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Agilent Polaris С18-А (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 20% В до промежуточной концентрации 35% В (40 мл/мин) в течение 5 мин и затем до конечной концентрации 45% В (40 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 19. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 19.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 4, с остатком Lys(NH-y-Glu-Pal), введенным в положение 30 вместо положения 11, Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH вместо Fmoc-Arg(pbf)-OH в положении 35 на этапе 1, Fmoc-Cys(trt)-OH вместо Fmoc-hCys(trt)-OH, и с применением п-бромметилбензойной кислоты вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 6 (этап 2 из Примера 2).

Следующую модификацию произвели на этапе 6 (этапы 3 и 4 из Примера 2). Неочищенный пептид, полученный до циклизации, очищали с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 20-70% Н (30 мл/мин) в течение 36 мин. Фракции, содержащие продукт, объединяли и обрабатывали твердым NaHCO₃ для повышения рН до ~7-8; полученный раствор перемешивали при к.т. в течение 4 ч, затем подкисляли до рН 4 с помощью ТФУ. Раствор концентрировали до объема 5-10 мл и добавляли MeCN для солюбилизации возможного осадка. Очистку продукта выполняли так, как описано выше, с градиентом 20-60% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

- 67 045724

Пример 20. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 20.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 4, с остатком Lys(NH-y-Glu-Pal), введенным в положение 30 вместо положения 11, Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-ОН вместо Fmoc-Arg(pbf)-ОН в положении 35 на этапе 1 и Fmoc-Cys(trt)-ОН вместо Fmoc-hCys(trt)-ОН. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19. Окончательную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-60% Н (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 21. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 21.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 4, с остатком Lys(NH-y-Glu-Pal), введенным в положение 30 вместо положения 11, Fmoc-Ala-OH, применяемым вместо Fmoc-His(trt)-ОН в положении 26, и Fmoc-Ala-OH, применяемым вместо Fmoc-Lys(Boc)ОН в положении 4 на этапе 1. Буфер ТРИС/HCl, (1 М, рН 7,5), применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 6 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Agilent Polaris C18-A (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 20% В до промежуточной концентрации 35% В (40 мл/мин) в течение 5 мин и затем до конечной концентрации 45% В (40 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 22. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 22.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 4, с остатком Lys(NH-y-Glu-Pal), введенным в положение 30 вместо положения 11, Fmoc-Ala-OH, применяемым вместо Fmoc-His(trt)-ОН в положении 26, и Fmoc-Glu(OtBu)-ОН, применяемым вместо Fmoc-Lys(Boc)-ОН в положении 4 на этапе 1. Буфер ТРИС/HCl, (1 М, рН 7,5), применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 6 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Agilent Polaris С18-А (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 20% В до промежуточной концентрации 33% В (40 мл/мин) в течение 5 мин и затем до конечной концентрации 43% В (40 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 23. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 23.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, с применением октадекандикарбоновой кислоты, моно-трет-бутилового эфира (доступного у компании AstaTech, Inc.) вместо α-токоферилоксиуксусной кислоты (AcVitE) (8), протокола связывания, использовавшего HATU/ДИЭА при 50°C в течение 30 мин и NMP в качестве растворителя вместо ДМФ на этапе 2, и связывания двух звеньев Fmoc-OEG-OH последовательно, перед сочетанием Fmoc-Glu-OtBu, на этапе 2. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-60% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-70% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 24. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 24.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 23, с применением 20-(трет-бутокси)-20-оксоикозановой кислоты (доступной у компании Key Organics, Inc.) вместо октодекандикарбоновой кислоты, моно-трет-бутилового эфира. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-60% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-60% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 25. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 25.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, с применением стеариновой кислоты вместо α-токоферилоксиуксусной кислоты (AcVitE) (8), протокола связывания, использующего HATU/ДИЭА при 50°C в течение 30 мин и NMP в качестве растворителя вместо ДМФ на этапе 2. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-80% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-80% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 26. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 26.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, с применением арахидиновой кислоты вместо α-токоферилоксиуксусной кислоты (AcVitE) (8), протокола связывания, использующего HATU/ДИЭА при 50°C в течение 30 мин и NMP в качестве растворителя вместо ДМФ на этапе 2. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-90% бар. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-90% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 27. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 27.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 23, но опуская связывание Fmoc-Glu-OtBu после последовательных связываний Fmoc-OEG-OH.

- 68 045724

Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-60% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-60% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 28. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 28.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, с применением пальмитиновой кислоты вместо α-токоферилоксиуксусной кислоты (AcVitE) (8), опуская связывание Fmoc-Ile-OH в положении 3, и с применением п-бромметилбензойной кислоты вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-60% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-60% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 29. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 29.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, с применением пальмитиновой кислоты вместо α-токоферилоксиуксусной кислоты (AcVitE) (8), заменив Fmoc-Ile-OH на Fmoc-eAla-OH в положении 3 и подвергая связыванию бромуксусный ангидрид вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2), с применением модификации, описанной в Примере 15. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-60% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-60% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 30. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 30.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, с применением пальмитиновой кислоты α-токоферилоксиуксусной кислоты (AcVitE) (8), заменив Fmoc-Ile-OH на Fmoc-Aeu-OH в положении 3 и подвергая связыванию бромуксусный ангидрид вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2), с применением модификации, описанной в Примере 15. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-60% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-60% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 31. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 31.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 23, с применением стеариновой кислоты вместо октодекандикарбоновой кислоты, моно-третбутилового эфира. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-60% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-60% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 32. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 32.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, с применением пальмитиновой кислоты вместо α-токоферилоксиуксусной кислоты (AcVitE) (8) на этапе 2, Fmoc-Ala-OH, применяемого вместо Fmoc-His(trt)-ОН в положении 26 и Fmoc-Ala-OH, применяемого вместо Fmoc-Lys(Boc)-ОН в положении 4 на этапе 4 (Пример 9, этап 1). Буфер ТРИС/HCl, (1 М, рН 7,5), применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 6 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Agilent Polaris С18-А (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 20% В до промежуточной концентрации 35% В (40 мл/мин) в течение 5 мин и затем до конечной концентрации 45% В (40 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 33. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 33.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, с применением пальмитиновой кислоты вместо α-токоферилоксиуксусной кислоты (AcVitE) (8) на этапе 2 и Fmoc-N(Me)-Gln(trt)-ОН вместо Fmoc-Gln(trt)-ОН в положении 34 на этапе 4 (Пример 9, этап 1). В данном случае, связывания проводили при комнатной температуре с применением NMP в качестве растворителя, и протокола HATU/ДИЭА (1 ч, одно связывание); Fmoc-N(Me)-Gin(trt)-ОН и Fmoc-Arg(pbf)-ОН подвергали двойному связыванию. В ходе операции применяли двухстадийный протокол снятия защиты Fmoc (20% пиперидина в ДМФ; кт; 10 мин, 15 мин). Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-70% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-70% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 34. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 34.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, с применением пальмитиновой кислоты вместо α-токоферилоксиуксусной кислоты (AcVitE) (8), заменив Fmoc-hCys(trt)-ОН на Fmoc-Cys(trt)-OH в положении 31, Fmoc-Ile-OH на 6-Fmoc-аминогексановую кислоту в положении 3, и подвергнув связыванию бромуксусный ангидрид вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (пример 9, этап 2), с применением модификации, опи

- 69 045724 санной в Примере 15. Водн. NaHCO₃ (2н) применяли вместо буфера NH₄OAc для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 20-70% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 35. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 35.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 9, со следующими модификациями: Fmoc-psi-[N-Me-Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH, полученный из Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH вместо Fmoc-Arg(Pbf)-OH, в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, этап 1, применяли вместо Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH (6) для получения загруженной смолы Зибера, применяемой в настоящем документе; Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH (от компании Active Peptide) применяли вместо Leu в положении 30; м-хлорметилбензойную кислоту применяли вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 2; Связывания проводили при к.т. с применением NMP в качестве растворителя и применяли протокол HATU/ДИЭА (1 ч, одно связывание); Fmoc-Arg(pbf)-OH подвергали двойному связыванию. В ходе операции применяли двухстадийный протокол снятия защиты Fmoc (20% пиперидина в ДМФ; кт; 10 мин, 15 мин). Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-70% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-70% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 36. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 36.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 35, заменив Fmoc-Ile-OH на Fmoc-eAla-OH в положении 3, и подвергнув связыванию бромуксусный ангидрид вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2), с применением модификации, описанной в Примере 15. Модифицированную обработку, указанную в Примере 19, опустили. Fmoc-eAla-OH подвергали связыванию в условиях микроволнового облучения при 50°C в течение 20 мин. Насыщенный водн. NaHCO3 применяли вместо буфера NH4OAc для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 20-70% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 37. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 37.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 9, заменив Fmoc-hCys(trt)-OH на Fmoc-Cys(trt)-OH в положении 31 и Fmoc-Leu-OH на Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH (от компании Active Peptide) в положении 30. Кроме того, Fmoc-Abu-OH добавляли к последовательности в положение 2, на этапе 1, и связывание с бромуксусным ангидридом применяли вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 2, с применением модификации, описанной в Примере 15. Насыщенный водн. NaHCO₃ применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 3 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 20-70% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 38. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 38.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 35, со следующими модификациями: Fmoc-eAla-OH добавляли к последовательности в положение 2 после этапа 1, с применением микроволнового облучения при 50°C в течение 20 мин, и связывание с бромуксусным ангидридом применяли вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 2, с применением модификации, описанной в Примере 15. Насыщенный водн. NaHCO3 применяли вместо буфера NH4OAc для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 20-80% Н (30 мл/мин В) в течение 36 мин.

Пример 39. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 39.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, с применением арахидиновой кислоты вместо α-токоферилоксиуксусной кислоты (AcVitE) (8) на этапе 2. Fmoc-Ser(tBu)-OH применяли вместо Fmoc-Lys(Boc)-OH в положении 4 на этапе 4 (Пример 9, этап 1) и т-хлорметилбензойную кислоту применяли вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). 60% EtOH/H₂O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H₂O и насыщенный водн. NaHCO₃ применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 20% В до промежуточной концентрации 25% В (100 мл/мин) в течение 5 мин и затем до конечной концентрации 40% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 40. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 40.

1. Синтез (НССН(СН₂)₂CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(Dde)-(азидо-нор-Leu)-

- 70 045724

TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Удлинение аминокислот на предварительно загруженной (psi-R35,Y36)-смоле Зибера из Примера 1, этап 2, (0,1 ммоль) осуществляли при к.т. с применением NMP в качестве растворителя, 5-кратного избытка защищенных аминокислот и протокола HATU/ДИЭА (1 ч, одно связывание); Fmoc-Arg(pbf)-ОН и Fmoc-His(trt)-ОН подвергали двойному связыванию. В ходе операции применяли двухстадийный протокол снятия защиты Fmoc (20% пиперидина в ДМФ; кт; 10 мин, 15 мин).

2. Синтез (НССН(СН₂)₂CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH₂)-(азидо-нор-Leu)TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Смолу, упомянутую выше, обрабатывали 2% гидразином в ДМФ (в масштабе 12 мл/0,2 ммоль) в течение 2 мин при к.т. и затем смесь сливали. Эту процедуру повторяли приблизительно 4x, после чего смолу интенсивно промывали с помощью ДМФ и затем ДХМ.

3. Синтез (НССН(СН₂)₂CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK((OEG)₂-γ-Glu-Pal)-(азидонор-Leu)-TRQ(psi-R3 5Y 3 6)-смолы Зибера.

Смолу, упомянутую выше, подвергали связыванию с (S)-10,19-диоксо-22-пальмитамидо-3,6,12,15тетраокса-9,18-диазатрикозандикарбоновой кислотой (5 экв.) [полученной в соответствии с методикой, описанной в синтезе промежуточного соединения 3, путем замены 18-трет-бутокси-18-оксооктадекановой кислоты на пальмитиновую кислоту на этапе G], с применением протокола HBTU/ДИЭА при к.т. в течение 1,5 ч. Смолу сливали и интенсивно промывали с помощью ДМФ и ДХМ.

4. Синтез (НССН(СН₂)₂CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK((OEG)₂-γ-Glu-Pal)-(азидонор-Leu)-TRQ(psi-R3 5Y3 6)-CONH₂.

Высушенную смолу обрабатывали раствором 2% ТФУ в ДХМ (20 мл) и перемешивали в течение 20 мин, затем фильтровали. Эту обработку повторяли еще 2 раза, используя свежую смесь для каждой обработки. Объединенные фильтраты затем объединяли и концентрировали с получением неочищенного защищенного пептида в виде пены желтого цвета. Данную пену обрабатывали с помощью 20 мл смеси для расщепления (ТФУ/Н2О/ТИПС=95/2,5/2,5) при к.т. в течение 2,5 ч, а затем концентрировали под потоком азота до объема около 2,5 мл. Затем добавляли холодный эфир (40 мл) для осаждения пептида и смесь центрифугировали (5 мин; 5000 об/мин) и декантировали. Этот процесс повторяли еще 2 раза с получением неочищенного пептида в виде порошка почти белого цвета.

Неочищенный пептид очищали с помощью обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм). Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 20-70% В в течение 36 мин. УФ-детектирование контролировали при 220 и 254 нм. Фракции, содержащие продукт, анализировали с помощью аналитической ВЭЖХ на системе для ВЭЖХ Agilent 1100 с применением того же типа колонки, что и выше (4,6x250 мм, 5 мкм). Чистые фракции объединили и затем лиофилизировали с получением продукта в виде твердого хлопкоподобного вещества.

ЖХМС: 1211,8 (М+4Н)/4, 1615,4 (М+3Н)/3 и 2422,9 (М+2Н)/2 для пика продукта при 16,87 мин (ЖХ: Колонка Atlantis T3 С18, 5 мкм, 4,6x250 мм, 1,0 мл/мин, градиент 30-60%).

5. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 40.

Готовят 5,1 мг CuSO₄ в 1 мл Н₂О. Готовят 10,4 мг ТВТА в 3 мл EtOH. Предварительно смешивают 400 μцл раствора CuSO₄ и 3 мл раствора ТВТА. Готовят 13 мг Na аскорбата в 2 мл H2O.

К раствору очищенного азидсодержащего пептида из этапа 4 (37 мг) в 4 мл HEPES (0,1 М, рН 7,4) добавляли 1,7 мл предварительно смешанного раствора CuSO4/TBTA, после чего добавляли 1 мл раствора Na аскорбата. Корректируют соотношение EtOH/H2O до тех пор, пока реакционный раствор не становился прозрачным. Смесь перемешивали при к.т. и контролировали с помощью ВЭЖХ. Через 30 мин реакция была завершена. Смесь доводили до рН 4 и очищали с помощью обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ. Очистку проводили с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм). Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 20-60% В в течение 36 мин. УФ-детектирование контролировали при 220 и 254 нм. Фракции, содержащие продукт, анализировали с помощью аналитической ВЭЖХ на системе для ВЭЖХ Agilent 1100 с применением того же типа колонки, что и выше (4,6x250 мм, 5 мкм). Чистые фракции объединили и затем лиофилизировали с получением продукта в виде твердого хлопкоподобного вещества.

Пример 41. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 41.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 40, заменив (S)-10,19-диоксо-22-пальмитамидо-3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазатрикозандикарбоновую кислоту на L-глутаминовую кислоту, N-(1-оксогексадецил)-, 1-(1,1-диметилэтил) эфир, на этапе 3.

Пример 42. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 42.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 40, заменив (S)-10,19-диоксо-22-пальмитамидо-3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазатрикозандикарбоновую кисло

- 71 045724 ту на (S)-22-(трет-бутоксикарбонил)-43,43-диметил-10,19,24,41-тетраоксо-3,6,12,15,42-пентаокса-9,18,23триазатетратетраконтан-1-карбоновую кислоту (16) (промежуточное соединение 2), на этапе 3.

Пример 43. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 43.

1. Синтез (Alloc)Lys((OEG)₂-γ-Glu-NH₂)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Удлинение аминокислот на предварительно загруженной (psi-R35,Y36)-смоле Зибера из Примера 1, этап 2, (0,1 ммоль) осуществляли при к.т. с применением NMP в качестве растворителя, 5-кратного избытка защищенных аминокислот и протокола HATU/ДИЭА (1 ч, одно связывание); Fmoc-Arg(pbf)-ОН подвергали двойному связыванию. В ходе операции применяли двухстадийный протокол снятия защиты Fmoc (20% пиперидина в ДМФ; к.т.; 10 мин, 15 мин).

2. Синтез (Alloc)Lys((OEG)₂-γ-Glu-Pal)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Пальмитиновую кислоту подвергали связыванию со смолой из этапа 1, с применением условий микроволнового облучения, используя HATU/ДИЭА при 50°C в течение 20-30 мин и NMP в качестве растворителя.

3. Синтез (H₂N)Lys((OEG)₂-γ-Glu-Pal)-(hc)-TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Защитную группу alloc смолы, упомянутой выше, удаляли, следуя методике, описанной в Примере 1, этап 4.

4. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 43.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 9, этапы 1-3, с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 2. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-60% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-60% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 44. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 44.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 43, модифицированными таким образом, что спаренные звенья Fmoc-OEG-ОН и звено Fmoc-Glu-OtBu вводили на этапе 2 вместо этапа 1. Октодекандикарбоновую кислоту, моно-третбутиловый эфир (AstaTech, Inc.) применяли вместо пальмитиновой кислоты на этапе 2 и линкерлипидную последовательность устанавливали в положение 11 вместо положения 30. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-70% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-70% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 45. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 45.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 43, модифицированными таким образом, что Fmoc-dPEG24-карбоновую кислоту применяли вместо тандемных звеньев Fmoc-OEG-OH и ее, вместе с пальмитиновой кислотой, вводили на этапе 2. Линкер-липидную последовательность устанавливали в положении 11 вместо положения 30. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-90% бар. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-90% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 46. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 46.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 9, с применением Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-ОН (полученного у компании Active Peptide) вместо Leu в положении 30. Кроме того, Fmoc-eAla-OH добавляли к последовательности в положение 2, после этапа 1, с применением условий микроволнового облучения при 50°C в течение 20 мин, и связывание с бромуксусным ангидридом применяли вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 2, с применением модификации, описанной в Примере 15. Твердый неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-70% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-70% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 47. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 47.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 44, устанавливая линкер-липидную последовательность в положение 7 вместо положения 11. Очистку продукта выполняли с применением колонки Varian Pursuit XRs C18 (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-60% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-60% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 48. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 48.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 43, с применением октадекандикарбоновой кислоты, моно-трет-бутилового эфира (AstaTech, Inc.) вместо пальмитиновой кислоты на этапе 2 со временем связывания 30 мин, и устанавливая линкерлипидную последовательность в положение 22 вместо положения 30. Неочищенный линейный пептид

- 72 045724 очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-70% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-70% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 49. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 49.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, заменив α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на 16-тетрагидропиран-2илоксипальмитиновую кислоту на этапе 2, и с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо мбромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). 60% EtOH/H₂O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H2O и насыщенный водн. NaHCO₃ применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 20% В до промежуточной концентрации 10% В (100 мл/мин) в течение 5 мин и затем до конечной концентрации 30% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 50. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 50.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 48, и устанавливая линкер-липидную последовательность в положение 23 вместо положения 30.

Пример 51. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 51.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 9, с применением Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-ОН (полученного у компании Active Peptide) вместо Fmoc-Leu-OH в положении 30 и Fmoc-Ser(tBu)-ОН вместо Fmoc-Lys(Boc)-ОН в положении 4, на этапе 1. 60% EtOH/H2O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H2O и насыщенный водн. NaHCO₃применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 10% В до промежуточной концентрации 20% В (100 мл/мин) в течение 5 мин и затем до конечной концентрации 30% В (100 мл/мин) в течение 40 мин. Загрязненные фракции повторно хроматографировали с применением градиента, состоящего из исходной концентрации 10% В и промежуточной концентрации 20% В (100 мл/мин) в течение 5 мин и затем до конечной концентрации 30% В (100 мл/мин) в течение 60 мин.

Пример 52. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 52.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 43, с применением Fmoc-dPEG12-карбоновой кислоты вместо тандемных звеньев Fmoc-OEGOH и вводя ее вместе с Fmoc-Glu-OtBu и пальмитиновой кислотой на этапе 2. Линкер-липидную последовательность устанавливали в положении 11 вместо положения 30. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-70% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-70% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 53. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 53.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 52, с применением четырех тандемных звеньев Fmoc-OEG-OH вместо Fmoc-dPEG12карбоновой кислоты.

Пример 54. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 54.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 53, вводя два тандемных звена Fmoc-OEG-OH вместо двух.

Пример 55. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 55.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 43, вводя линкер-липидную последовательность в положение 23 вместо положения 30. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-70% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-70% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 56. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 56.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии со способами, описанными в Примере 11, заменяя α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на (4'-хлорбифенил-4-ил)уксусную кислоту на этапе 2, и с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо мбромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). 60% EtOH/H₂O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H₂O и насыщенный водн. NaHCO₃ применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне 10-28% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

- 73 045724

Пример 57. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 57.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, заменяя α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на 3-[(2,4-дихлорфенокси)фен-4ил]пропионовую кислоту на этапе 2, и с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо мбромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). 60% EtOH/H₂O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H₂O и насыщенный водн. NaHCO₃ применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне 10-30% В (80 мл/мин) в течение 40 мин. Фракции, содержащие продукт, объединяли, подкисляли с помощью ТФУ, концентрировали и повторно хроматографировали на колонке Agilent Polaris C18-A (30x250 мм, 100 А, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне от исходной концентрации 20% В до промежуточной концентрации 15% В (40 мл/мин) до конечной концентрации 45% В (40 мл/мин) в течение 45 мин.

Пример 58. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 58.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, заменяя α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на 11-(4-фторфенил)ундекановую кислоту на этапе 2, и с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (пример 9, этап 2). 60% EtOH/H2O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H2O и насыщенный водн. NaHCO₃ применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне 15-35% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 59. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 59.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 43, опуская этап 2 и вводя связывание пальмитиновой кислоты на этапе 1. Линкер-липидную последовательность устанавливали в положение 22 вместо положения 11. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-70% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 2070% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 60. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 60.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 53, вводя два тандемных звена FMOC-OEG-OH вместо четырех, и устанавливая линкерлипидную последовательность в положение 7 вместо положения 11. Неочищенный линейный пептид очищали и подвергали циклизации в соответствии с модификацией, описанной в Примере 19, с применением градиента 20-80% В. Конечную очистку продукта выполняли с применением градиента 20-80% В (30 мл/мин) в течение 36 мин.

Пример 61. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 61.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, заменяя α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на 11-[(4-трифторметил)фенил]ундекановую кислоту на этапе 2, и с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). 60% EtOH/H2O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H2O и насыщенный водн. NaHCO3 применяли вместо буфера NH4OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне 15-35% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 62. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 62.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, заменяя α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на 11,11,11-трифторундекановую кислоту на этапе 2, и с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). 60% EtOH/H₂O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H₂O и насыщенный водн. NaHCO₃ применяли вместо буфера NH4OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне 10-28% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 63. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 63.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, заменяя α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на 15,15,15-трифторпентандекановую кислоту на этапе 2, и с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). 60% EtOH/H2O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H2O и насыщенный водн. NaHCO3 применяли вместо буфера NH4OAc на этапе

- 74 045724 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне 15-30% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 64. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 64.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, заменяя α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на 16-этоксипальмитиновую кислоту на этапе 2, и с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). 60% EtOH/H₂O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H₂O и насыщенный водн. NaHCO₃ применяли вместо буфера NH4OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH₄OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне 15-30% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 65. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 65.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, заменяя α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на 13,13,14,14,15,15,16,16,16-В9пальмитиновую кислоту (Cambridge Isotopes) на этапе 2, и с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). 60% EtOH/H2O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H₂O и насыщенный водн. NaHCO₃ применяли вместо буфера NH4OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне 15-20% В (100 мл/мин) в течение 5 мин и затем до 35% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 66. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 66.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, заменяя α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на 11-[(2,4-бис-(трифторметил)фенил]ундекановую кислоту на этапе 2, и с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо м-бромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). 60% EtOH/H₂O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H₂O и насыщенный водн. NaHCO₃ применяли вместо буфера NH₄OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне 15-35% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 67. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 67.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 11, заменяя α-токоферилоксиуксусную кислоту (AcVitE) (8) на 11-[(3,5-бис-(трифторметил)фенил]ундекановую кислоту на этапе 2, и с применением м-хлорметилбензойной кислоты вместо мбромметилбензойной кислоты на этапе 4 (Пример 9, этап 2). 60% EtOH/H2O применяли в качестве растворителя вместо MeCN/H2O и насыщенный водн. NaHCO3 применяли вместо буфера NH4OAc на этапе 4 для осуществления циклизации. Очистку продукта выполняли с помощью колонки Waters XBridge C18 OBD (50x250 мм, 5 мкм) при к.т. Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (10 мМ NH4OH в воде, рН ~9) и буфера В (MeCN) в диапазоне 15-35% В (100 мл/мин) в течение 40 мин.

Пример 68. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 68.

1. Синтез (Fmoc)-βA-IKPEAPGEK(Alloc)ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Удлинение аминокислот на предварительно загруженной (psi-R35,Y36)-смоле Зибера из Примера 1, этап 2, (0,1 ммоль) осуществляли при к.т. с применением ДМФ в качестве растворителя, 6-кратного избытка защищенных аминокислот и протокола HATU/ДИЭА (10 мин, двойное связывание). В ходе операции применяли двухстадийный протокол снятия защиты Fmoc (20% пиперидина в ДМФ; к.т.; 10 мин, 15 мин).

2. Синтез (Fmoc)-eA-IKPEAPGEK((OEG)₂-y-Glu-NHCO(CH₂)₁₆CO₂tBu)-ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Снятие защиты с указанной выше смолы проводили в соответствии со способом, описанным в Примере 1, этап 4, с применением модифицированного времени реакции 10 мин для каждой обработки. Затем смолу подвергали связыванию с промежуточным соединением 2 (15) (5 экв.) с применением протокола HATU/ДИЭА в ДМФ (1 ч, к.т.).

3. Синтез (BrAc)-eA-IKPEAPGEK((OEG)₂-y-Glu-NHCO(CH₂)₁₆CO₂tBu)-ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

После снятия Fmoc-защиты (20% пиперидина/ДМФ) вышеупомянутую смолу обрабатывали бромуксусным ангидридом (10 экв.; к.т., 30 мин) с получением бромацетилированной смолы.

4. Синтез (BrAc)-eA-IKPEAPGEK((OEG)₂-y-Glu-NHCO(CH₂)₁₆CO₂tBu)-ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(psi-R3 5Y3 6)-CONH₂.

Вышеуказанную смолу обрабатывали смесью для расщепления, содержащей ТФУ/Н2О/ТИПС

- 75 045724 (95:2,5:2,5), в течение 1,5 ч при к.т. Неочищенный пептид осаждали эфиром в соответствии с процедурой, описанной в Примере 1, этап 7.

5. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 68.

Полученный выше неочищенный пептид растворяли в концентрации 10 мг/мл в 10% MeCN/H₂O и добавляли ТЭА, чтобы повысить рН раствора до 8-9. После перемешивания при к.т. в течение ~20 мин. добавляли ТФУ для понижения рН до 2, и раствор непосредственно очищали с помощью препаративной ВЭЖХ на колонке Kinetics C18 Evo (30x100 мм, 100 А, 5 мкм). Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 20-60% В в течение 22 мин. УФ-детектирование контролировали при 220 и 254 нм. Чистые фракции объединили и затем лиофилизировали с получением продукта в виде твердого хлопкоподобного вещества.

Пример 69. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 69.

1. Синтез (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(OAllyl)TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Удлинение аминокислот на предварительно загруженной (psi-R35,Y36)-смоле Зибера из Примера 1, этап 2, (0,1 ммоль) осуществляли при к.т., с применением ДМФ в качестве растворителя, 6-кратного избытка защищенных аминокислот и протокола HATU/NMM (10 мин, двойное связывание). В ходе операции применяли двухстадийный протокол снятия защиты Fmoc (20% пиперидина в ДМФ; к.т.; 10 мин, 15 мин).

2. Синтез (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(NHS)TRQ(psi-R35Y36)-смолы Зибера.

Снятие Alloc-защиты с вышеуказанной смолы проводили в соответствии со способом, описанным в Примере 1, этап 4, применяя модифицированное время реакции 10 мин для каждой обработки. Затем смолу подвергали связыванию с NHS (10 экв.) с применением протокола HATU/ДИЭА в ДМФ (1 ч, к.т., двойное связывание).

3. Синтез (NH2)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(NHS)TRQ(psi-R35Y36).

Вышеуказанную смолу обрабатывали смесью для расщепления, содержащей ТФУ/Н2О/ТИПС (95:2,5:2,5), в течение 1,5 ч при к.т. Неочищенный пептид осаждали эфиром в соответствии с процедурой, описанной в Примере 1, этап 7.

4. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 69.

Полученный выше неочищенный пептид растворяли в концентрации 80 мг/мл в ДМСО и добавляли ТЭА (25 экв.) для осуществления лактамизации. После перемешивания при комнатной температуре в течение ~ 30 мин реакционную смесь разбавляли в 10 раз с помощью 10% MeCN/вода, доводили рН до 2 и неочищенный пептид очищали непосредственно с помощью препаративной ВЭЖХ на колонке Kinetics C18 Evo (30x100 мм, 100 А, 5 мкм). Подвижная фаза состояла из градиента буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 10-60% В в течение 22 мин. УФ-детектирование контролировали при 220 и 254 нм. Чистые фракции объединяли и затем лиофилизировали с получением K(Dde)защищенного пептида. Защитную группу Dde удаляли с применением 2% гидразина/ДМФ (10 мг пептида/мл) в течение 30 мин при к.т. Реакционную смесь разбавляли в 10 раз с помощью 10% MeCN/вода и доводили рН до 2 с помощью ТФУ, раствор неочищенного пептида очищали, как описано выше, с получением продукта в виде твердого хлопкоподобного вещества.

Пример 70. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 70.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методиками, описанными в Примере 69, заменяя Fmoc-E(OAll)-ОН на Fmoc-Leu-OH в положении 30 и заменяя Fmoc-Val-OH на Fmoc-E(OAll)-ОН в положении 31.

Пример 71. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 71.

1. Синтез смолы (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNE(OAllyl)VTRQ(N-Me-R)YNovaSyn TGR.

Удлинение аминокислот на смоле NovaSyn TGR (0,1 ммоль) осуществляли с применением методики, описанной в Примере 69, этап 1.

2. Аналог циклического PYY SEQ ID NO: 71.

Соединение, указанное в заголовке, получали из смолы, упомянутой выше, в соответствии с методиками, описанными в Примере 69, этапы 2-4.

Пример 72. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 72.

1. Синтез (S)-22-(трет-бутоксикарбонил)-43,43-диметил-10,19,24,41-тетраоксо-3,6,12,15,42- пентаокса-9,18,23-триазатетраконтан-1 -ового N-гидроксисукцинимидного эфира.

К раствору (S)-22-(трет-бутоксикарбонил)-43,43-диметил-10,19,24,41 -тетраоксо-3,6,12,15,42пентаокса-9,18,23-триазатетратетраконтан-1-овой кислоты (Промежуточное соединение 2 (16)) (54,0 мг, 0,063 ммоль), N-гидроксисукцинимида (14,6 мг, 0,127 ммоль) и HATU (24,1 мг, 0,063 ммоль) в 1,0 мл ДМФ добавляли ДИЭА (0,022 мл, 0,127 ммоль), смесь перемешивали в течение 30 мин при к.т. и применяли на следующем этапе напрямую, без дополнительной очистки.

- 76 045724

2. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 72.

К раствору [цикло-(G2-E30), S4, K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 (полученного в Примере 70) (4 мг, 0,96 μмоль) в ДМФ (0,2 мл) добавляли 24 мкл раствора N-гидроксиэфира (полученного на этапе 1) и ТФУ (0,66 мкл; 5 экв.) и смесь перемешивали в течение ночи при к.т. Реакционную смесь разбавляли в 10 раз с помощью 10% MeCN/вода, доводили рН до 2 с помощью ТФУ и неочищенный пептид очищали непосредственно с помощью препаративной ВЭЖХ на колонке Kinetics C18 Evo (30x100 мм, 100 А, 5 мкм). Подвижная фаза состояла из градиентного элюирования буфера А (0,1% ТФУ в воде) и буфера В (0,1% ТФУ в MeCN) в диапазоне 10-60% В в течение 22 мин. УФ-детектирование контролировали при 220 и 254 нм. Чистые фракции объединяли и затем лиофилизировали с получением трет-бутиловый эфир-защищенного пептида. Защитные группы трет-бутилового эфира удаляли с применением смеси ТФУ/Н₂О/ТИПС (95:2,5:2,5) в течение 1,5 ч при к.т. Смесь концентрировали, и пептид очищали, как описано выше, с получением продукта в виде твердого хлопкоподобного вещества. Пример 73. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 73 Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя N-Fmoc-dPEG6-карбоновую кислоту на N-Fmoc-dPEG12карбоновую кислоту на этапе 5.

Пример 74. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 74.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, но опуская этап 5 связывания линкера PEG.

Пример 75. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 75.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя Fmoc-Cys(trt)-OH на Fmoc-hCys(trt)-OH в положении 31 и опуская этап связывания Fmoc-βΑΙα-ΟΗ на этапе 3.

Пример 76. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 76.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, с модифицированными этапом 3 и этапом 4. На этапе 3 Fmoc-Lys(Alloc)-OH и Fmoc-Lys(dde)-OH применяли для положения 30 и положения 11 соответственно. После снятия Alloc-защиты в положении 30 с помощью Pd(PPh₃)4-фенилсилана mPEG16-карбоновую кислоту подвергали связыванию с HATU-DIPEA. На этапе 4 dde в позиции 11 удаляли с помощью 2% гидразина в ДМФ.

Пример 77. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 77.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 76, заменяя mPEG12-карбоновую кислоту на mPEG16-карбоновую кислоту на этапе 3 и опуская этап связывания Fmoc-dPEG12-карбоновой кислоты на этапе 5.

Пример 78. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 78.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя Fmoc-N-Me-Gln(trt)-OH на Fmoc-Gln(trt)-OH на этапе 3.

Пример 79. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 79.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH на Fmoc-Arg(pbf)-OH на этапе 1В.

Пример 80. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 80.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 79, заменяя Fmoc-Arg (pbf)-OH на Fmoc-Lys(Boc)-OH в положении 4 и заменяя Fmoc-Trp(Вос)-ОН на Fmoc-Leu-OH в положении 30 на этапе 3.

Пример 81. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 81.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 80, заменяя Fmoc-Cys(trt)-OH на Fmoc-hCys(trt)-OH в положении 31 и заменяя Fmoc-γ-аминобутановую кислоту на Fmoc-eAla-OH на этапе 3.

Пример 82. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 82.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя Fmoc-PEG2-карбоновую кислоту на Fmoc-eAla-OH и Fmoc-Cys(trt)-OH на Fmoc-hCys(trt)-OH в положении 31, а также опуская связывание Fmoc-Ile-OH на этапе 3.

Пример 83. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 83.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя Fmoc-Lys(N3)-OH на Fmoc-hCys(trt)-OH в положении 31, заменяя пент-4-иновую кислоту на Fmoc-eAla-OH на этапе 3, и следуя методике циклизации В, как описано ниже.

Методика циклизации В. К раствору полностью незащищенного пептида с PEG12-AcBR, установленной в положении 11 (38 мг, 0,0067 ммоль) в 2 мл HEPES (рН 7,4), добавляли 1,7 мл предварительно смешанного раствора CuSO₄/TBTA (раствор готовили путем смешивания раствора 2,2 мг CuSO₄ в воде (0,4 мл) с раствором 11 мг ТВТА в EtOH), с последующим добавлением 7 мг натрия аскорбата в воде (1 мл). Прозрачный реакционный раствор оставили перемешиваться при к.т. и контролировали с помощью ВЭЖХ. Через 30 мин реакция завершалась, и реакционную смесь доводили до рН 4 с применением ТФУ, и подвергали ВЭЖХ-очистке (колонка Pursuit XRS 5 250x30 мм С18, со скоростью потока

- 77 045724 мл/мин, контролируя длину волны 214 нм, с градиентом в диапазоне от 20-60% MeCN-вода/вода, оба с 0,1% ТФУ, в течение 36 мин). Желаемую фракцию собирали и лиофилизировали.

Пример 84. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 84.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, опуская этап связывания Fmoc-eAla-OH, заменяя N3-PEG8-карбоновую кислоту на Fmoc-dPEG12карбоновую кислоту на этапе 5, заменяя связывание 3-(бромметил)бензойной кислоты с ДИК на ацилирование бромуксусного ангидрида на этапе 3 и следуя методике циклизации С, как описано ниже.

Методика циклизации С. К раствору полностью незащищенного пептида (20 мг, 0,0035 ммоль) в 5 мл дегазированной воды добавляли водн. раствор NaHCO₃ для доведения реакционной смеси до рН 6,4 или выше. Через 20 мин ЖХМС показала, что реакция завершена, и реакционную смесь доводили до рН 4 с помощью ТФУ и подвергали ВЭЖХ-очистке (колонка Pursuit XRS 5 250x30 мм С18, со скоростью потока 30 мл/мин, контролируя длину волны 214 нм, с градиентом в диапазоне от 10-60% MeCN-вода/вода, обе с 0,1% ТФУ, в течение 36 мин). Желаемую фракцию собирали и лиофилизировали.

После циклизации циклизованное промежуточное соединение подвергали удлинению линкера путем клик-химии, следуя методике циклизации В с N-(1-бромо-2-оксо-7,10,13-триокса-3-азагексадекан16-ил)пент-4-инамидом, который получали путем связывания N-Boc-PEG4-NH₂ с пент-4-иновой кислотой с применением HATU-DIPEA, с последующим снятием Вос-защиты с помощью ТФУ и ацилированием с помощью бромуксусного ангидрида в присутствии ТФУ.

Пример 85. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 85.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, с линкером PEG12-AcBr, установленным в положении 23 вместо положения 11.

Пример 86. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 86.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, с линкером PEG12-AcBr установленным в положении 22 вместо положения 11.

Пример 87. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 87.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, с линкером PEG12-AcBr, установленным в положении 7 вместо положения 11.

Пример 88. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 88.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя Fmoc-V-ОН на Fmoc-hCys(trt)-ОН в положении 31, заменяя Fmoc-Cys(trt)-ОН на Fmoc-Leu-OH в положении 30 и заменяя Fmoc-Gly-OH на Fmoc-eAla-OH на этапе 3.

Пример 89. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 89.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 88, опуская этап 1 для получения восстановленного дипептида и заменяя загрузку Fmoc-Tyr(tBu)-ОН с последующим сочетанием с Fmoc-(N-Me)Arg-OH на загрузку Fmoc-psi-(R35-N(Boc)-Y36)-ОН на этапе 2.

Пример 90. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 90.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 89, заменяя Fmoc-eAla-OH на Fmoc-Gly-OH на этапе 3.

Пример 91. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 91.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 89, заменяя Fmoc-hCys(trt)-ОН на Fmoc-Cys(trt)-ОН в положении 30 на этапе 3.

Пример 92. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 92.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 90, заменяя Fmoc-hCys(trt)-ОН на Fmoc-Val-OH в положении 31 и заменяя Fmoc-Leu-ОН на Fmoc-Cys(trt)-ОН в положении 30 на этапе 3.

Пример 93. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 93.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя Fmoc-Val-OH на Fmoc-hCys(trt)-ОН в положении 31, заменяя Fmoc-Cys(trt)-ОН на Fmoc-Leu-OH в положении 30 и заменяя Fmoc-Gly-OH на Fmoc-eAla-OH на N-конце на этапе 3.

Пример 94. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO:94.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя Fmoc-Val-OH на Fmoc-hCys(trt)-ОН в положении 31 и заменяя Fmoc-Cys(trt)-ОН на Fmoc-Leu-OH в положении 30 на этапе 3.

Пример 95. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 95.

Соединение, указанное в заголовке, получали (в масштабе 0,05 ммоль) в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя Fmoc-Val-OH на Fmoc-hCys(trt)-ОН в положении 31, заменяя Fmoc-Glu(OAlloc)-ОН на Fmoc-Leu-OH в положении 30, заменяя Fmoc-Lys(Dde)-ОН на Fmoc-Lys(Alloc)-ОН в положении 11, заменяя Fmoc-Ser(tBu)-ОН на Fmoc-Lys(Boc)-ОН в положении 4 и заменяя Boc-Gly-OH на Fmoc-eAla-OH на N-конце на этапе 3.

К полученной выше смоле добавляли бескислородный ДХМ (10 мл), фенилсилан (10 экв.) и раствор Pd(PPh₃)₄ (0,2 экв.) в ДХМ (1 мл) и смесь перемешивали в течение 10 мин. Реакционную смесь сливали и

- 78 045724 смолу промывали бескислородным ДХМ и снятие защиты повторяли один раз.

К смоле, полученной выше, добавляли ДМФ (10 мл), HATU (5 экв) и ДИЭА (10 экв) и смесь перемешивали в течение 5 мин, затем добавляли раствор N-гидроксисукцинимида (10 экв) в ДМФ и перемешивали в течение еще 20 мин. Смолу фильтровали и процедуру повторяли один раз.

Защиту со смолы, полученной выше, снимали в течение 2 ч при к.т. в ТФУ/ТИПС/вода (95/2,5/2,5) (10 мл). Смесь для расщепления концентрировали до приблизительно 1 мл и затем добавляли к 40 мл эфира. Полученный осадок собирали центрифугированием и сушили в атмосфере N₂.

Материал, полученный выше, растворяли в 9 мл ДМСО, к которому добавляли 10 экв ТЭА и реакция протекала в течение 3 ч при к.т. Полученный раствор разбавляли до 30 мл водой, рН доводили до 2 и очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ на колонке 30x250 мм С18, элюируя с линейным градиентом 20-40% MeCN в воде (0,1% ТФУ) в течение 30 мин. Фракции, содержащие продукт, лиофилизировали.

Материал, полученный выше, затем обрабатывали 1-2% гидразина/ДМФ (1 мл) для удаления Dole из лизина. Полученную смесь разбавляли до 10 мл водой, доводили рН до 2 и очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ, как описано выше.

Полученный продукт затем растворяли в 10% MeCN/вода, доводили рН до 10 и добавляли раствор бромуксусного N-гидроксисукцинимидного эфира (раствора 3 экв. 0,1 М/ДМФ), реакция протекала в течение 10 мин при к.т. Полученную смесь разбавляли до 10 мл водой, доводили рН до 2 и затем очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ, как описано выше, с получением продукта, указанного в заголовке.

Пример 96. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 96.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя N-Fmoc-dPEG24-карбоновую кислоту на N-Fmoc-dPEG12-карбоновую кислоту на этапе 5.

Пример 97. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 97.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 1, заменяя Fmoc-Gly-OH на Fmoc-eAla-OH на этапе 3.

Пример 98. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 98.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 89, но опуская этап связывания Fmoc-dPEG12-карбоновой кислоты на этапе 5.

Пример 99. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 99.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 90, но опуская этап связывания Fmoc-dPEG12-карбоновой кислоты на этапе 5.

Пример 100. Синтез аналога циклического PYY SEQ ID NO: 100.

Соединение, указанное в заголовке, получали в соответствии с методикой, описанной в Примере 94, но опуская этап связывания Fmoc-dPEG12-карбоновой кислоты на этапе 5.

Все следующие последовательности считаются примерами настоящего изобретения.

Перечень последовательностей

SEQ ID NO: 1

Название: [Цикло-( ₽A2-COCH₂-hC31) , К(PEG12-AcBr)11, psi(35R,36Y)]-PYY2-36

Структура:

SEQ ID NO: 2

Название: [цикло-(13- m-COPhCH₂-hC31)]-PYY3-36

Структура :

- 79 045724

- 80 045724

- 81 045724

- 82 045724

- 83 045724

- 84 045724

- 85 045724

- 86 045724

- 87 045724

- 88 045724

- 89 045724

- 90 045724

- 91 045724

- 92 045724

- 93 045724

- 94 045724

- 95 045724

- 96 045724

- 97 045724

psi-(R35,Y36)]-PYY3-36

Структура :

- 98 045724

- 99 045724

- 100 045724

(2,4-Cl₂Ph) 30, psi-(R35,Y36) ]-PYY3-3 6

Структура :

- 101 045724

- 102 045724

- 103 045724

- 104 045724

- 105 045724

- 106 045724

- 107 045724

SEQ ID NO: 70

Название: [цикло-(G2-E30), S4, Kll, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36

Структура :

hn nh₂

SEQ ID NO: 71

Название: [цикло-(G2-E30), S4, Kll, (N-Me-R35)]-PYY3-36

Структура :

hn^nh₂

SEQ ID NO: 72

Название: [цикло-(G2- E30), S4, К ( (OEG)₂-y-Glu- COCi₆CO₂H) 11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36

Структура :

- 108 045724

- 109 045724

Структура

- 110 045724

- 111 045724

- 112 045724

- 113 045724

- 114 045724

- 115 045724

- 116 045724

- 117 045724

- 118 045724

- 119 045724

Пример 111.: Анализ эффективности NPY2R сАМР человека in vitro (анализ hY2).

Способ, применяемый для испытания эффективности аналогов PYY in vitro, представлял собой клеточный анализ, разработанный для измерения ингибирования cAMP, индуцированного форсколином, производимого аденилатциклазой посредством модуляции связанного рецептора NPY2R Gi-белка человека. Продуцирование cAMP, индуцированное форсколином, в трансфицированных NPY2R HEK клетках человека снижали путем активации NPY2R с помощью аналогов PYY и контролей дозозависимым образом и измеряли в основанном на FRET конкурентном иммуноанализаторе cAMP LANCE (PerkinElmer).

Клетки размораживали из криоконсервации и добавляли к 15 мл клеточной среды (DMEM с высоким содержанием глюкозы (Cellgro), 10% ФБС (Hyclone), 1% пенициллин/стрептомицина (Life Technologies), 1% L-глутамина (Thermo Scientific), 1% Na пирувата (Thermo Scientific)). Клетки центрифугировали при 450xg в течение 5 мин, супернатанты отсасывали и клетки ресуспендировали в клеточной среде с плотностью 0,2х10⁶ клеток/мл. Клетки распределяли (25 мкл/лунка) на белый 384-луночный

- 120 045724 планшет Biocoat, покрытый коллагеном, (Becton Dickinson) до конечной плотности 5000 клеток/лунка и инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение 16-24 ч. Супернатанты в аналитическом планшете декантировали. Разбавления аналогов PYY и контролей готовили в 1х HBSS (Cellgro), 5 мМ HEPES (Cellgro), 0,1% БСА (PerkinElmer) и 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (Sigma) и 6 мкл/лунка каждого из образцов добавляли в соответствующие лунки. Антитело Lance cAMP (PerkinElmer) разбавляли 1:100 в 1х HBSS (Cellgro), 5 мМ HEPES (Cellgro), 0,005 мМ форсколина (Sigma), 0,1% БСА (PerkinElmer) и 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (Sigma) и 6 мкл смеси антител добавляли в лунку, которую затем инкубировали при к.т. в течение 25 мин. Затем 12 мкл/лунка LANCE cAMP проявляющей смеси реагентов, содержащей биотин-сАМР (1:750) и Европий-W8044 (1:2250) (PerkinElmer) добавляли на каждый аналитический планшет, который затем инкубировали при к.т. в течение 2 ч. Планшеты считывали на устройстве для считывания планшетов PerkinElmer Envision (возбуждение 320 нм, испускание - 615 и 665 нм) и относительные единицы флуоресценции (ОЕФ) рассчитывали как (615 нм/665 нм) х 10000. Все образцы анализировали трижды. Данные анализировали с применением внутреннего программного обеспечения для анализа данных Crucible, разработанного Eudean Shaw. Неизвестные концентрации сАМР в каждой лунке интерполировали по стандартным образцам известных концентраций сАМР, включенным в каждый планшет. Параметры, такие как ЕС₅₀, Log(EC₅₀), наклон кривой Хилла (nH), верх и низ, определяли путем откладывания значений концентрации сАМР от логарифма концентрации соединений, осуществляя подгонку с помощью модели 4-Р с применением нелинейного приложения взвешенных наименьших квадратов в среде R (открытый источник http://cran.us.r-project.org/), реализованного отделом неклинической статистики и вычислений компании Janssen R&D.

Значения эффективности аналогов NTSC-PYY, составляющих предмет настоящего изобретения, по сравнению с PYY₃.₃₆, которую применяли в качестве контроля в том же самом анализе, представлены в табл. 2.

Таблица 2

Эффективности соединений NTSC-PYY и PYY₃_₃₆(SEQ ID NO: 111) по отношению к рецептору hY2

SEQ ID NO:	Y2R EC₅₀ (нМ) SEQ ID NO: 2-39	Y2R EC₅₀ (hM) SEQ ID NO: 111
2	0, 14	0, 19
3	0, 11	0, 12
4	0,74	0, 05

- 121 045724

- 122 045724

Пример 112. Исследования эффективности in vivo.

A) Потребление пищи худыми мышами C57BL6N: Острая дозировка.

Самцы мышей C57BL/6 (возраст 10-12 недель) были получены от компании Taconic Laboratory. Мышей содержали по одной особи в клетке с подстилкой AlphaDri в комнате с контролируемой температурой с 12-часовым циклом свет/темнота. Мышам давали ad libitum доступ к воде и поддерживали их на их регулярной диете (Lab Diet Cat: 5001); Животных акклиматизировали в клетках BioDAQ (Research Diets, inc., Нью-Брансвик, NJ) не менее чем за 72 ч до начала эксперимента.

После акклиматизации в клетках BioDAQ мышей группировали в когорты из восьми животных на основании их индивидуального потребления пищи за последние 24 ч. В 16:00-17:00 животных взвешивали и обрабатывали либо носителем (2,7 мМ динатрия фосфата, 61,33 мМ пропиленгликоля, 19,5 мМ фенола, рН 8,2), либо испытуемым соединением в дозе 1 цмоль/кг (500 нмоль/мл) посредством подкожного введения. После введения соединения, изменения массы корма для каждой клетки непрерывно регистрировали с помощью системы автоматического контроля BioDAQ в течение 24 ч. Крошки удаляли ежедневно из бункеров и участков вокруг клеток с помощью вакуума. При необходимости корм пополняли. Рассчитывали процентное значение среднего кумулятивного потребления пищи относительно носителя в течение 24 ч после введения соединения, результаты представлены в табл. 3. Статистический анализ проводили с применением однофакторного дисперсионного анализа с пост-экспериментальным тестом Тьюки в программном обеспечении Prism. Все данные представлены в виде среднего значения.

B) Потеря массы у мышей с ожирением, вызванным диетой (DIO): Острая дозировка.

Самцов мышей DIO C57BL/6 (возраст 20 недель, 14 недели на диете с высоким содержанием жиров) получали от компании Taconic Laboratory. Мышей содержали по одной особи в клетке с подстилкой AlphaDri в комнате с контролируемой температурой с 12-часовым циклом свет/темнота. Мышам давали ad libitum доступ к воде и поддерживали на диете с высоким содержанием жиров (D12492, Research Diet). Животных акклиматизировали к помещению по меньшей мере за одну неделю до начала эксперимента.

За день до введения дозы мышей группировали в когорты из восьми животных в зависимости от

- 123 045724 индивидуальной массы тела. На следующий день, в 15:00-16:00, животных взвешивали и обрабатывали либо носителем (2,7 мМ динатрия фосфата, 61,33 мМ пропиленгликоля, 19,5 мМ фенола, рН 8,2), либо испытуемым соединением в дозе 100 нмоль/кг (50 нмоль/мл) посредством подкожного введения. Массу тела измеряли через 24 ч после дозирования и рассчитывали процентные доли потери массы, результаты представлены в табл. 3. Статистический анализ проводили с применением однофакторного дисперсионного анализа с пост-экспериментальным тестом Тьюки в программном обеспечении Prism. Все данные представлены в виде среднего значения.

С) Потеря массы у мышей с ожирением, вызванным диетой: Хроническая дозировка.

Самцов мышей DIO C57BL/6 (возраст 20 недель, 14 недели на диете с высоким содержанием жиров) получали от компании Taconic Laboratory. Мышей содержали по одной особи в клетке с подстилкой AlphaDri в комнате с контролируемой температурой с 12-ч циклом свет/темнота. Мышам давали ad libitum доступ к воде и поддерживали на диете с высоким содержанием жиров (D12492, Research Diet). Животных акклиматизировали к помещению по меньшей мере за одну неделю до начала эксперимента.

За день до введения дозы мышей группировали на основании индивидуальной массы тела. В 15:0016:00 в течение каждого из следующих 7 дней животных взвешивали, а затем обрабатывали либо носителем (2,7 мМ динатрия фосфата, 61,33 мМ пропиленгликоля, 19,5 мМ фенола, рН 8,2), либо испытуемым соединением в дозе 100 нмоль/кг (50 нмоль/мл) посредством подкожного введения. Через 7 суток измеряли массу тела и рассчитывали процентные доли потери массы, результаты представлены в табл. 3. Статистический анализ проводили с применением однофакторного дисперсионного анализа с постэкспериментальным тестом Тьюки в программном обеспечении Prism. Все данные представлены в виде среднего значения.

Таблица 3

Исследования эффективности соединений NTSC-PYY in vivo

Последов. I.D. №	Потребление пищи худыми мышами % носителя (доЗа=1цМ/кг	Острая потеря массы у DIO мышей % Изменение массы* (24 ч) (ДоЗа=100 нМ/кг)	Хроническая потеря массы у DIO мышей % Изменение массы* (7 дней) (ДоЗа=100 нМ/кг)
PYY3-36	84	НО	НО
2	65***	но	но
3	76*	но	но
8	48***	-4.95***	-10.23***
9	83	НО	НО
10	26***	-2.06**	но
11	НО	-5.10***	-9.65***
13	НО	-3.58***	-10.20***
14	НО	-2.56*	-5.66**
25	НО	-3.95***	НО
26	НО	-4.69***	НО
39	НО	-4.73***	НО
43	НО	-1.96**	НО
46	НО	-2.86*	НО
51	НО	-4.16***	НО
68	НО	-5.68***	НО

НО = не определено;

# % изменения массы по отношению к контрольным животным, которым вводили носитель;

*р<0,05;

**р<0,01;

***р<0,001.

Хотя приведенное выше описание содержит сведения о принципах настоящего изобретения с примерами, приведенными с целью иллюстрации, следует понимать, что практическое применение изобретения охватывает все обычные вариации, адаптации и/или модификации, входящие в объем приведенной ниже формулы изобретения и ее эквивалентов.

Все процитированные здесь документы включены путем ссылки.

Claims

1. Соединение формулы I о

и aspeelnryyz₂₂z₂₃lrz₂₆ylnz₃₀

HN О

-МОСТИК------(СН₂)_П [V₃₁]_qTRZ₃₄Z₃₅Y-NH₂

Формула I где р составляет 0 или 1;

m равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5;

n равно 1, 2, 3 или 4;

q равно 0 или 1; при условии, что q равно 1, только если Z₃₀ отсутствует;

-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- или -CH2S-;

Z4 представляет собой K, А, Е, S или R;

Z7 представляет собой А или K, где аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацилирована

где t равно 0, 1 или 2;

u равно 0 или 1;

v равно 14, 16 или 18;

- 125 045724

Z_n представляет собой D или K, причем аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацилирована

где w равно 0, 1, 2 или 4;

х равно 0 или 1;

у равен 14, 16 или 18;

О

_н со_?н о

N. J-. Д.

1 N- чсн_г)₁₄сн₃

2 о ^Н

(СН₂)₁₆СО₂Н

О

X, где i представляет собой целое число от 0 до 24, a X=Br, I или Cl,

- 126 045724 рована

-C(O)CH₂Br, -C(O)CH₂I или -C(O)CH₂Cl;

Z₂₂ представляет собой А или K, где аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацили-

Z₂₃ представляет собой S или K, где аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацили рована

- 127 045724

Z₂₆ представляет собой А или Н;

Л й ⁴ Т Y '° Т -

HcbY⁰ , о н ⁰

О и ⁰ ° ' ' О ' ^N'Y О ' - ⁰ ~ ' Ν’ ^L (СН.)_1ЬСО;Н о ^н

где r равно 0, 1 или 2;

s равно 0 или 1;

q равно 14, 16 или 18; или

- 128 045724

Z₃₅ представляет собой

CF₃

Z₃₄ представляет собой

(CH₂CH₂O)₁₂CH₃ .

(CH₂)_1SOH или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1, где m равно 0, 1, 2, 3 или 5;

n равно 1, 2 или 4;

Z7 представляет собой А или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на .о.

н

Ν^ΠΟΗ^ΟΟ^

НО’ н

N. (СНДпСНз

НО’ или

- 129 045724

Z9 представляет собой G или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на /о \ а где t равно 0;

u равно 1;

v равно 14;

Z11 представляет собой D или K, причем аминогруппа боковой цепи указанного K необязательно ацилирована f 1 \ / О

4 \с i [j '' - ) /χ где w равно 0 или 4;

х равен 1;

у равен 14;

N. ЛСН₂)1₄СНз

Z22 представляет собой А или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на

Z23 представляет собой S или K, причем боковая аминная цепь указанного K замещена на н

(СНД₁₄СН₃

•о°

НО' о

и

N' Н

или

- 130 045724

CO₂H

1СН₂СН₂ОЬСНз . ДСН₂СН₂О),₆СН₃ . _или где r равно 0 или 2;

sравно 1;

q равно 14, 16 или 18; или или его фармацевтически приемлемая соль.

3. Соединение по п.1, выбранное из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 110 или его фармацевтически приемлемая соль.

4. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.

5. Способ лечения или облегчения ожирения, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.

6. Способ лечения или облегчения синдрома, расстройства или заболевания, в котором указанный синдром, расстройство или заболевание выбрано из группы, состоящей из ожирения, диабета 2 типа, метаболического синдрома, резистентности к инсулину и дислипидемии, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения по пп.1-3.

- 131 045724

7. Способ по п.6, в котором указанный синдром, расстройство или заболевание представляют собой диабет 2 типа.

8. Способ снижения потребления пищи, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.

9. Способ модуляции активности рецептора Y2, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.

10. Способ лечения заболевания, расстройства или синдрома, выбранного из группы, состоящей из ожирения, диабета 2 типа, метаболического синдрома, резистентности к инсулину и дислипидемии, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения по любому из пп.1-3, в комбинации по меньшей мере с одним противодиабетическим средством.

11. Способ по п.10, в котором указанное противодиабетическое средство представляет собой модулятор рецептора глюкагон-подобного пептида 1.

12. Способ получения фармацевтической композиции, включающий объединение соединения по любому из пп.1-3 с фармацевтически приемлемым носителем.