Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

EA044850B1 - Антитела к par2 и пути их применения - Google Patents

Антитела к par2 и пути их применения Download PDF

Info

Publication number
EA044850B1
EA044850B1 EA201992186 EA044850B1 EA 044850 B1 EA044850 B1 EA 044850B1 EA 201992186 EA201992186 EA 201992186 EA 044850 B1 EA044850 B1 EA 044850B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
sequence
par2
Prior art date
Application number
EA201992186
Other languages
English (en)
Inventor
Клер ДОБСОН
Ричард Уилльямс
Иэн Гаррелл
Садхана Подичетти
Дэвид Фэирмен
Питер Торнтон
Филип НЬЮТОН
Original Assignee
Медиммун Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Медиммун Лимитед filed Critical Медиммун Лимитед
Publication of EA044850B1 publication Critical patent/EA044850B1/ru

Links

Description

Перекрестная ссылка на родственную заявку
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №
62/472462, поданной 16 марта 2017 г., и согласно предварительной заявке на патент США № 62/637766, поданной 2 марта 2018 г.. Вышеупомянутые заявки включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 8 марта 2018 г., имеет название 1848081-0002-093-WO1_SL.txt, и ее размер составляет 351668 байтов.
Предпосылки изобретения
Хроническая боль является состоянием, которое может затронуть каждого и ложится тяжелым бременем на пациентов, системы здравоохранения и экономики. Примерно 100 млн человек в Соединенных Штатах Америки страдают от хронической боли, и согласно оценкам, суммарные ежегодные дополнительные затраты на медицинское обслуживание, требующееся в связи с болью, включая медицинские затраты и экономические затраты, связанные с потерей времени и заработной платы, составляют от $560 до $635 миллиардов долларов (Институт медицины Национальных академий, 2011). Тем не менее, согласно опросу страдающих хронической болью, более половины считали, что они практически не контролируют или не контролируют свою боль (2006 Voices of Chronic Pain Survey, American Pain Foundation). Боль может быть вызвана различными состояниями и заболеваниями, от рака до диабета, артрита, и может быть разделена на следующие категории: ноцицептивная, нейропатическая и боль смешанного типа. Ноцицептивная боль определяется стимуляцией нервных волокон (например, тепловыми, механическими или химическими раздражителями), тогда как нейропатическая боль представляет собой боль, вызванную различными причинами, такими как повреждение нерва, заболевания и, что важно, воспаление. Воспаление, процесс, посредством которого организмы рекрутируют иммунные клетки и высвобождают иммунные факторы в место повреждения или инфекции, таким образом, может быть как полезным процессом восстановления повреждений, так и причиной боли.
Многие средства для лечения боли ингибируют воспаление. Двумя распространенными классами противовоспалительных болеутоляющих терапевтических средств являются стероидные противовоспалительные лекарственные средства и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID). Стероидные противовоспалительные лекарственные средства обычно подавляют простагландины и лейкотриены, продукты воспаления. Такие лекарственные средства являются надежными и эффективным, но влекут за собой риск серьезных побочных эффектов, включая, например, снижение плотности костной ткани, колебания веса, подавление иммунной системы и нарушения роста/полового созревания (Irving, P. M. et al. (2007) Aliment Pharmacol Ther. 26(3):313-329; Goodman et al. J Am Acad Orthop Surg. 2007 Aug;15(8):450-60). NSAID ингибируют циклооксигеназу 1 и/или 2 (COX-1 и/или COX-2), которые сами катализируют реакцию получения простагландинов из арахидоновой кислоты. Хроническая боль и воспаление могут требовать длительного лечения, а длительное ингибирование ферментов, представляющих собой СОХ, может привести к проблемам с желудочно-кишечным трактом, таким как желудочное кровотечение и язвы. С учетом рисков, связанных с такими противовоспалительными средствами для лечения боли, существует потребность в альтернативных подходах к лечению боли.
Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), представляют собой семейство мембранных белков, которые имеют общий структурный мотив из семи трансмембранных доменов, соединяющих Nконцевой внеклеточный домен и С-концевой внутриклеточный домен (Granier et al., Nat Chem Biol. 2012 Aug; 8 (8): 670-673). GPCR воспринимают внеклеточные сигналы, такие как фотоны, гормоны, хемокины и т.д., и активируют внутриклеточные G-белки. Существует много семейств GPCR, таких как семейство рецепторов Frizzled, семейство родопсина, семейство рецепторов секретина, семейство белков адгезии и семейство активируемого протеазой рецептора (PAR) (Zhang et al. Nature. 2012 Dec 20; 492(7429): 387392; Zhang et al. Mol Cells. 2015 Oct; 38(10):836-42). Хотя различные семейства GPCR имеют общие структурные особенности, они обладают разными функциями, связываются с разными лигандами и активируются разными механизмами. Активацию семейства PAR GPCR связывали с воспалением и ноцицепцией (Gieseler et al. Cell Commun Signal. 2013; 11: 86).
Было идентифицировано четыре рецептора PAR: PAR1, PAR2, PAR3 и PAR4 (Macfarlane et al. Pharmacol Rev. 2001 Jun;53(2):245-82; Gieseler et al Cell Commun Signal. 2013; 11: 86). Было показано, что активация PAR2 усиливает воспаление и ноцицепцию, что делает его ингибирование привлекательной мишенью противовоспалительных болеутоляющих терапевтических средств. PAR, в отличие от других GPCR, активируются путем протеолитического расщепления их внеклеточных доменов, что открывает N-концевую последовательность, которая действует в качестве привязанного активирующего лиганда. В частности, PAR2 расщепляется и активируется трипсином и триптазой.
Экспрессия PAR2 была обнаружена в васкуляризированных тканях, дыхательных путях, остеобластах, сердечно-сосудистой ткани, кератиноцитах, экзокринных железах, лейкоцитах, тучных клетках, кишечном эпителии, почке, нейронах, поджелудочной железе и различных типах гладких мышц (Macfar- 1 044850 lane выше). PAR2 также участвует в развитии различных заболеваний или состояний, связанных с нейрогенным воспалением, ноцицепцией и передачей болевого сигнала. PAR2 может активироваться несколькими сериновыми протеазами, полученными от хозяина и патогена (например, трипсином, триптазой тучных клеток, тканевыми калликреинами или представителями каскада свертывания TF-FVIIa и FVaFXa).
Было показано, что моноклональные антитела являются полезными в различных терапевтических применениях, и в настоящее время на рынке имеется множество терапевтических средств на основе антител (Maggon, Curr Med Chem. 2007;14(18):1978-87; Brekke and Sandlie, Nat Rev Drug Discov 2: 52-62, 2003). Наиболее распространенным типом антител, циркулирующих в кровотоке, является иммуноглобулин G (IgG). Применимость антитела IgG для терапевтических целей зависит от нескольких факторов, включая специфичность антитела к его мишени, силу его связывания с мишенью, а также то, насколько эффективно может продуцироваться антитело, и как быстро антитело выводится из сыворотки (время полужизни антитела в сыворотке крови). Значения времени полужизни антител в сыворотке крови часто регулируются с помощью FcRn (неонатального Fc-рецептора), который связывается с Fc-доменом иммуноглобулина G (IgG). In vivo IgG, как полагают, поглощаются неспецифически посредством пиноцитоза жидкой фазы (Pyzik et al, J Immunol. 2015 May 15;194(10):4595-603). Попав в эндосому, IgG связывается с FcRn, который распределяет IgG в эндосомы, осуществляющие рециклинг, и обратно на поверхность клетки, в направлении, противоположном лизосомам и противоположном разрушению. Хотя уровень рециклинга IgG, согласно оценкам, составляет 44% от уровня фракционного катаболизма, содержание терапевтических средств на основе антител все еще может истощаться в течение нескольких дней после введения (Kim, Jonghan, et al. Clin. Immunol. 122.2 (2007): 146-155).
Боль, связанная с воспалением, часто является хроническим состоянием. Сведение к минимуму дозировки и частоты введения терапевтической молекулы является желательным. Таким образом, существует потребность в новых противовоспалительных болеутоляющих средствах. Стандартные моноклональные антитела являются привлекательными кандидатами, но в некоторых случаях могут быть ограничены их значениями времени полужизни в сыворотке крови. По этой причине могут быть желательны альтернативные средства для лечения.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предусмотрены антитела, которые связывают PAR2. Антитела в соответствии с настоящим изобретением применимы, помимо прочего, для ингибирования PAR2опосредованной передачи сигнала и для лечения заболеваний и состояний, вызванных активностью PAR2 и/или передачей сигнала, опосредованной PAR2, или связанных с таковыми.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с PAR2, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), при этом VH содержит:
i) VH-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, ii) VH-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 818, iii) VH-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15, и при этом VL содержит:
i) VL-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18, ii) VL-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, iii) VL-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.
Предпочтительно VH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 831, и VL содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 17.
Предпочтительно VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 12, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 17.
Более предпочтительно VH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 12, и VL содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 17.
В одном воплощении антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv или Fab'.
В другом воплощении антитело представляет собой моноклональное антитело.
В еще одном воплощении антитело представляет собой IgG.
В дополнительном воплощении VH кодируется нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 11, и/или VL кодируется нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 16.
В дополнительном воплощении антитело или антигенсвязывающий фрагмент предотвращает взаи- 2 044850 модействие трипсина, триптазы и/или матриптазы с PAR2.
В дополнительном воплощении антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с PAR2 с большей аффинностью при рН 7,4, чем при рН 6,0.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению и содержащая нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 95% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 11.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению и содержащая нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 95% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 16.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен набор экспрессирующих векторов, содержащий: а) нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, как описано выше; и b) нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, как описано выше.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая один или несколько векторов, описанных выше, или набор векторов, описанный выше.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен фармацевтический набор, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или композицию по изобретению и один или несколько контейнеров.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения боли, проявляющейся при заболеваниях, при которых экспрессируется PAR2, у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающий введение субъекту фармацевтически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или композиции по изобретению.
Предпочтительно боль выбрана из группы, состоящей из ноцицептивной, нейропатической и боли смешанного типа.
Предпочтительно боль связана с головной болью, хронической головной болью, мигреневой головной болью, раком, вирусной инфекцией, ревматоидным артритом, остеоартритом, болезнью Крона, болезнью печени, рассеянным склерозом, повреждением спинного мозга, постгерпетической невралгией, диабетической нейропатией, болью в нижней части спины, воспалительным заболеванием сердца, заболеванием почки, гастритом, гингивитом, заболеванием пародонта, астмой, хронической обструктивной болезнью легких, аутоиммунным заболеванием, синдромом раздраженного кишечника, фибромиалгией, болями в ногах, синдромом беспокойных ног, диабетической нейропатией, аллергическим состоянием, хирургической процедурой, острым или хроническим физическим повреждением, переломом кости или повреждением раздавливанием, повреждением спинного мозга, воспалительным заболеванием, состоянием невоспалительной нейропатической или дисфункциональной боли или их комбинацией.
Более предпочтительно боль представляет собой боль при остеоартрите.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, предусматривающий стадии экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, или нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, в культивируемой клетке, и очистки антитела или антигенсвязывающего фрагмента.
Краткое описание графических материалов
Данный патент или поданная заявка на патент содержат по меньшей мере один графический материал, выполненный в цвете. Копии публикации данного патента или заявки на патент с цветным(и) графическим(и) материалом(ами) будут предоставлены Ведомством по запросу и при уплате необходимой пошлины.
На фигурах 1А и 1В показаны таблицы, иллюстрирующие отличия последовательностей CDR2 (SEQ ID NOS 4, 14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214,
224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434,
444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654,
664, 674, 684, 694, 704, 714, 724, 734, 744, 754, 764, 774, 784, и 794, соответственно, в порядке появления)
- 3 044850 и CDR3 VH (SEQ ID NOS 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 155, 165, 175, 185,
195, 205, 215, 225, 235, 245, 255, 265, 275, 285, 295, 305, 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375, 385, 395, 405,
415, 425, 435, 445, 455, 465, 475, 485, 495, 505, 515, 525, 535, 545, 555, 565, 575, 585, 595, 605, 615, 625,
635, 645, 655, 665, 675, 685, 695, 705, 715, 725, 735, 745, 755, 765, 775, 785, и 795, соответственно, в порядке появления) различных клонов от таких же CDR Par0067. CDR1 и каркасные области являются одинаковыми для Par0067 и для всех из указанных клонов (т.е. Par0067 и каждый из клонов содержали последовательности под SEQ ID NO: 3 и 803-806).
На фиг. 2А и 2В показаны таблицы, иллюстрирующие отличия последовательностей CDR3 VL (SEQ ID NOS 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790 и 800, соответственно, в порядке появления) различных клонов от такой же CDR Par0067. CDR1, CDR2 и каркасные области являются одинаковыми для Par0067 и для всех из указанных клонов (т.е., клоны содержали последовательности под SEQ ID NO: 8, 9 и 807-810).
На фиг. 3 представлены данные по IC50, полученные из анализа активности с использованием клеток с применением различных антител на основе IgG. Указаны типы клеток, которые применяли в каждом из клеточных анализов. N1 = не ингибирует.
На фиг. 4А представлены кривые IC50 для РаВ670129 при противопоставлении трипсину в клетках линии А549 по отношению к агонистическим ответам на антитело при эквивалентных концентрациях. На фиг. 4В представлены кривые IC50 для РаВ670129 при противопоставлении различным активаторам PAR2, представляющим собой протеазы.
На фиг. 5A-5F проиллюстрированы результаты экспериментов, в которых чувствительные нейроны или отличные от нейронов клетки дорсальных корешковых ганглиев (DRG) крысы обрабатывали матриптазой в присутствии или отсутствие РаВ670129 (также называемого в данном документе РаВ670129). Чувствительные нейроны DRG крысы, предварительно обработанные изотипическим контролем (20 нМ), демонстрируют индуцируемое матриптазой временное повышение уровней кальция (5А). Чувствительные нейроны, предварительно обработанные с помощью РаВ670129 IgG1TM (20 нМ), не отвечают на матриптазу (5В); количественная оценка в % нейронов, отвечающих на матриптазу, представлена на (5С). Отличные от нейронов клетки DRG, предварительно обработанные изотипическим контролем (20 нМ), также демонстрируют индуцируемое матриптазой временное повышение уровней кальция (8D), но отличные от нейронов клетки, предварительно обработанные с помощью РаВ670129 IgGlTM (20 нМ), нет (5Е); количественная оценка в % отличных от нейронов клеток, отвечающих на матриптазу, представлена на (5F). На фигурах 5А-5Е раскрывается LIGRLO в виде SEQ ID NO: 832.
На фиг. 6 проиллюстрированы эффекты РаВ670129 (по сравнению с антителами к PAR1 или ворапаксаром) в отношении индуцированной тромбином активации PAR1 в клетках линии А549 человека.
На фиг. 7А изображен график, иллюстрирующий эффект различных средств для лечения (в том числе антитела к PAR2, представляющего собой Par0067) в отношении процентного значения соотношения гиперчувствительности, индуцируемой монойодацетатом (MIA) на ипсилатеральной/контралатеральной стороне у крысы. На фиг. 7В изображен график, иллюстрирующий эффект различных доз РаВ670129 или антитела изотипического контроля в отношении процентного значения соотношения гиперчувствительности, индуцируемой с помощью MIA на ипсилатеральной/контралатеральной стороне у крысы, в/в означает внутривенный, и п/о означает per os (пероральный).
На фиг. 8 изображен график, иллюстрирующий эффект различных доз РаВ670129 или антитела изотипического контроля в отношении процентного значения соотношения гиперчувствительности, индуцируемой с помощью частичного лигирования периферического нерва на ипсилатеральной/контралатеральной стороне у мыши, п/к означает подкожный. N = 9-10 на группу. Данные анализировали с применением двухфакторного ANOVA с временем и лечением в качестве зависимых факторов. Последующую статистическую значимость получали с применением апостериорного критерия Тьюки. При сравнении отдельных индивидов показаны * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001 при сравнении с Опер. + изотипический контроль 10 мг/кг.
Подробное описание
Перед обращением к описанию настоящего изобретения следует учитывать, что настоящее изобретение не ограничивается раскрываемыми конкретными способами и экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Также следует учитывать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена исключительно в целях описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.
Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту среднего уровня квалификации в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.
- 4 044850
Хотя при осуществлении или исследовании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, далее описываются предпочтительные способы и материалы.
А. Определения
Используемая в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения форма единственного числа предусматривает определяемые объекты и во множественном числе, если из контекста явно не следует иное.
Аминокислоты могут обозначаться в данном документе с помощью их общеизвестных трехбуквенных символов или с помощью однобуквенных символов, рекомендованных Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Подобным образом, нуклеотиды могут обозначаться с помощью их общепринятых однобуквенных кодов.
Следует обратить внимание на то, что применяемое в данном документе и/или следует понимать как конкретное раскрытие каждого из данных двух указанных свойств или компонентов с другим или без другого. Например, А и/или В следует рассматривать как конкретное раскрытие каждого из (i) A, (ii) В, (iii) А и В, как если бы каждый из них был изложен в данном документе по отдельности.
Термины полипептид, пептид и белок используются в данном документе взаимозаменяемо в отношении полимера из аминокислотных остатков. Термины применимы к полимерам из аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к полимерам из встречающихся в природе аминокислот и к полимеру из не встречающихся в природе аминокислот.
Выражения активируемый протеазой рецептор 2, PAR2 и т.п., как используется в данном документе, относятся к белку PAR2 человека, имеющему аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 801, или его биологически активным фрагментам.
Термин привязанный лиганд относится к области N-концевой части PAR2, которая связывается с самим рецептором PAR2 и активирует его. В некоторых вариантах осуществления часть PAR2, представляющая собой привязанный лиганд, не становится доступной до тех пор, пока протеаза (например, тромбин или трипсин) не осуществит протеолитическое расщепление части фермента PAR2. В некоторых вариантах осуществления привязанный лиганд соответствует полипептиду, который на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 802.
Как используется в данном документе, антитело, которое связывает PAR2, антитело к PAR2 и т. п. включают антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают связанный с мембраной PAR2 или его фрагменты. В некоторых вариантах осуществления антитело к PAR2 или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с частью PAR2, представляющей собой привязанный лиганд.
В. Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты
Как используется в данном документе, антитела или антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением относятся к любому одному или нескольким из антител и антигенсвязывающих фрагментов, представленных в данном документе. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением содержат тяжелую цепь (VH), содержащую вариабельный домен тяжелой цепи, и легкую цепь (VL), содержащую вариабельный домен легкой цепи. VH-домен содержит три CDR, такие как любые из CDR, представленных в данном документе, и определенные или идентифицированные с помощью систем Chothia, Kabat или IMGT. Эти CDR обычно чередуются с каркасными областями (FR) и вместе составляют VH-домен. Подобным образом, VL содержит три CDR, такие как любые из CDR, представленных в данном документе, и определенные с помощью систем Chothia, Kabat или IMGT. Эти CDR обычно чередуются с каркасными областями (FR) и вместе составляют VL-домен. FR-области, такие как FR1, FR2, FR3 и/или FR4, подобным образом, могут быть определены или идентифицированы с помощью систем Chothia, Kabat или IMGT. По всей настоящей заявке, если указано, что CDR соответствуют системам Chothia, Kabat или IMGT, идентифицированы или определены с помощью этих систем, это означает, что CDR согласуются с этой системой (например, CDR по Chothia, CDR по Kabat или CDR по IMGT). Любой из данных терминов может быть использован для указания того, на какую из CDR, по Chothia, Kabat или IMGT, ссылаются.
Термин антитело, как используется в данном документе, также включает антигенсвязывающие фрагменты молекул, представляющих собой полные антитела. Термины антигенсвязывающая часть антитела, антигенсвязывающий фрагмент антитела и т. п., как используется в данном документе, включают любой встречающийся в природе, получаемый ферментативным способом, синтетический или полученный способами генной инженерии полипептид или гликопротеин, который специфически связывает антиген с образованием комплекса. Антигенсвязывающие фрагменты антитела могут быть получены, например, из молекул, представляющих собой полные антитела, с применением любых подходящих стандартных методик, таких как протеолитическое расщепление, или методик генной инженерии на основе рекомбинации, предусматривающих манипуляцию с ДНК и экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и необязательно константные домены антитела. Такая ДНК известна и/или легко доступна из,
- 5 044850 например, коммерческих источников, библиотек ДНК (в том числе, например, фаговых библиотек антител) или ее можно синтезировать. ДНК можно секвенировать и осуществлять манипуляции с ней с помощью химических способов или с применением методик молекулярной биологии, например, для организации одного или нескольких вариабельных и/или константных доменов в подходящую конфигурацию, или для введения кодонов, создания цистеиновых остатков, модификации, добавления или делеции аминокислот и т.д.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с PAR2 с большей аффинностью при рН 7,4, чем при рН 6,0. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с PAR2 с по меньшей мере в 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз большей аффинностью при рН 7,4, чем при рН 6,0. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), при этом VH содержит i) VH-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3, но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 3 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; ii) VH-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 4 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; и iii) VH-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5, но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 5 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; и при этом VL содержит: i) VL-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8; но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 8 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; ii) VL-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 9 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; и iii) VLCDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10; но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 10 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; при этом аминокислотные замены, делеции или вставки снижают аффинность связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с PAR2 человека в не более чем 1000, 800, 700, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 10 или 5 раз по сравнению с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, содержащим VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 2 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7, при исследовании при рН 7,4 в анализе связывания PAR2. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены, делеции или вставки включают гомологичную замену. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеет не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен, вставок или делеций в CDR VH по сравнению с аминокислотными последовательностями CDR, присутствующими в последовательности под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеет не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен, вставок или делеций в CDR VL по сравнению с аминокислотными последовательностями CDR, присутствующими в последовательности под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен, вставок или делеций представляют собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 замен на гистидин.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), при этом VH содержит: i) VH-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 13 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; ii) VH-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 14 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; и iii) VHCDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15, но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 15 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; и при этом VL содержит i) VL-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18; но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 18 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; ii) VL-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 19 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; и iii) VL-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20; но при этом в последовательности под SEQ ID NO: 20 необязательно присутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; при этом аминокислотные замены, делеций или вставки снижают аффинность связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с PAR2 человека в не более чем 1000, 800, 700, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 10 или 5 раз по сравнению с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, содержащим VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 12 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 17, при исследовании при рН 7,4 в анализе связывания PAR2. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены, делеций или вставки включают гомологичную замену. В
- 6 044850 некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеет не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен, вставок или делеций в CDR VH по сравнению с аминокислотными последовательностями CDR, присутствующими в последовательности под SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеет не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен, вставок или делеций в CDR VL по сравнению с аминокислотными последовательностями CDR, присутствующими в последовательности под SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), при этом VH содержит: i) VH-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, ii) VH-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, iii) VH-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15, и при этом VL содержит: i) VL-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18, ii) VL-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, iii) VL-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 аминокислотных замен, вставок или делеций представляют собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 замен на гистидин.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH); где VH-домен содержит по меньшей мере одну, две или все три CDR (например, определенные с применением любой из систем - Chothia, IMGT или Kabat) с аминокислотной последовательностью, указанной под любым из SEQ ID NOs: 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252,
262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472,
482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692,
702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, и 792. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH); где VH-домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3 (например, определенные с применением любой из систем - Chothia, IMGT или Kabat) с аминокислотной последовательностью, указанной под любым из SEQ ID NOs: 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, и 792. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH); где VH-домен содержит по меньшей мере одну, две или все три CDR (например, определенные с применением любой из систем - Chothia, IMGT или Kabat) с аминокислотной последовательностью, указанной под SEQ ID NO: 2 или 12. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH); при этом VL-домен содержит по меньшей мере одну, две или все три CDR (например, определенные с применением любой из систем - Chothia, IMGT или Kabat) с аминокислотной последовательностью, указанной под любым из SEQ ID NOs: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, и 797. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH); при этом VL-домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3 (например, определенные с применением любой из систем - Chothia, IMGT или Kabat) с аминокислотной последовательностью, указанной под любым из SEQ ID NOs: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787, и 797. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH); при этом VLдомен содержит по меньшей мере одну, две или все три CDR (например, определенные с применением любой из систем - Chothia, IMGT или Kabat) с аминокислотной последовательностью, указанной под SEQ ID NO: 7 или 17. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH); где VH-домен
- 7 044850 содержит CDR1, CDR2 и CDR3 (например, определенные с применением любой из систем - Chothia,
IMGT или Kabat) с аминокислотной последовательностью, указанной под любым из SEQ ID NOs: 2, 12,
22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252,
262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472,
482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692,
702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782, и 792,, и при этом VL-домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3 (например, определенные с применением любой из систем - Chothia, IMGT или Kabat) с аминокислотной последовательностью, указанной под любым из SEQ ID NOs: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107,117,
127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327,337,
347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547,557,
567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767,777,
787, и 797. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH); где VH-домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3 (например, определенные с применением любой из систем - Chothia, IMGT или Kabat) с аминокислотной последовательностью, указанной под SEQ ID NO: 2 или 12, и при этом VLдомен содержит CDR1, CDR2 и CDR3 (например, определенные с применением любой из систем - Chothia, IMGT или Kabat) с аминокислотной последовательностью, указанной под SEQ ID NO: 7 или 17.
После установления нуклеотидных последовательностей, кодирующих такие антитела, с помощью способов на основе рекомбинации можно получить химерные или гуманизированные антитела. Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, вводят в клетки-хозяева и экспрессируют с применением материалов и процедур, общеизвестных из уровня техники и раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления VH кодируется нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под любым из SEQ ID NOs: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 201, 211, 221, 231, 241, 251, 261, 271, 281, 291, 301, 311,
321, 331, 341, 351, 361, 371, 381, 391, 401, 411, 421, 431, 441, 451, 461, 471, 481, 491, 501, 511, 521, 531,
541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 611, 621, 631, 641, 651, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 751,
761, 771, 781, 791 и 833-841. В некоторых вариантах осуществления VH кодируется нуклеиновой кисло- той, содержащей нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 1 или 11. В некоторых вариантах осуществления VL кодируется нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под любым из SEQ ID NOs: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186, 196, 206, 216, 226, 236, 246, 256, 266, 276, 286, 296, 306, 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376, 386, 396, 406, 416, 426, 436, 446, 456, 466, 476, 486, 496, 506, 516, 526, 536, 546, 556, 566, 576, 586, 596, 606, 616, 626, 636, 646, 656, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 756, 766, 776, 786, и 796. В некоторых вариантах осуществления VL кодируется нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 6 или 16.
Настоящее изобретение включает антитела к PAR2 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают PAR2. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой нейтрализующее и/или блокирующее антитело или антигенсвязывающий фрагмент к PAR2. Термин нейтрализующее или блокирующее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как используется в данном документе, относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, связывание которого с PAR2 (i) препятствует взаимодействию между PAR2 и протеазой (например, трипсином, триптазой и/или матриптазой); (ii) ингибирует расщепление PAR2 протеазой; (iii) ингибирует передачу сигнала, опосредованную PAR2, или активацию PAR2; и/или (iv) приводит к ингибированию по меньшей мере одной биологической функции PAR2. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением ингибируют активацию PAR2. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты ингибируют превращение неактивного, нерасщепленного PAR2 в активный, расщепленный PAR2. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты ингибируют воздействие на привязанный лиганд. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты ингибируют активацию рецептора PAR2 его привязанным лигандом. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты ингибируют связывание привязанного лиганда со вторым трансмембранным доменом PAR2. Ингибирование, вызванное нейтрализующим или блокирующим антителом к PAR2, не обязательно должно быть полным, при условии, что его можно выявить с применением соответствующего анализа. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует активность PAR2 по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 9о% или 100% по сравнению с неингибированным активным PAR2. Некоторые примеры анализов для выявления ак- 8 044850 тивности типичного антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PAR2 = описаны в разделе Примеры. Специалисту известны дополнительные виды анализов активности антитела к PAR2.
В конкретных вариантах осуществления любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в данном документе, препятствует взаимодействию между PAR2 и протеазой. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой трипсин. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой нейтрофил-эластазу. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой нейтрофил-протеиназу 3. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой триптазу тучных клеток. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой тканевой фактор/фактор VIIa/фактор Ха. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой связанную с калликреином пептидазу. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой привязанную к мембране сериновую протеазу-1/матриптазу 1. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой цистеиновую протеиназу паразита. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты к PAR2 блокируют взаимодействие между PAR2 и протеазой (например, трипсином) in vitro со значением IC50, составляющим менее чем приблизительно 15 нМ, определенным с помощью анализа связывания, такого как анализы, описанные в разделе Примеры. В определенных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением блокируют взаимодействие между PAR2 и протеазой (например, трипсином) in vitro при рН 7,4 со значением IC50, составляющим менее чем приблизительно 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 400 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 5 пМ, 1 пМ или 0,1 пМ. В определенных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением блокируют взаимодействие между PAR2 и протеазой (например, трипсином) in vitro при рН 6,0 со значением IC50, составляющим более чем приблизительно 300 нМ, 500 нМ, 750 нМ, 1000 нМ, 1100 нМ или 1200 нМ. В определенных вариантах осуществления IC50 антитела к PAR2 или его фрагмента определяют в анализе конкуренции за эпитоп, таком как анализ конкуренции за эпитоп, описанный в разделе Примеры, представленный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления IC50 антитела к PAR2 или его фрагмента определяют в анализе активности с использованием клеток. В некоторых вариантах осуществления в анализе активности с использованием клеток используют клетку человека (например, клетку линии А549), клетку крысы (например, клетку линии KNRK), клетку макака-крабоеда (например, клетку линии CYN0M-K1) или клетку мыши (например, клетку линии LL/2). В некоторых вариантах осуществления для анализа активности с использованием клеток применяют анализ притока кальция (например, анализ притока кальция, описанный в разделе Примеры, представленном в данном документе). В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент ингибирует приток кальция в анализе притока кальция со значением IC50, составляющим менее 1 нМ, 500 пМ, 400 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 1 пМ или 0,1 пМ. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты предупреждают аномальную активацию PAR2 трипсином. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты ингибируют/уменыпают индуцированную воспалением боль.
В конкретных вариантах осуществления любые из антител или антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в данном документе, препятствуют взаимодействию между PAR2 и протеазой (например, трипсином). В некоторых вариантах осуществления антителам предупреждают связывание, расщепление и/или активацию PAR2 протеазой (например, трипсином). В настоящем изобретении предусмотрены антитела к PAR2 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают молекулы PAR2 с высокой аффинностью при физиологическом значении рН вне клетки (т.е. рН 7,4). В некоторых вариантах осуществления антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител связывают PAR2 при рН 7,4 (например, при 25 или 37°С) с KD, составляющей менее чем приблизительно 5 нМ, 1 нМ, 900 пМ, 800 пМ, 700 пМ, 650 пМ, 600 пМ, 500 пМ, 200 пМ, 100 пМ или 50 пМ. В некоторых вариантах осуществления антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител связывают PAR2 при слегка кислом значении рН (таком как рН 6,0) (например, при 25 или 37°С) с KD, составляющей более чем приблизительно 1 нМ, 5 нМ, 10 нМ, 15 нМ, 20 нМ, 25 нМ, 30 нМ, 40 нМ, 50 нМ, 60 нМ, 80 нМ или 100 нМ. В некоторых вариантах осуществления слегка кислым значением рН является значение рН эндосомального компартмента. В некоторых вариантах осуществления KD можно определять согласно имеющимся на данный момент стандартным способам, таким как способы с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR) или микровесов на кристалле кварца (QCM).
Настоящее изобретение также включает антитела к PAR2 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с PAR2 с периодом полудиссоциации (t1/2), составляющим более чем приблизительно 1,5 мин, 1,75 мин, 2 мин, 2,5 мин, 3 мин, 5 мин, 10 мин, 20 мин или 30 мин, определенным с применением анализа, такого как поверхностный плазмонный резонанс, при 25°С или 37°С при рН 7,4. В некоторых вариантах осуществления антитела к PAR2 и их антигенсвязывающие фрагменты связываются с PAR2 с периодом полудиссоциации (t1/2), составляющим менее чем приблизительно 1 мин, 45 с, 30 с, 20 с, 15 с, 13 с, 7 с, 5 с или 3 с, определенным с применением анализа, такого как поверхностный плазмонный резонанс, при 25 или 37°С при слегка кислом значении рН (например, рН 6). В не- 9 044850 которых вариантах осуществления слегка кислым значением рН является значение рН эндосомального компартмента. В некоторых вариантах осуществления KD можно определять согласно имеющимся на данный момент стандартным способам, таким как способы с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR) или микровесов на кристалле кварца (QCM).
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением могут обладать одной или несколькими из вышеупомянутых биологических характеристик или любыми их комбинациями. Другие биологические характеристики антител в соответствии с настоящим изобретением станут очевидны специалисту среднего уровня квалификации в данной области техники из обзора настоящего изобретения, в том числе раздела Примеры, представленного в данном документе.
В отношении полипептидов термин существенное сходство или существенно сходные означает, что две пептидных последовательности при оптимальном выравнивании, таком как выравнивание с помощью программ GAP или BESTFIT с применением штрафов за открытие гэпа по умолчанию, характеризуются по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей, еще более предпочтительно по меньшей мере 98 или 99% идентичностью последовательностей. Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. В некоторых вариантах осуществления любые из антител или антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в данном документе, содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 консервативных аминокислотных замен по сравнению с последовательностью сравнения (например, любой из аминокислотных последовательностей под SEQ ID NO: 2, 7, 12 или 17). Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (R-группу) со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Как правило, консервативная аминокислотная замена не будет существенно изменять функциональные свойства белка. В случаях, если две или более аминокислотных последовательностей отличаются друг от друга консервативными заменами, процентную идентичность последовательностей или степень сходства можно регулировать в сторону более высоких значений, чтобы сделать поправку на консервативный характер замены. Средства для осуществления этой регулировки хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают группу аминокислот с (1) алифатическими боковыми цепями: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; (2) с алифатически-гидроксильными боковыми цепями: серин и треонин; (3) с амидсодержащими боковыми цепями: аспарагин и глутамин; (4) с ароматическими боковыми цепями: фенилаланин, тирозин и триптофан; (5) с основными боковыми цепями: лизин, аргинин и гистидин; (6) с кислотными боковыми цепями: аспартат и глутамат и (7) с серосодержащими боковыми цепями, представляющими собой цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин.
В качестве альтернативы, консервативным замещением является любое изменение, характеризующееся положительным значением в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Умеренно консервативное замещение означает любое изменение, характеризующееся неотрицательным значением в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.
В зависимости от аминокислотных последовательностей константных доменов их тяжелых цепей антитела (иммуноглобулины) можно отнести к разным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть далее разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называют соответственно α, δ, ε, γ и μ. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны и в целом описаны, например в Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4-е изд. (W.B. Saunders, Co., 2000). Антитело может быть частью более крупной слитой молекулы, образованной с помощью ковалентной или нековалентной связи антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами.
Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают следующие: (i) Fabфрагменты; (ii) Fab'-фрагменты; (iii) F(ab')2-фрагменты; (iv) Fd-фрагменты; (v) Fv-фрагменты; (vi) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vii) dAb-фрагменты и (viii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (например, выделенная определяющая комплементарность область (CDR), такая как пептид CDR3), или пептид с ограниченной конформационной свободой FR3-CDR3-FR4. Другие сконструированные молекулы, такие как домен-специфические антитела, однодоменные антитела, антитела верблюдовых, антитела с удаленным доменом, химерные антитела, CDR-привитые антитела, диатела, триатела, тетратела, минитела, нанотела (например, одновалентные нанотела, двухвалентные нанотела и т.д.), аднектины, иммунофармацевтические средства на основе модульного белка малого размера (SMIP) и вариабельные домены IgNAR акулы, также охватываются выражением антигенсвязывающий фрагмент, как используется в данном документе.
- 10 044850
Антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно будет содержать по меньшей мере один вариабельный домен (например, по меньшей мере один из VH или VL). Вариабельный домен может иметь любые размер или аминокислотный состав и, как правило, будет содержать по меньшей мере одну CDR, которая расположена рядом с одной или несколькими каркасными последовательностями или в той же рамке. В антигенсвязывающих фрагментах, содержащих VH-домен, связанный с VL-доменом, VH и VLдомены могут находиться друг относительно друга в любом подходящем расположении. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать димеры VH-VH, VH-VL или VL-VL. В качестве альтернативы, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный VH- или VLдомен.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный по меньшей мере с одним константным доменом. Неограничивающие иллюстративные конфигурации вариабельных и константных доменов, которые могут находиться в антигенсвязывающем фрагменте антитела в соответствии с настоящим изобретением, включают: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (V) VHCH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1 ; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3 и (xiv) VL-CL. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, в том числе в любой из иллюстративных конфигураций, перечисленных выше, вариабельные и константные домены могут быть либо непосредственно связаны друг с другом, либо могут быть связаны с помощью полной или частичной шарнирной или линкерной области. Шарнирная область может состоять по меньшей мере из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или больше) аминокислот, которые обеспечивают образование гибкой или полугибкой связи между соседними вариабельными и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит глицин-сериновый линкер.
Более того, антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) вариабельных и константных доменов в любой из конфигураций, перечисленных выше, связанные друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными VH- или VL-доменами нековалентной связью (например, дисульфидной связью(связями)).
Как и молекулы, представляющие собой полные антитела, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими). Мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно будет содержать по меньшей мере два разных вариабельных домена, где каждый вариабельный домен способен специфически связываться с отдельным антигеном или с другим эпитопом на том же антигене. Любой формат мультиспецифического антитела, в том числе форматы иллюстративных биспецифических антител, раскрытые в данном документе, можно адаптировать для применения в контексте антигенсвязывающего фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением с применением стандартных методик, доступных из уровня техники.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением являются антителами человека. Термин антитело человека, как используется в данном документе, включает антитела, содержащие вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевого типа человека. Антитела человека в соответствии с настоящим изобретением могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевого типа человека (например, мутации, введенные путем случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или путем соматической мутации in vivo), например, в CDR, а в некоторых вариантах осуществления в CDR3. Однако термин антитело человека, как используется в данном документе, не включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, были привиты на каркасные последовательности человека.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением в некоторых вариантах осуществления могут представлять собой рекомбинантные антитела человека. Термин рекомбинантное антитело человека, как используется в данном документе, включает все антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью рекомбинантных средств, такие как антитела, экспрессируемые с применением рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина (дополнительно описано ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека (дополнительно описано ниже), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным по генам иммуноглобулина человека (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью любых других средств, которые предусматривают сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека содержат вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевого типа человека. Однако в определенных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергаются мутагенезу in vitro (или, при использовании животного, трансгенного в
- 11 044850 отношении последовательностей Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи полученными из последовательностей VH и VL человека зародышевого типа и родственными им, в природных условиях не могут находиться в зародышевом репертуаре антител человека in vivo.
Антитела человека могут существовать в двух формах, которые связаны с гетерогенностью шарниров. В одной форме молекула иммуноглобулина содержит стабильную четырехцепочечную конструкцию массой примерно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются вместе за счет межцепочечной дисульфидной связи между тяжелыми цепями. Во второй форме димеры не связываются межцепочечными дисульфидными связями, и образуется молекула массой приблизительно 75-80 кДа, состоящая из ковалентно сопряженных легкой и тяжелой цепей (полуантитело). Эти формы чрезвычайно сложно разделять даже после аффинной очистки.
Частота появления второй формы среди различных интактных изотипов IgG объясняется без ограничения структурными различиями, связанными с изотипом антитела в отношении шарнирной области. Одна аминокислотная замена в шарнирной области шарнира lgG4 человека может существенно уменьшить частоту появления второй формы (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) до уровней, обычно наблюдаемых при использовании шарнира lgG1 человека. В настоящем изобретении рассматриваются антитела, имеющие одну или несколько мутаций в шарнире, СН2- или СН3-области, которые могут быть желательными, например, при получении для увеличения выхода желаемой формы антитела.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой выделенные антитела или выделенные антигенсвязывающие фрагменты. Термин выделенное антитело или выделенный антигенсвязывающий фрагмент, как используется в данном документе, означает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые были идентифицированы, отделены и/или извлечены по меньшей мере из одного компонента их естественного окружения. Например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые были отделены или извлечены по меньшей мере из одного компонента организма, или из ткани или клетки, в которых антитело встречается в природе или продуцируется в природных условиях, представляет собой выделенное антитело или выделенный антигенсвязывающий фрагмент для целей настоящего изобретения. Выделенное антитело также включает антитело in situ в рекомбинантной клетке. Выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые были подвергнуты по меньшей мере одной стадии очистки или выделения. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут по сути не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты к PAR2, раскрытые в данном документе, могут содержать одну или несколько аминокислотных замен, вставок и/или делеций в каркасных и/или CDRобластях вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии, из которых антитела были получены. Настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые получены из любых аминокислотных последовательностей, раскрытых в данном документе, где одна или несколько аминокислот в одной или нескольких каркасных и/или CDR-областях были подвергнуты мутации с заменой на соответствующий(е) остаток(и) последовательности зародышевой линии, из которой антитело или антигенсвязывающий фрагмент были получены, или на соответствующий(е) остаток(и) другой последовательности зародышевой линии человека, или на аминокислоту, представляющую собой консервативную замену соответствующего остатка(ов) зародышевой линии (такие изменения последовательности совместно называются в данном документе мутациями зародышевой линии). Рядовой специалист в данной области техники, исходя из последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, раскрытых в данном документе, может легко получить множество антител и антигенсвязывающих фрагментов, которые содержат одну или несколько отдельных мутаций зародышевой линии или их комбинации. В определенных вариантах осуществления все из остатков каркасных и/или CDR-областей в VH- и/или VL-доменах подвергают обратной мутации с заменой на остатки, находящиеся в исходной последовательности зародышевой линии, из которой антитело было получено. В других вариантах осуществления только некоторые остатки подвергают обратной мутации с заменой на остатки исходной последовательности зародышевой линии, например, только мутантные остатки, находящиеся в составе первых 8 аминокислот FR1 или в составе последних 8 аминокислот FR4, или только мутантные остатки, находящиеся в составе CDR1, CDR2 или CDR3. В других вариантах осуществления один или несколько остатков из каркасных и/или CDR-областей подвергают мутации с заменой на соответствующий(е) остаток(и) другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой изначально получено антитело). В некоторых вариантах осуществления каркасная область 1 VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 803. В некоторых вариантах осуществления каркасная область 2 VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO:
- 12 044850
804. В некоторых вариантах осуществления каркасная область 3 VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 805. В некоторых вариантах осуществления каркасная область 4 VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 806. В некоторых вариантах осуществления каркасная область 1 VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 807. В некоторых вариантах осуществления каркасная область 2 VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 808. В некоторых вариантах осуществления каркасная область 3 VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 809. В некоторых вариантах осуществления каркасная область 4 VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 810. В некоторых вариантах осуществления каркасная область VH содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных замен по сравнению с последовательностью сравнения под любым из SEQ ID NO: 803-806. В некоторых вариантах осуществления каркасная область VL содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных замен по сравнению с последовательностью сравнения под любым из SEQ ID NO: 807-810.
Кроме того, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать любую комбинацию двух или более мутаций зародышевой линии в каркасных и/или CDR-областях, например, при этом некоторые отдельные остатки подвергают мутации с заменой на соответствующий остаток конкретной последовательности зародышевой линии, тогда как некоторые другие остатки, которые отличаются от исходной последовательности зародышевой линии сохраняются или подвергают мутации с заменой на соответствующий остаток другой последовательности зародышевой линии. После получения антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или несколько мутаций зародышевой линии, можно с легкостью исследовать в отношении наличия одного или нескольких желаемых свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в зависимости от конкретного случая), пониженная иммуногенность и т.д. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, полученные таким общим методом, охватываются настоящим изобретением.
Настоящее изобретение также включает антитела к PAR2, содержащие варианты любой из аминокислотных последовательностей VH, VL и/или CDR, раскрытых в данном документе, содержащие одну или несколько консервативных замен. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела к PAR2, имеющие аминокислотные последовательности VH, VL и/или CDR с, например, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 консервативной аминокислотной заменой, относительно любой из аминокислотных последовательностей VH, VL и/или CDR, раскрытых в данном документе.
Термин эпитоп относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует со специфическим сайтом связывания антигена в вариабельной области молекулы, представляющей собой антитело, известным как паратоп. Одни антиген может содержать более одного эпитопа. Таким образом, разные антитела могут связываться с разными участками на антигене и могут оказывать разные биологические эффекты. Эпитопы могут быть либо конформационными, либо линейными. Конформационный эпитоп образуется пространственно сближенными аминокислотами из разных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, образуемый соседними аминокислотными остатками в полипептидной цепи. В некоторых случаях эпитоп может включать фрагменты сахаридов, фосфорильные группы или сульфонильные группы на антигене.
Следует отметить, что любая часть любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с настоящим изобретением может быть подобным образом модифицирована, например, с помощью эпитопной метки, компонента или компонентов, представляющих собой PEG, и т.п. Более того, антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут содержать более одной эпитопной метки, например 2 эпитопные метки, или могут включать 0 эпитопных меток.
Термин значительная степень идентичности или идентичные в значительной степени в отношении нуклеиновой кислоты или ее фрагмента указывает на то, что при оптимальном выравнивании с соответствующими нуклеотидными вставками или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной нитью) наблюдается идентичность нуклеотидных последовательностей по по меньшей мере приблизительно 95% и более предпочтительно по по меньшей мере приблизительно 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидных оснований, определенная с помощью любого хорошо известного алгоритма определения идентичности последовательностей, такого как FASTA, BLAST или Gap, обсуждаемых ниже. Молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся значительной степенью идентичности в отношении молекулы нуклеиновой кислоты сравнения, в некоторых случаях может кодировать полипептид с такой же или в значительной степени сходной аминокислотной последовательностью, что и полипептид, коди
- 13 044850 руемый молекулой нуклеиновой кислоты сравнения.
Сходство последовательностей для полипептидов, которое также называется идентичностью последовательностей, обычно определяют с применением программного обеспечения для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белков сопоставляет сходные последовательности с применением показателей сходства, присвоенных различным заменам, делециям и другим модификациям, в том числе консервативным аминокислотным заменам. Например, программное обеспечение GCG содержит программы, такие как Gap и Bestfit, которые можно использовать с параметрами по умолчанию для установления гомологии последовательностей или идентичности последовательностей близко родственных полипептидов, таких как гомологичные полипептиды из разных видов организмов, или белка дикого типа и его мутеина. См., например, GCG версии 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнивать с применением FASTA с применением параметров по умолчанию или рекомендуемых параметров, программы в GCG версии 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивания и определение процентной идентичности последовательностей для областей наилучшего перекрытия для запрашиваемой последовательности и последовательности поиска (Pearson (2000) выше). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности в соответствии с настоящим изобретением с базой данных, содержащей большое количество последовательностей из разных организмов, является компьютерная программа BLAST, в частности BLASTP или TBLASTN, с применением параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402. В некоторых вариантах осуществления последовательности сравнивают с применением попарного выравнивания последовательностей EMBOSS Needle.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab'. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.
С разработкой моноклональных антител антитела стали полезными и представляющими интерес в качестве фармацевтических средств. Моноклональные антитела получают любым способом, при котором молекулы, представляющие собой антитела, продуцируются непрерывными клеточными линиями в культуре. Примеры подходящих способов получения моноклональных антител включают способы с применением гибридом по Kohler et al. (1975, Nature 256:495-497) и способ с применением гибридомы Вклеток человека (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; и Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., Нью-Йорк), с. 51-63). Во многих случаях гибридомы применяют для создания исходного антитела, происходящего от мыши или грызуна. Это исходное антитело затем может быть модифицировано, например, с применением рекомбинантных методик, с получением вариантов, химерных антител, гуманизированных антител грызунов и т. п. Существуют другие способы получения исходного антитела, и такие способы известны из уровня техники. Однако независимо от способа, используемого для создания исходного антитела или даже варианта этого исходного антитела, любое данное антитело, происходящее от организма, отличного от человека, может быть затем модифицировано для повышения степени его гуманизированности.
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены с применением комбинаторных библиотек для осуществления скрининга в отношении антител с желаемой активностью или активностями. Например, из уровня техники известен ряд способов для создания библиотек на основе фагового дисплея и скрининга таких библиотек на предмет антител, обладающих желаемыми характеристиками связывания. Такие способы описываются, в целом, в Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (под ред. O'Brien et al., Human Press, Тотова, Нью Джерси, 2001). Например, один из способов получения представляющих интерес антител заключается в использовании фаговой библиотеки антител, как описано в Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340 (5): 1073-93.
В принципе, клоны синтетических антител отбирают путем скрининга фаговых библиотек, содержащих фаги, которые демонстрируют различные фрагменты вариабельной области антитела (Fv), слитые с белком оболочки фага. Такие фаговые библиотеки сортируют с помощью аффинной хроматографии против желаемого антигена. Клоны, экспрессирующие Fv фрагменты, способные связываться с желаемым антигеном, адсорбируются на антигене и, таким образом, отделяются от несвязывающих клонов в библиотеке. Затем связывающие клоны элюируют с антигена и могут дополнительно обогащать с помощью дополнительных циклов адсорбции на антигене/ элюирования с антигена. Любое из антител в соответствии с настоящим изобретением может быть получено путем разработки подходящей процедуры скрининга по антигену для отбора представляющего интерес фагового клона с последующим конструированием клона полноразмерного антитела с применением последовательностей Fv из представляющего интерес фагового клона и подходящих последовательностей константной области (Fc), описанных в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunol ogical Interest, пятое издание, NIH Publication 91-3242, Бетесда, Мэриленд (1991), тома 1-3. Может быть целесообразным повысить степень гуманизированности антитела, не являющегося антителом человека, чтобы сделать его более подходящим для применения у субъек
- 14 044850 та, представляющего собой человека, и в клетках, будь то для диагностических, терапевтических или исследовательских целей. Антителам могут быть модифицированы для применения в качестве терапевтических средств. Примеры таких антител (в том числе фрагментов антител) включают химерные, гуманизированные и полностью человеческие антитела. В данной области техники существует множество способов для создания химерных, гуманизированных антител и антител человека. В контексте настоящего изобретения антитело считают гуманизированным, если по меньшей мере одни из VH-домена или VLдомена является гуманизированным. Более того, VH- или VL-домен является гуманизированным, если аминокислотная последовательность по меньшей мере части по меньшей мере одной из FR-областей была модифицирована относительно исходного антитела, не представляющего собой антитело человека (например, антитела мыши), так чтобы аминокислотная последовательность этой части соответствовала части антитела человека или консенсусной последовательности человека. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна, две, три или четыре FR-области VH-домена и/или по меньшей мере одна, две, три или четыре FR-области VL-домена были модифицированы (целиком или частично), так чтобы их последовательность была в большей степени родственной последовательности человека. В свете всего вышеизложенного в определенных вариантах осуществления фрагмент гуманизированного антитела может быть представлен в контексте человеческой или не являющейся человеческой константной области легкой цепи и/или тяжелой цепи (например, содержащей CL и один или несколько из СН1, шарнира, СН2- и/или СН3-доменов). В определенных вариантах осуществления гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением представлены в контексте константных доменов легкой и/или тяжелой цепей человека, если таковые присутствуют. Антитела и связывающие фрагменты антител, в которых объединены любые из гуманизированных вариабельных доменов легкой цепи и/или вариабельных доменов тяжелой цепи, описанных в данном документе, являются иллюстративными антителами и антигенсвязывающими фрагментами в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент является гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент является химерным. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент является антителом или антигенсвязывающим фрагментом человека.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела к PAR2, содержащие Fc-домен, содержащий одну или несколько мутаций, которые усиливают или ослабляют связывание антитела с FcRn-рецептором, например, при кислом значении рН по сравнению с нейтральным значением рН. Например, настоящее изобретение включает антитела к PAR2, содержащие мутацию в СН2- или СН3-области Fc-домена, где мутация(-и) повышает(-ют) аффинность Fc-домена по отношению к FcRn в кислой среде(например, в эндосоме, где значение рН варьирует от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0). Такие мутации могут приводить к повышению значения времени полужизни антитела в сыворотке крови при введении животному. Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают, например модификацию в положении 250 (например, Е или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или Т), 254 (например, S или Т) и 256 (например, S/R/Q/E/D или Т); или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, H/L/R/S/P/Q или K) и/или 434 (например, H/F или Y); или модификацию в положении 250 и/или 428; или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В одном варианте осуществления модификация включает модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S); модификацию 428L, 259I (например, V259I) и 308F (например, V308F); модификацию 433K (например, Н433К) и 434 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254Т и 256Е); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L) и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308Р). В еще одном варианте осуществления модификация включает модификацию 265А (например, D265A) и/или 297А (например, D297A). Все возможные комбинации вышеупомянутых мутаций Fc-домена, а также другие мутации в вариабельных доменах антител, раскрытых в данном документе, охватываются объемом настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат тройную мутацию L234F/L235E/P331S (ТМ). ТМ вызывает значительное уменьшение активности связывания молекул IgG1 человека с C1q, CD64, CD32A и CD16 человека. См., например, Oganesyan et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64:700-704 (2008). Антитела с увеличенными значениями времени полужизни также могут быть получены при помощи модификации аминокислотных остатков, идентифицированных как вовлеченные во взаимодействие между Fc и FcRnрецептором. Например, введение тройной мутации M252Y/S254T/T256E (ATE') в СН2-домен молекул, представляющих собой иммуноглобулин G человека (IgG), вызывает повышение уровня их связывания с неонатальным Fc-рецептором человека (FcRn). См. патент США № 7083784, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат модификации YTE.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела к PAR2, содержащие одну или несколько мутаций в VH- и/или VL-доменах, которые усиливают или ослабляют связывание антитела с PAR2, например, при кислом значении рН по сравнению с нейтральным значением рН. Например, настоящее изобретение включает антитела к PAR2, содержащие мутацию в CDR2- (SEQ ID NO: 4) или CDR3-области (SEQ ID NO: 5) VH-домена и/или CDR3 (SEQ ID NO: 10) VL
- 15 044850 домена, при этом в результате мутации(-ий) происходит замещение одной или нескольких аминокислот на гистидин и снижение аффинности VH- и/или VL-домена по отношению к PAR2 в кислой среде (например, в эндосоме, где рН варьирует от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0). Такие мутации могут приводить к повышению значения времени полужизни антитела в сыворотке крови при введении животному. Неограничивающие примеры таких модификаций VH включают, например, модификацию в положениях аминокислот 4, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16 и 17 CDR2 (SEQ ID NO: 4) и 1, 2, 4, 5 и 7 CDR3 (SEQ ID NO: 5). Неограничивающие примеры таких модификаций VL включают, например, модификацию в положениях 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12 и 14 CDR3 (SEQ ID NO: 10). В еще одном варианте осуществления VH содержит модификации в положениях 5, 8, 12, 16 и 17 CDR2 (SEQ ID NO: 4) и положениях 2 и 3 CDR3 (SEQ ID NO: 5). Все возможные комбинации вышеупомянутых мутаций VH- и VL-доменов, а также другие мутации в Fc-домене, раскрытые в данном документе, охватываются объемом настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), при этом VH содержит i) VH-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3; ii) VH-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, но при этом в любом одном или нескольких из положений аминокислот, соответствующих положениям 1-17 (например, 4, 5 и 7-17) в последовательности под SEQ ID NO: 4, необязательно присутствует гистидин; и iii) VH-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5, но при этом в любом одном или нескольких из положений аминокислот, соответствующих положениям 1-8 в последовательности под SEQ ID NO: 5, необязательно присутствует гистидин; и при этом VL содержит i) VL-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8; ii) VL-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9; и iii) VL-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10; но при этом в любом одном или нескольких из положений аминокислот, соответствующих положениям 1-14 в последовательности под SEQ ID NO: 10, необязательно присутствует гистидин. В некоторых вариантах осуществления VH содержит i) VH-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3, ii) VH-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, iii) VH-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5, и при этом VL содержит i) VL-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, ii) VL-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, iii) VLCDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит гистидин в положении аминокислоты, соответствующем любому одному или нескольким из положений 7, 8, 12, 15, 16 или 17 в последовательности под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит гистидин в положении аминокислоты, соответствующем любому одному или нескольким из положений 2 или 3 в последовательности под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит гистидин в положении аминокислоты, соответствующем любому одному или нескольким из положений 1, 5, 6 или 14 в последовательности под SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления гистидин присутствует в положениях аминокислот, соответствующих положениям 5, 8, 12, 16 и 17 в последовательности под SEQ ID NO: 4; и при этом гистидин присутствует в положениях аминокислот, соответствующих положениям 2 и 3 в последовательности под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 4, 14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284,
294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504,
514, 524, 534, 544, 554, 564, 574, 584, 594, 604, 614, 624, 634, 644, 654, 664, 674, 684, 694, 704, 714, 724,
734, 744, 754, 764, 774, 784, 794, и 811-818. В некоторых вариантах осуществления VH-CDR3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 155, 165, 175, 185, 195, 205, 215, 225, 235, 245, 255, 265, 275, 285, 295, 305, 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375, 385, 395, 405, 415, 425, 435, 445, 455, 465, 475, 485, 495, 505, 515, 525, 535, 545, 555, 565, 575, 585, 595, 605, 615, 625, 635, 645, 655, 665, 675, 685, 695, 705, 715, 725, 735, 745, 755, 765, 775, 785, 795, и 819-820. В некоторых вариантах осуществления VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790 и 800. В некоторых вариантах осуществления VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 14; при этом VH-CDR3 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 15, и при этом VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 811; VH
- 16 044850
CDR3 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 819, и VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 10 или 20. В некоторых вариантах осуществления VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 814; VHCDR3 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 820, и VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 10 или 20. В некоторых вариантах осуществления VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 816; VHCDR3 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 15, и VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 10 или 20. В некоторых вариантах осуществления VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 818; VHCDR3 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 15, и VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 10 или 20. В некоторых вариантах осуществления VH содержит каркасные области, каждая из которых по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 803-806. В некоторых вариантах осуществления VL содержит каркасные области, каждая из которых на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 807-810. В некоторых вариантах осуществления VH содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична любой из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из последовательностей под SEQ ID NOs: 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532, 542, 552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752, 762, 772, 782 и 792. В некоторых вариантах осуществления VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична любой из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из последовательностей под SEQ ID NOs: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317,
327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537,
547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757,
767, 777, 787 и 797. В некоторых вариантах осуществления VH содержит аминокислотную последова- тельность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 12, и VL содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления VH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 821, и VL содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 7 или 17. В некоторых вариантах осуществления VH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 824, и VL содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 7 или 17. В некоторых вариантах осуществления VH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 827, и VL содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 7 или 17. В некоторых вариантах осуществления VH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 831, и VL содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 7 или 17.
Настоящее изобретение также включает антитела к PAR2, содержащие химерную константную область тяжелой цепи (СН), где химерная СН-область содержит сегменты, полученные из СН-областей более чем одного изотипа иммуноглобулина. Например, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать химерную СН-область, содержащую часть СН2-домена или весь СН2-домен, полученный из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, объединенный с частью СН3домена или всем СН3-доменом, полученным из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат химерную СН-область, содержащую химерную шарнирную область. Например, химерный шарнир может содержать аминокислотную последовательность, представляющую собой верхний шарнир (аминокислотные остатки от положения 216 до 227 согласно нумерации по EU), полученную из шарнирной области IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, объединенную с последовательностью, представляющей собой нижний шарнир (аминокислотные остатки от положения 228 до 236 согласно нумерации по EU), полученной из шарнирной области IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека.
Согласно некоторым вариантам осуществления химерная шарнирная область содержит аминокислотные остатки, полученные из верхнего шарнира IgG1 человека или IgG4 человека, и аминокислотные
- 17 044850 остатки, полученные из нижнего шарнира IgG2 человека. Fc антитела, содержащего химерную СНобласть, как описывается в данном документе, в определенных вариантах осуществления может демонстрировать модифицированные эффекторные функции без нежелательного влияния на терапевтические или фармакокинетические свойства антитела (см., например, US 2015-0203591 А1).
Настоящее изобретение включает антитела или антигенсвязывающие фрагменты к PAR2, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами PAR2. Эпитоп, с которым связываются антитела, может состоять из оной непрерывной последовательности из 3 или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) аминокислот PAR2. В качестве альтернативы эпитоп может состоять из множества аминокислот (или аминокислотных последовательностей) PAR2, не образующих непрерывную последовательность.
Различные методики, известные специалистам среднего уровня квалификации в данной области техники, могут быть использованы для установления того, взаимодействует ли антитело с одной или несколькими аминокислотами в полипептиде или белке. Иллюстративные методики включают, например, стандартный анализ с перекрестным блокированием, такой как описанный в Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк), мутационный анализ на основе аланинового сканирования, блот-анализ пептидов (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) и анализ с использованием расщепления на пептиды. Кроме того, можно применять способы, такие как вырезание эпитопа, экстракция эпитопа и химическая модификация антигенов (Tomer, 2000, Protein Science 9:487496). Другим способом, который может быть использован для идентификации в полипептиде аминокислот, с которыми взаимодействует антитело, является водородно-дейтериевый обмен, выявляемый с помощью масс-спектрометрии. В общих чертах, способ на основе водородно-дейтериевого обмена предусматривает мечение представляющего интерес белка с помощью дейтерия с последующим связыванием антитела с меченным дейтерием белком. Затем комплекс белок/антитело переносят в воду, чтобы водородно-дейтериевый обмен произошел во всех остатках, кроме остатков, защищенных антителом (которые остаются меченными дейтерием). После диссоциации антитела белок-мишень подвергают расщеплению протеазой и масс-спектрометрическому анализу, таким образом выявляя меченные дейтерием остатки, которые соответствуют специфическим аминокислотам, с которыми взаимодействует антитело. См., например, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267 (2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.
Настоящее изобретение, кроме того, включает антитела к PAR2 или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с одним и тем же эпитопом, что и любые из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе (например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 12 и 17). Подобным образом, настоящее изобретение также включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты к PAR2, которые конкурируют за связывание с PAR2 с любым из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе (например, антителом или антигенсвязывающим фрагментом, содержащим аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 12 и 17). Специалист может легко установить, связывается ли антитело с тем же эпитопом, что и антитело сравнения к PAR2, или конкурирует за связывание с ним, с применением стандартных способов, известных из уровня техники и иллюстрируемых в данном документе. Например, для установления того, связывается ли исследуемое антитело с тем же эпитопом, что и антитело сравнения к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивают связывание антитела сравнения с белком PAR2. Затем оценивают способность исследуемого антитела связываться с молекулой PAR2. Если исследуемое антитело способно связываться с PAR2 после насыщения связывания антителом сравнения к PAR2, можно сделать вывод, что исследуемое антитело связывается с эпитопом, отличным от того, с которым связывается антитело сравнения к PAR2. С другой стороны, если исследуемое антитело не способно связываться с молекулой PAR2 после насыщения связывания антителом сравнения к PAR2, тогда исследуемое антитело может связываться с тем же эпитопом, что и эпитоп, с которым связывается антитело сравнения к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением. Затем можно провести дополнительные стандартные эксперименты (например, анализ с внесением мутаций в пептид и анализ связывания), чтобы подтвердить, действительно ли наблюдаемое отсутствие связывания исследуемого антитела обусловлено связыванием с тем же эпитопом, с которым связывается антитело сравнения, или за наблюдаемое отсутствие связывания отвечает стерическое блокирование (или другое явление). Эксперименты такого рода могут быть выполнены с применением ELISA, RIA, Biacore, проточной цитометрии или любого другого количественного или качественного анализа связывания антител, доступного из уровня техники. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, два антитела связываются с одним и тем же эпитопом (или перекрывающимися эпитопами), если, например, 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный избыток одного антитела ингибирует связывание другого на по меньшей мере 50%, но предпочтительно 75%, 90% или даже 99%, в случае определения в анализе конкурентного связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502).
В качестве альтернативы считается, что два антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если по сути все аминокислотные мутации в антигене, которые обеспечивают уменьшение или предотвращение связывания одного антитела, обеспечивают уменьшение или предотвращение связывания другого.
- 18 044850
Считается, что два антитела имеют перекрывающиеся эпитопы, если только некоторое подмножество аминокислотных мутаций, которые обеспечивают уменьшение или предотвращение связывания одного антитела, обеспечивают уменьшение или предотвращение связывания другого.
Чтобы установить, конкурирует ли антитело за связывание (или перекрестно конкурирует за связывание) с антителом сравнения к PAR2, описанный выше метод связывания выполняются в двух направлениях. В случае первого направления обеспечивают связывание антитела сравнения с белком PAR2 с обеспечением условий для насыщения с последующей оценкой связывания исследуемого антитела с молекулой PAR2. В случае второго направления обеспечивают связывание исследуемого антитела с молекулой PAR2 с обеспечением условий для насыщения с последующей оценкой связывания антитела сравнения с молекулой PAR2. Если в случае обоих направлений только первое (насыщающее) антитело способно связываться с молекулой PAR2, тогда делают вывод о том, что исследуемое антитело и антитело сравнения конкурируют за связывание с PAR2. Как будет понятно специалисту среднего уровня квалификации в данной области техники, антитело, которое конкурирует за связывание с антителом сравнения, необязательно может связываться с тем же эпитопом, что и антитело сравнения, но может стерически блокировать связывание антитела сравнения путем связывания перекрывающегося или соседнего эпитопа.
Способы получения моноклональных антител, в том числе полностью человеческих моноклональных антител, известны из уровня техники. Любые такие известные способы можно применять в контексте настоящего изобретения для получения антител человека, которые специфически связываются с PAR2 человека.
При применении технологии VELOCIMMUNE™, например, или любого другого известного способа получения полностью человеческих моноклональных антител сначала выделяют высокоаффинные химерные антитела к PAR2, содержащие вариабельную область человека и константную область мыши. Как в экспериментальном разделе ниже, антитела характеризуют и отбирают по желаемым характеристикам, в том числе по аффинности, селективности, эпитопу и т. д. При необходимости константные области мыши заменяют желаемой константной областью человека, например, из lgG1 или lgG4 дикого типа или модифицированного, с получением полностью человеческого антитела к PAR2. В то время как выбранная константная область может варьировать в зависимости от конкретного применения, такие характеристики, как высокоаффинное связывание антигена и специфичность в отношении мишени, свойственны вариабельной области. В некоторых случаях полностью человеческие антитела к PAR2 выделяют непосредственно из антигенпозитивных В-клеток.
Антитела и фрагменты антител к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением охватывают белки, имеющие аминокислотные последовательности, которые могут отличаться от последовательностей описанных антител, но которые сохраняют способность связывать PAR2 (например, SEQ ID NO: 801), или, более конкретно, в некоторых вариантах осуществления привязанный лиганд PAR2 (например, SEQ ID NO: 802). Такие вариантные антитела и фрагменты антител содержат одно или несколько из добавлений, делеций или замен аминокислот по сравнению с исходной последовательностью, но проявляют биологическую активность, которая по сути эквивалентна активности описанных антител. Подобным образом, последовательности ДНК, кодирующие антитело к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением, охватывают последовательности, которые содержат одно или несколько из добавлений, делеций или замен нуклеотидов по сравнению с раскрытыми последовательностями, но которые кодируют антитело или фрагмент антитела к PAR2, которое является по сути биоэквивалентным антителу или фрагменту антитела к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением. Примеры таких вариантных аминокислотных последовательностей и последовательностей ДНК обсуждаются выше.
Два антитела или антигенсвязывающих фрагмента считают биоэквивалентными, если, например, они являются фармацевтическими эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, чья скорость и степень абсорбции не демонстрируют значительного различия при введении в одной и той же молярной дозе в сходных экспериментальных условиях в виде либо одной дозы, либо нескольких доз. Некоторые антитела или антигенсвязывающие фрагменты будут считаться эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, если они эквивалентны по степени их абсорбции, но не по скорости их абсорбции, и все же могут рассматриваться как биоэквивалентные, поскольку такие различия в скорости абсорбции являются преднамеренными и отражаются в маркировке, не являются существенными для достижения эффективных концентраций лекарственного средства в организме, например, при длительном применении, и считаются с медицинской точки зрения незначительными для конкретного исследуемого лекарственного препарата.
В некоторых вариантах осуществления два антитела или антигенсвязывающих фрагмента являются биоэквивалентными, если нет клинически значимых различий в их безопасности, чистоте и активности.
В некоторых вариантах осуществления два антитела или антигенсвязывающих фрагмента являются биоэквивалентными, если пациента можно переключать один или несколько раз между продуктом сравнения и биологическим продуктом без ожидаемого повышения риска возникновения побочных эффектов, включающих клинически значимое изменение иммуногенности, или снижения эффективности по сравнению с продолжением терапии без такого переключения.
- 19 044850
В некоторых вариантах осуществления два антитела или антигенсвязывающих фрагмента являются биоэквивалентными, если они оба действуют по общему механизму или механизмам действия для условия или условий применения в той степени, в которой такие механизмы известны.
Биоэквивалентность может быть продемонстрирована способами in vivo и in vitro. Определение биоэквивалентности включает, например, (а) исследование in vivo на людях или других млекопитающих, при котором концентрацию антитела или его метаболитов определяют в крови, плазме крови, сыворотке крови или другой биологической жидкости в виде функции времени; (b) исследование in vitro, которое было приведен в соответствие с данными о биодоступности для человека in vivo и является обоснованно прогностическим в отношении таковых; (с) исследование in vivo на людях или других млекопитающих, при котором соответствующий немедленный фармакологический эффект антитела (или его мишени) определяют в виде функции времени; и (d) хорошо контролируемое клиническое испытание, в котором устанавливают безопасность, эффективность, или биодоступность, или биоэквивалентность антитела.
Биоэквивалентные варианты антител к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением могут быть сконструированы, например, путем осуществления различных замен остатков или последовательностей или удаления концевых или внутренних остатков или последовательностей, не являющихся необходимыми для биологической активности. Например, остатки цистеина, несущественные для биологической активности, могут быть удалены или заменены на другие аминокислоты для предотвращения образования ненужных или некорректных внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации. В других контекстах биоэквивалентные антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать варианты антитела к PAR2, содержащие аминокислотные изменения, которые обеспечивают модификацию характеристик гликозилирования антител или антигенсвязывающих фрагментов, например, мутации, которые обеспечивают предотвращение или устранение гликозилирования.
В настоящем изобретеним согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрены антитела или антигенсвязывающие фрагменты к PAR2, которые связываются с PAR2 человека, но не с PAR2 других видов. Настоящее изобретение также включает антитела к PAR2, которые связываются с PAR2 человека и с PAR2 от одного или нескольких отличных от человека видов. Например, антитела к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением могут связываться с PAR2 человека и могут связываться или не связываться, в зависимости от конкретного случая, с одним или несколькими из PAR2 мыши, крысы, морской свинки, хомяка, песчанки, свиньи, кошки, собаки, кролика, козы, овцы, коровы, лошади, верблюда, макаки-крабоеда, мармозетки, резуса или шимпанзе. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты связываются с PAR2 в клетках линии А549 человека, клетках линии KNRK крысы, клетках линии CYNOM-K1 макаки-крабоеда или клетках линии LL/2 мыши.
Настоящее изобретение охватывает моноклональные антитела к PAR2, конъюгированные с терапевтическим компонентом (иммуноконъюгат), таким как цитотоксин, химиотерапевтическое средство, иммуносупрессант или радиоизотоп. Примеры подходящих цитотоксических средств и химиотерапевтических средств для образования иммуноконъюгатов известны из уровня техники (см., например, WO 05/103081).
В некоторых вариантах осуществления антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть моноспецифическими, биспецифическими или мультиспецифическими. Мультиспецифические антитела могут быть специфическими в отношении разных эпитопов одного полипептида-мишени или могут содержать антигенсвязывающие домены, специфические в отношении более чем одного полипептида-мишени. См., например, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением могут быть соединены с другой функциональной молекулой, например другому пептиду или белку, или совместно экспрессироваться с ней. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть функционально соединены (например, с помощью химического сочетания, генетического слияния, нековалентной связи или иным образом) с одним или несколькими другими молекулярными структурами, такими как другое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, с получением биспецифического или мультиспецифического антитела со второй специфичностью связывания. Например, настоящее изобретение включает биспецифические антитела, у которых одно плечо иммуноглобулина является специфическим в отношении PAR2 человека или его фрагмента, а другое плечо иммуноглобулина является специфическим в отношении второй терапевтической мишени или конъюгировано с терапевтическим компонентом.
Иллюстративный формат биспецифического антитела или антигенсвязывающего фрагмента, который может использоваться в контексте настоящего изобретения, предусматривает применение первого СН3 домена иммуноглобулина (Ig) и второго СН3 домена Ig, где первый и второй СН3 домены Ig отличаются друг от друга по меньшей мере одной аминокислотой, и где отличие по меньшей мере по одной аминокислоте снижает связывание биспецифического антитела с белком А по сравнению с биспецифическим антителом без отличия по аминокислоте. В одном варианте осуществления первый СН3 домен Ig связывает белок А, а второй СН3 домен Ig содержит мутацию, которая снижает или подавляет связывание белка А, такую как модификация H95R (при нумерации экзонов по IMGT; H435R при нумерации по
- 20 044850
EU). Второй СН3 может дополнительно содержать модификацию Y96F (по IMGT; Y436F по EU). Дополнительные модификации, которые могут находиться во втором СН3, включают следующие: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M и V82I (по IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I по EU) в случае антител IgG1; N44S, K52N и V82I (IMGT; N384S, K392N и V422I по EU) в случае антител IgG2; и Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V82I (по IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I по EU) в случае антител IgG4. Вариации в биспецифическом формате антитела, описанные выше, предусмотрены объемом настоящего изобретения.
Другие иллюстративные биспецифические форматы, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, включают без ограничения, например, биспецифические форматы на основе scFv или диатела, слитые структуры типа IgG-scFv, двойной вариабельный домен (DVD)-Ig, квадрогибридому, структуры с соединением по типу выступы-во-впадины, структуры с общей легкой цепью (например, общей легкой цепью с соединением по типу выступы-во-впадины и т.д.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, структуры с лейциновой застежкой, Duobody, IgG1/IgG2, Fab двойного действия (DAF)lgG и Mab<2>биспецифические форматы (обзор вышеупомянутых форматов см., например, в Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11 и ссылках, цитируемых там). Биспецифические антитела или антигенсвязывающие фрагменты также могут быть сконструированы с применением конъюгации пептид/нуклеиновая кислота, например, такой, при которой используются невстречающиеся в природе аминокислоты с ортогональной химической реакционной способностью для создания сайт-специфических конъюгатов антителоолигонуклеотид, которые затем самостоятельно собираются в мультимерные комплексы с определенной композицией, валентностью и геометрией (см., например, Kazane et al., J. Am. С em. Soc. [Epub: 4 декабря, 2012]).
С. Нуклеиновые кислоты и системы экспрессии
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена нуклеиновая кислота, способная экспрессировать любые из антител или антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в данном документе. Нуклеиновые кислоты могут быть однонитевыми или двухнитевыми молекулами ДНК или РНК. В следующих вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты антитела или антигенсвязывающего фрагмента могут быть выделенными, рекомбинантными и/или слитыми с гетерологичной нуклеотидной последовательностью или в библиотеке ДНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под любым из SEQ ID NOs: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 201, 211, 221, 231, 241, 251, 261, 271, 281, 291, 301, 311, 321, 331, 341, 351, 361, 371, 381, 391, 401, 411, 421, 431, 441, 451, 461, 471, 481, 491, 501, 511, 521, 531, 541, 551, 561, 571, 581, 591, 601, 611, 621, 631, 641, 651, 661, 671, 681, 691, 701, 711, 721, 731, 741, 751, 761, 771, 781 и/или 791. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под любым из SEQ ID NOs: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116,
126, 136, 146, 156, 166, 176, 186, 196, 206, 216, 226, 236, 246, 256, 266, 276, 286, 296, 306, 316, 326,336,
346, 356, 366, 376, 386, 396, 406, 416, 426, 436, 446, 456, 466, 476, 486, 496, 506, 516, 526, 536, 546,556,
566, 576, 586, 596, 606, 616, 626, 636, 646, 656, 666, 676, 686, 696, 706, 716, 726, 736, 746, 756, 766,776,
786, и/или 796. В конкретных вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 1, 6, 11 и/или 16.
В определенных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, также содержат нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются при условиях высокой жесткости с полинуклеотидом, кодирующим любую из вышеупомянутой нуклеотидной последовательности антител или антигенсвязывающих фрагментов, или комплементарными ему последовательностями. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты гибридизуются при условиях высокой жесткости с полинуклеотидом, кодирующим аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под любым из SEQ ID NOs: 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102,
112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312,322,
332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 532,542,
552, 562, 572, 582, 592, 602, 612, 622, 632, 642, 652, 662, 672, 682, 692, 702, 712, 722, 732, 742, 752,762,
772, 782 и 792. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты гибридизуются при условиях высокой жесткости с полинуклеотидом, кодирующим аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности под любым из SEQ ID NOs: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 527, 537, 547, 557, 567, 577, 587, 597, 607, 617, 627, 637, 647, 657, 667, 677, 687, 697, 707, 717, 727, 737, 747, 757, 767, 777, 787 и 797. Специалисту среднего уровня квалификации в данной области техники будет понятно, что условия соот
- 21 044850 ветствующей жесткости, которые обеспечивают гибридизацию ДНК, могут варьировать. Например, гибридизацию можно выполнять при применении 6,0 х хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) при приблизительно 45°С с последующим промыванием с помощью 2,0 х SSC при 50°С. Например, концентрация соли на стадии промывания может быть выбрана из диапазона концентраций от соответствующих условиям низкой жесткости, приблизительно 2,0 х SSC при 50°С, до соответствующих условиям высокой жесткости, приблизительно 0,2 х SSC при 50°С. Кроме того, температура на стадии промывания может быть повышена от соответствующей условиям низкой жесткости, комнатной температуры, составляющей приблизительно 22°С, до соответствующей условиям высокой жесткости, приблизительно 65°С. И значения температуры, и содержания соли могут варьировать, или значение температуры, или концентрации соли могут быть постоянными, тогда как другие переменные изменяются. В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрены нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются при условиях низкой жесткости, соответствующих применению 6 х SSC при комнатной температуре с последующим промыванием с применением 2 х SSC при комнатной температуре.
Выделенные нуклеиновые кислоты, которые отличаются от нуклеиновых кислот, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, из-за вырожденности генетического кода, также находящихся в пределах объема настоящего изобретения. Например, многие аминокислоты обозначаются более чем одним триплетом. Кодоны, которые определяют ту же аминокислоту, или синонимы (например, CAU и САС являются синонимами гистидина) могут привести к возникновению молчащих мутаций, которые не влияют на аминокислотную последовательность белка. Однако ожидается, что в клетках млекопитающих будут возникать случаи полиморфизма последовательностей ДНК, которые будут приводить к изменениям в аминокислотных последовательностях исследуемых белков. Специалисту в данной области будет понятно, что такие вариации одного или нескольких нуклеотидов (приблизительно до 35% нуклеотидов) в нуклеиновых кислотах, кодирующих конкретный белок, могут существовать между индивидами данного вида из-за естественных вариаций аллелей. Все без исключения такие варианты нуклеотидов и возникающие в результате случаи полиморфизма аминокислот находятся в пределах объема настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен вектор, содержащий любую из нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена клетка-хозяин, содержащая любой из векторов, раскрытых в данном документе.
Независимо от того, является ли антитело в соответствии с настоящим изобретением полноразмерным антителом или антигенсвязывающим фрагментом, антитела и антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением можно экспрессировать в линиях клеток с помощью метода рекомбинации. В таких вариантах осуществления последовательности, кодирующие конкретные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, можно использовать для трансформации подходящей клеткихозяина, такой как клетка-хозяин млекопитающего или клетка-хозяин дрожжей. Согласно этим вариантам осуществления трансформация может быть достигнута с применением любого известного способа введения полинуклеотидов в клетку-хозяина, включая, например, упаковку полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор) и трансдукцию клетки-хозяина вирусом (или вектором), или с помощью процедур трансфекции, известных из уровня техники. Как правило, используемая процедура трансформации может зависеть от хозяина, подлежащего трансформации. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны из уровня техники и включают без ограничения декстран-опосредованную трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, полибрен-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомах и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи (всю или часть), вариабельной области тяжелой цепи в соответствии с настоящим изобретением, константной области легкой цепи, или вариабельную область легкой цепи в соответствии с настоящим изобретением, вставляют в соответствующий вектор экспрессии с применением стандартных методик лигирования. В предпочтительном варианте осуществления константная область тяжелой или легкой цепей присоединяется к С-концу соответствующей вариабельной области и лигируется в вектор экспрессии. Вектор обычно выбирают так, чтобы он был функциональным в конкретной используемой клетке-хозяине (т.е. вектор является совместимым с механизмом клетки-хозяина, так что может происходить амплификация гена и/или экспрессия гена). Обзор векторов экспрессии см. в Goeddel (ред.), 1990, Meth. Enzymol. том 185, Academic Press. Нью-Йорк. В контексте экспрессии антител как тяжелая, так и легкая цепи могут экспрессироваться из одного и того же вектора (например, из одного и того же или разных промоторов, присутствующих в одном и том же векторе), или тяжелая и легкая цепи могут экспрессироваться из разных векторов. В определенных вариантах осуществления тяжелая и легкая цепи экспрессируются из разных векторов, которые трансфицируются в одну и ту же клетку-хозяина и совместно экспрессируются. Независимо от того, экспрессируются литяжелая и легкая цепи в одной и той же клетке-хозяине из одно- 22 044850 го и того же вектора или из разных векторов, цепи могут затем связываться с образованием антитела (или фрагмента антитела, в зависимости от частей экспрессируемой тяжелой и легкой цепей).
Обычно векторы экспрессии, используемые в любой из клеток-хозяев, будут содержать последовательности для поддержания плазмиды и для клонирования и экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности, в совокупности называемые фланкирующими последовательностями, в определенных вариантах осуществления обычно будут включать одну или несколько следующих нуклеотидных последовательностей: промотор, одну или несколько энхансерных последовательностей, точку начала репликации, последовательность терминации транскрипции, полную последовательность интрона, содержащую донорный и акцепторный сайт сплайсинга, последовательность, кодирующую лидерную последовательность для секреции полипептида, сайт связывания с рибосомой, последовательность полиаденилирования, полилинкерную область для вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, подлежащий экспрессии, и элемент, представляющий собой селективный маркер. Эти части векторов хорошо известны, и существует множество общедоступных векторов, которые можно выбирать и использовать для экспрессии белков. Можно легко выбрать векторы на основании желаемой клетки-хозяина и желаемого применения.
Точка начала репликации обычно является частью этих векторов экспрессии прокариот, приобретаемых на коммерческой основе, и точка начала способствует амплификации вектора в клетке-хозяине. Если выбранный вектор не содержит сайт, представляющий собой точку начала репликации, его можно синтезировать химическим способом на основе известной последовательности и лигировать в вектор. Например, точка начала репликации из плазмиды pBR322 (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс) подходит для большинства грамотрицательных бактерий, а точки начала различных вирусов (например, SV40, полиомы, аденовируса, вируса везикулярного стоматита (VSV) или папилломавирусов, таких как HPV или BPV) применимы для векторов клонирования в клетках млекопитающих. Как правило, компонент, представляющий собой точку начала репликации, не требуется для векторов экспрессии в млекопитающих (например,точка начала SV40 часто используется только потому, что она также содержит ранний промотор вируса).
Векторы экспрессии и клонирования в соответствии с настоящим изобретением обычно будут содержать промотор, который распознается организмом-хозяином и функционально связан с молекулой, кодирующей тяжелую и/или легкую цепи. Промоторы представляют собой нетранскрибируемые последовательности, расположенные выше (т.е. в направлении 5') по отношению к стартовому кодону структурного гена (как правило, в пределах от приблизительно 100 до 1000 п.н.), которые контролируют транскрипцию структурного гена. Промоторы обычно группируются в один из двух классов: индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибельные промоторы инициируют повышение уровней транскрипции ДНК, находящейся под их контролем, в ответ на некоторые изменения условий культивирования, таких как наличие или отсутствие питательного вещества или изменение температуры. С другой стороны, конститутивные промоторы инициируют непрерывное продуцирование генного продукта; то есть, контроль над экспрессией генов является незначительным или вообще отсутствует. Хорошо известно большое количество промоторов, распознаваемых различными потенциальными клеткамихозяевами. Подходящий промотор функционально связывается с ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь, входящие в состав антитела или антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с настоящим изобретением. В определенных вариантах осуществления один и тот же промотор используется как для тяжелой, так и для легкой цепи. В других вариантах осуществления для каждой используются разные промоторы (присутствующие в одном и том же или разных векторах).
Подходящие промоторы для использования с хозяевами, представляющими собой дрожжи, также хорошо известны из уровня техники. Энхансеры дрожжей преимущественно используются с промоторами дрожжей. Подходящие промоторы для использования с клетками-хозяевами млекопитающих хорошо известны и включают без ограничения промоторы, полученные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы кур, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирусы, вирус гепатита В и наиболее предпочтительно вирус обезьян 40 (SV40). Другие подходящие промоторы млекопитающих включают гетерологичные промоторы млекопитающих, например, промоторы теплового шока и промотор актина.
Дополнительные промоторы, которые могут представлять интерес, включают без ограничения область раннего промотора SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-10); промотор CMV; промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-97); промотор тимидинкиназы герпеса (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. США 78:1444-45); регуляторные последовательности гена металлотионина (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); векторы экспрессии прокариот, такие как промотор бета-лактамазы (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. США 75:3727-31) или промотор tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. США 80:21-25). Также представляют интерес следующие области транскрипционного контроля животных, которые проявляют тканевую специфичность и были использованы у трансгенных животных: контрольная область гена эластазы I, которая активна в ацинозных клетках поджелудочной железы (Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology
- 23 044850
7:425-515); область контроля гена инсулина, которая активна в бета-клетках поджелудочной железы (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); область контроля гена иммуноглобулина, которая активна в лимфоидных клетках (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-44); область контроля вируса опухоли молочной железы мыши, которая активна в клетках яичка, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al., 1986, Cell 45:48595); область контроля гена альбумина, которая активна в печени (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-76); область контроля гена альфа-фетопротеина, которая активна в печени (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); область контроля гена альфа-1антитрипсина, которая активна в печени (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-71); область контроля гена бета-глобина, которая активна в миелоидных клетках (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); область контроля гена основного белка миелина, которая активна в олигодендроцитах в головном мозге (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); область контроля гена легкой цепи 2 миозина-, которая активна в скелетных мышцах (Sani, 1985, Nature 314: 283-86); и область контроля гена гонадотропного рилизинг-гормона, которая активна в гипоталамусе (Mason et al., 1986, Science 234: 137278).
Вектор также может содержать энхансерную последовательность для повышения уровня транскрипции ДНК, кодирующей легкую цепь или тяжелую цепь.
Векторы экспрессии в соответствии с настоящим изобретением могут быть сконструированы из исходного вектора, такого как коммерчески доступный вектор. Такие векторы могут содержать или могут не содержать все из необходимых фланкирующих последовательностей. Если одна или несколько из фланкирующих последовательностей, описанных в данном документе, еще не присутствуют в векторе, они могут быть получены отдельно и лигированы в вектор. Способы, используемые для получения каждой из фланкирующих последовательностей, хорошо известны специалисту в данной области.
После того как вектор был сконструирован и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь или тяжелую цепь или легкую цепь и тяжелую цепь, входящие в состав антитела или антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с настоящим изобретением, была вставлена в соответствующий сайт вектора, готовый вектор может быть вставлен в подходящую клетку-хозяина для амплификации и/или экспрессии полипептида. Трансформация вектора экспрессии в выбранную клетку-хозяина может быть осуществлена хорошо известными способами, включающими трансфекцию, инфекцию, совместное осаждение фосфатом кальция, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, или другие известные методики. Выбранный способ будет частично зависеть от типа используемой клетки-хозяина. Эти способы и другие подходящие способы хорошо известны специалисту.
Клетка-хозяин при культивировании в соответствующих условиях синтезирует антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением, которые впоследствии могут быть собраны из культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует их в среду) или непосредственно из клетки-хозяина, продуцирующей их (если она их не секретирует). Выбор подходящей клетки-хозяина будет зависеть от различных факторов, таких как желаемые уровни экспрессии, модификации полипептида, которые являются желательными или необходимыми для активности (такие как гликозилирование или фосфорилирование) и легкость укладки в биологически активную молекулу.
Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве клеток-хозяев для экспрессии, хорошо известны из уровня техники и включают без ограничения многие иммортализованные линии клеток, доступные из Американской коллекции типовых культур (АТСС), в том числе без ограничения клетки яичника китайского хомячка (линии СНО), клетки линии HeLa, клетки почки детеныша хомяка (линии ВНК), клетки почки обезьяны (линии COS), клетки гепатоклеточной карциномы человека (например, линии Hep G2) и ряд других клеточных линий. В другом варианте осуществления клеточную линию можно выбрать из линии В-клеток, которая не производит свое собственное антитело, но обладает способностью вырабатывать и секретировать гетерологичное антитело (например, линии клеток миеломы мыши NS0 и SP2/0). В других вариантах осуществления используют клетку, отличную от клетки млекопитающего, такую как линия клеток дрожжей (например, Pichia).
В определенных вариантах осуществления клеточная линия экспрессирует антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением стабильно. В других вариантах осуществления клетки экспрессируют антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением временно.
D. Терапевтический состав и введение
В настоящем изобретении предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие антитела к PAR2 или их антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением. Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением составляют с подходящими носителями, вспомогательными веществами и другими средствами, которые обеспечивают улучшенные перенос, доставку, переносимость и т.п. Множество соответствующих составов можно найти в известном всем химикам-фармацевтам справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Истон, Пенсильвания. Такие составы включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды,
- 24 044850 содержащие липид (катионный или анионный) везикулы (такие как LIPOFECTIN™, Life Technologies,
Карлсбад, Калифорния), безводные абсорбционные пасты, эмульсии масло-в-воде и вода-в-масле, эмульсии на основе карбовакс (полиэтиленгликоли с разными молекулярными массами), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. См. также Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
Доза антитела, вводимого пациенту, может варьировать в зависимости от возраста и размера пациента, целевого заболевания, состояний, пути введения и т.п.
Предпочтительную дозу обычно рассчитывают по весу тела или площади поверхности тела. В зависимости от тяжести состояния частоту и длительность лечения можно регулировать. Эффективные дозировки и схемы для введения антител или антигенсвязывающих фрагментов к PAR2 могут быть установлены эмпирически; например, за прогрессом пациента можно наблюдать путем периодической оценки и соответственно регулировать дозу. Более того, межвидовое масштабирование дозировок может быть выполнено с применением хорошо известных из уровня техники способов (например, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
Различные системы доставки известны и могут применяться для введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, например, инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, опосредованный рецептором эндоцитоз (см., например, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Способы введения включают без ограничения внутрикожный, интратекальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Композицию можно вводить любым удобным путем, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем всасывания через эпителиальные или кожно-слизистые покровы (например, слизистую ротовой полости, слизистую прямой кишки и кишечника и т.д.), и их можно вводить совместно с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным.
В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты находят применение в лечении состояний и нарушений, связанных с центральной нервной системой и, в частности, связанных с головным мозгом. При том, что при введении макромолекулы, такой как антитело или антигенсвязывающий фрагмент, в головной мозг субъекта необходимо учитывать различные факторы, т.е. способность антитела или антигенсвязывающего фрагмента преодолевать гематоэнцефалический барьер (ВВВ), квалифицированному специалисту известны способы введения таких макромолекул в головной мозг. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент ковалентно модифицированы с помощью одного или нескольких катионных полиаминов, таких как гексаметилендиамин или тетраметилендиамин, для повышения вероятности того, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент пройдет через ВВВ. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или фрагмент нацеливается на PAR2, а также нацеливается на рецептор, который облегчает транспорт через ВВВ (например, рецептор трансферрина, рецептор инсулина и ТМЕМ30А). В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент конъюгирован со средством, которое нацеливается на рецептор, который облегчает транспорт через ВВВ (например, рецептор трансферрина, рецептор инсулина и ТМЕМ30А). В некоторых вариантах осуществления ВВВ временно нарушается до или во время введения антитела или фрагмента. В некоторых вариантах осуществления ВВВ временно нарушают с помощью ультразвука, облучения, биохимической обработки (например, с помощью агониста рецептора KCa, такого как NS-1619) или внутриартериальной инфузии концентрированных гиперосмотических растворов.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть доставлена подкожно или внутривенно с помощью стандартной иглы и шприца. Кроме того, что касается подкожной доставки, устройство для доставки в виде шприца-ручки находит широкое применение в доставке фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением. Такое устройство доставки в виде шприца-ручки может быть многоразовым или одноразовым. В многоразовом устройстве для доставки в виде шприца-ручки обычно используется сменный картридж, который содержит фармацевтическую композицию. После того, как вся фармацевтическая композиция в картридже введена, и картридж опустел, пустой картридж можно легко выбросить и заменить новым картриджем, который содержит фармацевтическую композицию. Устройство доставки в виде шприца-ручки затем может быть повторно использовано. В одноразовом устройстве для доставки в виде шприца-ручки нет сменного картриджа. Вместо этого, одноразовое устройство для доставки в виде шприца-ручки поставляется предварительно заполненным фармацевтической композицией, удерживаемой в резервуаре внутри устройства. Когда в резервуаре фармацевтическая композиция заканчивается, все устройство выбрасывается.
Множество многоразовых устройств для доставки в виде шприца-ручки и автоинъектора находят применение в подкожной доставке фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением. Примеры включают без ограничения AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Великобритания), шприц-ручку DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Швейцария), шприц-ручку
- 25 044850
HUMALOGMIX 75/25™, шприц-ручку HUMALOG™, шприц-ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly и Co., Индианаполис, Индиана), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), шприц-ручку BD™ (Becton Dickinson, Франклин Лейке, НьюДжерси), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ и OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Франкфурт, Германия) и многие другие. Примеры одноразовых устройств для доставки в виде шприца-ручки, находящие применение в подкожной доставке фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, включают без ограничения шприц-ручку SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly), автоинъектор SURECLICK™ (Amgen, Таузанд-Окс, Калифорния), PENLET™ (Haselmeier, Штутгарт, Германия), EPIPEN (Dey, L.P.) и шприц-ручку HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, Иллинойс) и многие другие.
В некоторых ситуациях фармацевтическая композиция может доставляться в виде системы с контролируемым высвобождением. В одном варианте осуществления может быть использован насос (см. Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). В другом варианте осуществления можно применять полимерные материалы; см. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (ред.), 1974, CRC Pres.,Бока-Ратон, Флорида. В еще одном варианте осуществления система с контролируемым высвобождением может быть размещена в непосредственной близости от мишени композиции, таким образом, требуется только часть системной дозы (см, например, Goodson, 1984, в Medical Applications of Controlled Release, выше, том 2, с. 115-138). Другие системы контролируемого высвобождения обсуждаются в обзоре Langer, 1990, Science 249:1527-1533.
Инъекционные препараты могут включать лекарственные формы для внутривенных, подкожных, интратекальных, внутрикожных и внутримышечных инъекций, капельных инфузий и т. д. Такие инъекционные препараты могут быть получены общеизвестными способами. Например, инъекционные препараты могут быть получены, например путем растворения, суспендирования или эмульгирования любых из антител или антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в данном документе, или их соли, описываемой выше, в стерильной водной среде-носителе или в масляной среде-носителе, традиционно используемой для инъекций. В качестве водной среды-носителя для инъекций выступает, например, физиологический солевой раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу, другие вспомогательные средства и т.д., которые можно использовать в комбинации с подходящим солюбилизирующим средством, таким как спирт (например, этанол), многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионогенное поверхностно-активное вещество [например, полисорбат 80, НСО-50 (полиоксиэтиленовый (50 моль) аддукт гидрогенизированного касторового масла)] и т.д. В качестве масляной средыносителя используются, например, кунжутное масло, соевое масло и т.д., которые можно использовать в комбинации с подходящим солюбилизирующим средством, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.д. Полученной таким образом инъекцией предпочтительно заполняют соответствующую ампулу.
Преимущественно, фармацевтические композиции для перорального или парентерального применения, описанные выше, получают в виде лекарственных форм с единичной дозой, подобранной таким образом, чтобы соответствовать дозе действующих веществ. Такие лекарственные формы с единичной дозой включают, например, таблетки, пилюли, капсулы, инъекции (ампулы), суппозитории и т. д. Количество содержащегося вышеуказанного антитела обычно составляет от приблизительно 5 до приблизительно 500 мг на лекарственную форму с единичной дозой; особенно в случае форме инъекции предпочтительно, чтобы вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержалось в количестве от приблизительно 5 до приблизительно 100 мг и от приблизительно 10 до приблизительно 250 мг для других дозированных форм.
Е. Терапевтические пути применения антител
В отношении любого из способов, описанных в данном документе, настоящее изобретение охватывает применение любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с настоящим изобретением.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения нарушения у субъекта, в которое вовлекается нежелательная и/или аберрантная активность PAR2, включающий введение любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе. Как используется в данном документе, термины нарушение, состояние и заболевание используют взаимозаменяемо в отношении любых из нарушений, состояний или заболеваний, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления заболевание/нарушение/состояние, в которое вовлекается нежелательная и/или аберрантная активность PAR2, представляет собой заболевание/нарушение/состояние, связанное с аберрантным или нежелательным воспалением. Примеры заболеваний/нарушений/состояний, в которые вовлекается аберрантная и/или нежелательная активность PAR2, включают острую или хроническую боль, острый или хронический зуд, острое или хроническое воспаление (например, острое или хроническое воспаление суставов, легких, головного мозга, желудочнокишечного тракта, периодонта, кожи и сосудистой системы), аутоиммунные нарушения, периодонтит, астеоартрит, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз, ожирение, диабет, сердечно-сосудистое заболевание, панкреатит, рак (например, рак молочной железы, легкого,
- 26 044850 толстой кишки, желудка или предстательной железы), астму, фиброз, язвы желудка, фиброз или фиброзные нарушения, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, контактный дерматит, болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), гломерулонефрит и менингит. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения субъекта с метаболическим синдромом или с одним или несколькими состояниями, связанными с метаболическим синдромом, такими как висцеральное отложение жира, гипертензия, нарушенный гомеостаз глюкозы и инсулина, инсулиновая резистентность, эндотелиальное повреждение, сердечнососудистая гипертрофия, воспаление, сосудистое воспаление, атеросклероз, сократительная дисфункция желудочка, фиброз и жировая болезнь печени. В конкретных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения боли, например, боли, связанной с любым из заболеваний/нарушений/состояний, раскрытых в данном документе (например, боли при остеоартрите). В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ препятствования взаимодействию между протеазой (например, трипсином) и PAR2, включающий стадию введения любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, в клетку. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ ингибирования воздействия на привязанный лиганд PAR2 на клетке, включающий стадию введения любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, в клетку. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ ингибирования взаимодействия между привязанным лигандов PAR2 и второй трансмембранной петлей белка PAR2, включающий стадию введения любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, в клетку. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ ингибирования активации рецептора PAR2 в клетке, включающий стадию введения любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, в клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой нейрон (например, чувствительный нейрон). В некоторых вариантах осуществления клетка находится in vitro. В других вариантах осуществления клетка находится в субъекте. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления субъект страдает любым из нарушений, раскрытых в данном документе.
В отношении любого из способов, описанных в данном документе, настоящее изобретение охватывает комбинацию любой стадии или стадий одного способа с любой стадией или стадиями из другого способа. Эти способы предусматривают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения в соответствии с настоящим изобретением, подходящего для конкретного заболевания или состояния. В определенных вариантах осуществления эти способы предусматривают доставку любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в данном документе, в клетки нуждающегося в этом субъекта.
Термины лечение, процесс лечения, облегчение и т.п. используют в данном документе, как правило, в значении получения желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта, а также могут применяться в отношении улучшения, облегчения и/или снижения тяжести одного или нескольких симптомов состояния, подлежащего лечению. Эффект может быть профилактическим, что выражается в полном или частичном замедлении возникновения или рецидива заболевания, состояния или его симптомов, и/или может быть терапевтическим, что выражается в частичном или полном излечении от заболевания или состояния и/или нежелательного эффекта, относящегося к заболеванию или состоянию. Термин лечение, как используется в данном документе, охватывает любое лечение заболевания или состояния млекопитающего, в частности человека, и включает любое одно или несколько из следующего: (а) предупреждения проявления заболевания или состояния у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию или состоянию, но его наличие еще не было диагностировано; (b) ингибирования заболевания или состояния (например, остановки его развития) или (с) ослабления заболевания или состояния (например, обуславливания регрессии заболевания или состояния с обеспечением улучшения в отношении одного или нескольких симптомов). Например, лечение боли (например, боли при остеоартрите) предусматривает снижение, прекращение, облегчение или устранение болевых симптомов у получающего лечение субъекта. Популяция субъектов, получающих лечение с помощью такого способа лечения заболевания, включает субъектов, страдающих нежелательным состоянием или заболеванием, а также субъектов с риском развития состояния или заболевания.
В отношении любого из способов, описанных в данном документе, настоящее изобретение охватывает применение любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящей заявке. Кроме того, в отношении любого из способов, описанных в данном документе, настоящее изобретение охватывает комбинацию любой стадии или стадий одного способа с любой стадией или стадиями из другого способа.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения состояний, связанных с любым из заболеваний/состояний/нарушений, раскрытых в данном докумен
- 27 044850 те, например, острой или хронической боли (например, боли при остеоартрите). Эти способы предусматривают введение индивидууму терапевтически эффективного количества любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных выше. Эти способы, в частности, направлены на терапевтические и профилактические средства для лечения животных и более конкретно людей. Настоящее изобретение предусматривает все комбинации любых из приведенных выше аспектов и вариантов осуществления, а также комбинации с любыми вариантами осуществления, изложенными в подробном описании и примерах.
Термин терапевтически эффективная доза означает дозу, которая дает желаемый эффект, для которого ее вводят. Точная доза будет зависеть от цели лечения и буде определяться специалистом в данной области с применением известных методик (см., например, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
В определенных вариантах осуществления любые из антител или антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными соединениями или терапевтическими средствами для лечения любого из заболеваний/состояний/нарушений, раскрытых в данном документе, например, острой или хронической боли (например, боли при остеоартрите). Например, любые из антител или антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в данном документе, могут быть совместно введены в сочетании с одним или несколькими терапевтическими соединениями. При указании совместного введения комбинаторная терапия может охватывать одновременное или чередующееся введение. Кроме того, комбинация может охватывать однократное или длительное введение. Необязательно, антитело/антигенсвязывающий фрагмент и дополнительные соединения действуют аддитивным или синергическим образом для лечения любого из заболеваний/состояний/нарушений, раскрытых в данном документе, например, острой или хронической боли (например, боли при остеоартрите). Дополнительные соединения, подлежащие использованию в виде комбинации терапевтических средств, включают без ограничения, малые молекулы, полипептиды, антитела, антисмысловые олигонуклеотиды и молекулы siRNA. В некоторых вариантах осуществления дополнительное соединение представляет собой любое одно или несколько из противовоспалительного лекарственного средства, анальгетика, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (NSAID), кортикостероида, гиалуроновой кислоты, ацетаминофена, кодеина, лорсета, лортаба, викодина, гидрокодона, морфина, оксиконтина, роксикодона, перкоцета, аспирина, целекоксиба, прегабалина, слияния сустава, замещения сустава, абатацепта, адалимумаба, анакинра, цертолизумаба, этанерцепта, голимумаба, инфликсимаба, ритуксимаба, тоцилизумаба и тофацитиниба. В зависимости от характера комбинаторной терапиивведение антител или антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в настоящем изобретении, может продолжаться, в то время, когда вводится другое терапевтическое средство, и/или после этого. Введение антител или антигенсвязывающих фрагментов может выполнять в виде однократной дозы или в виде нескольких доз. В некоторых случаях введение антитела или антигенсвязывающих фрагментов начинают по меньшей мере за несколько дней до начала введения другого терапевтического средства, тогда как в других случаях введение начинают либо непосредственно перед, либо во время введения другого терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления любое из дополнительных соединений, раскрытых в данном документе, конъюгируют с любым из антител или антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в данном документе.
В другом примере комбинаторной терапии любые из антител или антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с настоящим изобретением можно применять в виде части терапевтического режима в сочетании с одним или несколькими дополнительными процедурами лечения. В качестве примера такие другие процедуры лечения включают без ограничения диетическую терапию, трудовую терапию, физиотерапию, психиатрическую терапию, массаж, иглоукалывание, точечный массаж, средства передвижения, животных помощников и т.п.
Следует отметить, что хотя антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, можно применять в комбинации с другими терапевтическими средствами, в определенных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляют в форме монотерапии. Независимо от того, вводятся ли они отдельно или в комбинации с другими медикаментами или терапевтическими режимами, дозировка, частота, путь введения и время введения антител или антигенсвязывающих фрагментов устанавливаются врачом на основании состояния и потребностей пациента.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения несколько доз антитела или его антигенсвязывающего фрагмента к PAR2 (или фармацевтической композиции, содержащей комбинацию антитела к PAR2 и любого из дополнительных терапевтических средств, упомянутых в данном документе) можно вводить субъекту в течение определенного времени. Способы согласно этому аспекту настоящего изобретения предусматривают последовательное введение субъекту нескольких доз антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением. Как используется в данном документе, термин последовательное введение означает, что каждую дозу антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PAR2 вводят субъекту в отдельный момент времени, например, в разные дни, разделенные предварительно установленным интервалом (например, часы, дни, недели или месяцы). Настоящее изобретение включает способы, которые предусматривают последовательное введе- 28 044850 ние пациенту однократной начальной дозы антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PAR2 с последующей одной или несколькими вторичными дозами антитела или антигенсвязывающего фрагмента к
PAR2 и необязательно с последующей одной или несколькими третичными дозами антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PAR2.
Термины начальная доза, вторичные дозы и третичные дозы относятся к временной последовательности введения антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, термин начальная доза означает дозу, которую вводят в начале режима лечения (также называемую исходной дозой); термин вторичные дозы означает дозы, которые вводят после начальной дозы; а термин третичные дозы означает дозы, которые вводят после вторичных доз. Все начальная, вторичная и третичная дозы могут содержать одно и то же количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PAR2, но, как правило, они могут отличаться друг от друга частотой введения. В определенных вариантах осуществления, однако, количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента к PAR2, содержащееся в начальной, вторичной и/или третичной дозах варьирует (например, повышается или понижается при необходимости) на протяжении курса лечения. В определенных вариантах осуществления в начале режима лечения вводят две или более (например, 2, 3, 4 или 5) дозы в виде нагрузочных доз, а затем последующие дозы, которые вводят с меньшей частотой (например, поддерживающие дозы).
F. Диагностические/другие пути применения антител или антигенсвязывающих фрагментов
Антитела к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением также можно применять для выявления и/или определения количества PAR2 или экспрессирующих PAR2 клеток в образце, например, для диагностических целей. Например, антитело к PAR2 или его антигенсвязывающий фрагмент можно применять для диагностики состояния или заболевания, характеризующегося аберрантной экспрессией (например, сверхэкспрессией, недостаточной экспрессией, отсутствием экспрессии и т.д.) PAR2.
Иллюстративные диагностические анализы на PAR2 могут предусматривать, например, ведение в контакт образца, полученного от пациента, с антителом к PAR2 в соответствии с настоящим изобретением, где антитело к PAR2 является меченным выявляемой меткой или репортерной молекулой.
В качестве альтернативы, немеченое антитело к PAR2 использовать в диагностических применениях в комбинации со вторичным антителом, которое само мечено выявляемой меткой. Выявляемая метка или репортерная молекула может представлять собой радиоизотоп, такой как 3Н, 14С, 32Р, 35S или 125I; флуоресцентный или хемилюминесцентный компонент, такой как флуоресцеина изотиоцианат или родамин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза, пероксидаза хрена или люцифераза. Специфические иллюстративные анализы, которые можно применять для выявления или определения количества PAR2 в образце, включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA) и сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS).
Для композиций в соответствии с настоящим изобретением существует множество путей применения. Например, антитела и антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением применимы для исследования предпочтительного клеточного и тканевого распределения в клетках и в тканях in vitro и/или in vivo. Подобным образом, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, либо отдельно, либо конъюгированные с гетерологичным средством, применимы в качестве визуализирующих средств, например, для диагностических применений ex vivo или in vivo. Например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, конъюгированные с радиоактивным компонентом, применимы для исследований с визуализацией ex vivo или in vivo. Подобным образом, любые из антител или антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с настоящим изобретением применимы подобным образом.
При использовании in vitro антитела и антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением подходят для идентификации партнеров по связыванию для антитела или антигенсвязывающего фрагмента, подлежащего доставке (например, для идентификации белков или пептидов, которые связывают антитело или антигенсвязывающий фрагмент), а также для оценки локализации и миграции. Подобным образом, при использовании in vivo антитела или антигенсвязывающие фрагменты применимы для идентификации партнеров по связыванию для антитела или антигенсвязывающего фрагмента, подлежащего доставке (например, для идентификации белков или пептидов, которые связывают антитело или антигенсвязывающий фрагмент), для оценивания локализации и миграции, для оценивания биораспределения и времени полужизни и для оценивания иммуногенности.
G. Животные/клеточные модели
Специалисту известно множество животных моделей, которые могли бы оказаться полезными для изучения любого из антител или их фрагментов. См., например, Kuyinu et al., 2016, J Orthop Surg Res, 11(19): 10.1186/sl3018-016-0346-5. В некоторых вариантах осуществления животная модель представляет собой основанную на боли модель, создаваемую путем обработки животного химическим соединением, таким как монойодацетат натрия (MIA) или каррагенан. В некоторых вариантах осуществления химическое соединение вводят путем инъекции в участок, на котором индуцируют боль у животного. В некоторых вариантах осуществления животная модель представляет собой животного, повреждение у которого осуществляют после операции (например, после разрезания), например, разрез передней крестообразной связки, менискэктомия или медиальный разрез мениска. В некоторых вариантах осуществления живот- 29 044850 ная модель представляет собой модель, связанную с воспалительным состоянием, таким как раздражение нижних отделов пищевода, воспаление толстой кишки, изъязвление желудка, воспаление мочевого пузыря, воспаление поджелудочной железы и воспаление матки. См., например, животные модели, упомянутые в National Research Council Committee on Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals,
Models of Pain, 2009.
H. Наборы
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащим один или несколько контейнеров, заполненных по меньшей мере одним антителом или антигенсвязывающим фрагментом в соответствии с настоящим изобретением. Необязательно, совместно с таким контейнером(ами) может прилагаться уведомление в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, и такое уведомление отражает: (а) одобрение агентства на производство, применение или продажу для введения человеку, (b) инструкции по применению или и то, и другое.
Примеры
Следующие примеры предусмотрены для того, чтобы предоставить специалистам среднего уровня квалификации в данной области техники полное раскрытие и описание того, как осуществлять и применять способы и композиции в соответствии с настоящим изобретением, и они не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения считают настоящим изобретением. Были предприняты усилия для обеспечения точности по отношению к используемым числам (например, значениям количества, температуры и т.д.), но следует учитывать погрешности и отклонения эксперимента. Если не указано иное, части представляют собой части по весу, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура приводится в градусах Цельсия, а давление равно атмосферному или близко к нему.
Пр имер 1. Создание антител с чувствительным к рН связыванием PAR2
Создание рекомбинантных белков PAR2 и PAR1 человека, крысы и макака-крабоеда
Конструкции на основе PAR2 (активируемого протеиназой рецептора 2) человека, крысы и макакакрабоеда (Масаса fascicularis), содержащие внеклеточные остатки 1-75, разрабатывали с применением Nконцевой метки AviTag™ (Avidity LLC) и С-концевых метки Flag, и полигистидиновой метки и клонировали в вектор pDEST12.2 OriP FH (Life Technologies). Конструкции на основе PAR1 (активируемого протеиназой рецептора 1) человека, содержащие внеклеточные остатки 1-102, разрабатывали с применением с С-концевых метки Flag и полигистидиновой метки и клонировали в вектор pDEST12.2 OriP FH (Life Technologies). Конструкции экспрессировали в клетках линии FIEK293 и очищали от среды с применением стандартной очистки посредством аффинной и эксклюзионной хроматографии. Для создания биотинилированных белков AviTag™ биотинилировали ферментативным способом согласно инструкциям изготовителя.
Конструирование комбинаторных библиотек для гистидинового сканирования
Разрабатывали разделенные на пулы олигонуклеотиды для введения в каждое положение одного из VHCDR2, VHCDR3 или VLCDR3 в Par0067 гистидина или аминокислоты дикого типа. Затем конструировали три библиотеки на основе фагового дисплея scFv Par0067, в которых в каждой из VHCDR2, VHCDR3 или VLCDR3 содержалось от 0 до 100% гистидиновых остатков.
Отбор чувствительных к рН вариантных scFv Par0067
Комбинаторные библиотеки для гистидинового сканирования подвергали основанным на аффинности отборам с помощью фагового дисплея с целью выделения вариантов Par0067, которые связываются с PAR2 при рН 7,4, но при рН 6,0 их связывание снижается. Для достижения этого выполняли четыре цикла отбора с каждой библиотекой с применением понижающихся концентраций биотинилированного рекомбинантного PAR2 человека (Hawkins, RE et al., 1992 Aug 5;226(3):889-96). В каждом цикле фаг предварительно инкубировали в течение 1 ч с покрытыми стрептавидином парамагнитными гранулами (Dynabeads®) для удаления каких-либо связующих стрептавидина. Затем покрытые стрептавидином гранулы удаляли с помощью магнита DYNAL® и отбрасывали, а оставшийся фаг добавляли к биотинилированному рекомбинантному PAR2 человека при рН 7,4. Отбор проводили в течение 2 ч перед добавлением покрытых стрептавидином парамагнитных гранул для захвата фага, связанного с биотинилированным рекомбинантным PAR2 человека. Гранулы промывали 5 раз с помощью PBS Tween (PBST) перед элюированием специфического scFv в буфере с низким рН (рН 5,5 - рН 6,0). Затем отобранные фаговые частицы с scFv извлекали, как описано ранее (Osbourn JK.et al. Immunotechnology, 2(3): 181-96, 1996), и процесс отбора повторяли в присутствии понижающихся концентраций биотинилированного PAR2 (1 нМ 0,05 нМ за 4 цикла).
Изменение формата scFv на IgG1-TM
Антитела преобразовывали из scFv в формат антитела в виде иммуноглобулина G1 с тройной мутацией (IgG1-TM, Fc-последовательность IgG1 с введенными мутациями L234F, L235E и P331S), главным образом как описано в Persic et al. (1997, Gene, 187, 9-18) со следующими модификациями. Фрагмент
- 30 044850
OriP включали в векторы экспрессии для облегчения использования клеток линии СНО для временной трансфекции и для обеспечения возможности эписомной репликации. Вариабельный домен тяжелой цепи (VH) клонировали в вектор, содержащий константные домены тяжелой цепи человека и регуляторные элементы для экспрессии целой тяжелой цепи IgG1-TM в клетках млекопитающих. Аналогично, вариабельный домен легкой цепи (VL) клонировали в вектор для экспрессии константных доменов легкой цепи (лямбда) человека, который содержал регуляторные элементы для экспрессии целой легкой цепи IgG в клетках млекопитающих. Для получения IgG векторы, экспрессирующие тяжелую и легкую цепь IgG, трансфицировали в клетки млекопитающих для временной трансфекции на основе линии СНО (Daramola et al. Biotechnol Prog 30(1): 132-41 (2014)). IgG экспрессировались и секретировались в среду. Собранный материал фильтровали перед очисткой, затем IgG очищали с применением хроматографии с белком А. Образцы надосадочной жидкости с культуры загружали на колонку соответствующего размера с белком A Ceramic (BioSepra) и промывали с помощью 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 250 мМ NaCl. Связанный IgG элюировали из колонки с помощью 0,1 М цитрата натрия (рН 3,0) и нейтрализовали посредством добавления Tris-HCl (pH 9,0). В элюированном материале осуществляли замену буфера на PBS с применением колонок Nap10 (Amersham, № 17-0854-02) и концентрацию IgG устанавливали спектрофотометрически с применением коэффициента экстинкции на основании аминокислотной последовательности IgG (Mach et al., Anal. Biochem. 200(1):74-80 (1992)). Очищенные IgG анализировали в отношении агрегации и разрушения с применением SEC-HPLC и SDS-PAGE.
Скрининг на предмет чувствительных к рН вариантных scFv и IgG Par0067
Для скрининга и определения профиля антител с потенциальным рН-зависимым связыванием использовали формат биохимического анализа конкуренции за эпитоп. Анализ, в котором использовалась технология гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF™), разрабатывали для оценки способности исследуемых антител (scFv или IgG) ингибировать взаимодействие связывания исходного антитела IgG Par0067 с внеклеточным доменом (ECD)PAR2 человека. Важно отметить, что анализ проводили при двух разных значениях рН (рН 7,4 и рН 6,0).
Параллельные анализы при рН 7,4 и рН 6,0 (как описано выше) были сначала использовали для скрининга необработанного неочищенного scFv (бактериальные экстракты) в одноточечном 384луночном скрининге с высокой пропускной способностью (HTS). Данный формат одноточечного параллельного HTS позволил осуществить скрининг многих тысяч исследуемых scFv, и те антитела, у которых в результате получали пониженное ингибирование взаимодействия, представляющего собой связывание исходного IgG Par0067 с PAR2 человека, при рН 6,0 по сравнению с таковым при рН 7,4, брали для дальнейшей характеристики. Затем тот же подход, представляющий собой анализ конкуренции за эпитоп, осуществляли в формате определения многоточечного дозозависимого эффекта по IC50 для исследования как очищенного scFv, так и очищенного IgG (в последнем случае требовалась небольшая модификация схемы анализа, как изложено в разделе С). Опять анализы проводили при рН 7,4 и рН 6,0, однако в этих экспериментах авторов настоящего изобретения больше всего интересовали исследуемые антитела, кривые ингибирования дозозависимого эффекта которых показывали значительное смещение вправо (т. е. значительно повышенное значение IC50) при рН 6,0 относительно соответствующих кривых ингибирования дозозависимого эффекта, наблюдаемых при рН 7,4.
Следующий протокол включает способы как одноточечного исследования необработанного неочищенного scFv, так и последующего исследования очищенных scFv и IgG.
Раздел А. Общие условия анализа
Аналитические буферы
В день использования получали свежие аналитические буферы. Для экспериментов при рН 7,4 в DPBS (Gibco 14190-086) добавляли KF (0,4 М) (VWR, 103444Т) и BSA (0,1% вес./об.) (РАА, K05-013), а затем проверяли рН и точно доводили до рН 7,4 при необходимости. Для экспериментов при рН 6,0 при сохранении всех других буферных компонентов идентичными таковым в налитическом буфере для рН 7,4, описанном выше, аналитический буфер для рН 6,0 составляли с применением основного буфера, представляющего собой 200 мМ MES (Sigma, M-5287) (вместо DPBS). После добавления KF (0,4 М) и BSA (0,1% вес/об.) буфер на основе 200 мМ MES затем доводили до рН 6,0 с помощью HCL.
Аналитические планшеты
Анализы выполняли с применением 384-луночных планшетов с черными мелкими лунками (с круглым дном, без связывания) (Corning, 4514)
Объем анализа: 20 мкл.
Инкубация и считывание планшетов
Аналитические планшеты инкубировали в течение 2 ч при к. т. перед считыванием с применением стандартного протокола считывания HTRF™ на устройстве для считывания планшетов Envision.
- 31 044850
Раздел В. Исследование scFv. (Неочищенные бактериальные лизаты и очищенный scFv) Порядок добавления и аналитические компоненты
Суммарное nsb Исс. педование
IgG Раг0067 (х4 [конечный]) 5 мкл 5 мкл 5 мкл
Исследуемый scFv (х4 [конечный]) - - 5 мкл
Аналитический буфер 5 мкл 5 мкл -
ECD Bio-human-PAR2 (х4 [конечный]) 5 мкл - 5 мкл
Аналитический буфер - 5 мкл -
Меченый криптатом европия стрептавидин плюс VI 665 меченое XL антитело к Fc человека (оба х4 [ко-
нечный])5 мкл 5 мкл 5 мкл
Получение/добавление IgG Par0067
Немеченое очищенное IgG Par0067 (полученное на месте) доводили до концентрации 4,44 нМ (1,11 нМ конечной [анализ]) в каждом из двух аналитических буферов, описанных ранее в разделе А (рН 7,4 и рН 6,0). Во все лунки соответствующего аналитического планшета добавляли по 5 мкл/лунка раствора 4,44 нМ IgG Par0067 с соответствующим рН (рН 7,4 и рН 6,0).
Получение/добавление исследуемого scFv
a) Для параллельного одноточечного HTS образцов scFv в виде необработанного неочищенного бактериального лизата как при рН 7,4, так и при рН 6,0 образцы сначала предварительно разбавляли до 40% от их исходной концентрации с применением аналитического буфера либо с рН 7,4, либо с рН 6,0, соответственно. Затем 5 мкл предварительно разбавленного до 40% образца переносили в соответствующий анализ (рН 7,4 или рН 6,0) для получения конечной концентрации аналитического образца 10,0% (в конечном аналитическом объеме 20 мкл). Во все эксперименты HTS включали исходный scFv Par0067 в качестве контроля, а также специфические зависимые от рН антитела, когда те становились доступными (для сопоставительного анализа).
b) Для исследования многоточечного дозозависимого эффекта по IC50 очищенного антитела, представляющего собой scFv, образцы исследовали при верхней конечной аналитической концентрации, составляющей 1/4 от исходного неразбавленного образца (т.е. не выполняли стадию предварительного разбавления). Затем получали 11 точек серийных разведений 1:3, каждое в двух повторностях, в 384луночных полипропиленовых планшетах Greiner в каждом из двух аналитических буферов (рН 7,4 и 6,0). По 5 мкл на лунку каждого серийного разведения переносили из планшета для разбавления scFv при соответствующем рН в соответствующий аналитический планшет (рН 7,4 и рН 6,0). По 5 мкл аналитического буфера при соответствующем рН добавляли в лунки Суммарное и Неспецифическое (nsb). Во все многоточечные эксперименты определения дозозависимого эффекта по IC50 включали неочищенное сходное scFv Par0067 в качестве контроля, а также специфические зависимые от рН очищенные scFv, когда те становились доступными (для сопоставительного анализа). Данные представлены в табл. 1.
Получение/добавление биотинилированного ECD PAR2 человека
Полученный на месте биотинилированный ECD PAR2 человека разбавляли в каждом из двух аналитических буферов (рН 7,4 и рН 6,0) с получением рабочих растворов при 4,0 нМ (конечная аналитическая концентрация 1 нМ). Затем добавляли по 5 мкл/лунка соответствующего рабочего раствора 4,0 нМ биотинилированного ECD PAR2 человека во все лунки соответствующего аналитического планшета (рН 7,4 и Рн 6,0), за исключением лунок отрицательного контроля связывания. По 5 мкл аналитического буфера при соответствующем рН добавляли в лунки отрицательного контроля связывания.
Получение/добавление реагента для выявления с помощью HTRF
Меченый криптатом европия стрептавидин (CisBio, 610SAKLB) и меченое XL665 антитело к Fc человека (CisBio, 61HFCXLB) разбавляли аналитическим буфером при каждом рН (рН 7,4 и рН 6,0) с получением объединенных рабочих растворов при концентрациях 6,0 нМ (меченого криптатом европия стрептавидина) и 40 нМ (меченого XL665 антитела к Fc человека). Обеспечение 4-кратного разведения в анализе давало конечные аналитические концентрации 1,5 нМ (меченого криптатом европия стрептавидина) и 10 нМ (меченого XL665 антитела к Fc человека). Затем добавляли по 5 мкл/лунка объединенного рабочего раствора реагента для выявления HTRF™ при соответствующем рН во все лунки соответствующего аналитического планшета (рН 7,4 и рН 6,0).
Раздел С. Исследование очищенного IgG
Порядок добавления и аналитические компоненты
Суммарное nsb Исследование
Меченый с помощью Dylight650 IgG Раг0067 (х4 [конечный]) 5 мкл 5 мкл 5 мкл
Исследуемый IgG (х4 [конечный])
Аналитический буфер
- - 5 мкл мкл 5 мкл - 32 044850
ECD Bio-human-PAR2 (x4 [конечный]) 5 мкл - 5 мкл
Аналитический буфер - 5 мкл Меченый криптатом европия стрептавидин (х4 [конечный]) 5 мкл 5 мкл 5 мкл
Меченый с помощью Dylight650 IgG Par0067
Мечение IgG Par0067 с помощью Dylight650 выполняли с применением набора для мечения Dylight650 (№ по каталогу Thermo Scientific 84536). Мечение полученного на месте очищенного IgG Par0067 выполняли согласно рекомендованной изготовителем процедуре мечения. Установили, что конечная концентрация IgG Par0067, меченого с помощью Dylight650, составляла 0,56 мг/мл, при этом среднее отношение встраивания красителя Dylight650 к IgG составляло 2,7 моль красителя/моль IgG.
Получение/добавление IgG Par0067, меченого с помощью Dylight650
IgG Par0067, меченое с помощью Dylight650 (0,56 мг/мл, 3,733 нМ), доводили до концентрации 4,44 нМ (для получения 1,11 нМ конечной [анализ]) в каждом из двух аналитических буферов, описанных в разделе Материалы (рН 7,4 и рН 6,0). Добавляли по 5 мкл/лунка раствора 4,44 нМ IgGPar0067, Dylight650, меченого при соответствующем рН во все лунки соответствующего аналитического планшета (рН 7,4 и рН 6,0).
Серийное разбавление/добавление исследуемого IgG
Исходный IgG Par0067 (используемый в качестве сравнения/контроля во всех анализах) предварительно разбавляли с получением 2000 нМ стокового раствора в каждом из двух аналитических буферов с разными рН (для получения верхней конечной аналитической концентрации IgG, составляющей 500 нМ). Все исследуемые или другие IgG сравнения/контрольные IgG исследовали при верхней конечной аналитической концентрации, составляющей 1/4 от исходного неразбавленного образца (т.е. не выполняли стадию предварительного разбавления). Затем получали 11 точек серийных разведений 1:3, каждое в двух повторностях, в 384-луночных полипропиленовых планшетах Greiner в каждом из двух аналитических буферов (рН 7,4 и 6,0). По 5 мкл на лунку переносили из планшета для разбавления IgG при соответствующем рН в соответствующий аналитический планшет (рН 7,4 и рН 6,0). По 5 мкл аналитического буфера при соответствующем рН добавляли в лунки Суммарное и Неспецифическое.
Получение/добавление биотинилированного ECD PAR2 человека
Полученный на месте биотинилированный ECD PAR2 человека разбавляли в каждом из двух аналитических буферов (рН 7,4 и рН 6,0) с получением рабочих растворов при 4,0 нМ (конечная аналитическая концентрация 1 нМ). Затем добавляли по 5 мкл/лунка соответствующего рабочего раствора 4,0 нМ биотинилированного ECD PAR2 человека во все лунки соответствующего аналитического планшета (рН 7,4 и рН 6,0), за исключением лунок отрицательного контроля связывания. По 5 мкл аналитического буфера при соответствующем рН добавляли в лунки отрицательного контроля связывания.
Получение/добавление реагента для выявления с помощью HTRF
Меченый криптатом европия стрептавидин (CisBio, 610SAKLB) разбавляли аналитическим буфером при каждом рН (рН 7,4, и рН 6,0) с получением рабочих растворов при концентрации 6,0 нМ. Обеспечение 4-кратного разведения в анализе давало конечную аналитическую концентрацию меченого криптатом европия стрептавидина 1,5 нМ. Затем добавляли по 5 мкл/лунка рабочего раствора меченого криптатом европия стрептавидина при соответствующем рН во все лунки соответствующего аналитического планшета (рН 7,4 и рН 6,0).
Раздел D. Анализ данных
Сначала количество импульсов при 665 нм и 620 нм превращали в значения отношения 665/620. Затем рассчитывали дельта F (%) согласно следующему уравнению: Дельта F (%) = ((отношение для образца - отношение для отрицательного контроля)/отношение для отрицательного контроля) х 100.
Значения для отрицательного контроля рассчитывали при отсутствии IgG Par0067 в лунках соответствующего отрицательного контроля связывания.
Затем рассчитывали % специфического связывания согласно следующему уравнению:
% специфического связывания = {(% дельта F образца - % дельта F отрицательного контроля связывания)/(% дельта F суммарного связывания - % дельта F отрицательного контроля связывания)} х 100.
В случае одноточечного HTS строили график зависимости % специфического связывания при рН 6,0 от такового при рН 7,4 по осям х и у соответственно, для визуализации распределения scFv с пониженным ингибированием (более высокий % специфического связывания) при рН 6,0 по сравнению с рН 7,4.
В случае кривых многоточечного дозозависимого эффекта строили график зависимости значений % специфического связывания от концентрации исследуемого очищенного антитела (scFv или IgG). Значения IC50 устанавливали путем аппроксимацией кривой по вариабельному наклону сигмоидальной кривой дозозависимого эффекта ингибирования (4-параметрическое логистическое уравнение) с применением программного обеспечения Graphpad Prism.
- 33 044850
Таблица 1
Клон (scFv) Анализ конкуренции Раг0067 за эпитоп
1С5о (нМ) при pH 7,4 IC50 (нМ) при pH 6,0 Вариант: Кратность 1С5о (pH 6,0 против pH 7,4) Кратность 1С5о при pH 7,4 (вариант против Раг0067)
Раг0067 3,3 3,6 1Д 1,0
РаВ670010 15,4 41,8 2,7 4,7
РаВ670020 5,6 18,5 3.3 1,7
РаВ670034 5,6 14,2 2,5 1,7
РаВ670045 9,8 72,5 7,4 з,о
РаВ670048 14,5 139,4 9,6 4,4
РаВ670064 67,1 289,9 4,3 20,3
РаВ670066 52,2 486,9 9,3 15,8
РаВ670067 14,4 113,2 7,9 4,4
РаВ670068 77,8 447,6 5,8 23,6
РаВ670070 60,4 270,0 4,5 18,3
РаВ670071 101,2 424,8 4,2 30,7
РаВ670073 72,1 428,3 5,9 21,8
РаВ670075 101,8 603,0 5,9 30,8
РаВ670076 46,2 291,8 6,3 14,0
РаВ670077 55,4 619,9 И,2 16,8
РаВ670078 33,3 319,2 9,6 Ю,1
РаВ670079 44,2 489,8 И,1 13,4
РаВ670080 16,6 158,1 9,5 5,0
РаВ670081 51,4 260,0 5,1 15,6
РаВ670082 25,4 77,9 3,1 7,7
РаВ670083 45,2 151,8 3,4 13,7
РаВ670084 54,5 282,7 5,2 16,5
РаВ670085 48,1 154,7 3,2 14,6
РаВ670087 40,9 130,7 3,2 12,4
РаВ670088 29,8 114,7 3,8 9,0
РаВ670089 29,9 134,0 4,5 9,1
РаВ670090 22,6 85,5 3,8 6,8
РаВ670091 25,2 98,9 3,9 7,6
РаВ670092 41,1 193,5 4,7 12,5
РаВ670093 18,6 58,7 3,2 5,6
РаВ670094 72,5 236,8 3,3 22,0
РаВ670095 20,0 113,2 5,7 6,1
РаВ670097 21,8 77,9 3,6 6,6
РаВ670098 65,9 210,3 3,2 20,0
РаВ670099 12,9 62,4 4,8 3,9
РаВ670100 20,3 69,0 3,4 6,2
РаВ670101 146,9 496,5 3,4 44,5
РаВ670102 5,3 13,7 2,6 1,6
РаВ670103 27,9 203,5 7,3 8,5
РаВ670104 21,7 202,2 9,3 6,6
РаВ670105 74,4 495,5 6,7 22,5
РаВ670106 312,8 1188,0 3,8 94,8
РаВ670107 42,7 463,9 10,9 12,9
РаВ670108 29,1 148,6 5,1 8,8
Рекомбинация нескольких гистидиновых остатков в одном scFv
Гистидиновые остатки из scFv, который демонстрировал зависимое от рН связывание в анализе конкуренции Par0067 за связывание эпитопа, рекомбинировали с применением сайт-направленного мутагенеза (Reikofski J and Tao BY, 1992, Biotechnol Adv, 10(4): 535-547). Полученный в результате scFv, который содержал гистидины в двух разных CDR, исследовали в анализе конкурентного связывания как тройного мутанта целого иммуноглобулина G1 (IgG1-TM) (табл. 2) для идентификации вариантов с дополнительными улучшениями в отношении зависимого от рН связывания по сравнению с исходным ан- 34 044850 тителом Par0067.
Выравнивания последовательностей для каждого из модифицированных гистидином клонов по сравнению с последовательностями CDR антитела сравнения Par0067 представлены на фиг. 1А-1В и 2А2В.
Таблица 2
Клон (IgG) Анализ конкуренции Раг0067 за эпитоп
1С5о (нМ) при pH 7,4 IC50 (нМ) при pH 6,0 Вариант: Кратность 1С5о (pH 6,0 против pH 7,4) Кратность ICso при pH 7,4 (вариант против Par0067)
Раг0067 0,835 0,790 0,95 1,00
РаВ670045 2,9 25,8 8,9 3,5
РаВ670048 5,7 48,2 8,5 6,8
РаВ670128 32,8 IC ND 39,3
РаВ670129 56,1 IC ND 67,2
РаВ670084 10,3 64,6 6,3 12,3
РаВ670141 2,4 13,9 5,9 2,8
РаВ670142 4,8 67,1 14,0 5,7
РаВ670143 3,4 40,0 11,8 4,0
РаВ670144 29,0 564,8 19,5 34,7
РаВ670146 91,9 784,3 8,5 110,1
РаВ670148 48,5 844,6 17,4 58,1
РаВ670149 504,9 IC ND 604,7
РаВ670151 69,5 796,0 11,5 83,2
РаВ670152 438,8 6604,0 15,1 525,5
РаВ670153 93,0 1639,0 17,6 111,4
РаВ670156 7,0 190,0 27,2 8,4
РаВ670157 15,8 932,4 59,0 18,9
РаВ670158 6,8 477,0 69,8 8,2
РаВ670159 161,0 IC ND 192,8
РаВ670160 16,9 634,3 37,5 20,2
РаВ670161 47,9 1899,0 39,6 57,4
РаВ670162 И,4 906,2 79,5 13,7
РаВ670163 145,1 IC ND 173,8
IC = неполная кривая; ND = не показано
Аффинность Fab к PAR2 в отношении PAR2 человека, крысы, макака-крабоеда, установленная с помощью BIACORE™
Экспрессировали антигенсвязывающие фрагменты (Fab) антител к PAR2 (Spooner J. et al. (2015) Biotechnol Bioeng. 112:1472-7) и устанавливали аффинность в отношении рекомбинантного PAR2 разных видов (человека, крысы и макака-крабоеда) с помощью Biacore.
Анализ аффинности с помощью Biacore
Аффинность Fab к PAR2 определяли с применением Biacore T100 при 25°С при разных рН (рН 7,4, рН 6,0 и рН 5,6). Эксперименты выполняли с применением рекомбинантного PAR2 человека, крысы и макака-крабоеда с N-концевой меткой Avi и С-концевыми метками Flag-His.
Стрептавидин ковалентно иммобилизировали на поверхности чипа С1 с применением стандартных методик иммобилизации по амино-группе при концентрации 4 мкг/мл в 10 мМ ацетата натрия, рН 4,5. Достигали конечной степени покрытия поверхности стрептавидином, составляющей примерно 30-100 RU. Образцы рекомбинантного биотинилированного PAR2 (полученные на месте) титровали на поверхность чипа со стрептавидином при 4 мкг/мл в буфере HBS-EP+, чтобы обеспечить связывание Fab при насыщении (Rmax). Этот низкий уровень связывания аналита гарантировал минимальные эффекты массопереноса.
Fab к PAR2 серийно разбавляли (0,39 нМ - 25 нМ) в буфере HBS-EP+, рН 7,4, или в буфере MESBS-EP+, рН 6,0, или в буфере MES-BS-EP+, рН 5,6, и пропускали по чипу при 50 мкл/мин, с ассоциацией в течение 3 минут и диссоциацмкй в течение до 30 минут. Несколько введений отдельно буфера осуществляли при таких же условиях, чтобы обеспечить возможность двойного вычитания контроля из конечных наборов сенсограмм, которые анализировали с применением программного обеспечения BiaEval (версия 2.0.1). Поверхность чипа полностью регенерировали с помощью импульсной подачи 4 М MgCl2.
Результаты определения аффинности с помощью BiaCore для отобранных клонов представлены ниже в табл. 3-13.
- 35 044850
Таблица 3. Fab Par0067
pH Виды ka (Μ 1 с η kd fc η Kd (пМ) Rmax
7,4 Человек 6,66 Е+6 4,96 Е-5 7,5 50,1
6,0 Человек 3,12 Е+6 9,72 Е-5 31,2 39,3
7,4 Крыса 5,16 Е+6 1,94 Е-4 37,6 111
6,0 Крыса 3,21 Е+6 5,44 Е-4 170 100
Таблица 4. Fab PaB670048
pH Виды ka (М 1 СП kd (с П Kd (пМ) Rmax
7,4 Человек 4,20 Е+6 5,19 Е-4 124 69,0
6,0 Человек 1,94 Е+6 4,97 Е-3 2569 58,3
7,4 Крыса 5,24 Е+6 3,07 Е-3 586 124,7
6,0 Крыса 4,00 Е+6 2,05 Е-2 5120 105,2
Таблица 5. Fab PaB670084
pH Виды ka (М 1 С1) kd (с Н Kd (пМ) Rmax
7,4 Человек 6,49 Е+6 1,62 Е-3 250 68,4
6,0 Человек 1,73 Е+6 7,63 Е-3 4,410 104,6
7,4 Крыса 6,83 Е+6 8,37 Е-3 1226 97,6
6,0 Крыса 2,57 Е+6 2,77 Е-2 10,800 91,97
Таблица 6. Fab PaB670076
pH Виды ka (М 1 С») kd(cH Kd (пМ) Rmax
7,4 Человек 5,84 Е+6 1,21 Е-3 207 63,5
6,0 Человек 1,11 Е+6 5,14 Е-3 4,611 99,51
7,4 Крыса 6,34 Е+6 1,07 Е-2 1,689 87,9
6,0 Крыса 1,66 Е+6 5,10 Е-2 30,730 82,61
Таблица 7. Fab PaB670120
pH Виды ka (М 1 С1) kd (сП Kd (пМ) Rmax
7,4 Человек 5,54 Е+6 1,37 Е-3 247 61,62
6,0 Человек 3,48 Е+6 2,10 Е-2 6,047 94,67
7,4 Крыса 5,62 Е+6 1,46 Е-2 2,606 84,23
6,0 Крыса 8,26 Е+6 0,281 34,040 73,35
Таблица 8. Fab PaB670128
pH Виды ka (М 1 С П kd (сП Kd (пМ) Rmax
7,4 Человек 5,95 Е+6 3,65 Е-3 613 59,57
6,0 Человек 2,22 Е+6 4,57 Е-2 20,062 79,4
7,4 Крыса 6,49 Е+6 1,96 Е-2 3,023 80,86
6,0 Крыса 1,79 Е+6 6,89 Е-2 38,520 63,26
Таблица 9. Fah PaB670048
pH Виды ka (М 1 С1) kd (с-П Kd (пМ) Rmax
7,4 Человек 5,59 Е+6 5,80 Е-4 104 58,53
6,0 Человек 1,84 Е+6 4,58 Е-3 2,488 93,02
7,4 Крыса 7,46 Е+6 3,25 Е-3 435 81,2
6,0 Крыса 4,84 Е+6 2,17 Е-2 4,483 80,14
Таблица 10. Fab PaB670129
pH Виды ka (М 1 С1) kd (с1) Kd (пМ) Rmax
7,4 Человек 8,20 Е+6 5,04 Е-3 614 54,98
6,0 Человек 1,59 Е+6 5,54 Е-2 34,840 76,02
7,4 Крыса 8,82 Е+6 2,63 Е-2 2,979 73,16
6,0 Крыса 1,45 Е+6 8,41 Е-2 57,910 67,27
Таблица 11. Fab PaB670136
pH Виды ka (М 1 С1) kd(cH Kd (пМ) Rmax
7,4 Человек 5,17 Е+6 4,95 Е-3 957 50,27
6,0 Человек 7,92 Е+8 14,9 18,840 67,97
7,4 Крыса 7,57 Е+6 3,14 Е-2 4,149 73,24
6,0 Крыса 1,57 Е+6 5,89 Е-2 37,550 47,7
Таблица 12. Fab PaB670103
pH Виды ka (М-1 С Ц kd(cH Kd (пМ) Rmax
7,4 Человек 3,52 Е+6 1,11 Е-4 32,5 46,3
6,0 Человек 3,36 Е+5 6,07 Е-4 1,805 70,66
7,4 Крыса 3,04 Е+6 5,58 Е-4 184 74,2
6,0 Крыса 5,31 Е+5 5,42 Е-3 10,200 69,58
- 36 044850
Таблица 13. Fab РаВ670129 при 3 разных pH
pH Виды ка (М 1 С Ц ка (с Ц Kd (пМ) Rmax
7,4 Человек 7,14 Е+6 6,81 Е+6 5,34 Е-3 5,30 Е-3 747,8 778,0 75,9 66,5
6,0 Человек 1,56 Е+6 3,26 Е+6 5,76 Е-2 0,109 36,910 33,500 58,1 48,4
5,6 Человек 1,33 Е+6 0,112 84,550 42,5
7,4 Макак- 6,67 Е+6 2,23 Е-3 333,3 59,7
крабоед 6,59 Е+6 2,21 Е-3 335,0 51,9
6,0 Макак- 2,14 Е+6 2,75 Е-2 12,840 49,6
крабоед 1,74 Е+6 2,36 Е-2 13,560 44,2
5,6 Макаккрабоед 3,66 Е+6 0,139 37,840 41,3
Пример 2. Анализ активности PAR2 и PAR1 на основе клеток
Клетки линии А549 человека, линии KNRK крысы, линии LL/2 мыши или линии CYNOM-K1 макака-крабоеда, экспрессирующие эндогенный PAR2, или клетки линии 1321N1-hPAR2-c18 человека, сверхэкспрессирующие PAR2 человека, высевали в количестве 5000 (человека, макака-крабоеда) или 7000 (мыши, крысы) клеток на лунку в покрытые PDL планшеты для культуры тканей (Greiner Bio-One). Клетки нагружали не требующим смывания красителем для кальция Fluo-Screen Quest™ Fluo-8 (AAT Bioquest, Inc). Клетки предварительно обрабатывали с помощью IgG или Fab, разбавленных аналитическим буфером (HBSS, 0,1% BSA, 20 мМ HEPES) в течение 1 ч при комнатной температуре. Для анализов клеток мыши и макака-крабоеда клетки предварительно обрабатывали с помощью 0,5 нМ или 10 нМ тромбина, соответственно, для десенсибилизирования активности PAR1. Кальциевые ответы, опосредованные PAR2, на 11 нМ (человека), 400 нМ (мыши) или 80 нМ (крысы, макака-крабоеда) трипсина (Polymun) определяли на устройстве для считывания планшетов с помощью визуализации флуоресценции (FLIPR) Tetra (Molecular Devices). Для установления функциональной активности в отношении PAR1 человека устанавливали также управляемые тромбином кальциевые ответы в линии клеток А549 человека на FLIPR Tetra и в этих анализах WEDE15 (Beckman Coulter) и АТАР2 (Life Technologies), представляющие собой нейтрализующие IgG к PAR1, использовали в качестве положительных контролей. Для установления функциональной активности в отношении разнообразных протеаз клетки линии 1321N1hPAR2-c18, сверхэкспрессирующие PAR2 человека, предварительно обрабатывали с помощью РаВ670129 перед стимуляцией высвобождения кальция с помощью 0,5 нМ трипсина, 500 нМтриптазы или 1 нМ матриптазы. Определения флуоресценции выполняли до, во время и после добавления протеазы и рассчитывали пиковые RFU на лунку. Рассчитывали зависимость значений ответов в % (относительно протеазы отдельно) от концентрации антитела и устанавливали значения IC50 с применением программного обеспечения GraphPad Prism.
Результаты, полученные для клеток человека, макака-крабоеда, крысы и мыши в этих анализах представлены на фиг. 3 (А,В,С и D, соответственно), рассчитанные значения IC50 для PAR2 - на фиг. 3Е и фиг. 6 (данные специфичности PAR1). Расчеты IC50 демонстрируют, что РаВ670129 эффективно ингибирует индуцированные трипсином кальциевые ответы, опосредованные PAR2, в клетках человека, мыши, крысы и макака-крабоеда, экспрессирующих эндогенный PAR2 (фиг. 3Е). Кроме того, в клетках линии А549 человека индуцированная тромбином активация PAR1 не ингибировалась с помощью РаВ670129, но ее можно было эффективно блокировать ворапаксаром и моноклональными антителами к PAR1 (фиг. 6). Эти данные демонстрируют, что РаВ670129 является эффективным и специфическим антагонистом PAR2. Применение РаВ670129 отдельно в отношении экспрессирующих PAR2 клеток не оказывало эффекта на основные клеточные уровни кальция, что говорит о том, что РаВ670129 не обладает агонистической активностью в отношении PAR2 (фиг. 4А). Кроме того, РаВ670129 эффективно противодействует индуцированным PAR2 ответам на разнообразные протеазы, в том числе трипсин, триптазу и матриптазу (фиг. 4В).
Анализ кальция в экспрессирующих PAR2 первичных нейронах и глиальных клетках DRG
Получали диссоциированные культуры дорсальных корешковых ганглиев (DRG) детенышей крыс линии Sprague Dawley и выращивали в покрытых ламинином и PDL планшетах для культуры тканей (Greiner Bio-One). Планшеты инкубировали при 37° в течение 24-72 ч перед применением в анализе. Клетки нагружали с помощью 2 мкМ чувствительного к кальцию красителя Fura-2 (Life Technologies). Клетки инкубировали в буфере для визуализации (HBSS, 20 мМ HEPES, 0,1 мМ сульфинпиразона, 10 мкМ антагониста PAR1, представляющего собой ворапаксар), содержащем антитела к PAR2 в количестве 20 нМ. Затем осуществляли количественное определение внутриклеточного кальция посредством визуализации с помощью Fura-2, основанный на измерении отношений, на микроскопе Olympus IX81, оснащенном ксеноновой дуговой лампой, возбуждающей при 340 и 380 нм, в ответ на применение агонистов, тромбина (Sigma) и матриптазы (R&D Systems), пептида LIGRLO, активирующего PAR2 (SEQ ID NO: 832), (Peptides International) и высокого содержания внеклеточного калия (50 мМ). Подсчитывали количество нейронов по сравнению с количеством глиальных клеток в поле зрения (нейроны определяли по демонстрации ответа на высокое содержание калия). Затем рассчитывали суммарное количество чувствительных к матриптазе нейронов и глиальных клеток в поле зрения. Результаты анализа кальция
- 37 044850 представлены на фиг. 5A-F и иллюстрируют, что антитело РаВ670129 эффективно снижает чувствительность к матриптазе в нейронах (фиг. 5А-С) и отличных от нейронов клетках DRG (фиг. 5D-F).
Пример 3. Эффекты антитела к PAR2 на крысиной модели боли при воспалении суставов
Внутрисуставное введение йодацетата мононатрия (MIA) в ипсилатеральное колено крыс линии Sprague Dawley приводило к развитию сильной и длительной гипералгезии и аллодинии, первоначально связанных с воспалительным ответом. Считается, что развитие этих признаков в этой животной модели является клинически значимым, при этом отражает симптомы, проявляющиеся у пациентов с хронической болью, вызванной воспалением, связанной с такими основными состояниями, как остеоартрит (ОА) или ревматоидный артрит (Bove et al., 2003; Fernihough et al., 2004; Kalbhen 1987). Ранее было продемонстрировано, что (с применением весовой нагрузки в качестве конечной точки) временная динамика индуцированной MIA гипералгезии следует двухфазному паттерну с ранним, преимущественно воспалительным компонентом, который чувствителен к Сох-2, и заметно снижается с помощью общепринятого стандарта, представляющего собой целекоксиб. Эта ранняя воспалительная фаза сменяется более хроническим болевым фенотипом, который чувствителен к прегабалину (PGB) и нечувствителен к целекоксибу, что указывает на наличие основного компонента более нейропатического типа.
Весовая нагрузка
Не получавшие лечение крысы равномерно распределяют вес тела между двумя задними лапами. Однако, когда инъецированное (левое) заднее колено воспалено и/или болит, вес перераспределяется так, чтобы на пораженную конечность ложился меньший вес (уменьшение весовой нагрузки на поврежденную конечность).
Весовую нагрузку на каждую заднюю конечность определяют с помощью устройства измерения недееспособности крыс (Linton Instruments, Великобритания).
Крыс линии Sprague Dawley помещали в устройство для измерения неспособности задними лапами на отдельные датчики и регистрировали среднее усилие, прикладываемое обеими задними конечностями, в течение 4 с.
Процедура
После доставки крысы проходили минимальный период привыкания в течение 7 дней до начала исследования. Не получавших лечение крыс акклиматизировали в процедурной комнате в их домашних клетках, с едой и водой, доступными в неограниченном количестве. Привыкания к камере весовой нагрузки осуществляли в течение нескольких дней. Исходные данные весовой нагрузки учитывали в последний день.
В день 0 после учета конечных исходных данных животных анестезировали с применением изофлурана и кислорода, смешанных 3:1 в стерильных условиях. Область левого колена выбривали и очищали разбавленным раствором гибискраба.
Остеоартрит (ОА) индуцировали инъекцией раствора MIA (Sigma, I2512), 25 мкл с концентрацией 80 мг/мл, (2 мг) в коленный сустав левой задней ноги. Ложнооперированным животным вводили инъекцию солевого раствора. Обеспечивали восстановление животных в теплой среде, а затем возвращали в их домашнюю клетку.
У животных развивалась воспалительная реакция после MIA, и они могли оберегать и вылизывать пораженный участок. Поэтому крыс тщательно контролировали на наличие неожиданных признаков дистресса или сильной боли, чтобы любое животное с такими признаками могло быть немедленно выбраковано.
Животных взвешивали ежедневно в течение первой недели, а затем каждые несколько дней. Весовую нагрузку оценивали в дни 3, 7, 10 и 14 после инъекции MIA на предмет развития хронической боли. В день 18 проводили определения весовой нагрузки, животных ранжировали и рандомизировали по группам лечения в соответствии с их окном MIA в схеме латинского квадрата.
Режим введения дозы антитела
Животных обрабатывали с помощью Par0067 (PAR2 + ve) 10 мг/кг или изотипического контроля (PAR2 - ve) 10 мг/кг в/в в день 18, а затем проводили определения весовой нагрузки через 4 ч и 1, 2, 6, 8, 10 и 14 дней после введения дозы антитела.
Режим введения дозы прегабалина и целекоксиба
Животным вводили дозу PGB (30 мг/кг п/о; 2 мл/кг) или целекоксиба (50 мг/кг п/о; 2 мл/кг) ежедневно в дни 24, 25, 26, 27 и 28 после инъекции MIA. Оценивания весовой нагрузки выполняли через 1 ч после введения дозы в дни 24, 26 и 28, а дальнейшие данные получали после прекращения медикаментозного лечения в день 32.
В дни 1, 2, 6, 10 и 14 после введения дозы, после оценивания весовой нагрузки через хвостовую вену отбирали 400 мкл крови для фармакокинетического анализа обработанных антителом и изотипическим контролем групп (n = 5/группа).
Оценка исследования
Показания весовой нагрузки (г) получали и для правой, и для левой задних лап и рассчитывали разницу. Данные выражали в виде отношения ипсилатеральная лапа/контралатеральная лапа в % ((WB слева/WB справа)*100) (среднее ± s.e.m.).
- 38 044850
Расчет
Показания ипсилатеральной лапы/показания контралатеральной лапы х 100. Диапазон от значения разницы WB для животных, не получавших лечение до значения разницы WB при измерении до введения дозы определяли как окно MIA.
Статистический анализ ANOVA для повторяющихся измерений с последующим применением критерия плановых сравнений с применением InVivoStat (invivostat.co.uk) (р < 0,05 считали значимым). Данные анализировали путем сравнения групп обработки с контрольной группой, получавшей средуноситель, в каждый момент времени.
Инъекция 2 мг МИА в коленный сустав вызвала заметную реакцию воспаления и гиперчувствительности, очевидную со дня 3, что выявляли по смещению весовой нагрузки между пораженной и непораженной задними лапами. Этот индуцированный MIA гиперактивный ответ все еще был очевиден во всех группах вплоть до дня 18 (и далее для контрольных животных, получавших среду-носитель), в который вводили первые исследуемые средства. Инъекция солевого раствора не влияла на весовую нагрузку.
Как показано на фиг. 7А, значительное и выраженное купирование гиперчувствительности наблюдали после ежедневного введения прегабалина (30 мг/кг) с дня 24-28 со слабым остаточным эффектом, все еще проявляющимся после предшествующего прекращения лечения в день 32. Напротив, при ежедневном введении целекоксиба (50 мг/кг) с дня 24-28 в лучшем случае показано только слабое купирование гиперчувствительности. Этот фармакологический профиль показывает, что гиперактивность, наблюдаемая во время этой фазы ответа на MIA, носит преимущественно нейропатический, а не воспалительный характер.
Как также показано на фиг. 7А, значительное купирование гиперчувствительности наблюдалось при применении Par0067 через 4 ч после введения дозы до дня 28 (10 дней после введения дозы). Никакого эффекта не наблюдали с изотипическим контролем в течение того же периода времени. На фиг. 7В проиллюстрирован эффект обработки различными концентрациями Par0067.
Пример 4. Эффект антитела к PAR2, представляющего собой РаВ670129, в отношении купирования механической гипералгезии, индуцированной частичным лигированием нерва, у самок мышей линии C57BL/6
Введение
Частичное лигирование седалищного нерва (PNL), как описано Seltzer (1990), является одной из ряда моделей лигирования нерва, которые, как сообщается, служат доклиническими моделями нейропатической боли. Оно вызывает глубокую механическую гипералгезию, уровень которой можно определить с помощью анальгизиметра, как описано Randall и Selitto (1957). В этом примере описываются эффекты введения РаВ670129, представляющего собой антитело к PAR2, на гипералгезию в этой модели повреждения нерва/нейропатической боли.
Процедура
Шестьдесят самок мышей линии C57BL/6 подвергали введению транспондеров для целей идентификации по меньшей мере за 5 дней до начала исследования. Уровень механической гипералгезии устанавливали с применением анальгезиметра (Randall & Selitto 1957) (Ugo Basile). Возрастающую силу применяли к дорсальной поверхности каждой задней лапы по очереди до тех пор, пока не наблюдали ответа отдергивания. В этот момент применение силы останавливали и записывали вес в граммах. Данные выражали в виде порога отдергивания в граммах для ипсилатеральной и контралатеральной лап. После установления исходного уровня показаний мышей делили на 2 группы с примерно равным соотношением порога отдергивания для ипсилатеральной/контралатеральной лапы, которых подвергали хирургической операции по частичному лигированию седалищного нерва или использовали в качестве ложнооперированных контролей. Во время операции мышей анестезировали изофлураном. После этого примерно 1 см левого седалищного нерва подвергали тупой диссекции через разрез на уровне середины бедра. Шовный материал (8/0 Virgin Silk: Ethicon) затем пропускали через дорсальную треть нерва и туго завязывали. Затем разрез закрывали с помощью клея и мышам обеспечивали возможность восстановления в течение по меньшей мере шести дней перед началом исследования. Ложнооперированные мыши проходили обработку по тому же протоколу, но после обнажения нерва мышам накладывали швы и обеспечивали возможность восстановления.
Мышей исследовали в отношении возникновения гипералгезии в дни 7 и 10 после операции. Любых мышей, у которых наблюдали соотношение порога одергивания ипсилатеральной/контралатеральной лапы больше 80%, классифицировали как не отвечавших и удаляли из исследования. После исследования в день 10 мышей дополнительно подразделяли на группы с получением окончательных групп обработки;
A. Группа 1: Ложнооперированное животное + изотипический контроль 10 мг/кг π/κ(Ν = 10)
B. Группа 2: Лигирование нерва + изотипический контроль 10 мг/кг п/к (N = 9)
C. Группа 3: Лигирование нерва + этанерцепт 0,3 мг/кг п/к (N = 9)
D. Группа 4: Лигирование нерва + РаВ670129 3 мг/кг п/к (N = 9)
E. Группа 5: Лигирование нерва + РаВ670129 10 мг/кг п/к (N = 9)
- 39 044850
F. Группа 6: Лигирование нерва + РаВ670129 50 мг/кг п/к (N = 9)
Мышам вводили контроль или исследуемые молекулы, разбавленные в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS), в день 13 и повторно исследовали на предмет изменений уровня механической гипералгезии через 4 часа после введения дозы, а также в дни 1, 2, 4 и 7 после введения дозы.
Анализ данных
Показатели ипсилатеральной лапы и контралатеральной лапы получали для каждого животного в каждый момент времени исследования. Весовую нагрузку на ипсилатеральную и контралатеральную задние конечности выражали в виде отношения и данные группы анализировали (PRISM) с применением 2-факторного ANOVA и попарных сравнений, при этом соответствие определяли с применением критерия Тьюки.
Результаты
Частичное лигирование седалищного нерва вызывало механическую гипералгезию, которая проявлялась в виде значительного снижения соотношения порога отдергивания ипсилатеральной/контралатеральной лапы в день 7 и 10 по сравнению с таковым у ложнооперированных контролей. После обработки изотипическим контролем у оперированных мышей не показано никаких изменений в уровне механической гипералгезии относительно уровней до введения дозы, что указывает на отсутствие эффекта. Введение внутреннего общепринятого стандарта, представляющего собой этанерцепта (0,3 мг/кг п/к), вызывало значительное купирование гипералгезии от 4 часов до 7 дней после введения дозы, что соответствовало результатам предыдущих исследований. РаВ670129 вызывало купирование, представленное в виде отношения значений для ипсилатеральной лапы/контралатеральной лапы, в зависимости от дозы, при этом пиковые эффекты наблюдали как при 10 мг/кг, так и при 50 мг/кг. Наиболее низкая доза 3 мг/кг, которая хотя и являлась значимой через 1, 2 и 7 дней после введения дозы, показала меньший эффект (см. фиг. 8).
Частичное лигирование седалищного нерва вызывало длительную механическую гипералгезию, что соответствовало ранее сообщенным результатам. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что это служит доклиническим коррелятом боли, наблюдаемой при нейропатической боли. Введение РаВ670129 показало значительное и связанное с дозой купирование этой гипералгезии, что указывает на потенциал применения антител к PAR2 в лечении нейропатической боли.
Библиография • Persic, L. et al. An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries. Gene 187, 9-18 (1997).
• Reikofski J and Tao BY (1992) Polymerase chain reaction (PCR) techniques for sitedirected mutagenesis. Biotechnol Adv, 10(4): 535-547.
• Bove SE, Calcaterra SL, Brooker RM, Huber CM, Guzman RE, Juneau PL, et al. Weight bearing as a measure of disease progression and efficacy of anti-inflammatory compounds in a model of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage 2003; 11 (11): 821-30. eng.
• Fernihough J, Gentry C, Malcangio M, Fox A, Rediske J, Pellas T, et al. Pain related behaviour in two models of osteoarthritis in the rat knee. Pain 2004; 112 (1-2): 83-93. eng.
• Kalbhen DA. Chemical model of osteoarthritis-a pharmacological evaluation. J Rheumatol 1987; 14 Spec No: 130-1. eng.
- 40 044850 • Clark RA, Shoaib M, Hewitt KN, Stanford SC, Bate ST (2012)., A comparison of InVivoStat with other statistical software packages for analysis of data generated from animal experiments, J Psychopharmacology, 26(8), 1136-1142.
• Myska Improving Biosensor Analysis. Journal of Molecular Recognition. 1999 • D.G. Myska Improving Biosensor Analysis. Journal of Molecular Recognition. 1999; 12 : 279-284.
• Myska DG, Improving Biosensor Analysis. Journal of Molecular Recognition. 1999; 12: 279-284.
• A.W. Drake, M.L. Tang, G.A. Papalia, G. Landes, M. Haak-Frendscho, S.L. Klakamp, Biacore surface matrix effects on the binding kinetics and affinity of an antigen/antibody complex, Anal. Biochem. 429 (2012) 58-69 • Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grisley G and Grey T, How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein, Protein Sci. 1995; 4: 2411-2423.
• Spooner J, Keen J, Nayyar K, Birkett N, Bond N, Bannister D, Tigue N, Higazi D, Kemp B, Vaughan T, Kippen A, Buchanan A. (2015) Evaluation of strategies to control Fab light chain dimer during mammalian expression and purification: A universal one-step process for purification of correctly assembled Fab. Biotechnol Bioeng. 112:1472-7.
• Daramola O, Stevenson J, Dean G, Hatton D, Pettman G, Holmes W, Field R (2014) A high yielding CHO transient system: co-expression of genes encoding EBNA-1 and GS enhances transient protein expression. Biotechnol Prog. 30(1):132-41.
• Mach H, Middaugh CR, Lewis RV (1992) Statistical determination of the average values of the extinction coefficients of tryptophan and tyrosine in native proteins. Anal. Biochem. 200(1):74-80.
• Seltzer Z, Dubner R, Shir Y (1990). A novel behavioural model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain 43: 205-218 • Randall LO, Selitto JJ (1957). A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Arch Int Pharmacodyn Ther. 111(4): 409-419
Перечень последовательностей PRT = аминокислотная последовательность
SEQ ID NO: Название клона Тип
1 ZZ15D2-D02 (Par0067) ДНК VH
2 ZZ15D2-D02 (Par0067) PRTVH
3 ZZ15D2-D02 (Par0067) PRTCDR1
4 ZZ15D2-D02 (Par0067) PRTCDR2
5 ZZ15D2-D02 (Par0067) PRTCDR3
6 ZZ15D2-D02 (Par0067) ДНК VL
7 ZZ15D2-D02 (Par0067) PRT VL
8 ZZ15D2-D02 (Par0067) PRTCDR1
9 ZZ15D2-D02 (Par0067) PRTCDR2
- 41 044850
10 ZZ15D2-D02 (Par0067) PRTCDR3
11 ZZ1RUE-F02(PaB670129) ДНК VH
12 ZZ1RUE-F02(PaB670129) PRTVH
13 ZZ1RUE-F02(РаВ670129) PRTCDR1
14 ZZ1RUE-F02(РаВ670129) PRTCDR2
15 ZZ1RUE-F02(РаВ670129) PRTCDR3
16 ZZ1RUE-F02(РаВ670129) flHKVL
17 ZZ1RUE-F02(РаВ670129) PRT VL
18 ZZ1RUE-F02(РаВ670129) PRTCDR1
19 ZZ1RUE-F02(РаВ670129) PRTCDR2
20 ZZ1RUE-F02(РаВ670129) PRTCDR3
21 ZZ1DRB-B08(РаВ670010) ДНК VH
22 ZZ1DRB-B08(РаВ670010) PRTVH
23 ZZ1DRB-B08(РаВ670010) PRTCDR1
24 ZZ1DRB-B08(РаВ670010) PRTCDR2
25 ZZ1DRB-B08(РаВ670010) PRTCDR3
26 ZZ1DRB-B08(РаВ670010) flHKVL
27 ZZ1DRB-B08(РаВ670010) PRT VL
28 ZZ1DRB-B08(РаВ670010) PRTCDR1
29 ZZ1DRB-B08(РаВ670010) PRTCDR2
30 ZZ1DRB-B08(РаВ670010) PRTCDR3
31 ZZ1IGD-D05 (РаВ670020) ДНК VH
32 ZZ1IGD-D05 (РаВ670020) PRTVH
33 ZZ1IGD-D05 (РаВ670020) PRTCDR1
34 ZZ1IGD-D05 (РаВ670020) PRTCDR2
35 ZZ1IGD-D05 (РаВ670020) PRTCDR3
36 ZZ1IGD-D05 (РаВ670020) flHKVL
37 ZZ1IGD-D05 (РаВ670020) PRT VL
38 ZZ1IGD-D05 (РаВ670020) PRTCDR1
39 ZZ1IGD-D05 (РаВ670020) PRTCDR2
40 ZZ1IGD-D05 (РаВ670020) PRTCDR3
41 ZZ1IGF-B11 (РаВ670034) ДНК VH
42 ZZ1IGF-B11 (РаВ670034) PRTVH
43 ZZ1IGF-B11 (РаВ670034) PRTCDR1
44 ZZ1IGF-B11 (РаВ670034) PRTCDR2
45 ZZ1IGF-B11 (РаВ670034) PRTCDR3
46 ZZ1IGF-B11 (РаВ670034) flHKVL
47 ZZ1IGF-B11 (РаВ670034) PRT VL
48 ZZ1IGF-B11 (РаВ670034) PRTCDR1
49 ZZ1IGF-B11 (РаВ670034) PRTCDR2
50 ZZ1IGF-B11 (РаВ670034) PRTCDR3
51 ZZ1KX3-F01 (РаВ670045) ДНК VH
52 ZZ1KX3-F01 (РаВ670045) PRTVH
53 ZZ1KX3-F01(РаВ670045) PRTCDR1
- 42 044850
54 ZZ1KX3-F01(PaB670045) PRTCDR2
55 ZZ1KX3-F01(РаВ670045) PRTCDR3
56 ZZ1KX3-F01 (РаВ670045) ДНК VL
57 ZZ1KX3-F01(РаВ670045) PRT VL
58 ZZ1KX3-F01(РаВ670045) PRTCDR1
59 ZZ1KX3-F01(РаВ670045) PRTCDR2
60 ZZ1KX3-F01 (РаВ670045) PRTCDR3
61 ZZ1KX4-E11(РаВ670048) ДНК VH
62 ZZ1KX4-E11(РаВ670048) PRTVH
63 ZZ1KX4-E11(РаВ670048) PRTCDR1
64 ZZ1KX4-E11(РаВ670048) PRTCDR2
65 ZZ1KX4-E11(РаВ670048) PRTCDR3
66 ZZ1KX4-E11(РаВ670048) ДНК VL
67 ZZ1KX4-E11(РаВ670048) PRT VL
68 ZZ1KX4-E11(РаВ670048) PRTCDR1
69 ZZ1KX4-E11(РаВ670048) PRTCDR2
70 ZZ1KX4-E11(РаВ670048) PRTCDR3
71 ZZ1KX6-B09(РаВ670064) ДНК VH
72 ZZ1KX6-B09(РаВ670064) PRTVH
73 ZZ1KX6-B09(РаВ670064) PRTCDR1
74 ZZ1KX6-B09(РаВ670064) PRTCDR2
75 ZZ1KX6-B09(РаВ670064) PRTCDR3
76 ZZ1KX6-B09(РаВ670064) ДНК VL
77 ZZ1KX6-B09(РаВ670064) PRT VL
78 ZZ1KX6-B09(РаВ670064) PRTCDR1
79 ZZ1KX6-B09(РаВ670064) PRTCDR2
80 ZZ1KX6-B09(РаВ670064) PRTCDR3
81 ZZ1KX6-D05(РаВ670066) ДНК VH
82 ZZ1KX6-D05(РаВ670066) PRTVH
83 ZZ1KX6-D05(РаВ670066) PRTCDR1
84 ZZ1KX6-D05(РаВ670066) PRTCDR2
85 ZZ1KX6-D05(РаВ670066) PRTCDR3
86 ZZ1KX6-D05(РаВ670066) ДНК VL
87 ZZ1KX6-D05(РаВ670066) PRT VL
88 ZZ1KX6-D05(РаВ670066) PRTCDR1
89 ZZ1KX6-D05(РаВ670066) PRTCDR2
90 ZZ1KX6-D05(РаВ670066) PRTCDR3
91 ZZ1KXE-A05(РаВ670067) ДНК VH
92 ZZ1KXE-A05(РаВ670067) PRTVH
93 ZZ1KXE-A05(РаВ670067) PRTCDR1
94 ZZ1KXE-A05(РаВ670067) PRTCDR2
95 ZZ1KXE-A05(РаВ670067) PRTCDR3
96 ZZ1KXE-A05(РаВ670067) ДНК VL
97 ZZ1KXE-A05(РаВ670067) PRT VL
- 43 044850
98 ZZ1KXE-A05(PaB670067) PRTCDR1
99 ZZ1KXE-A05(PaB670067) PRTCDR2
100 ZZ1KXE-A05(РаВ670067) PRTCDR3
101 ZZ1KXE-B01(РаВ670068) ДНК VH
102 ZZ1KXE-B01(РаВ670068) PRTVH
103 ZZ1KXE-B01(РаВ670068) PRTCDR1
104 ZZ1KXE-B01(РаВ670068) PRTCDR2
105 ZZ1KXE-B01(РаВ670068) PRTCDR3
106 ZZ1KXE-B01(РаВ670068) ДНК VL
107 ZZ1KXE-B01(РаВ670068) PRT VL
108 ZZ1KXE-B01(РаВ670068) PRTCDR1
109 ZZ1KXE-B01(РаВ670068) PRTCDR2
110 ZZ1KXE-B01(РаВ670068) PRTCDR3
111 ZZ1KXE-D06(РаВ670070) ДНК VH
112 ZZ1KXE-D06(РаВ670070) PRTVH
113 ZZ1KXE-D06(РаВ670070) PRTCDR1
114 ZZ1KXE-D06(РаВ670070) PRTCDR2
115 ZZ1KXE-D06(РаВ670070) PRTCDR3
116 ZZ1KXE-D06(РаВ670070) ДНК VL
117 ZZ1KXE-D06(РаВ670070) PRT VL
118 ZZ1KXE-D06(РаВ670070) PRTCDR1
119 ZZ1KXE-D06(РаВ670070) PRTCDR2
120 ZZ1KXE-D06(РаВ670070) PRTCDR3
121 ZZ1L3F-A02 (РаВ670071) ДНК VH
122 ZZ1L3F-A02 (РаВ670071) PRTVH
123 ZZ1L3F-A02 (РаВ670071) PRTCDR1
124 ZZ1L3F-A02 (РаВ670071) PRTCDR2
125 ZZ1L3F-A02 (РаВ670071) PRTCDR3
126 ZZ1L3F-A02(РаВ670071) ДНК VL
127 ZZ1L3F-A02 (РаВ670071) PRT VL
128 ZZ1L3F-A02 (РаВ670071) PRTCDR1
129 ZZ1L3F-A02 (РаВ670071) PRTCDR2
130 ZZ1L3F-A02 (РаВ670071) PRTCDR3
131 ZZ1L3F-H03(РаВ670073) ДНК VH
132 ZZ1L3F-H03(РаВ670073) PRTVH
133 ZZ1L3F-H03(РаВ670073) PRTCDR1
134 ZZ1L3F-H03(РаВ670073) PRTCDR2
135 ZZ1L3F-H03 (РаВ670073) PRTCDR3
136 ZZ1L3F-H03(РаВ670073) flHKVL
137 ZZ1L3F-H03(РаВ670073) PRT VL
138 ZZ1L3F-H03(РаВ670073) PRTCDR1
139 ZZ1L3F-H03(РаВ670073) PRTCDR2
140 ZZ1L3F-H03(РаВ670073) PRTCDR3
141 ZZ1NHH-A05 (РаВ670075) ДНК VH
- 44 044850
142 ZZ1NHH-A05 (PaB670075) PRTVH
143 ZZ1NHH-A05 (РаВ670075) PRTCDR1
144 ZZ1NHH-A05 (РаВ670075) PRTCDR2
145 ZZ1NHH-A05 (РаВ670075) PRTCDR3
146 ZZ1NHH-A05 (РаВ670075) flHKVL
147 ZZ1NHH-A05 (РаВ670075) PRT VL
148 ZZ1NHH-A05 (РаВ670075) PRTCDR1
149 ZZ1NHH-A05 (РаВ670075) PRTCDR2
150 ZZ1NHH-A05 (РаВ670075) PRTCDR3
151 ZZ1NHH-F09 (РаВ670076) ДНК VH
152 ZZ1NHH-F09 (РаВ670076) PRTVH
153 ZZ1NHH-F09 (РаВ670076) PRTCDR1
154 ZZ1NHH-F09 (РаВ670076) PRTCDR2
155 ZZ1NHH-F09 (РаВ670076) PRTCDR3
156 ZZ1NHH-F09 (РаВ670076) flHKVL
157 ZZ1NHH-F09 (РаВ670076) PRT VL
158 ZZ1NHH-F09 (РаВ670076) PRTCDR1
159 ZZ1NHH-F09 (РаВ670076) PRTCDR2
160 ZZ1NHH-F09 (РаВ670076) PRTCDR3
161 ZZ1OZJ-C11 (РаВ670077) ДНК VH
162 ZZ1OZJ-C11 (РаВ670077) PRTVH
163 ZZ1OZJ-C11 (РаВ670077) PRTCDR1
164 ZZ1OZJ-C11 (РаВ670077) PRTCDR2
165 ZZ1OZJ-C11 (РаВ670077) PRTCDR3
166 ZZ1OZJ-C11 (РаВ670077) flHKVL
167 ZZ1OZJ-C11 (РаВ670077) PRT VL
168 ZZ1OZJ-C11 (РаВ670077) PRTCDR1
169 ZZ1OZJ-C11 (РаВ670077) PRTCDR2
170 ZZ1OZJ-C11 (РаВ670077) PRTCDR3
171 ZZ1OZJ-G03 (РаВ670078) ДНК VH
172 ZZ1OZJ-G03 (РаВ670078) PRTVH
173 ZZ1OZJ-G03 (РаВ670078) PRTCDR1
174 ZZ1OZJ-G03 (РаВ670078) PRTCDR2
175 ZZ1OZJ-G03 (РаВ670078) PRTCDR3
176 ZZ1OZJ-G03 (РаВ670078) flHKVL
177 ZZ1OZJ-G03 (РаВ670078) PRT VL
178 ZZ1OZJ-G03 (РаВ670078) PRTCDR1
179 ZZ1OZJ-G03 (РаВ670078) PRTCDR2
180 ZZ1OZJ-G03 (РаВ670078) PRTCDR3
181 ZZ1OZJ-G05 (РаВ670079) ДНК VH
182 ZZ1OZJ-G05 (РаВ670079) PRTVH
183 ZZ1OZJ-G05 (РаВ670079) PRTCDR1
184 ZZ1OZJ-G05 (РаВ670079) PRTCDR2
185 ZZ1OZJ-G05 (РаВ670079) PRTCDR3
- 45 044850
186 ZZ1OZJ-G05 (PaB670079) flHKVL
187 ZZ1OZJ-G05 (РаВ670079) PRT VL
188 ZZ1OZJ-G05 (РаВ670079) PRTCDR1
189 ZZ1OZJ-G05 (РаВ670079) PRTCDR2
190 ZZ1OZJ-G05 (РаВ670079) PRTCDR3
191 РаВ670080 flHKVH
192 РаВ670080 PRTVH
193 РаВ670080 PRTCDR1
194 РаВ670080 PRTCDR2
195 РаВ670080 PRTCDR3
196 РаВ670080 flHKVL
197 РаВ670080 PRT VL
198 РаВ670080 PRTCDR1
199 РаВ670080 PRTCDR2
200 РаВ670080 PRTCDR3
201 ZZ1OZA-C01(РаВ670081) ДНК VH
202 ZZ1OZA-C01(РаВ670081) PRTVH
203 ZZ1OZA-C01(РаВ670081) PRTCDR1
204 ZZ1OZA-C01(РаВ670081) PRTCDR2
205 ZZ1OZA-C01(РаВ670081) PRTCDR3
206 ZZ1OZA-C01(РаВ670081) flHKVL
207 ZZ1OZA-C01 (РаВ670081) PRT VL
208 ZZ1OZA-C01(РаВ670081) PRTCDR1
209 ZZ1OZA-C01(РаВ670081) PRTCDR2
210 ZZ1OZA-C01(РаВ670081) PRTCDR3
211 ZZ1OZA-D02(РаВ670082) ДНК VH
212 ZZ1OZA-D02(РаВ670082) PRTVH
213 ZZ1OZA-D02 (РаВ670082) PRTCDR1
214 ZZ1OZA-D02(РаВ670082) PRTCDR2
215 ZZ1OZA-D02(РаВ670082) PRTCDR3
216 ZZ1OZA-D02 (РаВ670082) flHKVL
217 ZZ1OZA-D02 (РаВ670082) PRT VL
218 ZZ1OZA-D02(РаВ670082) PRTCDR1
219 ZZ1OZA-D02 (РаВ670082) PRTCDR2
220 ZZ1OZA-D02 (РаВ670082) PRTCDR3
221 ZZ1OZB-H05(РаВ670083) ДНК VH
222 ZZ1OZB-H05(РаВ670083) PRTVH
223 ZZ1OZB-H05(РаВ670083) PRTCDR1
224 ZZ1OZB-H05(РаВ670083) PRTCDR2
225 ZZ1OZB-H05(РаВ670083) PRTCDR3
226 ZZ1OZB-H05(РаВ670083) flHKVL
227 ZZ1OZB-H05(РаВ670083) PRT VL
228 ZZ1OZB-H05(РаВ670083) PRTCDR1
229 ZZ1OZB-H05(РаВ670083) PRTCDR2
- 46 044850
230 ZZ1OZB-H05(PaB670083) PRTCDR3
231 ZZ1PXA-A05(РаВ670084) ДНК VH
232 ZZ1PXA-A05(РаВ670084) PRTVH
233 ZZ1PXA-A05(РаВ670084) PRTCDR1
234 ZZ1PXA-A05(РаВ670084) PRTCDR2
235 ZZ1PXA-A05(РаВ670084) PRTCDR3
236 ZZ1PXA-A05(РаВ670084) flHKVL
237 ZZ1PXA-A05(РаВ670084) PRT VL
238 ZZ1PXA-A05(РаВ670084) PRTCDR1
239 ZZ1PXA-A05(РаВ670084) PRTCDR2
240 ZZ1PXA-A05(РаВ670084) PRTCDR3
241 ZZ1ODR-A02 (РаВ670085) ДНК VH
242 ZZ1ODR-A02 (РаВ670085) PRTVH
243 ZZ1ODR-A02 (РаВ670085) PRTCDR1
244 ZZ1ODR-A02 (РаВ670085) PRTCDR2
245 ZZ1ODR-A02 (РаВ670085) PRTCDR3
246 ZZ1ODR-A02 (РаВ670085) flHKVL
247 ZZ1ODR-A02 (РаВ670085) PRT VL
248 ZZ1ODR-A02 (РаВ670085) PRTCDR1
249 ZZ1ODR-A02 (РаВ670085) PRTCDR2
250 ZZ1ODR-A02 (РаВ670085) PRTCDR3
251 ZZ1ODR-B05 (РаВ670087) ДНК VH
252 ZZ1ODR-B05 (РаВ670087) PRTVH
253 ZZ1ODR-B05 (РаВ670087) PRTCDR1
254 ZZ1ODR-B05 (РаВ670087) PRTCDR2
255 ZZ1ODR-B05 (РаВ670087) PRTCDR3
256 ZZ1ODR-B05 (РаВ670087) flHKVL
257 ZZ1ODR-B05 (РаВ670087) PRT VL
258 ZZ1ODR-B05 (РаВ670087) PRTCDR1
259 ZZ1ODR-B05 (РаВ670087) PRTCDR2
260 ZZ1ODR-B05 (РаВ670087) PRTCDR3
261 ZZ1ODR-B11 (РаВ670088) ДНК VH
262 ZZ1ODR-B11 (РаВ670088) PRTVH
263 ZZ1ODR-B11 (РаВ670088) PRTCDR1
264 ZZ1ODR-B11 (РаВ670088) PRTCDR2
265 ZZ1ODR-B11 (РаВ670088) PRTCDR3
266 ZZ1ODR-B11 (РаВ670088) flHKVL
267 ZZ1ODR-B11 (РаВ670088) PRT VL
268 ZZ1ODR-B11 (РаВ670088) PRTCDR1
269 ZZ1ODR-B11 (РаВ670088) PRTCDR2
270 ZZ1ODR-B11 (РаВ670088) PRTCDR3
271 ZZ1ODR-C05 (РаВ670089) ДНК VH
272 ZZ1ODR-C05 (РаВ670089) PRTVH
273 ZZ1ODR-C05 (РаВ670089) PRTCDR1
- 47 044850
274 ZZ1ODR-C05 (PaB670089) PRTCDR2
275 ZZ1ODR-C05 (РаВ670089) PRTCDR3
276 ZZ1ODR-C05 (РаВ670089) flHKVL
277 ZZ1ODR-C05 (РаВ670089) PRT VL
278 ZZ1ODR-C05 (РаВ670089) PRTCDR1
279 ZZ1ODR-C05 (РаВ670089) PRTCDR2
280 ZZ1ODR-C05 (РаВ670089) PRTCDR3
281 ZZ1ODR-F02 (РаВ670090) ДНК VH
282 ZZ1ODR-F02 (РаВ670090) PRTVH
283 ZZ1ODR-F02 (РаВ670090) PRTCDR1
284 ZZ1ODR-F02 (РаВ670090) PRTCDR2
285 ZZ1ODR-F02 (РаВ670090) PRTCDR3
286 ZZ1ODR-F02 (РаВ670090) flHKVL
287 ZZ1ODR-F02 (РаВ670090) PRT VL
288 ZZ1ODR-F02 (РаВ670090) PRTCDR1
289 ZZ1ODR-F02 (РаВ670090) PRTCDR2
290 ZZ1ODR-F02 (РаВ670090) PRTCDR3
291 ZZ1ODR-G02 (РаВ670091) ДНК VH
292 ZZ1ODR-G02 (РаВ670091) PRTVH
293 ZZ1ODR-G02 (РаВ670091) PRTCDR1
294 ZZ1ODR-G02 (РаВ670091) PRTCDR2
295 ZZ1ODR-G02 (РаВ670091) PRTCDR3
296 ZZ1ODR-G02 (РаВ670091) flHKVL
297 ZZ1ODR-G02 (РаВ670091) PRT VL
298 ZZ1ODR-G02 (РаВ670091) PRTCDR1
299 ZZ1ODR-G02 (РаВ670091) PRTCDR2
300 ZZ1ODR-G02 (РаВ670091) PRTCDR3
301 ZZ1ODR-G11 (РаВ670092) ДНК VH
302 ZZ1ODR-G11 (РаВ670092) PRTVH
303 ZZ1ODR-G11 (РаВ670092) PRTCDR1
304 ZZ1ODR-G11 (РаВ670092) PRTCDR2
305 ZZ1ODR-G11 (РаВ670092) PRTCDR3
306 ZZ1ODR-G11 (РаВ670092) flHKVL
307 ZZ1ODR-G11 (РаВ670092) PRT VL
308 ZZ1ODR-G11 (РаВ670092) PRTCDR1
309 ZZ1ODR-G11 (РаВ670092) PRTCDR2
310 ZZ1ODR-G11 (РаВ670092) PRTCDR3
311 ZZ1ODR-H04 (РаВ670093) ДНК VH
312 ZZ1ODR-H04 (РаВ670093) PRTVH
313 ZZ1ODR-H04 (РаВ670093) PRTCDR1
314 ZZ1ODR-H04 (РаВ670093) PRTCDR2
315 ZZ1ODR-H04 (РаВ670093) PRTCDR3
316 ZZ1ODR-H04 (РаВ670093) flHKVL
317 ZZ1ODR-H04 (РаВ670093) PRT VL
- 48 044850
318 ZZ1ODR-H04 (PaB670093) PRTCDR1
319 ZZ1ODR-H04 (РаВ670093) PRTCDR2
320 ZZ1ODR-H04 (РаВ670093) PRTCDR3
321 ZZ1ODS-B08 (РаВ670094) ДНК VH
322 ZZ1ODS-B08 (РаВ670094) PRTVH
323 ZZ1ODS-B08 (РаВ670094) PRTCDR1
324 ZZ1ODS-B08 (РаВ670094) PRTCDR2
325 ZZ1ODS-B08 (РаВ670094) PRTCDR3
326 ZZ1ODS-B08 (РаВ670094) ДНК VL
327 ZZ1ODS-B08 (РаВ670094) PRT VL
328 ZZ1ODS-B08 (РаВ670094) PRTCDR1
329 ZZ1ODS-B08 (РаВ670094) PRTCDR2
330 ZZ1ODS-B08 (РаВ670094) PRTCDR3
331 ZZ1ODS-H05 (РаВ670095) ДНК VH
332 ZZ1ODS-H05 (РаВ670095) PRTVH
333 ZZ1ODS-H05 (РаВ670095) PRTCDR1
334 ZZ1ODS-H05 (РаВ670095) PRTCDR2
335 ZZ1ODS-H05 (РаВ670095) PRTCDR3
336 ZZ1ODS-H05 (РаВ670095) ДНК VL
337 ZZ1ODS-H05 (РаВ670095) PRT VL
338 ZZ1ODS-H05 (РаВ670095) PRTCDR1
339 ZZ1ODS-H05 (РаВ670095) PRTCDR2
340 ZZ1ODS-H05 (РаВ670095) PRTCDR3
341 ZZ1ODT-E11 (РаВ670097) ДНК VH
342 ZZ1ODT-E11 (РаВ670097) PRTVH
343 ZZ1ODT-E11 (РаВ670097) PRTCDR1
344 ZZ1ODT-E11 (РаВ670097) PRTCDR2
345 ZZ1ODT-E11 (РаВ670097) PRTCDR3
346 ZZ1ODT-E11 (РаВ670097) ДНК VL
347 ZZ1ODT-E11 (РаВ670097) PRT VL
348 ZZ1ODT-E11 (РаВ670097) PRTCDR1
349 ZZ1ODT-E11 (РаВ670097) PRTCDR2
350 ZZ1ODT-E11 (РаВ670097) PRTCDR3
351 ZZ1ODT-G01 (РаВ670098) ДНК VH
352 ZZ1ODT-G01 (РаВ670098) PRTVH
353 ZZ1ODT-G01 (РаВ670098) PRTCDR1
354 ZZ1ODT-G01 (РаВ670098) PRTCDR2
355 ZZ1ODT-G01 (РаВ670098) PRTCDR3
356 ZZ1ODT-G01 (РаВ670098) ДНК VL
357 ZZ1ODT-G01 (РаВ670098) PRT VL
358 ZZ1ODT-G01 (РаВ670098) PRTCDR1
359 ZZ1ODT-G01 (РаВ670098) PRTCDR2
360 ZZ1ODT-G01 (РаВ670098) PRTCDR3
361 РаВ670099 ДНК VH
- 49 044850
362 PaB670099 PRTVH
363 РаВ670099 PRTCDR1
364 РаВ670099 PRTCDR2
365 РаВ670099 PRTCDR3
366 РаВ670099 ДНК VL
367 РаВ670099 PRT VL
368 РаВ670099 PRTCDR1
369 РаВ670099 PRTCDR2
370 РаВ670099 PRTCDR3
371 РаВ670100 ДНК VH
372 РаВ670100 PRTVH
373 РаВ670100 PRTCDR1
374 РаВ670100 PRTCDR2
375 РаВ670100 PRTCDR3
376 РаВ670100 ДНК VL
377 РаВ670100 PRT VL
378 РаВ670100 PRTCDR1
379 РаВ670100 PRTCDR2
380 РаВ670100 PRTCDR3
381 ZZ1ODO-H01 (РаВ670101) ДНК VH
382 ZZ1ODO-H01 (РаВ670101) PRTVH
383 ZZ1ODO-H01 (РаВ670101) PRTCDR1
384 ZZ1ODO-H01 (РаВ670101) PRTCDR2
385 ZZ1ODO-H01 (РаВ670101) PRTCDR3
386 ZZ1ODO-H01 (РаВ670101) flHKVL
387 ZZ1ODO-H01 (РаВ670101) PRT VL
388 ZZ1ODO-H01 (РаВ670101) PRTCDR1
389 ZZ1ODO-H01 (РаВ670101) PRTCDR2
390 ZZ1ODO-H01 (РаВ670101) PRTCDR3
391 ZZ1PXS-F08 (РаВ670102) ДНК VH
392 ZZ1PXS-F08 (РаВ670102) PRTVH
393 ZZ1PXS-F08 (РаВ670102) PRTCDR1
394 ZZ1PXS-F08 (РаВ670102) PRTCDR2
395 ZZ1PXS-F08 (РаВ670102) PRTCDR3
396 ZZ1PXS-F08 (РаВ670102) flHKVL
397 ZZ1PXS-F08 (РаВ670102) PRT VL
398 ZZ1PXS-F08 (РаВ670102) PRTCDR1
399 ZZ1PXS-F08 (РаВ670102) PRTCDR2
400 ZZ1PXS-F08 (РаВ670102) PRTCDR3
401 ZZ1RCX-C09(РаВ670103) ДНК VH
402 ZZ1RCX-C09(РаВ670103) PRTVH
403 ZZ1RCX-C09(РаВ670103) PRTCDR1
404 ZZ1RCX-C09(РаВ670103) PRTCDR2
405 ZZ1RCX-C09(РаВ670103) PRTCDR3
- 50 044850
406 ZZ1RCX-C09(PaB670103) ДНК VL
407 ZZ1RCX-C09(РаВ670103) PRT VL
408 ZZ1RCX-C09(РаВ670103) PRTCDR1
409 ZZ1RCX-C09(РаВ670103) PRTCDR2
410 ZZ1RCX-C09(РаВ670103) PRTCDR3
411 РаВ670104 ДНК VH
412 РаВ670104 PRTVH
413 РаВ670104 PRTCDR1
414 РаВ670104 PRTCDR2
415 РаВ670104 PRTCDR3
416 РаВ670104 ДНК VL
417 РаВ670104 PRT VL
418 РаВ670104 PRTCDR1
419 РаВ670104 PRTCDR2
420 РаВ670104 PRTCDR3
421 ZZ1RD0-D01(РаВ670105) ДНК VH
422 ZZ1RD0-D01 (РаВ670105) PRTVH
423 ZZ1RD0-D01(РаВ670105) PRTCDR1
424 ZZ1RD0-D01(РаВ670105) PRTCDR2
425 ZZ1RD0-D01(РаВ670105) PRTCDR3
426 ZZ1RD0-D01(РаВ670105) ДНК VL
427 ZZ1RD0-D01(РаВ670105) PRT VL
428 ZZ1RD0-D01(РаВ670105) PRTCDR1
429 ZZ1RD0-D01(РаВ670105) PRTCDR2
430 ZZ1RD0-D01(РаВ670105) PRTCDR3
431 ZZ1RD0-G02(РаВ670106) ДНК VH
432 ZZ1RD0-G02(РаВ670106) PRTVH
433 ZZ1RD0-G02(РаВ670106) PRTCDR1
434 ZZ1RD0-G02(РаВ670106) PRTCDR2
435 ZZ1RD0-G02(РаВ670106) PRTCDR3
436 ZZ1RD0-G02(РаВ670106) flHKVL
437 ZZ1RD0-G02(РаВ670106) PRT VL
438 ZZ1RD0-G02(РаВ670106) PRTCDR1
439 ZZ1RD0-G02(РаВ670106) PRTCDR2
440 ZZ1RD0-G02(РаВ670106) PRTCDR3
441 ZZ1RD3-D09(РаВ670107) ДНК VH
442 ZZ1RD3-D09(РаВ670107) PRTVH
443 ZZ1RD3-D09(РаВ670107) PRTCDR1
444 ZZ1RD3-D09(РаВ670107) PRTCDR2
445 ZZ1RD3-D09(РаВ670107) PRTCDR3
446 ZZ1RD3-D09(РаВ670107) ДНК VL
447 ZZ1RD3-D09(РаВ670107) PRT VL
448 ZZ1RD3-D09(РаВ670107) PRTCDR1
449 ZZ1RD3-D09(РаВ670107) PRTCDR2
- 51 044850
450 ZZ1RD3-D09(PaB670107) PRTCDR3
451 ZZ1RD3-H03(РаВ670108) ДНК VH
452 ZZ1RD3-H03 (РаВ670108) PRTVH
453 ZZ1RD3-H03 (РаВ670108) PRTCDR1
454 ZZ1RD3-H03 (РаВ670108) PRTCDR2
455 ZZ1RD3-H03 (РаВ670108) PRTCDR3
456 ZZ1RD3-H03 (РаВ670108) ДНК VL
457 ZZ1RD3-H03 (РаВ670108) PRT VL
458 ZZ1RD3-H03(РаВ670108) PRTCDR1
459 ZZ1RD3-H03(РаВ670108) PRTCDR2
460 ZZ1RD3-H03(РаВ670108) PRTCDR3
461 ZZ1RUC-C01(РаВ670114) ДНК VH
462 ZZ1RUC-C01(РаВ670114) PRTVH
463 ZZ1RUC-C01(РаВ670114) PRTCDR1
464 ZZ1RUC-C01(РаВ670114) PRTCDR2
465 ZZ1RUC-C01 (РаВ670114) PRTCDR3
466 ZZ1RUC-C01(РаВ670114) flHKVL
467 ZZ1RUC-C01 (РаВ670114) PRT VL
468 ZZ1RUC-C01(РаВ670114) PRTCDR1
469 ZZ1RUC-C01(РаВ670114) PRTCDR2
470 ZZ1RUC-C01 (РаВ670114) PRTCDR3
471 ZZ1RUC-G02 (РаВ670115) ДНК VH
472 ZZ1RUC-G02 (РаВ670115) PRTVH
473 ZZ1RUC-G02 (РаВ670115) PRTCDR1
474 ZZ1RUC-G02 (РаВ670115) PRTCDR2
475 ZZ1RUC-G02 (РаВ670115) PRTCDR3
476 ZZ1RUC-G02 (РаВ670115) ДНК VL
477 ZZ1RUC-G02 (РаВ670115) PRT VL
478 ZZ1RUC-G02 (РаВ670115) PRTCDR1
479 ZZ1RUC-G02 (РаВ670115) PRTCDR2
480 ZZ1RUC-G02 (РаВ670115) PRTCDR3
481 ZZ1RUC-B04(РаВ670116) ДНК VH
482 ZZ1RUC-B04 (РаВ670116) PRTVH
483 ZZ1RUC-B04(РаВ670116) PRTCDR1
484 ZZ1RUC-B04(РаВ670116) PRTCDR2
485 ZZ1RUC-B04(РаВ670116) PRTCDR3
486 ZZ1RUC-B04(РаВ670116) ДНК VL
487 ZZ1RUC-B04(РаВ670116) PRT VL
488 ZZ1RUC-B04(РаВ670116) PRTCDR1
489 ZZ1RUC-B04(РаВ670116) PRTCDR2
490 ZZ1RUC-B04(РаВ670116) PRTCDR3
491 ZZ1RUC-A06 (РаВ670117) ДНК VH
492 ZZ1RUC-A06 (РаВ670117) PRTVH
493 ZZ1RUC-A06 (РаВ670117) PRTCDR1
- 52 044850
494 ZZ1RUC-A06 (PaB670117) PRTCDR2
495 ZZ1RUC-A06 (РаВ670117) PRTCDR3
496 ZZ1RUC-A06 (РаВ670117) flHKVL
497 ZZ1RUC-A06 (РаВ670117) PRT VL
498 ZZ1RUC-A06 (РаВ670117) PRTCDR1
499 ZZ1RUC-A06 (РаВ670117) PRTCDR2
500 ZZ1RUC-A06 (РаВ670117) PRTCDR3
501 ZZ1RUC-A07 (РаВ670118) ДНК VH
502 ZZ1RUC-A07 (РаВ670118) PRTVH
503 ZZ1RUC-A07 (РаВ670118) PRTCDR1
504 ZZ1RUC-A07 (РаВ670118) PRTCDR2
505 ZZ1RUC-A07 (РаВ670118) PRTCDR3
506 ZZ1RUC-A07 (РаВ670118) flHKVL
507 ZZ1RUC-A07 (РаВ670118) PRT VL
508 ZZ1RUC-A07 (РаВ670118) PRTCDR1
509 ZZ1RUC-A07 (РаВ670118) PRTCDR2
510 ZZ1RUC-A07 (РаВ670118) PRTCDR3
511 ZZ1RUC-G08 (РаВ670119) ДНК VH
512 ZZ1RUC-G08 (РаВ670119) PRTVH
513 ZZ1RUC-G08 (РаВ670119) PRTCDR1
514 ZZ1RUC-G08 (РаВ670119) PRTCDR2
515 ZZ1RUC-G08 (РаВ670119) PRTCDR3
516 ZZ1RUC-G08 (РаВ670119) ДНК VL
517 ZZ1RUC-G08 (РаВ670119) PRT VL
518 ZZ1RUC-G08 (РаВ670119) PRTCDR1
519 ZZ1RUC-G08 (РаВ670119) PRTCDR2
520 ZZ1RUC-G08 (РаВ670119) PRTCDR3
521 ZZ1RUC-C11(РаВ670120) ДНК VH
522 ZZ1RUC-C11(РаВ670120) PRTVH
523 ZZ1RUC-C11(РаВ670120) PRTCDR1
524 ZZ1RUC-C11 (РаВ670120) PRTCDR2
525 ZZ1RUC-C11(РаВ670120) PRTCDR3
526 ZZ1RUC-C11(РаВ670120) ДНК VL
527 ZZ1RUC-C11(РаВ670120) PRT VL
528 ZZ1RUC-C11(РаВ670120) PRTCDR1
529 ZZ1RUC-C11(РаВ670120) PRTCDR2
530 ZZ1RUC-C11(РаВ670120) PRTCDR3
531 ZZ1RUC-H11 (РаВ670121) ДНК VH
532 ZZ1RUC-H11(РаВ670121) PRTVH
533 ZZ1RUC-H11(РаВ670121) PRTCDR1
534 ZZ1RUC-H11 (РаВ670121) PRTCDR2
535 ZZ1RUC-H11(РаВ670121) PRTCDR3
536 ZZ1RUC-H11(РаВ670121) ДНК VL
537 ZZ1RUC-H11 (РаВ670121) PRT VL
- 53 044850
538 ZZ1RUC-H11(PaB670121) PRTCDR1
539 ZZ1RUC-H11(PaB670121) PRTCDR2
540 ZZ1RUC-H11(PaB670121) PRT CDR3
541 ZZ1RUD-A02 (PaB670122) ДНК VH
542 ZZ1RUD-A02 (РаВ670122) PRTVH
543 ZZ1RUD-A02 (РаВ670122) PRTCDR1
544 ZZ1RUD-A02 (РаВ670122) PRTCDR2
545 ZZ1RUD-A02 (РаВ670122) PRT CDR3
546 ZZ1RUD-A02 (РаВ670122) ДНК VL
547 ZZ1RUD-A02 (РаВ670122) PRT VL
548 ZZ1RUD-A02 (РаВ670122) PRTCDR1
549 ZZ1RUD-A02 (РаВ670122) PRTCDR2
550 ZZ1RUD-A02 (РаВ670122) PRT CDR3
551 ZZ1RUD-H03 (РаВ670123) ДНК VH
552 ZZ1RUD-H03 (РаВ670123) PRTVH
553 ZZ1RUD-H03 (РаВ670123) PRTCDR1
554 ZZ1RUD-H03 (РаВ670123) PRTCDR2
555 ZZ1RUD-H03 (РаВ670123) PRT CDR3
556 ZZ1RUD-H03 (РаВ670123) ДНК VL
557 ZZ1RUD-H03 (РаВ670123) PRT VL
558 ZZ1RUD-H03 (РаВ670123) PRTCDR1
559 ZZ1RUD-H03 (РаВ670123) PRTCDR2
560 ZZ1RUD-H03 (РаВ670123) PRT CDR3
561 ZZ1RUD-H06 (РаВ670125) ДНК VH
562 ZZ1RUD-H06 (РаВ670125) PRTVH
563 ZZ1RUD-H06 (РаВ670125) PRTCDR1
564 ZZ1RUD-H06 (РаВ670125) PRTCDR2
565 ZZ1RUD-H06 (РаВ670125) PRT CDR3
566 ZZ1RUD-H06 (РаВ670125) ДНК VL
567 ZZ1RUD-H06 (РаВ670125) PRT VL
568 ZZ1RUD-H06 (РаВ670125) PRTCDR1
569 ZZ1RUD-H06 (РаВ670125) PRTCDR2
570 ZZ1RUD-H06 (РаВ670125) PRT CDR3
571 ZZ1RUD-B08 (РаВ670126) ДНК VH
572 ZZ1RUD-B08(РаВ670126) PRTVH
573 ZZ1RUD-B08 (РаВ670126) PRTCDR1
574 ZZ1RUD-B08(РаВ670126) PRTCDR2
575 ZZ1RUD-B08 (РаВ670126) PRT CDR3
576 ZZ1RUD-B08(РаВ670126) ДНК VL
577 ZZ1RUD-B08(РаВ670126) PRT VL
578 ZZ1RUD-B08(РаВ670126) PRTCDR1
579 ZZ1RUD-B08(РаВ670126) PRTCDR2
580 ZZ1RUD-B08(РаВ670126) PRT CDR3
581 ZZ1RUD-H10 (РаВ670127) ДНК VH
- 54 044850
582 ZZ1RUD-H10 (PaB670127) PRTVH
583 ZZ1RUD-H10 (PaB670127) PRTCDR1
584 ZZ1RUD-H10 (PaB670127) PRTCDR2
585 ZZ1RUD-H10 (PaB670127) PRTCDR3
586 ZZ1RUD-H10 (PaB670127) ДНК VL
587 ZZ1RUD-H10 (PaB670127) PRT VL
588 ZZ1RUD-H10 (PaB670127) PRTCDR1
589 ZZ1RUD-H10 (PaB670127) PRTCDR2
590 ZZ1RUD-H10 (PaB670127) PRTCDR3
591 ZZ1RUE-A01 (PaB670128) ДНК VH
592 ZZ1RUE-A01 (PaB670128) PRTVH
593 ZZ1RUE-A01(PaB670128) PRTCDR1
594 ZZ1RUE-A01 (PaB670128) PRTCDR2
595 ZZ1RUE-A01(PaB670128) PRTCDR3
596 ZZ1RUE-A01(PaB670128) ДНК VL
597 ZZ1RUE-A01(PaB670128) PRT VL
598 ZZ1RUE-A01(PaB670128) PRTCDR1
599 ZZ1RUE-A01 (PaB670128) PRTCDR2
600 ZZ1RUE-A01(PaB670128) PRTCDR3
601 ZZ1RUF-A01 (PaB670136) ДНК VH
602 ZZ1RUF-A01 (PaB670136) PRTVH
603 ZZ1RUF-A01 (PaB670136) PRTCDR1
604 ZZ1RUF-A01 (PaB670136) PRTCDR2
605 ZZ1RUF-A01 (PaB670136) PRTCDR3
606 ZZ1RUF-A01 (PaB670136) ДНК VL
607 ZZ1RUF-A01 (PaB670136) PRT VL
608 ZZ1RUF-A01 (PaB670136) PRTCDR1
609 ZZ1RUF-A01 (PaB670136) PRTCDR2
610 ZZ1RUF-A01 (PaB670136) PRTCDR3
611 ZZ1RUF-B06(PaB670137) ДНК VH
612 ZZ1RUF-B06(РаВ670137) PRTVH
613 ZZ1RUF-B06(РаВ670137) PRTCDR1
614 ZZ1RUF-B06(РаВ670137) PRTCDR2
615 ZZ1RUF-B06(РаВ670137) PRTCDR3
616 ZZ1RUF-B06(РаВ670137) ДНК VL
617 ZZ1RUF-B06(РаВ670137) PRT VL
618 ZZ1RUF-B06(РаВ670137) PRTCDR1
619 ZZ1RUF-B06(РаВ670137) PRTCDR2
620 ZZ1RUF-B06(РаВ670137) PRTCDR3
621 РаВ670141 ДНК VH
622 РаВ670141 PRTVH
623 РаВ670141 PRTCDR1
624 РаВ670141 PRTCDR2
625 РаВ670141 PRTCDR3
- 55 044850
626 PaB670141 ДНК VL
627 РаВ670141 PRT VL
628 РаВ670141 PRTCDR1
629 РаВ670141 PRTCDR2
630 РаВ670141 PRTCDR3
631 РаВ670142 ДНК VH
632 РаВ670142 PRTVH
633 РаВ670142 PRTCDR1
634 РаВ670142 PRTCDR2
635 РаВ670142 PRTCDR3
636 РаВ670142 ДНК VL
637 РаВ670142 PRT VL
638 РаВ670142 PRTCDR1
639 РаВ670142 PRTCDR2
640 РаВ670142 PRTCDR3
641 РаВ670143 ДНК VH
642 РаВ670143 PRTVH
643 РаВ670143 PRTCDR1
644 РаВ670143 PRTCDR2
645 РаВ670143 PRTCDR3
646 РаВ670143 ДНК VL
647 РаВ670143 PRT VL
648 РаВ670143 PRTCDR1
649 РаВ670143 PRTCDR2
650 РаВ670143 PRTCDR3
651 РаВ670144 ДНК VH
652 РаВ670144 PRTVH
653 РаВ670144 PRTCDR1
654 РаВ670144 PRTCDR2
655 РаВ670144 PRTCDR3
656 РаВ670144 ДНК VL
657 РаВ670144 PRT VL
658 РаВ670144 PRTCDR1
659 РаВ670144 PRTCDR2
660 РаВ670144 PRTCDR3
661 РаВ670146 ДНК VH
662 РаВ670146 PRTVH
663 РаВ670146 PRTCDR1
664 РаВ670146 PRTCDR2
665 РаВ670146 PRTCDR3
666 РаВ670146 ДНК VL
667 РаВ670146 PRT VL
668 РаВ670146 PRTCDR1
669 РаВ670146 PRTCDR2
- 56 044850
670 PaB670146 PRTCDR3
671 РаВ670148 ДНК VH
672 РаВ670148 PRTVH
673 РаВ670148 PRTCDR1
674 РаВ670148 PRTCDR2
675 РаВ670148 PRTCDR3
676 РаВ670148 flHKVL
677 РаВ670148 PRT VL
678 РаВ670148 PRTCDR1
679 РаВ670148 PRTCDR2
680 РаВ670148 PRTCDR3
681 РаВ670149 ДНК VH
682 РаВ670149 PRTVH
683 РаВ670149 PRTCDR1
684 РаВ670149 PRTCDR2
685 РаВ670149 PRTCDR3
686 РаВ670149 flHKVL
687 РаВ670149 PRT VL
688 РаВ670149 PRTCDR1
689 РаВ670149 PRTCDR2
690 РаВ670149 PRTCDR3
691 РаВ670151 ДНК VH
692 РаВ670151 PRTVH
693 РаВ670151 PRTCDR1
694 РаВ670151 PRTCDR2
695 РаВ670151 PRTCDR3
696 РаВ670151 flHKVL
697 РаВ670151 PRT VL
698 РаВ670151 PRTCDR1
699 РаВ670151 PRTCDR2
700 РаВ670151 PRTCDR3
701 РаВ670152 ДНК VH
702 РаВ670152 PRTVH
703 РаВ670152 PRTCDR1
704 РаВ670152 PRTCDR2
705 РаВ670152 PRTCDR3
706 РаВ670152 flHKVL
707 РаВ670152 PRT VL
708 РаВ670152 PRTCDR1
709 РаВ670152 PRTCDR2
710 РаВ670152 PRTCDR3
711 РаВ670153 ДНК VH
712 РаВ670153 PRTVH
713 РаВ670153 PRTCDR1
- 57 044850
714 PaB670153 PRTCDR2
715 РаВ670153 PRTCDR3
716 РаВ670153 ДНК VL
717 РаВ670153 PRT VL
718 РаВ670153 PRTCDR1
719 РаВ670153 PRTCDR2
720 РаВ670153 PRTCDR3
721 РаВ670156 ДНК VH
722 РаВ670156 PRTVH
723 РаВ670156 PRTCDR1
724 РаВ670156 PRTCDR2
725 РаВ670156 PRTCDR3
726 РаВ670156 ДНК VL
727 РаВ670156 PRT VL
728 РаВ670156 PRTCDR1
729 РаВ670156 PRTCDR2
730 РаВ670156 PRTCDR3
731 РаВ670157 ДНК VH
732 РаВ670157 PRTVH
733 РаВ670157 PRTCDR1
734 РаВ670157 PRTCDR2
735 РаВ670157 PRTCDR3
736 РаВ670157 ДНК VL
737 РаВ670157 PRT VL
738 РаВ670157 PRTCDR1
739 РаВ670157 PRTCDR2
740 РаВ670157 PRTCDR3
741 РаВ670158 ДНК VH
742 РаВ670158 PRTVH
743 РаВ670158 PRTCDR1
744 РаВ670158 PRTCDR2
745 РаВ670158 PRTCDR3
746 РаВ670158 ДНК VL
747 РаВ670158 PRT VL
748 РаВ670158 PRTCDR1
749 РаВ670158 PRTCDR2
750 РаВ670158 PRTCDR3
751 РаВ670159 ДНК VH
752 РаВ670159 PRTVH
753 РаВ670159 PRTCDR1
754 РаВ670159 PRTCDR2
755 РаВ670159 PRTCDR3
756 РаВ670159 ДНК VL
757 РаВ670159 PRT VL
- 58 044850
758 PaB670159 PRTCDR1
759 РаВ670159 PRTCDR2
760 РаВ670159 PRTCDR3
761 РаВ670160 ДНК VH
762 РаВ670160 PRTVH
763 РаВ670160 PRTCDR1
764 РаВ670160 PRTCDR2
765 РаВ670160 PRTCDR3
766 РаВ670160 ДНК VL
767 РаВ670160 PRT VL
768 РаВ670160 PRTCDR1
769 РаВ670160 PRTCDR2
770 РаВ670160 PRTCDR3
771 РаВ670161 ДНК VH
772 РаВ670161 PRTVH
773 РаВ670161 PRTCDR1
774 РаВ670161 PRTCDR2
775 РаВ670161 PRTCDR3
776 РаВ670161 ДНК VL
777 РаВ670161 PRT VL
778 РаВ670161 PRTCDR1
779 РаВ670161 PRTCDR2
780 РаВ670161 PRTCDR3
781 РаВ670162 ДНК VH
782 РаВ670162 PRTVH
783 РаВ670162 PRTCDR1
784 РаВ670162 PRTCDR2
785 РаВ670162 PRTCDR3
786 РаВ670162 ДНК VL
787 РаВ670162 PRT VL
788 РаВ670162 PRTCDR1
789 РаВ670162 PRTCDR2
790 РаВ670162 PRTCDR3
791 РаВ670163 ДНК VH
792 РаВ670163 PRTVH
793 РаВ670163 PRTCDR1
794 РаВ670163 PRTCDR2
795 РаВ670163 PRTCDR3
796 РаВ670163 ДНК VL
797 РаВ670163 PRT VL
798 РаВ670163 PRTCDR1
799 РаВ670163 PRTCDR2
800 РаВ670163 PRTCDR3
- 59 044850
SEQ ID NO: 801- Препротеин PAR2 человека (учетный номер в GenBank NP_005233.3)
MRSPSAAWLLGAAILLAASLSCSGTIQGTNRSSKGRSLIGKVDGTSHVTGKGV TVETVFSVDEFSASVLTGKLTTVFLPIVYTIVFVVGLPSNGMALWVFLFRTKKKHPAV IYMANLALADLLSVIWFPLKIAYHIHGNNWIYGEALCNVLIGFFYGNMYCSILFMTCL SVQRYWVIVNPMGHSRKKANIAIGISLAIWLLILLVTIPLYVVKQTIFIPALNITTCHDV LPEQLLVGDMFNYFLSLAIGVFLFPAFLTASAYVLMIRMLRSSAMDENSEKKRKRAIK LIVTVLAMYLICFTPSNLLLVVHYFLIKSQGQSHVYALYIVALCLSTLNSCIDPFVYYF VSHDFRDHAKNALLCRS VRTVKQMQ VSLTSKKHSRKS S S YS SS STTVKTS Y
SEQ ID NO: 802- Привязанный лиганд PAR2 человека SLIGKVDGTSHVTGKGVTVETVFSVDEFSASVLTGKLTT
SEQ ID NO: 803- Иллюстративная каркасная область 1 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
SEQ ID NO: 804- Иллюстративная каркасная область 2 VH WVRQAPGKGLEWVS
SEQ ID NO: 805- Иллюстративная каркасная область 3 VH RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
SEQ ID NO: 806- Иллюстративная каркасная область 4 VH WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 807- Иллюстративная каркасная область 1 VL SIELTQPPSVSVSPGQTASITC
SEQ ID NO: 808- Иллюстративная каркасная область 2 VL WYQQKPGQSPVLVIY
SEQ ID NO: 809- Иллюстративная каркасная область 3 VL GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC
SEQ ID NO: 810- Иллюстративная каркасная область 4 VL FGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 811— Иллюстративная CDR2 VH
TISYSGSHISYHDSVHH
SEQ ID NO: 812— Иллюстративная CDR2 VH
TISYHGSLISYHDSVHH
SEQ ID NO: 813— Иллюстративная CDR2 VH
- 60 044850
TISYHGSHISYADSVHH
SEQ ID NO: 814— Иллюстративная CDR2 VH
TISYHGSHISYHDSVKH
SEQ ID NO: 815— Иллюстративная CDR2 VH
TISYHGSHISYHDSVHG
SEQ ID NO: 816— Иллюстративная CDR2 VH
TISYHGSLISYADSVKG
SEQ ID NO: 817— Иллюстративная CDR2 VH
TISYSGSHISYADSVKG
SEQ ID NO: 818— Иллюстративная CDR2 VH
TISYHGSHISYADSVKG
SEQ ID NO: 819— Иллюстративная CDR3 VH
IHNDPMDV
SEQ ID NO: 820— Иллюстративная CDR3 VH
INHDPMDV
SEQ ID NO: 821— Иллюстративная VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS YAMNWVRQAPGKGLEWVSTIS YHGSHISYHDSVHHRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIHHDPMDVWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 822 — Иллюстративная VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S S YAMNWVRQAPGKGLEWVSTIS YSGSHISYHDSVHHRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIHHDPMDVWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 823 — Иллюстративная VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S S YAMNWVRQAPGKGLEWVSTIS YHGSLISYHDSVHHRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIHHDPMDVWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 824 — Иллюстративная VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S S YAMNWVRQAPGKGLEWVSTIS YHGSHISYADSVHHRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIHHDPMDVWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 825 — Иллюстративная VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S S YAMNWVRQAPGKGLEWVSTIS YHGSHISYHDSVKHRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIHHDPMDVWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 826 — Иллюстративная VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S S YAMNWVRQAPGKGLEWVSTIS YHGSHISYHDSVHGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIHHDPMDVWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 827 — Иллюстративная VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S S YAMNWVRQAPGKGLEWVSTIS YHGSHISYHDSVHHRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARINHDPMDVWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 828 — Иллюстративная VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S S YAMNWVRQAPGKGLEWVSTIS YHGSHISYHDSVHHRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIHNDPMDVWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 829 — Иллюстративная VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S S YAMNWVRQAPGKGLEWVSTIS YHGSLISYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIHHDPMDVWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 830 — Иллюстративная VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S S YAMNWVRQAPGKGLEWVSTIS YSGSHISYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIHHDPMDVWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 831 — Иллюстративная VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S S YAMNWVRQAPGKGLEWVSTIS YHGSHISYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIHHDPMDVWG QGTLVTVSS
Включение посредством ссылки
Все публикации и патенты, упомянутые в данном документе, настоящим включены в данный документ посредством ссылки в полном их объеме, как если бы каждая отдельная публикация или патент были конкретно и отдельно указаны как включенные посредством ссылки.
-

Claims (18)

  1. Хотя обсуждались конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, приведенное выше описание является иллюстративным, а не ограничительным. Многие варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники после рассмотрения настоящего описания и нижеприведенной формулы изобретения. Полный объем настоящего изобретения должен устанавливаться со ссылкой на пункты формулы изобретения вместе с полным объемом их эквивалентов и описанием вместе с такими вариантами.
    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с PAR2, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), при этом VH содержит:
    i) VH-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, ii) VH-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 818, iii) VH-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15, и при этом VL содержит:
    i) VL-CDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18, ii) VL-CDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, iii) VL-CDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.
  2. 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где VH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 831, и где VL содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 17.
  3. 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 12, и где VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 17.
  4. 4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.3, где VH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 12, и где VL содержит аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности под SEQ ID NO: 17.
  5. 5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv или Fab'.
  6. 6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
  7. 7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело представляет собой IgG.
  8. 8. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, где VH кодируется нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 95% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 11, и/или где VL кодируется нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 95% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 16.
  9. 9. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент предотвращает взаимодействие трипсина, триптазы и/или матриптазы с PAR2.
  10. 10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с PAR2 с большей аффинностью при рН 7,4, чем при рН 6,0.
  11. 11. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10.
  12. 12. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10 и содержащая нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 11.
  13. 13. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10 и содержащая нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95% или 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 16.
  14. 14. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 11-13.
  15. 15. Набор экспрессирующих векторов, содержащий:
    а) нуклеиновую кислоту по п. 12 и
    b) нуклеиновую кислоту по п.13.
  16. 16. Клетка-хозяин, содержащая один или несколько векторов по п.14 или набор векторов по п.15.
  17. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10.
  18. 18. Фармацевтический набор, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10 или композицию по п.17 и один или несколько контейнеров.
    -
EA201992186 2017-03-16 2018-03-16 Антитела к par2 и пути их применения EA044850B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/472,462 2017-03-16
US62/637,766 2018-03-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA044850B1 true EA044850B1 (ru) 2023-10-05

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11591389B2 (en) Nucleic acids encoding anti-PAR2 antibodies and uses thereof
US9260515B2 (en) Antibodies to human GDF8
JP6367233B2 (ja) 抗ｐｄｇｆｒ−ベータ抗体及びそれらの使用
CA2879724C (en) Human antibodies to gfr.alpha.3 and methods of use thereof
JP7034068B2 (ja) レプチン受容体を活性化させる抗原結合タンパク質
US20240190974A1 (en) Anti-acvr1 antibodies and uses thereof
US20240309100A1 (en) Anti-Trkb Monoclonal Antibodies And Methods Of Use
US12110336B2 (en) Method for treating a neurodegenerative disease by administering an anti-cellular prion protein (PrPc) antibody
TW202317643A (zh) 用於抗pacap抗體的組合物和方法
EA044850B1 (ru) Антитела к par2 и пути их применения
EA041171B1 (ru) Антитела к рецептору онкостатина m и их применение