EA031047B1

EA031047B1 - Антагонисты st2l и способы их применения

Info

Publication number: EA031047B1
Application number: EA201491996A
Authority: EA
Inventors: Карен Даффи; Кэтрин Хили; Роберта Лэмб; Рави Малавия; Майкл Пратта; Натали Фурсов; Цзиньцюань Ло; Майкл Насо; Марк Торнетта; Джон Уилер; Шэн-Дзюн У; ЛеРой Холл
Original assignee: Янссен Байотек, Инк.
Priority date: 2012-04-30
Filing date: 2013-04-29
Publication date: 2018-11-30
Also published as: EA201891264A2; SG10201608525SA; US20190062439A1; UA118336C2; US9090694B2; US9951137B2; TW202019969A; CN104411333A; PL2844292T3; NZ702136A; CL2014002955A1; KR20150008152A; KR20200037886A; TW201730216A; EP2844292A2; UY34774A; CO7240389A2; EP3597219A1; AU2017202610A1; MX2014013200A

Abstract

Изобретение относится к антагонистам ST2L, полинуклеотидам, кодирующим антагонисты или их фрагменты, а также к способам получения и использования указанных продуктов.

Description

031047 Bl

Перекрестные ссылки на смежные заявки

Настоящая заявка испрашивает преимущество заявки на патент США сер. № 13/798204, поданной 13 марта 2013 г., заявки на патент США сер. № 13/798226, поданной 13 марта 2013 г., предварительной заявки на патент США № 61/640407, поданной 30 апреля 2012 г., и предварительной заявки на патент США № 61/640238, поданной 30 апреля 2012 г., полное содержание каждой из которых включено в настоящий документ путем ссылки.

Область применения изобретения

Настоящее изобретение относится к антагонистам ST2L, полинуклеотидам, кодирующим антагонисты или их фрагменты, а также к способам получения и применения указанных продуктов.

Предпосылки создания изобретения

ST2L (IL-1RL1 или IL-33Ra) входит в семейство рецепторов Toll/IL-1 и экспрессируется на поверхности широкого спектра иммунных клеток, включая Т-клетки, естественные киллерные клетки и естественные Т-киллерные клетки (NK/NKT), базофильные клетки, эозинофилы, мастоциты и недавно описанные врожденные не-В/не-Т-лимфоидные клетки 2-го типа, неоциты и естественные хелперные клетки. Экспрессия ST2L также может быть индуцирована в дендритных клетках (DC), макрофагах и нейтрофилах. ST2L может снижать реакционную способность Toll-подобных рецепторов TLR2, TLR4 и TLR9, но также может индуцировать высвобождение цитокинов 2-го типа в результате активации рецептора лигандом интерлейкином-33 и связывания со вспомогательным белком IL-IRAcP. IL-33 описывают как алармин, поскольку его полная форма находится в ядрах клеток эпителия и эндотелия в процессе гомеостаза, но может расщепляться и высвобождаться в процессе некроза.

Для ST2L-сигнализации необходимо связывание вспомогательного белка IL-1RAcP с предварительно образовавшимся комплексом ST2L/IL-33. Вспомогательный белок IL-1RAcP также входит в сигнальный комплекс IL-1 (/./|3. Были предложены модели взаимодействий ST2L, IL-33 и IL-1RAcP, а также взаимодействий между IL-1R1 и IL-1RAcP (Lingel et al., Cell 17:1398-1410, 2009 г.; Wang et al., Nat Immunol 11:905-11, 2010 г.). Недавно было показано, что ST2L/IL-33/IL-1RAcP образуют на мастоцитах сигнальный комплекс с c-Kit, рецептором фактора стволовых клеток (SCF). IL-33 индуцировал в первичных мастоцитах SCF-зависимую продукцию цитокинов (Drube et al., Blood 115:3899-906, 2010 г.).

Активация ST2L приводит к гипертрофированным ответам, связанным с цитокинами 2-го типа (особенно IL-5 и IL-13), активации мастоцитов и эозинофилов и гиперреактивности дыхательных путей, а также известно, что она усиливает ответы клеток Th1 и Th7 через индукцию высвобождения интерферона IFNy из клеток NKT, а также IL-1 β и IL-6 из мастоцитов. С нарушением регуляции пути ST2L/IL-33 связаны различные иммуноопосредованные заболевания, включая астму, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, атопический дерматит, аллергический ринит, полипоз носа и системный склероз (обзор представлен в публикациях Palmer and Gabay, Nat Rev Rheumatol 7:321-9, 2011 г., и Lloyd, Curr Opin Immunol 22:800-6, 2010 г.; Shimizu et al., Hum Molec Gen 14:2919-27, 2005 г., Kamekura et al., Clin Exp Allergy 42:218-28, 2012 г.; Manetti et al., Ann Rheum Dis 69:598-605, 2010 г.).

Таким образом, существует потребность в антагонистах ST2L, подходящих для применения при лечении ST2L-опосредованных заболеваний и расстройств.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлено ингибирование гиперреактивности дыхательных путей при помощи mAb CNTO3914, связывающихся с доменом I рецептора ST2L, на модели легочного воспаления, индуцированного интраназальным введением IL-33, в сравнении с изотипическим контролем CNTO5516. Пиковую устойчивость дыхательных путей измеряли при введении увеличивающихся доз (мг/мл) метахолина (MCH). **p<0,05 для сравнения групп CNTO3914/IL-33 и CNTO5516/IL-33; и ***p<0,001 для сравнения группы CNTO3914/IL-33 и группы, получавшей PBS и IL-33.

На фиг. 2 представлено ингибирование рекрутинга клеток бронхоальвеолярного лаважа (BAL) посредством mAb CNTO3914, связывающихся с доменом I рецептора ST2L, на модели легочного воспаления, индуцированного интраназальным введением IL-33, в сравнении с изотипическим контролем CNTO5516. ***p<0,001.

На фиг. 3 представлено дозозависимое ингибирование высвобождения мышиной протеазы мастоцитов 1 (MMCP-1) посредством mAb CNTO3914, связывающихся с доменом I рецептора ST2L, в бесклеточной текучей среде BAL на модели легочного воспаления, индуцированного интраназальным введением IL-33. **p<0,01, ***p<0,001, в сравнении с группой, получавшей CNTO5516 (изотипический контроль) и IL-33.

На фиг. 4 представлено ингибирование вызванного посредством IL-33 высвобождения GM-CSF (фиг. 4A), IL-5 (фиг. 4B) и TNFa (фиг. 4C) при помощи mAb CNTO3914, связывающихся с доменом I рецептора ST2L, в мышиных мастоцитах костномозгового происхождения in vitro. Использованные концентраций антител CNTO3914 показаны в мкг/мл, а концентрации IL-33 показаны в нг/мл в скобках.

На фиг. 5 представлено ингибирование вызванного IL-33 высвобождения простагландина D2 (PGD2) мастоцитами пуповинной крови человека при помощи mAb C2494 (STLM62), связывающихся с доменом I рецептора ST2L, при идентифицированных концентрациях IL-33 и C2494. MOX-PDG2: меток

- 1 031047 en.TiaMHH-PGD₂.

На фиг. 6 представлено ингибирование высвобождения GM-CSF (фиг. 6A), IL-8 (фиг. 6B), IL-5 (фиг. 6C), IL-13 (фиг. 6D) и IL-10 (фиг. 6E) при помощи идентифицированных концентраций (мкг/мт) mAb C2244 и C2494, связывающихся e доменом I рецептора ST2Ls, в мастоцитах пуповинной крови человека (hCBMC) в присутствии 1 нг/мт IL-33 в среде StemPro-34+100 нг/мт SCF (фактор стволовых ктеток).

На фиг. 7 представлено влияние на высвобождение GM-CSF (фиг. 7A), IL-8 (фиг. 7B), IL-5 (фиг. 1C), IL-13 (фиг. 7D) и IL-10 (фиг. 7E) идентифицированных концентраций (мкг/мл) mAb C2519 или C2521, связывающихся с доменом III рецептора ST2L, в мастоцитах пуповинной крови человека в присутствии 1 нг/мл IL-33 в среде StemPro-34 + 100 нг/мл SCF.

На фиг. 8 представлено влияние на высвобождение: A) GM-CSF; B) IL-8; C) IL-5; D) IL-13; и E) IL10 mAb C2494; связывающихся с доменом I рецептора ST2L, а также mAb ST2M48 (M48), ST2M49 (M49), ST2M50 (M50) и ST2M51 (M51), связывающихся с доменом III рецептора ST2L, в мастоцитах пуповинной крови человека (hCBMC) в присутствии 3 нг/мл IL-33 в среде RPMI/10% FCS+100 нг/мл SCF.

На фиг. 9 представлено среднее процентное (%) ингибирующее воздействие антител к ST2L, связывающихся с доменом I (D1) или доменом III (D3) ST2L, на высвобождение GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-10 и IL-13 мастоцитами пуповинной крови человека при индукции IL-33 и SCF, как показано на фигуре, при использовании концентрации 50 или 2 мкг/мл каждого из испытуемых антител. Отрицательные значения указывают на процентную активацию.

На фиг. 10 представлены последовательности вариабельных участков тяжелых цепей (VH) и CDRучастков тяжелых цепей антител к ST2L, полученных из библиотек фаговых дисплеев и после последующих операций по созреванию аффинности.

На фиг. 11 представлены последовательности вариабельных участков легких цепей (VL) и CDRучастков легких цепей антител к ST2L, полученных из библиотек фаговых дисплеев и после последующих операций по созреванию аффинности.

На фиг. 12 представлены участки VH и VL и последовательности CDR-участков тяжелых цепей антител к ST2L, варианты STLM208, VH ST2H257, HCDR3.

На фиг. 13 представлены последовательности: A) VH и B) VL для антител к ST2L, полученных из библиотек фаговых дисплеев и после последующих операций по созреванию аффинности.

На фиг. 14 представлена картина антигенсвязывающих сайтов VH и VL антитела C2494, перенесенных на человеческие каркасы (перенесенные участки обозначены как HFA). Подчеркнуты участки Кабат CDR, а участки Чотиа HV обозначены пунктирными линиями над идентифицированными перенесенными участками HFA. Нумерация остатков VH и VL представлена в соответствии с Чотиа. Остатки, выделенные в VH серым цветом, в некоторых вариантах HFA не переносились. C2494 VH: SEQ ID NO: 48; C2494 VH: SEQ ID NO: 52.

На фиг. 15 представлены последовательности CDR-участков, адаптированных к человеческому каркасу (HFA) антител, полученных на основе C2494.

На фиг. 16 представлен: A) уровень антител CNTO3914 к ST2L в сыворотке; B) ингибирование рекрутинга клеток в бронхоальвеолярном лаваже (BAL); C) ингибирование секреции IL-6 клетками цельной крови, стимулированными IL-33; D) ингибирование секреции MCP1 клетками цельной крови, стимулированными IL-33, при помощи CNTO3914 через 24 ч после введения в 6-часовой модели легочного воспаления, индуцированного интраназальным введением IL-33. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001; H/O = ниже предела детекции; @ = одна точка данных ниже предела детекции.

На фиг. 17 представлена конкуренция между различными антителами к ST2L. A) 30 нМ меченых Fab-фрагментов C2244 проверяли на конкуренцию с идентифицированными антителами за связывание с покрытием из ST2L-ECD в микролунках. Антитела C2244 конкурировали с C2494, но не с C2539. B) 10 нМ меченых антител C2494 проверяли на конкуренцию с идентифицированными антителами за связывание с покрытием из ST2L-ECD в микролунках. Антитела C2494 конкурировали с STLM208 и STLM213, но не с C2539.

На фиг. 18 представлена упрощенная карта H/D обмена для человеческого ST2-ECD (SEQ ID NO: 119) в комплексе с Fab-фрагментами C2244. Участки, защищенные антителом, указаны обозначенной шкалой оттенков серого цвета. Сегменты, включающие остатки 18-31 (пунктирный прямоугольник) (соответствуют остаткам 35-48 полноразмерного ST2L последовательности SEQ ID NO: 1), были защищены посредством Fab-фрагментов. Участки, включающие остатки 71-100 (прямоугольник из сплошных линий) (соответствует остаткам 88-117 последовательности SEQ ID NO: 1), были сильно гликозилированы и не закрывались пептидами.

На фиг. 19 представлены константы скорости и аффинности для связывающегося с доменом I ST2L антитела применительно к вариантам ST2L, обозначенным на фигуре.

На фиг. 20 представлено ингибирование секреции: A) GM-CSF; B) IL-5; C) IL-8; D) IL-13 из первичных человеческих мастоцитов легких при помощи антитела к ST2L, называемого STLM208.

- 2 031047

Изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предложено выделенное человеческое или адаптированное к человеку антитело-антагонист или его фрагмент, специфически связывающееся с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого ST2L.

В настоящем изобретении также предложены адаптированные к человеку антитела-антагонисты, специфически связывающиеся с человеческим ST2L, имеющие определенные последовательности вариабельных участков легких и тяжелых цепей или определенные последовательности, определяющие комплементарность участков легких и тяжелых цепей.

В настоящем изобретении также предложены человеческие или адаптированные к человеку антитела-антагонисты, специфически связывающиеся с человеческим ST2L в определенных участках-эпитопах и/или имеющие определенные характеристики, описанные в настоящем документе.

В настоящем изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий вариабельные участки тяжелых цепей (VH) или вариабельные участки легких цепей (VL) настоящего изобретения.

В настоящем изобретении также предложен вектор, содержащий выделенный полинуклеотид настоящего изобретения.

В настоящем изобретении также предложена клетка-хозяин, содержащая вектор настоящего изобретения.

В настоящем изобретении также предложен способ получения антитела настоящего изобретения, включающий культивирование клетки-хозяина настоящего изобретения и выделение антитела из клетки.

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая выделенное антитело настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

В настоящем изобретении также предложен способ лечения или предотвращения ST2Lопосредованного заболевания, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенных антител настоящего изобретении требующему лечения пациенту в течение периода времени, достаточного для лечения или предотвращения ST2L-опосредованного заболевания.

В настоящем изобретении также предложен способ ингибирования ответа мастоцитов у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенных антител настоящего изобретения требующему лечения пациенту в течение периода времени, достаточного для ингибирования ответа мастоцитов.

В настоящем изобретении также предложен способ ингибирования у субъекта взаимодействия IL33 и ST2L, включающий введение субъекту антитела, специфически связывающегося с доменом I ST2L, в количестве, достаточном для ингибирования взаимодействия IL-33 и ST2L.

Подробное описание изобретения

Все публикации, включая, без ограничений, патенты и патентные заявки, упоминаемые в данном описании, включены в настоящий документ путем ссылки, как если бы они были полностью изложены в настоящем документе.

Следует понимать, что применяемые в настоящем документе термины используются только в целях описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не являются ограничивающими. Все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, если не указано иное, имеют общепринятое значение, понятное любому специалисту в области, к которой имеет отношение настоящее изобретение.

В настоящем документе описаны примеры способов и материалов, хотя для анализа настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе. При описании и изложении формулы настоящего изобретения будут использованы следующие термины.

При использовании в настоящем документе термин антагонист означает молекулу, которая частично или полностью ингибирует биологическую активность ST2L по любому механизму. Примерами антагонистов являются антитела, слитные белки, пептиды, пептидомиметики, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды и малые молекулы. Антагонисты можно выявлять с использованием анализов биологической активности ST2L, описанных ниже. Антагонисты ST2L могут ингибировать измеренную биологическую активность ST2L на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

Термин ST2L, или huST2L, или человеческий ST2L относится к человеческому ST2Lполипептиду с аминокислотной последовательностью, представленной в GenBank Acc. № NP 057316. Последовательность SEQ ID NO: 1 демонстрирует аминокислотную последовательность полноразмерного человеческого ST2L. При использовании в настоящем документе внеклеточный домен ST2L, ST2LECD или huST2L-ECD означает полипептид, имеющий аминокислоты 19-328 последовательности SEQ ID NO: 1. huST2L-ECD имеет три иммуноглобулин-подобных домена типа C2, охватывающих остатки 19-122 (домен I, SEQ ID NO: 9), остатки 123-202 (домен II, SEQ ID NO: 10) и остатки 209-324 (домен III, SEQ ID NO: 11) последовательности SEQ ID NO: 1. Домен I, или домен I ST2L, или домен I huST2L, или D1 относится к первому иммуноглобулин-подобному домену на человеческом ST2L с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 9. Домен III или домен III ST2L означает третий

- 3 031047 иммуноглобулин-подобный домен на человеческом ST2L с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 11.

При использовании в настоящем документе термин IL-33 включает в себя полноразмерный IL-33 (GenBank Acc. № NP 254274 SEQ ID NO: 3), его варианты и активные формы. Варианты IL-33 включают в себя белки с аминокислотными последовательностями, представленными в GenBank Acc. № NP 001186569 и GenBank Acc. № NP 001186570). Активные формы IL-33 включают в себя зрелый IL-33, имеющий остатки 112-270 последовательности SEQ ID NO: 3. Дополнительные активные формы включают в себя фрагменты IL-33, имеющие остатки 11-270, 115-270, 95-270, 99-270 или 109-270 последовательности SeQ ID NO: 3 (LeFrancais et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 109:1673-8, 2012 г.), или любую форму или комбинацию форм, выделенных из клеток, эндогенно экспрессирующих IL-33. Активная форма IL-33 представляет собой фрагмент или вариант IL-33 последовательности SEQ ID NO: 3, индуцирующий биологическую активность ST2L.

При использовании в настоящем документе термин антитела применяется в широком смысле и включает в себя молекулы иммуноглобулина, включая поликлональные антитела, моноклональные антитела, включая мышиные, человеческие, адаптированные к человеку, гуманизированные и химерные моноклональные антитела, фрагменты антител, биспецифические или мультиспецифические антитела, образованные на основе по меньшей мере двух интактных антител или фрагментов антител, димерные, тетрамерные или мультимерные антитела, а также одноцепочечные антитела.

Иммуноглобулины делятся на пять больших классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи. IgA и IgG дополнительно подразделяются на изотипы IgA_b IgA₂, IgGi, IgG₂, IgG₃ и IgG₄. На основе аминокислотной последовательности константных доменов легкие цепи антитела любого вида позвоночных можно отнести к одному из двух четко выделенных типов: каппа (к) и лямбда (λ).

Термин фрагменты антител относится к части молекулы иммуноглобулина, сохраняющей антигенсвязывающий сайт из тяжелой цепи и/или легкой цепи, например, участки, определяющие комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1, 2 и 3, участки, определяющие комплементарность легкой цепи (LCDR) 1, 2 и 3, вариабельный участок тяжелой цепи (VH) или вариабельный участок легкой цепи (VL). Фрагменты антител включают в себя хорошо известные фрагменты Fab, F(ab')₂, Fd и Fv, а также доменные антитела (dAb), содержащие один домен VH. Домены VH и VL могут быть соединены синтетическим линкером с образованием различных типов одноцепочечных структур антител, в которых пара доменов VH/VL образуется межмолекулярным или внутримолекулярным способом в тех случаях, когда домены VH и VL экспрессируются отдельными одноцепочечными конструктами антител, с образованием одновалентного антигенсвязывающего сайта, такого как одноцепочечное антитело Fv (scFv) или диатело; описанное, например, в международной патентной публикации № WO 98/44001, международной патентной публикации № WO 88/01649; международной патентной публикации № WO 94/13804; международной патентной публикации № WO 92/01047.

Вариабельный участок антитела состоит из каркасного участка, прерываемого тремя антигенсвязывающими сайтами. Антигенсвязывающие сайты обозначают различными терминами: (i) участки, определяющие комплементарность (CDR), три в VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три в VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), основаны на вариабельности последовательности (Wu and Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970 г.; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991 г.); (ii) гипервариабельные участки, HVR или HV, три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3), относятся к участкам вариабельных доменов антитела, являющихся по своей структуре гипервариабельными, согласно определению Chothia и Lesk (Chothia and Lesk, Mol. Biol 196:901-17, 1987 г.). Другие термины включают в себя IMGT-CDR (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003 г.) и задействование остатков, определяющих специфичность (SDRU) (Almagro, Mol Recognit 17:132-43, 2004 г.). В международной базе данных ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www.imgt.org) представлены стандартизованная нумерация и определение антигенсвязывающих сайтов. Соответствие между разграничениями CDR, HV и IMGT описано в публикации Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003 г.

При использовании в настоящем документе остатки Чотиа означают остатки VL и VH антитела и нумеруются в соответствии с Al-Lazikani (Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927-48, 1997 г.).

Каркасный участок или каркасные последовательности относятся к последовательностям вариабельного участка, которые не были определены как антигенсвязывающий сайт. Поскольку для определения антигенсвязывающего сайта могут использоваться разные термины, как описано выше, определение точной аминокислотной последовательности каркасного участка зависит от определения антигенсвязывающего сайта.

Термин человеческое антитело или полностью человеческое антитело относится к антителам, содержащим последовательности вариабельных участков и константных участков, полученные из последовательностей человеческих иммуноглобулинов. Человеческие антитела настоящего изобретения могут включать в себя замены, т.е. они могут не быть точными копиями экспрессируемого человеческого иммуноглобулина или зародышевых генных последовательностей. Однако антитела, в которых антигенсвя- 4 031047 зывающие сайты получены от видов, отличных от человека, не подходят под определение человеческих антител.

Термины адаптированные к человеку антитела или адаптированные к человеческому каркасу (HFA) антитела относятся к антителам, адаптированным в соответствии со способами, описанными в патентной публикации США № US 2009/0118127, а также относятся к антителам, в которых последовательности антигенсвязывающих сайтов получены от видов, отличных от человека, и трансплантированы на человеческие каркасы.

Термин гуманизированные антитела относится к антителам, у которых антигенсвязывающие сайты получены от видов, отличных от человека, а каркасы вариабельных участков получены от последовательностей человеческих иммуноглобулинов.

Гуманизированные антитела могут включать в себя замены в каркасных участках, так что каркас может не быть точной копией экспрессированных последовательностей человеческих иммуноглобулинов или зародышевых генных последовательностей.

При использовании в настоящем документе термин по существу идентичный означает, что аминокислотные последовательности двух вариабельных участков антител при сравнении являются идентичными или имеют незначительные отличия. Незначительными отличиями являются замещения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 аминокислот в последовательности антитела или вариабельного участка антитела, которые не влияют на характеристики антитела. Аминокислотные последовательности, по существу, идентичные последовательностям вариабельного участка, описанным в настоящем документе, входят в объем настоящей заявки. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей может достигать 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. Идентичность, определенная в процентном соотношении, можно вычислить, например, при попарном выравнивании с помощью настройки по умолчанию в модуле AlignX программного обеспечения Vector NTI v. 9.0.0 (Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния). Белковые последовательности настоящего изобретения можно использовать в качестве запроса для выполнения поиска в публичных или патентных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Примерами программ, используемых для осуществления такого поиска, являются XBLAST или BLASTP (http:.//www.ncbi .nlm/nih.gov), либо GenomeQuest™ (GenomeQuest, г. Уэстборо, штат Массачусетс) - пакет с настройками по умолчанию.

При использовании в настоящем изобретении термин эпитоп означает часть антигена, с которой специфически связывается антитело. Эпитопы обычно состоят из химически активных (например, неполярных, полярных или гидрофобных), поверхностно расположенных фрагментов, таких как боковые группы аминокислот или полисахаридов, и могут иметь специфическую трехмерную структуру, а также характеристики специфического заряда. Эпитоп может состоять из смежных и/или несмежных аминокислот, которые образуют конформационное пространственное звено. В несмежном эпитопе аминокислоты из различных частей линейной последовательности антигена оказываются в непосредственной близости друг от друга в трехмерном пространстве при сворачивании белковой молекулы. Примером эпитопа является домен I huST2L, представленный в последовательности SEQ ID NO: 9.

При использовании в настоящем документе термин паратоп означает часть антитела, с которой специфически связывается антиген. Паратоп по своей природе может быть линейным или дискретным, образованным за счет пространственных взаимоотношений между смежными аминокислотами, в отличие от взаимодействия линейно связанных аминокислот. Термины паратоп легкой цепи и паратоп тяжелой цепи или аминокислотные остатки паратопа легкой цепи и аминокислотные остатки паратопа тяжелой цепи означают аминокислотные остатки легкой цепи и тяжелой цепи, контактирующие с антигеном соответственно.

При использовании в настоящем документе термины специфическое связывание или специфически связывает относятся к антителу, проявляющему большую аффинность при связывании с заданным антигеном по сравнению с другими антигенами или белками. Как правило, связывание антитела с заданным антигеном характеризуется константой диссоциации (К_дисс) 1х10^-7 М или менее, например 1х10^-8 М или менее, 1х10^-9 М или менее, 1х10^-10 М или менее, 1х10^-11 М или менее или 1х10^-12 М или менее, как правило, при Кдисс, по меньшей мере в десять раз меньшей, чем его Кдисс связывания с неспецифичным антигеном (например, BSA, казеином или любым другим установленным полипептидом). Константу диссоциации можно измерить стандартными способами. Однако антитела, специфически связывающиеся с заданным антигеном, могут иметь перекрестную реактивность к другим родственным антигенам, например, к такому же заданному антигену от других биологических видов (гомологов), таких как человек или обезьяна, например, Macaca fascicularis (яванский макак).

При использовании в настоящем документе термин биспецифический относится к антителу, которое связывает два разных антигена или два разных эпитопа одного антигена.

При использовании в настоящем документе термин моноспецифический относится к антителу, связывающему один антиген или один эпитоп.

При использовании в настоящем документе термин в комбинации с означает, что описанные агенты можно вводить совместно в смеси, одновременно в качестве отдельных агентов или последова

- 5 031047 тельно в качестве отдельных агентов в любом порядке.

При использовании в настоящем документе термин воспалительное состояние относится к острому или хроническому локализованному или системному ответу на повреждающие стимулы, такие как патогены, поврежденные клетки, физические повреждения или повреждения раздражающими веществами, которые частично опосредованы активностью цитокинов, хемокинов или воспалительных клеток (например, нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и макрофагов), и характеризуются в большинстве случаев болью, покраснением, отеком и нарушением функций тканей.

При использовании в настоящем документе термин 8Т2Ь-опосредованное воспалительное заболевание относится к воспалительному заболеванию, по меньшей мере, частично возникающему из-за несоответствующей активации сигнального пути ST2L. Примерами 8Т2Ь-опосредованных воспалительных состояний являются астма и аллергии.

При использовании в настоящем документе термин ST2L-опосредованное заболевание включает в себя все заболевания и медицинские состояния, в которых ST2L играет какую-либо роль, прямую или косвенную, включая этиологическую или патогенетическую, включая роль в развитии, прогрессировании, устойчивости или патологии заболевания или состояния.

При использовании в настоящем изобретении термин биологическая активность ST2L относится к любой активности, возникающей в результате связывания ST2L лиганда IL-33 с ST2L. Пример биологической активности ST2L приводит к активации сигнального пути NF-кВ в ответ на IL-33. Активацию NF-кВ можно анализировать путем анализа на репортерный ген при индукции ST2L с IL-33 (Fursov et al., Hybridoma 30: 153-62, 2011 г.). Другие примеры биологических активностей ST2L приводят к пролиферации клеток Th2 или к секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов, например, IL-5, GM-CSF, IL-8, IL-10 или IL-13. Высвобождение цитокинов и хемокинов из клеток, тканей или в циркуляционных потоках можно измерить с помощью хорошо известных иммуноанализов, таких как ИФА.

Термин вектор означает полинуклеотид, способный к удвоению в биологической системе или к перемещению между такими системами. Полинуклеотиды-векторы, как правило, содержат элементы, такие как точки начала репликации, сигнал полиаденилирования или маркеры выбора, обеспечивающие удвоение или сохранение данных полинуклеотидов в биологической системе. Примеры таких биологических систем могут включать в себя клетку, вирус, животное, растение и реконструированные биологические системы, использующие биологические компоненты, способные к удвоению вектора. Полинуклеотид, содержащий вектор, может представлять собой молекулы ДНК или РНК или их гибрид.

Термин вектор экспрессии означает вектор, который можно использовать в биологической системе или реконструированной биологической системе для прямой трансляции полипептида, закодированного полинуклеотидной последовательностью, присутствующей в векторе экспрессии.

Термин полинуклеотид означает молекулу, содержащую цепочку нуклеотидов, ковалентно связанных через сахарофосфатную главную цепь или через другую эквивалентную ковалентную химическую структуру. Двухцепочечные и одноцепочечные молекулы ДНК и РНК представляют собой типичные примеры полинуклеотидов.

Термин полипептид или белок означает молекулу, содержащую по меньшей мере два аминокислотных остатка, связанных пептидной связью с образованием полипептида. Малые полипептиды, содержащие менее 50 аминокислотных остатков, могут называться пептидами.

В настоящем изобретении использованы следующие общепринятые одно- и трехбуквенные коды обозначения аминокислот.

Аминокислота	Трехбуквенный код	Однобуквенный код
Аланин	Ala	A
Аргинин	Arg	R
Аспарагин	Asn	N
Аспарагиновая кислота	Asp	D
Цистеин	Cys	C
Глутамат	Glu	E
Глутамин	Gin	Q
Глицин	Gly	G
Гистидин	His	H
Изолейцин	He	I
Лейцин	Leu	L
Лизин	Lys	К
Метионин	Met	M

- 6 031047

Фенилаланин	Phe	F
Пролин	Pro	P
Серин	Ser	S
Треонин	Thr	T
Триптофан	Trp	W
Тирозин	Туг	Y
Валин	Vai	V

Композиции настоящего изобретения

В настоящем изобретении предложены антитела, специфически связывающиеся с ST2L и ингибирующие биологическую активность ST2L, а также применение таких антител. Заявители неожиданно обнаружили, что антитела, связывающиеся с доменом I человеческого ST2L (SEQ ID NO: 9), блокируют взаимодействие IL-33/ST2L и ингибируют спектр биологических активностей ST2L, включая индуцируемые IL-33 ответы мастоцитов, тогда как антитела, связывающиеся с доменом III человеческого ST2L (SEQ ID NO: 11), не блокируют взаимодействие IL-33/ST2L, хотя являются ингибиторами спектра биологических активностей ST2L. Однако антитела, связывающиеся с доменом III, проявляют сниженный ингибиторный эффект или отсутствие ингибиторного эффекта, а в некоторых случаях стимулирующий эффект в отношении индуцированных IL-33 ответов мастоцитов.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитела, которые блокируют взаимодействие IL-33/ST2L и ингибируют спектр биологических активностей ST2L, включая индуцированные IL-33 ответы мастоцитов, связываются с эпитопом в домене I человеческого ST2L (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210), и необязательно аминокислотными остатками T93 и F94 в ST2L (нумерация аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 1).

Термин ответ мастоцитов или активность мастоцитов относится к индуцированному IL-33 высвобождению цитокинов, таких как GM-CSF, IL-8, IL-5, IL-13 и IL-10, и аллергических медиаторов, таких как простагландин D2, из мастоцитов.

В настоящем изобретении предложены новые антигенсвязывающие сайты, которые связываются с доменом I человеческого ST2L, как описано в настоящем документе. Структурой, переносящей антигенсвязывающий сайт, как правило, является антитело VH или VL.

Антитела настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, могут представлять собой выделенные человеческие или адаптированные к человеку антитела-антагонисты или их фрагменты, специфически связывающиеся с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого ST2L. Примером антитела, связывающегося с доменом I человеческого ST2L (SEQ ID NO: 9), является антитело STLM15 (C2244), содержащее последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 последовательностей SEQ ID NO: 23, 27 и 31 соответственно, и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 последовательностей SEQ ID NO: 35, 39 и 43 соответственно, или антитело C2494 (STLM62), содержащее последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 последовательностей SEQ ID NO: 24, 28 и 32 соответственно, и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 последовательностей SEQ ID NO: 36, 40 и 44 соответственно (табл. 3). Дополнительными примерами антител, связывающихся с доменом I человеческого ST2L, являются антитела, показанные в табл. 16 и на фиг. 13, например, антитела STLM103, STLM107, STLM108, STLM123, STLM124, STLM208, STLM209, STLM210, STLM211, STLM212 и STLM213. Примеры человеческих антителантагонистов представлены на фиг. 12 и фиг. 13. Примеры адаптированных к человеку антагонистов представлены в табл. 14.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, выделенное человеческое или адаптированное к человеку антитело-антагонист или его фрагмент, специфически связывающееся с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого ST2L, блокирует взаимодействие IL-33/ST2L.

Антитела можно испытывать на их способность блокировать взаимодействие IL-33/ST2L с помощью стандартного метода ИФА. Например, на планшеты наносят внеклеточный домен человеческого ST2L (huST2L-ECD) и инкубируют с антителом, после чего измеряют связывание биотинилированного IL-33 с планшетами. Антитела, которые блокируют взаимодействие IL-33/ST2L или ингибируют взаимодействие IL-33/ST2L, - это антитела, которые в анализе ИФА с использованием планшетов, покрытых huST2L-ECD, снижают сигнал связывания биотинилированного IL-33 с планшетами по меньшей мере на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% при концентрации антитела 50 мкг/мл по сравнению со связыванием IL-33 в отсутствие антитела.

Антитела можно испытывать на их способность ингибировать ответы мастоцитов путем анализа их ингибиторной активности в отношении секреции, например, высвобождение GM-CSF, IL-5, IL-10 или IL13 мастоцитами пуповинной крови человека или первичными легочными мастоцитами человека, с использованием стандартных способов и способов, примеры которых приведены ниже. Антитела, которые, как описано в настоящем документе, ингибируют ответ мастоцитов или ингибируют активность мастоцитов, - это антитела, которые снижают вызванную IL-33 в концентрации 1-3 нг/мл секрецию GMCSF, IL-5, IL-13 или IL-10 по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% в концентрации 10 мкг/мл по сравнению с мастоцитами, не

- 7 031047 обработанными антителом. Как правило, мастоциты можно получить из пуповинной крови человека или из CD34+ клеток-предшественников из паренхимы легких или малых дыхательных путей с использованием хорошо известных способов и способов, примеры которых представлены ниже. На измеренную для антитела величину % ингибирования могут влиять условия культивирования мастоцитов, и, следовательно, условия культивирования и испытаний следует стандартизовать, например, с использованием среды StemPro-34 в ходе всей 6-10 недельной процедуры дифференцировки. За 4 суток до анализа на высвобождение цитокинов мастоциты ежедневно стимулируют 10 нг/мл IL-4, 10 нг/мл IL-6 и 100 нг/мл SCF. Для анализа на высвобождение цитокинов мастоциты можно повторно растворить в свежей среде StemPro-34 или в среде RPMI, содержащей 10% FCS без антибиотиков, с 100нг/мл SCF. Подходящая плотность посева для анализа составляет от 65000 до 75000 клеток/0,16 мл/лунку. Примеры антител настоящего изобретения, которые, как описано в настоящем документе, ингибируют ответы мастоцитов, представляют собой антитела STLM15, STLM62 и STLM208. Антитело CNTO3914 связывается с доменом I мышиного ST2L без перекрестной реактивности с человеческим ST2L и ингибирует ответы мастоцитов мыши.

Специалистам в данной области будет очевидно, что ответы мастоцитов также включают в себя высвобождение IL-1 и IL-32 и хемокинов, таких как CCL1, CCL4, CCL5, CCL18 и CCL23, а также аллергических медиаторов, таких как цистеинил-лейкотриены, гистамин, а также различных протеаз мастоцитов, включая триптазы, химазы, карбоксипептидазы и катепсин G. Антитела настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, можно испытывать на их способность ингибировать данные дополнительные ответы мастоцитов при помощи стандартных способов. Можно ожидать, что антитела настоящего изобретения, связывающиеся с доменом I ST2L и блокирующие взаимодействие IL-33/ST2L, как описано в настоящем документе, будут ингибировать данные дополнительные ответы мастоцитов по меньшей мере на 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более при минимальной концентрации 10 мкг/мл и при данных условиях.

Антитела настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, связываются с человеческим ST2L с константой диссоциации (К_дисс) от приблизительно 5х10^-12 М до приблизительно 7х10^-10 М, с константой скорости ассоциации (касс) с человеческим ST2L от приблизительно 2х10⁶ М^-1с^-1 до приблизительно 1х10⁸ M^-1c^-1 или с константой скорости диссоциации (кдиее) с человеческим ST2L от приблизительно 1х10^-6с^-1 до приблизительно 1х10^-2с^-1. Например, антитела настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, связываются с человеческим ST2L с К_дисс менее приблизительно 7х10^-10 М, менее приблизительно 1х10^-10 М, менее приблизительно 5х10^-11 М, менее приблизительно 1х10^-11 M или менее приблизительно 5х10^-12 М.

Антитела настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, могут иметь перекрестную реактивность с ST2L Масаса fascicularis (яванского макака) (SEQ ID NO: 2) и связываться с ST2L яванского макака с константой диссоциации (К_дисс) от приблизительно 3х10^-12 М до приблизительно 2х10^-9 М, константой скорости ассоциации (kacc) с ST2L яванского макака от приблизительно 4х10⁶ М^-1с^-1 до приблизительно 1х10⁸ М^-1с^-1, или константой скорости диссоциации (k дисс) с ST2L яванского макака от приблизительно 7х10^-5с^-1 до приблизительно 1х10^-1с^-1. Например, антитела настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, связываются с ST2L яванского макака с К_дисс менее приблизительно 2х10^-9М, менее приблизительно 1х10^-9 М, менее приблизительно 1х10^-10 М, менее приблизительно 1х10^-11 М или менее приблизительно 3х10^-12 М.

Аффинность антител к ST2L можно определить экспериментально с использованием любого подходящего способа. Такие способы могут включать в себя ProteOn XPR36, использование инструментов Biacore 3000 или KinExA, ИФА или способов конкурентно-связывающего анализа, известных специалистам в данной области. Измеренная аффинность взаимодействия в конкретной паре антитело/ST2L может изменяться при измерении в различных условиях (например, осмолярность, pH). Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания (например, К_дисс, k_acc, k _дисс) предпочтительно осуществлять с использованием стандартизированных условий и стандартизированного буферного раствора, такого как буферный раствор, описанный в настоящем документе. Специалисту в данной области будет понятно, что внутренняя ошибка измерения аффинности, например, с использованием Biacore 3000 или ProteOn (измеряемая как стандартное отклонение, CO), как правило, может составлять 5-33% для измерений, проводимых в границах типичных пределов детекции. Следовательно, термин приблизительно отражает типичное стандартное отклонение в анализе. Например, типичное CO для Кдисс 1х10^-9М составляет до ±0,33х10^-9М.

Антитела, связывающие человеческий ST2L с нужной аффинностью и необязательно проявляющие перекрестную реактивность с ST2L яванского макака, можно выбрать из библиотек вариантов или фрагментов путем пэннинга с человеческим и/или ST2L яванского макака и необязательно с использованием дополнительного созревания аффинности антител. Антитела можно идентифицировать с помощью подходящего способа на основе их способности ингибировать биологическую активность ST2L. Такие способы могут включать в себя анализы с геном-репортером или анализы с помощью хорошо известных способов получения цитокинов, как показано в настоящей заявке.

- 8 031047

Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенное антителоантагонист, специфически связывающееся с человеческим ST2L, содержащее участок, определяющий комплементарность, тяжелой цепи (HCDR) 1 (HCDR1) последовательности SEQ ID NO: 160 (X₁X₂X₃MX₄); где

X_I представляет собой S, F, D, I, G или V;

X2 представляет собой Y или D;

X3 представляет собой A, D или S и

X4 представляет собой S, F или I;

HCDR 2 (HCDR2) последовательности SEQ ID NO: 161 (X₅IX₆GX₇GGX₈TX₉YADSVKG); где

X5 представляет собой A, S, T, Y или D;

X6 представляет собой S, R, E, K, G или A;

X₇ представляет собой S, E или N;

X₈ представляет собой S, R, E, G, T, D или A;

X₉ представляет собой Y, D, N, A или S;

HCDR 3 (HCDR3) последовательности SEQ ID NO: 162 (X₁₀X₁₁WSTEGSFFVLDY); где

X₁₀ представляет собой D, A, R, N, Q, P, E, I, H, S, Т или Y и

X_II представляет собой P, A, H, Y, E, Q, L, S, N, Т, V или I.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенное антителоантагонист, специфически связывающееся с человеческим ST2L, содержащее участок, определяющий комплементарность, легкой цепи (LCDR) 1 (LCDR1) последовательности SEQ ID NO: 163 (RASQSVDDX₁₂LA); где

X12 представляет собой A или D;

LCDR 2 (LCDR2) последовательности SEQ ID NO: 90 (DASNRAT); и

LCDR 3 (LCDR3) последовательности SEQ ID NO: 164 (QQXi₃Xi₄Xi₅Xi₆Xi₇Xi₈T); где

X₁₃ представляет собой F или Y;

X₁₄ представляет собой Y, I или N;

X₁₅ представляет собой N, G, D или Т;

X₁₆ представляет собой W или A;

X₁₇ представляет собой P или удален; и

X₁₈ представляет собой L или I.

Антитела настоящего изобретения, содержащие HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 последовательностей SEQ ID NO: 160, 161, 162, 163, 90 и 164 соответственно, можно получить хорошо известными способами мутагенеза с использованием в качестве шаблона, например, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 последовательностей SEQ ID NO: 78, 81, 84, 87, 90 и 92 соответственно. CDR-участки тяжелой цепи и CDR-участки легкой цепи последовательностей SEQ ID NO: 160, 161, 162, 163, 90 и 164 соответственно можно перенести на человеческие каркасы, такие как каркасы, описанные ниже. Антитела можно анализировать на связывание с ST2L и на их способность блокировать взаимодействие IL-33/ST2L и другие характеристики, такие как аффинность к человеческому ST2L и/или ST2L яванского макака, и на ингибирование ответов мастоцитов с использованием способов, описанных в настоящем документе.

В одном варианте осуществления выделенное антитело-антагонист, специфически связывающееся с человеческим ST2L, как описано в настоящем документе, содержит

HCDR1 последовательностей SEQ ID NO: 78 или 95-108;

HCDR2 последовательностей SEQ ID NO: 81, 109-118 или 120-129;

HCDR3 последовательностей SEQ ID NO: 84 или 165-185;

LCDR1 последовательностей SEQ ID NO: 87 или 130;

LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 90; и

LCDR3 последовательностей SEQ ID NO: 92 или 131-134.

В другом варианте осуществления выделенное антитело-антагонист, специфически связывающееся с человеческим ST2L, содержит последовательности HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано на фиг. 10, фиг. 11, и фиг. 12, как описано в настоящем документе.

В другом варианте осуществления выделенное антитело-антагонист, специфически связывающееся с человеческим ST2L, как описано в настоящем документе, содержит

HCDR1 последовательностей SEQ ID NO: 23 или 24;

HCDR2 последовательностей SEQ ID NO: 27 или 28;

HCDR3 последовательностей SEQ ID NO: 31 или 32;

LCDR1 последовательностей SEQ ID NO: 35 или 36;

LCDR2 последовательностей SEQ ID NO: 39 или 40; и

LCDR3 последовательностей SEQ ID NO: 43 или 44.

В другом варианте осуществления выделенное антитело-антагонист, специфически связывающееся с человеческим ST2L, как описано в настоящем документе, содержит последовательности HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3:

- 9 031047

SEQ ID NO: 23, 27, 31, 35, 39 и 43 соответственно;

SEQ ID NO: 24, 28, 32, 36, 40 и 44 соответственно; (HFA CDR);

SEQ ID NO: 24, 28, 146, 36, 40 и 147 соответственно; или

SEQ ID NO: 24, 28, 146, 36, 40 и 44 соответственно.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенное человеческое или адаптированное к человеку антитело-антагонист или его фрагмент, специфически связывающееся с человеческим ST2L (SEQ ID NO: 1), как описано в настоящем документе, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи (VH), содержащий каркас VH, полученный из человеческих каркасных последовательностей IGHV3-23 (SEQ ID NO: 158), IGHV1-24*01 (SEQ ID NO: 148) или IGHV1-f*01 (SEQ ID NO: 149), и вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий каркас VL, полученный из человеческих каркасных последовательностей IGKV3-11 (L6) (SEQ ID NO: 159), IGKV3-15*01 (L2) (SEQ ID NO: 150), IGKV1-9*01 (L8) (SEQ ID NO: 151), IGKV1-5*01 (L12) (SEQ ID NO: 152), IGKV1-12*01 (L5) (SEQ ID NO: 153), IGKV1-39*01 (012) (SEQ ID NO: 154), IGKV1-27*01 (A20) (SEQ ID NO: 155) или IGKV1-33*01 (O18) (SEQ ID NO: 156).

В другом варианте осуществления выделенное антитело, специфически связывающееся с доменом I человеческого ST2L, как описано в настоящем документе, содержит участок VH, содержащий каркас VH, полученный из человеческих каркасных последовательностей VH 3-23 (SEQ ID NO: 158); и вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий каркас VL, полученный из человеческих каркасных последовательностей Vk L6 (SEQ ID NO: 159). Человеческие каркасные последовательности хорошо известны и, как правило, включают в себя последовательности вариабельного участка зародышевого человеческого иммуноглобулина, связанные с соединительными (J) последовательностями. Каркасная человеческая аминокислотная последовательность VH 3-23, представленная в SEQ ID NO: 158, включает в себя зародышевую человеческую последовательность VH 3-23, соединенную с IGHJ4, а каркасная человеческая аминокислотная последовательность Vk L6, представленная в SEQ ID NO: 159, включает в себя зародышевую человеческую последовательность Vk L6, соединенную с IGKJ1, как описано в публикациях Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 г.; международной патентной публикации № WO2009/085462 и международной патентной публикации № US2010/0021477. Примеры антител, имеющие последовательность VH, полученную из человеческой последовательности VH 3-23, и последовательность VL, полученную из человеческой последовательности Vk L6, показаны на фиг. 12 и фиг. 13.

Человеческие и адаптированные к человеку антитела, содержащие вариабельные участки тяжелой или легкой цепи, полученные из конкретного каркаса или зародышевой последовательности, представляют собой антитела, полученные из системы, в которой используются зародышевые гены человеческого иммуноглобулина, например, из трансгенных мышей или из библиотек фаговых дисплеев, как описано ниже. Антитело, полученное из конкретного каркаса или зародышевой последовательности, может содержать аминокислотные отличия по сравнению с последовательностью, из которой оно получено, например, из-за естественно возникающих соматических мутаций или намеренно введенных замен.

В другом варианте осуществления выделенное человеческое или адаптированное к человеку антитело-антагонист или его фрагмент, специфически связывающееся с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого ST2L, как описано в настоящем документе, конкурирует за связывание с человеческим ST2L (SEQ ID NO: 1) с выделенным антителом, содержащим вариабельный участок тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO: 47 и вариабельный участок легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO: 51 (антитело С2244).

В другом варианте осуществления выделенное антитело настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, связывается с человеческим ST2L по аминокислотным остаткам 35-48 последовательности SEQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210). Антитело, как описано в настоящем документе, может дополнительно связываться с человеческим ST2L по аминокислотным остаткам T93 и F94 последовательности SEQ ID NO: 1.

Конкуренцию по специфическому связыванию с человеческим ST2L между антителами настоящего изобретения, описанными в настоящем документе, которые содержат определенные аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а также LCDR1, LCDR2 и LCDR3 или содержат определенные последовательности VH и VL, можно анализировать in vitro с использованием хорошо известных способов. Например, связывание меченных сложным эфиром NHS под названием MSD Sulfo-Tag™ антител с человеческим ST2L в присутствии немеченых антител можно анализировать методами ИФА или Biacore, или для демонстрации конкуренции с антителами настоящего изобретения можно использовать проточную цитометрию. Способность испытуемого антитела ингибировать связывание C2244 с человеческим ST2L демонстрирует, что испытуемое антитело может конкурировать с данными антителами за связывание с человеческим ST2L. Такие примеры антител представляют собой C2494, STLM208 и STLM213, показанные в табл. 3 и на фиг. 13.

Антитела, конкурирующие с C2244 за связывание с доменом I ST2L, как описано в настоящем документе, блокируют взаимодействие IL-33/ST2L и ингибируют спектр биологических активностей ST2L, включая индуцированные IL-33 ответы мастоцитов. В домене I ST2L также присутствует не нейтрали

- 10 031047 зующий (т.е. неингибирующий) эпитоп в виде второй группы конкуренции антител (которая представлена антителом C2240, связывающимся с доменом I ST2L, но не конкурирующим с C2244 и не ингибирующим сигнализацию ST2L).

Антитела настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, связывающиеся с конкретными доменами ST2L или эпитопами, можно получать путем иммунизации мышей, экспрессирующих локусы человеческого иммуноглобулина (Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994 г.; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996 г.; Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56, 1997 г.; патенты США №№ 5770429, 7041870 и 5939598), или мышей Balb/c пептидами, кодирующими эпитопы, например, пептидом, имеющим аминокислотную последовательность домена I человеческого ST2L: KFSKQSWGLENEALIVRCPRQGKPSYTVDWYYSQTNKSIPTQERNRVFASGQLLKFLPAAVADSGIYTCIVRSPTFNRTGYANVTIYKKQSDCNVPDYLMYSTV (SEQ ID NO: 9), или пептидом, имеющим аминокислотную последовательность RCPRQGKPSYTVDW (SEQ ID NO: 210), а также с использованием гибридомного метода, Kohler et al., Nature 256:495-97, 1975 г. Полученные антитела испытывают на их связывание с эпитопом с помощью стандартных способов. Например, когда известна структура каждого из отдельных компонентов, можно использовать анализ in silico прикрепления одного белка к другому для идентификации способных к взаимодействию сайтов. Можно провести водородно-дейтериевый (H/D) обмен в антигене и комплексе антитела для определения участков антигена, способных связываться с антителом. Сегментный и точечный мутагенез, модифицирующий антиген, можно использовать для локализации необходимых для связывания антитела аминокислот. Идентифицированные mAb можно дополнительно модифицировать путем включения измененных вспомогательных каркасных остатков с сохранением аффинности связывания, с использованием способов, описанных, например, в публикациях Queen et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 86:10029-32, 1989 г., и Hodgson et al., Bio/Technology 9:421, 1991 г.

Антитела настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, могут быть человеческими или адаптированными к человеку. Антитела настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, могут относиться к типу IgA, IgD, IgE, IgG или IgM.

Антитела, у которых аминокислотные последовательности антигенсвязывающего сайта, по существу, идентичны последовательностям, представленным на фиг. 10, 11, 12, 13, 15, в табл. 3, 9 и 12, входят в объем настоящего изобретения. Как правило, они включают одно или более замещений аминокислоты аминокислотой, имеющей аналогичный заряд или гидрофобные или стереохимические характеристики, что позволяет улучшить такие свойства антитела, как, например, стабильность или аффинность. Например, консервативные замещения могут означать замещения природных аминокислотных остатков на неприродные остатки, которые сопровождаются или не сопровождаются незначительным изменением полярности в положении замещения. Более того, любой природный остаток в полипептиде может быть замещен аланином, согласно способу, описанному как аланин-сканирующий мутагенез (MacLennan et al., Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67, 1998 г.; Sasaki et al., Adv Biophys 35:1-24, 1998 г.). При необходимости желательные замещения аминокислоты (консервативные или неконсервативные) могут быть запланированы специалистом в данной области. Например, замещения аминокислоты могут использоваться для идентификации остатков, влияющих на функционирование антител, таких как остатки, влияющие на аффинность, либо остатки, придающие нежелательные свойства, такие как способность к агрегации. Примеры замещений аминокислоты показаны на фиг. 12 и 13.

Также можно осуществить замены в каркасных участках, в отличие от антигенсвязывающих сайтов, если они отрицательно не влияют на свойства антитела. Замены в каркасных участках можно осуществить, например, в остатках верньерной зоны (патент США № 6649055) для улучшения аффинности или стабильности антитела. Замены также можно осуществить в тех каркасных участках антитела, которые отличаются последовательностью при сравнении с гомологичными человеческими зародышевыми генными последовательностями, чтобы уменьшить возможную иммуногенность. Данные модификации можно выполнить, например, для антител, полученных из новых библиотек антител, таких как pIX библиотеки.

Консервативные замещения аминокислоты также могут осуществляться путем введения в молекулу неприродных аминокислотных остатков, которое, как правило, происходит скорее при химическом синтезе пептидов, чем при синтезе в биологических системах. Замещения аминокислоты можно осуществить, например, с помощью ПЦР мутагенеза (патент США № 4683195). Можно создать библиотеки вариантов с помощью хорошо известных способов, например, применения случайных (NNK) или неслучайных кодонов, таких как кодоны DVK, кодирующие 11 аминокислот (ACDEGKNRSYW), а также скрининга библиотек или вариантов с желаемыми свойствами.

Хотя варианты осуществления показаны в примерах, содержащих пары вариабельных участков, пары полноразмерных цепей антител или пары участков CDR1, CDR2 и CDR3, один из тяжелой цепи и один из легкой цепи, специалистам будет понятно, что альтернативные варианты осуществления могут содержать одиночные вариабельные участки тяжелой цепи или одиночные вариабельные участки легкой цепи, одиночные полноразмерные цепи антител или участки CDR1, CDR2 и CDR3 из одной либо тяжелой, либо легкой цепи антитела. Одиночный вариабельный участок, полноразмерная цепь антител или участок CDR1, CDR2 и CDR3 одной цепи можно использовать для скрининга соответствующих доменов

- 11 031047 в другой цепи; две цепи способны к формированию антитела, специфически связывающего ST2L. Такой скрининг может осуществляться с помощью способов фагового дисплея, например, с использованием иерархического двойного комбинаторного подхода, описанного в публикации PCT № WO 1992/01047. Согласно данному подходу, индивидуальная колония, содержащая клон H или L цепей, используется для инфицирования всей библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (L или H), а полученный двухцепочечный специфический антигенсвязывающий домен выбирается в соответствии с методами фагового дисплея.

В настоящем изобретении предложены выделенные домены VH и VL антител настоящего изобретения, как описано в настоящем документе, а также антитела, содержащие определенные домены VH и VL. Вариабельные участки VH и VL определенных антител настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, представлены на фиг. 13 и в табл. 12.

Одним вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенное человеческое или адаптированное к человеку антитело-антагонист или его фрагмент, специфически связывающееся с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого ST2L, содержащее VH, по меньшей мере на 90% идентичный VH последовательности SEQ ID NO: 191.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенное человеческое или адаптированное к человеку антитело-антагонист или его фрагмент, специфически связывающееся с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого ST2L, содержащее VL, по меньшей мере на 94% идентичный VL последовательности SEQ ID NO: 209.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, настоящее изобретение предусматривает антитело, содержащее VH последовательностей SEQ ID NO: 143, 144, 145, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 или 205.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, настоящее изобретение предусматривает антитело, содержащее VL последовательностей SEQ ID NO: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 206, 207, 208 или 209.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, настоящее изобретение предусматривает антитело, содержащее:

VH последовательностей SEQ ID NO: 186, 187, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 или 205 и VL последовательности SEQ ID NO: 206;

VH последовательностей SEQ ID NO: 195 или 196 и VL последовательности SEQ ID NO: 207;

VH последовательностей SEQ ID NO: 188, 189 или 190 и VL последовательности SEQ ID NO: 208; или

VH последовательностей SEQ ID NO: 187, 191, 192, 193 или 194 и VL последовательности SEQ ID NO: 209.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенное человеческое или адаптированное к человеку антитело-антагонист или его фрагмент, специфически связывающееся с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого ST2L, содержащее:

HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 97;

HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 114;

HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 84;

LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 130;

LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 90;

LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 134 или

VH последовательности SEQ ID NO: 191 и VL последовательности SEQ ID NO: 209.

Человеческие mAb, в которых отсутствуют последовательности, не свойственные человеку, можно получить и оптимизировать из библиотек фаговых дисплеев с помощью способов, описанных, например, в работах Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000 г.; и Krebs et al., J Immunol Meth 254:67-84, 2001 г. В примере способа антитела настоящего изобретения выделены из библиотек экспрессией вариабельных участков тяжелой и легкой цепи антитела в виде слитных белков с белком оболочки pIX бактериофага. В библиотеках антител был проведен скрининг на связывание с человеческим ST2L-ECD, и затем полученные позитивные клоны были дополнительно охарактеризованы, из лизатов клонов были выделены Fab, и затем выполнена экспрессия полноразмерных IgG. (Примеры библиотек антител и способов скрининга представлены в публикациях Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 г.; международной патентной публикации № WO 2009/085462, патентной публикации США № 12/546850; патентах США №№ 5223409, 5969108 и 5885793).

Полученные mAb можно дополнительно модифицировать в их каркасных участках с изменением определенных каркасных остатков до остатков, присутствующих в соответствующей человеческой зародышевой линии.

Иммуноэффекторные свойства антител настоящего изобретения можно усилить или ослабить за счет модификаций Fc-фрагмента с применением способов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, эффекторные функции Fc-фрагмента, такие как связывание C1q, комплементзависимая цитотоксичность (CDC), антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, пони

- 12 031047 жающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора B-клетки; BCR) и т.п., могут обеспечиваться и/или контролироваться модифицирующими остатками в Fc-фрагменте, ответственными за данные действия. Мутировавшие остатки в Fc-домене, увеличивающие период полужизни антител, могут также улучшить фармакокинетические свойства (Strohl Curr Opin Biotechnol, 20: 685-91, 2009 г.). Примерами модификаций в Fc-домене являются IgG4 S228P/L234A/L235A, IgG2 M252Y/S254T/T256E (Dall'Acqua et al., J Biol Chem 281:23514-24, 2006 г.; или IgG2 V234A/G237A/P238S, V234A/G237A/H268Q, H268A/V309L/A330S/P331S или V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S в случае IgG2 (международная патентная заявка № WO 2011/066501) (нумерация в соответствии с принятой в EC нумерацией).

Кроме того, антитела настоящего изобретения можно модифицировать посттрансляционно за счет таких процессов, как гликозилирование, изомеризация, дегликозилирование или ненатуральная ковалентная модификация, такая как присоединение фрагментов полиэтиленгликоля (пегилирование) или липидизация. Такие модификации могут происходить in vivo или in vitro. Например, антитела настоящего изобретения можно конъюгировать с полиэтиленгликолем для усовершенствования их фармакокинетических характеристик. Конъюгацию можно выполнить с помощью способов, известных специалистам в данной области. Отмечено, что конъюгация терапевтических антител с PEG улучшает фармакодинамику, в то же время не оказывая влияния на функцию (Knigh et al., Platelets 15:409-18, 2004 г.; Leong et al., Cytokine 16:106-19, 2001 г.; Yang et al., Protein Eng 16:761-70, 2003 г.).

Антитела настоящего изобретения или их фрагменты, описанные в настоящем документе, модифицированные для улучшения стабильности, селективности, перекрестной реактивности, аффинности, иммуногенности или достижения других желательных биологических или биосептических характеристик, входят в объем настоящего изобретения. Стабильность антитела определяется рядом факторов, включая:

(1) пространственную укладку индивидуальных доменов, влияющую на их естественную стабильность;

(2) поверхностное взаимодействие белков, определяющее спаривание HC и LC; (3) глубину расположения полярных и заряженных остатков; (4) сеть водородных мостиков между полярными и заряженными остатками; и (5) поверхностный заряд и распределение полярных остатков наряду с другими внутри- и межмолекулярными взаимодействиями (Worn et al., J. Mol Biol 305:989-1010, 2001 г.). Остатки, способные дестабилизировать структуру, можно идентифицировать на основе кристаллической структуры антитела или путем молекулярного моделирования в определенных случаях, а эффект остатков на стабильность антитела можно испытывать путем создания вариантов мутаций в идентифицированных остатках и их оценки. Один из способов увеличения стабильности антитела заключается в увеличении срединной точки термоперехода (Tm), измеряемой путем дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Как правило, Tm белка имеет положительную корреляцию с его стабильностью и отрицательную корреляцию с подверженностью к нарушениям третичной структуры и денатурации в растворах, а также деградации, которая зависит от склонности белка к нарушению третичной структуры (Remmele et al., Biopharm 13:36-46, 2000 г.). Ряд исследований свидетельствует о корреляции между степенью физической стабильности составов, измеренной как термостабильность путем DSC, и измерениями, проведенными с помощью других способов (Gupta et al., AAPS PharmSci 5E8, 2003 г.; Zhang et al., J Pharm Sci 93:3076-89, 2004 г.; Maa et al., Int J Pharm 140:155-68, 1996 г.; Bedu-Addo et al., Pharm Res 21:1353-61, 2004 г.; Remmele et al., Pharm Res 15:200-8, 1997 г.). Результаты исследований состава позволяют предположить, что Tm Fab-фрагмента влияет на долговременную физическую стабильность соответствующего mAb. Различия в аминокислотах либо каркасного фрагмента, либо в CDR-участках могут существенно влиять на термическую стабильность домена Fab (Yasui et al., FEBS Lett 353: 143-6, 1994 г.).

Антитела настоящего изобретения, специфически связывающиеся с доменом I человеческого ST2L, описанные в настоящем документе, можно получить в виде биспецифических антител, которые также входят в объем настоящего изобретения. Из участков VL и/или VH антител настоящего изобретения с использованием опубликованных способов можно получить одноцепочечные биспецифические антитела в виде структур, таких как структуры TandAb® (международная патентная публикация № WO 1999/57150; патентная публикация США № US 2011/0206672), или биспецифические scFV в виде структур, таких как описанные в патенте США № US 5869620; международной патентной публикации № WO 1995/15388A, международной патентной публикации № WO 1997/14719 или международной патентной публикации № WO 2011/036460.

Из участков VL и/или VH антител настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, можно получить биспецифические полноразмерные антитела, где каждое плечо антитела связывается со своим антигеном или эпитопом. Такие биспецифические антитела, как правило, получают модулированием взаимодействий CH3 между двумя тяжелыми цепями антител с образованием биспецифических антител посредством таких способов, как описанные в патенте США № US 7695936; международной патентной публикации № WO 04/111233; патентной публикации США № US 2010/0015133; патентной публикации США № US 2007/0287170; международной патентной публикации № WO 2008/119353; патентной публикации США № US 2009/0182127; патентной публикации США № US 2010/0286374; патентной публикации США № US 2011/0123532; международной патентной публикации № WO 2011/131746; международной патентной публикации № WO 2011/143545; или патентной публикации

- 13 031047

США № US 2012/0149876. Дополнительными биспецифическими структурами, в которые могут встраиваться участки VL и/или VH антител настоящего изобретения, являются, например, иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами (международная патентная публикация № WO 2009/134776) или структуры, включающие в себя различные димеризационные домены для соединения двух обладающих разной специфичностью плеч антител, например лейциновую застежку или коллагеновые димеризационные домены (международная патентная публикация № WO 2012/022811, патент США № US 5932448; патент США № US 6833441).

Другим аспектом настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий любой из вариабельных участков тяжелой цепи антитела или вариабельных участков легкой цепи настоящего изобретения или их фрагменты, либо их комплемент. В настоящем документе описаны определенные полинуклеотиды, однако другие полинуклеотиды, которые, принимая во внимание вырожденность генетического кода или предпочтительность использования кодонов в данной экспрессирующей системе, кодируют антителаантагонисты настоящего изобретения, также входят в объем настоящего изобретения. Примерами полинуклеотидов настоящего изобретения являются полинуклеотиды с SEQ ID NO: 211, 212, 213 и 214.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой вектор, содержащий полинуклеотид настоящего изобретения. Такие векторы могут быть плазмидными, вирусными, бакуловирусными экспрессионными векторами, векторами на основе транспозонов или любыми другими векторами, подходящими для интродукции полинуклеотидов настоящего изобретения в заданный организм или генетическое окружение любым способом.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид настоящего изобретения. Такими клетками-хозяевами могут быть эукариотические, бактериальные, растительные клетки или клетки архей. Как правило, используются эукариотические клетки млекопитающих, насекомых, птиц или другие клетки животного происхождения. Эукариотические клетки млекопитающих включают в себя бессмертные клеточные линии, такие как гибридомы или клеточные линии миеломы, например SP2/0 (Американская коллекция типовых культур (ATCC), г. Манассас, штат Вирджиния, CRL-1581), NSO (Европейская коллекция клеточных культур (ECACC), г. Солсбери, Уилтшир, Великобритания, ECACC № 85110503), F0 (ATCC CRL-1646) и Ag653 (ATCC CRL1580) мышиные клеточные линии. Примером клеточной линии миеломы человека является U266 (ATTC CRL-TIB-196). Другие подходящие клеточные линии включают в себя линии, полученные из яичников китайского хомячка (CHO), такие как линии CHO-K1SV (Lonza Biologies, г. Уолкерсвилл, штат Мэриленд), CHO-K1 (ATCC CRL-61) или DG44.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ получения антитела, которое специфически связывается с доменом I ST2L, включающий культивирование клетки-хозяина настоящего изобретения и выделение антитела, формируемого клеткой-хозяином. Способы получения и очистки антител хорошо известны в данной области.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ ингибирования у субъекта взаимодействия ST2L с IL-33, включающий введение субъекту антитела, специфически связывающегося с доменом I ST2L в количестве, достаточном для ингибирования взаимодействия ST2L и IL-33.

Способы лечения

Для модуляции иммунной системы можно применять антагонисты ST2L настоящего изобретения, описанные в настоящем документе, например, антитела-антагонисты ST2L, блокирующие взаимодействие IL-33/ST2L и связывающиеся с доменом I ST2L, а также антитела, конкурирующие за связывание с человеческим ST2L (SEQ ID NO: 1) с выделенным антителом, содержащим вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 47 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 51, или антитела, связывающиеся с человеческим ST2L по аминокислотным остаткам 35-48 последовательности SEQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210). Антитела настоящего изобретения, описанные в настоящем документе, могут иметь более высокую антагонистическую эффективность в отношении биологической активности ST2L по сравнению с антителами, связывающимися с другими доменами и/или участками ST2L, поскольку антитела настоящего изобретения способны более эффективно снижать индуцированные IL-33 ответы мастоцитов. В способах настоящего изобретения можно использовать любые антитела настоящего изобретения. Примеры антител, которые можно использовать в способах настоящего изобретения, представляют собой антитела STLM62, STLM15, STLM103, STLM107, STLM108, STLM123, STLM124, STLM206, STLM207, STLM208, STLM209, STLM210, STLM211, STLM212, STLM213. Без стремления к ограничению какой-либо теорией, предполагается, что антитела-антагонисты, связывающиеся с доменом I и блокирующие взаимодействие IL-33/ST2L, могут ингибировать образование комплекса IL-1RAcP/IL-33/ST2L/cKit или расположенную ниже сигнализацию на мастоцитах, тогда как антитела, связывающиеся с доменом III, хотя и способны ингибировать рекрутинг IL-1RAcP в комплекс ST2L/IL-33, могут быть неспособны нарушать образование более крупного комплекса IL-1RAcP/IL-33/ST2L/cKit, специфичного для мастоцитов. Проведенный микропланшетный анализ подтверждает предположение, поскольку было показано, что антитела, связывающиеся с доменом I антител к ST2L, подавляли большую часть индуцированных IL-33 сигнальных путей в мастоцитах, а

- 14 031047 антитела, связывающиеся с доменом III антител к ST2L, могли лишь ингибировать небольшую часть данных сигнальных путей. Вероятно, это объясняется тем, что, поскольку IL-33 связывается с ST2L до ассоциации вспомогательного белка IL-1RAcP, блокирование связывания IL-33 с ST2L антителами, связывающимися с доменом I, может предотвращать ассоциацию любых других вспомогательных белков, включая cKit или еще не идентифицированных корецепторов. Антитела, связывающиеся с доменом III, которые не препятствуют связыванию IL-33 с ST2L, теоретически могут блокировать ассоциацию IL1RAcP, но не ассоциацию других корецепторов, включая еще не идентифицированные корецепторы. Было предложено множество моделей того, каким образом IL-1RAcP взаимодействует с комплексами IL1/IL-1R или ST2L/IL-33 (Lingel et al., Structure 17: 1398-1410, 2009 г.; и обзор Thomas et al., Nat Struct & Molec Biol 19: 455-457, 2012 г.). Данные модели указывают на то, что IL-1RAcP может связываться с одной стороной комплекса, но то, какая это сторона, окончательно не показано. Следовательно, вероятно, что существует возможность того, что другая сторона или свободная сторона комплекса доступна для ассоциации с другим корецептором, не блокируемым антителом к домену III, и возможны нерасчетные эффекты, такие как повышенный рекрутинг другого корецептора, приводящего к усилению сигнализации.

В способах настоящего изобретения можно использовать любое антитело-антагонист, специфически связывающееся с доменом I человеческого ST2L, антитело-антагонист, блокирующее взаимодействие IL-33/ST2L и связывающееся с доменом I человеческого ST2L, антитела, конкурирующие за связывание с человеческим ST2L (SEQ ID NO: 1) с выделенным антителом, содержащим вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 47 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 51, или антитела, связывающиеся с человеческим ST2L по аминокислотным остаткам 35-48 последовательности SEQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210). Дополнительные характеристики таких антител включают в себя способность антитела блокировать взаимодействие IL-33/ST2L и ингибировать ответы человеческих мастоцитов.

Следовательно, антитела настоящего изобретения подходят для лечения ряда ST2Lопосредованных заболеваний, ST2L-опосредованных воспалительных заболеваний и заболеваний, при которых желательным является ингибирование ответов мастоцитов.

Способы настоящего изобретения можно использовать для лечения любого животного. Примеры таких животных включают в себя млекопитающих, таких как люди, грызуны, собаки, кошки и сельскохозяйственные животные. Например, антитела настоящего изобретения подходят для использования при профилактике и лечении ST2L-опосредованных заболеваний, таких как воспалительные заболевания, включая астму, гиперреактивность дыхательных путей, саркоидоз, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), идиопатический легочный фиброз (IPF), муковисцидоз, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), ревматоидный артрит, эозинофильный эзофагит, склеродерму, атопический дерматит, аллергический ринит, буллезный пемфигоид, хроническую крапивницу, диабетическую нефропатию, интерстициальный цистит или реакцию трансплантат против хозяина (GVHD). Антитела настоящего изобретения подходят для использования при профилактике и лечении иммунных заболеваний, опосредованных по меньшей мере частично мастоцитами, таких как астма, экзема, кожный зуд, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, а также аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, буллезный пемфигоид и рассеянный склероз.

Антитела настоящего изобретения также подходят для получения лекарственных средств для лечения таких состояний, причем лекарственные средства готовят для введения в дозировках, определенных в настоящем документе.

Мастоциты играют центральную роль в аллергическом воспалении и астме благодаря высвобождению различных медиаторов (обзор Amin, Respir Med 106:9-14, 2012 г.). ST2L в большом количестве экспрессируется в мастоцитах, и его активация приводит к экспрессии многих провоспалительных цитокинов и других медиаторов. Предполагается, что ингибирование активности ST2L препятствует опосредованному мастоцитами рекрутингу воспалительных клеток и модулирует хроническое воспаление.

Мастоциты быстро реагируют на стимуляцию, включая аллергены, холодный воздух и патогены; повреждение эпителия данными стимулами может приводить к высвобождению IL-33 (обзор Zhao и Hu, Cell & Molec Immunol 7: 260-2, 2012 г.). Мастоциты выделяют лейкотриены, гистамин, простагландины и цитокины, повышая проницаемость сосудов и вызывая бронхостеноз, а также рекрутируют в сайт другие иммунные клетки, такие как нейтрофилы, эозинофилы и T-лимфоциты (Henderson et al., JEM 184:148394, 1996 г.; White et al., JACI 86:599-605, 1990 г.). Кроме того, они усиливают иммунные ответы, увеличивая экспрессию адгезивных молекул на клетках эпителия и усиливая направленную миграцию иммунных клеток (Meng et al., J Cell Physiol 165:40-53, 1995 г.). Мастоциты играют важную роль в перестройке дыхательных путей; у больных астмой обнаруживается повышенное число мастоцитов в слое гладкой мускулатуры дыхательных путей (ASM), и они секретируют медиаторы, стимулирующие пролиферацию ASM (обзор Okayama et al., Curr Opin Immunol 19:687-93, 2007 г.).

Воспалительное заболевание легких является примером воспалительного заболевания. Примеры воспалительных заболеваний легких включают в себя инфекционные болезни легких, вызванные вирусными, бактериальными, грибковыми, паразитарными или прионными инфекциями; заболевания легких,

- 15 031047 вызванные аллергенами; заболевания легких, вызванные загрязняющими факторами, такие как асбестоз, силикоз или бериллиоз; заболевания легких, вызванные аспирацией желудочного содержимого, нарушением иммунной регуляции, воспалительные заболевания с генетической предрасположенностью, такие как муковисцидоз, и заболевания легких, вызванные физической травмой, такие как травмы дыхательных путей. Данные воспалительные заболевания также включают в себя астму, эмфизему, бронхит, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), саркоидоз, гистиоцитоз, лимфангиомиоматоз, острое повреждение легких, синдром острого нарушения дыхания, хроническое заболевание легких, бронхопульмональную дисплазию, внебольничную пневмонию, госпитальную пневмонию, вызванную искусственной вентиляцией легких пневмонию, сепсис, вирусную пневмонию, инфекцию гриппа, парагриппозные инфекции, инфекцию ротавируса, инфекцию человеческого метапневмовируса, респираторно-синцитиальную инфекцию, Aspergillus и другие грибковые инфекции. Как правило, связанные с инфекцией воспалительные заболевания могут включать в себя вирусную или бактериальную пневмонию, включая тяжелую пневмонию, муковисцидоз, бронхит, обострения заболеваний дыхательных путей и синдром острого нарушения дыхания (ARDS). Такие связанные с инфекцией заболевания могут вовлекать множество инфекций, таких как первичная вирусная и вторичная бактериальная инфекция. Нарушение подачи сигналов ST2L может играть роль в патогенезе легочных заболеваний, таких как астма и хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD) (обзор Alcorn et al., Annu. Rev Physiol 72:495-516, 2010 г.). Часто применяемые модели астмы и воспалений дыхательных путей включают в себя модель со стимуляцией овальбумином, модели с метахолиновой сенсибилизацией и сенсибилизацией Aspergillus fumigatus (Hessel et al., Eur J Pharmacol 293:401-12, 1995 г.). Ингибирование продукции цитокинов и хемокинов в культурах человеческих бронхиальных клеток эпителия, бронхиальных фибробластов или клеток гладкой мускулатуры дыхательных путей также можно использовать в качестве моделей in vitro. Введение антагонистов настоящего изобретения в любую из данных моделей можно использовать для оценки эффективности применения данных антагонистов для облегчения симптомов и изменения течения астмы, воспалений дыхательных путей, COPD и т. п.

Астма является воспалительным заболеванием легких, которое характеризуется гиперчувствительностью дыхательных путей (AHR), бронхостенозом, хрипами в легких, эозинофильным или нейтрофильным воспалением, гиперсекрецией слизи, субэпителиальным фиброзом и повышенным уровнем иммуноглобулина IgE. Больные астмой пациенты испытывают приступы, ухудшение симптомов, чаще всего из-за микробиологических инфекций респираторного тракта (например, риновирус, вирус гриппа, гемофильная палочка Haemophilus influenza и т.п.). Астматические атаки могут провоцироваться факторами окружающей среды (например, аскариды, насекомые, животные (например, кошки, собаки, кролики, мыши, крысы, хомячки, морские свинки и птицы), грибки, загрязнение воздуха (например, табачный дым), раздражающие газы, запахи, испарения, аэрозоли, химикаты, пыльца, физические упражнения или холодный воздух). Кроме астмы некоторые хронические, поражающие легкие воспалительные заболевания характеризуются нейтрофильной инфильтрацией дыхательных путей, например, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), бактериальная пневмония и муковисцидоз (Linden et al., Eur Respir J 15:973-7, 2000 г.; Rahman et al., Clin Immunol 115:268-76, 2005 г.), а заболевания, такие как хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), аллергические риниты и муковисцидоз, характеризуются гиперчувствительностью дыхательных путей (Fahy и CByrne, Am. J Respir Crit Care Med 163:822-3, 2001 г.). Часто применяемые модели астмы и воспалений дыхательных путей включают в себя модель со стимуляцией метахолином после сенсибилизации и стимуляции овальбумином (Hessel et al., Eur J Pharmacol 293:401-12, 1995 г.). Ингибирование продукции цитокинов и хемокинов в культурах человеческих бронхиальных клеток эпителия, бронхиальных фибробластов или клеток гладкой мускулатуры дыхательных путей можно использовать в качестве моделей in vitro. Введение антител-антагонистов настоящего изобретения в любую из данных моделей можно использовать для оценки эффективности применения данных антагонистов для облегчения симптомов и изменения течения астмы, воспалений дыхательных путей, COPD и т. п.

Сигнализация IL-33 через рецептор ST2L на клетках ТН2, базофильных клетках, мастоцитах и недавно описанных лимфоидных клетках врожденного иммунитета 2-го типа приводит к секреции IL-5 и IL-13 (цитокинов 2-го типа) (обзор ILC представлен в публикации Spits et al., Nature Reviews Immunology 13:145-149, 2013 г.). Благоприятные эффекты терапевтического воздействия, ориентированного на IL-5 или IL-13, при астме подтверждает значимость данных сигнальных путей. IL-5 активирует эозинофилы, и лечение подгруппы пациентов с тяжелой астмой и эозинофилией в слюне моноклональным антителом, нейтрализующим IL-5, приводило к меньшему числу обострений (Nair et al. N. Engl J. Med. 2009 г.; 360(10):985-93). Для IL-13 показано участие в синтезе IgE, секреции слизи и фиброзе. Лечение пациентов с тяжелой астмой моноклональным антителом к IL-13 приводило к улучшению легочной функции, и в данной подгруппе было продемонстрировано более значительное улучшение (Corren et al., N. Engl. J. Med., 365:1088-1098, 2011 г.). Также в патогенезе астмы участвуют другие медиаторы различных иммунологических путей, и блокирование данных путей наряду с ST2L может обеспечить дополнительный терапевтический эффект. Терапии, ориентированные на множество цитокинов 2-го типа, или на сигнальные пути, расположенные выше продукции цитокинов 2-го типа, могут обеспечивать благоприятный

- 16 031047 эффект при лечении тяжелого заболевания.

Домены VH и VL антител к ST2L настоящего изобретения могут встраиваться в биспецифические антитела и молекулы, описанные в настоящем документе, причем биспецифические антитела специфически связываются с доменом I ST2L и со вторым антигеном, таким как TSLP (тимусный стромальный лимфопоэтин), IL-25, IL-17RB или TSLPR.

IL-25 и TSLP, подобно IL-33, активируют высвобождение цитокинов 2-го типа через разные сигнальные комплексы: IL-25 (IL-17B) входит в семейство IL-17 и активирует сигнализацию через IL17RA/IL-17RB, a TSLP входит в семейство IL-7 и активирует сигнализацию через гетеродимеры TSLPR/IL-7Ra (обзор Koyasu et al., Immunol 132:475-481, 2011 г.). Животные, лишенные IL-33, ST2L, IL25, IL-17RB, TSLP или TSLPR, демонстрируют меньшую тяжесть воспалений дыхательных путей по меньшей мере в одном из множества типов моделей астмы на мышах; однако в большинстве данных животных моделей продемонстрирована недостаточность защиты от воспаления дыхательных путей, повышающая вероятность того, что воздействие на эпителий различных аллергенов или патогенов приведет к параллельному высвобождению IL-33, IL-25 и TSLP. В публикации Hammad et al. отмечено, что введение мышам экстракта из домашних пылевых клещей приводило к увеличению высвобождения IL25, TSLP и IL-33 (а также IL-5 и IL-13 после IL-33) в дыхательных путях (Hammad et al., Nat Med 15:210216, 2009 г.). Предполагается, что блокирование ST2L и TSLP и/или IL-25 может оказывать благоприятные эффекты, особенно при тяжелом заболевании дыхательных путей.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело-антагонист, специфически связывающееся с доменом I человеческого ST2L, можно использовать для получения биспецифических молекул, связывающихся с ST2L и TSLP, ST2L и IL-25, ST2L и TSLPR, ST2L и IL-17RA, или ST2L и IL17RB.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело-антагонист, специфически связывающееся с доменом I человеческого ST2L, представляет собой биспецифическое антитело, причем антитело дополнительно связывается с TSLP, IL-25, TSLPR, IL-17RA или IL-17RB.

Антитела, связывающиеся с TSLP, IL-25, TSLPR, IL-17RA и IL-17RB, можно получать с использованием способов, описанных в настоящем документе, таких как иммунизация мышей, экспрессирующих локусы человеческого иммуноглобулина (Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994 г.; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996 г.; Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56, 1997 г., патенты США №№ 5770429, 7041870 и 5939598), или мышей Balb/c соответствующими белками или внеклеточными доменами белков, или с использованием библиотек фаговых дисплеев, как описано в настоящем документе. В альтернативном варианте осуществления существующие антитела к TSLP, IL-25, TSLPR, IL-17RA и IL17RB можно использовать для получения биспецифических молекул. Примеры пригодных для использования антител к IL-25 описаны, например, в международной патентной публикации № WO 2011/123507.

Артриты, включая остеоартрит, ревматоидный артрит, артрит суставов, возникший в результате повреждения, и т. п., являются обычными воспалительными состояниями, лечение которых можно улучшить за счет терапевтического применения таких противовоспалительных белков, как антагонисты, представленные в настоящем изобретении. Активация сигнального ST2L-пути может приводить к непрекращающемуся воспалению и дополнительному повреждению тканей в воспаленном суставе. Известно несколько животных моделей для изучения ревматоидного артрита. Например, при моделировании коллагениндуцированного артрита (CIA) у мыши развивается хронический воспалительный артрит, который очень напоминает человеческий ревматоидный артрит. У мышей с отсутствием ST2L (ST2KO) в данной модели развивалось ослабленное заболевание, и патология при данной модели зависела от экспрессии ST2L мастоцитами (Xu et al., PNAS 105:10913-8, 2008 г.). В данной модели наблюдали сниженную инфильтрацию моноядерных и полиморфноядерных клеток и сниженную синовиальную гиперплазию суставов у мышей с ST2KO. При культивации дренирующих лимфоузлов ST2KO с коллагеном (CII) было показано существенное снижение продукции IL-17, IFNy и TNFa. У мышей с отсутствием ST2L, которым перед индукцией CIA были адоптивно пересажены мастоциты костномозгового происхождения (BMMC) дикого типа (WT), развивался более тяжелый CIA, чем у мышей, которым пересаживали BMMC от мышей ST2KO. Следовательно, ST2L-сигнализация в мастоцитах была критичной для развития артрита в мышиной модели, напоминающей человеческий ревматоидный артрит. Введение антител ST2L настоящего изобретения, что ингибирует ответы мастоцитов, в мышиной модели с CIA можно использовать для оценки эффективности применения данных антагонистов для облегчения симптомов и изменения течения болезни.

Примеры воспалительных состояний включают в себя воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD), колит, индуцированный внешними воздействиями (например, желудочно-кишечное воспаление (например, колит), вызванные терапевтическими режимами или сопутствующие им (например, в качестве побочного эффекта), таким как химиотерапия, радиотерапия и т. п.), инфекционный колит, ишемический колит, коллагеновый или лимфоцитарный колит, некротический энтероколит, колиты, вызванные другими состояниями, такими как хроническая гранулематозная болезнь или целиакия, пищевые аллергии, гастриты, инфекционные гастриты или энтероколиты (на- 17 031047 пример, хронический активный гастрит, вызванный инфекцией Helicobacter pylori), а также другие формы желудочно-кишечного воспаления, вызванные возбудителем инфекции. Известно несколько моделей воспалительных состояний желудочно-кишечного тракта на животных. Одни из самых распространенных моделей представляют собой модель колита, индуцированного введением 2, 4, 6тринитробензолсульфоновой кислоты/этанола (TNBS), и модель с применением оксазолона, который индуцирует хроническое воспаление и возникновение язвы толстой кишки (Neurath et al., Intern Rev Immunol 19:51-62, 2000 г.). В другой модели используется декстран сульфата натрия (DSS), который индуцирует острый колит, сопровождающийся такими симптомами, как кровавая диарея, потеря веса, сокращение толстой кишки и вызываемое инфильтрацией нейтрофилов возникновение язвы слизистой оболочки. Другая модель основана на адоптивном переносе интактных CD45RB^high CD4 Т-клеток мышам линий RAG или SCID. В данной модели интактные Т-клетки донора атакуют кишечник реципиента, вызывая хроническое воспаление пищеварительного тракта и симптомы, сходные с воспалительным заболеванием кишечника человека (Read и Powrie, Curr. Protoc Immunol, глава 15, раздел 15.13, 2001 г.). Введение антагонистов настоящего изобретения в любую из данных моделей можно использовать для оценки потенциальной эффективности данных антагонистов в облегчении симптомов и изменении течения болезней, связанных с воспалительным процессом в пищеварительном тракте, таким как воспалительное заболевание кишечника.

Фиброз почек может развиться из-за острого инсульта, такого как ишемия, спровоцированная трансплантатом/реперфузией (Freese et al., Nephrol Dial Transplant 16:2401-6, 2001 г.), или хронического заболевания, такого как диабет (Ritz et al., Nephrol Dial Transplant 11 Suppl 9:38-44, 1996 г.). Как правило, патогенез характеризуется исходной воспалительной реакцией с последующим устойчивым фиброгенезом аппарата клубочковой фильтрации и канальцевого интерстиция (Liu, Kidney Int 69: 213-7, 2006 г.). Было показано, что тубулоинтерстициальный фиброз играет критическую роль в патогенезе поражения почек до развития терминальной почечной недостаточности, также было выявлено, что клетки проксимальных канальцев являются основным медиатором (Phillips and Steadman, Histol Histopathol 17: 247-52, 2002 г.; Phillips, Chang Gung Med J 30: 2-6, 2007 г.). Фиброгенез в тубулоинтерстициальном отделе частично опосредуется активацией находящихся там фибробластов, которые выделяют провоспалительные цитокины, стимулирующие эпителий проксимальных канальцев к выделению местных медиаторов воспаления и фиброгенеза. Кроме того, фибробласты и клетки эпителия выделяют хемотаксические цитокины, которые обеспечивают направленный градиент, направляющий проникновение моноцитов/макрофагов и Т-клеток в тубулоинтерстиций. Воспалительный инфильтрат продуцирует дополнительные фиброгенные и провоспалительные цитокины, что ведет к дополнительной активации высвобождения цитокинов из фибробластов и эпителия, тогда как в эпителии происходит изменение фенотипа, при котором клетки накапливают избыточное количество компонентов внеклеточного матрикса (Simonson, Kidney Int 71: 846-54, 2007 г.).

Другие примеры фиброзных заболеваний могут включать в себя фиброз печени (включая, без ограничений, алкогольный цирроз, вирусный цирроз, аутоиммунный гепатит); фиброз легких (включая, без ограничений, склеродерму, идиопатический легочный фиброз); фиброз почек (включая, без ограничений, склеродерму, диабетический нефрит, гломерулярный нефрит, волчаночный нефрит); кожный фиброз (включая, без ограничений, склеродерму, гипертрофические и келоидные рубцы, ожоги); миелофиброз; нейрофиброматоз; фиброму; кишечный фиброз; и фиброзные спайки в результате хирургических вмешательств. Фиброз может быть органоспецифическим или системным. Органоспецифический фиброз может быть связан с одним из следующих заболеваний: фиброз легких, фиброз печени, фиброз почек, фиброз сердца, фиброз сосудов, фиброз кожи, фиброз глаза или фиброз костного мозга.

Фиброз легких может быть связан с одним из следующих заболеваний: идиопатический легочный фиброз, медикаментозный легочный фиброз, астма, саркоидоз или хроническое обструктивное легочное заболевание. Фиброз печени может быть связан с одним из следующих заболеваний: цирроз, шистосомоз или холангит. Цирроз может быть либо алкогольным, возникшим после гепатита C или первичным билиарным циррозом. Холангит может быть склерозирующим холангитом. Фиброз почек может быть связан с диабетической нефропатией или с вызванным системной красной волчанкой гломерулосклерозом. Фиброз сердца может быть связан с инфарктом миокарда. Фиброз сосудов может быть связан с повторным сужением артерий после ангиопластики или атеросклерозом. Фиброз кожи может быть связан с возникшими в результате ожога рубцами, гипертрофическими рубцами, келоидными рубцами или нефрогенной фиброзирующей дермопатией. Фиброз глаза может быть связан с ретро-орбитальным фиброзом, с хирургическим вмешательством при лечении катаракты или пролиферативной витреоретинопатией. Фиброз костного мозга может быть связан с идиопатическим миелофиброзом или медикаментозным миелофиброзом. Системные фиброзы могут быть системными склерозами или реакцией трансплантат против хозяина.

Другие воспалительные заболевания и нейропатии, которые можно предотвратить или вылечить способами настоящего изобретения, вызываются аутоиммунными заболеваниями. Данные заболевания и нейропатии включают в себя рассеянный склероз, системную красную волчанку и нейродегенеративные заболевания и расстройства центральной нервной системы (CNS), включая болезнь Альцгеймера, бо

- 18 031047 лезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, биполярное аффективное расстройство и амиотрофический боковой склероз (ALS), болезни печени, включая первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, неалкогольную жировую инфильтрацию (жировой метаморфоз) печени/стеатогепатит, фиброз, вирус гепатита C (ВГС) и вирус гепатита B (ВГВ), диабет и резистентность к инсулину, сердечнососудистые расстройства, включая атеросклероз, церебральные кровотечения, инсульт и инфаркт миокарда, артрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит и ювенильный ревматоидный артрит (JRA), остеопороз, остеоартрит, панкреатит, фиброз, энцефалит, псориаз, гигантоклеточный артериит, анкилозирующий спондилит, аутоиммунный гепатит, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), воспалительные заболевания кожи, трансплантат, рак, аллергии, эндокринные заболевания, заживление ран, другие аутоиммунные расстройства, гиперчувствительность дыхательных путей, а также клеточные, вирусные или опосредованные прионами инфекции или расстройства.

Одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способ лечения или предотвращения ST2L-опосредованного заболевания, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного человеческого или адаптированного к человеку антитела-антагониста, которое специфически связывается с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого ST2L, блокирует взаимодействие IL-33/ST2L, конкурирует за связывание с человеческим ST2L (SEQ ID NO: 1) с выделенным антителом, содержащим вариабельный участок тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO: 47 и вариабельный участок легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO: 51, и/или связывается с человеческим ST2L по аминокислотным остаткам 35-48 последовательности SEQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210), требующему лечения пациенту в течение периода времени, достаточного для лечения или предотвращения ST2L-опосредованного заболевания.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ ингибирования ответа мастоцитов у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного человеческого или адаптированного к человеку антитела-антагониста, которое специфически связывается с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого ST2L, блокирует взаимодействие IL-33/ST2L, конкурирует за связывание с человеческим ST2L (SEQ ID NO: 1) с выделенным антителом, содержащим вариабельный участок тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO: 47 и вариабельный участок легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO: 51, и/или связывается с человеческим ST2L по аминокислотным остаткам 35-48 последовательности SEQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210), требующему лечения пациенту в течение периода времени, достаточного для ингибирования ответа мастоцитов.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ ингибирования взаимодействия IL-33 и ST2L у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного человеческого или адаптированного к человеку антитела-антагониста, которое специфически связывается с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого ST2L, блокирует взаимодействие IL-33/ST2L, конкурирует за связывание с человеческим ST2L (SEQ ID NO: 1) с выделенным антителом, содержащим вариабельный участок тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO: 47 и вариабельный участок легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO: 51, и/или связывается с человеческим ST2L по аминокислотным остаткам 35-48 последовательности SEQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210), в количестве, достаточном для ингибирования взаимодействия IL-33 и ST2L.

В другом варианте осуществления ST2L-опосредованное заболевание представляет собой астму, гиперреактивность дыхательных путей, саркоидоз, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), идиопатический легочный фиброз (IPF), муковисцидоз, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), эозинофильный эзофагит, склеродерму, атопический дерматит, аллергический ринит, буллезный пемфигоид, хроническую крапивницу, диабетическую нефропатию, ревматоидный артрит, интерстициальный цистит или реакцию трансплантат против хозяина (GVHD).

В другом варианте осуществления ST2L-опосредованное заболевание связано с рекрутингом воспалительных клеток в легкие, гиперплазией бокаловидных клеток и повышенной секрецией слизи.

В другом варианте осуществления ST2L-опосредованное заболевание связано с ответом мастоцитов.

В другом варианте осуществления ингибирование ответа мастоцитов включает ингибирование уровня высвобождения GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-10 или IL-13 мастоцитами пуповинной крови человека по меньшей мере на 50% антителом в концентрации 50 мкг/мл.

В другом варианте осуществления антитело-антагонист, вводимое требующему лечения пациенту, представляет собой биспецифическое антитело, которое специфически связывается с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого ST2L, блокирует взаимодействие IL-33/ST2L, конкурирует за связывание с человеческим ST2L (SEQ ID NO: 1) с выделенным антителом, содержащим вариабельный участок тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO: 47 и вариабельный участок легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO: 51, и/или связывается с человеческим ST2L по аминокислотным остаткам 35-48 последовательности SEQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210), а также связывается с TSLP, IL25, TSLPR, IL-17RA или IL-17RB.

- 19 031047

Введение/ фармацевтические композиции

Терапевтически эффективное количество антител к ST2L, эффективных в лечении заболеваний, при которых желательна биологическая активность модуляции ST2L, может быть определено путем стандартных исследовательских способов. Например, дозу антител к ST2L, эффективную при лечении воспалительного заболевания, такого как астма или ревматоидный артрит, можно определить введением антител к ST2L в соответствующие модели животных, такие как модели, описанные в настоящем документе.

Кроме того, для идентификации оптимальных диапазонов дозы можно использовать анализы in vitro. Выбор конкретной эффективной дозы (например, с помощью клинических испытаний) может осуществляться специалистами в данной области на основе нескольких факторов. Такие факторы включают в себя подлежащее лечению или предотвращению заболевание, симптомы заболевания, массу тела пациента, иммунологический статус пациента и другие факторы, известные специалистам в данной области. Точная доза, предназначенная для применения в составе, также зависит от способа введения и от тяжести болезни, и она должна определяться на основе решения медработника и состояния каждого пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать на основе кривой динамики доза-ответ, полученной в испытуемых системах моделей животных in vitro.

Для введения предназначенных для терапевтического применения антител можно использовать любой подходящий путь введения, который обеспечивает доставку агента пациенту. Фармацевтические композиции данных антител являются особенно подходящими для парентерального введения, например, внутрикожного, внутримышечного, внутрибрюшного, внутривенного, подкожного или интраназального введения.

Антитела настоящего изобретения можно получить в виде фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество агента в качестве активного компонента в фармацевтически приемлемом носителе. Термин носитель относится к растворителю, адъюванту, эксципиенту или несущей среде, вместе с которыми будет вводиться соединение. Такие фармацевтические несущие среды могут представлять собой жидкости, такие как вода или масла, включая масла, получаемые из нефти, масла растительного, животного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Например, можно использовать 0,4% солевой раствор и 0,3% раствор глицина. Данные растворы стерильны и, по существу, свободны от твердых примесей. Стерилизацию проводят с использованием стандартных, хорошо известных способов стерилизации (например, фильтрования). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для соответствующих физиологических условий, такие как агенты, необходимые для контроля и изменения pH, стабилизаторы, загустители, увлажнители и красители и т. п. Концентрация антитела настоящего изобретения в таком фармацевтическом составе может значительно варьироваться, т.е. от менее приблизительно 0,5%, обычно от не менее или равной приблизительно 1%, и до 15-20 вес.% и будет определяться преимущественно на основе необходимой дозы, объемов текучей среды, вязкости и т.п., в соответствии с конкретным выбранным способом введения.

Таким образом, фармацевтическая композиция настоящего изобретения для внутримышечной инъекции может содержать 1 мл стерильной воды буфера, а также от приблизительно 1 нг до приблизительно 100 мг, например, от приблизительно 50 нг до приблизительно 30 мг, или более предпочтительно от приблизительно от 5 до приблизительно 25 мг антитела к ST2L настоящего изобретения. Аналогичным образом фармацевтическая композиция настоящего изобретения для внутривенной инфузии может содержать приблизительно 250 мл стерильного раствора Рингера и от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг, предпочтительно приблизительно от 5 до приблизительно 25 мг антагониста настоящего изобретения. Действительные способы получения парентерально вводимых композиций хорошо известны и более подробно описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15-е изд., Mack Publishing Company, Easton, PA.

Антитела настоящего изобретения можно лиофилизировать для хранения и восстановить в подходящем носителе перед применением. Было показано, что данный способ является эффективным для стандартных иммуноглобулинов и белковых препаратов, причем можно использовать способы лиофилизации и восстановления, известные в данной области.

Настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие конкретные, но не имеющие ограничительного характера примеры.

Материалы и способы (общие)

Анализ ингибирования связывания рецептора с лигандом у человека и яванского макака (Macaca fascicularis, cyno) (RLB-анализ)

На 96-лучночный планшет наносили 50 мкл 4 мкг/мл человеческого ST2L-ECD (аминокислоты 19328 последовательности SEQ ID NO: 1) или 2 мкг/мл ST2L-ECD яванского макака (аминокислоты 19-321 последовательности SEQ ID NO: 2), содержащих C-концевую метку His6, в бикарбонатном буфере при 4°C на 16 часов. Все последующие стадии выполняли при комнатной температуре. Планшет блокировали блокирующим буфером, 200 мкл, и промывали трижды промывочным буфером, 300 мкл, содержащим PBS+0,05% Tween. 30 мкл mAb к ST2L в различных разведениях добавляли в лунки и культивировали в

- 20 031047 течение 1 ч. Для анализа связывания человеческого рецептора с лигандом добавляли 20 мкл биотинилированного человеческого IL-33 (остатки 112-270 последовательности SEQ ID NO: 3) с конечной концентрацией 100 нг/мл и культивировали в течение 30 мин. Для анализа связывания рецептора с лигандом яванского макака добавляли 20 мкл биотинилированного IL-33 яванского макака (остатки 112-269 последовательности SEQ ID NO: 4) с конечной концентрацией 200 нг/мл и культивировали в течение 30 мин. Планшет трижды промывали, используя 300 мкл промывочного буфера. Добавляли 50 мкл 0,2 мкг/мл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена (Streptavidin-HRP) (Jackson Immunoresearch) и культивировали в течение 30 минут. Планшет трижды промывали, используя 300 мкл промывочного буфера, содержащего PBS+0,05% Tween. В каждую лунку добавляли 50 мкл субстрата ТМВ (EMD Biosciences). Реакцию останавливали, добавляя 100 мкл 0,2 H серной кислоты. OD450 измеряли с использованием спектрофотометра для прочтения планшетов Envision (Perkin Elmer).

Получение химерных конструктов ST2L

Различные конструкты с заменами человеческих и мышиных доменов I, II или III ST2L были разработаны и созданы с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Конструкты перечислены в табл. 1. Нумерация аминокислот соответствует человеческому ST2L (hST2L)(SEQ ID NO: 1; NP 057316) и мышиному ST2L (mST2L)(SEQ ID NO: 5; NP 001020773).

Таблица 1

	Происхождение аминокислотных остатков для каждого домена в химерных конструктах
Название конструкта	Домен I	Домен II	Домен III
HHM-ST2L	hST2L аа. 19-122	hST2L аа. 123202	mST2L аа. 209324
MHM-ST2L	mST2L аа. 28-128	hST2L аа. 123202	mST2L аа. 209324
HMH-ST2L	hST2L аа. 19-122	mST2L аа. 129208	hST2L аа. 203321
HH-ST2L	hST2L аа.19-122	hST2L аа. 123205	N/A

hST2L: человеческий ST2L SEQ ID NO: 1 mST2L: мышиный ST2L SEQ ID NO: 5

Анализ для определения связывания с доменом

Антитело, связывающееся с доменом I, II и III ST2L, определяли с использованием стандартного метода ИФА с захватом и с электрохемилюминесцентным форматом детекции (технология Meso-Scale Discovery (MSD)). На каждую лунку планшета MSD HighBind (5 мкл/лунка) наносили 10 мкг/мл каждого антитела на 2 ч при комнатной температуре. Планшет блокировали 150 мкл 5% блокирующего буфера MSD в течение 2 ч при комнатной температуре и трижды промывали промывочным буфером с HEPES с последующим добавлением 25 мкл меченного сульфо-меткой человеческого белка huST2L-ECD или мышиного белка ST2L-ECD (аминокислоты 28-326 последовательности SEQ ID NO: 5), или химер HHMST2L (SEQ ID NO:6) или HMH-ST2L (SEQ ID NO: 8), или HH-ST2L (остатки 19-205 последовательности SEQ ID NO: 1) на планшет, в концентрациях, возрастающих в диапазоне от 5 до 40 нМ. Планшет закрывали алюминиевой фольгой и культивировали в течение 1 ч при комнатной температуре с осторожным покачиванием. Затем планшет трижды промывали промывочным буфером с HEPES. В каждую лунку добавляли буфер считывания MSD (150 мкл) и проводили сканирование с помощью сканера MSD Sector Imager 6000.

Антитела, связавшиеся с человеческим ST2L-ECD, HHM-ST2L и HMH-ST2L, но не с мышиным ST2L-ECD, распознают домен I человеческого ST2L-ECD. Антитела, связавшиеся с человеческим ST2LECD, HMH-ST2L, но не с HHM-ST2L и не с мышиным ST2L-ECD, распознают домен III человеческого ST2L-ECD. Антитела, связавшиеся с человеческим и мышиным ST2L-ECD, но не с HH-ST2L, распознают домен III человеческого и мышиного ST2L-ECD.

Измерение аффинности mAb к ST2L

MAb к ST2L, huST2L-ECD и ST2L-ECD яванского макака экспрессировали с использованием стандартных способов. Козьи антитела против IgG Fcy человека, специфичные к фрагменту (номер по каталогу 109-005-098), приобрели в Jackson ImmunoResearch (г. Вест Гроув, штат Пенсильвания). Сенсорные чипы GLC (Bio-Rad, номер по каталогу 176-5011), сенсорные чипы CM-5 (GE Healthcare, номер по каталогу BR100014) и реагенты для подготовки захватной поверхности приобрели в Biacore (GE Healthcare, г. Пискатауэй, штат Нью-Джерси) или в Bio-Rad Life Sciences (Bio-Rad, г. Геркулес, штат Калифорния).

Взаимодействие антител к ST2L с меченным His6 человеческим ST2L-ECD и меченным His6 ST2L

- 21 031047

ECD яванского макака исследовали при помощи ProteOn с использованием ProteOn XPR36 при 25°C. Биосенсорную поверхность готовили, связывая козьи антитела против IgG Fcy человека, специфичные к фрагменту, с поверхностью сенсорного чипа GLC в соответствии с инструкциями производителя по химии аминного связывания. Буфер соединения представлял собой 10 мМ ацетата натрия, pH 4,5. Козьи антитела против IgG Fcy человека (приблизительно 4500 единиц ответа) иммобилизовали в горизонтальной ориентации. Антитела к ST2L получали в очищенном виде или в неочищенных надосадочных жидкостях. В любом случае антитела разводили в буфере PRB (PBS, pH 7,4, с добавлением 3 мМ ЭДТА и 0,005% Tween 20) в концентрации приблизительно 0,5 мкг/мл. Антитела захватывались (60-130 RU) в вертикальной ориентации чипом GLC, измененным антителами против Fcy человека. После захвата mAb к ST2L делали инъекцию huST2L ECD в растворе (0,024-15 нМ в 5-кратных разведениях) или ST2L ECD яванского макака в растворе (0,020-5 нМ в 4-кратных разведениях) в горизонтальной ориентации. Во всех экспериментах за ассоциацией наблюдали в течение 4 мин (делали инъекцию 200 мкл со скоростью 50 мкл/мин). За диссоциацией наблюдали в течение 30 мин. Регенерации сенсорной поверхности добивались при помощи трех 15-секундных подач 10 мМ глицина, pH 1,5. Данные аппроксимировали с использованием программного обеспечения ProteOn с использованием модели связывания 1:1 с переносом массы.

Эксперименты на оборудовании Biacore проводили с использованием оптического биосенсора Biacore 2000 или Biacore 3000 (BiacoreAB). Все эксперименты проводили в буфере BRB (PBS, pH 7,4, с добавлением 3 мМ ЭДТА и 0,005% Tween 20) с добавлением или без добавления 0,1% BSA при 25°C.

Биосенсорную поверхность Biacore готовили, связывая фрагменты специфических козьих антител против IgG Fcy человека с карбоксиметилированным декстраном на поверхности чипа CM-5 Biacore в соответствии с инструкциями производителя по химии аминного связывания. Буфер соединения представлял собой 10 мМ ацетата натрия, pH 4,5. В среднем в каждой из четырех проточных ячеек иммобилизовали 6000 единиц ответа (RU) антител. MAb к ST2L захватывались (приблизительно 33 RU) на поверхность сенсорного чипа, измененного антителами против Fcy человека. После захвата mAb к ST2L делали инъекцию huST2L ECD в растворе (от 0,2 до 15 нМ в 3-кратных разведениях) или ST2L ECD яванского макака в растворе (от 0,2 до 15 нМ или 0,020-5 нМ в 3-кратных разведениях). За ассоциацией наблюдали в течение 4 или 8 мин (делали инъекцию 200 мкл со скоростью 50 или 20 мкл/мин для C2521 и C2519). За диссоциацией наблюдали в течение 10 мин или до 2,5 ч. Регенерации сенсорной поверхности добивались путем инъекции 50 мМ NaOH и/или инъекции 100 мМ H3PO4.

Данные обрабатывали с использованием программного обеспечения Scrubber, версия 1.1g (BioLogic Software). Выполняли двойное вычитание эталона из данных путем вычитания кривых, сгенерированных путем инъекции буфера, из кривых, полученных после вычитания кривой эталона из кривых инъекций аналита, для поправки на вклад в сигнал буфера и шума инструмента (Myszka, Journal of Mol Recogn 12:279-84, 1999 г.).

После обработки данных полученные результаты определения кинетики и аффинности анализировали с помощью программного обеспечения Scrubber или программного обеспечения BIAevaluation, версия 4.0.1 (Biacore, AB). Данные кинетики анализировали с использованием простой модели связывания 1:1, включая элемент, учитывающий перенос массы.

Измерение аффинности mAb (C1999/CNTO3914) к мышиному белку ST2L ECD

MAb к ST2L (C1999/CNTO3914) и экстраклеточный домен мышиного ST2L (muST2L-ECD) экспрессировали и очищали стандартными способами. Антитела, специфичные к фрагменту IgG Fcy мышей, приобрели в Jackson ImmunoResearch laboratories (г. Вест Гроув, штат Пенсильвания). Сенсорные чипы и реагенты для подготовки поверхности захвата приобрели в Biacore (GE healthcare, г. Пискатауэй, штат Нью-Джерси). В эксперименте использовали рабочий буфер Biacore running buffer (BRB), содержащий PBS pH 7,4 с 0,005% Tween 20 и 0,1 мг/мл BSA, данные регистрировали при 25°C.

Взаимодействие антител к ST2L с белком muST2L-ECD исследовали на приборе Biacore2000 при 25°C. Биосенсорную поверхность готовили, связывая антитела, специфичные к мышиному Fcy, с поверхностью сенсорного чипа CM4, в соответствии с инструкциями производителя, относящимся к химии аминного связывания. Антитела C1999/CNTO3914 и muST2L-ECD разводили в буфере BRB. С1999 связывали, используя антитела к мышиному Fcy (приблизительно 85 RU). После связывания делали инъекцию muST2L ECD (остатки 28-326 последовательности SEQ ID NO: 5) в растворе (начиная с 15 нМ, 5 концентраций, 3-кратное последовательное разведение). За ассоциацией наблюдали в течение 8 мин. За диссоциацией наблюдали до 6000 с. Регенерацию выполняли с помощью разведенной 1/100 фосфорной кислоты. Данные аппроксимировали в модели связывания 1:1.

Анализ на линии человеческих базофильных клеток (анализ высвобождения цитокинов базофильными клетками)

Клетки KU812 (линия человеческих базофильных клеток; ATCC, CRL-2099) высевали на стерильные 96-луночные культуральные планшеты с U-образным дном по 25000 или 50000 клеток на лунку, всего в общий объем 40 мкл питательной среды RPMI 1640 (Invitrogen) с добавлением 10% FBS и пенициллина/стрептомицина. Добавляли в различных концентрациях mAb против ST2L человека и контрольные

- 22 031047 образцы (50 мкл/лунку) и культивировали при 37°C. Через 1 ч культивирования добавляли рекомбинантный зрелый IL-33 (аминокислоты 111-270 последовательности SEQ ID NO: 3) с конечной концентрацией 10 нг/мл в 10 мкл питательной среды RPMI. Затем клетки культивировали при 37°C в течение 18-24 ч, чтобы обеспечить IL-33-опосредуемую индукцию IL-5 и IL-6. После культивирования выбирали клетки, а надосадочную жидкость собирали для последующей детекции индуцированной IL-33 высвобождения IL-5 и IL-6 с помощью ИФА (R&D systems) или мультиплексных анализов с микроносителями (Millipore).

Анализ высвобождения цитокинов человеческими мастоцитами и анализ высвобождения pgd₂

Мастоциты получали из CD34+ клеток пуповинной крови человека (Lonza). Флаконы с замороженными клетками пуповинной крови >1,0х10⁶ CD34+ быстро оттаивали и переносили в коническую пробирку на 50 мл. К клеткам медленно добавляли капли подогретой или имеющей комнатную температуру среды Stem-Pro 34+добавки (всего 25 мл; Invitrogen). Клетки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 минут и ресуспендировали в среде (10 мл среды StemPro-34 со следующими добавками: 30 нг/мл IL-3, 100 нг/мл IL-6 и 100 нг/мл SCF). Клетки высевали в 2 лунки 6-луночного планшета и культивировали в течение 1 недели. На 4-е сутки клетки пересевали 1:3 в содержащую добавки среду Stem Pro-34. На 7-е сутки неприкрепленные клетки извлекали и высевали 0,5х10⁶/мл в среду StemPro-34, содержащую 10 нг/мл IL-6 и 100 нг/мл SCF. Клетки пересевали еженедельно, поддерживая плотность 0,5х10⁶/мл, до тех пор, пока через 6-10 недель не созрели мастоциты (оценивали по экспрессии FceR1, cKit и триптазы).

Зрелые мастоциты культивировали в концентрации 0,5х10⁶/мл в среде StemPro-34 и стимулировали ежедневно в течение 4 суток IL-4 (10 нг/мл; Peprotech), IL-6 (10 нг/мл; R&D Systems) и SCF (100 нг/мл; Invitrogen). Перед анализом клетки собирали, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин и ресуспендировали в свежей среде StemPro-34 или RPMI, содержащей 10% FCS без антибиотиков, с 100 нг/мл человеческого рекомбинантного SCF. Клетки высевали с плотностью 65000-75000 клеток/0,16 мл/лунку в плоскодонный обработанный для культивирования клеток 96-луночный планшет. MAb к ST2L добавляли на планшет в конечной концентрации 50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0,016, 0,0032 мкг/мл на 30 минут перед добавлением IL-33. Рекомбинантный человеческий зрелый IL-33 (остатки 111-270 последовательности SEQ ID NO: 3) также готовили в виде 10-кратного раствора (10 или 30 нг/мл) в среде+100 нг/мл SCF. 20 мкл 10Х IL-33 добавляли в лунки, получая конечную концентрацию 1 (фиг. 6 и 7A-7E) или 3 нг/мл (фиг. 8A-8E), и планшеты культивировали в течение ночи при 37°C, 5% CO₂. Надосадочную жидкость культуры собирали через 18-24 ч после стимуляции. Планшеты центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость извлекали, наносили на 96-луночный планшет с Uобразным дном и хранили при -20°C до анализа. Для анализа уровня цитокинов с использованием технологии Luminex™ применяли наборы реактивов для определения человеческих цитокинов от Millipore. Уровни простагландина PGD2 измеряли с использованием набора Prostaglandin D2-MOX EIA от Cayman Chemical Company в соответствии с инструкциями производителя. Для повышения чувствительности ИФА-анализа PGD2 в надосадочных жидкостях культур мастоцитов превращали в неразлагаемую форму MOX-PGD₂ (метоксилзамин-PGD₂) путем обработки метоксиламином гидрохлоридом (MOX-HCl).

Анализ ингибирования связывания лиганда с рецептором у мышей (RLB-анализ на мышах)

На прозрачный 96-луночный планшет (VWR) наносили 50 мкл 2 мкг/мл козьих антител против фрагмента IgG Fcy человека (Jackson Immunoresearch), приблизительно на 16 ч при 4°C. Оставшиеся стадии выполняли при комнатной температуре. Лунки культивировали с блокирующим буфером, промывали и добавляли 50 мкл 2 мкг/мл мышиного белка ST2L-ECD, слитого с человеческим Fcy на 1 ч. Планшет промывали и добавляли 1 мкг/мл биотинилированного мышиного белка mIL-33 с добавлением или без добавления антител к мышиному белку mST2L. Планшет промывали и проводили детекцию комплексом стрептавидин-пероксидаза хрена (Jackson Immune Research) с формированием сигнала в субстрате ТМВ (RDI Division of Fitzgerald Industries) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ по мышиным и человеческим репортерным генам (мышиный или человеческий RGA-анализ)

Клетки HEK293 высевали в количестве 50000 клеток на лунку в белые 96-луночные планшеты с прозрачным дном, обработанные для культивирования тканей (NUNC) в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, 10% FBS, и культивировали в инкубаторе с увлажнением при 37°C, 5% CO₂ в течение 24 ч. Затем выполняли сотрансфицирование векторами, кодирующим кДНК человеческого или мышиного белка ST2L-ECD и NF-кВ-люциферазу (Stratagene, Agilent Technologies, г. Санта-Клара, штат Калифорния) с использованием Lipofectamine™ 2000 в среде Opti-MEM (Invitrogen) с применением стандартных протоколов. После 24-часового культивирования при 37°C, 5% CO₂, трансфицированные клетки обрабатывали мышиным (R&D Systems, остатки 109-266 последовательности SEQ ID NO: 5) или человеческим IL-33 (остатки 112-270 из SEQ ID NO: 3) с добавлением или без добавления антител к ST2L в течение 16 ч при 37°C, 5% CO₂. Люциферазную активность измеряли с использованием реагента SteadyGlo® (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.

- 23 031047

Анализ пролиферации Т-клеток у мышей

Мышиные клетки Th2 (D10.G4.1, ATCC) культивировали в полной питательной среде: RPMI 1640 с 2 мМ L-глутамина с корректированным содержанием бикарбоната натрия 1,5 г/л, 4,5 г/л глюкозы, 10 мМ HEPES и 1,0 мМ пирувата натрия, а также с добавлением следующих реагентов: 0,05 мМ 2меркаптоэтанола, 10 пг/мл IL-1a (R&D Systems), 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 10% крысиного фактора T-STIM с Con А (культуральная добавка крысиного IL-2, Becton Dickinson). Клетки двукратно промывали средой для проведения анализа (RPMI, 10% FBS, без IL-1, без T-STIM), ресуспендировали в концентрации 1,25х10⁵ клеток на мл и высевали в 80 мкл среды на белые 96-луночные планшеты с прозрачным дном, обработанные для тканевых культур (NUNC, г. Рочестер, штат Нью-Йорк). К клеткам добавляли различные количества мышиного IL-33 (остатки 109-266 последовательности SEQ ID NO: 5), конечный объем 100 мкл. При испытании нейтрализации антителами к клеткам добавляли контрольные антитела (введенные в среду, в которой культивировали гибридомные клетки) или надосадочные жидкости гибридомных клеток и культивировали в течение 1 ч с последующим добавлением 20 пг/мл mIL-33. Планшеты культивировали в течение 24 ч в инкубаторе с увлажнением при 37°C, 5% CO₂. Количественную проверку жизнеспособных клеток проводили реагентами CellTiter-Glo® (Promega, г. Мэдисон, штат Висконсин); протокол проводили в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ на мастоцитах костномозгового происхождения

Мышиные мастоциты получали из костного мозга мышей Balb/c (6 недель). Клетки высевали в количестве 300000 клеток на лунку в среде RPMI (без эндотоксина), 10% FBS, 10% среды, кондиционированной клетками WEHI, 10 нг/мл IL-3 (Peprotech), 0,1 мМ незаменимых аминокислот, 1% пенициллина/стрептомицина (Invitrogen). MAb к ST2L (100, 10, 1, 0,1 или 0,01 мкг/мл) культивировали с клетками в течение 1 ч, после чего добавляли зрелый мышиный IL-33 (остатки 109-266 последовательности SEQ ID NO: 215 (10 нг/мл; R&D Systems)). Приблизительно через 24 ч собирали надосадочные жидкости и замораживали до проведения анализа с использованием набора реактивов Millipore Mouse 22-plex для Luminex™ в соответствии с инструкциями производителя. Анализ на клетках эндотелия яванского макака Аортальные эндотелиальные клетки яванского макака, культивируемые в питательной среде для эндотелиальных клеток EGM®-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 (Lonza), высевали на культуральные 96луночные планшеты в количестве 10000 или 20000 клеток на лунку. Добавляли 50 мкл антител к ST2L, начиная от концентрации 100 мкг/мл с последовательными 4- или 5-кратными разведениями, и культивировали при 37°C в течение 1 ч, после чего добавляли зрелый рекомбинантный IL-33 яванского макака (SEQ ID NO: 4). Затем к клеткам добавляли 50 мкл 20 нг/мл IL-33 яванского макака и культивировали при 37°C в течение 24 ч. Для анализа индуцированных IL-33 цитокиновых ответов выбирали надосадочные жидкости и анализировали уровень цитокинов с использованием комплекта реактивов Non-Human Primate IL-8 для Luminex™ (Millipore) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ перитонеального лаважа у мышей

Брюшные полости 6 мышей Balb/c промывали PBS полным объемом 3 мл для сбора перитонеальных клеток. Большинство данных клеток, судя по экспрессии B220 и F4/80 (FACS-анализ), оказались лимфоцитами и макрофагами. Приблизительно 1% составили мастоциты cKit⁺ (CD117⁺). Клетки центрифугировали и осадок ресуспендировали до концентрации 1х10⁶ клеток/мл в среде Alpha MEM+10% FBS+100 МЕ/мл пенициллина+100 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen). Клетки высевали в объеме 200 мкл на лунку на 96-луночный планшет и оставляли на 2 ч при 37°C. К клеткам добавляли mAb к ST2L, а через 30 минут добавляли 10 нг/мл зрелого мышиного IL-33 (R&D Systems; остатки 109-266 последовательности SEQ ID NO: 215). Надосадочные жидкости собирали через 24 ч после добавления IL-33, хранили при -20°C до проведения анализа и анализировали с использованием набора реактивов Millipore Mouse 22-plex для Luminex™ в соответствии с инструкциями производителя.

Пример 1. Получение крысиных антител к мышиному ST2L

Крыс внутрибрюшинно иммунизировали мышиным ST2-Fcy (R&D Systems (Ser27-Ser342 последовательности SEQ ID NO: 5)) и анализировали титры специфичных IgG. После получения достаточных титров выделяли спленоциты и сливали их с клетками FO. Полученные гибридомы высевали на 96луночные планшеты или на метилцеллюлозу и культивировали в течение 10 суток. Антигенспецифические клоны выявляли стандартным методом ИФА с захватом для связывания с mST2-Fc и проводили перекрестный скрининг с одним белком Fc. Гибридомы, специфичные к ST2, затем испытывали на ингибирование связывания IL-33 с ST2 методом ИФА и на ингибирование индуцированной IL-33 пролиферации мышиных Th2-клеток D10.G4.1. Гибридомы, проявившие нейтрализацию в обоих анализах, как при связывании лиганда с рецептором, так и при клеточной пролиферации, клонально выбирали путем предельного разведения. V-участки в гибридоме секвенировали и клонировали на основе мышиного IgG1. Специфичность к домену ST2L-ECD определяли стандартным иммуносорбентным анализом с электрохемилюминесцентной детекцией, используя различные конструкты с заменами доменов человекмышь.

Антитело, секретированное гибридомой С1999, было клонировано на основе мышиного IgG1 и получило наименование CNTO3914. Последовательности вариабельных и гипервариабельных участков

- 24 031047

CNTO3914 показаны в табл. 2. CNTO3914 не дает перекрестной реакции с человеческим ST2L и связывается с доменом I мышиного ST2L-ECD.

Таблица 2

	HCDR1	HCDR2	HCDR3
Название mAb	Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:
С1999/ CNT03914	HYGMA	13	SIITDGTSTYY RDSVKG	14	QSDDYFDY	15

	LCDR1	LCDR2	LCDR3
mAb Название	Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:
С1999/ CNT03914	KSSQSLEYSD GDSYLE	16	GVSNRFS	17	FQATHDPFT	18

Название mAb	Последовательность VH	SEQ ID NO:
Cl999/CNT03914	EVQLVESGGGLLQPGRSLKLSCTASGFIFSHYGMA WVRQAPTKGLEWVSSIITDGTSTYYRDSVKGRFTI SRDNAKNTQYLQMDSLRSEDTATYYCARQSDDYFDY WGQGVMVTVSS	19

Последовательность VL	SEQ ID NO:
DWLTQTPVSLSVTLGDQASISCKSSQSLEYSDGDSYL EWYLQKPGQSPQLLIYGVSNRFSGVPDRFIGSGSGTDF TLKISRVEPEDLGVYYCFQATHDPFTFGSGTKLEIK	20

Пример 2. Получение мышиных антител против ST2L человека

Для получения мышиных mAb против ST2 человека использовали две различные иммунизации.

BALB/c внутрибрюшинно иммунизировали растворимым белком ST2-Fc (R&D Systems, SEQ ID NO: 157) и анализировали титры специфичных IgG. После получения достаточных титров выделяли спленоциты и сливали их с клетками FO. Полученные гибридомы высевали на 96-луночные планшеты и культивировали в течение 10 суток. Антиген-специфичные клоны идентифицировали стандартным методом ИФА с захватом при связывании с человеческим белком huST2L-ECD с C-концевой меткой His₆ и при перекрестной реактивности с меченным His₆ ST2L-ECD яванского макака. Гибридомы, специфичные к человеческому ST2L, обладающие перекрестной реактивностью с ST2L яванского макака, затем испытывали на ингибирование связывания IL-33 с huST2L в тесте ИФА, и на ингибирование активации NF-кВ В анализе по репортерному гену. Для дальнейших исследований выбирали клоны, проявляющие ингибирование в анализе по репортерному гену или в обоих анализах, как в ИФА, так и в анализе по репортерному гену.

Для дальнейших анализов отобрали гибридомы C2494, C2519A и C2521A. Гибридомы C2519A и C2521A проявляли связывание с человеческим ST2L в домене III, а гибридома C2494 проявляла связывание с человеческим ST2L в домене I. Антитело C2494 клонировали на основе IgG2, и полноразмерное антитело получило наименование STLM62.

MAb против ST2L человека создавали в компании Genovac Gmbh с применением патентованной технологии ДНК-иммунизации, с использованием полноразмерных ST2L-конструктов и бустерной иммунизации клетками, трансфицированными для экспрессии человеческого ST2L-ECD. Проводили скрининг гибридом на связывание с человеческим ST2L-ECD методом проточной цитометрии. Для клонов, проявивших связывание в данном анализе, было подтверждено связывание с hST2L-ECD, и проведена дополнительная характеризация на связывание с ST2L-ECD яванского макака стандартным методом ИФА с захватом. Выбранные клоны охарактеризовали по ингибированию связывания лиганда с рецептором методами ИФА и анализом по репортерному гену. Для дальнейших исследований выбирали клоны, проявляющие ингибирование в анализе по репортерному гену или в обоих анализах, как в ИФА, так и в анализе по репортерному гену.

Для дальнейшего анализа отобрали антитело из полученной Genovac гибридомы C2244, которое было клонировано на основе человеческого IgG2. Полноразмерное антитело получило наименование STLM15. STLM15 связывается с человеческим ST2L в домене I.

Последовательности доменов VH, VL и CDR мышиных античеловеческих антител представлены в табл.3.

- 25 031047

Таблица 3

Название mAb	HCDR1	HCDR2	HCDR3
Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:
C2519A	DYNMN	21	NINPYYGSTT YNQKFKG	25	EGDTYLAWFAY	29
C2521A	TYWMN	22	QIFPASGSTYY NEMFKD	26	SENIYYINFQY YFAY	30
C2244/STLM15	SDYAWN	23	FISYSGDTSFN PSLKS	27	YDGYSFDY	31
C2494/STLM62	DDYMH	24	RIDPAIGNTEY APKFQD	28	GDFYAMDY	32

Название mAb	LCDR1	LCDR2	LCDR3
Последова тельность	SEQ ID NO:	Последова тельность	SEQ ID NO:	Последова тельность	SEQ ID NO:
C2519A	RSSQSIVYSN GNTYLE	33	KVSNRFS	37	FQGSHVPPT	41
C2521A	RASQNIGTRMH	34	YASES IS	38	QQSNTWPFT	42
C2244/STLM15	RASKSVSTSGS SYMF	35	LASNLES	39	QHSREIPYT	43
C2494/STLM62	ITNTDIDDVIH	36	EGNTLRP	40	LQSDNMLT	44

mAb	Последовательность VH	SEQ ID NO:
C2519A	E FQLQQS GPELVKPGASVKIS CKASGYS FTDYNMNWVKQ SHGKSLEWIGNINPYYGSTTYNQKFKGKATLTVDKSSNTA YMHLNSLTSEDSAVYYCAREGDTYLAWFAYWGQGTLVTVSA	45
C2521A	QIQLQQSGPELVRPGTSVKISCKASGYTFLTYWMNWVKQRP GQGLEWIGQIFPAS GS T YYNEMFKDKAT L TVD T S S S TAYMQ LSSLTSEDTAVYFCARSENIYYINFQYYFAYWGQGTTLTVSS	46
C2244/STLM15	EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSDYAWNWIRQFP GSKLEWMGFISYSGDTSFNPSLKSRISVTRDTSKNQFFLQLNS VTTEDTATYYCASYDGYSFDYWGQGTTLTVSS	47
C2494/STLM62	EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASAFNIKDDYMHWVKQRPEQ GLEWIGRIDPAIGNTEYAPKFQDKATMTADTSSNTAYLQLSSL TSEDTAVYYCALGDFYAMDYWGQGTSVTVSS	48

mAb	Последовательность VL	SEQ ID NO:
C2519A	DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSNGNTYL EWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDF TLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIK	49
C2521A	ILLTQS PAILSVS PGERVS FS CRAS QNIGTRMHWYQQR TNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLTISS VESEDIADYYCQQSNTWPFTFGSGTKLEIK	50
C2244/STLM15	DIVLTQSPASLAISLGQRATISCRASKSVSTSGSSYMF WYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFT LNIHPVEEEDAAAYYCQHSREIPYTFGGGTKLEIK	51
C2494/STLM62	ETTVTQSPASLSVATGEKVTIRCITNTDIDDVIHWYQQ KPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIE NTLSEDVADYYCLQSDNMLTFGAGTKLELK	52

Пример 3. Получение полностью человеческих антител к ST2L

Связывающиеся с человеческим ST2L Fab-фрагменты выбирали из библиотек новых синтезируемых pIX-фаговых дисплеев, как описано в публикации Shi et al., J. Mol Biol 397:385-96, 2010 г.; междуна

- 26 031047 родной патентной публикации № WO 2009/085462; патентной публикации США № US 2010/0021477). Вкратце, библиотеки получали путем диверсификации человеческих матриксов, при которой гены VH зародышевой линии IGHV1-69*01, IGHV3-23*01 и IGHV5-51*01 рекомбинировали с человеческим минигеном IGHJ-4 посредством петли H3, а человеческие гены VLkappa зародышевой линии O12 (IGKV139*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01) и B3 (IGKV4-1*01) рекомбинировали с минигеном IGKJ1, получая полные домены VH и VL. Для диверсификации выбирали те позиции вариабельных участков легкой и тяжелой цепи вокруг петель H1, H2, L1, L2 и L3, для которых был выявлен частый контакт с белковыми и пептидными антигенами. Диверсификация последовательности в выбранных позициях ограничивалась остатками, появляющимися в каждом из положений в семействах зародышевых генов IGHV или IGLV для соответствующих генов IGHV или IGLV. Диверсификацию петли H3 получали, используя синтетические короткие или средние петли длиной 7-14 аминокислот. Распределение аминокислот в петле H3 выполнили аналогично наблюдаемой вариации аминокислот в человеческих антителах. Создание библиотеки подробно описано Shi et al., J. Mol Biol 397:385-96, 2010 г. Матриксы, использованные для создания библиотек, получали наименования в соответствии с их происхождением от человеческого зародышевого гена VH и VL. Три библиотеки тяжелых цепей скомбинировали с четырьмя зародышевыми легкими цепями или библиотеками зародышевых легких цепей, получив 24 уникальных комбинации VH:VL для сканирования. Все 24 библиотеки комбинаций VH:VL использовали в экспериментах фагового просеивания относительно huST2L-ECD-Fcy.

Библиотеки просеивали при помощи белка Fc, слитого с huST2L-ECD (остатки 19-328 последовательности SEQ ID NO: 1). Просеивание проводили в 2 разных форматах: антиген (Ar) в растворе и Ar в дисплее. В случае Ar в растворе покрытые стрептавидином магнитные микроносители блокировали в PBS при помощи 3% обезжиренного сухого молока. Биотинилированный (Bt) антиген, huST2L-ECD, слитый с Fc (Bt-huST2L-ECD-Fc), и 10-кратно более высокую концентрацию человеческого белка Fc в качестве конкурента смешивали с фаговыми библиотеками Fab-pIX. Фаг Fab-pIX, связавшийся с BthuST2L-ECD-Fc, отлавливали на блокированные и покрытые стрептавидином (SA) магнитные микроносители. Фаговую селекцию выполняли в три цикла, в ходе которых концентрацию huST2L-ECD-Fc варьировали от 100 к 10 нМ и к 10 нМ с 1-го по 3-й цикл соответственно. В случае Ar в дисплее белок BthuST2L-ECD-Fc наносили на покрытые SA магнитные микроносители. Фаговые библиотеки Fab-pIX и 10-кратную концентрацию белка Fc одновременно добавляли к Bt-huST2L-ECD-Fc, экспонированному на покрытых SA магнитных носителях. Концентрации Bt-Ag составляли 100, 10, 10 нМ для циклов с 1-го по 3-й соответственно. Скрининг при обоих форматах просеивания проводили методом ИФА со связыванием Fab-фрагментов с белком huST2L-ECD-Fc. В результате селекции всего было выделено 79 Fabфрагментов, связывающихся с hST2L-Fc. Fab-фрагмент HuT2SU-39 обладал наивысшей связывающей активностью в соответствии с данными ранжирующего ИФА.

Анализ ингибирования связывания IL-33 методом ИФА проводили на 79 Fab-фрагментах. Всего ингибирующей активностью в отношении связывания IL-33 с huST2L-ECD-FcA обладали 32 Fabфрагмента. 46 Fab-фрагментов выбрали для созревания аффинности в процедуре с новыми полученными фагами pIX.

Пример 4. Созревание аффинности полностью человеческих антител к ST2L

Созревание аффинности выбранных антител проводили с использованием оперативного процесса созревания, описанного в публикациях Shi et al., J. Mol Biol 397:385-96, 2010 г. и WO 09085462A1. При данной технологии участки VH клонов Fab-фрагментов, полученные при первой селекции, комбинировали с библиотеками соответствующего матрикса VL. Все гены VH из 46 Fab-фрагментов, идентифицированных в примере 3, были клонированы в окружении соответствующих библиотек созревания VL в виде пулов, соответствующих их исходному семейству генов VL. Использованные библиотеки матриксов VL и схемы их диверсификации представлены в табл. 4. Использовали следующие человеческие матриксы VL: IGKV1-39*01 (012), IGKV3-11 (L6), IGKV3-20 (А27), IGKV4-1*01 (B3), описанные, например, в патентной публикации США № US2012/0108795. Для просеивания при созревании аффинности фаговые библиотеки сначала добавляли к Bt-huST2-ECD-Fc. После культивирования комплекс из созревающего библиотечного фага и Bt-hST2L-ECD-Fc добавляли к покрытым SA магнитным микроносителям. Концентрации Bt-huST2-Fc варьировали в циклах с R1 по R3: 10 нМ, 1 нМ и 0,1 нМ. Конечное промывание цикла 3 проводили в течение ночи при комнатной температуре в присутствии 10 нМ немеченого huST2L-ECD-Fc для дополнительного увеличения аффинности.

- 27 031047

Таблица 4

		Схема диверсификации библиотеки VL для различных матриксов
Петля	Позиция (по Кабат)	А27	ВЗ	L6	012
L1	30	SRNTD	RNDGHSY	SRNAD	SRNAD
30а	SNR	RNDGHWY	-
ЗОе		RNDGHSY	-
31	SNRADH	RNDGHWY	NSKD	SNKDG
32	YFHQSEK	YNWR	YWDFHSAN	YHNDWFSAV
L2	50	ADGS	YWNK	ADKGYFTN	FYTNKADG
L3	91	YSHA	SYWH	RYS GF	SAYHPD
92	YNDSHIFKG	SYGN	RHNSL	FIYHNDKGRE
93	SNTDGHR	STER	NDKR	STHNDRG
94	TYLVFAS	WYSH	WA	TYLVFSRGPI
96	WYFUR	YRWH	WYFUR	LWRFYIN

Всего в ходе просеивания при созревании получили 161 Fab-фрагмент с уникальными последовательностями. Fab-фрагменты, проявившие наилучшее связывание с huST2L-ECD, преобразовывали в IgG для дополнительной характеризации.

Для дополнительной характеризации отобрали mAb ST2M48, ST2M49, ST2M50 и ST2M51, и их последовательности VH, VL и CDR представлены в табл. 5. Mab ST2M48, ST2M49, ST2M50 и ST2M51 связываются с человеческим ST2L в домене III и дают перекрестную реакцию с мышиным ST2L.

Таблица 5

mAb ID	HC ID	HCDR1	HCDR2	HCDR3
Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:
ST2M48	STLH125	TSYWIG	53	GIIYPGDSY TRYSPSFQG	55	LSGRFDY	57
ST2M49	STLH149	TSYWIG	53	GIIYPGDSY TRYSPSFQG	55	IGGMFDY	58
ST2M50	STLH125	TSYWIG	53	GIIYPGDSY TRYSPSFQG	55	LSGRFDY	57
ST2M51	STLH130	SSYAIS	54	GIIPIFGTA NYAQKFQG	56	DTPQLDY	59

mAb ID	LC ID	LCDR1	LCDR2	LCDR3
Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:
ST2M48	STLL232	RASQSVRDALA	60	FASNRAT	64	QQFNTWPIT	67
ST2M49	STLL216	RASQSVANALA	61	KASNRAT	65	QQYYGWPIT	68
ST2M50	STLL228	RASQSVSNALA	62	FASNRAT	64	QQFFNWPIT	69
ST2M51	TC1L3	RASQSISSYLN	63	YASSLQS	66	QQSYSTPLT	70

Название mAb	Последовательность VH	SEQ ID NO:
ST2M48	EVQLVQ S GAEVKKPGE S LKIS CKGS GY S FT SYWIGW VRQMPGKGLEWMGIIYPGDSYTRYSPSFQGQVTISA DKSIS TAYLQWS S LKAS DTAMYYCARLS GRFDYWGQ GTLVTVSS	71
ST2M49	EVQLVQ S GAEVKKPGE S LKIS CKGS GY S FT SYWIGW VRQMPGKGLEWMGIIYPGDSYTRYSPSFQGQVTISA DKSIS TAYLQWS S LKAS DTAMYYCARIGGMFDYWGQ GTLVTVSS	72
ST2M50	QVQLVQS GAEVKKPGS SVKVS CKASGGT FS SYAISW VRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITA DESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYNFFFDYWGQ GTLVTVSS	71

- 28 031047

ST2M51

QVQLVQS GAEVKKPGSSVKVS CKAS GGT FS SYAISW VRQAPGQGLEWMGGIIРIFGTANYAQKFQGRVTIТА DESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTPQLDYWGQ GTLVTVSS

73

Название mAb	Последовательность VL	SEQ ID NO:
ST2M48	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRDALAWY QQKPGQAPRLLIYFASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQFNTWPITFGQGTKVEIK	74
ST2M49	ЕIVLТQSPATLSLSРGERATLSCRASQSVANALAWY QQKPGQAPRLLIYKASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQYYGWPITFGQGTKVEIK	75
ST2M50	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDWLAWY QQKPGQAPRLLIYKASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQYNRAPWTFGQGTKVEIK	76
ST2M51	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWY QQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK	77

Пример 5. Определение характеристик антител к ST2L

Антитела, полученные в результате различных описанных выше процедур, дополнительно охарактеризовали по их способности блокировать взаимодействие IL-33/ST2L, по их способности ингибировать индуцированную IL-33 сигнализацию, определяемой анализом по репортерному гену NF-кВ, ПО способности антител ингибировать ответы мастоцитов, по аффинности к ST2L, человеческому и яванского макака, и по перекрестной реактивности с мышиным ST2L. Картирование эпитопов проводили с использованием химерных конструктов с заменой человеческих/мышиных доменов ST2L, как описано в разделе Материалы и методы. Результаты экспериментов представлены в табл. 6, 7 и 8. В табл. 7 и 8 знак + обозначает, что антитело блокирует взаимодействие IL-33/ST2L, а знак - обозначает, что оно не блокирует взаимодействие IL-33/ST2L. Эксперименты с CNTO3914 проводили с использованием мышиных клеток и реагентов из-за отсутствия перекрестной реактивности с человеком. При анализе всех остальных антител использовали человеческие клетки и человеческие реагенты.

Охарактеризованные антитела были разделены на те, которые блокировали взаимодействие IL33/ST2L (mAb STLM15, STLM62 и CNTO3914), и те, которые не блокировали взаимодействие IL33/ST2L (mAb C2519, С2521, ST2M48, ST2M49, ST2M50 и ST2M51). Антитела, блокирующие взаимодействие IL-33/ST2L, связываются с доменом I ST2L, тогда как неблокирующие антитела связываются с доменом III ST2L. Испытуемые антитела ингибировали запускаемую ST2L сигнализацию, о чем свидетельствовали данные анализа по репортерному гену NF-кВ и данные об индуцированном IL-33 высвобождении цитокинов в человеческой линии базофильных клеток KU812 или, в случае CNTO3914, данные о пролиферации клеток Th2 у мышей. Антитела, связывающиеся с доменом I ST2L, в большей степени ингибировали ответы человеческих мастоцитов, оцениваемые по секреции цитокинов и хемокинов, по сравнению с антителами к ST2L, связывающимися с доменом III ST2L. Антитела CNTO3914, связывающиеся с доменом I мышиного ST2L и не дающие перекрестной реакции с человеческим белком, также были способны ингибировать индуцированные IL-33 ответы мастоцитов мышей.

Таблица 6

mAb	Соответствующая гибридома	Аффинность к человеческому ST2L	Аффинность к ST2L яванского макака
касс	кдиСС (S-¹)	K_D(рМ)	касс (NBs-¹)	кдиСС (s'¹)	KD (рМ)
STLM15	C2244	1Д2Е+06	4,25Е-05	42	4,81Е+06	5, ЗОЕ-05	11
STLM62	C2494	4,26Е+06	1Д9Е-04	28	4,51Е+07	5,39Е-04	12
na	C2519	4,83Е+05	8J0E-05	180	7Д4Е+04	3,20Е-03	44800
na	C2521	6Д8Е+05	4,90Е-05	79	4,47Е+05	1,66Е-03	3710
ST2M48	na	1Д2Е+06	7ДЗЕ-05	56	1ДЗЕ+07	2,65Е-03	257
ST2M49	na	1,59Е+06	1,61Е-04	101	4,66Е+07	1,24Е-02	266
ST2M50	na	1Д5Е+06	5Д0Е-05	45	2,01Е+07	2,49Е-03	124
ST2M51	na	1,29Е+06	4,87Е-05	38	4,42Е+07	3,36Е-03	76

- 29 031047

Таблица 7

mAb

Соответствующая гибридома

RLB*

RGA#

Высвобождение цитокина базо-

Высвобождение цитокина

Эпитоп ST2L

				фильными клетками	мастоцитами
STLM15	С2244	+	+	+	+	hDl
STLM62	С2494	+	+	+	+	hDl
	С2519	-	+	+	-	hD3
	С2521	-	+	+	-	hD3
ST2M48	NA	-	+	н/и	-	h/mD3
ST2M49	NA	-	+	н/и	-	h/mD3
ST2M50	NA	-	+	н/и	-	h/mD3
ST2M51	NA	-	+	н/и	-	h/mD3

*Ингибирование связывания лиганда с рецептором # Анализ по репортерному гену hD1 = домен D1 человеческого ST2L mD1 = домен D1 мышиного ST2L hD3 - домен D3 домена ST2L h/mD3 = домены D1 и D2 человеческого и мышиного ST2L н/и = не испытывали

Таблица 8

mAb	Соответствующая гибридома	RLB*	RGA#	Пролиферация Tклеток	Лаваж с перитонеальными клетками	Высвобождение цитокина мастоцитами	Эпитоп ST2L
CNTO3914	C1999	+	+	+	+	+	mDl

* Ингибирование связывания лиганда с рецептором #Анализ по репортерному гену ** Производное от костного мозга

Пример 7.

Связывающееся с доменом I ST2L антитело CNTO3914 ингибирует индуцированную интраназальным введением IL-33 гиперреактивность дыхательных путей (AHR), воспаление дыхательных путей и ответы мастоцитов мышей.

Самкам мышей линии BALB/c вводили четыре последовательных ежедневных интраназальных дозы 2 мкг/мышь зрелого IL-33 (R&D Systems) (остатки 109-266 последовательности SEQ ID NO: 215). Антитела CNTO3914 к мышиному ST2L профилактически вводили подкожно в дозе 20 мг/кг (или 2 мг/кг, или 0,2 мг/кг) за 24 ч до первого интраназального введения IL-33. Контрольные мыши получали изотопический контроль CNTO5516 или PBS за 24 ч до первого интраназального введения IL-33. Гиперреактивность дыхательных путей (AHR) в ответ на повышающиеся дозы метахолина измеряли с использованием принудительных процедур системой Flexivent (Scireq, г. Монреаль, Квебек, Канада). Для измерения гиперреактивности дыхательных путей (AHR) мышей анестезировали введением 100 мг/кг пентобарбитала и 13 мг/кг фенитоина, выполняли трахеостомию и затем подключали к системе FlexiVent. Мышам распылительным методом вводили солевой раствор для регистрации фоновых показаний, после чего вводили две дозы метахолина (10 и 20 мг/мл). Для солевого раствора и каждой из доз метахолина получали значения сопротивления (R) в течение приблизительно 2 мин, используя мгновенное возмущение. Пиковое сопротивление рассчитывали только для значений, для которых коэффициент детерминации (COD) превышал 0,9.

Отдельная группа мышей проходила обработку и анализ для определения ответа клеток в легких. Через двадцать четыре часа после последнего введения изотопического mIL-33 или PBS мышей умерщвляли интраперитонеально введением высокой дозы препарата Sleepaway®. Легкие мышей промывали 0,7 мл охлажденного PBS с 0,1% BSA. Полученные бронхоальвеолярные текучие среды (BAL) центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 мин, а бесклеточные надосадочные жидкости хранили при -80°C до анализа на цитокины/хемокины. Образцы BAL использовали для общих подсчетов с использованием гемацитометра. Для дифференциальных подсчетов в BAL -200 клеток из мазков, полученных в цитоцентрифуге, подсчитывали после окраски красителем Гимза под световым микроскопом.

Собирали бесклеточные надосадочные жидкости, которые хранили при -80°C до использования в анализах белка методом Luminex. Ткани легких извлекали и затем проводили перфузию через правый

- 30 031047 желудочек 5 мл стерильным холодным PBS до достижения адекватной перфузии. Доли легкого помещали в пробирку Fast Prep®, содержащую 1 мл PBS+ингибитор протеаз, и хранили при -80°C для анализа профиля цитокинов/хемокинов. Мультиплексный анализ на цитокины/хемокины проводили в соответствии с инструкциями производителя набора реактивов Murine Millipore 22-plex. Проводили анализ на мышиную протеазу-1 мастоцитов (мМСР-1) в текучей среде BAL методом ИФА (Moredun Scientific).

Гиперреактивность дыхательных путей

Антитело CNTO3914 достоверно ингибировало гиперреактивность дыхательных путей в модели легочного воспаления, индуцированного интраназальным введением IL-33 (фиг. 1). Антитело CNTO3914 вводили подкожно за 24 ч перед четырьмя последовательными ежедневными интраназальными введениями 2 мкг/мышь mIL-33. Пиковое сопротивление дыхательных путей, определяемое при помощи Flexivent, существенно снижалось при использовании 20 мг/кг CNTO3914. Каждый столбик показывает среднее значение ± СПС для группы с числом мышей от трех (CNTO5516, изотопическое контрольное антитело) до шести. Результаты повторяли в двух отдельных исследованиях. Достоверность определяли, используя двухфакторный дисперсионный анализ с пост-тестом Бонферрони, CNTO3914/IL-33 **p<0,05 в сравнении с группой, получавшей CNTO5516/IL-33; и ***p<0,001 в сравнении с группой, получавшей PBS и IL-33.

Воспаление дыхательных путей

Антитело CNTO3914 достоверно ингибировало в использованной модели рекрутинг клеток в бронхоальвеолярный лаваж (BAL) (фиг. 2). Антитело CNTO3914 вводили подкожно за 24 часа перед четырьмя последовательными ежедневными интраназальными введениями 2 мг/мышь mIL-ЗЗ. Количество лейкоцитов в BAL достоверно увеличивалось при введении IL-33 и достоверно ингибировалось при введении CNTO3914 в дозе 20 мг/кг. Каждый столбик показывает среднее значение ± СПС для группы с числом мышей от трех (CNTO5516, изотопическое контрольное антитело) до шести. Результаты повторяли в двух отдельных исследованиях.

Достоверность определяли, используя двухфакторный дисперсионный анализ с пост-тестом Бонферрони, ***p<0,001.

Ответы мастоцитов in vivo

В гранулах мастоцитов содержатся протеазы, включая триптазы и химазы, которые быстро высвобождаются при активации мастоцитов. Мышиная протеаза мастоцитов 1 (мМСР-1) представляет собой β-химазу, высвобождаемую при активации мастоцитов и участвующую в борьбе с паразитарными инфекциями (Knight et al., J. Exp Med 192:1849-56, 2000 г.; Huntley et al., Parasite Immunol 12:85-95, 1990 г.). Измеренный уровень мМСР-1 можно использовать в качестве маркера активации мастоцитов, и было показано, что он индуцируется в модели зависящего от мастоцитов легочного воспаления, вызванного клещами домашней пыли (Yu and Chen, J. Immunol 171:3808-15, 2003 г.). Уровень ММСР-1 в текучей среде BAL, измеренный методом ИФА (Moredun Scientific), был существенно увеличен у мышей, которым вводили IL-33, и ингибировался в зависимости от дозы при введении CNTO3914 (фиг. 3). Достоверность определяли однофакторным дисперсионным анализом с пост-тестом Тьюки, **p<0,01, ***p<0,001, в сравнении с введением IL-33.

Пример 8. Антитела, связывающиеся с доменом I ST2L, ингибируют ответы мастоцитов in vitro

Ответы мастоцитов оценивали по высвобождению хемокинов и цитокинов мышиными и человеческими мастоцитами, а также по высвобождению простагландина D2 в человеческих мастоцитах.

Антитело CNTO3914, связывающееся с доменом I ST2L, ингибировало индуцированное IL-33 высвобождение цитокинов, включая GM-CSF (фиг. 4A), IL-5 (фиг. 4B) и TNFa (фиг. 4C), мышиными мастоцитами костномозгового происхождения.

MAb C2494 (STLM62), связывающееся с доменом I ST2L, ингибировало индуцированное IL-33 высвобождение PGD₂ мастоцитами пуповинной крови человека, вызванное 3 нг/мл IL-33, при концентрации антитела 2, 10 и 50 мкг/мл (фиг. 5).

Антитела C2494 и C2244, связывающиеся с доменом I ST2L, ингибировали индуцированное IL-33 высвобождение цитокинов GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-13 и IL-10 мастоцитами пуповинной крови человека при концентрации антител 50, 10 и 2 мкг/мл (фиг. 6 и 8A-8E). Степень ингибирования зависела от измеренного уровня цитокинов/хемокинов, испытуемого антитела, его концентрации и используемой среды. Рассчитанное среднее процентное (%) ингибирование во всех проведенных анализах составило 50,6100% при концентрации антител 2 мкг/мл и 62-100% при концентрации антител 50 мкг/мл (фиг. 9).

Связывающиеся с доменом III ST2L антитела C2521, C2519, ST2M48, ST2M49, ST2M50 и ST2M51 проявляли умеренный ингибирующий эффект или отсутствие ингибирующего эффекта или стимулировали индуцированное IL-33 высвобождение цитокинов мастоцитами (фиг. 7A-7E и 8A-8E) при концентрациях антител 50 и 10 мкг/мл. Степень ингибирования зависела от измеренного уровня цитокинов/хемокинов, испытуемого антитела и используемой среды. Рассчитанное среднее процентное (%) ингибирование во всех проведенных анализах составило -594,4-31,9% при концентрации антител 2 мкг/мл и -481,5-36% при концентрации антител 50 мкг/мл (фиг. 9). В некоторых анализах антитело ST2M50 ингибировало высвобождение GM-CSF, IL-5, IL-10 и IL-13 при концентрации антитела 10 мкг/мл (фиг. 8A- 31 031047

8E).

Средний % ингибирования рассчитывали по следующей формуле: (1-(концентрация высвобожденного цитокина в присутствии mAb)/(концентрация того же цитокина, высвобожденного в ответ на IL-33 в отсутствие mAb))xl00. Концентрации цитокинов представлены в пг/мл. В некоторых случаях % ингибирования представляет собой отрицательное значение, и это указывает на то, что высвобождение цитокина в присутствии mAb было фактически выше высвобождения в отсутствие mAb. Небольшие вариации эффективности mAb могут проявляться в зависимости от концентраций IL-33, использованных для индукции высвобождения цитокинов в мастоцитах. Аналогично небольшие вариации эффективности mAb могут проявляться в зависимости от использованной при анализе среды (StemPro-34 в сравнении с RPMI/10% FCS). Все испытанные антитела, связывающиеся с доменом I ST2L, ингибировали высвобождение всех измеренных цитокинов и хемокинов, оцениваемое по % ингибирования, по меньшей мере на 50%, в концентрациях 2, 10 или 50 мкг/мл.

Пример 9. Антитела, связывающиеся с доменом I ST2L, ингибировали вызванное интраназальным введением IL-33 ремоделирование ткани дыхательных путей

Мыши линии C57BL/6 получали интраназально 1 мкг/мышь зрелого IL-33 (или PBS) (остатки 109-266 последовательности SEQ ID NO: 215) в 1, 3, 5, 7 и 9-е сутки, и анализ легких проводили на 10 или 20-е сутки. Антитела CNTO3914 к мышиному ST2L или изотопический контроль (CNTO5516) вводили подкожно в дозе 2 мг/кг за 6 ч до первого интраназального введения IL-33. Контрольные мыши получали изотопический контроль CNTO5516 или PBS за 6 ч до первого интраназального введения IL-33. Раздутые легкие фиксировали для гистологического исследования в 10% формалиновом буфере; при окраске использовали красители Н&Е, трихром по Массону и PAS.

Введение IL-33 вызывало умеренную и заметную гипертрофию и гиперплазию бронхиолярного эпителия с гиперплазией бокаловидных клеток и смешением перибронхиальных инфильтратов, главным образом с эозинофилами. У животных, получавших CNTO3914, гипертрофия и гиперплазия бронхиолярного эпителия были неочевидны. Окрашивание трихромом по Массону проводили для определения количества имеющегося коллагена; данное окрашивание выявило гипертрофию бокаловидных клеток у животных, получавших IL-33. У животных, получавших CNTO3914, инфильтраты в альвеолах и перибронхиолярных участках отсутствовали.

Пример 10. Получение полностью человеческих антител к ST2L

Дополнительные Fab-фрагменты, связывающиеся с человеческим ST2L, выбирали из новых полученных дисплейных pIX-фаговых библиотек, по существу как описано в примере 3, за исключением того, что библиотеки просеивали с использованием химерного конструкта HHM-ST2L (SEQ ID NO: 6, табл. 1) с биотинилированным антигеном, связанным с покрытыми стрептавидином магнитными микроносителями. Фаговую библиотеку блокировали PBS-T с 3%-ным обезжиренным сухим молоком. Белокконкурент, химерный белок MHM-ST2L (SEQ ID NO: 7, табл. 1), добавляли в блокирующий раствор для сдвига селекции фагов в сторону Fab-фрагментов, которые могли специфически связываться с человеческими аминокислотными последовательностями домена I ST2L. Селекцию фагов проводили в три цикла с последующим скринингом Fab-фрагментов, связывающихся с белком hST2L-Fc, методом ИФА.

В ходе данной селекции выделили девятнадцать Fab-фрагментов, связывающихся с hST2L-Fc, и провели дополнительный скрининг на связывание с химерными ST2L-конструктами (табл. 1), а также с мышиным белком ST2L и человеческим белком ST2L для картирования домена специфичности и характеризации способности блокировать взаимодействие IL-33/hST2L. Fab-фрагменты ST2F1, ST2F4 и ST2F6 блокировали взаимодействие hIL-33/ST2L и связывались с доменом I ST2L и были переданы на созревание аффинности.

Таблица 9

Fab ID	VH ID	Каркас	HCDR1	HCDR2	HCDR3
Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:	Последовательность	SEQ ID NO:
ST2F6	ST2H41	VH3-23	SYAMS	78	AISGSGGS TYYADSVKG	81	DPWSTEGS FFVLDY	84
ST2F4	ST2H39	VH3-23	SYWMH	79	GISSGGGS TYYADSVKG	82	DGWGTVYF PFDY	85
ST2F1	ST2H35	VH5-51	SYWIG	80	IIYPGDSD TRYSPSFQG	83	DTADFRRW DFDY	86

Fab ID	VL ID	Каркас	LCDR1	LCDR2	LCDR3
Последователь ность	SEQ ID NO:	Последователь ность	SEQ ID NO:	Последователь ность	SEQ ID NO:
ST2F6	ST2L24	Vk-L6	RASQSV DDALA	87	DASNRAT	90	QQFYNWPLT	92

- 32 031047

ST2F4	ST2L23	Vk-L6	RASQSV RDDLA	88	DASNRAT	90	QQYIHAPLT	93
ST2F1	ST2L20	Vk-B3	KSSQSV LYSSNN KNYLA	89	WAS Т RES	91	QQSNTYPFT	94

Пример 11. Созревание аффинности Fab-фрагментов, связывающихся с человеческим ST2L

Созревание аффинности ST2F1, ST2F4 и ST2F6 проводили с помощью оперативного процесса созревания, описанного в публикациях Shi et al., J. Mol Biol 397:385-396, 2010 г., международной патентной публикации № WO 2009/085462 и в примере 4. Библиотеки для созревания аффинности ST2F1, ST2F4 и ST2F6 получили путем диверсификации соответствующих библиотек легких цепей, B3, L6 и L6, соответственно, и комбинирования с библиотеками участков VH Fab-фрагментов. Схемы диверсификации для остатков в легких цепях для библиотек созревания аффинности L6 и B3 представлены в табл. 10. Нумерация позиций представлена в соответствии со схемой Кабат. Для просеивания при созревании аффинности биотинилированный huST2-ECD-Fc улавливали на покрытые стрептавидином (SA) магнитные микроносители в концентрациях 10 нМ в цикле 1, 1 нМ в цикле 2 и 0,1 нМ в цикле 3. Конечное промывание цикла 3 проводили в течение ночи при комнатной температуре в присутствии 10 нМ немеченого huST2LECD-Fc.

Таблица 10

Селекция по библиотекам созревания легких цепей ST2F6 позволила получить фрагменты с улучшенным связыванием (ST2F14, ST2F17, ST2F31 и ST2F41) (фиг. 10 и фиг. 11). Они были исследованы в виде Fab-фрагментов с помощью ProteOn, и было продемонстрировано умеренное улучшение аффинности в диапазоне от 2 нМ до 400 пМ.

Для дополнительного увеличения аффинности ST2F14, ST2F17, ST2F31 и ST2F41 общую тяжелую цепь ST2H41 в ST2F14, ST2F17, ST2F31 и ST2F41 рандомизировали в участках HCDR1 и HCDR2, позиции по Кабат 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 56 и 58, используя схему диверсификации, представленную в табл. 11. Полученную библиотеку тяжелых цепей соединяли с четырьмя легкими цепями с улучшенной аффинностью ST2L32, ST2L35, ST2L49 и ST2L59 и данную библиотеку просеивали и подвергали скринингу, как описано применительно к библиотекам созревания легких цепей. Выделили Fab-фрагменты с повышенным связыванием по сравнению с ST2F14 и конвертировали их в IgG для дополнительной характеризации. Полученные антитела (STLM103, STLM107, STLM108, STLM123, STLM124, STLM206, STLM207, STLM208, STLM209, STLM210, STLM211, STLM212, STLM213, STLM214, STLM215, STLM216, STLM217, STLM218, STLM219, STLM220, STLM221, STLM222) (фиг. 10 и 11) имели каркасы, полученные из VH3-23 или VK-L6. Все антитела связываются с доменом I ST2L и блокируют взаимодействие IL33/ST2L.

Таблица 11

Разработали и экспрессировали дополнительные варианты STLM208 VH ST2L257 для замены мотива DP в начале участка HCDR3. Последовательности вариантов представлены на фиг. 12.

- 33 031047

Пример 11. Адаптация антител C2494 к человеческому каркасу (HFA)

Процесс адаптации к каркасу проводили, как по существу описано в патентной публикации США № US 2009/0118127 и Fransson et al., J. Mol Biol 398:214-231, 2010 г. Вкратце, последовательности тяжелой и легкой цепей сравнивали с человеческими зародышевыми последовательностями (только аллели 01 по данным на 1 октября 2007 г.) с использованием поиска BLAST по базе данных IMGT (Kaas, et al., Nucl. Acids. Res. 32, D208-D210, 2004 г.; Lefranc et al., Nucl. Acid Res., 33, D593-D597, 2005 г.). Из данного набора человеческих зародышевых генов убрали избыточные гены (100% идентичные на уровне аминокислот) и гены с непарными цистеиновыми остатками. Оставшиеся максимально соответствующие, как по каркасным участкам, так и по CDR-участкам, человеческие зародышевые гены выбрали в качестве акцепторных человеческих каркасов. Всего на основе гомологии последовательностей и длины CDR, а также сходства CDR отобрали 9 человеческих зародышевых каркасов VL и 7 человеческих зародышевых каркасов VH. Участки FR-4 выбирали на основе сходства последовательности человеческих зародышевых генов IGHJ/IGJK, JK2 для цепей VL и JH1 для цепей VH (Kaas et al., Nucl. Acid Res. 32, D208-D210, 2004 г.; Lefranc M.-P. et al., Nucl. Acid Res., 33, D593-D597, 2005 г.) с последовательностью C2494. Затем CDR-участки C2494 (подчеркнуты на фиг. 14) перенесли в выбранные акцепторные человеческие каркасы с получением HFA-вариантов, за исключением участка, соответствующего CDR-H1 из VH. Для данного участка комбинацию CDR и HV или более короткого участка HCDR2 (обозначается как Кабат-7, см. патентная публикация США № US2009/0118127) перенесли с антитела, не относящегося к человеческому, на человеческие каркасные участки (FR), поскольку было показано, что остатки HCDR2, выделенные серым цветом на фиг. 14, не вступают в контакт с комплексами антиген-антитело известных структур (Almagro, J. Mol Recognit. 17, 132, 2004 г.). Последовательность зрелого белка C2494 (VL: SEQ ID NO:52; VH: SEQ ID NO: 48) показана на фиг. 14. На данной фигуре подчеркнуты CDR-остатки (по Кабат), под CDR-участками обозначены HV-петли по Чотиа, а остатки, перенесенные на выбранные человеческие каркасы, обозначены под HV-участками (HFA). Остатки в HCDR2, выделенные серым, во всех вариантах не переносили.

Построили трехмерную модель гомологии для Fv-фрагмента антитела C2494 с использованием модуля моделирования антител MOE (CCG, г. Монреаль). Данную модель использовали для оценки подверженности модификациям, в частности, по открытым остаткам метионина и триптофана, потенциальным мотивам N-гликозилирования и деамидирования. В LCDR3-участке, на основе структурной модели Fv, присутствует потенциально открытый остаток Met (M94). Для его удаления был сгенерирован и охарактеризован вариант (STLL280, O12b) с мутацией M94L. Для тяжелой цепи остаток R в мотиве CAR (остатки 92-94 по Чотиа, фиг. 14) непосредственно перед HCDR3-участком может отрицательно повлиять на кластер отрицательно заряженных остатков (остатки D31, D32, D96 и D101a по Чотиа, фиг. 14), что может быть важным для связывания. Был сгенерирован и охарактеризован участок VH с заменой аргинина на лейцин в остатке 94 по Чотиа (CARACAL).

Провели экспрессию mAb, содержащих обозначенные тяжелые и легкие цепи, а также их предшественников C2494, и анализ их связывания с человеческим ST2L. Из полученных HFA-антител mAb с цепями VH, имеющими каркасы тяжелых цепей IGHV1-24*01 (SEQ ID NO: 148) и IGHV1-f*01 (SEQ ID NO: 149) (STLH195 и STLH194), хорошо экспрессировались и связывались с ST2L в комбинации с различными легкими HFA-цепями, имеющими IGKV3-15*01 (L2) (SEQ ID NO: 150), IGKV1-9*01 (L8) (SEQ ID NO: 151), IGKV1-5*01 (L12) (SEQ ID NO: 152), IGKV1-12*01 (L5) (SEQ ID NO: 153), IGKV1-39*01 (O12) (SEQ ID NO: 154), IGKV1-27*01 (A20) (SEQ ID NO: 155) или IGKV1-33*01 (O18) (SEQ ID NO: 156) каркасы (STLL280, STLL278, STLL277, STLL276, STLL275, STLL274, STLL273, STLL272).

Последовательности HFA-вариантов VH и VL представлены в табл. 12. Подчеркнуты перенесенные остатки, а описанные выше дополнительные замены выделены серым цветом. В табл. 13 представлены номера SEQ ID NO, а также уникальные номера pDR (плазмида) и CBIS ID для каждого HFA-варианта VH и VL. Комбинация легких и тяжелых цепей для полученных mAb, выбранных для дополнительной характеризации, представлена в табл. 14.

В табл. 15 представлены человеческие каркасы (общие V- и J-участки), которые использовали при переносе CDR C2494.

- 34 031047

Таблица 12. Адаптированные каркасные участки цепей VL (соединенные с последовательностью JK2).

CDR выделены подчеркиванием.

RVL2494 (исходный) (SEQ ID NO: 52)

Е Т TVTQS PAS LSVATGEKVTIRCITNTDIDDVIHWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRP

GVPSRFSSSGYGTDFVFTIENTLSEDVADYYCLQSDNMLTFGAGTKLELK >VL2494-IGKV1-33*01 018 (SEQ ID NO: 135)

DIQMTQS PS SLSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP

GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK >VL2494-IGKV1-27* 01 A20 (SEQ ID NO: 136)

DIQMTQS PS SLSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKVPKLLIYEGNTLRP

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK >VL2494-IGKVl-39*01O12 (SEQ ID NO: 137)

DIQMTQS PS S LSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK >VL2494-IGKV1-12*01 L5 (SEQ ID NO: 138)

DIQMTQS PS SVSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK >VL2494-IGKV1-5*01 L12 (SEQ ID NO: 139)

DIQMTQS PS TLSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP

GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK >VL2494-IGKV1-9*01 L8 (SEQ ID NO: 140)

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCITNTDIDDVIHWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP

GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK >VL2494-IGKV3-15*01 L2 (SEQ ID NO: 141)

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCITNTDIDDVIHWYQQKPGQAPRLLIYEGNTLRP

GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK >VL2494-IGKVl-39*01 012b (SEQ ID NO: 142)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC ITNTDIDDVIH WYQQKPGKAPKLLIY EGNTLRP

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC LQSDNLLT FGQGTKLEIK

Адаптированные каркасные участки цепей VH, соединенные с JH1 >VH2494(исходный) (SEQ ID NO: 48)

EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASAFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAIGNT

EYAPKFQDKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCALGDFYAMDYWGQGTSVTVSS >VH2494-IGHVl-f*01 (SEQ ID NO: 143)

EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSAFNIKDDYMHWVQQAPGKGLEWMGRIDPAIGNT

EYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGDFYAMDYWGQGTLVTVSS >VH2494-IGHVl-24*01 (SEQ ID NO: 144)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSAFNIKDDYMHWVRQAPGKGLEWMGRIDPAIGNT

EYAPKFQDRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGDFYAMDYWGQGTLVTVSS

Таблица 13

	HFA-вариант	pDR#	CBIS ID	SEQ ID NO:
Цепи VH	>VH2494-IGHV1-24*01	9870	STLH195	144
HFA	>VH2494-IGHV1-f* 01	9871	STLH194	143

Цепи VL HFA	>VL2494-IGKV1-39*01 012b	9865	STLL280	142
>VL2494-IGKV3-15*01 L2	9873	STLL278	141
>VL2494-IGKV1-9*01 L8	9874	STLL277	140
>VL2494-IGKV1-5*01 L12	9875	STLL276	139
>VL2494-IGKV1-12* 01 L5	9876	STLL275	138
>VL2494-IGKV1-39*01 012	9877	STLL274	137
>VL2494-IGKV1-27* 01 A20	9878	STLL273	136
>VL2494-IGKV1-33*01 018	9879	STLL272	135

- 35 031047

Таблица 14

	Цепи VH
Исходные*	>VH2494IGHV124*01	>VH2494IGHV1-P01
Цепи VL	pRD#	pDR4211	pDR9870	pDR9871
Исходные*	pDR4212	STLM126	STLM186	STLM196
>VL2494-IGKV139*01 012b	PDR9865	STLM127	STLM187	STLM197
>VL2494-IGKV315*01 L2	pDR9873	STLM129	STLM189	STLM199
>VL2494-IGKV19*01 L8	pDR9874	STLM130	STLM190	STLM200
>VL2494-IGKV15*01 L12	pDR9875	STLM131	STLM191	STLM201
>VL2494-IGKV112*01 L5	PDR9876	STLM132	STLM192	STLM202
>VL2494-IGKV139*01 012	PDR9877	STLM133	STLM193	STLM203
>VL2494-IGKV127*01 A20	pDR9878	STLM134	STLM194	STLM204
>VL2494-IGKV133*01 018	pDR9879	STLM135	STLM195	STLM205

* Исходные = C2494 VH и VL

Таблица 15

Каркасы, использованные для адаптации к человеческому каркасу (HFA)	Последовательность	SEQ ID NO:
Происхождение V-участка каркаса	Происхождение J-участка каркаса
IGHV1-24*O1	JH1	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGY TLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPE DGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYM ELSSLRSEDTAVYYCATWGQGTLVTVS S	148
IGHVl-f*01	JH1	EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGY TFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPE DGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYM ELSSLRSEDTAVYYCATWGQGTLVTVS S	149
IGKV3-15*01 L2	JK2	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQ SVS SNLAWYQQKPGQAPRLLIYGAS TR ATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSE DFAVYYCQQYNNWPTFGQGTKLEIK	150
IGKV1-9*O1 L8	JK2	DIQLTQS PS FLSASVGDRVTITCRASQ GIS SYLAWYQQKPGKAPKLLIYAAS TL QSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPE DFATYYCQQLNSYPTFGQGTKLEIK	151
IGKV1-5*O1 L12	JK2	DIQMTQS PS TLSASVGDRVTITCRASQ SIS SWLAWYQQKPGKAPKLLIYDAS S L ESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPD DFATYYCQQYNSYSTFGQGTKLEIK	152
IGKV1-12*O1 L5	JK2	DIQMTQS PS SVSASVGDRVTITCRASQ GISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQANSFPTFGQGTKLEIK	153

- 36 031047

IGKV1-39*O1 012	JK2	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ SISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQSYSTPTFGQGTKLEIK	154
IGKV1-27*O1 А2 0	JK2	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ GISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DVATYYCQKYNSAPTFGQGTKLEIK	155
IGKV1-33*O1 018	JK2	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQ DISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNL ETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPE DIATYYCQQYDNLPTFGQGTKLEIK	156

Пример 12. Разработка аланиновых мутантов и мутантов человеческой зародышевой линии для сканирования паратопов

Провели сайт-направленный мутагенез для оценки вклада в связывание индивидуальных остатков CDR, а также некоторых остатков, обладающих потенциальным влиянием на другие характеристики антитела. На основе описанной выше молекулярной модели Fv-остатка C2494 спрогнозировали подгруппу экспонированных в растворитель остатков CDR, которые могут быть вовлечены в связывание с антигеном. Их заменили на аланин и/или соответствующий подобный человеческому остаток, т.е. на соответствующий остаток из максимально близкого зародышевого гена. Замена D101aA (нумерация по Чотиа), (D104A в SEQ ID NO: 48) в участке VH C2494 снижала k _дисс приблизительно в 4 раза, с 1,43х10^-4 на 3,2х10^-5.

Поскольку замена D101aA снижала k _дисс связывания Fab-фрагмента C2494 с ST2L, можно было ожидать, что та же мутация также сможет улучшить скорость диссоциации HFA-вариантов C2494. Таким образом, мутацию D101aA (нумерация по Чотиа) включили в VH STLH194 (>VH2494-IGHV1-f*01, SEQ ID NO: 143) с получением VH STLH201 (SEQ ID NO: 145). STLH201 спарили с 7 легкими цепями STLL280, STLL277, STLL276, STLL275, STLL274, STLL273 и STLL272 (табл. 13 и 14) с получением mAb STLM226, STLM227, STLM228, STLM229, STLM230, STLM231 и STLM232, которые затем охарактеризовали. Следовательно, mAb STLM226, STLM227, STLM228, STLM229, STLM230, STLM231 и STLM232 имеют идентичные последовательности LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 и HCDR2 по сравнению с исходным антителом C2494, а также отличающийся участок HCDR3 (SEQ ID NO: 146, GDFYAMAY). Кроме того, антитело STLM266 VL STLM280 имело уникальный участок LCDR3: LQSDNLLT (SEQ ID NO: 147).

STLH201 (SEQ ID NO: 145):

EVQLVQS GAEVKKPGATVKIS CKVSAFNIKDDYMHWVQQAPGKGLEWMGRIDPAIGNT EYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGDFYAMAYWGQGTLVTVSS.

Включение в HCDR3 замены D101aA (нумерация по Чотиа): SEQ ID NO: 146: GDFYAMAY.

Антитело STLM266 VL STLM280 имело уникальный участок LCDR3: LQSDNLLT (SEQ ID NO: 147).

Пример 13. Определение характеристик антител к ST2L

Антитела, полученные из фаговых дисплеев, гибридом и процессов адаптации к человеческому каркасу, были охарактеризованы в различных анализах, включая связывание с huST2L-ECD, cynoST2LECD, измерения аффинности, связывание с человеческими/мышиными химерами для определения связывания с доменами, анализы ингибирования лиганд-рецепторного взаимодействия, анализы по репортерному гену и анализы на ответы мастоцитов.

Аффинности антител, полученных в процедурах с фаговыми дисплеями, к ST2L, человеческому и яванского макака, а также специфичность связывания с человеческим ST2L представлены в табл. 16. Все антитела в табл. 16 связывались с доменом I человеческого ST2L.

- 37 031047

Таблица 16

	Аффинность человеческого ST2L	Аффинность ST2L яванского макака	Связывание с доменом ST2L-ECD
	касс (МАЦ	кдисс (с ¹)	KD (пмоль)	касс (M-V)	кдисс (с Д	KD (пмоль)
STLM103	3,97Е+06	Ц63Е-04	41	6Д2Е+06	2,02Е-04	31	D1
STLM107	2,90Е+07	ЗД1Е-04	12	1,00Е+08	6,50Е-04	7	D1
STLM108	2,29Е+06	2,22Е-04	97	2,05Е+07	5,98Е-04	29	D1
STLM123	Ц37Е+07	2,08Е-04	15	1,00Е+08	5Д9Е-04	5	D1
STLM124	Ц65Е+07	7,56Е-04	46	8,71Е+07	2,57Е-03	30	D1
STLM206	6,39Е+06	Ц60Е-04	25	9Д0Е+07	5,83Е-04	6	D1
STLM207	8,ЗЗЕ+06	3,95Е-04	48	1,00Е+08	2,07Е-03	21	D1
STLM208	5,97Е+06	6,76Е-05	11	1Д9Е+07	7,02Е-05	5	D1
STLM209	6,59Е+06	Ц70Е-04	26	ЗД9Е+07	ЗД1Е-04	9	D1
STLM210	Ц21Е+07	2,27Е-04	19	5,70Е+07	5,28Е-04	9	D1
STLM211	1J0E+07	4,83Е-04	29	1,00Е+08	1Д9Е-03	14	D1
STLM212	Ц24Е+07	3,98Е-04	32	1ДЗЕ+07	ЗД6Е-04	24	D1
STLM213	7,54Е+06	Ц08Е-04	14	1,64Е+07	1,24Е-04	8	D1
STLM214	9Д6Е+06	2,99Е-04	33	7,20Е+06	2,64Е-04	37	D1
STLM215	6,91Е+06	Ц72Е-04	25	3,54Е+07	3,69Е-04	10	D1
STLM216	9,63Е+06	Ц58Е-04	16	7,89Е+07	2,64Е-04	3	D1
STLM217	7,27Е+06	Ц26Е-04	17	3,81Е+07	1Д8Е-04	4	D1
STLM218	9,89Е+06	2,24Е-04	23	1Д5Е+07	2,65Е-04	18	D1
STLM219	7,54Е+06	2,01Е-04	27	1,07Е+07	2,ЗОЕ-04	22	D1
STLM220	5,80Е+06	9,53Е-05	16	1,60Е+07	1Д0Е-04	9	D1
STLM221	2,73Е+06	9,61Е-05	35	6,04Е+06	1,ЗОЕ-04	22	D1
STLM222	8,22Е+06	3,01Е-04	37	1Д8Е+07	ЗД5Е-04	29	D1
STLM226	2Д6Е+07	1,93Е-03	90	1,00Е+08	3,01Е-02	301	D1
STLM227	2,66Е+07	Ц70Е-03	64	1,00Е+08	2,94Е-02	294	D1
STLM228	2,01Е+07	Ц04Е-03	52	1,00Е+08	Ц55Е-02	155	D1
STLM229	Ц29Е+07	4Д5Е-04	35	1,00Е+08	8,50Е-03	85	D1
STLM230	1Д1Е+07	4,26Е-04	38	5,06Е+07	7, ЗОЕ-ОЗ	144	D1
STLM231	Ц97Е+07	9,1 ЗЕ-04	46	8,27Е+07	1ДЗЕ-02	172	D1
STLM232	1J8E+07	4Д9Е-04	25	1,00Е+08	7,97Е-03	80	D1

Аффинности антител к ST2L, полученных в процедурах HFA, в сравнении с исходными (STLM62, C2494) показаны в табл. 17.

Аффинности анализировали методом ProteOn. Эксперименты проводили при 25°C с использованием буфера ProteOn's PBS-T-E (PBS, 0,005% P20 и 3 мМ ЭДТА) в качестве рабочего буфера. Для проведения экспериментов сенсорный чип GLC подготавливали путем ковалентной иммобилизации козьих антител к человеческому Fc (-5800 RU). Было захвачено 122-146 единиц ответа (RU) mAb. После захвата mAb делали инъекцию ST2L-ECD в диапазоне 0,024-15 нМ (5-кратные разведения) в течение 4 минут (200 мкл со скоростью 50 мкл/мин). За диссоциацией наблюдали в течение 30 мин во всех реакциях. Регенерацию выполняли, используя два 15-секундных введения 10 мМ глицина, pH 1,5. Данные аппроксимировали 1:1 моделью смещения базовой линии.

Для тех образцов, где скорости ассоциации были высокими, для аппроксимации кривой и оценки аффинности использовали модель Ленгмюра с переносом массы. У всех образцов скорость диссоциации была выше, чем у исходного клона и у контрольных mAb. Разница в скорости диссоциации была основным фактором, определяющим более низкую аффинность HFA-вариантов по сравнению с исходным антителом.

- 38 031047

Таблица 17

	Аффинность человеческого ST2L	Аффинность ST2L яванского макака
Образец	касс (M-lc-1)	кдисс (с-1)	Kd (пмоль)	касс (M-lc-1)	кдисс (С“1)	Kd (пмоль)
STLM62*	1,84Е+07	1,59Е-04	8,67	3,84Е+07	4,57Е-04	12,35
STLM187	3,37Е+07	1,59Е-02	473,00	1,00Е+08	1Д0Е-01	1100,00
STLM190	1,00Е+08	5,34Е-02	534,00	1,00Е+08	1,02Е-01	1020,00
STLM191	8,46Е+07	2,47Е-02	292,00	1,00Е+08	6,66Е-02	666,00
STLM192	2Д1Е+07	8,85Е-03	420,00	1,00Е+08	9,99Е-02	999,00
STLM193	4,77Е+07	1,27Е-02	267,00	1,00Е+08	9,32Е-02	932,00
STLM194	1,00Е+08	7,03Е-02	703,00	1,00Е+08	1,90Е-01	1900,00
STLM195	2,49Е+07	6,73Е-03	271,00	1,00Е+08	7Д9Е-02	719,00
STLM197	1,83Е+07	1,62Е-03	88,50	2,97Е+07	6,88Е-03	232,00
STLM199	2Д7Е+07	8,97Е-04	41,40	7,78Е+07	6,57Е-03	84,50
STLM200	2,35Е+07	1,43Е-03	60,80	8,23Е+07	1Д0Е-02	134,00
STLM201	1J6E+07	8,52Е-04	48,40	3,55Е+07	4Д0Е-03	116,00
STLM202	2,24Е+07	1Д9Е-03	52,90	7,75Е+07	1,04Е-02	134,00

STLM203	2,04Е+07	9,67Е-04	47,30	5,88Е+07	6,56Е-03	111,00
STLM204	2,97Е+07	2,41Е-03	81,30	1,00Е+08	2,05Е-02	205,00
STLM205	1J3E+07	6,95Е-04	40,10	4,04Е+07	4,04Е-03	100,00

*STLM62=C2494, исходное антитело

Таблица 18

Происхождение	mAb	RLB IC50, мкг/мл	RGA IC50, мкг/мл	Анализ на клетках эндотелия яванского макака	Высвобождение цитокина базофильными клетками
	STLM103	0,47	1,92	н/и	+
	STLM107	0,44	1,10	н/и	+ +
	STLM108	0,23	2,34	+ +	+ +
	STLM116	0,29	6,71	н/и	+
	STLM123	0,28	1,25	н/и	+ +
	STLM124	0,35	0, 87	+ +	+ +
	STLM206	0,40	0, 67	+ +	+ +
	STLM207	0,36	2,30	н/и	+ +
	STLM208	0,47	0, 61	+ +	+ +
	STLM209	0,32	0, 97	+ +	+ +
Фаговый	STLM210	0,30	2,10	н/и	+ +
STLM211	0,28	2,52	н/и	+ +
дисплей
STLM212	0,33	4,32	н/и	+
	STLM213	0,34	0,49	++	+ +
	STLM214	0,28	2,52	н/и	+ +
	STLM215	0,29	1,30	н/и	+ +
	STLM216	0,30	1,86	н/и	+ +
	STLM217	0,49	1, 69	н/и	+ +
	STLM218	0,42	1,33	н/и	+ +
	STLM219	0,29	3,16	н/и	+ +
	STLM220	0,39	0, 60	н/и	+ +
	STLM221	0,39	2,79	н/и	+
	STLM222	0,25	1,88	н/и	+ +

- 39 031047

	STLM226	0,26	0,25	+ +	+ +
STLM227	0, 17	0,23	+ +	+ +
STLM228	0,20	0,28	+ +	+ +
HFA	STLM229	0,29	0,32	+ +	+ +
STLM230	0,28	0, 15	+ +	+ +
STLM231	0,26	1,10	+	+
STLM232	0,31	0, 15	+ +	+ +
Гибридома С2494	STLM62*	0,70	0, 11	+ +	+ +

++ сильное ингибирование + некоторое ингибирование отсутствие ингибирования н/и не испытывали * испытывали в виде гибридомы

RLB = ингибирование лиганд-рецепторного взаимодействия

RGA = анализ по репортерному гену

Выбранные антитела испытывали в анализах на ответы мастоцитов, при которых измеряли ингибирование вызванного 3 нг/мл IL-33 высвобождения IL-5, IL-13 и IL-8 из мастоцитов пуповинной крови человека, как описано выше, антителами в концентрации 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл или 0,01 мкг/мл в среде RPMI+10% FCS. В данных условиях анализа все испытуемые антитела ингибировали вызванное IL-33 высвобождение цитокинов IL-5, IL-13 и IL-8 приблизительно на 40-100% при использовании концентрации антитела 100 мкг/мл по сравнению с контрольным образцом с индукцией IL-33.

Пример 14. Антитела к ST2L ингибируют расположенные ниже пути передачи сигналов в человеческих базофильных клетках

Антитела к ST2L испытывали на способность ингибировать сигнализацию p38 MAPK в человеческих базофильных клетках.

Цельную кровь собирали в гепаринизированные пробирки и перед проведением анализа доводили до комнатной температуры. По 1 мл аликвоты крови помещали в 50 мл конические пробирки и добавляли либо антитела к ST2L (STLB252), либо изотопический контроль (CNTO 8937), разведенные в PBS, с конечной концентрацией 2, 20 или 200 мкг/мл. Пробирки слегка встряхивали для перемешивания и помещали их в инкубатор при 37^х30 мин с осторожным встряхиванием после 15 мин. Затем кровь окрашивали меченными флуорохромом антителами к антигенам клеточной поверхности (CD123-FITC, CRTH2-PCP-CY5.5 и CD45-APC-C7) и культивировали пробирки при 37°C в течение 15 мин. В каждую пробирку добавляли 1 мл нагретой культуральной среды (RPMI-1640/10% FBS/1% пенициллинстрептомицин), после чего добавляли IL-33, разведенный в подогретой культуральной среде, с конечной концентрацией 10 нг/мл. Образцы культивировали при 37^oCх10 мин, после чего в каждую пробирку добавляли 20 мл предварительно подогретого лизирующего/фиксирующего буфера BD Phosflow Lyse/Fix, чтобы одновременно лизировать эритроциты и зафиксировать образцы. Содержимое пробирок хорошо перемешали, перевернув их 10 раз, и культивировали при 37^oCх10 мин. Образцы промывали 20 мл стерильного PBS комнатной температуры, ресуспендировали в 2 мл пермеабилизирующего/промывочного буфера 1 х BD Perm/Wash Buffer комнатной температуры и культивировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Образцы промыли один раз 2 мл пермеабилизирующего/промывочного буфера BD Perm/Wash и затем ресуспендировали в 400 мкл пермеабилизирующего/промывочного буфера BD Perm/Wash. К образцам добавили меченные PE антитела к внутриклеточному p38-MAPK (vCell Signaling, номер по каталогу 6908S) и образцы культивировали в течение 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. Образцы однократно промыли 5 мл буфера Perm/Wash, после чего ресуспендировали в 100 мкл буфера для FACS и перенесли в круглодонный 96-лучночный планшет. Образцы анализировали с помощью проточного цитометра BD LSRII с применением высокопроизводительной системы (HTS), регистрирующей максимально возможное количество событий для каждого образца. Данные анализировали с использованием программного обеспечения FloJo. Базофильные клетки идентифицировали как CD45+CRTH2+CD123+ и для каждого условия определяли процентную долю позитивных по p38 MAPK базофильных клеток. Прекультивирование цельной крови с mAb к ST2L (STLB252) приводило к дозозависимому ингибированию индуцированного IL-33 фосфорилирования p38-MAPK, тогда как при использовании изотопического контроля эффект не наблюдался (CNTO 8937). Антитело к человеческому ST2L специфически блокировало активацию базофильных клеток рекомбинантным человеческим IL-33 в ситуации с цельной кровью. Результаты демонстрируют, что антитела к ST2L ингибируют сигнализацию, индуцируемую эндогенным IL-33 in vivo.

- 40 031047

Таблица 19

Пример 15. Связывание антител к ST2L с мишенью in vivo

Модель с рекрутингом клеток в BAL через 6 ч после интраназального введения mIL-33 in vivo

Однократную дозу mIL-33 (R&D systems №3626-ML/CF) 1,2 мкг/мышь или PBS вводили самцам мышей линии Balb/c (возраст 6-8 недель, Taconic). Крысиные антитела к мышиному ST2L CNTO 3914 в дозе 2, 0,2, 0,06 или 0,02 мг/кг вводили за 24 ч до первого интраназального введения mIL-33. MAb CNTO 5516 в качестве изотопического контроля (ITC) вводили подкожно в дозе 2 мг/кг. Через 6 ч после введения mIL-33 (или PBS) мышей умерщвляли и собирали кровь для анализа сыворотки. Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) осуществляли путем инъекции двух объемов 0,7 мл PBS/0,1% BSA в легкие и отбора эффлюента. BAL центрифугировали (1200 об/мин, 10 мин) и осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл PBS для общего и дифференциального подсчета клеток с использованием гемацитометра (в цитоцентрифужных препаратах окрашенных по Райту-Гимзе). Измерение CNTO 3914 в мышиной сыворотке

Планшеты MSD SA-STD блокировали путем введения в каждую лунку 50 мкл буфера для анализа на 5 мин. Затем из планшетов путем переворачивания слили буфер и обстучали их на бумажном полотенце. Добавили по 50 мкл на лунку 1,4 мкг/мл биотинилированного рекомбинантного мышиного химерного ST2L/IL1R4/Fc (R&D System) в буфере для анализа и культивировали в течение ночи в холодильнике. В каждую лунку планшетов с таким предварительно нанесенным белком добавили по 150 мкл буфера для анализа без удаления реагента и культивировали в течение 30 мин. Планшеты трижды промыли промывочным буфером на устройстве для промывки планшетов. Планшеты осторожно обстучали на бумажных полотенцах для удаления остатков промывочного буфера. В каждую лунку планшета добавили по 50 мкл образца CNTO 3914. Планшеты культивировали в течение одного часа при мягком покачивании при температуре окружающей среды. Планшеты трижды промыли промывочным буфером на устройстве для промывки планшетов. В каждую лунку планшета добавили по 50 мкл меченных рутением мышиных антител к мышиному IgG1b (BD Biosciences). Планшеты культивировали в течение одного часа при мягком покачивании при температуре окружающей среды. Планшеты трижды промыли промывочным буфером на устройстве для промывки планшетов. В каждую лунку планшета добавили по 150 мкл буфера считывания. После этого планшеты сразу же сканировали на сканере MSD sector imager 6000, определяя уровни люминесценции.

Анализ цельной крови

Кровь разводили 1:4 в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла+1% раствор пенициллина+стрептомицин +/- 10 нг/мл мышиного IL-33 в фильтрующих пробирках Sarstedt. Пробирки культивировали при 37°C в течение ночи, затем измеряли уровни цитокинов и хемокинов в надосадочных жидкостях, используя комплект реактивов Millipore Milliplex Mouse Cytokine/Chemokine Kit в соответствии с инструкциями производителя.

Результаты

Антитела к ST2L определялись в сыворотке мышей через 24 ч после введения 0,2 или 2 мг/кг CNTO 3914 (фиг. 16A).

Интраназальное введение IL-33 приводило к рекрутингу клеток в дыхательные пути через 6 часов (фиг. 16B). Введение mAb к ST2L уменьшало рекрутинг клеток в BAL; минимальная доза антител для регистрации существенного ингибирования рекрутинга клеток в BAL составила 0,2 мг/кг (фиг. 16B). Статистическую достоверность рассчитывали однофакторным дисперсионным анализом.

В цельной крови, стимулированной мышиным IL-33, через 24 ч наблюдали повышенные уровни цитокинов и хемокинов, включая IL-6 (фиг. 16C) и MCP-1 (фиг. 16D). У мышей, получавших 20 мг/кг или 2 мг/кг mAb CNTO 3914 к ST2L, уровни IL-6 и MCP-1 были снижены по сравнению с введением CNTO5516 (изотопические контрольные мышиные антитела IgG1), что указывает на связывание с мишенью. Минимальная доза, ингибирующая рекрутинг клеток в BAL, 2 мг/кг, коррелировала с ингибированием при анализе цельной крови (фиг. 16B).

В совокупности, настоящие данные подтверждают, что mAb к ST2L достигают области своего действия и осуществляют предусмотренный фармакологический эффект (что предполагает связывание с

- 41 031047 мишенью).

Пример 16. Эпитопы антител к ST2L

При селекции антител к ST2L проводили картирование эпитопов и исследования конкуренции.

Анализы конкурентного связывания

Анализы конкурентного связывания проводили с целью оценки связываемых эпитопов у mAb к ST2L различных групп. Белок ST2L-ECD наносили по 5 мкл на лунку (10 мкг/мл) на планшет MSD HighBind (Meso Scale Discovery, г. Гейтерсберг, штат Мэриленд) на 2 ч при комнатной температуре. В каждую лунку добавили по 150 мкл блокирующего буфера 5% MSD Blocker A (Meso Scale Discovery, г. Гейтерсберг, штат Мэриленд) и культивировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды промывали буфером 0,1 M HEPES, pH 7,4, после чего добавляли смесь меченного флуоресцентным красителем MSD (сульфо-метка, NHS-эфир) индивидуального антитела к ST2L с различными конкурентами. Меченое антитело в концентрации 10 или 30 нМ культивировали с увеличивающимися концентрациями антител-конкурентов, от 1 нМ до 2 или до 5 мкМ, а затем добавляли в обозначенные лунки в объеме смеси 25 мкл. После 2 ч культивирования с осторожным встряхиванием при комнатной температуре планшеты трижды промывали буфером 0,1 М HEPES (pH 7,4). Буфер считывания MSD Read Buffer T разбавляли дистиллированной водой (4-кратно), разливали в объеме по 150 мкл/лунку и анализировали с помощью SECTOR Imager 6000.

В конкурентном анализе использовали следующие антитела: связывающиеся с доменом I ST2L нейтрализующие антитела STLM208, STLM213, C2244 (STLM15) и C2494 (STLM62), связывающееся с доменом III ST2L антитело C2539, а также ненейтрализующее антитело C2240 к ST2L, связывающееся с доменом I человеческого ST2L. На фиг. 17A и 17B представлены эксперименты с конкуренцией. На основе эксперимента выявили следующие эпитопные участки (карманы): карман A: mAb C2244, C2494, STLM208 или STLM213; карман B: mAb C2240, карман C: C2539. Было показано, что антитела, блокирующие взаимодействие IL33/ST2L и ингибирующие ответы мастоцитов, относились к одному эпитопному карману и демонстрировали перекрестную конкуренцию друг с другом. Сводная информация по конкуренции представлена в табл. 20.

Таблица 20

Конкурент	Меченое антитело
	С2240	С2539	С2244	С2494
С2240	+	-	-	-
С2539	-	+	-	-
С2244	-	-	+	+
С2494	-	-	+	+
STLM208	-	-	+	+
STLM213	-	-	+	+

Картирование эпитопов: анализ H/D обмена

В случае H/D-обмена процедура, использованная для анализа связанных с антителом пертурбаций, была аналогична описанной ранее (Hamuro, Y., et al., Journal of Biomolecular Techniques, 14:171-182, 2003 г.; Horn, J. R., et al., Biochemistry, 45: 8488-8498, 2006 г.) с некоторыми модификациями. Рекомбинантный ST2-ECD (экспрессированный из ИГ1<293Е с His-меткой на C-конце) (остатки 18-328 последовательности SEQ ID NO: 157) культивировали в растворе на основе дейтерированной воды в течение заданных периодов времени, при этом в белок внедрялся дейтерий, заменяющий атомы водорода. Дейтерированный ST2-ECD зафиксировали в колонке, содержащей иммобилизованные Fab-фрагменты mAb к ST2L C2244, затем промыли водным буфером. Затем белок ST2-ECD элюировали с колонки и после расщепления протеазами определяли местоположение дейтерий-содержащих фрагментов с помощью массспектрометрического анализа.

На фиг. 18 представлена упрощенная карта H/D обмена для человеческого ST2-ECD (растворимый ST2) в комплексе с Fab-фрагментами C2244. Остатки 18-31 белка ST2-ECD последовательности SEQ ID NO: 119 (аминокислотные остатки RCPRQG<PSYTVDW; SEQ ID NO: 210) оказались защищены Fabфрагментами (соответствуют остаткам 35-48 полноразмерного ST2L последовательности SEQ ID NO: 1. Данные указывают на то, что антитело C2244 связывается с эпитопом RCPRQG<PSYTVDW; SEQ ID NO: 210), и антитела, конкурирующие с C2244 (C2494, STLM208 или STLM213), по всей видимости, связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом.

Картирование эпитопов по мутагенезу

Получили несколько мутантных форм ST2L с заменами, соответствующими мышиным аминокислотным остатками в домене I ST2L. Испытуемые антитела не давали перекрестной реакции с мышиным ST2L, следовательно, прогнозировали, что варианты ST2L с нарушенным и/или сниженным связыванием укажут на наличие эпитопных остатков в сайтах проведенных замен в ST2L. Варианты ввели в конструкт HH-ST2L, содержащий остатки 19-205 полноразмерного ST2L последовательности SEQ ID NO: 1, с использованием стандартных способов. Антитела испытывали на связывание с вариантами ST2L методом ИФА или Proteon.

- 42 031047

Метод поверхностного плазмонного резонанса

Исследования связывания проводили с использованием системы матрицы белковых взаимодействий ProteOn XPR36 Protein Interaction Array (Bio-Rad) (Bravman T, et al. Anal Biochem 358:281-288, 2006 г.). Смесь антител к человеческому и мышиному Fc-фрагменту (Jackson ImmunoResearch, номер по каталогу 109-005-098/115-005-071) иммобилизировали на сенсорном чипе GLC методами, относящимися к химии аминного связывания. Затем проводили захват индивидуальных mAb к ST2L путем пропускания (со скоростью 1 мкг/мл) раствора антител в PBS, содержащего 0,5% Nonidet P-40 и 0,5% Na-деоксихолат. Сигнал на поверхностях, покрытых антителами к Fc, достигал -250 резонансных единиц (RU, 1 RU=1 пг белка/мм²), и это подтверждает, что данные антитела специфически связываются с mAb к STL2. После поворота системы текучей среды на 90° в параллельные проточные каналы делали инъекцию ST2L-D1D2 дикого типа или белки-варианты (0,5 мг/мл в PBS, содержащий 0,5% Nonidet P-40 и 0,5% Naдеоксихолат). Все данные анализы проводили при 25°C. ST2L-D Ш2-зависимые сигналы на поверхностях получали путем двойного контроля, вычитая сигнал, наблюдаемый на поверхностях, содержащих одни иммобилизованные антитела, и сигнал, наблюдаемый при инъекции одного растворителя (что позволило внести поправку на сигналы, не зависящие от связывания). Полученные сенсограммы аппроксимировали простейшей моделью взаимодействия 1:1 (аналитическое программное обеспечение ProteOn), получая соответствующие константы скорости ассоциации и диссоциации (k_acc и k _дисс).

На фиг. 19 представлены полученные варианты ST2L и аффинность антител к ST2L ST2B206 и ST2B252 к данным вариантам. Вариант 93NL94 (замена 93TF94^93NL94) снижал аффинность связывания STLM208 и STLB252 приблизительно в 5 раз, от приблизительно 10,8х10^-12 М до приблизительно 49,5х10^-12 М. Отсутствие существенного снижения аффинности связывания подразумевает, что энергия связывания для взаимодействия между антителом и ST2L-D1D2 представляет собой суммарное значение для эпитопного участка (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210) выявленного анализом H/D-обмена, и дополнительного вклада сайта 93NL94. Нумерация остатков соответствует полноразмерному ST2L последовательности SEQ ID NO: 1.

Пример 17. Антитела, связывающиеся с доменом I ST2L, ингибируют ответы первичных человеческих мастоцитов легких in vitro

Способность антител, связывающихся с доменом I ST2L, ингибировать ответы мастоцитов оценивали по высвобождению хемокинов и цитокинов в первичных человеческих мастоцитах легких.

Выделение первичных человеческих мастоцитов легких

Первичные человеческие мастоциты легких выделяли из нормальной ткани некурящего человека, приобретенной в Международном институте новых медицинских технологий (International Institute for the Advancement of Medicine). Клетки из легочной паренхимы и малых дыхательных путей рассеивали путем измельчения, промывки и разложения ткани паренхимы в течение ночи при 37°C ферментами коллагеназой и гиалуронидазой. Клетки собирали, промывали и подвергали процедуре обогащения с использованием набора реагентов CD117 MicroBead Kit (человеческий) производства MACS Miletnyi Biotec для позитивной селекции мастоцитов из популяции. Перед экспериментом мастоциты культивировали в течение 6 недель в среде StemPro-34+200 нг/мл фактора стволовых клеток. Через две недели после выделения клетки подвергали фенотипической характеризации с помощью проточной цитометрии для определения процентной чистоты популяции мастоцитов. В последующих анализах использовали клетки, на 89% представлявшие собой дважды позитивные клетки по CD117 (C-kit или рецептор фактора стволовых клеток) и Fc£RI (высокоаффинный рецептор IgE). Более того, клетки были на 94,2% положительны для ST2L; таким образом, это подтверждает их фенотип мастоцитов.

Анализ высвобождения цитокинов из первичных человеческих мастоцитов легких

Первичные человеческие мастоциты легких, культивированные в среде StemPro-34+200 нг/мл фактора стволовых клеток приблизительно в течение 6 недель, собирали и промывали центрифугированием в среде RPMI (с 10% инактивированной нагреванием FCS). Клетки подсчитывали и высевали в среду RPMI/10% FCS с плотностью 65000 клеток в 96-луночный планшет. MAb, связывающиеся с доменом I ST2L, добавляли к первичным мастоцитам легких и давали возможность связаться в течение 30 мин при 37°C перед стимуляцией IL-33. Клетки стимулировали в течение 24 ч при помощи 3 нг/мл IL-33, чтобы инициировать накопление различных медиаторов в надосадочной жидкости культуры. Надосадочную жидкость культуры собирали и хранили в замороженном состоянии до проведения анализа с использованием набора Milliplex 9-plex.

Связывающееся с доменом I ST2L антитело STLM208 ингибировало индуцированное IL-33 высвобождение GM-CSF (фиг. 20A), IL-5 (фиг. 20B), IL-8 (фиг. 20C) и IL-13 (фиг. 20D) в первичных человеческих мастоцитах легких при концентрации антитела 100, 10 и 1 мкг/мл. Аналогичные результаты были получены на мастоцитах пуповинной крови человека (данные не показаны).

- 43 031047

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Janssen Biotech, Inc.

Duffy, Karen

Fursov, Natalie

Hall, LeRoy

Healey, Catherine

Lamb, Roberta

Luo, Jinquan

Malaviya, Ravi

Naso, Michael

Pratta, Michael

Tornetta, Mark

Wheeler, John

Wu, Sheng-Jiu <120> ST2L антагонисты и способы применения <130> JBI5003WOPCT <140> PCT/US13/38637 <141> 2013-04-29 <150> US 61/640,407 <151> 2012-04-30 <150> US 61/640,238 <151> 2012-04-30 <150> US 13/798,204 <151> 2013-03-13 <150> US 13/798,226 <151> 2013-03-13 <160>215 <170> PatentIn, версия 3.5 <210> 1 <211>556 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>1

Met 1

Gly

Phe

Trp

Ile 5

Leu

Ala

Ile

Leu

Thr 10

Ile

Leu

Met

Tyr

Ser 15

Thr

Ala

Lys

Phe

Ser

Lys

Gln

Ser

Trp

Gly

Leu

Glu

Asn

Glu

Ala

Leu

20

25

30

Ile

Val

Arg

Cys

Pro

Arg

Gln

Gly

Lys

Pro

Ser

Tyr

Thr

Val

Asp

Trp

35

40

45

Tyr

Ser

Gln

Thr

Asn

Lys

Ser

Ile

Pro

Thr

Gln

Glu

Arg

Asn

Arg

50

55

60

Val

Phe

Ala

Ser

Gly

Gln

Leu

Lys

Phe

Leu

Pro

Ala

Val

Ala

- 44 031047

Asp

Ser

Gly

Ile

Tyr 85

Thr

Cys

Ile

Val

Arg 90

Ser

Pro

Thr

Phe

Asn 95

Arg

Thr

Gly

Tyr

Ala

Asn

Val

Thr

Ile

Tyr

Lys

Gln

Ser

Asp

Cys

Asn

100

105

110

Val

Pro

Asp

Tyr

Leu

Met

Tyr

Ser

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Glu

Lys

Asn

115

120

125

Ser

Lys

Ile

Tyr

Cys

Pro

Thr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Asn

Trp

Thr

Ala

Pro

130

135

140

Leu

Glu

Trp

Phe

Lys

Asn

Cys

Gln

Ala

Leu

Gln

Gly

Ser

Arg

Tyr

Arg

145

150

155

160

Ala

His

Lys

Ser

Phe

Leu

Val

Ile

Asp

Asn

Val

Met

Thr

Glu

Asp

Ala

165

170

175

Gly

Asp

Tyr

Thr

Cys

Lys

Phe

Ile

His

Asn

Glu

Asn

Gly

Ala

Asn

Tyr

180

185

190

Ser

Val

Thr

Ala

Thr

Arg

Ser

Phe

Thr

Val

Lys

Asp

Glu

Gln

Gly

Phe

195

200

205

Ser

Leu

Phe

Pro

Val

Ile

Gly

Ala

Pro

Ala

Gln

Asn

Glu

Ile

Lys

Glu

210

215

220

Val

Glu

Ile

Gly

Lys

Asn

Ala

Asn

Leu

Thr

Cys

Ser

Ala

Cys

Phe

Gly

225

230

235

240

Lys

Gly

Thr

Gln

Phe

Leu

Ala

Val

Leu

Trp

Gln

Leu

Asn

Gly

Thr

245

250

255

Lys

Ile

Thr

Asp

Phe

Gly

Glu

Pro

Arg

Ile

Gln

Glu

Gly

Gln

260

265

270

Asn

Gln

Ser

Phe

Ser

Asn

Gly

Leu

Ala

Cys

Leu

Asp

Met

Val

Leu

Arg

275

280

285

Ile

Ala

Asp

Val

Lys

Glu

Asp

Leu

Gln

Tyr

Asp

Cys

Leu

290

295

300

Ala

Leu

Asn

Leu

His

Gly

Leu

Arg

His

Thr

Val

Arg

Leu

Ser

Arg

305

310

315

320

- 45 031047

Lys

Asn

Pro

Ile

Asp 325

His

Ser

Ile

Tyr 330

Cys

Ile

Ala

Val 335

Cys

Ser

Val

Phe

Leu

Met

Leu

Ile

Asn

Val

Leu

Val

Ile

Leu

Lys

Met

340

345

350

Phe

Trp

Ile

Glu

Ala

Thr

Leu

Trp

Arg

Asp

Ile

Ala

Lys

Pro

Tyr

355

360

365

Lys

Thr

Arg

Asn

Asp

Gly

Lys

Leu

Tyr

Asp

Ala

Tyr

Val

Tyr

Pro

370

375

380

Arg

Asn

Tyr

Lys

Ser

Thr

Asp

Gly

Ala

Ser

Arg

Val

Glu

His

Phe

385

390

395

400

Val

His

Gln

Ile

Leu

Pro

Asp

Val

Leu

Glu

Asn

Lys

Cys

Gly

Tyr

Thr

405

410

415

Leu

Cys

Ile

Tyr

Gly

Arg

Asp

Met

Leu

Pro

Gly

Glu

Asp

Val

Thr

420

425

430

Ala

Val

Glu

Thr

Asn

Ile

Arg

Lys

Ser

Arg

His

Ile

Phe

Ile

Leu

435

440

445

Thr

Pro

Gln

Ile

Thr

His

Asn

Lys

Glu

Phe

Ala

Tyr

Glu

Gln

Glu

Val

450

455

460

Ala

Leu

His

Cys

Ala

Leu

Ile

Gln

Asn

Asp

Ala

Lys

Val

Ile

Leu

Ile

465

470

475

480

Glu

Met

Glu

Ala

Leu

Ser

Glu

Leu

Asp

Met

Leu

Gln

Ala

Glu

Ala

Leu

485

490

495

Gln

Asp

Ser

Leu

Gln

His

Leu

Met

Lys

Val

Gln

Gly

Thr

Ile

Lys

Trp

500

505

510

Arg

Glu

Asp

His

Ile

Ala

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Asn

Ser

Lys

Phe

Trp

515

520

525

Lys

His

Val

Arg

Tyr

Gln

Met

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Ile

Pro

Arg

Lys

530

535

540

Ala

Ser

Leu

Thr

Pro

Leu

Ala

Gln

Lys

Gln

545

550

555

<210> 2 <211> 556 <212> PRT

- 46 031047 <213> Macaca fascicularis <400> 2

Met 1

Gly

Leu

Trp

Ile 5

Leu

Ala

Ile

Leu

Thr 10

Ile

Leu

Val

Tyr

Ser 15

Thr

Ala

Lys

Phe

Ser

Lys

Gln

Ser

Trp

Gly

Leu

Glu

Asn

Glu

Ala

Leu

20

25

30

Ile

Val

Arg

Cys

Pro

Arg

Gln

Gly

Lys

Ser

Tyr

Ile

Val

Asp

Trp

35

40

45

Tyr

Ser

Gln

Thr

Asn

Lys

Ser

Ile

Pro

Thr

Gln

Glu

Arg

Asn

Arg

50

55

60

Val

Phe

Ala

Ser

Gly

Gln

Leu

Lys

Phe

Leu

Pro

Ala

Glu

Val

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Gly

Ile

Tyr

Thr

Cys

Ile

Val

Arg

Ser

Pro

Thr

Phe

Asn

Arg

85

90

95

Thr

Gly

Tyr

Ala

Asn

Val

Thr

Ile

Tyr

Lys

Gln

Pro

Asp

Cys

Asn

100

105

110

Val

Pro

Asp

Tyr

Leu

Met

Tyr

Ser

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Glu

Lys

Asn

115

120

125

Ser

Lys

Ile

Tyr

Cys

Pro

Thr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Asn

Trp

Thr

Ala

Pro

130

135

140

Leu

Glu

Trp

Phe

Lys

Asn

Cys

Gln

Ala

Leu

Gln

Gly

Ser

Arg

Tyr

Lys

145

150

155

160

Ala

His

Lys

Ser

Phe

Leu

Val

Ile

Asp

Asn

Val

Met

Thr

Asp

Ala

165

170

175

Gly

Asp

Tyr

Thr

Cys

Lys

Phe

Ile

His

Asn

Glu

Asn

Gly

Ala

Asn

Tyr

180

185

190

Ser

Val

Thr

Ala

Thr

Arg

Ser

Phe

Thr

Val

Lys

Asp

Glu

Gln

Gly

Phe

195

200

205

Ser

Leu

Phe

Pro

Val

Ile

Arg

Ala

Pro

Ala

His

Asn

Glu

Thr

Lys

Glu

210

215

220

Val

Glu

Ile

Gly

Glu

Asn

Thr

Asn

Leu

Thr

Cys

Ser

Ala

Cys

Phe

Gly

225

230

235

240

- 47 031047

Lys

Gly Ala

Gln

Phe 245

Leu

Ala

Thr

Val

Gln 250

Trp

Gln

Leu

Asn

Gly Asn 255

Lys

Ile

Thr

Asp

Phe

Ser

Glu

Pro

Arg

Ile

Gln

Glu

Gly

Gln

260

265

270

Asn

Gln

Ser

Phe

Ser

Asn

Gly

Leu

Ala

Cys

Val

Asn

Thr

Val

Leu

Arg

275

280

285

Ile

Ala

Asp

Val

Lys

Glu

Asp

Leu

Arg

Tyr

Asp

Cys

Leu

290

295

300

Ala

Leu

Asn

Leu

His

Gly

Leu

Arg

His

Thr

Ile

Arg

Leu

Ser

Arg

305

310

315

320

Lys

Asn

Pro

Ile

Asp

His

Gln

Ser

Thr

Tyr

Cys

Ile

Ala

Val

Cys

325

330

335

Ser

Val

Leu

Met

Leu

Ile

Asn

Val

Leu

Val

Ile

Leu

Lys

Thr

340

345

350

Phe

Trp

Ile

Glu

Ala

Thr

Leu

Trp

Arg

Asp

Ile

Ala

Lys

Pro

Tyr

355

360

365

Lys

Thr

Arg

Asn

Asp

Gly

Lys

Leu

Tyr

Asp

Ala

Tyr

Val

Ile

Tyr

Pro

370

375

380

Arg

Asn

Tyr

Thr

Ser

Thr

Asp

Gly

Ala

Ser

Arg

Val

Glu

Tyr

Phe

385

390

395

400

Val

His

Gln

Ile

Leu

Pro

Asp

Val

Leu

Glu

Asn

Lys

Cys

Gly

Tyr

Thr

405

410

415

Leu

Cys

Ile

Tyr

Gly

Arg

Asp

Met

Leu

Pro

Gly

Glu

Asp

Val

Thr

420

425

430

Ala

Val

Glu

Thr

Asn

Ile

Arg

Lys

Ser

Arg

His

Ile

Phe

Ile

Leu

435

440

445

Thr

Pro

Gln

Ile

Thr

His

Asn

Glu

Phe

Ala

Tyr

Glu

Gln

Glu

Val

450

455

460

Ala

Leu

His

Ser

Ala

Leu

Ile

Gln

Asn

Asp

Ser

Lys

Val

Ile

Leu

Ile

465

470

475

480

Glu

Met

Glu

Ala

Leu

Ser

Glu

Leu

Asp

Met

Leu

Gln

Ala

Glu

Ala

Leu

485 490 495

- 48 031047

Gln

Asp

Ser

Leu 500

Arg

His

Leu

Met

Glu 505

Val

Gln

Gly

Thr

Ile 510

Lys

Trp

Arg

Glu

Asp

His

Val

Ala

Asn

Lys

Arg

Ser

Leu

Asn

Ser

Lys

Phe

Trp

515

520

525

Lys

His

Val

Arg

Tyr

Gln

Met

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Met

Pro

Arg

Lys

530

535

540

Ala

Ser

Leu

Thr

Ser

Leu

Ala

Gln

Lys

Gln

545

550

555

<210>

3

<211>

270

<212>

PRT

<213>

Homo

sapiens

<400>

3

Met

Lys

Pro

Lys

Met

Lys

Tyr

Ser

Thr

Asn

Lys

Ile

Ser

Thr

Ala

Lys

1

5

10

15

Trp

Lys

Asn

Thr

Ala

Ser

Lys

Ala

Leu

Cys

Phe

Lys

Leu

Gly

Lys

Ser

20

25

30

Gln

Lys

Ala

Lys

Glu

Val

Cys

Pro

Met

Tyr

Phe

Met

Lys

Leu

Arg

35

40

45

Ser

Gly

Leu

Met

Ile

Lys

Glu

Ala

Cys

Tyr

Phe

Arg

Glu

Thr

50

55

60

Thr

Lys

Arg

Pro

Ser

Leu

Lys

Thr

Gly

Arg

Lys

His

Lys

Arg

His

Leu

65

70

75

80

Val

Leu

Ala

Cys

Gln

Ser

Thr

Val

Glu

Cys

Phe

Ala

Phe

85

90

95

Gly

Ile

Ser

Gly

Val

Gln

Lys

Tyr

Thr

Arg

Ala

Leu

His

Asp

Ser

100

105

110

Ile

Thr

Gly

Ile

Ser

Pro

Ile

Thr

Glu

Tyr

Leu

Ala

Ser

Leu

Ser

Thr

115

120

125

Tyr

Asn

Asp

Gln

Ser

Ile

Thr

Phe

Ala

Leu

Glu

Asp

Glu

Ser

Tyr

Glu

130

135

140

Ile

Tyr

Val

Glu

Asp

Leu

Lys

Asp

Glu

Lys

Asp

Lys

Val

Leu

145 150 155 160

- 49 031047

Leu

Ser

Tyr

Glu 165

Ser

Gln

His

Pro

Ser 170

Asn

Glu

Ser

Gly

Asp 175

Gly

Val

Asp

Gly

Lys

Met

Leu

Met

Val

Thr

Leu

Ser

Pro

Thr

Lys

Asp

Phe

180

185

190

Trp

Leu

His

Ala

Asn

Lys

Glu

His

Ser

Val

Glu

Leu

His

Lys

Cys

195

200

205

Glu

Lys

Pro

Leu

Pro

Asp

Gln

Ala

Phe

Val

Leu

His

Asn

Met

His

210

215

220

Ser

Asn

Cys

Val

Ser

Phe

Glu

Cys

Lys

Thr

Asp

Pro

Gly

Val

Phe

Ile

225

230

235

240

Gly

Val

Lys

Asp

Asn

His

Leu

Ala

Leu

Ile

Lys

Val

Asp

Ser

Glu

245

250

255

Asn

Leu

Cys

Thr

Glu

Asn

Ile

Leu

Phe

Lys

Leu

Ser

Glu

Thr

260 265 270 <210> 4 <211> 269 <212> PRT <213> Macaca fascicularis

<400> 4

Met

Lys

Pro

Lys

Met

Lys

Tyr

Ser

Thr

Asn

Lys

Ile

Ser

Thr

Ala

Lys

1

5

10

15

Arg

Lys

Asn

Thr

Ala

Ser

Lys

Ala

Leu

Cys

Phe

Lys

Leu

Gly

Lys

Ser

20

25

30

Gln

Lys

Ala

Lys

Glu

Val

Cys

His

Val

Tyr

Phe

Met

Lys

Leu

Arg

35

40

45

Ser

Gly

Leu

Met

Ile

Lys

Glu

Ala

Cys

Tyr

Phe

Arg

Glu

Thr

50

55

60

Thr

Lys

Arg

Pro

Ser

Leu

Lys

Thr

Gly

Lys

His

Lys

Gly

His

Leu

65

70

75

80

Val

Leu

Ala

Cys

Gln

Ser

Thr

Val

Glu

Cys

Phe

Ala

Phe

85

90

95

Gly

Ile

Ser

Gly

Val

Pro

Lys

Tyr

Thr

Arg

Ala

Leu

His

Asp

Ser

100

105

110

- 50 031047

Ile

Thr

Gly 115

Ile

Ser

Pro

Ile

Thr 120

Glu

Ser

Leu

Ala

Ser 125

Leu

Ser

Thr

Tyr

Asn

Asp

Gln

Ser

Ile

Thr

Phe

Ala

Leu

Glu

Asp

Glu

Ser

Tyr

Glu

130

135

140

Ile

Tyr

Val

Glu

Asp

Leu

Lys

Asp

Lys

Asp

Lys

Val

Leu

145

150

155

160

Leu

Ser

Tyr

Glu

Ser

Gln

His

Pro

Ser

Glu

Ser

Gly

Asp

Gly

165

170

175

Val

Asp

Gly

Lys

Met

Leu

Met

Val

Thr

Leu

Ser

Pro

Thr

Lys

Asp

Phe

180

185

190

Trp

Leu

Gln

Ala

Asn

Lys

Glu

His

Ser

Val

Glu

Leu

His

Lys

Cys

195

200

205

Glu

Lys

Pro

Leu

Pro

Asp

Gln

Ala

Phe

Val

Leu

His

Asn

Arg

Ser

210

215

220

Phe

Asn

Cys

Val

Ser

Phe

Glu

Cys

Lys

Thr

Asp

Pro

Gly

Val

Phe

Ile

225

230

235

240

Gly

Val

Lys

Asp

Asn

His

Leu

Ala

Leu

Ile

Lys

Val

Asp

Tyr

Ser

Glu

245

250

255

Asn

Leu

Gly

Ser

Glu

Asn

Ile

Leu

Phe

Lys

Leu

Ser

Glu

260 265 <210> 5 <211> 567 <212> PRT <213> Mus musculus

<400>

5

Met

Ile

Asp

Arg

Gln

Arg

Met

Gly

Leu

Trp

Ala

Leu

Ala

Ile

Leu

Thr

1

5

10

15

Leu

Pro

Met

Tyr

Leu

Thr

Val

Thr

Glu

Gly

Ser

Lys

Ser

Trp

Gly

20

25

30

Leu

Glu

Asn

Glu

Ala

Leu

Ile

Val

Arg

Cys

Pro

Gln

Arg

Gly

Arg

Ser

35

40

45

Thr

Tyr

Pro

Val

Glu

Trp

Tyr

Ser

Asp

Thr

Asn

Glu

Ser

Ile

Pro

50

55

60

- 51 031047

Thr 65

Gln Lys

Arg Asn

Arg 70

Ile

Phe

Val

Ser

Arg 75

Asp

Arg

Leu

Lys

Phe 80

Leu

Pro

Ala

Arg

Val

Glu

Asp

Ser

Gly

Ile

Tyr

Ala

Cys

Val

Ile

Arg

85

90

95

Ser

Pro

Asn

Leu

Asn

Lys

Thr

Gly

Tyr

Leu

Asn

Val

Thr

Ile

His

Lys

100

105

110

Lys

Pro

Ser

Cys

Asn

Ile

Pro

Asp

Tyr

Leu

Met

Tyr

Ser

Thr

Val

115

120

125

Arg

Gly

Ser

Asp

Lys

Asn

Phe

Lys

Ile

Thr

Cys

Pro

Thr

Ile

Asp

Leu

130

135

140

Tyr

Asn

Trp

Thr

Ala

Pro

Val

Gln

Trp

Phe

Lys

Asn

Cys

Lys

Ala

Leu

145

150

155

160

Gln

Glu

Pro

Arg

Phe

Arg

Ala

His

Arg

Ser

Tyr

Leu

Phe

Ile

Asp

Asn

165

170

175

Val

Thr

His

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Thr

Cys

Gln

Phe

Thr

His

Ala

180

185

190

Glu

Asn

Gly

Thr

Asn

Tyr

Ile

Val

Thr

Ala

Thr

Arg

Ser

Phe

Thr

Val

195

200

205

Glu

Lys

Gly

Phe

Ser

Met

Phe

Pro

Val

Ile

Thr

Asn

Pro

Tyr

210

215

220

Asn

His

Thr

Met

Glu

Val

Glu

Ile

Gly

Lys

Pro

Ala

Ser

Ile

Ala

Cys

225

230

235

240

Ser

Ala

Cys

Phe

Gly

Lys

Gly

Ser

His

Phe

Leu

Ala

Asp

Val

Leu

Trp

245

250

255

Gln

Ile

Asn

Lys

Thr

Val

Gly

Asn

Phe

Gly

Glu

Ala

Arg

Ile

Gln

260

265

270

Glu

Gly

Arg

Asn

Glu

Ser

Asn

Asp

Met

Asp

Cys

Leu

275

280

285

Thr

Ser

Val

Leu

Arg

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Glu

Lys

Asp

Leu

Ser

Leu

290

295

300

Glu

Tyr

Asp

Cys

Leu

Ala

Leu

Asn

Leu

His

Gly

Met

Ile

Arg

His

Thr

- 52 031047

305

310

315

320

Ile

Arg

Leu

Arg

Arg 325

Lys

Gln

Pro

Ile

Asp 330

His

Arg

Ser

Ile

Tyr 335

Tyr

Ile

Val

Ala

Gly

Cys

Ser

Leu

Met

Phe

Ile

Asn

Val

Leu

Val

340

345

350

Ile

Val

Leu

Lys

Val

Phe

Trp

Ile

Glu

Val

Ala

Leu

Phe

Trp

Arg

Asp

355

360

365

Ile

Val

Thr

Pro

Tyr

Lys

Thr

Arg

Asn

Asp

Gly

Lys

Leu

Tyr

Asp

Ala

370

375

380

Tyr

Ile

Tyr

Pro

Arg

Val

Phe

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Thr

His

385

390

395

400

Ser

Val

Glu

Tyr

Phe

Val

His

Thr

Leu

Pro

Asp

Val

Leu

Glu

Asn

405

410

415

Lys

Cys

Gly

Tyr

Lys

Leu

Cys

Ile

Tyr

Gly

Arg

Asp

Leu

Pro

Gly

420

425

430

Gln

Asp

Ala

Thr

Val

Glu

Ser

Ile

Gln

Asn

Ser

Arg

435

440

445

Gln

Val

Phe

Val

Leu

Ala

Pro

His

Met

His

Ser

Lys

Glu

Phe

Ala

450

455

460

Tyr

Glu

Gln

Glu

Ile

Ala

Leu

His

Ser

Ala

Leu

Ile

Gln

Asn

Ser

465

470

475

480

Lys

Val

Ile

Leu

Ile

Glu

Met

Glu

Pro

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

Arg

Leu

485

490

495

Gln

Val

Gly

Asp

Leu

Gln

Asp

Ser

Leu

Gln

His

Leu

Val

Lys

Ile

Gln

500

505

510

Gly

Thr

Ile

Lys

Trp

Arg

Glu

Asp

His

Val

Ala

Asp

Lys

Gln

Ser

Leu

515

520

525

Ser

Lys

Phe

Trp

Lys

His

Val

Arg

Tyr

Gln

Met

Pro

Val

Pro

Glu

530

535

540

Arg

Ala

Ser

Lys

Thr

Ala

Ser

Val

Ala

Pro

Leu

Ser

Gly

Lys

Ala

545 550 555 560

- 53 031047

Cys Leu Asp Leu Lys His Phe

565 <210> 6 <211> 300 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2L человеческо-мышиная химера HHM <400> 6

Lys 1

Phe

Ser

Lys

Gln 5

Ser

Trp

Gly Leu

Glu 10

Asn

Glu

Ala

Leu

Ile 15

Val

Arg

Cys

Pro

Arg

Gln

Gly

Lys

Pro

Ser

Tyr

Thr

Val

Asp

Trp

Tyr

20

25

30

Ser

Gln

Thr

Asn

Lys

Ser

Ile

Pro

Thr

Gln

Glu

Arg

Asn

Arg

Val

Phe

35

40

45

Ala

Ser

Gly

Gln

Leu

Lys

Phe

Leu

Pro

Ala

Val

Ala

Asp

Ser

50

55

60

Gly

Ile

Tyr

Thr

Cys

Ile

Val

Arg

Ser

Pro

Thr

Phe

Asn

Arg

Thr

Gly

65

70

75

80

Tyr

Ala

Asn

Val

Thr

Ile

Tyr

Lys

Gln

Ser

Asp

Cys

Asn

Val

Pro

85

90

95

Asp

Tyr

Leu

Met

Tyr

Ser

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Glu

Lys

Asn

Ser

Lys

100

105

110

Ile

Tyr

Cys

Pro

Thr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Asn

Trp

Thr

Ala

Pro

Leu

Glu

115

120

125

Trp

Phe

Lys

Asn

Cys

Gln

Ala

Leu

Gln

Gly

Ser

Arg

Tyr

Arg

Ala

His

130

135

140

Lys

Ser

Phe

Leu

Val

Ile

Asp

Asn

Val

Met

Thr

Glu

Asp

Ala

Gly

Asp

145

150

155

160

Tyr

Thr

Cys

Lys

Phe

Ile

His

Asn

Glu

Asn

Gly

Ala

Asn

Tyr

Ser

Val

165

170

175

Thr

Ala

Thr

Arg

Ser

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Gly

Phe

Ser

Met

Phe

180

185

190

Pro

Val

Ile

Thr

Asn

Pro

Tyr

Asn

His

Thr

Met

Glu

Val

Glu

Ile

- 54 031047

195

200

205

Gly

Lys

Pro

Ala

Ser

Ile

Ala

Cys

Ser

Ala

Cys

Phe

Gly

Lys

Gly

Ser

210

215

220

His

Phe

Leu

Ala

Asp

Val

Leu

Trp

Gln

Ile

Asn

Lys

Thr

Val

Gly

225

230

235

240

Asn

Phe

Gly

Glu

Ala

Arg

Ile

Gln

Glu

Gly

Arg

Asn

Glu

Ser

245

250

255

Ser

Asn

Asp

Met

Asp

Cys

Leu

Thr

Ser

Val

Leu

Arg

Ile

Thr

Gly

260

265

270

Val

Thr

Glu

Lys

Asp

Leu

Ser

Leu

Glu

Tyr

Asp

Cys

Leu

Ala

Leu

Asn

275

280

285

Leu

His

Gly

Met

Ile

Arg

His

Thr

Ile

Arg

Leu

Arg

290

295

300

<210> 7 <211> 297 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2L человеческо-мышиная химера MHM <400> 7

Lys 1

Ser

Trp

Gly Leu 5

Glu

Asn Glu

Ala 10

Leu

Ile

Val

Arg

Cys 15

Pro

Gln

Arg

Gly

Arg

Ser

Thr

Tyr

Pro

Val

Glu

Trp

Tyr

Ser

Asp

Thr

20

25

30

Asn

Glu

Ser

Ile

Pro

Thr

Gln

Lys

Arg

Asn

Arg

Ile

Phe

Val

Ser

Arg

35

40

45

Asp

Arg

Leu

Lys

Phe

Leu

Pro

Ala

Arg

Val

Glu

Asp

Ser

Gly

Ile

Tyr

50

55

60

Ala

Cys

Val

Ile

Arg

Ser

Pro

Asn

Leu

Asn

Lys

Thr

Gly

Tyr

Leu

Asn

65

70

75

80

Val

Thr

Ile

His

Lys

Pro

Ser

Cys

Asn

Ile

Pro

Asp

Tyr

Leu

85

90

95

Met

Tyr

Ser

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Glu

Lys

Asn

Ser

Lys

Ile

Tyr

Cys

100

105

110

- 55 031047

Pro

Thr

Ile 115

Asp

Leu

Tyr

Asn

Trp 120

Thr

Ala

Pro

Leu

Glu 125

Trp

Phe

Lys

Asn

Cys

Gln

Ala

Leu

Gln

Gly

Ser

Arg

Tyr

Arg

Ala

His

Lys

Ser

Phe

130

135

140

Leu

Val

Ile

Asp

Asn

Val

Met

Thr

Glu

Asp

Ala

Gly

Asp

Tyr

Thr

Cys

145

150

155

160

Lys

Phe

Ile

His

Asn

Glu

Asn

Gly

Ala

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Ala

Thr

165

170

175

Arg

Ser

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Gly

Phe

Ser

Met

Phe

Pro

Val

Ile

180

185

190

Thr

Asn

Pro

Tyr

Asn

His

Thr

Met

Glu

Val

Glu

Ile

Gly

Lys

Pro

195

200

205

Ala

Ser

Ile

Ala

Cys

Ser

Ala

Cys

Phe

Gly

Lys

Gly

Ser

His

Phe

Leu

210

215

220

Ala

Asp

Val

Leu

Trp

Gln

Ile

Asn

Lys

Thr

Val

Gly

Asn

Phe

Gly

225

230

235

240

Glu

Ala

Arg

Ile

Gln

Glu

Gly

Arg

Asn

Glu

Ser

Asn

245

250

255

Asp

Met

Asp

Cys

Leu

Thr

Ser

Val

Leu

Arg

Ile

Thr

Gly

Val

Thr

Glu

260

265

270

Lys

Asp

Leu

Ser

Leu

Glu

Tyr

Asp

Cys

Leu

Ala

Leu

Asn

Leu

His

Gly

275

280

285

Met

Ile

Arg

His

Thr

Ile

Arg

Leu

Arg

290

295

<210>	8
<211>	303
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ST2L	человеческо-мышиная	химера HMH
<400>	8
Lys Phe	Ser	Lys Gln Ser Trp Gly	Leu Glu Asn Glu Ala	Leu Ile Val
1		5	10	15

- 56 031047

Arg Cys

Pro Arg Gln 20

Gly

Lys

Pro

Ser 25

Tyr Thr

Val

Asp

Trp 30

Tyr

Ser

Gln

Thr

Asn

Lys

Ser

Ile

Pro

Thr

Gln

Glu

Arg

Asn

Arg

Val

Phe

35

40

45

Ala

Ser

Gly

Gln

Leu

Lys

Phe

Leu

Pro

Ala

Val

Ala

Asp

Ser

50

55

60

Gly

Ile

Tyr

Thr

Cys

Ile

Val

Arg

Ser

Pro

Thr

Phe

Asn

Arg

Thr

Gly

65

70

75

80

Tyr

Ala

Asn

Val

Thr

Ile

Tyr

Lys

Gln

Ser

Asp

Cys

Asn

Val

Pro

85

90

95

Asp

Tyr

Leu

Met

Tyr

Ser

Thr

Val

Arg

Gly

Ser

Asp

Lys

Asn

Phe

Lys

100

105

110

Ile

Thr

Cys

Pro

Thr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Asn

Trp

Thr

Ala

Pro

Val

Gln

115

120

125

Trp

Phe

Lys

Asn

Cys

Lys

Ala

Leu

Gln

Glu

Pro

Arg

Phe

Arg

Ala

His

130

135

140

Arg

Ser

Tyr

Leu

Phe

Ile

Asp

Asn

Val

Thr

His

Asp

Glu

Gly

Asp

145

150

155

160

Tyr

Thr

Cys

Gln

Phe

Thr

His

Ala

Glu

Asn

Gly

Thr

Asn

Tyr

Ile

Val

165

170

175

Thr

Ala

Thr

Arg

Ser

Phe

Thr

Val

Lys

Asp

Glu

Gln

Gly

Phe

Ser

Leu

180

185

190

Phe

Pro

Val

Ile

Gly

Ala

Pro

Ala

Gln

Asn

Glu

Ile

Lys

Glu

Val

Glu

195

200

205

Ile

Gly

Lys

Asn

Ala

Asn

Leu

Thr

Cys

Ser

Ala

Cys

Phe

Gly

Lys

Gly

210

215

220

Thr

Gln

Phe

Leu

Ala

Val

Leu

Trp

Gln

Leu

Asn

Gly

Thr

Lys

Ile

225

230

235

240

Thr

Asp

Phe

Gly

Glu

Pro

Arg

Ile

Gln

Glu

Gly

Gln

Asn

Gln

245

250

255

Ser

Phe

Ser

Asn

Gly

Leu

Ala

Cys

Leu

Asp

Met

Val

Leu

Arg

Ile

Ala

260

265

270

- 57 031047

Asp

Val

Lys 275

Glu

Asp

Leu

Leu 280

Leu

Gln Tyr

Asp

Cys 285

Leu

Ala

Leu

Asn

Leu

His

Gly

Leu

Arg

His

Thr

Val

Arg

Leu

Ser

Arg

Lys

290

295

300

<210>

9

<211>

104

<212>

PRT

<213>

Homo

sapiens

<400>

9

Lys

Phe

Ser

Lys

Gln

Ser

Trp

Gly

Leu

Glu

Asn

Glu

Ala

Leu

Ile

Val

1

5

10

15

Arg

Cys

Pro

Arg

Gln

Gly

Lys

Pro

Ser

Tyr

Thr

Val

Asp

Trp

Tyr

20

25

30

Ser

Gln

Thr

Asn

Lys

Ser

Ile

Pro

Thr

Gln

Glu

Arg

Asn

Arg

Val

Phe

35

40

45

Ala

Ser

Gly

Gln

Leu

Lys

Phe

Leu

Pro

Ala

Val

Ala

Asp

Ser

50

55

60

Gly

Ile

Tyr

Thr

Cys

Ile

Val

Arg

Ser

Pro

Thr

Phe

Asn

Arg

Thr

Gly

65

70

75

80

Tyr

Ala

Asn

Val

Thr

Ile

Tyr

Lys

Gln

Ser

Asp

Cys

Asn

Val

Pro

85

90

95

Asp

Tyr

Leu

Met

Tyr

Ser

Thr

Val

100

<210>

10

<211>

80

<212>

PRT

<213>

Homo

sapiens

<400>

10

Ser

Gly

Ser

Glu

Lys

Asn

Ser

Lys

Ile

Tyr

Cys

Pro

Thr

Ile

Asp

Leu

1

5

10

15

Tyr

Asn

Trp

Thr

Ala

Pro

Leu

Glu

Trp

Phe

Lys

Asn

Cys

Gln

Ala

Leu

20

25

30

Gln

Gly

Ser

Arg

Tyr

Arg

Ala

His

Lys

Ser

Phe

Leu

Val

Ile

Asp

Asn

35

40

45

- 58 031047

Val

Met 50

Thr

Glu

Asp

Ala

Gly 55

Asp

Tyr

Thr

Cys

Lys 60

Phe

Ile

His

Asn

Glu

Asn

Gly

Ala

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Ala

Thr

Arg

Ser

Phe

Thr

Val

65

70

75

80

<210> 11 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11

Ser 1

Leu

Phe

Pro

Val 5

Ile

Gly Ala

Pro Ala 10

Gln

Asn

Glu

Ile

Lys 15

Glu

Val

Glu

Ile

Gly

Lys

Asn

Ala

Asn

Leu

Thr

Cys

Ser

Ala

Cys

Phe

Gly

20

25

30

Lys

Gly

Thr

Gln

Phe

Leu

Ala

Val

Leu

Trp

Gln

Leu

Asn

Gly

Thr

35

40

45

Lys

Ile

Thr

Asp

Phe

Gly

Glu

Pro

Arg

Ile

Gln

Glu

Gly

Gln

50

55

60

Asn

Gln

Ser

Phe

Ser

Asn

Gly

Leu

Ala

Cys

Leu

Asp

Met

Val

Leu

Arg

65

70

75

80

Ile

Ala

Asp

Val

Lys

Glu

Asp

Leu

Gln

Tyr

Asp

Cys

Leu

85

90

95

Ala

Leu

Asn

Leu

His

Gly

Leu

Arg

His

Thr

Val

Arg

Leu

Ser

Arg

100

105

110

Lys

Asn

Pro

Ile

115

<210>	12
<211>	101
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	12
Lys Ser Ser	Trp Gly Leu Glu Asn
1		5

Gln Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Pro

Glu	Ala 10	Leu	Ile	Val	Arg	Cys 15	Pro
Val	Glu	Trp	Tyr	Tyr	Ser	Asp	Thr
25					30

- 59 031047

Asn

Glu

Ser 35

Ile

Pro

Thr

Gln

Lys 40

Arg Asn

Arg

Ile

Phe 45

Val

Ser

Asp

Arg

Leu

Lys

Phe

Leu

Pro

Ala

Arg

Val

Glu

Asp

Ser

Gly

Ile

50

55

60

Ala

Cys

Val

Ile

Arg

Ser

Pro

Asn

Leu

Asn

Lys

Thr

Gly

Tyr

Leu

65

70

75

Val

Thr

Ile

His

Lys

Pro

Ser

Cys

Asn

Ile

Pro

Asp

Tyr

85

90

95

Met

Tyr

Ser

Thr

Val

100

Arg

Tyr

Asn

Leu <210>13 <211>5 <212> PRT <213> Mus musculus <400>13

His Tyr Gly Met Ala <210>14 <211>17 <212> PRT <213> Mus musculus <400>14

Ser Ile Ile Thr Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp

510

Ser Val

Lys

Gly

<210>	15
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	15
Gln Ser Asp Asp Tyr
1	5
<210>	16
<211>	16
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	16

Phe

Asp

Tyr

- 60 031047

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr

5

Ser Asp Gly Asp

Ser Tyr Leu Glu

<210> <211> <212> <213>	17 7 PRT Mus musculus
<400>	17

Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser

<210> <211> <212> <213>	18 9 PRT Mus musculus
<400>	18

Phe Gln Ala Thr His Asp Pro Phe Thr <210>19 <211>117 <212> PRT <213> Mus musculus <400>19

Glu Val 1

Gln Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly Gly Leu 10

Leu Gln

Pro

Gly 15

Arg

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Ile

Phe

Ser

His

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Ala

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Thr

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Ile

Thr

Asp

Gly

Thr

Ser

Thr

Tyr

Arg

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Gln

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asp

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Gln

Ser

Asp

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Val

Met

100

105

110

Val Thr Val Ser Ser

- 61 031047

115 <210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400>20

Asp Val 1

Val

Leu

Thr 5

Gln

Thr

Pro

Val

Ser Leu 10

Ser

Val

Thr

Leu 15

Gly

Asp

Gln

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Lys

Ser

Gln

Ser

Leu

Glu

Tyr

Ser

20

25

30

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

Glu

Trp

Tyr

Leu

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ser

35

40

45

Pro

Gln

Leu

Ile

Tyr

Gly

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp

Arg

Phe

Ile

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Pro

Glu

Asp

Leu

Gly

Val

Tyr

Cys

Phe

Gln

Ala

85

90

95

Thr

His

Asp

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210>	21
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	21

Asp Tyr Asn Met Asn

<210>	22
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Mus musculus

<400> 22

Thr Tyr Trp Met Asn

<210>	23
<211>	6
<212>	PRT

- 62 031047

<213>	Mus musculus
<400>	23
Ser Asp	Tyr Ala Trp Asn
1	5
<210>	24
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	24
Asp Asp	Tyr Met His
1	5

<210>	25
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	25
Asn Ile	Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser	Thr Thr Tyr Asn Gln Lys	Phe Lys
1	5	10	15

Gly

<210>	26
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	26
Gln Ile	Phe Pro Ala	Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Met	Phe Lys
1	5	10	15

Asp

<210>	27
<211>	16
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	27
Phe Ile	Ser Tyr Ser Gly Asp Thr	Ser Phe Asn Pro	Ser Leu Lys Ser
1	5	10	15

<210>	28
<211>	17
<212>	PRT

- 63 031047 <213> Mus musculus <400> 28

Arg Ile Asp Pro Ala

5

Ile Gly Asn Thr Glu

Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

Asp

<210> <211> <212> <213>	29 11 PRT Mus musculus
<400>	29

Glu Gly Asp Thr Tyr Leu Ala Trp Phe Ala Tyr

5 10

<210> <211> <212> <213>	30 15 PRT Mus musculus
<400>	30

Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ile Asn Phe

5

Gln Tyr Tyr Phe Ala Tyr

15

<210>	31
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	31
Tyr Asp	Gly	Tyr Ser Phe Asp Tyr
1		5

<210>	32
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Mus	musculus
<400>	32
Gly Asp	Phe	Tyr Ala Met Asp Tyr
1		5

<210>	33
<211>	16
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	33

- 64 031047

Arg Ser Ser Gln Ser	Ile	Val	Tyr	Ser
1	5
<210>	34
<211>	11
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	34
Arg Ala Ser Gln Asn	Ile	Gly	Thr	Arg
1	5
<210>	35
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	35
Arg Ala Ser Lys Ser	Val	Ser	Thr	Ser
1	5
<210>	36
<211>	11
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	36
Ile Thr Asn Thr Asp	Ile	Asp	Asp	Val
1	5
<210>	37
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	37
Lys Val	Ser Asn Arg	Phe	Ser
1	5
<210>	38
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	38
Tyr Ala Ser Glu Ser	Ile	Ser
1	5
<210>	39
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Mus musculus

Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

His

Ser Ser Tyr Met Phe

His

- 65 031047 <400> 39

Leu Ala Ser Asn Leu	Glu	Ser
1	5
<210>	40
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	40
Glu Gly Asn Thr Leu	Arg	Pro
1	5
<210>	41
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	41
Phe Gln Gly Ser His	Val	Pro	Pro	Thr
1	5
<210>	42
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	42
Gln Gln Ser Asn Thr	Trp	Pro	Phe	Thr
1	5
<210>	43
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	43
Gln His	Ser Arg Glu	Ile	Pro	Tyr	Thr
1	5
<210>	44
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	44
Leu Gln Ser Asp Asn	Met	Leu	Thr
1	5

<210> 45

- 66 031047

<211> <212> <213>	120 PRT Искусственная последовательность
<220>
<223>	C2519A VH
<400>	45

Glu 1

Phe

Gln

Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

5

10

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Asn

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gln

Ser

His

Gly

Lys

Ser

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Asn

Ile

Asn

Pro

Tyr

Gly

Ser

Thr

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

His

Leu

Asn

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Glu

Gly

Asp

Thr

Tyr

Leu

Ala

Trp

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

115

120

<210> 46 <211> 124 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> C2521A VH <400> 46

Gln 1

Ile Gln

Leu Gln Gln 5

Ser Gly Pro

Glu Leu 10

Val

Arg

Pro

Gly Thr 15

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Leu

Thr

Tyr

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gln

Arg

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

- 67 031047

Gly Gln

Ile

Phe

Pro

Ala

Ser 55

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr 60

Asn Glu

Met

Phe

50

Lys

Asp

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Glu

Asn

Ile

Tyr

Ile

Asn

Phe

Gln

Tyr

Phe

Ala

100

105

110

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

115

120

<210>	47
<211>	117
<212>	PRT
<213>	Искусственная	последовательность
<220> <223>	C2244/ STLM15	VH
<400>	47

Glu 1

Val

Gln

Leu Gln 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly Leu 10

Val

Lys

Pro

Ser 15

Gln

Ser

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Thr

Gly

Phe

Ser

Ile

Thr

Ser

Asp

20

25

30

Tyr

Ala

Trp

Asn

Trp

Ile

Arg

Gln

Phe

Pro

Gly

Ser

Lys

Leu

Glu

Trp

35

40

45

Met

Gly

Phe

Ile

Ser

Tyr

Ser

Gly

Asp

Thr

Ser

Phe

Asn

Pro

Ser

Leu

50

55

60

Lys

Ser

Arg

Ile

Ser

Val

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gln

Phe

65

70

75

80

Leu

Gln

Leu

Asn

Ser

Val

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ser

Tyr

Asp

Gly

Tyr

Ser

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

100

105

110

Leu Thr Val Ser Ser

115 <210> 48

- 68 031047

<211> <212> <213>	117 PRT Искусственная последовательность
<220>
<223>	C2494A/ STLM62 VH
<400>	48

Glu 1

Val

Gln

Leu Gln 5

Gln

Ser

Val

Ala

Glu 10

Leu

Val

Arg

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Ala

Phe

Asn

Ile

Lys

Asp

20

25

30

Tyr

Met

His

Trp

Val

Lys

Gln

Arg

Pro

Glu

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Asp

Pro

Ala

Ile

Gly

Asn

Thr

Glu

Tyr

Ala

Pro

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Asp

Lys

Ala

Thr

Met

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Leu

Gly

Asp

Phe

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Ser

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

115 <210> 49 <211> 112 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> C2519A VL <400> 49

Asp 1

Val

Leu

Met

Thr Gln 5

Thr

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro Val

Ser

Leu Gly 15

Asp

Gln

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Gln

Ser

Ile

Val

Tyr

Ser

20

25

30

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Glu

Trp

Tyr

Leu

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ser

35

40

45

- 69 031047

Pro

Lys 50

Leu

Ile

Tyr Lys 55

Val

Ser

Asn

Arg

Phe 60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gly

Val

Tyr

Cys

Phe

Gln

Gly

85

90

95

Ser

His

Val

Pro

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 50 <211> 106 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> C2521A VL <400> 50

Ile 1

Leu

Thr

Gln 5

Ser

Pro

Ala

Ile

Leu 10

Ser

Val

Ser

Pro

Gly 15

Glu

Arg

Val

Ser

Phe

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Asn

Ile

Gly

Thr

Arg

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gln

Arg

Thr

Asn

Gly

Ser

Pro

Arg

Leu

Ile

Lys

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Glu

Ser

Ile

Ser

Gly

Ile

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Val

Glu

Ser

Glu

65

70

75

80

Asp

Ile

Ala

Asp

Tyr

Cys

Gln

Ser

Asn

Thr

Trp

Pro

Phe

Thr

85

90

95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu

100

Ile Lys

105

<210>	51
<211>	111
<212>	PRT
<213>	Искусственная	последовательность
<220> <223>	C2244/ STLM15	VL
<400>	51

- 70 031047

Asp 1

Ile Val

Leu

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ala

Ser 10

Leu

Ala

Ile

Ser

Leu 15

Gly

Gln

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Val

Ser

Thr

Ser

20

25

30

Gly

Ser

Tyr

Met

Phe

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Ile

Tyr

Leu

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Asn

Ile

His

65

70

75

80

Pro

Val

Glu

Asp

Ala

Tyr

Cys

Gln

His

Ser

Arg

85

90

95

Glu

Ile

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 52 <211> 106 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> C2494A/ STLM62 VL <400> 52

Glu 1

Thr

Val

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ala

Ser 10

Leu

Ser

Val

Ala

Thr 15

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Ile

Arg

Cys

Ile

Thr

Asn

Thr

Asp

Ile

Asp

Val

20

25

30

Ile

His

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Glu

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Ser

Glu

Gly

Asn

Thr

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Ser

Gly

Tyr

Gly

Thr

Asp

Phe

Val

Phe

Thr

Ile

Glu

Asn

Thr

Leu

Ser

65

70

75

80

Glu

Asp

Val

Ala

Asp

Tyr

Cys

Leu

Gln

Ser

Asp

Asn

Met

Leu

Thr

85

90

95

- 71 031047

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> STLM48, STLM49, STLM50 HCDR1 <400>53

Thr Ser Tyr Trp Ile Gly <210>54 <211> 6 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> STLM51 HCDR1 <400>54

Ser Ser Tyr Ala Ile Ser <210>55 <211> 18 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> STLM48, STLM49, STLM50 HCDR2 <400>55

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

5 1015

Gln Gly <210>56 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> STLM51 HCDR2 <400> 56

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

5 10 15

- 72 031047

Gly

<210> <211> <212> <213>

57 7 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM48, STLM50 HCDR3
<400>	57

Leu Ser Gly Arg Phe Asp Tyr

1	5
<210> <211> <212> <213>	58 7 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM49 HCDR3
<400>	58

Ile Gly Gly Met Phe Asp Tyr

1	5
<210> <211> <212> <213>	59 7 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM51 HCDR3
<400>	59

Asp Thr Pro Gln Leu Asp Tyr

1	5
<210> <211> <212> <213>	60 11 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM48 LCDR1
<400>	60

Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Asp Ala Leu Ala

1	5 10
<210> <211>	61 11

- 73 031047

<212> <213>

PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM49 LCDR1
<400>	61

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ala Asn Ala Leu Ala

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	62 11 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM50 LCDR1
<400>	62

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ala Leu Ala

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	63 11 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM51 LCDR1
<400>	63

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	64 7 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM48, STLM50 LCDR2
<400>	64

Phe Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	65 7 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM49 LCDR2
<400>	65

- 74 031047

Lys Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	66 7 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM51 LCDR2
<400>	66

Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1	5
<210> <211> <212> <213>	67 9 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM48 LCDR3
<400>	67

Gln Gln Phe Asn Thr Trp Pro Ile Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	68 9 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM49 LCDR3
<400>	68

Gln Gln Tyr Tyr Gly Trp Pro Ile Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	69 9 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM50 LCDR3
<400>	69

Gln Gln Phe Phe Asn Trp Pro Ile Thr

1	5
<210> <211>	70 9

- 75 031047

<212> <213>

PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	STLM51 LCDR3
<400>	70

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

5 <210> 71 <211> 116 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> STLM48, STLM50 VH <400> 71

Glu Val 1

Gln Leu Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu Val 10

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

Trp

Ile

Gly

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Ile

Tyr

Pro

Gly

Asp

Ser

Tyr

Thr

Arg

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Leu

Ser

Gly

Arg

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

100

105

110

Thr Val Ser Ser

115

<210>	72
<211>	116
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	STLM49 VH
<400>	72

- 76 031047

Glu Val 1

Gln Leu Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu Val 10

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

Trp

Ile

Gly

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Ile

Tyr

Pro

Gly

Asp

Ser

Tyr

Thr

Arg

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ile

Gly

Met

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

100

105

110

Thr Val Ser Ser

115 <210> 73 <211> 116 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> STLM51 VH <400> 73

Gln Val 1

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Thr

Phe

Ser

Tyr

20

25

30

Ala

Ile

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Ile

Pro

Ile

Phe

Gly

Thr

Ala

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Glu

Ser

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

- 77 031047

Met Glu Leu Ser

Ser Leu Arg Ser Glu Asp

90

Thr Ala Val

Tyr Tyr Cys

Ala Arg Asp Thr

100

Pro Gln Leu Asp Tyr Trp

105

Gly Gln Gly

Thr

110

Leu Val

Thr Val Ser Ser

115

<210>	74
<211>	107
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	STLM48 VL
<400>	74

Glu 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ala

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Arg

Asp

Ala

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Phe

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gln

Phe

Asn

Thr

Trp

Pro

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

<210> <211> <212> <213>	75 107 PRT Искусственная	последовательность
<220>
<223>	STLM49 VL
<400>	75
Glu Ile	Val Leu Thr	Gln Ser Pro Ala Thr Leu	Ser Leu Ser Pro Gly
1	5	10	15

- 78 031047

Glu Arg

Ala Thr 20

Leu

Ser Cys

Arg

Ala 25

Ser Gln

Ser

Val

Ala 30

Asn

Ala

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Lys

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Gly

Trp

Pro

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

<210>	76
<211>	107
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	STLM50 VL
<400>	76

Glu 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ala

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Trp

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Lys

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Asn

Arg

Ala

Pro

Trp

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

- 79 031047 <210> 77 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> STLM51 VL <400> 77

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Ile

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Leu

Gln

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Leu

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

<210>	78
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220> <223>	ST2F6 HCDR1
<400>	78

Ser Tyr Ala Met Ser

5

<210> <211> <212> <213>

79 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2F4 HCDR1
<400>	79

Ser Tyr Trp Met His

- 80 031047 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2F1 HCDR1 <400>80

Ser Tyr Trp Ile Gly <210> 81 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2F6 HCDR2 <400>81

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly <210> 82 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2F4 HCDR2 <400>82

Gly Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly <210>83 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2F1 HCDR2 <400> 83

- 81 031047

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

5 1015

Gly <210>84 <211>14 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2F6 HCDR3 <400>84

Asp Pro Trp Ser Thr Glu Gly Ser Phe Phe Val Leu Asp Tyr

510 <210>85 <211> 12 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2F4 HCDR3 <400> 85

Asp Gly Trp Gly Thr Val Tyr Phe Pro Phe Asp Tyr

5 10 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2F1 HCDR3 <400>86

Asp Thr Ala Asp Phe Arg Arg Trp Asp Phe Asp Tyr

510 <210>87 <211> 11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2F6 LCDR1 <400> 87

Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asp Ala Leu Ala

5 10

- 82 031047 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2F4 LCDR1 <400>88

Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Asp Asp Leu Ala

510 <210>89 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2F1 LCDR1 <400>89

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu

5 1015

Ala

<210> <211> <212> <213>	90 7 PRT Искусственная	последовательность
<220>
<223>	ST2F6, ST2F4	LCDR2
<400>	90

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr <210>91 <211>7 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2F1 LCDR2 <400>91

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser <210>92 <211>9

- 83 031047

<212> <213>

PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2F6 LCDR3
<400>	92

Gln Gln Phe Tyr Asn Trp Pro Leu Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	93 9 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2F4 LCDR3
<400>	93

Gln Gln Tyr Ile His Ala Pro Leu Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	94 9 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2F1 LCDR3
<400>	94

Gln Gln Ser Asn Thr Tyr Pro Phe Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	95 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H112, ST2H137 HCDR1
<400>	95

Phe Tyr Asp Met Phe

1	5
<210> <211> <212> <213>	96 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H52 HCDR1
<400>	96

- 84 031047

Asp Tyr Ala Met Phe

1	5
<210> <211> <212> <213>	97 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H50, ST2H232, ST2H257, ST2H231 HCDR1
<400>	97

Ile Tyr Asp Met Ile

1	5
<210> <211> <212> <213>	98 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H228 HCDR1
<400>	98

Ser Tyr Asp Met Ile

1	5
<210> <211> <212> <213>	99 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H318 HCDR1
<400>	99

Asp Asp Ala Met Ile

1	5
<210> <211> <212> <213>	100 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H316 HCDR1
<400>	100

Gly Tyr Ala Met Ile

1	5
<210> <211>	101 5

- 85 031047

<212> <213>

PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H314 HCDR1
<400>	101

Val Tyr Asp Met Ile

1	5
<210> <211> <212> <213>	102 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H202 HCDR1
<400>	102

Phe Tyr Asp Met Ile

1	5
<210> <211> <212> <213>	103 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H179, ST2H172, ST2H173 HCDR1
<400>	103

Ser Tyr Asp Met Phe

1	5
<210> <211> <212> <213>	104 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H163 HCDR1
<400>	104

Val Tyr Asp Met Phe

1	5
<210> <211> <212> <213>	105 5 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H162 HCDR1
<400>	105

- 86 031047

Val Asp Ser Met Phe

5 <210> 106 <211> 5 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2H139 HCDR1 <400>106

Gly Tyr Asp Met Phe <210>107 <211>5 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2H136 HCDR1 <400>107

Ile Tyr Asp Met Phe <210> 108 <211>5 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2H129 HCDR1 <400>108

Ile Tyr Ser Met Phe <210>109 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2H112 HCDR3 <400> 109

Ser Ile Arg Gly Glu Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 10 15

Gly

- 87 031047 <210> 110 <211> 17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2H52 HCDR3 <400>110

Ala Ile Glu Gly Glu Gly Gly Glu Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly

<210>	111
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	ST2H50 HCDR3
<400>	111
Thr Ile	Lys Gly Glu	Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15

Gly <210> 112 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2H232 HCDR3 <400> 112

Thr Ile Arg Gly Glu Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 10 15

Gly

<210> <211> <212> <213>

113 17 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>

ST2H228 HCDR3

- 88 031047 <400> 113

Thr Ile Arg Gly Glu Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 10 15

Gly

<210>	114
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ST2H257 HCDR3
<400>	114
Ser Ile	Arg Gly Glu Gly Gly Gly Thr	Tyr Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15

Gly

<210>	115
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ST2H231 HCDR3
<400>	115
Thr Ile	Arg Gly Glu Gly Gly Gly Thr	Ser Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15
Gly

<210>	116
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220> <223>	ST2H318 HCDR3
<400>	116
Tyr Ile	Gly Gly Asn Gly Gly Thr	Thr Tyr Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15

Gly

- 89 031047 <210> 117 <211> 17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2H316 HCDR3 <400>117

Tyr Ile	Glu Gly Glu Gly Gly Glu	Thr Tyr Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15
Gly

<210>	118
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ST2H314 HCDR3
<400>	118

Thr	Ile Arg Gly Glu Gly Gly Gly Thr	Tyr Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15
Gly

<210>119 <211>311 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>119

Ala 1

Lys

Phe

Ser

Lys 5

Gln

Ser

Trp

Gly

Leu 10

Glu

Asn

Glu

Ala

Leu 15

Ile

Val

Arg

Cys

Pro

Arg

Gln

Gly

Lys

Pro

Ser

Tyr

Thr

Val

Asp

Trp

Tyr

20

25

30

Tyr

Ser

Gln

Thr

Asn

Lys

Ser

Ile

Pro

Thr

Gln

Glu

Arg

Asn

Arg

Val

35

40

45

Phe

Ala

Ser

Gly

Gln

Leu

Lys

Phe

Leu

Pro

Ala

Glu

Val

Ala

Asp

50

55

60

Ser

Gly

Ile

Tyr

Thr

Cys

Ile

Val

Arg

Ser

Pro

Thr

Phe

Asn

Arg

Thr

65

70

75

80

- 90 031047

Gly

Tyr

Ala Asn

Val 85

Thr

Ile

Tyr

Lys

Lys 90

Gln

Ser

Asp

Cys

Asn 95

Val

Pro

Asp

Tyr

Leu

Met

Tyr

Ser

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Glu

Lys

Asn

Ser

100

105

110

Lys

Ile

Tyr

Cys

Pro

Thr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Asn

Trp

Thr

Ala

Pro

Leu

115

120

125

Glu

Trp

Phe

Lys

Asn

Cys

Gln

Ala

Leu

Gln

Gly

Ser

Arg

Tyr

Arg

Ala

130

135

140

His

Lys

Ser

Phe

Leu

Val

Ile

Asp

Asn

Val

Met

Thr

Glu

Asp

Ala

Gly

145

150

155

160

Asp

Tyr

Thr

Cys

Lys

Phe

Ile

His

Asn

Glu

Asn

Gly

Ala

Asn

Tyr

Ser

165

170

175

Val

Thr

Ala

Thr

Arg

Ser

Phe

Thr

Val

Lys

Asp

Glu

Gln

Gly

Phe

Ser

180

185

190

Leu

Phe

Pro

Val

Ile

Gly

Ala

Pro

Ala

Gln

Asn

Glu

Ile

Lys

Glu

Val

195

200

205

Glu

Ile

Gly

Lys

Asn

Ala

Asn

Leu

Thr

Cys

Ser

Ala

Cys

Phe

Gly

Lys

210

215

220

Gly

Thr

Gln

Phe

Leu

Ala

Val

Leu

Trp

Gln

Leu

Asn

Gly

Thr

Lys

225

230

235

240

Ile

Thr

Asp

Phe

Gly

Glu

Pro

Arg

Ile

Gln

Glu

Gly

Gln

Asn

245

250

255

Gln

Ser

Phe

Ser

Asn

Gly

Leu

Ala

Cys

Leu

Asp

Met

Val

Leu

Arg

Ile

260

265

270

Ala

Asp

Val

Lys

Glu

Asp

Leu

Gln

Tyr

Asp

Cys

Leu

Ala

275

280

285

Leu

Asn

Leu

His

Gly

Leu

Arg

His

Thr

Val

Arg

Leu

Ser

Arg

Lys

290

295

300

Asn

Pro

Ser

Lys

Glu

Cys

Phe

305 310 <210> 120

- 91 031047 <211> 17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2H202 HCDR3 <400>120

Thr Ile Arg Gly Glu Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly <210> 121 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2H179 HCDR3 <400>121

Asp Ile Lys Gly Glu Gly Gly Arg Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly <210> 122 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2H172 HCDR3 <400> 122

Ala Ile Ala Gly Glu Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 10 15

Gly

<210> <211> <212> <213>

123 17 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2H173 HCDR3
<400>	123

- 92 031047

Asp Ile Lys Gly Glu Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala	Asp	Ser	Val 15	Lys
1	5	10
Gly
<210>	124
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ST2H163 HCDR3
<400>	124
Asp Ile	Lys Gly Glu Gly Gly Glu Thr	Ser Tyr Ala	Asp	Ser	Val	Lys
1	5	10			15
Gly

<210>	125
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ST2H162 HCDR3
<400>	125
Ser Ile	Glu Gly Asn Gly Gly Ala	Thr Tyr Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15
Gly

<210> 126 <211> 17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ST2H139 HCDR3 <400>126

Asp Ile Gly Gly Glu Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly <210>127

- 93 031047 <211> 17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность

<220>
<223>	ST2H137 HCDR3
<400>	127
Asp Ile	Arg Gly Glu Gly Gly Gly	Thr Ala Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15
Gly

<210>	128
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ST2H136 HCDR3
<400>	128
Tyr Ile	Arg Gly Glu Gly Gly Asp	Thr Asn Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15

Gly

<210>	129
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ST2H129 HCDR3
<400>	129
Asp Ile	Gly Gly Glu Gly Gly Gly Thr	Ser Tyr Ala Asp	Ser Val Lys
1	5	10	15

Gly

<210> <211> <212> <213>

130 11 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2L32 LCDR1
<400>	130

- 94 031047

Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asp Asp Leu Ala

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	131 9 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2L32 LCDR3
<400>	131

Gln Gln Tyr Ile Gly Ala Pro Ile Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	132 9 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2L35 LCDR3
<400>	132

Gln Gln Tyr Ile Asp Ala Pro Leu Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	133 8 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2L49 LCDR3
<400>	133

Gln Gln Tyr Asn Asp Ala Ile Thr

1	5
<210> <211> <212> <213>	134 9 PRT Искусственная последовательность

<220> <223>	ST2L59 LCDR3
<400>	134

Gln Gln Tyr Ile Thr Ala Pro Leu Thr

1	5
<210> <211> <212>	135 106 PRT

- 95 031047 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL2494-IGKV1-33*01 O18 <400> 135

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Ile

Thr

Asn

Thr

Asp

Ile

Asp

Val

20

25

30

Ile

His

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Glu

Gly

Asn

Thr

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Leu

Gln

Ser

Asp

Asn

Met

Leu

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

<210> 136 <211> 106 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL2494-IGKV1-27*01 A20 <400> 136

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Ile

Thr

Asn

Thr

Asp

Ile

Asp

Val

20

25

30

Ile

His

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Glu

Gly

Asn

Thr

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

- 96 031047

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Met 85 90

Leu Thr

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100

105

<210>	137
<211>	106
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	VL2494-IGKV1-39*01O12
<400>	137

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Ile

Thr

Asn

Thr

Asp

Ile

Asp

Val

20

25

30

Ile

His

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Glu

Gly

Asn

Thr

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Leu

Gln

Ser

Asp

Asn

Met

Leu

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

<210> 138 <211> 106 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL2494-IGKV1-12*01 L5

<400>

138

Asp

Ile

Gln

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Val

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Ile

Thr

Asn

Thr

Asp

Ile

Asp

Val

- 97 031047

25 30

Ile

His

Trp 35

Tyr

Gln

Lys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Ile

Tyr

Glu

Gly

Asn

Thr

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Leu

Gln

Ser

Asp

Asn

Met

Leu

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

<210> 139 <211> 106 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL2494-IGKV1-5*01 L12 <400> 139

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Ile

Thr

Asn

Thr

Asp

Ile

Asp

Val

20

25

30

Ile

His

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Glu

Gly

Asn

Thr

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Leu

Gln

Ser

Asp

Asn

Met

Leu

Thr

85

90

95

Phe Gly Gln

Gly Thr Lys

100

Leu Glu

Ile Lys

105 <210> 140 <211> 106

- 98 031047 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL2494-IGKV1-9*01 L8 <400> 140

Asp 1

Ile

Gln

Leu

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Phe 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Ile

Thr

Asn

Thr

Asp

Ile

Asp

Val

20

25

30

Ile

His

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Glu

Gly

Asn

Thr

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Leu

Gln

Ser

Asp

Asn

Met

Leu

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

<210> 141 <211> 106 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL2494-IGKV3-15*01 L2 <400> 141

Glu 1

Ile Val

Met

Thr Gln 5

Ser

Pro Ala

Thr 10

Leu

Ser

Val

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Ile

Thr

Asn

Thr

Asp

Ile

Asp

Val

20

25

30

Ile

His

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Glu

Gly

Asn

Thr

Leu

Arg

Pro

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Ser

- 99 031047

70 7580

Glu Asp	Phe Ala Val 85	Tyr Tyr Cys	Leu Gln Ser Asp Asn Met 90	Leu Thr 95
Phe	Gly	Gln	Gly	Thr	Lys	Leu	Glu	Ile	Lys
			100					105

<210>	142
<211>	106
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	VL2494-IGKV1-39*01 O12b
<400>	142

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Ile

Thr

Asn

Thr

Asp

Ile

Asp

Val

20

25

30

Ile

His

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Glu

Gly

Asn

Thr

Leu

Arg

Pro

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Leu

Gln

Ser

Asp

Asn

Leu

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

<210>143 <211>117 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VH2494-IGHV1-f*01 <400> 143

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

5 10 15

- 100 031047

Thr Val

Lys

Ile 20

Ser

Cys

Lys

Val

Ser 25

Ala

Phe

Asn

Ile

Lys 30

Asp

Tyr

Met

His

Trp

Val

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Asp

Pro

Ala

Ile

Gly

Asn

Thr

Glu

Tyr

Ala

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Thr

Asp

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Gly

Asp

Phe

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210>	144
<211>	117
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	VH2494-IGHV1-24*01
<400>	144

Gln Val 1

Gln

Leu

Val 5

Gln

Ser Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Val

Ser

Ala

Phe

Asn

Ile

Lys

Asp

20

25

30

Tyr

Met

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Asp

Pro

Ala

Ile

Gly

Asn

Thr

Glu

Tyr

Ala

Pro

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Asp

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Glu

Asp

Thr

Ser

Thr

Asp

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Gly

Asp

Phe

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

- 101 031047

100

105

110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210>	145
<211>	117
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	VH STLH201
<400>	145

Glu Val 1

Gln Leu Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu Val 10

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Val

Ser

Ala

Phe

Asn

Ile

Lys

Asp

20

25

30

Tyr

Met

His

Trp

Val

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Asp

Pro

Ala

Ile

Gly

Asn

Thr

Glu

Tyr

Ala

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Thr

Asp

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Gly

Asp

Phe

Tyr

Ala

Met

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210>	146
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Искусственная последовательность
<220> <223>	HCDR3 of STLM226-STLM232
<400>	146

Gly Asp Phe Tyr

Ala Met Ala Tyr

- 102 031047 <210> 147 <211> 8 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> STLM266 VL <400>147

Leu Gln Ser Asp Asn Leu Leu Thr <210>148 <211>109 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> IGHV1-24*01 каркас <400> 148

Gln Val 1

Gln Leu Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu Val 10

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Val

Ser

Gly

Tyr

Thr

Leu

Thr

Glu

Leu

20

25

30

Ser

Met

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Phe

Asp

Pro

Glu

Asp

Gly

Glu

Thr

Ile

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Glu

Asp

Thr

Ser

Thr

Asp

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

100

105

<210> <211> <212> <213>

149 109 PRT Искусственный

<220> <223>	IGHV1-f*01 каркас
<400>	149

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

Lys Lys Pro Gly Ala

- 103 031047

Thr

Val

Lys

Ile 20

Ser

Cys

Lys

Val

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Asp

Tyr

Met

His

Trp

Val

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Leu

Val

Asp

Pro

Glu

Asp

Gly

Glu

Thr

Ile

Tyr

Ala

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Thr

Asp

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Thr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

100

105

<210>

150

<211>

106

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

IGKV3

5-15*

*01 L2 каркас

<400>

150

Glu

Ile

Val

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Ser

Asn

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Gly

Ala

Ser

Thr

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Ser

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Asn

Trp

Pro

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

- 104 031047 <210> 151 <211> 106 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> IGKV1-9*01 L8 каркас <400> 151

Asp 1

Ile

Gln

Leu

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Phe 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Gly

Ile

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Thr

Leu

Gln

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Leu

Asn

Ser

Tyr

Pro

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

<210> 152 <211> 106 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> IGKV1-5*01 L12 <400> 152

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr Gln 5

Ser

Pro

Ser

Thr 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Ile

Ser

Trp

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

- 105 031047

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Leu

Gln

Pro 80

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Asn

Ser

Tyr

Ser

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

<210>

153

<211>

106

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

IGKV1-12*

01 L5

<400>

153

Asp

Ile

Gln

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Val

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Gly

Ile

Ser

Trp

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Leu

Gln

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Ala

Asn

Ser

Phe

Pro

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100 105 <210> 154 <211> 106 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> IGKV1-39*01 O12 <400> 154

- 106 031047

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Ile

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Leu

Gln

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

<210>

155

<211>

106

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

IGKV1-27*

01 A20

<400>

155

Asp

Ile

Gln

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Gly

Ile

Ser

Asn

Tyr

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Thr

Leu

Gln

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Val

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Lys

Tyr

Asn

Ser

Ala

Pro

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

- 107 031047

100

105 <210> 156 <211> 106 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> IGKV1-33*01 O18 <400> 156

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Gln

Ala

Ser

Gln

Asp

Ile

Ser

Asn

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Asp

Asn

Leu

Pro

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

<210>

157

<211>

328

<212>

PRT

<213>

homo

sapiens

<400>

157

Met

Gly

Phe

Trp

Ile

Leu

Ala

Ile

Leu

Thr

Ile

Leu

Met

Tyr

Ser

Thr

1

5

10

15

Ala

Lys

Phe

Ser

Lys

Gln

Ser

Trp

Gly

Leu

Glu

Asn

Glu

Ala

Leu

20

25

30

Ile

Val

Arg

Cys

Pro

Arg

Gln

Gly

Lys

Pro

Ser

Tyr

Thr

Val

Asp

Trp

35

40

45

Tyr

Ser

Gln

Thr

Asn

Lys

Ser

Ile

Pro

Thr

Gln

Glu

Arg

Asn

Arg

50

55

60

- 108 031047

Val 65

Phe

Ala

Ser

Gly

Gln 70

Leu

Lys

Phe

Leu 75

Pro Ala

Glu

Val

Ala 80

Asp

Ser

Gly

Ile

Tyr

Thr

Cys

Ile

Val

Arg

Ser

Pro

Thr

Phe

Asn

Arg

85

90

95

Thr

Gly

Tyr

Ala

Asn

Val

Thr

Ile

Tyr

Lys

Gln

Ser

Asp

Cys

Asn

100

105

110

Val

Pro

Asp

Tyr

Leu

Met

Tyr

Ser

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Glu

Lys

Asn

115

120

125

Ser

Lys

Ile

Tyr

Cys

Pro

Thr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Asn

Trp

Thr

Ala

Pro

130

135

140

Leu

Glu

Trp

Phe

Lys

Asn

Cys

Gln

Ala

Leu

Gln

Gly

Ser

Arg

Tyr

Arg

145

150

155

160

Ala

His

Lys

Ser

Phe

Leu

Val

Ile

Asp

Asn

Val

Met

Thr

Glu

Asp

Ala

165

170

175

Gly

Asp

Tyr

Thr

Cys

Lys

Phe

Ile

His

Asn

Glu

Asn

Gly

Ala

Asn

Tyr

180

185

190

Ser

Val

Thr

Ala

Thr

Arg

Ser

Phe

Thr

Val

Lys

Asp

Glu

Gln

Gly

Phe

195

200

205

Ser

Leu

Phe

Pro

Val

Ile

Gly

Ala

Pro

Ala

Gln

Asn

Glu

Ile

Lys

Glu

210

215

220

Val

Glu

Ile

Gly

Lys

Asn

Ala

Asn

Leu

Thr

Cys

Ser

Ala

Cys

Phe

Gly

225

230

235

240

Lys

Gly

Thr

Gln

Phe

Leu

Ala

Val

Leu

Trp

Gln

Leu

Asn

Gly

Thr

245

250

255

Lys

Ile

Thr

Asp

Phe

Gly

Glu

Pro

Arg

Ile

Gln

Glu

Gly

Gln

260

265

270

Asn

Gln

Ser

Phe

Ser

Asn

Gly

Leu

Ala

Cys

Leu

Asp

Met

Val

Leu

Arg

275

280

285

Ile

Ala

Asp

Val

Lys

Glu

Asp

Leu

Gln

Tyr

Asp

Cys

Leu

290

295

300

Ala

Leu

Asn

Leu

His

Gly

Leu

Arg

His

Thr

Val

Arg

Leu

Ser

Arg

305

310

315

320

- 109 031047

Lys Asn Pro Ser Lys Glu Cys Phe

325

<210>	158
<211>	109
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	VH 3-23 каркас
<400>	158

Glu 1

Val

Gln

Leu

Leu Glu 5

Ser

Gly Gly

Gly 10

Leu Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

20

25

30

Ala

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Lys

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

100

105

<210>

159

<211>

106

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

Vk L6

каркас

(IGKV3-11 )

<400>

159

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

- 110 031047

40 45

Tyr Asp

Ala

Ser

Asn

Arg Ala 55

Thr Gly

Ile

Pro Ala 60

Arg

Phe

Ser

Gly

50

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gln

Arg

Ser

Asn

Trp

Pro

Thr

85

90

95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

100

Glu Ile Lys

105 <210> 160 <211> 5 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> HCDR1 общий типичный элемент

<220> <221> <222> <223>	Xaa1 (1).. Xaa1	. (1)
- S,	, F, D,
<220>
<221>	Xaa2
<222>	(2)..	(2)
<223>	Xaa2	- Y	или D
<220>
<221>	Xaa3
<222>	(3)..	. (3)
<223>	Xaa3	- A,	, D или
<220>
<221>	Xaa4
<222>	(5)..	. (5)
<223>	Xaa4	- S,	F или
<400>	160
Xaa Xaa Xaa	Met	Xaa
1			5
<210>	161
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Искусственный

S

I

I, G или V <220>

<223>

HCDR2 общий типичный элемент

- 111 031047 <220>

<221> Xaa1 <222> (1)..(1) <223> Xaa1 - A, S, T, Y или D <220>

<221> Xaa2 <222> (3)..(3) <223> Xaa2 - S, R, E, K, G или A <220>

<221> Xaa3 <222> (5)..(5) <223> Xaa3 - S, E или N <220>

<221> Xaa4 <222> (8)..(8) <223> Xaa4 - S, R, E, G, T, D или A <220>

<221> Xaa5 <222> (10)..(10) <223> Xaa5 - Y, D, N, A или S <400> 161

Xaa Ile Xaa Gly Xaa Gly Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys

5 10 15

Gly

<210>	162
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	HCDR3 общий типичный элемент

<220>

<221>	Xaa1
<222>	(1)..	. (1)
<223>	Xaa1	- D, A,	R, N, Q, P,	E, I, H,	S,	T	или Y
<220>
<221>	Xaa2
<222>	(2)..	. (2)
<223>	Xaa2	- P, A,	H, Y, E, Q,	L, S, N,	T,	V	или I
<400>	162
Xaa Xaa Trp	Ser Thr	Glu Gly Ser	Phe Phe	Val	Leu Asp
1		5		10

Tyr

<210>	163
<211>	11
<212>	PRT

- 112 031047 <213> Искусственный <220>

<223> LCDR1 общий типичный элемент

<220>
<221>	Xaa1
<222>	(9)..(9)
<223>	Xaa1 - A или D

<400> 163

Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asp Xaa Leu Ala

5 10

<210>	164
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	LCDR3 общий типичный элемент

<220>
<221>	Xaa1
<222>	(3)..(3)
<223>	Xaa1 — F или Y

<220>

<221> Xaa2 <222> (4)..(4) <223> Xaa2 - Y, I или N <220>

<221> Xaa3 <222> (5)..(5) <223> Xaa3 - N, G, D или T

<220>
<221>	Xaa4
<222>	(6)..(6)
<223>	Xaa4 — W или A

<220>
<221>	Xaa5
<222>	(7)..(7)
<223>	Xaa5 — P или удален

<220>
<221>	Xaa6
<222>	(8)..(8)
<223>	Xaa6 — L или I

<400> 164

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr

5 <210> 165

- 113 031047 <211> 14 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> STLH255 HCDR3 <400> 165

Ala Pro Trp Ser Thr Glu	Gly Ser	Phe	Phe 10	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5
<210>	166
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH256 HCDR3
<400>	166
Arg Pro	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10
<210>	167
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH257 HCDR3
<400>	167
Asn Pro	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10
<210>	168
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH258 HCDR3
<400>	168
Gln Pro	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10

<210>	169
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220> <223>	STLH259 HCDR3

- 114 031047 <400> 169

Glu Pro Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe 10	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5
<210>	170
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220> <223>	STLH260 HCDR3
<400>	170
Ile Pro	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10
<210>	171
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220> <223>	STLH261 HCDR3
<400>	171
His Pro	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10
<210>	172
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220> <223>	STLH262 HCDR3
<400>	172
Ser Pro	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10
<210>	173
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220> <223>	STLH263 HCDR3
<400>	173
Thr Pro	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10

<210> 174

- 115 031047 <211> 14 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> STLH264 HCDR3 <400> 174

Tyr Pro Trp Ser Thr Glu	Gly Ser	Phe	Phe 10	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5
<210>	175
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH265 HCDR3
<400>	175
Asp Ala	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10
<210>	176
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH266 HCDR3
<400>	176
Asp His	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10
<210>	177
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH267 HCDR3
<400>	177
Asp Tyr	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10

<210> <211> <212> <213>

178 14 PRT Искусственный

<220>

<223> STLH268 HCDR3

- 116 031047 <400> 178

Asp Glu Trp Ser Thr Glu	Gly Ser	Phe	Phe 10	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5
<210>	179
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH269 HCDR3
<400>	179
Asp Gln Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10
<210>	180
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH270 HCDR3
<400>	180
Asp Leu Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10
<210>	181
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH271 HCDR3
<400>	181
Asp Ser Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10
<210>	182
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH272 HCDR3
<400>	182
Asp Asn Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe	Val	Leu	Asp	Tyr
1	5				10

<210> 183

- 117 031047

<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH273 HCDR3
<400>	183
Asp Thr	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe
1	5				10
<210>	184
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH274 HCDR3
<400>	184
Asp Val	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe
1	5				10
<210>	185
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	STLH275 HCDR3
<400>	185
Asp Ile	Trp Ser Thr Glu	Gly	Ser	Phe	Phe
1	5				10
<210>	186
<211>	123
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	ST2H52
<400>	186
Glu Val	Gln Leu Leu Glu	Ser	Gly	Gly	Gly
1	5				10
Ser Leu	Arg Leu Ser Cys	Ala	Ala	Ser	Gly
	20			25
Ala Met	Phe Trp Val Arg	Gln	Ala	Pro	Gly
	35		40

Val

Leu

Phe

Lys

Leu

Val

Thr

Gly

Asp

Gln

Phe

Leu

Tyr

Pro

Ser

Glu

Gly

Asp

Trp

Gly

Tyr

Val

- 118 031047

Ser Ala

Ile

Glu

Gly Glu Gly Gly Glu Thr Asn Tyr

Ala

Asp

Ser Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210> 187 <211> 123 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> ST2H50 <400> 187

Glu Val 1

Gln

Leu

Leu 5

Glu

Ser

Gly Gly

Gly Leu 10

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ile

Tyr

20

25

30

Asp

Met

Ile

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Thr

Ile

Lys

Gly

Glu

Gly

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210> 188

- 119 031047 <211> 123 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> ST2H318 <400> 188

Glu Val 1

Gln Leu Leu 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Asp

20

25

30

Ala Met

Ile

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser Tyr

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

189

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H316

<400>

189

Glu Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Ala Met

Ile

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

- 120 031047

Ser

Tyr 50

Ile Glu Gly Glu

Gly Gly Glu Thr Tyr Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

190

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H314

<400>

190

Glu

Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Val

Tyr

20

25

30

Asp

Met

Ile

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Thr

Ile

Arg

Gly

Glu

Gly

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210> 191

- 121 031047 <211> 123 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> ST2H257 <400> 191

Glu Val 1

Gln Leu Leu 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ile

Tyr

20

25

30

Asp Met

Ile

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser Ser

Ile

Arg

Gly

Glu

Gly

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

192

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H232

<400>

192

Glu Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ile

Tyr

20

25

30

Asp Met

Ile

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

- 122 031047

Ser

Thr 50

Ile Arg Gly Glu

Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

193

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H231

<400>

193

Glu

Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ile

Tyr

20

25

30

Asp

Met

Ile

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Thr

Ile

Arg

Gly

Glu

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210> 194

- 123 031047 <211> 123 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> ST2H228 <400> 194

Glu Val 1

Gln Leu Leu 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

20

25

30

Asp Met

Ile

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser Thr

Ile

Arg

Gly

Glu

Gly

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

195

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H202

<400>

195

Glu Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Phe

Tyr

20

25

30

Asp Met

Ile

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

- 124 031047

Ser Thr

Ile

Arg

Gly

Glu

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

196

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H179

<400>

196

Glu Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

20

25

30

Asp Met

Phe

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser Asp

Ile

Lys

Gly

Glu

Gly

Arg

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210> 197

- 125 031047 <211> 123 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> ST2H173 <400> 197

Glu Val 1

Gln Leu Leu 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

20

25

30

Asp Met

Phe

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser Asp

Ile

Lys

Gly

Glu

Gly

Ala

Thr

Asn

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

198

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H172

<400>

198

Glu Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

20

25

30

Asp Met

Phe

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

- 126 031047

Ser

Ala 50

Ile Ala Gly Glu

Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

199

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H163

<400>

199

Glu

Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Val

Tyr

20

25

30

Asp

Met

Phe

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Asp

Ile

Lys

Gly

Glu

Gly

Glu

Thr

Ser

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210> 200

- 127 031047 <211> 123 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> ST2H162 <400> 200

Glu Val 1

Gln Leu Leu 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Val

Asp

20

25

30

Ser Met

Phe

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser Ser

Ile

Glu

Gly

Asn

Gly

Ala

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

201

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H139

<400>

201

Glu Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

20

25

30

Asp Met

Phe

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

- 128 031047

Ser

Asp 50

Ile Gly Gly Glu

Gly Gly Ser Thr Asn Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

202

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H137

<400>

202

Glu

Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Phe

Tyr

20

25

30

Asp

Met

Phe

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Asp

Ile

Arg

Gly

Glu

Gly

Thr

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210> 203

- 129 031047 <211> 123 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223> ST2H136 <400> 203

Glu Val 1

Gln Leu Leu 5

Glu

Ser Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ile

Tyr

20

25

30

Asp Met

Phe

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser Tyr

Ile

Arg

Gly

Glu

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

204

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H129

<400>

204

Glu Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ile

Tyr

20

25

30

Ser Met

Phe

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

- 130 031047

Ser

Asp 50

Ile Gly Gly Glu

Gly Gly 55

Gly Thr

Ser

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

205

<211>

123

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2H112

<400>

205

Glu

Val

Gln

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Phe

Tyr

20

25

30

Asp

Met

Phe

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Ile

Arg

Gly

Glu

Gly

Arg

Thr

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Asp

Pro

Trp

Ser

Thr

Glu

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210> 206

- 131 031047

<211> <212> <213>	107 PRT Искусственный
<220>
<223>	ST2L32
<400>	206

Glu 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ala

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Ile

Gly

Ala

Pro

Ile

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

<210>

207

<211>

107

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2L35

<400>

207

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

- 132 031047

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Leu

Glu

Pro 80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Ile

Asp

Ala

Pro

Leu

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

<210>

208

<211>

106

<212>

PRT

<213>

Искусственный

<220>

<223>

ST2L49

<400>

208

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Asn

Asp

Ala

Ile

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

<210>	209
<211>	107
<212>	PRT
<213>	Искусственный
<220>
<223>	ST2L59
<400>	209
Glu Ile	Val Leu Thr Gln Ser	Pro Ala Thr Leu	Ser Leu Ser Pro Gly
1	5	10	15

- 133 031047

Glu Arg

Ala

Thr 20

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gln Ser Val

Asp Asp Asp 30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Asp

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Ile

Thr

Ala

Pro

Leu

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100 105 <210> 210 <211> 14 <212> PRT <213> Искусственный <220>

<223>	ST2L	эпитоп
<400>	210
Arg Cys	Pro	Arg Gln Gly Lys	Pro Ser Tyr Thr Val Asp Trp
1		5	10
<210>	211
<211>	369
<212>	DNA

<213> Искусственный <220>

<223> VH CDNA для STLM208 <400> 211

gaggtgcagc	tgctggagag	cggcggcggc	ctggtgcagc	ccggcggcag	cctgcgcctg	60
agctgcgccg	ccagcggctt	caccttcagc	atctacgaca	tgatctgggt	gcgccaggcc	120
cccggcaagg	gcctggagtg	ggtcagcagc	atccgcggcg	agggcggcgg	cacctactac	180
gccgacagcg	tgaagggccg	cttcaccatc	agccgcgaca	acagcaagaa	caccctgtac	240
ctgcagatga	acagcctgcg	cgccgaggac	accgccgtgt	actactgcgc	ccgcgacccc	300
tggagcaccg	agggcagctt	cttcgtgctg	gactactggg	gccagggcac	cctggtgacc	360

gtgagcagc 369

- 134 031047 <210> 212 <211> 321 <212> DNA <213> Искусственный <220>

<223> VL CDNA для STLM208 <400> 212

gagatcgtgc	tgacccagag	ccccgccacc	ctgagcctga	gccccggcga	gcgcgccacc	60
ctgagctgcc	gcgccagcca	gagcgtggac	gacgacctgg	cctggtacca	gcagaagccc	120
ggccaggccc	cccgcctgct	gatctacgac	gccagcaacc	gcgccaccgg	catccccgcc	180
cgcttcagcg	gcagcggcag	cggcaccgac	ttcaccctga	ccatcagcag	cctggagccc	240
gaggacttcg	ccgtgtacta	ctgccagcag	tacatcaccg	cccccctgac	cttcggccag	300
ggcaccaagg	tggagatcaa	^g				321

<210> 213 <211> 351 <212> DNA <213> Искусственный <220>

<223> VH CDNA для c2244 <400> 213

gaggtgcagc	ttcaggagtc	aggacctggc	ctggtgaaac	cttctcagtc	tctgtccctc	60
acctgcactg	tcactggctt	ctcaatcacc	agtgattatg	cctggaactg	gatccggcag	120
tttccaggaa	gcaagctaga	gtggatgggc	ttcataagct	acagtggtga	cactagcttc	180
aacccatctc	tcaaaagtcg	aatctctgtc	actcgagaca	catccaagaa	ccagttcttc	240
ctgcagttga	attctgtgac	tactgaggac	acagccacat	attactgtgc	aagttatgat	300
ggttactcat	ttgactactg	gggccaaggc	actactctca	cagtctcctc	a	351

<210> 214 <211> 333 <212> DNA <213> Искусственный <220>

<223> VL CDNA для c2244 <400> 214

gacattgtgc	tgacccaatc	tccagcttcc	ttagctatat	ctctggggca	gagggccacc	60
atctcatgca	gggccagcaa	aagtgtcagt	acatctggct	ctagttatat	gttctggtac	120
caacagaaac	caggacagcc	acccaaactc	ctcatctatc	ttgcatccaa	cctagaatct	180
ggggtccctg	ccaggttcag	tggcagtggg	tctgggacag	acttcaccct	caacatacat	240
cctgtggagg	aggaggatgc	tgcagcctat	tactgtcaac	acagtaggga	gattccgtac	300

- 135 031047 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa

333 <210> 215 <211> 266 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 215

Met 1

Arg

Pro

Arg

Met 5

Lys

Tyr

Ser

Asn

Ser 10

Lys

Ile

Ser

Pro

Ala 15

Lys

Phe

Ser

Thr

Ala

Gly

Glu

Ala

Leu

Val

Pro

Cys

Lys

Ile

Arg

20

25

30

Arg

Ser

Gln

Lys

Thr

Lys

Glu

Phe

Cys

His

Val

Tyr

Cys

Met

Arg

35

40

45

Leu

Arg

Ser

Gly

Leu

Thr

Ile

Arg

Lys

Glu

Thr

Ser

Tyr

Phe

Arg

Lys

50

55

60

Glu

Pro

Thr

Lys

Arg

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Lys

His

Glu

65

70

75

80

Asn

Phe

Ser

Ala

Tyr

Pro

Arg

Asp

Ser

Arg

Lys

Arg

Ser

Leu

Gly

85

90

95

Ser

Ile

Gln

Ala

Phe

Ala

Ser

Val

Asp

Thr

Leu

Ser

Ile

Gln

Gly

100

105

110

Thr

Ser

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ser

Thr

Tyr

Asn

Asp

115

120

125

Gln

Ser

Val

Ser

Phe

Val

Leu

Glu

Asn

Gly

Cys

Tyr

Val

Ile

Asn

Val

130

135

140

Asp

Ser

Gly

Lys

Asp

Gln

Glu

Gln

Asp

Gln

Val

Leu

Arg

Tyr

145

150

155

160

Tyr

Glu

Ser

Pro

Cys

Pro

Ala

Ser

Gln

Ser

Gly

Asp

Gly

Val

Asp

Gly

165

170

175

Lys

Leu

Met

Val

Asn

Met

Ser

Pro

Ile

Lys

Asp

Thr

Asp

Ile

Trp

180

185

190

Leu

His

Ala

Asn

Asp

Lys

Asp

Tyr

Ser

Val

Glu

Leu

Gln

Arg

Gly

Asp

195

200

205

Val

Ser

Pro

Glu

Gln

Ala

Phe

Val

Leu

His

Lys

Ser

- 136 031047

210

215

220

Asp 225

Phe

Val

Ser

Phe

Glu 230

Cys

Lys

Asn

Leu

Pro 235

Gly

Thr

Tyr

Ile

Gly 240

Val

Lys

Asp

Asn

Gln

Leu

Ala

Leu

Val

Glu

Lys

Asp

Glu

Ser

Cys

245

250

255

Asn

Ile

Met

Phe

Lys

Leu

Ser

Lys

Ile

260 265

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенное человеческое или адаптированное в отношении человеческой каркасной области антитело-антагонист или их фрагменты, специфически связывающиеся с доменом I (SEQ ID NO: 9) человеческого интерлейкина 1 рецепторподобного белка 1 (ST2L), содержащее участок, определяющий комплементарность, тяжелой цепи (HCDR) 1 (HCDR1), HCDR 2 (HCDR2), HCDR 3 (HCDR3), участок, определяющий комплементарность, легкой цепи (LCDR) 1 (LCDR1), LCDR 2 (LCDR2) и LCDR 3 (LCDR3); где:

a) HCDR1 содержит SEQ ID NO: 97;

b) HCDR2 содержит SEQ ID NO: 114;

c) HCDR3 содержит SEQ ID NO: 84;

d) LCDR1 содержит SEQ ID NO: 130;

e) LCDR2 содержит SEQ ID NO: 90 и

f) LCDR3 содержит SEQ ID NO: 134.

2. Выделенное антитело-антагонист по п.1, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), где:

(a) VH содержит каркас VH, полученный из каркасных областей антитела человека IGHV3-23 (SEQ ID NO: 158), IGHV1-24*01 (SEQ ID NO: 148) или IGHV1-f*01 (SEQ ID NO: 149), и (b) VL содержит каркас VL, полученный из каркасных областей антитела человека IGKV3-11 (L6) (SEQ ID NO: 159), IGKV3-15*01 (L2) (SEQ ID NO: 150), IGKV1-9*01 (L8) (SEQ ID NO: 151), IGKV1-5*01 (L12) (SEQ ID NO: 152), IGKV1-12*01 (L5) (SEQ ID NO: 153), IGKV1-39*01 (O12) (SEQ ID NO: 154), IGKV1-27*01 (A20) (SEQ ID NO: 155) или IGKV1-33*01 (O18) (SEQ ID NO: 156).

3. Выделенное антитело-антагонист по п.2, где:

(a) каркас VH получен из человеческого IGHV3-23 (SEQ ID NO: 158) и (b) каркас VL получен из человеческого IGKV3-11 (L6) (SEQ ID NO: 159).

4. Выделенное антитело-антагонист по п.2 или 3, где:

(a) VH содержит SEQ ID NO: 191 и (b) VL содержит SEQ ID NO: 209.

5. Выделенное антитело-антагонист по любому из пп.1-4, где антитело-антагонист относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

6. Выделенное антитело-антагонист по п.5, где Fc-участок антитела-антагониста содержит замену, где замена содержит M252Y/S254T/T256E, V234A/G237A/P238S, V234A/G237A/H268Q,

H268A/V309L/A330S/P331S, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S или S228P/L234A/L235A, причем нумерация остатков соответствует принятой в EC нумерации.

7. Выделенное антитело-антагонист по любому из пп.1-6, где антитело-антагонист блокирует взаимодействие IL-33/ST2L.

8. Выделенное антитело-антагонист по любому из пп.1-7, где антитело-антагонист имеет константу диссоциации (К_дисс) с человеческим ST2L от приблизительно 5х10^-12 М до приблизительно 7х10^-10 М, константу скорости ассоциации (kacc) с человеческим ST2L от приблизительно 2х10⁶ М^-1с^-1 до приблизительно 1х10⁸ М^-1с^-1, или константу скорости диссоциации (k OTcc) с человеческим ST2L от приблизительно 1х10^-6 с^-1 до приблизительно 1х10^-2с^-1.

9. Выделенное антитело-антагонист по любому из пп.1-8, где антитело-антагонист имеет константу диссоциации (К_дисс) с ST2L Macaca fascicularis (яванского макака) (SEQ ID NO: 2) от приблизительно 3х10^-12 М до приблизительно 2х10^-9 М, константу скорости ассоциации (kacc) с ST2L яванского макака от приблизительно 4х10⁶ М^-1с^-1 до приблизительно 1х10⁸ М^-1с^-1, или константу скорости диссоциации (k OTcc) с ST2L яванского макака от приблизительно 7х10^-5с^-1 до приблизительно 1х10^-1 с^-1.

10. Выделенный полинуклеотид, кодирующий выделенное антитело-антагонист по любому из пп.1-9.

- 137 031047

11. Вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по п.10.

12. Клетка-хозяин для продуцирования выделенного человеческого или адаптированного в отношении человеческой каркасной области антитела-антагониста, содержащая вектор экспрессии по п.11.

13. Способ получения антитела-антагониста, включающий культивирование клетки-хозяина по п.12 и выделение антитела-антагониста из клетки-хозяина.

14. Фармацевтическая композиция, содержащая выделенное антитело-антагонист по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель, где фармацевтическая композиция предназначена для лечения или предотвращения ST2L-опосредованного заболевания.

15. Способ лечения или предотвращения ST2L-опосредованного заболевания, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного антитела-антагониста по любому из пп.1-9 или фармацевтической композиции по п.14 пациенту, нуждающемуся в этом.

16. Способ по п.15, в котором ST2L-опосредованное заболевание представляет собой астму, гиперреактивность дыхательных путей, саркоидоз, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), идиопатический легочный фиброз (IPF), муковисцидоз, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), эозинофильный эзофагит, склеродерму, атопический дерматит, аллергический ринит, буллезный пемфигоид, хроническую крапивницу, диабетическую нефропатию, ревматоидный артрит, интерстициальный цистит или реакцию трансплантат против хозяина (GVHD) или связано с рекрутингом воспалительных клеток в легкие, гиперплазией бокаловидных клеток или увеличенной секрецией слизи или ответом мастоцитов.

17. Способ ингибирования ответа мастоцитов у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного антитела-антагониста по любому из пп.1-9 или фармацевтической композиции по п.14 пациенту, нуждающемуся в этом.

18. Способ по п.17, в котором ингибирование ответа мастоцитов включает ингибирование уровня высвобождения GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-10 или IL-13 мастоцитами пуповинной крови человека у пациента.

19. Способ ингибирования у субъекта взаимодействия IL-33 и ST2L, включающий введение выделенного антитела-антагониста по любому из пп.1-9 или фармацевтической композиции по п.14 субъекту, нуждающемуся в этом.

20. Способ по п.19, в котором субъект имеет ST2L-опосредованное заболевание.

21. Способ по п.20, в котором ST2L-опосредованное заболевание представляет собой астму, гиперреактивность дыхательных путей, саркоидоз, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), идиопатический легочный фиброз (IPF), муковисцидоз, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), эозинофильный эзофагит, склеродерму, атопический дерматит, аллергический ринит, буллезный пемфигоид, хроническую крапивницу, диабетическую нефропатию, ревматоидный артрит, интерстициальный цистит или реакцию трансплантат против хозяина (GVHD) или связано с рекрутингом воспалительных клеток в легкие, гиперплазией бокаловидных клеток, увеличенной секрецией слизи или ответом мастоцитов.

22. Применение выделенного антитела-антагониста по любому из пп.1-9 для лечения или предотвращения ST2L-опосредованного заболевания.

23. Применение фармацевтической композиции по п.14 для лечения или предотвращения ST2Lопосредованного заболевания.

Ф 15η ®ф > =

PBS/PBS

PBS/IL-33

CNTO3914/IL-33

CNTO5516/IL-33

15

МСН

Фиг. 1

- 138 031047

Суммарно по BAL для дисперсионного анализа

150_ί

О Г——--------“1 со ...

Фиг. 2 PBS га iL-зз га CNTO3914/IL-33 □ CNTO5516/IL-33 тМСР-1 ИФА

Фиг. 3

- 139 031047

Фиг. 4A-C

140 031047

Фиг. 5

С2494 (мкг/мл) _IL_₃₃

С2244 (мкг/мл) ц__зз ___ + IL-33(1 нг/мл) ^этс^^ствУ^ет+ !L-33(1 нг/мл) отсутствует

IL-8

С2244(мкг/мл) _IL.₃₃ С2494 (мкг/мл) _IL_₃₃ + IL-33(1 нг/мл)^этсугствует+|L-33(1 н г/мл) отсутствует

- 141 031047

С2244 (мкг/мл)

С2494 (мкг/мл)

Фиг. 6A-6E

С2244 (мкг/мл) + IL-33 (1 нг/мл)

- 142 031047

С2519 (мкг/мл) + IL-33 (1 нг/мл)

- 143 031047

Фиг. 7A-7E

-—Планшет 3 — + IL-33(3 нг/мл)

С2494 (мкг/мл)

М50 (мкг/мл) + IL-33(3 нг/мл)

М51 (мкг/мл) + IL-33 (3 нг/мл)

М50 (мкг/мл + IL-33(3 нг/мл)

С2494 мкг/мл + IL-33 3 нг/мл + IL-33(3 нг/мл)

Планшет 3------С2494 (мкг/мл)о

- 144 031047

IL-13 =i 1

Ϊ3

500-]

2500007505002500-L

О О CM XT СО СО СМ О Ь D)

Ют- „Όν-СО °§в в

I__________________._____________________;_______а з

С2494(мкг/мл) + IL-3i(3 нг/мл)

-------Планшет 3------о о см xt-oo со см о СП

Ют- ХОт-Ю <

°°11

I_____________________._____._________-J

M48 (мкг/мл) + I L-33 (3 нг/мл)

О О CM Xf СО СО СМ О Ь

Ют- „Όν-СО >

°§s В |_-,-—

М49 (мкг/мл) ” + IL-33 (3 нг/мл)

Планшет 1——---—„со о О) с;

I__________________I £

М50 (мкг/мл) + IL-33 (3 нг/мл) о о см х|- оо со см о ‘Λ- 0%g °§о о

I ----------—I н

М51 (мкг/мл) + IL-33 (3 нг/мл)

Планшет 2--------------------IL-10

200-1

050900750600450300150oJО О СМ xf со СО СМ О ь О) <=>§§ Вш °о ____________8 2

С2494(мкг/мл) + IL-33(3 нг/мл)

-------Планшет 3-------OOCMxj-OOCDCMO О)

Ют- ₀Ot-co <С

М48(мкг/мл) + IL-33 (3 нг/мл)

OOCMxf-COCDCMO IDv —- — °Ч?

I-------------------------------М49 (мкг/мл) + IL-33 (3 нг/мл)

Планшет 1----------------ООСМхГООСОСМО о О)

- — i<

П~“

О

Ют- „Όν-со =>§§. о ф st о g

I------------------! §2

М51 (мкг/мл) + IL-33 (3 нг/мл) оосмхгсососмо

Юг- „Όν-со %-оо °οθ о

I_________.____________________I н

М50 (мкг/мл) + IL-33 (3 нг/мл)

-------------------- Планшет 2·

Фиг. 8A-8E

Стимуляция 1 нг/мл IL-33 в среде stemPro-34 + 100 нг/мл SCF

Домен ST2L* МаЬ Средний % ингибирования при помощи 50 мкг/мл МаЬ Средний % ингибирования при помощи 2 мкг/мл МаЬ GM-CSF IL-5 IL-8 IL-10 IL-13 GM-CSF IL-5 IL-8 IL-10 IL-13 D1 С2244 95,3 99,4 91,6 86,3 100,0 62,1 68,3 57,1 50,6 62,5 D1 С2494 95,3 99,4 93,5 87,3 100,0 84,1 96,2 83,0 76,1 95,8 D3 С2519 -179,9 -481,5 -95,5 -120,6 180,0 -205,3 -516,3 -103,3 -144,5 -195,6 D3 С2521 -12,2 -39,4 25,5 38,8 36,0 -295,3 -594,4 -190,0 -130,6 -207,8

Стимуляция 3 нг/мл IL-33 в среде RPMI/10 % FCS + 100 нг/мл SCF

Домен ST2L* Mab Средний % ингибирования при помощи 50 мкг/мл Mab Средний % ингибирования при помощи 2 мкг/мл Mab GM-CSF IL-5 IL-8 IL-10 IL-13 GM-CSF IL-5 IL-8 IL-10 IL-13 DI C2494 95,0 99,4 67,0 87,8 99,3 92,9 99,6 62,2 84,7 98,8 D3 ST2M48 23,2 20,7 28,7 8,3 11,0 -61,6 -46,1 -5,8 -79,1 -80,8 D3 ST2M49 -7,0 -20,9 -5,7 -12,4 9,3 -65,4 -33,1 -30,0 -36,8 -35,7 D3 ST2M50 -5,7 25,7 13,2 2,0 31,9 -26,0 1,6 -4,4 -18,7 14,9 D3 ST2M51 1,9 27,3 15,0 1,3 28,6 -35,3 1,2 11,8 -3,6 3,0

*Домен ST2L, с которым связывается антитело

Фиг. 9

- 145 031047

Название mAb/Fab Название VL HCDR1 HCDR2 HCDR3 Последовательность SEQ ID NO: Последовательность SEQIDNO: Последовательность SEQIDNO: ST2F6 ST2H41 SYAMS 78 AISGSGGSTYYADSVKG 81 DPWSTEGSFFVLDY 84 ST2F14 ST2H41 SYAMS 78 AISGSGGSTYYADSVKG 81 DPWSTEGSFFVLDY 84 ST2F17 ST2H41 SYAMS 78 AISGSGGSTYYADSVKG 81 DPWSTEGSFFVLDY 84 ST2F31 ST2H41 SYAMS 78 AISGSGGSTYYADSVKG 81 DPWSTEGSFFVLDY 84 ST2F41 ST2H41 SYAMS 78 AISGSGGSTYYADSVKG 81 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM103 ST2H112 FYDMF 95 SIRGEGGRTDYADSVKG 109 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM107 ST2H52 DYAMF 96 AIEGEGGETNYADSVKG 110 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM108 ST2H50 IYDMI 97 TIKGEGGGTYYADSVKG 111 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM123 ST2H52 DYAMF 96 AIEGEGGETNYADSVKG 110 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM124 ST2H50 IYDMI 97 TIKGEGGGTYYADSVKG 111 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM206 ST2H232 IYDMI 97 TIRGEGGSTYYADSVKG 112 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM207 ST2H228 SYD Ml 98 TIRGEGGTTAYADSVKG 113 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM208 ST2H257 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM209 ST2H231 IYDMI 97 TIRGEGGGTSYADSVKG 115 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM210 ST2H318 DDAMI 99 YIGGNGGTTYYADSVKG 116 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM211 ST2H316 GYAMI 100 YIEGEGGETYYADSVKG 117 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM212 ST2H314 VYDMI 101 TIRGEGGGTYYADSVKG 118 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM213 ST2H202 FYDMI 102 TIRGEGGDTNYADSVKG 120 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM214 ST2H179 SYDMF 103 DIKGEGGRTAYADSVKG 121 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM215 ST2H172 SYDMF 103 AIAGEGGRTYYADSVKG 122 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM216 ST2H173 SYDMF 103 DIKGEGGATNYADSVKG 123 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM217 ST2H163 VYDMF 104 DIKGEGGETSYADSVKG 124 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM218 ST2H162 VDSMF 105 SIEGNGGATYYADSVKG 125 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM219 ST2H139 GYDMF 106 DIGGEGGSTNYADSVKG 126 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM220 ST2H137 FYDMF 95 DIRGEGGGTAYADSVKG 127 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM221 ST2H136 IYDMF 107 YIRGEGGDTNYADSVKG 128 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM222 ST2H129 IYSMF 108 DIGGEGGGTSYADSVKG 129 DPWSTEGSFFVLDY 84

Фиг. 10

Название mAb/Fab Название LCDR 1 LCDR2 LCDR3 VL Последовательность SEQIDNO: Последовательность SEQIDNO: Последовательность SEQIDNO: ST2F6 ST2L24 RASQSVDDALA 87 DASNRAT 90 QQFYNWPLT 92 ST2F14 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131 ST2F17 ST2L35 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIDAPLT 132 ST2F31 ST2L49 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYNDAIT 133 ST2F41 ST2L59 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYITAPLT 134 STLM103 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131 STLM107 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131 STLM108 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131 STLM123 ST2L59 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYITAPLT 134 STLM124 ST2L59 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYITAPLT 134 STLM206 ST2L59 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYITAPLT 134 STLM207 ST2L59 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYITAPLT 134 STLM208 ST2L59 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYITAPLT 134 STLM209 ST2L59 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYITAPLT 134 STLM210 ST2L49 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYNDAIT 133 STLM211 ST2L49 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYNDAIT 133 STLM212 ST2L49 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYNDAIT 133 STLM213 ST2L35 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIDAPLT 132 STLM214 ST2L35 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIDAPLT 132 STLM215 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131 STLM216 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131 STLM217 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131 STLM218 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131 STLM219 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131 STLM220 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131 STLM221 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131 STLM222 ST2L32 RASQSVDDDLA 130 DASNRAT 90 QQYIGAPIT 131

Фиг. 11

Название mAb/Fab Название VH Название VL H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 SEQ ID NO: Последовательность SEQ ID NO: Последовательность SEQ ID NO: STLM208 ST2H257 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DPWSTEGSFFVLDY 84 STLM352 STLH255 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 APWSTEGSFFVLDY 165 STLM351 STLH256 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 RPWSTEGSFFVLDY 166 STLM350 STLH257 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 NPWSTEGSFFVLDY 167 STLM349 STLH258 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 QPWSTEGSFFVLDY 168 STLM348 STLH259 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 EPWSTEGSFFVLDY 169 STLM347 STLH260 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 IPWSTEGSFFVLDY 170 STLM346 STLH261 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 HPWSTEGSFFVLDY 171 STLM345 STLH262 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 SPWSTEGSFFVLDY 172 STLM344 STLH263 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 TPWSTEGSFFVLDY 173 STLM343 STLH264 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 YPWSTEGSFFVLDY 174 STLM342 STLH265 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DAWSTEGSFFVLDY 175 STLM341 STLH266 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DHWSTEGSFFVLDY 176 STLM340 STLH267 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DYWSTEGSFFVLDY 177 STLM339 STLH268 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DEWSTEGSFFVLDY 178 STLM338 STLH269 5T2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DQWSTEGSFFVLDY 179 STLM337 STLH270 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DLWSTEGSFFVLDY 180 STLM336 STLH271 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DSWSTEGSFFVLDY 181 STLM335 STLH272 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DNWSTEGSFFVLDY 182 STLM334 STLH273 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DTWSTEGSFFVLDY 183 STLM333 STLH274 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DVWSTEGSFFVLDY 184 STLM332 STLH275 ST2L59 IYDMI 97 SIRGEGGGTYYADSVKG 114 DIWSTEGSFFVLDY 185

Фиг. 12

146 031047

mAb VHID Последовательность SEQIDNO: STLM1O3 ST2H112 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYDMFWVRQAPGKGLEWVSSIRGEGGRTDYAD 3VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 205 STLM1O7 ST2H52 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMFWVRQAPGKGLEWVSAIEGEGGETNYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPVv’STEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 186 STLM108 ST2H50 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYDMIWVRQAPGKGLEWVSTIKGEGGGTYYAD SVKGRFTISRDNSK'NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 187 STLM123 ST2H52 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMFWVRQAPGKGLEWVSAIEGEGGETNYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTZWYYCAiRDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 186 STLM124 ST2H50 EVQLLESGGGLVQPGGSLRL3CAASGFTF3IYDMIWVRQAPGKGLEWV3TIKGEGGGTYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 187 STLM206 ST2H232 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYDMIWVRQAPGKGLEWVSTIRGEGGSTYY.AD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 192 STLM2O7 ST2H228 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMIWVRQAPGKGLEWVSTIRGEGGTTAYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 194 STLM2O8 ST2H257 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYDMIWVRQAPGKGLEWVSSIRGEGGGTYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 191 STLM209 ST2H231 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYDMIWVRQAPGKGLEWVSTIRGEGGGTSYAD 3VKGRFTISRDN3KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 193 STLM210 ST2H318 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDDAMIWVRQAPGKGLEWVSYIGGNGGTTYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 188 STLM211 ST2H316 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMIWVRQAPGKGLEWVSYIEGEGGETYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 189 STLM212 ST2H314 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF3VYDMIWVRQAPGKGLEWVSTIRGEGGGTYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 190 STLM213 ST2H202 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF3FYDMIWVRQAPGKGLEWVSTIRGEGGDTNYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 195 STLM214 ST2H179 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMFWVRQAPGKGLEWVSDIKGEGGRTAYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 196 STLM215 ST2H172 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMFWVRQAPGKGLEWV3AIAGEGGRTYYAD SVKGRFTISRDN3KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEG3FFVLDYWGQGTLVTVSS 198 STLM216 ST2H173 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMFWVRQAPGKGLEWVSDIKGEGGATNYAD SVKGRFTISRDN3KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 197 STLM217 ST2H163 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYDMFWVRQAPGKGLEWVSDIKGEGGETSYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 199 STLM218 ST2H162 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVDSMFWVRQAPGKGLEWV3S1EGNGGATYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 200 STLM219 ST2H139 EVQLLESGGGLVQPGGSLRL3CAASGFTFSGYDMFWVRQAPGKGLEWVSDIGGEGGSTNYAD SVKGRFTISRDN3KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 201 STLM220 ST2H137 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYDMFWVRQAPGKGLEWVSDIRGEGGGTAYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 202 STLM221 ST2H136 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYDMFWVRQAPGKGLEWVSYIRGEGGDTNYAD SVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAED'rAVYYCARDPWST'EGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 203 STLM222 ST2H129 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMFWVRQAPGKGLEWV3DIGGEGGGTSYAD SVKGRFTISRDN3KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPWSTEGSFFVLDYWGQGTLVTVSS 204

- 147 031047

mAb VH ID Последовательность SEQ ID NO: STLM103 ST2L32 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLTYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIGAPITFGQGTKVEIK 206 STLM107 ST2L32 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIGAPITFGQGTKVEIK 206 STLM108 ST2L32 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIGAPITFGQGTKVEIK 206 STLM123 ST2L59 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLT1SSLEPEDFAVYYCQQYITAPLTFGQGTKVEIK 209 STLM124 ST2L59 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYITAPLTFGQGTKVEIK 209 STLM206 ST2L59 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDPLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSG'TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYITAPLTFGQGTKVEIK 209 STLM207 ST2L59 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYITAPLTFGQGTKVEIK 209 STLM208 ST2L59 ЕТУЬТОЗРАТЬЗЬЗРСЕРАТЬЗСРАЗаЗУЕРРРАКРС'ОКРСаАРРЕЪТУРАЗКР ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYITAPLTFGQGTKVEIK 209 STLM209 ST2L59 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYITAPLTFGQGTKVEIK 209 STLM210 ST2L49 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYNDAITFGQGTKVEIK 208 STLM211 ST2L49 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYNDAITFGQGTKVEIK 208 STLM212 ST2L49 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYNDAITFGQGTKVEIK 208 STLM213 ST2L35 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIDAPLTFGQGTKVEIK 207 STLM214 ST2L35 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIDAPLTFGQGTKVEIK 207 STLM215 ST2L32 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIGAPITFGQGTKVEIK 206 STLM216 ST2L32 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFZWYYCQQYIGAPITFGQGTKVEIK 206 STLM217 ST2L32 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIGAPITFGQGTKVEIK 206 STLM218 ST2L32 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIGAPITFGQGTKVEIK 206 STLM219 ST2L32 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIGAPITFGQGTKVEIK 206 STLM220 ST2L32 E1VLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIGAPITFGQGTKVEIK 206 STLM221 ST2L32 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIGAPITFGQGTKVEIK 206 STLM222 ST2L32 ETVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDDDLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYIGAPITFGQGTKVEIK 206

Фиг. 13A-B

- 148 031047

V_L:

2 3 4 56

123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890 >VL2494 _ETTVTQ_Sp_{ASLSVATGEKVTIRCITNTDIDDVIHWY}QQ_Kp_GEpp_{KLLIgEGNTLRpGV}p_S

Чотиа _______

HFA ----—— >VL2494

Чотиа

HFA

7 8 910

1234567890123456789012345678901234567890123456

RFSSSGYGTDFVFTIENTLSEDVADYYCLQSpNMLTFGAGTKLELK

V_H: 1 2 3 4 5 6 1234567890123456789012345678901234567890123456789012а3456789012345 >VH2494 Чотиа EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASAFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAIGNTEXAPKFQD HFA 78 9 10 11 67 8 9012345 678 9012abc345 6789012345678 90аЫ234567 8 9012 >VH2494 Чотиа KATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCALGDFYAMDYWGQGTSVTVSS

HFA

Фиг. 14

mAb VL.ID VH ID VLSEQID NO: VHSEQID NO: H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 Последовательность SEQ ID NO: Последовательность SEQ ID NO: Последовательность SEQID NO: STLM226 STLL280 STLH201 142 145 DDYMH 24 RIDPAIGNTEYAEKFQG 28 GDFYAMAY 146 STLM227 STLL277 STLH201 140 145 DDYMH 24 RIDPAIGNTEYAEKFQG 28 GDFYAMAY 146 STLM228 STLL276 STLH201 139 145 DDYMH 24 RIDPAIGNTEYAEKFQG 28 GDFYAMAY 146 STLM229 STLL275 STLH201 138 145 DDYMH 24 RIDPAIGNTEYAEKFQG 28 GDFYAMAY 146 STLM230 STLL274 STLH201 137 145 DDYMH 24 RIDPAIGNTEYAEKFQG 28 GDFYAMAY 146 STLM231 STLL273 STLH2O1 136 145 DDYMH 24 RIDPAIGNTEYAEKFQG 28 GDFYAMAY 146 STlM2’2 STLL272 STLH201 135 145 DDYMH 24 RIDPAIGNTEYAEKFQG 28 GDFYAMAY 146

mAb VLID VHID VLSEQID NO: VHSEQID NO: L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3 Последовательность SEQID NO: Последовательность SEQID NO: Последовательность SEQID NO: STLM226 STLL280 STLH201 142 145 ITNTDIDDVIH 36 EGNTLRP 40 LQSDNLLT 147 SI _ VI227 S1LL277 STLH201 140 145 ITNTDIDDVIH 36 EGNTLRP 40 LQSDNMLT 44 STLM228 STLL276 STLH201 139 145 ITNTDIDDVIH 36 EGNTLRP 40 LQSDNMLT 44 STLM229 STLL275 STLH201 138 145 ITNTDIDDVIH 36 EGNTLRP 40 LQSDNMLT 44 STLM230 STLL274 STLH201 137 145 ITNTDIDDVIH 36 EGNTLRP 40 LQSDNMLT 44 STLM231 STLL273 STLH2O1 136 145 ITNTDIDDVIH 36 EGNTLRP 40 LQSDNMLT 44 STLM232 STLL272 STLH201 135 145 ITNTDIDDVIH 36 EGNTLRP 40 LQSDNMLT 44

Фиг. 15

1000000-1

100000100001000

ED

100

10V--r—1--—-j—--T—·-Г—--r rub Л Дх Дх Дх Д* о*

А/> А '

149 031047

Статистическая достоверность по однофакторному дисперсионному анализу

Фиг. 16A-D мг/кг CNTO5516 + L-33

0,02 мг/кг CNTO3914 +IL-33

0.06 мг/кг CNTO3914 + IL-33

0,2 МГ/КГ CNTO3914 + IL-33 мг/кг CNTO3914 + IL-33

- 150 031047

Логарифмический показатель [конкурент (нМ)]

Фиг. 17A-B

100

230

240

250

260

270

280

290

300

201 210 220

AQNEIKEVEI GKNANLTCSACFGKGTQFLAAVLWQLNGTKI TDFGEPRI QQEEGQNQSFSNGLACLDMVLRIADVKEEDLLLQYDCLALNLHGLRRHTVRL

EZZZ1 EZZZZZZZZZZZZZZ1 EZZZZZZZZJ ΕΞΣΞΖΞΞ3 ΕΖΖΞΞΖΞΞΖΖ1

302 310

SRKNPSKECF

ИИ· Много Η/D обмена при защите антителом Мало Η/D обмена при защите антителом

I I Без защиты

Фиг. 18

- 151 031047

Вариант ST2L Антитело STLB206 (STLM208) STLB252 касс кдисс Кдисс касс кдисс Кдисс 1/Мс 1/с пмоль 1/Мс 1/с ПМОЛЬ Дикий тип 1Д4Е+07 1Д2Е-04 10,8 8,85Е+06 1,22Е-04 13,8 _1sakf₂₀->teg 1,30Е+07 2Д9Е-04 19,3 8,34Е+06 1,93Е-04 23,2 !<₅₅Е 1Д6Е+07 1Д9Е-04 10 1,07Е+07 1,26Е-04 11,8 EeiK 1,55Е+07 1Д6Е-04 8,1 1,56Е+07 1Д1Е-04 7,8 ₆₉gql₇₁->rdr 1,02Е+07 9Д7Е-05 9,6 8,06Е+06 9,36Е-05 11,6 a₇₈r 1,24Е+07 1,ЗОЕ-04 10,4 1,08Е+07 1,23Е-04 11,4 а₈₀е 1Д5Е+07 1Д7Е-04 11 1ДЗЕ+07 1,39Е-04 12,4 93TF94—>NL 1Д7Е+07 6Д5Е-04 49,5 1,07Е+07 5,22Е-04 48,9 iosGSDuq—>PPS 1Д8Е+07 1Д9Е-04 10 8,99Е+06 1Д7Е-04 13

Фиг. 19

- 152 031047

Фиг. 20A-20D