EA010979B1 - Стабилизированные жидкие препаративные формы интерферона - Google Patents

Abstract

Описана стабилизированная, свободная от HSA жидкая фармацевтическая композиция, которая включает интерферон (IFN), где указанная препаративная форма представляет собой раствор, который включает буфер, аминокислоту и антиоксидант. Предпочтительно интерферон представляет собой человеческий рекомбинантный IFN-β.

Description

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к свободным от Н8А (человеческого сывороточного альбумина) фармацевтическим композициям, содержащим интерферон, конкретнее, к препаративным формам интерферона-β, включающим буфер, аминокислоту и антиоксидант.

Описание предшествующего уровня техники

Интерфероны представляют собой цитокины, т.е. растворимые белки, которые передают информацию между клетками и играют существенную роль в иммунной системе, содействуя разрушению микроорганизмов, которые вызывают инфекцию, и восстанавливая любое возникающее в результате этого повреждения. Интерфероны естественно секретируются инфицированными клетками и впервые были идентифицированы в 1957 г. Их название происходит из того обстоятельства, что они «вмешиваются» (ш!ег1еге) в вирусную репликацию и продукцию.

Интерфероны проявляют как противовирусную, так и антипролиферативную активность. На основании биохимических и иммунологических свойств естественно встречающиеся человеческие интерфероны группируются в 3 основных класса: интерферон-α (лейкоцит), интерферон-β (фибробласт) и интерферон-γ (иммунный). α-интерферон в настоящее время разрешен в США и других странах для лечения лейкозного ретикулоэндотелиоза, венерических бородавок, саркомы Капоши (рака, обычно поражающего пациентов, страдающих синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД)) и хронического не-А, не-В гепатита.

Интерфероны (ΙΕΝ) представляют собой гликопротеины, вырабатываемые организмом в ответ на вирусную инфекцию. Они ингибируют размножение вирусов в защищенных клетках. ΙΕΝ состоят из белка с низкой молекулярной массой, они крайне неспецифичны в своем действии, т.е. ΙΕΝ, индуцированный одним вирусом, эффективен против широкого диапазона других вирусов. Однако они являются видоспецифичными, т.е. ΙΕΝ, продуцируемый одним видом, будет только стимулировать противовирусную активность в клетках того же или близкородственного вида. ΙΕΝ представляли собой первую группу цитокинов, подлежащих использованию, ввиду их возможной противоопухолевой и противовирусной активности.

Три основных ΙΕΝ именуются ΙΕΝ-α, ΙΕΝ-β и ΙΕΝ-γ. Такие основные виды ΙΕΝ первоначально классифицировались в соответствии с клетками их происхождения (лейкоцит, фибробласт или Т-клетка). Однако стало ясно, что несколько типов могут продуцироваться одной клеткой. Следовательно, лейкоцитарный ΙΝΕ теперь называется ΙΕΝ-α, фибробластный ΙΕΝ представляет собой ΙΕΝ-β и Т-клеточный ΙΕΝ представляет собой ΙΕΝ-γ. Существует также четвертый тип ΙΕΝ, лимфобластоидный ΙΕΝ, продуцируемый в линии клеток Ν;·ιιη;·ι1\ν;·Γ (полученной из лимфомы Буркитта), которые, как представляется, продуцируют смесь лейкоцитарного и фибробластного ΙΕΝ.

Сообщалось об интерфероновой единице или международной единице интерферона (ЕД или МЕ, для международной единицы) как о показателе активности ΙΕΝ, определенной как количество, необходимое для защиты 50% клеток против вирусного повреждения. Анализ, который можно использовать для измерения биологической активности, представляет собой анализ ингибирования цитопатического эффекта, как описано в публикации (ВиЫпйеш, е! а1., 1981; Εат^11еΐί^, Р.С, е! а1., 1981). При этом противовирусном анализе для интерферона примерно 1 единица/мл интерферона представляет собой количество, необходимое для продукции цитопатического эффекта 50%. Единицы определяются в отношении международного эталонного стандарта для человеческого ΙΕΝ-β, предоставленного Национальными Институтами Здоровья (Рейка, 8. 1986).

Каждый класс ΙΕΝ содержит несколько определенных типов. Каждый из ΙΕΝ-β и ΙΕΝ-γ представляет собой продукт одного гена.

Белки, классифицированные как ΙΕΝ-α, представляют собой наиболее разнообразную группу, содержащую примерно 15 типов. Имеется кластер генов ΙΕΝ-α на хромосоме 9, содержащей по меньшей мере 23 члена, из которых 15 являются активными и транскрибированными. Зрелые ΙΕΝ-α не гликозилированы.

Все ΙΕΝ-α и ΙΕΝ-β имеют одинаковую длину (165 или 166 аминокислот) с одинаковыми видами биологической активности. ΙΕΝ имеют длину 146 аминокислот и менее близко напоминают α и β. Только ΙΕΝ-γ может активировать макрофаги или индуцировать созревание киллерных Т-клеток. Эти новые типы терапевтических средств могут иногда называться модификаторами биологической реакции (ВКМ), потому что они оказывают эффект на реакции организма на опухоль, воздействуя на распознавание через иммуномодуляцию.

Человеческий фибробластный интерферон (ΙΕΝ-β) обладает противовирусной активностью и может также стимулировать действие натуральных киллерных клеток против неопластических клеток. Он представляет собой полипептид примерно 20000 Да, индуцированный вирусом и двухнитевыми РНК. По нуклеотидной последовательности гена фибробластного интерферона, клонированного технологией рекомбинантной ДНК (Иегупк е! а1., 1980), установлена полная аминокислотная последовательность белка. Он имеет длину 166 аминокислот.

8йерагб е! а1. (1981) описали мутацию в основании 842 (Сук Туг в положении 141), которая уст

- 1 010979 раняла его противовирусную активность, и вариантный клон с делецией нуклеотидов 119-1121.

Магк с1 а1. (1984) провели инсерцию искусственной мутации замещением основания 469 (Т) (А), вызывающей аминокислотное переключение от Сук Бет в положении 17. Сообщалось, что полученный в результате ΙΕΝ-β активен в качестве «нативного» ΙΕΝ-β и устойчив в течение длительного хранения (-70°С).

К.еЬ1Г® (Бегопо - рекомбинантный человеческий интерферон-β), самая последняя разработка в терапии интерфероном по поводу рассеянного склероза (МБ), представляет собой (ΙΕΝ)-β-Λ, продуцируемый из клеточных линий млекопитающих. Его рекомендуемым международным не патентованным названием (ΙΝΝ) является «интерферон-в-1а».

Как и для всех фармацевтических средств на белковой основе одним основным препятствием, которое необходимо преодолеть при использовании ΙΕΝ-β в качестве терапевтического средства, является потеря возможности фармацевтического использования, которая может возникнуть в результате его неустойчивости в фармацевтических препаративных формах.

Физическая неустойчивость, которая угрожает активности полипептида и эффективности в фармацевтических препаративных формах, включает денатурацию и образование растворимых и нерастворимых агрегатов, в то время как химическая неустойчивость включает гидролиз, образование имида, окисление, рацемизацию и деаминирование. Известно, что некоторые из этих изменений ведут к потере или снижению фармацевтической активности интересующего белка. В других случаях, точные эффекты этих изменений неизвестны, но полученные продукты разрушения еще считаются фармацевтически неприемлемыми ввиду возможных нежелательных побочных эффектов.

Стабилизация полипептидов в фармацевтических композициях остается областью, в которой пробы и ошибки играют основную роль (обзор ^апд (1999) Ιηΐ. 1. Рйагга. 185: 129-188; \Уапд апб Напкоп (1988) 1. Ратеп1ета1 Бс1. Теей. 42: Б3-Б26). Эксципиенты, которые добавляются к полипептидным фармацевтическим препаративным формам для увеличения их устойчивости, включают буферы, сахара, поверхностноактивные вещества, аминокислоты, полиэтиленгликоли и полимеры, но стабилизирующие эффекты этих химических добавок варьируются в зависимости от белка.

В иБ 2002/0172661 описаны препаративные формы ΙΕΝ-β, которые характеризуются их низкой ионной силой и рН примерно 3,0-5,0.

В современных препаративных формах ΙΕΝ-β используется НБА в виде усиливающего растворимость агента для ΙΕΝ-β. Однако применение НБА имеет некоторые недостатки. НБА представляет собой продукт человеческой крови, и поэтому его нужно получать у людей. Хотя предприняты шаги для снижения риска, применение продуктов человеческой крови, таких как НБА, несет с собой возможное внесение человеческих вирусов, таких как ВИЧ и НСУ (вирус гепатита В).

Следовательно, существует необходимость в дополнительных фармацевтических композициях ΙΕΝβ, включающих физиологически совместимые стабилизаторы, которые улучшают растворимость этого белка и стабилизируют белок против формирования агрегатов, посредством этого повышая возможность фармацевтического использования.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к стабилизированным фармацевтическим композициям, которые включают интерферон (ΙΕΝ), и к способам их получения. Эти композиции получают при отсутствии человеческого сывороточного альбумина (НБА). Такие композиции именуются как «свободные от НБА». Свободные от НБА фармацевтические композиции ΙΕΝ включают интерферон (ΙΕΝ) или его изоформу, мутеин, гибридный белок, функциональное производное, активную фракцию или соль, где указанная композиция представляет собой раствор, который включает буфер, аминокислоту и антиоксидант.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, композиции также включают бактериостатический агент.

Используемые термины «интерферон» или «ΙΕΝ» предназначены для включения любой молекулы, определенной так в литературе, включающей, например, любые типы ΙΕΝ, указанные в приведенном выше разделе «Описание предшествующего уровня техники». В частности, в приведенное выше определение включены ΙΕΝ-α, ΙΕΝ-β и ΙΕΝ-γ. ΙΕΝ-β представляет собой предпочтительный ΙΕΝ, в соответствии с настоящим изобретением. ΙΕΝ-β, подходящий в соответствии с настоящим изобретением, имеется в продаже, например, в виде ВеЫГ® (Бегопо), Ауопех® (Вюдеп) или Ве1аГетоп® (Бсйеппд). Применение интерферонов человеческого происхождения также предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением. Используемый термин «интерферон» предназначен для охвата его изоформы, мутеина, гибридного белка, функционального производного, активной фракции или соли.

Используемый термин «интерферон-β (ΙΕΝ-бета или ΙΕΝ-β)» предназначен для включения фибробластного интерферона, в частности, человеческого происхождения, полученного выделением из биологических жидкостей или полученного методиками рекомбинантной ДНК из прокариоцитной или эукариоцитной клеток-хозяев, а также его солей, функциональных производных, вариантов, аналогов и активных фрагментов. Предпочтительно ΙΕΝ-β предназначен для обозначения интерферона β-1η.

Используемый термин «мутеины» относится к аналогам ΙΕΝ, в которых один или более аминокис

- 2 010979 лотных остатков натурального ΙΡΝ замещены различными аминокислотными остатками или подвергнуты делеции, или один или более аминокислотных остатков добавлены к натуральной последовательности ΙΡΝ без существенного изменения активности полученных продуктов по сравнению с ΙΡΝ дикого типа. Эти мутеины получают известным синтезом и/или методиками направленного сайта мутагенеза или любой другой известной методикой, подходящей для этого. Предпочтительные мутеины включают, например, мутеины, описанные ЗНерагб с1 а1. (1981) или Магк с1 а1. (1984).

Любой такой мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, достаточно дупликативную в отношении аминокислотной последовательности ΙΡΝ, с тем, чтобы иметь, по существу, такую же или даже лучшую активность, чем ΙΡΝ. Биологическая функция интерферона хорошо известна специалисту в данной области, а биологические стандарты установлены и имеются, например, на сайте Νηΐίοηηΐ 1и81йи1е ίοτ Βίοίοβίοηΐ §1аибатб8 аиб Сои1то1 (Ы1р://1ттиио1оду.огд/11пк8/МВ§С).

Были описаны биологические количественные анализы для определения активности ΙΡΝ. Анализ ΙΡΝ можно, например, проводить, как описано К.иЫи81еш е1 а1., 1981. Так, посредством обычного экспериментирования можно определить, имеет ли любой данный мутеин, по существу, такую же или даже лучшую активность, чем ΙΡΝ.

Мутеины ΙΡΝ, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, или кодирующие их нуклеиновые кислоты включают конечный набор, по существу, соответствующих последовательностей, как у замещающих пептидов или полинуклеотидов, которые может получить обычным способом специалист в данной области без ненужного экспериментирования на основании положений и представленного руководства.

Предпочтительные изменения для мутеинов в соответствии с настоящим изобретением представляют собой те, которые известны как «консервативные» замещения. Консервативные аминокислотные замещения полипептидов или белков по изобретению могут включать синонимные аминокислоты в пределах группы, которые имеют достаточно аналогичные физико-химические свойства, так что замещение между членами группы сохранит биологическую функцию молекулы. Ясно, что инсерции и делеции аминокислот можно также производить в определенных выше последовательностях без изменения их функции, особенно если инсерции или делеции только включают несколько аминокислот, например менее 30, а предпочтительно менее 10, и не удаляют или не замещают аминокислоты, которые имеют решающее значение для функциональной конформации, например цистеиновые остатки. Белки и мутеины, продуцируемые такими делециями и/или инсерциями, входят в сферу действия настоящего изобретения.

Предпочтительно синонимическими аминокислотными группами являются аминокислотные группы, определенные в табл. 1. Предпочтительнее синонимическими аминокислотными группами являются аминокислотные группы, определенные в табл. 2; а наиболее предпочтительно синонимическими аминокислотными группами являются аминокислотные группы, определенные в табл. 3.

Таблица 1 Предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота Синонимическая группа

бег	Зег,	ТЬг,	<31у, Азп
Агд	Агд,	С1п,	Ьуз,	О1и,	ΗΪΒ
Ьеи	Не,	РЬе,	Туг,	МеС,	Уа1,	Ьеи
Рго	С1У,	А1а,	ТЬг,	Рго
ТЬг	Рго,	Зег,	А1а, О1у,	ΗΪ8,	С1п, ТЬг
А1а	<31у,	ТЬг,	Рго, А1а
Уа1	МеС,	туг.	РЬе,	11е,	Ьеи,	Уа1

- 3 010979

С1у	А1а, ТЬг,	Рго,	Зег, С1у
Не	Меб, Туг,	РЬе,	Уа1, Ьеи,	11е
РЬе	Тгр, Меб,	туг.	11е, Уа1,	Ьеи,	РЬе
Туг	Тгр, Меб,	РЬе,	11е, νβΐ,	Ьеи,	Туг
Суз	Зег, ТЬг,	Суз
Н13	<31и, Ьуз,	(31п,	ТЬг, Агд,	ΗΪ3
<31п	О1и, Ьуз,	Азп,	ΗΪ8, ТЬг,	Агд,	(31п
Азп	<31п, Азр,	Зег,	Азп
Ьуз	О1и, (31п,	ΗΪ3,	Агд, Ьуз
Азр	С1и, Авп,	Азр
61и	Азр, Ьуз,	Азп,	С1П, ΗΪ3,	Агд,	С1и
МеС	РЬе, 11е,	Уа1,	Ьеи, Меб

Тгр Тгр

Таблица 2

Более предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота Синонимическая группа

Зег	Зег
Агд	Н1з, Ьуз, Агд
Ьеи	Ьеи, 11е, РЬе, Меб
Рго	А1а, Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	Рго, А1а
Уа1	Уа1, Меб, 11е
<31у	С1у
11е	11е, Меб, РЬе, Уа1, Ьеи
РЬе	Меб, Туг, 11е, Ьеи, РЬе
Туг	РЬе, Туг
Суз	Суз, Зег
ΗΪ3	ΗΪ3, О1п, Агд
С1п	<31и, О1п, Шз
Азп	Азр, Азп
Ьуз	Ьуз, Агд
Азр	Азр, Азп
<31и	С1и, С1п
Меб	Меб, РЬе, 11е, Уа1, Ьеи
Тгр	Тгр

- 4 010979

Таблица 3

Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота	Синонимическая группа
Зег	Зег
Агд	Агд
Ьеи	Ьеи,	11е,	Мес
Рго	Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	А1а
Уа1	УаЬ
С1у	61у
Не	Не,	МеС,	Ьеи
РЬе	РЬе
Туг	Туг
Суз	Суз,	Зег
ΗΪΞ	ΗΪ3
С1п	Й1п
АЗП	Азп
Ьуз	Ьуз
Азр	Азр
О1и	О1и
Мес	Мес,	Не,	Ьеи
Тгр	МеС

Примеры продукции аминокислотных замещений в белках, которые можно использовать для получения мутеинов ΙΤΝ, для применения в настоящем изобретении, включают любые этапы известного способа, такие как представленные в патентах США №№ 4959314, 4588585 и 4737462, Магк е! а1.; № 5116943, Ко!йк е! а1., № 4965195, Nатеη е! а1.; № 4879111, Сйоид е! а1. и № 5017691, Ьее е! а1.; и замещенные лизином белки, представленные в патенте США № 4904584 (§йате е! а1.). Определенные мутеины ΙΤΝ-β были описаны, например, Магк е! а1., 1984.

Термин «слитый белок» относится к полипептиду, включающему ΙΤΝ, или к его мутеину, слитому с другим белком, который, например, имеет продолжительное время нахождения в биологических жидкостях. Таким образом, ΙΤΝ может быть слит с другим белком, полипептидом или им подобным, например иммуноглобулином или его фрагментом.

Используемый термин «функциональные производные» охватывает производные ΙΤΝ и их мутеины и слитые белки, которые можно получить из функциональных групп, которые встречаются в виде боковых цепей на остатках или Ν- или С-концевых группах, средством, известным в данной области, и они включены в изобретение, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не разрушают активность белка, которая, по существу, аналогична активности ΙΤΝ, и не придают токсичные свойства композициям, содержащим его. Эти производные могут, например, включать боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут маскировать антигенные сайты и продлевать нахождение ΙΤΝ в биологических жидкостях. Другие производные включают сложные алифатические эфиры карбоксильных групп, амидов карбоксильных групп взаимодействием с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованных с ацильными частями (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами) или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, гидроксильных групп серильных или треонильных остатков), образованных с ацильными частями.

В качестве «активных фракций» ΙΡΝ или мутеинов и гибридных белков, настоящее изобретение охватывает любой фрагмент или предшественников полипептидной цепи белковой молекулы отдельно или вместе с ассоциированными молекулами или остатками, связанными с ней, например сахарными или фосфатными остатками, или агрегатами самих белковой молекулы или сахарных остатков, при условии, что указанная фракция значимо не снизила активность по сравнению с соответствующим ΙΡΝ.

Используемый термин «соли» относится и к солям карбоксильных групп, и к кислотно-аддитивным солям аминогрупп описанных выше белков или их аналогов. Соли карбоксильной группы могут образовываться средствами, известными в данной области, и включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, трехвалетного железа или цинка и им подобные, и соли с органическими основаниями, как соли, образованные, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и им подобные. Кислотные аддитивные соли включают, например, соли с неор

- 5 010979 ганическими кислотами, такими как, например, хлористо-водородная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Конечно, любая такая соль должна сохранять биологическую активность белков (ΙΡΝ), относящуюся к настоящему изобретению, т.е. способность связываться с соответствующим рецептором и инициировать передачу сигналов рецепторами.

В соответствии с настоящим изобретением, кроме того, особенно предпочтительно применение рекомбинантного человеческого ΙΡΝ-β и соединений по изобретению.

Недавно был описан определенный вид варианта интерферона. Так называемые «консенсусные интерфероны» представляют собой не натурально встречающиеся варианты ΙΡΝ (патент США № 6013253). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения соединения по изобретению применяются в комбинации с консенсусным интерфероном.

Используемый термин «консенсус человеческого интерферона» (ΙΡΝ-сои) должен означать не натурально встречающийся полипептид, который преимущественно включает те аминокислотные остатки, которые являются общими для подтипа ΙΡΝ-α, репрезентативного для большинства последовательностей натурально встречающегося подтипа человеческого лейкоцитарного интерферона, и который включает, в одном или более из этих положений, где нет аминокислоты, общей для всех подтипа, аминокислоту, которая преимущественно встречается в этом положении, и ни в коем случае не включает любой амино кислотный остаток, который не существует в этом положении, по меньшей мере, у одного натурально встречающегося подтипа. ΙΡΝ-соп охватывает, но не ограничивается этим, аминокислотные последовательности, обозначенные ШЫ-соп1, ШЫ-соп2 и ΙΡΝ-сопЗ, которые раскрыты в патентах США №№ 4695623, 4897471 и 5541293. Последовательности ДНК, кодирующие ΙΡΝ-соп, можно получить, как описано в указанных выше патентах, или другими стандартными способами.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления гибридный белок включает слияние Ιβ. Слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид, который может иметь столь маленькую длину, как 1-3 аминокислотных остатка, или иметь длину, например, 13 аминокислотных остатков. Указанный линкер может представлять собой трипептид последовательности, например, Ε-Ρ-М (С1и-Р11с-Мс1). или последовательность линкера из 13 аминокислот, включающую С1и-Рйе-С1у-А1а-С1уЕеи-Уа1-Ееи-С1у-С1у-С1п-Рйе-Ме!, введенную между последовательностью ΙΡΝ и последовательностью иммуноглобулина. Полученный гибридный белок может иметь улучшенные свойства, такие как продленное пребывание в биологических жидкостях (период полувыведения), увеличенная удельная активность, повышенный уровень экспрессии, или облегчается очистка гибридного белка.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ΙΡΝ слит с константной областью молекулы Ι§. Предпочтительно, он слит с областями тяжелой цепи, подобными доменам СН2 и СН3, например человеческого ЦС]. Другие изоформы молекул Ιβ также подходят для создания гибридных белков в соответствии с настоящим изобретением, таких как изоформы ЦС^ ЦС-, или ΙβΟ-ι, или другие классы Ι§, подобные, например, ЦМ или Ι§Α. Гибридные белки могут быть мономерными или многомерными, гетеро- или гомомногомерными.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления функциональное производное включает по меньшей мере одну часть, присоединенную к одной или более функциональным группам, которые встречаются в виде одной или более боковых цепей на аминокислотных остатках. Предпочтительно часть представляет собой полиэтиленовую (РЕС, полиэтиленгликолевую) часть. Пэгилирование можно проводить известными способами, такими как способы, описанные, например, в νθ 99/55377.

Дозировка, введенная индивидууму в виде одной или множественных доз, будет варьироваться в зависимости от различных векторов, включая фармакокинетические свойства, путь введения, состояния и характеристики пациента (пол, возраст, масса тела, здоровье, рост), степени симптомов, сопутствующих способов лечения, частоты лечения и желательного эффекта.

Дозировка ΙΡΝ-β при лечении рецидивирующего, ремитирующего М8 в соответствии с изобретением зависит от типа используемого ΙΡΝ-β.

В соответствии с настоящим изобретением, где ΙΡΝ представляет собой рекомбинантный ΙΡΝ-β-16, продуцируемый в Е. со11, имеется в продаже под торговым названием Ве!а§етоп®, его можно предпочтительно вводить подкожно через день в дозировке примерно от 250 до 300 мкг или от 8 до 9,6 МЕ на человека.

В соответствии с настоящим изобретением, где ΙΡΝ представляет собой рекомбинантный ΙΗΝ-β-Ετ продуцируемый клетками яичников китайских хомячков (клетки СНО), имеющихся в продаже под торговым названием Ауопех®, его можно предпочтительно вводить внутримышечно 1 раз/нед. в дозировке от приблизительно 30 до 33 мкг или от 6 до 6,6 МЕ на человека.

В соответствии с настоящим изобретением, когда ΙΡΝ представляет собой рекомбинантный ΙΡΝ-β1а, продуцируемый клетками яичников китайских хомячков (клетки СНО), имеющихся в продаже под торговым названием ВеЬй®, его можно предпочтительно вводить подкожно 3 раза/нед. (ΤΙν) в дозировке от 22 до 44 мкг или от 6 до 12 МЕ на человека.

Введение активных ингредиентов в соответствии с настоящим изобретением может осуществляться

- 6 010979 внутривенным, внутримышечным или подкожным путем. Предпочтительным путем введения ΙΕΝ является подкожное введение. Еще одним предпочтительным путем введения является внутримышечное введение, которое может, например, осуществляться 1 раз/нед.

ΙΕΝ можно также вводить ежедневно, или через день, или реже. Предпочтительно ΙΕΝ вводится 1, 2 или 3 раза/нед.

Термин «устойчивость» относится к физической, химической и конформационной устойчивости препаративных форм интерферона по настоящему изобретению (включая поддержание биологической активности). Неустойчивость белковой препаративной формы может быть вызвана химическим разложением или агрегацией молекул белка для образования полимеров высшего порядка, дегликозилирования, модификации гликозилирования, окисления или любой другой структурной модификации, которая снижает по меньшей мере одну биологическую активность полипептида интерферона, включенного в настоящее изобретение.

«Устойчивый» раствор или препаративная форма представляет собой раствор или композицию, в которой степень разложения, модификации, агрегации, потери биологической активности и тому подобное, содержащихся в них белков регулируется приемлемым образом и не увеличивается неприемлемо с течением времени. Предпочтительно препаративная форма удерживается, по меньшей мере, на уровне примерно 60%, предпочтительнее, по меньшей мере, на уровне примерно 70%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на уровне примерно 80% активности меченого интерферона в течение периода от 12 до 24 мес. Стабилизированные лишенные Н8Л композиции ΙΕΝ по изобретению предпочтительно имеют срок хранения по меньшей мере примерно 6, 12, 18 мес., предпочтительнее по меньшей мере 20 мес., еще предпочтительнее по меньшей мере примерно 22 мес., наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 24 мес. при хранении при 2-8°С.

Способы мониторинга устойчивости лишенных НЛ8 фармацевтических композиций ΙΕΝ по изобретению имеются в данной области, включая те способы, которые описаны в раскрытых примерах. Так, образование агрегатов ΙΝΕ во время хранения жидкой фармацевтической композиции по изобретению можно легко определить измерением изменения растворимого ΙΕΝ в растворе с течением времени. Количество растворимого полипептида в растворе можно количественно определить рядом аналитических количественных определений, приспособленных для выявления ΙΕΝ. Такие анализы включают, например, ВЭЖХ в обращенной фазе (ЯР) -НРЬС и УФ абсорбционную спектроскопию, как описано ниже в примерах.

Определения и растворимых, и нерастворимых агрегатов во время хранения в жидких препаративных формах можно достичь, например, с использованием аналитического ультрацентрифугирования, как отмечено ниже в примерах для различения той части растворимого полипептида, которая присутствует в виде растворимых агрегатов, и той части, которая присутствует в не агрегированной, биологически активной молекулярной форме. Кроме того, скорость ультрацентрифугирования способна выявить и не ковалентные, и ковалентные олигомеры и количественно, и качественно. Аналогичным образом, новый способ (8Е)-НРЬС с исключением по размеру (описанный в примерах), именуемый здесь ΝΕν 8ЕС, способен выявить и ковалентные, и не ковалентные олигомеры и количественно, и качественно.

Выражение «многодозовое применение» предназначено для включения применения одного флакона, ампулы или кассеты препаративной формы интерферона для более чем одной инъекции, например 2, 3, 4, 5, 6 или более инъекций. Инъекции предпочтительно производятся в течение периода, по меньшей мере составляющего или примерно 12, 24, 48 ч и т.д., предпочтительно до периода, равного или примерно 12 д. Инъекции могут быть разделены во времени, например, периодом 6, 12, 24, 48 или 72 ч.

Термин «аминокислота» относится к аминокислоте или комбинации аминокислот, где любая данная аминокислота присутствует или в форме его свободного основания, или в форме его соли. Когда используется комбинация аминокислот, все аминокислоты могут присутствовать в их формах свободного основания, все могут присутствовать в их солевых формах или некоторые могут присутствовать в их формах свободного основания, в то время как другие присутствуют в их солевых формах. Предпочтительные аминокислоты для применения в настоящем способе или препаративной форме по настоящему изобретению представляют собой те, которые несут заряженную боковую цепь, именуемые «аминокислота(ы) с заряженной боковой цепью», такие как аргинин, лизин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. Предпочтительнее аминокислота представляет собой лизин. Любой стереоизомер (т.е. Ь-, Όили ОЬ-изомер) определенной аминокислоты или комбинации этих стереоизомеров можно использовать в настоящем способе или препаративной форме по изобретению, пока определенная аминокислота присутствует в ее форме свободного основания или его солевой форме. Предпочтительно используется Ьстереоизомер. Аналоги этих предпочтительных аминокислот можно также использовать в настоящей препаративной форме по изобретению. Термин «аминокислотный аналог» относится к производному натурально встречающейся аминокислоты. Подходящие аналоги аргинина включают, например, аминогуанидин и Ν-моноэтил-Ь-аргинин. Как и предпочтительные аминокислоты, аналоги аминокислот используются в настоящей препаративной форме или в их форме свободного основания, или в их солевой форме. Аминокислоты здесь также именуются стабилизаторами.

Аминоксилота(ы), используемая в настоящей препаративной форме по изобретению, защищает те

- 7 010979 рапевтически активный полипептид против разнообразных стрессов, увеличивая или/и поддерживая посредством этого устойчивость препаративной формы интерферона-β. Используемый термин «стресс» включает, но не ограничивается, нагревание, замораживание, рН, свет, перемешивании, окисление, дегидратацию, сдвиг, замораживание/оттаивание, лиофилизацию, давление, тяжелые металлы, фенольные соединения, денатураты и т.д. Термин «стресс» охватывает любой фактор, который модулирует (т.е. уменьшает, поддерживает или увеличивает) устойчивость препаративной формы, содержащей интерферон-β. Увеличение и/или сохранение устойчивости при добавлении аминокислоты происходит зависимым от концентрации образом. Т.е. увеличение концентраций аминокислоты ведет к увеличенной и/или сохраненной устойчивости препаративной формы, содержащей интерферон-β по настоящему изобретению, когда эта препаративная форма, содержащая интерферон-β, обычно проявляет образование агрегатов или олигомеров в отсутствие аминокислоты. Определение количества определенной аминокислоты, которую предстоит использовать в настоящей препаративной форме по изобретению, для уменьшения образования олигомеров или агрегатов и, посредством этого, увеличения устойчивости мономерного белка, можно легко произвести без ненужного экспериментирования, используя способы, в целом известные специалисту в данной области.

Термин «буфер» или «физиологически приемлемый буфер» относится к растворам соединений, которые, как известно, безопасны для фармацевтического или ветеринарного применения в препаративных формах и которые оказывают эффект поддержания или регулирования рН препаративной формы в диапазоне рН, желательном для препаративной формы. Приемлемые буферы для регулирования рН в пределах от умеренно кислотного рН до умеренно основного рН включают, но не ограничиваются, такие соединения как фосфат, ацетат, цитрат, аргинин, ТК18 и гистидин. ТК18 относится к 2-амино-2гидроксиметил-1,3-пропандиолу и к любой его фармакологически приемлемой соли. Предпочтительными буферами являются ацетатные буферы с солевым раствором или приемлемой солью.

«Агент, придающий изотоничность», представляет собой соединение, которое физиологически переносимо и придает подходящую изотоничность препаративной форме для предотвращения чистого потока воды через клеточные мембраны, которые находятся в контакте с препаративной формой. Соединения, такие как глицерин, обычно используются для таких целей в известных концентрациях. Другие подходящие агенты, придающие изотоничность, включают, но не ограничиваются, маннит, аминокислоты или белки (например, глицин или альбумин), соли (например, хлорид натрия) и сахара (например, декстроза, маннит, сахароза и лактоза).

Термин «антиоксидант» относится к соединению, которое предотвращает взаимодействие кислорода или происходящих из кислорода свободных радикалов с другими веществами. Антиоксиданты находятся среди ряда эксципиентов, обычно добавляемых к фармацевтическим системам, для увеличения физической и химической устойчивости. Антиоксиданты добавляются для минимизации или задержки окислительных процессов, которые происходят с некоторыми препаратами или эксципиентами после контакта с кислородом или в присутствии свободных радикалов. Эти процессы могут часто катализироваться светом, температурой, водородом, концентрацией, присутствием металлических микроэлементов или пероксидов. Сульфиты, бисульфиты, тиомочевина, метионин, соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (БИТА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ) и бутилированный гидроксианизол (ВНА) часто используются в качестве антиоксидантов в препаратах. Было обнаружено, что натрий БИТА усиливает активность антиоксидантов образованием хелатов ионов металлов, которые в противном случае катализировали бы реакцию окисления. Наиболее предпочтительный антиоксидант представляет собой метионин. Антиоксиданты также именуются стабилизаторами.

Метионин может присутствовать или в форме его свободного основания, или в его солевой форме. Любой стереоизомер (т.е. Б-, Ό- или ИБ-изомер) метионина можно использовать в настоящем способе или препаративной форме по изобретению, пока метионин присутствует в форме его свободного основания, или в его солевой форме. Предпочтительно используется Б-стереоизомер. Аналоги метионина можно также использовать в настоящей препаративной форме по изобретению. Термин «аналог метионина» относится к производному натурально встречающегося метионина. Аналоги метионина также можно использовать в настоящей препаративной форме, или в форме его свободного основания, или в его солевой форме.

Повышение и/или сохранение устойчивости при добавлении антиоксидантов (например, метионина) происходит зависимым от концентрации образом. То есть увеличение концентрации антиоксидантов ведет к повышенной и/или сохраненной устойчивости препаративной формы, содержащей интерферон-β по настоящему изобретению, когда эта препаративная форма, содержащая интерферон-β, обычно проявляет окисление или образование агрегатов/олигомеров в отсутствие антиоксиданта. Определение количества антиоксиданта (например, метионина), который предстоит использовать в настоящей препаративной форме по изобретению, для уменьшения окисления или образования олигомеров/агрегатов, можно легко определить без ненужного экспериментирования с использованием способов, в целом известных специалисту в данной области.

Термин «бактериостатическое» относится к соединению или композициям, добавляемым к препа

- 8 010979 ративной форме, для действия в качестве антибактериального средства. Примеры бактериостатических средств включают фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил, этил, пропил, бутил и им подобные), бензалконийхлорид, бензетонийхлорид, дегидроацетат натрия и тимеросал.

Предпочтительно бактериостатическое средство представляет собой бензиловый спирт.

Термин «поверхностно-активное вещество» относится к растворимому соединению, которое снижает поверхностное натяжение жидкостей или снижает межповерхностное натяжение между жидкостями или жидкостью и твердым веществом, причем поверхностное натяжение представляет собой силу, действующую на поверхность жидкости, имея тенденцию минимизировать площадь поверхности. Поверхностно-активные вещества иногда использовались в фармацевтических препаративных формах, включая доставку препаратов с низкой молекулярной массой и полипептиды, для модификации всасывания препарата или его доставки к тканям-мишеням. Хорошо известные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (производные полиоксиэтилена; Тетееп), а также Иигошс.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения было обнаружено, что путем включения в состав интерферона с поверхностно-активным веществом, выбранным из Р1шошс® Е77, Р1игошс Е87, Р1итошс Е88 и Р1шошс® Е68, особенно предпочтительно Р1шошс Е68 (ВА8Г, Р1игошс Е68, также известного как Ро1охатег 188), получается устойчивая препаративная форма, которая минимизирует потерю активного ингредиента, вызванную адсорбцией на поверхности флакончика и/или устройства доставки (например, шприца, насоса, катетера и т.д.). Было обнаружено, что путем включения в состав интерферона с поверхностно-активным веществом, выбранным из Р1итошс® Е77, Р1итошс Е87, Р1итошс Е88 и Р1итошс® Е68, особенно предпочтительно Р1итошс Е68 (ВА8Е, Р1итошс Е68, также известным как Ро1охатег 188), получается устойчивая препаративная форма, которая более устойчива к окислению и к образованию агрегатов белков.

Поверхностно-активные вещества Р1итошс представляют собой блок-сополимеры этиленоксида (ЕО) и пропиленоксида (РО). Блок пропиленоксида (РО) вставляется между двумя блоками этиленоксида (ЕО).

сн₃ но—(СН₂СН₂О)_Х-(СН₂СНО)_У-(СН₂СН₂О)_Х-Н

ЕО

РО

ЕО

Поверхностно-активные вещества Р1итошс синтезируются способом из двух стадий:

1. Гидрофобное вещество с желательной молекулярной массой создается контролируемым добавлением пропиленоксида к двум гидроксильным группам пропиленгликоля; и

2. Этиленоксид добавляется для прослойки гидрофобного вещества между гидрофильными группами.

В Р1игошс® Г77 процентное содержание полиоксиэтилена (гидрофильного вещества) составляет 70%, а молекулярная масса гидрофобного вещества (полиоксипропилена) составляет приблизительно 2306 Да.

В Р1итошс Г87 процентное содержание полиоксиэтилена (гидрофильного вещества) составляет 70%, а молекулярная масса гидрофобного вещества (полиоксипропилена) составляет приблизительно 2644 Да.

В Р1итошс Г88 процентное содержание полиоксиэтилена (гидрофильного вещества) составляет 80%, а молекулярная масса гидрофобного вещества (полиоксипропилена) составляет приблизительно 2644 Да.

В Р1итошс Г68 процентное содержание полиоксиэтилена (гидрофильного вещества) составляет 80%, а молекулярная масса гидрофобного вещества (полиоксипропилена) составляет приблизительно 1967 Да.

Типичные свойства Р1игоп1с Г77 перечислены ниже.

Средняя молекулярная масса: 6600

Точка плавления/температура потери текучести: 48°С

Физическая форма @ 20°С: твердое вещество

Вязкость (ВтоокйеИ), спз: 480 [жидкости при 25°С, пасты при 60°С и твердые вещества при 77°С]

Поверхностное натяжение, дин/см @ 25°С

0,1% концентрация: 47,0

0,01% концентрация: 49,3

0,001% концентрация: 52,8

Межповерхностное натяжение, дин/см @ 25°С в сравнении с М.1)о1

0,1% концентрация: 17,7

0,01% концентрация: 20,8

0,01% концентрация: 25,5

Смачивание Эгауех. секунды 25°С

1,0% концентрация: >360

0,1% концентрация: >360

Высота пены

- 9 010979

Кокк Мйек, 0,1%, мм @ 50°С: 100

Кокк Мйек, 0,1%, мм @ 26°С: 47

Динамика, 0,1%, мм @ 400 мл/мин: >600

Точка помутнения в водном растворе, °С

1% концентрация: >100

10% концентрация: >100

НТВ (гидрофильно-липофильный баланс): 25

Типичные свойства Р1игошс Р87 перечислены ниже.

Средняя молекулярная масса: 7700

Точка плавления/температура потери текучести: 49°С

Физическая форма @ 20°С: твердое вещество

Вязкость (ВгоокПе1б). спз: 780 [жидкости при 25°С, пасты при 60°С и твердые вещества при 77°С]

Поверхностное натяжение, дин/см @ 25°С

0,1% концентрация: 44,0

0,01% концентрация: 47,0

0,001% концентрация: 50,2

Межповерхностное натяжение, дин/см @ 25°С в сравнении с Νυ)ο1

0,1% концентрация: 17,4

0,01% концентрация: 20,3

0,01% концентрация: 23,3

Смачивание Огауек, секунды 25°С

1,0% концентрация: >360

0,1% концентрация: >360

Высота пены

Кокк Мйек, 0,1%, мм @ 50°С: 80

КО88 Мйек, 0,1%, мм @ 26°С: 37

Динамика, 0,1%, мм @ 400 мл/мин: >600

Точка помутнения в водном растворе, °С

1% концентрация: >100

10% концентрация: >100

НЬВ (гидрофильно-липофильный баланс): 24

Типичные свойства Р1игошс Р88 перечислены ниже.

Средняя молекулярная масса: 11400

Точка плавления/температура потери текучести: 54°С

Физическая форма @ 20°С: твердое вещество

Вязкость (ВгоокйеИ), спз: 2300 [жидкости при 25°С, пасты при 60°С и твердые вещества при 77°С]

Поверхностное натяжение, дин/см @ 25°С

0,1% концентрация: 48,5

0,01% концентрация: 52,6

0,001% концентрация: 55,7

Межповерхностное натяжение, дин/см @ 25°С в сравнении с №уо1

0,1% концентрация: 20,5

0,01% концентрация: 23,3

0,01% концентрация: 27,0

Смачивание Эгауек, секунды 25°С

1,0% концентрация: >360

0,1% концентрация: >360

Высота пены

Кокк Мйек, 0,1%, мм @ 50°С: 80

Кокк Мйек, 0,1%, мм @ 26°С: 37

Динамика, 0,1%, мм @ 400 мл/мин: >600

Точка помутнения в водном растворе, °С

1% концентрация: >100

10% концентрация: >100

НЬВ (гидрофильно-липофильный баланс): 28

Типичные свойства Р1игошс Р68 перечислены ниже.

Средняя молекулярная масса: 8400

Точка плавления/температура потери текучести: 52°С

Физическая форма @ 20°С: твердое вещество

Вязкость (ВгоокйеИ), спз: 1000 [жидкости при 25°С, пасты при 60°С и твердые вещества при 77°С]

Поверхностное натяжение, дин/см @ 25°С

0,1% концентрация: 50,3

- 10 010979

0,01% концентрация: 51,2

0,001% концентрация: 53,6

Межповерхностное натяжение, дин/см @ 25°С в сравнении с Νιροί

0,1% концентрация: 19,8

0,01% концентрация: 24,0

0,01% концентрация: 26,0

Смачивание Эгауск. секунды 25°С

1,0% концентрация: >360

0,1% концентрация: >360

Высота пены

ΚΌδδ М11ек, 0,1%, мм @ 50°С: 35

Кокк Мйек, 0,1%, мм @ 2б°С: 40

Динамика, 0,1%, мм @ 400 мл/мин: >600

Точка помутнения в водном растворе, °С

1% концентрация: >100

10% концентрация: >100

НТВ (гидрофильно-липофильный баланс): 29

Другие полимеры, имеющие свойства, аналогичные свойствам, перечисленным выше, можно также использовать в препаративных формах по изобретению. Предпочтительным поверхностно-активным является Р1игоше Е68 и поверхностно-активные вещества, имеющие аналогичные свойства.

Р1цтошс, в частности Р1цтошс Е68, предпочтительно присутствует в концентрации, которая достаточна для поддержания устойчивости интерферона в течение желательного периода хранения (например, 12-24 мес.), а также в концентрации, которая достаточна для предотвращения потерь белка вследствие адсорбции на поверхностях, таких как флакон, ампула или кассета или шприц.

Предпочтительно концентрация Р1игошс, в частности Р1итошс Е68, в жидких препаративных формах составляет от или примерно от 0,01 мг/мл до или примерно до 10 мг/мл, предпочтительнее от или примерно от 0,05 мг/мл до или примерно до 5 мг/мл, предпочтительнее от или примерно от 0,1 мг/мл до или примерно до 2 мг/мл, наиболее предпочтительно на уровне или около 0,5 мг/мл.

Предпочтительно концентрация ΙΗΝ-β-1 а в препаративной форме составляет от или примерно от 10 мкг/мл до или примерно до 800 мкг/мл, предпочтительнее от или примерно от 20 мкг/мл до или примерно до 500 мкг/мл, еще предпочтительнее от или примерно от 30 до или примерно до 300 мкг/мл, наиболее предпочтительно на уровне 22, 44, 88 или 264 мкг/мл.

Предпочтительно препаративные формы по настоящему изобретению имеют рН от или примерно от 3,5 до или примерно до 5,5, предпочтительнее на уровне или примерно 4,7. Предпочтительным буфером является ацетат, причем предпочтительными противоионами являются ионы натрия или калия. Ацетатные солевые буферы хорошо известны в данной области. Концентрации буфера во всем растворе могут варьироваться на уровне или примерно 5, 9,5, 10, 50, 100, 150, 200, 250 и 500 мМ. Предпочтительно концентрация буфера находится на уровне или примерно 10 мМ в ацетатных ионах при рН 4,7±0,2.

Предпочтительно в композиции по изобретению антиоксидант, например метионин, присутствует в концентрации от или примерно от 0,01 до или примерно до 5,0 мг/мл, предпочтительнее от или примерно от 0,05 до или примерно до 0,3 мг/мл, наиболее предпочтительно на уровне или примерно 0,12 мг/мл.

Предпочтительно в композиции по изобретению антиоксидант, аминокислота, например лизин, присутствует в концентрации от или примерно от 1 до или примерно до 100 мг/мл, предпочтительнее от или примерно от 10 до или примерно до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно на уровне или примерно 27,3 мг/мл.

Изобретение включает жидкие препаративные формы. Предпочтительным растворителем является вода для инъекций.

Жидкие препаративные формы могут быть однодозовыми или многодозовыми. Те жидкие препаративные формы интерферона по изобретению, которые предназначены для многодозового применения, предпочтительно включают бактериостатическое средство, такое как фенол, м-крезол, п-крезол, окрезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил, этил, пропил, бутил и им подобные), бензалконийхлорид, бензетонийхлорид, дегидроацетат натрия и тимеросал. Особенно предпочтительными являются фенол, бензиловый спирт или м-крезол, более предпочтителен бензиловый спирт.

Бактериостатическое средство используется в количестве, которое даст концентрацию, которая эффективна для поддержания препаративной формы, по существу, свободной от бактерий (подходящей для инъекций) в течение периода инъекций множественных доз, который может составлять от или примерно от 12 или 24 ч до или примерно до 12 дней, предпочтительно от или примерно от 6 до или примерно до 12 дней. Бактериостатическое средство предпочтительно присутствует в концентрации от или примерно от 0,1% (масса бактериостатического средства/масса растворителя) до или примерно до 2,0%, предпочтительнее от или примерно от 0,2% до или примерно до 1,0%. В случае бензилового спирта особенно предпочтительными являются концентрации 0,2 или 0,3%).

- 11 010979

Однако использование консерванта, например бензилового спирта, не ограничивается многодозовыми препаративными формами, но его можно также добавлять в однодозовые препаративные формы. Один вариант осуществления настоящего изобретения состоит в однодозовых препаративных формах, содержащих бензиловый спирт.

В еще одном варианте осуществления препаративных форм в соответствии с настоящим изобретением, интерферон-β представлен по меньшей мере примерно на 96% или по меньшей мере примерно на 98% в его мономерной форме (менее чем 4, предпочтительнее менее чем 2% агрегатов) при комнатной температуре или при 2-8°С, по данным измерения описанным ниже анализом скорости осаждения.

Предпочтительная препаративная форма состоит из интерферона-в-1а, бензилового спирта, лизина, метионина, Р1игошс Р-68 и водного ацетатного буфера предпочтительно для доведения рН до 3,7-4,7.

Диапазон интерферона в препаративных формах по изобретению включает количества, дающие после растворения концентрации от или примерно от 1,0 мкг/мл до или примерно до 50 мг/мл, хотя функциональны и более низкие и более высокие концентрации, и они зависят от предполагаемого носителя доставки, например препаративные формы в виде растворов будут отличаться от способов доставки трансдермальной системой, через легкие, через слизистые оболочки или осмотическим или микронасосом. Концентрация интерферона составляет предпочтительно от или примерно от 5,0 мкг/мл до или примерно до 2 мг/мл, предпочтительнее от или примерно от 10 мкг/мл до или примерно до 1 мг/мл, наиболее предпочтительно от или примерно от 30 мкг/мл до или примерно до 100 мкг/мл.

Предпочтительно препаративные формы по изобретению удерживают по меньшей мере или примерно 60%, предпочтительнее по меньшей мере или примерно 70%, наиболее предпочтительно по меньшей мере или примерно 80% активности нтерферона во время упаковки в течение периода 24 мес.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ изготовления жидкой фармацевтической композиции, как описано ранее.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ изготовления упакованной фармацевтической композиции, включающий помещение раствора, включающего активный ингредиент и эксципиенты, как описано ранее.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет изделие изготовления для фармацевтического применения у человека, включающее флакончик, содержащий фармацевтические композиции, как описано выше, и письменный материал, указывающий на то, что такой раствор может храниться в течение периода, составляющего или примерно составляющего 24 ч или более после первого применения. Предпочтительно в письменном материале указано, что раствор можно держать в течение или примерно в течение 12 дней.

После первого применения многодозовой препаративной формы ее можно хранить и использовать в течение по меньшей мере 24 ч или примерно 24 ч, предпочтительно по меньшей мере в течение или примерно в течение 4, 5 или 6 дней, предпочтительнее в течение до 12 дней. После первого применения препаративная форма предпочтительно хранится при температуре ниже комнатной (т.е. ниже или примерно ниже 25°С), предпочтительнее ниже или примерно ниже 10°С, предпочтительнее при или примерно при 2-8°С, наиболее предпочтительно при или примерно при 4-6°С.

Препаративные формы по настоящему изобретению можно получить способом, который включает добавление рассчитанных количеств эксципиентов к забуференному раствору и затем добавление интерферона.

Полученный раствор затем помещают во флакончики, ампулы или кассеты. Специалисту в данной области должны быть понятны возможные изменения этого способа. Например, порядок добавления компонентов, то, используются ли дополнительные добавки, температура и рН, при которых получают препаративную форму, - это все факторы, которые можно оптимизировать для используемой концентрации и средств введения.

В случае препаративной формы многодозового применения бактериостатическое средство можно добавлять к раствору, содержащему активный ингредиент (интерферон) или, альтернативно, ее можно держать в отдельном флакончике или кассете и в последующем смешивать с раствором, содержащим активный ингредиент, в момент применения.

Препаративные формы по изобретению можно вводить, используя признанные устройства. Примеры, включающие эти системы одиночных флакончиков, включают устройства в виде автоинжектора или ручки-инжектора для доставки раствора, такого как ЯсЬцсс! ®.

Заявляемые в настоящее время продукты включают упаковочный материал. Упаковочный материал предоставляет в дополнение к информации, требуемой регуляторными агентствами, условия, в которых можно применять продукт. Упаковочный материал по настоящему изобретению, при необходимости, предоставляет пациенту инструкции по получению конечного раствора и по применению такого конечного раствора в течение периода 24 ч или более для содержащегося в двух флаконах влажного/сухого продукта. Для содержащегося в одном флаконе продукта в виде раствора на этикетке указывается, что такой раствор можно применять в течение периода 24 ч или более. Заявляемые в настоящее время продукты можно использовать для применения в качестве фармацевтического продукта для людей.

- 12 010979

Устойчивые консервированные препаративные формы могут предоставляться пациентам в виде прозрачных растворов. Раствор может быть для однократного применения или его можно использовать повторно множество раз, и его может быть достаточно для одного и множественных циклов лечения пациентов и, таким образом, он обеспечивает более удобную схему лечения, чем имеющиеся в настоящее время растворы препаративных форм.

Интерферон или в устойчивых, или в консервированных препаративных формах или растворах, согласно изобретению, можно вводить пациенту посредством разнообразных способов доставки, включая подкожную или внутримышечную инъекцию; трансдермальную систему, через легкие, через слизистые оболочки, посредством импланта, кассеты, осмотическим насосом или микронасосом, оральное или другое средство доставки, известное специалисту, как хорошо известно в данной области.

Термин «флакон» относится в широком смысле к резервуару, подходящему для удерживания интерферона в твердой или жидкой форме в помещенном в емкость, стерильном состоянии. Примеры флаконов, используемых в настоящем описании, включают ампулы, кассеты, блистерные упаковки или другие такие резервуары, подходящие для доставки интерферона пациенту посредством шприца, насоса (включая осмотический), катетера, трансдермальной системы, аэрозольного распыления через легкие или слизистые оболочки. Флаконы, подходящие для упаковки продуктов для парентерального, легочного, через слизистые оболочки или трансдермального введения, хорошо известны и признаны в данной области.

Термин «лечение» в пределах контекста настоящего изобретения относится к любому благоприятному эффекту на прогрессирование заболевания, включая ослабление, снижение, уменьшение или облегчение патологического развития после начала заболевания.

Фармацевтические композиции по изобретению, включающие ΙΤΝ или его изоформу, мутеин, гибридный белок, функциональное производное, активную фракцию или соль, можно применять в диагностике, профилактике и лечении (местном или системном) клинических показаний, реагирующих на лечение этим полипептидом. Такие клинические показания включают, например, расстройства или заболевания центральной нервной системы (ЦНС), мозга и/или спинного мозга, включая рассеянный склероз; аутоиммунные заболевания, включая ревматоидный артрит, псориаз, болезнь Крона; и различные формы рака, включая рак молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, почки и толстой кишки.

Все приведенные ссылки, включая журнальные статьи или рефераты, опубликованные или неопубликованные заявки на патенты США или других стран, выданные патенты США или других стран, или любые другие ссылки, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки, включая все данные, таблицы, чертежи и текст, представленный в приведенных ссылках. Кроме того, содержание ссылок, приведенных в указанных ссылках, также полностью включено в качестве ссылок.

Ссылка на стадии известных способов, стадии обычных способов, известные способы или обычные способы ни в коей мере не представляют собой допущение, что любой аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения раскрывается, описывается или предлагается в релевантной области.

Таким образом, предшествующее описание определенных вариантов осуществления полностью выявляет общую природу изобретения, которое другим путем применения знаний в пределах навыков в данной области (включая содержание приведенных ссылок) легко модифицируют и/или адаптируют для различных видов применения без ненужного экспериментирования, не отходя от общей концепции настоящего изобретения. Поэтому предполагается, что такие адаптации и модификации находятся в пределах значения диапазона эквивалентов раскрытых вариантов осуществления, на основании представленных положений и руководства. Следует понимать, что используемая фразеология или терминология представлена с целью описания, а не ограничения, так что терминологию или фразеологию настоящего описания опытный специалист должен интерпретировать в свете представленных положений и руководства, в комбинации со знанием среднего специалиста в данной области.

Примеры

Пример 1. Аналитические методы.

(8Е)-НРЬС с исключением по размеру, также именуемая «новой 8Е-НРЬС» или «НОВОЙ 8ЕС», и скоростное ультрацентрифугирование (АИС) использовали для измерения уровней агрегатов и олигомеров рекомбинантного человеческого интерферона-в-1а (г-й ΙΠΝ-β-Ια или Γ-1ι8ΙΕΝ-1α). Способы 8Е-НРЬС и АИС, представленные ниже, способны выявить и ковалентные, и не ковалентные олигомеры и количественно, и качественно.

a. 8Е-НРЬС. Тест чистоты.

Выявление общего содержания агрегатов выполняют на колонке Т8К С20008^ХЬ (ТокоНаак) или Вю8ш1е (\Уа1сг8); элюирование выполняют изократическим путем при 0,5 мл/мин, используя 50 мМ буфер ацетата натрия, 50 мМ №1С1 рН 3,8; длину волн устанавливают на 215 нм. Время цикла составляет 30 мин.

Образцы в концентрации 88 мкг/мл анализируют в имеющемся виде, инъецируя 100 мкл.

b. Анализ скорости осаждения - АИС.

1. Описание метода.

- 13 010979

Образцы загружают в ячейки 2-канальным центральным отрезком из активированного угля-эпона с 12-мм оптическим проходом. Центральные отрезки и сапфировые окна очищают детергентом и затем вымачивают в воде для попытки обеспечения наиболее чистых поверхностей. Соответствующее плацебо загружают в эталонный канал (прибор функционирует в качестве двухлучевого спектрофотометра). Затем эти загруженные ячейки помещают в аналитический ротор А№50Т1, загруженный в аналитическую центрифугу ОрЕта ХЬ-Ι, и температуру доводят до 20°С. Затем скорость вращения ротора доводят до 3000 об./мин и образцы сканируют (при 280 нм, пике спектральной поглощательной способности) для подтверждения соответствующей загрузки ячеек. Затем скорость вращения ротора доводят до конечной скорости цикла 50000 об./мин. При этой скорости ротора регистрируют 50 сканов для каждого образца.

Данные анализируют, используя метод, разработанный Ре1ег Бсйиск в Национальном институте здоровья и использованный в программе анализа БЕЭПТ (версия 8.7; Бсйиск, Р. (2000). Анализ распределения макромолекул по размеру ультрацентрифугированием со скоростью осаждения и моделированием уравнением Ьашт, Вюрйук. 1. 78, 1606-1619).

При этом подходе множество необработанных данных непосредственно подгоняется для получения распределения коэффициентов осаждения, в то же время моделируя влияние диффузии на данные для усиления разрешения. Способ работает определением коэффициента диффузии для каждой величины коэффициента осаждения на основании допущения, что все виды имеют одинаковую общую гидродинамическую форму (при форме, определяемой отношением коэффициента трения относительно такового сферы, Г/Го). Затем варьируются величины Г/Го для обнаружения наилучшей общей подгонки данных по каждому образцу. Распределения рассчитываются с использованием сглаживания максимальной энтропии 0,51.

2. Аналитические параметры.

Тип ротора

Скорость ротора

Центральные отрези

Длина канала

Температура во время

Длина волн выявления

Объем образца

Эталонный объем

Ротор с 8 отверстиями

50к об./мин

Активированный уголь эпон мм цикла АЙС 20°С

280 нм

432 моль

442 мкл

3. Оборудование и программное обеспечение.

Аналитическая ультрацентрифуга модели ХЬ-Ι (Весктап СоиЙег)

Программное обеспечение БЕЭПТ версии 8.70Ь (Ре1ег Бсйиск - Национальные институты здоровья)

Первоначальная версия 6.03 программного обеспечения (Весктап СоиЙег)

Программное обеспечение РгсИеоте ЬаЬ ХЬ-А/ХЬ-Ι версия 5.0 (Весктап СоиЙег)

с. Количественное определение ΙΕΝ-β-1η ВР-НРЬС - ОиЛНТ-НРЕС.

Описанный ниже метод в обращенной фазе обеспечивает возможность количественного определения ΙΕΝ-β-1η в образцах.

Количественное определение белка выполняют на колонке С4, ^1бе-Роге Ви1у1 5 мкм, 4,6x250 мм (Вакег); длину волны устанавливают на 214 нм и элюирование выполяют при 1 мл/мин, используя следующую подвижную фазу и градиент:

А = вода/трифторуксусная кислота 0,1% - В = ацетонитрил/трифторуксусная кислота 0,1% - С = ацетонитрил.

Образцы анализируют инжекцией 50 мкл образца в том виде, как он есть (образцы 88 мкг/мл).

- 14 010979

Таблица IV

Время (мин)	% элюента А	% элюента В	% элюента С
0	70	30	0
5,0	70	30	0
6,0	58	42	0
15,0	57	43	0
30,0	46	54	0
35,0	45	55	0
40,0	40	60	0
40,1	20	80	0
45,0	20	80	0
45,1	0	0	100
50,0	0	0	100
50,1	70	30	0
65,0	70	30	0

Время цикла = 65 мин

Количественное определение образцов выполняют в сравнении со стандартной кривой в диапазоне 0,0125 мг/мл-0,2 мг/мл, полученной эталонным стандартным материалом.

б. Определение чистоты (РР)-НРБС в обращенной фазе ΌΕΟ/ΟΧ.

Описанный ниже метод в обращенной фазе обеспечивает возможность выявления окисленных форм ΙΗΝ-β-Λ которые элюируются иначе, чем интактная молекула.

Количественное определение окисленных форм выполняют на колонке С4, §ире1со811 ЬС-304 (8ире1со), термостатированной при 40°С; длину волны устанавливают на 208 нм, и элюирование выполняют при 1 мл/мин, используя следующую подвижную фазу и градиент:

А = вода 60%/ацетонитрил 40%/гептафторуксусная кислота 0,14% - В = вода 20%/ацетонитрил 80%/гептафтормасляная кислота 0,14% - С = вода 20%/ацетонитрил 80%/трифторуксусная кислота 0,1%

Градиент:

Таблица V

0'	70%А	30%В	0%С
5'	70%А	30%В	0%С
58'	62%А	38%В	0%С	Кривая 6
63'	0%А	100%В	0%С	Кривая 1
68'	0%А	0%В	100%С	Кривая 1
69'	70%А	30%В	0%С	Кривая 6

Время цикла: 96 мин (уравнение 70 мин + 26 мин)

Образцы анализируют в том виде, как они есть, инжекцией 200 мкл (образцы 88 мкг/мл).

е. Биологический анализ ингибирования цитопатического эффекта - СРЕ.

Биологическая активность (противовирусная активность).

Противовирусную активность ΙΡΝ-β-1;·ι измеряют биологическим анализом ингибирования цитопатического эффекта (СРЕ).

Биологическую активность измеряют антивирусным анализом на основании вызванной ΙΡΝ-β защиты клеток (клеток ^КН-амниотической ткани человека) против цитопатического эффекта вируса (вируса везикулярного стоматита).

Принцип биологического анализа интерферона основан на том, что ряд вирусов, таких как вирус везикулярного стоматита (νδν), вызывают гибель клеток, которую можно визуализировать витальным окрашиванием.

Затем цитопатический эффект можно использовать для количественной характеристики защиты клеток интерфероном.

Анализ выполняют косвенным измерением гибели клеток, которую оценивают количеством красителя соли тетразолия МТТ (диметилтиотетразолия), захватываемого живыми клетками.

В способе используется автоматическое спектрофотометрическое определение процентной доли защищенных клеток и анализ параллельной линии в трех точках для статистической оценки титра.

Процедура:

Анализ выполняют в титровочных микропланшетах.

a. 50 мкл среды клеточной культуры (МЕМ/5% РВ8) добавляют в каждую лунку.

b. 100 мкл образца ΙΡΝ-β-1;·ι или стандартного раствора (60-100 МЕ ΙιΙΡΝ-β/мл) добавляют в лунки и

- 15 010979 выполняют 3 стадии разведений 1:1,5 от ряда к ряду планшет.

с. 50 мкл суспензии клеток ^Ι8Η (0,78-0,82х10⁶ клеток/мл) добавляют в каждую лунку и планшеты инкубируют при 37°С в течение 18-20 ч в инкубаторе с увлажненным 5% СО₂.

б. Суспензию У8У добавляют в каждую лунку, за исключением лунок клеточного контроля, заполненных МЕМ/2,5% ΕΒ8.

е. Планшеты инкубируют в течение 24 ч в инкубаторе с увлажненным 5% СО2 при 37°С.

£. После проверки инвертационным микроскопом, что (1) по меньшей мере 80% повреждения клеток достигнуто в ряду контроля У8У и (2) процентные средние величины защиты стандарта ΙΕΝ-8 подпадают под диапазон 84% для не разбавленного стандарта, 45% для разбавления 1:1,5 и 27% для разведения 1:3.

Культуры окрашивают специфическим красителем МТТ.

д. Интенсивность окрашивания определяют автоматическим спектрофотометрическим считыванием при 592 нм.

11. Для количественного определения активности ΙΕΝ^-β-^ считываемые данные ΘΌ (оптической плотности) затем анализируют компьютерной программой (программное обеспечение Со1отЬо).

Пример 2. Стабилизация лишенных Н8А препаративных форм интерферона-β-1а.

Следующий эксперимент проводили для проверки защитного эффекта, оказываемого препаративной формой, включающей аминокислоту (т.е. лизин) и антиоксидант (т.е. метионин), на хранение препаративной формы IΕN-β-1а при различных температурах (2-8, 25 и 40°С). Следующие аналитические тесты и способы использовали во время разработки (см. пример 1):

биологическая активность (биологический количественный анализ ίη νί!το), количественный анализ (метод ВР-НРЬС), продукты окисления (метод Иед-ох), димеры/агрегаты (ΝΕν 8ЕС-НРБС и АИС, оба метода способны выявить ковалентные и не ковалентные олигомеры), количественный метод ВР-НРЬС (ОиаП-НРЬС).

рН (потенциометрический метод).

Результаты представлены в табл. 6-8.

1. Процедура:

а. Препаративную форму изготавливали, используя основное количество продукта, хранившееся/траспортировавшееся при 2-8°С.

Концентрация г-1 ΙΕΝ-β-1;·ι в основном количестве продукта составила примерно 0,5 мг/мл.

a. Препаративную форму, включающую лизин (как указано в п.2), изготавливали разбавлением субстанции препарата в носителе, таким образом достигая конечной композиции (концентрация г-1 ΙΕΝ-β-1;·ι 88 мкг/мл).

b. Компаундированный раствор затем асептически фильтровали через нейлоновую мембрану 0,2 мкм и собирали в стерильный контейнер; затем шприцы заполняли 0,5 мл, используя разливочную машину.

c. Затем образец хранили в термостатических шкафах при 2-8, 25 и 40°С и тестировали в соответствии с планом устойчивости, используя различные способы/тесты, примерно до 2 мес. хранения (1-3 нед. для образцов, хранившихся при 40°С).

2. Композиция препаративной формы:

a. 0,088 мг/мл г-1 интерферон^На;

b. 27,3 мг/мл Ь-лизина моногидрохлорида (код 1.05701, Мегск);

c. 0,12 мг/мл Ь-метионина (1.05707, Мегск);

б. 0,5 мг/мл Р1игошс Ε-68 (1,и1го1 Ε 68 ИАС, И8Р/№, Вак£), 5163315;

е. 10 мМ ацетат натрия рН 4,7.

3. Результаты.

- 16 010979

Таблица 6

Хранение при 2-8°С

2-8*С
	т=о	4 нед.	6 нед.	8 нед.
ОиапС-НРЬС (мкг/шприц)	39,0	38,2	39,8	39,2
Бед-οχ НРЬС (% окисленного)	1,3	1,5	1,5	1,5
дис (% мономера)	98,7	-	98,8	-
Νβν-ЗЕС (% мономера) ......	100,0	100,0	100,0	100,0
рН	4,7	4,7	-	4,7
Биологический количественный анализ (МЕ/мл)	24,1	24,6	-	-
Осмолярность (ОСМ/кг)	0,303	-	-	-

Таблица 7

Хранение при 25°С

25’С
	т=о	2 нед.	4 нед.	6 нед.	8 нед.
ОиапЬ-НРЬС (мкг/шприц)	39, 0	42,8	38,0	39,4	37,8
Бед-ох НРЬС (% окисленного)	1,3	1,5	1,4	2,3	2,3
дис (% мономера)	98,7	99,0		98,2	-
Νβν-ЗЕС (% мономера)	100, 0	100,0	100,0	100, 0	100,0
рН	4,7	4,7	4,7	-	4,7
Биологический количественный анализ (МЕ/мл)	24,1	-	24,0	-	-

Таблица 8

Хранение при 40°С

40°С
	т=о	1 нед.	3 нед.
ОиапС-НРЬС (мкг/шприц)	39,0	37,8	34,9
Бед-οχ НРЬС (% окисленного)	1,3	1,9	3,4
АИС (% мономера)	98,7	99,6	-
Ыеш-5ЕС (% мономера)	100,0	100,0	100,0
рН	4,7	4,7	4,6

4. Выводы.

Исследования хранения показывают, что препаративная форма или композиция, включающая лизин, метионин и Р1игошс Ρ-68, остается очень устойчивым при 2-8°С, а также при 25°С до 8 нед. Они остаются устойчивыми при 40°С до 3 нед. с точки зрения процентного содержания мономера (процентная доля мономера всегда выше чем 98%). 2 различных способа подтвердили эти результаты (ЛИС и ΝΕ\ν8Е-НРЬС). Таким образом, препаративная форма по настоящему изобретению предпочтительно включает комбинацию аминокислоты и антиоксиданта. Предпочтительно поверхностно-активное вещество, кроме того, добавляется к композиции.

Предпочтительно аминокислота представляет собой лизин, а антиоксидант представляет собой метионин. Предпочтительно поверхностно-активное вещество выбрано из Тетееи (например, Тетееи 20),

- 17 010979

Р1цгошс® Р77, Р1цгошс Р87, Р1цгошс Р88 и Р1цгошс Р68. Предпочтительнее поверхностно-активное вещество представляет собой Р1игошс Р68.

Предпочтительно рН препаративной формы устанавливается в диапазоне от 3,5 до 5,5. Предпочтительнее рН препаративной формы устанавливается на уровне 4,7.

Предпочтительно лизин присутствует в концентрации от примерно 1 до примерно 100 мг/мл. Предпочтительнее лизин присутствует в концентрации примерно 27,3 мг/мл. Предпочтительно поверхностноактивное вещество присутствует в концентрации от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл. Предпочтительнее поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации примерно 0,5 мг/мл. Предпочтительно антиоксидант присутствует в концентрации от примерно 0,01 до примерно 5,0 мг/мл. Предпочтительнее антиоксидант присутствует в концентрации примерно 0,12 мг/мл. Предпочтительно интерферон присутствует в концентрации от примерно 10 до примерно 800 мкг/мл. Предпочтительнее интерферон присутствует в концентрации примерно 88 мкг/мл.

Ссылки

1. Оегупк Я. е! а1., №11игс 1980; 285, 542-547.

2. РашШеШ, Р.С, ЯиЬтйещ 8., апб Рейка, 8. 1981 А Сопуешеп! апб Яар1б Су!ораШ1с ЕГГес! 1пЫЫбоп Аккау Гог 1п!егГегоп, ш Мебюбк ш Еп7уто1оду, Уо1. 78 (8. Рейка, еб.), Асабетк Ргекк, №\ν Уогк, 387-394;

3. Магк Ό.Ε. е! а1., Ргос. ЫаП. Асаб. 8ск И.8.А., 81 (18) 5662-5666 (1984) .

4. Рейка, 8. (1986) ЕнегГегоп 8!апбагбк апб Сепега1 АЬЬгеу1абопк, ш Ме!1обк т Епхутокду (8. Рейка, еб.), Асабетк Ргекк, №\ν Уогк 119,14-23.

5. ЯиЬтйет, 8., РатШеШ, Р.С, апб Рейка, 8. Сопуешеп! Аккау Гог 1п!егГегопк. I У1го1. 1981; 37, 755758.

6. 8Ьерагб Н.М. е! а1., Ыа1иге 1981; 294, 563-565.

Claims (29)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Стабилизированная, свободная от НА8 (человеческого сывороточного альбумина) жидкая фармацевтическая композиция, включающая интерферон-бета (ΙΕΝ-β), где указанная препаративная форма представляет собой раствор, который включает буфер, аминокислоту, которая является лизином, и антиоксидант.
2. 2. Композиция по п.1, где указанная композиция дополнительно включает поверхностно-активное вещество.
3. 3. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный ΙΕΝ-β представляет собой человеческий рекомбинантный ΙΕΝ-β.
4. 4. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный буфер присутствует в количестве, достаточном для поддержания рН указанной композиции, в пределах плюс или минус 0,5 единиц определенного рН, где определенный рН составляет от 3,5 до 5,5.
5. 5. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный рН составляет 4,7±0,2.
6. 6. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный буфер присутствует в концентрации от 5 до 500 мМ.
7. 7. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный буфер присутствует в концентрации 10 мМ.
8. 8. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буфер представляет собой ацетатный буфер.
9. 9. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная аминокислота выбрана из группы аминокислот с заряженной боковой цепью.
10. 10. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный лизин присутствует в концентрации от 1 до 100 мг/мл.
11. 11. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный лизин присутствует в концентрации 27,3 мг/мл.
12. 12. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанное поверхностно-активное вещество выбрано из Ттееп, Р1игошс® Ε77, Р1игошс Ε87, Р1игошс Ε88 и Р1игошс Ε68.
13. 13. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанное поверхностно-активное вещество представляет собой Р1игошс Ε68.
14. 14. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанное поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации от 0,01 до 10 мг/мл.
15. 15. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанное поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации 0,5 мг/мл.
16. 16. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный антиоксидант представляет собой метионин.
17. 17. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный антиоксидант присутствует в концентрации от 0,01 до 5,0 мг/мл.
18. 18. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный антиоксидант присутствует в

    - 18 010979 концентрации 0,12 мг/мл.
19. 19. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный интерферон присутствует в концентрации от 10 до 800 мкг/мл.
20. 20. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный интерферон представляет собой рекомбинантный человеческий интерферон-в-1а и присутствует в концентрации 22,44 или 88 мкг/мл.
21. 21. Композиция по п.20, где указанный интерферон присутствует в концентрации 88 мкг/мл.
22. 22. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающая бактериостатическое средство, выбранное из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил, этил, пропил, бутил и им подобных), бензалконийхлорида, бензетонийхлорида, дегидроацетата натрия и тимерозала.
23. 23. Композиция по п.22, где бактериостатическое средство представляет собой бензиловый спирт.
24. 24. Композиция по любому из предыдущих пунктов, состоящая из интерферона-в-1а, бензилового спирта, лизина, метионина, Р1игошс Е-68 и водного ацетатного буфера.
25. 25. Композиция по любому из предыдущих пунктов, в которой интерферон представлен по меньшей мере примерно на 96% или по меньшей мере примерно на 98% в качестве мономера.
26. 26. Композиция по любому из пп.1-25, предназначенная для лечения рассеянного склероза.
27. 27. Контейнер, герметично запаянный в стерильных условиях, соответствующих хранению перед применением, включающий жидкую фармацевтическую препаративную форму по любому из пп.1-25.
28. 28. Контейнер по п.27, где указанный контейнер представляет собой предварительно заполненный шприц, флакон или автоинжектор.
29. 29. Применение ΙΕΝ-β для изготовления лекарственного средства, включающего ΙΕΝ-β, буфер, аминокислоту, которая является лизином, и антиоксидант для лечения рассеянного склероза.