EA009463B1

EA009463B1 - Применение эритропоэтина

Info

Publication number: EA009463B1
Application number: EA200500281A
Authority: EA
Inventors: Фердинанд Херманн Бальманн; Херманн Халлер
Original assignee: Эпоплус Гмбх Унд Ко. Кг
Priority date: 2002-07-26
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2007-12-28
Also published as: DE50307140D1; EP1526867B1; HRP20100187A2; US20050272634A1; ES2285195T3; CN1681526A; AU2003255290B2; HRP20050065A2; CY1110713T1; EA200801236A1; PL395151A1; PL374874A1; SI1779862T1; DE10234192A1; WO2004012759A2; KR20100077033A; DK1526867T3; CY1108052T1; ATE468132T1; BR0312981A

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению эритропоэтина для получения фармацевтических композиций для лечения хронической почечной недостаточности, острой почечной недостаточности и для заживления ран.

Description

Настоящее изобретение относится к применению эритропоэтина для стимуляции физиологической мобилизации, пролиферации и дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников, для стимуляции васкулогенеза, для терапии заболеваний, связанных с дисфункцией эндотелиальных клетокпредшественников, и для получения фармацевтических композиций в целях лечения таких заболеваний, а также к фармацевтическим композициям, которые включают эритропоэтин и другие пригодные биологически активные вещества для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников.

Эндотелий сосудов представляет собой слой клеток, который выстилает кровеносные сосуды. Эндотелий отделяет кровь от других слоев сосудов, причем эндотелий является не только пассивным барьером, но и активно участвует в регуляции сосудистого тонуса. Соответственно этому также говорят о зависимой от эндотелия вазодилатации. В силу своего положения эндотелий постоянно подвергается гемодинамическому стрессу и метаболическому стрессу. В случае патогенных состояний, например в случае повышенного кровяного давления, повышенных содержаний липопротеинов низкой плотности (ЪЭЬ). ограниченной почечной функции или повышенного уровня сахара в крови, часто возникают функциональные дефекты эндотелия, за которыми затем могут следовать морфологически конкретные повреждения, такие как образование атеросклеротических бляшек. Очень ранний симптом измененной, соответственно, редуцированной эндотелиальной функции, соответственно эндотелиальной дисфункции, представляет собой уменьшение зависимой от эндотелия вазодилатации.

В случае коронарной болезни сердца (КНК), а также в случае имеющихся факторов риска без КНК, таких как, например, гипертония, гиперлипопротеинемия или диабет, дефекты эндотелиальной функции проявляются в пониженном продуцировании N0 (=ΕΌΒΕ) и повышенном продуцировании эндотелина. Высокие уровни эндотелина в плазме приводят к анормальному росту клеток, воспалениям, сосудистым разрастаниям и сильным сужениям сосудов. Нарушения эндотелиальной функции, к тому же, характеризуются усиленным продуцированием адгезивных молекул, таких как 1САМ-1 и УСАМ-1, за счет чего к эндотелию в повышенной мере прилипают тромбоциты и моноциты. Обусловленное этим происходит повышение сосудистого тонуса. Таким образом, в самых различных системах возникает неравновесие, что способствует вазоконстрикции, адгезии, агрегации, коагуляции, атеросклерозу и атеротромбозу. Даже ментальный стресс приводит к измеримой эндотелиальной дисфункции, которая может продолжаться вплоть до 4 ч.

Эндотелиальные клетки принимают участие также в образовании новых кровеносных сосудов. Образование кровеносных сосудов имеет значение в случае множества процессов, например при эмбриогенезе, репродуктивном цикле у женщин, заживлении ран, росте опухолей и неоваскуляризации ишемических областей. Первоначально постнатальное образование кровеносных сосудов, т.е. образование кровеносных сосудов после родов, сводится главным образом к ангиогенетическим процессам. Под ангиогенезом понимают образование новых кровеносных сосудов за счет появления капилляров из уже существующей сосудистой системы. При ангиогенезе, прежде всего, с помощью протеолитических ферментов разрушается окружающая кровеносные сосуды базальная мембрана, и внеклеточная матрица фрагментируется в периваскулярном пространстве. Высвобождающиеся при этом ангиогенные стимулы вызывают миграцию уже имеющихся, образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток в направлении хемотактического раздражителя, причем они одновременно пролиферируют и перестраиваются. За счет наложения друг на друга эндотелиальных клеток затем образуются новые сосудистые петли с капиллярообразными просветами. После этого происходит синтез новой базальной мембраны.

Однако проведенные в недавнее время исследования показывают, что образование новых кровеносных сосудов во взрослом организме основано не только на ангиогенезе, но и также на васкулогенетических механизмах. Под васкулогенезом понимают сосудистое новообразование из дифференцирующихся ίη кйи эндотелиальных клеток-предшественников. Догма, что васкулогенез ограничен эмбриогенезом, опровергнута за счет обнаружения эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС) в периферической крови здоровых людей и животных. При использовании животных моделей подтверждено, что происходящие из костного мозга эндотелиальные клетки-предшественники активно участвуют в неоваскуляризации. Также показано, что в ишемических областях находится специфическая СО34-положительная подгруппа лейкоцитов, которая экспрессирует специфичные к эндотелию антигены. Сверх того, из клеток СЭ133' и СЭ34' ίη νίίτο могут получаться эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС), которые вносят значительный вклад в образование кровеносных сосудов во взрослом организме (АкаЫага с1 а1., 8аепсе, 275, 1997, 964-967; СтокЬу е1 а1., С1гс. Век., 87, 2000, 728-730; СеЫтд е1 а1., Β1οο6, 95, 2000, 31063112). Далее показано, что инъекция выделенных клеток СЭ34' или культивированных эндотелиальных клеток-предшественников ускоряет восстановление кровотока у больных диабетом мышей (8сЫаИешап еί а1., I. С11п. ИттеМ., 106, 2000, 571-578) и ίη νίνο улучшает неоваскуляризацию (АкаЫага еί а1., С1гс. Век., 85, 221-228, 1999; СгокЬу е1 а1., С1гс. Век., 87, 728-730, 2000; МигоЫата е1 а1., I. С11п. 1пте81, 105, 2000, 15271536). Сверх того, показано, что индуцируемая за счет клеток СЭ34' неоваскуляризация улучшает функцию сердца (^сЫет еί а1., №1. Меб., 7, 2001, 430-436).

Находящиеся в основе мобилизации и дифференцировки эндотелиальных клетокпредшественников механизмы, однако, еще полностью не выяснены. Биологические исследования в отношении молекул и клеток указывают на то, что различные цитокины и ангиогенные факторы роста сти

- 1 009463 мулирующе воздействуют на мобилизацию эндотелиальных клеток-предшественников в костном мозге. Так, известно, что проангиогенные факторы, такие как УЕСТ и СМ-С8Т, могут повышать число эндотелиальных клеток-предшественников (Акайага с( а1., ЕМВО Т. 18, 1999, 3964-3972; ТакайакЫ е1 а1., ΝηΙ. Мей., 5, 1999, 434-438). В случае УЕСТ (васкулярный эндотелиальный фактор роста) речь идет о находящемся в различных изоформах протеине, связывающем оба рецептора тирозинкиназы УЕСЕ-В1 (111-1) и УЕСТ-К2 (11к-1), которые находятся, например, на поверхности растущих эндотелиальных клеток (петлей е1 а1., Апдете. Сйеш1е, 21, 1999, 3432-3435). Активация рецепторов УЕСТ через путь Яак-ЯаТМАР-киназа приводит к экспрессии протеиназ и специфических интегринов на поверхности эндотелиальных клеток, соответственно, эндотелиальных клеток-предшественников и, наконец, к инициации пролиферации и миграции этих клеток в направлении ангиогенного стимула. В случае СМ-С8Е (фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов и макрофагов) речь идет о цитокине, который до сих пор был известен, прежде всего для стимуляции лейкоцитов, включая нейтрофилы, макрофагов и эозинофилов. О плацентарном факторе роста (Р1СТ) известно, что он стимулирует мобилизацию эндотелиальных клеток-предшественников, но не стимулирует их пролиферацию. Из исследований Ыеуайо! е1 а1. (1. С1ш. 1пуей., 108, 2001, 399-405) яствует, что ингибиторы НМС-СоА-редуктазы, в особенности статины, которые используют в качестве снижающих уровень липидов лекарственных средств и которые снижают заболеваемость и смертность в случае коронарной болезни, могут мобилизовывать эндотелиальные клетки-предшественники. И1шш1ег е1 а1. (1. С1ш. 1пуей., 2001, 108, 391-397) далее показали, что статины, такие как аторвастатин и симвастатин, ίη νίίτο и ίη νίνο могут значительно улучшать дифференцировку эндотелиальных клеток-предшественников в мононуклеарные клетки и стволовые клетки СИ34⁺, которые выделяются из периферической крови. Так, обработка мышей статинами приводит к повышенному количеству дифференцированных эндотелиальных клеток-предшественников, причем статины обладают таким же сильным действием, как УЕСТ.

Стимуляция мобилизации и/или дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников представляет собой важную новую терапевтическую стратегию для повышения постнатальной неоваскуляризации, в особенности васкулогенеза, и для лечения заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток.

В основу изобретения положена техническая проблема получения средств и разработки способов для повышенной стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников и лечения заболеваний, которые связаны в особенности с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников.

Согласно настоящему изобретению эта техническая проблема решается за счет применения эритропоэтина и/или его производных для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клетокпредшественников, пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников, дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников в эндотелиальные клетки и/или миграции эндотелиальных клетокпредшественников в направлении ангиогенного или васкулогенного стимула в организме человека или животного. Согласно настоящему изобретению эта техническая проблема также решается за счет применения эритропоэтина и/или его производных для лечения заболеваний или болезненных состояний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток.

Согласно изобретению неожиданно установлено, что обработка эритропоэтином приводит к физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, причем повышается количество циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников и индуцируется их дифференцировка, в особенности при сравнительно низких дозах эритропоэтина. Сверх того, компенсируются возникающие в случае определенных патологических состояниий функциональные дефициты эндотелиальных клетокпредшественников. Согласно изобретению показано, что у пациентов с хроническим заболеванием почек в конечной стадии число циркулирующих стволовых клеток точно такое же высокое, как у здоровых испытуемых, однако у этих пациентов эти стволовые клетки потеряли способность к дифференцировке в эндотелиальные клетки из эндотелиальных клеток-предшественников. Так, у пациентов с хроническим заболеванием почек количество клеток, которые являются адгезивно-способными и относятся к эндотелиальному клеточному фенотипу, отчетливо уменьшено по сравнению со здоровыми испытуемыми. Согласно изобретению в настоящее время установлено, что после обработки этих пациентов эритропоэтином количество циркулирующих стволовых клеток значительно возрастает на более чем на 50%. При этом в особенности резко повышается количество клеток, которые относятся к эндотелиальному фенотипу. Как обнаружено с помощью функционального теста в отношении клеточной культуры, ухудшенная у пациентов с хроническим заболеванием почек способность эндотелиальных клетокпредшественников к адгезии за счет обработки эритропоэтином повышается в три раза. Способность дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников, соответственно, эндотелиальных клеток к адгезии представляет собой одну из основных предпосылок образования новых тканей и/или сосудов. Эритропоэтин, таким образом, может индуцировать неоваскуляризацию, в особенности васкулогенез, в тканях или органах, в которых высвобождаются соответствующие васкулогенные или ангиогенные стимулы.

Согласно изобретению эритропоэтин (в дальнейшем называемый ЕРО) можно использовать для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, пролиферации

- 2 009463 эндотелиальных клеток-предшественников, дифференцировки эндотелиальных клетокпредшественников в эндотелиальные клетки и/или для миграции эндотелиальных клетокпредшественников в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула в организме человека или животного, в особенности взрослого организма. Согласно изобретению эритропоэтин поэтому предпочтительно можно использовать для стимуляции новообразования сосудов за счет васкулогенеза в тканях или органах, в которых имеются патологические изменения сосудов. На основании стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников за счет эритропоэтина, сверх того, можно также индуцировать образование эндотелиальной ткани. Согласно изобретению эритропоэтин поэтому можно также использовать для лечения заболеваний организма человека или животного, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток.

Согласно настоящему изобретению под термином эритропоэтин, соответственно, ЕРО понимают вещество, которое регулирует рост, дифференцировку и созревание стволовых клеток через эритробласты в эритроциты. Эритропоэтин представляет собой гликопротеин, который включает 166 аминокислот, три сайта гликозилирования и имеет молекулярную массу примерно 34000 Да. В рамках индуцируемой эритропоэтином дифференцировки эритроцитных клеток-предшественников индуцируется синтез глобулина и усиливается синтез гемкомплекса, а также увеличивается число рецепторов ферритина. Благодаря этому клетка может поглощать больше железа и синтезировать функциональный гемоглобин. В зрелых эритроцитах гемоглобин связывает кислород. Таким образом, эритроциты и, соответственно, содержащийся в них гемоглобин выполняют ключевую роль в отношении снабжения организма кислородом. Эти процессы возбуждаются за счет взаимодействия эритропоэтина с соответствующим рецептором на поверхности эритроцитных клеток-предшественников (СтаЬет и КгаШх. Апп. Ксу. Меб., 29, 1978, 5156).

Эритропоэтин образуется главным образом в почках, в меньших количествах также в печени и в головном мозге. В незначительных количествах эритропоэтин находится также в сыворотке и в физиологических условиях, по меньшей мере, частично выделяется в моче. У пациентов с почечной недостаточностью эритропоэтин может образовываться незначительно, вследствие этого они страдают анемией. Известна компенсация недостаточного снабжения эритропоэтином за счет введения эритропоэтина. Дальнейшие клинические использования эритропоэтина заключаются в применении эритропоэтина при ятрогенной анемии после химиотерапии или лучевой терапии злокачественных заболеваний или вирусных инфекций (европейский патент ЕР 0456153-В1). Из патента США 4732889 известно использование содержащих эритропоэтин композиций для лечения ассоциированной с ревматоидным артритом анемии. Из международной заявки νϋ-88/03808 известно лечение гемохроматоза с помощью композиций, содержащих эритропоэтин.

Используемое в данном контексте понятие эритропоэтин включает эритропоэтин любого происхождения, в особенности человеческий или животный. Используемое в данном контексте понятие включает не только естественно встречающиеся формы эритропоэтина, т.е. дикого типа, но и также его производные, аналоги, модификации, мутеины, мутанты или пр., если они обладают биологическими действиями эритропоэтина дикого типа.

Согласно настоящему изобретению под термином производные понимают функциональные эквиваленты или производные эритропоэтина, которые при сохранении основной структуры эритропоэтина получают путем замещения одного или нескольких атомов или молекулярных групп, соответственно, остатков, в особенности путем замещения сахаридных цепей, таких как этиленгликоль, и/или аминокислотных остатков, которые отличаются от естественно встречающегося человеческого или животного эритропоэтина по меньшей мере одной позицией, которые, по существу, обладают высокой степенью гомологии в отношении аминокислот и сравнимой биологической активностью. Производные эритропоэтина, которые, например, можно использовать согласно настоящему изобретению, известны, в частности, из международной заявки νΘ-94/25055, европейского патента ЕР 0148605-В1 или международной заявки νΘ-95/05465.

Термин гомология означает в особенности идентичность последовательностей по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85% и особенно предпочтительно по меньшей мере более чем на 90, 95, 97 и 99%. Известный специалисту термин гомология, таким образом, характеризует степень родства между двумя или несколькими полипептидными молекулами, которая определяется соответствием между последовательностями. При этом соответствие может означать как идентичное соответствие, так и консервативную замену аминокислоты.

Согласно изобретению понятие производное включает также слитые протеины, у которых в Ν-концевой части, соответственно в С-концевой части, имеются функциональные домены другого протеина. Согласно одному варианту осуществления изобретения в случае этого другого протеина речь может идти, например, о СМ-С8Е, УЕСЕ, Р1СЕ, статине или другом факторе, который обладает стимулирующим воздействием на эндотелиальные клетки-предшественники. Согласно другому варианту осуществления изобретения в случае другого протеина речь может идти также о факторе, который проявляет стимулирующее воздействие на образовавшиеся путем дифференцировки эндотелиальные клетки, на

- 3 009463 пример об ангиогенине или ЬЕСЕ (главный фактор роста фибробластов). Известно, что этот фактор роста ЬЕСЕ оказывает сильное митогенное и хемотактическое воздействие на эндотелиальные клетки.

Различия между производным эритропоэтина и нативным эритропоэтином могут возникать, например, за счет мутаций, таких как, например, делеции, замещения, инсерции, присоединения, обмены оснований и/или рекомбинации нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности эритропоэтина. Разумеется, при этом речь может идти также о естественно встречающихся вариациях последовательностей, например о последовательностях из другого организма или о последовательностях, которые мутируют естественным образом, или о мутациях, которые с помощью обычных, известных в данной области средств, например химических агентов и/или физических агентов, целенаправленно вводятся в кодирующие эритропоэтин нуклеотидные последовательности. Согласно изобретению понятие производное поэтому включает также мутированные молекулы эритропоэтина, следовательно, мутеины эритропоэтина.

Согласно изобретению можно использовать также пептидные или белковые аналоги эритропоэтина. В соответствии с настоящим изобретением понятие аналоги включает соединения, которые не обладают никакой аминокислотной последовательностью, идентичной аминокислотной последовательности эритропоэтина, трехмерная структура которых очень похожа на таковую эритропоэтина и которые поэтому обладают сравнимой биологической активностью. В случае аналогов эритропоэтина речь может идти, например, о соединениях, которые содержат ответственные за связывание эритропоэтина с его рецепторами аминокислотные остатки в пригодной конформации и которые поэтому могут имитировать основные поверхностные свойства места связывания эритропоэтина. Такого рода соединения описываются, например, ХУгщЫоп е! а1., 8с1еисе, 273, 1996, 458.

Используемый согласно изобретению эритропоэтин можно получать различным образом, например путем выделения из человеческой мочи или из мочи и плазмы (включая сыворотку) пациентов, страдающих апластической анемией (М1уаке е! а1., 1. В. С., 252, 1977, 5558). Человеческий эритропоэтин, например, также можно получать из тканевых культур человеческих почечных раковых клеток (1Ά-Θ8 555790/1979), из человеческих лимфобластов, которые обладают способностью к образованию человеческого эритропоэтина (1Ά-Θ8 40411/1982), и из гибридомной культуры, получаемой за счет слияния клеток человеческих клеточных линий. Эритропоэтин также можно получать путем генноинженерных способов, тем, что с помощью пригодной ДНК или РНК, которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность эритропоэтина, путем генной инженерии получают желательный протеин, например, в бактерии, дрожжах, растительной или животной клеточной линии. Такого рода способы описываются, например, в европейских патентах ЕР 0148605-В2 или ЕР 0205564-В2, а также в ЕР 0411678-В1.

Настоящее изобретение в особенности относится к применению эритропоэтина (в дальнейшем называемого ЕРО) и/или его производных для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников, дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников в эндотелиальные клетки и/или для миграции эндотелиальных клеток-предшественников в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула в организме человека или животного, в особенности во взрослом организме.

Согласно настоящему изобретению под выражением эндотелиальные клетки-предшественники понимают циркулирующие в системе кровообращения клетки, которые обладают способностью к дифференцировке в эндотелиальные клетки. В случае эндотелиальных клеток-предшественников, встречающихся во время эмбрионального развития, речь идет об ангиобластах. В случае эндотелиальных клетокпредшественников, встречающихся во взрослом организме, речь идет о подобных ангиобластам клетках, которые могут получаться из мононуклеарных клеток, в особенности моноцитов СЭ34^-СЭ14' и/или стволовых клеток СЭ34'. выделяемых из периферической крови.

Согласно настоящему изобретению под термином мобилизация или физиологическая мобилизация понимают процесс активации стволовых клеток и/или клеток-предшественников из костного мозга с помощью факторов роста, причем стволовые клетки и/или клетки-предшественники попадают в круг кровообращения, в особенности в периферическую кровь.

Согласно настоящему изобретению под термином пролиферация понимают способность клеток к увеличению и к последующему делению на две или более дочерних клеток. Опосредованная эритропоэтином стимуляция эндотелиальных клеток-предшественников, таким образом, касается в особенности количества и вместе с тем поведения при делении эндотелиальных клеток-предшественников.

Согласно настоящему изобретению под термином дифференцировка эндотелиальных клетокпредшественников понимают развитие происходящих из костного мозга мононуклеарных клеток через эндотелиальные клетки-предшественники в эндотелиальные клетки.

Под термином эндотелиальные клетки понимают клетки, которые образуют эндотелий, т.е. монослойную клеточную выстилку сосудов и серозных полостей. Эндотелиальные клетки отличаются тем, что они высвобождают активные в отношении сосудов вещества, например сосудорасширяющие вещества, такие как ΕΌΚΕ (происходящий от эндотелия расслабляющий фактор), или сужающие вещества, такие как эндотелин, факторы подавления или активации свертывания крови и факторы регуляции про

- 4 009463 ницаемости сосудов. Эндотелиальные клетки также синтезируют компоненты субэндотелиальной соединительной ткани, в особенности коллагены типа IV и V, клеточно-адгезивные протеины, такие как ламинин, фибронектин и тромбоспондин, факторы роста, например, для гладкомышечных клеток, и факторы новообразования сосудов.

Согласно настоящему изобретению под термином миграция эндотелиальных клетокпредшественников понимают, что находящиеся в кровообращении эндотелиальные клеткипредшественники перемещаются в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула и концентрируются в области васкулогенного или ангиогенного стимула.

Под термином васкулогенный стимул понимают химический раздражитель в ткани или кровеносном сосуде организма человека или животного, который специфически действует на эндотелиальные клетки-предшественники и вызывает их перемещение к месту в организме, из которого исходит химический раздражитель. За счет васкулогенного стимула, таким образом, индуцируется процесс васкулогенеза.

Под термином ангиогенный стимул понимают химический раздражитель в ткани или кровеносном сосуде организма человека или животного, который специфически действует на образовавшиеся путем дифференцировки эндотелиальные клетки и вызывает их миграцию к месту в организме, из которого исходит химический раздражитель. Ангиогенный стимул, таким образом, вызывает индуцирование ангиогенеза.

Согласно следующему варианту осуществления изобретения предусматривается применение эритропоэтина и/или его производных для повышения адгезивной способности дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников. Согласно изобретению эритропоэтин в особенности применяют для улучшения способности эндотелиальных клеток-предшественников к адгезии, т. е. к адгезии клеткаклетка. Адгезия дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников, соответственно, образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток, представляет собой одну из основных предпосылок для образования новых сосудов или новой эндотелиальной ткани. Клеточная адгезия опосредуется протеиновой молекулой.

Настоящее изобретение относится также к применению эритропоэтина для стимуляции новообразования сосудов, в особенности стимуляции васкулогенеза. Согласно настоящему изобретению под термином васкулогенез понимают новообразование сосудов из дифференцирующихся ίη δίΐιι эндотелиальных клеток-предшественников. Согласно изобретению за счет использования эритропоэтина, следовательно, достигают того, что эндотелиальные клетки-предшественники в усиленной мере принимают участие в новообразовании сосудов, соответственно в локальном новообразовании сосудов, для восстановления поврежденных областей сосудов. Согласно изобретению, следовательно, предусматривается, что применение эритропоэтина и/или его производных способствует образованию новых кровеносных сосудов и/или замене поврежденных областей сосудов за счет локального новообразования кровеносных сосудов.

Согласно следующему варианту осуществления изобретения предусматривается применение эритропоэтина и/или его производных для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников в целях образования эндотелиальной ткани.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается применение эритропоэтина и/или его производных для лечения болезненных состояний или заболеваний организма человека или животного, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клетокпредшественников, или заболеваний, являющихся следствием предыдущих заболеваний.

Согласно настоящему изобретению под терминами заболевания, болезненные состояния или болезни понимают нарушения жизненных процессов в органах или во всем организме с последствием субъективно ощущаемых, соответственно объективно устанавливаемых, физических, психических или умственных изменений. Согласно изобретению речь идет в особенности о заболеваниях, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, т. е. о заболеваниях, которые либо являются следствием такого рода дисфункции этих клеток, либо опосредуются этими клетками. Под выражением заболевания, являющиеся следствием предыдущих заболеваний, понимают вторичные заболевания, т.е. присоединяющееся к первичной картине болезни второе заболевание.

Согласно настоящему изобретению под термином дисфункция эндотелиальных клетокпредшественников понимают нарушение существенных функций клеток, таких как интенсивности обмена веществ, ответ на раздражение, моторика, поведение при делении или поведение при дифференцировке этих клеток. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может состоять, например, в том, что эти клетки не пролиферируют или пролиферируют только в недостаточной мере. Так как благодаря применению эритропоэтина стимулируется пролиферация эндотелиальных клеток-предшественников, за счет этого может компенсироваться недостаточное поведение при делении как эндотелиальных клетокпредшественников, так и уже образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток и может повышаться количество эндотелиальных клеток-предшественников, соответственно, эндотелиальных клеток. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может заключаться, например, в нарушенной способности этих клеток к дифференцировке в эндотелиальные клетки. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может быть также обусловлена их нарушенной способностью к адге

- 5 009463 зии и/или их нарушенной способностью к миграции в направлении ангиогенного или васкулогенного стимула. Такие дисфункции эндотелиальных клеток-предшественников могут приводить к тому, что, например, ухудшается или предотвращается новообразование эндотелиальной ткани и/или васкулогенез. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может быть также обусловлена патогенно, например, за счет гипертонии, гиперлипопротеинемии, уремии или диабета. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может выражаться, например, в уменьшенном продуцировании N0 (=ΕΌΚΤ) за счет ΝΟ-синтаз (N08) из Ь-аргинина, повышенном продуцировании эндотелина и/или в усиленном продуцировании адгезивных молекул, таких как 1САМ-1 и УСАМ-1.

Согласно изобретению в случае заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, речь идет в особенности о гиперхолестеринемии, сахарном диабете, опосредованных эндотелием хронических воспалительных заболеваниях, таких как васкулиты, эндотелиоз, включая ретикулоэндотелиоз, атеросклероз, коронарная болезнь сердца, ишемия миокарда, стенокардия, обусловленное возрастом сердечно-сосудистое заболевание, ишемические заболевания конечностей, болезнь Рейно, преэклампсия, вызванная беременностью гипертония, хроническая или острая почечная недостаточность, в особенности терминальная почечная недостаточность, сердечная недостаточность, заживление ран, а также заболевания, являющиеся следствием предыдущих заболеваний.

Гиперхолистеринемия характеризуется повышенными концентрациями холестерина в крови. Гораздо более частой формой первичных гиперхолестеринемий является полигенная гиперхолестеринемия. Вторичные гиперхолестеринемии часто возникают при сахарном диабете, нефротическом синдроме, гипотиреозе и заболеваниях печени.

Под понятием сахарный диабет объединяют различные формы нарушений метаболизма глюкозы с различной этиологией и симптоматикой. За возникновение сосудисто-обусловленных диабетических осложнений ответственна в особенности система АСЕ-ВАСЕ. АСЕ (образованные из гликатиона конечные продукты) образуются за счет ряда сложных реакций после продолжительной выдержки протеинов или липидов с редуцирующими сахарами, например с глюкозой. Образование АСЕ происходит во время нормального процесса старения, а также в повышенной мере при сахарном диабете и болезни Альцгеймера. За счет связывания АСЕ возникает окислительный стресс, активация фактора транскрипции ΝΕ-кВ и вместе с этим нарушение эндотелиального гомеостаза.

Опосредованные эндотелием хронические воспалительные заболевания представляют собой заболевания или состояния организма человека или животного, которые основываются на защитной реакции организма и его тканей по отношению к причиняющим вред раздражителям, причем определенные сигнальные молекулы изменяют свойства эндотелиальных клеток, так что вкупе с активацией других клеточных типов лейкоциты прилипают к эндотелиальным клеткам, наконец, внедряются в ткань и там вызывают воспаление. Примером опосредованного эндотелием воспаления является лейкоцитарный васкулит. Центральную роль при активации опосредованного эндотелием воспалительного явления играет фактор транскрипции ΝΕ-кВ. Другой системой, которая приводит к возникновению опосредованных эндотелием хронических воспалений, является система АСЕ-ВАСЕ.

Под термином эндотелиоз понимают дегенеративные и пролиферативные изменения эндотелия при простой пурпуре. Под термином ретикулоэндотелиоз понимают заболевания ретикулогистиоцитарной системы, такие как ретикулум, ретикулез, ретикулогистиоцитоз и болезнь Хенда-ШюллераКресчета.

Под термином ишемия миокарда понимают анемию или недостаточный кровоток, следовательно, нарушение кровоснабжения мышечной стенки сердца вследствие недостаточного или отсутствующего артериального притока крови. В случае инфаркта сердца или инфаркта миокарда речь идет о некрозе описанного участка сердечной мышцы, который чаще всего появляется в качестве возникающего острого осложнения при хронической коронарной болезни сердца. В случае коронарной болезни сердца или ишемической болезни сердца речь идет о дегенеративном коронарном заболевании, которое, обусловленное сужением или закупоркой венечных сосудов сердца, приводит к уменьшенному кровоснабжению сердечной мышцы.

Под термином стенокардия понимают активную коронарную недостаточность или стенокардию, которая может возникать за счет диспропорции предложения кислорода и потребности в кислороде при коронарной болезни сердца, коронарных спазмах, нарушениях кровотока, нарушениях сердечного ритма, гипертонии или гипотонии.

Под термином болезнь Рейно понимают обусловленные вазоконстрикцией, т.е. спазмами сосудов, возникающие приступообразно ишемические состояния, чаще всего в артериях пальцев. Первичная болезнь Рейно представляет собой чисто функциональное нарушение маленьких кровоснабжающих сосудов конечностей, в то время как основу вторичной болезни Рейно составляет другое заболевание, например васкулит.

Преэклампсия представляет собой болезнь эндотелия и сосудов материнского организма и, повидимому, является результатом воздействия эндотелиотропных веществ из плаценты. Преэклампсия представляет собой многосистемное заболевание, которое приводит к функциональным нарушениям многочисленных органов и может выражаться в разнообразных симптомах. Типичные для заболевания

- 6 009463 нарушения кровоснабжения являются следствием повышенного сопротивления сосудов, которое локально может проявляться различным образом. Для преэклампсии считается гарантированным, что эндотелиальная дисфункция представляет собой центральный компонент патогенеза.

Под термином почечная недостаточность понимают, согласно настоящему изобретению, ограниченную способность почек к выделению обязательных для мочи веществ, причем на прогрессирующих стадиях происходит потеря также способности регуляции электролитного, водного и кислотно-основного баланса. Терминальная почечная недостаточность характеризуется совместным разрушением экскреторной и эндокринной почечной функции.

При почечной недостаточности речь может идти, согласно изобретению, об активной почечной недостаточности, которую называют также острая почечная недостаточность, шоковая почка или шоковая анурия. Острая почечная недостаточность характеризуется внезапной частичной или полной потерей экскреторной почечной функции как следствие чаще всего обратимого повреждения почек. Причиной могут быть недостаточная перфузия за счет гиповолемии, гипотонии и дегидратации вследствие кровопотерь (политравма, желудочно-кишечное или постпартальное кровотечение, большие операционные вмешательства в случае сердца, сосудов, брюшной полости или простаты), шок (инфаркт миокарда, эмболия), тяжелые инфекции (сепсис, перитонит, холецистит), гемолиз (гемолитически-уремический синдром, пароксизмальная гемоглобинурия, промежуточное падение трансфузии), миолиз (краш-синдром, рабдомиолиз, миозит, ожоги), обезвоживания и потери электролитов (массивная рвота, диареи, чрезмерные потения, кишечная непроходимость, острый панкреатит). Другими причинами могут быть нефротоксины, такие как экзогенные токсины, например анилин, гликолевые соединения, метанол и подобные, или эндогенные токсины, например миоглобин и оксалаты. Дальнейшими причинами острой почечной недостаточности являются заболевания почек, такие как, например, воспалительные нефропатии или реакции отторжения после трансплантации почки. Острая почечная недостаточность может возникать также за счет задержки мочи вследствие затруднений мочевыделения. Предлагаемое согласно изобретению лечение острой почечной недостаточности с помощью эритропоэтина приводит, согласно изобретению, к предотвращению или по меньшей мере к уменьшению прогрессирования острой почечной недостаточности.

При почечной недостаточности, согласно изобретению, речь может идти также о хронической почечной недостаточности. Причинами хронической почечной недостаточности являются сосудистые, гломерулярные и тубулоинтерстициальные заболевания почек, инфекции, а также врожденные или приобретенные структурные дефекты. Причинами хронической почечной недостаточности являются, в частности, хроническая гломерулопатия, хронический пиелонефрит, нефропатия за счет анальгетиков, закупоривающая уропатия, а также артерио- и артериолосклероз. Хроническая почечная недостаточность в конечном счете переходит в уремию. Предлагаемое согласно изобретению лечение хронической почечной недостаточности с помощью эритропоэтина приводит, согласно изобретению, к уменьшению прогрессирования хронической почечной недостаточности.

Согласно настоящему изобретению под термином сердечная недостаточность понимают картину болезни, которую также называют как недостаточность функционирования миокарда или слабость сердечной мышцы. Сердечная недостаточность характеризуется недостаточной функцией сердца, при которой сердце больше не в состоянии развивать соответствующую требованиям мощность. Классификацию сердечной недостаточности можно осуществлять с различных точек зрения. Соответственно пораженной части сердца осуществляют, например, подразделение на правую сердечную недостаточность, левую сердечную недостаточность и недостаточность с обеих сторон (общая сердечная недостаточность). В зависимости от стабильности равновесия, на которое влияют физиологические и терапевтические механизмы, различают компенсированную и декомпенсированную сердечную недостаточность. Соответственно протеканию процесса осуществляют подразделение на острую и хроническую сердечную недостаточность. Причинами сердечной недостаточности являются, в частности, инфаркт сердца, кардиомиопатия, врожденный или приобретенный порок сердца, артериальная или легочная гипертония, нарушения сердечного ритма, коронарная болезнь сердца или миокардит.

Согласно настоящему изобретению под термином заживление раны понимают физиологические процессы для регенерации нарушенной ткани, соответственно, для закрытия раны, в особенности новообразование соединительной ткани и капилляров. При заживлении раны речь может идти о первичном заживлении раны (8аиа!ю рег рпшаш т!ешоиет), которое характеризуется быстрым и без осложнений закрытием, и дальнейшим КейЩЦю аб йИегиш вследствие минимального новообразования соединительной ткани между хорошим кровоснабжением и, в случае необходимости, адаптированными краями чистой раны. В случае ран с находящимися на расстоянии друг от друга, в особенности раздавленными или некротическими краями, соответственно с раневыми инфекциями, осуществляется замедленное вторичное заживление раны (8аиа!ю рег кесиибат т!ешоиет), при котором за счет бактериального воспаления происходит восполнение дефекта ткани с помощью грануляционной ткани и расширенного образования рубцовой ткани. Эпителизация края завершает заживление раны. Заживление раны подразделяют на три фазы: латентную фазу, фазу пролиферации и репаративную фазу. Латентную фазу снова подразделяют на экссудативную фазу с образованием струпа, в особенности в первые часы после возникновения раны,

- 7 009463 и резорбтивную фазу с катабольным аутолизом, которая продолжается в течение периода времени от 1 до 3 дней после возникновения раны. Фаза пролиферации характеризуется анабольной репарацией с образованием коллагена за счет фибробластов и наступает на 4-7 день после возникновения раны. Начиная с 8 дня после возникновения раны наступает репаративная фаза, которая характеризуется превращением грануляционной ткани в рубец.

Под термином рана согласно настоящему изобретению понимают нарушение связности тканей организма с потерей или без потери вещества, которое происходит за счет механического ранения или физически обусловленного повреждения клеток. Формами раны являются механические раны, термические раны, химические раны, обусловленные излучением раны и обусловленные болезнью раны. Механические раны образуются за счет внешнего насильственного воздействия и возникают прежде всего в виде резаных и колотых ран, ран от царапин и укушенных ран и огнестрельных ран. Термические раны возникают за счет воздействия нагрева или холода. Химические раны возникают в особенности за счет травления с помощью кислот или щелочей. Обусловленные излучением раны возникают, например, за счет воздействия актинического и ионизирующего излучения. Появляющиеся в результате болезни раны представляют собой, в особенности обусловленные застоем, раны, травматические раны, диабетические раны и т.д. Согласно изобретению в особенности предусматривается, что для заживления раны эритропоэтин предпочтительно применяют локально или внутривенно.

Настоящее изобретение относится поэтому к применению эритропоэтина для лечения гиперхолестеринемии, сахарного диабета, опосредованных эндотелием хронических воспалительных заболеваний, эндотелиоза, включая ретикулоэндотелиоз, атеросклероза, коронарной болезни сердца, ишемии миокарда, стенокардии, обусловленных старением сердечно-сосудистых заболеваний, ишемических заболеваний конечностей, преэклампсии, болезни Рейно, вызванной беременностью гипертонии, хронической или острой почечной недостаточности, в особенности терминальной почечной недостаточности, сердечной недостаточности, заживления ран и заболеваний, являющихся следствием предыдущих заболеваний.

Согласно изобретению предусматривается, что эритропоэтин вводят пациенту в терапевтически эффективной дозе, которая является достаточной для лечения состояния вышеуказанного заболевания, в особенности заболевания, которое связано с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, или для профилактики этого состояния, прекращения прогрессирования такого заболевания и/или облегчения симптомов такого заболевания. Вводимая пациенту доза зависит от множества факторов, например, от возраста, массы тела и пола пациента, тяжести заболеваний и т. д.

Особенно предпочтительно, согласно изобретению, эритропоэтин в случае всех применений, способов и композиций, в соответствии с настоящим изобретением используют в очень незначительных количествах, которые ниже используемых, как известно, количеств, причем в особенности вводят ίη νίνο, т.е. на пациента, дозы эритропоэтина от 200 до 2000 единиц (Ед.; международные единицы) в неделю, предпочтительно дозы от 500 до 2000 Ед. в неделю в зависимости от тяжести заболевания и в зависимости от функции почек. В случае предусматриваемых согласно изобретению доз от 200 до 2000 Ед. в неделю и на пациента, в особенности от 500 до 2000 Ед. в неделю и на пациента, речь идет о субполицитемических дозах, т. е. дозах, которые не приводят к эритроцитозу со значениями гематокрита более чем 50%. Предусматриваемые согласно изобретению субполицитемические дозы соответствуют еженедельным дозам примерно от 1 до 90 Ед. ЕРО/кг массы тела, в особенности 1-45 Ед. ЕРО/кг массы тела или сравнимой недельной дозе аранеспа 0,005-0,45 мкг/кг массы тела, в особенности 0,005-0,225 мкг/кг массы тела. В случае аранеспа речь идет о вдвое полиэтиленгликолированном эритропоэтине. Доза 2002000 Ед. в неделю на пациента, в особенности 500-2000 Ед. в неделю и на пациента, которая предусматривается согласно изобретению для лечения заболеваний или болезненных состояний, протекающих с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, является очень низкой по сравнению с обычно используемой для лечения ренальной анемии начальной дозой 50-150 Ед./кг массы тела в неделю (как правило, начинающейся с 4000-8000 Ед. в неделю, при неудовлетворительном результате лечения, однако, также значительно выше).

Особенно предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина и/или его производных в качестве биологически активного вещества для получения фармацевтической композиции или лекарственного средства в целях лечения болезненных состояний или заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников.

Согласно изобретению под термином биологически активное вещество понимают гомолочное или чужеродное вещество, которое при контакте с молекулами-мишенями или клетками-мишенями или тканями-мишенями влияет на специфические функции тканей, органов или организмов дифференцированным образом. Согласно изобретению также предусматривается, что эритропоэтин в качестве биологически активного вещества предлагаемой согласно изобретению фармацевтической композиции при контакте с эндотелиальными клетками-предшественниками влияет на их поведение в отношении пролиферации, дифференцировки и/или миграции в организме человека или животного таким образом, что компенсируются дисфункции эндотелиальных клеток-предшественников и можно эффективно бороться, облегчать или устранять возникающие вследствие этих дисфункций заболевания, соответственно, можно эффективно предупреждать эти заболевания.

- 8 009463

Согласно настоящему изобретению под выражением фармацевтическая композиция или лекарственное средство понимают смесь, используемую для диагностических, терапевтических и/или профилактических целей, следовательно, способствующую или восстанавливающую здоровье организма человека или животного, которая включает по меньшей мере одно природное или синтетически полученное биологически активное вещество, которое оказывает терапевтическое действие.

Фармацевтическая композиция может быть как твердой, так и жидкой смесью. Например, фармацевтическая композиция, включающая биологически активное вещество, может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых компонентов. Сверх того, фармацевтическая композиция может включать обычно используемые в данной области добавки, например стабилизаторы, средства для получения готовой формы, смазки, порофоры, эмульгаторы или другие, обычно используемые для получения фармацевтической композиции вещества.

Согласно изобретению в особенности предусматривается применение эритропоэтина и/или его производного в качестве биологически активного вещества для получения лекарственного средства в целях лечения гиперхолестеринемии, сахарного диабета, опосредованных эндотелием хронических воспалительных заболеваний, таких как васкулиты, эндотелиоз, включая ретикулоэндотелиоз, атеросклероз, коронарная болезнь сердца, ишемия миокарда, стенокардия, обусловленное старением сердечнососудистое заболевание, ишемические заболевания конечностей, болезнь Рейно, преэклампсия, вызываемая беременностью гипертония, острая или хроническая почечная недостаточность, в особенности терминальная почечная недостаточность, сердечная недостаточность, заживление раны, а также заболевания, являющиеся следствием предыдущих заболеваний.

Предлагаемая согласно изобретению фармацевтическая композиция может быть пригодна как для локального, так и для системного введения.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается, что фармацевтическая композиция применяется для парентерального, в особенности внутривенного, внутримышечного, интрадермального или подкожного введения. Содержащее эритропоэтин лекарственное средство предпочтительно имеет форму инъекции или инфузии.

Согласно следующему применению предусматривается, что содержащая эритропоэтин фармацевтическая композиция вводится перорально. Например, содержащее эритропоэтин лекарственное средство вводят в жидкой форме применения, такой как раствор, суспензия или эмульсия, или твердой форме применения, такой как таблетка.

Согласно следующему применению предусматривается, что фармацевтическая композиция пригодна для легочного введения или для ингаляции. Согласно изобретению, следовательно, предусматривается, что эритропоэтин терапевтически эффективным образом вводится прямо в легкие пациента. Эта форма введения эритропоэтина позволяет быстро вводить дозу эритропоэтина пациенту без необходимости осуществления инъекции. При поступлении эритропоэтина через легкие в кровообращение могут вводиться значительные количества эритропоэтина через легкие, что приводит к повышенным количествам эритропоэтина в системе кровообращения. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения в случае вводимой через легкие фармацевтической композиции речь идет о водном или неводном растворе или о сухом порошке. При нахождении вводимого через легкие, содержащего эритропоэтин лекарственного средства в форме сухого порошка оно включает предпочтительно содержащие эритропоэтин частицы, причем частицы имеют диаметр меньше чем 10 мкм, так что лекарственное средство может достигать также дистальных областей легких пациента. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается, что вводимое через легкие лекарственное средство находится в форме аэрозоля.

Особенно предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина для получения фармацевтической композиции в целях лечения заболеваний, связанных с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, причем фармацевтическая композиция, наряду с эритропоэтином в качестве биологически активного вещества, содержит по меньшей мере одно другое дополнительное биологически активное вещество для стимуляции эндотелиальных клетокпредшественников.

В случае другого биологически активного вещества речь идет предпочтительно о биологически активном веществе, которое в особенности стимулирует физиологическую мобилизацию эндотелиальных клеток-предшественников из костного мозга.

Согласно изобретению в случае другого биологически активного вещества, однако, речь также может идти о биологически активном веществе, которое в особенности стимулирует поведение в отношении деления, следовательно, пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников. Согласно изобретению, однако, существует также возможность того, что другое биологически активное вещество стимулирует в особенности поведение в отношении дифференцировки и/или поведение в отношении миграции эндотелиальных клеток-предшественников. В случае другого стимулирующего эндотелиальные клетки-предшественники биологически активного вещества особенно предпочтительно речь идет о УЕОЕ, РЮЕ, ОМ-С8Е, ингибиторе НМО-СоА-редуктазы, в особенности о статине, таком как симвастатин, мевастатин или аторвастатин, и/или о доноре N0, в особенности о Ь-аргинине.

- 9 009463

Согласно изобретению также предусматривается, что по меньшей мере одно другое биологически активное вещество стимулирует в особенности образовавшиеся путем дифференцировки эндотелиальные клетки, т.е. их пролиферацию и/или миграцию, но не эндотелиальные клетки-предшественники. При этом особенно предпочтительно речь идет о ЬТСТ (основной фактор роста фибробластов) или ангиогенине.

Следующий вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина и/или его производных в качестве биологически активного вещества для получения фармацевтической композиции для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников, в особенности в целях стимуляции мобилизации, пролиферации, дифференцировки в эндотелиальные клетки и/или для миграции в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула. Согласно изобретению, далее, предусматривается применение эритропоэтина и/или его производных в качестве биологически активного вещества для получения фармацевтической композиции в целях стимуляции васкулогенеза и/или образования эндотелия, в особенности в организме взрослого человека или животного.

Настоящее изобретение, таким образом, относится также к фармацевтическим композициям для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников, в особенности для стимуляции их мобилизации, пролиферации, дифференцировки в эндотелиальные клетки и/или миграции в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула, для стимуляции васкулогенеза и/или образования эндотелия и для лечения заболеваний организма человека или животного, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток. Настоящее изобретение в особенности относится к фармацевтическим композициям или лекарственным средствам, которые включают эритропоэтин в качестве биологически активного вещества и по меньшей мере одно другое билогически активное вещество для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников и/или образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые включают эритропоэтин и по меньшей мере одно другое биологически активное вещество, выбираемое из группы, состоящей из УЕСТ, Р1СТ, СМ-С8Т, ингибитора НМС-СоА-редуктазы, в особенности статина, такого как симвастатин, мевастатин или аторвастатин, донора N0 в особенности Ь-аргинина, ЬТСТ и ангиогенина.

Следующий предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина для получения трансплантируемого препарата эндотелиальных клеток. Согласно изобретению, при этом в особенности предусматривается, что эндотелиальные клетки получают ίη νίίτο путем культивирования эндотелиальных клеток-предшественников в присутствии эритропоэтина и затем трансплантируют в организм реципиента, в особенности в организм, страдающий заболеванием, которое связано с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников. Например, мононуклеарные клетки (МNС) можно выделять из крови посредством центрифугирования в градиенте плотности и культивировать ίη νίίτο в пригодных культуральных средах. Способы выделения и культивирования ίη νίίτο мононуклеарных клеток описываются, например, Акайага, 8с1е1тсе, 275, 1997, 964-967; Э|тте1ег е! а1., 1 С1т. [нуек!., 108, 2001, 391-397 и е! а1., 1. С1т. [нуек!., 108, 2001, 399-405. Затем мононуклеарные клетки культивируют дальше в присутствии эритропоэтина, чтобы стимулировать содержащиеся в мононуклеарных клетках эндотелиальные клетки-предшественники относительно их поведения в отношении пролиферации и дифференцировки и в особенности повышать количество дифференцированных адгезивных эндотелиальных клеток. Согласно изобретению также предусматривается, что культивирование мононуклеарных клеток осуществляют в присутствии эритропоэтина и по меньшей мере одного другого вещества, которое стимулирует пролиферацию и дифференцировку эндотелиальных клетокпредшественников. В качестве другого вещества особенно предпочтительно используют УЕСТ, Р1СТ, СМ-С8Т, донор N0, такой как Ь-аргинин, или ингибитор НМС-ОзА-редуктазы, такой как статин, в особенности симвастатин, мевастатин или аторвастатин.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается применение эритропоэтина для предварительной обработки и/или дальнейшей обработки трансплантируемых тканей или органов. При этом трансплантаты обрабатывают эритропоэтином перед трансплантацией, предпочтительно непосредственно перед ней, еще в организме донора. Организм реципиента также можно обрабатывать эритропоэтином в момент трансплантации. За счет этой обработки эритропоэтином трансплантируемых органов или тканей, как непосредственно перед, так и после трансплантации, согласно изобретению достигают того, что в трансплантате после осуществленной трансплантации в организм на основании индуцированного васкулогенеза быстро образуются новые кровеносные сосуды и эти вновь образовавшиеся кровеносные сосуды быстро связываются с кровеносной системой организма реципиента. Таким образом, также быстро достигается образование эндотелия. Обработка трансплантатов органов или тканей с помощью эритропоэтина вызывает, таким образом, более быстрое врастание этих систем в организм, благодаря чему значительно уменьшается риск отторжения.

Согласно следующему варианту осуществления изобретения предусматривается, что трансплантаты органов или тканей перед трансплантацией обрабатывают эритропоэтином в сочетании по меньшей мере с одним другим фактором, который стимулирует эндотелиальные клетки-предшественники. В случае этого фактора предпочтительно речь идет о веществе, выбираемом из группы, состоящей из УЕСТ,

- 10 009463

Р1СЕ, СМ-С8Е, ингибитора НМС-СоА-редуктазы, такого как, например, статин, в особенности симвастатин, мевастатин или аторвастатин, или донора N0, в особенности Ь-аргинина. Согласно следующему варианту осуществления предусматривается, что трансплантаты органов или тканей перед трансплантацией обрабатывают, наряду с эритропоэтином, с помощью другого вещества, которое стимулирует пролиферацию и миграцию образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток. В случае этого вещества особенно предпочтительно речь идет о ангиогенине или ЬЕСЕ. Согласно следующему варианту осуществления предусматривается, что предварительную обработку трансплантатов органов или тканей эритропоэтином осуществляют при использовании выделенных и, в случае необходимости, культивированных ίη νίΐτο эндотелиальных клеток-предшественников.

Согласно другому, особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается, что эритропоэтин применяют для приготовления имплантируемых или трансплантируемых, содержащих клетки, ίη νίΐτο-органов или тканей. Согласно изобретению в особенности предусматривается, что полученный ίη νίΐτο орган или ткань перед трансплантацией или имплантацией обрабатывают ίη νίΐτο эритропоэтином, чтобы стимулировать находящиеся в организме реципиента эндотелиальные клетки-предшественники, в особенности их физиологическую мобилизацию, миграцию, пролиферацию и дифференцировку. Предпочтительно организм реципиента после трансплантации, соответственно, имплантации ίη νίΐτο-органа или ткани обрабатывают дальше эритропоэтином в предлагаемых согласно изобретению дозах. За счет обработки ίη νίΐΓο-органа или ткани перед трансплантацией, соответственно, имплантацией с помощью эритропоэтина и, в случае необходимости, дополнительной обработки организма реципиента с помощью эритропоэтина согласно изобретению достигают того, что в системе ίη νίΐτο-органа или ткани после осуществленной трансплантации или имплантации в организм на основании индуцированного васкулогенеза быстро образуются новые кровеносные сосуды и эти вновь образовавшиеся кровеносные сосуды быстро связываются с кровеносной системой организма реципиента. Таким образом, также быстро достигается образование эндотелия и тем самым реэндотелиализация. Обработка систем ίη νίΐτο-органов или тканей с помощью эритропоэтина, таким образом, вызывает более быстрое врастание этих систем в организм, благодаря чему значительно уменьшается риск отторжения, и служит для защиты трансплантата.

Под выражением система ίη νίΐτο-органа или ткани понимают трансплантируемую или имплантируемую, содержащую клетки ткань или орган, которую (который) получают ίη νίΐτο при применении определенных клеток и/или определенной ткани и в определенных условиях культивирования. Под имплантируемой системой ίη νίΐτο-органа или ткани понимают систему, которая наряду с клетками включает чужеродные вещества. Под трансплантируемой системой ίη νίΐτο-органа или ткани понимают в особенности содержащую клетки систему, которая наряду с клетками содержит гомологичные тканям или органам одного и того же или другого индивидуума вещества. Ιη νίΐτο-органы или ткани отличаются в особенности тем, что в отношении их строения они в значительной степени соответствуют заменяемым нативным органам или тканям и, таким образом, ίη νίνο могут брать на себя функцию замененных нативных органов или тканей.

Согласно предлагаемому в изобретении варианту осуществления предусматривается, что системы ίη νίΐτο-органов или тканей перед трансплантацией, соответственно, имплантацией обрабатывают эритропоэтином в сочетании по меньшей мере с одним другим фактором, стимулирующим эндотелиальные клетки-предшественники. В случае этого фактора предпочтительно речь идет о веществе, выбираемом из группы, состоящей из УЕСЕ, РЮЕ, СМ-С8Е, ингибитора НМС-СοА-редуктазы, в особенности симвастатина, мевастатина или аторвастатина, и донора N0. Согласно следующему варианту осуществления предусматривается, что системы ίη νίΐτο-органов или тканей перед трансплантацией, соответственно, имплантацией обрабатывают, наряду с эритропоэтином, с помощью другого вещества, которое стимулирует пролиферацию и миграцию образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток. В случае этого вещества особенно предпочтительно речь идет о ангиогенине или ЬЕСЕ. Согласно другому варианту осуществления, предусматривается, что системы ίη νίΐτο-органов или тканей дополнительно содержат выделенные и, в случае необходимости, ίη νίΐτο культивированные эндотелиальные клеткипредшественники.

Дальнейший предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина для получения протезов сосудов или сердечных клапанов, причем протезы сосудов или сердечные клапаны перед введением в организм, в особенности организм человека, покрывают эритропоэтином. За счет покрытия протезов сосудов или сердечных клапанов эритропоэтином достигают того, что в организме реципиента стимулируются эндотелиальные клетки-предшественники, причем стимулируются в особенности их мобилизация из костного мозга, их пролиферация, их дифференцировка в эндотелиальные клетки и их миграция к используемым протезам сосудов или сердечным клапанам. После введения таким образом полученного протеза сосуда или сердечного клапана в организм его можно обрабатывать далее с помощью эритропоэтина, в особенности в предлагаемых согласно изобретению дозах. Обусловленное этим быстрее происходит образование эндотелиальных слоев на используемых протезах сосудов и более быстрое врастание в пораженные области организма. Согласно предпочтительному варианту осуществления предусматривается, что для покрытия протезов сосудов и сердечных клапанов

- 11 009463 дополнительно используют выделенные и, в случае необходимости, культивированные ίη νίίΓΟ эндотелиальные клетки-предшественники.

Настоящее изобретение относится также к способу стимуляции образования эндотелиальных клеток ίη νίίτο, включающему:

a) выделение содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток из крови посредством центрифугирования в градиенте плотности;

b) культивирование выделенных, содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток в среде для культивирования клеток;

c) культивирование популяций клеток в присутствии эритропоэтина.

Согласно изобретению культивирование популяций клеток можно осуществлять в присутствии другого вещества, которое стимулирует эндотелиальные клетки-предшественники.

Настоящее изобретение относится далее к способу лечения заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, путем введения эритропоэтина в дозе от 200 до 2000 Ед. в неделю, в особенности в дозе от 500 до 2000 Ед. в неделю пациенту с таким заболеванием. Предлагаемый согласно изобретению способ в особенности пригоден для лечения заболеваний человеческого организма, таких как гиперхолестеринемия, сахарный диабет, опосредованные эндотелием хронические воспалительные заболевания, такие как васкулиты, эндотелиоз, включая ретикулоэндотелиоз, атеросклероз, коронарная болезнь сердца, ишемия миокарда, стенокардия, обусловленное возрастом сердечно-сосудистое заболевание, ишемические заболевания конечностей, болезнь Рейно, преэклампсия, вызванная беременностью гипертония, острая или хроническая почечная недостаточность, в особенности терминальная почечная недостаточность, сердечная недостаточность, заживление ран, а также заболевания, являющиеся следствием предыдущих заболеваний.

Согласно предпочтительному варианту осуществления предлагаемого в изобретении способа лечения заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, предусматривается, что пациенту, наряду с эритропоэтином, вводят по меньшей мере одно другое биологически активное вещество, выбираемое из группы, состоящей из УЕСЕ, РЮЕ, 6М-С8Е, ингибитора НМССоА-редуктазы и донора N0. В случае вводимого ингибитора НМС-СоА-редуктазы речь идет предпочтительно о статине, таком как симвастатин, мевастатин или аторвастатин. В случае вводимого донора N0 речь идет предпочтительно о Ь-аргинине.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления предлагаемого в изобретении способа лечения заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клетокпредшественников, предусматривается выделение энотелиальных клеток-предшественников из крови организма человека, культивирование ίη νίίτο при применении эритропоэтина и дифференцировка в эндотелиальные клетки и, после очистки и выделения образовавшихся за счет дифференцировки эндотелиальных клеток, соответственно, дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников, затем их целенаправленное трансплантирование в область организма, ткань или орган пациента, которая (который) повреждена (поврежден) по причине дисфункции эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток, чтобы индуцировать там локальное новообразование эндотелия. Таким образом, возможно более целенаправленное и более быстрое лечение поврежденных областей организма, тканей и/или органов пациента. Этот вариант осуществления предлагаемого в изобретении способа лечения заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, включает следующие стадии:

b) культивирование содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток в среде для культивирования клеток;

c) культивирование содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток в присутствии эритропоэтина для стимуляции пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников и/или их дифференцировки в эндотелиальные клетки;

Л) выделение и очистка образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток; и

е) трансплантация образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток в организм с заболеванием, которое связано с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников.

После трансплантации образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток в организм, его можно обрабатывать далее эритропоэтином, в особенности в предлагаемых согласно изобретению дозах от 200 до 2000 Ед. в неделю.

Согласно изобретению содержащие эндотелиальные клетки-предшественники популяции клеток культивируют ίη νίίτο в присутствии по меньшей мере одного другого биологически активного вещества, выбираемого из группы, состоящей из УЕСЕ, РЮЕ, 6М-С8Е, ингибитора НМС-СоА-редуктазы и донора N0. В случае используемого для культивирования ингибитора НМС-СоА-редуктазы речь идет предпочтительно о статине, таком как симвастатин, мевастатин или аторвастатин.

- 12 009463

Дальнейший предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу лечения заболеваний сосудов, включающему:

б) выделение и очистка образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток; и

е) трансплантацию эндотелиальных клеток в организм с заболеванием сосудов.

После трансплантации эндотелиальных клеток в организм с заболеванием сосудов его можно обрабатывать далее с помощью эритропоэтина, предпочтительно в предлагаемых согласно изобретению дозах от 200 до 2000 Ед. в неделю.

Согласно изобретению существует возможность культивирования содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток в присутствии по меньшей мере одного другого биологически активного вещества, выбираемого из группы, состоящей из УЕСЕ, Р1СЕ, СМ-С8Е и/или ингибитора НМС-СоА-редуктазы. В случае применяемого для культивирования ингибитора НМС-СоА-редуктазы речь идет предпочтительно о статине, таком как симвастатин, мевастатин или аторвастатин.

Согласно предлагаемому в изобретении способу лечения заболеваний сосудов, следовательно, предусматривается выделение эндотелиальных клеток-предшественников из крови человеческого организма, культивирование ίη νίΐτο при применении эритропоэтина и дифференцировка в эндотелиальные клетки и, после очистки и выделения образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток, соответственно, дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников, их трансплантация целенаправленно в поврежденный кровеносный сосуд или ишемическую область, чтобы там индуцировать локальную неоваскуляризацию. Таким образом, возможна более целенаправленная и более быстрая терапия поврежденных кровеносных сосудов или ишемической ткани. Предлагаемый согласно изобретению способ лечения заболеваний сосудов в особенности пригоден для лечения таких заболеваний сосудов, как ишемия, в особенности церебральная ишемия, ишемические заболевания конечностей, ишемия миокарда, инфаркт сердца, инсульт, коронарная болезнь сердца, стенокардия, острая обтурация артерии, артериальное облитерирующее заболевание, болезнь Рейно и эрготизм.

Дальнейшие предпочтительные варианты осуществления изобретения следуют из зависимых пунктов формулы изобретения.

Изобретение поясняется подробнее с помощью нижеследующих фигур и примеров.

На фиг. 1 представлены результаты анализа при использовании клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) циркулирующих стволовых клеток СЭ34' (с8С): (А-Ό): пробы пациентов; (Е-Е): изотипические контроли. Стволовые клетки СЭ34' идентифицируют с помощью дополнительной экспрессии маркера ί.Ό34 (В и Е), с помощью характерной от незначительной до средней экспрессии антигена ί.Ό45 (С и С) и с помощью характерных свойств в отношении светорассеяния (Ό и Н). Абсолютное количество с8С рассчитывают на 100000 моно- и лимфоцитов.

На фиг. 2 представлено количественное определение циркулирующих стволовых клеток с помощью проточной цитометрии. На фигуре показано зависящее от времени действие обработки эритропоэтином при применении человеческого рекомбинантного эритропоэтина (тйЕРО) спустя 0, 2, 4, 6 и 8 недель, п=11, значения соответствуют средним значениям ± стандартное отклонение. Медиана представлена в виде линии.

*: р<0,01 по сравнению с 2 неделями; ψ: р<0,05 по сравнению с 4 неделями; #: р<0,05 по сравнению с 8 неделями.

На фиг. 3 представлено количественное определение культивированных эндотелиальных клетокпредшественников (ЕРС). На фигуре показано, что обработка с помощью тйЕРО повышает относительное количество эндотелиальных клеток-предшественников. Эндотелиальные клетки-предшественники выделяют перед обработкой ренальных пациентов с помощью тйЕРО, а также спустя 2, 4, 6 и 8 недель после обработки пациентов с помощью тйЕРО и характеризуют с помощью их адгезивной способности и обоих маркеров асЬПЬ-Об и ИЕА-1 Е1ТС. п=11, значения соответствуют средним значениям ± стандартное отклонение. Медиана представлена в виде линии.

*: р<0,01 по отношению к периоду времени перед обработкой; #: р<0,001 по отношению к периоду времени перед обработкой.

На фиг. 4 представлено количественное определение культивированных эндотелиальных клетокпредшественников (ЕРС). На фигуре показано, что абсолютное количество ЕРС до использования терапии с помощью тйЕРО значительно уменьшено по сравнению со здоровыми испытуемыми, подобранными по возрасту и полу. Пациенты с ренальной анемией, следовательно, проявляют отчетливую дисфункцию ЕРС по сравнению со служащими в качестве контроля людьми. Спустя 8 недель после начала тера

- 13 009463 пии с помощью 1Ί1ΕΡΘ в отношении ренальной анемии это уменьшенное число функциональных ЕРС компенсируется. ЕРС§ выделяют до терапии ренальных пациентов с помощью гйЕРО, а также спустя 2, 4, 6 и 8 недель после терапии пациентов с помощью гйЕРО и характеризуют с помощью их адгезивной способности и обоих маркеров асЬПЬ-ΌίΙ и ИЕЛ-1 МТС. и=11. Представлен примерно ход процесса в течение 8 недель и все контроли. Абсолютные значения представлены, с одной стороны, в виде отдельных значений. Дополнительно представлены гистограммы (90/75/50/25- и 10-й процентиль, а также среднее значение). В качестве здорового контроля служат подобранные по возрасту и полу испытуемые, у которых аналогичным образом выделяют и характеризуют ЕРС§ (и=11).

На фиг. 5 представлено воздействие эритропоэтина на заживление раны. На фигуре показано, что при обработке стандартизированной кожной раны, которую наносят мышам посредством тканевого перфоратора, с помощью эритропоэтина рана полностью закрывается уже спустя от семи до восьми дней, в то время как при обработке раны с помощью физиологического раствора хлорида натрия (солевой раствор) рана полностью закрывается только спустя от тринадцати до четырнадцати дней. Обработку эритропоэтином, соответственно, физиологическим раствором хлорида натрия начинают за 7 дней до нанесения раны. Рекомбинантный человеческий эритропоэтин вводят однократно еженедельно (группа и=5) путем подкожной инъекции (0,1 мкг/кг аранеспа).

На фиг. 6 показано, что эритропоэтин уменьшает потерю почечной функции после острой почечной недостаточности. Для исследования использовали крыс Зргадие Оа\\'1еу (массой 200-300 г). Крыс наркотизировали с помощью кетамина (120 мг/кг) и ромпуна (10 мг/кг). Одна из подопытных групп получала 0,1 мкг/кг массы тела аранесп один раз в сутки до индукции острой почечной недостаточности. В качестве сравнения служила группа подопытных животных, которым, соответственно, вводили путем подкожной инъекции в то же самое время раствор хлорида натрия. Посредством закрепления артериального зажима на правой почечной артерии прерывали кровоток в почке на 45 мин. В это время с левой стороны осуществляли нефрэктомию. Псевдооперацию осуществляли в случае другой, контрольной группы. При этом вскрывали брюшную полость, препарировали левую почечную артерию, но кровоснабжение не прерывали и отнимали контралатеральную правую почку. Всех животных наркотизировали на 60 мин и спустя 24 ч после операции умерщвляли. Ишемия в течение 45 мин с последующей реперфузией оставшейся правой почки в случае обработанных хлоридом натрия животных приводила к очень большой потере почечной функции. Это отражается на содержании креатинина в сыворотке, которое спустя 24 ч после ишемии-реперфузии в 7 раз больше, чем значение до ишемии-реперфузии (р<0,05). В противоположность этому, у обработанных аналогом эритропоэтина аранеспом животных обнаружили только четырехкратное увеличение содержания креатинина в сыворотке спустя сутки после индукции повреждения за счет ишемии-реперфузии. У левосторонне нефрэктомированных животных с псевдооперированной правой почкой не произошло никакого увеличения значений ретенции. На фигуре представлена концентрация креатинина в сыворотке обработанных эритропоэтином (ЕРО) животных (ΙΚ+ЕРО), обработанных с помощью №1С1 животных (ΙΚ) и псевдооперированных животных (8с11ет-ОР) до повреждения за счет ишемии-реперфузии (ΙΚ) и спустя 24 ч после этого. Из фигуры следует, что концентрация креатинина в сыворотке в случае обработанных аранеспом животных спустя 24 ч после повреждения за счет ишемии-реперфузии составляет почти половину по отношению к контролю без обработки с помощью ЕРО (обработка с помощью ЫаС1).

На фиг. 7 представлены кривые выживаемости по Каплану-Майеру двух испытуемых групп после индукции хронической почечной недостаточности, которых обрабатывали либо с помощью аранеспа, либо с помощью ЫаС1. Для исследования использовали крыс Зргадие Эа\у1еу в возрасте 8 недель. Крыс наркотизировали с помощью кетамина (120 мг/кг) и ромпуна (10 мг/кг). В день 0 у них отнимали правую почку, которую тотчас после отнятия фиксировали в формалине для гистологического исследования. В случае левой почки лигировали сегментарные артерии, которые снабжают верхний и нижний полюс почки. Благодаря этому вызывают инфаркт соответствующих областей почки и функциональной сохраняется только средняя треть почки. Крысы получали один раз в неделю аранесп (0,1 мкг/кг массы тела) или №1С1 путем подкожной инъекции. Обработанные с помощью аналога эритропоэтина аранеспа животные проявляют значительное преимущество в отношении выживаемости по сравнению с обработанными с помощью хлорида натрия животными (р=0,027; Ьод Каик-тест).

На фиг. 8-15 показаны наблюдаемые под микроскопом срезы почки спустя 6 недель после индукции хронической почечной недостаточности в случае двух испытуемых групп, которых обрабатывали либо с помощью аранеспа, либо с помощью ЫаС1, и относящиеся к ним кривые выживаемости по Каплан-Майеру представлены на фиг. 7.

На фиг. 8 представлены гистологические изменения у крысы 8ргас.|ие-0а\\'1еу с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью ЫаС1, начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлена средней величины прегломерулярная артерия с характерной типа луковой ше

- 14 009463 лухи пролиферацией стенки сосуда при тяжелом гипертензивном повреждении, так называемом злокачественном нефросклерозе с переходом в эндартериит.

На фиг. 9 представлены гистологические изменения у крысы 8ргадие-Эает1еу с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью №С1, начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен флоридный фокально-сегментальный гломерулосклероз в качестве так называемого пролиферативного Е8С8 (клубочек справа). Другой клубочек (слева) показывает ишемический коллапс лигатурной конволюты. В нижней части представленной картины можно видеть маленький сосуд с тяжелыми повреждениями эндотелия. Наблюдаемые гистологические изменения соответствуют гипертензивным повреждениям органа, соответственно, изменениям в рамках перегрузочной нефропатии после 5/6 нефрэктомии.

На фиг. 10 представлены гистологические изменения у крысы 8ргас.|ие-0а\\'1еу с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью №С1, начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен почти полный склероз, соответственно, деструкция компенсирующе увеличенного клубочка с выраженным гиалинозом, соответственно, фибриноидным некрозом относящейся к этому афферентной артериолы.

На фиг. 11 представлены гистологические изменения у крысы 8ргас.|ие-0а\\'1еу с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью №С1, начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре показана маленькая прегломерулярная артерия с характерной, в виде луковой шелухи, пролиферацией стенки сосуда и некрозом стенки при тяжелом гипертензивном повреждении, так называемым злокачественным нефросклерозом (сравнимое изображение справа). Слева можно видеть подлинную, (еще) неповрежденную артериолу.

На фиг. 12 представлены гистологические изменения у крысы 8ргас.|ие-0а\\'1еу с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью аранеспа (эритропоэтина) (0,1 мкг/кг аранеспа), начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом. В тубулоинтерстиции нельзя констатировать никакой патологии.

На фиг. 13 представлены гистологические изменения у крысы 8ргас.|ие-0а\\'1еу с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью аранеспа (эритропоэтина) (0,1 мкг/кг аранеспа), начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом (630-кратное увеличение). В тубулоинтерстиции нельзя констатировать никакой патологии.

На фиг. 14 представлены гистологические изменения у крысы 8ргас.|ие-0а\\'1еу с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью аранеспа (эритропоэтина) (0,1 мкг/кг аранеспа), начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом. В тубулоинтерстиции нельзя констатировать никакой патологии.

На фиг. 15 представлены гистологические изменения у крысы 8ргас.|ие-0а\\'1еу с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью аранеспа (эритропоэтина) (0,1 мкг/кг аранеспа), начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом (630-кратное увеличение). В тубулоинтерстиции нельзя костатировать никакой патологии.

- 15 009463

Пример 1. Действие эритропоэтина в случае пациентов с ренальной анемией.

Исследовали действие эритропоэтина в случае пациентов с ренальной анемией (НЬ<10,5 г/дл) как следствие болезни почек в конечной стадии (претерминальная почечная недостаточность; клиренс креатинина менее 35 мл/мин). 11 пациентов в течение периода времени по меньшей мере 8 недель обрабатывали эритропоэтином в еженедельных дозах в среднем 5000 Ед. гЬЕРО (рекомбинантный человеческий эритропоэтин) внутривенно, соответственно, подкожно. После обработки эритропоэтином исследовали в течение 20 недель эндотелиальные клетки-предшественники в крови пациентов, причем спустя 0, 2, 4, 6 и 8 недель эндотелиальные клетки-предшественники анализировали относительно их количества, а также их дифференцировочного статуса, посредством проточной цитометрии и теста на культивирование.

В случае циркулирующих периферических стволовых клеток крови (СРВ8С) речь идет о маленькой популяции клеток, которые экспрессируют как антиген СЭ34, так и антиген СЭ45. На основе рекомендаций 18НАСЕ разработан тест для определения количества СРВ8С посредством проточной цитометрии (8иШсг1апб с1 а1., 1. Нсш;Цо111сг.. 5, 213-226, 1996). При использовании этого теста определяли как этот образец экспрессии клеток СЭ34 и СЭ45, так и морфологию стволовых клеток. Таким образом определяли как абсолютное количество СРВ8С на 1 мкл, так и процентную долю СРВ8С в общем количестве лейкоцитов.

На фиг. 1 представлены результаты анализа при использовании клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (ЕАС8-анализ) циркулирующих стволовых клеток СЭ34' на основе рекомендаций 18НАСЕ.

На фиг. 2 показано количество определенных посредством ЕАС8-анализа стволовых клеток СЭ34' в течение периода времени 8 недель.

Тест в отношении клеточной культуры.

Мононуклеарные периферические клетки крови (РВМС) выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности в фиколле из человеческих проб крови по способу, описанному АкаЬага, 8с1спсс, 275, 964-967, 1997. Клетки помещали на культуральные планшеты с фибронектином и сохраняли в базальной среде ЕС. Базальная среда ЕС состоит из квот базальной среды ЕВМ-2 (фирма С1опсНс5) и ЕСМ-2 (ЬЕСЕ; СА-1000 (гентамицин, амфотерицин-В) ЕВ8, УЕСЕ, ЬЕСЕ-В (^/гепарин), В³-1СЕ-1, аскорбиновая кислота, гепарин). После культивирования в течение 4 дней неадгезивные клетки удаляли путем промывки планшетов. Остающиеся адгезивные клетки обрабатывали трипсином и снова высевали. Затем их культивировали в течение следующих трех дней. Клетки с эндотелиальным фенотипом в день 7 после выделения идентифицировали путем положительного окрашивания относительно двух различных эндотелиальных маркеров. При этом речь идет о маркированном ΌίΙ ацетилированном липопротеине низкой плотности (асЬПЕ-ΟίΙ) и аглютинине-1 И1сх сигорасш (ИЕА-1). Результаты этого исследования представлены на фиг. 3.

Результаты показывают, что эритропоэтин может мобилизировать эндотелиальные клеткипредшественники и повышать количество циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников. При этом могут компенсироваться функциональные дефициты, которые возникают при определенных патологических состояниях, таких как ренальная анемия. Эти результаты представлены на фиг. 4.

Посредством проточной цитометрии определено, что у пациентов с почечной недостаточностью в конечной стадии количество циркулирующих стволовых клеток СЭ34' соответствует количеству циркулирующих стволовых клеток СЭ34' в крови здоровых испытуемых. После начала обработки эритропоэтином значительно повышается количество стволовых клеток СЭ34' в системе кровообращения на более чем 50%. При использовании теста в отношении клеточной культуры определено, что после обработки эритропоэтином резко увеличивается количество клеток, которые относятся к эндотелиальному фенотипу. В случае функционального теста в отношении клеточной культуры очень ухудшенная способность эндотелиальных клеток-предшественников увеличивается более чем в три раза.

Пример 2. Улучшенное заживление раны за счет систематического использования рекомбинантного человеческого эритропоэтина (гЬЕРО).

Мышей ЕУВ/Ν наркотизировали путем ингаляционной анестезии с помощью изофлорана. Волосяной покров обеих задних ног удаляли с помощью лосьона для депиляции и дезинфицировали с помощью 70% спирта. С помощью стерильного четырехмиллиметрового одноразового перфоратора для биопсийной ткани в каждом случае наносили кожную рану на правый бок мышей. Противоположная сторона служила в качестве внутреннего контроля. Однократно осуществляли послеоперационную антибиотическую защиту с помощью пенициллина С (20000 ед./кг). В течение всего периода исследования осуществляли один раз в неделю подкожные инъекции аналога рекомбинантного человеческого эритропоэтина аранеспа (0,1 мкг/кг массы тела). Обработку начинали за семь дней до взятия перфоратором ткани. Результаты представлены на фиг. 5. Они показывают, что введение эритропоэтина значительно ускоряет процесс заживления раны.

- 16 009463

Пример 3. Уменьшение прогрессирования хронической почечной недостаточности за счет терапии эритропоэтином.

Крыс 8ргас.|ие-0а\\'1еу в возрасте восьми недель наркотизировали с помощью кетамина (120 мг/кг) и ромпуна (10 мг/кг). В день 0 у крыс отнимали правую почку, которую тотчас после отнятия фиксировали в формалине для гистологического исследования. В случае левой почки лигировали сегментарные артерии, которые снабжают верхний и нижний полюс почки. Благодаря этому вызывают инфаркт соответствующих областей почки, причем функциональной сохраняется только средняя треть почки. Крысы получали один раз еженедельно аналог эритропоэтина аранесп в дозе 0,1 мкг/кг массы тела или для контроля №С1. подкожно (8.С.).

На фиг. 7 представлена кривая выживаемости по Каплану-Майеру обеих испытуемых групп. Обработанные с помощью аранеспа животные имеют отчетливо повышенную выживаемость по сравнению с обработанными с помощью хлорида натрия контрольными животными.

На фиг. 12-15 показано, что после обработки эритропоэтином почечная ткань не показывает никаких патологических изменений, в то время как после обработки с помощью №1С1 видны тяжелые патологические изменения (сравниваемые фиг. 8-11). Дальнейшие гистологические исследования показали, что в случае обработанных аранеспом животных можно наблюдать отчетливо более высокую плотность сосудов (СЭ31), чем у обработанных с помощью хлорида натрия животных (данные не представлены).

Пример 4. Уменьшение прогрессирования острой почечной недостаточности.

Для этого исследования использовали крыс 8ргас.|ие-0а\\1еу с массой тела 250-300 г. Перед индукцией острой почечной недостаточности подопытные животные получали один раз в сутки аранесп в дозе 0,1 мкг/кг массы тела. Крыс наркотизировали с помощью кетамина (120 мг/кг массы тела) и ромпуна (10 мг/кг). В качестве сравнения служила группа подопытных животных, которым, соответственно, в то же самое время вводили путем подкожной инъекции раствор хлорида натрия. Кровоток в почке прерывали на 45 мин тем, что помещали артериальный зажим на правую почечную артерию. В это время с левой стороны осуществляли нефрэктомию. Псевдооперацию проводили в случае другой, контрольной группы. При этом вскрывали брюшную полость, препарировали левую почечную артерию, но кровоснабжение не прерывали, и отнимали контралатеральную правую почку. Всех животных наркотизировали на период времени 60 мин и спустя 24 ч после операции умерщвляли.

Ишемия в течение 45 мин с последующей реперфузией оставшейся правой почки в случае обработанных хлоридом натрия животных приводила к очень большой потере почечной функции. Это нашло свое выражение в повышенном в 7 раз количестве креатинина в сыворотке (р<0,05). В противоположность этому, у обработанных аналогом эритропоэтина аранеспом животных обнаружили только четырехкратное увеличение содержания креатинина в сыворотке спустя сутки после индукции повреждения за счет ишемии-реперфузии. У левосторонне нефрэктомированных животных с псевдооперированной правой почкой не произошло никакого увеличения значений ретенции. Результаты представлены на фиг. 6.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение эритропоэтина (ЕРО) для получения фармацевтической композиции, содержащей субполицитемическую дозу ЕРО, соответствующую еженедельной дозе от 1 до 90 международных единиц (Ед.) ЕРО/кг массы тела, для лечения хронической почечной недостаточности.
2. Применение эритропоэтина для получения фармацевтической композиции, содержащей субполицитемическую дозу ЕРО, соответствующую еженедельной дозе от 1 до 90 международных единиц (Ед.) ЕРО/кг массы тела, для лечения острой почечной недостаточности.
3. Применение эритропоэтина для получения фармацевтической композиции, содержащей субполицитемическую дозу ЕРО, соответствующую еженедельной дозе от 1 до 90 международных единиц (Ед.) ЕРО/кг массы тела, для заживления раны.
4. Применение по любому из пп.1-3, где фармацевтическая композиция пригодна для парентерального, в особенности внутривенного, внутримышечного, интрадермального или подкожного введения.
5. Применение по п.4, где фармацевтическая композиция находится в виде инъекции или инфузии.
6. Применение по любому из пп.1-3, где фармацевтическая композиция пригодна для легочного введения.
7. Применение по п.6, где фармацевтическая композиция находится в виде водного раствора, неводного раствора или порошка.
8. Применение по п.6 или 7, где фармацевтическая композиция находится в форме аэрозольного препарата.
9. Применение по любому из пп.1-3, где фармацевтическая композиция пригодна для перорального введения.
10. Применение по п.9, где фармацевтическая композиция находится в виде раствора, суспензии, эмульсии или таблетки.

- 17 009463
11. Применение по любому из пп.1-10, где фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно другое биологически активное вещество для стимуляции эндотелиальных клетокпредшественников.
12. Применение по п.11, где другим биологически активным веществом является фактор роста эндотелия сосудов (УЕСЕ), фактор роста плаценты (РЮЕ), колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (СМ-С8Е), ингибитор 3-гидрокси-3-метилглутарилкоэнзим А-редуктазы (НМС-СоАредуктазы) и/или донор N0, в особенности Ь-аргинин.
13. Применение по п.12, где ингибитором НМС-СоА-редуктазы является статин, такой как симвастатин, мевастатин или аторвастатин.
14. Применение по любому из пп.1-13, где эритропоэтином является человеческий или животный эритропротеин.
15. Применение по п.14, где эритропоэтином является производное, аналог, модификация или мутеин эритропоэтина.
16. Применение по п.14 или 15, где эритропоэтин выделяют из человеческой мочи, мочи или плазмы страдающих апластической анемией пациентов, тканевых культур человеческих почечных раковых клеток, обладающих способностью к образованию человеческого эритропоэтина человеческих лимфобластов или получаемой за счет слияния клеток человеческой клеточной линии гибридомной культуры.
17. Применение по п.14 или 15, где эритропоэтином является эритропоэтин, получаемый посредством методов рекомбинантных ДНК.