EA006484B1

EA006484B1 - Долгоживущие производные рилизинг-фактора гормона роста

Info

Publication number: EA006484B1
Application number: EA200300856A
Authority: EA
Inventors: Доминик П. Бридон; Ниссаб Буджеллаб; Роже Леже; Мартин Робитай; Люси Жетт; Коринн Бенке
Original assignee: Конджачем, Инк.
Priority date: 2001-02-02
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2005-12-29
Also published as: JP2008106073A; CN101696240A; WO2002062844A3; JP2009024017A; ZA200305641B; JP2004520395A; US7268113B2; CA2435563A1; CN1491233A; AU2002233082B2; BR0206919A; US20030073630A1; WO2002062844A2; EA200300856A1; EP1355941A2

Abstract

Настоящее изобретение относится к производным рилизинг-фактора гормона роста. В частности, данное изобретение относится к производным пептида GRF, имеющим продолжительный in vivo период полужизни, для стимулирования эндогенного продуцирования или высвобождения гормона роста у человека и животных.

Description

Данное изобретение относится к производным рилизинг-фактора ростового гормона (гормона роста, ОКБ). В частности, данное изобретение относится к пептидным производным с продолжительным временем полужизни для промотирования эндогенной продукции или высвобождения (рилизинга) гормона роста в организме человека или животных.

Предпосылки создания изобретения

Гормон роста (ОН), также известный как соматотропин, является белковым гормоном, содержащим примерно 190 аминокислот, синтезируемым в клетках и секретируемым в аденогипофизе клетками, называемыми соматотропными. Он играет главную роль в регуляции роста и в обмене веществ. Значительный интерес он представляет также в качестве фармацевтического продукта, применяющегося как для людей, так и для животных. Продукция ОН модулируется многими факторами, включая стресс, питание, сон и сам ОН. Однако его основными регуляторами являются два гормона гипоталамуса:

- рилизинг-фактор ростового гормона (ОКБ или ОНКН), последовательность из 44 аминокислот, которая стимулирует синтез и секрецию ОН и

- соматостатин (88), который ингибирует высвобождение ОН в ответ на ОКБ.

Показано, что биологическая активность ОКБ(1-44) является свойством Ν-концевой части пептида. Полная внутренняя активность и эффективность также проявляется ОКБ (1-29) как ίη νίΐΓΟ, так и ίη νίνο. Кроме того, непрерывное введение ОКБ индуцирует секрецию ОН, носящую такой же эпизодический характер, что и в нормальных физиологических условиях. Синтетические пептиды, такие как рилизинг пептид гормона роста (ОНКР), а также пептидомиметики, недавно полученные Мегск и другими фармацевтическими компаниями, продемонстрировали свою способность стимулировать рилизинг эндогенного ОН. Другой аналог тризамещённого ОКБ_1-29, полученный НоГГтапп-Ба Коске в середине 80^-х, [дезамино-Туг¹,И-А1а²,А1а¹⁵]-ОКБ_{1 -29},] является суперагонистом с длительным периодом действия.

Известно, что средства, усиливающие секрецию ОН (ОН8), стимулируют высвобождение ОН из гипофиза с помощью орфанного О-протеинсвязанного рецептора (ОН8-К). Недавно другой эндогенный лиганд для ОН8-К идентифицирован как грелин. Он представляет собой октаноилированный пептид (пептид из 28 остатков с н-октаноилом при 8ег³).

Рекомбинантный ОН (гОН) впервые получен в 1985 г. и сейчас выпускается промышленно как для медицинских целей, так и для целей ветеринарии. Однако не определялась долговременная безопасность гОН. Кроме того, сообщалось о нескольких побочных эффектах при применении гОН, а именно, об индексе массы левого желудочка, повышении уровня сывороточного липопротеина и странном изменении иммунных параметров. Наконец, известно, что частые болюсные инъекции гОН оказывают прогрессирующее суппрессирующее действие на рецепторы и, следовательно, на понижение их эффективности во времени.

Помимо этих практических недостатков, экзогенный ОН является видоспецифическим, что ограничивает его преимущества по увеличению роста и другое положительное действие на различные виды, то есть на человека и животных.

Найдено, что малые количества ОКБ вызывают значительное выделение гипофизом ОН в кровь животных, подвергаемых лечению. Следовательно, ОКБ имеет значительное терапевтическое применение в тех случаях, когда показан ростовой гормон. Например, его можно применять при лечении гипофизарного инфантилизма, диабета вследствие нарушения продукции ОН и замедления роста. Многие другие заболевания или состояния, при которых помогает эндогенная продукция или высвобождение ОКБ, приведены ниже. Кроме того, ОКБ применим в сельском хозяйстве. Примеры применения в сельском хозяйстве включают прирост мяса у свиней, крупного рогатого скота и т. п. Известно также, что ОКР стимулирует появление (продукцию) молока у дойных коров.

До настоящего времени основным недостатком применения родственных пептидам средств, усиливающих секрецию ОН, является отсутствие подходящей технологии, способной обеспечить практически линейную и пролонгированную доставку ОН в течение продолжительного периода времени, например от нескольких дней до недель.

ОКБ (1-29), как многие другие пептиды, обладающие терапевтическими свойствами, в высшей степени неустойчивы ίη νίνο, что значительно ограничивает их применение в качестве фармацевтического продукта для промотирования высвобождения ОН в организме человека и животных. Из-за того что период полужизни ОКБ 1-29 обычно не превышает 10-13 мин, его следует вводить в виде болюсных инъекций несколько раз в день или в виде вливаний, чтобы поддерживать измеряемый уровень высвобождения ОН.

Значительные усилия в последние несколько лет исследователи тратят на то, чтобы получить аналоги ОКБ длительного действия. Хотя синтезировано несколько новых аналогов с повышенной длительностью действия, ни один из них не отвечает критериям, предъявляемым лекарственным препаратам для ОН-рилизинга. Кроме того, не известно ни одного препарата для высвобождения таких неустойчивых пептидов в течение определённого периода времени в организме животных или человека.

В патенте США 5846936 описаны аналоги ОКБ, которые, как сказано, имеют повышенную эффективность, повышенную стабильность в отношении ферментов и повышенную стабильность в период по- 1 006484 лужизни. В патенте указано, что аналоги можно вводить с различными адъювантами, такими как сывороточный альбумин. Единственные результаты по стабильности в период полужизни представлены в патенте ίη νίίτο. Отсутствуют данные о действительной стабильности ίη νινο.

В патенте США 4963529 описана композиция ОКЕ либо в твёрдой, либо в жидкой форме, содержащая ОКЕ и человеческий сывороточный альбумин или глицин. Композиция также может содержать буфер, и утверждается, что она стабилизирует ОКЕ.

В Международной заявке УО 9724445 описано слияние ростового гормона (ЙОН) с молекулой рекомбинантного альбумина. Утверждается, что такой слитый белок имеет повышенное время полужизни в кровотоке по сравнению с неслитым гормоном роста. Между молекулой альбумина и ростовым гормоном может быть встроен линкер, необязательно расщепляемый для того, чтобы облегчить связывание ЙОН с рецептором.

В Международной заявке УО 0069900 описан способ продуцирования пептидов, стабилизированных в отношении пептидаз. Ряд пептидов ОКЕ перечислен как потенциальные кандидаты, которые можно стабилизировать по способу, раскрываемому в данной заявке, но ни один из них не приведён конкретно в качестве примеров в описании.

Следовательно, существует необходимость в создании соединения, устойчивого в течение длительного времени, способного промотировать высвобождение ОН в организме субъекта, животного или человека. Такое промотирование предпочтительно должно быть в течение продолжительного периода времени без нежелательных побочных эффектов гОН.

Сущность изобретения

Согласно данному изобретению предлагается производное рилизинг-фактора ростового гормона (ОКЕ) с повышенным, по сравнению с соответствующей немодифицированной (или нативной) ОКР пептидной последовательностью, периодом полужизни ίη νινο. Более конкретно, производное представляет собой ОКЕ пептид с присоединённой к нему реакционноспособной группой (реакционноспособным фрагментом), способной реагировать с соответствующими функциональными группами компонентов крови ίη νινο и ίη νίίτο с образованием устойчивой ковалентной связи. Реакционноспособная группа может присоединяться к Ν-концу пептида, к С-концу пептида или к любому другому подходящему сайту вдоль пептидной цепи.

Предпочтительные компоненты крови включают белки, такие как иммуноглобулины, включая 1дО и 1дМ, сывороточный альбумин, ферритин, стероид-связывающие белки, трансферрин, тироксинсвязывающий белок, α-2-макроглобулин и т.д., причём более предпочтительными являются сывороточный альбумин и 1дО, а наиболее предпочтительным является сывороточный альбумин.

Предпочтительные реакционноспособные группы способны образовывать ковалентную связь с компонентами крови, реагируя с находящимися в них аминогруппами, гидроксильными группами или тиольными группами, либо ίη νινο, либо ίη νίίτο (или ех νινο). В наиболее предпочтительном варианте изобретения функциональная группа белка может представлять собой тиольную группу, а реакционноспособный фрагмент может являться акцептором Михаэля, таким как акролеиновые производные, α,βненасыщенные кетоны, α,β-ненасыщенные сложные эфиры, α,β-ненасыщенные амиды, α,β-ненасыщенные тиоэфиры и т.п., причём малеинимид или малеинимидсодержащая группа, такая как γмалеинимидбутириламид (ОМВА) или малеинимидпропионовая кислота (МРА), являются наиболее предпочтительными.

Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая производное ОКЕ по данному изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Такая композиция применима для промотирования продукции или высвобождения эндогенного ОН в организме субъекта. Композицию можно также применять для производства фармацевтических препаратов или препаратов для ветеринарии для лечения или предотвращения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продукции ОН. Перечень таких заболеваний или состояний даётся ниже.

Ещё одним вариантом настоящего изобретения предлагается способ промотирования эндогенной продукции или высвобождения ОН в организме субъекта, животного или человека. Способ включает введение субъекту эффективного количества производного ОКЕ по данному изобретению, одного или в сочетании с фармацевтическим носителем.

Ещё в одном варианте данного изобретения предлагается способ лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продукции ОН, заключающийся во введении субъекту эффективного количества производного ОКЕ по данному изобретению, одного или в комбинации с фармацевтическим носителем.

В другом аспекте данного изобретения предлагается конъюгат, содержащий производное ОКЕ по данному изобретению, ковалентно связанное с компонентом крови.

Ещё в одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ увеличения ίη νινο периода полужизни пептида ОКЕ в организме субъекта, причём способ включает ковалентное присоединение ОКЕ по данному изобретению к компоненту крови. Ковалентное связывание может происходить ίη νινο или ίη νίίτο.

- 2 006484

Предпочтительные ОКБ представляют собой пептиды, такие как ОКБ (1-44) и его аналоги, такие как ОНКР-6, гексарелин, грелин, ОНКР-1, 1ОБ-1, 1ОБ-2, В-НТ920, ОКБ (1-29) и их аналоги и фрагменты, перечисленные ниже, при условии, что такой аналог или фрагмент проявляет активность, практически аналогичную активности ОКБ. Патенты США 4411890; 4517181; 4518586; 4528190; 4529595; 4563352; 4585756; 4595676; 4605643; 4610976; 4626523; 4628043; 4689318; 4734399; 4784987; 4843064; 5756458; Европейская патентная заявка ЕР 0188214; Международные заявки \УО 89/07110; \УО 89/07111 и \УО 93/04081, каждый из этих патентов и каждая из этих заявок включает дополнительные аналоги ОКБ, пригодные для дериватизации по данному изобретению.

Если связывающая группа находится между реакционноспособной группой (фрагментом) и ОКБ пептидом, она, предпочтительно, определяется, без ограничения, как линейный или разветвлённый С_1-10алкил; линейный или разветвлённый частично или перфторированный С^^алкил; С^щлкил или фторалкил, в котором один или более атомов углерода заменено на О или 8 с образованием простого эфира или тиоэфира, например, -2-СН₂СН₂-, -2-СБ₂СН₂-, -2-СН₂СБ₂- или -2-СБ₂-СБ₂-, где Ζ обозначает О или 8; о-, м- или п-дизамещённый фенил, где заместители одинаковы или различны и представляют собой СН₂, О, 8, ΝΉ, ЯК, где К обозначает Н, С_1-10 алкил или С_1-10 ацил; или дизамещённые гетероциклы, такие как фуран, тиофен, пиран, оксазол или тиазол.

Пояснения к чертежам

Фиг. 1 иллюстрирует секрецию ОН первичными клетками аденогипофиза крыс после инкубации в течение четырёх часов с промышленным ОКБ(1-29) и соединениями из примеров 1 и 2 в различных концентрациях;

фиг. 2 иллюстрирует секрецию ОН первичными клетками аденогипофиза крыс после инкубации в течение четырёх часов с промышленным О-Л1а-ОКБ(1-29) и соединениями из примеров 3 и 4 в различных концентрациях;

фиг. 3 иллюстрирует секрецию ОН первичными клетками аденогипофиза крыс после инкубации в течение четырёх часов с соединениями из примеров 5 и 6 в различных концентрациях;

фиг. 4 иллюстрирует секрецию ОН первичными клетками аденогипофиза крыс после инкубации в течение четырёх часов с соединениями из примеров 7 и 8 в различных концентрациях;

фиг. 5 иллюстрирует секрецию ОН у нормальных крыс 8ргадис-0а\\'1су после однократной подкожной болюсной инъекции соединений из примеров 1 и 2;

фиг. 6 иллюстрирует секрецию ОН у нормальных крыс 8ргащ.1С-0а\\'1су после однократной подкожной болюсной инъекции соединений из примеров 3 и 4;

фиг. 7 иллюстрирует секрецию ОН у нормальных крыс 8ргащ.1С-0а\\'1су после однократной подкожной болюсной инъекции соединений из примеров 5 и 6;

фиг. 8 иллюстрирует секрецию ОН (общая площадь поверхности под кривой; ЛИС) у нормальных крыс 8ргадие-ОаМеу после однократной подкожной болюсной инъекции;

фиг. 9 - фармакокинетические кривые соединений из примеров 5 и 6 у самцов крыс 8ргадие-ОаМеу.

Подробное описание изобретения

Ιη νίνο биоконъюгация представляет собой процесс ковалентного связывания молекулы, такой как производное ОКБ по данному изобретению, в организме с нацеленными компонентами крови, предпочтительно с белками, таким способом, который допускает практическое сохранение в нём биологической активности первоначального немодифицированного ОКБ, но при этом обеспечивается продолжительная биологическая активность, несмотря на то, что производное ОКБ приобретает биофизические параметры нацеленного компонента крови.

Для целей настоящего изобретения предполагается, что термин аналог включает пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, являющиеся различными аминокислотными последовательностями нативной последовательности ОКБ, но со сходной или сравнимой активностью. Такие аналоги, предпочтительно, имеют аминокислотную последовательность по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95%, идентичную либо последовательности ОКБ, либо последовательности фрагмента ОКБ, имеющей такое же число аминокислотных остатков.

В более предпочтительном варианте изобретения ОКБ по данному изобретению содержит пептид ОКБ, который модифицирован присоединением к нему реакционноспособной группы либо непосредственно, либо через связывающую группу, причём реакционноспособная группа может образовывать ковалентную связь с компонентом крови, предпочтительно с белками крови. Реакционноспособная группа должна быть устойчива в водной среде, а её предпочтительные варианты включают карбоксильную группу, фосфорильную группу, имидатную группу, или ацильную группу либо в виде сложного эфира, либо в виде смешанного ангидрида. Ковалентная связь обычно образуется между реакционноспособной группой и аминогруппой, гидроксигруппой или тиольной группой компонента крови. Аминогруппа предпочтительно образует ковалентную связь с реакционноспособными группами, такими как карбоксигруппа, фосфорильная или ацильная группа; гидроксигруппа предпочтительно образует ковалентную связь с реакционноспособными соединениями, такими как активированные сложные эфиры; а тиольная группа предпочтительно образует ковалентную связь с реакционноспособными соединениями, такими

- 3 006484 как сложные эфиры или смешанные ангидриды. Предпочтительный компонент крови представляет подвижный компонент крови, такой как сывороточный альбумин, иммуноглобулины или их комбинацию, а предпочтительные реакционноспособные группы представляют собой аналогичные ангидридным малеинимидные группы.

Компоненты крови предпочтительно являются подвижными, это означает, что они не имеют фиксированного положения в любой продолжительный период времени, обычно не превышающий 5 мин и более обычно одну минуту. Эти компоненты крови не являются мембраносвязанными и присутствуют в крови в течение продолжительного времени в минимальной концентрации по меньшей мере 0,1 мкг/мл. Предпочтительные подвижные компоненты крови включают сывороточный альбумин, трансферрин, ферритин и иммуноглобулины, такие как 1дМ и 1§С. Период полужизни подвижных (несвязанных) компонентов крови составляет по меньшей мере около 12 ч.

Так как производное СКР по данному изобретению содержит пептид, то в процессе синтеза производного могут потребоваться защитные группы. Эти защитные группы являются обычными в области пептидного синтеза и в целом могут быть описаны как химические группы, способные защитить пептидное производное от реакции с самим собой. Соединения, содержащие различные защитные группы, выпускаются промышленностью. Типичные примеры подходящих защитных групп включают ацетил, фторфенилметилоксикарбонил (ЕМОС), трет.-бутилоксикарбонил (ВОС), бензилоксикарбонил (ΟΒΖ) и т.д. В табл. 1 приводятся как трёхбуквенные, так и однобуквенные аббревиатуры для аминокислот.

___________________________Таблица 1____________________________

Природные аминокислоты и их аббревиатуры

Название	З^х-буквенная аббревиатура	1-буквенная аббревиатура
Аланин	А1а	А
Аргинин	Агд	К.
Аспарагин	Азп	N
Аспарагиновая кислота	Азр	Ώ
Цистеин	Суз	С
Глутаминовая кислота	Ши	Е
Глутамин	С1п	Ω
Глицин	О1у	С
Гистидин	ΗΪ8	Н
Изолейцин	Не	I
Лейцин	Геи	ь
Лизин	Ьуз	к
Метионин	МеТ	м
Фенилаланин	РЬе	Р
Пролин	Рго	Р
Серин	8ег	8 '
Треонин	ТЬг	Т
Триптофан	Тгр	Ψ
Тирозин	Туг	Υ
Валин	Уа!	V

Производное СКЕ по данному изобретению после конъюгации с компонентом крови образует стабилизированное в отношении пептидазы долго живущее соединение. Также рассматривается, что перед присоединением реакционноспособного фрагмента к пептиду можно добавлять одну или более аминокислот. Такое добавление можно делать на С-конце, Ν-конце или между ними. Полученное таким образом пептидное производное можно вводить субъекту, животному или человеку, таким образом, что ίη νίνο происходит конъюгация с компонентами крови или сначала может происходить конъюгация с компонентами крови субъекта, человека или животного ίη νίΐτο, и образующийся конъюгат или долго живущее стабилизированное в отношении пептидазы пептидное производное по определению ниже вводят субъекту.

- 4 006484

Аминокислота, присутствующая, заменяемая или добавляемая к последовательности ОКБ, может быть Ό-аминокислотой, или Б-аминокислотой, или их комбинацией. Обычно предпочтительными являются Б-аминокислоты. Следующие замены или мутации в нативной последовательности пептида ОКБ (129) или (1-44) являются предпочтительными по изобретению либо независимо, либо в комбинациях: Όаланин в положении 2; глутамин в положении 8; Ό-аргинин в положении 11; (Ы-Ме)Ьук в положении 12; аланин в положении 15; и лейцин в положении 27.

Изобретение также включает фрагменты ОКБ, в которых, хотя они и содержат последовательность, практически гомологичную последовательности природного пептида ОКБ, может на амино и/или карбоксильном конце отсутствовать одна или более дополнительная аминокислота, которая имеется в природе в нативном ОКБ пептиде. Следовательно, изобретение относится к полипептидным фрагментам ОКБ, в которых может отсутствовать одна или более аминокислот, которые имеются в природной последовательности ОКБ, при условии, что такие полипептиды имеют активность высвобождения гормона роста, которая предпочтительно, по меньшей мере, практически равна активности ОКБ.

Изобретение также охватывает очевидные или тривиальные варианты вышеописанных аналогов или фрагментов, которые содержат незначительные аминокислотные замены (и, следовательно, имеют аминокислотные последовательности, которые отличаются от природной последовательности), при условии, что такие варианты имеют активность высвобождения гормона роста, которая практически равна активности ОКБ. Примеры очевидных или тривиальных замен включают замену одного основного остатка на другой (т.е. Агд на Бук), замену одного гидрофобного остатка на другой (т.е. Ьеи на 11е) или замену одного ароматического остатка на другой (т.е. РНе на Туг) и т.д. Далее, другие тривиальные варианты включают аналоги, в случае которых получают консервативные замены, приводящие к значительной структурной аналогии с первоначальной последовательностью. Примеры таких консервативных замен, без ограничения, включают замену глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту и наоборот; глутамин на аспарагин и наоборот; серии на треонин и наоборот; лизин на аргинин и наоборот; или любой остаток из группы изолейцин, валин или лейцин друг на друга.

Стабилизированное в отношении пептидазы ОКБ производное более устойчиво в присутствии пептидаз ίη νίνο, чем соответствующий нестабилизированный ОКР аналог. Устойчивость в отношении пептидаз определяется сравнением периода полужизни нативного ОКБ аналога в сыворотке или крови с периодом полужизни соответствующего производного, содержащего реакционноспособную группу, в сыворотке или в крови. Период полужизни определяют, отбирая образцы крови или сыворотки после введения производного или немодифицированного пептида и определяя активность каждого компонента.

Более подробно, настоящее изобретение направлено на модификацию ОКБ и родственных пептидов с целью повышения их биодоступности, увеличения ίη νίνο их периода полужизни и распределения за счёт селективной конъюгации с компонентом крови без практического изменения их отличительных терапевтических свойств.

В более предпочтительном варианте изобретения последовательность пептида ОКБ, пригодная для дериватизации по данному изобретению, представляет собой следующую последовательность:

А1-А2-Акр-А.4-11е-Рйе-А7-А₈-А9-Туг-А11-А12-А1з-Теи-А15-О1п-Теи-А1₈-А1а-А2о-А21-А22-Теи-А24-А25-А2б-А27-А28-А29-Азо где А₁ обозначает Туг, Ν-Ас-Туг, Н1к, 3-МеН1к, дезNН₂ Н1к, дезNΗ₂ Туг, Бук-Тут, Бук Ηίκ или Бук-3МеН1к;

А₂ обозначает Уа1, Беи, 11е, А1а, И-А1а, №метил-О-А1а, (№метил)-А1а, О1у, ΝΚ или Ννα1;

А4 обозначает А1а или О1у;

А₅ обозначает Ме! или 11е;

А₇ обозначает Акп, 8ет или ТНг;

А₈ обозначает Акп, О1п, Бук или 8ет;

А₉ обозначает А1а или 8ет;

А₁₁ обозначает Агд, Ό-Агд. Бук или Ό-Бук;

А₁₂ обозначает Бук, (Ν-МеЩук или Ό-Бук;

А₁₃ обозначает Уа1 или Беи;

А₁₅ обозначает А1а, Беи или О1у;

А₁₈ обозначает 8ег или ТНг;

А₂₀ обозначает Агд, Ό-Атд, Бук или Ό-Бук;

А₂₁ обозначает Бук, (Ν-МеЩук или Акп;

А₂₂ обозначает Туг или Беи;

А₂₄ обозначает О1п или Н1к;

А₂₅ обозначает 8ет или Акр;

А₂₆ обозначает Беи или 11е;

А₂₇ обозначает Ме!, 11е, Беи или №е;

А₂₈ обозначает 8ет, Акп, А1а или Акр;

А₂₉ обозначает Бук или Агд; и

А₃₀ отсутствует, обозначает X или Х- Бук, где X отсутствует или обозначает последовательность О1п- О1п- О1у- О1и- 8ет- Акп- О1п- О1и- Агд- О1у- А1а- Агд- А1а- Атд-Беи или её фрагмент, который

- 5 006484 уменьшен на одну - пятнадцать аминокислот на С-конце; и что один аминокислотный остаток во фрагменте может необязательно быть заменён на остаток лизина; а С-конец может представлять собой свободную карбоновую кислоту или соответствующий амид, при условии, что когда А₂ обозначает А1а, тогда фрагмент не обозначает фрагмент, уменьшенный на 5-8 аминокислот.

Изобретение относится к применению производных ОВЕ, имеющих продолжительный период полужизни ίη νΐνο, для терапевтических и родственных целей, в частности для повышения уровня гормона роста;

диагностики дефицита гормона роста путём введения субъекту аналога производного ОВЕ по данному изобретению и определения ответа гормона роста;

лечения гипофизарного инфантилизма;

лечения или предупреждения замедления роста;

ускорения срастания костей после перелома или заживления ран;

ускорения восстановления больных с ожогами или больных, перенесших хирургическую операцию; повышения мышечной силы, подвижности, сохранения кожного слоя, поддержания метаболического гомеостаза или почечного гомеостаза;

лечения или предупреждения застойной сердечной недостаточности;

лечения или предупреждения слабости, обусловленной старением;

лечения или предупреждения остеопороза;

лечения или предупреждения ожирения;

уменьшения потерь белка в связи с катаболической реакцией после большой хирургической операции;

уменьшения кахексии и потери белка вследствие хронического заболевания;

улучшения белкового анаболизма (включая сбережение белков); индуцирования липолитического эффекта и/или повышения соматотрофической функции.

Все вышеприведённые методы можно применять как в отношении людей, так и в отношении животных.

Помимо промотирования эндогенной продукции или высвобождения гормона роста в производные ОВЕ по данному изобретению может быть введена аминокислотная замена в один или более сайтов остова пептида ОВЕ; или имеется вариант ОВЕ пептида, в котором С-конец или Ν-конец изменён путём добавления одного или более основных остатков или модифицирован за счёт введения блокирующей группы, обычно применяемой в химии пептидов для защиты пептидного конца от нежелательной биохимической атаки и расщепления ίη νΐνο. Таким образом, производные ОВЕ по данному изобретению вводят аминокислотную замену в контекст любых ОВЕ пептидов, включая, но без ограничения, человеческий ОВЕ, бычий ОВЕ, крысиный ОВЕ, ОВЕ свиньи и т.д., последовательности которых описаны многими авторами. В более предпочтительном варианте изобретения остаток лизина добавляют на С-конце или Ν-конце ОВЕ-пептидной последовательности.

В предпочтительном варианте изобретения функциональной группой белка является тиольная группа, а реакционноспособной группой (реакционноспособным фрагментом) является малеинимидная группа или малеинимидосодержащая группа, такая как γ-малеинимидбутириламид (ОМВА), малеинимидопропионовая кислота (МРА), (2-амино)этоксиуксусная кислота (АЕА)-МРА, этилендиамин(ЕОА)МРА или [2-(2-амино)этокси)]этоксиуксусная кислота (АЕЕА)-МРА и их комбинации. Примеры комбинаций включают, без ограничения, (АЕЕА- ЕИА)-МРА; (АЕЕА- АЕЕА)-МРА, (АЕА- АЕЕА)-МРА и т.п.

Малеинимидогруппа является наиболее селективной для сульфгидрильньгх групп в пептидах, когда рН реакционной смеси остаётся 6,5-7,4. При рН 7,0 скорость реакции малеинимидогрупп с сульфгидрильными группами в 1000 раз быстрее, чем с аминогруппами. При реакции между малеинимидной и сульфгидрильной группами образуется устойчивая тиоэфирная связь, которая не расщепляется в физиологических условиях.

Производные ОВЕ по изобретению обеспечивают специфическое мечение компонентов крови. Такое специфическое мечение, в частности, малеинимидом даёт ряд преимуществ. Тиольные группы менее распространены ίη νΐνο, чем аминогруппы, и, в результате, малеинимидные производные ковалентно связываются с меньшим количеством белков. Например, в молекуле сывороточного альбумина имеется только одна свободная тиольная группа. Поэтому примерное молярное соотношение пептида и альбумина в конъюгате ОВЕ - малеинимид - альбумин составляет 1:1. Помимо альбумина свободные тиольные группы содержат также молекулы 1дО (класс II). Так как молекулы 1дО и сывороточного альбумина составляет основную часть растворимых белков в крови, они также содержат основную часть тиольных групп, способных ковалентно связываться с малеинимидозамещёнными ОВЕ.

Далее, даже среди содержащих свободные тиольные группы белков крови специфическое мечение малеинимидом приводит к преимущественному образованию конъюгатов пептидмалеинимид - альбумин вследствие уникальных особенностей самого альбумина. Единственная свободная тиольная группа альбумина, высококонсервативная среди этих групп, расположена в аминокислотном остатке Су§₃₄. Недавно было показано, что Су§₃₄ альбумина обладает повышенной реакционной способностью по сравнению со

- 6 006484 свободными тиолами других тиолсодержащих белков. Это частично объясняется очень низким значением рК для Сук₃₄ альбумина, равным 5,5. Эта величина значительно ниже, чем типичные значения рК для цистеиновых остатков в целом, равной, как правило, примерно 8. Из-за низкого значения рК Сук₃₄ альбумина в обычных физиологических условиях преимущественно находится в ионизированной форме, которая резко повышает её реакционную способность. Помимо низкого значения рК Сук₃₄ другим фактором, который повышает реакционную способность Сук₃₄ является его локализация в щели около поверхности одной петли области V альбумина. Это местоположение делает Сук₃₄ очень доступным для лигандов всех видов и является важным фактором, определяющим биологическую роль Сук₃₄ в качестве ловушки свободных радикалов и скавенджер свободных тиольных групп. В результате скорость реакции может увеличиваться в 1000 раз по сравнению со скоростью реакции пептид - малеинимидов с другими белками, содержащими свободные тиольные группы.

Другим преимуществом конъюгатов пептид - малеинимид - альбумин является воспроизводимость, обусловленная соотношением пептида к альбумину 1: 1 специфически по остатку Сук₃₄. Обычные методы активации, например с помощью глутаральдегида, ЭСС, ЕЭС и других химических активаторов, не дают возможности достичь такой селективности. Например, альбумин содержит 52 остатка лизина, 25-30 из которых локализовано на поверхности альбумина и доступно для конъюгирования. Активирование этих остатков лизина или же модификация пептида в пару за счёт этих остатков лизина приводит к гетерогенной популяции конъюгатов. Даже если применяется эквимолярное соотношение (т.е. 1:1), конечный результат - это случайные продукты конъюгации, причём некоторые из них содержат неопределённое число пептидов, связанных с каждой молекулой альбумина, и каждый конъюгат содержит пептиды, произвольно соединённые по любому из 25-30 подходящих сайтов лизина. Соответственно, точная характеристика композиции фактически невозможна, не говоря об отсутствии воспроизводимости. Кроме того, хотя может показаться, что конъюгация за счёт лизиновых остатков альбумина даёт, по меньшей мере, преимущество при доставке большего количества терапевтического агента на молекулу альбумина, исследования показали, что предпочтительным является соотношение терапевтического агента и альбумина, равное 1:1. В статье 81еЫе, с1 а1. в АиНсаисег Эгидк, 1997, 8, 677-685, которая вводится в данное описание во всей полноте, сообщается, что отношение противоракового метотрексата к альбумину, конъюгированному через глутаральдегид, даёт обещающие результаты. Эти конъюгаты поглощаются опухолевыми клетками, тогда как конъюгаты, несущие молекулы метотрексата от 5:1 до 20:1, изменяют ВЭЖХхроматограмму и быстро поглощаются в печени ίη νίνο. Казалось бы, что при более высоких соотношениях конформационные изменения в альбумине уменьшают его эффективность в качестве носителя терапевтического агента.

С помощью регулируемого введения производного СНЕ по данному изобретению, и в особенности СНЕ, содержащего реакционноспособный малеинимидный фрагмент, можно регулировать специфическое ίη νίνο мечение или связывание альбумина и 1дС. Показано, что при типичном введении 80-90% вводимых пептидных производных связывается с альбумином и менее 5% связывается с 1дС. Также имеются следовые количества связывания свободных тиолов, таких как глутатион. Такое специфическое связывание предпочтительно для применения ίη νίνο, так как оно позволяет точно рассчитывать оцениваемый период полужизни вводимого терапевтического агента.

Помимо обеспечения регулируемого специфического ίη νίνο связывания малеинимидзамещённый пептид СНЕ может обеспечивать специфическое мечение сывороточного альбумина и 1дС ех νίνο. Такое ех νίνο связывание включает добавление малеинимид-пептидов к раствору крови, сыворотки или физиологическому раствору, содержащему очищенные компоненты крови, такие как сывороточный альбумин и/или 1дС. В предпочтительном формате в производное вводят заместитель малеинимид, необязательно через связывающую группу, и он реагирует с сывороточным альбумином в физиологическом растворе. После модификации ех νίνο с помощью производных СНЕ по настоящему изобретению кровь, сыворотку или физиологический раствор можно снова вводить в кровь с целью лечения ίη νίνο.

Малеинимид - замещённые пептиды СНЕ, как правило, совершенно устойчивы в водных растворах и в присутствии свободных аминов. Так как малеинимидзамещённые пептиды СНЕ реагируют со свободными тиолами, для предотвращения их реакции с самими собой не нужны защитные группы. Кроме того, повышенная стабильность пептидного производного позволяет использовать дополнительные стадии очистки, например ВЭЖХ, для получения продуктов высокой степени чистоты, пригодных для применения ίη νίνο. Наконец, повышенная химическая стабильность обеспечивает продукту более длительное время хранения.

Требуемые конъюгаты производных СНЕ с компонентами крови можно получать ίη νίνο, непосредственно введя производные субъекту, который может быть животным или человеком. Введение можно осуществлять в виде болюса или можно вводить медленно во времени с помощью инфузии с определённой скоростью тока и т.п.

Или же конъюгат можно получать также ех νίνο, объединяя кровь или промышленные очищенные компоненты крови с производным СНЕ по данному изобретению, что даёт возможность ковалентного связывания производного СНЕ по функциональным группам компонентов крови, а затем возвращение или введение конъюгированной крови или конъюгированного очищенного компонента крови хозяину.

- 7 006484

Кроме того, вышеописанное можно выполнять, сначала очищая индивидуальный компонент или ограниченное число компонентов, таких как эритроциты, иммуноглобулины, сывороточный альбумин и т.п., и объединение этого компонента или этих компонентов с соединением по данному изобретению ех νίνο. Меченая кровь или меченый компонент крови можно затем возвратить субъекту, чтобы в условиях ίη νίνο иметь терапевтически эффективные конъюгаты. Кровь можно также обработать, чтобы предотвратить коагуляцию во время операций ех νίνο.

Пептидный синтез

Пептиды ОКБ можно синтезировать стандартными методами твердофазного пептидного синтеза, хорошо известными любому рядовому специалисту в данной области техники. Например, пептид можно синтезировать методами твердофазного пептидного синтеза, описанными 81е\тагб е! а1. в δοϊίά Р1аке Рерйбе 8уп1йек1к, 2'¹ Еб., Р1егсе Сйеш1еа1 ί,’οιηραην. Εοο1<Γογ6. 111., (1984), используя синтезатор Лррйеб Βίοкук!ет. Аналогично пептидные фрагменты можно синтезировать, а затем объединить или связать вместе с образованием более протяжённого пептида. Эти синтетические пептидные фрагменты также могут быть получены с аминокислотными заменами в специфических положениях.

Обзор многих методов твердофазного пептидного синтеза можно найти в 81е^атб е! а1. в 8ο1ί6 Рйаке Рерббе 8уп1йек1к, XV.Н. Ргеетап Си. (8ап Р^аηс^ксο), 1963 и Ме1еп1юГег. Нο^тοηа1 РгоЮшк апб Рерббек, 1973, 246. О классическом синтезе в растворе см., например, 8с11гобег е! а1., в Тйе Рерббек, νο1ите 1, Асабеш1с Ргекк (Ыете Υογ1<). В целом такие методы включают последовательное присоединение одной или более аминокислот или защищенных соответствующим образом аминокислот к наращиваемой пептидной цепи. Обычно либо аминогруппу, либо карбоксильную группу первой аминокислоты защищают с помощью соответствующей защитной группы. Защищенную или дериватизированную аминокислоту затем либо иммобилизуют на инертном твёрдом носителе, либо используют в растворе, добавляя следующую аминокислоту в последовательности, содержащую комплементарную (амино или карбоксильную) группу, соответствующим образом защищенную и в условиях, подходящих для образования амидной связи. Затем защитную группу удаляют с этого вновь образованного остатка добавляемой аминокислоты и добавляют следующую аминокислоту (соответствующим образом защищенную) и т. д.

После того, как все нужные аминокислоты соединены в соответствующей последовательности, последовательно или одновременно удаляют все оставшиеся защитные группы (и весь твёрдый носитель) и получают конечный полипептид. Простой модификацией этой общей методики можно добавлять к наращиваемой цепи более одной аминокислоты за определённое время, например, соединяя (в условиях, в которых хиральные центры не рацемизируются) защищенный трипептид с защищенным соответствующим образом дипептидом, при этом образуется после депротекции пентапептид.

Особенно предпочтительным способом получения производных ОКБ по данному изобретению является твердофазный пептидный синтез, причём аминокислотный α-Ν-конец защищен группой, чувствительной к кислоте или к основанию. Такие защитные группы должны быть устойчивыми к условиям образования пептидной связи, в то же время они должны легко сниматься без нарушения растущей пептидной цепи или рацемизации какого-либо хирального центра, содержащегося в ней. Примеры Ν-защитных групп и карбоксизащитных групп приведены в монографии Отеепе, Рго1есйуе Огоирк Ιη Отдашс 8у1йеκϊκ, (1ο1ιπ Χνίφ\· & δοπκ, Νον Υογ1< рр. 152-186 (1981)). Примеры Ν-защитных групп включают, без ограничения, низшие алканоильные группы, такие как формил, ацетил (Ас), пропионил, пивалоил, трет.бутилацетил и т.п.; другие ацильные группы включают 2-хлорацетил, 2-бромацетил, трифторацетил, трихлорацетил, фталил, о-нитрофеноксиацетил, -хлорбутирил, бензоил, 4-хлорбензоил, 4-бромбензоил, 4нитробензоил и т.п.; сульфонильные группы. такие как бензолсульфонил, п-толуолсулъфонил, онитрофенилсульфонил, 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил (ртс) и т.п.; группы, образующие карбаматы, такие как трет-амилоксикарбонил, бензилоксикарбонил, п-хлорбензилоксикарбонил, п-мето-ксибензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил, 2-нитробензил оксикарбонил, п-бромбензилоксикарбонил, 3,4-диметоксибензилоксикарбонил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, 2,4-диметоксибензилоксикарбонил, 4-этоксибензилоксикарбонил, 2-нитро-4,5-диметоксибензилоксикарбонил, 3,4,5триметоксибензилоксикарбонил, 1 -(п-бифенилил)-1 -метилэтоксикарбонил, α,α-диметил-3,5 -димето ксибензилоксикарбонил, бензгидрилилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил (1юс), диизопропилметоксикарбонил, изопропилоксикарбонил, этоксикарбонил, метоксикарбонил, аллилоксикарбонил, 2,2,2трихлорэтоксикарбонил, феноксикарбонил, 4-нитрофеноксикарбонил, фторфенил-9-метоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, циклопентилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, фенилтиокарбонил и т.п.; арилалкильные группы, такие как бензил, бифенилизопропилоксикарбонил, трифенилметил, бензилоксиметил, 9-фторфенилметилоксикарбонил (Ртοс) и т.п., и силильные группы, такие как триметилсилил и т.п. Предпочтительными α-Ν-защитньгми группами являются о-нитрофенилсульфенил; 9фторфенилметилоксикарбонил; трет-бутоксикарбонил φοφ, изоборнилоксикарбонил; 3,5диметоксибензилоксикарбонил; трет-амилоксикарбонил; 2-циано-трет-бутилоксикарбонил и т.п., более предпочтительной группой является 9-фторфенилметилоксикарбонил (Ртοс), тогда как предпочтительными Ν-защитными группами боковой цепи являются 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил (ртс), нитро, п-толуолсульфонил, 4-метоксибензолсульфонил, СЬх, Βοс и адамантилоксикарбонил - для ами

- 8 006484 ногрупп боковых цепей, таких как лизин и аргинин; бензил, бромбензилоксикарбонил, 2,6-дихлорбензил, изопропил, трет-бутил (трет-Ви), циклогексил, циклопентил и ацетил (Ас) для тирозина; трет-бутил, бензил и тетрагидропиранил для серина; тритил, бензил, СЬх. п-толуолсульфонил и 2,4-динитрофенил для гистидина; формил для триптофана; бензил и трет-бутил для аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты; и трифенилметил (тритил) для цистеина.

Защитная группа для карбоксильной группы обычно относится к защитной сложноэфирной или амидной группе. Такие карбоксизащитные группы хорошо известны специалистам в данной области техники, они широко применяются для защиты карбоксильных групп в химии пенициллина и цефалоспоринов, как описано в Патентах США 3840556 и 3719667, которые во всей полноте вводятся в данное описание в качестве ссылки. Репрезентативные карбоксизащитные группы включают, без ограничения, низший алкил С₃-С₈; арилалкил, такой как фенетил или бензил и их замещённые производные, такие как алкоксибензильная или нитробензильная группы; арилалкенил, такой как фенилэтенил; арил и его замещённые производные, такие как 5-инданил; диалкиламиноалкил, такой как диметиламиноэтил; алканоилоксиалкильные группы, такие как ацетоксиметил, бутирилоксиметил, валерилоксиметил, изобутирилоксиметил, изовалерилоксиметил, 1-(пропионилокси)-1-этил, 1-(пивалоилоксил)-1-этил, 1-метил-1(пропионилокси)-1-этил, пивалоилоксиметил, пропионилоксиметил; циклоалканоилоксиалкильные группы, такие как циклопропилкарбонилоксиметил, циклобутилкарбонилоксиметил, циклогексилкарбонилоксиметил; ароилоксиалкил, такие как бензоилоксиметил, бензоилоксиэтил; арилалкилкарбонилоксиалкил, такой как бензилкарбонилоксиалкил, 2-бензилкарбонилоксиэтил; алкоксикарбонилалкил или циклоалкилоксикарбонилалкил, такой как метоксикарбонилметил, циклогексилоксикарбонилметил, 1 метоксикарбонил-1 - этил; алкоксикарбонилоксиалкил или циклоалкилоксикарбонилоксиалкил, такой как метоксикарбонилоксиметил, трет-бутилоксикарбонилоксиметил, 1 -этоксикарбонил-1-этил, 1-циклогексилоксикарбонилокси-1 -этил; арилоксикарбонилоксиалкил, такой как 2-(феноксикарбонилокси)этил, 2(5-инданилоксикарбонилокси)этил; алкоксиалкилкарбонилоксиалкил, такой как 2-(1-метокси-2метилпропан-2-оилокси)-этил; арилалкоксикарбонилоксиалкил, такой как 2-(бензилоксикарбонилокси)этил; арилалкенилоксикарбонилоксиалкил, такой как 2-(3-фенилпропен-2-илоксикарбонил-окси)этил; алкоксикарбониламиноалкил, такой как трет-бутоксикарбониламинометил; алкиламинокарбониламиноалкил, такой как метиламинокарбониламинометил; алканоиламиноалкил, такой как ацетиламинометил; гетероциклилкарбонилоксиалкил, такой как 4-метилпиперазинилкарбонилоксиметил; диалкиламинокарбонилалкил, такой как диметиламинокарбонилметил, диэтиламинокарбонилметил; (5-(низший алкил)-2-оксо-1,3-диоксоленил)алкил, такой как (5-трет-бутил-2-оксо-1,3диоксолен-4-ил)метил; и (5-фенил-2-оксо-1,3-диоксолен-4-ил)алкил, такой как (5-фенил-2-оксо-1,3диоксолен-4-ил)метил. Репрезентативные амидкарбоксизащитные группы включают, без ограничения, аминокарбонильные и низшие алкиламинокарбонильные группы. Из вышеприведённых карбоксизащитных групп предпочтительными являются сложноэфирные группы, содержащие низший алкил, циклоалкил или арилалкил, например, метиловый эфир, этиловый эфир, пропиловый эфир, изопропиловый эфир, бутиловый эфир, вт-бутиловый эфир, амиловый эфир, изоамиловый эфир, октиловый эфир, циклогексиловый эфир, фенилэтиловый эфир и т.п., или алканоилоксиалкиловый эфир, циклоалканоилоксиалкиловый эфир, ароилоксиалкиловый эфир или арилалкилкарбонилоксиалкиловый эфир. Предпочтительными амидкарбоксизащитными группами являются (низший алкил)аминокарбонильные группы.

По методу твердофазного пептидного синтеза α-С-концевую аминокислоту прикрепляют (иммобилизуют) к соответствующему твёрдому носителю или полимеру. Подходящие твёрдые носители, применимые для вышеуказанного синтеза, представляют собой материалы, инертные в отношении реагентов и условий постадийного проведения реакций конденсации - снятия защиты, а также не растворимые в применяемых средах. Предпочтительным твёрдым носителем (подложкой) для синтеза α-С-концевых карбоксипептидов является 4-гидроксиметилфеноксиметил-сополимер(стирол-1% дивинилбензол).

Предпочтительным твёрдым носителем (подложкой) для синтеза α-С-концевых амидопептидов является полимер 4-(2',4'-диметоксифенил-Ршос-аминометил)-феноксиацетамидоэтила, выпускаемый Аррйеб Вю8у81еш8 (Роз1ет Сйу, Сайр). α-С-концевая аминокислота соединяется с полимером в присутствии Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимида (ЭСС). Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида (И1С) или О-бензотриазол-1илА^,№,№-тетраметилуронийгексафторфосфата (НВТИ), в присутствии или в отсутствие 4диметиламинопиридина (ΌΜΑΡ), 1-гидроксибензотриазола (НОВТ), бензотриазол-1-илокси-трис(диметиламино)-фосфонийгексафторфосфата (ВОР) или бис(2-оксо-3-оксазолидинил)фосфинхлорида (ВОРС1), опосредующих соединение, в течение примерно 1-24 ч при температуре между 10 и 50°С в растворителе, таком как хлористый метилен или ДМФА.

Если твёрдым носителем является полимер 4-(2',4'-диметоксифенил-Ртос-аминометил)феноксиацетамидоэтила, Ртос-группа отщепляется вторичным амином, предпочтительно пиперидином, прежде чем полимер соединится с α-С-концевой аминокислотой. Предпочтительным методом присоединения к полимеру 4-(2',4'-диметоксифенил-Ртос-аминометил)феноксиацетамидоэтила после снятия защиты является реакция в присутствии О-бензотриазол-1-илА^,№,№- 9 006484 тетраметилуронийгексафторфосфата (НВТи, 1 экв.), диизопропилэтиламина (ΌΙΕΑ, 1 экв.) и, необязательно, 1- гидроксибензотриазола (НОВТ, 1 эквив.) в ДМФА. Присоединение последовательно защищаемых аминокислот можно проводить в автоматическом синтезаторе полипептидов обычным методом, хорошо известным в технике.

Снятие Ешое-защитной группы с α-Ν-концевой стороны наращиваемого пептида выполняют обычным способом, например обработкой вторичным амином, предпочтительно пиперидином. Каждую защищенную аминокислоту затем вводят примерно в 3^х-кратном молярном избытке и присоединение предпочтительно проводят в ДМФА. Конденсирующим агентом обычно является О-бензотриазол-1-илΝ,Ν,Ν',Ν'-тетраметалуронийгексафторфосфат (НВТИ, 1 экв.), диизопропилэтиламин (ΌΙΕΑ, 1 экв.) и, необязательно, 1 - гидроксибензотриазол (НОВТ, 1 эквив.).

В конце твердофазного синтеза пептид снимают с полимера и снимают защиту либо последовательно, либо одновременно. Удаление полипептида и снятие защиты можно осуществлять обычным способом в виде одной операции обработкой связанного с полимером полипептида с расщепляющим реагентом, содержащим тиоанизол, триизопропилсилан, фенол и трифторуксусную кислоту. В случаях, когда α-С-конец полипептида представляет собой алкиламид, смолу отщепляют аминолизом алкиламином. Или же пептид можно удалять переэтерификацией, например метанолом, с последующим аминолизом или прямым переамидированием. Защищенный пептид можно очищать на этой стадии или непосредственно брать в следующую стадию. Удаление защитных групп боковой цепи выполняют, используя описанную выше смесь для отщепления. Полностью защищенный пептид можно очищать с помощью последовательных хроматографических операций, используя все приведённые ниже виды хроматографии или любой из них: ионообменную хроматографию на слабоосновных смолах (ацетатная форма); гидрофобную адсорбционную хроматографию на недериватизированном полистиролдивинилбензоле (таком как АшЬет1йе ΧΑΌ™); адсорбционную хроматографию на силикагеле; ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе, например на 8ерйабех С-25™, ЬН-2-™ или противоточное распределение; высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), в особенности обращённо-фазовую ВЭЖХ на связанной с октил- или октадецилсилил-силикагелем в качестве наполнителя в колонке. Любой рядовой специалист в данной области техники способен легко определить, какие предпочтительные хроматографические стадии или последовательности требуются для получения приемлемой степени очистки СКЕ пептида.

Молекулярные веса этих пептидов определяют квадрупольной масс-спектрометрией с ионизацией электрораспылением.

Процесс синтеза производных СКЕ по данному изобретению меняется в широких пределах в зависимости от природы различных элементов, т.е. последовательности СКЕ, связывающей группы и реакционноспособной группы, имеющейся в производном СКЕ. Методики синтеза выбирают так, чтобы обеспечить простоту, высокий выход и воспроизводимость, а также продукт высокой степени чистоты. Обычно присоединение за счёт химически реакционноспособной группы происходит на последней стадии синтеза. Конкретные методы получения производных СКР по данному изобретению приводятся далее.

Требованием является то, что химически реакционноспособная группа должна быть расположена в таком сайте, который даёт возможность пептиду связываться с компонентом крови, сохраняя при этом основную часть активности и/или полезного действия, если не всю активность и не все полезные свойства, исходного СКЕ пептида.

В более предпочтительном варианте каждое производное СКЕ синтезируют в соответствии со следующими критериями. Если концевая карбоксильная группа пептида доступна и не является важной для сохранения фармакологической активности и никакой другой чувствительной функциональной группы в пептиде не имеется, тогда в качестве места прикрепления модификации связывающая группа реакционноспособная группа выбирают карбоксильную группу. Если концевая карбоксильная группа связана с фармакологической активностью, или ни одна из карбоновых кислот не доступна, тогда в качестве места прикрепления модификации связывающая группа - реакционноспособная группа выбирают любую другую чувствительную функциональную группу, не являющуюся важной для сохранения фармакологической активности. Если в пептиде доступными являются несколько чувствительных функциональных групп, сочетание защитных групп используют таким образом, чтобы после соединения связывающей группы/реакционноспособной группы и депротекции всех чувствительных функциональных групп по-прежнему сохранялась фармакологическая активность. Если в пептиде отсутствуют доступные чувствительные функциональные группы, то применяют синтетические методы для такой модификации исходного пептида, которая бы позволила сохранить биологическую активность исходного пептида и рецепторную специфичность и специфичность в отношении мишени. В этом случае модификацию предпочтительно осуществляют на противоположном конце пептида.

Производные СКР по данному изобретению можно применять индивидуально или в комбинации с другими лекарственными веществами или фармацевтическими продуктами для оптимизации их терапевтического действия. Их можно вводить в физиологически приемлемой среде, например в деионизиро- 10 006484 ванной воде, физиологическом растворе с фосфатным буфером (РВ8), физиологическом растворе, водном этаноле или водном растворе другого спирта, плазме, белковых растворах, манните, водной глюкозе, спирте, растительном масле и т.п. Другие добавки, которые могут быть включены, содержат буферы, рН среды которых обычно забуферивают таким образом, чтобы значения их рН были в интервале от 5 до 1 0, в которых концентрация буфера составляет около 50-250 мМ, в которых концентрация соли обычно находится в интервале около 5-500 мМ, физиологически приемлемые стабилизаторы и т.п. Композиции могут быть лиофилизированы для удобства хранения и транспортировки.

Пептидные производные по данному изобретению можно вводить перорально, парентерально, например интраваскулярно (внутрисосудистая инъекция, IV, ВС), внутриартериально (1А, ВА), внутримышечно (1М, ВМ), подкожно (8С) и т.п. В соответствующих ситуациях можно вводить в виде вливания. В некоторых случаях, когда функциональная группа реагирует довольно медленно, можно применять пероральное, назальное, ректальное, трансдермальное введение, введение в виде аэрозолей, если природа конъюгата позволяет перенос в сосудистую систему. Обычно применяют единичную инъекцию, хотя, в случае необходимости, можно делать более одной инъекции. Пептидное производное можно вводить обычными средствами, включая шприц, троакар, катетер и т.п. Конкретный способ введения в большей степени зависит от вводимого количества, от того, нужна ли единичная болюсная инъекция или продолжительное введение, и т. п. Предпочтительно введение является внутрисосудистым, если место введения не является важным для данного изобретения, предпочтительно в место, где быстрый ток крови, например внутривенно, в периферическую или центральную вену. Могут найти применение другие способы, при которых используют пролонгированное введение или защитную матрицу. Целью является эффективное распределение пептидов в крови, так чтобы они могли реагировать с компонентами крови. Концентрация конъюгата изменяется в очень широких пределах, как правило, около 1 пг/мл - 50 мг/мл. При внутрисосудистом введении количество пептида составляет, как правило, около 0,1-10 мг/мл, более часто около 1 -5 мг/мл.

Связывание с долгоживущими компонентами крови, такими как иммуноглобулин, сывороточный альбумин, эритроциты и тромбоциты, обеспечивает ряд преимуществ. Активность пептидных производных по данному изобретению пролонгируется до дней, возможно, до недель. В течение этого времени требуется лишь однократное введение. Можно достичь более высокой специфичности, так как активное соединение сначала связывается с большой молекулой, которая с меньшей вероятностью поглощается клеткой, чтобы помешать другим физиологическим процессам.

Кровь хозяина - млекопитающего можно проверять на активность пептидов и/или присутствие пептидных производных. Беря часть или пробу крови хозяина в разное время, можно определить, связался ли пептид с долгоживущими компонентами крови в достаточном количестве, чтобы быть терапевтически активным, а затем, уровень пептида в крови. Если требуется, можно также определить, с каким из компонентов крови ковалентно связан пептид. Для конкретных малеинимидзамещённых пептидов просто вычислить период полужизни сывороточного альбумина и 1дО. Мониторинг также можно осуществлять, применяя анализ пептидной активности, ВЭЖХ-масс-спектрометрию (М8) или антитела к пептидам.

Другой аспект данного изобретения относится к способам определения концентрации ОКБ пептида или его конъюгата в биологических образцах (таких как кровь) с применением антител, специфических в отношении пептидов, и к применению таких антител для преодоления токсичности, вероятно, обусловленной такими пептидами или конъюгатами. Это является преимуществом, так как продолжительное присутствие и продолжительное существование производных ОКБ ίη νίνο в организме больного может вызвать новые проблемы, включая повышенную вероятность токсичности. Применение антител против производных, моноклональных или поликлоналъных, специфических в отношении конкретных производных, может помочь решить эту проблему. Антитело может быть генерировано или получено от хозяина, иммунизированного конкретным модифицированным пептидом, или иммуногенным фрагментом агента, или синтезированным иммуногеном, соответствующим антигенной детерминанте агента. Предпочтительные антитела обладают высокой специфичностью и сродством (аффинностью) к нативной, дериватизированной и конъюгированной формам пептидного производного. Такие антитела можно также метить ферментами, флуорохромами или радиоактивными метками.

Антитела, специфические в отношении производных ОКБ, можно получать, используя очищенные пептиды для индукции антител, специфических в отношении дериватизированных пептидов. Под индукцией антител понимается не только стимуляция иммунного ответа с помощью инъекции животному, но аналогичные стадии при получении синтетических антител или других специфических связывающих молекул, например скрининг библиотек рекомбинантных иммуноглобулинов. Как моноклональные, так и поликлональные антитела можно получать по методикам, хорошо известным в технике.

Антитела могут также использоваться для мониторинга присутствия производного в кровотоке. Образцы крови и/или сыворотки можно анализировать методом 8Э8-РАСЕ и вестерн-блоттингом. Такие методы позволяют анализировать кровь или сыворотку для определения связывания производного ОКБ с компонентами крови.

Антитела к антитерапевтическому агенту можно также использовать для лечения токсичности, вызванной введением производного ОКБ, их можно вводить ех νίνο или ίη νίνο. Методы ех νίνο включают

- 11 006484 иммунодиализное лечение токсичности с применением антител к антитерапевтическому агенту, иммобилизованных на твёрдом носителе. Методы ίη νινο включают введение антител к антитерапевтическому агенту в количествах, эффективных для индукции клиренса комплексов антитело-агент.

Антитела можно использовать для удаления производных ОКЕ и их конъюгатов из крови больных ех νινο при контактировании крови с антителами в стерильных условиях. Например, антитела можно прикреплять или иным образом иммобилизовать в колонке с носителем, у больного можно взять кровь и пропустить через колонку. Производные ОКЕ свяжутся с антителами, и кровь, содержащую небольшую концентрацию производного ОКЕ, можно затем снова ввести в кровоток больного. Количество отбираемого производного ОКЕ можно контролировать, регулируя давление и скорость тока. Предпочтительного удаления производного ОКЕ из компонента плазмы крови больного можно достигнуть, например, используя полупроницаемую мембрану или, иначе, сначала отделяя компонент плазмы от компонентов клетки способами, известными в технике, перед тем как пропускать компонент плазмы через колонку с носителем, содержащим антитерапевтические антитела. Или же предпочтительного удаления производного, конъюгированного с клетками крови, включая эритроциты, можно достичь, собирая и концентрируя клетки крови больного и затем осуществляя контактирование этих клеток с фиксированными антителами против пептида для исключения компонента сыворотки крови больного.

Антитела против пептида можно вводить ίη νινο парентерально больному, который получал в качестве лечения ОКР производное или конъюгат. Антитела связываются с ОКЕ производным или конъюгатами. Связывание ОКЕ производного препятствует его активности, если не полностью блокирует её, тем самым уменьшая биологически активную концентрацию производного ОКЕ в кровотоке больного и сводя к минимуму побочные эффекты. Кроме того, связанный комплекс антитело - пептид облегчает клиренс производного ОКЕ и конъюгатов из кровотока больного.

Следующие примеры приводятся для иллюстрации предпочтительных вариантов изобретения, и их ни в коей мере нельзя рассматривать как ограничивающие его объём. Если не указано иначе, используют оптически активные защищенные аминокислоты в Ь-конфигурации.

Синтез

Синтез производных ОКЕ осуществляют по методике автоматизированной твердофазной реакции в синтезаторе пептидов Ξνιηρίιοην™ с вмешательством при получении производных. Синтез проводят на Етοс - защищенной Катаде™ амидной линкерной смоле, используя Εтοс-защищенные аминокислоты. Присоединение осуществляют с помощью О-бензотриазол-1-ил-Ы^,№,№-тетраметилуронийгексафторфосфата (НВТИ) и диизопропилэтиламина (ΌΙΕΆ) в качестве активирующей смеси в растворе Ν, Ν-диметилформамида (ДМФА). Защитную группу Εтοс удаляют с помощью 20% раствора пиперидина в ДМФА. При необходимости для получения свободного Ν-конца после отщепления пептида от полимера используют Βοο-защищенную аминокислоту. Если не указано иначе, в синтезе используют кислоты с Ь-конфигурацией. Для синтеза используют реакционные сосуды из силиконизированного стекла.

Пример 1.

Туг-Лкг-Лхр-Лкг-Пе-Рйе-Тйг-Лщ-Зег-Туг-Лгд-Елл-УаЕЕеи-СК-СЕч-Ееи-Зег-Лкг-Лгд-Елл-Ееи-ЕеиО1η-А8ρ-I1е-Меί-8е^-А^д-СОNН₂

Стадия 1: Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Ептое-Лгд^ЬП-ОН. Εтοс-8е^(ίΒи)-ОН, ΕтοсМеСОН, Εтοс-I1е-ОН, Εтοс-А8ρ(ίΒи)-ОН, Εтοс-О1η(Т^ί)-ОН, Εтοс-^еи-ОН, Εтοс-^еи-ОН, Εтοс^у8(Βοс)-ОН, Εтοс-А^д(РЬ£)-ОН, Εтοс-А1а-ОН, Εтοс-8е^(ίΒи)-ОН, Ρтοс-^еи-ОН, Ρтοс-О1η(Т^ί)-ОН, Εтοс-О1у-ОН, Ρтοс-^еи-ОН, Εтοс-Vа1-ОН, Ρтοс-^у8(Βοс)-ОН, Ρтοс-А^д(РЬ£)-ОН, Εтοс-Ту^(ίΒи)-ОН, Εтοс-8е^(ίΒи)-ОН, Εтοс Л5п(Тг1)-ОН, Εтοс-Тй^(ίΒи)-ОН, Етοс-Рйе-ОН, Εтοс-I1е-ОН, Εтοс-А1а-ОН, Εтοс-А8ρ(ίΒи)-ОН, Εтοс-А1а-ОН, Βοс-Ту^(ίΒи)ОН. Их растворяют в Ν,Ν-диметилформамиде (ДМФА) и в соответствии с последовательностью активируют, используя О-бензотриазол-1-ил-Ы^,№,№тетраметилуроний-гексафторфосфат (НВТИ) или диизопропилэтиламин (ΌΙΕΑ). Удаление Εтοс защитной группы осуществляют с помощью 20 об.% раствора пиперидина в Ν,Ν-диметилформамиде (ДМФА) в течение 20 мин (стадия 1 ). Аминогруппу конечной аминокислоты ацилируют уксусной кислотой в присутствии О-бензотриазол-1-ил-^^№,№-тетраметилуроний-гексафторфосфата (НВТИ) или диизопропилэтиламина (ΌΙΕΑ).

Стадия 2: Пептид снимают с полимерной подложки, используя смесь 85% ТФК/5% Т18/5% тиоанизола и 5% фенола, с последующим осаждением ледяным (0-4°С) ЕьО. Сырой пептид собирают на воронке из полипропилена, сушат, снова растворяют в смеси ацетонитрила (40%) с водой (0,1% ТФК) и лиофилизируют, получая соответствующий сырой продукт, используемый для очистки.

Пример 2. Долгоживущее производное ОКЕ пептида из примера 1 Туг-Лкг-Лхр-Лкг-Пе-Рйе-Тйг-Лщ-Зег-Туг-Лгд-Еул-УаЕЕеи-СК-СЕч-Ееи-Зег-Лкг-Лгд-Еул-Ееи-ЕеиО1η-А8ρ-I1е-Меί-8е^-А^д-^у8(МРА)-СОNН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 1, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Етοс-^у5(Л1οс)-ОН.

- 12 006484

Стадия 2. Селективную депротекцию Ьуз (А1ос) группы осуществляют вручную и выполняют, обрабатывая полимер раствором 3 экв. РП(РРП₃)₄ в 5 мл С₆Н₆:СНС1₃ (1:1): 2,5 об.% ΝΜΜ : 5 об.% АсОН в течение 2 ч. Затем раствор промывают СНС1₃ (6x5 мл), 20% АсОН в ЭСМ (в хлористом метилене, 6x5 мл) ЭСМ (6x5 мл.) и ДМФА (6x5 мл).

Стадия 3. Синтез снова автоматизируют для прибавления 3-малеинимидопропионовой кислоты (МРА). Между прибавлениями (присоединениями) смолу три раза промывают Ν,Ν-диметилформамидом (ДМФА) и три раза изопропанолом.

Стадия 4. Производное снимают с полимерной подложки, используя смесь 85% ТФК/5% Т18/5% тиоанизола и 5% фенола, с последующим осаждением ледяным (0-4°С) ЕьО. Сырой продукт производное собирают на воронке из полипропилена, сушат, снова растворяют в смеси ацетонитрила (40%) с водой (0,1 % ТФК) и лиофилизируют, получая соответствующий сырой продукт, используемый для очистки.

Пример 3.

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-Рйе-Тйг-А8п-8ег-Туг-Агд-Ьу8-Уа1-Ьеи-О1у-О1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу8-Ьеи-ЬеиО1п-А8р-11е-Ме1-8ег-Агд-СОЯН₂

Стадия 1 . Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 1 00 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие зашдщённые аминокислоты: Ртос-Агд(РЫ)-ОН, Ртос-8ег(!Вц)-ОН, Ртос-Ме1-ОН, Ртос-11е-ОН, Ртос-А§р(1Вц)-ОН, Ртос-О1п(Тй)ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Етос-Ьу5(Вос)-ОН. Етос-Агд(РЬГ)-ОН. Бтос-А1а-ОН, Бтос-8ег(1Ви)ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-О1п(Тг1)-ОН, Бтос-О1у-ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-Уа1-ОН, Бтос-БуЦВосЕОН, Бтос-Агд(РЬГ)-ОН, Бтос-Туг(1Ви)-ОН, Бтос-8ег(1Ви)-ОН, Бтос-А8п(Тг1)-ОН, Бтос-ТЬДШиЕОН, БтосРПе-ОН, Бтос-11е-ОН, Бтос-А1а-ОН, Бтос-А^ШиЕОН, Бтос-(П)а1а-ОН, Вос-Туг(!Ви)-ОН.

Стадия 2. Эту стадию проводят, как описано в примере 1, стадия 2.

Пример 4. Долгоживущее производное ОКБ пептида из примера 3

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-Рйе-Тйг-А8п-8ег-Туг-Агд-Ьу8-Уа1-Ьеи-О1у-О1п-Ьеи-8ег-А1а-Лгд-Ьу8-Ьеи-ЬеиО1п-А§р-11е-Ме1- 8ег- Агд-Ьу8(МРА)-СОЯН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 3, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Бшос-Ьу8(А1ос)-ОН.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 2, стадии 2-4.

Пример 5.

Ту^-(^)а1а-А8р-А1а-I1е-Рйе-Тй^-О1η-8е^-Ту^-А^д-^у8-Vа1-^еи-АIа-О1η-^еи-8е^-Л1а-А^д-^у8-^еи-^еиО1п-А8р-11е-Ьеи-8ег-Агд-СОЯН₂

Стадия 1 . Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 1 00 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Бтос-Агд(РЬГ)-ОН, Бтос-8ег(1Ви)-ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-Пе-ОН, Ртοс-А8р(ΐВи)-ОН, Бтос-О1п(Тг1)ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-Ьув(Вос)-ОН, Бтос-Аг^/РЬ^-ОН, Бтос-А1а-ОН, Бтос-8ег(1Ви)ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-О1п(Тг1)-ОН, Бтос-А1а-ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-Уа1-ОН, Бтос-Луз^о^-ОН, Ртοс-А^д(РЬГ)-ОН, Бтос-Туг(1Ви)-ОН, Бтос-8ег(1Ви)-ОН, Бтос-О1п(Тг1)-ОН, Бтос-ТЬДШиЕОН, БтосРПе-ОН, Бтос-Пе-ОН, Бтос-А1а-ОН, Ртοс-А8р(ΐВи)-ОН, Бтос-(П)а1а-ОН, Вос-Туг(!Ви)-ОН.

Стадия 2. Эту стадию проводят, как описано в примере 1 , стадия 2.

Пример 6. Долгоживущее производное ОКБ пептида из примера 5

Ту^-(^)а1а-А8р-А1а-Πе-Рйе-Тй^-О1η-8е^-Ту^-А^д-^у8-Vа1-^еи-А1а-О1η-^еи-8е^-А1а-Л^д-^у8-^еи-^еиО1п-А8р-11е-Ьеи-8ег-Агд-Ьу8(МРА)-СОЯН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 5, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Бтос-Ьу8(А1ос)-ОН.

Пример 7.

Ту^-(^)а1а-А8р-А1а-Πе-Рйе-Тй^-О1η-8е^-Ту^-(^)А^д-^у8-Vа1-^еи-А1а-О1η-^еи-8е^-Л1а-Л^д-^у8-^еи^еи-О1η-А8р-Πе-^еи-8е^-Л^д-СОNН₂

Стадия 1 . Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 1 00 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Бтос-Агд(РЬГ)-ОН, Бтос-8ег(1Ви)-ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-Пе-ОН, Ртοс-А8р(ΐВи)-ОН, Бтос-О1п(ТП)ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-Ьув(Вос)-ОН, Бтос-Аг^/РЬ^-ОН, Бтос-А1а-ОН, Бтос-8ег(!Ви)ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-О1п(Тг1)-ОН, Бтос-А1а-ОН, Бтос-Ьеи-ОН, Бтос-Уа1-ОН, Бтос-Луз^о^-ОН, Ртοс-(^)Л^д(РЬГ)-ОН, Бтос-Туг(1Ви)-ОН, Бтос-8ег(1Ви)-ОН, Бтос-О1п(Тг1)-ОН, Ртοс-Тй^(ίВи)-ОН, Бтос- РПе-ОН, Бтос-Пе-ОН, Бтос-А1а-ОН, Ртοс-А8р(ΐВи)-ОН, Ртοс-(^)Л1а-ОН,Вοс-Ту^(ίВи)-ОН.

Пример 8. Долгоживущее производное ОКБ пептида из примера 7

Ту^-(^)а1а-А8р-А1а-Πе-РЬе-Тй^-ОIη-8е^-Ту^-(^)А^д-^у8-Vа1-^еи-Л1а-О1η-^еи-8е^-А1а-А^д-^у8-^еи^еи-О1η-А8р-Πе-^еи-8е^-Л^д-^у8(ΜРА)-СОNН₂

Стадия 1 . Эту стадию проводят, как описано выше в примере 7, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Ртοс-^у8(А1οс)-ОН.

- 13 006484

Пример 9.

Туг-(Р)а1а-Л8р-Л1а-Пе-РЬе-ТЬг-61п-§ег-Туг-Лгд-((№Ме)Ьу8)-Уа1-Ьеи-Л1а-61п-Ьеи-8ег-Л1а-Лгд-Ьу8Ьеи- ΓΌΐι-61η-Α5ρ-ΙΚ-ΓΌΐι^Γ-ΑΓ8-ί.ΌΝΗ_;

Стадия 1: Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Ешос-Агд(РЬГ)-ОН. Етос-8ег(1Ви)-ОН, Етос-Ьеи-ОН. Етос-11е-ОН, Етос-А8р(1Ви)-ОН. Етос-С1п(Тг1)ОН, Етос-Ьеи-ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-Ьу§(Вос)-ОН. Етос-Агд(РЬГ)-ОН. Етос-А1а-ОН. Етос-8ег(1Ви)ОН. Етос-Ьеи-ОН, Етос-С1п(Тг1)-ОН. Етос-А1а-ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-Уа1-ОН. Етос-(№ Ме)Ьу§(Вос)-ОН. Етос-Агд(РЬГ)-ОН. Етос-Туг(1Ви)-ОН. Етос-8ег(1Ви)-ОН, Етос-С1п(Тг1)-ОН. ЕтосТйг(1Ви)-ОН. Етос-РЬе-ОН. Етос-11е-ОН. Етос-А1а-ОН. Етос-А8р(1Ви)-ОН. Етос-(Э)А1а-ОН. ВосТуг(1Ви)-ОН.

Пример 10. Долгоживущее производное СКЕ пептида из примера 9

Туг-(О)а1а-А5р-А1а-11е-Р11е-Т11г-С1п-8ег-Туг-Аг8-((№Ме)Ьу5)-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу5^еи-^еи-С1η-Α8р-I1е-^еи-8е^-Α^д-^у8(МРΑ)-СОNН2

Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 9, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Етос-Ьу§(А1ос)-ОН.

Пример 11. Второе долгоживущее производное СКЕ пептида из примера 9

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-РЬе-ТЙг-С1п-8ег-Туг-Агд-Ьу8(МРА)-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу8^еи-^еи-С1η-Α8р-I1е-^еи-8е^-Α^д-СОNН2

Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Етос-Агд(РЬГ)-ОН. Етос-8ег(1Ви)-ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-11е-ОН. Етос- А8р(1Ви)-ОН. Етос-С1п(Тг1)ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос -Ьу§(Вос)-ОН. Етос- Агд(РЬГ)-ОН. Етос-А1а-ОН. Етос-8ег(1Ви)ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-С1п(Тг1)-ОН. Етос-А1а-ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-Уа1-ОН. Етос- Ьу§(А1ос)-ОН. Етос-Агд(РЬГ)-ОН. Етос- Туг(1Ви)-ОН. Етос-8ег(1Ви)-ОН. Етос-С1п(Тг1)-ОН. Етос -Тйг(1Ви)-ОН. ЕтосРйе-ОН. Етос-11е-ОН. Етос -А1а-ОН. Етос-А8р(1Ви)-ОН. Етос-(Э)А1а-ОН. Вос-Туг(1Ви)-ОН.

Пример 12 (Бычий СКЕ).

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-РЬе-Тйг-А8п-8ег-Туг-Агд-Ьу8-Уа1-Ьеи-С1у-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу5-Ьеи-ЬеиС1η-Α8р-I1е-Меΐ-Α8η-Α^д-СОNН2

Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Етос- Агд(РЬГ)-ОН. Етос-А§п(Тг1)-ОН. Етос-Ме1-ОН. Етос-11е-ОН. Етос-А8р(1Ви)-ОН. Етос-С1п(Тг1)ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-Ьу§(Вос)-ОН. Етос-Агд(РЬГ)-ОН. Етос-А1а-ОН. Етос-8ег(1Ви)ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-С1п(Тг1)-ОН. Етос-С1у-ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-Уа1-ОН. Етос-Ьу§(Вос)-ОН₅Етос-Агд(РЬГ)-ОН. Етос-Туг(1Ви)-ОН. Етос-8ег(1Ви)-ОН. Етос-А§п(Тг1)-ОН. Етос-Тйг(1Ви)-ОН. ЕтосРйе-ОН. Етос-11е-ОН. Етос-А1а-ОН. Етос-А8р(1Ви)-ОН. Етос-(Э)А1а-ОН. Вос-Туг(1Ви)-ОН.

Пример 13. Долгоживущее производное пептида СКЕ из примера 12

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-РЬе-Тйг-А8п-8ег-Туг-Агд-Ьу8-Уа1-Ьеи-С1у-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу5-Ьеи-ЬеиС1п-А§р -I1е-Меΐ-8е^-Α8η-^у8(МРΑ)-СОNН2

Стадия 1. Эту стадию проводят как, описано выше в примере 12, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Етос-Ьу§(А1ос)-ОН.

Пример 14 А (Бычий СКЕ).

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-РЬе-ТЬх-С1п-8ег-Туг-Агд-Ьу8-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу5-Ьеи-ЬеиС1η-Α8р-I1е-^еи-Α8η-Α^д-СОNН2

Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Етос-Агд(РЬГ)-ОН. Етос-А§п(Тг1)-ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-11е-ОН. Етос-А8р(1Ви)-ОН. Етос-С1п(Тг1)ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-Ьу§(Вос)-ОН. Етос-Агд(РЬГ)-ОН. Етос-А1а-ОН. Етос-8ег(1Ви)ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-С1п(Тг1)-ОН. Етос-А1а-ОН. Етос-Ьеи-ОН. Етос-Уа1-ОН. Етос-Ьу8(Вос)-ОН. Етос-Агд(РЬГ)-ОН. Етос-Туг(1Ви)-ОН. Етос-8ег(1Ви)-ОН. Етос-СЬп(Тй)-ОН. Етос-Тйг(1Ви)-ОН. ЕтосРйе-ОН. Етос-11е-ОН. Етос-А1а-ОН. Етос-А8р(1Ви)-ОН. Етос-(Э)А1а-ОН. Вос-Туг(1Ви)-ОН.

Стадия 2. Эту стадию проводят,как описано в примере 1, стадия 2.

Пример 1 4В. Долгоживущее производное пептида СКЕ из примера 14А

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-РЬе-Тйг-С1п-8ег-Туг-Агд-Ьу8-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу5-Ьеи-ЬеиС1η-Α8р-I1е-^еи-Α8η-Α^д-^у8(ΑΕΕΑ-МРΑ)-СОNН2

- 14 006484

Стадия 1. Эту стадию проводят, как в примере 14А, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Етос-Ьу8(А1ос)-ОН.

Стадия 2. Селективную депротекцию Ьу§ (А1ос) группы осуществляют вручную и выполняют, обрабатывая полимер раствором 3 экв. Рб(РРЬ₃)4 в 5 мл С₆Н₆:СНС1₃ (1:1): 2,5 об.% ΝΜΜ : 5 об.% АсОН в течение 2 ч. Затем раствор промывают СНС1₃ (6x5 мл), 20% АсОН в ЭСМ (в хлористом метилене, 6x5 мл) ЭСМ (6x5 мл.) и ДМФА (6x5 мл).

Стадия 3. Синтез снова автоматизируют для прибавления Етос-АЕЕА-ОН (Етосаминоэтоксиэтоксиуксусной кислоты). Между прибавлениями (присоединениями) смолу три раза промывают ^^диметилформамидом (ДМФА) и три раза изопропанолом. После соответствующей депротекпии МРА (3-малеинимидопрошюновую кислоту) прикрепляют к АЕЕА спейсеру и снова смолу три раза промывают ^№диметилформамидом (ДМФА) и три раза изопропанолом.

Стадия 4. Пептид снимают с полимерной подложки, используя смесь 85% ТФК/5% Т18/5% тиоанизола и 5% фенола, с последующим осаждением ледяным (0-4°С) ЕьО. Сырой продукт - производное собирают на воронке из полипропилена, сушат, снова растворяют в смеси ацетонитрила (40%) с водой (0,1% ТФК) и лиофилизируют, получая соответствующий сырой продукт, используемый для очистки.

Пример 15 (Бычий ОВЕ).

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-РЬе-Тйг-О1п-8ег-Туг-(П)агд-Ьу8-Уа1-Ьеи-А1а-О1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу8-ЬеиЬеи-О1п-А8р-11е-Ьеи- А8η-А^д-СОNΗ₂

Стадия 1 . Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 1 00 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Етос-Агд(РЬ1)-ОН, Етос-А§п(Тг1)-ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-11е-ОН, Етос-А8р(1Ви)-ОН, Етос-О1п(Тй)ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-Ьу§(Вос)-ОН, Етос-Агд(РЫ)-ОН, Етос-А1а-ОН, Етос-8ег(1Ви)ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-О1п(Тй)-ОН, Етос-А1а-ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-Уа1-ОН, Етос-Ьу§(Вос)-ОН, Етос-(Э)Агд(РЬ£)-ОН, Етос-Туг(1Ви)-ОН, Етос-8ег(1Ви)-ОН, Етос-ОЬп(Тй)-ОН, Етос-ТЬг(1Ви)-ОН, Етос-РЬе-ОН, Етос-11е-ОН, Етос-А1а-ОН, Етос-А8р(1Ви)-ОН, Етос-(Э)А1а-ОН, Вос-Туг(1Ви)-ОН.

Стадия 2. Эти стадии проводят, как описано в примере 1 , стадия 2.

Пример 1 6. Долгоживущее производное пептида ОВЕ из примера 15

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-РЬе-Тйг-О1п-8ег-Туг-(П)агд-Ьу8-Уа1-Ьеи-А1а-О1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу8-ЬеиЬеи-О1п-А8р-Пе-Ьеи-А8п-Агд- ^у8(ЛЕЕА-МРА)-СОNΗ₂

Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 15, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Етос-Ьу§(А1ос)-ОН.

Стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 1 4, стадии 2-4.

Пример 1 7 (Бычий ОВЕ).

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-Пе-Рйе-Тйг-О1п-8ег-Туг-Агд-(Щ-Ме)Ьу8)-Уа1-Ьеи-Л1а-О1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу8^еи-^еи-О1η-А8р-I1е-^еи-А8η-А^д-СОNΗ₂

Стадия 1 . Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 1 00 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Етос- Агд(РЫ)-ОН, Етос-А§п(Тг1)-ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-11е-ОН, Етос-А8р(1Ви)-ОН, Етос-О1п(Тй)ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-Ьу§(Вос)-ОН, Етос-Агд^ЬЦ-ОН, Етос-А1а-ОН, Етос-8ег(1Ви)ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-О1п(Тй)-ОН, Етос-А1а-ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-Уа1-ОН, Етос-ЩМе)Ьу§(Вос)-ОН, Етос-Аг^РЬ^-ОН, Етос-Туг(1Ви)-ОН, Етос-8ег(1Ви)-ОН, Етос-ОЬп(Тй)-ОН, ЕтосТЬг(1Ви)-ОН, Етос-РЬе-ОН, Етос-11е-ОН, Етос-А1а-ОН, Етос-А8р(1Ви)-ОН, Етос-(Э)А1а-ОН, ВосТуг(1Ви)-ОН.

Пример 1 8. Долгоживущее производное пептида ОВЕ из примера 17

Ту^-(^)а1а-А8р-А1а-I1е-РЬе-Тй^-О1η-8е^-Ту^-А^д-((N-Ме)^у8)-Уа1-^еи-ЛIа-О1η-^еи-8е^-А1а-Л^д-^у8Ьеи- ^еи-01η-А8р-I1е-^еи-А8η-А^д-^у8(МРА)-С0NΗ₂

Стадия 1 . Эту стадию проводят, как описано выше в примере 1 7, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Етос-Ьу8(А1ос)-ОН.

Пример 19. Второе долгоживущее производное пептида ОВЕ из примера 17

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-РЬе-ТЬг-О1п-8ег-Туг-Агд-Ьу8(МРА)-Уа1-Ьеи-А1а-О1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу8^еи-^еи-О1η-А8р-I1е-^еи-А8η-А^д-СОNΗ₂

Стадия 1 : Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 1 00 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Етос-Агд(РЫ)-ОН, Етос-А§п(Тг1)-ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-11е-ОН, Етос-А8р(1Ви)-ОН, Етос-О1п(Тй)ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-Ьу§(Вос)-ОН, Етос-Агд^ЬЦ-ОН, Етос-А1а-ОН, Етос-8ег(1Ви)ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-О1п(Тй)-ОН, Етос-А1а-ОН, Етос-Ьеи-ОН, Етос-Уа1-ОН, Етос-Ьу§(А1ос)-ОН, Етос-Агд(РЫ)-ОН, Етос-Туг(1Ви)-ОН, Етос-8ег(1Ви)-ОН, Етос-ОЬп(Тй)-ОН, Етос-ТЬг(1Ви)-ОН, ЕтосРЬе-ОН, Етос-11е-ОН, Етос-А1а-ОН, Етос-А8р(1Ви)-ОН, Етос-(Э)а1а-ОН, Вос-Туг(1Ви)-ОН.

- 15 006484

Пример 20 (СНЕ лосося).

Η^5-(^)а1а-А5ρ-С1у-Μеΐ-Ρйе-А5η-^у5-А1а-Τу^-А^д-^у5-А1а-^еи-С1у-С1η-^еи-8е^-А1а-А^д-^у5-Τу^Ьеи-Н15-8ег-Ьеи-Ме1-А1а-Ьу5-СОНН₂

Стадия 1 . Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 1 00 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Γιηο^Γ-νδίΒοΟ-ΟΗ. Етοс-А1а-ΟН, Етοс-Меΐ-ΟН, Ριηο^Ρ^ΓΟΗ. Етοс-8е^(ίΒи)-ΟН, Етοс-Н^5(Тή)-ΟН, Етοс- Ьеи-ОН, Етοс-Τу^(ίΒи)-ΟН, Етοс-^у5(Βοс)-ΟН, Етοс-А^д(ΡЬί)-ΟН, Етοс А1а-ОН, Етοс-8е^(ίΒи)ОН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-С1η(Τ^ι)-ΟН, Етοс-С1у-ΟН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-А1а-ΟН, Етοс-^у5(Βοс)-ΟН, Етοс-А^д(ΡЬ£)-ΟН, Етοс-Τу^(ίΒи)-ΟН, Етοс-А1а-ΟН, Етοс-^у5(Βοс)-ΟН, Етοс-А5η(Тή)-ΟН, Ец-тос-Р11еОН, Етοс-Меΐ-ΟН, Етοс-С1у-ΟН, Етοс-А5р(ΐΒи)-ΟН, Етοс-(^)а1а-ΟН, Βοс-Н^5(Βοс)-ΟН.

Пример 21 . Долгоживущее производное пептида СНЕ из примера 20

Н^5-(^)а1а-А5р-С1у-Меΐ-РЬе-А5η-^у5-А1а-Ту^-А^д-^у5-А1а-^еи-С1у-С1η-^еи-8е^-А1а-А^д-^у5-Ту^Ьеи-Н|5-8ег-Ьеи-Ме1-А1а-Ру5(АЕЕА-МРА)-С.’ОНН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано в примере 20, стадии 2-4.

Эти стадии проводят, как описано в примере 14, стадии 2-4.

Пример 22 (СНЕ лосося).

Второе долгоживущее производное пептида СНЕ из примера 20

Н^5-(^)а1а-А5р-С1у-Меΐ-РЬе-А5η-^у5-А1а-Ту^-А^д-^у5(МРА)-А1а-^еи-С1у-С1η-^еи-8е^-А1а-А^д-^у5Туг-Ьеи-Н|5-8ег-Ьеи-Ме1-А1а-Ьу5-СОНН₂

Стадия 1 . Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 1 00 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Етοс-^у5(Βοс)-ΟН, Етοс-А1а-ΟН, Етοс-Меΐ-ΟН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-8е^(ίΒи)-ΟН, Етοс-Н^5(Тή)-ΟН, Етοс-Ьеи-ОН, Етοс-Ту^(ίΒи)-ΟН, Етοс-^у5(Βοс)-ΟН, Етοс-А^д(ΡЬ£)-ΟН, Етοс-А1а-ΟН, Етοс-8е^(ίΒи)ОН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-С1η(Тή)-ΟН, Етοс-С1у-ΟН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-А1а-ΟН, Етοс-^у5(АIοс)-ΟН, Етοс-А^д(ΡЬ£)-ΟН, Етοс-Ту^(ίΒи)-ΟН, Етοс А1а-ОН, Етοс-^у5(Βοс)-ΟН, Етοс А5п(Тй)-ОН, Ец-тос-Р11еОН, Етοс-Меΐ-ΟН, Етοс-С1у-ΟН, Етοс-А5р(ΐΒи)-ΟН, Етοс-(^)а1а-ΟН, Βοс-Н^5(Βοс)-ΟН.

Пример 23 (СНЕ цыплят).

Н15-8ег-Ееи-Ме1-А1а-Еу5-СОНН₂

Стадия 1 . Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 1 00 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Етοс-^у5(Βοс)-ΟН, Етοс-А1а-ΟН, Етοс-Меΐ-ОН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-8е^(ίΒи)-ΟН, Етοс-Н^5(Тή)-ΟН, Етοс-Ьеи-ОН, Етοс-Ту^(ίΒи)-ΟН, Етοс-А5η(Тή)-ΟН, Етοс-А^д(ΡЬί)-ΟН, Етοс-А1а-ΟН, Етοс-8е^(ίΒи)ОН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-С1η(Т^ι)-ΟН, Етοс-С1у-ΟН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс -^у5(Βοс)-ΟН, Етοс Агд(РЫ)-ОН, Етοс-Ту^(ίΒи)-ΟН, Етοс-А1а-ΟН, Етοс-^у5(Βοс)-ΟН, Етοс-8е^(ίΒи)-ΟН, Ец-юс-Р11еОН, Етοс-I1е-ΟН, Етοс С1у-ОН, Етοс-А5р(ΐΒи)-ΟН, Етοс-(^)а1а-ΟН, Βοс-Н^5(Βοс)-ΟН.

Пример 24. Долгоживущее производное пептида СНЕ из примера 23

Н^5-(^)а1а-А5ρ-С1у-I1е-РЬе-8е^-^у5-А1а-Ту^-А^д-^у5-^еи-^еи-С1у-С1η-^еи-8е^-А1а-А^д-А5η-Ту^-^еиШк-Зег-Ьеи- Ме1-А1а-Еу5(АЕЕА-МРА)-СОМН₂

Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано в примере 23.

Пример 25. Второе долгоживущее производное пептида СНЕ из примера 23

Н^5-(^)а1а-А5ρ-С1у-I1е-РЬе-8е^-^у5-А1а-Ту^-А^д-^у5(МРА)-^еи-^еи-С1у-С1η-^еи-8е^-А1а-А^д-А5ηТуг-Ьеи- Н15-8ег-Ьеи-Ме1-А1а-Ьу5-СОНН₂

Стадия 1 . Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 1 00 мкмоль. К смоле по методике, описанной в примере 1 , стадия 1 , последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Етοс-^у5(Βοс)-ΟН, Етοс-А1а-ΟН, Етοс-Меΐ-ОН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-8е^(ίΒи)-ΟН, Етοс-Н^5(Тή)-ΟН, Етοс-Ьеи-ОН, Етοс-Ту^(ίΒи)-ΟН, Етοс-А5η(Тή)-ΟН, Етοс-А^д(РЬ£)-ΟН, Етοс-А1а-ΟН, Етοс-8е^(ίΒи)ОН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-С1η(Тή)-ΟН, Етοс-С1у-ΟН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-^еи-ΟН, Етοс-^у5(А1οс)-ΟН, Етοс Агд(РЫ)-ОН, Етοс-Ту^(ίΒи)-ΟН, Етοс-А1а-ΟН, Етοс-^у5(Βοс)-ΟН, Етοс-8е^(ίΒи)-ΟН, Ец-юс-Р11еОН, Етοс-I1е-ΟН, Етοс С1у-ОН, Етοс-А5ρ(ΐΒи)-ΟН, Етοс-(^)а1а-ΟН, Βοс-Н^5(Βοс)-ΟН.

Пример 26. Второе долгоживущее производное пептида СНЕ из примера 1 (N-МРА)-Ту^-А1а-А5ρ-А1а-I1е-РЬе-ТЬ^-А5η-8е^-Ту^-А^д-^у5-Vа1-^еи-С1у-С1η-^еи-8е^-А1а-А^д-^у5Ееи-Ееи-СШ-Акр-Пе-МеЕЗег-Агд-СОМШ

Стадия 1 . Эту стадию проводят, как описано выше в примере 1 , за исключением того, что в конце синтеза к смоле (полимерной подложке) добавляют последний компонент (МРА).

Стадия 2. Производное снимают с полимерной подложки, используя смесь 85% ТФК/5% Т18/5% тиоанизола и 5% фенола, с последующим осаждением ледяным (0-4°С) ЕьО. Сырой продукт - 16 006484 производное собирают на воронке из полипропилена, сушат, снова растворяют в смеси ацетонитрила (40%) с водой (0,1 % ТФК) и лиофилизируют, получая соответствующие сырое производное ОКБ, используемое в процессе очистки.

Пример 27. Третье долгоживущее производное пептида ОКБ из примера 1 (№ЛЕВА-МРА)-Туг-А1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-Акп-§ег-Туг-Лгд-Ьук-Уа1-Ьеи-О1у-О1п-Ьеи-8ег-А1аА^д-^уκ-^еи-^еи-01η-Аκр-I1е-Ме!-8е^-А^д-С0NΗ₂

Стадия 1: Эту стадию проводят, как описано выше в примере 1, за исключением того, что предпоследним добавляемым компонентом является Бтос-АЕЕА, а последним компонентом является (МРА).

Стадия 2. Эту стадию проводят, как описано в примере 26, стадия 2.

Методика очистки

Каждое соединение очищают препаративной обращённо-фазовой ВЭЖХ, используя систему препаративной бинарной ВЭЖХ Уапап (Эупатах). Очистку производят на колонке РНепотепех Ьипа 10 мк фенил-гексил, 50 мм х 250 мм (частицы 10 мк), уравновешенной смесью вода/ТФК (0,1% ТФК в Н₂О (растворитель А)) и ацетонитрил/ТФК (0,1% ТФК в ΟΗ₃ΟΝ (растворитель В)). Элюирование проводят, пропуская смесь в градиенте 28-38% растворителя В со скоростью 50 мл/мин в течение 180 мин. Фракции, содержащие пептид, определяют УФ-спектроскопией по поглощению при 214 и 254 нм (Уапап Эупатах ИУЭ II).

Фракции собирают в виде аликвот по 25 мл. Фракции, содержащие нужный продукт, идентифицируют, определяя массу с помощью непосредственной инъекции в БС.7М8. Отобранные фракции последовательно анализируют методом аналитической ВЭЖХ (20-60% В в течение 20 мин; колонка РНепотепех Ьипа 5 мк фенил - гексил, 50 мм х 250 мм, 0,5 мл/мин), объединяя фракции с чистотой > 90%. Пул замораживают в жидком азоте и сушат, а затем лиофилизируют по меньшей мере в течение 2 дней, получая жёлтый порошок.

Результаты ΐη νϊίΐΌ

Эффективность некоторых производных ОКБ по настоящему изобретению оценивают как их способность значительно повышать секрецию ОΗ в анализе культур первичных клеток аденогипофиза крыс. Свежие первичные клетки гипофиза экспонируют с различными концентрациями соединений в течение 4 ч и определяют уровни ОΗ в культуральных средах, используя набор К1А, выпускаемый Ыпсо КекеагсН (МО).

Методология

Гипофиз целиком удаляют из нормальных крыс 8ртадие-ОаМеу после анестезии и сразу собирают в свежую культуральную среду, содержащую фунгизон и гентамицин сульфат. Клетки готовят для первичной клеточной культуры в течение одного часа после сбора гипофизов. Отдельные гипофизы разрезают и фрагменты гидролизуют в присутствии трипсина при продолжительном осторожном перемешивании. Фрагменты ткани механически разрушают, используя пипетку Пастера, и инкубируют ещё в течение 1 5 мин. Клетки растирают, дважды отмывают и засевают в 24-луночные планшеты, содержащие свежую среду. После культивирования в течение 72 ч клетки дважды отмывают бессывороточной средой, а затем инкубируют с аналогом или производным ОКБ или без него в течение 4 ч. После инкубирования собирают супернатанты и анализируют, количественно определяя гормон роста крысы методом радиоиимуноанализа (набор от Ыпсо КекеагсН, МО).

Как видно на фигурах, результаты показывают, что все производные ОКБ по данному изобретению способны стимулировать секрецию ОΗ в концентрациях в интервале от 10^-6 до 10^-13 М. Коэффициент стимуляции сравним с коэффициентом стимуляции, получаемым с помощью промышленного ОКБ(1-29) и Э-А1а-ОКБ(1-29) (оба реагента от Ро1урерй4е ЬаЬота!опек, СаШоттаа).

Результаты ΐη νίνο

Эффективность ш νί\Ό производных ОКБ по настоящему изобретению оценивают как их способность значительно повышать секрецию ОΗ в организме свободно движущихся животных. Соединения вводят подкожно в виде болюсной инъекции (1 мкмоль/кг) нормальным катетеризованным крысам 8ртадие-ОаМеу. Серийные образцы крови отбирают для экстренного определения выделения ОΗ после введения соединения.

Методология

Катетеризованных 7-8-недельных катетеризованных самцов крыс 8ргадие-ОаМеу подготавливают с помощью приспособлений для фиксации крыс по меньшей мере за 5 дней до эксперимента, чтобы избежать стресса. Эксперимент начинают только между 9 и 11 ч утра. Каждая подопытная группа состоит из 8 крыс. Соединения вводят только подкожной инъекцией в поясничной области. Серийные образцы крови берут перед введением дозы и через 5, 10, 15, 20, 30 и 60 мин после инъекции. Плазму собирают и образцы сразу же посылают в Ыпсо КекеагсН (МО) для определения ОΗ радиоиммуноанализом. Статистические определения (!-ТЕСТ) осуществляют, используя программное обеспечение Мютокой Ехсе1™.

Как видно на фигурах, все производные ОКБ по данному изобретению могут индуцировать секрецию ОБ на моделях нормальных крыс.

- 17 006484

Фармакокинетические исследования

Фармакокинетические исследования проводят на соединениях из примеров 5 и 6. Каждое соединение инъецируют самцам крыс 8ргадие-ОаМеу подкожно (1 мкмоль/кг) или внутривенно (100 нмоль/кг). Серийные образцы крови отбирают перед введением дозы, через 5, 30 и 60 мин и через 2, 4, 8, 24, 48, 72 и 96 ч после введения агента. Плазму собирают и замораживают до момента проведения радиоиммуноанализа (К1А). Для обнаружения соединений используют готовое поликлональное антитело, специфичное к человеческому нативному ОКБ(1-29). Чувствительность анализа составляет 300-10000 пМ. Соответственно, некоторые образцы следует разбавлять для анализа. Результаты фармакокинетических показателей представлены на фиг. 9. Как можно видеть, соединение из примера 5, т.е. нативный пептид, исчезает очень быстро. Действительно, соединение из примера 5, вводимое подкожно или внутривенно, нельзя обнаружить через 60 мин после введения. Это согласуется с результатами, полученными на крысах 8ргадие-ЭаМеу, опубликованными в литературе для ОКБ(1-29) и других его аналогах, относящимися к их конечному периоду полужизни и к процентному соотношению биодоступности (8С'.'/Ш) (подкожно/внутривенно) (см., например, РерЕбек. 9:207-209, и 1. Εη6ο^., 107:К5-К8.

С другой стороны, соединение из примера 6, которое представляет собой дериватизированный по данному изобретению нативный пептид из примера 5, обнаруживается через 96 ч. Дополнительные данные представлены далее в табл. 2.

Таблица 2. Фармакокинетические параметры соединения из примера 6

Параметры	Подкожное введение	Внутривенное введение
λ	0,027	0,037
Конечное время полужизни (часы)	25,8+2,1	18,7 + 1,4
Аис (нМ х час.)	8864,5	23277,5
, % биодоступноста (ЗСДУ)	3,8 \| ΝΖΑ

Хотя данное изобретение описано на конкретных примерах, ясно, что его можно дополнительно модифицировать, и данное изобретение претендует на то, чтобы охватить любые варианты, применения или адаптации данного изобретения, следующие, в основном, принципам данного изобретения и включающие такие отклонения от данного описания, которые соответствуют общеизвестной или обычной практике в области техники, к которой относится данное изобретение, и к которым могут быть приложимы основные особенности, представленные в данном описании, и которые соответствуют формуле изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Производное рилизинг-фактора гормона роста, содержащее пептид с активностью продуцирования или рилизинга гормона роста и реакционноспособную группу, соединённую с пептидом, причём производное способно ковалентно связываться ίη νίνο или ίη νίίτο с функциональной группой компонента крови, а пептид содержит ОКБ последовательность

А|-А2-Акр-А₁-А5-Рке-А-А8-А9-Туг-А||-А|2-А|з-Ьеи-А|5-С1п-Еси-А|8-А1а-А₂гА2|-А22-Еси-А2₁-А25-А2б-А2-А28-А29-Аз₎.

где А₁ обозначает Туг, Ν-Ас-Туг, Н1к, 3-МеН1к, дезNН₂ Н1к, дезNН₂ Туг, Ьук-Туг, Ьук Н1к или Ьук-3МеН1к;

А₂ обозначает Vа1, Ьеи, 11е, А1а, И-А1а, М-метил-Э-А1а, (Ы-метил)-А1а, О1у, ΝΚ или Νν81;

А4 обозначает А1а или О1у;

А₅ обозначает Ме! или 11е;

А₇ обозначает Акп, 8ег или Ткг;

А₈ обозначает Акп, О1п, Ьук или 8ег;

А₉ обозначает А1а или 8ег;

А₁₁ обозначает Агд, Ό-Агд, Ьук или Ό-Ьук;

А₁₂ обозначает Ьук, (Ν-Ме^ук или Ό-Ьук;

А₁₃ обозначает Vа1 или Ьеи;

А₁₅ обозначает А1а, Ьеи или О1у;

А₁₈ обозначает 8ег или Ткг;

А₂₀ обозначает Агд, Ό-Агд, Ьук или Ό-Ьук;

А₂₁ обозначает Ьук, (№Ме)Ьук или Акп;

А₂₂ обозначает Туг или Ьеи;

А₂₄ обозначает О1п или Н1к;

А₂₅ обозначает 8ег или Акр;

А₂₆ обозначает Ьеи или 11е;

А₂₇ обозначает Ме!, 11е, Ьеи или ΝΚ;

- 18 006484

А₂₈ обозначает 8ег, Акп, А1а или Акр;

А₂₉ обозначает Ьук или Агд и

А₃₀ отсутствует, обозначает X или Х-Ьук, где X отсутствует или обозначает последовательность С1п-С1п-С1у-С1и-8ег-Акп-С1п-С1и-Агд-С1у-А1а-Агд-А1а-Агд-Ьеи или её фрагмент, причем фрагмент уменьшен на одну-пятнадцать аминокислот на С-конце тем, что один аминокислотный остаток во фрагменте может необязательно быть заменён на остаток лизина; а С-конец может представлять собой свободную карбоновую кислоту или соответствующий амид, при условии, что когда А₂ обозначает А1а, тогда фрагмент не обозначает фрагмент, уменьшенный на 5-8 аминокислот.
2. Производное по п. 1, у которого А₃₀ обозначает Χ-Ьук, а X отсутствует.
3. Производное по п.2, у которого А₂ обозначает И-А1а.
4. Производное по п.1, у которого А₁₅ обозначает А1а.
5. Производное по п.1, у которого А₂ обозначает И-А1а, А₈ обозначает С1п, А₁₅ обозначает А1а, А₂₇обозначает Ьеи, А₃₀ обозначает Χ-Ьук, а X отсутствует.
6. Производное по п. 1, у которого последовательность СКЕ выбирают из группы, состоящей из

Туг-А1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-Акп-8ег-Туг-Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-С1у-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-Ьеи-ЬеиС1п-Αкр-I1е-Меΐ-8е^-Α^д-СΟNН₂,

Туг-(Р)а1а-Акр-А1а-Пе-Рйе-Тйг-Акп-8ег-Туг-Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-С1у-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-Ьеи-ЬеиС1п-Αкр-I1е-Меΐ-8е^-Α^д-СΟNН₂;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-Ьеи-ЬеиС1п-Акр-11е-Ееи-8ег-Агд-СОНН_;.

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-(П)Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-ЬеиЕеи-С1п-Акр-11е-Ееи-8ег-Агд-СОНН₂;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-Агд-((№Ме)Ьук)-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-ЬукЕеи-Ееи-С1п-Акр-Не-Ееи-8ег-Агд-СОНН₂;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-Акп-8ег-Туг-Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-С1у-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-Ьеи-ЬеиС1п-Αкр-I1е-Меΐ-Αкп-Α^д-СΟNН₂;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-А1а-Ст-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-Ьеи-ЬеиС1п-Акр-11е-Ееи-Акр-Агд-СОНН₂;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-(П)агд-Ьук-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-ЬеиЕеи-С1п-Акр-11е-Ееи-Акп-Агд-СОНН_;;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-Агд-((№Ме)Ьук)-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-ЬукЕеи-Ееи-С1п-Акр-11е-Ееи-Акп-Агд-СОНН_;;

Н1к-(П)а1а-Акр-С1у-Ме1-Рйе-Акп-Ьук-А1а-Туг-Агд-Ьук-А1а-Ьеи-С1у-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-ТугЬеи-Н1к-8ег-Ьеи-Ме1-А1а -Бук-СОНН. и

Н1к-(П)а1а-Акр-С1у-11е-Рйе-8ег-Ьук-А1а-Туг-Агд-Ьук-Ьеи-Ьеи-С1у-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Акп-Туг-ЬеиН^к-8е^-^еи-Меΐ-Α1а-^ук-СΟNН₂, причём каждая последовательность СКЕ необязательно содержит остаток лизина на Ν-конце или на С-конце; и отличающееся также тем, что реакционноспособная группа представляет собой малеинимидосодержащую группу.
7. Производное по п.6, у которого последовательность СКЕ содержит на С-конце дополнительный остаток лизина.
8. Производное по п. 1, у которого последовательность СКЕ выбирают из группы, состоящей из

Туг-А1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-Акп-8ег-Туг-Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-С1у-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-Ьеи-ЬеиСIп-Αкр-I1е-Меΐ-8е^-Α^д-^ук(МРΑ)-СΟNН₂;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-Акп-8ег-Туг-Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-С1у-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-Ьеи-ЬеиС1п-Αкр-I1е-Меΐ-8е^-Α^д-^ук(МРΑ)-СΟNН₂;.

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-Ьеи-ЬеиС1п-Акр-11е-Ееи-8ег-Агд-Еук(МРА)-СОНН₂;

Туг-(П)А1а-Акр-А1а-11е-Рйе-ТЬг-С1п-8ег-Туг-(П)Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-ЬеиЬеи-С1п-Акр-11е-Ьеи-8ег-Агд-Ьук(МРА) СОНН₂;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-Агд-((№Ме)Ьук)-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-ЬукЕеи-Ееи-С1п-Акр-11е-Ееи-8ег-Агд-Еук(МРА)-СОНН₂;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-Агд-Ьук(МРА)-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-ЬукЕеи-Ееи-С1п-Акр-11е-Ееи-8ег-Агд-СОНН₂;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-Акп-8ег-Туг-Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-С1у-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-Ьеи-ЬеиС1п-Акр-11е-Ме1-8ег-Акп-Еук(МРА)-СОНН₂;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-Агд-Ьук-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-Ьеи-ЬеиС1п-Акр-11е-Ееи-Акп-Агд-Еук(АЕЕА-МРА)-СОНН₂;

Туг-(П)а1а-Акр-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-(П)агд-Ьук-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьук-ЬеиЬеи-С1п-Акр-11е-Ьеи -Акп-Агд-Еук(АЕЕА-МРА)-СОНН₂;

- 19 006484

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-Рйе-Тйг-61п-§ег-Туг-Агд-((АМе)Ьу8)-Уа1-Ьеи-А1а-61п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу8Ьеи -Ьеи-С1п-А8р-11е-Ьеи -Акп-Агд ^у8(МΡА)-СОNН₂;

Туг-(П)а1а-А8р-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-§ег-Туг-Агд-Ьу8(МРА)-Уа1-Ьеи-А1а-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу8^еи-^еи-С1η-А8р-I1е-^еи-А8η-А^д-СОNН₂;

Н18-(П)а1а-А8р-С1у-Ме1-Рйе-А8п-Ьу8-А1а-Туг-Агд-Ьу8-А1а-Ьеи-С1у-С1п-Ьеи-8ег-А1а-Агд-Ьу8-Туг^еи-Н^8-8е^-^еи-Меΐ-Л1а-^у8(ЛЕЕА-МΡА)-СОNН₂;

Н18-(П)а1а-А8р-С1у-Ме1-Рйе-А5п-Еу8-А1а-Туг-Агд-Еу8(МРА)-А1а-Ееи-С1у-С1п-Ееи-8ег-А1а-Агд-Еу8Ту^-^еи-Н^8-8е^-^еи-Меΐ-А1а-^у8-СОNН₂;

Н18-(П)а1а-А8р-С1у-11е-Рйе-8ег-Еу8-А1а-Туг-Агд-Еу5-Ееи-Ееи-С1у-С1п-Ееи-8ег-А1а-Агд-А8п-Туг-ЕеиН18-8ег-Ееи-Ме1-А1а-Еу8(АЕЕА-МРА)-СО1УН2;

Н15-(П)а1а-А8р-С1у-11е-Рйе-8ег-Еу8-А1а-Туг-Агд-Еу8(МРА)-Ееи-Ееи-С1у-С1п-Ееи-8ег-А1а-Агд-А5пТуг-Ееи-Н15-8ег-Ееи-Ме1-Л1а-Еу8-СО:МН₂;

(№МРА)-Туг-Л1а-А8р-Л1а-11е-Рйе-Тйг-А8п-8ег-Туг-Агд-Еу8-Уа1-Ееи-61у-61п-Ееи-8ег-А1а-Агд-Еу8^еи-^еи-С1п-А8р-I1е-Меΐ-8е^-А^д-СОNН₂ и (N-ЛЕЕА-МΡА)-Ту^-А1а-А8р-А1а-I1е-Ρйе-Тй^-А8п-8е^-Ту^-Л^д-^у8-Vа1-^еи-С1у-С1п-^еи-8е^-А1аЛ^д-^у8-^еи-^еи-С1п-А8р-I1е-Меΐ-8е^-А^д-СОNН₂.
9. Производное по п. 1, отличающееся тем, что компонент крови включает белки крови.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая производное СИР по п. 1 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
11. Композиция по п. 10, предназначенная для стимуляции продуцирования или высвобождения эндогенного СН в организме субъекта.
12. Композиция по п.10, предназначенная для лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования СН.
1 3. Способ стимулирования эндогенного продуцирования или высвобождения СН в организме субъекта, заключающийся во введении субъекту эффективного количества производного по п.1, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
1 4. Способ лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования СН, заключающийся во введении субъекту эффективного количества производного по п.1, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
15. Конъюгат, содержащий производное по п.1, ковалентно связанное с компонентом крови.
16. Способ продления ш у1уо периода полужизни пептида, проявляющего гормон роста (СН)рилизинг активность, заключающийся в ковалентном связывании пептида с компонентом крови, в котором в качестве пептида используют пептид с последовательностью СИР, определенной в п. 1.
1 7. Способ лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования СН, заключающийся во введении субъекту эффективного количества конъюгата по п. 15, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
18. Способ стимулирования эндогенного продуцирования или высвобождения СН в организме субъекта, заключающийся во введении субъекту эффективного количества конъюгата по п.15, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
19. Производное по п.1, представляющее собой Туг-(П)а1а-А5р-А1а-11е-Рйе-Тйг-С1п-8ег-Туг-Агд-Еу5Vа1-^еи-А1а-С1п-^еи-8е^-А1а-А^д-^у8-^еи-^еи-С1п-А8р-I1е-^еи-8е^-Л^д-^у8(МΡА)-СОNН₂.
20. Конъюгат, содержащий производное по п.19, ковалентно связанное с компонентом крови.
21 . Конъюгат по п.20, у которого компонент крови представляет собой белок сыворотки.
22. Фармацевтическая композиция, содержащая производное по п.19 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
23. Композиция по п.22 для стимуляции продуцирования или высвобождения эндогенного СН в организме субъекта.
24. Композиция по п.22, предназначенная для лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования СН.
25. Способ лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования СН, заключающийся во введении субъекту эффективного количества производного по п.19, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
26. Способ стимулирования эндогенного продуцирования или высвобождения СН в организме субъекта, заключающийся во введении субъекту эффективного количества производного по п. 13, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
27. Способ лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования СН, заключающийся во введении субъекту эффективного количества конъюгата по п.21 , индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
28. Способ стимулирования эндогенного продуцирования или высвобождения СН в организме субъекта, заключающийся во введении субъекту эффективного количества конъюгата по п.21 , индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.