DK149823B

DK149823B - Fremgangsmaade til fremstilling af kijanimicin eller farmaceutisk acceptable salte heraf

Info

Publication number: DK149823B
Application number: DK012581AA
Authority: DK
Inventors: Jay Allan Waitz; Ann Camille Horan; Mahesh Gordhandas Patel
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1980-01-17
Filing date: 1981-01-13
Publication date: 1986-10-06
Also published as: PT72348A; ATE8798T1; DK12581A; EP0033840A3; KR840000751B1; AU6619181A; KR830005360A; NO810114L; FI810078L; DE3164568D1; PT72348B; FI69099C; US4375542A; NZ196006A; ES8200922A1; NO155732B; PH17057A; HU181799B; JPS56118078A; IE50810B1

Description

i 149823

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt, farmaceutisk aktiv forbindelse, kijanimicin, eller farmaceutisk acceptable salte heraf. Kijanimicin og dets salte udviser 5 antibiotisk virkning og er nyttige som antiacnemidler, som antitumormidler, som antimalariemidler, som anti-bakterielle midler og som antiinflammatoriske midler.

Som følge af dets antibakterielle virkning vil kijanimicin i det følgende blive betegnet som antibiotikum, 10 selv om det udviser andre, ikke-antibiotiske, beslægtede virkninger. Kijanimicin har formlen

O

OH I

j n 20 hoc^7 o h y ch3 CH,OCONH Π H rCH, Λ S ?=\ C”3

N°2 η 1 Z I

J H jL>° ^7^CH3 ch2oh 2 149823

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man dyrker en stamme af arten Actinomadura ki-janiata i et vandigt næringsmedium og isolerer kijani-micin som sådant eller i form af et farmaceutisk accep-5 tabeltsalt.

Der dyrkes især Actinomadura kijaniata ATCC

31588.

Actinomadura kijaniata nov. sp. SCC 1256 isolere-des fra en jordbundsprøve opsamlet i Kenya, Afrika. En 10 kultur af denne mikroorganisme er blevet indlemmet i samlingen i American Type Culture Collection (ATCC) Rockville·, Maryland, hvor den er blevet tildelt accessionsnummeret ATCC 31588 (deponeringsdato: 28. november 1979).

. En prøve deraf vil blive udleveret efter anmodning.

15 Stammen SCC 1256 har følgende morfologiske egen skaber, når den dyrkes på gærekstrakt-dextrose-agar ved 30°C i 14 til 21 dage: der dannes kraftige, snoede luftmycelier, som itubrydes til lange kæder af eliptiske sporer på ca. 1,0 til 1,5 mikron i diameter gange 1,5 til 20 2,0 mikron i længde. Det vegetative mycelium danner ri- 3 149823 gelige forgreninger.

Organismen indeholder meso-diaminopimelinsyre (meso-DAP) som en karakteristisk aminosyre i cellevæggen.

Hele celler indeholder 3-0-methyl-D-galactose (madurose).

5 I tabel 1 er der angivet dyrkningsegenskaberne for SCC 1256 dyrket på forskellige standardmedier foreslået af Shirling og Gottlieb (Inter. J. Syst. Bact. 16, 313-340, 1966) og Waksman (The Actinomycetes, Vol. II,

The Williams and Wilkins Co., 1961). Der blev foretaget 10 iagttagelser efter 14 dage ved 30°C. De farvebetegnelser, der er anført for det vegetative myceliums pigmenter, består af et farvenavn (Descriptive Color Names Dictionary, Container Corp., America, 1950) og et farve-delnummer (Color Harmony Manual, ed. 4, Container Corp.

15 America, 1958). Hovedfarven af det vegetative mycelium er mørkegrøn, og luftmyceliet som helhed er hvidt og dannes i rigelig mængde på ISP medium nr. 7, stivelsesagar og gærekstrakt-dextrose-agar.

De fysiologiske egenskaber og carbonhydratudnyt-20 teisen hos stammen 1256 er anført i henholdsvis tabel 2 og 3.

Morfologisk analyse og cellevæganalyse viser, at stammen SCC 1256 er en art af slægten Actinomadura. Ingen af de beskrevne arter af Actinomadura (Cross & Good-25 fellow, Actinomycetales, Characteristics and Practical Importance, London, Academic Press, 1973? Nonomura, Jap.

J. Ferment 52:71-77, 1974? Preobrazhenskaya og Sveshni-kova, Microbiol 43:864-868, 1974) deler SCC 1256's kombination af mørkegrønt vegetativt mycelium, hvidt luft-30 mycelium og fysiologiske særpræg. Desuden producerer ingen af dem kijanimicin. Kulturen betragtes derfor som en hidtil ukendt art af slægten Actinomadura betegnet A. kijaniata nov. sp. SCC 1256, ATCC 31588.

149823 4

Tabel 1 Vækstegenskaber af A. kijaniata på forskellige descriptive medier.

Medium Vækstegenskaber 5 Bennett's agar V: +++, god O: ophøjet, foldet LM: til stede, sparsomt, hvidt DFP: ikke til stede F: g 22 li, fyrregrøn 10 Czapek-saccharose-agar V: +++, god O: båndlignende LM: ikke til stede DFP: ikke til stede F: g 22 n, mørk fyrregrøn 15 Glucose-asparagin-agar V: +++, god O: ophøjet, foldet LM: til stede, sparsomt, hvide pletter DFP: ikke til stede 20 F: g 22 n, mørk fyrregrøn

Glycerol-asparagin-agar V: +++, god O: flad, foldet LM: ikke til stede DFP: grå, rødbrune 25 F: midte, g 19 po, mørk laur- bærbladfarvet, periferi, g 6 ie, rødtræ-farvet Næringsagar V: +++, god 30 O: ophøjet, foldet LM: ikke til stede DFP: svagt matgrønne F: g 23 n, stedsegrøn

Vandagar V: +, ringe 35 O: granulær LM: ikke til stede DFP: ikke til stede F: g 24 ge, støvgrøn Gærekstrakt-maltekstrakt- 40 agar_ (ISP nr. 2) V: +++, god O: ophøjet, hård, foldet LM: til stede, hvide pletter DFP: ikke til stede 45 F: midte, g 21 ni, mørk jade grøn periferi., g 2 ec, sandfarvet 149823 5

Tabel 1 (fortsat)

Medium Vakstegenskaber

Kartoffel-dextrose-agar V: ++» moderat 0: flad til svagt ophøjet 5 LM: ikke til stede DFP: ikke til stede F: g 2 ge, maskeret gulbrun

Emerson's agar V: + til ++/ nogenlunde til moderat 10 0: flad, granular LM: ikke til stede DFP: ikke til stede F: g 22 ig, laurbærfrugtfarvet NZA-glucose-agar V: +++, god 15 0: blød, kompakt foldet LM: ikke til stede DFP: ikke til stede til mørke brune F: g 15 po, mørk skifer 20 Gærekstrakt-glucose-agar V: +++, god 0: ophøjet, dybt foldet, hård med revner LM: til stede, hvidt DFP: ikke til stede 25 F: midte, g 22 ig, mandelgrøn periferi, g 3 ge, kamel

Tomatpasta-havremel-agar V: +++, god 0: flad, granular LM: til stede, hvide pletter 30 DFP: ikke til stede F: gi 1/2 li, lys olivenfarvet

Stivelse-agar (Waksman nr.

21)_ V: +, nogenlunde 0: flad, granular 35 LM: ikke til stede DFP: ikke til stede . F: g 24 ig, mat grågrøn

Calcium-maleat-agar V: + til ++, nogenlunde til (Waksman nr. 7)_ moderat 40 0: foldet, blød LM: ikke til stede DFP: ikke til stede F: g 2 gc, bambus 149823 6

Tabel 1 (fortsat)

Medium Vækstegenskaber

Havremel-agar (ISP nr. 3) V: + til ++, nogenlunde til moderat 5 0: flad, granulær LM: til stede, hvide pletter DFP: ikke til stede F: g 22 hl, mørk fyrregrøn

Uorganiske salte - stivel- V: +, nogenlunde 10 se-agar (ISP nr. 4)_O: flad, granulær LM: ikke til stede DFP: svagt grønne F: midte, g 23 li, skifergrøn periferi, g 4 ge, lysebrun 15 Pepton-jern-agar V: ++, moderat O: ophøjet, granulær LM: til stede, hvide pletter DFP: ikke til stede F: g 2 ge, maskeret gulbrun 20 Casein-agar V: ++, moderat O: flad, granulær LM: ikke til stede DFP: ikke til stede F: g 22 ih, mosgrå 25 Tyrosin-agar (ISP nr. 7) V: +++, god 0: ophøjet, foldet LM: til stede, rigeligt, hvidt DFP: ikke til stede F: g 5 ih, blygrå 30 Stivelse-agar (gær) V: +++, god 0: hård, foldet LM: til stede, moderat, hvid DFP: ikke til stede F: g 23 li, skifergrøn 35 Calcium-citrat-agar V: +, nogenlunde 0: flad, granulær LM: ikke til stede DFP: ikke til stede F: g 2 li,maskeret brun 40 Gelatine-agar (McDade) V: ++, moderat 0: ophøjet,kompakt foldet LM: ikke til stede DFP: ikke til stede F: midte, g 1 po, ibenholt 45 periferi, g 1 fe, som u- behandlet tekstilstof V: vækst; 0: overfladeegenskaber; LM: luftmycelium; DFP: diffunderbare pigmenter; og F: farve af væksten.

149823 7

Tabel 2

Fysiologiske egenskaber af A. kijaniata Prøve A. Kijaniata

Hydrolyse af: Resultater 5 Adenin +

Hypoxanthin +

Tyrosin +

Xanthin +

Casein + 10 Stivelse + , svagt positiv

Gelatine +

Nitrat til nitrit svagt positiv Vækst i nærværelse af NaCl 15 1,0% +++, god 2,0% ++, moderat 3,0% +, nogenlunde til ringe Vækst ved 28°C +++, god 20 35°C +++, god 40°C ++, nogenlunde til moderat 45°C +, nogenlunde

Dannelse af H2S negativ 25 Melanin negativ

Tabel 3

Udnyttelse af carbonhydrater

Prøve A. kijaniata

Carbonhydrater1 30 Kontrol D-Arabinose + L-Arabinose +

Dextrin +

Dulcitol 35 Erythritol D-Fructose + L-Fucose + δ 149823

Tabel 3 (fortsat)

Prøve Å. kiianiata

Carbonhydrater1 D-Galactose + 5 D-Glucose + α-m-d-Glucosid ιη-β-D-Glucopyranosid + (grønne dfp)

Glycerol +

Inositol + 10 Inulin Lactose

Maltose + D-Mannitol D-Mannose + 15 Melibiose -

Melizitose

Raffinose - L-Rhamnose +

Ribose + 20 Saccharose +

Trehalose + D-Xylose +

Medium ifølge Luedemann og Brodsky Antimicrobial A-gents and Chemotherapy, 1963, pg. 116-124 (1964).

25 Fermenteringen Når A. kijaniata fermenteres under kontrollerede betingelser i et egnet medium, producerer den et antibiotikum, som heri betegnes kijanimicin.

Fermenteringen, ved hvilken antibiotiket produ-30 ceres, påbegyndes med fremstillingen af et kraftigt ve-.getativt podemateriale, der sædvanligvis fremstilles i to eller tre trin. Et egnet medium til fremstilling af et sådant podemateriale er anført nedenfor som medium A og medium B. Podematerialefremstillingen og fermenterin-35 gen udføres i et medium, hvori pH-værdien holdes på fra ca. 6,5 til ca. 8,5, fortrinsvis ca. 7,5 for podemateri- 149823 9 alets vedkommende og 7,0 for fermenteringens vedkommende. De rette pH-områder opretholdes sædvanligvis ved inkorporering af passende puffere, såsom calciumcarbonat, i medierne.

5 Det vegetative podemateriales fremstilling og fermenteringen foretages ved fra ca. 25°C til ca. 45°C, fortrinsvis mellem 28°C og 35°C. Den mest foretrukne temperatur til fremstilling af det vegetative podemateriale og til udførelse af fermenteringen er ca. 30°C.

10 Almindeligvis fremstilles næringsmedierne i en passende fermenteringsbeholder eller-kolbe, som steriliseres og afkøles før podningen. Medierne kan dog før anvendelse oplagres under aseptiske betingelser ved temperaturer under nulpunktet.

15 Fremstilling af podemateriale.

Til fremstilling af antibiotiket ifølge den foreliggende opfindelse foretrækkes et kraftigt voksende vegetativt podemateriale.

Almindeligvis udføres podematerialefremstillingen 20 i to eller flere trin. Til fermenteringer i stor målestok (f. eks. ca. 50 liter) foretrækkes det, at podematerialet fremstilles i tre trin.

Et egnet medium til fremstilling af vegetative podematerialer er følgende:

25 Medium A

Kødekstrakt 3 g

Tryptose 5 g

Dextrose 1 g

Kartoffelstivelse 24 g 30 Gærekstrakt 5 g

Calciumcarbonat 2 g

Ledningsvand til 1,0 liter 2 ml frisk optøet helnæringsvæske med A. kijania-ta anvendes til podning af 50 ml sterilt medium A.

35 Kolben inkuberes ved ca. 30°C i fra ca. 48 til ca.

96 timer, fortrinsvis i ca. 72 timer, i et rotationsrysteapparat ved ca. 300 o/m og 5 cm slaglængde.

149823 10

Andet podematerialetrin.

25 ml af det første podemateriale anvendes til podning af en række 500 ml portioner af sterilt medium A i 2 liters Erlenmeyer-kolber. Kolberne inkuberes ved ca.

5 30°C i fra ca. 24 til ca. 72 timer, fortrinsvis i 48 timer.

Tredje podematerialetrin.

25 ml af det andet podemateriale anvendes til podning af hver af en række af 500 ml portioner af ste-10 rilt medium B i 2 liters Erlenmeyer-kolber. Kolberne inkuberes under omrystning ved ca. 350 o/m og ved ca. 30°C i fra ca. 24 til ca. 72 timer, fortrinsvis i 48 timer.

Beluftning med ca. 0,35 volumener luft/volumen fermen-teringsblanding/minut (wm).

15 Det følgende medium har vist sig at give både tilfredsstillende og reproducerbare udbytter af antibiotikumproduktion.

Medium B

Gærekstrakt 5 g/liter 20 Dextrose 10 g/liter

Opløselig stivelse 20 g/liter NZ-Amin (Difco) 5 g/liter

Calciumcarbonat 4 g/liter

Cobaltchlorid 10-®M

25 Eftersterilisation pH 7,0

Antibiotikumproduktion.

10 Liter sterilt medium B podes med 500 ml af det andet trins podemateriale fremstillet som beskrevet ovenfor. Fermenteringsblandingen inkuberes ved fra ca. 27°C 30 til ca. 35°C, fortrinsvis ved ca. 30°C med omrystning og beluftning ved henholdsvis ca. 350 o/m og 0,35 vvm. Fermenteringsblandingens pH-værdi holdes på ca. 6,8 til ca.

7,5 ved tilsætning af fortyndet syre eller alkali om nødvendigt. Tilsætning af fortyndet syre eller fortyndet 35 alkali er sædvanligvis unødvendig. Ved en normal fermentering vil pH-værdien imidlertid stige til ca. 7,5 og 149823 11 falde tilbage til neutralværdien ved afslutningen af fermenteringen.

Isolering og rensning.

Kijanimicin kan isoleres ved ekstraktion under 5 anvendelse af ca. 2 rumfang ikke-blandbart organisk opløsningsmiddel (f.eks. ethylacetat) pr. ekstrakt og ved ekstraktion af fermenteringsblandingen to gange. Ekstrakterne hældes sammen og inddampes til en remanens, der opløses i acetone. Produktet udfældes ved tilsætning 10 af ether:hexan (6:4 v/v) opløsning. Det opnåede brungule bundfald frafiltreres og tørres i vakuum ved ca. 40°C til opnåelse af kijanimicin.

Kijanimicin kan renses ved chromatografi på sili-cagel under anvendelse af et passende opløsningsmiddel-15 system.

Kijanimicin har en hel speciel kemisk struktur.

Den indeholder en hidtil ukendt tetrasaccharidenhed bestående af tre molekyler L-digitoxose og St molekyle 4- O-methy1-L-digitoxose. Tetrasaccharidenheden er knyttet 20 til en sekundær hydroxylgruppe i aglyconet. Antibiotiket har desuden en hidtil ukendt forgrenet nitro-sukkerart, D-kijanose, der også er knyttet til en sekundær hydroxy lgruppe på aglyconet.

Kijanimicin er et farveløst amorft fast stof, der 25 sønderdeles ved 174,5°C og har følgende katakteristiske fysiskkemiske egenskaber:

Tabel 4

Elementæranalyse

Fundet: C 60,78, H 7,94, N 1,96% 30 Beregnet for cg7HioON2°24: C H 7,65, N 2,13, 0 29,14%. pka 5,0 [a]£6-116,4° (C o,3%, CH30H) 149023 12

Ultraviolet spektrum λ max (CF3CH2OH) 199 nm (E^ 328,4), 242 nm te« 56'2>' 264 “ »L63'»' 274 nm (E^m 60,7).

i a 5 λ max (CH30H/ 0,1N HC1) 260 nm (E^m 60,8) i a λ.max (CH30H/ 0,lNaOH) 236 nm (E^m 103,9), 265 nm (E^Jm 86,1), 276 nm (E^ 83,4).

Cirkulær dichroisme [Θ3194-176,016, [θ]216-176,016, fΘ]3Q0 10 +11,479 (CE3CH2OH),

Infrarødt spektrum v max (CHC13) 3690, 3620, 3540, 3480, 3440, 2970, 2940, 1755, 1733, 1623, 1545, 1515, 1318, 1232, 1130, 1060 cm-1.

15 1H Kernemagnetlsk resonans δ h(CDC13) 0,65 (3H, d, J = 5Hz), 1,07 (3H, d, J - 7Hz), 1,18 (3H, d, J = 6Hz), 1,20-1,40 (kreds af signaler), 1,60 (3H,s), 1,64 (3H,s), 3,45 (3H,s), 20 3,76 ppm. (3H,s).

13„ „„„Kernemaqnetisk resonans C-NMR-2-- 6 C(CDC13) 206,2, 201,5, 167,1, 157,4, 141.5, 137,1, 135,7, 126,7, 125,8, 123,6, 121.5, 119,3, 101,9, 99,8, 98,2, 97,1, 92,2, 25 91,0, 90,8, 84,5, 83,3, 82,6,79,6,78,4,72,4, 71.8, 69,1, 68,1, 67,5, 67,1, 66,8, 65,1, 64.9, 64,4, 63,8, 62,6, 57,3, 53,8, 53,2, 52.7, 51,0, 43,1, 41,6, 40,2, 38,5, 36,8, 35.7, 35,5, 34,8, 34,4, 31,3, 31,1, 29,9, 30 29,7, 27,9, 25,3, 22,2, 20,2, 18,4, 17,9, 17.9, 17,9, 17,0, 15,1, 15,1, 14,0, 13,7.

Molekylvægt og formel.

Bestemt ved plasmadesorption-massespektrometri (Cf) på kijanimicin-methylether (1331,5+0,2, C68H102N2°24^ * 149823 13

Stabilitet

Kijanimicin er i det væsentlige stabilt ved pH

6-10 ved stuetemperatur og op til 100°C i mindst 30 minutter. Det mister hurtigt aktivitet ved stuetemperatur 5 ved pH 2-3.

Struktur På grundlag af de ovenstående fysiske data og røntgenstrålékrystallografiske undersøgelser på diacetyl-derivatet af aglyconet er det blevet bestemt, at kijani-10 micin har følgende strukturformel: 15 o

OH I

j n ao HoC!^7

O

Η CHg CH-.OCONH if H [▼cH, Λ 30 no2 Tv h°? 7 I h L>*°

L vv»H

35 ]^^CH3 ch2oh 14 .

149823

Da kijanimicin har sur karakter, danner det fysiologisk acceptable (dvs. farmaceutisk acceptable) metal- eller aminkationsalte. Belysende eksempler på sådanne metaller er alkalimetallerne, dvs. lithium, natri-5 um og kalium, og jordalkalimetallerne, dvs. magnesium og calcium. Andre metaller, dvs. aluminium, zink og jern, kan også anvendes. Eksempler på amineme er sådanne afledet af primære, sekundære eller tertiære aminer.

Eksempler på egnede aminer er methylamin, dimethyΙ-ΙΟ amin, triethylamin, ethylamin, dibutylamin, triisopropylamin, N-methylhexylamin, decylamin, dodecyl-amin, allylamin, crotylamin, cyclopentylamin, dicyclo-hexylamin, benzylamin, dibenzylamin, a-phenylethylamin, β-phenylethylamin, ethylendiamin, diethylentriamin og 15 lignende alifatiske, cycloalifatiske og aralifatiske a-miner indeholdende op til og med ca. 18 carbonatomer, samt heterocycliske aminer, dvs. piperidin, morpholin, pyrrolidin, piperazin og lavere alkyIderivater heraf, dvs. 1-methylpiperidin, 4-ethylmorpholin, 1-isopropyl-20 pyrrolidin, 2-methylpyrrolidin, 1,4-dimethylpiperazin, 2-methylpiperidin, 1,4-dimethylpiperazin, 2-methylpipe-ridin og lignende, samt aminer indeholdende vandopløse-liggørende eller hydrofile grupper, dvs. mono-, di- og triethanolamin, ethyldiethanolamin, N-butylethanolamin, 25 2-amino-l-butanol, 2-amino-2-ethyl-l,3-propandiol, 2-amino-2-methyl-l-propanol, tris(hydroxymethyl)aminome-than, N-phenylethanolamin, N-(p-tetramethylphenyl)di-ethanolamin, galactamin, N-methyl-D-glucamin, N-methyl-glucosamin og lignende.

30 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærme re ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Isolering af kijanimicin 35 30,1 g råt kijanimicin fremstilles ved dyrkning af Actinomadura kijaniata ATCC 31588 og isoleres som beskrevet ovenfor, hvorpå det chromatograferes på en 149823 15 4 kg silicagelkolonne under anvendelse af 3,5% methanol i methylenchlorid som elueringsmiddel. Der opsamles 10 ml fraktioner, medens kolonnen kontrolleres ved hjælp af tyndtlagschromatografi på silicagelplader under anvendet 5 se af 10% methanol i chloroform som elueringsmiddel.

Fraktioner, der har samme mobilitet på TLC-plademe, hældes sammen og inddampes til tørhed til opnåelse af 9,3 g ki-janimicin. Ved sammenhældning af langsommere bevægende fraktioner og inddampning af dem til tørhed kan der op-10 nås 5,5 g kijanimicin.

Eksempel 2

Natriumsalt af kijanimicin.

7,6 g kijanimicin opnået ifølge eksempel 1 sæt-15 tes til en omrørt opløsning af 58,12 ml 0,1 N natriumhydroxid i 800 ml destilleret vand, og man fortsætter omrøringen ved 25°C i 5 timer. Opløsningen filtreres gennem en fin glassintertragt, og filtratet lyofili-seres til opnåelse af 6,3 g af natriumsaltet af kija-20 nimicin som et farveløst amorft fast stof.

Fundet: C 58,65, H 7,49, N 1,93, Na 2,24%

Beregnet for Cg7HggN2C>24Na: C 60,08, H 7,45, N 2,09,

Na 1,72%. [a]26 = -165,5° (0,3%, H20) .

Ultraviolet absorption λ max (CF^CI^OH) 197 nm 251¾ 1¾ 1¾ (Elcm304,5)' 236 nm {Elcm65'2)' 266 11111 (Elcm62'8)' 272 nm (Ε^ιη62,8)·

Infrarød absorption v max (K Br) 3450, 2970, 2925, 1720, 1625, 1542, 1510, 1405, 1050 cm-1.

30 På lignende måde, ved at anvende en ækvivalent mængde af andre·saltdannende stoffer, såsom kalium- eller rubidiumhydroxid og lignende, og ved i det væsentlige at følge fremgangsmåden ifølge det foreliggende eksempel, fremstilles de tilsvarende kijanimicinsalte.

35 På lignende måde, ved at anvende en ækvivalent mængde af organiske kationdannende stoffer, såsom N- 149823 16 methylglucamin eller diethylamin og lignende, og ved i det væsentlige at følge fremgangsmåden ifølge det foreliggende eksempel, fremstilles de tilsvarende kijanimi-cinsalte.

5 Biologisk virkning af kijanimicin.

Acne er en lidelse, for hvilken pathogenesen ikke er fuldstændig kendt. Det er imidlertid kendt, at administrering af visse antibiotika (f.eks. tetracyclin) har en gunstig terapeutisk virkning. De antibiotika, der ud-10 viser den største virkning, er de, der er aktive mod Propionibacterium aenes. Dette tyder på, at P. aenes spiller en fremtrædende rolle ved udviklingen af lidelsen. Ud over at være virksomt mod P. aenes må et effektivt antiaenemiddel have et snævert antimikrobielt virk-15 ningsspektrum for at mindske muligheden for udvikling af resistente mikroorganismer. Midlet må have en tilstrækkelig lipidopløselighed til at trænge ind i talgkirtlen, må have begrænset mulighed for irritation og sensibilisering og må have antilipaseegenskaber, således at dan-20 nelsen af inflammatoriske frie fedtsyrer fra talget forhindres .

Kijanimicin opfylder de ovenstående fordringer.

Når det afprøves mod en mangfoldighed af stammer af P. aenes, udviser kijanimicin MIC-værdier i området fra 25 0,37 til 1,5 yg pr. ml efter 48 timer i flydende thio-glycollat-næringsmedium. Den anvendte metodologi ved in- vivo-antiaeneprøver er i det væsentlige den samme som den, der er anført i US-patentskrift nr. 4.044,140, udstedt 23. august 1977.

30 Når det anvendes til behandling af acne, vil do sisområdet almindeligvis variere mellem ca. 5 og ca. 25 mg kijanimicin pr. kg legemsvægt pr. dag. Topisk og parenteral administrering i enhedsdosisformer vil almindeligvis foretrækkes.

35 Kijanimicin er også aktivt mod andre stammer af anaerobe bakterier end P. aenes. Når det afprøves in vitro, var antibiotiket f.eks. aktivt mod stammer af Pep-tococcus-arter, Peptostreptococcus og E. lenturn.

. 17 149823

Kijanimicin udviser antitumorvirkning mod P-388 leukæmi, når det afprøves in vivo på mus, som på forhånd har fået administreret en dødelig dosis.

Antitumorvirkningen bestemtes ved National Cancer 5 Institute's standardprøve, som er offentliggjort i Cancer Chemothr. Rep. 3:1-103 1972.

C

Ved prøven administreres 10° celler pr. mus af P-388 leukæmi (bleomycin-sensitive) intraperitonealt på dag 1. Prøveforbindelsen underkastes seriefortynding 10 (1/10, 1/100 osv.), og hver fortynding administreres til en mus fra dag 1 til dag 9. Dyr, der dør på eller før dag 5, opføres som toksisk døde. Der foretages kontrolforsøg under anvendelse af bleomycin og olivomycin A. Resultaterne beregnes ved hjælp af nedenstående formel, 15 hvori MST = gennemsnitlig overlevelsestid i dage, T = behandlede, C = kontrol, MST T/C - x 100.

T

20 Hvis /C > 125, udviser prøveforbindelsen sxgni- fikant antitumorvirkning, og dette er tilfældet for kijanimicin.

Kijanimicin udviser også antiparasitisk virkning og er navnlig nyttig mod stammer af malariaparasitten 25 Plasmodium berghei. Virkningen udvistes ved forsøg under anvendelse af CF-j-mus, som fik administreret en dødelig dosis af blodet fra i forvejen inficerede mus, idet den antibiotiske terapi påbegyndtes én dag efter infektionen.

Kijanimicin udviser antiinflammatorisk virkning, 30 når det underkastes i fagkredse anerkendte prøveprocedurer, hvilken virkning navnlig er fordelagtig til behandling af acne.

Kijanimicin udviser en oral PD5Q i mg/kg hos mus mod repræsentative gram-negative og gram-positive bakte-35 rier i området fra 50 til over 100 som natriumsaltet og fra 10 til over 100 som det frie antibiotikum. Antibioti-

Claims

149823 18 . ket udviser en subcutan PD,-q i mg/kg mod de samme bakterier på fra 10 til over 100 både som natriumsaltet og som det frie antibiotikum. Kijanimicin udviser en oral og en subcutan LD^-g 5 på over 1000 mg/kg. Den orale og den subcutane LD,-q er således ca. 10 gange PD<-g (dvs. det terapeutiske index er ca. 10). ^ 1. Fremgangsmåde til fremstilling af kijanimicin med formlen OK 15 O OH I ? n

20 J CH3 ΑΛ^ ° / HO O H Y/ CH3 25 CH,OCONH Π H IVpt? UH3 ^ - CH3 VC'-'X 0=3 3 ,n CH, Λ \ . \ 30 3 0 ί \ Nv CH i N02 Η Y H°f / LU0

35 LI'h 1^CH3 ch2oh