DK149203B - Hentriakontapeptidderivater til anvendelse som udgangsforbindelser ved fremstilling af beta-endorphiner - Google Patents

Description

149203 i

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte hentriakontapeptid-derivater til anvendelse som udgangsforbindelser ved fremstilling af hidtil ukendte β-endorphiner med den almene formel II

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-GIn-5 -Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-lle-lle- II

-Lys-Asn-Ala-R'^-Lys-Lys-Gly-R'2-OH

12 1 hvor R' betegner His, og R' betegner Gin, eller R' betegner Tyr, 2 og R' betegner Glu,

hvilke peptidderivater er ejendommelige ved, at de har den almene 10 formel I

Boc-Tyr(oBr-Z)-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser(Bzl)--Glu(OBzl)-Lys(oBr-Z)-Ser(Bzl)-Gln-Thr-Pro-Leu--Val-Thr-Leu-Phe-LysfoBr-Zj-Asn-Ala-lle-lle- I

-Lys(oBr-Z)-Asn-Ala-R^-Lys(oBr-Z)-Lys(oBr-Z)-15 -Gly-R2-(R) hvor oBr-Z betegner o-brombenzyloxycarbonyl; Bzl betegner benzyl;

1 2 Boc betegner tert.butyloxycarbonyl; R betegner His(Boc), og R

1 2 betegner Gin, eller R betegner Tyr(oBr-Z), og R betegner Glu(OBzl); og (R) betegner en styren-divinylbenzen-copolymerisat-20 harpiks.

Ved forbindelserne ifølge opfindelsen drejer det sig om derivater af de naturligt forekommende β-endorphiner H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-GIn- -Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-lle-lle

25 -Lys-Asn-Ala-His-Lys-Lys-Gly-GIn-OH

(β -endorphin = kamel-3-endorphin, Ila)

C

og 2 149203 H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-GIu-Lys-Ser-GIn- -Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-lle-

-lle-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu-OH

(f^-endorphin = humant-fi-endorphin, Mb) 5 dvs. om forbindelser, som er udgangsforbindelser ved fastfasesyntese af disse to f5-endorphiner.

Med disse mellemprodukter kan syntesen af β-endorphinerne udføres under anvendelse af de til fastfasesynteser af peptider almindeligt kendte metoder. Ved en syntesemåde anvendes aminobeskyttet giu-10 tannin, som giver den terminale carboxylgruppe i ^-endorphin, med en i fastfasesyntesen sædvanlig anvendt harpiks, fx benzhydrylamin-polystyren, som er tværbundet med 1-2% divinylbenzen. Aminobeskyt-telsesgruppen fjernes derefter selektivt, hvorved der anvendes et alt efter beskyttelsesgruppens art forskelligt reagens. Ved en syntesemå-15 de anvendes som aminobeskyttelsesgruppe en tert.butoxycarbonyl-gruppe (Boc) og som selektivt spaltningsreagens 50%'s trifluoreddike-syre i methylenchlorid.

Efter fraspaltning af beskyttelsesgruppen behandles glutamin-harpik-sen på i og for sig kendt måde med aminobeskyttet glycin, fortrinsvis 20 N-Boc-glycin, især i form af det symmetriske anhydrid, så at der fås en peptidbinding mellem den frie aminogruppe i glutamindelen og carboxylgruppen i glycinet.

Cyklen med beskyttelsesgruppefraspaltning og kobling med symmetriske anhydrider af beskyttede aminosyrer gentages derefter med de 25 resterende aminosyrer i β-endorphin-sekvensens rækkefølge. Enkelte af disse aminosyrer nødvenddiggør, foruden beskyttelsen af a-amino-gruppen, blokering af en reaktiv sidegruppe. Sådanne aminosyrer og deres beskyttelsesgrupper er:

Glu(OBzl), Ser(BzI), Lys(oBr-Z), Tyr(oBr-Z) og His(Boc), 3 149203 hvor oBr-Z betegner o-brombenzyloxycarbonyl, Bzl betegner benzyl, og Boc betegner tert.butoxycarbonyl.

Efter endt syntese fås fx det nedenfor anførte beskyttede hentriakon-tapeptid, der er bundet til styren-divinylbenzen-copolymerisatet: 5 Boc-Tyr(oBr-Z)-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser(Bzl)- -Glu(OBzl)-Lys(oBr-Z)-Ser(Bzl)-Gln-Thr-Pro-Leu--Val-Thr-Leu-Phe-Lys(oBr-Z)-Asn-Ala-IIe-lle--Lys (oBr-Z)-Asn-Ala-His(Boc)-Lys (oBr-Z)--Lys(oBr-Z)-Gly-Gln-CR) 10 hvor oBr-Z, Bzl og Boc har den ovenfor anførte betydning, og (R) betegner styren-divinylbenzen-copolymerisatet.

Fraspaltningen af peptidet fra harpiksen udføres ved behandling med flydende hydrogenfluorid under samtidig fraspaltning af alle beskyttelsesgrupper, hvorved det ønskede β-endorphin fås.

15 Selv om (5 -endorphin har aminosyresekvens som delene 61-91 i hormonet β -lipotropin, er dets lipolytiske aktivitet meget ringe i sammen-

O

ligning med aktiviteten af hele hormonet, β-endorphinerne har en signifikant opiat-antagonistvirkning og er derfor et virksomt, ikke-af-hængighedsgørende analgetikum. Syntetisk og naturligt β^^-endorphin 20 har samme fysiske og biologiske egenskaber.

β-Endorphinerne kan anvendes som farmaceutiske præparater med direkte eller forsinket frigørelse af aktivstoffet i blanding med et til enteral, percutan eller parenteral applikation egnet organisk eller uorganisk inert bærestof. Fremstillingen af farmaceutiske præparater 25 kan foretages på for fagmanden sædvanlig måde.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler: 4 149203 EKSEMPEL 1

Fastfasesyntese af β -endorphin.

Sammenkoblingen af a-benzyl-Na-tert.butyloxycarbonylglutamat og benzhydrylaminharpiks (copolymerisat af benzhydrylamin-polystyren 5 og divinylbenzen) udføres ved hjælp af det symmetriske anhydrid.

2,5 g benzhydrylamin-hydrochloridharpiks indeholdende 0,38 millimol fri amin pr. g neutraliseres med 5%'s diisopropylethylamin (DIEA) i CH2CI2 og behandles derefter med 3 ækvivalenter af det symmetriske anhydrid i CF^C^ i 45 minutter. Der tilsættes yderligere 5 ml 5%’s 10 DIEA i CF^C^· Efter 10 minutters forløb filtreres der og vaskes tre gange med 30 ml CF^C^ og tre gange med 30 ml absolut ethanol.

Efter yderligere behandling af harpiksen med den samme mængde symmetrisk anhydrid tørres der i 1 time over 1*2^5· 0msætn'n9ens fuldstændighed prøves med gisin-testen. Efter hydrolyse af en prøve 15 i propionsyre/12N HCI viser aminosyreanalysen en top, der svarer til en mængde på 0,23 millimol Gin pr. g (68%'s spaltning). Identificering af det med hydrogenfluorid spaltede produkt som glutamin foretages tyndtlagschromatografisk i 1-butanol/eddikesyre/vand i forholdet 4:1:1 (v/v) og i 1-butanol/pyridin/eddikesyre/vand i forholdet 6:6:1,2:4,6 20 (v/v).

Omsætningen af Boc-aminosyrerne med N,Nr-dicyc!ohexylcarbodiimid udføres på følgende måde: 1,9 millimol af Boc-aminosyren i 6 ml CF^C^ afkøles til 0°C og blandes med 1,6 ml 0,6M Ν,Ν'-dicycIohexylcarbodiimid i Ch^Clj. Efter 20 25 minutters omrøring ved 0°C frafiltreres dicyclohexylurinstofbundfaldet og vaskes med 2,4 ml CF^C^. Filtratet anvendes straks til koblingsreaktionen.

Den ovenfor beskrevne harpiks underkastes følgende synteseskema: 1. Tre gange vask med hver gang 15 ml CF^C^, 30 2. fjernelse af Boc-gruppen med 50%'s trifluoreddikesyre i CF^C^ i 15 minutter, 5 149203 3. to gange vask med hver gang 15 ml Ch^C^, 4. to gange vask med hver gang 15 ml 50%'s dioxan i C^C^, 5. to gange vask med hver gang 15 ml Ch^CI^, 6. neutralisation med 15 ml 5%'s DIEA i CI^C^, 5 7. seks gange vask med hver gang 15 ml 8. tilsætning af opløsningen af det symmetriske anhydrid af Boc-ami-nosyren og rystning i 30 minutter, 9. tilsætning af 0,20 ækvivalenter 5%’s DIEA i og rystning i 20 minutter, 10 10. tre gange vask med hver gang 15 ml og 11. tre gange vask med hver gang 15 ml absolut ethanol.

Denne cyklus gentages med hver af de nedenfor anførte N-beskyttede aminosyrer:

Boc-Gly, Boc-Lys(oBr-Z), Boc-Lys(oBr-Z), Boc-His(Boc), Boc-Ala, 15 Boc-Asn, Boc-Lys(oBr-Z), Boc-lle, Boc-lle, Boc-Ala, Boc-Asn*,

Boc-Lys(oBr-Z), Boc-Phe, Boc-Leu, Boc-Thr, Boc-Val, Boc-Leu,

Boc-Pro, Boc-Thr, Boc-GIn, Boc-Ser(Bzl), Boc-Lys(oBr-Z), Boc-Glu(OBzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Thr, Boc-Met, Boc-Phe, Boc-Gly,

Boc-Gly og Boc-Tyr(oBr-Z).

20 * Efter indføring af Asn tørres peptidet (udbytte 4,7 g), og der fjernes 400 mg af en alikvot del. Den resterende peptidharpiks behandles derefter efter det samme, ovenfor beskrevne skema til indføring af yderligere aminosyrer, dog med to undtagelser: Til neutralisation behandles to gange med 5%'s DIEA i CI^CIj, og i andet trin i 25 anhydridkoblingen tilsættes trifluorethanol til en koncentration på 20%.

0,6 g tør, beskyttet og til harpiksen bundet β-endorphin omrøres i 1,8 ml anisol og 15 ml flydende hydrogenfluorid ved 0°C i 1 time. Hydrogenfluorid fjernes derefter med en nitrogenstrøm, og den olieag-tige remanens vaskes to gange med 15 ml ethylacetat. Peptidet ek-30 straheres fra harpiksen tre gange med 15 ml 50%'s eddikesyre, og de samlede filtrater inddampes under reduceret tryk til et ringe rumfang og underkastes gelfiltrering på Sephadex® G-10 i 0,5N eddikesyre.

Der konstateres 1 top. Ved lyofilisering fås 110 mg af et stof, som 6 149203 derpå chromatograferes på carboxymethylcellulose. Ved isolering af hovedtoppen fås 66 mg stof, som renses yderligere ved fordelings-chromatografi på Sephadex® G-50. Hovedtoppen leverer igen 52 mg meget rent β-endorphin (udbytte 19,6% beregnet på udgangsharpik-5 sen).

Ved tyndtlagschromatografi af det rensede materiale i n-butanol/py-ridin/iseddike/vand i forholdet 15:10:3:12 (v/v) fås en plet med en Rp-værdi på 0,35. Ved papirelektroforese af det syntetiske β-endorphin fås en enkelt plet ved pH-værdi 3,7 og 6,9 med Rp-værdier 10 (beregnet på Lys) på henholdsvis 0,65 og 0,42. Ved gelelektroforese af det rensede materiale fås ligeledes et enkelt bånd ved pH-værdi 4,5 i 1 time. En prøve på 1 mg underkastes elektrofokusering i 5%'s polyacrylamidgel, og der fås et bånd med en pi-værdi på ca. 10,0. Aminosyreanalysen efter sur hydrolyse giver følgende værdier: 15 Lys5,2' His0,9' Asp2,2' Thr3,0' Ser2,1' Glu2,1' Pro1,l' Gly3,0'

Ala2,1' Vall,i' Met0,9' ile1,5' Leu2,2' Tyr1,0°9 Phe2,2·

Aminosyreanalysen giver efter fuldstændig enzymatisk nedbrydning (først med trypsin og chymotrypsin, derefter med leucinaminopepti-dase) følgende værdier: 20 Lysg q, His1 Q, Thrg 2, (Ser, Asn, Gln)g 2, Glu1 v ProQ g,

Gly3,0' Ala2,V Val1,0' Met1,2' lle2,0' Le“2,1' Tyr1,1 og ,phe1,8· EKSEMPEL 2

Analogt med den i eksempel 1 beskrevne metode og under anvendelse af de samme beskyttede aminosyrer, idet der i stilling 27 i stedet for 25 Boc-His(Boc) anvendes Boc-Tyr-(oBr-Z), og der i stedet for den beskyttede C-terminale aminosyre anvendes a-benzyI-Na-tert.butyloxy-carbonylglutamat Boc-Glu(OBzl), fremstilles U92G3 7

Boc-Tyr(oBr-Z)-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-SeKBzl)--Glu(OBzl)-Lys(oBr-Z)-Ser(Bzl)-Gln-Thr-Pro-Leu--Val-Thr-Leu-Phe-Lys(oBr-Z)-Asn-Ala-lle-lle--Lys(oBr-Z)-Asn-Ala-Tyr-(oBr-Z)-Lys(oBr-Z)-5 -Lys(oBr-Z)-Gly-Glu(OBzl)-(R) Ib det beskyttede og til harpiksen bundne umiddelbare forprodukt til β^-endorphin, som analogt med det i eksempel 1 beskrevne ved hjælp af anisol og hydrogenfluorid omdannes til β^-endorphin.

Papirelektroforese på det syntetiserede produkt (110 y-prøve) viste 10 en enkelt plet ved pH 3,7 (pyridin/acetatpuffer) og pH 6,7 (kolli-din/acetatpuffer) med R^-værdierne (beregnet på lysin) 0,56 og 0,23. Tyndtlagschromatografi i systemet n-butanol/pyridin/iseddike/vand (15:10:3:12) (v/v) viste en plet med R^-værdi 0,52. Aminosyreanalyse efter 24 timers sur hydrolyse (HCI) gav følgende værdier: 15 Lys5,3' Asp2,0' Thr2,8' G,u3,r Pro1,0' Gly3,1' Alal,8' Wet0,9'

Val^ q, lle^ l_eu2 Tyr^ g, Phe^ g. Aminosyreanalyse efter fuldstændig enzymatisk nedbrydning (først med trypsin og chymotrypsin, derefter med leucinaminopeptidase) gav følgende værdier:

LySg y (Thr + Ser + Asn + Gln)7 7, Glu2 Qr Pro^ y Gly3 Q, Ala^ Q, 20 Valy'y Met10, lle^g, Leu2J, Tyr^g, Phe^.

En kvantitativ bestemmelse af den analgetiske styrke af β^-endorphin (humant) og βc-endorphin (kamel) efter intracerebroventrikulær og intravenøs injektion i mus er vist i nedenstående tabel. Morphin er anvendt som referenceforbindelse. Når styrkerne sammenlignes på 25 molær basis, er β^-endorphin efter central administration 17-48 gange så kraftigt som morphin bedømt ved tre bioforsøg og 3,4 gange så kraftigt som morphin efter intravenøs injektion. Ved central administration er β -endorphin 17-33 gange så kraftigt som morphin og 3,5 gange så kraftigt efter intravenøs injektion.

Claims (3)

149203 δ Tabel Styrkeforhold (morphin = 1) 5 humant kamel a) Intracerebroventrikulær injektion Haleknibe-test 48,4 33,0 " Hot- plate" -test 32,8 17,5 10 ”Writhing"-test 17,3 19,5 b) Intravenøs injektion Haleknibe-test 3,4 3,5 Hentriakontapeptidderivater til anvendelse som udgangsforbindelser 15 ved fremstilling af (5-endorphinerne med den almene formel II H-Tyr-GIy-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-GIn--Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-lle-lle- II -Lys-Asn-Ala-R'^-Lys-Lys-Gly-R,2-OH 1.2 1 hvor R' betegner His, og R' betegner Gin, eller R betegner Tyr, 2 20 og R' betegner Glu, kendetegnet ved, at de har den almene formel I Boc-T y r (oB r-Z) -G ly-G ly- Phe-Met-Th r-Ser (Bzl) --Glu(OBzl)-Lys(oBr-Z)-Ser(Bzl)-Gln-Thr-Pro-Leu--Val-Thr-Leu-Phe-Lys(oBr-Z)-Asn-Ala-lle-lle- I

25 -Lys(oBr-Z)-Asn-Ala-R^-Lys(oBr-Z)-Lys(oBr-Z)- -Gly-R2-(R) hvor oBr-Z betegner o-brombenzyloxycarbonyl; Bzl betegner benzyl;

1. Boc betegner tert.butyloxycarbonyl; R betegner His(Boc), og R