DE69333019T2

DE69333019T2 - Delta opioidrezeptor-gene

Info

Publication number: DE69333019T2
Application number: DE69333019T
Authority: DE
Inventors: J. Christopher EVANS; E. Duane KEITH; H. Robert EDWARDS; Daniel Kaufman
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1992-08-13
Filing date: 1993-08-13
Publication date: 2004-01-08
Anticipated expiration: 2013-08-14
Also published as: WO1994004552A1; US6265563B1; EP0656007A4; AU5012393A; US5985600A; PT656007E; DE69333019D1; EP0656007B1; EP1306437A2; JPH08502164A; EP1306437A3; CA2142305A1; JP4208960B2; DK0656007T3; JP2004154144A; ATE242321T1; ES2201061T3; EP0656007A1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Verbindungen, die in den vertebralen Nervensystemen involviert sind, und insbesondere Opioid-Rezeptoren und durch diese vermittelte Aktivitäten. Demgemäß betrifft die Erfindung rekombinante Materialien, die für die Herstellung von Opioid-Rezeptoren geeignet sind, und Vertahren zur Verwendung des Rezeptors zum Screenen von Arzneimitteln, die die Aktivität des Rezeptors modulieren.
Stand der Technik
Die Bezeichnung "Opioid" bezieht sich ganz allgemein auf alle Arzneimittel, natürlich und synthetisch, die morphinähnliche Wirkungen aufweisen. Früher wurde die Bezeichnung "Opiat" zur Benennung von Arzneimitteln verwendet, die von Opium abgeleitet sind, beispielsweise Morphin, Codein, und viele halbsynthetische Verwandte von Morphin. Nach der Isolierung von Peptidverbindungen mit morphinähnlichen Wirkungen wurde die Bezeichnung Opioid eingeführt, um ganz allgemein auf alle Arzneimittel mit morphinähnlichen Wirkungen zu verweisen. Unter Opioide fallen verschiedene Peptide, die eine morphinähnliche Wirkung aufweisen, wie z. B. Endorphine, Enkephaline und Dynorphine. Trotzdem haben manche Quellen weiterhin die Bezeichnung "Opiate" in einem allgemeinen Sinn verwendet, und in solchen Kontexten sind Opiate und Opioide austauschbar. Zusätzlich wurde die Bezeichnung Opioid verwendet, um Antagonisten von morphinähnlichen Arzneimitteln zu bezeichnen, und auch um Rezeptoren oder Bindungsstellen zu charakterisieren, die mit solchen Mitteln zusammenwirken.
Opioide werden üblicherweise als Analgetika eingesetzt, aber sie können auch noch viele weitere pharmakologische Wirkungen aufweisen. Die Hauptwirkungen von Morphin und verwandten Opioiden liegt im Zentralnervensystem und im Verdauungssystem. Die Wirkungen sind unterschiedlich, und umfassen Analgesie, Schläfrigkeit, Gemütsschwankungen, Atemnot, Schwindel, geistige Umnachtung, Dysphorie, Pruritus, erhöhten Druck im Gallentrakt, verminderte Magen-Darm-Mobilität, Übelkeit, Erbrechen und Veränderungen der endokrinen und autonomen Nervensysteme.
Ein wichtiges Merkmal der Analgesie, die durch Opioide bewirkt wird, liegt darin, dass sie ohne Bewusstseinsverlust auftritt. Wenn therapeutische Morphindosen an Patienten mit Schmerzen verabreicht werden, so berichten diese, dass der Schmerz weni ger intensiv, weniger störend oder vollständig verschwunden ist. Manche Patienten erfahren zusätzlich zur durchlebten Schmerzlinderung eine Euphorie. Wenn aber Morphin in einer bestimmten schmerzlindernden Dosis an schmerzfreie Individuen verabreicht wird, so ist diese Erfahrung nicht immer angenehm; das Auftreten von Übelkeit ist häufig, und auch Erbrechen kann vorkommen. Es können sich auch Schläfrigkeit, Unfähigkeit zur Konzentration, Mentationsschwierigkeiten, Apathie, verminderte physische Aktivität, reduzierte Sehfähigkeit und Lethargie einstellen.
Ein charakteristisches Merkmal aller opioider Arzneimittel ist die Entwicklung von Toleranz und physischer Abhängigkeit bei wiederholter Verwendung; und die Möglichkeit, dass sich eine psychische Abhängigkeit von den Wirkungen dieser Arzneimittel entwickelt, stellt die hauptsächliche Beschränkung bezüglich ihrer klinischen Verwendung dar. Es liegen Nachweise dafür vor, dass die Phosphorylierung mit der Toleranz in ausgewählten Zellpopulationen assoziiert sein kann (Louie, A. et al. Biochem Biophys Res Comm (1988) 152: 1369-75).
Eine akute Opioidvergiftung kann von einer klinischen Überdosis, einer versehentlichen Überdosis oder einem versuchten Selbstmordversuch herrühren. Bei einem klinischen Bild deutet die Triade von Koma, verengte Pupillen und Atemnot auf eine O-pioidvergiftung hin. Gemischte Vergiftungen, die auch Mittel wie z. B. Barbiturate oder Alkohol umfassen, können ebenfalls zum klinischen Bild von akuter Opioidvergiftung beitragen. In jedem Szenario einer Opioidvergiftung muss die Behandlung umgehend verabreicht werden.
Die Opioide interagieren mit verschiedenen, anscheinend nah verwandten Rezeptoren. Aus Daten, in denen versucht wurde, die pharmakologischen Wirkungen mit den Interaktionen von Opioiden mit einer bestimmten Opioidrezeptorkonstellation zu korrelieren, wurden unterschiedliche Störungen entnommen (Goodman and Gilman's, THE PHARMACOLOGICAL BASIS 0F THERAPEUTICS, 7. Auflage, Seiten 493-95 (MacMillan 1985)). Eine Analgesie wurde beispielsweise mit mu- und kappa-Rezeptoren assoziiert. Man geht davon aus, dass delta-Rezeptoren an Veränderungen des affektiven Verhaltens beteiligt sind, primär aufgrund der Lokalisierung dieser Rezeptoren in dem limbischen Regionen des Gehirns. Zusätzlich wird davon ausgegangen, dass eine Aktivierung, z. B. eine Ligandenbindung mit Stimulierung weiterer Rezeptor-vermittelter Antworten, von delta-Opioid-Rezeptoren die Freisetzung von anderen Neurotransmittern inhibiert. Die Wege, die relativ große Populationen an delta-Opioid-Rezeptoren enthalten, sind ähnlich zu den Wegen, die mit einer Beteiligung an der Huntington'schen Krankheit in Verbindung gebracht werden. Folglich wird postuliert, dass die Huntington'sche Krankheit mit irgendeinem Effekt auf delta-Opioid-Rezeptoren korreliert werden kann.
Zwei unterschiedliche Klassen von Opioidmolekülen können an Opioid-Rezeptoren binden: die Opioid-Peptide (z. B. die Enkephaline, Dynorphine und Endorphine) und die Alkaloid-Opiate (z. B. Morphin, Etorphin, Dipronorphin und Naloxon). Nach dem anfänglichen Nachweis von Opiatbindungsstellen (Pert, C. B. und Snyder, S. N., Science (1973) 179: 1011-1014) dienten die unterschiedlichen pharmakologischen und physiologischen Wirkungen sowohl der Opioid-Peptid-Analoga wie auch der Alkaloid-Opiate der Beschreibung von einer Vielzahl von Opioid-Rezeptoren. So wurden drei anatomisch und pharmakologisch unterschiedliche Opioid-Rezeptortypen beschrieben: delta, kappa und mu. Zudem wird davon ausgegangen, dass jeder dieser Typen Sub-Typen aufweist (Wollemann, M., J. Neurochem. (1990) 54: 1095-1101; Lord, J. A., et al., Nature (1977) 267: 495-499).
Alle drei Opioid-Rezeptortypen scheinen auf einem zellulären Niveau die gleichen funktionellen Mechanismen miteinander zu teilen. Beispielsweise verursachen die Opioid-Rezeptoren die Inhibierung der Adenylat-Cyclase und eine Inhibierung von einer Neurotransmitterfreisetzung über sowohl eine Kaliumkanalaktivierung und eine Inhibierung der Calcium²⁺-Kanäle (Evans, C. J., In: Biological Basis of Substance Abuse, S. G. Korenman und J. D. barchas, eds., Oxford University Press (in Druck); North, A. R., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 7025-29; Gross, R. A., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 7025-29; Sharma, S. K., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1975) 72: 3092-96). Obwohl die funktionellen Mechanismen die gleichen sind, unterscheiden sich die Verhaltensmanifestationen von rezeptorselektiven Arzneimitteln sehr stark ( Gilbert, P. E. und Martin, W. R., J Pharmacol Exp Ther (1976) 198: 66-82). Solche Unterschiede könnten zum Teil der anatomischen Lokalisierung der unterschiedlichen Rezeptoren zugeschrieben werden.
Die delta-Rezeptoren weisen im Säuger-CNS eine diskretere Verteilung als mu- oder kappa-Rezeptoren auf, mit hohen Konzentrationen in dem Amygdaloid-Komplex, Striatum, substantia nigra, Riechkolben, Riechtuberkel, Hippokampus-Formation, und der Hirnrinde (Mansour, A., et al., Trends in Neurosci (1988) 11: 308-14). Das Kleinhirn von Ratten ist auffällig frei von Opioid-Rezeptoren, einschließlich der delta-Opioid-Rezeptoren.
Von mehreren Opioid-Molekülen ist bekannt, dass sie selektiv oder bevorzugt an delta-Rezeptoren binden. Von den wirbeltierendogenen Opioiden scheinen die Enkepha line, insbesondere met-enkephalin und leu-enkephalin, die höchste Affinität für delta-Rezeptoren aufzuweisen, obwohl die Enkephaline auch eine hohe Affinität für mu-Rezeptoren zeigen. Zudem umfassen die Deltorphane, das sind aus Froschhaut isolierte Peptide, eine Familie von Opioid-Peptiden, die eine hohe Affinität und Selektivität für delta-Rezeptoren aufweisen (Erspamer, V., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:5188-92).
Eine Reihe von synthetischen Enkephalin-Analoga sind ebenfalls delta-Rezeptor-selektiv, dazu gehören (D-Ser²), Leucin Enkephalin Thr (DSLET) (Garcel, G. et al., (1980) FEBS. Lett. 118:245-247) und (D-Pen², D-Pen⁵) Enkephalin (DPDPE) (Akiyama, K. et al., (1985) 82:2543-2547).
Vor kurzem wurden eine Reihe von weiteren selektiven delta-Rezeptor-Liganden hergestellt, und deren Bioaktivitäten und Bindungscharakteristika lassen die Existenz von mehr als einem Delta-Rezeptor-Subtyp vermuten (Takemori, A. E., et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., (1992) 32: 239-69; Negri, L., et al., Eur J Pharmacol (1991) 196: 335-355; Sofuoglu, M., et al., Pharmacologist (1990) 32: 151).
Obwohl das synthetische Pentapeptide 2dAla, 5dLeu-Enkephalin (DADLE) als deltaselektiv erachtet wurde, bindet es auch gleich stark an mu-Rezeptoren. Bezüglich dem synthetischen Peptid D-Al a²-N-Me-Phe⁴-Gly-ol⁵-Enkephalin (DAGO) wurde gefunden, dass es ein selektiver Ligand für mu-Rezeptoren ist.
Das Vorliegen von verschiedenen Delta-Opioid-Rezeptoren wurde nicht nur durch die vorstehend beschriebenen pharmakologischen Studien angedeutet, sondern auch durch die Molekulargewichtsschätrungen, die durch Verwendung von irreversiblen Affinitätsliganden erhalten wurden. Die Molekulargewichte von dem delta-Opioid-Rezeptor reichen von 30 kDa bis 60 kDa (Evans, C. J., supra, Evans, C. J. et al., Science 258:1952-1955 (1992), wobei dieses Dokument der Offenbarung des Prioritätsdokuments der vorliegenden Anmeldung entspricht; Bochet„ P. et al., Mol Pharmacol (1988) 34:436-43). Die unterschiedlichen Rezeptorgrößen könnten alternative Splice-Produkte darstellen, auch wenn dies noch nicht herausgefunden worden ist.
Viele Studien über den delta-Opioid-Rezeptor wurden mit der Neuroblastoma/Gliom-Zelllinie NG108-15 durchgeführt, die durch Fusion der Ratten-Glial-Zelllinie (C6BU-1) und der Mäuse-Neuroblastoma-Zelllinie (N18-TG-2) erzeugt wurde (Klee, W. A. und Nirenberg, M. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1974) 71: 3474-3477). Die Ratten-Glial-Zelllinie exprimiert im wesentlichen keine delta-Opioid-Rezeptoren, während die Mäuse-Neuroblastoma-Zelllinie geringe Mengen des Rezeptors exprimiert. Daher wurde vorgeschlagen, dass der delta-Rezeptor in den NG108-15-Zellen vom Mausechromosom abstammt (Law, Mol Pharm (1982) 21: 438-91). Es wird geschätzt, dass jede NG108-15-Zelle ungefähr 300000 delta-Rezeptoren exprimiert. Es werden nur delta-Typ-Opioid-Rezeptoren exprimiert, auch wenn es nicht bekannt ist, ob diese mehr als einen einzigen Subtyp darstellen. Folglich hat die NG108-15-Zelllinie dazu gedient, einen erheblichen Einblick in die Bindungseigenschaften von Opioid-Rezeptoren zu liefern, insbesondere von delta-Opioid-Rezeptoren. Andererseits ist die NG108-15-Zelllinie ein Krebs-Hybrid und ist eventuell aufgrund der einzigartigen zellulären Umgebung in den Hybridzellen nicht ganz repräsentativ für den delta-Rezeptor in endogenen Neuronen.
In zahlreichen Publikationen wurde die Auffassung vertreten, dass die Opioid-Rezeptoren an G-Proteine gekoppelt sind (siehe z. B. Schofield, P. R., et al., EMBO J., 8:489-95 (1989)), und dass sie somit Mitglieder der Familie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren sind. G-Proteine sind Guaninnukleotid-bindende Proteine, die die extrazellulären Signale, die von Zellobertlächenrezeptoren erhalten werden, an verschiedene intrazelluläre sekundäre Botenstoffsysteme koppeln. Die bestimmten Mitglieder der G-Protein-gekoppelten Familie weisen eine Reihe von gemeinsamen strukturellen Merkmalen auf, wobei die am höchsten konservierten Regionen sieben anscheinend Membran-durchspannende Regionen sind, die unter den Mitgliedern dieser Familie hoch homolog sind (Strosberg, A. D., Eur. J. Biochem. 1 6: 1-10 (1991)). Der Nachweis, dass die Opioid-Rezeptoren Mitglieder dieser Familie sind, beinhaltet die Stimulierung der GTPase-Aktivität durch Opioide, der Befund, dass GTP-Analoga eine dramatische Wirkung auf die Opioid- und Opiat-Agonisten-Bindung aufweist, und die Beobachtung, dass das Keuchhustentoxin (welches durch ADP-Ribosylierung selektiv sowohl die Gi- und Go-Subfamilien der G-Proteine inaktiviert) die Kopplung des Opioid-Rezeptors an Adenylat-Cyclase und an K⁺- und Ca²⁺-Kanäle blockiert (Evans, C. J., supra).
Die Mitglieder der G-Protein-gekoppelten-Rezeptorfamilie weisen eine Reihe von Eigenschaften auf. Viele der G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren, z. B. der Somatostatin-Rezeptor und der Angiotensin-Rezeptor, haben ein einzelnes Exon, das für die gesamte Protein-codierende Region codiert (Strosberg supra: Langord, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 138: 1025-1032 (1992)). Andererseits enthalten andere Rezeptoren, wie z. B. der Substanz-P-Rezeptor und der Dopamin-D2-Rezeptor, die Protein-codierende Region. Der D2-Rezeptor ist von besonderem Interesse, da ein alternierendes Spleißen der Gene zu unterschiedlichen transkribierten Produkten führt (d. h. Rezeptoren) (Evans, C. J., supra; Strosberg, supra). Interessanterweise wurde auch von den Somatostatin-Liganden berichtet, dass sie an Opioid-Rezeptoren binden (Terenius, L., Eur. J. Pharmacol. 38:211 (1976); Mulden, A. N., et al., Eur. J. Pharmacol. 205:1-6 (1991)) und weiterhin, daß sie ähnliche molekulare Mechanismen aufweisen (Tsunoo, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9832-9836 (1986)).
Im Rahmen der vorhergehenden Bemühungen, Opioid-Rezeptoren zu beschreiben und zu reinigen, wurden zwei Klone beschrieben, bezüglich derer die Hypothese vorgeschlagen wurde, daß sie entweder einen Teil oder die ganzen Opioid-Rezeptoren codieren. Der erste Klon, der das Opiat bindende Protein OBCAM codiert (Schofield et al., supra), wurde durch Verwendung einer Sonde erhalten, die ausgehend von einer Aminosäuresequenz von einem Protein entwickelt wurde, das auf einer Morphin-Affinitätssäule gereinigt wurde. OBCAM weist keine Membran durchspannenden Domänen auf, aber es hat eine C-terminale Domäne, die für eine Anhaftung des Proteins an die Membran über eine Phosphatidylinositol (PI)-Bindung charakteristisch ist. Dieses Merkmal, das Mitgliedern der Immunglobulin-Superfamilie gemeinsam ist, ist nicht üblich in der Familie von Rezeptoren, die an G-Proteine koppeln. Von daher wurde vorgeschlagen, dass OBCAM ein Teil eines Rezeptor-Komplexes gemeinsam mit weiteren Komponenten ist, die an G-Proteine gekoppelt sind (Schofield et al., supra). Zur Zeit gibt es aber keinen direkten Nachweis für solch einen Komplex.
Ein zweiter, vorgeschlagener Opioid-Rezeptorklon wurde im Rahmen der Bemühungen erhalten, einen Rezeptor zu klonen, der an kappa-Opioid-Rezeptorliganden bindet (Xie, G. X., Proc Natl Acad Sci USA 89: 4124-4128 (1992)). Aus einer PlacentacDNS-Bibliothek wurde ein DNS-Molekül isoliert, das einen G-gekoppelten Rezeptor codiert. Dieser Rezeptor weist eine extrem hohe Homologie mit dem Neurokinin-B-Rezeptor auf (84 % Identität bezüglich der vorgeschlagenen Proteinsequenz). Wenn dieser Klon in COS-Zellen exprimiert wurde, zeigte er eine Opioid-Peptid-verdrängbare Bindung von ³H-Bremazocin (ein Opiat-Ligand mit hoher Affinität für kappa-Rezeptoren). Die geringe Affinität dieses Rezeptors für ³H-Bremazocin und der Mangel einer geeigneten Selektivität dieses Rezeptors (der sowohl mu- und delta-Liganden bindet) lassen es zweifelhaft erscheinen, dass dieses geklonte Molekül tatsächlich ein Opioid-Rezeptor ist.
Des weiteren hat sich die Charakterisierung von Opioid-Rezeptor-Proteinen aufgrund ihrer Instabilität, sobald sie aus der Membran solubilisiert sind, als schwierig erwiesen; es sind keine gereinigten delta-Opioid-Rezeptoren isoliert worden. Die früheren Schätzungen der Molekulargewichte von Opioid-Rezeptoren im Bereich von 30 kDa bis 60 kDa spiegeln weiterhin die Schwierigkeiten bei der Isolierung und Charakterisierung dieser Proteine wieder.
Kürzlich wurde über eine DNS berichtet, die murine kappa- und delta-Opioid-Rezeptoren aus Mäusehirn codiert (Yasuda, K. et al. Proc Natl. Acad Sci USA (1993) 90: 6736-6740. Die Sequenz der Klone wies auf das Vorliegen der erwarteten sieben transmembranen Regionen hin. Bezüglich dem Mäuse-delta-Opioid-Rezeptor wurde offenbart, dass er nach dem Anmeldungstag des Prioritätsdokuments der vorliegenden Anmeldung geklont worden war (Kieffer, B. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12048-12052 Dezember 1992). Wie auch immer, die dort beschriebene Sequenz B unterscheidet sich von der Sequenz des Mäuse-delta-Rezeptors, die von den vorliegenden Erfindern beschrieben worden ist (Evans, et al., 1992, supra).
Eberwine, J. N., et al., Fed Proc. (1987) 46: 1444, abstract 6582, beschreiben die Transfektion einer angereicherten NG108-cDNS-Bibliothek in Zelllinien, die keine Opioid-Rezeptorbindungsstellen besitzen, und stellen so Zellen mit Opioid-Bindungsaktivität bereit. Simonds, W. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 4974-4978 berichteten über die Reinigung von Opiat-Rezeptoren von NG108-15-Zelllinien bis zu anscheinender Homogenität.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Nukleinsäuremoleküle bereit, die den murinen delta-Opioid-Rezeptor codieren, wie auch rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die durch Verwendung von niedrigstringenter Hybridisierung an diese offenbarte DNS wiedergewonnen werden können. Somit stellt die Erfindung Gene bereit, die die delta-Rezeptoren von allen Spezies codieren, welche Gene enthalten, die solche Rezeptoren codieren, die ausreichend homolog sind, um unter den Bedingungen niedriger Stringenz, wie sie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen beschrieben sind, zu hybridisieren.
Folglich ist die Erfindung gemäß einem Aspekt auf ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül gerichtet, umfassend eine Nukleotidsequenz, die einen delta-Opioid-Rezeptor codiert, welche unter Bedingungen niedriger Stringenz an die Nukleotidsequenz aus 5 oder an ihrem Komplement hybridisiert. Unter "niedriger Stringenz" wird folgendes verstanden: 50% Formamid/6 X SSC, über Nacht bei 37°C für die Hybridisierung, gefolgt von Waschvorgängen mit 2 X SSC 0,1 % SDS bei Raumtemperatur.
Es wird auch ein DNS-Molekül bereitgestellt, umfassend ein Expressionssystem, das in der Lage ist, wenn es in eine Wirtszelle transformiert ist, einen Opioid-Rezeptor in der Zelle herzustellen, wobei das Expressionssystem eine Nukleotidsequenz umfasst, die den Opioid-Rezeptor codiert, operabel gebunden an heterologe Kontrollsequenzen, die in der Zelle operabel sind. Der Rezeptor kann unter Verwendung von diesem Expressionssystems und von Wirtszellen, die modifiziert wurden, um es zu enthalten, hergestellt werden.
Besonders geeignet sind Wirbeltierzellen, die das Opioid-Rezeptorgen derart exprimieren, dass das Opioid-Rezeptorprotein an der Oberfläche der Zellen gezeigt wird. Dieses Zellen stellen Mittel bereit, um native und synthetische Kandidatenagonisten und -antagonisten für die Opioid-Rezeptoren zu screenen.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf Vertahren zum Screenen von Kandidatenagonisten und/oder -antagonisten, die an Opioid-Rezeptoren wirken, unter Verwendung der rekombinanten transformierten Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung gerichtet. Solche Assays umfassen (1) Bindungsassays, in denen die Kompetition mit Liganden, die bekanntermaßen Opioid-Rezeptoren binden, verwendet wird, (2) Agonisten-Assays, die die Aktivierung der sekundären Wege analysieren, welche mit der Opioid-Rezeptoraktivierung in den transformierten Zellen assoziiert sind, und (3) Assays, die die Wirkung auf die Bindung des Kandidaten an den Rezeptor in Gegenwart oder Abwesenheit von Natriumion und GTP untersuchen. Antagonisten-Assays beinhalten die Kombination von der Fähigkeit des Kandidaten, an den Rezeptor zu binden während keine weitere Aktivierung bewirkt wird, und, von größerer Wichtigkeit, von der Kompetition mit einem bekannten Agonisten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt einen Vergleich der Bindung von ³H-Diprenorphin (Sättigungskurven) zwischen NG108-15-Zellen und COS-Zellen drei Tage nach der jeweiligen Transfektion (durch Elektroporation) mit DOR-1 in dem CDM8-Vektor. In den nicht transfizierten COS-Zellen oder den COS-Zellen, die nur mit Plasmid transfiziert worden waren, konnte keine spezifische Opioid-Bindung detektiert werden.
2 zeigt Verdrängungskurven von 5 nM ³H-Diprenorphin von COS-Zellmembranen von Zellen, die mit DOR-1 transfiziert worden waren. ³H-Diprenorphin wurde verdrängt durch Diprenorphin, Etorphin, Morphin und Levorphanol, aber nicht durch Dextrorphan (das nicht opiatwirksame optische Isomer von Levorphanol).
3 zeigt Verdrängungskurven von 5 nM ³H-Diprenorphin von COS-Zellmembranen von Zellen, die mit DOR-1 transfiziert worden waren. ³H-Diprenorphin wurde verdrängt durch DPDPE und DSLET, die delta-selektive Agonisten darstellen, durch DADLE, ein Hochaffinitätsligand für mu- und delta-Rezeptoren, und durch Dynorphin 1-17, ein kappa-bevorzugender Ligand. ³H-Diprenorphin wurde nicht durch DAGO verdrängt, ein mu-selektiver Ligand.
4 zeigt die Ergebnisse einer Northern-Analyse von mRNS aus NG108-15-Zellen und Zellen aus verschiedenen Rattenhirnregionen.
5 zeigt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des DOR-1-Klons.
6 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz von DOR-1 im Vergleich mit dem Ratten-Somatostatin-Rezeptor. Consensus-Glycosylierungsstellen, von denen vorausgesagt wurde, dass sie in extrazelluläre Domänen fallen würden, sind durch ein Sternchen gekennzeichnet. Mögliche Proteinkinase C-Stellen sind in Beispiel 5 angegeben. Die sieben vorausgesagten Membran-durchspannenden Regionen (unterstrichen) werden auf der Grundlage des Hydrophobizitäts-Profils und der veröffentlichten Vorschläge vorausgesagt (MacVector software program (IBI); T. Hopp und K. Woods, Proc Natl Acad Sci USA 78: 3842-3828 (1981)). Für die Sequenzierung wurde das cDNS-Stück in pBluescript subkloniert, und beide Stränge wurden von einsträngiger DNS unter Verwendung von Sequenase und Taq cycle-Sequenzieren sequenziert. Wegen der Unklarheiten aufgrund der Kompressionen wurde dGTP in den Sequenzierungsreaktionen durch 7-deaza-dGTP ersetzt, und die Produkte wurden auf Formamidgelen aufgelöst.
7 zeigt einen Southern-Blot einer radioaktiv markierten DOR-1-cDNS-Sonde, die unter hoher Stringenz an NG108-15, Mäuse, Ratten und menschliche DNS hybridisiert wurde, geschnitten mit BamHI.
8 zeigt eine partielle Nukleotidsequenz des humanen delta-Opioid-Rezeptorgenomischen Klons H3 (auch als humaner DORa oder hDORa bezeichnet).
9 zeigt die Homologie der verschiedenen Rezeptoraminosäuresequenzen.
Ausführungsarten der Erfindung Die Erfindung stellt DNS, welche menschlisches delta-Opioid-Rezeptorprotein codiert, und weitere rekombinante Nukleinsäuren, Expressionsvektoren und Verfahren bereit, die für die Herstellung dieser Proteine geeignet sind. Des weiteren sind eukaryotische Zellen, wie z. B. COS-Zellen, die mit den rekombinanten Molekülen gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert worden sind, so dass sie auf ihrer Oberfläche Opioid-Rezeptorproteine exprimieren, brauchbar für Screening-Assays, um Kandidaten für Opioid-Agonisten und -antagonisten zu identifizieren. Ferner können Antikörper gegen die rekombinant hergestellten Opioid-Rezeptorproteine gezüchtet werden. Diese Antikörper sind in Immunassays für dieses Protein und bei der Affinitätsreinigung davon verwendbar.
Rekombinanter Opioid-Rezeptor
Im folgenden wird der Erhalt einer cDNS, die einen murinen delta-Opioid-Rezeptor codiert, beschrieben. Die vollständige DNS-Sequenz dieser cDNS und die davon codierten Aminosäuresequenz sind in der 5 der Beschreibung angegeben. Die Verfügbarkeit dieser cDNS erlaubt es, auf die korrespondierende Opioid-Rezeptorcodierende DNS aus anderen Wirbeltierspezies zurückzugreifen. Folglich stellt die vorliegende Erfindung rekombinante Moleküle und Verfahren zur Herstellung von delta-Opioid-Rezeptor exprimierenden Zellen verschiedener Wirbeltierspezies der Fachwelt zur Verfügung. Somit kann die cDNS aus 5, oder ein Teil davon, als eine Sonde für die Identifizierung des Teils einer genomischen Wirbeltier-DNS oder -cDNS verwendet werden, der ein delta-Opioid-Rezeptor-Protein codiert. Beispielhafte Verfahren zur Herstellung von einer genomischen Bibliothek und zur Identifizierung der Opioid-Rezeptor-codierenden Gene sind im folgenden in der Beschreibung dargestellt.
Bei dem in 5 beschriebenen DOR-1-Klon handelt es sich um einen cDNS-Klon, der dem murinen delta-Opioid-Rezeptor entspricht. Die vorliegenden Erfinder fanden heraus, und stellen dies in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen dar, dass das Screenen von einer humanen genomischen Bibliothek unter Bedingungen niedriger Stringenz zum Erhalt von DNS führt, die alle drei Typen der humanen Opioid-Rezeptoren codiert. Auf ähnliche Art und Weise wurde ein muriner genomischen Klon erhalten. Des weiteren wurde ein cDNS-Klon aus einer Mäusehirnbibliothek erhalten, die den murinen mu-Opioid-Rezeptor codiert. Daher sind entweder cDNS-Bibliotheken aus geeigneten Quellen, wie z. B. dem Gehirn, oder genomische Bibliotheken ergiebige Quellen oder Substrate, um die DNS gemäß der vorliegenden Erfin dung und die korresponierenden rekombinanten Materialien zu erhalten. Die Erfindung betrifft daher DNS, die einen delta-Opioid-Rezeptor eines Wirbeltiers codiert, worin der Opioid-Rezeptor durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, die unter Bedingungen niedriger Stringenz an die in 5 dargestellte Nukleotidsequenz oder an ihrem Komplement hybridisiert.
Als Alternative kann die DNS gemäß 5 oder ein Teil davon verwendet werden, um bestimmte Gewebe oder Zellen zu identifizieren, die Opioid-Rezeptor-Protein exprimieren, indem die mRNS analysiert wird, beispielsweise durch Verwendung von Northern-Blot-Techniken. Dieses Gewebe, bei denen unter Verwendung der Sonden gemäß der Erfindung bestimmt wurde, dass sie mRNS enthalten, die das Opioid-Rezeptor-Protein codieren, sind anschließend geeignete Quellen für die Herstellung von cDNS-Bibliotheken, die weiter unter Verwendung der im folgenden beschriebenen cDNS untersucht werden können.
Die DNS, die verschiedene Wirbeltier-Opioid-Rezeptor-Proteine codiert, und üblicherweise wie im folgenden beschrieben gemäß den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Standardtechniken erhalten werden kann, kann zur Herstellung von Zellen verwendet werden, die den Opioid-Rezeptor an ihrer Oberfläche exprimieren; solche Zellen sind üblicherweise eukaryotische Zellen, insbesondere Säugetierzellen wie z. B. COS-Zellen oder CHO-Zellen. Geeignete Expressionssysteme in eukaryotischen Zellen für diese Herstellung sind im folgenden angegeben. Die Opioid-Rezeptor-Proteine können auch in Prokaryoten oder in alternativen eukaryotischen Expressionssystemen zur Gewinnung des Proteins per se hergestellt werden. Die das Protein codierende DNS kann in Expressionsvektoren mit vorangehenden Signalsequenzen ligiert werden, um deren Sekretion zu bewirken, oder kann intrazellulär hergestellt werden, wie auch an der Zelloberfläche, in Abhängigkeit der Wahl des Expressionssystems und des Wirtes. Wenn dies gewünscht ist, kann das so rekombinant hergestellte Opioid-Rezeptor-Protein unter Verwendung geeigneter Mittel der Proteinreinigung gereinigt werden, und insbesondere durch Affinitätsreinigung, bei der Antikörper oder Fragmente davon, die immunspezifisch für Opioid-Rezeptor-Protein sind, eingesetzt werden.
Screenen von Opioid-Agonisten und -antagonisten unter Verwendung von rekombinanten Zellen
Die Fähigkeit einer Kandidatensubstanz, als ein Opioid-Agonist oder Opioid-Antagonist zu wirken, kann durch Verwendung der rekombinanten Zellen gemäß der vorlie genden Erfindung auf mehrere Arten bestimmt werden. Die Kandidatensubstanz muss an den Opioid-Rezeptor binden, um entweder Agonisten- oder Antagonistenaktivität aufzuweisen. Daher kann für die Bestimmung der Bindungsfähigkeit des Kandidaten entweder ein direkter oder ein indirekter Bindungsassay verwendet werden. Für einen direkten Bindungsassay wird die Kandidatenbindungssubstanz selbst detektierbar markiert, wie z. B. mit einer radioisotopen oder fluoreszierenden Markierung, und die Bindung an die rekombinanten Zellen gemäß der Erfindung wird bestimmt, indem der Erwerb an Markierung durch die rekombinanten Zellen mit dem Erwerb an Markierung durch korrespondierende, nicht transformierte (Kontroll-) Zellen verglichen wird.
Einfacher ist jedoch die Verwendung von einem kompetitiven Assay, worin die Kandidatensubstanz bezüglich der Bindung an die rekombinanten Zellen gemäß der Erfindung mit einer detektierbar markierten Form eines Opioid-Liganden konkurriert, der bekanntermaßen an den Rezeptor bindet. Diese Liganden selbst sind beispielsweise durch Verwendung von radioisotopen oder fluoreszierenden Gruppen markiert. Ein besonders geeignetes Opioid, von dem bekannt ist, dass es an diesen Rezeptor bindet, ist Diprenorphin. Ein typischer Aufbau für einen solchen Assay ist wie folgt:
Üblicherweise werden ungefähr 10⁶ rekombinante Zellen in Suspension in 1,0 ml von Kreb's Ringer Hepes Puffer (KRHB) bei pH 7,4, 37°C für 20 Minuten mit ³N-Diprenorphin inkubiert. Die unspezifische Bindung wird durch die Zugabe von 400 nM Diprenorphin in die Bindungsmischungen bestimmt. Zu den Reaktionsmischungen werden verschiedene Konzentrationen der Kandidatensubstanzen gegeben. Die Inkubierungen werden durch das Sammeln der Zellen auf Whatman GF-B-Filtern beendet, wobei der Überschuss an Radioaktivität durch dreimaliges Waschen der Filter mit 5 ml KRHB bei 0°C entfernt wird. Nach Inkubieren bei 20°C über Nacht in 5 ml Szintillationsflüssigkeit, wie z. B. Liquiscint (National Diagnostics, Somerville, NJ), wird die Radioaktivität auf den Filtern durch flüssiges Szintillationszählen bestimmt.
Die K_d-Werte (Dissoziationskonstante) für die Kandidaten-Opiatliganden kann aus dem IC_5O-Wert bestimmt werden ("inhibitierende Konzentration₅₀" entspricht der Konzentration an Kandidatenligand, die zu einer 50%igen Verminderung der Bindung von markiertem Diprenorphin führt).
Zur Unterscheidung von Agonisten- und Antagonisten-Aktivitäten können die Wirkungen von Natrium und GTP auf das Bindungsverhalten der Liganden an die rekombinant exprimierten Rezeptoren verwendet werden. Wenn die Bindung einer Kandida tensubstanz empfindlich gegenüber Na⁺ und GTP ist, so ist es wahrscheinlicher, dass es sich um einen Agonisten statt einem Antagonisten handelt, da die funktionelle Kopplung von Opioid-Rezeptoren an sekundäre Botenstoffmoleküle wie z. B. Adenylatcyclase die Anwesenheit von sowohl Natrium als auch GTP erfordert (Blume et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 6-35 (1979)). Des weiteren konnte gezeigt werden, dass Natrium, GTP und GTP-Analoga die Bindung von Opioiden und Opioid-Agonisten an Opioid-Rezeptoren bewirken (Blume, Life Sci 22: 1843-52 (1978)). Da die Opioid-Antagonisten keine Bindung aufweisen, die empfindlich auf Guanin-Nukleotide und Natrium ist, wird diese Wirkung als eine Methode zum Unterscheiden von Agonisten und Antagonisten unter Verwendung von Bindungsassays eingesetzt.
Zusätzlich kann die Agonisten-Aktivität direkt durch das funktionelle Ergebnis innerhalb der Zelle bestimmt werden. So ist es beispielsweise bekannt, dass die Bindung von Opioid-Agonisten die cAMP-Bildung inhibiert, die Kaliumkanal-Aktivierung inhibiert, die Calciumkanal-Aktivierung inhibiert und die GTPase stimuliert. Die Bestimmung dieser Aktivitäten als Reaktion auf eine Kandidatensubstanz ist diagnostisch für Agonisten-Aktivität. Des weiteren lässt sich die Kandidatensubstanz durch die Fähigkeit der Substanz, mit der aktivierenden Aktivität von einem bekannten Agonisten wie z. B. Etorphin zu interferieren, in wirksamer Weise als Antagonist einordnen.
In einem typischen Assay wird die Messung der cAMP-Niveaus in Zellen, die Opioid-Rezeptoren exprimieren, durchgeführt, indem die Menge an ³H-cAMP gemessen wird, die aus mit ³H-Adenin vormarkierten intrazellulären ATP-Pools gebildet wird (Law et al., supra). Somit werden die cAMP-Bildungsassays mit 0,5 x 10⁶ Zellen/0,5 ml KRHB bei einem pH von 7,4 durchgeführt, mit einer Inkubation bei 37°C für 20 Minuten. Nach der Zugabe des internen Standard-³²P-cAMP wird das radioaktive cAMP über bekannte Doppel-säulenchromatographische Verfahren von anderen ³H-markierten Nukleotiden getrennt. Die Fähigkeit des Opiat-Agonisten zur Inhibierung der cAMP-Akkumulierung wird anschließend wie von Law et al. (supra) beschrieben bestimmt.
Die Wirksamkeit eines Kandidaten-Opiat-Antagonisten kann über die Messung der Fähigkeit von Etorphin, die Akkumulierung von cyclischem AMP in Gegenwart und in Abwesenheit von bekannten Mengen des Kandidaten-Antagonisten zu inhibieren, bestimmt werden. Die Inhibierungskonstante (K_i) eines Antagonisten kann anschließend aus der Gleichung für kompetitive Inhibitoren berechnet werden.
Ein interessantes Merkmal der Screening-Assays, in denen die zum Stand der Technik gehörenden NG108-15-Zellen eingesetzt werden, liegt darin, dass die Adenylatcycla se-Inhibierungsfunktion des Agonisten anscheinend nicht die Bindung aller Rezeptoren auf diesen Zellen erfordert. Daher unterschieden sich die K_d-Werte und die K_i-Werte für die opioiden Liganden bei Verwendung dieser Zellen.
Die vorstehend beschriebenen Assays, die an rekombinant transformierten Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, erlauben ein direkteres und einfacheres Screenen für Kandidatensubstanzen mit Agonisten- und Antagonisten-pioid-Rezeptor-Aktivität als die bis anhin zur Vertügung stehenden Screeningverfahren. Des weiteren sind solche Assays empfindlicher, da die Zellen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung so konstruiert werden können, dass sie hohe Levels des Opioid-Rezeptors exprimieren. Zudem umgeht man mit den gemäß der vorliegenden Erfindung konstruierten Zellen die Bedenken, dass die NG108-15-Zellen aufgrund ihres Tumorzellenhintergrunds eine zelluläre Umgebung aufweisen, die künstlich die Opioid-Rezeptor-Expression beeinflusst.
Verfahren zur Herstellung von Opioid-Rezeptor-Protein oder Teilen davon
Die vorliegende Erfindung stellt die Aminosäuresequenz von einem murinen Opioid-Rezeptor bereit; in ähnlicher Weise stellt die Verfügbarkeit der cDNS gemäß der Erfindung korrespondierende Wirbeltier-Opioid-Rezeptoren der Fachwelt zur Verfügung, deren Aminosäuresequenz ebenfalls nach Standardverfahren bestimmt werden kann. Nachdem die Aminosäuresequenzen solcher Opioid-Rezeptoren bekannt sind, oder bestimmbar sind, können neben der Reinigung solch eines Rezeptor-Proteins aus natürlichen Quellen auch die rekombinante Herstellung oder synthetische Peptidsyntheseverfahren zur Herstellung des Rezeptor-Proteins oder -Peptids verwendet werden.
Der Opioid-Rezeptor oder Teile davon kann/können folglich auch durch Verwendung von Standardfestphasen-Peptidsynthesemethoden (oder Flüssigphase) hergestellt werden, wie dem Fachmann bekannt. Des weiteren kann die DNS, die diese Peptide codiert, unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Oligonukleotidsyntheseinstrumenten für die Herstellung des Proteins wie vorstehend beschrieben synthetisiert werden. Die Herstellung durch Festphasenpeptidsynthese ist natürlich erforderlich, wenn Aminosäuren eingebaut werden sollen, die nicht durch das Gen codiert werden.
Die zur Beschreibung der Peptide und Proteine gemäß der Erfindung verwendete Nomenklatur folgt der üblichen Praxis, bei der die N-terminale Aminogruppe auf der linken Seite und die Carboxygruppe auf der rechten Seite jedes Aminosäurerests im Peptid angenommen wird. In den Formeln, die ausgewählte spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen, wird davon ausgegangen, dass die Amino- und Carboxy-terminalen Gruppen, wenn sie auch oft nicht extra aufgeführt sind, in der Form vorliegen, die sie bei physiologischen pH-Werten annehmen würden, sofern nichts anderes angegeben ist. So ist davon auszugehen, dass bei physiologischem pH N-terminal NH₃+ und C-terminal COO" vorliegt, auch wenn dies nicht notwendigerweise spezifiziert und dargestellt ist, entweder in bestimmten Beispielen oder in allgemeinen Formeln. Die freien funktionellen Gruppen an den Seitenketten der Aminosäurereste können auch durch Glycosylierung, Phosphorylierung, Cysteinbindung, Amidierung, Acylierung oder weitere Substitutionen modifiziert sein, die beispielsweise die physiologischen, biochemischen oder biologischen Eigenschaften der Substanzen verändern können, ohne aber ihre Aktivität im Rahmen der beiliegenden Ansprüche zu beeinflussen.
In den dargestellten Peptiden wird jeder Gen-codierende Rest, sofern zweckmäßig, durch eine Einzelbuchstabenbenennung dargestellt, die dem Trivialnamen der Aminosäure entspricht, in Übereinstimmung mit der folgenden üblichen Liste:
Nomenklatur der Enkephaline Enkephaline sind eines der beiden Peptide mit fünf Resten mit dem N-terminalen Rest mit Nummer 1:
In "met-Enkephalin" ist der fünfte Rest Methionin:
tyr-gly-gly-phe-met
In "leu-Enkephalin" ist der fünfte Rest Leucin: tyr-gly-gly-phe-leu
Enkephalinanaloga können (1) mit Aminosäuresubstitutionen, (2) mit D-Aminosäuresubstitutionen und/oder (3) mit zusätzlichen Aminosäuren hergestellt werden. Die Stelle, an der die Substitution stattgefunden hat, wird am Anfang des Verbindungsnamens angegeben. So bedeutet z. B. "(D-ala², D-leu⁵)-Enkephalin", dass D-ala an der zweiten Position und D-leu an der fünften Position vorliegt: tyr-[D-ala]-gly-phe-[D-leu] Es können auch Einbuchstaben-Abkürzungen verwendet werden. So könnte "(D-ser²) leu-Enkephalin" als "DSLE" bezeichnet werden. Auch zusätzliche Reste werden angegeben. So entspricht die Addition von einem Threoninrest (an der sechsten Position) von (D-ser²) leu-Enkephalin "(D-ser²) leu-Enkephalin thr", das als "DSLET' abgekürzt werden kann:
tyr-[D-ser]-gly-phe-leu-thr
Antikörper
Mit dem Delta-Opioid-Rezeptor-Protein oder -Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung immunreaktive Antikörper können durch Immunisierung von geeigneten Säugersubjekten mit Peptiden erhalten werden, die als Antigenregionen jene Teile des Rezeptors enthalten, die als Ziele für die Antikörper vorgesehen sind. Bei gewissen Proteinsequenzen wurde ein hohes Antigenpotential bestimmt. Solche Sequenzen werden in Antigenindices aufgelistet, z. B. MacVector Software (I.B.I.). So können durch Bestimmung der Sequenz des Opioid-Rezeptor-Proteins und einer Auswertung der Sequenz mit einem Antigenindex mögliche Antigensequenzen lokalisiert werden.
Die Antikörper werden durch Immunisierung von geeigneten Säugerwirten gemäß bekannten Immunisierungsprotokollen immunisiert, wobei die Peptidhaptene alleine verwendet werden, sofern sie eine ausreichende Länge aufweisen, oder an geeignete Träger konjugiert werden, wenn dies erwünscht oder zur Verstärkung der Immunogenizität erforderlich ist. Vertahren zur Herstellung von immunogenen Konjugaten mit Trägern wie z. B. BSA, KLH oder weiteren Trägerproteinen sind der Fachwelt wohl bekannt. Unter gewissen Umständen kann die direkte Konjugierung mit z. B. Carbodiimid-Reagenzien wirksam sein; in anderen Fällen können Verknüpfungsreagenzien wie die von Pierce Chemical Co., Rockford, IL, hergestellten wünschenswert sein, um die Haptenzugänglichkeit bereitzustellen. Die Haptenpeptide können z. B. mit Cysteinresten verlängert oder durchstreut werden, um die Verknüpfung mit dem Träger zu erleichtern. Die Verabreichung des Immunogens wird üblicherweise durch eine Injektion über einen geeigneten Zeitraum und unter Verwendung von geeigne ten Adjuvantien durchgeführt, wie allgemein der Fachwelt bekannt. Während der Immunisierungsphasen werden Antikörpertiter entnommen, um die Adäquanz der Antikörperbildung zu bestimmen.
Während die so hergestellten polyklonalen Antiseren für gewisse Verwendungen zufriedenstellend sein können, ist für pharmazeutische Zusammensetzungen die Verwendung von Präparationen von monoklonalen Antikörpern (mAb) bevorzugt. Die immortalisierten Zelllinien, die die erwünschten mAbs sekretieren können, können nach den Standardverfahren von Kohlen und Milstein oder mit Modifikationen, die die Immortalisierung von Lymphozyten oder Spleenzellen bewirken, hergestellt werden, wie allgemein bekannt. Die immortalisierten Zelllinien, die die erwünschten mAbs sekretieren, werden durch einen Immunassay gescreent, in dem das Antigen das Peptidhapten oder der Opioid-Rezeptor selbst ist, der auf einer rekombinanten Wirtszelle gezeigt ist. Wenn die geeignete immortalisierte Zellkultur bestimmt worden ist, die den erwünschten mAb sekretiert, können die Zellen entweder in vitro oder durch intraperitonale Injizierung in Tiere kultiviert werden, in denen die mAbs in der Lymphflüssigkeit produziert werden.
Die gewünschten mAbs werden dann aus dem Kulturüberstand oder aus der Lymphflüssigkeit gewonnen. Zusätzlich zu den intakten Antikörpern können auch Fragmente der mAbs oder der polyklonalen Antikörper, die den Antigen-bindenden Teil enthalten, als Antagonisten verwendet werden. Die Verwendung der immunologisch reaktiven Antigenbindungsfragmente, wie z. B. die Fab-, Fab'- oder F(ab')₂-Fragmente, ist oftmals bevorzugt, insbesondere in einem therapeutischem Zusammenhang, da diese Fragmente üblicherweise weniger immunogen sind als das gesamte Immunglobulinmolekül.
Standardverfahren
Die Techniken zum Sequenzieren, Klonieren und Exprimieren von DNS-Sequenzen, welche die Aminosäuresequenzen codieren, die einem Opioid-Rezeptor entsprechen, z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Synthese von Oligonukleotiden, das Sondieren einer cDNS-Bibliothek, das Transformieren von Zellen, das Konstruieren von Vektoren, das Herstellen von Antisensoligonukleotidsequenzen auf der Basis von bekannten Sense-Nukleotidsequenzen, das Extrahieren von Messenger-(Boten)-RNS, das Herstellen von cDNS-Bibliotheken und ähnliches sind der Fachwelt wohl bekannt. Dem Durchschnittsfachmann sind die standardmäßigen Ressourcenmaterialien, bestimmte Bedingungen und Verfahren geläufig. Die folgenden Absätze sind der Be quemlichkeit halber angegeben, wobei die Erfindung selbstverständlich nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt wird.
RNS-Herstellung und Northern-Blot
Die RNS-Herstellung wird wie folgt durchgeführt: Die für die Herstellung von RNS verwendeten Proben werden umgehend in flüssigem Stickstoff gefroren und werden bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Die RNS wird durch CsCI-Zentrifugation (Ausubel et al., supra) unter Verwendung von einem modifizierten Homogenisierungspuffer hergestellt (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294-5299 (1979)). Die Poly(A⁺)-RNS wird durch Oligo(dT)Chromatographie ausgewählt (Aviv und Leder, Proc Natl Acad Sci USA 69: 1408-1412 (1972)). Die RNS-Proben werden bei –80°C gelagert.
Die Analyse der Genexpression und der Verteilung im Gewebe kann durch Verwendung von Northern-Blots mit z. B. radioaktiv markierten Sonden durchgeführt werden. Durch Gelelektrophorese wird die mRNS der Größe nach aufgetrennt und wird anschließend auf eine Nylonmembran oder Nitrocellulose transferiert und mit einer radioaktiv markierten Sonde hybridisiert. Das Vorliegen der hybridisierten Probe wird durch Verwendung von Autoradiographie detektiert.
Klonieren
Die das Opioid-Rezeptor-Protein codierenden cDNS-Sequenzen werden aus einer zufällig geprimten, größenselektierten cDNS-Bibliothek erhalten.
Als Alternative dazu werden die Opioid-Rezeptor-Protein codierenden cDNS-Sequenzen aus einer cDNS-Bibliothek erhalten, die aus mRNS hergestellt worden ist, welche aus Zellen isoliert wurde, die das Rezeptor-Protein in verschiedenen Organen wie z. B. dem Gehirn exprimieren, gemäß den in Sambrook, J. Et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL; ": Auflage; Verlag Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, beschriebenen Verfahren.
Das cDNS-Insert aus dem erfolgreichen Klon, das mit einem Restriktionsenzym wie z. B. EcoRI ausgeschnitten wurde, wird anschließend als eine Sonde der ursprünglichen cDNS-Bibliothek oder anderen Bibliotheken (niedrigen Stringenz) verwendet, um weitere Klone zu erhalten, die Inserts enthalten, die andere Regionen des Proteins codieren, die zusammen oder alleine die gesamte für das Protein codierende Nukleotidsequenz umspannen.
Ein weiteres Verfahren zum Erhalten von cDNS-Sequenzen, die das Opioid-Rezeptor-Protein codieren, ist PCR. PCR wird verwendet, um die Sequenzen von einer gepoolten cDNS-Bibliothek von reverse-transkribierter RNS zu amplifizieren, wobei Oligonukleotid-Primer auf der Grundlage von bereits bekannten Transportersequenzen verwendet werden.
Vektorkonstruktion
Bei der Konstruktion von geeigneten Vektoren, die die erwünschten Codierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, werden Ligations- und Restriktionstechniken eingesetzt, die der Fachwelt wohl bekannt sind (Young et al., Nature 316: 450-452 (1988)). Die Opioid-Rezeptor-Protein codierende Doppelstrang-cDNS wird für die Insertion in einem Plasmidvektor CDM8 synthetisiert und hergestellt. Alternativ dazu können Vektoren wie z. B. Bluescript² oder Lambda ZAP² (Stratagene, San Diego, CA) oder ein Vektor von Clontech (Palo Alto, CA) gemäß den Standardverfahren eingesetzt werden (Sambrook, J. et al., supra).
Die seitenspezifische DNS-Spaltung wird durch Behandlung mit dem geeigneten Restriktionsenzym durchgeführt, wie z. B. EcoRI, oder mit mehr als einem Enzym, unter Bedingungen, die für die Fachwelt offensichtlich sind, deren Einzelheiten durch die Hersteller dieser kommerziell erhältlichen Restriktionsenzyme angegeben sind, siehe z. B. New England Biolabs, Product Catalog. Üblicherweise wird etwa 1 μg DNS durch eine Enzymeinheit in etwa 20 μl Pufferlösung gespalten; in den Beispielen gemäß der vorliegenden Anmeldung wird üblicherweise ein Überschuss an Restriktionsenzym eingesetzt, um die vollständige Verdauung des DNS-Substrats sicherzustellen. Inkubationszeiten von etwa 1 bis 2 Stunden bei etwa 37°C sind durchführbar, wenn auch Variationen toleriert werden können. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, und dies kann durch eine weitere Extraktion und Nukleinsäurerückgewinnung aus den wässrigen Fraktionen durch Ausfällung mit Ethanol gefolgt werden.
Bei der Vektorkonstruktion, die "Vektorfragmente" einsetzt, wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) oder alkalischer Phosphatase aus dem Kalbsdarm (calf intestinal alkaline phosphatase, (CIP)), um die 5'-Phosphate zu entfernen und um eine Re-Ligation des Vektors zu verhindern. Die Verdauungen werden bei pH 8 in ungefähr 150 mM Tris durchgeführt, in Gegenwart von Na⁺ und Mg⁺⁺, wobei etwa eine Einheit BAP oder CIP pro μg Vektor bei 60°C resprektive 37°C für etwa 1 Stunde eingesetzt wird. Um die Nukleinsäurefragmente zu gewinnen, wie die Präparation mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol prezipitiert. Alternativ dazu kann die Religation in Vektoren, die zweifach verdaut worden sind, durch zusätzliche Restriktionsenzymverdauung der unerwünschten Fragmente verhindert werden.
Die Ligationen werden in 15-50 μl Volumina unter den folgenden Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10 mM bis 50 mM NaCl und entweder 40 μM ATP, 0,01-0,02 (Weiss) Einheiten T4-DNS-Ligase bei 0°C (für ''sticky-end''-Ligation) oder 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) Einheiten T4-DNS-Ligase bei 14°C (für ''blunt-end''-Ligation). Intermolekulare "sticky-end"-Ligationen werden üblicherweise bei 33-100 μg/ml Gesamt-DNS-Konzentrationen durchgeführt (5-100 nM Gesamtendkonzentration). Intermolekulare blunt-end-Ligationen (in denen üblicherweise ein 10-30-facher molarer Überschuss der Linker verwendet wird), werden bei 1 μM Gesamtendkonzentration durchgeführt. Die korrekten Ligationen für die Vektorkonstruktion werden nach den Verfahren von Young et al., Nature, 316: 450-452 (1988) bestätigt.
cDNS-Bibliothek-Screenen
cDNS-Bibliotheken können unter Verwendung von Bedingungen niedriger Stringenz gescreent werden, wie durch Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1990) beschrieben worden ist, oder unter Verwendung von Verfahren, die in Sambrook et al., (supra) dargestellt sind, oder durch Verwendung von einem Kolonie- oder Plaque-Hybridisierungsverfahren mit einem Fragment der DOR-1-cDNS, die Opioid-Rezeptor-Protein codiert.
Die Plaque-Hybridisierung wird üblicherweise wie folgt ausgeführt: Wirtsbakterien wie z. B. LE 392 (Stratagene) werden über Nacht bei 37°C in LB-Kulturflüssigkeit gewachsen (Sambrook et al., supra), behutsam pelletisiert und in der Hälfte des Originalvolumens von 10 mM MgS0₄, 10 mM CaCl₂ resuspendiert. Nach der Titration wird eine Menge der Phagen-Bibliothek, die ungefähr 50000 plaquebildende Einheiten (pfu) enthält, zu 300 μl der Wirtsbakterien zugegeben, für 15 Minuten bei 37°C inkubiert und mit 10 ml NZYCM-Topagarose auf NZYCM-Agar ausplattiert. Eine Gesamtheit von 1 Million Plaques, die auf zwanzig 15 cm-Platten verteilt sind, werden gescreent. Für das Kolonie-Screenen werden transfizierte Bakterien auf LB-Kulturflüssigkeitsplatten mit den geeigneten Antibiotika ausplattiert. Nachdem die Plaques oder Kolonien auf 1 mm angewachsen sind, werden die Platten bei 4°C für wenigstens 2 Stunden abgeschreckt, und anschließend mit doppelten Nitrocellulose-Filtern überdeckt, gefolgt von einer Denaturierung der Filter in 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl für 5 Minuten und einer Neutralisierung in 0,5 M Tris, pH 7,4/1,5 M NaCl für 5 Minuten. Die Filter werden dann an der Luft getrocknet, für 2 Stunden bei 80°C gebacken, für mehrere Stunden bei 68°C in 5X SSC/0,5% SDS gewaschen und in 0,5 M NaPO₄, pH 7,2/1% BSA/1 mM EDTA/7% SDS/100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNS für mehr als 4 Stunden prehybridisiert. Unter Verwendung der DOR-1-cDNS (die in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen dargestellt wird) als Sonde, die durch zufälliges Primen markiert worden war, wird die Hybridisierung hoher Stringenz in der gleichen Lösung bei 68°C durchgeführt, und für die Hybridisierung niedriger Stringenz wird die Temperatur auf 50-60°C vermindert. Nach der Hybridisierung für 16-24 Stunden werden die Filter erst in 40 mM NaPO₄, pH 7,2/0,5% BSA/ 5% SDS/ 1 mM EDTA zweimal für je 1 Stunde gewaschen, anschließend in 40 mM NaPO₄, pH 7,2/ 1% BSA/ 1 mM EDTA jeweils für 1 Stunde gewaschen, jeweils bei der gleichen Temperatur wie die Hybridisierung (Boulton et al., Cell 65: 663-675 (1991)). Anschließend werden die Filter einem Röntgenfilm mit "enhancing screen" bei –70°C für 1 Tag bis zu 1 Woche ausgesetzt.
Danach werden die positiven Signale den Platten zugeordnet, und der entsprechende positive Phage wird im nachfolgenden Screening-Zyklus gereinigt, wobei die gleichen Bedingungen wie im primären Screening verwendet werden. Anschließend werden die gereinigten Phagen-Kolonien zur Herstellung von Phagen-DNS zum Subklonen in einen Plasmidvektor für eine Sequenzanalyse verwendet. Die Gewebeverteilung der DNS, die den unterschiedlichen verschiedenen Klonen entspricht, wird analysiert, indem Northern-Blots und in situ-Hybridisierung nach Standardverfahren durchgeführt werden. Die Funktion der DNS wird durch Expression in einem heterologem eukaryotischen Expressionssystem wie z. B. den COS-Zellen untersucht.
Expression des Opioid-Rezeptor-Proteins
Die Nukleotidsequenz, die das Opioid-Rezeptor-Protein codiert, kann in einer Reihe von Systemen exprimiert werden. Die cDNS kann mittels geeigneter Restriktionsenzyme ausgeschnitten werden und für solch eine Expression in prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren ligiert werden.
Wie im folgenden näher ausgeführt, wird beispielsweise die cDNS, die das Protein codiert, in COS-Zellen exprimiert. Der Plasmidexpressionsvektor CDM8 (Aruffo und Seed, Proc Natl Acad Sci USA 84: 8573-8577 (1987), zur Verfügung gestellt durch Drs. Aruffo und Seed (Harvard University, Boston, MA), wurde verwendet, um eine funktionelle Expression zu bewirken. Als Alternative dazu können andere geeignete Expressionsvektoren wie z. B. retrovirale Vektoren eingesetzt werden.
Für die Expression des Opioid-Rezeptors können prokaryotische und bevorzugt eukaryotische Systeme eingesetzt werden. Eukaryotische Mikroben, wie z. B. Hefe, können als Wirte für die Massenproduktion des Opioid-Rezeptor-Proteins verwendet werden. Am häufigsten werden Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, Bäckerhefe, eingesetzt, obwohl auch eine Reihe von weiteren Stämmen üblicherweise erhältlich sind. Vektoren, die z. B. den 2μ-Replikationsursprung (Broach, Meth. Enz. 101: 307 (1983)) oder weitere Hefen-kompatible Replikationsursprünge verwenden (z. B. Stinchcomb et al., Nature 282: 39 (1979); Tschempe et al., Gene 10: 157(1980) und Clarke et al., Meth. Enz. 101: 300 (1983)), können eingesetzt werden. Die Kontrollsequenzen für die Hefevektoren umfassen Promotoren für die Synthese von glycolytischen Enzymen (Ness et al., J. Ady. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland et al., Biochemistry 17: 4900 (1978)). Weitere dem Fachmann bekannte Promotoren umfassen den Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase (Hitreman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)) und jene für andere glycolytische Enzyme. Weitere Promotoren, die den zusätrlichen Vorteil aufweisen, dass die Transkription durch die Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, sind die Promotorregionen für die Alkoholdehydrogenase-2, Isocytochrom-C, Säurephosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, und Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Verwendung verantwortlich sind. Es wird auch davon ausgegangen, dass Terminatorsequenzen am 3'-Ende der codierenden Sequenzen wünschenswert sind. Solche Terminatoren werden in der 3'-nichttranslatierten Region gefunden, die den codierenden Sequenzen in von Hefe abgeleiteten Genen folgt.
Als Alternative werden die Gene, die das Opioid-Rezeptor-Protein codieren, in eukaryotischen Wirtszellkulturen exprimiert, die von multizellulären Organismen abgeleitet sind. (Siehe z. B. Tissues Cultures, Academic Press, Cruz and Patterson, eds, (1973)). Diese Systeme haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie die Fähigkeit aufweisen, Introns auszuspleißen, und dass sie daher direkt für die Expression von genomischen Fragmenten eingesetzt werden können. Geeignete Wirtszelllinien umfassen amphibische Oocyten wie z. B. Xenopus oocytes, COS-Zellen, VERO- und HeLa-Zellen, Eierzellen vom chinesischen Hamster (CHO) und Insektenzellen wie z. B. SF9-Zellen. Die Expressionsvektoren für solche Zellen umfassen üblicherweise Promotoren und Kontrollsequenzen, die mit Säugerzellen kompatibel sind, wie z. B. die häufig verwende ten frühen und späten Promotoren von Baculovirus, vaccinia virus, Simian Virus 40 (SV40) (Fiers et al., Nature 273: 113 (1973)) oder weitere virale Promotoren wie jene, die von Polyoma, Adenovirus 2, Rinderpapilloma-Virus oder Vögel-Sarcomaviren abgeleitet sind. Der kontrollierbare Promoter hMTII (Karin et al., Nature 299: 797-802 (1982)) kann ebenfalls verwendet werden. Die allgemeinen Aspekte von Säugerzellen-Wirtssystemtransformationen sind von Axel, U.S.-Patent Nr. 4,399,216 beschrieben worden. Es sieht heute danach aus, dass "Verstärker"-Regionen für die Optimierung der Expression wichtig sind; diese sind üblicherweise Sequenzen, die der Promotorregion in nichtcodierenden DNS-Regionen vorgelagert oder nachgelagert gefunden werden. Die Replikationsursprünge können, sofern benötigt, aus viralen Quellen erhalten werden. Jedoch ist die Integration in das Chromosom für eine DNS-Replikation in Eukaryoten ein üblicher Mechanismus.
Wenn prokaryotische Systeme eingesetzt werden, sollte eine intronfreie codierende Sequenz verwendet werden, zusammen mit geeigneten Kontrollsequenzen. Die cDNS des Opioid-Rezeptor-Proteins kann durch Verwendung von geeigneten Restriktionsenzymen ausgeschnitten werden und zusammen mit geeigneten Kontrollsequenzen für solch eine Expression in prokaryotische Vektoren ligiert werden.
Die am häufigsten verwendeten Prokaryoten stellen verschiedene Stämme von E. coli dar; es können aber auch andere mikrobielle Arten und Stämme verwendet werden. Häufig verwendete prokaryotische Kontrollsequenzen, die in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen angegeben sind, umfassen Promotoren für die Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit Ribosom-Bindungsstellensequenzen, und umfassen so häufig verwendete Promotoren wie das ß-Lactamase-Promotersystem (Penicillinase) und das Laktose-Promotorsystem (lac) (Chang et al., Nature 198: 1056 (1977)) und das Tryptophan-Promotorsystem (trp) (Goeddel et al., Nucl Acids Res 8: 4057 (1980)) und den λ-abgeleiteten P_L-Promoter und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (Shimatake et al., Nature 292: 128 (1981)).
In Abhängigkeit der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für diese Zellen geeignet sind. Die Behandlung, bei der Calciumchlorid eingesetzt wird, wie von Cohen, Proc Natl Acad Sci USA 69: 2110 (1972) oder von Sambrook et al., (supra) beschrieben, kann für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet werden, die substantielle Zellwandbarrieren enthalten. Für Säugerzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren nach Graham und van der Eb, Virology 54: 546 (1978) oder gegebenenfalls das modifizierte nach Wigler et al., Cell 16: 777-785 (1979) oder das jenige nach Chen and Okayama, supra verwendet werden. Die Transformationen in Hefe können gemäß dem Verfahren nach Van Solingen et al., J. Bact. 130: 946 (1977) oder nach Hsiao et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 3829 (1979) durchgeführt werden.
Weitere repräsentative Transfektionsmethoden umfassen die virale Transfektion, DEAE-Dextran vermittelte Transfektionstechniken, die Lysozymfusion oder die Erythrocytenfusion, Kratzen (scraping), direkte Aufnahme, osmotischer Schock oder Sucrose-Schock, direkte Mikroinjektion, indirekte Mikroinjektion wie z. B. über die Erythrocyten-vermittelten Techniken und/oder indem die Wirtszellen elektrischen Strömen unterworfen werden. Die vorstehende Liste von Transfektionstechniken wird nicht als vollständig betrachtet, da weitere Vertahren zur Einführung von genetischem Material in Zellen ohne Zweifel noch entwickelt werden.
Modulation der Expression durch Antisense-Sequenzen
Als Alternative können Antisense-Sequenzen als Mittel zur Modulation der funktionellen Expression der Rezeptoren, die durch die sense-Oligonukleotide codiert werden, in Zellen insertiert werden, die die Opioid-Rezeptoren exprimieren. Die Antisense-Sequenzen werden ausgehend von bekannten Sense-Sequenzen (entweder DNS oder RNS) nach dem Fachmann geläufigen Standardmethoden hergestellt. Antisense-Sequenzen, die spezifisch für das Opioid-Rezeptorgen oder das RNS-Transkript sind, können verwendet werden, um an die Oligonukleotide, welche den Opioid-Rezeptor codieren, zu binden oder diese zu inaktivieren.
Terminologie
Die in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen angegebene Verwendung der Singularformen "ein", "eine" und "der, die, das" umfassen auch den Plural, sofern sich aus dem Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes ergibt. So beinhaltet z. B. die Verweisung auf "einen Rezeptor" Mischungen von solchen Rezeptoren, die Verweisung auf "ein Opioid" umfasst eine Mehrzahl von und/oder Mischungen von solchen Opioiden und die Verweisung auf "die Wirtszelle" umfasst eine Vielzahl solcher Zellen gleicher oder ähnlicher Art usw..
Sofern nichts anderes angegeben ist, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Bezeichnungen, die in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden, die gleiche Bedeutung auf, wie sie von einem Durchschnittsfachmann auf dem vorliegenden technischen Gebiet üblicherweise aufgefasst wird. Die vorliegenden Beispiele sollen die Erfindung darstellen, ohne sie jedoch zu beschränken. Die Temperaturen sind in °C und Drucke bei nahezu atmosphärischem Druck angegeben, sofern nichts anderes angegeben ist.
Herstellung von Mono ¹²⁵I-DADLE DADLE (Peninsula Laboratories Inc.) wurde nach dem Iodogen-Verfahren iodiert (Maidment et al., in: MICORDIALYSIS IN THE NEUROSCIENCES, T. Robinsond and J. Justice, eds., Seiten 275-303 (Elsevier, 1991)). Es werden sowohl die mono- als auch die di-iodierten Formen erhalten. Von den Di-Iodo-DADLE wurde berichtet, dass sie aufgrund der Diiodierung des Tyrosinrests nicht an Opiat-Rezeptoren binden (Meller, R. J., et al., Life Sci., 22: 379-88 (1978)). Folglich wird mono-iodiertes DADLE bevorzugt. Mono-¹²⁵I-DADLE wird auch deshalb bevorzugt, weil es eine extrem hohe spezifische Aktivität im Vergleich mit DADLE, das mit anderen Isotopen markiert ist, aufweist. Aufgrund dessen können Einwirkungszeiten in der Größenordnung von Tagen statt von Wochen oder Monaten angewendet werden.
Die Ausbeute an dem bevorzugten mono-iodierten DADLE konnte erhöht werden, indem ein molares Verhältnis von Natriumiodid zu Peptid von ungefähr 1: 100 bei der Durchführung der Iodierung eingesetzt wurde. Zusätzlich wurde zur weiteren Steigerung der Ausbeute an der mono-iodierten Form das iodierte DADLE (das sowohl die mono- als auch die di-iodierte Form enthielt) durch reverse-phase HPLC gereinigt (Maidment et al., supra). Durch Verwendung dieses Verfahrens wurde ein einziger, großer radioaktiv markierter Peak des mono-iodierten DADLE von den di-iodierten und den nicht iodierten Formen abgetrennt.
Das einfach mit ¹²⁵I markierte DADLE ist für ein erfolgreiches Screenen von entscheidender Bedeutung. Das radioaktiv markierte ¹²⁵I-DADLE unterscheidet sich vom DADLE in mehreren bedeutenden Parametern: Größe, Hydrophobizität und Bindungsaffinität (leicht geringer). Die Reinigung des mono-iodierten DADLE von di-iodiertem und nicht iodiertem DADLE über den HPLC-Schritt ergibt einen Liganden mit einer sehr hohen spezifischen Aktivität (ungefähr 2000 Ci/mmol). Die spezifische Aktivität der mono-iodierten Form ist ungefähr 100 mal größer als diejenige, die durch Verwendung der nicht aufgetrennten Mischung von mono-, di- und nicht iodiertem DADLE erhalten wird. Das monomarkierte ¹²⁵I-DADLE muss innerhalb weniger Tage nach seiner Herstellung eingesetzt werden.
Beispiel 1
Herstellung von DOR-1 Die NG108-15-Zelllinie (erhältlich von Dr. Christopher Evans, UCLA) umfasst eine homogene und angereicherte Quelle von Delta-Opioid-Rezeptoren. Unter Verwendung der aus NG108-15 isolierten mRNS wurde eine zufällig-geprimte, größenselektive cDNS-Bibliothek im Plasmidvektor CDM8 konstruiert. Die cDNS-Bibliothek wurde in Bakterien amplifiziert. Die cDNS-Bibliothek wurde durch Elektroporation in COS-7-Zellen transfiziert. Vorübergehend transfizierte COS-Linien (transient lawns) wurden gescreent und mittels hochgereinigtem Mono-¹²⁵I-2dAla, 5dLeu-Enkephalen (¹²⁵I-DADLE) gescreent und selektiert. Durch Filmautoradiographie wurden die positiven Klone bestimmt, und Plasmide aus diesen Zellen wurden zurückgewonnen und in Bakterien amplifiziert. Anschließend wurden die Plasmide in COS-Zellen retransfiziert. Nach drei Zyklen solch einer Plasmidanreicherung wurden individuelle Klone transfiziert und es wurde ein reiner Klon bestimmt, der ¹²⁵I-DADLE bindet.
A. Konstruktion der cDNS-Bibliothek
Die RNS wurde aus NG108-15-Zellen durch Homogenisierung in 6 M Guanidiniumisothiocyanat hergestellt, gefolgt von einer Cäsiumchlorid-Zentrifugation (J. M. Chirgwin, et al., Biochemistry 18: 5294 (1979)). Die Poly-A⁺-RNS wurde mittels Chromatographie über Oligo-dT-Cellulose isoliert (N. Aviv und P. Leder, Proc Natl Acad Sci USA 69: 1408 (1972)). Unter Verwendung dieser RNS als ein Templat wurden statistische Hexamere verwendet, um die cDNS-Synthese mittels Vogel-Myeloblastosis-Virus-Reverse-Transkriptase zu Primen (Life Sciences Inc.). Die zweite Strangsynthese wurde mit RNase-H und E. coli DNS-Polymerase durchgeführt (U. Gubler und B. J. Hoffman, Gene 24: 263 (1983)). Die Enden der cDNSs wurden mit T4-DNS-Polymerase abgestumpft (blunt) und BstXI-Linker wurden hinzugefügt. Mittels Elektrophorese durch 5% Acrylamid, gefolgt von Elektro-Eluierung, wurde cDNS, die länger als 1,5 kb war, selektiert. Die 1,5 kb-cDNS wurde an den CDM8-Vektor ligiert (A. Aruffo und B. Seed, supra, und anschließend in MC-1061-Bakterien mittels Elektroporation transformiert (W. J. Dower et al., Nucl. Acids Res. 16: 6127 (1988)). So wurden aus der ursprünglichen cDNS-Bibliothek mit ungefähr 2 x 10⁶ Rekombinanten 6 Plasmid-DNS-Pools erhalten.
B. Plasmidtransfektion mittels Elektroporation und Expression in COS-Zellen
Die COS-Zellen wurden bei großer Dichte gezüchtet und in Trypsin geerntet, und anschließend bei 2 x 10⁷/ml in 1.2X RPMI, das 20 % fetales Kalbsserum enthält, resuspendiert. Diese Zellen wurden anschließend für 10 Minuten bei 4°C mit 20 μg rekombinanter Plasmid-DNS aus der vorstehend beschriebenen cDNS-Bibliothek inkubiert, und dann bei 960 μF und 230 V in einer 0,4 cm-Gap-Kuvette (BioRad) elektroporiert. Die Zellen wurden daraufhin weitere 10 Minuten bei 4°C inkubiert, und dann in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 10% fetalem Kalbsserum (FCS) ausplattiert.
C. Screenen der transfizierten COS-Zellen Die wie oben beschrieben erhaltenen transfizierten COS-Zellen wurden für 3 Tage wachsen gelassen, und anschließend unter Verwendung von radioaktiv markiertem Mono-¹²⁵I-DADLE gescreent. Transfizierte COS-Linien wurden mit PBS gewaschen, dann bei Raumtemperatur mit 10-20 nM ¹²⁵I-DADLE in KHRB, das 1 % BSA enthielt, inkubiert. Nach 1 Stunde wurden die Platten rasch mehrmals mit eiskaltem PBS gewaschen, und anschließend mit einem starken Strom von kalter Luft auf Eis getrocknet. Die Platten wurden auf DuPont Cronex-Filmen in Kassetten bei Raumtemperatur exponiert. Die positiven Klone wurden durch eine sorgfältige Zuordnung des Films mit der Petrischale durch Mikroskopie niedriger Stärke bestimmt.
Die DNS wurde aus den positiven Zellen durch Solubilisierung in 0,1 % SDS in TE, das 1 μg/μl tRNS enthielt, welche von einer am Kapillarrohr eines Mikromanipulators befestigten Spritze abgegeben wurde, entfernt. Die Plasmide wurden von den extrahierten Zellen gereinigt, indem das Hirt-Lyse-Verfahren angewendet wurde ((Hirt, B., J. Mol. Biol. 26: 365-369 (1967)), und in MC-1061-Bakterien elektroporiert. Die Plasmide wurden gereinigt, und anschließend in COS-Zellen retransfiziert. Nach drei solcher Anreicherungszyklen wurden einzelne Plasmidklone in COS-Zellen transfiziert, um einen einzigen Klon zu ergeben, der als DOR-1-Klon bezeichnet wird.
Beispiel 2
Charakterisierung von DOR-1
Der DOR-1-Klon wurde anfänglich durch Screenen der Zellmembranfraktionen charakterisiert, bei den DOR-1 exprimierenden Zellen wurde mit dem markierten DADLE gefunden, dass die Bindung von ¹²⁵I-DADLE durch nanomolare Konzentrationen von den Opiat-Alkaloiden Dipronorphin, Morphin, Etorphin und durch DADLE, DSLET und DPDPE verdrängt wurde. Dextrorphan (10 μM) verdrängte nicht das ¹²⁵I-DADLE, während dessen Opioid-aktives Enantiomer Levorphanol das radioaktiv markierte DADLE verdrängte. Des weiteren verdrängte der mu-Rezeptor selektive Ligand DAGO (5 μM) nicht die Zählungen.
Der DOR-1-Klon wurde ferner pharmakologisch charakterisiert, indem die Bindung von ³H-Diprenorphin an intakte, den DOR-1-Klon exprimierende Zellen bestimmt wurde (1), und indem die Verdrängung von ³H-Diprenorphin aus Membranfraktionen solcher Zellen bestimmt wurde (2 und 3).
Die Bindungsstudien wurden mit intakten Zellen in KRHB, 1 % BSA durchgeführt; oder mit Membranen in 25 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, pH 7,7. Die Zellen wurden mit PBS, das 1 mM EDTA enthielt, geerntet, zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in KHRB resuspendiert. Die Membranen, die aus den Zellen hergestellt wurden (Law, P. Y. E. et al., Mol. Pharm. 23: 26-35 (1983)) wurden direkt im Bindungsassay eingesetzt. Die Bindungsassays wurden in 96-Well-Polypropylen-Clusterplatten durchgeführt (Coster), bei 4°C in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einer geeigneten Menge an radioaktiv markierten Liganden. Nach 1 Stunde Inkubation wurden die Platten mit einem Tomtec-Erntegerät geerntet und die "B"-Filtermatten wurden in einem Betaplatten (Pharmacia)-Scintillationszähler gezählt, wobei Meltilex B/HS (Pharmacia)-Schmelzscintillationslagen verwendet wurden.
Mit dem Hochaffinitäts-Opiat-Antagonisten ³H-Diprenorphin wurden die intakten Zellen, die DOR-1 exprimieren, analysiert. Das spezifische Binden wurde über die Zählungen, die durch 400 nM Diprenorphin verdrängt wurden, bestimmt. 1 zeigt eine Sättigungskurve für ³N-Diprenorphin für die NG108-15-Zellen und COS-7-Zellen, die mit dem Delta-Opioid-Rezeptor-Klon transfiziert worden waren. Nicht transfizierte COS-Zellen oder COS-Zellen, die mit einem Plasmid ohne Insert transfiziert worden waren, zeigten keine spezifische Bindung. Folglich war die Opioid-Bindung von COS-DOR-1-Zellen ähnlich zu denjenigen der NG108-15-Zellen.
Für eine genauere pharmakologische Charakterisierung des Rezeptors, der durch den DOR-1-Klon codiert wird, wurden Membranen nach Standardverfahren aus transfizierten COS-7-Zellen hergestellt. In 2 sind die Affinitäten der folgenden Alkaloid-Opiate in Kompetition mit ³H-Diprenorphin dargestellt: unmarkiertes Diprenorphin, ein Hochaffinitätsantagonist für Delta-Rezeptoren; Etorphin, ein Hochaffinitätsagonist für delta-, mu- und kappa-Rezeptoren; Levorphanol, ein Agonist für delta-Rezeptoren mit niedriger Affinität; Morphin, ein Agonist für delta-Rezeptoren mit niedriger Affinität und ein Agonist für mu-Rezeptoren mit hoher Affinität; und Dextrorphan, nichtopiat-aktives Enantiomer von Levorphanol, das nicht an delta-Rezeptoren binden sollte.
Wie in 2 dargestellt, wurde mit Diprenorphin, Etorphin, Levorphanol und Morphin in sinkender Affinitätsstärke eine Verdrängung von ³H-Diprenorphin beobachtet. Wie erwartet, wurde ³H-Diprenorphin nicht durch Dextrorphan verdrängt.
Die Affinitäten der folgenden Opioid-Peptide in Kompetition mit ³H-Diprenorphin sind in 3 dargestellt: DADLE, ein Hochaffinitätsagonist für mu- und delta-Rezeptoren; DSLET und DPDPE, jeweils beide Hochaffinitätsagonisten für delta-Rezeptoren (aber nicht mu-Rezeptoren); DAGO, ein selektiver Agonist für mu-Rezeptoren und Dynorphin 1-17, ein Hochaffinitätsagonist für kappa-Rezeptoren und ein Agonist mit moderater bis niederer Affinität für delta-Rezeptoren. Wie in 3 gezeigt, wurde für DSLET, DPDPE und DADLE und Dynorphin 1-17 in sinkender Affinitätsstärke eine Verdrängung von ³H-Diprenorphin beobachtet. Es wurde nur eine geringe Verdrängung durch DAGO festgestellt.
Beispiel 3
Northern-Blot-Analyse von RNS
Für die Northern-Analyse wurde die mRNS aus NG108-15-Zellen und aus Zellen, die aus Regionen des Rattenhirns seziert wurden, durch Elektrophorese über 2,2 M Formaldehyd/1,5% Agarose aufgetrennt, auf Nylon aufgetragen und in einer wässrigen Lösung bei hoher Stringenz hybridisiert. Die Filter wurden in 0,5M NaPO₄, pH 7,2; 1 % BSA; 1 mM EDTA; 7% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNS für wenigstens 4 Stunden bei 68°C prähybridisiert (Boulton et al., supra). Die Filter wurden anschließend über Nacht unter den gleichen Bedingungen mit ⩾ 5 x 10⁶ cpm/ml gereinigtem cDNS-Insert hybridisiert, das durch zufälliges Primen markiert worden war (A. P. Feinberg und B. Vogelstein, Anal. Biochem. 132: 6 (1983)). Die Filter wurden zweimal in 40 mM NaPO₄, pH 7,2; 0,5 % BSA, 5 % SDS und 1 mM EDTA für 1 Stunde gewaschen, und anschließend zweimal in 40 mM NaPO₄, pH 7,2; 1% SDS und 1 mM EDTA für jeweils 1 Stunde jeweils bei 68°C gewaschen. Danach wurde eine Autoradiographie mit DuPont Cromex Lightening Plus bei –70°C durchgeführt.
Die Ergebnisse der Northern-Analyse der mRNS zeigen die Gegenwart von multiplen Banden, die an die Sonde hybridisierten, bei ungefähr 8,7, 6,8, 4,4, 2,75 und 2,2 Ki lobasen (Kb) (4). Die Northern-Analyse deutet auch darauf hin, dass sich das mRNS-Muster zwischen den Gehirnregionen unterscheiden kann. Zum jetrigen Zeitpunkt ist es ungeklärt, ob diese mRNSs unterschiedliche Proteinsequenzen codieren, und wenn dies der Fall ist, ob sie unterschiedliche Typen oder Subtypen der Opioid-Rezeptoren darstellen.
Beispiel 4
Southern-Blot-Analyse der DNS
Die radioaktiv markierte DOR-1-cDNS-Sonde wurde an genomische Southern-Blots nach Standardverfahren hybridisiert (Sambrook et al., supra). Demgemäß wurde die radioaktiv markierte DOR-1-cDNS-Sonde unter Bedingungen hoher Stringenz an einem Blot mit NG108-15-, Maus-, Ratten- und Human-DNS hybridisiert, die mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten wurde (7). In den Klonen, die NG108-15-, Mäuse- und Ratten-DNS enthielten, wurden Einzelbanden beobachtet. Die Größe der Banden, die an die cDNS-Sonde hybridisierten, wurden auf 5,2 kb (NG108-15), 5,2 kb (Maus) und 5,7 kb (Ratte) geschätzt. Diese Ergebnisse zeigen die enge Homologie von Mäusegenen und Rattengenen, und veranschaulichen zudem, dass der DOR-1-Klon von dem murinen Verwandten der NG108-15-Zelllinie abstammt.
In einem Blot, der Eco-RI-geschnittene genomische DNS von vielen verschiedenen Arten enthielt, zeigte die Hybridisierung der DOR-1-cDNS unter Bedingungen moderater Stringenz zwei Banden in jeder Linie der Maus, Ratte, Mensch, Kaninchen und viele weitere Säugerarten. Dies zeigt eine enge Verwandtschaft zwischen den Opioid-Rezeptor-Genen in all diesen Arten auf. Des weiteren zeigen diese Ergebnisse, dass die Gene oder cDNS von jeder dieser Arten einfach geklont werden kann, indem eine Hybridisierung unter moderater Stringenz verwendet wird.
Beispiel 5
Bestimmung der cDNS-Sequenz
Isolierte cDNS, die durch den D0R-Klon dargestellt wird, wurde durch Subklonieren des Inserts aus dem cDNS-Klon in ein Plasmid wie z. B. pBluescript^TM (Stratagene, San Diego, CA) und unter Verwendung der Dideoxy-Methode analysiert (Sangen et al., Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467 (1977)). Die Sequenz der cDNS wurde ausgehend von der Einzelstrang-DNS bestimmt und sieht spezifisch designte interne Primen vor, wobei sowohl Sequenase- als auch ΔTaq-Zyklus-Sequenzierkits (USB) verwendet wurden. Diese Kits, die häufig im Stand der Technik verwendet werden, setzt die Dideoxykettenterminations-Methode ein. Die DNS-Sequenz und die vorausgesagte Proteinsequenz wurde dann mit Sequenzen in etablierten Datenbanken wie z. B. GenBank verglichen.
Das Sequenzieren des cDNS-Inserts in dem DOR-1-Klon offenbarte ein offenes Leseraster (open reading frame) von 370 Aminosäuren (5). Die Vergleiche mit bekannten Sequenzen in der GenBank zeigten Höchsthomologie zwischen DOR-1 und dem G-Protein-gekoppelten Somatostatin-Rezeptor (57% Aminosäurenidentität), und eine geringfügig niedrigere Homologie mit den Rezeptoren, die Angiotensin binden, den zwei chemotaktischen Faktoren IL-8 und N-Formylpeptid. 6 gibt die Homologie zu dem menschlichen Somatostatin-l-Rezeptor an. Die starke Homologie des vorliegenden Rezeptorklons mit dem Somatostatin-Rezeptor ist besonders bemerkenswert, da berichtet wurde, dass Somatostatin-Liganden an Opioid-Rezeptoren binden und molekulare Mechanismen aufweisen, die ähnlich zu denen in delta-Rezeptoren sind.
Weitere Merkmale der Aminosäuresequenz des DOR-1-Klons, die von der cDNS-Sequenz abgeleitet worden ist, umfassen 3 Konsensus-Glycosylierungsstellen an den Resten 18 und 33 (von denen vorausgesagt wurde, dass sie in der extrazellulären Nterminalen Domäne liegen), und am Rest 310 (in der Nähe zum C-Terminus und als intrazellulär vorausgesagt). An den Resten 242, 255, 344 und 352 liegen Phosphokinase-C-Konsensusstellen innerhalb der vorausgesagten intrazellulären Domänen vor. Sieben mutmaßliche Membranen-spannende Regionen wurden auf der Grundlage von Hydrophobizitäts-Profilen identifiziert, wie auch aufgrund der Homologie mit Rhodopsin und anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die bezüglich der Membran-spannenden Regionen unter Verwendung der MacVector-Analyse (I.B.I.) analysiert worden waren. Der DOR-1-Klon, der gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung isoliert wird, ergibt einen delta-Rezeptor mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 40,558 Daltons vor posttranslationalen Modifikationen wie z. B. N-Glycosylierung.
Beispiel 6
Isolierung der Opioid-Rezeptor-genomischen Klone
sDie Isolierung von genomischen Klonen wurde nach im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt. Für die Isolierung der Opiat-Rezeptor-genomischen Klone wurden 300000 menschliche genomische Klone in γgem 11 (Promega) und eine ähnliche Anzahl an Mausgenomklonen in lambda Fix (Stratagene) auf dem Wirtsstamm Le392 ausplattiert und mit dem 1,1 kb DOR-1 Pst/Xba I-Fragment sondiert, das primär die codierende Region enthält. Die Bedingungen für die Hybridisierung waren recht niedriger Stringenz: 50% Formamid/6 X SSC, über Nach bei 37°C. Die Waschungen wurden ebenfalls bei niedriger Stringenz durchgeführt: 2 X SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur.
Es wurden ein Mausklon und ein menschlicher genomischer Klon durch sequenzielle Zyklen von Hybridisierung und Plaque-Reinigung isoliert und gereinigt. Der humane genomische Klon wurde als H3 bezeichnet (siehe 8).
Der H3-Klon wurde durch EcoRI und TagI in kleinere Fragmente verdaut und anschließend an die geeignete Stelle von Bluescript zum Sequenzieren durch "shotgun" geklont. Die partielle Nukleotidsequenz für H3 ist in 8 angegeben.
Der genomische Klon wurde durch in situ-Hybridisierung an menschlichen Metaphasechromosomen durch Dr. Glenn Evans vom Salk Institute entschlüsselt. H3 entschlüsselt Chromosom 1P. Ein Vergleich der Sequenzdaten, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, mit den veröffentlichten Sequenzen der vorstehend genannten murinen Gegenstücke und mit dem im folgenden beschriebenen DOR-2-Klon bestätigt, dass H3 den menschlichen Delta-Opioid-Rezeptor codiert.
Der genomische Klon wurde durch EcoRI und TagI in kleinere Fragmente verdaut und an die geeignete Stelle von Bluescript zum Sequenzieren "shotgun"-geklont.
Beispiel 7
Isolierung von Opioid-Rezeptor-Klonen aus zusätzlichen Organismen
Um einen Opioid-Rezeptor aus Säugerhirnzellen, z. B. menschlichen Hirnzellen, zu isolieren, wurde eine zufällig geprimte menschliche Hirnstamm-cDNS-Bibliothek in λ Zap (Stratagene) gescreent, wobei die in der vorliegenden Anmeldung und den Ansprüchen beschriebene murine cDNS verwendet wurde, die den DOR-1 codiert. Die positiven Plaques wurden gereinigt und wieder gescreent. Individuelle positive Klone werden wie vorstehend beschrieben sequenziert und charakterisiert.
Beispiel 8
Bestimmung von möglichen antigenischen Sequenzen
sDurch Evaluierung der Aminosäuresequenz des Opioid-Rezeptors, der durch DOR-1 codiert wird, mit dem MacVector (I.B.I.)-Antigenindex und dem Antigenindex gemäß Jameson, B. und N. Wolf, Comput. Applic. in Biosci. 4: 181-186 (1988) wurden die folgenden, unterstrichenen Sequenzen des Delta-Opioid-Rezeptors als jene mit einem hohen antigenischen Potential bestimmt:
Die N-terminale Sequenz ist extrazellulär, von den weiteren 4 Sequenzen wird vorhergesagt, dass sie intrazellulär sind.
9 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen des murinen delta-Rezeptors mit den mu- und kappa-Rezeptoren von Ratten. Es liegen umfangreiche Regionen von Homologie vor.
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Claims

Rekombinantes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die einen delta-Opioid-Rezeptor codiert, welche unter Bedingungen niedriger Stringenz an eine Sonde, die; aus der in 5 gezeigten Nucleotidsequenz besteht, oder an ihrem Komplement hybridisiert.;
Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, welches menschlichen delta-Opioid-Rezeptor oder murinen delta-Opioid-Rezeptor codiert.
Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 2, welches den murinen delta-Opioid-Rezeptor codiert, wobei der murine delta-Opioid-Rezeptor die Aminosäuresequenz, welche durch; die Nucleotidsequenz von 5 codiert wird, umfasst.
DNA-Molekül, umfassend ein Expressionssystem, das in der Lage ist, wenn es in eine Wirtszelle transformiert ist, einen Opioid-Rezeptor in der Zelle herzustellen, wobei das' Expressionssystem eine Nucleotidsequenz, die den gemäß Anspruch 1, 2 oder 3 definierten Opioid-Rezeptor codiert, umfasst, operabel gebunden an heterologe Kontrollsequenzen, die in der Zelle operabel sind. '
Wirtszelle, die so modifiziert ist, dass sie das Expressionssystem von Anspruch 4 umfasst;
Verfahren zur Herstellung einer Zelle, welche einen Opioid-Rezeptor an ihrer Oberfläche zeigt, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zelle von Anspruch 5 unter Bedingungen umfaßt, welche eine Expression der kodierenden Sequenz zur Herstellung des Rezeptor- proteins an der Oberfläche bewirken.
Zelle, hergestellt durch das Verfahren von Anspruch 6.
Verfahren zum Screenen einer Kandidatensubstanz für Opioid-Agonisten- oder -Antagonisten-Aktivität, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Inkubieren einer Zelle von Anspruch 7 in Gegenwart und Abwesenheit der Kandidatensubstanz unter Bedingungen, die zum Nachweis einer solchen Aktivität geeignet sind, und Detektieren der Gegenwart, Abwesenheit oder Menge der Aktivität.
In-Vitro-Verfahren, um die Expression eines Nucleinsäure-Moleküls, das einen Opioid-Rezeptor codiert, zu modulieren, wobei das Verfahren das Behandeln einer Zelle, die zu einer solchen Expression mit einer DNA, die komplementär zu dem Nucleinsäuremolekül von mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 ist, in Lage ist, unter Bedingungen umfaßt, unter denen die DNA an dem Nucleinsäuremolekül hybridisiert.