DE69332911T2

DE69332911T2 - Rekombinanter humanisierter Antikörper gegen menschlichen Immunschwächevirus

Info

Publication number: DE69332911T2
Application number: DE69332911T
Authority: DE
Inventors: Lesley Armour; Joseph Carr; William Harris
Original assignee: Nissin Food Products Co Ltd
Current assignee: SRD Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-08-24
Filing date: 1993-08-24
Publication date: 2003-12-18
Anticipated expiration: 2013-08-25
Also published as: ATE238420T1; EP0714439B1; AU685397B2; CA2170034A1; JP3741221B2; JPH09501838A; WO1995006119A1; KR100304333B1; EP0714439A1; AU4968793A; DE69332911D1; CA2170034C; US5607847A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Fachgebiet der Molekularbiologie und insbesondere das Fachgebiet der humanisierten Antikörper.
Diese Anmeldung betrifft die Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US92107111, eingereicht am 24. August 1992, welche Materialien und Verfahren, die bei der Vorbeugung und Behandlung der Infektion durch das Menschliche Immunschwäche Virus (Human Immunodeficiency Virus (HIV-1)) brauchbar sind, und insbesondere monoklonale Antikörper, die bei der passiven Immunisierung von HIV-1 empfänglichen oder infzierten Tieren, besonders Menschen, brauchbar sind. Diese Anmeldung gibt einen Hintergrund zur HIV-1- Infektion und ihrer prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung durch passive Immunisierung, deren Hauptpunkte hier wiederholt werden.
Der Infektionsprozeß von HIV-1 in vivo ist Gegenstand eines Übersichtsartikels von McCune, Cell, 64, S. 351-363 (1991) gewesen. HIV-1 infiziert Zeliklone, welche den CD4- Rezeptor exprimieren. Die meisten dieser Zellen sind ruhig und teilen sich nur als Antwort auf spezifische Signale, und so kann eine HIV-1-Infektion bewirken, dass sich CD4&spplus;-Zellen replizieren, woraufhin Viruspartikel produziert werden, die die Infektion ausbreiten. Weil es nicht ratsam ist, die Immunantwort eines HIV-1-infizierten Tieres zu stimulieren, kann es sein, dass die beste Art und Weise, eine HIV-1-Infektion zu verhindern oder zu behandeln, die der passiven Immunisierung ist. Dieses schließt die Verabreichung eines anti-HIV-1-Antikörpers an den Patienten ein, und vermutlich wäre es wünschenswert, dass dieses Antikörpermittel nicht immunogen ist. Es gibt einen Präzedenzfall für eine derartige Behandlung. Menschlichen Patienten, die an fortgeschrittenem erworbenem Immunschwächesyndrom (Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS)) leiden, dem Syndrom des fortschreitenden Verfalls des Immunsystems, das mit der HIV-1-Infektion verbunden ist, wurde Plasma gegeben, das Antikörper gegen HIV-1 enthält und eine temporäre Verringerung verschiedener Krankheitsparameter zeigte (Jackson et al., Lancet, 2, S. 647-652 (1988)). Auch hatte die Verabreichung eines HIV-1-spezifischen Antikörpers an einen Schimpansen, bevor das Tier HIV-1 ausgesetzt wurde, zur Folge, dass das Tier frei von Anzeichen viraler Infektionen blieb (Emini et al., Nature, 355, S. 728-730 (1992)).
Das HIV-1-Hauptaußenhüllglykoprotein (HIV-1 major external envelope glycoprotein), gp120, bindet an den zellulären CD4-Rezeptor und erleichtert die Aufnahme des Virus. Mehrere Epitope von gp120 sind mit der Entwicklung neutralisierender Antikörper mit der sogenannten Hauptneutralisierungsdeterminante ("principal neutralizing determinant" (PND)), die auf dem "V3-Loopn von gp120 lokalisiert ist, verbunden worden, wie in der vorherigen Anmeldung (PCT/US92/07111) verwiesen. Das V3-Loop besteht aus einer hypervariablen Domäne, welche durch Disulfidbindung zwischen Cysteinresten gebildet wird, die die Domäne flankieren.
Die PCT-Patentveröffentlichung Nr. PCT/US92107111 zitiert Beispiele des Antikörpers, der mit dem V3-Loop reaktiv ist, welche isolat- oder typspezifisch und auch Kandidaten für breit neutralisierende Antikörper sind, obwohl von keinem von diesen nachgewiesen wurde, dass sie multiple Stämme von lebendem HIV-1 neutralisieren. Es ist wahrscheinlich, dass die Reaktivitätsmuster, die von diesen Antikörpern gezeigt werden, mit der Reihe von Primärsequenzen und Konformationen des V3-Loops in Beziehung stehen. Die vorstehend erwähnte Anmeldung hebt auch mögliche Unzulänglichkeiten solcher Antikörper hervor CD4 ist vielleicht nicht der einzige zelluläre Rezeptor, der für Virusinfektiösität verantwortlich ist (Cheng-Mayer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, S. 3526-3530 (1987)), und Antikörper/HIV-1-Komplexe können die Virus-Replikation zum Beispiel durch Fördern der Infektion von Monozyten durch rezeptorvermittelte Endozytose steigern (Takeda et al., Science, 242, S. 580-583 (1988)).
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass bestimmte tierische Viren durch Komplement, insbesondere Clq, durch einen antikörperunabhängigen Mechanismus inaktiviert werden (siehe zum Beispiel Weiss, in Molecular Biology of Tumour Viruses. RNA Tumour Viruses, Weiss et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, S. 1219-1220 (1982)). Während Banapour et af., Virology, 252, S. 268-271 (1986) beschreiben, dass Erzeugung nichterhitzten Serums keine Wirkung auf die Dichte von HIV-1 oder auf ihre Fähigkeit, mononukleare Zellen des peripheren Bluts zu infizieren, hat, berichten Spear et al., J. Virol., 64 12, S. 5869-5873 (1990), dass HIV-1, das mit einer Kombination von Komplement und vereinigten Seren von HIV-1 sero-positiven Patienten behandelt wurde, verringerte Infektiösität zeigt.
Folglich war der Hintergrund zur vorherigen Erfindung (PCT/US92/07111) die Identifizierung eines Bedarfs für neue monoklonale Antikörperstoffe, welche spezifisch immunreaktiv mit HIV-1 sind und welche vorzugsweise multiple HIV-Stämme neutralisieren würden. Als Kandidaten zur Verwendung in der passiven Immunisierung von infizierten und nichtinfizierten Patienten würden diese Mittel idealerweise in der Lage sein, komplementabhängige Virolyse von HIV-1-Partikeln und antikörperabhängige Cytolyse von HIV-1 infizierten Zellen medizinisch zu behandeln.
Die vorstehend erwähnte Erfindung (PCT/US92/07111) stellt die monoklonalen Antikörper bereit, die mit dem Teil von HIV-1 gp120 oder dem Vorläufer gp160 reaktiv sind, umfassend die Aminosäuresequenz GPGR, gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit, die Infektion von H9-Zellen durch lebende HIV-1-Stämme MN und IIIB in Kultur zu neutralisieren und komplementabhängige Virolyse von HIV-1-Partikeln und/oder antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität von HIV-1-infizierten Zellen zu bewirken. Es wurde nahegelegt, dass die monoklonalen Antikörper der Erfindung zur Verwendung bei der anti-HIV-1-Behandlung von Tieren, insbesondere Menschen geeignet sein würden, die empfänglich sind für oder infiziert sind mit HIV-1. Innerhalb der Betrachtung der Erfindung war die ähnliche Verwendung von chimären Antikörpern, humanisierten Antikörpern, Antikörperfragmenten, oder bispezifischen Antikörpern, welche als Derivate der Antikörper der Erfindung hergestellt werden konnten, und die Verwendung von Produkten der Antikörper der Erfindung und die Verwendung von Produkten der Erfindung in Verbindung mit anderen immunologischen und/oder therapeutischen Mitteln.
Die Erfindung beschreibt die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern durch Immunisierung eines geeigneten Wirts mit lebenden-HIV-1, die folglich gp120 in ihrer natürlichen Konformation präsentieren. Es wird durch den monoklonalen Maus-Antikörper, NM-01, der von der Hybridomazelllinie HB 10726 produziert wurde, veranschaulicht. Die Wirksamkeit von NM-01 in in vitro-Tests, die Kartierung des Epitops von NM-01 zur Sequenz GPGR des gp120-V3-Loops und die Bestimmung der Sequenzen der variablen Region der leichten und schweren Kette von NM-01 sind beschrieben.
Es könnte erwartet werden, dass ein menschlicher Antikörper geeigneter sein würde als ein xenogener Antikörper in der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung einer HIV-1-Infektion in Menschen. Dieses ist so, weil der menschliche Antikörper weniger immunogen sein würde als zum Beispiel ein Mausegegenstück (Bruggermann et al., J Exp Med, 170, S. 2153-2157, 1989) und in Abhängigkeit vom beteiligten Isotyp am Auslösen der komplementabhängigen Virolyse und der antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität von HIV-1 infizierten Zellen wirksamer sein kann (diskutiert durch Winter und Milstein, Nature, 349, 293-299, 1991).
Um die Vorteile eines menschlichen Antikörpers zu sichern, während von den Antigen-Bindungseigenschaften eines Antikörpers Gebrauch gemacht wird, der in einer anderen Spezies gezüchtet wurde, haben Arbeiter das Verfahren zur Humanisierung verwendet, um die Antigen-Bindungsloops auf eine menschliche Matrize zu übertragen (zum Beispiel Riechmann et al., Nature, 332, S. 323-327, 1988; Tempest et al., Bio/Technology, 9, S. 266-271, 1991). Diese Loops, bekannt als complementary determining regions (CDRs), sind an einem Gerüst - den Gerüstregionen - montiert, welche zusammen die sogenannten variablen Domänen sind, die an den N-terminalen Enden jeder Antikörperkette liegen. Jede Bindungsstelle wird im meisten Teil von drei CDRs in der schweren Kette und drei CDRs in der leichten Kette gebildet, obwohl Gerüstreste mit dem Antigen entweder direkt oder indirekt durch Ändern der CDR-Konformation wechselwirken können. Die Gene, die diese rekombinanten Antikörper kodieren, werden zum Beispiel in Säugetierzellen exprimiert, und ihre konstanten Regionkomponenten können maßgeschneidert werden, um der Anwendung zu entsprechen.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung stellen wir einen humanisierten Antikörper bereit, der spezifisch mit HIV-1 reaktiv ist, der CDRs mit den in den Fig. 1 und 2 gezeigten Sequenzen umfasst, wobei die CDRs in die Gerüstregionen NEWH VH und REI VK des Menschen übertragen wurden.
Gemäß einem zweiten, einem alternativen, Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein humanisierter Antikörper bereitgestellt, der variable Regionen mit der in SEQ ID NR. 13 oder SEQ ID NR. 14 gezeigten Aminosäuresequenz umfasst.
Es wird ferner gemäß den dritten, vierten und fünften alternativen Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung DNA, die einen humanisierten Antikörper codiert, eine Zelllinie, die einen humanisierten Antikörper nach einem der ersten bis dritten Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung produziert, und eine Zelllinie HuVH/HuVKF C4, die unter der Accessionsnr. ECACC 93082019 hinterlegt ist, bereitgestellt.
Gemäß einem sechsten Gesichtspunkt der Erfindung stellen wir ein Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Antikörpers bereit, der die Schritte umfasst:
(a) Nehmen von CDRs aus den in den Fig. 1 und 2 gezeigten Sequenzen;
(b) Übertragen der CDRs in die Gerüstregionen des Menschen; und
(c) Modifizieren der Gerüstregionen des Menschen an der Kabat-Position 71 in einer Gerüstregion mit leichter Kette, um damit einen Phenylalanin-Rest (F) zu substituieren, wobei Verbesserungen durch den humanisierten Antikörper eine Fähigkeit einschließen, eine Infektion in H9-Zellen durch die lebenden HIV-1-Stämme MN und IIIB zu neutralisieren, wie durch Reverse Transkriptase-, p24- und Syncytiumbildungsassays gezeigt.
Es wird gemäß einem siebten alternativen Gesichtspunkt der Erfindung ein therapeutisches Mittel zur Behandlung oder Verhinderung von HIV-1-Infektionen bereitgestellt, das einen humanisierten Antikörper nach einem der ersten bis dritten Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Wir stellen gemäß einem achten alternativen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung einen Antikörper gemäß der ersten bis fünften alternativen Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren bereit.
Wir beschreiben menschliche monoklonale Antikörper, die sich vom Maus-mAb-NM- 01 (PCT/US92/07111) ableiten, welche spezifisch mit HIV gp120 reaktiv sind und das Vermögen haben, die Infektion von H9-Zellen in Kultur durch die lebenden HIV-1-Stämme mm und IIIB zu neutralisieren, wie durch Reverse Transkriptase-, p24- und Syncytiumbildungsassays gezeigt. Es wurde durch die vorstehend erwähnten Kriterien gezeigt, dass diese Antikörper gleich wirksam oder wirksamer waren als der Elternmausantikörper.
Die hier beschriebenen monoklonalen Antikörper sind besonders zur Verwendung bei der Anti-HIV-1-Behandlung von Menschen geeignet, weil sie wahrscheinlich weniger immunogen sind als xenogene Antikörper und wirksamer bei der komplementabhängigen Virolyse von HIV-1-Partikeln und/oder bei der antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität von HIV-1 infizierten Zellen sind.
Wie in der folgenden ausführlichen Beschreibung aufgezeigt, wurden monoklonale Antikörper als menschliche IgG1/K-Antikörper durch Humanisierung des Maus-mAb-NM-01 erzeugt. Die Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind bei Berücksichtigung der veranschaulichenden Beispiele und der Beschreibungen der Ausübung der vorliegenden Erfindung in der folgenden ausführlichen Beschreibung davon ersichtlich, wobei Bezug auf die Zeichnungen genommen wird, wobei gilt:
Die Fig. 1A, 1B und 1C zeigen die Nucleotidsequenz der variablen Region der schweren Kette der Maus-NM-01-(VH)-cDNA (SEQ ID NR. 8) und das Translationsprodukt (SEQ ID NR. 9). Die CDRs befinden sich im Kasten.
Die Fig. 2A, 2B und 2C zeigen die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR. 10) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR. 11) der variablen Region der Maus-k-Kette (VK cDNA).
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Fähigkeit verschiedener rekombinanter NM-01- Antikörper zeigt, an rekombinantes gp120 zu binden, wie durch ELISA beurteil.
Die Fig. 4A und 4B zeigen zwei Vergleiche von Aminosäuresequenzen. In Fig. 4A wird die Maus-NM-01-VH (MuVH) mit seinem humanisierten Gegenstück abgeglichen (HuVH, SEQ ID NR. 13). Die angezeigten Gerüstreste sind die Mausreste, weiche in die humanisierte Kette eingebracht wurden, wie in Beispiel 3 diskutiert. In Fig. 4B wird die Maus-NM-01-VK mit der humanisierten NM-01-VK verglichen (HuVK, SEQ ID NR. 14). F71 der MuVK, welche in die HuVK-Kette eingeschlossen wurde, ist angezeigt.
Fig. 5A zeigt die Ergebnisse eines ELISA, der die Bindung von NM-01-Antikörpern an ein Lysat des MN-Virus misst. Fig. 5B zeigt die Ergebnisse eines ELISA, der die Bindung von NM-01-Antikörpern an ein Lysat einer Mutante des MN-Virus misst.
Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse eines ELISA darstellt, in welchem die aufgeführten Antikörper auf ihre Fähigkeit getestet wurden, an ein Loop-Peptid zu binden, das die Reste 312-326 von HIV-1MNgp120 darstellt.
Fig. 7 zeigt die Fähigkeit von verschiedenen NM-01-Antikörpem, die Bindung eines markierten Maus-NM-01-Antikörpers an rekombinantes gp120 zu blockieren.
Die Fig. 8 und 9 veranschaulichen graphisch die neutralisierende Aktivität von NM-01- und HuVH/HuVKF-Antikörpem gegen MN- und IIIB-Stämme von HIV-1, wie durch den Reverse Transkriptase-Assay bestimmt.
Die Fig. 10 und 11 veranschaulichen graphisch die neutralisierende Aktivität von NM-01-Antikörpern, wie durch den p24-Assay bestimmt.
Fig. 12 zeigt die Fähigkeit der aufgeführten Antikörper, die Syncytiumbildung durch den MN-Stamm von HIV-1 zu hemmen.

Beispiele

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Ausübung der Erfindung bei der Erzeugung eines humanisierten monoklonalen Antikörpers, der mit HIV-1-gp120 reaktiv ist. Die Beispiele werden zum Zweck der Veranschaulichung der beanspruchten Erfindung gegeben und sollten nicht als Beschränkung der beanspruchten Erfindung ausgelegt werden.
Insbesondere beschreibt Beispiel 1 die Bestimmung der Aminosäuresequenzen der variablen Regionen des Eltem-NM-01-Maus-Antikörpers. Die Beispiele 2 und 3 sind auf die Erzeugung von chimären und humanisierten NM-01-Antikörpern gerichtet, Beispiel 4 betrifft die Charakterisierung des Epitops von einem der humanisierten Antikörper und Beispiel 5 beschreibt die Bewertung der biologischen Aktivität dieses humanisierten Antikörpers.

Beispiel 1

Isolierung der DNA-Seguenzen, die variable Regionen von Maus-NM-01 kodieren

Die Sequenzen der variablen Region wurden in der Anmeldung PCT/US92/07111 offenbart und wurden durch unabhängige Isolierung bestätigt, wie hier beschrieben. Die Sequenzen wurden aus cDNAs der schweren und leichten Kette bestimmt, welche aus zellplasmatischer RNA synthetisiert wurden, wie im Wesentlichen durch Tempest et al., vorstehend zitiert, beschrieben.

1. RNA-Isolierung

Ungefähr 200 ug zellplasmatische RNA wurden aus 10&sup7; NM-01-produzierenden Hybridomazellen durch das Verfahren von Favalora et al., Meth Enzymol 65, 5 718-749 (1980) isoliert. Der Überstand, der von der Kultur dieser Zellen erhalten wurde, wurde durch Festphasen-ELISA unter Verwendung eines Inno-Lia Isotypisierungskits für monoklonale Mausantikörper (Innogenetics, Antwerpen, Belgien) auf das Vorhandensein von Antikörpern geprüft. Es wurde durch dieses Verfahren bestätigt, dass der Antikörper IgG2b/K ist.

2. cDNA-Synthese

Reverse Transkription von NM-01-RNA wurde von den Primern initiiert, die auf dem 5'-Ende entweder des Maus-IgG2a/MausIgG2b Gens (CG2FOR, SEQ ID NR. 1) oder des Maus-k-IgG2a/MausIgG2b Gens (CG2FOR, SEQ ID NR. 1) oder der konstanten Region des Maus-k-Gens (CK2FOR, SEQ ID NR. 2) beruhen. Die Umsetzungen bestanden aus 5 ug RNA, 5 ug CG2FOR oder CK2FOR, jeweils 250 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 3 mM MgCl&sub2;, 30 Units Rnase-Inhibitor (Pharmacia Milton Keynes, United Kingdom) im Gesamtvolumen mit 50 ug. Proben wurden 10 Minuten lang auf 70ºC erwärmt und dann 30 Minuten lang auf 37ºC abgekühlt. 100 Units M-MLV- Reverse Transkriptase (Life Technologies, Paisley, United Kingdom) wurden zugegeben und man ließ die Reaktion 1 Stunde lang bei 37ºC ablaufen.

3. Amplifikation von VH- und VK-cDNA

Die Maus-cDNAs der variablen Region wurden durch PCR (Saiki et ah Science, 239, 487-491, 1988) unter Verwendung von Primern der variablen Region, einschließlich solcher, die durch Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 86, S. 3833-3837 (1989) beschrieben wurden, und Signalsequenz-Primern, die sich von denen von Jones und Bendig, Bio/Technology, 9, 88-89 (1991), sowie von Primern der konstanten Region, welche in die Synthese des ersten Strangs der cDNA miteinbezogen wurden, amplifiziert. Mehrere Primer, gaben erfolgreiche Amplifikation. Diese zusätzlichen Primern bezogen sich auf konservierte Regionen am 5'-Ende entweder des Maus-VH-Gens (VH1BACK, SEQ ID NR. 3) oder des Maus-VK-Gens (VK1BACK, SEQ ID NR. 4) oder am 3'-Ende der Maus-VH- Gene (VH1FOR, SEQ ID NR. 5). Andere Primer wurden von den Signalsequenzgenen der schweren Kette (SH3BACK, SEQ ID NR. 6) oder der k-Kette (SK5BACK, (SEQ ID NR. 7) der Maus entworfen.
Für die PCR-Amplifikation der VH enthielten die Umsetzungen 5 ug RNA/cDNA- Hybrid, 0,5 uM CG2FOR und 0,5 uM VH1BACK oder SH3BACK. Für die VK wurden 5 ug RNA/cDNA-Hybrid mit jeweils 0,5 uM CK2FOR und VK1BACK oder SK5BACK amplifiziert. Außerdem enthielt jede Umsetzung jeweils 250 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01% (v/v) Tween 20, 0,01% (v/v) NP-40 und 3 Units AmpIiTaq (Perkin Eimer Cetus, Beaconsfield, UK). Die Amplifikation lief über 25 Zyklen bei 94ºC, 30s; 50 oder 55ºC, 30s; 72ºC, 45 s plus 72ºC 5 min am Ende. Um die Spezifität zu erhöhen, wurde das Produkt der VH-Umsetzung mit CG2FOR und SH3BACK ferner unter Verwendung von VH1FOR und SH3BACK amplifiziert. Die VH-Produktgrößen betrugen ungefähr 400 bp (CG2FOR, VH1BACK) und 440 bp (VH1FOR, SH3BACK), wenn durch Agarosegel-Elektrophorese sichtbar gemacht. Die VK-Produkte betrugen etwa 370 bp (CK2FOR, VK1BACK) und 440 bp (CK2FOR, SK5BACK). Diese DNAs wurden durch Elektrophorese auf Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Elutip-d- Säulenchromatographie gereinigt (Schleider und Schuell, Dassel, Deutschland).

4. Klonieren und Sequenzieren von VH-cDNA

Ein allgemeines Klonierverfahren ist in Maniatis et al.. Molecular cloning, a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1982) beschrieben. Enzyme wurden erhalten von Life Technologies (Paisley, United Kingdom).
Das CG2FOR, VH1BACK-Produkt wurde unter Verwendung der HindIII- und PstI- Restriktionsstellen, die in die PCR-Primer eingebracht wurden, in M13mp18 und M13mp19 (Pharmacia, Milton Keynes, United Kingdom) kloniert. Die Klone wurden unter Verwendung der T7 DNA-Polymerase (Pharmacia, Milton Keynes, United Kingdom) durch das Didesoxyverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, S. 5463-5467, 1977) sequenziert.
Die Mehrheit der Klone, von denen sieben für die gesamte Insertion sequenziert wurden, enthielt ein identisches vollständiges VH-Gen durch Vergleich mit bekannten Sequenzen und steift beide Fragmentorientierungen dar. Ein Klon enthielt eine PCR- verursachte Übergangsveränderung. Die einzige andere Sequenz, die erhalten wurde, wurde nicht identifiziert, war aber nicht VH-ähnlich.
Weil die Sequenz am N-Terminus der VH durch den VH1BACK-Primer vorgegeben wurde, wurde das Produkt der VH1FOR- und SH3BACK-Umsetzung kloniert, um die Originalreste zu identifizieren. Das Produkt wurde unter Verwendung der SalI- Restriktionsstelle von SH3BACK und der BamHI-Stelle, welche sich im Inneren des VH- Fragments befindet, kloniert. Die 5'-VH-Sequenz wurde aus zwei Klonen erhalten. Die vollständige VH-Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz, die sich durch Translation ableitet, sind in Fig. 1 gezeigt (SEQ ID NR. 8 und 9). Der Umfang der angezeigten CDRs, wurde bestimmt, wie durch Kabat et al., Seauences of Proteins of Immunological Interest (5. Aufl.), U. S. Department of Health and Human Services (1991), definiert. Diese unterscheiden sich von denen, die in der Anmeldung PCT/US92/07111 gezeigt sind.

5. Klonieren und Sequenzieren von VK-cDNA

Die bei der Amplifikation von VK-cDNA verwendeten Primer enthalten auch Restriktionsstellen, so dass das CK2FOR, VH1BACK-Produkt als HindIII-PvuII-Fragmente und das CK2FOR-, SK5BACK-Produkt als HindIII-SalI-Fragmente in M13mp18 und M13mp19 kloniert wurde.
Die Mehrheit (26/31) der sequenzierten Klone enthielt dieselbe VK-Insertion, die durch Homologie mit bekannten VK-Sequenzen identifiziert wurde. Dieses wurde von beiden PCR-Produkten in beiden Orientierungen erhalten. Die Sequenzen von 21 Klonen wurden wenigstens 200 Nukleotide lang gelesen und im Fall von 14 Klonen das gesamte VK. Es gab vier PCR-induzierte Punktmutationen. Von den anderen erhaltenen Klonen hatten die meisten nicht identifizierte Insertionen, aber einer enthielt eine VK-ähnliche Sequenz, welche wegen des Fehlens des konservierten Cysteinrests an der Kabat-Position 23 und einer Rastermutation innerhalb der CDR3 kodierenden DNA nicht produktiv sein würde. Die Sequenz ist von RNA anderer Hybridomazellen erhalten worden, und es wird angenommen, dass sie vom Fusionspartner herrührt (unveröffentlichte Daten).
Die NM-01-VK-Nukleotidsequenz, einschließlich der originalen 5'-Reste, wie vom CK2FOR, SK5BACK-Produkt erhalten, wird in Fig. 2 zusammen mit seinem Aminosäuretranslationsprodukt gezeigt (SEQ ID NR. 10 und 11). Wieder unterscheiden sich die CDRs durch die Definition von Kabat et al., vorstehend, von denen, die in der Anmeldung PCT/US92/07111 angezeigt sind.

Beispiel 2

Produktion des chimären NM-01-Antikörpers

Die Produktion eines chimären Antikörpers, der aus variablen Maus- und konstanten Menschregionen besteht, ist zum Humanisierungverfahren nicht erforderlich, kann aber nützlich sein, weil seine Fähigkeit, ein Antigen zu binden, nahelegen kann, dass die korrekte VH und VK von der cDNA der Hybridoma geklont worden sind, und der Antikörper kann als Kontrolle in Assays verwendet werden, um die Wirksamkeit der humanisierten Antikörper festzustellen.
VH- und VK-Insertionen wurden unter Verwendung der Oligonukleotide VH1 FOR und VH1 BACK oder VK1 FOR (Orlandi et al., vorstehend; SEQ ID NR. 12) und VK1 BACK von M13-Klonen amplifiziert, so dass ihre Übertragung auf chimäre Expressionsvektoren durch die eingeschlossenen Restriktionsstellen erleichtert werden konnte. Die Reaktionsgemische enthielten ungefähr 100 ng M13 ssDNA, jeweils 0,5 uM Primer, jeweils 250 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 20 mM Tris-HCl pH 8, 8, 10 mM KCl, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 mM MgSO&sub4;, 0,1% (v/v) Triton X-100 und 1 Unit Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA, USA.) in 50 ul Gesamtvolumina. Die Proben wurden 10 Zyklen 94ºC, 30 s; 50ºC, 30 s; 75ºC, 1 min unterzogen, gefolgt von zusätzlichen 5 min bei 75ºC. Das VH-Produkt wurde mit PstI und BstEII verdaut und in M13VHPCR1 (Orlandi et al., vorstehend) kloniert. Das VK- Produkt wurde als PvuII-BgII-Fragment in die PvuII- und BcII-Stellen von M13VKPCR1 kloniert (Orlandi et al., vorstehend). Diese Manipulationen dienten dazu, die variablen Regionen hinter den Promotor- und Signalpeptidgensequenzen in den korrekten Kontext zur Expression zu bringen, änderten aber auch einwenig die Reste an ihren Termini:
VH I2 zu V; K5 zu Q; S108 zu T
VK V3 zu Q; L106 zu I
Diese Expressionskassetten wurden vollständig sequenziert, um das Fehlen von Scheinmutationen zu bestätigen, und wurden dann von der M13-RF-DNA als HindIII-BamHI- Fragmente herausgeschnitten. Teilweiser BamHI-Verdau wurde verwendet, so dass Fragmente mit voller Länge, die nicht an den BamHI-Stellen im Inneren der VH und VK geschnitten wurden, erhalten werden konnten. Das VH-Fragment wurde in einen Abkömmling von pSVgpt kloniert (Orlandi et al., vorstehend) welches ein Gen der konstanten Region eines IgG1 des Menschen enthält (Takahashi et al., Cell, 29, S. 671-679, 1982). Das VK-Fragment wurde in pSVhyg kloniert (Orlandi et al., vorstehend), das bereits das Gen der konstanten k-Region des Menschen enthält (Hieter et al Cell, 22, S. 197-207, 1980).
Die Vektoren wurden in das Rattenmyelom YB2/0 cotransfiziert (Kilmartin et al., J. Cell Biol 93, 3 576-582, 1982 (69), erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), unter der Accessionsnr. CRL-1662), wie vorher beschrieben (Tempest et al., vorstehend). Die Mycophenolsäure-resistenten Klone wurden durch ELISA auf Sekretion des IgG-/K-Antikörpers des Menschen abgesucht. ELISA-positive Klone wurden vermehrt, und der Antikörper wurde aus dem Kulturmedium durch Protein A-Affinitäts- Chromatographie gereinigt.
Der chimäre Antikörper, der von den transfizierten Zellen gereinigt wurde, wurde durch ELISA auf das Binden an rekombinantes gp120 (American BioTechnologies Inc., Cambridge, MA, USA) getestet. gp120 (2 ng/100 ul 15 mM Na&sub2;CO&sub3;, 35 mM NaHCO&sub3; pH 9,6 pro Vertiefung) wurde über Nacht bei 4ºC in Immulon 2-Platten (Dynatech) inkubiert. Die Platten wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) - 0,05% Tween 20 gewaschen, mit 5% normalem Ziegenserum (Life Technologies, Paisley, United Kingdom) 1 h lang bei 37ºC geblockt und erneut gewaschen. Antikörper wurden bei verschiedenen Konzentrationen in PBS-0,05% Tween 20 zugegeben und 1 h lang bei 37ºC inkubiert. Nach dem Waschen wurden die k-Ketten von HRPO-konjugierten Ziege anti-Mensch Antikörpern (Sera-Lab Limited, Crawley Down, Sussex, England; 40 ng/100 ul PBS-0,05% Tween 20 pro Vertiefung) zugegeben. Nach 1 h wurden die Vertiefungen gewaschen und bei Gegenwart von o-Phenyldiamin inkubiert, bis sich Farbe entwickelt hatte (5-10 min). Die Absorption wurde bei 492 nm abgelesen.
Die Ergebnisse (Fig. 3) zeigten, dass der chimäre Antikörper (MuVH/MuVK benannt) gegen rekombinantes gp120 reaktiv ist.

Beispiel 3

Erzeugung von humanisierten NM-01-Antikörpern

Humanisierte variable Domänen werden erzeugt, indem die Antigen-Bindungsloops des Elternantikörpers auf variable Gerüstregionen des Menschen übertragen werden. Die Gerüste, die im Fall von NM-01 verwendet wurden, waren solche von NEWH VH (Saul et al., J. Biol Chem., 253, S. 585-597, 1978) und REI VK (Epp et al., Eur. J. Biochem., 45, S. 513- 524, 1974).
Für die humanisierte schwere Kette (HuVH, SEQ ID NR. 13) schloss dies die Übertragung der CDRs, wie durch Kabat et al., vorstehend, definiert, und zusätzliche fünf Reste des Gerüsts ein (Fig. 4A). Die vier Reste vor CDR1 sind nicht hypervariabel und deshalb nicht als Teil der CDR durch Kabat et al., vorstehend, definiert, aber sie sind ein Teil der Loop-Struktur, welche sich vom b-Flattblatt-Gerüst der Domäne erstreckt und folglich die Loopkonformation beeinflussen (Chothia und Lesk, J. Mol. Biol., 196, S. 901-917, 1987). Rest 71 (Kabat-Numerierung) packt sich zwischen die Loops der CDRs 1 und 2 und ist wichtig beim Bestimmen der Konformation von CDR2 (Tramontano et al., J. Mol. Biol., 215, S. 175-182, 1990).
Die grundlegende humanisierte VK (HuVK, SEQ ID NR. 14) enthielt nur die CDR- Sequenzen des Maus-Antikörpers, aber eine zweite Version (HuVKF) schloss zusätzlich den Mausrest, F, an Kabat-Position 71 ein (Fig. 4B). Die Seitenkette der Aminosäure an dieser Position beeinflusst die Konformation von CDR1 (Chothia und Lesk, vorstehend), und die Reversion zum Mausrest hat die Bindungsfähigkeit anderer humanisierter Antikörper positiv beeinflusst (siehe z. B. Foote und Winter, J. Mol. Biol., 224, S. 487-499, 1992).
Die DNA, die die NM-01-CDRs und die vorstehend erwähnten Gerüstreste kodiert, wurde durch ortsgerichtete Mutagenese in die geeigneten Gene der variablen Region des Menschen eingebracht, wie sie in den Abkömmlingen von M13VHPCRI und von M13VKPCR1 (Beispiel 2) enthalten sind.
Der M13-Phage wurde in E. coli Rz1032 (dut&supmin; ung&supmin;) wachsen gelassen, wobei einzelsträngige Matrizen-DNA erhalten wurde, die Uracil statt Thymin enthielt. 0,5 ug DNA wurde mit jeweils 1 umol mutagenem Oligonukleotid und einem Oligonukleotid gemischt, welches sich an die M13-Matrize stromabwärts der Insertions-DNA anlagert. Die Oligonukleotide wurden in 20 ul 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM MgCl&sub2;, 63 mM NaCl an die Matrize angelagert, indem 5 Minuten lang auf 80ºC erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt wurde dATP, dCTP, dGTP und dTTP wurden zu 250 uM Endkonzentration, DTT zu 7 mM, ATP zu 1 mM mit 0,5 Units T7-DNA-Polymerase (United States Biochemical Cleveland, Ohio, USA) und 0,5 Units T4-DNA-Ligase (Life Technologies, Paisley, UK) im selben Puffer zugegeben. Die 30 ul-Reaktion wurde 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert, und die DNA mit Ethanol gefällt. Um den Elternstrang zu schneiden, wurde die DNA in 50 ul 60 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, das 1 Unit Uracil-DNA-Glucosylase (Boehringer Mannheim, Lewis, Sussex, UK) enthielt, gelöst Und bei MaC inkubiert, 1 h bevor NaOH zu 0,2 M zugegeben wurde und die Inkubation 5 min lang bei Raumtemperatur fortgesetzt wurde. Die DNA wurde mit Ethanol gefällt, in 20 ul TE gelöst und das Insertionsfragment durch PCR amplifiziert. Das Reaktionsgemisch enthielt 2 ul mutierte DNA, jeweils 0,5 uM M13-Haupt- und Gegenstrangprimer (forward und reverse primer), jeweils 250 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01% Tween-20, 0,01% Gelatine, 0,01% NP40 und 2 Units Thermalase (IBI, Cambridge, UK) in 50 ul. Die Amplifikation wurde mit 15 Zyklen 94ºC, 30 s; 50ºC, 30 s; 72ºC, 1 min. endend mit 72ºC, 5 min erreicht. Die Produkt-DNAs wurden in M13mp19 als HindIII-BamHI-Fragmente kloniert. Repräsentative Klone wurden sequenziert. Die HindIII-BamHI-Fragmente wurden aus der RF-DNA von genau-mutierten Klonen ausgeschnitten und in die pSVgpt- und pSVhyg- Expressionsvektoren übertragen, beschrieben in Beispiel 2.
Die Transfektion von YB2/0 und ihre Selektion und Expression wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt. HuVH/HuVKF C4 (siehe Beispiel 6) ist ein Beispiel einer YB210- Transfectoma-Zelllinie, welche den NM01-HuVH/HuVK-Antikörper produziert. Ebenso wie Transfektionen, um humanisierte Antikörper (HuVH/HuVK und HuVH/HuVKF) zu ergeben, wurden chimäre und humanisierte Antikörperkettenexpressionsvektoren cotransfiziert, um gemischte Antikörper zu ergeben, welche erlauben würden, dass die Wirksamkeit der humanisierten Ketten einzeln überprüft werden.
Die Antikörper wurden durch Protein A-Agarose-Affinitäts-Chromatographie gereinigt und auf das Binden an rekombinantes gp120 getestet, wie in Beispiel 2 beschrieben (Fig. 3). Das Ergebnis zeigt an, dass die HuVH- und MuVH-Ketten equivalent sind, weil die HuVK- und MuVK-Ketten mit der HuVKF-Kette einen Vorteil vom 2-4fachen ergeben. Dieses legt nahe, dass die humanisierten NM-01-Antikörper (HuVH/HuVK und HuVH/HuVKF) gut an rekombinantes gp120 binden. Die Antikörper wurden auf ähnliche Weise auf ihre Fähigkeit getestet, an Triton X-100-Lysat des MN-Virus und einer Mutante des MN-Virus zu binden (Fig. 5A und B). Die Signalniveaux für die Maus- und rekombinanten Antikörper können nicht verglichen werden, weil unterschiedliche Reporterantikörper verwendet wurden, aber es kann gesehen werden, dass die MuVH/MuVK-, HuVH/HuVK- und HuVH-/HuVKF- Antikörper an das MN-Virus binden, aber nicht an eine Mutante des MN-Virus, an welche NM-01-Maus-mAb nicht bindet.

Beispiel 4

Bestimmung des NM-01 HuVH/HuVKF-Epitops

Das Epitop des humanisierten Antikörpers NM-01-HuVH/HuVKF wurde durch Peptidbindung und kompetitive ELISAs untersucht.

1. ELISA gegen das HIV-1-Peptid

Maus-NM-01 bindet an ein Loop-Peptid, das die Reste 312-326 von HIV-1MN-gp120 darstellt, welches das GPGR-Motiv einschließt.
Das Peptid (synthetisiert durch Multiple Peptide Systems, San Diego, CA, USA) und ein Peptid zur Negativkontrolle, das einen anderen Teil des V3-Loops darstellt (beide 250 ng/100 ul 0,1 M Natriumborat pH 8,0 pro Vertiefung), wurden über Nacht bei 4ºC in Immulon 2-Platten (Dynatech) inkubiert. Die Platten wurden mit PBS-0,05% Tween 20 gewaschen und mit PBS-0,1% Tween 20-0,1% BSA 1 h lang bei Raumtemperatur geblockt. Die Blocklösung wurde entfernt, Verdünnungen von NM-01-Antikörpem in Blocklösung zugegeben und die Inkubation 1 h fang bei 37ºC fortgesetzt. Die Platten wurden gewaschen und HRPO-konjugierte Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (Zymed, San Francisco, CA, USA; 60 ng/Vertiefung) oder HRPO-konjugierte Ziege-anti-Mensch-IgG-Antikörper (Sera-Lab Limited, Crawley Down, Sussex, UK; 40 ng/Vertiefung) zugegeben. Im Anschluss an die 1 h I lange Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten gewaschen und in Gegenwart von o-Phenyldiamin inkubiert, bis sich Farbe entwickelt hatte (etwa 5 min). Die Absorptionen wurden bei 492 nm abgelesen. Die Bindung von NM-01-Antikörpem an die Reste 312-326 des HIV-1 MN gp120-Peptids ist in Fig. 6 gezeigt; keine Bindung wurde beobachtet, wenn das Peptid zur Negativkontrolle verwendet wurde. Es wurde gesehen, dass der NM-01- HuVH/HuVKF-Antikörper an das Peptid mit erhöhter Wirksamkeit bindet, verglichen mit dem chimären (MuVH1MuVK)-Antikörper. Ein direkter Vergleich mit dem Maus-NM-01-Antikörper kann nicht gemacht werden, weil unterschiedliche konjugierte Antikörper verwendet wurden.

2. Kompetitiver ELISA gegen rekombinantes gp120

Platten wurden mit rekombinantem gp120 (5 ng/Vertiefung) beschichtet und, wie in Beispiel 2 beschrieben, geblockt. Verdünnungen von NM-01-Antikörpern oder eines irrelevanten humanisierten Antikörpers wurden in 100 ul/Vertiefung zugegeben und die Platten bei 37ºC 30 min lang inkubiert. Ein biotinylierter Maus-NM-01-Antikörper (500 mg/50ul PBS pro Vertiefung) wurde zugegeben und die Inkubation 1 h lang fortgesetzt. Die Platten wurden mit PBS-0,05% Tween 20 gewaschen, HRPO-Streptavidin (Sera-Lab Limited, Crawley Down, Sussex, UK. 40 ng/100 ul PBS pro Vertiefung) zugegeben und die Inkubation 30 min lang fortgesetzt. Die Platten wurden gewaschen und in Gegenwart von o- Phenyldiamin 5 min lang inkubiert oder bis sich Farbe entwickelte. Die Absorptionen wurden bei 492 nm abgelesen.
Das Ergebnis ist in Fig. 7 gezeigt, wobei direkter Vergleich der Maus- und rekombinanten NM-01-Antikörper möglich ist. HuVH/HuVK ist so wirksam wie das Maus-NM- 01 beim Blockieren der Bindung von markiertem Maus-NM-01-Antikörper. Der HuVH/HuVKF ist ungefähr vierfach aktiver als der Maus-Antikörper, wohingegen der chimäre (MuVH/MuVK)-Antikörper im Verhältnis zum Maus-Antikörper etwas mangelhaft ist - dies liegt vermutlich an den Änderungen, die am Terminus der variablen Region während der Erzeugung des chimären Antikörpers gemacht wurden (Beispiel 2). Der irrelevante humanisierte Antikörper zeigt keine blockierende Aktivität.
Diese beiden Experimente zeigen, dass das Epitop, das durch den humanisierten NM-01 Antikörper, HuVH/HuVKF, erkannt wird, im Wesentlichen, wenn nicht vollständig identisch ist mit dem des Maus-NM-01-Antikörpers.

Beispiel 5

Biologische Aktivität von NM-01 HuVH/HuVKF

Der humanisierte NM-01 Antikörper, HuVH/HuVKF, wurde mit dem Maus-NM-01 verglichen bezüglich der Fähigkeit, eine Infektion von H9-Zellen durch die lebenden HIV-1- Stämme MN und IIIB zu neutralisieren, wie durch Reverse Transkriptase- und p24-Assays gemessen. Die Antikörper wurden auch in einem Syncytiumbildungsassay unter Verwendung des lebenden MN-Virus verglichen.

1. Reverse Transkriptase- und p24-Assays

Verdünnungen der Antikörper wurden mit 100 TCID&sub5;&sub0; von lebendem MN- oder IIIB Virus in Platten mit 96 Vertiefungen 2 h lang bei 4ºC inkubiert. H9-Zellen (2,5 · 105) wurden dann zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden eine weitere Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die H9-Zellsuspension wurde dann in 2 ml RPMI 1640/15% FBS verdünnt und in einer Platte mit 24 Vertiefungen bei 37ºC inkubiert. Die Virusproduktion wurde durch Reverse Transkriptase- (RT) Assay bestimmt, der an Tag 7 durchgeführt wurde, wie in Poiesz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, S. 7415-7419 (1980) beschrieben. Die Gegenwart des p24-Antigens im Gewebekulturüberstand wurde nach 6-8 Tagen durch den HIV-1-p24-Kern-Profil-ELISA quantitativ bestimmt, wobei das durch den Hersteller beschriebene Verfahren verwendet wurde (Du Pont - New England Nuclear). Die Ergebnisse sind in den Fig. 8-12 gezeigt. Beim MN-Stamm wurde 50% Neutralisation der RT-Aktivität mit 1,2 ug/ml Maus-NM-01 oder 0,8 ug/ml NM-01-HuVH/HuVKF erreicht (Fig. 8). Beim IIIB-Stamm betrug der ID&sub5;&sub0; Wert 0,2 ug/ml für Maus-NM-01 und 0,08 ug/ml für NM- 01-HuVH/HuVKF (Fig. 9). Beim p24-Assay erforderte 50% Neutralisation des MN-Virus 1,5 ug/ml Maus-NM-01 oder 0,3 ul/ml NM-01-HuVH/HuVKF (Fig. 10), und 50% Neutralisation des IIIB Virus erforderte 0,15 ug/ml Maus-NM-01 oder 0,08 ug/ml NM-01-HuVH/HuVKF (Fig. 11). Diese Ergebnisse legen dar, dass NM-01-HuVH/HuVKF beim Neutralisieren von MN- und IIIB HIV-1-Stämmen wirksamer ist als der Eltern-Maus-NM-01. Fig. 11 zeigt auch die Neutralisationsaktivität anderer rekombinanter NM-01-Antikörper und des irrelevanten humanisierten Antikörpers (2990,7 HuVH/HuVK), welcher als Negativkontrolle dient. Diese Ergebnisse stützen die des kompetitiven ELISA, welcher nahelegt, dass der chimäre Antikörper (MuVH/MuVK) im Verhältnis zum Maus-NM-01 mangelhaft war. Es wird erneut gesehen, dass der HuVH/HuVK-Antikörper weniger wirksam ist als der HuVH/HuVKF. Das Ergebnis mit dem gemischten Antikörper MuVH/HuVKF zeigt an, dass die humanisierte k- Kette statt der schweren Kette für die überragende Aktivität von HuVH/HuVKF verantwortlich ist, verglichen mit dem Maus-Antikörper.

2. Syncytiumbildungsassays

Der Bindungsinhibitionsassay war eine Abänderung von dem, der vorher in Johnson and Walker, Hrsg., Techniques in HIV-1 Research, Stockton Press, New York, NY, S. 92-97 (1990) beschrieben wurde. H9-Zellen, die chronisch mit dem MN-Virus infiziert wurden, wurden 1 h lang bei 37ºC mit Verdünnungen der Antikörper inkubiert. Zeilen aus der Indikatorzelllinie C8166 wurden dann zugegeben (3 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung) und die Platte 2- 12 h lang bei 37ºC inkubiert. Syncytia, die größer waren als der Zelldurchmesser von drei Lymphozyten, wurden gezählt und verglichen mit dem, was bei infizierten H9-Kontrollzelten erhalten wurde, die in Abwesenheit eines Antikörpers behandelt wurden.
Das Ergebnis ist in Fig. 12 gezeigt und legt dar, dass mit dem NM-01- HuVH/HuVKF-Antikörper ein erhöhtes Inhibitionsniveau erreicht wird, verglichen mit dem Maus-NM-01. Die Negativkontrolle, der humanisierte Antikörper (2990,7), wies keine nachweisbare Wirkung auf.

Beispiel 6

Formulierungen

Die humanisierten Immunglobuline der vorliegenden Erfindung und Arzneimittel davon sind zur parenteralen Verabreichung, z. B. subkutan, intramuskulös oder intravenös besonders nützlich. Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung umfassen typischerweise eine Lösung des humanisierten Immunglobulins, das in einem physiologisch verträglichen Träger, vorzugsweise einem wässriger Träger, gelöst wird. Verschiedene wässrige Träger können verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, 0,3% Glycin und dergleichen. Lösungen zur parenteralen Verabreichung sind vorzugsweise steril und allgemein frei von teilchenförmigem Stoff. Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung können zur einfachen Aufbewahrung lyophilisiert und vor Gebrauch wieder hydratisiert werden. Diese Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung können durch herkömmliche Sterilisationsverfahren sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe enthalten, wenn erforderlich, um physiologischen Bedingungen, wie pH-Einstell- und Puffermittel, toxizitätseinstellende Mittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat und dergleichen, nahe zu kommen. Die Konzentration des humanisierten Immunglobulins in diesen Formulierungen kann weit variieren, d. h. von weniger als etwa 0,5%, aber gewöhnlich bei oder wenigstens etwa 1% bis höchstens 15 Gew.-% oder 20 Gew.-%, und kann in erster Linie ausgewählt werden, bezogen auf Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten, etc., gemäß dem bestimmten Modus der ausgewählten Verabreichung.

Biologische Hinterlegungen

Vor dem Einreichen dieser Anmeldung haben die Anmelder bei der ECACC, die folgende antikörperproduzierende Zellinie, wie hier beschrieben, hintergelegt: HuVH/HuVKF C4 (Accessionsnr. 93082019).
Die Verfügbarkeit des hinterlegten Stamms soll nicht als Lizenz zur Ausübung der Erfindung entgegen den erteilten Rechten unter der Behörde einer Regierung gemäß ihren Patentgesetzen ausgelegt werden.

Claims

1. Humanisierter Antikörper, der spezifisch mit HIV-1 reaktiv ist, umfassend CDRs mit den in den Fig. 1 und 2 im Kasten befindlichen Sequenzen, wobei die CDRs in die Gerüstregionen NEWH VH und REI VK des Menschen übertragen wurden.

2. Humanisierter Antikörper, umfassend variable Regionen mit der in SEQ ID NR. 13 oder SEQ ID NR. 14 gezeigten Aminosäuresequenz.

3. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper eine Gerüstregion mit leichter Kette aufweist, welche an der Kabat-Position 71 modifiziert ist, wobei ein Phenylalanin-Rest (F) substituiert wird.

4. DNA, die einen humanisierten Antikörper nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3 codiert.

5. Zelllinie, die einen humanisierten Antikörper nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3 produziert.

6. Zelllinie HuVH/HuVKF C4, hinterlegt unter der Accessionsnr. ECACC 93082019.

7. Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Antikörpers, umfassend die Schritte des:

(a) Nehmens von CDRs aus den in den Fig. 1 und 2 gezeigten Sequenzen;

(b) Übertragens der CDRs in die Gerüstregionen des Menschen; und

(c) Modifizierens der Gerüstregionen des Menschen an der Kabat-Position 71 in einer Gerüstregion mit leichter Kette, um damit einen Phenylalanin-Rest (F) zu substituieren, wobei Verbesserungen durch den humanisierten Antikörper eine Fähigkeit einschließen, eine Infektion in H9-Zellen durch die lebenden HIV-1-Stämme MN und IIIB zu neutralisieren, wie durch Reverse Transkriptase-, p24- und Syncytiumbildungsassays gezeigt.

8. Therapeutisches Mittel zur Behandlung oder Verhinderung von HIV-1-Infektionen, umfassend einen humanisierten Antikörper nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

9. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren.