DE69233435T2

DE69233435T2 - Vorläufer von für tumorabstossung verantwortlichen antigenen, die antigene und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69233435T2
Application number: DE69233435T
Authority: DE
Inventors: Thierry Boon; Pierre Van Der Bruggen; Benoit Van Den Eynde; Aline Van Pel; Etienne De Plaen; Christophe Lurquin; Patrick Chomez; Catia Traversari
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1991-05-23
Filing date: 1992-05-22
Publication date: 2005-03-03
Anticipated expiration: 2012-05-23
Also published as: DK0595838T3; CA2307317C; WO1992020356A1; PT100515B; JPH06511144A; FI935174A0; CA2307317A1; ATE279514T1; CA2109727C; ES2225818T3; EP0595838B1; IL101963A; NO315051B1; FI117555B; CA2109727A1; JP3484459B2; NO934130L; IL101963A0; NO934130D0; FI935174A

Description

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Immungenetik in der Anwendung beim Studium der Onkologie. Insbesondere betrifft sie die Untersuchung und Analyse von Mechanismen, durch die Tumoren vom Immunsystem des Organismus erkannt werden, wie beispielsweise durch die Präsentation von sogenannten Tumorantigenen und die Expression von den hier so bezeichneten "Tumorantigenvorläufern".
Die Untersuchung der Erkennung oder des Fehlens einer Erkennung von Krebszellen durch einen Wirtsorganismus hat sich in viele verschiedene Richtungen entwickelt. Ein Verständnis des Gebiets setzt gewisse Grundkenntnisse sowohl der Immunologie als auch der Onkologie voraus.
Frühe Forschung an Maus-Tumoren ergab, daß diese Moleküle aufweisen, die zur Abwehr von Tumorzellen führen, wenn sie in syngene Tiere transplantiert wurden. Diese Moleküle werden durch T-Zellen im Empfängertier "erkannt" und provozieren eine Antwort zytolytischer T-Zellen mit Lysis der transplantierten Zellen. Dieser Nachweis wurde zuerst mit Tumoren erhalten, die in vitro durch chemische Karzinogene, wie beispielsweise Methylcholanthren, induziert wurden. Es zeigte sich, daß die von Tumoren exprimierten Antigene, die die T-Zellantwort hervorriefen, für jeden Tumor anders waren. Siehe Prehn et al., J. Natl. Canc. Inst. 18: 769–778 (1957); Klein et al., Cancer Res. 20: 1561–1572 (1960); Gross, Cancer Res. 3: 326–333 (1993), Basombrio, Cancer Res. 30: 2458–2462 (1970) für allgemeine Lehren über die Induktion von Tumoren mit chemischen Karzinogenen und Unterschieden bei Zelloberflächenantigenen. Diese Klasse von Antigenen ist bekannt geworden als "tumorspezifische Transplantationsantigene" oder "TSTAs ("tumor specific transplantation antigens). Nach der Beobachtung der Präsentation solcher Antigene bei Induktion durch chemische Karzinogene wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet, wenn Tumoren in vitro mit ultravioletter Strahlung induziert wurden. Siehe Kripke, J. Natl. Canc. Inst. 53: 333-1336 (1974).
Während T-Zell-vermittelte Immunantworten für die oben beschriebenen Tumorarten beobachtet wurden, wurde angenommen, daß spontane Tumoren grundsätzlich nicht-immunogen sind. Es wurde daher angenommen, daß diese keine Antigene präsentieren, die eine Antwort auf den Tumor in dem tumortragenden Subjekt provozierten. Siehe Hewitt et al., Brit. J. Cancer 33: 241–259 (1976).
Die Familie der tum^–-Antigen-präsentierenden Zellinien sind immunogene Varianten, die durch Mutagenese von Maustumorzellen oder -zellinien, wie von Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184–1193 (1980) beschrieben, erhalten wurden. Genauer gesagt, werden tum^–-Antigene durch Mutieren von Tumorzellen erhalten, die keine Immunantwort in syngenen Mäusen generieren und Tumoren ausbilden (d.h. "tum⁺-Zellen). Wenn diese tum⁺-Zellen mutagenisiert sind, werden sie von syngenen Mäusen abgewehrt und bilden keine Tumoren (daher "tum^–"). Siehe Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 272 (1977), deren Offenbarung hier durch Inbezugnahme aufgenomme ist. Es konnte gezeigt werden, daß viele Tumorarten dieses Phänomen zeigen. Siehe z.B. Frost et al., Cancer Res. 43: 125 (1983).
Es scheint, daß tum^–-Varianten keine fortschreitenden Tumoren ausbilden, weil sie einen Immunabwehrprozeß hervorrufen. Zu den Indizien, die für diese Hypothese sprechen, gehört die Möglichkeit von "tum^–"-Tumorvarianten, d.h. solchen, die normalerweise keine Tumoren bilden, dieses aber doch bei Mäusen mit durch subletale Bestrahlung unterdrücktem Immunsystem zu tun, Van Pel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5282–5285 (1997), sowie die Beobachtung, daß intraperitoneal injizierte Mastozytom-P815-tum^–-Zellen sich exponentiell für 12–15 Tage vermehren und dann in nur wenigen Tagen inmitten eines Zustroms von Lymphozyten und Makrophagen eliminiert werden (Uyttenhove et al., J. Exp. Med. 152: 1175–1183 (1980). Weitere Indizien schließen die Beobachtung ein, daß Mäuse ein Immungedächtnis erwerben, das es ihnen erlaubt, einer nachfolgenden Konfrontation mit derselben tum^–-Variante zu widerstehen, selbst wenn immunsuppressive Strahlungsmengen bei der nachfolgenden Konfrontation verabreicht werden (Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 272–275 (1977); Van Pel et al., s. oben; Uyttenhove et al., s. oben).
Spätere Forschung ergab, daß, wenn spontane Tumoren einer Mutagenese unterzogen wurden, immunogene Varianten gebildet wurden, die eine Antwort hervorriefen. In der Tat waren diese Varianten in der Lage, eine Immunantwort gegen den ursprünglichen Tumor auszulösen. Siehe Van Pel et al., J. Exp. Med. 157: 1992–2001 (1983). Auf diese Weise wurde gezeigt, daß es möglich ist, die Präsentation sogenannter "Tumorantigene" bei einem Tumor hervorzurufen, der ein Ziel für eine syngene Abwehrantwort ist. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn fremde Gene in spontane Tumoren transfiziert wurden. Siehe diesbezüglich Fearson et al., Cancer Res. 48: 2975–1980 (1988).
Es ist eine Klasse von Antigenen erkannt worden, die an der Oberfläche von Tumorzellen präsentiert werden und von zytotoxischen T-Zellen erkannt werden, was zur Lysis führt. Diese Klasse von Antigenen wird im folgenden als "Tumorantigene" oder "TRAs" bezeichnet. TRAs können Antikörperantworten auslösen oder auch nicht. Soweit diese Antikörper untersucht wurden, ist dies durch Charakterisierungsstudien zu zytolytischen T-Zellen in vitro erfolgt, d.h. die Untersuchung der Identifizierung des Antigens durch eine bestimmte Untergruppe von zytotoxischen T-Zellen (im folgenden "CTL"). Die Untergruppe proliferiert bei Erkennung des präsentierten Tumorantigens, und die Zellen, die das Antigen präsentieren, werden lysiert. Charakterisierungsstudien haben CTL-Klone identifiziert, die spezifisch Zellen lysieren, die das Antigen exprimieren. Beispiele dieser Arbeit können in Levy et al., Adv. Cancer Res. 24: 1-59 (1977); Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184–1193 (1980); Brunner et al., J. Immunol. 124: 1627–1634 (1980); Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 124: 1627–1634; Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 12: 406–412 (1982); Palladino et al., Canc. Res. 47: 5074–5079 (1987) gefunden werden. Diese Art von Analysen ist für andere Arten von Antigenen, die durch CTLs erkannt werden, einschließlich Haupthistokompatibilitäts-Antigenen, den männerspezifischen H-Y-Antigenen und einer Klasse von Antigenen, die als "tum^–"-Antigene bezeichnet und hier beschrieben werden, erforderlich.
Ein Tumor, der für den oben beschriebenen Gegenstand beispielhaft ist, ist als P815 bekannt. Siehe DePlaen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2274–2278 (1988); Szikora et al., EMBO J 9: 1040–1050 (1990) und Sibille et al., J. Exp. Med. 172: 34–45 (1990), deren Offenbarung hier durch Inbezugnahme aufgenommen ist. Der P815-Tumor ist ein Mastozytom, induziert mit Methylcholanthren in einer DBA/2-Maus und kultiviert sowohl als In-vitro-Tumor als auch als Zellinie. Die P815-Linie hat nach Mutagenese viele tum^–-Varianten, einschließlich Varianten, die als P91A (DePlaen, s. oben), 35B (Szikora, s. oben) und P198 (Sibille, s. oben) bezeichnet werden, hervorgebracht. Im Gegensatz zu Tumorantigenen – und dies ist ein wesentlicher Unterschied – sind die tum^–-Antigene nur zugegen, wenn die Tumorzellen mutagenisiert wurden. Tumorantigene sind auf Zellen eines gegebenen Tumors ohne Mutagenese vorhanden. Folglich kann, unter Bezugnahme auf die Literatur, eine Zellinie tum⁺ sein, wie die als "P1" bezeichnete Linie, und kann dazu angeregt werden, tum^–-Varianten hervorzubringen. Da sich der tum^–-Phänotyp von dem der Elternzellinie unterscheidet, erwartet man einen Unterschied in der DNA von tum^–-Zellinien im Vergleich zu ihren tum⁺-Elternlinien, und dieser Unterschied kann ausgenutzt werden, um die interessierenden Gene in tum^–-Zellen zu lokalisieren. Als Ergebnis wurde gefunden, daß Gene von tum^–-Varianten wie beispielsweise P91A, 35B und P198 sich von ihren normalen Allelen durch Punktmutationen in den codierenden Bereichen des Gens unterscheiden. Siehe Szikora und Sibille, s. oben, sowie Lurquin et al., Cell 58: 293:303 (1989). Dies ist nachweislich nicht der Fall bei den TRAs der vorliegenden Erfindung. Diese Veröffentlichungen zeigten ebenfalls, daß von tum^–-Antigenen abgeleitete Peptide von dem L^d-Molekül zur Erkennung durch CTLs präsentiert werden. P91A wird durch L^d, P35 durch D^d und P198 durch K^d präsentiert.
Es ist nun gefunden worden, daß die Gene, die für die Moleküle kodieren, die zur Bildung der Präsentations-Tumorantigene (im folgenden als "Tumorantigenvorläufer", "Vorläufermoleküle" oder "TRAPs" bezeichnet) verarbeitet werden, in den meisten normalen adulten Geweben nicht exprimiert werden, jedoch in Tumorzellen exprimiert werden. Gene, die für die TRAPs kodieren, sind nun isoliert und kloniert worden und bilden einen Teil der hier offenbarten Erfindung.
Daß Gen ist nützlich als Quelle für den isolierten und gereinigten Tumorantigenvorläufer und das TRA selbst, die beide sowohl als Mittel zur Behandlung von Krebs, für den das Antigen ein "Marker" ist, als auch bei verschiedenen unten beschriebenen diagnostischen und Überwachungs-Ansätzen hinsichtlich der Onkologie verwendet werden können. Es ist beispielsweise bekannt, daß tum^–-Zellen verwendet werden können, um CTLs zu erzeugen, die sowohl Zellen, die verschiedene tum^– -Antigene präsentieren als auch tum⁺-Zellen lysieren. Siehe z. B. Maryanski et al., Eur. J. Immunol 12: 401 (1982); und Van den Eynde et al., Modern Trends in Leukemia IX (June 1990), deren Offenbarungen hier durch Inbezugnahme aufgenommen sind. Die Tumorantigenvorläufer können in Zellen exprimiert werden, die durch das Gen transfiziert sind, und können anschließend verwendet werden, um eine Immunantwort gegen einen bestimmten Tumor zu erzeugen.
Im parallelen Fall menschlicher Neoplasmen ist beobachtet worden, das autologe gemischte Lymphozyten-Tumor-Zell-Kulturen (im folgenden "MLTC") häufig Responder-Lymphozyten erzeugen, die autologe Tumorzellen lysieren, aber keine Ziele natürlicher Killerzellen, autologen EBV-transformierten B-Zellen oder autologen Fibroblasten lysieren (siehe Anichini et al., Immunol. Today 8:385-389 (1987)). Diese Antwort ist besonders gut bei Melanomen untersucht worden, und MLTCs sind entweder mit peripheren Blutzellen oder mit tumorinfiltrierenden Lymphozyten durchgeführt worden. Literaturbeispiele für dieses Gebiet beinhalten Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2804-2802 (1984); Mukherji et al., J. Exp. Med. 158: 240 (1983); Herin et al., Int. J. Canc. 39: 390–396 (1987); Topalian et al, J. Clin. Oncol 6:839-853 (1988). Stabile zytotoxische T-Zell-Klone (im folgenden "CTLs") sind abgeleitet von MLTC-Responderzellen worden, und diese Klone sind spezifisch für die Tumorzellen. Siehe Mukherji et al., oben, Herin et al., oben, Knuth et al., oben. Die durch diese autologen CTLs auf Tumorzellen erkannten Antigene scheinen keinen Kulturartefakt darzustellen, da sie auf frischen Tumorzellen gefunden werden. Topalian et al., oben; Degiovanni et al., Eur. J. Immunol. 20: 1865–1868 (1990). Diese Beobachtungen haben, zusammen mit den hier verwendeten Techniken zur Isolierung der Gene für spezifische murine Tumorantigenvorläufer, zur Isolierung der Nukleinsäuresequenzen geführt, die für Tumorantigenvorläufer von TRAs, die auf menschlichen Tumoren präsentiert werden, kodieren. Es ist nunmehr möglich, die Nukleinsäuresequenzen zu isolieren, die für Tumorantigenvorläufer kodieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf jene, die am meisten charakteristisch für einen bestimmten Tumor sind, mit Konsequenzen, die unten beschrieben sind. Diese isolierten Nukleinsäuresequenzen für menschliche Tumorantigenvorläufer und deren Anwendungen, wie unten beschrieben, sind ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt isolierte Nukleinsäurenmoleküle bereit. Eine ein isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß dieses Aspekts der Erfindung ist:

(a) ein DNA-Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus den SEQ ID NO: 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 16, 18 und 19, komplementären Sequenzen gleicher Länge und Teilen davon; oder
(b) unter stringenten Bedingungen mit einem DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den SEQ ID NO: 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 16, 18 und 19 und komplementären Sequenzen gleicher Länge, hybridisierbar ist;

Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann eine cDNA, genomische DNA oder ein RNA-Molekül sein. Es kann ebenfalls ein RNA-Transkript eines DNA-Moleküls gemäß der Erfindung sein.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die für ein Polypeptid oder Protein, das, wenn es auf einer Zelloberfläche präsentiert wird, in der Lage ist, eine zytolytische Antwort menschlicher T-Lymphozyten auszulösen, oder einen Vorläufer eines solchen Polypeptids oder Proteins kodiert, das durch ein Nukleinsäuremolekül nach dem ersten Aspekt der Erfindung kodiert wird, oder eine komplementäre Nukleinsäuresequenz gleicher Länge.
Bevorzugt kodiert das isolierte Nukleinsäurenmoleküle gemäß der Erfindung für ein Polypeptid oder Protein, das die in der SEQ ID NO: 26 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfaßt oder ist ein Komplement eines Nukleinsäurenmoleküls gleicher Länge, das für ein Polypeptid oder Protein, das die in der SEQ ID NO: 26 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfaßt, kodiert.
Bevorzugt ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäu remolekül, das eine in den SEQ ID NO: 7, 8, 9 und 11 wiedergegebene Nukleotidsequenz aufweist, oder einer komplementären Nukleotidsequenz gleicher Länge hybridisierbar.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor bereit. Ein Expressionsvektoren gemäß dieses Aspekts der Erfindung umfaßt ein Nukleinsäuremolekül gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung. Das Nukleinsäuremolekül kann funktionsfähig mit einem Promotor verbunden sein und ein Expressionsvektoren gemäß der Erfindung kann ferner eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die für ein Haupthistokompatibilitätsantigen (MHC) oder ein Human-Leukozytenantigen (HLA), ein Zytokin oder ein Bakterien- oder Virengenom oder einen Teil davon kodiert. Das Zytokin kann Interleukin, vorzugsweise IL-2 oder IL-4, sein.
In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung transfizierte Zellen bereit. Eine Zelle gemäß dieses Aspekts der Erfindung den ist mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung oder einem Expressionsvektor gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung transfiziert. Solch eine Zelle kann mit einem Nukleinsäuremolekül transfiziert sein, das für ein MHC oder HLA oder ein Zytokin kodiert.
Vorzugsweise ist eine Zelle gemäß der Erfindung in der Lage, ein MHC oder HLA oder ein Zytokin zu exprimieren, wobei das Zytokin bevorzugt ein Interleukin, besonders bevorzugt IL-2 oder IL-4, ist. Bevorzugte Zellen gemäß der Erfindung sind nicht proliferativ.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung Polypeptide und Proteine bereit. Ein Polypeptid oder Protein gemäß dieses Aspekts der Erfindung ist in der Lage, eine zytolytische Ant wort von menschlichen Lymphozyten auszulösen, oder ist ein Vorläufer für solch ein Polypeptid oder Protein und wird durch ein Nukleinsäuremolekül gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung kodiert. Ein bevorzugtes Polypeptid oder Protein gemäß dieses Aspekts der Erfindung weist eine Nukleinsäuresequenz auf, wie sie in der SEQ ID NO: 26 wiedergegeben ist.
In einem fünften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Viren. Ein Virus gemäß dieses Aspekts der Erfindung enthält ein Nukleinsäuremolekül gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung. Ein Virus gemäß dieses Aspekts der Erfindung kann mutiert oder abgeschwächt sein.
In einem sechsten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper. Ein Antikörper gemäß dieses Aspekts der Erfindung bindet spezifisch ein Polypeptid oder Protein gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung oder einen Komplex aus solch einem Polypeptid oder Protein und einem MHC oder HLA, bindet jedoch nicht an den MHC oder das HLA allein.
Bevorzugten Antikörper gemäß der Erfindung beinhalten monoklonale Antikörper.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, ein Expressionsvektor, eine Zelle, ein Polypeptid, Protein, Virus oder Antikörper gemäß der Erfindung kann zur Verwendung bei der Therapie, Prophylaxe oder Diagnose von Tumoren vorgesehen sein.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen für die Prophylaxe, Therapie oder Diagnose von Tumoren bereit. Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß dieses Aspekts der Erfindung umfaßt ein Nukleinsäuremolekül, einen Expressionsvektor, eine Zelle, ein Polypeptid, ein Protein, einen Virus oder Antikörper gemäß der Erfindung, optional mit Beimischung eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers und optional ferner umfassend einen MHC oder ein HLA.
In einem zusätzlichem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer zytolytischen T-Zell-Kultur bereit, die reaktiv ist gegen autologe Tumorzellen eines Individuums, umfassend den Schritt des Kultivierens einer Probe von Lymphozyten von dem Individuum mit Zellen gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines isolierten Nukleinsäurenmoleküles, eines Expressionsvektors, einer Zelle, eines Polypeptids, Proteins, Virus, Antikörpers oder einer pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe, Therapie oder Diagnose von Tumoren bereit. Bevorzugt schließen solche Tumoren ein Melanom, ein Sarkom und ein Karzinom wie beispielsweise ein kleinzelliges Bronchial-, ein nicht-kleinzelliges Bronchial-, Plattenepithel-, Schilddrüsen-, Dickdarm-, Pankreas-, Prostata-, Brust- oder Kehlkopfkarzinom ein.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Feststellung der Rückbildung, des Fortschreitens oder des Beginns eines Tumors bei einem Individuum bereit, umfassend die Schritte des:

(a) Feststellens der Menge Polypeptid oder Protein gemäß der Erfindung, die in einer Körperflüssigkeits-, Gewebe- oder Tumorprobe von dem Individuum vorhanden ist, optional durch Einsetzen eines Immunassays unter Einbeziehung eines Antikörpers gemäß der Erfindung,
(b) Feststellens der in einer Körperflüssigkeits-, Gewebe- oder Tumorprobe von dem Individuum vorhandenen Zahl zytolytischer T-Zellen, die auf eine Zelle gemäß der Erfindung oder ein Polypeptid oder Protein gemäß der Erfindung reagieren.
(c) Feststellens der in einer Körperflüssigkeits-, Gewebe- oder Tumorprobe von dem Individuum vorhandenen Expression eines Polypeptids gemäß der Erfindung, optional durch Nukleinsäurehybridisierung, bei der ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung als Sonde eingesetzt wird.

Diese und andere Aspekte der Erfindung werden in der folgenden Offenbarung beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt die Detektion von Transfektanten dar, die das Antigen P815A exprimieren.
2 zeigt die Empfindlichkeit der Klone P1.HTR, PO.HTR, der genomischen Transfektanten P1A.T2 und des Cosmid-Transfektanten P1A.TC3.1 gegenüber der Lyse durch verschiedene CTLs, bestimmt durch Chromfreisetzungstests.
3 ist eine Restriktionskarte des Cosmi den C1A.3.1.
4 zeigt die Northern-Blot-Analyse der Expression des Gens P1A.
5 stellt die Struktur des Gens P1A mit seinen Restriktionsstellen dar.
6 zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn Zellen mit dem Gen von P1A, isoliert entweder aus P815 oder normalen Zellen, transfiziert und anschließend auf CTL-Lyse getestet wurden.
7 zeigt Lyse-Untersuchungen unter Verwendung der Mastzellinie L138. 8A.
8 ist eine Karte von Unterfragmenten der Sequenz des 2,4-kb-Antigen-E-Fragments, die ebenfalls das Antigen exprimieren.
9 zeigt die Homologie von Abschnitten des Exons 3 der Gene mage 1, 2 und 3.
10 zeigt die Ergebnisse von Northern-Blots für MAGE-Gene bei verschiedenen Geweben.
11 zeigt die Daten von 13 in tabellarischer Form.
12 zeigt Southern-Blot-Versuche unter Verwendung der verschiedenen humanen Melanomzellinien, die bei dieser Anmeldung eingesetzt worden.
13 ist ein verallgemeinertes Schema zur Expression von MAGE-1, -2 und -3-Genen durch Tumor- und normale Gewebe.
Kurze Beschreibung der Sequenzen

SEQ ID NO: 1 ist cDNA für einen Teil des Gens P1A.
SEQ ID NO: 2 bildet die kodierende Region der cDNA für das Gen P1A.
SEQ ID NO: 3 zeigt nichtkodierende DNA für P1A-cDNA, die 3' zur kodierenden Region der SEQ ID NO: 2 liegt.
SEQ ID NO: 4 ist die vollständige Sequenz der cDNA für P1A.
SEQ ID NO: 5 ist die genomische DNA-Sequenz für P1A.
SEQ ID NO: 6 zeigt die Aminosäuresequenz für die antigenen Peptide für P1A-TRA. Die Sequenz ist für Zellen, die A⁺B⁺ sind, d. h. sowohl das A- als auch das B-Antigen exprimieren.
SEQ ID NO: 7 ist eine Nukleinsäuresequenz, die für das Antigen E kodiert.
SEQ ID NO: 8 ist eine Nukleinsäuresequenz, die für MAGE-1 kodiert.
SEQ ID NO: 9 ist das Gen für MAGE-2.
SEQ ID NO: 10 ist das Gen für MAGE-21.
SEQ ID NO: 11 ist cDNA für MAGE-3
SEQ ID NO: 12 ist das Gen für MAGE-31.
SEQ ID NO: 13 ist das Gen für MAGE-4.
SEQ ID NO: 14 ist das Gen für MAGE-41.
SEQ ID NO: 15 ist cDNA für MAGE-4.
SEQ ID NO: 16 ist cDNA für MAGE-5.
SEQ ID NO: 17 ist genomische DNA für MAGE-51.
SEQ ID NO: 18 ist cDNA für MAGE-6.
SEQ ID NO: 19 ist genomische DNA für MAGE-7.
SEQ ID NO: 20 ist genomische DNA für MAGE-8.
SEQ ID NO: 21 ist genomische DNA für MAGE-9.
SEQ ID NO: 22 ist genomische DNA für MAGE-10.
SEQ ID NO: 23 ist genomische DNA für MAGE-11.
SEQ ID NO: 24 ist genomische DNA für smage-I.
SEQ ID NO: 25 ist genomische DNA für smage-II.

Ausführlichen Beschreibung die bevorzugten Ausführungsformen
Viele verschiedene "MAGE"-Gene sind identifiziert worden, wie anhand der Sequenzen, die der Anmeldung folgen, ersichtlich ist. Die Protokolle, die in den folgenden Beispielen beschrieben sind, wurden verwendet, um diese Gene und cDNR-Sequenzen zu isolieren. "MAGE" wie hier verwendet bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die aus menschlichen Zellen isoliert wurde. Das Akronym "smage" wird verwendet, um Sequenzen murinen Ursprungs zu beschreiben.
Wenn "TRAPs" oder "TRAs" hier als spezifisch für eine Tumorart beschrieben werden, bedeutet dies, daß das betrachtete Molekül mit dieser Art Tumor verbunden ist, wenngleich nicht notwendigerweise unter Ausschluß von anderen Tumorarten.
Beispiel 1
Um das Gen, das für Antigen P815A kodiert, zu identifizieren und zu isolieren, wurde Gentransfektion eingesetzt. Dieser Ansatz erfordert sowohl eine Quelle für das Gen als auch eine Empfängerzellinie. Die hochtransfiziere Zellinie P1.HTR bildete das Ausgangsmaterial für den Empfänger, konnte jedoch nicht ohne weitere Behandlung verwendet werden, da sie "Antigen A" präsentiert, eines von vier erkannten P815-Tumorantigenen. Siehe Van Pel et al., Molecular Genetics 11: 467-475 (1985). Daher wurden Screeningsversuche durchgeführt, um Zellinien zu isolieren, die das Antigen nicht exprimierten und die trotzdem die vorteilhaften Eigenschaften von P1.HTR besaßen.
Hierzu wurde P1.HTR mit CTLs untersucht, die spezifisch für jedes der Tumorantigene A, B, C und D waren. Solche CTLs sind durch Uyttenhove et al., J. Exp. Med. 157:1040–1052 (1983), beschrieben worden.
Um die Selektion durchzuführen, wurden 10⁶ Zellen von P1.HTR in einem Rundboden-Reaktionsgefäß in 2 ml Medium mit 2–4 × 10⁶ Zellen des CTL-Klons gemischt und für drei Minuten bei 150 × g zentrifugiert. Nach vier Stunden bei 37 °C wurden die Zellen gewaschen und in 10 ml Medium resuspendiert, gemäß Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 12: 406–412 (1982). Zusätzliche Informationen zu dem CTL-Test und Screening-Protokoll im allgemeinen könen in Boon et al., J. Exp. Med. 152: 1184-1193 (1980), und Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 12: 406- 412 (1982), deren Offenbarung hierdurch Inbezugnahme aufgenommen ist, gefunden werden.
Bei Durchführung dieser Selektionen wurde eine Zellinien-Variante gefunden, die weder Antigen A noch B exprimierten. Zusätzliche Selektionen mit für Antigen C spezifischen CTLs ergab eine Variante, der auch Antigen C fehlte. Für eine Zusammenfassung der Ergebnisse zu diesen Screenings wird auf 2 verwiesen. Die Variante PO.HTR ist negativ für die antigenen A, B und C, und wurde daher für die Transfektionsversuche ausgewählt.
Die Zellinie PO.HTR wurde gemäß dem Budapester Vertrag beim Institute Pasteur Collection Nationale De Cultures De Microorganismes, 28, Rue de Docteur Roux, 75724 Paris France, hinterlegt und besitzt die Zugriffsnummer 1-1117.
Diese Methodik ist anwendbar, um andere Zellinien zu beschaffen, die Varianten eines Zelltyps sind, der normalerweise mindestens eines der vier erkannten P815-Tumorantigene, d. h. die Antigene A, B, C und D präsentiert, wohingegen die Varianten keines der Antigene A, B und C präsentieren. P1.HTR ist eine Mastozytom-Zellinie, so daß es ersichtlich ist, daß das Protokoll die Isolierung von biologisch reinen Mastozytom-Zellinien ermöglicht, die keines der P815-Antigene A, B und C exprimiert, die jedoch hochtransfizierbar sind. Andere Tumorarten können ebenfalls auf diese Weise untersucht werden, um gewünschte biologisch reine Zellinien zu beschaffen. Die erhaltenen Zellinien sollten mindestens ebenso gut mit fremder DNA transfizierbar sein wie P1.HTR, und sollten so ausgewählt werden, daß sie kein spezifisches Antigen exprimieren.
Beispiel 2
Vorangegangene Arbeiten, die von DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2274–2278 (1988), beschrieben wurden, deren Offenbarung hier durch Inbezugnahme aufgenommen ist, hatten die Wirksamkeit der Verwendung der Cosmid-Bibliothek-Transfektion zur Erlangung von Genen gezeigt, die für tum^–-Antigene kodieren.
Ausgewählte Plasmid-und genomische DNA von P1.HTR wurde gemäß Wölfel et al., Immunogenetics 26: 178–187 (1987), hergestellt. Das Transfektion-Verfahren folgte Corsaro et al., Somatic Cell Molec. Genet 7:603-616 (1981), mit einigen Modifikationen. Kurz gesagt, wurden 60 μg zellulärer DNA und 3 μg DNA des Plasmids pHMR272, beschrieben von Bernard et al., Exp. Cell. Biol. 158:237-243 (1985), gemischt. Dieser Plasmid überträgt Hygromycin-Resistenz auf Empfängerzellen und stellt daher einen geeigneten Weg zum Screening auf Transfektanten bereit. Die gemischte DNA wurde mit 940 μl Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA und 310 μl 1M CaCl₂ kombiniert. Die Lösung wurde langsam und unter ständiger Umwälzung zu 1,25 ml 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HPO₄, eingestellt mit NaOH auf pH 7,1, zugegeben. Für 30–45 Minuten konnten sich bei Raumtemperatur Kalziumphosphat-DNA-Niederschläge bilden. Im Anschluß hieran wurden fünfzehn Gruppen von PO.HTR-Zellen (5×10⁶) pro Gruppe für 10 Minuten bei 400 g zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt und die Niederschläge wurden direkt in dem Medium, das die DNA-Niederschläge enthielt, resuspendiert. Diese Mischung wurde für 20 Minuten bei 37 °C inkubiert, wonach sie zu einer 80-cm²-Gewebekulturflasche mit 22,5 ml DMEM, versetzt mit 10% fötalem Kälberserum, zugegeben wurde. Nach 24 Stunden wurde das Medium ausgetauscht. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen gesammelt und ge zählt. Transfizierte Zellen wurden unter Verwendung von Kulturmedium, versetzt mit Hygromycin B (350 μg/ml) in Massenkultur selektiert. Diese Behandlung selektierte Zellen auf Hygromycin-B-Resistenz.
Für jede Gruppe wurden zwei Flasche vorbereitet, die jeweils 8×10⁶ Zellen in 40 ml Medium enthielten. Um die Anzahl von Transfektanten abzuschätzen, wurden 1×10⁶ Zellen aus jeder Gruppe in 5 ml DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 0,4% Bactoagrar und 300 μg/ml Hygromycin B ausplattiert. Die Kolonien wurden dann 12 Tage später gezählt. Zwei unabhängige Bestimmungen wurden durchgeführt und der Mittelwert gebildet. Dieser wurde mit 5 multipliziert, um die Zahl von Transfektanten in der entsprechenden Gruppe abzuschätzen. Eine Korrektur mußte für die Klonierungseffizienz von P815-Zellen, die bekanntermaßen etwa 0,3 beträgt, vorgenommen werden.
Beispiel 3
Acht Tage nach der Transfektion wie oben in Beispiel 2 beschrieben wurden antibiotikaresistente Transfektanten von toten Zellen unter Verwendung von Dichtezentrifugationen mit Ficoll-Paque abgetrennt. Diese Zellen wurden für 1 bis 2 Tage in nichtselektivem Medium gehalten. Die Zellen wurden in 96-Loch-Mikroplatten (Rundboden) ausplattiert, zu 30 Zellen/Microwell in 200 μl Kulturmedium. Abhängig von der Anzahl der hergestellten Transfektanten wurden irgendwo zwischen 100–400 Microwells hergestellt. Agar-Kolonie-Tests ergaben Schätzungen von 500–3000. Nach 5 Tagen enthielten die Näpfe ungefähr 6×10⁹ Zellen, und parallele Platten wurden durch Transferieren von 1/10 der Näpfe zu Mikroplatten hergestellt, die anschließend bei 30 °C inkubiert wurden. Einen Tag später wurden die Stammplatten zentrifugiert, das Medium wurde ent fernt und 750 CTLs gegen das P815-Antigen A (CTL-P1:5) wurden zusammen mit 10⁶ bestrahlten syngenen Milz-Feederzellen in CTL-Kulturmedium mit 40 U/ml rekombinantem Human-IL2 und HAT-Medium zum Abtöten von Stimulatorzellen zu jedem Napf zugegeben. Sechs Tage später wurden die Platten visuell untersucht, um Näpfe zu identifizieren, in denen die CTLs proliferiert waren. Wenn Platten proliferierende Mikrokulturen zeigten, wurden Teilmengen von 100 μl aus den Näpfen zu einer anderen Platte mit ⁵¹Cr-markierten P1.HTR-Zielzellen (2×10³-4×10³ pro Napf) transferiert und die Chromfreisetzung wurde nach vier Stunden gemessen. Parallele Mikrokulturen entsprechend jenen, die eine hohe CTL-Aktivität zeigen, wurden expandiert und durch Reihenverdünnung in DMEM mit 10% FCS kloniert. Fünf Tage später wurden etwa 200 Klone gesammelt und mit der oben beschriebenen Zellinien CTL.P1:5 in einem visuellen Lyse-Test untersucht. Siehe zu diesen Ergebnissen 1A.
Bei diesen Versuchen ergaben drei von fünfzehn Gruppen von Transfektanten wenige positive Mikrokulturen. Diese Mikrokulturen wurden wie oben beschrieben auf lytische Aktivität gegen P1.HTR getestet. Die meisten Mikrokulturen, bei denen Proliferation beobachtet worden war, zeigten lytische Aktivität. Diese Aktivität lag deutlich über dem Hintergrund, wie in 1B dargestellt ist. Diese Figur faßt Daten zusammen, wobei zwei Gruppen von Zellen (Gruppe "5" und "14"), 400 und 300 Microwells mit 30 hygromycinresistenten transfizierten Zellen angeimpft wurden. Der Amplifikation und Verdopplung der Mikrokulturen folgte die Zugabe der Anti-A-CTL P1:5. Sechs Tage später wurde die lytische Aktivität gegen P1.HTR getestet. In der Figur repräsentiert jeder Punkt lytische Aktivität einer einzelnen Kultur.
Zwei parallele Mikrokulturen, die mehreren positiven Näpfen entsprachen, wurden subkloniert und es zeigte sich, daß mehr als 1% der Subklone durch Anti-A-CTLs lysiert wurden. Auf diese Weise wurden drei unabhängige P815A exprimierende Transfektanten aus 33.000 hygromycinresistenten Transfektanten erhalten. Eine diese Linien, im folgenden als P1A.T2 bezeichnet, wurde weiter untersucht.
Das relevante Antigenprofil von P1A.T2 ist in 2 dargestellt, welches über Anti-CTL-Tests vom oben beschriebenen Typ erhalten wurde.
Beispiel 4
Der für P1A.T2 durchgeführte CTL-Test zeigte, daß es Antigen A präsentierte ("P815A") und daher das Gen für P1.HTR erhalten hatte. Daher wurde diese Zellinie in den folgenden Versuchen als Quelle für das Gen für den Antigenvorläufer verwendet.
Vorangegangene Arbeiten hatten gezeigt, daß Gene, die für tum^–-Antigene kodieren, direkt aus Transfektanten geborgen werden konnten, die mit einer Cosmid-Bibliothek erhalten wurden. Siehe DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2274–2278 (1988). Dieses Verfahren wurde zur Beschaffung des P815-Gens durchgeführt.
Die gesamte genomische DNA von P1A.T2 wurde partiell mit Restriktionsendonuklease Sau 3A1 verdaut und durch NaCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation fraktioniert, um 35-50-kb-DNA-Fragmente gemäß Grosveld et al., Gene 10: 6715–6732 (1982), anzureichern. Diese Fragmente wurden an Cosmid-Arme von C2RB ligiert, wie durch Bates et al., Gene 26: 137–146 (1983), beschrieben, deren Offenbarung hierdurch Inbezugnahme aufgenommen ist. Diese Cosmid-Arme wurden durch Spaltung mit SmaI und Behandlung mit Kälberdarm-Phosphatase sowie anschließender Verdauung mit BamHI erhalten. Die ligierte DNA wurde gemäß Grosveld et al., siehe oben, in Lambda-Phagen-Komponenten verpackt und auf E. coli ED 8767 titriert. Ungefähr 9 × 10⁵ ampicillinresistente Kolonien wurden pro Mikrogramm DNA-Insert erhalten.
Die Cosmid-Gruppen wurden amplifiziert durch Mischen von 30.000 unabhängigen Cosmiden mit 2 ml ED 8767 in 10 mM MgCl₂, 20 Minuten bei 37 °C inkubiert, mit 20 ml in Luria-Bertani("LB")-Medium verdünnt, und anschließend eine Stunde inkubiert. Diese Suspension wurde titriert und zur Beimpfung von 1 Liter LB-Medium in Gegenwart von Ampicillin (50 μg/ml) verwendet. Bei einer Bakterienkonzentration von 2 × 10⁸/ml (OD₆₀₀ = 0,8) wurde eine Teilmenge von 10 ml eingefroren und 200 μg/ml Chloramphenicol wurden für eine Über-Nacht-Inkubation zu der Kultur zugegeben. Die Gesamt-Cosmid-DNA wurde durch alkalische Lyse isoliert und auf einem CsCl-Gradienten gereinigt.
In diesen Versuchen wurde eine Bibliothek von 650.000 Cosmiden hergestellt. Das Amplifikations-Protokoll beinhaltet die Verwendung von 21 Gruppen mit ungefähr 30.000 Cosmiden.
Beispiel 5
Unter Einsatz der oben erwähnten einundzwanzig Gruppen von Cosmiden (60 μg) und 4 μg pHMR272, wie oben beschrieben, wurden Gruppen von 5 × 10⁶ PO.HTR-Zellen als Transfektanten-Wirte verwendet. Die Transfektion wurde in der gleichen Weise durchgeführt wie in den vorangegangenen Versuchen beschrie ben. Durchschnittlich wurden 3.000 Transfektanten pro Gruppe auf Antigen-Präsentation untersucht, erneut unter Verwendung der beschrieben CTL-Tests. Eine Gruppe von Cosmiden ergab wiederholt positive Transfektanten, in einer Häufigkeit von etwa 1/5000 arzneimittelresistenten Transfektanten. Die Transfektanten zeigten wie bei P1A.T2 ebenfalls die Expression sowohl von Antigen A als auch B. Das Expressionsmuster des Transfektanten P1A.TC3.1 ist in 2 dargestellt.
Beispiel 6
Wie in Beispiel 5 oben angegeben, wurden drei unabhängig cosmidtransfizierte Zellen isoliert, die P815A-Antigen präsentieren. Die DNA dieser Transfektanten wurde isoliert und gemäß DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2274–2278 (1988), direkt mit Lambda-Phagen-Extrakten verpackt. Das erhaltene Produkt wurde auf E. coli ED 8767 titriert, mit Ampicillin-Selektion wie in Beispiel 5.gleichermaßen folgte die Amplifikation der Cosmide und die Transfektion Beispiel 5, erneut unter Verwendung von PO.HTR.
Hohe Transfektionsfrequenzen wurden beobachtet, wie in der folgenden Tabelle 1 dargestellt:
Tabelle 1. Transfer der Expression von Antigen P815A durch Cosmide, die durch direktes Verpacken erhalten wurden.
Die Cosmide wurden mit Restriktionsenzymen analysiert und es wurde gefunden, daß der direkt verpackte Transfektant P1A.TC3.1 32 Cosmide enthielt von denen sieben verschieden waren. Jedes dieser 7 Cosmide wurde in der oben beschriebenen Weise in PO.HTR transfiziert und erneut wurden Transfektanten gemäß dem oben beschriebenen Protokoll auf die Präsentation von P815A untersucht. Vier der Cosmid-Transfektanten zeigten P815-Präsentation und, wie bei allen hier beschriebenen Experimenten, wurde P815B coexprimiert.
Von den vier Cosmiden, die eine Präsentation der zwei Antigene zeigten, war das Cosmid C1A.3.1 lediglich 16,7 Kilobasen lang und wurde für weitere Analysen wie unten beschrieben ausgewählt.
Das Cosmid C1A.3.1 wurde einer Restriktionsendonukleasen-Analyse unterzogen, was die in 3 dargestellte Karte ergab.
Alle EcoRI-Fragmente wurden transfiziert, erneut unter Verwendung der oben beschriebenen Protokolle, und lediglich das 7,4-Kilobasen-Fragment bildete einen Transfektanten, der Anti-A-CTLs lysieren konnte. Ähnliche Versuche wurden mit den PstI-Fragmenten durchgeführt und nur ein 4,1-kb-Fragment, das vollständig in dem 7,4-kb-EcoRI-Fragment enthalten war, produzierte lysierbare Transfektanten.
Dieses Fragment (d. h. das 4,1-kb-PstI-Fragment) wurde mit SmaI verdaut und ergab ein 2,3-kb-Fragment, das ebenfalls Wirtszellen ergab, die nach der Transfektion die Antigene A und B präsentierten. Schließlich übertrug auch ein Fragment von 900 Basen Länge, das mit SmaI/XbaI gesichert wurde, die Expression der Vorläufer dieser zwei Antigene, d. h., die transfizierte Wirtszelle präsentierte sowohl Antigen A als auch Antigen B.
Beispiel 7
Das oben beschriebene 900-Basen-Fragment wurde als Sonde zur Feststellung der Expression des P815A-Gens in der Elternzelllinie P1.HTR verwendet. Um dies zu erreichen, wurde zunächst die gesamte zellulärer RNA unter Verwendung des Guanidin-Isothiocyanat-Verfahrens von Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (Elseview Science Publishing Co, New York, 1986) isoliert. Dieselbe Literaturstelle war die Quelle für das Verfahren, das zur Isolierung und Reinigung von PolyA⁺-mRNA unter Verwendung von Oligo-dT-Zellulose-Säulenchromatographie verwendet wurde.
Die Proben wurden dann einer Northern-Blot-Analyse unterzogen. RNA-Proben wurden auf 1%-Agarose-Gelen mit 0,66 M Formaldehyd fraktioniert. Die Gele wurden für 30 Minuten mit 10×SSC (SSC: 0,5 M NaCl; 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) behandelt, bevor über Nacht das Blotting auf Nitrozellulosemem branen durchgeführt wurde. Diese wurden für zwei Stunden bei 80 °C gebacken, wonach die Membranen für 15 Minuten bei 60 °C in einer Lösung enthaltend 10% Dextransulfat, 1% SDS und 1 M NaCl vorhybridisiert wurden. Die Hybridisierung wurde anschließend zusammen mit 100 μg/ml Lachssperma-DNA unter Verwendung einer denaturierten Sonde (das 900-Basen-Fragment) durchgeführt.
Wenn dieses Protokoll unter Verwendung von P1.HTR-Poly-A⁺-RNA durchgeführt wurde, wurden eine Bande von 1,2 kb und zwei schwächere Banden identifiziert, wie in 4, Spur 1 (6 μg der RNA) dargestellt ist.
Dieselbe Sonde wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek zu untersuchen, die aus Poly-A⁺-RNA aus der Zellinie hergestellt wurde. Dies ergab einen Klon mit einem 1-kb-Insert, was auf ein fehlendes 5'-Ende hindeutet. Die Northern-Blots für die cDNA sind nicht dargestellt.
Hybridisierungsexperimente wurden in jedem Fall über Nacht bei 60 °C durchgeführt. Die Blots wurden zweimal bei Raumtemperatur mit 2×SSC und zweimal bei 60 °C mit 2×SSC, versetzt mit 1% SDS, gewaschen.
Die vorangegangenen Experimente grenzten die den P815A-Antigen-Vorläufer exprimierende DNA ausreichend ab, um eine Sequenzierung mit Hilfe des gut bekannten Sanger-Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens zu ermöglichen. Dieses wurde auf Klone angewendet, die unter Verwendung verschiedener Restriktionsendonukleasen und durch spezifisches Priming mit synthetischen Oligonukleotid-Primern erzeugt wurden. Die Ergebnisse für Exons des Gens sind in SEQENZ ID NO: 4 wiedergegeben.
Beispiel 8
Die oben beschriebenen Northern-Analyse deutete darauf hin, daß das 5'-Ende der cDNA fehlte. Um diese Sequenz zu erhalten, wurde cDNA aus P1.HTR-RNA unter Verwendung eines Primers, der den Positionen 320–303 entsprach, hergestellt. Die Sequenz wurde dann unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines 3'-Primers entsprechend den Positionen 286–266 und eines 5'-Primers, der durch Frohman et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002 (1988), beschrieben wurde, amplifiziert. Eine Bande von der erwarteten Größe (270 Basen) wurde gefunden, die mit dem oben beschriebenen 900-bp-SmaI/XbaI-Fragment in einem Southern-Blot hybridisierte. Die anschließende Klonierung in dem eines 3 TG 130 Lambda TG 131, Im Anschluß an die Klonierung in m13tg 130 λ tg 131 wurde das kleine 72-bp-Fragment sequenziert. Die Sequenz ist in der SEQUENZ ID NO: 1 dargestellt.
Beispiel 9
Nach der Beschaffung der in den Beispielen 7 und 8 beschriebenen und in der SEQUENZ ID NO: 4 wiedergegebenen Sequenzen wurde eine 5,7-kb-Region des Cosmids C1A.3.1 sequenziert. Dieses Fragment enthielt bekanntermaßen das 900-Basen-Fragment, welches P815A in den Transfektanten exprimierte. Diese Experimente erlaubte die Abgrenzung von Introns und Exons, da das Cosmid genomischen Ursprungs ist.
Die abgegrenzte Struktur des Gens ist in 5 dargestellt. Zusammen mit der SEQ ID NO: 4 zeigen diese Daten, daß das Gen für den Antigen-Vorläufer, im folgenden als "P1A" bezeichnet, ungefähr 5 Kilobasen lang ist und 3 Exons enthält. Ein ORF für ein Protein aus 224 Aminosäuren beginnt in Exon 1 und en det in Exon 2. Das 900-Basenpaar-Fragment, welches die Expression des Vorläufers für die Antigene A und B überträgt, enthält lediglich Exon 1. Die Promotorregion enthält eine CAAT-Box, wie in der SEQ ID NO: 1 angegeben, und eine Enhancer-Sequenz. Diese letztere Eigenschaft ist in Promotoren der meisten MHC-Klasse-I-Gene beobachtet worden, wie von Geraghty et al., J. Exp. Med 171: 1–18 (1990); Kimura et al., Cell 44:261-272 (1986), beobachtet wurde.
Eine Computer-Homologierecherche wurde unter Verwendung des Programms FASTA mit K-Tripel-Parametern von 3 und 6, wie von Lipman et al., Science 227:1435-1441 (1985), vorgeschlagen und unter Verwendung der Genbank-Datenbank Version 65 (Oktober 1990) durchgeführt. Es wurde keine Homologie gefunden, mit Ausnahme für eine Strecke von 95 Basen, die einem Teil eines durch Exon 1 (Positionen 524–618) kodierten sauren Bereichs entspricht, der Sequenzen ähnlich ist, die für die sauren Bereiche im Kernprotein NO38/B23 der Maus kodiert, wie durch Bourbon et al., Mol. Biol. 200:627-638 (1988), und Schmidt-Zachmann et al., Chromosoma 96:417-426 (1988), beschrieben. Sechsundfünfzig von 95 Basen waren identisch. Um zu testen, ob diese Homologie die Ursache für die Kreuzhybridisierung waren, wurden Experimente unter Verwendung einer Maus-Milz-cDNA-Bibliothek durchgeführt, die mit dem 900-Basen-Fragment gescreent wurde. Es wurden cDNA-Klone erhalten, die den Größen der kreuzhybridisierenden Banden nahezu entsprachen. Diese wurden teilweise sequenziert, und es wurde gefunden, daß die 2,6-kb-cDNA exakt der bekannten cDNA-Sequenz von Maus-Nukleolin entsprach, während das 1,5-kb-cDNA dem Maus-Kernprotein NO38/B23 entsprach.
Die Analyse der Nukleotidsequenz des Gens, im folgenden als "P1A" bezeichnet, deutet darauf hin, daß sein kodiertes Pro dukt eine Molekulargewicht von 25 kDa aufweist. Die Analyse der SEQENZ ID NO: 4 zeigt zeigt ein potentielles Kern-Lokalisierungssignal bei den Resten 5–9 (Dingwall et al., Ann. Rev. Cell Biol. 2:367-390 (1986)), sowie eine große saure Domäne an den Positionen 83–118. Wie oben angegeben, enthält diese den Homologiebereich zwischen P1A und den zwei Kernproteinen. Eine mutmaßliche Phosphorylierungsstelle kann an Position 125 (Serin) gefunden werden. Ebenso wird eine zweite saure Domäne in der Nähe des C-Terminus als ununterbrochene Kette von 14 Glutamat-Resten gefunden. Eine ähnliche C-terminale Struktur wurde von Kessel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5306-5310 (1987), in einem murinen Homeodomänen-Protein mit Kernlokalisierung gefunden.
In Studien, die die Sequenz des Gens P1A mit den Sequenzen für P91A, 35B und P198 vergleicht, wurden keine Ähnlichkeiten gefunden, was zeigt, daß P1A ein Beispiel für eine andere Klasse von Genen und Antigenen ist.
Beispiel 10
Mit der P1A-Sonde und -sequenz in der Hand wurden Untersuchungen durchgeführt, um festzustellen, ob das in normalem Gewebe vorhandene mit dem durch den Tumor exprimierten Gen identisch war. Um dies zu tun, wurden unter Verwendung von den Lambda zapII 10 und genomischer DNA von murinen DBA2-Nierenzellen Phagen-Bibliotheken hergestellt. P1A wurde als Sonde verwendet. Die Hybridisierungsbedingungen waren wie oben beschrieben, und ein Hybridisierungsklon wurde gefunden. Der Klon enthielt Exons eins und zwei des P1A-Gens und entsprach den Positionen –0,7 bis 3,8 in 5. Im Anschluß an die Lokalisierung dieser Sequenz wurde eine PCR-Amplifikation durchgeführt, um die Sequenz zu erhalten, die 3,8 bis 4,5 in 5 entspricht.
Eine Sequenzanalyse wurde durchgeführt und es wurden keine Unterschiede zwischen den Genen von normalen Nieren und dem aus P815-Tumorzellen erhaltenen P1A-Gen festgestellt.
In weiteren Versuchen wurde das in DBA/2-Nierenzellen gefundene Gen wie oben beschrieben in PO.HTR transfiziert. Diese Versuche, betrifft in 7 dargestellt, zeigten, daß die Antigene A und B durch das aus normalen Nierenzellen isolierte Nierengen genauso effizient exprimiert wurde wie das aus normalen Nierenzellen isolierte P1A-Gen.
Diese Versuche führen zu der Schlußfolgerung, daß das Gen, das für den Tumorantigenvorläufer kodiert, ein Gen ist, daß nicht auf eine Mutation zurückzuführen ist; es scheint vielmehr, daß das Gen dasselbe ist, das in normalen Zellen anwesend ist, dort jedoch nicht exprimiert wird. Die Auswirkungen dieses Befundes sind wichtig und werden unten diskutiert.
Ähnliche nicht beschriebenen Studien wurde gefunden, das Varianten des Gens erhältlich waren. Einige Zellen waren "P1A^– B⁺" statt des normalen "P1A". Der einzige Unterschied zwischen diesen ist eine Punktmutation in Exon 1, wobei das 18. Triplett in der Variante für Ala statt Val kodiert.
Beispiel 11
Zusätzliche Versuche wurden mit anderen Zellarten durchgeführt. Gemäß den Protokollen, die oben für die Northern-Blot-Hybridisierungen beschrieben wurden, wurde RNA aus normalen Leber- und Milzzellen getestet, um festzustellen, ob ein Transkript des P1A-Gens gefunden werden konnte. Die Northern-Blot-Daten sind in 4 dargestellt, und, wie ersichtlich ist, gibt es keine Hinweis auf eine Expression.
Die murine P815-Zellinie, aus der P1A isoliert wurde, ist ein Mastozytom. Daher wurden Mastzellinien studiert, um festzustellen, ob sie das Gen exprimierten. Die Mastzellinie MC/9, beschrieben durch Nabel et al., Cell 23: 19–28 (1981), und Kurzzeitkulturen von aus Knochenmark erhaltenen Mastzellen wurden in der oben beschriebenen Weise getestet (Northern-Blotting), es wurde jedoch kein Transkript gefunden. Im Gegensatz hierzu wurde ein starkes Signal gefunden, wenn eine Balb/C-abgeleitete IL-3-abhängige Zellinie L138.8A (Hultner et al., J. Immunol. 142:3440-3446 (1989)) getestet wurde. Die Mastzell-Arbeit ist in 4 dargestellt.
Es ist bekannt, daß sowohl BALB/C- als auch DBA/2-Größen den H-2^d-Haplotyp gemeinsam haben, und es war daher möglich, die Empfindlichkeit gegenüber Lyse unter Verwendung der oben beschriebenen CTLs zu untersuchen. 8 zeigt diese Ergebnisse, die im wesentlichen beweisen, daß Anti-A- und Anti-B-CTLs die Zellen stark lysierten, wohingegen Anti-C und Anti-D-Linien dies nicht taten.
Weitere Tests wurden bei anderen murinen Tumorzellinien durchgeführt, d. h. bei der Teratokarzinom-Zellinie PCC4 (Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 272–275 (1977), und den Leukämien LEC and WEHT-3B. In keiner dieser Proben konnte Expression nachgewiesen werden.
Beispiel 12
Die tatsächliche Präsentation des P1A-Antigens durch MHC-Moleküle war von Interesse. Um dieses untersuchen, wurde das Cosmid C1A.3.1 in die Fibroblasten-Zellinie DAP transfiziert, die den Phänotyp H–2^k aufweist. Die Zellinien wurden mit Genen transfiziert, die eines der K^d, D^d und L^d-Antigene exprimieren. Im Anschluß an die Transfektion mit sowohl dem Cosmid als auch dem MHC-Gen wurde die Lyse mit CTLs untersucht, erneut wie oben beschrieben. Diese Studien, die in Tabelle 2 zusammengefaßt sind, zeigen, daß L^d für die Präsentation der P1A-Antigene A und B erforderlich ist.
Tabelle 2 H-2-Restriktion der Antigene P815A und P815B
Die Beobachtung, daß man die Präsentation eines Tumorantigens mit bestimmten MHC-Moleküle in Verbindung bringen kann, wurde in Experimenten mit menschlichen Zellen und HLA-Molekülen bestätigt, wie unten näher ausgeführt.
Beispiel 13
Unter Verwendung sowohl der Sequenz des P1A-Gens als auch der daraus ableitbaren Aminosäuresequenz wurden antigene Peptide, die A⁺ B⁺ waren (d. h. charakteristisch für Zellen, die sowohl die A- als auch B-Antigene exprimieren) und solche, die A^– B⁺ sind, identifiziert. Das Peptid ist in 10 dargestellt. Dieses Peptid führte bei Verabreichung an Proben von PO.HTR-Zellen in Gegenwart von CTL-Zellinien, die spezifisch sind für Zellen, die es präsentieren, zur Lyse der PO.HTR-Zellen, was die Ansicht stützt, daß Peptide auf Basis des durch das Gen exprimierten Produkts als Impfstoff verwendet werden können.
Beispiel 14
Die im folgenden als MZ2-MEL bezeichnete menschliche Melanomzellinie ist keine klonale Zellinie. Sie exprimiert vier stabile Antigene, die durch autologe CTLs erkannt werden, bekannt als Antigene "C, E, F und A". Darüber hinaus werden zwei andere Antigene "B" und "C" durch einige Unterlinien des Tumors exprimiert. CTL-Klone, die spezifisch für diese sechs Antigene sind, werden von Van den Eynde et al., Int. J. Canc. 44: 634–640 (1989), beschrieben. Unter den erkannten Subklonen vom MZ2-MEL sind MEL.43, MEL3.0 und MEL3.1. (Van den Eynde et al., oben). Die Zellinie MEL3.1 exprimiert das Antigen E, wie durch CTL-Untersuchungen, wie die für die P815-Varianten oben beschriebenen, festgestellt wurde, so daß es als Quelle für die Nukleinsäuresequenz ausgewählt wurde, die den Antigenvorläufer exprimiert.
Bei der Isolierung der entsprechenden Nukleinsäuresequenz für einen Tumorantigenvorläufer zeigten die oben entwickelten Techniken, daß eine Empfängerzelle erforderlich ist, die zwei Kriterien erfüllt: (ii) die Empfängerzelle darf den interessierenden TRAP unter normalen Bedingungen nicht exprimieren und (ii) muß sie das relevante Klasse-I-HLA-Molekül exprimieren. Darüber hinaus muß die Empfängerzelle eine hohe Transfektionsfrequenz aufweisen, d. h. sie muß ein "guter" Empfänger sein.
Um eine solche Zellinie zu bergen, wurde die klonale Unterlinie ME3.1 wiederholter Selektion mit Anti-E-CTL-82/30 wie durch Van den Eynde, s. oben, beschrieben, unterzogen. Die wiederholten Selektionszyklen führten zur Isolierung des Subklons des MZ2-MEL-2.2 isc E^–. Dieser Subklon ist ebenfalls HPRT^– (d. h. empfindlich gegenüber HAT-Medium: 10^–4 M Hypoxanthin, 3, 8 × 10^–7 Aminopterin, 1, 6 × 10^–5 M 2-Desoxythymidin hat). Der Subklon unter wird zur Vereinfachung im folgenden als "MEL-2.2"bezeichnet.
Beispiel 15
Die genomische DNA von MEL 3.0 wurde nach Wölfel et al., Immunogenetics 26:178-187 (1987), hergestellt, deren Offenbarung hier durch Inbezugnahme aufgenommen ist. Der Plasmid pSVtkneoß, wie von Nicolas et al., Cold Spring Harb., Conf. Cell Prolif. 10:469-485 (1983) beschrieben, vermittelt Geneticin-Resistenz, so daß er als Marker für die Cotransfektion wie in diesem Experiment verwendet werden konnte.
Nach einem Verfahren, das dem von Corsao et al., Somatic Cell Molec. Genet 7:603-616 (1981), ähnelte, jedoch nicht damit identisch war, wurden die gesamte genomische DNA und der Plasmid cotransfiziert. Die genomische DNA (60 μg) und die Plasmid-DNA (6 μg) wurden in 940 μl 1 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, gemischt, wonach 310 μl 1 M CaCl₂ zugegeben wurden. Diese Lösung wurde langsam unter ständiger Umwälzung zu 1,25 ml 2×HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HO₄, mit NaOH auf pH 7,1 eingestellt) zugegeben. Die Kalziumphosphat-DNA-Niederschläge konnten sich über 30–45 Minuten bei Raumtemperatur bilden, wonach sie in 80 cm² Gewebekulturkolben, gegeben wurden, die 24 Stunden vorher mit 3×10⁶ MEL2.2-Zellen in 22,5 ml Melanomkulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium), versetzt mit 10% fötalem Kälberserum, angeimpft worden waren. Nach 24 Stunden wurde das Medium ersetzt. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und zu 4×10⁶ Zellen pro 80-cm²-Kolben in Melanomkulturmedium, versetzt mit 2 mg/ml Geneticin, angeimpft. Das Geneticin dient als Selektionsmarker.
Beispiel 16
Dreizehn Tage nach der Transfektion wurden geneticinresistente Kolonien gezählt, geerntet und für 2 oder 3 Tage in nichtselektivem Medium kultiviert. Transfizierte Zellen wurden dann in 96-Napf-Mikroplatten zu 200 Zellen/Napf im 200 μl Kulturmedium mit 20% fötalem Kälberserum (FCS) ausplattiert, um ungefähr 30 wachsende Kolonien pro Napf zu erhalten. Die Zahl der Mikrokulturen war darauf ausgelegt, Redundanz zu erzeugen, d. h. so daß jeder unabhängige Transfektant mindestens viermal vertreten sein sollte.
Nach 10 Tagen enthielten die Näpfe ungefähr 6×10⁴ Zellen. Diese Zellen wurden abgelöst und 1/3 jeder Mikrokulturen wurde auf eine zweite Platte übertragen. Nach 6 Stunden, d.h. nach Wiederanheftung, wurde das Medium entfernt und 1500 Anti-E-CTL (CTL 82/30) wurden zu jedem Napf in 100 μl CTL-Kulturmedium mit 35 U/ml IL-2 zugegeben. Einen Tag später wurde der Überstand (50 μl) geerntet und aus Gründen, die in dem folgenden Beispiel erläuter werden, auf die Konzentration von TNF untersucht.
Beispiel 17
Die Größe des Säugetiergenoms beträgt 6×10⁶ kb. Da erwartet wurde, daß die durchschnittliche Menge von in jedem arzneimittelresistenten Transfektanten integrierter DNA etwa 200 kb beträgt, würde ein Minimum von 30.000 Transfektanten untersucht werden müssen, um festzustellen, ob Antigen E transfiziert wurde. Vorangegangene Arbeiten mit murinen Zellen hatten gezeigt, daß bei Verwendung eines CTL-Stimulationstests Gruppen identifiziert werden konnten, die lediglich 3% Zellen enthielten, die das interessierende Antigen exprimieren. Dies sollte die Anzahl von Tests um ein Faktor von 30 reduzieren. Während ein Ariti-E-CTL-Test, wie oben beschrieben, bei gemischten E⁺/E^–-Zellen hilfreich war, war er jedoch dahingehend nicht ausreichend, daß keine konsistenten Ergebnisse erhalten werden konnten.
Im Ergebnis wurde ein alternativer Test entwickelt. Die Stimulation von CTLs wurde durch Freisetzung des Tumornekrosefaktors ("TNF") unter Verwendung gut bekannter Verfahren, die hier nicht wiederholt werden müssen, untersucht. Wie in Beispiel 15 beschrieben, waren 1500 CTL-82/30-Zellen pro Napf mit Transfektanten zugegeben worden. Diese CTLs wurden 6 Tage nach der Stimulation gesammelt. Wie oben angegeben, wurden die CTLs und IL-2 hierzu zugegeben, nachdem 1/3 der Zellen in jedem Napf entfernt worden waren und die verbliebenen 2/3 (4×10⁴) sich wieder angeheftet hatten. Die 50 μl Überstand wurden 24 Stunden später entfernt und auf eine Mikroplatte mit 3×10⁹ W13-(WEHI-164-Klon 13; Espevik et al., J. Immunol.
Meth. 95: 99–105 (1986))-Zellen in 50 μl W13-Kulturmedium (RPMI-1640, versetzt mit L-Arginin (116 mg/l), L-Asparagin (36 mg/l), L-Glutamin (216 mg/l) und 10% FCS, versetzt mit 2 μg Aktinomycin D zu 37% in einer 8% CO₂-Atmosphäre transferiert. Die Zellinie W13 ist eine Maus-Fibrosarkom-Zellinie, die empfindlich gegenüber TNF ist. Verdünnungen von rekombinantem TNF-β in PPMI 1640 wurden zu Zielzell-Kontrollen zugegeben.
Die W13-Kulturen wurden nach 20 Stunden Inkubation ausgewertet und der Prozentanteil toter Zellen wurde anhand eines angepaßten kolorimetrischen Tests von Hansen et al., J. Immunol. Meth. 119: 203–210 (1989) gemessen. Dieser beinhaltet die Zugabe von 50 ml 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid zu 2,5 mg/ml in PBS, mit anschließender Inkubation bei 37 °C für zwei Stunden. Dunkelblaue Formazan-Kristalle wurden durch Zugabe von 100 μl Lyse-Lösung (ein Volumen N,N-Dimethylformamid, gemischt bei 37 °C mit zwei Volumen Wasser, enthaltend 30% (Gewicht/Volumen) Natriumdodecylsulfat, bei pH 4,7 aus 1,6% Essigsäure und 2,5% 1N HCl) gelöst. Die Platten wurden bei 37 °C über Nacht inkubiert und die ODs wurden bei 570 nm unter Verwendung von 650 nm als Kontrolle ermittelt. Der Prozentanteil toter Zellen wurde nach der folgenden Formel gemäß Espevik et al., J. Immunol. Meth. 95:99-105 (1986), ermittelt:
Die Ergebnisse zeigten, daß selbst dann, wenn das Verhältnis von E⁺/E^–-Zellen so niedrig war wie 1/45, eine signifikante Bildung von TNF beobachtet wurde, was aktive CTLs anzeigt.
Dies führte zur Entscheidung, die arzneimittelresistenten Transfektanten in Gruppen von 30 zu testen.
Beispiel 18
Zellen wurden auf TNF-Bildung wie in Beispiel 17 oben beschrieben, getestet. Insgesamt 100 Gruppen von E^–-Zellen (4×10⁶ Zellen/Gruppe) wurden im Anschluß an die Transfektion untersucht, und 7×10⁴ unabhängige geneticinresistente Transfektanten wurden erhalten, bei einem Durchschnitt von 700 pro Gruppe. Nur eine Gruppe von transfizierten Zellen führte zu einer Mikrokultur, die den Anti-E-Antigen-CTL-Klon-82/30 dazu veranlaßte, TNF zu bilden. Von 300 Klonen getesteten Klonen waren 8 positiv. Diese Klone wurden dann unter Verwendung des Standard-⁵¹Cr-Freisetzungstests auf Lyse durch Anti-E-CTL getestet, und zeigten, daß sie ebenso wirksamen lysiert werden konnten wie die Original-E⁺-Zellinie. Der hier beschriebenen Transfektant E.T1 wies das gleiche Lyse-Muster auf wie MEL2.2 für CTLs gegen die Antigene B, C, D und F.
Die Tatsache, daß lediglich ein Transfektant aus 70.000 geneticinresistenten Transfektanten das Antigen präsentierte, mag auf den ersten Blick sehr niedrig erscheinen, ist es jedoch nicht. Die oben beschriebene Arbeit für P815 zeigte eine durchschnittliche Frequenz von 1/13.000. Der Human-DNA-Empfänger MEL 2.2 scheint 5 Mal weniger DNA zu integrieren als P1.HTR.
Beispiel 19
Nachdem der Transfektant E.T1 einmal gefunden war, mußte die Analyse mehrere Fragen behandeln, einschließlich derjenigen, ob ein E⁺-Kontaminant der Zellpopulation die Ursache war. Die oben beschriebene Analyse der Antigen-Präsentation zeigt, daß E.T1 B^– und C^– ist, genau wie die Empfängerzelle MEL2.2. Er erwies sich unter Anwendung von Standard-Selektionsverfahren auch als HPRT^–. Alle in der vorliegenden Arbeit verwendeten E⁺-Zellen waren jedoch HPRT⁺.
Es auch möglich, daß ein E⁺-Revertant von MEL2.2 die Quelle für E.T1 war. Um dies zu testen, wurde die Beobachtung von Perucho et al., Cell 22:309-317 (1980), eingesetzt, wonach cotransfizierte Sequenzen üblicherweise zusammen an einer einzelnen Stelle des Empfängergenoms integrieren. Wenn Antigen E in einem Transfektanten auf Cotransfektion mit pSVtkneoß zurückzuführen ist, dann sollten die Sequenzen verknüpft sein und die Deletion des Antigens könnte ebenfalls die benachbarten pSVtkneoβ-Sequenzen entfernen. Wölfel et al., s. oben, haben gezeigt, daß dies zutrifft. Wenn eine normalerweise E^–-Zelle mit pSVtkneoß transfiziert wird, dann sollten die Sequenzen verknüpft sein und die Deletion Deletion des Antigens könnte auch die benachbarten pSVtkneoβ-Sequenzen entfernen. Wenn eine normalerweise E⁺-Zelle, die mit pSVtkneoß transfiziert ist, E.T1 ist, sollte "Co-Deletion" jedoch nicht auftreten. Um dies zu testen, wurde der Transfektant E.T1 wie oben beschrieben einer Immunselektion mit 82/30 unterzogen. Zwei Antigen-Verlustvarianten wurden beobachtet, die der Lyse durch diesen CTL widerstanden. Keine davon hatte die Geneticin-Resistenz verloren, Southern-Blot-Analyse zeigte jedoch den Verlust mehrerer neo^r-Sequenzen in den Varianten, was eine enge Verknüpfung zwischen dem E-Gen und dem neo^r-Gen in E.T1 zeigt, was zu der Schlußfolgerung führt, daß E.T1 ein Transfektant war.
Beispiel 20
Der E⁺-Subklon MZ2-MEL 4B wurde als Quelle für DNA zur Herstellung einer Cosmid-Bibliothek verwendet. Diese Bibliothek von beinahe 700.000 Cosmiden wurde gemäß den oben beschriebenen Cosmid-Transfektions-Protokollen in MZ2-MEL2.2-Zellen transfiziert.
Durch Verpacken der DNA der Cosmid-Transfektanten direkt in Lambda-Phasen-Komponenten ist es manchmal möglich, Cosmide zu erhalten, die die interessierenden Sequenzen enthalten. Dieses Verfahren war hier nicht erfolgreich, so daß wir die transfizierte Sequenz durch Ligieren von DNA des Transfektanten an geeignete Restriktionsfragmente des Cosmid-Vektors pTL6 sicherten. Dies wurde mit zwei Transfektanten versucht und war bei einem von ihnen erfolgreich. Ein Cosmid, als P3 bezeichnet, wurde aus diesem Experiment erhalten und einem Restriktionsendonukleasen-Verdau via XmaI oder durch BamHI-Verdau eines großen, 12-kb-XmaI-transfizierten Fragments unterzogen. Die Fragmente wurden in den Vektor pTZ 18R kloniert und dann in MEL2.2 transfiziert. Erneut wurde die TNF-Bildung gemessen, wodurch eine erfolgreiche Transfektion festgestellt wurde. Diese Experimente führten zu der Bestimmung einer Gensequenz, die in der Lage ist, Antigen E auf dem 12-kb-XmaI-Fragment und dann auf dem 2,4-kb-Fragment des BamHI-Verdaus des 12-kb-Segments zu transfizieren.
Das 2,4-kb-Fragment hybridisiert mit einem 2,4-kb-Fragment aus MZ2-MEL und mit einem T-Zell-Klon des Patienten MZ-2, wie durch Southern-Blots (BamHI/SmaI-verdaute DNA) festgestellt wurde. Die Bande fehlt bei E^–-Antigen-Verlustvarianten von MZ2-MEL, wie aus 12 ersichtlich ist.
Die Sequenz für das E-Antigenvorläufergen ist bestimmt worden und wird hier wiedergegeben:
Beispiel 21
Nachdem das 2,4-kb-Genomsegment identifiziert wurde, wurden Untersuchungen durchgeführt, um festzustellen, ob eine "E⁺"-Unterlinie irgendeine homologe DNA exprimierte. Die Zellinie MZ2-MEL 3.0 wurde als Quelle verwendet und eine cDNA-Bibliothek wurde unter Anwendung bekannter Techniken aus seiner mRNA hergestellt. Das 2,4-kb-Segment wurde als Sonde verwendet und mRNA von etwa 1,8 kb wurde unter Anwendung von Northern-Blot-Analyse als homolog identifiziert. Wenn cDNA gescreent wurde, wurden Klone erhalten, die nahezu vollständige Identität zu Teilen des 2,4-kb-Fragments aufwiesen. Zwei Exons wurden auf diese Weise identifiziert. Ein weiteres Exons wurde stromaufwärts von diesen lokalisiert, via Sequenzierungssegmenten des Cosmids 3, die vor dem 2,4-kb-BamHI-Fragment lokalisiert waren. Das Gen erstreckt sich über etwa 4,5 kb, wie in 8 dargestellt. Der Startpunkt der transkribierten Region wurde unter Verwendung von PCR für das 5'-Ende der cDNA bestätigt. Die drei Exons umfassen 65, 73 und 1551 Basenpaare. Ein ATG ist an Position 66 von Exon 3 lokalisiert, gefolgt von einem Leseraster mit 828 Basenpaaren.
Beispiel 22
Um festzustellen, ob die kleineren Segmente des 2,4-kb-Fragments die Expression des Antigens E übertragen konnten, wurden unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken kleinere Stücke, die dem größeren Gen entsprechen, hergestellt und in E^–-Zellen übertragen. 8 zeigt die Grenzen der drei Segmente.
Der Transfer der Antigenexpression auf diese Weise zeigt, daß das Gen statt für ein Protein, das das Antigen aktiviert, für den Antigenvorläufer kodiert.
Beispiel 23
Die oben beschriebene Untersuchung von cDNA förderte überraschend zwei verschiedene, aber nahe verwandte cDNAs zu Tage. Diese cDNAs übertrugen beim Test keine Expression von Antigen E, zeigen jedoch beträchtliche Homologie mit dem ersten cDNA-Segment. Die drei Segmente scheinen auf eine neu erkannte Familie von Genen, die als "MAGE" für "Melanomantigen" bezeichnet wird, hinzudeuten. In 9 steuert "mage –1" die Expression des Antigens aus MZ2-Zellen. Teile des dritten Exons von jedem Gen sind in 9 dargestellt. Die zweiten und dritten Sequenzen sind miteinander untereinander verwandt als die erste (18,1 und 18,9% Unterschied im Vergleich zur ersten; 12% untereinander). Von 9 erhaltenen cDNA-Klonen wurden drei von jedem Typ erhalten, was auf gleiche Expression hindeutet. "MAGE", wie hier im folgenden verwendet, bezieht sich auf eine Familie von Molekülen und die hierfür kodierenden Nukleinsäuren. Diese Nukleinsäuren haben einen bestimmten Grad von Homologie gemeinsam und werden in Tumorzellen, einschließlich mehrerer Arten von menschlichen Tumorzellen, sowie in menschlichen Tumoren exprimiert. Die Familie wird als "MAGE" bezeichnet, weil die ersten Mitglieder in menschlichen Melanomzellen identifiziert wurden. Wie die folgenden Experimente zeigen, sind die Mitglieder der MAGE-Familie jedoch ganz und gar nicht auf Melanomtumoren beschränkt; vielmehr bezieht sich MAGE auf eine Familie von Tumorantigenvorläufern und den hierfür kodierenden Nukleinsäurensequenzen. Die daraus erhaltenen Antigene werden hier als "MAGE-TRAs" oder "Melanomantigen-Tumorantigene" bezeichnet.
Beispiel 24
Versuche mit Maus-Tumoren haben gezeigt, das neue durch T-Zellen erkannte Antigene auf Punktmutationen zurückgeführt werden können, die aktive Genen in einem Bereich modifizieren, der für das neue antigene Peptid kodiert. Neue Antigene können auch aus der Aktivierung von Genen entstehen, die in den meisten normalen Zellen nicht exprimiert werden. Um diesen Gesichtspunkt für MZ2-E zu klären, wurde das in den Melanomzellen vorhandene mage-1-Gen mit dem in normalen Zellen des Patienten MZ2 vorhandenen verglichen.
Die Amplifikation von DNA aus phytohämagglutininaktivierten Blut-Lymphozyten durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern, die einen 1300-bp-Abschnitt umgeben, der die erste Hälfte des 2,4-kb-Fragments abdeckt, wurde durchgeführt. Wie erwartet wurde ein PCR-Produkt erhalten, wohingegen mit der DNA aus der E^–-Variante keines erhalten wurde. Die Sequenz dieses PCR-Produkts erwies sich als identisch zu der entsprechenden Sequenz des Gens, das durch die E⁺-Melanomzellen getragen wurde. Darüber hinaus wurde gefunden, daß das Antigen MZ2-E durch Zellen exprimiert wurde, die mit dem klonierten PCR-Produkt transfiziert waren. Dieses Ergebnis deutet daraufhin, daß die Aktivierung eines normalerweise stillen Gens für das Auftreten des Tumorantigens MZ2-E verantwortlich ist.
Beispiel 25
Um die Expression des Gens mage-1 durch verschiedene normale und Tumorzellen zu untersuchen, wurden Northern-Blots mit einer Sonde hybridisiert, die den Großteil des dritten Exons abdeckt. Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die mit der menschlichen Tumorzellinie MZ2-MEL 3.0 beobachtet wurden, wurde keine Bande mit RNA beobachtet, die aus einem CTL-Klon des Patienten MZ2 und phytohämagglutininaktivierten Blut-Lymphozyten desselben Patienten isoliert wurde. Ebenfalls negativ waren verschiedene normale Gewebe von anderen Individuen ( 10 und 11). Vierzehn Melanomzellinien von anderen Patienten wurde getestet. Elf waren positiv mit Banden unterschiedlicher Intensitäten. Zusätzlich zu diesen Kulturzellinien wurden vier Proben von Melanomtumorgewebe analysiert. Zwei Proben, einschließlich einer Metastase des Patienten MZ2, erwiesen sich als positiv, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, daß die Expression des Gens einen Gewebekulturartefakt darstellte. Einige Tumoren von anderem histologischen Typ, einschließlich Lungentumoren, wurden getestet. Die meisten dieser Tumoren waren positiv (10 und 11). Diese Ergebnisse zeigten, daß die MAGE-Gen-Familie durch viele Melanome exprimiert wird, und auch durch andere Tumoren. Sie ergaben jedoch keinen klaren Hinweis, welche der Gene mage-1, 2 oder 3 durch diese Zellen exprimiert wurden, weil die den drei Genen entsprechenden DNA-Sonden in beträchtlichem Maß kreuzhybridisierten. Um diese Analyse spezifischer zu machen, wurde eine PCR-Amplifikation und Hybridisierung mit hochspezifischen Oligonukleotidsonden verwendet. cDNAs wurden erhalten und durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, entsprechend Sequenzen von Exon 3, die identisch zu den drei hier beschriebenen MAGE-Genen waren, amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden anschließend auf ihre Fähigkeit gete stet, mit drei anderen Oligonukleotiden zu hybridisieren, die eine vollständige Spezifität für eines der drei Gene zeigten (9). Kontrolleexperimente, die durch Verdünnen von RNA aus dem Melanom MZ2-MEL 3.0 in RNA aus negativen Zellen durchgeführt wurden, zeigten, daß unter den hier eingesetzten Bedingungen die Intensität des Signals proportional zur Verdünnung abnahm und das positive Signale auch bei einer Verdünnung von 1/300 noch festgestellt werden konnten. Die normalen Zellen (Lymphozyten), die durch PCR getestet wurden, wurden als negativ in Bezug auf die Expression der drei MAGE-Gene bestätigt, was daher auf ein Expressionsniveau von weniger als 1/300 von dem der MZ2-Melanomzellinie hindeutet ( 11). Für die Reihe von Melanomzellinien zeigten die Ergebnisse eindeutig, daß einige Melanome die MAGE-Gene mage 1, 2 und 3 exprimierten, wohingegen andere lediglich mage-2 und 3 exprimierten (11 und 10). Einige der anderen Tumore exprimierten auch alle drei Gene, wohingegen andere lediglich mage-2 und 3 oder nur mage-3 exprimierten. Es ist unmöglich, formal auszuschließen, daß einige positive PCR-Resultate nicht die Expression eines der drei charakterisierten MAGE-Gene, sondern die eines anderen nahe verwandten Gens wiederspiegeln, das die Sequenz der Primer- und hybridisierenden Oligonukleotide gemeinsam haben würde. Es kann geschlossen werden, daß die MAGE-Genfamilie durch eine große Gruppe verschiedener Tumore exprimiert wird, und daß diese Gene in bisher getesteten normalen Zellen still sind.
Beispiel 26
Die Verfügbarkeit einer Sequenz, die mit hoher Effizienz transfiziert und ein TRAP effizient exprimiert, macht es möglich, nach dem assoziierten Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-Klasse-I-Molekül zu suchen. Die Klasse-I-Spezifi täten des Patienten MZ2 sind HLA-A1, A29, B37, B44 und C6. Vier andere Melanome von Patienten, die A1 zusammen mit MZ2 aufwiesen, wurden mit dem 2,4-kb-Fragment und pSVtkneoß cotransfiziert. Drei von ihnen ergaben neo^r-Transfektanten, die die TNF-Freisetzung durch den Anti-E-CTL-Klon 82/30, der CD8+ ist, stimulierten (10). Kein E^–-Transfektant wurde mit vier anderen Melanomen erhalten, von denen einige A29, B44 oder C6 mit MZ2 gemeinsam hatten. Dies deutet darauf hin, daß das präsentierende Molekül für Antigen MZ2-E HLA-A1 ist. Bestätigend wurde hierzu gefunden, daß von 6 Melanomzellinien, die aus Tumoren aus HLA-A1-Patienten erhalten wurden, zwei die TNF-Freisetzung durch den Anti-E-CTL-Klon 82/30 des Patienten MZ2 stimulierten. Eine dieser Tumorzellinien, MI13443-MEL, zeigte auch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Lyse durch diese Anti-E-CTL. Diese zwei Melanome waren jene, die das mage-1-Gen exprimierten (13). Acht Melanome von Patienten mit HLA-Haplotypen, die A1 nicht beinhalteten, wurden auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Lyse und auf ihre Fähigkeit zur Stimulierung der TNF-Freisetzung durch die CTL untersucht. Keine war positiv. Die Fähigkeit einiger menschlicher Anti-Tumor-CTLs, allogene Tumoren zu lysieren, die eine angemessene HLA-Spezifität mit dem ursprünglichen Tumor gemeinsam haben, ist früher berichtet worden (Darrow, et al., J. Immunol. 142:3329 (1989)). Es ist gut möglich, daß antigene Peptide, die durch die Gene mage 2 und 3 kodiert werden, durch HLA-A1 oder andere Klasse-I-Moleküle auch gegenüber autologen CTLs präsentiert werden, insbesondere angesichts der vergleichbaren Ergebnisse, die für murine Tumoren gefunden wurden, wie oben ausgeführt ist.
Beispiel 27
Wie oben angegeben, exprimierte das Melanom MZ2 zusätzlich zu Antigen E die Antigene F, D und A'. im Anschluß an die Isolierung der für das Antigen E kodierenden Nukleinsäuresequenz, wurden vergleichbare Experimente durchgeführt, um die für Antigen F kodierende Nukleinsäuresequenz zu isolieren.
Um dies zu tun, wurden Kulturen der Zellinie MZ2-MEL2.2, eine oben beschriebenen E^–-Zellinie, mit dem Anti-F-CTL-Klon 76/6 in gleicher Weise wie für die Behandlung mit Anti-E-CTL-Klonen beschrieben behandelt. Dies führte zur Isolierung einer F-Antigen-Verlustvarianten, die dann mehreren Selektionszyklen unterworfen wurde. Die erhaltene Zellinie, "MZ2-MEL2.2.5" war vollständig resistent gegenüber Lyse durch Anti-F-CTLs, wurde jedoch durch Anti-D-CTLs lysiert.
Erneut wurde die F^–-Variante nach dem Protokoll, das für die Isolierung von Antigen-E-Vorläufer-DNA ausgeführt wurde, mit genomischer DNA aus der F⁺-Zellinie MZ2-MEL3.0 transfiziert. Die Experimente ergaben 90.000 arzneimittelresistente Transfektanten. Diese wurden auf MZ2-F-Expression unter Verwendung eines Pools von 30 Zellen in dem oben ausgeführten TNF-Detektionstest getestet. Ein Pool stimulierte die TNF-Freisetzung durch Anti-F-CTLs und wurde kloniert. Fünf von 145 Klone stimulierten Anti-F-CTLs. Lyse-Tests, ebenfalls den oben beschriebenen Protokollen folgend, bestätigten (i) die Expression des für Antigen F kodierenden Gens und (ii) die Präsentation von Antigen F selbst.
Beispiel 28
Im Anschluß an die Identifikation von F⁺-Zellinien wurde die DNA daraus verwendet, um Zellen zu transfizieren. Um dies zu tun, wurde eine Cosmid-Bibliothek aus der F+-Zellinie MZ2-MEL.43 hergestellt, erneut unter Anwendung der oben beschriebenen Protokolle. Die Bibliothek wurde in 14 Gruppen aus etwa 50.000 Cosmiden aufgeteilt, und die DNA aus jeder Gruppe wurde in MZ2-MEL2.2.5 transfiziert. Die Transfektanten wurden dann auf ihre Fähigkeit, die TNF-Freisetzung aus dem Anti-F-CTL-Klon 76/6 zu stimulieren, getestet. Von 14 Cosmid-Gruppen bildete eine zwei Antigen F exprimierende unabhängige Transfektanten; ein Ertrag von zwei Positiven aus 17.500 geniticinresistenten Transfektanten.
Beispiel 29
Die Existenz einer Genfamilie wurde durch das in den Southern-Blots beobachtete Muster nahegelegt (12). Um dies zu tun, wurde das 2,4-kb-BamHI-Fragment, das die Expression des Antigens M22-E übertrug, mit ³²P markiert und in einem Southern-Blot von BamHI-verdauter DNA von E + kloniertem Subklon M22-MEL2.2 als Sonde verwendet. Die Hybridisierungsbedingungen beinhalteten 50 μl/cm² 3,5×SSC, 1×Denhardt-Lösung; 25 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0), 0,5% SDS, 2 mM EDTA, wobei die 2,4-kb-Sonden mit [α³²P]dCTP (2–3000 Ci/mol) markiert waren, bei 3×10⁶ cpm/ml. Die Hybridisierung wurde für 18 Stunden bei 65 °C durchgeführt. Danach wurden die Membranen bei 65 °C viermal für jeweils eine Stunde jeweils in 2×SSC, 0,1% SDS und schließlich für 30 Minuten in 0,1×SSC, 0,1% SDS gewaschen. Um eine Hybridisierung festzustellen, wurden die Membranen unter Verwendung eines Kodak-X-AR-Films und einer Kodak-X-Omatic-fein-Verstärkerfolie autoradiographiert.
Wann immer der Begriff "Hybridisierung" in den folgenden Beispielen verwendet wird, waren die eingesetzten Stringenzbedingungen zu den oben beschriebenen vergleichbar. "Stringente Bedingungen" wie hier verwendet bezieht sich daher auf die vorstehenden Bedingungen, die routinemäßigen, dem Fachmann bekannten Modifikationen unterzogen werden können.
Beispiel 30
Die für mage 4 kodierende cDNA wurde aus einer Probe der menschlichen Sarkom-Zellinie LB23-SAR identifiziert. Von dieser Zellinie wurde gefunden, daß sie mage 1, 2 oder 3 nicht exprimiert, die mRNA der Zellinie jedoch mit der 2,4-kb-Sequenz für mage 1 hybridisierte. Um dies näher zu untersuchen, auf wurde eine cDNA-Bibliothek aus der gesamten mRNA von LB23-SAR hergestellt und anschließend mit dem 2,4-kb-Fragment hybridisiert. Eine cDNA-Sequenz wurde als hybridisierend mit dieser Sonde identifiziert und wird im folgenden als mage 4 bezeichnet.
Beispiel 31
Versuche wurden durchgeführt unter Verwendung von PHA-aktivierten Lymphozyten von dem Patienten "MZ2", der Quelle der oben beschriebenen "MZ2"-Zellen. Eine Oligonukleotid-Sonde, die Homologie mit mage 1, jedoch nicht mit mage 2 oder 3 zeigte, wurde mit einer Cosmid-Bibliothek, die aus den PHAaktivierten Zellen erhalten wurde, hybridisiert. Die Größe des hybridisierenden BamHI-Cosmid-Fragments betrug jedoch 4,5 kb, was daraufhin hinwies, daß das Material nicht mage 1 war; auf Basis der Homologie zu mage 1–4 kann das Fragment jedoch als "mage 5" bezeichnet werden. Die Sequenz von MAGE 5 ist in der SEQ ID NO: 16 wiedergegeben.
Beispiel 32
Die Melanomzellinie LB-33-MEL wurde getestet. Die Gesamt-mRNA von der Zellinie wurde verwendet, um cDNA herzustellen, die dann mit den Oligos CHO9: (ACTCAGCTCCTCCCAGATTT) und CHO10: (GAAGAGGAGGGGCCAAG) amplifiziert wurde. Diese Oligos entsprechenden den Bereichen von Exon 3, die den zuvor beschriebenen mage 1, 2 und 3 gemeinsam sind.
Um dies zu tun, wurde 1 μg RNA unter Verwendung von 2 μl 10× PCR-Puffer, jeweils 2 μl 10 mM dNTP, 1,2 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl einer 80 mM Lösung vom oben beschriebenen CHO9, 20 Einheiten RNAsin und 200 Einheiten M-MLV-Reverse-Transkriptase zu einem Gesamtvolumen von 20 μl verdünnt. Dem schloß sich eine Inkubation für 40 Minuten bei 42 °C an. PCR-Amplifikation folgte unter Verwendung von 8 μl 10× PCR-Puffer, 4,8 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl CHO10, 2,5 Einheiten Thermus-aquaticus("Taq")-Polymerase und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 100 μl. Die Amplifikation wurde dann für 30 Zyklen (1 Minute 94 °C; 2 Minuten bei 52 °C, 3 Minuten bei 72 °C) durchgeführt. Zehn μl jeder Reaktionslösung wurden dann auf Agarosegel, gefolgt von einem Nitrozellulose-Blotting, größenfraktioniert. Das Produkt hybridisierte mit der Oligonukleotid-Sonde CHO18 (TCTTGTATCCTGGAGTCC). Diese Sonde identifizierte mage 1, aber nicht mage 2 oder 3. Das Produkt hybridisierte jedoch nicht mit der Sonde SEQ 4 (TTGCCAAGATCTCAGGAA). Diese Sonde bindet auch mage 1, nicht jedoch 2 und 3. Dies zeigt, daß das PCR-Produkt eine Sequenz enthielt, die sich von mage 1, 2 und 3 unterschied. Die Sequenzierung dieses Fragments zeigte auch Unterschiede hinsichtlich mage 4 und 5. Diese Ergebnisse zeigen eine Sequenz, die sich von den zuvor identifizierten mage 1, 2, 3, 4 und 5 unterscheidet und den Namen mage 6 erhielt.
Beispiel 33
In weiteren Experimenten, bei denen Cosmid-Bibliotheken aus PHA-aktivierten Lymphozyten von MZ2 verwendet wurden, wurde das 2,4-bk-mage-1-Fragment als Sonde verwendet und ein komplementäres Fragment isoliert. Dieser Klon band jedoch nicht an für mage 1, 2, 3 oder 4 spezifische Oligonukleotide. Die erhaltene Sequenz zeigt einige Homologie zu Exon 3 von mage 1 und unterscheidet sich von den mages 1–6. Es wird im folgenden als mage 7 bezeichnet. Weitere Screenings ergaben mage 8-11.
Beispiel 34
Die Nützlichkeit der TRAPs sowie der daraus abgeleiteten TRAs wurde wie folgt beispielhaft gezeigt.
Von Exon 3 aus mage 1 wurde gezeigt, daß es die Expression von Antigen E überträgt. Im Ergebnis wurde entschieden, zu untersuchen, ob synthetische Peptide, die von diesem Exon 3 abgeleitet wurden, verwendet werden konnten, um die Empfindlichkeit gegenüber Anti-ECTL zu vermitteln.
Um dies zu tun, wurden Zellen, die normalerweise unempfindlich gegenüber Anti-E/CTLs sind, unter Verwendung von Standard-Protokollen mit den von Exon 3.1 abgeleiteten synthetischen Peptiden inkubiert. Unter Verwendung des oben fpr P815A beschriebenen CTL-Lyse-Tests und einer Peptidkonzentration von 3 mM erwies sich das Peptid Glu-Ala-Asp-Pro-Thr-Gly-His- Ser-Tyr als das beste. Der Test zeigte eine Lyse von 30%, was die Übertragung der Empfindlichkeit gegenüber dem Anti-E-CTL zeigte.
Beispiel 35
Weitere Gewebeproben wurden auf Anwesenheit des MACE-Gens untersucht, wobei die oben beschriebenen Protokolle angewendet wurden. Einige dieser Ergebnisse sind im folgenden dargestellt.
Es wurde keine Expression des MAGE-Gens in Hirn- oder Nierentumorgewebe gefunden. Dickdarmtumorgewebe zeigte die Expression von MAGE 1, 2, 3 und 4, obwohl nicht alle getesteten Tumoren eine Expression aller MAGE-Gene zeigten. Dies trifft auch auf Bauchspeicheldrüsentumor (MAGE 1), nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom (MAGE 1, 2, 3 und 4), Prostata (MAGE 1), Sarkome (MAGE 1, 2, 3 und 4), Brust (MAGE 1, 2 und 3) sowie Kehlkopf (MAGE 1 und 4) zu.
Die vorstehende Offenbarung, einschließlich der Beispiele, gibt dem Fachmann viele Werkzeuge von extrem hohem Wert an die Hand. Zunächst identifizieren und bieten die Beispiele ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäurenmolekülen, die für Tumorantigenvorläufer kodieren sowie die hierzu komplementären Nukleinsäuremoleküle. Es ist bekannt, daß DNA in doppelsträngige Form vorliegt und das jeder der zwei Stränge komplementär zu dem anderen ist. Die Nukleinsäureybridisierungstechnologie ist bis zu dem Punkt entwickelt, an dem der Fachmann zu einem gegebenen DNA-Strang dessen Komplement isolieren oder synthetisieren kann.
"Nukleinsäuremolekül" wie hier verwendet bezeichnet alle Arten von DNA und RNA, die die oben beschriebenen Eigenschaften aufweisen. Genomische und komplementäre DNA oder "cDNA" kodieren beide für bestimmte Proteine, und wie die auf die Isolierung von für MAGE kodierende Sequenzen gerichteten Beispiele zeigen, lehrt diese Offenbarung den Fachmann, wie er beide sichern kann.
Gleichermaßen können RNA-Moleküle wie beispielsweise mRNA gesichert werden. Erneut kann unter Hinweis auf den Fachmann eine mRNA isoliert oder synthetisiert werden, sobald man die kodierende Sequenz in Händen hat.
Komplementäre Sequenzen, die nicht für TRAPs kodieren, wie beispielsweise "Antisense-DNA" oder mRNA sind z.B. nützlich bei der Suche nach der kodierenden Sequenz sowie in Verfahren zur Blockierung von deren Expression.
Es wird ebenfalls klar sein, daß die Beispiele die Herstellung biologisch reiner Kulturen von Zellinien zeigen, die mit Nukleinsäuresequenzen transfiziert wurden, die für die TRAP-Moleküle kodieren oder diese exprimieren. Solche Kulturen können z.B. als Quelle für Tumorantigene oder als Therapeutika verwendet werden. Dieser Aspekt der Erfindung wird unten beschrieben.
Zellen, die mit den kodierenden Sequenzen für TRAPs transfiziert sind, können auch mit anderen kodierenden Sequenzen transfiziert werden. Beispiele für andere kodierende Sequenzen schließen Zytokin-Gene wie beispielsweise Interleukine (zum Beispiel IL-2 oder IL-4) oder Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)- oder Human-Leukozytenantigen(HLA)-Moleküle ein. Zytokin-Gen-Transfektion ist von Nutzen, da von deren Expression erwartet wird, daß sie die therapeutische Wirksamkeit der biologisch reinen Kultur der Zellen in vivo verbessern. Dem Fachmann sind Therapien gut bekannt, bei denen Interleukin-Transfektanten zur Behandlung von Krebszuständen an Personen verabreicht wurden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen mit Sequenzen transfiziert, die jeweils für (i) ein TRAP-Moleküle, (ii) ein HLA/MHC-Molekül und (iii) ein Zytokin kodieren.
Die Transfektion mit einer kodierenden Sequenz für MHC/HLA ist wünschenswert, weil bestimmte TRAB möglicherweise vorzugsweise oder spezifisch nur durch bestimmte MHC-/HLA-Moleküle präsentiert werden. Wenn eine Empfängerzelle bereits das MHC-HLA-Molekül exprimiert, das mit der Präsentation eines TRAs verbunden ist, kann es sein, daß eine zusätzliche Transfektion nicht erforderlich ist, obwohl eine weitere Transformation eingesetzt werden könnte, um eine Überexpression des Antigens hervorzurufen. Auf der anderen Seite kann es wünschenswert sein, mit einer zweiten Sequenz zu transfizieren, wenn die Empfängerzelle das relevante MHC/HLA-Molekül normalerweise nicht exprimiert. Es sollte verstanden werden, daß die Transfektion mit einer zusätzlichen Sequenz die weitere Transfektion mit anderen Sequenzen natürlich nicht ausschließt
Der in Zusammenhang mit der hier beschriebenen Zellinie verwendete Begriff "biologisch rein" wie bedeutet einfach, daß diese im wesentlichen frei sind von anderen Zellen. Genaugenommen ist eine "Zellinie" per Definition "biologisch rein", die Wiederholung macht dies aber vollends deutlich.
Die Transfektion von Zellen erfordert, daß ein geeigneter Vektor verwendet wird. Die Erfindung umfaßt daher Expressi onsvektoren, bei denen eine kodierende Sequenz für das jeweilige TRAP funktionsfähig mit einem Promotor verbunden ist. Der Promotor kann ein starker Promotor sein, wie sie dem Fachmann in der Fachwelt gut bekannt sind, oder ein differentieller Promotor, d. h. ein Promotor, der nur in bestimmten Zelltypen aktiv ist. Die Expressionsvektoren können auch die Gesamtheit oder einen Teil eines viralen oder bakteriellen Genoms enthalten, wie beispielsweise Vaccinia-Virus oder BCG. Solche Vektoren sind besonders geeignet zur Herstellung von Impfstoffen.
Die Expressionsvektoren können mehrere kodierende Sequenzen beinhalten, solange die TRAP-Sequenz darin enthalten ist. Die oben beschriebenen Zytokin- und/oder MHC/HLA-Gene können mit der TRAP-Sequenz in einem einzigen Vektor enthalten sein. Wo dies nicht erwünscht ist, kann ein Expressionssystem bereitgestellt werden, bei dem zwei oder mehrere separate Vektoren verwendet werden, wobei jede kodierende Sequenz funktionsfähig mit einem Promotor verbunden ist. Erneut kann der Promotor ein starker oder differentieller Promotor sein. Die Cotransfektion ist eine gut bekannte Technik und von dem Fachmann auf diesem Gebiet wird erwartet, daß er diese Technik zur Anwendung verfügbar hat. Die Vektoren können in einer Weise konstruiert sein, daß sie statt für das TRAP-Molekül für das TRA-Molekül direkt kodieren. Dies beseitigt den Bedarf für eine posttranslationale Prozessierung.
Wie die vorangegangene Diskussion klarmacht, kodieren die Sequenzen für "Tumorantigenvorläufer" ("TRAPs"), die wiederum zu Tumorantigenen ("TRAs") verarbeitet werden. Isolierte Formen von diesen beiden Kategorien sind hier beschrieben, einschließlich jeweils spezifischer Beispiele. Der vielleicht beachtenswerteste Aspekt ist die Verwendung als Impfstoff zur Behandlung verschiedener Krebszustände. Die Belege deuten auf die Präsentation von TRAs auf Tumorzellen mit anschließender Entwicklung einer Immunantwort und Zerstörung der Zellen hin. Die Beispiele zeigen, daß, wenn verschiedene TRAs an Zellen verabreicht werden, eine CTL-Antwort aufgebaut wird und präsentierende Zellen zerstört werden. Dies ist ein Verhalten, das für Impfstoffe charakteristisch ist, und somit können die TRAPs, die zu TRAs weiterverarbeitet werden, und die TRAs selbst, entweder allein oder in pharmazeutisch geeigneten Zusammensetzungen als Impfstoffe verwendet werden. Gleichermaßen können präsentierende Zellen in der gleichen Weise, entweder allein oder in Kombination mit Zusatzstoffen, verwendet werden, um pharmazeutische Zusammensetzungen zu erhalten. Weitere Materialien, die als Impfstoffe verwendet werden können, beinhalten isolierte Zellen, die das TRA-Moleküle auf ihrer Oberfläche präsentieren, sowie TRAP-Fragmente, mutierte Viren, insbesondere abgeschwächte Formen, und transfizierte Bakterien. "Fragmente" wie hier verwendet, bezieht sich auf Peptide, die kleiner sind als das TRA, die jedoch die Eigenschaften aufweisen, die für einen Impfstoff erforderlich sind, wie oben beschrieben. Ein anderer Impfstoff umfaßt oder besteht aus Komplexen aus TRA- und HLA-Molekülen. Impfstoffe vom hier beschriebenen Typ können präventiv verwendet werden, d. h. durch Verabreichung an eine Person in einer Menge, die ausreicht, um den Beginn eines Krebszustandes zu verhindern.
Die Erzeugung einer Immunantwort, sei sie die T-Zell- oder B-Zell-vermittelt, ist charakteristisch für die Wirkung der präsentierten Tumorantigene. Mit Blick auf die B-Zell-Antwort beinhaltet dies u. a. die Erzeugung von Antikörpern gegen das TRA, d. h., die spezifisch daran binden. Darüber hinaus sind die TRAP-Moleküle von ausreichender Größe, um sie immunogen zu machen, und Antikörper, die spezifisch daran binden, sind ein Teil dieser Erfindung. Diese Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, wobei die letzteren durch jedes der gut bekannten Verfahren zu ihrer Herstellung hergestellt werden können, die hier nicht wiederholt werden müssen. Beispielsweise können mAbs unter Einsatz eines Tiermodells, z. B. einer Balb/C-Maus oder in einem Teströhrchen, unter Verwendung zum Beispiel von EBV-Transformanten hergestellt werden. Darüber hinaus kann Antiserum aus einer Person isoliert werden, die unter einem Krebszustand leidet, bei dem bestimmte Zellen ein TRA präsentieren. Solche Antikörper können auch gegen Epitope erzeugt werden, die durch die Wechselwirkung zwischen TRA- und HLA/MHC-Molekülen definiert sind.
Das Studium der vorangegangenen Offenbarung wird zeigen, daß das System eine Reihe von Facetten aufweist, die als "Tumorantigenpräsentation und -erkennung" bezeichnet werden können. Die Erkennung dieses Phänomens hat diagnostische Konsequenzen. Zum Beispiel macht es die Existenz von spezifischen CTL-Klonen oder Antikörpern gegen das TRA möglich, Krebszustände (unten erklärt) durch Überwachung der CTLs in einer Probe aus einer Person, die Bindung von Antikörpern an TRAs oder die Aktivität von Anti-TRA-CTLs in Verbindung mit Personenproben zu diagnostizieren oder zu überwachen. Gleichermaßen kann die Expression von Nukleinsäuremolekülen für TRAPs überwacht werden durch Amplifikation (z. B. "Polymerasekettenreaktion"), Antisense-Hybridisierung, Sondentechnologien usw. Verschiedene Proben der Person, einschließlich Körperflüssigkeiten (zum Beispiel Blut, Serum und andere Exsudate), Geweben und Tumoren können auf diese Weise getestet werden.
Eine besondere Diagnosemethode besteht darin, eine Anpassung des gegenwärtig zur Diagnose von Tuberkulose eingesetzten Standard-"Tuberkulintests" zu verwenden. Dieser Standard- Hauttest verabreicht eine stabile Form von "gereinigtem Proteinderivat" oder "PPP" als Diagnosehilfe. In paralleler Weise können TRAs gemäß der Erfindung in solch einem Hauttest als Diagnosehilfe oder Überwachungsmethode verwendet werden.
Der Begriff "Krebszustand" soll hier alle physiologischen Ereignisse umfassen, die mit dem Einsetzen des Krebses beginnen und zu einer endgültigen klinischen Manifestation führen. Tumoren erscheinen nicht "ab initio" als sichtbare Tumoren; vielmehr gibt es verschiedene Ereignisse, die mit der Transformation einer normalen Zellen zu einer Malignität, mit anschließender Entwicklung eines Wachstums von Biomasse, wie beispielsweise einem Tumor, Metastasen etc. verbunden sind. Darüber hinaus kann die Remission als Teil "eines Krebszustandes" angesehen werden, da Tumoren selten spontan verschwinden. Die diagnostischen Aspekte der vorliegenden Erfindung schließen alle Ereignisse ein, die an der Karzinogenese beteiligt sind, von der ersten Transformation zur Malignität einer einzelnen Zelle über die Tumorentwicklung und Metastasen bis hin zu Remissionen. Alle sind hier umfaßt.
Wenn der Begriff "Person" verwendet wird, umfaßt er jede Art, die von einem Krebszustand befallen sein kann. Dies schließt Menschen und Nicht-Menschen wie beispielsweise domestizierte Tiere, Zuchtvieh usw. ein.
Die vorliegende Erfindung weist auch therapeutische Aspekte auf. Die Wirksamkeit der Verabreichung wirksamer Mengen von TRAPs und TRAs als Impfstoffe ist bereits oben diskutiert worden. Gleichermaßen kann man die spezifischen CTLs in vitro heranziehen und diese dann an die Person verabreichen. Antikörper, entweder polyklonale oder monoklonale, können verabreicht werden, die spezifisch an Zellen binden, die das je weilige TRA präsentieren. Diese Antikörper können an spezifische Antitumormittel gebunden sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Methotrexat, radioiodierte Verbindungen, Toxine wie Ricin, anderes zytostatische oder zytolytische Arzneimittel usw. Daher ist eine "zielgerichtete" Antikörpertherapie hier umfaßt, wie auch die Anwendung der Zerstörung von Krebszellen durch die Verwendung von CTLs.
Die Begriffe und Ausdrücke, die eingesetzt wurden, werden als Begriffe zur Beschreibung und nicht der Beschränkung verwendet, und es liegt keine Intention vor, durch Verwendung solcher Begriffe und Ausdrücke irgendwelche Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon auszuschließen, wobei ersichtlich ist, daß verschiedene Modifikationen innerhalb des Bereichs der Erfindung möglich sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, wobei das Molekül: (a) ein DNA-Molekül ist, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus den SEQ ID NO: 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 16, 18 und 19, komplementären Sequenzen gleicher Länge und Teilen davon; oder (b) unter stringenten Bedingungen mit einem DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den SEQ ID NO: 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 16, 18 und 19 und komplementären Sequenzen gleicher Länge, hybridisierbar ist; und für ein Polypeptid oder Protein, das, wenn es auf einer Zelloberfläche präsentiert wird, in der Lage ist, eine zytolytische Antwort menschlicher T-Lymphozyten auszulösen, oder für einen Vorläufer eines solchen Polypeptids oder Proteins kodiert, oder ein Komplement eines Nukleinsäuremoleküls gleicher Länge ist, das für das Polypeptid oder Protein oder einen Vorläufer des Polypeptids oder Proteins kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül eine cDNA, genomische DNA oder ein RNA-Molekül ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein RNA-Transkript eines DNA-Moleküls nach Anspruch 2.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid oder Protein, das, wenn es auf einer Zelloberfläche präsentiert wird, in der Lage ist, eine zytolytische Antwort menschlicher T-Lymphozyten auszulösen, oder einen Vorläufer eines solchen Polypep tids oder Proteins kodiert, das durch ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–3 kodiert wird, oder eine komplementäre Nukleinsäuresequenz gleicher Länge umfaßt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das Polypeptid oder Protein eine in der SEQ ID NO: 26 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfaßt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–4, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine in den SEQ ID NO: 7, 8, 9 und 11 wiedergegebene Nukleotidsequenz aufweist, oder einer komplementären Nukleotidsequenz gleicher Länge hybridisierbar ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6 mit einer in 9 oder einer der in den SEQ ID NO: 7, 8, 9 und 11 wiedergegebenen Nukleotidsequenzen oder einer komplementären Nukleotidsequenz gleicher Länge.
Expressionsvektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–7.
Expressionsvektor nach Anspruch 8, wobei das Nukleinsäuremolekül funktionsfähig mit einem Promotor verbunden ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, ferner umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Haupthistokompatibilitätsantigen (MHC) oder ein Human-Leukozytenantigen (HLA), ein Zytokin oder ein Bakterien- oder Virengenom oder einen Teil davon kodiert.
Expressionsvektor nach Anspruch 10, wobei das Zytokin ein Interleukin, vorzugsweise IL-2 oder IL-4, ist.
Zelle, die mit einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–7 oder einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 8–11 transfiziert ist.
Zelle nach Anspruch 12, die mit einem Nukleinsäuremolekül transfiziert ist, das für ein MHC oder HLA oder ein Zytokin kodiert.
Zelle nach Anspruch 12, die in der Lage ist, ein MHC oder HLA oder ein Zytokin zu exprimieren.
Zelle nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei das Zytokin ein Interleukin, vorzugsweise IL-2 oder IL-4, ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 12–15, die nichtproliferativ ist.
Polypeptid oder Protein, das in der Lage ist, eine zytolytische Antwort von menschlichen Lymphozyten auszulösen, oder Vorläufer-Polypeptid oder -Protein, kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–7.
Polypeptid oder Protein nach Anspruch 17, das eine in der SEQ ID NO: 26 wiedergegebene Nukleinsäuresequenz aufweist.
Virus, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–7.
Virus nach Anspruch 19, wobei der Virus mutiert oder abgeschwächt ist.
Antikörper, der ein Polypeptid oder Protein nach Anspruch 17 oder Anspruch 18 oder einen Komplex aus einem Polypeptid oder Protein nach Anspruch 17 oder Anspruch 18 und einem MHC oder HLA spezifisch bindet, jedoch nicht an den MHC oder das HLA alleine bindet.
Antikörper nach Anspruch 21, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–7, ein Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 8–11, eine Zelle nach einem der Ansprüche 12–16, ein Polypeptid oder Protein nach einem der Ansprüche 17 oder 18, ein Virus nach einem der Ansprüche 19 oder 20, oder ein Antikörper nach einem der Ansprüche 21 oder 22 zur Verwendung bei der Therapie, Prophylaxe oder Diagnose von Tumoren.
Pharmazeutische Zusammensetzung für die Prophylaxe, Therapie oder Diagnose von Tumoren, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–7, einen Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 8–11, eine Zelle nach einem der Ansprüche 12–16, ein Polypeptid oder Protein nach einem der Ansprüche 17 oder 18, ein Virus nach einem der Ansprüche 19 oder 20, oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 21 oder 22, optional mit Beimischung eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers und optional ferner umfassend einen MHC oder ein HLA.
Verfahren zur Herstellung einer zytolytischen T-Zell-Kultur, die reaktiv ist gegen autologe Tumorzellen eines Individuums, umfassend den Schritt des Kultivierens einer Probe von Lymphozyten von dem Individuum mit Zellen nach einem der Ansprüche 12–16.
Verwendung eines isolierten Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1–7, eines Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 8–11, einer Zelle nach einem der Ansprüche 12–16, eines Polypeptids oder Proteins nach einem der Ansprüche 17 oder 18, eines Virus nach einem der Ansprüche 19 oder 20, eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 21 oder 22 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 24 zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe, Therapie oder Diagnose von Tumoren.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei der Tumor ein Melanom, ein Sarkom oder ein Karzinom wie beispielsweise ein kleinzelliges Bronchial-, ein nicht-kleinzelliges Bronchial-, Plattenepithel-, Schilddrüsen-, Dickdarm-, Pankreas-, Prostata-, Brust- oder Kehlkopfkarzinom ist.
Verfahren zur Feststellung der Rückbildung, des Fortschreitens oder des Beginns eines Tumors bei einem Individuum, umfassend die Schritte des: (a) Feststellens der Menge Polypeptid oder Protein nach Anspruch 17 oder 18, die in einer Körperflüssigkeits-, Gewebe- oder Tumorprobe von dem Individuum vorhanden ist, optional durch Einsetzen eines Immunassays unter Einbeziehung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 21 oder 22. (b) Feststellens der in einer Körperflüssigkeits-, Gewebe- oder Tumorprobe von dem Individuum vorhandenen Zahl zytolytischer T-Zellen, die auf eine Zelle nach einem der Ansprüche 12–16 oder ein Polypeptid oder Protein nach einem der Ansprüche 17 oder 18 reagieren. (c) Feststellens der in einer Körperflüssigkeits-, Gewebe- oder Tumorprobe von dem Individuum vorhandenen Expression eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 17 oder 18, optional durch Nukleinsäurehybridisierung, bei der ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–7 als Sonde eingesetzt wird.