DE69231583T2

DE69231583T2 - Zusammensetzung zur Behandlung des Insulinmangels bei Säugetieren, die Amylin und Insulin enthält.

Info

Publication number: DE69231583T2
Application number: DE69231583T
Authority: DE
Inventors: J. Rink; A. Young
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1991-05-24
Filing date: 1992-05-23
Publication date: 2001-03-29
Anticipated expiration: 2012-05-24
Also published as: AU2169392A; JPH06510753A; AU6196496A; DE69231583D1; CA2109604A1; GR3035287T3; ES2153828T3; EP0586592B1; DK0586592T3; ATE197764T1; EP0586592A1; SG44838A1; WO1992020366A1

Description

Fachbereich der Erfindung

Diese Erfindung betrifft therapeutische Kombinationen von Insulin und Amylin und deren Verwendung in der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Säugern mit Insulinmangel, zum Beispiel von diabetischen Menschen.

Hintergrund der Erfindung

Bei Human-Diabetes liegt eine mangelhafte Insulinsekretion, und in einigen Fällen das Fehlen von Insulin vor. Bei Insulin handelt es sich um eines von mehreren Hormonen, die in der Regulierung der Blutzuckerspiegel eine Rolle spielen. Einfach gesagt besitzt ein Säuger zwei Hauptspeicher der Glucose, nämlich die Leber und die Skelettmuskulatur, worin Glucose in Form von Glykogen gespeichert wird. Das Glykogen der Muskulatur findet als Glucose-Quelle für die Muskeln Verwendung, während das Glykogen der Leber als Glucose-Quelle für alle Gewebe einschließlich Blut verwendet wird. Das Wechselspiel bestimmter Hormone in der Regulierung der Glykogen-Speicherung und seines Abbaus stellt den entscheidenden Faktor für die nachfolgend beschriebene Erfindung dar.
Das Insulin reguliert die Glucoseaufnahme durch das Muskelgewebe, zur Speicherung der Glucose als Muskelglykogen. Das Insulin verhindert auch eine Hyperglykämie, d. h. die unannehmbare Ansammlung hoher Glucosemengen im Blut, und unterdrückt die Umwandlung des Leberglykogens zu Glucose und die anschließende Sekretion dieser Glucose in das Blut. In Gegenwart überschüssigen Insulins sammelt sich der Blutzucker im Muskelgewebe als Glykogen an, wird die Leberglucose-Abgabe unterdrückt und fällt der Blutzuckerspiegel ab, was einen als Hypoglykämie bezeichneten Zustand erzeugt.
Ein anderes Hormon, Glucagon, erhöht den Blutzuckerspiegel durch Stimulierung des Leberglykogen-Abbaus zu Glucose und der anschließenden Sekretion dieser Glucose. Dieses Leberglykogen dient zur Aufrechterhaltung des Blutzuckerspiegels, und Glucagon kann als entgegengesetzt regulatorisches Hormon zu Insulin betrachtet werden.
Bei Amylin handelt es sich um ein anderes Hormon, von dem festgestellt wurde, daß es an der Regulierung des Blutzuckerspiegels beteiligt ist. Es kehrt die Insulin- vermittelte Unterdrückung der Leberglucose-Abgabe bei Ratten um. Molina et al., 39 Diabetes 260, 1990, und Koopmans et al., 39 Diabetes 101A, 1990.
In der Europäischen Patentanmeldung Nr. 88307927.9 (EP-A-0.309.100) ist die Behandlung von Diabetes mellitus oder Hypoglykämie mit Amylin oder mit einer Kombination von Amylin und Insulin, vorzugsweise in einem Verhältnis von 100 : 1 bis 0,1 : 1, Insulin zu Amylin, beschrieben. Der Anmelder berichtet, daß das Hauptproblem bei der Insulinbehandlung des Diabetes die Hypoglykämie ist und daß die gleichzeitige Verabreichung von Insulin und Amylin diese Nebenwirkung verhindert oder zumindest ihr Risiko und/oder ihren Schweregrad vermindert. In der Anmeldung wird festgestellt, daß Amylin eine kraftvoll modulierende Wirkung auf die Insulin- induzierte Speicherung von Glucose als Glykogen ausübt und daß Amylin auf die Modulierung und Reduzierung der hypoglykämischen Wirkungen von Insulin hinwirkt, indem es die Freisetzung von Insulin im Verhältnis zu einem gegebenen Glucose- Stimulus und die Rate der Speicherung von Glucose als Muskelglykogen reduziert. Das heißt, daß Amylin die Insulin-Sensibilität herabsetzen und die hypoglykämischen Wirkungen von Insulin dämpfen sollte.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung der Anmelder betrifft die Entdeckung einer weiteren überraschenden Beziehung zwischen Amylin und Insulin. Sie betrifft auch die unerwartete Entdeckung der optimalen Verhältnisse von Insulin und Amylin für die Verwendung in der Behandlung von Säugern, die an Diabetes oder einem anderweitigen Insulinmangel leiden. Der Anmelder hat entdeckt, daß die Aufrechterhaltung eines Verhältnisses von Amylin und Insulin in einem Säugers innerhalb eines relativ engen Bereichs oder Bereichen bevorzugt ist, wodurch sowohl das Amylin als auch das Insulin optimale Wirkungen zeigen und die schädlichen Nebenwirkungen sowohl einer Überschußmenge des Amylins als auch des Insulins alleine vermieden werden.
Angesichts des Antagonismus der Muskelreaktion von Amylins zu Insulin haben andere Autoren vorausgesetzt, daß sich die Wirkungen von Amylin und Insulin in vivo schlicht gegenseitig aufheben. Die Anmelder stellten jedoch fest, daß dies nicht nur nicht der Fall ist, sondern daß die Amylin-Unterdrückung der Insulinreaktion eines Patienten mit einer Erhöhung der hormonellen Konzentrationen über einen bestimmten Wert hinaus gesteigert wird. Werden also die Hormone in einem festgelegten Verhältnis zur Verfügung gestellt, so mäßigt dies die Wirkungen jedes einzelnen Hormons und verhindert die schädliche Wirkung der einzelnen Hormone bei hoher Konzentration.
Bei Amylin handelt es sich um einen funktionellen nichtkompetitiven Antagonisten des Insulins im Hinblick beispielsweise auf den Muskelglykogen-Metabolismus. Das heißt, unabhängig von der Insulinkonzentration und dem Grad der Insulin- Stimulierung wird die Insulinreaktion durch das Amylin bei geeigneten Konzentrationen nichtsdestotrotz vermindern. Sind Amylin und Insulin in einem geeigneten festgelegten Verhältnis vorhanden, so haben steigende Konzentrationen des Gemischs die anfängliche Wirkung einer Insulin-Stimulierung, woraufhin zum Beispiel eine vermehrte Muskelglykogen-Synthese eintritt. Mit weiteren Erhöhungen der Konzentration des Gemischs nimmt die Reaktion auf die Insulin-Komponente nur wenig weiter zu, doch wirkt der nichtkompetitive Antagonismus der Amylin- Komponente fortgesetzt. Die Nettoreaktion auf weitere Konzentrationserhöhungen des Gemischs nimmt tatsächlich ab, was eine glockenförmige Dosis-Wirkungs-Kurve und nicht die sigmaförmige Reaktion ergibt, die typischerweise mit Insulin alleine erzielt wird.
Die Anmelder haben festgestellt, daß die Bereitstellung von Amylin und Insulin in einem konstanten Molverhältnis zu einem glockenförmigen Dosis-Wirkungs- Verhältnis zwischen den Hormonspiegeln und der Glucoseablagerung im Skelettmuskel führt, was darauf hinzeigt, daß Amylin und Insulin unabhängig voneinander wirken und nichtkompetitive funktionelle Antagonisten für bestimmte metabolische Schlüsslfunktionen einschließlich der Glucose-Aufnahme in das Skelettmuskek-Glykogen und den hepatischen Glucose-Abbau sind. Die Anmelder schlagen bei dieser Erfindung vor, daß an Diabetes erkrankte Patienten in einer Weise behandelt werden können, die beispielsweise das Insulin und Amylin im Patienten in relativ konstanten Proportionen, einschließlich solcher, wie den bei normalen Säugern unter physiologischen Bedingungen vorhanden ähnlich, aufrechterhält. Dies ist von Vorteil, da sich bei normalen physiologischen Insulin- und Amylin-Konzentrationen die Reaktion des Körpers auf Insulin in Gegenwart von Amylin nicht stark verändert, doch die Reaktion bei hohen Insulin- und Amylinspiegel beträchtlich geringer als das Maximum in Gegenwart von Amylin ist. Daher werden die Insulin-vermittelten Nebenwirkungen durch Amylin bei hohen Insulin- Konzentrationen unterdrückt. Die Verabreichung von Insulin und Amylin in einem gegebenen Verhältnis oder die Gabe von mindestens etwa 0,5 mg/kg/Tag Amylin vermindert das Risiko einer katastrophalen Hypoglykämie, die im anderen Fall der Verabreichung von Überschußmengen an Insulin folgen würde. Beim vorgeschlagenen Dosierungsschema ist der Patient vor einer Überdosis Insulin geschützt, da das Amylin potentielle Schwankungen des Plasmaglucosespiegels, wie durch eine schlechte Insulinregulierung verursacht, dämpft. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, glauben die Anmelder, daß das gleichzeitig verabreichte Amylin durch Wiederherstellen der hepatischen Glykogen-Speicher so wirkt, daß in Gegenwart von Insulin dieses Glykogen durch Glucagon mobilisiert wird.
Ein Ziel der gleichzeitigen Verabreichung von Amylin und Insulin bei Diabetes ist die weitestpraktikable Wiederherstellung des wirksamsten Verhältnisses dieser Hormone. Daher reflektiert die Dosis von jedem ihren jeweiligen Mangel aufgrund eines Beta-Zell-Verlusts und wird im Verhältnis von Amylin zu Insulin, welche normalerweise von einer pankreatischen Beta-Zelle zusammen sekretiert werden, annähernd in Bezug gesetzt. Die Anmelder haben festgestellt, daß ein Molverhältnis von etwa 3% bis etwa 40% Amylin zu Insulin angezeigt ist, d. h. ein Verhältnis von Amylin zu Insulin von etwa 1 : 35 bis etwa 1 : 2,5. Dieses kann für verschiedene Patienten variieren, wobei das annähernde Verhältnis bestimmt wird durch (1) Überwachen der verbliebenen Amylin- und Insulinspiegel mittels Plasma- Immunoassay und (2) durch der normalen Praxis entsprechende klinische Überwachung der Plasmaglucose und des klinischen Zustands.
Erwünscht ist die Bereitstellung relativ konstanter Amylin : Insulin-Verhältnisse, besonders dann, wenn sich der Insulinspiegel mit einiger Wahrscheinlichkeit verändert. Es ist jedoch unwahrscheinlich, daß eine Depot-Form von Amylin in Abstimmung etwa zu Ultralente-Insulin erforderlich sein wird. Ultralente-Insulin sorgt für einen recht konstanten Basal-Insulinspiegel, der aller Wahrscheinlichkeit nach keine hypoglykämischen Episoden auslöst. Die wichtigste Anforderung besteht in wirksamen Amylinmengen, die die Insulinmengen begleiten und verfolgen auf die Verabreichung schnellerwirkender Formen von Insulin hin, welche zu sich schnell verändernden Plasmaspiegeln führen.
Daher sollte Amylin so formuliert werden, daß ein Muster der Plasmakonzentrationen bereitgestellt wird, das, innerhalb eines Faktors vom etwa 2,5-fachen, bei 'Zeit bis zum Peak' und 'Halbwertszeit bis zum Verschwinden' dem einem Patienten zu verabreichenden löslichen oder schnellwirkenden Insulins entspricht. In dieser Weise wirkt Amylin am mäßigensten auf die Insulinwirkung, wenn Insulin im höheren Konzentrationsbereich liegt, und beläßt die Insulinwirkung im wesentlichen intakt, wenn die Plasmaspiegel aufgrund eines löslichen Insulins fallen. Das verabreichte Amylin beeinträchtigt die Fähigkeit des Ultralente-Basalinsulins zur Limitierung der Plasmaglucose nicht wesentlich.
Zusammenfassend gesagt ist die bevorzugte Formulierung für Amylin eine solche, die Verhältnisse der Amylin/Insulin-Konzentrationen von etwa 33% bis etwa 300% dessen bei normalen Patienten schafft, und zwar für die nächsten 4 Stunden nach Verabreichung der am schnellsten wirksamen Insulindosis für den jeweiligen Patienten, und die einem Faktor vom etwa 3-fachen bei 'Zeit bis zum Peak' und 'Zeitverlauf der Abnahme' der Plasma-Insulinspiegel entspricht.
Daher stellt die Erfindung bei einer ersten Ausführungsform eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein Insulin mit einer in vitro-Aktivität zur Stimulierung des Glucose- Einbaus in Glykogen im Ratten-Soleusmuskel, und ein Amylin mit der in vitro- Aktivität zur Unterdrückung des Glucose-Einbaus in Glykogen im Ratten-Soleusmuskel, wobei das Insulin und Amylin in einem Molverhältnis von 1 : 1 bis 40 : 1 bereitgestellt werden.
Bei einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein Insulin und ein Amylin, wobei das Insulin und Amylin in einem Molverhältnis von 1 : 1 bis 40 : 1 bereitgestellt werden, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugers mit einer verminderten Fähigkeit zur Produktion von Serum-Insulin im Vergleich zu einem normalen Säuger.
Mit "ein Insulin" ist jegliches Insulin eines natürlichen oder synthetischen Ursprungs als auch funktionelle Peptidfragmente und konservative Varianten eines Insulins gemeint, die in der herkömmlichen Behandlung von Diabetes mellitus Verwendung finden können. Es ist für diese Erfindung von Bedeutung, und wird den Fachleuten dieses Bereichs klar sein, daß das Insulin-Polypeptid-Fragment lediglich eine Insulin- Aktivität aufzuweisen braucht, gekennzeichnet durch die in vitro-Aktivität zur Stimulierung des Glucose-Einbaus in Glykogen im Ratten-Soleusmuskel, wie nachfolgend ausführlich beschrieben. Daher kann das Insulin in jeglicher standardmäßigen Weise erzeugt werden, einschließlich, doch nicht darauf beschränkt, der Extraktion von pankreatischem Rinder- und Schweine-Insulin, der Expression des Insulins aus rekombinanter DNA und der in vitro-Polypeptid-Synthese von Fragmenten des Insulins. Das Insulin kann auch in einer schnellwirkenden oder Semilente-Form bereitgestellt werden.
Mit konservativer Variante ist ein Insulin-Polypeptid gemeint, das eine wesentliche (mindestens 90% einer angrenzenden Aminosäure-Zehnersequenz aufweist) Aminosäuresequenz-Identität mit einem natürlich vorkommenden Insulin oder einem in der herkömmlichen Behandlung von Diabetes mellitus verwendeten Insulin aufweist, wobei jedoch ein oder mehrere Aminosäuren in einer solchen Sequenz in konservativer Weise substituiert sind, so daß die biologische Aktivität des Insulins im wesentlichen intakt bleibt. Beispiele für solch eine konservative Substitution umfassen die Substitution positiv geladener Aminosäuren gegen andere positiv geladene Aminosäuren, negativ geladene Aminosäuren gegen andere negativ geladene Aminosäuren, und einfache Aminosäuren, wie etwa Glycin, gegen andere derartige Aminosäuren, wie etwa Valin. Nützliche Insuline für diese Erfindung lassen sich ohne weiteres durch Testen eines ausgewählten Insulins auf die gewünschte Aktivität im nachfolgend beschriebenen in vitro-Test oder einem beliebigen gleichwertigen in vitro- oder in vivo-Test bestimmen.
Mit "ein Amylin" ist jegliches Agonist-Molekül gemeint, das ein funktionelles Peptidfragment eines natürlich vorkommenden Amylin, Carboxy-deamidierten Amylin oder Calcitonin-Gen-zugehörigen Peptids (CGRP) enthält, das mindestens fünf Aminosäure-Reste umfaßt und die oben beschriebene in vitro-Aktivität aufweist. Außerdem ist es bevorzugt, daß solch ein Amylin in vivo eine therapeutische Funktion des vollständigen Amylins oder CGRP-Peptids erfüllt. Der Begriff umfaßt auch konservative Varianten und funktionelle Peptid-Fragmente solcher Peptide. Beispiele solcher Amyline sind in Abb. 1 bereitgestellt, wo Sequenz-Homologien unter den Amylinen beim Menschen und anderen Spezies gezeigt sind (unter Anwendung eines standardmäßigen Einbuchstaben-Aminosäure-Codes). Vorzugsweise weist das Amylin einen Kd von weniger als 60 pMolar in einem Rezeptor-Assay und einen EC5o von weniger als 1 nMolar in einem Rattensoleus- Assay auf (Abb. 7, siehe unten).
Fachleute des Bereichs werden bei üblicher Sachkenntnis erkennen können, daß die obengenannten Begriffe "Insulin" und "Amylin" breit ausgelegt werden können und dabei jegliches Polypeptid oder eine andere chemische Klasse mit der oben beschriebenen gewünschten biologischen Aktivität, in vitro oder in vivo, umfassen, die den Glucose-Einbau in das Glykogen in einem beliebigen von vielen Testsystemen, einschließlich des Ratten-Soleusmuskel, stimuliert oder unterdrückt. Außerdem werden diese Fachleute erkennen, daß das Polypeptid in einer Carboxyterminierten Form, Carboxy-terminal amidierten Form oder einer anderen Form bereitgestellt werden kann, die die gewünschte biologische Aktivität des Polypeptids nicht signifikant beeinträchtigt. Zum Beispiel kann, wie in EP-A-0.309.100, supra, beschrieben, das Amylin in einer löslichen Form hergestellt werden.
Bei bevorzugten Ausführungsformen werden das Insulin und Amylin in einem Molverhältnis von etwa 2,5 : 1 bis 35 : 1 oder etwa 5 : 1 bis 25 : 1, und dabei mindestens 0,5 Mikrogramm Amylin pro Kilogramm des Säugers pro Tag, bereitgestellt.
Vorzugsweise wird die Zusammensetzung in einer Form bereitgestellt, die eine verzögerte Freisetzung sowohl des Insulins als auch Amylins in einem konstanten Molverhältnis oder in einer zur parenteralen Verabreichung geeigneten Form erlaubt.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können Säugern mit einer verminderten Fähigkeit zur Produktion von Insulin im Vergleich zu einem normalen Säuger verabreicht werden. Am bevorzugtesten ist der Säuger ein Mensch, der z. B. an Diabetes mellitus leidet. Vor der Verabreichung kann der Insulin- und Amylinspiegel im Säuger bestimmt und dann eine Menge an Insulin und Amylin verabreicht werden, die ein Molverhältnis von Insulin : Amylin im Serum des Tieres von etwa 2,5 : 1 bis 35 : 1 schafft.
Der Insulin- und Amylinspiegel im Säuger kann mittels irgendeiner gewünschten Methode bestimmt werden, wofür viele Beispiele in der veröffentlichten Literatur vorliegen. Außerdem kann die Amylin-Aktivität untersucht werden, wie beschrieben bei Cooper und Young, US-Reihenanmeldung-Nr. 07/666.512, mit dem Titel "Amylin Activity Assays", eingereicht am 8. März 1991, demselben Rechtsnachfolger der vorliegenden Anmeldung übertragen.
Bei einer verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verwendung wie oben definiert bereit, wobei die Zusammensetzung, umfassend Insulin und Amylin, eine zirkulierende Plasmamenge von Amylin in einem Säuger bereitstellt, die etwa 3 bis 6% der von Insulin beträgt.
Einer der wichtigsten Vorteile der vorliegenden Erfindung kann in der Verminderung der Nebenwirkungen einer Insulin-Überdosis gesehen werden, solange das korrekte Verhältnis von Amylin zusammen mit dem Insulin bereitgestellt wird. Um die akut unangenehmen Wirkungen der Hypoglykämie zu vermeiden, neigen derzeit die Patienten charakteristischerweise dazu, bei ihrer Insulin-Therapie zu bleiben und dabei ein Leben mit höheren Mengen an Plasma-Glucose vorzuziehen, die keine unmittelbar erkennbaren pathologischen Befunde darstellen. Die resultierende chronische Hyperglykämie führt jedoch zu Gefäßschäden, Insulinresistenz und abnormalem Kohlenhydrat-Metabolismus. Mit der vorliegenden Erfindung brauchen sich diese Diabetiker nicht länger mit dem chronisch hyperglykämischen Zustand abzufinden. So unterstützt die optimale Amylin/Insulin-Kombination dieser Erfindung die Überwindung langfristiger Komplikationen, die normalerweise mit der Insulin- Therapie verbunden sind.
Die Amylin/Insulin-Formulierungen dieser Erfindung dient jenen Patienten, die ihr Insulin bei einer verbesserten Formulierung selbst injizieren und damit das Auftreten niedriger Plasma-Glucosespiegel vermindern. Diese Formulierungen verhindern die Glucose-Ablagerung in der Skelettmuskulatur, wenn die Plasma-Glucosespiegel gesenkt werden, stimulieren die hepatische Glykogen-Synthese, um eine wirksame gegenregulatorische Wirkung auf Hypoglykämie zu gewährleisten und gestatten eine im wesentlichen normale Insulin-Kontrolle der Hyperglykämie.
Die gemischten Insulin/Amylin-Formulierungen beschränken die Rate der Glucose- Ablagerung in der Skelettmuskulatur, was das Risiko einer mit aggressiver Hormontherapie verbundenen Hypoglykämie vermindert. Außerdem erhöht das Amylin die Fettsäure-Synthese aus Laktat oder stellt sie wieder her und schafft eine normalere Körperfettverteilung bei den Patienten.
Zu weiteren Vorteile dieser Erfindung für Diabetiker zählen die durchschnittlich niedrigeren Plasma-Glucosespiegel; verminderte Langzeit-Komplikationen; ein verminderter Überwachungsbedarf; eine geringere Notwendigkeit einer rigorosen Definierung der Insulindosierung; eine größere Freiheit bezüglich der Variierung von Umfang und Zeitpunkt der Hormontherapie ebenso wie von Umfang und Zeitpunkt jeglicher rigoroser Aktivität; und ein höheres Wohlbefinden.
Wie bei Insulin alleine können die obigen Insulin/Amylin-Formulierungen mittels standardmäßiger Methoden auf die spezifischen physiologischen Anforderungen eines jeden Patienten hin maßgeschneidert werden. Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen erkennbar werden.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Zunächst sollen kurz die Zeichnungen beschrieben werden.

Zeichnungen

Abb. 1 zeigt eine Darstellung, unter Verwendung der standardmäßigen Einbuchstaben-Nomenklatur zur Darstellung von Aminosäuren, der Aminosäure- Sequenz von Amylin und den verwandten Polypeptiden;
Abb. 2 zeigt ein Diagramm der Insulindosis-Wirkung im Ratten-Soleusmuskel;
Abb. 3 zeigt ein Diagramm einer Familie von Insulindosis-Wirkungs-Kurven bei unterschiedlichen festgelegten Konzentrationen an Amylin;
Abb. 4 zeigt ein Diagramm einer Familie von Amylindosis-Wirkungs-Kurven bei unterschiedlichen festgelegten Konzentrationen von Insulin;
Abb. 5 zeigt ein Diagramm einer Insulin/Amylin-Dosis-Wirkungs-Oberfläche, wobei die mit 1, 14 und 100 bezeichneten Linien die vorausgesagten Wirkungen der Insulin/Amylin-Gemische darstellen, wobei Amylin zu 1%, 14% bzw. 100% der Molkonzentration des Insulin vorliegt.
Abb. 6 zeigt ein Diagramm, in dem die Reaktion auf eine steigende Insulin- und Amylinkonzentration in einem festgelegten Verhältnis von 7 zu 1 dargestellt ist; die obere Linie zeigt die sigmaförmige Dosiswirkung von Insulin alleine;
Abb. 7 zeigt ein Diagramm, das die Amylindosis-Wirkungs-Kurven unter Ausnutzung dreier verschiedener Methoden zur Messung der experimentellen Amylin- Konzentrationen veranschaulicht; und
Abb. 8 zeigt ein Diagramm der Leber-Glykogenspiegel bei Ratten, das die Wirkung von Insulin und Insulin/Amylin-Kombinationen bei der Wiederherstellung der Glykogen-Spiegel in diabetischen Streptozotocin-behandelten diabetischen Ratten wiedergibt.

Ausführliche Beschreibung

Die folgenden Experimente demonstrieren die Wechselwirkung von Amylin und Insulin in einem in vitro- und einem in vivo-Testformat. Diese Experimente verdeutlichen die überraschende Natur der Wechselwirkung zwischen den beiden Hormonen in der Regulierung des Glykogen-Metabolismus.
Wie nachstehend ausführlicher beschrieben, ist bei niedrigen bis mäßigen Raten der Insulinsekretion, dem Bereich der meisten physiologischen Situationen, die Reaktion auf Insulin in Gegenwart von Amylin nicht stark verändert. Das Gefälle der Insulindosis-Wirkung reduziert sich, je mehr sich die Amylin-Konzentrationen Niveaus annähern, die die Insulin-Wirkung signifikant herabsetzen. Die maximal erzielbare Wirkung ist beträchtlich geringer als das Maximum, das durch Insulin alleine ausgelöst werden könnte. Mit einem weiteren Anstieg der Insulin- und Amylin- Konzentrationen in normalerweise erwartungsgemäß nicht eintretende Bereiche nimmt die Insulin-Wirkung tatsächlich ab, je mehr eine zunehmende Amylin-Wirkung die funktionelle Reaktion auf Insulin weiter herabsetzt.

Beispiel 1: Isolation des Ratten-Soleusmuskels

Soleus-Assay, Dissektion
Männliche Harlan-Sprague-Dawley-Ratten von etwa 200 g Körpergewicht wurden verwendet, um eine Soleusmuskelmasse von weniger als 40 mg zu erhalten. Die Tiere blieben 4 Stunden lang ungefüttert, bevor sie durch Dekapitation geopfert wurden. Die Haut wurde von den unteren Gliedmaßen abgezogen, die dann an eine Korktafel geheftet wurde. Die Tendo achillis wurde direkt oberhalb des os calcis durchtrennt, und M. gastrocnemius bog sich aus dem hinteren Teil der Tibia heraus. M. soleus, ein kleiner, 15-20 mm langer, 0,5 mm dicker flacher Muskel an der Knochenoberfläche von M. gastrocnemius wurde dann freigelegt und das Perimysium unter Verwendung feiner Scheren und Pinzetten gereinigt. M. soleus wurde dann in gleichgroße Teile unter Verwendung eines Messers geteilt, das antero-posterior durch die Bauch des Muskels zum Erhalt von insgesamt vier Muskeistreifen von jedem Tier geführt wurde. Nach Dissektion des Tiermuskels wurde dieser für kurze Zeit in physiologischer Kochsalzlösung aufbewahrt. Der Muskel wurde nicht gespannt gehalten, wie bei anderen Vorgehensweisen berichtet, da dies bei unserer Handhabung kerne nachweisbare Wirkung auf die Insulin- Sensibilität bei Radioglucose-Einbau in Glykogen zeigte.

Inkubation

Die Muskel wurden in 50-ml-Erlenmeyer-Kolben eingebracht, die 10 ml eines vorab begasten Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffers, enthaltend (mM) NaCl 118,5; KCl 5,94; CaCl&sub2; 2,54; MgSO&sub4; 1,19; KH&sub2;PO&sub4; 1,19; NaHCO&sub3; 25; Glucose 5,5; und rekombinantes Human-Insulin (Humulin-R, Eli Lilly, IN) oder entweder synthetisches Ratten- (Bachem, Torrance, Ca. Charge# ZG485) oder synthetisches Human-Amylin (Bachem, Torrance, Ca. Chargen ZH 144), wie unten ausführlich beschrieben, enthielten. Die zur Bestimmung der Natur und Reinheit von Ratten- und Human- Amylin angewandten Methoden umfaßten die quantitative Aminosäure-Analyse, die Gasphasen-Aminosäure-Sequenzierung, die Umkehrphasen-HPLC und die 'fast atom bombardement'-Massenspektrometrie. Mittels der letzteren beiden Methoden betrug die Reinheit 98,4 bzw. 97,9%. Unter Anwendung dieser Methoden konnte jedoch das eine Atom Quecksilber pro Molekül Ratten-Amylin nicht detektiert werden, das anschließend durch Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie und Atomabsorptions-Spektroskopie erfolgte. Die anschließende Analyse der Synthesemethode des Ratten-Amylins läßt darauf schließen, daß dieses Atom zwischen die Schwefelatome der Cystein-Reste 2 und 7 eingeschoben ist und daher Teil der Ringstruktur nahe dem Amino-Terminus bildet. Der Einbau von Quecksilber in das Ratten-Amylin kann ein Merkmal vieler kommerziell verfügbarer Chargen sein, wie bereits in veröffentlichten Untersuchungen verwendet. Da das Peptid bioaktiv war, wurde von seiner Wirkung im Muskel eine zumindest qualitative Nachahmung des echten Ratten-Amylins erwartet. Die Quecksilber-Methode der Ringbildung wurde in der Synthese von Human-Amylin nicht angewandt, das mittels Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie und Atomabsorptions-Spektroskopie als Quecksilber-frei befunden wurde.
Die Muskeln wurden in verschiedene Kolben eingebracht, so daß die vier Muskelstücke eines jeden Tiers gleichmäßig auf die verschiedenen Assaybedingungen verteilt waren. Die Inkubationsmedien wurden durch leichtes Blasen von Carbogen (95% O&sub2;, 5% CO&sub2;) über die Oberfläche unter fortgesetztem Rütteln bei 37ºC in einem Schüttelwasserbad begast. Der pH-Wert der begasten Medien bei 37ºC wurde als 7,1 bis 7,4 verifiziert. Nach halbstündiger Vorinkubation wurden 0,5 uCl der [U-¹&sup4;C]-Glucose jedem Kolben über weitere 60 Minuten hinweg zugegeben. Jedes Muskelstück wurde dann schnell entfernt, von Sehnen befreit, abgetupft, in Flüssig-N&sub2; eingefroren, gewogen und dann bei 20ºC zur späteren Bestimmung des ¹&sup4;C-Glykogens eingelagert. Das Inkubationsmedium wurde ebenfalls zur anschließenden Analyse eingefroren. Die Konzentration an im Medium am Ende der Inkubation vorhandenem Human-Amylin wurde mittels Radioimmunoassay in Tensid-haltigem Puffer bestimmt. Sowohl für Human- als auch Ratten-Amylin wurde die dem Inkubationsmedium zugegebene tatsächliche Masse mittels quantitativer Aminosäure-Analyse bestimmt.

¹&sup4;-C-Glykogen-Bestimmung

Jede gefrorene Muskelprobe wurde in eine Phiole mit 1 ml an 60% Kaliumhydroxid (Gew/Vol) eingebracht und bei 70ºC über 45 Minuten hinweg unter intermittierendem kräftigen Rühren verdaut. Gelöstes Glykogen wurde auf die Wände der Phiole durch Zugabe von 3 ml absolutem Ethanol und nächtlichem Kühlen bei -20ºC ausgefällt. Nach 30minütiger Zentrifugation bei 2000 · g wurde der Überstand leicht abgesaugt, das Glykogen nochmals mit Ethanol gewaschen und zentrifugiert, das Ethanol abgesaugt und das Präzipitat unter Vakuum getrocknet. Wichtig war, alles Ethanol einzudampfen, um eine Abschreckung während der Szintillationszählung zu vermeiden. Das verbleibende Glykogen wurde nochmals in 1 ml Wasser und 4 ml Szintillationsflüssigkeit gelöst und auf ¹&sup4;C gezählt.

Numerische Methoden

Eine Rate des Glucose-Einbaus in Glykogen (ausgedrückt in uMol/Std./g Naßgewebe) wurde von der spezifischen Aktivität der ¹&sup4;C-Glucose in der 5,5 mM Glucose des Inkubationsmediums erhalten und die gesamte ¹&sup4;C-Glycose, die im Glykogen verblieben war, aus jedem Muskel extrahiert. Die Dosis-Wirkungs-Kurven wurden einem logistischen Modell mit 4 Parametern unter Anwendung der sich wiederholenden Methode der kleinsten Quadrate (ALLFIT, v2,7, NIH, MD) zur Ableitung der EC&sub5;&sub0; angepaßt. Da der EG&sub5;&sub0; log-normal verteilt ist, wird er ± Standardabweichung des Logarithmus ausgedrückt. Paarweise Vergleiche wurden unter Anwendung von auf t-Test basierenden Routinemethoden des SYSTAT vorgenommen.

Insulindosis-Wirkung

Insulindosis-Wirkungs-Kurven wurden durch Inkubationen bei Medien erhalten, die bei Endkonzentrationen von 0, 0,071, 0,21, 0,71, 2,1, 7,1 und 71 nM1) [1) angewandte Umrechnung, 1 uE/ml = 7,1 pM.] zugegebenes Insulin enthielt.

Amylindosis-Wirkung

Amylindosis-Wirkungs-Kurven wurden erhalten, indem Muskeln in Medien eingebracht wurden, die 7,1 nM rekombinantes Human-Insulin und entweder synthetisches Ratten- oder synthetisches Human-Amylin (Bachem, Torrance, Ca) enthielten, das bei End-(Nominal)-Konzentrationen von 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 und 1000 nM zugegeben wurden.
Aus zwei Gründen wurde eine supraphysiologische Insulin-Konzentration verwendet: (1) Die Präzision der Bestimmung des EC&sub5;&sub0; wurde zur Größe des ¹&sup4;C-Einbaus in Glykogen in Bezug gesetzt, da eine größere Amylin-Unterdrückung der Insulin- Wirkung bei nahezu maximaler Insulin-Stimulation möglich war; und (2) die Verwendung einer Insulinreaktion nahe dem Plateau (asymptotischer Teil) der Dosis- Wirkungs-Kurve gegenüber der 50% Reaktion, wie bei der häufig verwendeten Insulin-Konzentration von 710 pM erhalten, minimierte die Variation bei der Reaktion aufgrund einer Variation bei der Insulin-Badkonzentration oder individueller Muskelinsulin-Sensibilitäten. Die Wirkung der Verwendung höherer Insulin-Konzentrationen ist aus der verminderten Standardabweichung der EC&sub5;&sub0; der Amylindosis-Wirkung erkennbar, wie ausführlich in Tabelle 1 gezeigt.
Jeder Assay enthielt auch interne positive Kontrollen, bestehend in einer Einzelcharge (Bachem Charge# 2G485) von archiviertem Ratten-Amylin, das lyophilisiert und bei -20ºC gelagert worden war.
In Abb. 9 sind die Daten aus 5 Amylindosis-Wirkungs-Assays gepoolt, die an einer einzelnen Charge von Human-Amylin in Gegenwart von 7,1 nM Insulin vorgenommen wurden, gezeigt. Kurve A wurde den erhaltenen Daten angepaßt, wenn die Amylin-Konzentration von einer anfänglich abgewogenen und verdünnten Masse stammt. Kurve B wurde den erhaltenen Daten angepaßt, wenn die Amylin- Konzentration aus einer den Assay-Medien zugegebenen Peptidmasse stammt, wie mittels quantitativer Aminosäure-Analyse bestimmt. Kurve C wurde den erhaltenen Daten angepaßt, wenn die Amylin-Konzentration in den Assay-Medien mittels Radioimmunoassay gemessen wird. Der EC&sub5;&sub0; für Kurve C beträgt 483 pM ± 0,17 log-Einheiten (SE).

Insulin/Amylin-Wirkungs-Matrix

Die Insulin/Amylindosis-Wirkungs-Matrix wurde durch Wiederholen der Insulindosis- Wirkungs-Analysen mit Amylin erhalten, wie zu nominalen Endkonzentrationen von 0, 3, 10, 30, 100 und 300 nM zugegeben, wobei eine 6 · 6-Tafel mit Quadruplikaten bei jeder Kombination von Insulin- und Amylin-Konzentrationen erzeugt wurde.

Dosis-Wirkung bei festgelegtem Insulin : Amylin-Verhältnis

Die Muskeln werden in Medien inkubiert, die synthetisches Ratten-Amylin und rekombinantes Human-Insulin enthielten, wie in einem 1 : 7,1-Molverhältnis zugegeben.

Insulin und Amylin-Dosis-Wirkungen

Die aus 7 Insulindosis-Wirkungs-Assays gepoolten Daten, wie in Abwesenheit von Amylin vorgenommen, sind in Abb. 2 gezeigt. Es trat ein 3,7-facher Anstieg bei der Rate der Glykogen-Markierung bei einem EC&sub5;&sub0; der Wirkung von 1,05 nM ± 0,07 log- Einheiten ein (n = 8 bis 28 pro Punkt).

Dosis-Wirkung bei kombiniertem Insulin/Amylin

In Abb. 3 ist eine Reihe von Insulindosis-Wirkungs-Kurven gezeigt, wie in Gegenwart der angegebenen verschiedenen Amylin-Konzentrationen erhalten. Die Daten für die Maxima und EC&sub5;&sub0; der Insulin-Wirkungen sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Sie weisen darauf hin, daß der EC&sub5;&sub0; der Insulinwirkung mit steigenden Amylin-Konzentrationen nichtprogressiv rechtsverschoben war. In Abb. 4 sind die Amylindosis- Wirkungs-Kurven gezeigt, wie mit den angegebenen verschiedenen Insulin- Konzentrationen erhalten. Die in Tabelle 1 dargestellten EC&sub5;&sub0; und Maximalwirkungen von Amylin weisen entsprechend darauf hin, daß der EC&sub5;&sub0; der Amylinwirkung von der vorliegenden Insulin-Konzentration unabhängig war. In anderen Worten könnte Amylin die Markierung von Glykogen bei allen Insulin- Konzentrationen unterdrücken. In Abb. 5 sind die Daten aus den Insulin- und Amylindosis-Wirkungen in einer einzelnen angepaßten Oberfläche kombiniert. Die Oberfläche wurde als das Produkt der fraktionellen Reaktionen auf Insulin und Amylin unter Verwendung von Parametern für Gefälle und EC&sub5;&sub0; für die Insulin- und Amylin-Transekte erzeugt und auf log/log/lineare Achsen aufgetragen.
Die Gleichung für die Oberfläche ist
Die Gleichung weist also die allgemeine Form auf:
Reaktion = [Insulinfaktor] · [Amylinfaktor] · F + K, wobei
Ains = 1 Aamy = 1 (Maximalreaktionen)
Bins = -0,889 Bamy = 0,835 (Gefällefaktoren)
Cins = 1,42 nM Camy = 9,0 nm (EC&sub5;&sub0;)
Dins = 0,18 Damy = 0,15 (Basisreaktionen)
F (Reaktionsfaktor) = 4,0 uMol/Std/g naßer Muskel
K (Konstante) = 0,14
Die Insulin- und Amylin-Konzentrationen sind in nM angegeben.
Da die Basisebene des Graphen durch log-[Insulin]- und log-[Amylin]-Achsen definiert ist, sind Kombinationen von Insulin und Amylin in jeglichem gegebenem Verhältnis als gerade Linien auf dieser Ebene dargestellt. Die Amylin : Insulin- Verhältnisse von 0,01 : 1, 0,14 : 1 und 1 : 1 beschreibenden Linien ragen von der Oberfläche aus hoch (markiert mit 0,01, 0,14 bzw. 1).

Dosis-Wirkung bei festgelegtem Insulin : Amylin-Verhältnis

Die experimentell bestimmte Reaktion auf steigende Konzentrationen eines festgelegten 0,14 : 1-Verhältnisses von Amylin : Insulin sind in Abb. 6 als leere Kreise aufgetragen. Die aus Gleichung 1 unter Anwendung von [Amylin] = [Insulin] · 0,14 errechnete glockenförmige Funktion, die der mit "0,14" in Abb. 5 markierten Trajektorie entspricht, ist als kontinuierliche Linie gezeigt. Ebenfalls aufgetragen ist die sigmaförmige Dosis-Wirkung, die für Insulin in Abwesenheit von Amylin vorhergesagt wird. Die Daten entsprechen dem glockenförmigen Profil, das für einen nichtkompetitiven funktionellen Antagonismus vorhergesagt ist und nicht für eine verschobene sigmaförmige Reaktionskurve, wie für einen kompetitiven Antagonismus vorgesagt werden würde.
Die Feststellung, daß die EC&sub5;&sub0; für die Amylin- und Insulinwirkung am Soleusmuskel durch Erhöhung der Konzentrationen des anderen Hormons nicht verändert werden, stimmen mit den biochemischen und pharmakologischen Daten überein, die darauf hinweisen, daß sie eher über separate Rezeptoren als durch Konkurrieren an einem gemeinsamen Rezeptor wirken. Amylin verhält sich als ein nichtkompetitiver funktioneller Antagonist zu Insulin. Das heißt, Amylin reduziert die Größe der Insulinreaktion ohne Beeinträchtigung der Potenz von Insulin. Von entscheidender Wichtigkeit für die Analyse der Rolle des Amylins ist die Feststellung, daß es eine unüberwindbare Hemmung der Insulinwirkung bewirkt.
Die biologische Aktivität des Amylins wurde ursprünglich als ein "Antagonismus" der Muskelreaktion auf Insulin beschrieben. Einige mögen deshalb erwogen haben, daß Amylin und Insulin sich gegenseitig aufhebende Signale darstellen und daß dann, wenn diese Hormone in einem konstanten Verhältnis sekretiert werden, die Wirkungen jeglichen Anstiegs des Plasma-Amylins durch den proportionalen Anstieg beim Insulin gleich Null gemacht werden. Das "konstante Verhältnis" schneidet durch die Reaktionsoberfläche (Abb. 4), anstatt vorauszusagen, daß bei beliebigen festgelegten Verhältnissen von Insulin und Amylin die Unterdrückung der Insulinreaktionen durch Amylin mit steigenden Konzentrationen beider Hormone schließlich eintritt. Diese Voraussage wurde durch die in Abb. 6 gezeigten Experimente bestätigt. Würden Amylin und Insulin in einem festgelegten Verhältnis gemeinsam sekretiert werden, so würde die glockenförmige Trajektorie aus Abb. 6 für die Reaktion des Muskels auf eine steigende Sekretion der β-Zelle stehen. Der Scheitelpunkt des Peaks, die Position und Form der glockenförmigen Insulin : Amylin- Kurve sind Funktionen der Muskel-Sensibilitäten gegenüber Insulin und Amylin und deren Konzentrationsverhältnis. Tabelle 1 Insulindosis-Wirkung

Beispiel 2: Tägliche Amylin-Ersetzung kehrt den hepatischen Glykogen-Verlust bei Insulin-behandelten Streptozotocin-diabetischen Ratten um

Bei Streptozotocin-diabetischen Ratten, die mittels Insulin-Ersetzung behandelt wurden, geht das Leber-Glykogen zu 35% verloren. Subkutane Injektionen über 5 aufeinanderfolgende Tage hinweg von Amylin stellte in Dosis-abhängiger Weise die normalen Spiegel des Leber-Glykogens wieder her. Signifikante Anstiege bei der nur-Insulin-Therapie traten bei Amylin-Dosen von 10, 30 und 100 mg/Tag auf, was Amylin : Insulin-Verhältnisse von 0,22, 0,75 und 2,79 darstellte.

Tiere

Es wurden 68 männliche Harlan-Sprague-Dawley-Ratten (Masse 301 ± 3 g) auf 8 Behandlungsgruppen verteilt. Die Tiere wurden bei 22,7 ±0,8ºC in einem 12 : 12 Stunden Hell : Dunkel-Zyklus (die Experimente wurden während des Hell-Zyklus durchgeführt) behaust und ad libitum gefüttert und getränkt (Diet LM-485, Teklad, Madison, WI). Die Tiere wurden zur Entnahme der Lebern nach 4 bis 5 Stunden im Hell-Zyklus geopfert.

Behandlungsgruppen

1. STZ-diabetische nur-Insulin-Behandlung (n = 11)
Den Tieren wurde in Wasser gelöstes Streptozotocin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO: Sigma 50130) in einer Dosis von 65 mg/kg in die laterale Schwanzvene injiziert. Als sie eine 5% Glykosurie (Chemstrip uGH, Boehringer-Mannheim, BRD) zeigten, wurde ein gleitend eingeteiltes tägliches Insulin-Behandlungsschema (Humulin-Ultralente, Eli Lilly, Indianapolis, IN) bei den Ratten fortgesetzt, das auf die Aufrechterhaltung der Acetonurie (mittels Chemstrip), doch bei 5% Glykosurie, abzielte. Durch Halten der diabetischen Ratten in diesem metabolischen Zustand wird die Überlebensrate optimiert. Eine Woche nach nachgewiesenem Diabetes erhielten die Tiere einmal täglich s.c.-Injektionen von Amylin-Träger (Wasser zur Injektion) über 5 Tage hinweg zur gleichen Zeit der Verabreichung der Insulin- Injektion.
2-6 STZ-Diabetes, Insulin+Amylin-Behandlungsgruppen
Diese Tiere wurden gleich wie die in Gruppe 1 behandelt, außer daß die tägliche subkutane Injektion 3 ug (n = 5); 10 ug (n = 12); 30 ug (n = 5); 100 ug (n = 5) oder 300 ug (n = 5) Ratten-Amylin (Bachem Charge# WG4852) [2) Von dieser Charge von Ratten-Amylin wurde anschließend festgestellt, daß sie eine Quecksilber-Kontaminante enthielt, die vermutlich zwischen die Schwefel- Atome der 2-Cys 7-Cys-Disulfid-Brücke eingelagert war.] enthielt. Die Bioaktivität des bei diesen Experimenten verwendeten Peptids wurde zunächst mittels Bioassay anhand der Hemmung des Insulin-stimulierten Radioglucose-Einbaus in Glykogen im isolierten freigelegten Ratten-Soleusmuskel verifiziert. Der für das verwendete Peptid abgeleitete EC&sub5;&sub0; betrug 6,2 nM (±0,2 log-Einheiten). Die Insulin-Dosis bei jeder der Gruppen der diabetischen Tiere betrug im Mittel 1,67 E/Tier/Tag. Es lagen keine weiteren beobachtbaren Unterschiede bei der erforderlichen Behandlung der verschiedenen Gruppen vor.
7. Normale Tiere (n = 10)
Diese Tiere stammten aus derselben Zucht und wurden unter denselben Bedingungen über denselben Zeitraum hinweg wie die Tiere in Gruppen 1-6 behaust, doch erhielten keine Injektionen. 24 Stunden nach der fünften täglichen Injektion von Amylin oder Wasser (oder einem gleichwertigen Zeitraum nach Einbringen in den Tierkäfig im Falle der Ratten der Gruppe 7) wurden die nicht- futterentzogenen Ratten durch Dekapitation getötet und die Leber sofort entnommen und in Flüssig-N&sub2; gefroren, gewogen und zur anschließenden Bestimmung der Glykogen-Konzentration aufbewahrt.
8. STZ-diabetische Tiere, keine Behandlung (n = 10)
Diese Tiere wurden in gleicher Weise wie Gruppen 1-6 diabetisch gemacht, doch erhielten weder Insulin noch Amylin.

Glykogen-Bestimmung

Die ganzen Lebern wurden im gefrorenen Zustand pulverisiert. Etwa 200 mg des Pulvers wurde weiter in 1,0 ml der 0,6 M Perchlorsäure zur Denaturierung der Enzyme denaturiert. 200 ul des Homogenats wurden mit 0,5 Volumeneinheiten an 1,0 M KHCO&sub3; in zwei Acetat-Pufferlösungen homogenisiert, wobei eine 2,0 ml an 200 mM Acetat (pH 4,8) enthielt, die andere dasselbe, doch mit zugesetzten 18,5 E/ml Amyloglucosidase (EC5 3.2.1.3, aus Asperaillus niger, Sigma A3423, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) enthielt. Nach mindestens 20minütiger Inkubation bei 23ºC wurden die Überstände auf die Glucose hin in einem Analysegerät unter Verwendung von D-Glucoseoxidase immobilisierter Enzym- Chemie (Analyzer Modell 2300-STAT, YSI, Yellow Springs, OH) untersucht. Gereinigtes Kaninchenleber-Glykogen (Sigma G8876), das als Standardsubstanz diente, ergab eine 98±4% Rückgewinnung an gelöstem Glykogen und eine Linearität innerhalb des Bereichs der beobachteten Leberglykogen-Konzentrationen (r = 0,9994). Alle Reagentien waren von analytischer Qualität oder besser.

Numerische Methoden

Die statistischen Vergleiche wurden mittels Student-t-Test-Methode, wie im SYSTAT-System vorgesehen (Systat, Evanston, IL) vorgenommen. Alle Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung vom Mittel angegeben.

Leberglykogen

Der Leberglykogen-Spiegel wurde bei Ratten mit freiem Zugang zur Nahrung bis zum Zeitpunkt der Opferung gemessen (Fasten erschöpft das Leberglykogen schnell, so daß die Gehalte nach 18-stündigem Hungern typischerweise lediglich 2-5% des im gefütterten Zustand beobachteten beträgt). Die Glykogen-Spiegel bei den 8 Tiergruppen sind in Abb. 8 gezeigt. STZ-diabetische Tiere ohne Therapie zeigten eine 67%ige Abnahme der Leberglykogen-Konzentration im Vergleich zu normalen Ratten (2,86 vs 8,6 mg/g, P< 0,001). STZ-diabetische Tiere, die eine Insulin-Ersetzung erhielten, wiesen eine 35%ige Abnahme des Leberglykogens im Vergleich zu normalen Ratten auf (5,6 vs 8,6 mg/g P< 0,01). Bei Insulin-behandelten STZ-diabetischen Ratten, denen täglich Amylin zugesetzt wurde, zeigte sich ein Dosis abhängiger Anstieg der Leberglykogen-Konzentration über die bei Ratten hinaus, die lediglich Insulin erhielten (P< 0,05, 10 ug/Tag; P< 0,02, 30 ug/Tag; P< 0,01, 100 ug/Tag). Die Leberglykogen-Konzentration bei Tieren, die 10, 30 und 100 ug Amylin pro Tag erhielten, war nicht signifikant verschieden zu der bei normalen Tieren (P< 0,3), obschon die Mittelwerte einen Dosis-abhängigen Anstieg mit einem erkennbaren Peak bei 30 ug/Tag zeigten. Die kleinste untersuchte Dosis, 3 ug/Tag, erhöhte die Glykogen-Spiegel nichtmeßbar über die bei der nur-Insulin- Behandlung gemessenen Werte hinaus. Interessanterweise brachte auch die höchste Dosis an getestetem Amylin, 300 ug/Tag, das Leberglykogen nicht meßbar auf normal zurück, was eine offensichtlich biphasige Dosisreaktion ergab.
Die Ergebnisse zeigen, daß die kombinierte Ersetzung von Amylin und Insulin wieder normale Leberglykogen-Spiegel bei STZ-diabetischen Ratten herstellen kann; eine volle Wiederherstellung wird mit nur-Insulin-Therapie nicht erreicht. Diese physiologische Reaktion wird durch eine subkutane Injektion einmal täglich in einem Molverhältnis von Amylin zu Insulin nahe dem bewirkt, das für bei gesunden Tieren natürlich vorhanden erachtet wird.
Fachleute mit üblicher Sachkenntnis, die sich einen Überblick über die beiden oben angegebenen Beispiele verschaffen, werden erkennen, daß die Daten einem Fachmann mit üblicher Sachkenntnis die Verabreichung von Insulin und Amylin in den angegebenen Verhältnissen als einer wirksamen Behandlung von Diabetes beim Menschen nahelegen. Amylin und Insulin können in standardmäßiger Weise unter Verwendung pharmazeutisch geeigneter Puffer verabreicht werden. Zum Beispiel können die Hormone in einer Form verabreicht werden, die eine verzögerte Freisetzung der Hormone im Körper bewirkt.
Weitere Ausführungsformen finden sich in den folgenden Ansprüchen.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend ein Insulin mit einer in vitro-Aktivität zur Stimulierung des Glucose-Einbaus in Glykogen im Ratten-Soleusmuskel, und ein Amylin mit der in vitro-Aktivität zur Unterdrückung des Glucose-Einbaus in Glykogen im Ratten-Soleusmuskel, wobei das Insulin und Amylin in einem Molverhältnis von 1 : 1 bis 40 : 1 bereitgestellt werden.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Insulin und Amylin in einem Molverhältnis von 2,5 : 1 bis 35 : 1 bereitgestellt werden.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Insulin und Amylin in einem Molverhältnis von 5 : 1 bis 10 : 1 bereitgestellt werden.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zusammensetzung in einer für die parenterale Verabreichung geeigneten Form bereitgestellt wird.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Insulin in einer schnellwirkenden Form bereitgestellt wird.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, zur Verwendung bei einer Methode zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

7. Anwendung einer Zusammensetzung, umfassend ein Insulin und ein Amylin, wobei das Insulin und Amylin in einem Molverhältnis von 1 : 1 bis 40 : 1 bereitgestellt werden, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugers mit einer verminderten Fähigkeit zur Produktion von Serum-Insulin im Vergleich zu einem normalen Säuger.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 definiert ist.

9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Amylin in einer Menge von mindestens 0,5 Mikrogramm pro Kilogramm des Säugers pro Tag bereitgestellt wird.

10. Verwendung nach Anspruch 7, 8 oder 9, wobei die Zusammensetzung, umfassend Insulin und Amylin, einen zirkulierenden Plasmagehalt an Amylin in einem Säuger bereitstellt, der etwa 3 bis 6 Prozent dessen an Insulin beträgt.