DE69221147T2 - Nicht glycosylierter Anti-CD3-IgG-Antikörper - Google Patents
Nicht glycosylierter Anti-CD3-IgG-AntikörperInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft neue Antikörper, insbesondere gegen den CD3-Antigen- Komplex gerichtete Antikörper.
- Antikörper, oder Immunoglobuline, umfassen zwei über Disulfidbrücken miteinander verbundene schwere Ketten und zwei leichte Ketten, wobei jede leichte Kette an jeweils eine schwere Kette über Disulfidbrücken in einer "Y"-förmigen Konfiguration gebunden ist. Die zwei "Arme" des Antikörpers sind für die Antigenbindung verantwortlich und schließen Regionen ein, in denen die Polypeptidstruktur variiert, wobei diese "Arme" als Fab'-Fragmente (Fragment-Antigen-bindend) oder F(ab')&sub2;, was für die zwei über Disulfidbrucken miteinander verbundenen Fab'-Arme steht, bezeichnet werden. Der "Schwanz" oder die Zentralachse des Antikörpers enthält eine feste oder konstante Sequenz von Peptiden und wird als das Fc- Fragment (Fragment-kristallin) bezeichnet. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern wurde zuerst von Kohler und Milstein (Kohler & Milstein, Nature 256 495-497 (1975)) beschrieben. Derartige monoklonale Antikörper haben eine weitverbreitete Anwendung als diagnostische Mittel und auch in der Therapie gefünden.
- Jede schwere Kette besitzt an einem Ende eine variable Domäne, an die sich eine Anzahl konstanter Domänen anschließt. Jede leichte Kette besitzt eine variable Domäne an einem Ende und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende, wobei die variable Domäne der leichten Kette parallel zur variablen Domäne der schweren Kette angeordnet ist und die konstante Domäne der leichten Kette parallel zur ersten konstanten Domäne der schweren Kette (CH1) angeordnet ist. Die konstanten Domänen in den leichten und schweren Ketten sind nicht direkt an der Bindung des Antikörpers an das Antigen beteiligt. Die konstante Domäne der leichten Kette und die CH1-Domäne der schweren Kette machen 50 % jedes Fab'- Fragmentes aus.
- Die variablen Domänen jedes Paars von leichten und schweren Ketten bilden die Antigenbindungsstelle. Die Domänen auf den leichten und schweren Ketten besitzen dieselbe allgemeine Struktur, und jede Domäne umfaßt vier Gerüstbereiche, deren Sequenzen verhältnismäßig konserviert sind, welche durch drei Komplementaritäts-bestimmende Bereiche (CDRs) verbunden sind (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S Department of Health and Human Services (1987)). Die vier Gerüstbereiche nehmen großteils eine β-Faltblatt-Konformation ein, und die CDRs bilden Schleifen, die die β-Faltblatt-Struktur verbinden, und in einigen Fällen Teil davon sind. Die CDRs werden durch die Gerüstbereiche in enger Nachbarschaft gehalten und tragen, mit den CDRs aus der anderen Domäne, zur Bildung der Antigenbindungsstelle bei.
- Das humane CD3-Antigen besteht aus einem Minimum von vier invarianten Polypeptidketten, welche mit den T-Zellrezeptoren auf der Oberfläche von T-Zellen nicht-kovalent assoziiert sind, und wird jetzt allgemein als der CD3-Antigen-Komplex bezeichnet. Er ist eng am Vorgang der T-Zellaktivierung als Antwort auf Antigenerkennung durch die T-Zellrezeptoren beteiligt.
- Alle monoklonalen CD3-Antikörper können verwendet werden, um T-Zellen für sekundäre Proliferations-Stimuli, wie IL1 (Interleukin 1) und IL2 (Interleukin 2) empfindlich zu machen. Daruber hinaus sind bestimmte monoklonale CD3-Antikörper selbst mitogen für T-Zellen. Diese Eigenschaft ist Isotyp-abhängig und folgt aus der Wechselwirkung der Fc- Domäne der CD3-Antikörper mit Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche akzessorischer Zellen.
- Nager-CD3-Antikörper sind verwendet worden, um den immunologischen Zustand durch Unterdrucken, Verbessern oder Umlenkung von T-Zell-Antworten gegenüber Antigenen zu beeinflussen. Sie besitzen deshalb beim Menschen ein beträchtliches therapeutisches Potential zur Verwendung als Immunsuppressionsmittel, zum Beispiel für die Behandlung von Abstoßungsperioden im Anschluß an die Transplantation von Nieren-, Leber- und Herz- Fremdimplantaten. Ihr Nutzen wird jedoch durch zwei Hauptfaktoren gefährdet. Der erste ist die aufgrund der xenogenen Natur des Antikörpers hervorgerufene Antiglobulin-Antwort. Der zweite ist das von den Patienten im Anschluß an die anfängliche Verabreichung des Antikörpers erfahrene "Erste Dosis"-Syndrom. Die Symptome, welche in ihrer Schwere von Fieber und Fieberfrost bis zum Lungenödem reichen, und welche in seltenen Fällen den Tod verursachen können, werden verursacht durch die im Kreislauf befindlichen erhöhten Cytokinspiegel, die mit der von CD3-Antikörpern induzierten T-Zell-Aktivierung zusammenhängen. Dieses Phänomen erfordert die Quervernetzung des CD3-Antigens auf der Oberfläche von T-Zellen an akzessorische Zellen über Fc-Rezeptoren; eine solche Proliferation tritt bei F(ab')2-Fragmenten von CD3-Antikörpern nicht auf.
- Dem ersten Problem kann durch Umformen oder "Humanisieren" der Gene für die variable Region von Antikörpern und Exprimieren derselben in Assoziation mit entsprechenden Genen für die humane konstante Domäne begegnet werden. Dies vermindert den nichthumanen Gehalt des monoklonalen Antikörpers auf einen derart geringen Anteil, daß eine Antiglobulin-Antwort unwahrscheinlich ist. Ein solcher umgeformter Antikörper mit einer Bindungsaffinität für den CD3-Antigen-Komplex ist in der GB-Patentanmeldung Nr. 9121126.8 (veröffentlicht als GB-A-2 249 310A) und ihren Äquivalenten (Europäische Patentanmeldung Nr. 91 917 169.4 (EP-A-0 504 350), Japanische Patentanmeldung Nr. 516117/91 und U.S.-Patentanmeldung Nr.07/862543) beschrieben.
- Das Problem der Ersten-Dosis-Antwort bleibt allerdings bestehen, wenn diese Antikörper in der Therapie verwendet werden. Es wurde beschrieben, daß die Aglykosylierung von Antikörpern deren Fähigkeit zur Bindung an Fc-Rezeptoren in vitro in manchen Fällen vermindert. Es ist allerdings nicht vorhersagbar, daß dies bei allen Antikörpern der Fall sein wird, insbesondere in vivo, und die Aglykosylierung kann zur Einführung von neuen und unvorhersagbaren Eigenschaften in den Antikörper führen, einschließlich neuer Fc-Bindungsmerkmale, welche andere unerwünschte Effekte verursachen. Es ist ebenfalls möglich, daß dem Antikörper andere unerwünschte Eigenschaften, welche nicht mit der Fc-Bindung in Zusammenhang stehen, verliehen werden können.
- Darüber hinaus ist es natürlich von größter Bedeutung, daß die Aglykosylierung nicht vom Verlust bestimmter erwünschter Merkmale der Fc-Bindung zusätzlich zum Verlust der unerwünschten Merkmale, wie denjenigen, welche der Ersten-Dosis-Antwort zuzurechnen sind, begleitet wird.
- Nun ist jedoch festgestellt worden, daß es möglich ist, nicht glykosylierte CD3- Antikörper der IgG-Unterklasse herzustellen, welche überraschenderweise ihre Antigen- Bindungs-Spezifität und immunosuppressiven Eigenschaften beibehalten und dennoch keine T-Zell-Mitogenese in vitro herbeiführen und eine verminderte Höhe der Cytokinfreisetzung in vivo induzieren, während sie eine gewisse Fc-Bindungsfähigkeit dennoch beibehalten.
- Demgemäß stellt die Erfindung einen nicht glykosylierten IgG-Antikörper mit einer Bindungsaffinität für den CD3-Antigen-Komplex zur Verfügung.
- Der Begriff "nicht glykosyliert" wird in seiner normalen Verwendung eingesetzt, um anzuzeigen, daß die Antikörper gemäß der Erfindung nicht glykosyliert sind. Obwohl die vorliegende Erfindung auf Antikörper mit einer Bindungsaffinität für einen nicht-humanen CD3-Antigen-Komplex, zum Beispiel verschiedene andere Säuger-CD3-Antigene für tiermedizinische Verwendung, angewandt werden kann, liegt der hauptsächliche Nutzen der Erfindung in nicht glykosylierten Antikörpern mit einer Affinität für den humanen CD3- Antigen-Komplex zur Verwendung beim Menschen, und die folgende Erörterung richtet sich insbesondere auf diesen Kontext.
- Eine weitere Erörterung von CD3-Antigenen kann in dem Bericht des "First International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens" gefunden werden, und eine Beschreibung von verschiedenen gegen das CD3-Antigen gerichteten glykosylierten Antikörpern läßt sich auch in den Berichten dieser Reihe von Workshops und Konferenzen, insbesondere der dritten und vierten, veröffentlicht von Oxford University Press, finden. Spezifische Beispiele solcher Antikörper schließen diejenigen ein, welche von Van Lier et al., Euro. J. Immunol., 1987, 17, 1599-1604, Alegre et al., J. Immunol., 1991, 140, 1184, und von Smith et al., ebenda, 1986, 16, 478, beschrieben wurden, wobei die letzte Druckschrift den IgG1-Antikörper UCHT1 und Varianten davon betrifft. Von besonderem Interesse als Basis für nicht glykosylierte Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung sind jedoch die in den Antikörpern OKT3 und YTH 12.5.14.2 enthaltenen CDRs. Der Antikörper OKT3 wird in Veröffentlichungen, wie Chatenaud et al., Transplantation, 1991, 51, 334, und der Druckschrift New England Journal of Medicine, 1985, 313, 339, und ebenfalls im Europäischen Patent Nr.0 018 795 und dem U.S.-Patent Nr.4 361 539 erörtert. Der Antikörper YTH 12.5.14.2 (hier nachfolgend bezeichnet als YTH 12.5) wird in Veröffentlichungen, wie Clark et al., European J. Immunol., 1989 19 381-388, erörtert und umgeformte YTH 12.5-Antikörper sind Gegenstand der GB-Patentanmeldung Nr.9121126.8 (GB-A-2 249 310) und ihren Äquivalenten, wobei diese Anmeldung die in diesem Antikörper vorhandenen CDRs ausführlich beschreibt.
- Nicht glykosylierte Antikörper mit einem oder mehreren der CDRs, welche in der obenstehenden Anmeldung beschrieben sind, sind von besonderem Interesse. Somit weisen die Antikörper der Erfindung vorzugsweise mindestens ein CDR, welches aus den folgenden Aminosäuresequenzen gewählt ist, auf:
- (a) Ser-Phe-Pro-Met-Ala (SEQUENZ ID Nr.1),
- (b) Thr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val-Lys-Gly (SEQUENZ ID Nr.2),
- (c) Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr (SEQUENZ ID Nr.3),
- (d) Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn-Tyr-Val-His (SEQUENZ D Nr.4),
- (e) Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp (SEQUENZ ID Nr.5),
- (f) His-Ser-Tyr-Val-Ser-Ser-Phe-Asn-Val (SEQUENZ ID Nr.6),
- und konservativ modifizierte Varianten davon.
- Der Begriff "konservativ modifizierte Varianten" ist im Fachgebiet gut bekannt und bezeichnet Varianten mit Veränderungen, welche im wesentlichen ohne Wirkung auf die Antikörper-Antigen-Affinität sind.
- Die CDRs sind innerhalb von Gerüstbereichen der variablen Domänen der schweren Kette (für (a), (b) und (c)) und leichten Kette (für (d), (e) und (f)) gelegen. Der Antikörper umfaßt auch eine konstante Domäne.
- In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt der nicht glykosylierte Antikörper drei CDRs, welche den obenstehenden Aminosäuresequenzen (a), (b) und (c) oder konservativ modifizierten Varianten davon entsprechen, und/oder drei CDRs, welche den Aminosäuresequenzen (d), (e) und (f) oder konservativ modifizierten Varianten davon entsprechen, wobei die CDRs (a), (b) und (c) der schweren Kette von der größten Bedeutung sind.
- Ein bevorzugter nicht glykosylierter Antikörper mit Bindungsaffinität für das CD3- Antigen besitzt somit eine schwere Kette mit mindestens einem CDR und insbesondere drei CDRs, gewählt aus den folgenden Aminosäuresequenzen:
- (a) Ser-Phe-Pro-Met-Ala (SEQUENZ ID Nr.1),
- (b) Thr-Ile-Ser-Thr-Der-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val-Lys-Gly (SEQUENZ ID Nr.2),
- (c) Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr (SEQUENZ ID Nr.3),
- und konservativ modifizierten Varianten davon, und/oder eine leichte Kette mit mindestens einem CDR und insbesondere drei CDRs, gewählt aus den folgenden Aminosäuresequenzen:
- (d) Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn-Tyr-Val-His (SEQUENZ ID Nr.4),
- (e) Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp (SEQUENZ ID Nr.5),
- (f) His-Ser-Tyr-Val-Ser-Ser-Phe-Asn-Val (SEQUENZ ID Nr.6),
- und konservativ modifizierten Varianten davon.
- Falls ein nicht glykosylierter Antikörper gemäß der Erfindung bevorzugte CDRs, wie hier vorstehend beschrieben, enthält, enthält er passenderweise sowohl einen oder mehrere der angegebenen CDRs der schweren Kette als auch einen oder mehrere der angegebenen CDRs der leichten Kette. Die CDRs (a), (b) und (c) sind in der schweren Kette in der Reihenfolge: Gerüstbereich 1/(a)/Gerüstbereich 2/(b)/Gerüstbereich 3/(c)/Gerüstbereich 4 in der Richtung Leader T konstante Domäne (N-terminal nach C-terminal) angeordnet, und die CDRs (d), (e), (f) sind in der leichten Kette in der Reihenfolge: Gerüstbereich 1/(d)/Gerüstbereich 2/(e)/Gerüstbereich 3/(f)/Gerüstbereich 4 in der Richtung Leader T konstante Domäne angeordnet. Es wird deshalb bevorzugt, daß, falls alle drei vorhanden sind, die CDRs der schweren Kette in der Reihenfolge (a), (b), (c) in der Richtung Leader T konstante Domäne angeordnet sind und die CDRs der leichten Kette in der Reihenfolge (d), (e), (f) in der Richtung Leader T konstante Domäne angeordnet sind.
- Man sollte jedoch davon ausgehen, daß nicht glykosylierte Antikörper gemäß der Erfindung von den hier vorstehend beschriebenen gänzlich verschiedene CDRs enthalten können und daß, selbst wenn dies nicht der Fall ist, es möglich sein kann, schwere Ketten und insbesondere leichte Ketten zu haben, welche lediglich einen oder zwei der CDRs (a), (b) und (c) bzw. (d), (e) und (f) enthalten. Obwohl die Gegenwart aller sechs obenstehend angegebenen CDRs deshalb nicht notwendigerweise in einem nicht glykosylierten Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung erforderlich ist, werden jedoch am gewöhnlichsten alle sechs CDRs in den am stärksten bevorzugten Antikörpern vorhanden sein. Ein besonders bevorzugter nicht glykosylierter Antikörper besitzt deshalb eine schwere Kette mit drei CDRs, umfassend die Aminosäuresequenzen (a), (b) und (c) oder konservativ modifizierte Varianten davon, und eine leichte Kette mit drei CDRs, umfassend die Aminosäuresequenzen (d), (e) und (f) oder konservativ modifizierte Varianten davon, wobei die CDRs der schweren Kette in der Reihenfolge (a), (b), (c) in der Richtung Leader 4 konstante Region angeordnet sind und die CDRs der leichten Kette in der Reihenfolge (d), (e), (f) in der Richtung Leader 4 konstante Region angeordnet sind.
- Die CDRs können von verschiedenem Ursprung als der variable Gerüstbereich und/oder der konstante Bereich sein, und dies ist, zumal die CDRs in der Regel einen Ratten- oder Maus-Ursprung haben, vorteilhaft, um eine Antiglobulin-Antwort beim Menschen zu verhindern, obwohl die Erfindung sich auf Antikörper mit solchen Bereichen von Ratten- oder Maus-Ursprung erstreckt.
- Gewöhnlicher sind die CDRs entweder vom gleichen Ursprung wie der variable Gerüstbereich aber von einem unterschiedlichen Ursprung als der konstante Bereich, zum Beispiel zum Teil ein humaner chimärer Antikörper, oder häufiger haben die CDRs einen anderen Ursprung als der variable Gerüstbereich.
- Die bevorzugten hier vorstehend erörterten CDRs werden aus einem Ratten-CD3- Antikörper erhalten. Obwohl der Gerüstbereich der variablen Domäne verschiedene Formen einnehmen kann, stammt er folglich passenderweise von denjenigen eines Nagers oder ist daraus abgeleitet, zum Beispiel einer Ratte oder Maus, und stammt weiter bevorzugt aus denjenigen menschlichen Ursprungs oder ist davon abgeleitet. Eine Möglichkeit für den Antikörper besteht darin, einen Gerüstbereich der variablen Domäne, welcher demjenigen in dem YTH 12.5-Hybridom entspricht, aufzuweisen, obwohl die konstante Region vorzugsweise dennoch von denjenigen menschlichen Ursprungs stammt oder davon abgeleitet ist. Der Antikörper der Erfindung liegt jedoch vorzugsweise sowohl hinsichtlich des Gerüstbereichs der variablen Domäne als auch, wie hier folgend weiter erörtert, hinsichtlich der konstanten Region, in der humanisierten Form vor.
- Folglich umfaßt die Erfindung ferner einen nicht glykosylierten Antikörper mit einer Bindungsaffinität für das humane CD3-Antigen, in welchem die Gerüstbereiche der variablen Domäne und/oder die konstante Region einen menschlichen Ursprung haben oder davon abgeleitet sind.
- Bestimmte humane Gerüstsequenzen der variablen Domäne werden für das Pfropfen der bevorzugten CDR-Sequenzen zu bevorzugen sein, da die dreidimensionale Konformation der CDRs in solchen Sequenzen besser aufrechterhalten wird und der Antikörper einen hohen Bindungsaffinitätswert für das Antigen beibehalten wird. Wünschenswerte Merkmale in derartigen Gerüstbereichen der variablen Domäne bestehen in der Gegenwart von Schlüsselaminosäuren, welche die Struktur der CDR-Schleifen aufrechterhalten, um die Affinität und Spezifität des Antikörpers für das CD3-Antigen zu gewährleisten, wobei der Lambda-Typ für die leichte Kette bevorzugt wird.
- Gerüstbereiche der variablen Region vom Menschen, welche für die Verwendung im Zusammenhang mit den oben genannten CDRs besonders geeignet sind, sind zuvor in der GB-Patentannneldung Nr.9121126.8 (GB-A-2 249 310) angegeben worden. Die Gerüstbereiche der variablen (V)-Region der schweren Kette sind diejenigen, für welche das humane VH-Typ 111-Gen VH26.D.J. codiert, welches aus der B-Zell-Hybridomzellinie 18/2 (Genbank- Code: Huminghat, Dersimonian et al., Journal of Immunology, 139, 2496-2501) stammt. Die Gerüstbereiche der variablen Region der leichten Kette sind diejenigen des humanen VLλ- Typ VI-Gens SUT (Swissprot-Code: LV6CSHum, Solomon et al. in Glenner et al. (Hrsg.), Amyloidosis, Plenum Press N.Y., 1986, S.449).
- Der eine oder mehrere bevorzugte CDR(s) der schweren Kette des Ratten-Anti-CD3- Antikörpers sind deshalb vorzugsweise in einem Gerüstbereich der humanen variablen Domäne vorhanden, welcher die folgende Aminosäuresequenz aufweist, gelesen in der Richtung Leader T konstante Region, wobei CDR ein CDR (a), (b) oder (c), wie hier obenstehend definiert, eine konservativ modifizierte Variante davon, oder einen alternativen CDR angibt:
- Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly- Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-/CDR/- Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-/CDR/- Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln- Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys- /CDR/-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser.
- (SEQUENZ ID Nr.7/CDR/SEQUENZ ID Nr.8/CDR/SEQUENZ ID Nr.9/CDR/SEQUENZ ID Nr.10).
- In einem nicht glykosylierten Antikörper mit allen drei bevorzugten CDRs umfaßt die variable Region der schweren Kette die folgende Sequenz:
- Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly- Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe- Pro-Met-Ala-Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val- Ser-Thr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val- Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr- Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys- Ala-Lys-Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly- Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser.
- (SEQUENZ ID Nr.11).
- In ähnlicher Weise sind der eine oder mehrere bevorzugte CDR(s) der leichten Kette des Ratten-CD3-Antikörpers deshalb vorzugsweise in einem Gerüstbereich der humanen van ablen Domäne vorhanden, welcher die folgende Aminosäuresequenz aufweist, gelesen in der Richtung Leader T konstante Region, wobei CDR ein CDR (d), (e) und (f), wie hier obenstehend definiert, eine konservativ modifizierte Variante davon, oder einen alternativen CDR angibt:
- Asp-Phe-Met-Leu-Thr-Gln-Pro-His-Ser-Val-Ser-Glu-Ser-Pro-Gly-Lys- Ihr-Val-Ile-Ile-Ser-Cys-/CDR/-Trp-Tyr-Gln-Gln-Arg-Pro-G]y-Arg-Ala- Pro-Thr-Thr-val-Ile-Phe-/CDR/-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser- Ile-Asp-Arg-Ser-Ser-Asn-Ser-Ala-Ser-Leu-Thr-Ile-Ser-Gly-Leu-Gln- Thr-Glu-Asp-Glu-Ala-Asp-Tyr-Tyr-Cys-/CDR/-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys- Leu-Thr-Val-Leu
- (SEQUENZ ID Nr.12/CDR/SEQUENZ ID Nr.13/CDR/SEQUENZ ID Nr. 14/CDR/SEQUENZ ID Nr.15).
- In einem nicht glykosylierten Antikörper mit allen drei bevorzugten CDRs umfaßt die variable Region der leichten Kette die folgende Sequenz:
- Asp-Phe-Met-Leu-Thr-Gln-Pro-His-Ser-Val-Ser-Glu-Ser-Pro-Gly-Lys- Thr-Val-Ile-Ile-Ser-Cys-Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn- Tyr-Val-His-Trp-Tyr-Gln-Gln-Arg-Pro-Gly-Arg-Ala-Pro-Thr-Thr-Val- Ile-Phe-Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe-Ser- Gly-Ser-Ile-Asp-Arg-Ser-Ser-Asn-Ser-Ala-Ser-Leu-Ihr-Ile-Ser-Gly- Leu-Gln-Thr-Glu-Asp-Glu-Ala-Asp-Tyr-Tyr-Lys-His-Ser-Tyr-Val-Ser- Ser-Phe-Asn-Val-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys-Leu-Thr-Val-Leu(SEQUENZ ID Nr. 16)
- Die variablen Domänen, welche zum Beispiel einen oder mehrere bevorzugte CDRs wie obenstehend beschrieben, umfassen, vorzugsweise in der humanisierten Form mit aus humanen Antikörpern abgeleiteten variablen Gerüstregionen, sind an den entsprechenden konstanten Domänen angefügt.
- Die konstanten Regionen der schweren und leichten Kette können auf Antikörpern unterschiedlicher Typen, wie erwünscht, basieren, abhängig davon daß der Antikörper ein IgG- Antikörper ist, aber obwohl sie einen Ratten- oder Maus-Ursprung haben oder davon abgeleitet sein können, besitzen sie bevorzugt einen menschlichen Ursprung oder sind davon abgeleitet. Für die leichte Kette ist die konstante Region vorzugsweise vom Lambda-Typ und für die schwere Kette ist sie vorzugsweise ein IgG-Isotyp, insbesondere IgG1, und zwar modifiziert, um eine Aglykosylierung wie angemessen zu bewirken. Es ist bekannt, daß alle humanen konstanten Regionen des IgG-Isotyps an dem Asparaginrest an der Position 297 glykosyliert werden, welcher einen Teil des N-Glykosylierungsmotives Asparagin²&sup9;&sup7;-X²&sup9;&sup8;-Serin²&sup9;&sup9; oder -Threonin²&sup9;&sup9; bildet, worin X der Rest einer beliebigen Aminosäure außer Prolin ist. Der Amikörper der Erfindung kann somit durch das Ersetzen von Asparagin²&sup9;&sup7; in einer derartigen konstanten Region durch eine andere Aminosäure, welche nicht glykosyliert werden kann, aglykosyliert werden. Potentiell kann ein beliebiger anderer Aminosaurerest eingesetzt werden, aber Alanin wird am stärksten bevorzugt. Alternativ dazu kann die Glykosylierung am Asparagin²&sup9;&sup7; durch Veränderung eines der anderen Reste des Motivs verhindert werden, z.B. durch Ersetzen des Rests 298 durch Prolin, oder des Restes 299 durch eine beliebige von Serin oder Threonin verschiedene Aminosäure. Techniken für die Durchführung dieser Orts- gerichteten Mutagenese sind dem Fachmann gut bekannt und können zum Beispiel unter Verwendung eines Kits für Orts-gerichtete Mutagenese durchgeführt werden, wie zum Beispiel desjenigen, welcher im Handel von Amersham erhältlich ist. Die Arbeitsweise wird hier nachstehend weiter beispielhaft dargestellt.
- Im Fachgebiet wird allgemein anerkannt, daß der Austausch einer Aminosäure in einem CDR durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften, zum Beispiel der Austausch eines Glutaminsäurerestes durch einen Asparaginsäurerest, die Eigenschaften oder die Struktur des Peptids oder Proteins, in welchem die Substitution oder die Substitutionen vorgenommen wurden, nicht im wesentlichen verändern wird. Daher schließen die nicht glykosylierten Antikörper der vorliegenden Erfindung diejenigen Antikörper mit den bevorzugten CDRs aber mit einer spezifizierten Aminosäuresequenz ein, in welcher eine derartige Substitution oder Substitutionen stattgefunden haben, ohne die Bindungsaffinität und Spezifität der CDRs im wesentlichen zu verändern. Alternativ dazu können Deletionen in der Sequenz der Aminosäurereste der CDRs vorgenommen werden, oder die Sequenzen können an einem oder beiden der N- und C-Termini verlängert werden, während die Aktivität noch beibehalten wird.
- Bevorzugte nicht glykosylierte Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung sind derartig beschaffen, daß die Affinitätskonstante für das Antigen 10&sup5; Mol&supmin;¹ oder mehr beträgt, zum Beispiel bis zu 10¹² Mol&supmin;¹. Liganden von verschiedenen Affinitäten können für verschiedene Anwendungen geeignet sein, so daß zum Beispiel eine Affinität von 10&sup6;, 10&sup7; oder 10&sup8; Mol&supmin;¹ oder mehr in manchen Fällen angemessen sein kann. Jedoch werden Antikörper mit einer Affinität im Bereich von 10&sup6; bis 10&sup8; Mol&supmin;¹ oft geeignet sein. Angemessenerweise zeigen die Antikörper ebenfalls keinerlei wesentliche Bindungsaffinität für andere Antigene. Die Bindungsaffinitäten des Antikörpers und die Antikörperspezifität können durch Assayverfahren, wie denjenigen, welche in dem Beispiel-Abschnitt hier nachfolgend beschrieben werden (Effektor-Zell-Retargetting-Assay), oder durch Techniken, wie ELISA und anderen Immunoassays getestet werden.
- Antikörper gemäß der Erfindung sind nicht glykosylierte IgG-CD3-Antikörper mit einer "Y"-förmigen Konfiguration, welche zwei identische leichte und zwei identische schwere Ketten besitzen können, und somit bivalent sind, wobei jede Antigen-Bindungsstelle eine Affinität für das CD3-Antigen aufweist. Alternativ dazu ist die Erfindung ebenfalls auf Antikörper anwendbar, in welchen nur einer der Arme des Antikörpers eine Bindungsaffinität für das CD3-Antigen aufweist. Derartige Antikörper können verschiedene Formen einnehmen. So kann der andere Arm des Antikörpers eine Bindungsaffinität für ein von CD3 verschiedenes Antigen besitzen, so daß der Antikörper ein bispezifischer Antikörper ist, wie zum Beispiel beschrieben in dem U.S.-Patent Nr.4 474 893 und den europäischen Patentanmeldungen Nr. 87 907 123.1 (EP-A-0 289 546) und 87 907 124.9 (EP-A-0 293 405). Alternativ dazu kann der Antikörper nur einen Arm besitzen, welcher eine Bindungsaffinität aufweist, wobei ein derartiger Antikörper als "monovalent" bezeichnet wird.
- Monovalente Antikörper (oder Antikörperfragmente) können auf verschiedenen Wegen hergestellt werden. Glennie und Stevenson (Nature, 295 712-713 (1982)) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung monovalenter Antikörper durch enzymatischen Verdau. Stevenson et al. beschreiben ein zweites Vorgehen zur Herstellung monovalenter Antikörper, in welchem enzymatisch hergestellte Fab'- und Fc-Fragmente chemisch quervernetzt werden (Anticancer Drug Design, 3, 219-230 (1989)). In diesen Verfahren haben die resultierenden monovalenten Antikörper einen ihrer Fab'-Arme verloren. Ein drittes Verfähren zur Herstellung monovalenter Antikörper ist in dem Europäischen Patent Nr.131424 beschrieben. In diesem Vorgehen wird die "Y"-Gestalt des Antikörpers beibehalten, aber nur eine der zwei Fab'-Domänen wird an das Antigen binden. Dies wird durch Einführen eines Gens, welches für eine irrelevante leichte Kette codiert, die mit der schweren Kette des Antikörpers kombinieren wird, in das Hybridom erreicht, um eine Mischung von Produkten herzustellen, worin der monovalente Antikörper derjenige von Interesse ist.
- Weiter bevorzugt jedoch werden die monovalenten nicht glykosylierten CD3-Antikörper der Erfindung durch das folgende Verfahren hergestellt. Dieses beinhaltet die Einführung eines Gens, welches für eine gestutzte bzw. trunkierte schwere Kette codiert, in welcher die Domäne der variablen Region und die Domäne der ersten konstanten Region der schweren Kette abwesend sind, wobei dem Gen das Exon für jede dieser Domänen fehlt, zusammen mit für die schweren und leichten Ketten codierenden Genen, in ein geeignetes Expressionssystem, zum Beispiel ein Zellsystem wie hier nachstehend beschrieben. Dies führt dazu, daß das Zellsystem eine Mischung von (a) Antikörpern, welche vollständige bivalente Antikörper sind, (b) Antikörperfragmenten, welche lediglich aus zwei trunkierten schweren Ketten (d.h. einem Fc-Fragment) bestehen, und (c) Antikörperfragmenten, welche für das CD3-Antigen monovalent sind, die aus einer gestutzten schweren Kette und einer leichten Kette in Assoziation mit der normalen schweren Kette bestehen, herstellt. Ein derartiges Antikörperfragment (c) ist monovalent, weil es jeweils nur einen Fab'-Arm besitzt. Die Herstellung eines monovalenten Antikörpers in der Form eines solchen Fragmentes durch dieses Verfahren wird aus einer Anzahl von Gründen bevorzugt. So ist das resultierende Antikörperfragment leicht aus einer von dem Zellsystem hergestellten Mischung von Antikörpern zu reinigen, da es zum Beispiel einfach auf der Basis seines Molekulargewichts abtrennbar sein kann. Dies ist in dem Verfahren des europäischen Patents Nr.131424 nicht möglich, worin der hergestellte monovalente Antikörper ähnliche Merkmale zu einem bivalenten Antikörper hinsichtlich seiner Größe und äußeren Erscheinung besitzt.
- Daruber hinaus wendet die Herstellung eines monovalenten Antikörperfragmentes durch das neue Verfähren Bedingungen an, welche einfacher gesteuert werden können, und ist somit nicht so zufallsabhängig wie ein enzymatisches Verdau/chemisches Kopplungs- Verfahren, das die Auftrennung eines komplexen Reaktionsprodukts erfordert, mit dem zusätzlichen Vorteil, daß die verwendete Zellinie damit fortfahren wird, monovalente Antikörperfragmente herzustellen, ohne die Notwendigkeit von kontinuierlichen Syntheseverfahren, wie sie in dem enzymatischen Verdau/chemischen Kopplungs-Verfahren erforderlich sind.
- Es wird angenommen, daß nicht glykosylierte Antikörper gemaß der Erfindung nicht in der Natur vorkommen und daß diese nicht glykosylierten Antikörper im allgemeinen synthetisch auf vielen verschiedenen Wegen hergestellt werden können. Am bequemsten allerdings werden geeignete Genkonstrukte für die konstanten und variablen Regionen der schweren und leichten Ketten, welche in dem Antikörper vorhanden sind, getrennt erhalten und dann in ein geeignetes Expressionssystem eingeführt.
- Für die variablen Domänen eines Liganden der gewünschten Struktur codierende Gene können hergestellt und bequemerweise an für die konstanten Domänen eines Antikörpers codierende Gene angefügt werden, welche einer Orts-gerichteten Mutagenese unterzogen wurden. Diese konstanten Gene können aus Hybridom-cDNA oder aus der chromosomalen DNA erhalten werden, und sind einer Mutagenese (Orts-gerichtet) unterzogen worden, um die nicht glykosylierten konstanten Regionen zu erzeugen. Für die variablen Regionen codierende Gene können ebenfalls mittels bei der Identifikation der hierin enthaltenen CDRs verwendeten Gensynthesetechniken abgeleitet werden. Geeignete Klonierungsvehikel für die DNA können von verschiedenen Typen sein.
- Die Expression dieser Gene über die Kultivierung eines Zellsystems zur Herstellung eines fünktionellen CD3-Liganden wird am bequemsten durch Transformieren eines geeigneten prokaryontischen oder insbesondere eukaryontischen Zellsystems, insbesondere einer immortalisierten Säuger-Zellinie, wie einer Myelom-Zellinie, zum Beispiel den Ratten-Myelomzellen YB2/3.01/Ag20 (hier nachstehend bezeichnet als YO), oder Eierstockzellen vom chinesischen-Hamster (obwohl die Verwendung von Pflanzenzellen ebenfalls von Interesse ist), mit Expressionsvektoren, welche für die verschiedenen Antikörperregionen codierende DNA einschließen, und dann Kultivieren des transformierten Zellsystems zur Herstellung des gewünschten Antikörpers durchgeführt. Derartige allgemeine Techniken von Nutzen für die Herstellung von Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung sind auf dem sehr beträchtlichen Fachgebiet der Gentechnik allgemein bekannt und sind in Veröffentlichungen, wie "Molecular Cloning" von Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989 (2. Ausgabe), beschrieben. Die Techniken werden durch die hier enthaltenen Beispiele weiter erläutert.
- Die vorliegende Erfindung schließt somit ein Verfahren zur Herstellung eines nicht glykosylierten IgG-Antikörpers mit einer Bindungsaffinität für das CD3-Antigen ein, das das Kultivieren von zur Expression des Antikörpers fähigen Zellen umfaßt, um dessen Expression zu bewirken. Die Erfindung schließt ebenfalls eine Zellinie ein, welche einen nicht glykosylierten Antikörper gemäß der Erfindung exprimiert.
- Bevorzugt unter solchen Zellinien sind diejenigen, welche DNA-Sequenzen umfassen, die für die hier vorstehend beschriebenen bevorzugten CDRs codieren. Eine Gruppe von für die hier obenstehend beschriebenen CDRs (a) bis (f) codierenden Nukleotidsequenzen ist unter (a) bis (f) jeweils nachstehend angegeben, aber es ist davon auszugehen, daß die Degenerierung des genetischen Codes zuläßt, daß Variationen in diesen Sequenzen vorgenommen werden können, während diese noch immer für die Aminosäuresequenzen der CDRs codieren.
- (a) AGCTTTCCAA TGGCC (SEQUENZ ID Nr.17)
- (b) ACCATTAGTA CTAGTGGTGG TAGAACTTAC TATCGAGACT CCGTGAAGGG C (SEQUENZ ID Nr.18)
- (c) TTTCGGCAGT ACAGTGGTGG CTTTGATTAC (SEQUENZ ID Nr.19)
- (d) ACACTCAGCT CTGGTAACAT AGAAAACAAC TATGTGCAC (SEQUENZ ID Nr.20)
- (e) GATGATGATA AGAGACCGGA T (SEQUENZ ID Nr.21)
- (f) CATTCTTATG TTAGTAGTTT TAATGTT (SEQUENZ ID Nr.22)
- Derartige Zellinien werden insbesondere größere DNA-Sequenzen enthalten, welche (1) DNA, die variable Gerüstregionen der humanen schweren Kette und einen oder mehrere von (a), (b) und (c) exprimiert, und (2) DNA, die variable Gerüstregionen der humanen leichten Kette und einen oder mehrere von (d), (e) und (f) exprimiert. Ein spezifisches Beispiel von derartiger DNA ist die nachfolgend angegebene Sequenz (1), die für die CDRs (a), (b) und (c) codiert, angeordnet in dem Gerüstbereich der schweren Kette, für welchen das humane VH-Typ III-Gen VH26.D.J., wie hier obenstehend erörtert, codiert, und die nachfolgend angegebene Sequenz (2), die für die CDRs (d), (e) und (f) codiert, angeordnet in dem Gerüstbereich der leichten Kette, für welchen das humane VLλ-Typ VI-Gen SUT codiert. Die CDR-Sequenzen (a), (b), (c), (d), (e) und (f) sind unterstrichen.
- (1) GAGGTCCAAC TGCTTGGAGTC TGGGGGCGGT TTAGTGCAGC CTGGAGGGTC CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCAGGATT CACTTTCAGT AGCTTTCCAA TGGCCTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACC ATTAGTACTA GTGGTGGTAG AACTTACTAT CGAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACTATC TCCAGAGATA ATAGCAAAAA TACCCTATAC CTGCAAATGA ATAGTCTGAG GGCTCAGGAC ACGGCCGTCT ATTACTGTGC AAAATTTCGG CAGTACAGTG GTGGCTTTGA TTACTGGGGC CAAGGGACCC TGGTCACCGI CTCCTCA (SEQUENZ ID Nr.23)
- (2) GACTTCATGC TGACTCAGCC CCACTCTGTG TCTGAGTCTC CCGGAAAGAC AGTCATTATT TCTTGCACAC TCAGCTCTGG TAACATAGAA AACAACTATG TGCACTGGTA CCAGCAAAGG CCGGGAAGAG CTCCCACCAC TGTGATTTTC GATGATGATA AGAGACCGGA TGGTGTCCCT GACAGGTTCT CTGGCTCCAT TGACAGGTCT TCCAACTCAG CCTCCCTGAC AATCAGTGGT CTGCAAACTG AAGATGAAGC TGACTACTAC TGTCATTCTT ATGTTAGTAG TTTTAATGTT TTCGGCGGTG GAACAAAGCT CACTGTCCTT (SEQUENZ ID Nr.24)
- Die Zellinien werden selbstverständlich auch insbesondere DNA-Sequenzen enthalten, welche die konstanten Regionen der schweren und leichten Kette exprimieren.
- Die humanisierten nicht glykosylierten Antikörper gemäß der Erfindung besitzen therapeutischen Wert. Insbesondere besitzen derartige nicht glykosylierte Antikörper, besonders ein humanisierter nicht glykosylierter Antikörper mit einer Spezifität für das humane CD3- Antigen, nutzbare Anwendungen bei der Immunosuppression, insbesondere der Bekämpfung der Transplantatabstoßung, wo es besonders wünschenswert ist, daß die Immunosuppression vorübergehend statt vollkommen ist, und daß somit T-Zellen nicht vollständig zerstört, sondern anstelledessen durch die Antikörper-Blockade des CD3-Antigen-TCR-Komplexes unfunktional gemacht werden. Zusätzlich dazu können die nicht glykosylierten CD3- Antikörper ein Potential in anderen Gebieten aufweisen, wie der Behandlung von Krebs, insbesondere bei der Konstruktion von bispezifischen Antikörpern (für "Effektor-Zell-Retargetting") oder Antikörper-Toxin-Konjugate, wo die Effektivität des therapeutischen Mittels durch das Fc-vermittelte Abtöten der Effektor-Zellen bzw. das unspezifische Abtöten von Fc- Rezeptor-tragenden Zellen gefährdet sein würde.
- Nicht glykosylierte Antikörper gemäß der Erfindung können zur Verabreichung an Patienten durch Darbieten des Antikörpers zusammen mit einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger zubereitet werden. Die Antikörper werden zusammen mit einem solchen Verdünnungsmittel oder Träger, welcher steril und pyrogenfrei ist, vorzugsweise in einer injizierbaren Form verabreicht. Als Anleitung kann angegeben werden, daß eine geeignete Antikörperdosis etwa 1 - 10 mg bei täglicher Injektion über eine Zeitdauer von, zum Beispiel, 10 Tagen beträgt, obwohl es aufgrund der Ausschaltung der "Erste-Dosis"-Antwort möglich sein wird, falls gewunscht, höhere Mengen des Antikörpers zu verabreichen, zum Beispiel selbst bis zu 100 mg täglich, abhängig von den Bedürfnissen des individuellen Patienten. Die tierärztuche Anwendung erfolgt auf einer ähnlichen g/kg-Dosierungsbasis.
- Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche durch die nachstehend aufgezählten Zeichnungen erläutert werden:
- Figur 1-8: Diese Figuren zeigen die Ergebnisse von Proliferationsassays von peripheren Blut- Lymphozyten gegenüber CD3-Antikörpern. Es wurden vier verschiedene gesunde Freiwillige verwendet. Der humanisierte Anti-Lymphozyten-Antikörper CDw52 wurde als Negativkontrolle eingeschlossen.
- Figur 9-12: Diese Figuren zeigen den Vergleich von nicht glykosyliertem CD3-Antikörper und glykosyliertem CD3-Antikörper in einer gemischten Lymphozyten-Reaktion. Für das Maus-CD8-Antigen spezifischer nicht glykosylierter Antikörper wurde als Negativkontrolle eingeschlossen.
- Figur 13 & 14: Diese Figuren zeigen die Ergebnisse eines Effektor-Zell-Retargetting-Assays unter Vergleich von glykosylierten und nicht glykosylierten IgG-Typ-CD3-Antikörpern. Der Antikörper CDw52 wurde als Negativkontrolle eingesetzt.
- Die Klonierung und Umformung des V-Region-Gens des für das humane CD3-Antigen spezifischen Ratten-Antikörpers YTH 12.5 wurde, wie beschrieben in Routledge et al., 1991, Eur. J.Immunol 21, 2717, und in der GB-Patentanmeldung Nr.9 121126.8 (GB-A-2 249 310) und ihren Äquivalenten, durchgeführt. YTH 12.5 ist eine Ratten-Hybridom-Zellinie, die einen für den CD3-Antigen-Komplex spezifischen monoklonalen IgG2b-Antikörper sezermert.
- Kurz gesagt, beruhte die Methodik auf derjenigen von Orlandi et al., 1989, PNAS USA, 86, 3833, unter Verwendung der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR). Das VH-Gen (Gen für die variable Region der schweren Kette) wurde unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer VH1FOR und VH1BACK kloniert. Die PCR-Produkte wurden in den Vektor M13- VHPCR1 ligiert, in welchem die Orts-gerichtete Mutagenese unter Verwendung von 6 Oligonukleotid-Primern durchgeführt wurde. Das VL-Gen (Gen für die variable Region der leichten Kette) wurde unter Verwendung von auf Grundlage der veröffentlichten VLλ-Sequenzen entworfenen Primer kloniert. Das Gen wurde in den Vektor M13-VKPCR kloniert, zusammen mit der humanen konstanten Region der leichten Lambda-Kette. In diesem Vektor wurde die Mutagenese des VL-Gerüstbereichs unter Verwendung von 5 Oligonukleotiden durchgeführt. Das humanisierte VL-Gen wurde dann in den Expressionsvektor pHβApr- 1 eingeführt.
- Ein Vektor wurde hergestellt (p316), in dem das umgeformte CD3-VH-Gen im Zusammenhang mit verschiedenen Genen für die konstante Region der Immunoglobulin H- Kette exprimiert werden konnte, wobei dieser Vektor auf dem Vektor pHβApr-gpt (Gunning et al., 1987, P.N.A.S. USA, 85, 7719-7723) basierte. Ein 1,65 kb großes DNA-Fragment, welches das Dihydrofolatreduktase(dhft)-Gen und SV40-Expressionssignale (Page & Sydenham, 1991, Biotechnology, 9, 64) trug, wurde in die einzige EcoRI-Stelle von pHβApr-gpt eingeführt. Ein für das umgeformte CD3-VH-Gen codierendes 700 bp großes HindIII-BamHI- DNA-Fragment wurde dann in die Mehrfachklonierungsstelle des Vektors, stromabwärts und unter der Kontrolle des β-Actin-Promotors, kloniert. Das gewünschte Gen für die konstante Region der H-Kette (in genomischer Konfiguration) konnte dann in die einzige BamHI- Restriktionsenzymstelle stromabwärts des CD3-VH-Gens eingefügt werden.
- Die konstante Region von humanem Aglykosyl-IgG1 wurde aus dem von Takahashi et al. (1982, Cell, 29 671-679) beschriebenen Wildtypgen Glm( 1,17) wie folgend abgeleitet. Das Gen wurde in den Vektor M13 tg131 kloniert, worin eine Orts-gerichtete Mutagenese (Amersham International PLC) durchgeführt wurde, um den Aminosäurerest 297 von einem Asparagin- in einen Alaninrest zu mutieren.
- Ein Oligosaccharid am Asn-297 ist ein charakteristisches Merkmal aller normalen humanen IgG-Antikörper (Kabat et al., 1987, "Sequence of Proteins of Immunological Interest", Veröffentlichung der "US Department of Health Human Services"), wobei jede der zwei schweren Ketten in den IgG-Molekülen eine einzelne verzweigtkettige Kohlenhydratgruppe aufweist, welche an die Amidgruppe des Asparaginrests gebunden ist (Rademacher und Dwek, 1984, Prog. Immunol., 5, 95-112). Die Ersetzung des Asparagins durch Alanin verhindert die Glykosylierung des Antikörpers.
- Die 2,3 kb große konstante Region von Aglykosyl-IgG1 wurde durch einen Doppelverdau unter Verwendung von BamfHI und BGIII ausgeschnitten und in die BamHI-Stelle des Vektors p316 ligiert, um den Klon p323 zu erzeugen.
- Subkonfluente Monoschichten von dhfr&supmin;-Chinesischen Hamster-Eierstockzellen wurden mit dem Vektor p323, enthaltend das Gen für die schwere Kette, und einem zweiten Vektor p274, enthaltend die umgeformte humane leichte λ-Kette (Routledge et al., 1991, Eur. J. Immunol., 21 2717-2725), cotransfiziert. Vor der Transfektion wurden beide Plasmid- DNAs unter Verwendung der Restriktionsendonuklease PvuI linearisiert. Die Transfektion wurde unter Verwendung des DOTMA-Reagenz (Boehringer, Deutschland) unter Befolgen der Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.
- Nach Transfektanten bezuglich der schweren Kette und leichten Kette wurde in Xanthin/Hypoxanthin-freiem IMDM mit 5% (v/v) dialysiertem fötalem Kälberserum selektiert.
- Die Herstellung des analogen Vektors p278 mit der schweren Kette von humanem Wildtyp-IgG1-CD3 ist an anderer Stelle beschrieben worden (Routledge et al., 1991, Eur. J. Immunol., 21, 2717-2725). H-Ketten-Expressionsvektoren, welche die Gene für die konstante Region des nicht mutanten humanen IgG2 (Flanagan & Rabbitts, 1982, Nature 300, 709-713), IgG3 (Huck et al., 1986, Nuc. Acid. Res. 14, 1779-1789), IgG4 (Flanagan & Rabbitts, 1982, Nature 300, 709-713), Epsilon (Flanagan & Rabbitts, 1982, EMBO. Journal 1, 655-660) und Alpha-2 (Flanagan & Rabbitts, 1982, Nature 300, 709-713) tragen (Vektoren p317, p318, p320, p321 bzw. p325) wurden aus dem Vektor p316 abgeleitet. Die Einführung dieser Vektoren zusammen mit dem Leichte-Kette-Vektor p274 in dhfr&supmin;-CHO-Zellen, wie vorhergehend beschrieben, erzeugte Zellinien, die CD3-Antikörper vom γ1-, γ2-, γ3-, γ4-, ε- bzw. α- 2-Isotyp sezernierten. CD3-Antikörper exprimierende Zellen wurden zwei Klonierungsrunden in Weichagar unterzogen, und danach in Rollflaschenkulturen vermehrt. Das Immunoglobulin aus etwa 4 Litern Gewebekulturüberstand aus jeder Zellinie wurde durch Ammoniumsulfat- Fällung konzentriert, gründlich gegen PBS dialysiert und dann wie folgend quantifiziert:
- Da der Antikörper nicht rein war, wurde ein Kompetitions-Assay entworfen, um spezifisch die Konzentration der Antikörper mit CD3-Antigen-Bindungsvermögen zu quantifizieren. Humane T-Zell-Blasten wurden mit FITC-markiertem UCHT-1 inkubiert, einem Antikörper, der an dasselbe Epitop des CD3-Antigens bindet, wie das chimäre Panel. Man hatte zuvor festgelegt, daß die Konzentration des verwendeten FITC-Reagenz halbsättigend ist. Nicht markierter YTH 12.5 (über HPLC gereinigt) wurde von einer bekannten Ausgangskonzentration aus titriert und Vertiefüngen, die T-Zellen und UCHT-1-FITC enthielten, zugegeben. Der nicht markierte Antikörper diente als ein Kompetitor für die Antigenbindungsstelle. Dies wird als Absinken der bei der Untersuchung der Zellen unter Verwendung der FACS-Analyse beobachteten mittleren Fluoreszenz nachgewiesen. So ergibt die Titration der chimären Antikörper von unbekannten Ausgangskonzentrationen aus eine Reihe sigmoider Kurven, wenn die mittlere Fluoreszenz gegen die Antikörperverdünnung aufgetragen wird. Diese können direkt mit der YTH 12.5-Standard-Kurve verglichen werden.
- Die Fähigkeit eines CD3-Antikörpers, die T-Zell-Proliferation in Lösung zu fördern, hängt mit der Wechselwirkung der Fc-Region des Antikörpers mit Fc-Rezeptoren auf akzessorischen Zellen zusammen.
- Der wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte nicht glykosylierte chimäre CD3-Antikörper wurde mit einer Palette anderer chimärer Antikörper, welche dieselbe Architektur der variablen Region gemeinsam hatten, aber unterschiedliche konstante Regionen der H-Kette (siehe Beispiel 1) aufwiesen, hinsichtlich der Fähigkeit, die Proliferation von humanen peripheren Blutlymphozyten herbeizuführen, verglichen. Aus dem Blut gesunder Spender isolierte Lymphozyten wurden auf einem Lymphopaque-Gradienten getrennt, gewaschen und in IMDM mit 5 % (v/v) hitzeinaktiviertem humanen AB-Serum resuspendiert und bei 5 x 10&sup4; bis 1 x 10&sup5; Zellen pro Vertiefüng in Platten mit CD3-Antikörpern in Lösung ausplattiert. Nach 3 Tagen in Kultur wurden die Zellen mit tritiummarkiertem Thymidin pulsmarkiert und 6 Stunden später geerntet, und der Anteil des zellulären ³H-Einbaus wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Die Proliferationsantwort auf den titrierten Antikörper wurde bei vier Blutspendem untersucht. Für einen fünften Blutspender wurde die Proliferationsantwort nur bei 1 µg untersucht. Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 bis 8 gezeigt.
- Bei den untersuchten Spendern führten alle "Wildtyp"-Antikörper zu T-Zell- Proliferation. Der mutante, nicht glykosylierte IgG1-Isotyp war jedoch niemals mitogen, was eine bedeutende Rolle für die Kohlenhydrat-Seitenkette impliziert.
- In einem getrennten Experiment wurde die Fähigkeit einer Auswahl von monoklonalen CD3-Antikörpern in Lösung, die T-Zell-Proliferation zu stimulieren, unter Verwendung von aus dem Blut von 10 Spendern aus verschiedenen ethnischen Hintergründen isolierten Lymphozyten untersucht. Alle der natürlich vorkommenden Isotypen verursachten eine Proliferation in Gegenwart von 5 % humanem AB-Serum, obwohl vom T-Zell-Spender abhängige Variationen im Ausmaß der durch die Antikörper hervorgerufenen Antworten auftraten. Im allgemeinen waren die monoklonalen γ1- und ε-Antikörper am stärksten mitogen, wobei sie bei den geringsten Konzentrationen Zellen aktivierten, und γ3 und γ2 waren die am wenigsten aktiven. Das Aglykosyl-Derivat des monoklonalen γ1-Antikörpers war der einzige CD3-Antikörper, welcher konsistent darin versagte, die T-Zell-Proliferation in einem beliebigen der getesteten Spender herbeizuführen, wobei sich Antworten ergaben, die äquivalent zu denjenigen des nicht-aktivierenden monoklonalen Kontroll-Antikörpers Campath-1H waren. Um eine Endotoxin-Kontamination als Ursache für die mit den α2- und ε- Präparationen beobachtete Proliferation auszuschließen, wurde bestätigt, daß die Proliferation durch die Zugabe eines Überschusses des nicht glykosylierten CD3-mAb's blockiert werden konnte, was somit das CD3-Antigen in dem Aktivierungsvorgang impliziert.
- Das mit dem nicht glykosylierten monoklonalen γ1-CD3-Antikörper beobachtete vollständige Fehlen einer Proliferations-Antwort war überraschend, wenn man dessen Position in der ECR-Aktivitätshierarchie bedenkt (siehe nachstehendes Beispiel 5). Der Grund für diese Inaktivität beruht wahrscheinlich eher auf dessen verminderter Affinität für FcR's als darauf, daß die Aglykosylierung die Fähigkeit, ein für die Proliferation erforderliches Nach-Bindungs- Ereignis auszulösen, aufgehoben hat, wie z.B. durch Zerstören einer sekundären Erkennungsstelle auf dem monoklonalen Antikörper. Dies wird unterstützt durch die Beobachtung, daß der nicht glykosylierte γ1-mAb die Proliferation zu einem beträchtlichen Grad stimulieren konnte, wenn der Assay in IgG-freiem Medium durchgeführt wurde. Es besteht wahrscheinlich ein Minimum-Schwellenwert für die Anzahl von Kontakten oder die Stärke der Wechselwirkung zwischen T-Zelle und akzessorischer Zelle, der überschritten werden muß, bevor die Proliferation eingeleitet werden kann, und dies kann durch den nicht glykosylierten γ1-mAb in Gegenwart von signifikanten Spiegeln an kompetitierendem Immunoglobulin nicht erreicht werden.
- Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um zu testen, ob der nicht glykosylierte Antikörper IgG1 Ag von Beispiel 1 die Fähigkeit besaß, die T-Zell-Proliferation in einer gemischten Lymphozyten-Reaktion (MLR) zu blockieren, und die Ergebnisse von 2 Experimenten sind in den Figuren 9 bis 12 gezeigt.
- Periphere Blut-Lymphozyten wurden aus zwei Blutspendern isoliert. Die Stimulatorzellpopulation wurde Cäsium-bestrahlt. Die Antworter-Population wurde 30 Minuten lang mit titriertem Antikörper inkubiert, bevor die bestrahlten Stimulator-Zellen zugegeben wurden (Figuren 9, 10 und 11). Kontroll-Vertiefüngen der Antworter-Zellen wurden auch mit bestrahlten Antworter-Zellen bei jeder Antikörper-Bedingung inkubiert, um den spezifischen Effekt des Antikörpers auf die Antworter-Zellen festzustellen (Figuren 9, 10 und 12).
- Nach 5 Tagen Inkubation wurden die Vertiefungen mit tritiummarkiertem Thymidin pulsmarkiert und 6 Stunden später abgeerntet.
- Der nicht glykosylierte Antikörper blockierte die gemischte Lymphozyten-Reaktion; bei Austitrieren des Antikörpers ist der Blockierungs-Effekt geringer und die Proliferation nimmt zu. Das "Wildtyp"-IgG1 hat tatsächlich eine mitogene Wirkung auf die T-Zellen, und so ist keinerlei Blockierung der MLR durch diese Antwort ersichtlich.
- Ein für das Mäuse-CD8-Antigen spezifischer "irrelevanter" nicht glykosylierter Antikörper wurde als Negativkontrolle eingeschlossen. Dieser Antikörper besitzt wie erwartet keinen Effekt auf die MLR.
- In vivo-Experimente wurden mit chimären Antikörpern gegen humanes CD3 in Mäusen durchgeführt, welche hinsichtlich der Epsilon-Untereinheit des humanen CD3 transgen waren, wobei der nicht glykosylierte Antikörper aus Beispiel 1 (IgG1Ag) eingeschlossen wurde. Die Fähigkeit mancher dieser chimären CD3-Antikörper, die Freisetzung von TNF-Faktor im Anschluß an eine einzelne Injektion zu verursachen, wurde verglichen.
- In diesem Satz von Experimenten wurde Serum vor der Injektion und dann nach 90 Minuten und 4 Stunden im Anschluß an die intravenöse Injektion mit 10 µg des relevanten CD3-Antikörpers aus den Mäusen gewonnen. Die Gruppen bestanden aus 5 Mäusen und das aus jeder Gruppe gewonnene Serum wurde vereinigt. Die Analyse des TNF-Gehalts im Serum wurde im Laboratorium von Professor Jean-Francois Bach durchgeführt, wobei ein Bioassay angewandt wurde, der den zytotoxischen Effekt von Seren auf die L929-Maus-Fibroblastenzellen als Ergebnis der Gegenwart von TNF ermittelte.
- Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt: Tabelle 1 Im Serum von HCD3 -Mäusen anschließend an eine Injektion mit chimären CD3- Antikörpern nachgewiesener TNF Tabelle 1 Im Serum von hCD3-Mäusen anschließend an eine Injektion mit chimären CD3- Antikörpern nachgewiesener TNF
- Ein signifikanter Unterschied ist hinsichtlich des mit der Injektion der zwei Formen von humanem IgG1 zusammenhängenden TNF-Gehalts ersichtlich. Die nicht glykosylierte Form ist mit einer mindestens achtfach geringeren Freisetzung von TNF assoziiert als der Wildtyp- IgG1- oder der IgG2-Antikörper.
- Die Ergebnisse der Beispiele 2-4 zeigen, daß der nicht glykosylierte CD3-Antikörper nicht mitogen gegenüber T-Zellen in Lösung war, was anzeigt, daß der Antikörper eine verminderte Fähigkeit besaß, mit Fc-Rezeptoren auf akzessorischen Zellen zu interagieren. Der Antikörper behielt die immunosuppressiven Eigenschaften bei, welche charakteristisch für CD3-Antikörper sind. In vivo führte der nicht glykosylierte Antikörper zu einer signifikant geringeren Freisetzung von Tumornekrosefaktor in bezüglich humanem CD3 transgenen Mäusen als der parentale IgG1-Antikörper. Somit kann dieses Mittel ein "verbesserter" CD3- Antikörper für Zwecke der Immunosuppression sein, wenn die in Mäusen beobachtete verringerte TNF-Freisetzung bei Menschen widergespiegelt wird.
- Dies wurde wie an anderer Stelle beschrieben (Gilliland et al., 1988, PNAS USA, 85, 4419) durchgeführt und bestimmt die Fähigkeit eines monoklonalen CD3-Antikörpers, aktivierte T-Zellen an FcγR-tragende Zielzellen zu binden und somit die Lyse der Zielzellen zu vermitteln. Kurz gesagt wurden humane U937-Monozyten-Zellen, welche die Fcγ-Rezeptoren I, II und III exprimieren, mit &sup5;¹Cr-Natriumchromat markiert und auf 2 x 10&sup5; Zellen pro ml resuspendiert. Diese Zellen wurden als Ziele verwendet. Humane T-Zell-Blasts, erzeugt aus Lymphozyten des peripheren menschlichen Bluts durch Aktivierung mit dem mitogenen CD3- Antikörper gefolgt von Kultur in IL-2-haltigem Medium, wurden als die Effektorzellen verwendet. Sie wurden vor der Verwendung in dem Assay gewaschen und bei einer Konzentration von 2 x 10&sup5; Zellen ml&supmin;¹ resuspendiert. 100 µl große Volumina der gereinigten chimären Antikörper-Präparationen wurden in 3fach-Schritten in den Vertiefüngen einer Mikrotiterplatte verdünnt. Dann wurden jeweils 50 µl der Effektor- und Zielzellen in jede Vertiefung gegeben und die Mischung wurde mindestens 4 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Nach dieser Zeit wurden 100 µl des Überstands entfernt und hinsichtlich des freigesetzten &sup5;¹Cr geassayt. Jede Antikörperverdünnung wurde in zweifacher Ausfertigung getestet.
- Die U937-Monozyten-Zellinie exprimiert humane Fc-Rezeptoren und kann durch aktivierte humane T-Zell-Blasten in Gegenwart von monoklonalen CD3-Antikörpern, die fähig sind, die zwei Zelltypen querzuverbinden, lysiert werden. Die Ergebnisse (Figur 13 und 14) zeigen, daß der humane IgG1-Antikörper aus Beispiel 1, wenn nicht glykosyliert, immer noch fähig ist, T-Zellen an die U937-Zellen querzuvernetzen, obwohl zu einem verringerten Ausmaß, und somit die T-Zell-Cytotoxizität umzulenken. Dies war eine überraschende Feststellung, da, angesichts der veröffentlichten Daten, das von einem nicht glykosylierten monoklonalen γ1-Antikörper vermittelte effektive Abtöten unerwartet war.
- Es bestand die Möglichkeit, daß die Entfernung des Kohlenhydrats diesen monoklonalen Antikörper besonders klebrig gemacht hatte, und ihn so in die Lage versetzt hatte, ohne Wechselwirkung mit FcγRs an U937-Zellen zu binden. Es wurde jedoch anschließend demonstriert (Ergebnisse nicht gezeigt), daß die Fähigkeit des nicht glykosylierten monoklonalenγ -Antikörpers, die Zerstörung von Maus-L-Zellzielen (eine Mauszellinie, welche den humanen FcγRI exprimiert) zu vermitteln, abhängig von der Expression eines transfizierten humanen FcγRI-Gens war, wodurch die FcγR-Bindungsaktivität dieses monoklonalen Antikörpers bestätigt wurde. Wir folgern daraus, daß der ECR-Assay ein besonders empfindliches Verfahren zum Nachweis von Fc-FcR-Wechselwirkungen ist.
- Die ECR-Ergebnisse zeigen, daß die Bindungshierarchie der chimären IgG-Antikörper γ2< γ3< Agγ1< γ4< γ1 ist. Wenn man von der Annahme ausgeht, daß die mitogene Aktivität eines Antikörpers durch seine Fc-Rezeptor-Bindungfähigkeit vorhergesagt wird, würde man erwarten, daß die obenstehende Hierarchie in den T-Zell-Proliferationsassays aufgezeigt wird. Allerdings war dies nicht der Fall; die Reihenfolge der Aktivitäten in den T-Zell-Proliferationsexperimenten (1 bis 3) war Agγ1< γ2< γ4< γ3< γ1. Dies zeigt, daß die Mitogenizität eines Antikörpers nicht in einer direkten Weise aus den Ergebnissen von Assays, welche Fc-Fc- Rezeptor-Wechselwirkungen messen, vorhergesagt werden kann. Diese Anschauung wird durch das Verhalten des chimären Epsilon-Antikörpers unterstützt, welcher in dem ECR-Assay eine geringe Leistung aufwies und dennoch in konsistenter Weise die höchste mitogene Aktivität besaß. Dies legt nahe, daß Antikörper T-Zellen durch Bindung an irgend etwas von den Fcγ-Rezeptoren (wie sie auf U937-Zellen aufgewiesen werden) verschiedenes auf akzessorischen Zellen aktivieren können, d.h. eine Unfähigkeit, an Fcγ-Rezeptoren zu binden, ist keine Garantie dafür, daß ein Antikörper nicht mitogen sein wird.
Claims (25)
1. Nicht glykosylierter IgG-Antikörper mit Bindungsaffinität für den CD3-Antigen-Komplex.
2. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 1, welcher Bindungsaffinität für den
menschlichen CD3-Antigen-Komplex zeigt.
3. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 2, in dem mindestens ein
Komplementarität bestimmender Bereich (CDR) gewählt wird aus den Aminosäuresequenzen:
(a) Ser-Phe-Pro-Met-Ala,
(b) Thr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val-Lys-Gly,
(c) Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr,
(d) Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn-Tyr-Val-His,
(e) Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp,
(l) His-Ser-Tyr-Val-Ser-Ser-Phe-Asn-Val,
und konservativ modifizierten Varianten davon.
4. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 2, welcher eine schwere Kette mit
mindestens einem aus folgenden Aminosäuresequenzen gewählten CDR:
(a) Ser-Phe-Pro-Met-Ala,
(b) Thr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val-Lys-GIY,
(c) Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr,
und konservativ modifizierten Varianten davon, und/oder eine leichte Kette mit
mindestens einem aus folgenden Aminosäuresequenzen gewählten CDR:
(d) Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn-Tyr-Val-His,
(e) Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp,
(f) His-Ser-Tyr-Val-Ser-Ser-Phe-Asn-Val,
und konservativ modifizierten Varianten davon, aufweist.
5. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 2, welcher eine schwere Kette mit drei
CDRs, umfassend folgende Aminosäuresequenzen:
(a) Ser-Phe-Pro-Met-Ala,
(b) Thr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val-Lys-Gly,
(c) Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr,
oder konservativ modifizierte Varianten davon, und eine leichte Kette mit drei CDRs,
umfassend folgende Aminosäuresequenzen:
(d) Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn-Tyr-Val-His,
(e) Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp,
(f) His-Ser-Tyr-Val-Ser-Ser-Phe-Asn-Val,
oder konservativ modifizierte Varianten davon aufweist, wobei die CDRs der schweren
Kette in der Reihenfolge (a), (b), (c) in der Richtung Leader T konstante Domäne
angeordnet sind und die CDRs der leichten Kette in der Reihenfolge (d), (e), (f) in der
Richtung Leader T konstante Domäne angeordnet sind.
6. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, in dem die
Gerüstbereiche der variablen Domänen einen Ratten- oder Maus-Ursprung haben oder davon
abgeleitet sind.
7. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, in dem die CDRs
einen anderen Ursprung haben als der variable Gerüstbereich.
8. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 7, in dem die Gerüstbereiche der
variablen Domänen einen menschlichen Ursprung haben oder davon abgeleitet sind.
9. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 8, in dem der Gerüstbereich der
variablen Domäne von der schweren Kette, gelesen in der Richtung Leader T konstante
Domäne, folgendes umfaßt:
Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-
Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-/CDR/-
Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Ley-Glu-Trp-Val-Ser-/CDR/-
Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-
/CDR/-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser,
wobei CDR die Anwesenheit eines CDR angibt, von denen mindestens einer (a), (b) oder
(c) oder eine konservativ modifizierte Variante davon ist.
10. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 8 oder 9, in dem der Gerüstbereich der
variablen Domäne der leichten Kette, gelesen in der Richtung Leader T konstante
Domäne, folgendes umfaßt:
Asp-Phe-Met-Leu-Thr-Gln-Pro-His-Ser-Val-Ser-Glu-Ser-Pro-Gly-Lys-
Thr-Val-Ile-Ile-Ser-Cys-/CDR/-Trp-Tyr-Gln-Gln-Arg-Pro-Gly-Arg-Ala-
Pro-Thr-Thr-Val-Ile-Phe-/CDR/-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-
Ile-Asp-Arg-Ser-Ser-Asn-Ser-Ala-Ser-Leu-Thr-Ile-Ser-Gly-Leu-Gln-
Thr-Glu-Asp-Glu-Ala-Asp-Tyr-Tyr-Cys-/CDR/-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys-
Leu-Thr-Val-Leu-Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro-Ser-Val-Thr-Leu-Phe-
Pro-Pro-Ser-Ser-Glu-Glu-Leu-Gln,
wobei CDR die Anwesenheit eines CDR angibt, von denen mindestens einer (d), (e) oder
(f) oder eine konservativ modifizierte Variante davon ist.
11. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 9 mit einer schweren Kette mit variabler
Domäne, welche folgendes umfaßt:
Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-
Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe-
Pro-Met-Ala-Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-
Ser-Thr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val-
Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-
Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-
Ala-Lys-Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-
Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser.
12. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 8 oder 11 mit einer leichten Kette mit
variabler Domäne, welche folgendes umfaßt:
Asp-Phe-Met-Leu-Thr-Gln-Pro-His-Ser-Val-Ser-Glu-Ser-Pro-Gly-Lys-
Thr-Val-Ile-Ile-Ser-Cys-Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn-
Tyr-Val-His-Trp-Tyr-Gln-Gln-Arg-Pro-Gly-Arg-Ala-Pro-Thr-Thr-Val-
Ile-Phe-Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe-Ser-
Gly-Ser-Ile-Asp-Arg-Ser-Ser-Asn-Ser-Ala-Ser-Leu-Thr-Ile-Ser-Gly-
Leu-Gln-Thr-Glu-Asp-Glu-Ala-Asp-Tyr-Tyr-Cys-His-Ser-Tyr-Val-Ser-
Ser-Phe-Asn-Val-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys-Leu-Thr-Val-Leu-Gly-Gln-
Pro-Lys-Ala-Ala-Pro-Ser-Val-Thr-Leu-Phe-Pro-Pro-Ser-Ser-Glu-Glu-
Leu-Gln.
13. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß einem der Anspruche 1 bis 12, in dem die kon
stanten Domänen einen Ratten- oder Maus-Ursprung haben oder davon abgeleitet sind.
14. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, in dem die CDRs
einen anderen Ursprung als die konstante Region haben.
15. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, in dem die
konstanten Domänen einen menschlichen Ursprung haben oder davon abgeleitet sind.
16. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß einem der Anspruche 1 - 15, in dem die konstante
Region von einem IgG1-Isotyp ist.
17. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 15 oder 16, in dem der Asparaginrest in
Position 297 jeder konstanten Region der schweren Kette durch einen alternativen
Aminosäurerest ausgetauscht ist.
18. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 17, bei dem der Asparaginrest durch ein
Alaninrest ausgetauscht ist.
19. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem nur
einer von dessen Armen Affinität für das CD3-Antigen zeigt.
20. Nicht glykosylierter Antikörper gemäß Anspruch 19, welcher monovalent ist.
21. Nicht glykosylierter Antikörper gemaß Anspruch 20, in dem die Hälfte des Antikörpers
aus einer vollständigen schweren Kette und leichten Kette besteht und die andere Hälfte
aus einer ähnlichen, aber gestutzten bzw. trunkierten schweren Kette besteht, der die
Bindungsstelle für die leichte Kette fehlt.
22. Nicht glykosylierter Antikörper gemaß einem der Ansprüche 1 bis 21 in Form einer
pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend ein physiologisch annehmbares
Verdünnungsmittel oder Träger.
23. Nicht glykosylierter Antikörper gemaß einem der Anspruche 1 bis 21 zur Verwendung bei
der Therapie.
24. Verwendung eines nicht glykosylierten Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21
zur Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Immunosuppression.
25. Verwendung gemaß Anspruch 24, wobei das Medikament zur Verwendung bei der
Behandlung von Empfängern eines Transplantats ist.
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