DE69220442T2

DE69220442T2 - Heparinderivate und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69220442T2
Application number: DE69220442T
Authority: DE
Inventors: Christer Mattsson; Carl-Magnus Svahn; Michael Weber
Original assignee: Pharmacia and Upjohn AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1991-04-18
Filing date: 1992-04-14
Publication date: 1998-01-29
Anticipated expiration: 2012-04-15
Also published as: US6326476B1; ATE154614T1; AU642626B2; SE9101155D0; DE69220442D1; EP0536363A1; GR3024757T3; US6150342A; CA2084301A1; DK0536363T3; EP0536363B1; CA2084301C; JPH05508184A; ES2104909T3; AU1646392A; JP3278676B2; WO1992018545A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Heparinderivate zur Behandlung von ischämischen Herzerkrankungen und verwandten Gefäßerkrankungen und Verfahren zu deren Herstellung.
Heparin ist ein sulfathaltiges Polysaccharid, das im großen Maßstab aus Darmschleimhaut von Schweinen oder Lungen von Rindern isoliert wird. Das mittlere Molekulargewicht für Standard-Rinderheparin beträgt mehr als 9000 und für Standard-Schweineheparin mehr als 12000.
Traditionell ist die klinische Verwendung von Heparin mit seinen Antikoagulans- und antithrombotischen Eigenschaften verbunden (Jorpes, E., 1946, Heparin in Treatment of Thrombosis, 2. Auflage, Oxford Medical Publications). Es hat sich auch gezeigt, daß Heparin die Korona- Kollateralentwicklung bei Hunden beschleunigt (Fujita, M. Mikuniya, A. Takahashi, M. Gaddis, R. Hartley, J. McKnown, D. und Franklin, D., 1987, Japanese Circulation Journal, 51, 395-402) und den kollateralen Kreislauf bei Patienten mit Anstrengungsangina verbessert (Fujita, M. Sasayama, S. Asanoi, H. Nakijama, H. Sakai, O. und Ohino, A., 1988, Circulation, 77, 1022-1029).
Andere Wirkungen, wie die "antikomplementäre Kraft von Heparin", festgestellt von Ekker E. E. und Gross, P. (1929) in J. Infect. Dis. 44, 250-253, und die Feststellungen von Clowes, A.W. und Karnovsky, M.J. (1977) in Natura 265, 625-626, daß eine Heparininfüsion nach experimenteller Verletzung die Proliferation von glatten Muskelzellen unterdruckt, haben nicht zu einer verbreiteten Verwendung von Heparin zur Behandlung von Erkrankungen geführt, die mit Entzündungen oder Arteriosklerose zusammenhängen, die mit einer Komplementaktivierung bzw. Proliferation von glatten Muskelzellen verbunden sind. Es wird angenommen, daß die Gefahr von Hämorrhagie die Hauptbegrenzung für die klinische Verwendung von Heparin bei nicht-antithrombotischen Indikationen darstellt.
Die Patentanmeldung EP 287 477-A beschreibt Heparinprodukte mit niedrigem Molekulargwicht, und diese Druckschrift gibt eine gute Übersicht des Standes der Technik bezüglich der Oxidation von Heparin durch Periodat und nieder-molekulare Heparine, die auf diese Weise erhalten worden sind. Auf diese Druckschrift wird hier verwiesen.
In der EP 287477 wird gezeigt, daß, wenn Heparin, das aus der Darmschleimhaut von Schweinen erhalten worden ist, einer Behandlung mit Periodat bei pH 5 und anschließenden Depolymerisierung durch Behandlung mit einer starken Base bei einem pH-Wert über 11 unterworfen und dann mit einem Reduktionsmittel reduziert worden ist, ein nieder-molekulares Heparin erhalten worden ist, bei dem 70 % des Molekulargewichts zwischen 4800-9000 Da liegen und ein Spitzenmolekulargewicht von 5500-6000 Da, bestimmt durch HPLC. Dieses nieder-molekula-re Heparin wird verwendet zur Regulation des physiologischen Systems.
Es hat sich jetzt gezeigt, daß nieder-molekulare Heparine (Heparinfragmente), entsprechend der EP 287 477, die Entwicklung von Koronarkollateralen nicht deutlich beschleunigen. Überraschenderweise hat es sich jedoch gezeigt, daß die neuen Heparinderivate mit einem Molekulargewicht, das gleich oder größer ist als bei Standard-Heparin, die einen erhöhten Schwefelgehalt besitzen, die wertvollen physiologischen Eigenschaften von Standard-Heparin, wie Verstärkung der Entwicklung von Koronarkollateralen, beibehalten. Außerdem wurde eine wesentlich geringere Wirkung auf die Blutungszeit bei den neuen Heparinderivaten gezeigt als bei Heparin selbst. Es zeigte sich auch eine starke antithrombotische Wirkung der neuen Heparinderivate in einer Dosis, bei der die Blutungszeit nicht verlängert wird. So sind die neuen Heparinderivate den in der EP 287 477 angegebenen Produkten überlegen und stellen wertvolle Arzneimittel dar zur Behandlung von ischämischen Herzerkrankungen, wie Angina und verwandten Gefäßerkrankungen, z.B. zur Verhütung einer erneuten Verengung nach perkutaner transluminaler Angioplastik (PTCA).
Patienten, die an ischämischen Herzerkrankungen leiden, zeigen im allgemeinen eine Verengung der Arterien im Herzen. Eine progressive Verengung des Lumens der Koronararterien führt zu den Symptomen von Angina und schließlich häufig zu einem Myokardinfarkt (MI). Ein überschüssiges unkontrolliertes Wachstum von glatten Muskelzellen (SMC) stellt einen Hauptbeitrag dar für die progressive Verengung der Koronargefaße. Der schließliche Verschluß eines verengten Gefaßes, der den Myokardinfarkt auslöst, wird häufig hervorgerufen durch Bildung eines Thrombus. Die Thrombusbildung kann ausgelöst werden durch Aktivierung der Koagulations- und komplementären Systeme, die selbst aktiviert werden können durch die sklerotische Oberfläche der verengten Arterie. Als natürlicher Abwehrmechanismus des verringerten Blutstroms und der damit verringerten Sauerstoffzufuhr an diese Teile des Herzens, die von den verengten Blutgefäßen versorgt werden, entwickeln sich bei manchen Patienten langsam neue Routen für die Blutzuführ, während dies bei anderen Patienten kaum geschieht. Diese neuen Routen der Blutzuführ zu einem Bereich mit Sauerstoffmangel (ischämisch) des Herzens, werden Kollaterale genannt, und das Verfahren zur Bildung von neuen Blutgefäßen wird Angiogenese genannt. Die neuen Routen können kleine oder große Gefäße sein. Hier werden sie allgemein als Kollaterale bezeichnet. Es hat sich gezeigt, daß Heparin eine stimulierende Wirkung auf die Entwicklung von Koronarkollateralen und den Prozeß der Angiogenese sowie eine hemmende Wirkung auf die SMC- Proliferation und eine präventive Wirkung auf die Thrombusbildung besitzt. Ein Hauptnachteil für eine allgemeine Verwendung von Heparin bei ischämischen Herzerkrankungen ist jedoch die Gefahr des Blutens, das mit einer Therapie unter Verwendung von Standard-Heparin verbunden ist. Die vorliegende Erfindung beschreibt neue Heparinderivate, die die Bildung von Koronarkollateralen verstärken, die SMC-Proliferation hemmen und einen niedrigen Gehalt an Antikoagulansaktivität im Blut aufrechterhalten, ohne daß sie gefahrlich sind in Bezug auf Blutungen und somit geeignet zur Behandlung von ischämischen Herzerkrankungen, z.B. Angina pectoris und verwandten Gefäßerkrankungen. Ein Beispiel für verwandte Gefäßerkrankungen ist die Behandlung von Patienten mit einer perkutanen transluminalen Herzkranzangioplastik (PTCA), um eine erneute Verengung zu verhüten.

Legende zu den Figuren

Fig. 1: Gelpermeationschromatographie durch HPLC
1 Heparin aus Rinderlunge.
2 Heparin aus Rinderlunge nach Oxidation mit Periodat.
3 Heparin aus Rinderlunge nach Oxidation mit Periodat, Depolymerisierung mit Natriumhydroxid und Reduktion mit Natriumborhydrid.
4 Heparin aus Rinderlunge nach Oxidation mit Periodat, Depolymerisierung mit Natriumhydroxid, Reduktion mit Natriumborhydrid und Fraktionierung (Heparinderivat 1).
Fig. 2: Gelpermeationschromatographie durch HPLC
3 Heparin aus Rinderlunge nach Oxidation mit Periodat, Depolymerisierung mit Natriumhydroxid und Reduktion mit Natriumborhydrid.
5 Heparin aus Schweinedarmschleimhaut nach Oxidation mit Periodat, Depolymerisierung mit Natriumhydroxid und Reduktion mit Natriumborhydrid.
Fig. 3: Gelpermeationschromatographie durch HPLC
6 Standard-Heparin aus Schweinedarmschleimhaut.
7 Standard-Heparin aus Schweinedarmschleimhaut nach Sulfatisierung, Oxidation mit Periodat, Depolymerisierung mit Natriumhydroxid und Reduktion mit Natriumborhydrid.
8 Standard-Heparin aus Schweinedarmschleimhaut nach Sulfatisierung, Oxidation mit Periodat, Depolymerisierung mit Natriumhydroxid und Reduktion mit Natriumborhydrid und Fraktionierung (Beispiel 5),
Fig. 4: Anti-FXa-Aktivität bei Hunden nach subkutaner Verabreichung von Heparinderivat 1 (10 mg/kg). Die Anti-FXa-Aktivität wurde bestimmt nach Bergkvist et al. (1983), Thromb. Res., 32, 381-391.
Fig. 5: APTT-Aktivität bei Hunden nach subkutaner Verabreichung von Heparinderivat 1 (10 mg/kg). Die APTT-Aktivität wurde bestimmt nach Teien et al. (1975), Tromb. Res. 7, 777-778.
Fig. 6: Die Entwicklung von Koronarkollateralen durch Standard-Heparin, das Heparinderivat 1, ein nieder-molekulares Heparin (Heparinfragment) mit einem Molekulargewicht von 4800, und eine Kontrolle ohne Behandlung. Nur in Gegenwart von Heparinderivat 1 oder Heparin konnte die Verstärkung der Entwicklung von Koronarkollateralen als eine statistisch signifikante (p< 0,05) Abnahme der Anzahl der gebildeten Verschlüsse gezeigt werden.
Fig. 7: Die Verlängerung der Lee-White-Gerinnungszeit (Gerinnungszeitzunahme %) im Blut von durch subkutane Injektion mit Standard-Heparin (3,6 mg/kg) oder Heparinderivat 1(10 mg/kg) behandelten Hunden. Obwohl die Dosis an Heparinderivat 1 dreifach größer war (Gewicht) als bei Heparin, war die Verlängerung der Gerinnungszeit weniger ausgeprägt.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue Heparinderivate aus Rinder- oder Schweineheparin, die nach dem unten beschriebenen Verfahren hergestellt worden sind, und die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie:
- ein Molekulargewicht gleich oder größer als das Standard-Heparin aufweisen, das 9000 für Standard-Rinderheparin und 12000 für Standard-Schweineheparin beträgt,
- einen Schwefelgehalt zeigen, der gleich oder höher ist als derjenige des Ausgangs- Heparins oder mindestens 13 % (Gew./Gew.) beträgt,
- eine gerinnungshemmende Aktivität in dem Anti-FXa-Assay von weniger als 10 % des Standard-Heparins, aus dem sie hergestellt worden sind, aufweisen,
- ein Verhältnis von APTT-Aktivität gegenüber Anti-FXa-Aktivität von 3-35 zeigen,
- eine um mindestens 75 % verringerte Verlängerung der Blutungszeit, vergleichen mit dem Standard-Heparin, aus dem sie hergestellt worden sind, zeigen, gemessen im Schwanz einer Ratte nach i.v.-Verabreichung,
- eine Erhöhung der Geschwindigkeit der Entwicklung von Koronarkollateralen bei Hunden zeigen, die gleich oder besser ist als bei klinisch angewandtem Heparin.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der beanspruchten neuen Rinderheparinderivate, umfassend die Behandlung von Standard-Rinderheparin durch die folgenden Stufen:
- Oxidation durch Periodat bei pH 4-5 und 0-10ºC in der Dunkelheit,
- partielle Depolymerisierung durch Alkali,
- Reduktion durch Natriumborhydrid,
- Fraktionieren des erhaltenen Produktes unter Anwendung von Gelpermeationschromatographie, Ultrafiltration, hydrophober Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Ausfallung aus einer wäßrigen Lösung durch Zugabe eines organischen Lösemitteis, vorzugsweise von Ethanol,
- Sammeln des Produktes mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als demjenigen von Standard-Heparin, das als Ausgangsmaterial verwendet wurde, d.h. 9000 für Standard-Rinderheparin.
Der Zweck des Fraktionierens liegt darin, ein Produkt mit gleichem oder höherem Molekulargewicht als Standard-Heparin zu erhalten und eine engere Molekulargewichtsverteilung zu erhalten als bei Heparin oder Zwischenprodukten.
Die Erfindung betriffi auch ein Verfahren zur Herstellung der beanspruchten neuen Schweine-Heparinderivate, umfassend die Behandlung von Standard-Schweineheparin durch
- milde chemische Sulfatierung,
- Oxidation durch Periodat bei pH 4-5 und 0-10ºC in der Dunkelheit,
- partielle Depolymerisierung durch Alkali,
- Reduktion durch Natriumborhydrid,
- Fraktionieren des erhaltenen Produktes unter Anwendung von Gelpermeationschromatographie, Ultrafiltration, hydrophober Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Ausfallung aus einer wäßrigen Lösung durch Zugabe eines organischen Lösemittels, vorzugsweise von Ethanol,
- Sammeln des Produktes mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als demjenigen des Heparins, das als Ausgangsmaterial verwendet wurde, d.h. 12000 für Standard-Schweineheparin.
Die Erfindung betriffi so ein Verfahren, bei dem die neuen Heparinderivate nach der Erfindung auch erhalten werden, wenn Schweineheparin als Ausgangsmaterial verwendet wird. Bei Schweineheparin wird eine milde Sulfatierung durchgeführt vor der Oxidation durch Periodat und anschließende Depolymerisierung. Diese milde Sulfatierung verstärkt den Gesamtschwefelgehalt des Schweineheparins und blockiert auch einige der vicinalen Hydroxylgruppen von nichtsulfatierter Gluconsäure und von Iduronsäuren, die der Oxidation durch Periodat unterliegen. Diese Sulfatierung führt auch zu einer geringeren Depolymerisierung des Schweineheparins als in der EP 287 477 angegeben.
Die Verwendung des Produktes zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ischämischen Herzerkrankungen und verwandten Gefäßerkrankungen und zur Verstärkung der Geschwindigkeit der Entwicklung von Koronarkollateralperfusion wird ebenfalls beansprucht.
Ein Aspekt der Erfindung ist das Molekulargewicht der neuen erfindungsgemäßen Heparinderivate. Wie in Fig. 6 gezeigt, zeigt ein nieder-molekulares Heparin (Heparinfragment) mit einem Molekulargewicht von 4800 nicht die gleiche gute Wirkung wie das Standard-Heparin in der gleichen Dosis. Fig. 6 zeigt die Bedeutung des Molekulargewichts des neuen Heparins zur Verstärkung der Entwicklung von Koronarkollateralen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist, daß die Anti-FXa-Aktivität der neuen Heparine auf weniger als 10 % der Aktivität des Standard- Heparins verringert wird, das als Ausgangsmaterial zur Herstellung der neuen erfindungsgemäßen Heparine verwendet wird. Das ist in Tabelle 1 gezeigt. Die Anti-FXa-Aktivität, die sich üblicherweise in Standard-Heparinen zur Injektion findet, beträgt 120-190 IE/mg.
Die Verringerung der Anti-FXa-Aktivität wird hervorgerufen durch die Oxidationsbehandlung durch Periodat, Alkalibehandlung und Reduktion. Diese Behandlung beeinflußt auch das Molekulargewicht des Endproduktes.
So war, wenn die Periodatoxidation bei pH 3 stattfindet, die Anti-FXa-Aktivität des Produktes verhältnismäßig hoch; es verblieben etwa 20-40 % der ursprünglichen Aktivität. Das ist auch in der EP 14 184-B gezeigt. Wenn jedoch bei einem pH-Wert von 7 gearbeitet wurde, wurde ein nieder-molekulares Heparin (Heparinfragment) mit einem Molekulargewicht von 4800 erhalten. So wurde ein pH-Wert von 4-5 und vorzugsweise unter 4,5 für die Periodatstufe bei der Herstellung des neuen Heparinderivats nach der Erfindung angewandt.
Bei der Antikoagulansbestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT) ist die Aktivität der neuen Heparinderivate nach der Erfindung immer höher als bei dem Anti- FXa-Assay. Das Verhältnis von APTT gegenüber Anti-FXa beträgt 3-35, verglichen mit einem Verhältnis von 0,8-1,2 bei Standard-Heparinen, und 0,5-0,05 für viele nieder-molekulare Heparine.
Die Gehalte an Antikoagulansaktivität in vivo bei Hunden, die sich bei den neuen Heparinderivaten zeigen, stellen Gehalte dar, die sich normalerweise finden, wenn Heparin klinisch zur Thromboseprophylaxe bei der allgemeinen Chirurgie verwendet wird (das geht aus den Fig. 3 und 4 hervor). Die neuen Heparinderivate nach der Erfindung besitzen daher auch ein antithrombotisches Potential, während sie noch weniger die Nebenwirkung von unerwünschten Blutungen zei gen als Standard-Heparin. Die antithrombotische Aktivität wurde in vivo bei Kaninchen gezeigt (Tabelle 2).
Ein weiterer Aspekt der neuen Heparine ist die Verringerung der Verlängerung der Blutungszeit (dies ist aus Tabelle 1 zu ersehen), was sehr wichtig ist, da es erlaubt, die neuen Produkte nach der Erfindung in höheren und wirksameren Dosen zu verabreichen als Standard-Heparin, ohne die Gefahr von Blutungen. Unter Verringerung der Verlängerung der Blutungszeit ist hier eine Verringerung von mindestens 75 % zu verstehen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist der hohe Sulfatgehalt der neuen Heparine, der gleich oder vorzugsweise höher ist als derjenige der Heparine, die als Ausgangsmaterial verwendet wreden.
Dieser hohe Sulfatgehalt der neuen Heparine wird erzielt durch
- Verwendung eines Heparins, das reich an Sulfatgruppen ist, z.B. Heparin aus Rinderlunge, als Ausgangsmaterial,
- Verringerung der Antikoagulansaktivität des Ausgangs-Heparins durch Anwendung eines Verfahrens, wie des beschriebenen Periodatverfahrens, das nicht-sulfatierte Uronsäureeinheiten von Heparin eliminiert und dadurch den Anteil an sulfatierten Uronsäureeinheiten in den neuen Heparinderivaten erhöht,
- Anwendung eines Fraktionierverfahrens, das die neuen Heparinderivate an hoch-sulfatierten Komponenten anreichert. Ein solches Fraktionierverfahren könnte ein Ausfällen des Produktes aus einer wäßrigen Lösung eines Natrium-, Calcium-, Zink- oder Bariumsalzes durch ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel sein und im Falle von Calcium-, Zink- und Bariumsalzen nach der Fraktionierung, Umwandlung dieser Salze in Natriumsalze oder ein chromatographisches Verfahren, umfassend eine hydrophobe Wechselwirkung, Kationenaustausch oder Affinitätschromatographie. Dieses Fraktionierverfahren kann entweder vor oder nach dem angegebenen Periodatverfahren durchgeführt werden oder beide Verfahren können zusammen angewandt werden. Ein Beispiel für einen Affinitäts- Chromatographie-Liganden ist Thrombin, das an Sepharose gekuppelt sein kann. Neben diesen Verfahren zur Erhöhung des Sulfatgehalts der neuen Heparinderivate nach der Erfindung, kann gegebenenfalls eine chemische Sulfatierung angewandt werden, um den Sulfatgehalt noch weiter zu erhöhen.
Methoden zur chemischen Sulfatierung der erfindungsgemäßen Produkte sollten mild genug sein, um nicht zu einer Depolymerisierung oder einem Abbau des Produktes, das sulfatiert wird, zu führen. Zum Beispiel können die Produkte sulfatiert werden durch Behandlung ihrer Tributylammoniumsalze, die in trockenem Dimethylformamid gelöst sind, bei niedriger Temperatur mit einem Komplex aus Schwefeltrioxid und einer organischen Base, wie Pyridin oder Triethylamin, und anschließendes Isolieren und Reinigen des sulfatierten Produktes unter Anwendung irgendeiner der Methoden, die zur Fraktionierung bei dem Periodatverfahren angewandt werden. Da die chemische Sulfatierung von Heparin als solche allgemein die Antikoagulansaktivität von Heparin, gemessen durch das Anti-FXa-Assay, verringert, kann ein milderes Periodatverfahren angewandt werden, wenn es mit einer chemischen Sulfatierung kombiniert wird, verglichen damit, wenn das Periodatverfahren allein angewandt wird. Bei einer anderen Durchführung der Erfindung kann die Herstellung mit einer milden partiellen chemischen Sulfatierung beginnen, gefolgt von einer Periodatverfahren, was em für Schweineheparin bevorzugtes Verfahren ist.
Die vorliegende Erfindung betriffi somit neue Heparinderivate zur Behandlung von ischämischen Herzerkrankungen und verwandten Gefäßerkrankungen. Diese Heparinderivate können in hohen Dosen verabreicht werden, um die Koronarkollateralbildung wirksam zu verstarken, die Proliferation von glatten Muskelzellen zu hemmen, und sie können gleichzeitig eine verzögernde bzw. lang anhaltende geringe Antikoagulansaktivität in Plasma ergeben, die zu einer antithrombotischen Wirkung beiträgt, ohne die Gefahr von Hämorrhagie.
In der klinischen Praxis muß nur eine einzige tägliche subkutane Injektion verabreicht werden, anstelle von 2-3 subkutanen oder intravenösen Injektionen täglich, wie es allgemein der Fall ist für Standard-Heparin, z.B. bei der klinischen Antithrombose-Therapie. Die Dosis der neuen Heparinderivate kann im Bereich von 0,5-15 mg/kg.Tag bei subkutaner Injektion oder aus einer Depotzubereitung liegen. Eine intravenöse Inftision oder Injektion kann ebenfalls angewandt werden.
Unten sind einige nicht beschränkende Beispiele zur Herstellung der neuen Heparinderivat angegeben.

Beispiele

Beispiel 1 Heparinderivat 1

Standard-Heparin aus Rinderlunge (100 g), MG = 10000, wurde in Natriumacetatpuffer (2,5 1) (0,05 M Natriumacetat, 0,2 M Natriumchlorid, pH 5,0) gelöst und auf 4ºC gekühlt. Natriumperiodat (107 g, 0,50 mol), gelöst in dem Natriumacetatpuffer (2,5 1), wurde zugegeben, und das Gemisch wurde 2 Tage gerührt. Ethylenglykol (100 ml) wurde zugegeben, um überschüssiges Periodat zu zerstören, und das Gemisch wurde einige Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde über eine Sephadex G-15-Säule entsalzt. Die Fraktion, die das entsalzte Produkt enthielt, wurde gefriergetrocknet und ergab 81 g mit Periodat oxidiertes Heparin.
Das mit Periodat oxidierte Heparin wurde in 0,02 M Natriumhydroxid (4,25 1) gelöst und 40 min bei Raumtemperatur stehengelassen und dann durch Natriumborhydrid (4,25 g) 2,5 h re duziert. Überschüssiges Natriumborhydrid wurde durch Essigsäure (28 ml) zersetzt. Diese Lösung wurde dann durch Ionenaustauschchromatographie über eine DEAE-Sepharose-Säule fraktioniert. Eine Fraktion, die zwischen 0,7 M und 2 M Natiumchlorid eluiert wurde, wurde gesammelt und entsalzt mit Hilfe einer Hohlfaser (Amicon H1P3-20, cutoff 3000). Das Heparinderivat wurde ausgefällt durch Zugabe von kaltem Ethanol (das 2,5-Fache des Gewichts des Retentats). Der Niederschlag wurde gesammelt und im Vakuum getrocknet und ergab 31 g Heparinderivat 1.
Nach Elementaranalyse war N 2,1 % und 5 war 13,5 %. Nach konduktometrischer Titration war das Molverhältnis SO&sub3;/CO&sub2; 2,82. Nach Gelpermeationschromatographie war das Molekulargewicht 11000 Da. Bei dem als Ausgangsmaterial in diesem Beispiel verwendeten Heparin war S 13,0 %, das Molverhältnis SO&sub3;/CO&sub2; war 2,47 und das Molekulargewicht durch Gelpermeationschromatographie war 10000 Da. Die Anti-FXa-Aktivität betrug 8 IE/mg, APTT 54 IE/mg und die antithrombotische Aktivität 4 IE/mg, verglichen mit 126 IE/mg, 151 IE/mg bzw. 124 IE/mg für Standard-Heparin.
Die von Heparin/Cofaktor II abhängige Antithrombin-Aktivität (Tollefsen, D.M. et al., Blood (1985), 66, 769-774) wurde untersucht und es zeigte sich, daß sie um das zweifache erhöht war, verglichen mit dem mit Periodat oxidierten Heparin-Zwischenprodukt, und sogar höher, verglichen mit dem mit Periodat oxidierten depolymerisierten und reduzierten Heparin.

Beispiel 2

Heparin aus Rinderlunge (100 g) wurde wie in Beispiel 1 oxidiert, Ethylenglykol wurde zugegeben und die Lösung mit Hilfe einer Hohlfaser (Amicon H1P3-20, cutoff 3000) entsalzt. Das Gefriertrocknen ergab 78 g oxidiertes Heparin. Dieses Material (4,0 g) wurde in 0,1 M Natriumhydroxid (200 ml) gelöst und 2 h bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit Natriumborhydrid (0,18 g) während 3 h reduziert. Überschüssiges Borhydrid wurde durch Essigsäure (5 ml) zersetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde dann mit Natriumhydroxid (2 M) auf 6,3 eingestellt. Die Lösung wurde durch Ultrafiltration entsalzt. Das Gefriertrocknen ergab 3,7 g eines mit Periodat oxidierten depolymerisierten und reduzierten Produktes. Um dieses Produkt zu fraktionieren, wurde es der Gelpermeationschromatographie über eine Sephadex G-75-Säule unterworfen; 2,0 g wurden in 0,2 M Natriumchlorid gelöst und dann durch die Säule (5x83 cm) mit einer Geschwindigkeit von 0,65 ml/min geleitet. Eine hoch-molekulare Fraktion wurde gesammelt und durch Ultrafiltration entsalzt. Das Gefriertrocknen ergab 0,34 g eines neuen Heparinderivats. Nach Elementaranalyse war S 14,3 % und Anti-FXa war 7 IE/mg und APTT war 55 IE/mg.

Beispiel 3

Heparin aus Rinderlunge (2,0 g) wurde in dem Natriumacetatpuffer (50 ml) (0,05 M Natriumaceat, 0,2 M Natriumchlorid, pH 4,0) gelöst und auf 4ºC gekühlt. Natriumperiodat (2,14 g, 10 mmol), gelöst in dem Natriumacetatpuffer (50 ml), wurde zugegeben und die Lösung 3 Tage bei 7ºC stehengelassen. Ethylenglykol (2 ml) wurde zugegeben, um überschüssiges Periodat zu zerstören, und die Lösung wurde 1 h bei Raumtemperatur stehengelassen und durch Ultrafiltration (Amicon YM2) entsalzt. Das Retentat wurde auf pH 6,5 neutralisiert und gefriergetrocknet und ergab 1,78 g mit Periodat oxidiertes Heparin. Das mit Periodat oxidierte Heparin (1,60 g) wurde in 0,1 M Natriumhyroxid (80 ml) gelöst und 2 h bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend mit Natriumborhydrid (80 mg) 3 h reduziert. Überschüssiges Natriumborhydrid wurde durch Essigsäure (2 ml) zersetzt, auf pH 6,5 neutralisiert und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einem Schnitt von 8000 Da fraktioniert. Die hoch-molekulare Fraktion blieb auf dem Ultrafilter und wurde gefriergetrocknet. Nach Elementaranalyse war 5 13,6 % und Anti-FXa war 5 IE/mg und APTT war 26 IE/mg.

Beispiel 4 Heparinderivat 2

Das Heparinderivat 1(1,00 g, S = 13,5 %) wurde in Wasser (20 ml) gelöst und durch ein Kationenaustauscherharz (Amberlite IR-120 in Wasserstofform) (2x20 cm) geleitet und mit Wasser (80 ml) eluiert. Das Eluat wurde mit Tri-n-butylamin/Ethanol 1:9 (11 ml) auf pH 5,8 neutralisiert und mit Diethylether (2x60 ml) extrahiert. Die wäßrige Phase wurde gefriergetrocknet und dann im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in trockenem N,N-Dimethylformamid (15 ml) gelöst und Schwefeltrioxid/Triethylamin-Komplex (3,0 g) wurde zugegeben. Die Lösung wurde 3 Tage auf Raumtemperatur gehalten und dann in 3 % Natriumacetat, gelöst in Ethanol (150 ml), gegossen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und der Niederschlag mit Ethanol (2x20 ml) gewaschen, in 2 M Natriumchlorid gelöst und ultrafiltriert (Amicon YM2, cutoff 1000). Das Retentat wurde mit Wasser gewaschen und dann durch ein Kationenaustauscherharz (Amberlite IR-120, Wasserstofform) geleitet und mit Wasser eluiert. Das Eluat wurde mit 0,1 M Natriumhydroxid auf pH 6,2 neutralisiert und gefriergetrocknet und ergab 0,88 g. Die Elementaranalyse zeigte einen Gehalt an 5 von 15,7 %. Das Molverhältnis SO&sub2;/CO&sub2; durch konduktometrische Titration nach Casu, B. und Gennaro H., (1975), Carbohydr. Res., 39, 168-176 betrug 3,92. Das Molekulargewicht durch Gelpermeationschromatographie betrug 11000 Da. Anti-FXa betrug 3 IE/mg und die APTT-Aktivität betrug 102 IE/mg.

Beispiel 5

Heparin aus Schweineschleimhaut (5,0 g) (11,3 % 5) wurde in Wasser (75 ml) gelöst und dann durch ein Kationenaustauscherharz (Dowex 50WX8 in Wasserstofform) (2,5x24 cm) geleitet und mit Wasser (150 ml) eluiert. Das Eluat wurde mit Tri-n-butylamin/Ethanol 1:9 (50 ml) auf pH 5,5 neutralisiert und mit Diethylether (2x150 ml) extrahiert. Die wäßrige Phase wurde gefriergetrocknet und ergab 7,56 g Produkt. Das Tributylammoniumsalz (0,50 g) wurde im Vakuum getrocknet und in trockenem N,N-Dimethylformamid (5 ml) gelöst und Schwefeltrioxid/Triethylamin-Komplex (0,15 g) wurde zugegeben. Die Lösung wurde 18 h auf Raumtemperatur gehalten und dann in 3 %-iges Natriumacetat in Ethanol (45 ml) gegossen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und der Niederschlag mit Ethanol (2x30 ml) gewaschen, in 2 M Natriumchlorid gelöst und ultrafiltriert (Amicon YMI, cutoff 1000). Das Retentat wurde mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet, Ausbeute 0,32 g.
Das sulfatierte Heparin (0,20 g) wurde in Natriumacetatpuffer (5 ml) (0,05 M Natriumacetat, 0,2 M Natriumchlorid, pH 5,0) gelöst. Natriumperiodat (214 mg, 1 mmol), gelöst in dem Natriumacetatpuffer (5 ml), wurde zugegeben und (das Gemisch) 1 Tag bei 8ºC gehalten. Ethylenglykol (0,5 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wenige Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und die Lösung dann durch Ultrafiltration entsalzt. Das mit Periodat oxidierte Heparin wurde in 0,1 M Natriumhydroxid gelöst und 2 h bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit Natriumborhydrid (14 mg) reduziert. Überschüssiges Natriumborhydrid wurde mit Essigsäure (0,2 ml) zerstört. Diese Lösung wurde durch Ionenaustauscherchromatographie über einer DEAE-Sepharose-Säule fraktioniert. Eine Fraktion, die zwischen 0,7 M und 2 M Natriumchlorid eluiert wurde, wurde gesammelt und weiter durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einem Schnitt von 10000 Da (Amicon YM10) fraktioniert. Das Retentat wurde gefriergetrocknet, Ausbeute 100 mg. Durch Elementaranalyse zeigte es sich, daß 5 13,8 % betrug.

Chemische und biologische Tests

Molekulargewichtsverteilung

Fig. 1 zeigt die Molekulargewichtsverteilung bei Gelpermeationschromatographie durch HPLC (nach Sudhalter J. et al., (1989), J. Biol. Chem., 264, 6892-6897) nach chemischer Behandlung und Fraktionierung des aus Rinderlunge nach dem beanspruchten Verfahren hergestellten Heparins.
Wenn klinisch verwendetes Heparin, das aus Rinderlunge hergestellt worden ist (Kurve 1 in Fig. 1), mit Periodat bei pH 4-5 oxidiert wurde, wurde eine Verteilung nach Kurve 2 in Fig. 1 erhalten. Nach Behandlung mit einer starken Base, um eine Depolymerisierung zu erreichen, und anschließende Reduktion mit Natriumborhydrid, wurde ein Produkt erhalten, das unerwarteterweise eine sehr geringe Verschiebung der Molekulargewichtsverteilung (Kurve 3 in Fig. 1) zeigte, verglichen mit dem Ausgangs-Rinderlungenheparin (Kurve 1 in Fig. 1).
Im Gegensatz dazu zeigte ein Produkt, das aus Schweineheparin nach dem gleichen Verfahren erhalten worden war, eine deutliche Verschiebung der Molekulargewichtsverteilung, vergleiche Kurve 5 mit Kurve 3 in Fig. 2. Die Verschiebung nach einem niedrigeren Molekulargewicht, die in Fig. 5 zu sehen ist, war ahnlich der Abnahme der Molekulargewichtsverteilung, wie sie in der EPO 287 477 angegeben ist, die nieder-molekulares Heparin beschreibt.
Fig. 3 zeigt die Molekulargewichtsverteilung bei Gelpermeationschromatographie durch HPLC (nach Sudhalter J. et al., (1989), J. Biol. Chem., 264, 6892-6897) nach chemischer Behandlung und Fraktionierung von Heparin aus Darmschleimhaut von Schweinen nach dem für Schweineheparin beanspruchten Verfahren.
Wenn klinisch verwendetes Heparin, das aus Darmschleimhaut von Schweinen erzeugt worden ist (Kurve 6 in Fig. 3), sulfatiert, mit Periodat oxidiert, mit Natriumhydroxid depolymerisiert und mit Natriumborhydrid reduziert worden ist, wurde eine Verteilung entsprechend Kurve 7 in Fig. 3 erhalten. Nach Behandlung mit einer starken Base, um eme Depolymerisierung zu erreichen, und anschließende Reduktion mit Natriumborhydrid, wurde ein Produkt erhalten, das unerwarteterweise eine sehr geringe Verschiebung der Molekulargewichtsverteilung (Kurve 8 in Fig. 3) zeigte, verglichen mit dem Ausgangs-Heparin aus Darmschleimhaut vom Schwein (Kurve 6 in Fig. 3).
Das zeigt deutlich, daß überraschenderweise unterschiedliche Produkte erhalten wurden, wenn klinische Heparine von unterschiedlichen Arten als Ausgangsmaterial für das gleiche Verfahren der Periodatoxidation und Alkalidepolymerisierung verwendet wurden.
Das in Kurve 3 in Fig. 1 gezeigte Produkt wurde weiter einer Fraktionierung nach Beispiel 1 unterworfen, um ein neues Produkt mit der in Kurve 4 in Fig. 1 gezeigten Molekulargewichtsverteilung zu erhalten. Andere Methoden der Fraktionierung zur Bildung der neuen Heparine nach der Erfindung sind in den Beispielen 2 und 3 beschrieben.

Bestimmung der Anti-Faktor IIA-potenzierenden Aktivität

Die Anti-Faktor IIA-potenzierende Aktivität der neuen Heparinderivate wurde in einem System bestimmt, in dem sie einen Komplex mit Antithrombin bilden. Das Antithrombin/Heparinderivat-Gemisch wurde 1 min bei 37ºC mit Faktor II inkubiert. Eine Menge an Faktor IIa wird durch Antithrombin/Heparinderivat-Komplex im Verhältnis zu der Konzentration des Heparinderivats neutralisiert. Die verbleibende Faktor IIa-Aktivität wurde gemessen unter Anwendung des chromogenen Substrats S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA). Die Geschwindigkeit, mit der PNA gebildet wurde, wurde verglichen mit der Geschwindigkeit, mit der PNA gebildet wurde, unter Verwendung des 4. International Standards für Heparin.

Untersuchung der Antikoagulansaktivität bei Tieren

Die neuen Heparinderivate wurden in einer Dosis von 10 mg/kg an zwei Beagle-Hunde verabreicht. Lösungen (0,2 ml/kg) in Salzlösung wurden hergestellt und subkutan in den Nacken des Hundes injiziert. Blutproben von 5 ml wurden mit Hilfe von Venoject , enthaltend 0,5 ml 0,13 M Natriumcitrat, entnommen. Vier Blutproben wurden während der ersten Stunde des Versuchs entnommen und anschließend eine Probe jede Stunde bis zu 9 h. Die Blutproben wurden 10 min bei Raumtemperatur gehalten, zur Abtrennung des Plasmas zentrifugiert, das sofort für die APTT- Analyse verwendet wurde. Verbleibendes Plasma wurde bei -20ºC gefroren gehalten bis zu Analyse der Anti-FXa-Aktivität. Die Anti-FXa (Bestimmung) wurde durchgeführt nach Bergkvist D., Hedner U., Sjödin E. und Holmer E., (1983), Tromb. Res., 32, 381-391. Die APPT-Bestimmung wurde durchgeführt nach Teien, AN. und Lie, M., (1975), Tromb. Res., 7, 777-778. Die Ergebnisse für das Heparinderivat 1 bei den Anti-FXa- und APTT-Bestimmungen sind in Fig. 4 bzw. 5 angegeben.
Die Anti-FXa-Aktitvität konnte in dem Blutplasma des Hundes ab etwa 1 h nach der Injektion gemessen werden. Diese Aktivität zeigte keine Abnahme nach 9 h, was aus Fig. 4 hervorgeht.
Auch eine Verlängerung der APTT-Aktivität war noch nach 9 h vorhanden (siehe Fig. 5).
Die Gehalte der Antikoagulansaktivität, die in Fig. 4 und Fig. 5 angegeben sind, stellen Gehalte dar, die sich normalerweise finden, wenn Heparin klinisch zur Thromboseprophylaxe bei der allgemeinen Chirurgie angewandt wird. Die neuen erfindungsgemäßen Heparinderivate besitzen daher auch eine antithrombotische Wirkung, während sie noch eine geringere unerwunschte Blutungsnebenwirkung zeigen als Standard-Heparin.
Bei der Antikoagulansbestimmung nach der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT) ist die Aktivität der neuen Heparinderivate nach der Erfindung immer höher als bei der Anti-FXa-Bestimmung. Das Verhältnis APTT gegenüber Anti-FXa ist 3-35, verglichen mit einem Verhältnis von 0,8-1,2 bei Standard-Heparinen, und 0,5-0,05 für viele nieder-molekulare Heparine.
Die Plasmakonzentrationskurven für die Antikoagulansaktivitäten (Fig. 4 und 5) sind auch vorteilhaft gegenüber Standard-Heparin, indem sie einen gleichbleibenden Gehalt an Antikoagulansaktivität über einen langen Zeitraum (mindestens 9 h) zeigen. Das bedeutet, daß in der klinischen Praxis nur eine einzige tägliche subkutane Injektion verabreicht werden muß anstelle von 2- 3 subkutanen oder intravenösen Injektionen täglich, wie es im allgemeinen der Fall ist bei Standard-Heparin, z.B. bei der klinischen Antithrombose-Therapie.

Untersuchung der Blutungszeit

Ein Schablonenblutungszeittest nach Dejana E., Callioni A., Quintana A., Gaetano G., 1979, Tromb. Res., 15, 191-197 wurde an Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 200- 250 g, die mit Mebumal/Stesolid (Dumex A/S Kopenhagen) anästhesiert waren, durchgeführt. Die Schablonenvorrichtung (Simplate, General Diagnostics, Durham, NC) wurde längs auf den Rükkenteil des Schwanzes aufgesetzt, wobei darauf geachtet wurde, große Venen zu vermeiden. Blut aus der Wunde wurde dann sorgfältig alle 30 s mit saugfähigem Papier entfernt. Ein Minimum von sechs Ratten wurde für jede Verbindung und Dosis verwendet. Die Blutungszeiten wurden gemessen von dem Moment an, an dem der Schwanz eingeschnitten wurde bis zum ersten Stillstand der Blutung. Die Blutungszeit wurde mit einer Genauigkeit von 30 5 aufgezeichnet. Zwei Blutungszeiten wurden jeweils bei jeder Ratte bestimmt, und zwar 10 min vor und 10 min nach der Arzneimittelverabreichung, und die Ergebnisse sind angegeben als Verlängerung der Blutungszeit (siehe Tabelle 1). Tabelle 1 Blutungszeit für Heparine bei der Ratte
# Die angewandten Antikoagulansbestimmungen sind unter Bestimmung der Antikoagulansaktivität bei Tieren beschrieben.
## Die Blutungszeit (min) ist angegeben als Differenz der Blutungszeit 10 min nach und 10 min vor der Arzneimittelverabreichung.
Diese Verringerung der Blutungszeit bei den neuen Heparinderivaten ist sehr wichtig, da sie es ermöglicht, die neuen erfindungsgemäßen Produkte in höheren und wirksameren Dosen zu verabreichen als Standard-Heparin, ohne daß die Gefahr von Blutungen auftritt.

Untersuchung der antithrombotischen Wirkung bei Tieren

Die antithrombotische in vivo-Wirkung von Heparinderivat 1 wurde in einem Wessler Kaninchen-Thrombusmodell (Wessler et al., J. Appl. Physiol., 14, 1959, 943-946) untersucht. Die Kaninchen hatten vorher Atropin und Hypnorm erhalten und waren mit Pentobarbiton anästhesiert. Ein Teil jeder Jugularvenen wurde von umgebendem Gewebe befreit und die Venen abgebunden. Die Testverbindung wurde intravenös (Zeitpunkt 0) in Dosen von 1 und 3,5 mg/kg injiziert. 15 min nach der Arzneimittelverabreichung wurde das Koagulationssystem der Kaninchen aktiviert durch intravenöse Injektion von glasaktiviertern menschlichem Plasma. Genau 30 s nach dieser thrombotischen Belastung wurde ein 2 cm langes Segment der rechten Jugularvene 10 min verschlossen, um stagnierendes Blut zu erhalten. Das Segment wurde dann herausgeschnitten und der Gehalt in eine Petri-Schale gegossen und visuell untersucht und der Thrombus, soweit einer vorhanden war, nach einem unten angegebenen System bewertet. Nach weiteren 15 min (30 min nach Injektion der Testverbindung) erhielt das Kaninchen eine neue thrombotische Belastung und die linke Jugularvene wurde wie oben angegeben verschlossen und untersucht. Dieses Verfahren erlaubt die Untersuchung der antithrombotischen Wirkung von Heparinderivat 1 zu zwei Zeitpunkten (15 und 30 min nach der Verabreichung), und so ist es möglich, die Dauer der antithrombotischen Wirkung zu bestimmen. Das Heparinderivat 1 wurde in zwei Dosen bei mindestens 6 Kaninchen in jeder Gruppe bewertet. Die antithrombotische Aktivität der Testverbindung wurde bewertet nach einem Bewertungssystem, das wie folgt definiert ist:
Die antithrombotische Aktivität von Heparinderivat 1 wird beschrieben durch einen "antithrombogenen Index", der von 0 (stark antithrombotisch) bis 1 (nicht-antithrombotisch) reicht. Dieser Index wird erhalten durch Division der Summe der Thrombosebewertungen in jeder Dosisgruppe durch 4 x n, was die Bewertung ist, die erhalten wird mit einer nicht-antithrombotischen Bezugsverbindung (physiologisches NaCl). Die antithrombotische Aktivität von Heparinderivat 1, spezifische Anti-FXa-Aktivität: 8 IE/mg, wurde bei 3,5 und 1 mg/kg getestet unter Verwendung von mindestens drei Kaninchen in jeder Dosisgruppe. Die Ergebnisse, angegeben als antithrombotische Bewertung für jedes einzelne Kaninchen sowie als antithrombotischer Index für Gruppen von Kaninchen, die die gleiche Dosis erhielten, sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 Antithrombotische Aktivität bei Kaninchen, Heparinderivat 1
Dieses Experiment zeigt sehr deutlich die antithrombotische Aktivität des beanspruchten neuen Heparinderivats in einer Dosis, bei der die Blutungszeit nicht verlängert ist (Tabelle 1).

Antiproliferative Wirkung auf glatte Muskelzellen

Die neuen erfindungsgemäßen Heparine zeigten eine antiproliferative Wirkung auf das Wachstum von glatten arteriellen Muskelzellen bei Ratten, die in einer Zellkultur gewachsen waren. Eine Hemmung von 50 % der Zellproliferation wurde erzielt bei einer Konzentration von 50 µg/ml in dem Zellkulturmedium. Das ist die gleiche Konzentration die erforderlich ist, wenn klinisch verwendetes Standard-Heparin verwendet wurde.

Verstärkung der Koronarkollateralentwicklung

Die Verstärkung der Koronarkollateralentwicklung durch die neuen Heparine nach der Erfindung wurde untersucht nach dem Verfahren, das beschrieben ist von Fujita et al., (1987), Japanese Circulation Journal, 51, 395-402). In dieser Arbeit wird gezeigt, daß das Vorhandensein von schwerer Myokardischämie, von der bekannt ist, daß sie die Kollateralisierung begunstigt, Heparin die Entwicklung von Koronarkollateralen beschleunigt. Die Dosis an Heparin in dem Versuch dieser Veröffentlichung wurde bestimmt durch seine Fähigkeit, eine Antikoagulansaktivität im Plasma von Hunden aufrechtzuerhalten, die als doppelte Lee-White-Gerinnungszeit gemessen wurde. Die Wirkung von Standard-Heparin, dem Heparinderivat 1, einem nieder-molekularen Heparin (Heparinfragment) mit Molekulargewicht 4800 und einer Kontrolle ohne Behandlung auf die Verstärkung der Koronarkollateralen ist in Fig. 6 gezeigt. Nur in Gegenwart von Heparinderivat 1 oder Heparin konnte die Verstärkung der Koronarkollateralentwicklung als statistisch signifikante (p (0,05) Abnahme der Anzahl der erforderlichen Okklusionen gezeigt werden. Wenn das neue Heparinderivat 1 nach der Erfindung einmal täglich durch subkutane Verabreichung in einer Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht wurde, zeigte sich der gleiche Grad der Verstärkung der Koronarkollateralentwicklung wie bei der Dosis an Standard-Heparin, die von Fujita et al, (1987) angewandt wurde (siehe Fig. 6).

Verlängerung der Lee-White-Gerinnungszeit

Eine statistisch signifikante Abnahme der Verlängerung der Lee-White-Gerinnungszeit wurde für das neue Heparinderivat beobachtet, verglichen mit der vorher verwendeten Heparinkonzentration (siehe Fig. 7). (Der Lee-White-Gerinnungszeittest ist beschrieben in Clinical Interpretation of Laboratory Test, Herausgeber Godal, (1950), S.30).
Die Verlängerung der Lee-White-Gerinnungszeit (Zunahme der Gerinnungszeit %) im Blut von Hunden, die durch subkutane Injektion mit Standard-Heparin (3,6 mg/kg) oder Heparinderivat 1(10 mg/kg) behandelt wurden. Die Dosis von Heparinderivat 1 war dreimal größer (Gewicht) als von Heparin, aber die Verlängerung der Gerinnungszeit war trotzdem geringer.

Claims

1. Neue Heparinderivate von Rinder- oder Schweineheparin, hergestellt durch das Verfahren der Ansprüche 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie

- ein Molekulargewicht gleich oder größer als das Standardheparin aufweisen, das 9 000 für Standard-Rinderheparin und 12 000 für Standard-Schweineheparin beträgt,

- einen Schwefelgehalt zeigen, der gleich oder höher ist als derjenige des Ausgangsheparins oder mindestens 13 % (Gew./Gew.) beträgt,

- eine gerinnungshemmende Aktivität in dem Anti-FXa-Assay von weniger als 10 % des Standardheparins, aus dem sie hergestellt worden sind, aufweisen,

- ein Verhältnis von APTT-Aktivität gegenüber Anti-FXa- Aktivität von 3-35 zeigen,

- eine um mindestens 75 % verringerte Verlängerung der Blutungszeit, verglichen mit dem Standardheparin, aus dem sie hergestellt worden sind, zeigen, gemessen im Schwanz einer Ratte nach i.v.-Verabreichung,

- eine Erhöhung der Geschwindigkeit der Entwicklung von Koronarkollateralen bei Hunden zeigen, die gleich oder besser ist als bei klinisch angewandtem Heparin.

2. Verfahren zur Herstellung von neuen Rinderheparinderivaten nach Anspruch 1, umfassend die Behandlung von Standard-Rinderheparin durch

- Oxidation durch Periodat bei pH 4-5 und 0-10ºC in der Dunkelheit,

- partielle Depolymerisierung durch Alkali,

- Reduktion durch Natriumborhydrid,

- Fraktionieren des erhaltenen Produktes unter Anwendung von Gelpermeationschromatographie, Ultrafiltration, hydrophober Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Ausfällung aus einer wäßrigen Lösung durch Zugabe eines organischen Lösemittels, vorzugsweise von Ethanol,

- Sammeln des Produktes mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als demjenigen des Heparins, das als Ausgangsmaterial verwendet wurde, d.h. 9 000 für Standard- Rinderheparin.

3. Verfahren zur Herstellung von neuen Schweineheparinderivaten nach Anspruch 1, umfassend die Behandlung von Standard-Schweineheparin durch

- milde chemische Sulfatierung,

- Oxidation durch Periodat bei pH 4-5 und 0-10ºC in der Dunkelheit,

- partielle Depolymerisierung durch Alkali,

- Reduktion durch Natriumborhydrid,

- Sammeln des Produktes mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als demjenigen des Heparins, das als Ausgangsmaterial verwendet wurde, d.h. 12 000 für Standard-Schweineheparin.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, umfassend zusätzlich eine chemische Sulfatierung.

5. Verwendung eines Produktes nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ischämischen Herzerkrankungen und verwandten Gefäßerkrankungen.

6. Verwendung eines Produktes nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Erhöhung der Geschwindigkeit der Entwicklung von Koronarkollateralperfusion.