DE69216221T2

DE69216221T2 - Verbindungen mit guanidin-struktur und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69216221T2
Application number: DE69216221T
Authority: DE
Inventors: Herbert Koenig; Janine Koenig; Marie-Madeleine Portier; Pierre Potier; Catherine Cite Quirosa-Guillou; Dolor Renko; Monique Sensenbrenner; Claude Thal; Jean-Pierre Zanetta
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1991-11-22
Filing date: 1992-11-20
Publication date: 1997-05-28
Anticipated expiration: 2012-11-21
Also published as: ATE146780T1; DK0572635T3; FR2684103A1; JPH06505027A; CA2101058A1; EP0572635A4; WO1993010102A1; US5719187A; ES2098023T3; FR2684103B1; EP0572635B1; EP0572635A1; DE69216221D1; US5480884A

Description

CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen mit Guanidinstruktur, die das Wachstum, die Reparatur und die Regenerierung des Axons von Neuronen begünstigen und in der Lage sind, den Zustand von Patienten, die an Neuropathien und Myopathien erkrankt sind, zu bessern. Diese Verbindungen können ganz allgemein auf dem Gebiet der degenerativen Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden.
Ziel der Erfindung sind außerdem Herstellungsverfahren, die Zugang zu den genannten Verbindungen verschaffen, sowie die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten.
Nach Kenntnis der Anmelderin gibt es keine in der Humantherapie verfügbaren Verbindungen, welche die Regenerierung von peripheren Nerven bewirken und einen günstigen Einfluß auf Neuromuskulärerkrankungen haben können.
In "La Nouvelle Presse Médicale", Masson, 1982,16(11), 1193-1280, wurde bereits eine Verbindung, das Isaxonin oder 2-Isopropylamin-pyrimidin, beschrieben, das sehr vorteilhafte pharmakologische Eigenschaften aufweist; obgleich es unter der Bezeichnung Nerfactor auf den Markt gebracht wurde, mußte es wegen einer Hepatotoxizität wieder vom Markt genommen werden.
In der Zeitschrift "Therapie" (1968, XXIII, S.1221-1232) sind außerdem das Veratrylguanidin, das 3,4-Diethoxybenzylguanidin, das 3,4-n-Propoxybenzylguanidin und das Hemisulfat dieser Verbindungen als antihypertensive Agentien beschrieben worden.
Die Eigenschaften dieser Verbindungen in der Neurotherapie wurden nach Kenntnis der Anmelderin bisher jedoch nirgends beschrieben.
In der im Verhältnis zum Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung EP-A-526 877 ist eine Verbindung der Formel beschrieben:
Ziel der Erfindung war es daher, neue Verbindungen vorzuschlagen, die auf dem Gebiet der Regeneration der Nerven nützlich (verwendbar) sind und demzufolge günstige Effekte bei damit in Verbindung stehenden Erkrankungen wie der Myopathie haben sollen.
Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel
worin bedeuten:
R&sub1; einen Isopropylrest, einen Benzylrest, der gegebenenfalls substituiert ist durch einen oder mehrere (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxyreste, oder einen Rest
worin n für die Zahl 0,1 oder 2 und R&sub8; für einen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl- oder (C&sub7;- C&sub9;)-Aralkylrest stehen,
R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Pyrimidin-Ring der Formel (II) oder einen Pyrimidiniumring der Formel (IIa) bilden:
worin R&sub4; für einen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl-, (C&sub7;-C&sub9;)-Aralkyl-, Phenyl-Rest oder ein Wasserstoffatom; R&sub5; für einen Hydroxy-, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxy-, Aminorest und X für ein pharmakologisch akzeptables Kation stehen, oder
R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; Wasserstoffatome darstellen oder
R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Imidazol-Ring der Formel
oder einen 1,6-Dihydropyrimidin-Ring der Formel bilden:
worin R&sub6; eine der für R&sub5; angegebenen Bedeutungen hat, oder R&sub2; und R&sub3; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Ring der Formel:
worin R&sub7; für einen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxy- oder 1-Glyceryl-Rest steht, wobei im zuletzt genannten Fall R&sub1; ein Wasserstoffatom sein kann, und
die pharmazeutisch akzeptablen Salze dieser Verbindungen mit Ausnahme von Veratrylguanidin und dem Hemisulfat desselben und der Verbindungen der Formel (I), worin R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; Wasserstoffatome sind und R&sub1; einen Benzylrest darstellt, der in m-p-Stellung gleichzeitig durch zwei Ethoxy-Reste oder zwei n-Propoxy-Reste substituiert ist, und der Hemisulfate derselben und mit Ausnahme der Verbindung, in der R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; Wasserstoffatome sind und R&sub1; für -(CH&sub2;)&sub3;-CH(COOH)-NH-COOtBu steht.
Die Erfindung betrifft außerdem die pharmakologisch akzeptablen Salze dieser Verbindungen, insbesondere ihr Lactat, Fumarat, Hydrochlond, Maleat, Malat, Ketoglutarat, Glutarat, Phenoxyacetat, Sulfonat, Picrat, Tartrat und Methansulfonat.
Nach einer bevorzugten Variante der Erfindung ist R&sub1; ein Isopropyl oder Di- oder Tri-methoxybenzylrest oder der Rest:
Nach einer zweiten bevorzugten Variante der Erfindung allein oder in Kombination mit der vorgenannten Variante, steht R&sub4; für einen Methyl-, Ethyl-, n-Propyl- oder Benzylrest.
Gemäß einer dritten bevorzugten Variante betrifft die Erfindung das Lactat, Fumarat, Hydrochlond, Maleat, Malat, Ketoglutarat, Glutarat, Phenoxyacetat, Sulfonat, Picrat, Tartrat und Methansulfonat von Veratrylguanidin.
Die Erfindung betrifft außerdem Arzneimittel, die aus einer der erfindungsgemäßen Verbindungen, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, bestehen und pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens eines dieser Arzneimittel und einen akzeptablen Träger enthalten. Diese Arzneimittel und Zusammensetzungen sind nützlich (verwendbar) zur medizinischen Behandlung von bestimmten Störungen, die mit der Funktionsweise des Nervensystems in Zusammenhang stehen, bei Menschen oder Tieren.
Diese Arzneimittel und Zusammensetzungen können somit in vorteilhafter Weise bestimmt sein für die Mitverwendung bei einer wirksamen Therapie gegen degenerative Erkrankungen des peripheren Nervensystems und gegen Neuromuskulärerkrankungen, wie der Myopathie.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind insbesondere formuliert für die orale Aufnahme und für die Injektion. Dennoch können auch andere Arten der Verabreichung im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden.
Die Dosierung hängt z.T. von der zu behandelnden Erkrankung sowie von ihrer Schwere und auch vom Typ des Individuums (Gewicht, Alter) ab.
Bezüglich der bereits bekannten Verbindungen wie Veratrylguanidin oder des Hemisulfats desselben oder der Verbindungen der Formel I, worin R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; Wasserstoffatome und R&sub1; einen Benzylrest, der in m-p-Stellung gleichzeitig durch zwei Ethoxyreste oder zwei n-Propoxyreste substituiert ist, darstellen, und der Hemisulfate derselben betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels, das für die Behandlung von Neuropathien oder Myopathien verwendbar ist.
Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I), in der R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Pyrimidin-Ring der Formel (II) bilden, besteht darin, daß man ein saures Guanidinsalz (beispielsweise das Hydrogensulfat) der Formel
mit einem (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxycarbonylmalonaldehyd der Formel:
in Gegenwart eines Säureakzeptors (z.B. eines sekundären Amins wie Pyrrolidin) und gegebenenfalls einem protischen polaren Lösungsmittel wie Methanol in Kontakt bringt.
Die in der Nicht-Salzform erhaltenen Verbindungen werden anschließend durch Hydrolyse auf an sich bekannte Weise in eine Säure überführt und gegebenenfalls auf ebenfalls bekannte Weise (beispielsweise durch Umsetzung mit Aminochloromethylaluminium in ein Carboxamid umgewandelt.
Darüber hinaus kann die Alkylierung dieser Pyrimidine der Formel (II) in welcher Form sie auch vorliegen mögen (als Säure, Ester, Amid) bewirkt werden durch Einwirkenlassen eines Dialkylsulfats in einem aprotischen polaren Lösungsmittel, um sie in das gereinigte saure Sulfat zu überführen in Form des entsprechenden 1-Alkylpyrimidiniumhydroxids, das anschließend in ein anderes Salz (beispielsweise das Salz der Methansulfonsäure) überführt werden kann.
Das gebildete Hydroxid kann auch in ein 1,6-Dihydro-1-alkyl-pyrimidin der Formel (IV) umgewandelt werden durch Umsetzung mit einem Reduktionsmittel, insbesondere mit Natriumtetraborhydrid, gegebenenfalls in Gegenwart eines protischen polaren Lösungsmittels (insbesondere von Ethanol).
Ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I), in der R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Imidazol-Ring der Formel (III) bilden, besteht im wesentlichen darin, daß die entsprechenden 4,5-Dicarboxyimidazole durch Erwärmen, gegebenenfalls in Gegenwart eines polaren Lösungsmittels wie N,N- Dimethylacetamid, partiell decarboxyl iert werden.
Die 4,5-Dicarboxyimidazole werden erhalten durch Verseifen der entsprechenden 4,5-Dicyano-Verbindungen auf an sich bekannte Weise. Diese zuletzt genannten Verbindungen sind entweder Handeisprodukte oder auf an sich bekannte Weise erhältlich.
Ein Verfahren zur Herstellung besteht beispielsweise darin, das 2- Bromo-4,5-dicyanoimidazol in der 1-Position zu alkylieren durch Umsetzung mit einem Dialkylsulfonat. Diese zuletzt genannte Verbindung wird in der 2- Position substituiert durch ein Amin H&sub2;N-R&sub1;, dann mit einer starken Base (z.B. NaOH) behandelt und angesäuert (beispielsweise mit konzentrierter HCl).
Das als Ausgangsprodukt verwendete 2-Bromo-4,5-dicyanoimidazol wird auf an sich bekannte Weise erhalten durch Bromierung von 4,5- Dicyanoimidazol.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Imidazole, in denen R&sub4; ein Wasserstoffatom bedeutet (somit eine Tautomene vorliegt) besteht darin, eine Folge von Reaktionen nach dem folgenden Schema durchzuführen:
Ein Verfahren zur Herstellung der Guanidine der Formel (1a) oder ihrer pharmakologisch akzeptablen Salze besteht darin, einen S-Alkylthioharnstoff mit einem Alkylamin R&sub1;-NH&sub2; auf an sich bekannte Weise reagieren zu lassen.
Ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I), in der R&sub2; und R&sub3; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Ring der Formel (V) bilden, worin R&sub7; für einen (C&sub1;-C&sub4;)- Alkoxyrest steht, besteht darin, das Guanidin der entsprechenden Formel mit einem Dialkylketomalonat gegebenenfalls in einem polaren protischen Medium nach dem oben angegebenen Reaktionsschema reagieren zu lassen. Für den Fall, daß R&sub7; für den 1-Glyceryl-Rest steht, besteht ein Herstellungsverfahren darin, ein Guanidin der Formel (Ia) mit der oxidierten Form der Ascorbinsäure nach dem folgenden Reaktionsschema zu kondensieren:
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

1-Methyl-2-isopropylamino-5-methoxycarbonyl-1,6-dihydropyrimidin

Zu 10,5 g (32 mmol) 1-Methyl-2-isopropylamino-5-methoxycarbonylpyrimidinium-hydroxid in 180 ml wasserfreiem Ethanol gibt man in Portionen unter Argon bei -40ºC Natriumborhydrid (2,8 g; 73 mmol) zu. Die Mischung wird 1 h lang bei Umgebungstemperatur unter Argon gerührt. Nach dem Eindampfen des Ethanols wird das Reaktionsmedium mit Dichlormethan und Wasser extrahiert. Die organischen Phasen werden mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Reinigen des durch Eindampfen der organischen Phasen erhaltenen Öls an Silicagel (200 mb; Eluierungsmittel: MeOH 10 % / CH&sub2;Cl&sub2;) erhält man 7 g (Ausbeute: 100 %) des entsprechenden Dihydroesters, Schmelzpunkt: 83ºC.
Das 1-Methyl-2-isoproylamino-5-methoxycarbonylpyrimidinium-hydroxid wird auf die folgende Weise erhalten:
Eine Mischung von 27,45 g (0,140 mol) 2-Isopropylamino-5-methoxycarbonylpyrimidin und 56 ml (2 Äqivalente; 0,59 mol) Dimethylsulfat in 440 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wird 24 h lang unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsmedium wird mit Ethylacetat und Wasser extrahiert. Nach dem Reinigen des beim Eindampfen der wäßrigen Phasen erhaltenen Öls an Silicagel (Eluierungsmittel: CH&sub2;Cl&sub2; 95 % 1 MeOH 5 % 1 Sättigung mit NH&sub3;-Gas) erhält man 37,2 g 1-Methyl-2-isopropylamino-5-methoxycarbonyl-pyrimidiniumhydroxid (Ausbeute: 82 %).

Beispiel 2

2-Isopropylamino-5-methoxycarbonyl-pyrimidin

Eine Mischung von 11,62 g (77,5 mmol) Isopropylguanidinhydrogensulfat und 32 ml (5 Äquivalente; 0,37 mol) frisch destilliertem Pyrrolidin in 230 ml wasserfreiem Methanol wird 20 min lang zum Rückfluß erhitzt. Zu der obengenannten Lösung werden bei 0ºC eine methanolische Lösung (60 ml) von Methoxycarbonylmalonaldehyd (1 Äquivalent; 77,5 mmol; 10 g) sowie 140 g Molekularsiebe (4 Å) zugegeben. Das Reaktionsmedium wird 24 h lang unter Rückfluß und unter Argon gerührt. Die Molekularsiebe werden durch Filtrieren entfernt, dann mit Methanol gespült. Nach dem Eindampfen des Filtrats erhält man einen Rückstand, der in Ethylacetat aufgenommen und dann mit einer 1 N Chlorwasserstoffsäurelösung angesäuert wird. Die organischen Phasen werden mit einer an Natriumchlorid gesättigten Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet, eingedampft und an Silicagel unter 200 mbar (Eluierungsmittel: Ethylacetat 50/Heptan 50) gereinigt.
Gewicht: 11,27 g (Ausbeute: 75 %);
Schmelzpunkt 102ºC.

Beispiel 3

1-Methyl-2-isopropylamino-5-methoxvcarbonyl-pyrimidinium-sulfat

1,09 ml (16,78 mol; 1,61 g) Methansulfonsäure werden zu einer Lösung von 1 Methyl-2-isopropylamino-5-methoxycarbonyl-pyrimidinium-hydroxid (3,48 g; 15,35 mol), gelöst in 100 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran, zugegeben. Die Mischung wird 1 h lang bei Umgebungstemperatur unter Argon gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfutriert und dann mit Ether gespült.
Gewicht: 3,74 g (Ausbeute: 80 %),
Schmelzpunkt: 209ºC.

Beispiel 4

2-Isopropylamino-5-carbamoyl-pyrimidin

30,6 ml (61,2 mmol) einer 2N Lösung von Trimethyaluminium in Toluol werden langsam in eine Suspension von Ammoniumchlorid (61,2 mmol; 3,26 g) in 71 ml wasserfreiem Benzol bei 0ºC eingeführt. Nach Beendigung der Zugabe wird die Mischung 1 bis 2 h lang unter Argon gerührt, bis die Freisetzung von Methan beendet ist.
Zu 92 ml der obengenannten Lösung (6 Äquivalente Reagens) wird eine Lösung von 2-Isopropylamino-5-methoxycarbonyl-pyrimidin (0,102 mol; 2 g) in 40 ml wasserfreiem Benzol mit einem Rohr zugegeben. Nach 48-stündigem Rühren bei Umgebungstemperatur unter Stickstoff wird die Mischung mit 5 %iger Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, dann mit Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen werden eliminiert, die wäßrigen Phasen werden filtriert und eingedampft und nach der Reinigung an Silicagel (Eluierungsmittel: CH&sub2;Cl&sub2; 80 % / MeOH 20 % / 0,7 % NH&sub3; als 33 %ie wäßrige Lösung) erhält man das Amid in Form eines Pulvers in einer Ausbeute von 80 %.

Beispiel 5

2-Isopropylamino-5-carboxy-pyrimidin

6 ml einer 1 N Natriumhydroxid-Lösung werden zu einer Lösung von 2-Isopropylamino-5-methoxycarbonyl-pyrimidin (1 g; 5,12 mmol) in 33 ml Methanol zugegeben. Die Mischung wird 2 h lang zum Rückfluß (66ºC) erhitzt. Eine minimale Menge Wasser wird zugegeben, um den gebildeten Niederschlag aufzulösen; das Methanol wird unter vermindertem Druck eingedampft. Die zurückbleibende Lösung wird bei 0ºC mit 2N Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Der erhaltene Niederschlag wird filtriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet, wobei man 850 mg (92 %) Säure erhält.

Beispiel 6

1-Methyl-2-isopropylamino-5-carbamoyl-1,6-dihydropyrimidin

49,7 ml (99,5 mmol) einer 2N Lösung von Trimethylaluminium in Toluol werden langsam in eine Suspension von Ammoniumchlorid (99,5 mmol; 5,32 g) in 105 ml wasserfreiem Toluol bei 0ºC eingeführt. Nach Beendigung der Zugabe wird die Mischung 1 bis 2 h lang unter Argon gerührt bis zur Beendigung der Freisetzung von Methan.
Eine Lösung von 1-Methyl-2-isopropylamino-5-methoxycarbonyl-1,6- dihydropyrimidin (3,4 g; 0,16 mol) in 175 ml wasserfreiem Toluol wird mit einem Rohr zu 144 ml der 0,67 M Lösung von Aminochloromethylaluminium (6 Äquivalente Reagens) zugegeben. Nach 60-stündigem Rühren bei Umgebungstemperatur unter Argon wird die Mischung bei 0ºC mit 1 N Chlorwasserstoffsäure (350 ml) langsam neutralisiert, dann mit Ethylacetat extrahiert. Die wäßrigen Phasen werden eingedampft, mit an Ammoniak gesättigtem Ethanol und Siliciumdioxid (welches die Aluminiumsalze zurückhält) wieder aufgenommen; diese Mischung wird filtriert und dann eingedampft. Nach mehreren Schnell-Chromatographien an Silicagel (200 mbar; 5 30 % MeOH / CH&sub2;Cl&sub2;/NH&sub3;-Sättigung) des Filtrats erhält man 2,28 mg Amid in einer Ausbeute von 72 %, Schmelzpunkt:179-180ºC.

Beispiel 7

α-N-Boc-δ-N-(5-methoxycarbonyl-2-pyrimidinyl)-L-ornithin

Eine Mischung von 4 g (14,5 mmol) L-Arginin-α-N-Boc (im Handel erhältlich), 2,84 g (1,5 Äquivalente; 21,8 mol) Methoxycarbonylmalonaldehyd, 3,65 ml frisch destilliertem Pyrrolidin und 10 g aktivierten Molekularsieben 4 Å wird in 30 ml wasserfreiem Methanol 24 h lang unter Argon auf 50ºC erhitzt.
Nach der Eliminierung der Molekularsiebe durch Filtrieren und nach dem Eindampfen von Methanol wird das Reaktionsmedium mit Wasser und Dichlormethan extrahiert. Die wäßrigen Phasen werden eingedampft, dann an Siiicagel gereinigt (200 mbar; Eluierungsmittel: CH&sub2;Cl&sub2; 80 % / MeOH 20 % / NH&sub3; in Form einer 33 %igen wäßrigen Lösung, 0,7 ml auf 100 ml) gereinigt. Man erhält 4,21 g (Ausbeute: 80 %).

Beispiel 8

2-Veratrylamino-5-carboxypyrimidin

0,4 ml einer 1N Natriumhydroxid-Lösung werden zu einer methanolischen Lösung (1 ml) von 2-Veratrylamino-5-methoxycarbonyl-pyrimidin (100 ml; 3,3 mmol) zugegeben. Die Mischung wird 2 h lang zum Rückfluß erhitzt. Das Methanol wird unter vermindertem Druck eingedampft. Die zurückbleibende Lösung wird mit 2N Chlorwasserstoffsäure angesäuert; der gebildete Niedersch lag wird abfutriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet (Ausbeute: 90 %).

Beispiel 9

2-Veratrylamino-5-methoxycarbonyl-pyrimidin

Eine Mischung von 21,92 g (0,1 mmol) Veratrylguanidin, das nach "Thérapie" (loc.cit.) hergestellt worden ist, 41,7 ml (0,5 mol) frisch destilliertem Pyrrolidin, 15 g Methoxycarbonylmalonaldehyd, 180 g Molekularsieben (4 Å) in 300 ml wasserfreiem Methanol wird 24 h lang unter Argon zum Rückfluß erhitzt. Die Molekularsiebe werden durch Filtrieren eliminiert, dann mit Methanol und Chloroform gespült. Nach dem Eindampfen des Filtrats erhält man einen Rückstand, der in Ethylacetat wieder aufgenommen, dann mit einer 1 N Chlorwasserstoffsäure-Lösung angesäuert wird. Die organischen Phasen werden mit einer an Natriumchlorid gesättigten Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, eingedampft und an Silicagel gereinigt (Eluierungsmittel: Ethylace tat Solheptan 50) (Ausbeute: 40 %).

Beispiel 10

1-Methyl-2-veratrylamino-5-methoxycarbonyl-1,6-dihdropyrimidin

0,170 g (3 Äquivalente) Natriumborhydrid werden zu 0,400 g 1-Methyl- 2-veratrylamino-5-methoxycarbonyl-pyrimidiniumhydroxid, gelöst in 50 ml Ethanol, zugegeben. Die Mischung wird 3 h lang unter Argon bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen des Ethanols wird das Medium mit Dichlormethan und Wasser extrahiert. Die organischen Phasen werden mit einer an Natriumchlorid gesättigten Lösung gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet. Das beim Eindampfen der organischen Phasen erhaltene Öl wird an Silicagel unter mittlerem Druck gereinigt (Eluierungsmittel: MeOH 15 % / CH&sub2;Cl&sub2;) und man erhält 467 mg (Ausbeute: 98 %) des entsprechenden Dihydro-1,6-pyrimidins.

Beispiel 11

1-Methyl-2-veratrylamino-5-methoxycarbonyl-pyrimidinium-hydroxid

Eine Mischung von 2,62 g (8,6 mmol) 2-Veratrylamino-5-methoxycarbonyl-pyrimidin und 3,28 ml (4 Äquivalenten) Dimethylsulfat in 60 ml wasserfreiem THF wird 48 h lang zum Rückfluß erhitzt. Das Medium wird mit Ethylacetat und Wasser extrahiert. Nach der Reinigung des beim Eindampfen der wäßrigen Phasen erhaltenen Öls an Silicagel (Eluierungsmittel: MeOH 3 % / CH&sub2;Cl&sub2; / NH&sub3; in Form einer 33 %igen wäßrigen Lösung 5,5 mil/100) erhält man 2,2 g Salz (Ausbeute: 76 %).

Beispiel 12

1-Methyl-2-veratrylamino-5-methoxycarbonyl-pyrimidinium-sulfat

Zu 400 mg 1-Methyl-2-veratrylamino-5-methoxycarbonylpyrimidinium hydroxid, gelöst in 15 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran, gibt man 85 µl (1,1 Äquivalente; 1,31 mmol) Methansulfonsäure zu. Die Mischung wird 1 h lang bei Umgebungstemperatur unter Argon gerührt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Tetrahydrofuran und mit Ether gespült und dann getrocknet (Gewicht: 490 mg - Ausbeute: 96 %).

Beispiel 13

Veratrylguanidin-methansulfonat

In eine Suspension von Veratrylguanidin (25 g; 0,119 mol) in 240 ml Methanol führt man Methansulfonsäure (7,8 ml; 0,120 mol) ein. Die Mischung wird 1 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Methanol wird unter Vakuum eingedampft, das erhaltene Öl wird durch 15-minütiges Rühren in Tetrahydrofuran ausgefällt. Der weiße Feststoff wird abfiltriert, mit Tetrahydrofuran und Ether gewaschen und dann unter Vakuum getrocknet. Man erhält 30 g Veratrylguanidin-methansulfonat in einer Ausbeute von 82 %.

Beispiel 14

1-Methyl-2-isopropylamino-4-carboxy-imidazol

Eine Mischung von 1-Methyl-2-isopropylamino-4,5-dicarboxy-imidazol (910 mg; 4 mmol) und 20 ml N,N-Dimethylacetamid wird 3 h lang unter Argon auf 180ºC erwärmt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck eingedampft; der Rückstand wird in einer minimalen Menge Ethanol wieder aufgenommen und mit Tetrahydrofuran ausgefällt. Die Mutterlaugen werden bis zur Ausfällung eingeengt. Man erhält das 1-Methyl-2-isopropylamino-4-carboxyimidazol in einer Ausbeute von 88 % (m = 650 mg), Schmelzpunkt:247ºC.

Beispiel 15

1-Methyl-2-isopropylamino-4-methoxycarbonyl-imidazol

400 mg 1-Methyl-2-isopropylamino-4-carboxy-imidazol werden in 25 ml wasserfreiem Methanol solubilisiert. Die Lösung wird auf 0ºC abgekühlt, an Chlorwasserstoffsäure gesättigt, dann 12 h lang zum Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die überschüssige Säure mit einem Argonstrom verjagt. Das Medium wird durch Zugabe von Natriumcarbonat neutralisiert und eingedampft. Der Rückstand wird in Wasser wieder aufgenommen und mit Dichlormethan extrahiert. Aus den über Natriumsulfat getrockneten organischen Phasen erhält man nach dem Eindampfen einen Rückstand, der mit Ether gewaschen und dann unter Vakuum getrocknet wird.
m = 384 mg; Ausbeute: 89 %;
Schmelzpunkt: 198ºC.

Beispiel 16

2-Isopropylamino-4-oxo-5-ethoxyvcarbonyl-5-hydroxy-Δ&sub2;-imidazolin

5,72 g (0,0191 mol) Isopropylguanidinhydrogensulfat werden mit einer methanolischen Lösung (20 ml) von Natriumhydroxid (0,038 mol; 1,53 g) bei Umgebungstemperatur unter Argon 1 h lang entsalzt. Der resultierende Niederschlag wird abfiltriert; das Filtrat wird eingedampft. Das Isopropylguanidin wird in Ethanol wieder aufgenommen und erneut filtriert. Das ethanolische Filtrat wird eingeengt.
3,85 g (0,0382 mol) Isopropylguanidin und 10 g Diethylketomalonat in 150 ml Ethanol werden 10 h lang auf 50ºC erwärmt. Nach dem Eindampfen von Ethanol erhält man einen Rückstand, der durch Schnellchromatographie an Silicagel 60 (Eluierungsmittel: MeOH 15 %/CH&sub2;Cl&sub2;) gereinigt wird (m = 7 g; Ausbeute: 80 %). Die Verbindung liegt in zwei Formen A und B vor, die miteinander im Gleichgewicht stehen.

Beispiel 17

2-Amino-4-(2',3',4'-trihydroxybutanoyl)4-hydroxy-5-oxo-imidazolin

Eine Mischung von L-Ascorbinsäure (0,314 mol; 55,4 g) und p- Benzochinon in 470 ml Ethanol wird im Dunkeln unter Argon 90 min lang gerührt; dann wird eine ethanolische Lösung (100 ml) von Guanidin (0,157 mol) (das vorher mit Natriumhydroxid in Ethanol) entsalzt worden ist) zugegeben. Das Medium wird 6 h lang unter Argon und bei Umgebungstemperatur im Dunkeln gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, mit Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet (m = 30 g; Ausbeute = 100 %).
Nach einem bekannten Verfahren wurden auch erhalten das Isopropylguanidin (Beispiel 18), das Isaxonin (Beispiel 19) und das lsopropylguanidinchlorid (Beispiel 20).

Biologische Versuche

A - Einfluß auf das Neuriten-Wachstum von Rückenmarks-Ganglien Versuchsmethode

Man kultiviert Ganglien, die aus neugeborenen Ratten entnommen worden sind, in Platten mit 96 Vertiefungen mit ebenem Boden in einem DMEM (Gibco)-Medium, dem 5 % fötales Kalbsserum (FCS) und 10 mM Ara-C (Cytosin-β-D-arabinofuranosid) zugesetzt worden sind.
Nach einem Tag gibt man die zu untersuchenden verschiedenen Verbindungen und Vergleichslösungen zu.
2 Tage danach stoppt man die Kultivierung und man photographiert Explantate bei geringer Vergrößerung mit dem Phasenkontrast-Mikroskop oder mit dem klassischen Mikroskop nach dem Anfärben mit Toluidinblau und nach dem Fixieren mit Aldehydgemischen. Bei den Bewertungen sind berücksichtigt der mittlere Verlängerungsdurchmesser von Neuriten-Bündeln, ihre Verzweigungen, ihre Assoziation mit Gliazellen und die abgestorbenen Zellen.

Getestete Verbindungen:

Die Verbindungen 1 bis 7,13,17 und 19 wurden in drei unterschiedlichen Konzentrationen getestet:10&supmin;&sup5;, 10&supmin;&sup6; und 10&supmin;&sup7;M in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 Ul/ml NGF (angelsächsische Abkürzung zur Bezeichnung des Nervenwachstumsfaktors). Die Versuche in Gegenwart von NGF hatten als Ziel, einerseits den Vergleich mit den getesteten Produkten, andererseits die Beobachtung einer eventuellen Modifizierung des NGF-Effekts (Absterben einer Zelle, Initiierung von Neuritenverzweigungen).
Ohne einen anderen Zusatz als PBS, das verwendet wird, um die verschiedenen Verbindungen zu solubilisieren, stellt man das Auftreten von seltenen kurzen Verlängerungen und einer beträchtlichen Anzahl von abgestorbenen Zellen fest. In Gegenwart des Vergleichs-NGF stellt man zahlreiche feine Verlängerungen und wenig verzweigte Verlängerungen fest.
Der Einfluß der verschiedlenen Produkte wird bewertet durch Vergleich mit dem Referenz-Vergleich: Produkte allein, verglichen mit PBS einerseits, Produkt-NGF, verglichen mit NGF andererseits. Darüber hinaus wird der positive Effekt eines allein verwendeten Produkts mit demjenigen von NGF verglichen.
Die Verbindung des Beispiels 3 in Gegenwart von NGF ruft eine starke Modifizierung der Neuriten hervor; diese sind länger und vor allem weisen sie eine beträchtliche baumartige Verzweigung auf mit zahlreichen Zellen, die sich auf den Verlängerungen angesammelt haben. Die Verbindung des Beispiels 13 in Gegenwart von NGF ruft eine Verlängerung der Neuriten hervor (etwa das Doppelte der Kulturen in Gegenwart nur von NGF). Es tritt auch ein Effekt auf, der die Vernetzung der Neuriten begünstigt (weniger zahlreiche Neuriten mit größerem Durchmesser).
Die Verbindungen 3 und 13, die allein verwendet werden, verstärken das Neuritenwachstum im Vergleich zu dem Vergleichs-PBS. Das morphologische Aussehen der Verlängerungen ist identisch mit demjenigen von NGF und die Wirksamkeit scheint ähnlich derjenigen dieses Wachstumsfaktors zu sein. Die Verbindung des Beispiels 5, die nur in einer geringen Konzentration oder in Gegenwart von NGF (10&supmin;&sup7; M) verwendet wird, ergibt einen positiven Effekt mit einer Erhöhung der Anzahl der Verlängerungen.
Die Verbindungen der Beispiele 7 und 20 weisen einen positiven Effekt auf sowohl einzeln als auch in Synergie mit NGF und dieser ist charakterisiert durch eine Vergrößerung der Länge der Neuriten.
Mit den Beispielen 2, 6 und 19 stellt man das Auftreten einer viel größeren Anzahl von Verlängerungen ohne Zunahme ihrer Länge fest.

B - Einfluß auf die Neuronen und die Gliazellen eines Hühnchens und einer Ratte in einer Primärkultur

Die Verbindungen der Beispiele 13 und 19 wurden getestet in bezug auf das Überleben und das Wachstum der Neuriten von Neuronen des Zentralnervensystems und des peripheren Nervensystems in einer Primärkultur sowie auf die Proliferation und die morphologische Modifizierung von Astrozyten.

Versuchsmethode

1. Gehirn-Neuronen eines 14 Tage alten Rattenembryos

Die Neuronen wurden den Gehirn-Hemisphären entnommen und in Petri-Schalen in Gegenwart eines Nährmediums ohne ein chemisch definiertes Serum auf Polylysin kultiviert.

2. Neuronen von Rückenmarks- und Ziliarganglien eines 8 Tage alten Hühnchenembryos

Die entnommenen Neuronen wurden in einem Nährmedium, das 20 % fötales Kalbsserum enthielt, auf Polyomithin kultiviert.

3. Astrocyten des Gehirns einer neugeborenen Ratte

Die entnommenen Zellen wurden direkt auf der Kunststoffoberfläche der Petri-Schale in einem definierten Medium kultiviert.
Die Verbindungen 13 und 19 werden in Konzentrationen von 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup8; M bei Beginn der Kultivierung und bei jeder Änderung des Mediums zugegeben.
Auf den isolierten Neuronen in der Reinkultur stimuliert die Verbindung 19 das Neuriten-Wachstum der Neuronen des Zentralnervensystems und die Verbindung 13 begünstigt das Überleben und das Neuriten-Wachstum der Neuronen der Rückenmarksganglien (peripheres Nervensystem). Darüber hinaus hat die Verbindung 13 keine toxische Wirkung auf die Träger-Zellen (Astrozyten). Diese Verbindungen, welche das Überleben der Neuronen und das Neuriten-Wachstum steuern können, stellen einen therapeutischen Weg auf dem Gebiet der Neuropathien und Myopathien dar.

C - Neurotropher Effekt in der Neuromuskel-Achse

Die Verbindungen 1, 3 und 13 wurden in vivo getestet in bezug auf die Regenerierung der Axonen und ihre Remyelinisierung bei der Trembler-Maus, dem tierischen Modell der Neuropathie nach Charcot-Marie-Tooth beim Menschen.
Die Verbindungen 1 in subkutaner Injektion (100 mg/kg) und 13 bei intraperitonealer Injektion (50 mg/kg) fördern das axonale "Sprießen" zwischen den Nerven (+25 % und +20 %) und sie beschleunigen die Demyelinisierung, welche die Trembler-Mutation charakterisiert (-25 %).
Die Verbindung 3 fördert ebenfalls die Demyelinisierung. Nach 40-tägiger tägl icher Injektion sind nur 22 % der Nervenfasern myelinisiert anstatt 32 % bei den Vergleichsprodukten.
Die Verbindungen 1, 3, 7 und 13 wurden in vitro in einer Konzentration von 10&supmin;³ M, 10&supmin;&sup5; M und 10&supmin;&sup7; M in den folgenden Kulturen untersucht:
1) Rückenmarkszellen von Rattenembryonen mit einem Alter von 14 Tagen;
2) Myoblasten von normalen Mäusen und Mdx-Mäusen, dem nächsten Tiermodell der Myopathie nach Duchenne beim Menschen;
3) Cokulturen von Myoblasten (von 19 Tage alten Ratten-Embryonen) und Neuronen (von 14 Tagen alten Ratten-Embryonen) und
4) 3T3-Zelien der Fibroblast-Linie.
Die Verbindungen 1, 3 und 13 fördern die Bildung von Zellenansammlungen, die Emergenz und das Wachstum der Neuriten. Die Verbindung 13 ist die aktivste der genannten drei.
In den Neutronenmuskel-Cokulturen fördern die Verbindungen 3 und 13 das Neuritenwachstum und ihre Verzweigung.
In den Cokulturen werden die neuromuskulären Verbindungen (Synapsen) durch die Colokalisation von Acetylcholinesterase und Acetylcho- Im-Rezeptoren nachgewiesen.
Die Verbindung 7 erhöht die Anzahl der Synapsen bei 10&supmin;³ M um 60 %.
Die Zunahme der Anzahl der unter dem Einfluß der Verbindung 7 gebildeten Synapsen ist dosisabhängig.

Claims

1. Verbindungen der Formel

in der bedeuten:

R&sub1; einen Isopropylrest, einen Benzylrest, der gegebenenfalls substituiert ist durch einen oder mehrere (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxyreste, oder einen Rest

worin n für die Zahl 0,1 oder 2 und R&sub8; für einen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl- oder (C&sub7;- C&sub9;)-Aralkylrest stehen, und

R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Pyrimidin-Ring der Formel (II) oder einen Pyrimidiniumring der Formel (IIa) bilden:

worin R&sub4; für einen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl-, (C&sub7;-C&sub9;)-Aralkyl-, Phenyl-Rest oder ein Wasserstoffatom, und R&sub5; für einen Hydroxy-, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxy-, oder Aminorest und X für ein pharmakologisch akzeptables Kation stehen oder worin R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; Wasserstoffatome darstellen oder R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an welches die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Imidazol-Ring der Formel

oder einen 1,6-Dihydropyrimidin-Ring der Formel:

bilden, worin R&sub6; eine der für R&sub5; angegebenen Bedeutungen hat, oder

worin R&sub2; und R&sub3; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Ring der Formel bilden:

worin R&sub7; einen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxy- oder 1-Glyceryl-Rest darstellt, wobei im

zuletzt genannten Fall R&sub1; einem Wasserstoffatom entsprechen kann, und die pharmazeutisch akzeptablen Salze dieser Verbindungen mit Ausnahme von Veratrylguanidin und des Hemisulfats desselben und der Verbindungen der Formel (I), worin R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; Wasserstoffatome darstellen und R&sub1; ein Benzylrest ist, der in m- und p-Stellung gleichzeitig durch zwei Ethoxy- oder zwei n-Propoxy-Reste substituiert ist, und der Hemisulfate derselben und mit Ausnahme der Verbindung der Formel (I), worin R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; für ein Wasserstoffatom und R&sub1; für -(CH&sub2;)&sub3;-CH(COOH)-NH-COOtBu stehen.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R&sub1; einen Isopropylrest oder einen Di- oder Trimethoxybenzylrest oder den Rest bedeutet

3. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R&sub4; ein Methyl-, Ethyl-, n-Propyl- oder Benzylrest ist.

4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Formel entsprechen

sowie die pharmazeutisch akzeptablen Salze dieser Verbindungen.

5. Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um 1-Methyi-2-isopropylamino-4-carboxy-imidazol handelt.

6. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt werden aus dem Lactat, Fumarat, Hydrochlorid, Maleat, Malat, Ketoglutarat, Glutarat, Phenoxyacetat, Sulfonat, Picrat, Tartrat und Methansulfonat von Veratrylguanidin.

7. Verbindungen der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und Verbindung der Formel (I), worin R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; Wasserstoffatome und R&sub1; -(CH&sub2;)&sub3;-CH(COOH)-NH-COOtBu darstellen, zur Verwendung als therapeutisch aktive Substanz.

8. Verbindungen der Formel (I) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie für die Behandlung von Neuropathien oder Myopathien angewendet werden.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine Verbindung nach Anspruch 7 oder 8 und einen pharmakologisch akzeptablen inerten Träger enthält.

10. Verwendung von Veratrylguanidin oder des Hemisulfats desselben oder der Verbindungen der Formel (I), worin R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; Wasserstoffatome und R&sub1; einen Benzylrest, der in m- und p-Stellung gleichzeitig durch zwei Ethoxyoder 2 n-Propoxyreste substituiert ist, darstellen, und der Hemisulfate derselben zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Neuropathien oder Myopathien.

11. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in der R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Pyrimidinring der Formel (II) bilden,

das darin besteht, daß man ein Guanidinsäuresalz der Formel

mit einem (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxycarbonylmalonaldehyd der Formel

worin R für einen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkylrest steht,

in Gegenwart eines Säureakzeptors und gegebenenfalls in Gegenwart eines protischen polaren Lösungsmittels in Kontakt bringt, wobei die erhaltenen Verbindungen gegebenenfalls hydrolysiert und gegebenenfalls in ein Carboxamid und/oder gegebenenfalls in ein 1-Alkylpyrimidinium-hydroxid der Formel (IIa) umgewandelt werden können durch Einwirkenlassen eines Dialkylsulfats, und die anschließend in ein anderes Salz überführt werden können.

12. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in der R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen 1,6-Dihydropyrimidin- Ring der Formel (IV) bilden,

das für den Fall, daß R&sub4; einen Alkylrest darstelt, darin besteht, daß man das Pyrimidiniumhydroxid der Formel:

mit einem Reduktionsmittel wie Natriumtetraborhydrid in Kontakt bringt.

13. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) nach Anspruch 1, in der R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Imidazolring der Formel (III) bilden, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen darin besteht, die den Verbindungen der Formel (III) entsprechenden 4,5-Dicarboxyimidazole durch Erwärmen, gegebenenfalls in Gegenwart eines polaren Lösungsmittels, partiell zu decarboxylieren.

14. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) nach Anspruch 1, in der R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; gemeinsam zusammen mit den Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, und dem Kohlenstoffatom, an das die genannten Stickstoffatome gebunden sind, einen Imidazolring der Formel (III) bilden, worin R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen darin besteht, daß man eine Verbindung der folgenden Formel dehydratisiert: