DE69130323T2

DE69130323T2 - Entzündungshemmender faktor, verfahren zur isolation und verwendung

Info

Publication number: DE69130323T2
Application number: DE69130323T
Authority: DE
Inventors: Lee R. Lebanon Oh 45036 Beck
Original assignee: Stolle Milk Biologics Inc
Current assignee: Stolle Milk Biologics Inc
Priority date: 1990-09-11
Filing date: 1991-06-12
Publication date: 1999-05-20
Anticipated expiration: 2011-06-13
Also published as: WO1992004035A1; EP0548123A4; NZ250386A; DE69130323D1; NZ238751A; AU8434091A; EP0548123B1; CA2090011C; DK0548123T3; CA2090011A1; EP0548123A1; IL98647A; IE912109A1; US5242691A; ATE171875T1; ES2124229T3; IL98647A0; JPH08502718A; AU660626B2

Description

Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-part-Anmeldung von U. S. Patent Nr. 4.956,349, eingereicht am 4. April 1988, das eine Continuation-in-part-Anmeldung von U. S. Patent Nr. 4.897.265, eingereicht am 9. Jänner 1987, ist, das eine Continuation-in-part-Anmeldung von U. S. Serial Nr. 384.625, eingereicht am 3. Juni 1982 und nun fallengelassen, ist und eine Ausscheidung aus U. S. Patent Nr. 4.636.384, eingereicht am 27. Oktober 1983, und aus U. S. Serial Nr. 910.297, eingereicht am 17. September 1986, ist, das eine File Wrapper-Continuation-Anmeldung von U. S. Serial Nr. 576.001, eingereicht am 1. Februar 1983 und nun fallengelassen, ist, die alle hierin vollständig durch Bezugnahme einbezogen werden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen entzündungshemmenden Faktor, ein Verfahren zu dessen Herstellung in im wesentlichen reiner Form und ein Verfahren zu dessen Verwendung in der Behandlung einer Entzündung.

Beschreibung des Standes der Technik

Eine Entzündung ist laut Defnition im Medical Dictionary von Dorland "a localized protective response elicited by injury or destruction of tissues which serves to destroy, dilute or wall off both the injurious agent and the injured tissue" (eine örtliche Abwehrreaktion, die durch Verletzung oder Zerstörung von Gewebe hervorgerufen wird und sowohl das schädliche Agens als auch das verletzte Gewebe zerstören, verdünnen oder abtrennen soll). Sie ist gekennzeichnet durch eine Durchlöcherung des Mikrogefäßsystems, Durchsickern der Blutelemente in die Interstitialräume und die Migration von Leukozyten in das entzündete Gewebe. Auf makroskopischer Ebene ist dies für gewöhnlich von den vertrauten klinischen Symptomen wie Rötung, Ödem, Empfindlichkeit (Hyperalgesie) und Schmerz begleitet. Während dieser komplexen Reaktion werden chemische Vermittler wie Histamin, 5-Hydroxytryptamin, verschiedene chemotaktische Faktoren, Bradykinin, Leukotriene und Prostaglandine örtlich freigesetzt. Phagozytische Zellen wandern in den Bereich und zelluläre lysosomale Membrane können aufgebrochen werden und lytische Enzyme freisetzen. Alle diese Vorgänge können zu der entzündlichen Reaktion beitragen.
Die Entzündung bei Patienten mit rheumatoider Arthritis umfaßt wahrscheinlich die Kombination eines Antigens (Gammaglobulin) mit einem Antikörper (rheumatoider Faktor) und Komplement, wodurch die örtliche Freisetzung chemotaktischer Faktoren hervorgerufen wird, welche Leukozyten anziehen. Die Leukozyten phagozytieren die Komplexe von Antigen-Antikörper und Komplement und setzen auch die vielen Enzyme frei, die in ihren Lysosomen enthalten sind. Diese lysosomalen Enzyme verursachen dann eine Verletzung an Knorpeln und anderen Geweben, und dies erhöht das Ausmaß der Entzündung. Es können auch zellvermittelte Immunreaktionen beteiligt sein. Auch Prostaglandine werden während dieses Prozesses freigesetzt.
Prostaglandine, die wahrscheinlich bei einer Entzündung erzeugt werden, führen zu Rötungen und erhöhen die örtliche Durchblutung. Zwei wichtige Gefäßwirkungen von Prostaglandinen werden im allgemeinen von anderen Entzündungsvermittlern nicht geteilt - eine langanhaltende gefäßerweiternde Wirkung und eine Fähigkeit, den gefäßverengenden Wirkungen von Substanzen wie Norepinephrin und Angiotensin entgegenzuwirken.
Eine Reihe von Entzündungsvermittlern erhöht die Gefäßdurchlässigkeit (das Durchsickern) in den postkapillaren und Sammelvenülen. Zusätzlich ist die Migration von Leukozyten in einen entzündeten Bereich ein wesentlicher Aspekt des Entzündungsvorganges.
Die Arthus-Reaktion ist eine entzündliche Reaktion, die durch die Bildung von Immunkomplexen an subkutanen Stellen hervorgerufen wird, wo ein Antigen mit einem Antikörper zu diesem Antigen einen Komplex bildet. Neutrophile heften sich charakteristisch an den Fc-Teil des Immunglobulinkomplexes, der sich an der subkutanen Injektionsstelle bildet, wo sie Verdauungsenzyme freisetzen, die eine sichtbare akute Entzündung verursachen. Somit ist die Reaktion vorwiegend neutrophilvermittelt, und Mittel, welche die Entwicklung der Reaktion bewirken, tun dies über eine Wirkung auf diese Zellen.
Es gibt mehrere Wege, über die ein Mittel die Neutrophilenmigration von den Blutgefäßen zu einer Entzündungsstelle stören könnte. Ein wahrscheinlicher Weg ist die Hemmung der Entzündungsrandbildung, des reversiblen "Anheftens" von Entzündungszellen an die Endothelzellauskleidung der Blutgefäßwand. Im normalen Zustand werden etwa 50% Neutrophile reversibel angeheftet, aber während einer akuten entzündlichen Reaktion wird die Adhäsion viel stärker und ist ein kritischer Schritt in dem Prozeß der Neutrophilenmigration. Während es unwahrscheinlich ist, daß Prostaglandine direkt an der chemotaktischen Reaktion beteiligt sind, ist ein anderes Produkt des Stoffwechsels der Arachidonsäure, Leukotrien, eine sehr starke chemotaktische Substanz.
Die entzündungshemmende Reaktion ist jede Reaktion, die durch eine Entzündung wie oben definiert charakterisiert ist. Es ist den Fachleuten in der Medizin allgemein bekannt, daß die entzündliche Reaktion viel zu dem körperlichen Unwohlsein wie Schmerz und Funktionsverlust beiträgt, das mit verschiedenen Erkrankungen und Verletzungen in Zusammenhang gebracht wird. Daher ist es eine allgemein übliche medizinische Praxis, pharmakologische Mittel zu verabreichen, die eine Neutralisierung der entzündlichen Reaktion bewirken. Mittel mit diesen Eigenschaften werden als entzündungshemmende Arzneimittel klassifiziert.
Entzündungshemmende Arzneimittel werden zur Behandlung eines breiten Spektrums von Störungen verwendet, und dieselben Arzneimittel werden häufig zur Behandlung verschiedener Erkrankungen verwendet. Die Behandlung mit entzündungshemmenden Arzneimitteln ist nicht auf die Krankheit, sondern häufig auf das Symptom, d. h., die Entzündung ausgerichtet.
Die entzündungshemmenden, schmerzlindernden und fiebersenkenden Arzneimittel sind eine heterogene Gruppe von Verbindungen, die oft chemisch nicht verwandt sind, aber dennoch bestimmte therapeutische Wirkungen und Nebenwirkungen gemeinsam haben. Corticosteroide steilen die am häufigsten verwendete Klasse von Verbindungen zur Behandlung der entzündungshemmenden Reaktion dar. Proteolytische Enzyme stellen eine weitere Klasse von Verbindungen dar, die entzündungshemmende Wirkungen haben soll. Hormone, welche die Nebennierenrinde direkt oder indirekt veranlassen, Steroide zu erzeugen und auszuscheiden, stellen eine weitere Klasse von entzündungshemmenden Verbindungen dar. Es wurde eine Reihe von nichthormonellen, entzündungshemmenden Mitteln beschrieben. Von diesen sind die am häufigsten verwendeten die Salicylate. Acetylsalicylsäure oder Aspirin ist das am häufigsten verschriebene schmerzlindernde, fiebersenkende und entzündungshemmende Mittel. Beispiel für steroidale und nichtsteroidale, entzündungshemmende Mittel sind in Physician's Desk Reference, 1987 (siehe Index für solche Zubereitungen, S. 207 und 208), aufgelistet.
Die natürlichen und synthetischen Corticosteroidzubereitungen rufen eine Reihe schwerer Nebenwirkungen hervor, einschließlich einer Blutdruckerhöhung, Salz- und Wasserretention und einer erhöhten Kalium- und Kalziumausscheidung. Ferner können Corticosteroide die Infektionssymptome maskieren und die Verbreitung infektiöser Mikroorganismen verstärken. Diese Hormone werden zur Verwendung bei schwangeren Frauen als nicht sicher angesehen, und eine langfristige Corticosteroidbehandlung wurde mit gastrischer Hyperaktivität und/oder gastrointestinalen Geschwüren in Zusammenhang gebracht. Die Behandlung mit diesen Verbindungen kann auch Diabetes mellitus verschlechtern und höhere Insulindosen erfordern und kann psychotische Störungen hervorrufen. Hormonale entzündungshemmende Mittel, die indirekt die Produktion endogener Corticosteroide erhöhen, weisen dasselbe Potential für ungünstige Nebenwirkungen auf.
Die nichthormonellen entzündungshemmenden Mittel sind synthetische biochemische Verbindungen, die bei hohen Dosen mit einem weiten Spektrum unerwünschter Nebenwirkungen toxisch sein können. Zum Beispiel tragen Salicylate zu den ernsthaften Störungen des Säure-Base-Gleichgewichts bei, welche die Vergiftung durch diese Klasse von Verbindungen charakterisieren. Salicylate stimulieren die Atmung direkt und indirekt. Toxische Dosen von Salicylaten führen zu einer zentralen Atemlähmung wie auch zu einem Kreislaufversagen als Folge einer vasomotorischen Depression. Die Einnahme von Salicylat kann zu Oberbauchbeschwerden, Ekel und Erbrechen führen. Durch Salicylat herbeigeführte Magenblutung ist allgemein bekannt. Salicylate können einen Leberschaden erzeugen und zu einer Verlängerung der Gerinnungszeit führen. Daher sollte Aspirin bei Patienten mit schweren Leberschäden, Hypoprothrombinämie, Vitamin K-Mangel oder Hämophilie vermieden werden, da die Hemmung der Plättchenhämostase durch Salicylate zu einer Blutung führen kann. Die Salicylatvergiftung ist häufig, und in den Vereinigten Staaten werden jährlich mehr als 10.000 Fälle einer schweren Salicylatvergiftung beobachtet, von welchen einige fatal sind und viele bei Kindern auftreten. Siehe Goodman und Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. Ausgabe, 1985. Trotz der großen Zahl entzündungshemmender Mittel, die gegenwärtig zur Verfügung stehen, besteht daher weiterhin ein Bedarf an einem sicheren, wirksamen, entzündungshemmenden Produkt, das frei von Neben- und Schadwirkungen ist.
Wenn ein natürliches Nahrungsmittelprodukt, wie eines, das zum Beispiel von Milch abgeleitet wird, mit entzündungshemmenden Wirkungen erhalten werden könnte, wäre es eine leicht verabreichbare, leicht verfügbare, sichere therapeutische Zusammensetzung.
Nach dem Stand der Wissenschaft ist bekannt, Milchsorten mit einer Vielzahl therapeutischer Wirkungen zu erzeugen. Zum Beispiel hat Beck eine Milch offenbart, die Antikörper zu Streptococcus mutans enthält, die eine Zahnkaries hemmende Wirkung hat (U. S. Patent Nr. 4.324.782). Die Milch wird durch Immunisieren einer Kuh mit S. mutans Antigen in zwei Stufen und Gewinnen der therapeutischen Milch von dieser erhalten.
Stolle et al. haben ein Verfahren zur Behandlung von Gefäßleiden oder Lungenleiden, die mit Rauchen in Zusammenhang stehen, bei einem Tier offenbart, welches die Verabreichung von Milch an das Tier umfaßt, die von einer Kuh gewonnen wurde, welche in einem hyperimmunen Zustand gehalten wurde (U. S. Patent Nr. 4.636.384). Beck hat ein Verfahren zur Behandlung einer Entzündung bei einem Tier offenbart, welches die Verabreichung einer entzündungshemmenden, wirksamen Menge von Milch an das Tier umfaßt, die von einer Kuh gewonnen wurde, die in einem Zustand zur Erzeugung eines entzündungshemmenden Faktors gehalten wurde. (U. S. Patent Nr. 4.284.623). Heinbach, U. S. Patent Nr. 3.128.230, hat eine Milch beschrieben, die Globuline von Alpha-, Beta- und Gammakomponenten durch Impfen einer Kuh mit antigenen Mischungen enthält. Peterson et al. (U. S. Patent Nr. 3.376.198), Holm (U. S. Anmeldung (veröffentlicht) Seriennr. 628.987), Tunnah, et al. (Britisches Patent Nr. 1.211.876) und Biokema S. A. (Britisches Patent 1.442.283) haben auch antikörperhaltige Milchsorten beschrieben.
Keine der obengenannten Verweisstellen offenbart jedoch die Identität der Komponente oder Komponenten von therapeutischen Milchsorten, welche die gewünschten therapeutischen Wirkungen erzeugen. Zum Beispiel bestehen bei Beck, U. S. Patent Nr. 4.284.623, die Milchprodukte, die als therapeutisches Mittel verwendet werden, entweder aus flüssiger Vollmilch, flüssiger fettfreier Molke oder Vollmilchpulvern. Obwohl jedes dieser Milchprodukte entzündungshemmende Eigenschaften aufweist, wurden der oder die Faktoren, die tatsächlich die therapeutischen Nutzen bringen, bisher nicht isoliert oder identifiziert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Überlegung der Erfinder, daß ein isoliertes und gereinigtes entzündungshemmendes Milchprodukt äußerst zweckdienlich zur Behandlung von Entzündungshemmungsstörungen bei einem Tier wäre.
Mit diesem Ziel haben die vorliegenden Erfinder einen entzündungshemmenden Faktor von hyperimmuner Rindermilch, der in der Folge entzündungshemmender Milchfaktor (MAIF) genannt wird, isoliert, teilweise gereinigt und charakterisiert.
Daher enthält die vorliegende Erfindung den gereinigten entzündungshemmenden Milchfaktor, der von Milch von milcherzeugenden Tieren isoliert ist, die zuvor gegen bestimmte polyvalente Antigene hyperimmunisiert wurden. Er ist bei Entzündungszuständen wirksam, wenn er isoliert, gereinigt und in einer Menge und unter einem Schema, das zur Erzeugung entzündungshemmender Wirkungen ausreichend ist, verabreicht wird. Die Isolierung des aktiven Faktors aus der Milch hyperimmunisierter Rinder führte zu der unerwarteten Erkenntnis, daß MAIF in kleinen Mengen in der Milch normaler Rinder vorhanden ist. Diese Entdeckung blieb durch die Tatsache verborgen, daß die Konzentration von MAIF in normaler Rindermilch zu gering ist, um c er Milch erkennbare entzündungshemmende Eigenschaften zuzuschreiben. Der MAIF der normalen Milch kann jedoch durch das Isolierungsverfahren der Erfindung konzentriert werden und kann danach wirksam zur Behandlung einer Entzündung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung enthält ferner die Verwendung des gereinigten MAIF als Mittel zur Blockierung der zellulären entzündlichen Reaktion durch Verabreichung einer hemmenden Dosis des hyperimmunen Milchfaktors an ein Tier, wobei die hemmende Dosis ausreicht, um die zelluläre entzündliche Reaktion wirksam zu hemmen. Die hemmende Dosis ist zur Hemmung der Migration von Entzündungszellen ausreichend, insbesondere wenn die Entzündungszellen Neutrophile sind. Der MAIF wird auch zur Hemmung der entzündlichen Reaktion verwendet, die während der Arthus-Reaktion auftritt. Der MAIF kann auch zur Hemmung der zellulären entzündlichen Reaktion verwendet werden, die aus einer Infektion eines Tieres resultiert. Der MAIF kann auch als Mittel zur Hemmung der zellulären entzündlichen Reaktion verwendet werden, die das Ergebnis einer Freisetzung von Reaktanten der akuten Phase ist. Der MAIF kann auch zur Hemmung der Cytokinwirkung bei einem Tier verwendet werden, indem eine wirksame hemmende Dosis des hyperimmunen Milchfaktors an das Tier verabreicht wird. Die obengenannte Hemmung der Cytokinwirkung findet am Rezeptor der Entzündungszelle statt. Der MAIF kann auch zur Verhinderung der Adhäsion von Neutrophilen an Endothelzellen verwendet werden. Die Verwendung umfaßt die Verabreichung einer hemmenden MAIF-Dosis an ein Tier, wobei die hemmende Dosis ausreicht, um die Adhäsion wirksam zu verhindern. Der MAIF wird vorzugsweise intravenös verabreicht.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Ein umfassenderes Verständnis der Erfindung und vieler ihrer anhängigen Vorteile wird möglich, wenn diese mit Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen betrachtet wird:
Fig. 1. Isolierung von MAIF durch Ionenaustauschchromatographie auf einer Säule von DEAIZellulose in Schritt 2 des bevorzugten Verfahrens.
Fig. 2. Fraktionierung des MAIF-F'eaks (zweiter) von der DEAE-Zellulosechromatographie (Fig. 1) auf einer Sephadex Gb- Molekularsiebsäule in Schritt 3 des bevorzugten Verfahrens.
Fig. 3. Wirkung der immunen Milch auf Ödeme, die durch Carrageen bei Ratten herbeigeführt wurden (Pfotengewicht, % Kontrollpfote, Mittel ± SEM (Standardabweichung des Mittelwerts), n = 10).
Fig. 4. Wirkung von intraperitonealem MAIF auf Fußballenödeme bei Ratten (uL, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 5. Intraperitoneale Dosiswirkungskurve für MAIF im Rattenpfoten-Ödemtest (% Kontrolle, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 6. Wirkung des hyperimmunen Milchfaktors (MAIF) im Vergleich zu Placebo (Lactose) auf Fußballenödeme bei Ratten (% Kontrolle, Mittel 20 ± SD, n = 6).
Fig. 7. Wirkung von i. v. und oralem MAIF auf Fußballenödeme bei Ratten (% Kontrolle, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 8. Wirkung einer geringen i. v. Dosierung von MAIF auf Fußballenödeme bei Ratten (% Kontrolle, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 9. Intravenöse Dosiswirkungskurve für MAIF im Rattenpfoten-Ödemtest (% Kontrolle, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 10. Versuch 1, Zwillingsherde / Ultrafiltrationsversuche (% durchschnittliche Kontrollödeme, Mittel + SD, n = 6).
Fig. 11. Versuch 2, Zwillingsherde 1 Ultrafiltrationsversuche (% durchschnittliche Kontrollödeme, Mittel + SD, n = 6).
Fig. 12. Versuch 3, Zwillingsherde / Ultrafiltrationsversuche (% durchschnittliche Kontrollödeme, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 13. Wirkung verschiedener MAIF-Behandlungen auf die Hemmung von Fußballenödemen bei Ratten, (uL Fußballenödeme, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 14. Wirkung von MAIF-Frakt.onen und von immunem MPK auf die Hemmung von Fußballenödemen bei Raten, (uL Fußballenödeme, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 15. Wirkung von fünf verschiedenen Anästhetika auf die Reaktion auf Carrageen im Rattenfußballen. Die Ansammlung von Ödemen wurde in bestimmten Intervallen beim denselben Tieren aufgezeichnet. n 6 für jeden Datenpunkt.
Fig. 16. Demonstration des Zweiphasenverlaufs der Reaktion auf Carrageen im Rattenfußballen. n = 5 für jeden Datenpunkt. Ether wurde als Anästhetikum verwendet.
Fig. 17. MAIF, verabreicht mit entweder 5 mg pro Ratte (A) oder 40 mg pro Ratte (B), hemmt nicht die entzündliche Reaktion auf Carrageen bei Ratten, die mit Ether narkotisiert sind. n = 4 für alle Datenpunkte.
Fig. 18. Unterdrückung einer Ödemansammlung, die durch Carrageen herbeigeführt wurde, während der sekundären, durch phagozytenzellvermittelten Reaktion, durch 40 mg MAIF, der i. v. zum Zeitpunkt der Carrageen-Belastung (Zeitpunkt 0) injiziert wurde. n = 12 für jeden Datenpunkt in der Kontrollgruppe und n = 10 für jeden Datenpunkt in der MAIF-behandelten Gruppe.
Fig. 19. Wirkung von MAIF, der i. v. mit 4 mg pro Ratte zu verschiedenen Zeitpunkten verabreicht wurde, auf die Reaktion auf Carrageen im Rattenfußballen. Die Ödeme wurden in allen Fällen 4 Stunden nach der Belastung beurteilt. n = 12 für jeden Datenpunkt.
Fig. 20. Wirkung von 20 mg MAIF, der i. v. injiziert wurde, auf die reverse passive Arthus-Reaktion. * = p < 0,01; ** = p < 0,05.
Fig. 21. Wirkung von abnehmenden MAIF-Dosen auf die Fähigkeit von Neutrophilen, aus dem Gefäßsystem in sut'kutan implantierte, sterile Schwämme zu wandern. * = p < 0,01.
Fig. 22. Wirkung von MAIF, der in einer Dosis von 20 mg pro Ratte verabreicht wurde, die Fähigkeit von Entzündungszellen zu hemmen, sich in subkutan implantierten Schwämmen anzusammeln, wenn er zum Zeitpunkt der Implantation oder bis zu 120 Minuten nach der Implantation verabreicht wurde. * = p < 0,01.
Fig. 23. Zeitverlauf der zellulären entzündlichen Infiltration in subkutan implantierte Schwämme bei normalen Tieren.
Fig. 24. Wirkung von 40 mg MAIF, der i. v. verabreicht wurde, auf die Anzahl zirkulierender Neutrophile und Lymphozyten in den 24 Stunden nach der Injektion.
Fig. 25. Dosiswirkungsverhältnis zwischen einer i. v. MAIF-Verabreichung und der Anzahl zirkulierender Leukozyten (p < 0,01).
Fig. 26. Unterdrückung von infektionsbedingten Ödemen durch 40 mg MAIF, der i. v. injiziert wurde. Die Mittelwerte der beiden Gruppen waren: Kontrollen, 87 ± 22 ul, MAIF, 45 ± 17 ul, p < 0,01.
Fig. 27. Wirkung von MAIF, der i. v. mit 40 mg pro Ratte verabreicht wurde, auf die Bakterienreplikation und auf subkutan implantierte, E. coli-infizierte Schwämme.
Fig. 28. Hemmung der Entzündungszelleninfiltration in infizierte Schwämme durch MAIF (40 mg pro Ratte, i. v.).
Fig. 29. Wirkung von MAIF (40 ing pro Ratte, i. v.) auf die Unterdrückung der Zwischenphase (4-16 Stunden) der Entzündungsfluidansammlung in E.coli-infizierten Schwämmen.
Fig. 30. Wirkung von 40 mg MAIF, der zum Zeitpunkt der Belastung und 48 Stunden später intravenös verabreicht wurde, auf die Pathogenese experimenteller Pyelonephritis. Die gestrichelte Linie in der linken Graphik stellt das mittlere Hintergrundsnierengewicht dar. * = p < 0,01; *v = p < 0,02.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE

Die Erfindung umfaßt die Isolierung und Reinigung von MAIF und die Verabreichung dieses MAIF an ein Tier zum Zwecke der Behandlung von Entzündungshemmungsstörungen.
Mit dem Begriff "entzündungshemmender Milchfaktor" wird ein Faktor bezeichnet, der entweder von hyperimmuner Milch oder normaler Kuhmilch erhalten wird. Mit dem Begriff "im wesentlichen reiner entzündungshemmender Milchfaktor" wird für den Zweck dieser Erfindung ein entzündungshemmender Faktor bezeichnet, der als einziger symmetrischer Hauptpeak auf HPLC-Chromatographie nach der Entfernung von Substanzen mit hohem Molekulargewicht (> 10.000 Dalton) und der Isolierung der negativ geladenen Arten mit geringem Molekulargewicht durch Ionenaustauschchromatographie eluiert. Sowohl normale Milch als auch hyperimmune Milch können durch die hierin beschriebenen Verfahren verarbeitet werden, um den MAIF zu erhalten.
Mit dem Begriff "hyperimmune Milch" wird für den Zweck dieser Erfindung Milch bezeichnet, die von milchproduzierenden Tieren erhalten wird, die in einem hyperimmunen Zustand gehalten werden, wobei die Einzelheiten zur Hyperimmunisierung in der Folge ausführlicher beschrieben werden.
Mit dem Begriff "Molke" wird für den Zweck dieser Erfindung Milch bezeichnet, von welcher der Rahm entfernt wurde.
Mit dem Begriff "normale Milch" wird für den Zweck dieser Erfindung Milch bezeichnet, die von milchproduzierenden Tieren durch herkömmliche Mittel und Molkereipraktiken erhalten wird.
Mit dem Begriff "milchproduzierendes Tier" werden für den Zweck dieser Erfindung Säugetiere bezeichnet, die Milch in für den Handel angemessenen Mengen produzieren, vorzugsweise Kühe, Schafe und Ziegen, insbesondere Milchkühe der Gattung Bos (Rind), insbesondere jene Züchtungen mit den höchsten Milchausbeuten wie Holstein.
Mit dem Begriff "bakterielles Antigen" wird für den Zweck dieser Erfindung eine lyophilisierte Zubereitung von durch Wärme abgetöteten Bakterienzellen bezeichnet.
Mit dem Begriff "mikroeingekapselte Form" werden für den Zweck dieser Erfindung polymere Mikropartikel bezeichnet, die ein oder mehrere bakterielle Antigene einkapseln, zur Verabreichung an milchproduzieiende Tiere.
Mit dem Begriff "Entzündung" wird für den Zweck dieser Erfindung eine örtliche Abwehrreaktion bezeichnet, die durch Verletzung oder Zerstörung von Gewebe hervorgerufen wird und sowohl das schädliche Agens als auch das verletzte Gewebe zerstören, verdünnen oder abtrennen soll, die in der akuten Form durch die klassische Abfolge von Schmerz, Wärme, Rötung, Schwellung und Funktionsverlust gekennzeichnet ist und histologisch eine komplexe Reihe von Vorgängen umfaßt, einschließlich der Erweiterung der Arteriolen, Kapillaren und Venülen mit erhöhter Permeabilität und Durchblutung, Exsudation von Fluids einschließlich Plasmaproteinen und Leukozytenmigration in den Entzündungsherd.
Mit dem Begriff "behandeln" ist für den Zweck dieser Erfindung gemeint, daß die Symptome der Erkrankung und/oder der pathogene Ursprung der Erkrankung verbessert oder vollständig beseitigt werden.
Mit dem Begriff "verabreichen" wird für den Zweck dieser Erfindung jedes Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Substanz bezeichnet, wie ein orales, intranasales, parenterales (intravenöses, intramuskuläres oder subkutanes) oder rektales.
Mit dem Begriff "Tier" wird für den Zweck dieser Brfindung jedes Lebewesen bezeichnet, das an einer Entzündung leidet, einschließlich Menschen, landwirtschaftliche Nutztiere, Haustiere oder Tiere im Zoo.
Beispiele für Entzündungszustände, die mit dem isolierten und gereinigten Milchprodukt der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind Zustände, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus akuter und subakuter Bursitis, akuter unspezifischer Tendinitis, systemischem Lupus eythematodes, systemischer Dermatomyositis, akuter rheumatischer Karditis, Pemphigus, bullöser Dermatitis, Herpeteformis schwerem Erythem, multiformer Dermatitis exfoliativa, Zirrhose, jahreszeitlich bedingter perennialer Rhinitis, Asthma bronchiale, ektopischer Dermatitis, Serumkrankheit, Keratitis, Ophthalmikus-kitis, diffuser Ureteritis, Chorditis, Neuritis nervi optici, sympathischer Oph thalmie, symptomatischer Sarkoidose, Löffler-Syndrom, Berylliose, hämolytischer Anämie, Mastitis, Mastoiditis, Kontaktdermatitis, allergischer Konjunktivitis, Arthritis psoriatica, ankylosierender Spondylitis, akuter Gichtarthritis und Herpes zoster, Ferner kann das isolierte und gereinigte Milchprodukt zur Behandlung von Patienten verwendet werden, die potentiellen Entzündungserregern ausgesetzt sind.
Die Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, daß, wenn ein milchproduzierendes Tier wie ein Rind in einen bestimmten Zustand der Hyperimmunisierung gebracht wird, das Tier Milch produziert, die supranormale Werte des äußerst nützlichen MAIF aufweist, wobei der MAIF nicht nur die Symptome der Entzündung beim Menschen und anderen Tieren unterdrückt, sondern auch ein prophylaktisches Mittel bei zu erwartenden Entzündungserregern beim Empfänger ist. Mit dem Begriff "supranormale Werte" werden Werte über jenen bezeichnet, die in der Milch von nicht hyperimmunisierten Tieren vorgefunden werden. Die Herbeiführung einer Immunsensitivität alleine reicht nicht aus, um das Auftreten supranormaler Werte von MAIF in Milch auszulösen, wie durch die Tatsache bewiesen wird, daß normale Kuhmilch diese supranormalen Werte nicht enthält, obwohl die Kühe gegen verschiedene Antigene während der normalen Immunisierung gegen Kuhkrankheiten und während der normalen Umweltbelastung sensibilisiert wurden. Nur in bestimmten hyperimmunen Zuständen weist die Milch die gewünschten supranormalen Werte auf.
Dieser besondere Zustand kann durch Verabreichung einer anfänglichen Immunisierung, auf die periodische Booster mit ausreichend hohen Dosen spezifischer Antigene folgen, erreicht werden. Die bevorzugte Booster-Dosierung sollte gleich oder größer 50% der Dosierung sein, die zur Erzeugung der primären Immunisierung des Rinds erforderlich ist. Somit gibt es eine Booster-Schwellendosierung, unter welcher die Eigenschaft in der Milch nicht erzeugt werden, selbst wenn die Kuh sich in einem Zustand befindet, der für gewöhnlich als Immunzustand bezeichnet wird. Zum Eneichen des erforderlichen hyperimmunen Zustands ist es notwendig, die hyperimmune Milch nach einer ersten Reihe von Booster-Verabreichungen zu testen. Wenn die nützlichen Faktoren in der Milch nicht vorhanden sind, werden zusätzliche Booster mit hohe Dosierung verabreicht, bis die Eigenschaften in der Milch auftreten.
Das Verfahren zur Erzeugung der hyperimmunen Milch, die supranormale Werte von MAIF aufweist, ist offenbart in der gleichzeitig anhängigen U. S. Serial Nr. 069.139, eingereicht am 2. Juli 1987, und in der gleichzeitig anhängigen U. S. Serial Nr. 910.297, eingereicht am 17. September 1986, einer File Wrapper-Continuation der U. S. Patentanmeldung Serial Nr. 576.001, eingereicht am 1. Februar 1983, die in ihrer Gesamtheit hierin durch Bezugnahme einbezogen werden. Zusammenfassend umfaßt ein Verfahren zur Herstellung der hyperimmunen Milch, die supranormale Werte von MAIF aufweist, die folgenden Schritte: (1) Wahl des Antigens; (2) primäre Immunisierung des Rinds; (3) Testen des Serums zur Bestätigung der Herbeiführung einer Sensitivität; (4) Hyperimmunisierung mit Booster geeigneter Dosierung; und, gegebenenfalls, (5) Testen der Milch auf entzündungshemmende Eigenschaften; (6) Sammeln der Milch von dem hyperimmunen Rind; und (7) Verarbeiten der Milch zur Isolierung des MAIF.
Schritt 1: Es kann jedes Antigen oder jede Kombination von Antigenen verwendet werden. Die Antigene können bakterielle, virale, protozoische, fungale, zelluläre oder alle anderen Substanzen sein, auf welche das Immunsystem eines milchproduzierenden Tiers reagiert. Der kritische Punkt in diesem Schritt ist, daß das oder die Antigene imstande sein müssen, nicht nur immune und hyperimmune Zustände in dem milchproduzierenden Tier auszulösen, sondern auch supranormale Werte von MAIF in der Milch zu erzeugen. Es kann jedes Antigen zur Erzeugung supranormaler Werte von MAIF verwendet werden. Ein bevorzugter Impfstoff ist eine Mischung aus polyvalenten bakteriellen Antigenen, der als Serie 100 Impfstoff bezeichnet wird und in dem folgenden Beispiel 1A ausführlich beschrieben ist.
Schritt 2: Das oder die Antigene können mit jedem Verfahren verabreicht werden, das eine Sensibilisierung verursacht. In einem Verfahren wird ein Impfstoff, der aus Antigen besteht, das von 1 · 106 bis 1 · 1020, vorzugsweise 108 bis 1010, insbesondere 2 · 108, durch Wärme abgetöteten Bakterien abgeleitet wurde, durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Es können jedoch andere Verfahren wie eine intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion, ein Rektalzäpfchen oder eine orale Verabreichung verwendet werden.
Schritt 3: Es muß bestimmt werden, ob das milchproduzierende Tier gegenüber dem Antigen empfindlich geworden ist. Es gibt eine Reihe von Verfahren, die den Fachleuten in der Immunologie bekannt sind, um die Sensitivität zu testen ethods in Immunology and Immunochemistry, William, C. A., und Chase, W. M., Academic Press, New York, Bd. 1-5 (1975)). In dem bevorzugten Verfahren wird ein polyvalenter Impfstoff mit mehreren Bakterienarten als Antigen verwendet und die Gegenwart von agglutinierenden Antikörpern im Serum des Tieres vor und nach der Belastung mit dem Impfstoff getestet. Das Auftreten von Milchantikörpern nach der Immunisierung mit dem Impfstoff zeigt die Sensitivität an; an diesem Punkt kann mit Schritt 4 fortgefahren werden.
Schritt 4: Dieser beinhaltet das Herbeiführen und Erhalten des hyperimmunen Zustandes in dem sensibilisierten Tier. Dies erfolgt durch wiederholte Booster-Verabreichungen in festgesetzten Zeitintervallen desselben polyvalenten Impfstoffs, der zum Erreichen der primären Sensibilisierung verwendet wurde. Ein zweiwöchiges Booster-Intervall ist für polyvalente bakterielle Antigene optimal. Es muß jedoch garantiert sein, daß das Tier nicht von einem hyperimmunen Zustand zu einem Zustand der Immuntoleranz gegenüber dem Antigen wechselt.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die Hyperimmunisierung von Rindern durch eine einzige Verabreichung des mikroeingekapselten Impfstoffs erreicht werden, der wie im folgenden Beispiel 1B ausführlich beschrieben ist, hergestellt wurde. Der Vorteil dieser kontrollierten Freisetzungsform der Hyperimmunisierung besteht darin, daß die ständige Antigen-Exposition dafür sorgt, daß das Tier im hyperimmunen Zustand bleibt.
In einem anderen Ausführungsbeispiel ist es auch möglich, verschiedene Immunisierungsverfahren zu kombinieren, z. B., gleichzeitig mikroeingekapseltes und flüssiges Antigen zu verabreichen oder eine intramuskuläre Injektion zur primären Immunisierung und Booster-Dosen durch orale Verabreichung oder parenterale Verabreichung durch Mikroeinkapselungsmittel. Den Fachleuten sind viele verschiedene Kombinationen von Primär- und Hyperimmunisierung bekannt.
Schritt 5: Die Milch muß auf die Werte der entzündungshemmenden Aktivität getestet werden. Dies kann durch jede Untersuchungstechnik erfolgen, welche die Wirkungen entweder der hyperimmunen Milch oder der Produkte, die davon abgeleitet wurden, bei einer Entzündung testet. Eine chemisch herbeigeführte Entzündung der Rattenpfote ist ein Standardtest für entzündungshemmende Arzneimittel.
Schritt 6: Dieser beinhaltet die Gewinnung und Verarbeitung der Milch. Die Milch kann durch herkömmliche Verfahren gewonnen werden. Die Verarbeitung der Milch zur Isolierung des MAIF ist in der Folge beschrieben.
Das einfachste Verfahren zur Isolierung, Reinigung und Testung des MAIF umfaßt die folgenden Schritte:
1. das Entfetten der hyperimmunen Milch zur Herstellung von Magermilch;
2. die Entfernung von Casein aus der Magermilch zur Herstellung von Molke;
3. die Entfernung von Molke-Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10.000 Dalton durch Ultrafiltration;
4. das Fraktionieren des Produkts von Schritt 3 unter Verwendung einer Ionenaustauschharzsäule zur Isolierung einer negativ geladenen MAIF-Art mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 Dalton;
5. das Abtrennen der negativ geladenen Art von Schritt 4 durch Molekularsiebohromatographie; und
6. das biologische Testen des MAIF von Schritt 5.
In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die Fraktionen von der Molekularsiebohromatographie, die biologische Aktivität aufweisen, weiter durch Filtration durch ein Membran gereinigt, das Makromoleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 5.000 Dalton zurückhält.
7. Die entzündungshemmende Aktivität des Milchfaktors wird an einem Ödem getestet, das durch Injektion einer Carrageen-Lösung in die Pfote von Ratten hervorgerufen wird. Der Rattenpfotentest ist der Standardtierversuch für entzündungshemmende Arzneimittel. Winter, C. A, Risley, G. A., Nuss, A. W., "Carrageenan-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs", Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 3 : 544 (1967). Es kann eine Vielzahl anderer Tests verwendet werden. Wetnick, A. S., und Sabin, C., "The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalomyelitis in Rats", Jap. J. Pharm. 22 : 741 (1972). Der Rattenpfotentest ist jedoch der einfachste und direkteste verfügbare Test und hat sich bei allen entzündungshemmenden Arzneimitteln als zufriedenstellend erwiesen. Dieser Test wurde ausführlich in Beck, U. S. Patent 4.284.623 beschrieben, das hierin durch Bezugnahme bis zu dem Ausmaß eingebracht wird, in dem es den Rattenpfotentest beschreibt. Kurz gesagt, der Test beinhaltet die Injektion einer kleinen Menge Carrageen in den Fußballen erwachsener weißer Ratten. Dies löst bekanntlich eine entzündliche Reaktion aus. Das entstehende Schwellungsmaß kann quantifiziert werden. Proben, die entzündungshemmenden Faktor enthalten, werden der Ratte über eine geeignete Route verabreicht, vorzugsweise durch intraperitoneale Injektion, und die Hemmung oder Verbesserung des Entzündungsprozesses wird entweder durch volumetrische oder gravimetrische Verfahren quantifiziert.
In Zusammenfassung, der entzündungshemmende Faktor kann von hyperimmunisierter Milch durch Ausführen eines Verfahrens mit Entfetten der Milch, Entfernen von Casein, Entfernen von Makromolekülen mit mehr als 10.000 Dalton und anschließende Ionenaustausch- und Molekularsiebohromatographie isoliert werden. Die biologische Aktivität der geeigneten Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors kann durch Ausführung eines Dosiswirkungsexperiments bei Ratten wie hierin beschrieben getestet werden. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch jedes Mittel verabreicht werden, das eine entzündungshemmende Aktivität bereitstellt. Zum Beispiel kann die Verabreichung parenteral, subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal oder oral sein.
Feste Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granula. In solchen festen Dosierungsformen wird die aktive Verbindung mit mindestens einem inaktiven Verdünnungsmittel wie Sucrose, Lactose oder Stärke vermischt. Solche Dosierungsformen können auch, wie dies die normale Praxis ist, zusätzliche Substanzen neben dem inaktiven Verdünnungsmittel umfassen. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen auch Puffermittel umfassen. Tabletten und Pillen können zusätzlich mit einem magensaftresistenten Überzug hergestellt werden.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere, die inaktive Verdünnungsmittel enthalten, die allgemein in der Pharmazie verwendet werden. Neben den inaktiven Verdünnungsmitteln können solche Zusammensetzungen auch Adjuvantien wie Benetzungsmittel, Emulgatoren und Trägerflüssigkeiten und Süßstoffe enthalten.
Zubereitungen gemäß dieser Erfindung zur parenteralen Verabreichung enthalten sterile wässerige oder nichtwässerige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Beispiele für nichtwässerige Lösemittel oder Träger sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, pflanzliche Öle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat.
Die Dosierung aktiver Inhaltsstoffe in der Zusammensetzung dieser Erfindung kann unterschiedlich sein; es ist jedoch notwendig, daß die Menge des aktiven Inhaltsstoffs derart ist, daß eine geeignete Dosierungsform erhalten wird. Die gewählte Dosierungsform hängt von der gewünschten therapeutischen Wirkung, von dem Verabreichungsweg und von der Dauer der Behandlung ab.
Die Verabreichungsdosierung und -frequenz hängt von dem Alter und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten ab, wobei die Möglichkeit von Nebenwirkungen berücksichtigt wird. Die Verabreichung hängt auch von einer gleichzeitigen Behandlung mit anderen Arzneimitteln und der Verträglichkeit des Patenten für das verabreichte Arzneimittel ab.
Die Erfindung beruht zum Teil auf der unerwarteten Entdeckung, daß ein MAIF isoliert und gereinigt werden kann und in der Behandlung einer Reihe von entzündlichen Prozessen bei Menschen und Tieren wirksam ist. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird der MAIF durch Hyperimmunisieren eines milchproduzierenden Tieres gegen einen bakteriellen Antigenimpfstoff erzeugt. Der Impfstoff, der zur Hyperimmunisierung der Tiere verwendet wird, enthält keine entzündungshemmende Aktivität. Es ist daher überraschend, daß die Behandlung mit einem isolierten und gereinigten Faktor, der von Tieren erhalten wird, die gegen einen gemischten bakteriellen Antigenimpfstoff immunisiert sind, in der Linderung oder Beseitigung entzündlicher Prozesse wirksam ist.
Nachdem die Erfindung nun in allgemeinen Worten beschrieben wurde, wird sie mit Bezugnahme auf bestimmte besondere Beispiele näher beschrieben, die hierin nur zum Zwecke der Erklärung angeführt sind und keine Einschränkungen darstellen sollen, wenn nicht anders angegeben.

Beispiel 1A

Herstellung des 5-100 Impfstoffes

Eine Bakterienkultur, die das Bakterienspektrum enthielt, das in der folgenden Tabelle 1 wiedergegeben ist und von der American Type Culture Collection erhalten wurde, wurde mit 15 ml Medium rekonstituiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Sobald ein gutes Wachstum erreicht war, wurde etwa eine Hälfte der Bakteriensuspension zur Beimpfung eines Liters Nährlösung verwendet, wobei das Inokulat bei 37ºC inkubiert wurde. Die verbleibende Suspension wurde in sterile Glycolröhrchen überführt und bei -20ºC bis zu sechs Monate gelagert.
Sobald ein gutes Wachstum in der Kultur erkennbar war, wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation der Suspension über 20 Minuten zur Entfernung des Mediums geerntet. Das erhaltene Bakterienpellet wurde in steriler Kochsalzlösung resuspendiert, und die Bakterienprobe wurde dreimal zentrifugiert, um das Medium von den Zellen zu waschen. Nach der dritten Waschung mit steriler Kochsalzlösung wurde das Bakterienpellet, das nach der Zentrifugation erhalten wurde, in einer kleinen Menge doppelt destilliertem Wassers resuspendiert. Die medienfreie Bakteriensuspension wurde durch Wärme abgetötet, indem die Suspension über Nacht in einem Glaskolben in ein 80ºC Wasserbad gestellt wurde. Die Keimfähigkeit der Nährkultur wurde mit einer kleinen Menge durch Wärme abgetöteter Bakterien getestet. Die Nährlösung wurde mit durch Wärme abgetöteten Bakterien beimpft, bei 37ºC fünf Tage inkubiert und täglich auf Wachstum geprüft, da die Bakterien zur Verwendung in dem Impfstoff abgetötet sein müssen.
Die durch Wärme abgetöteten Bakterien wurden bis zur Trockenheit lyophilisiert. Die trockenen Bakterien wurden dann mit steriler Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 2,2 · 10&sup8; Bakterienzellen/ml Kochsalzlösung vermischt (1,0 Extinktionswert bei 660 nm). Tabelle 1 Liste der S-100 Bakterien
Kühe erhielten tägliche Injektionen von 5 ml Proben des polyvalenten flüssigen Impfstoffs. Antikörper- (IgG-) Titerwerte für die injizierten Rinder wurden periodisch unter Verwendung eines enzymgebundenen Immuntests für Rinderantikörper gegen das polyvalente Antigen bestimmt.

Beispiel 1B

Immunisierungsverfahren

Durch Wärme abgetötete Bakterien wurden auf die zuvor beschriebene Weise hergestellt. Die erhaltene polyvalente Antigenprobe (S-100) wurde durch ein herkömmliches Phasentrennverfahren mikroeingekapselt, um ein Mikropartikelprodukt zu erhalten, das polyvalentes Antigen enthält. Im allgemeinen werden die antigenhaltigen, geformten Matrixmaterialien aus Polymeren aus biologisch verträglichem Material gebildet, vorzugsweise aus biologisch abbaubaren oder biologisch erodierbaren Materialien, vorzugsweise Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Copolymeren von Milch- und Glycolsäure, Polycaptolacton, Copolyoxalaten, Proteinen wie Collagen, Fettsäureestern von Glycerin und Zelluloseestern. Diese Polymere sind in der Wissenschaft gut bekannt und sind zum Beispiel in U. S. 3.773.919; U. S. 3.887.699; U. S. 4.118.470; U. S. 4.076.798; beschrieben, die alle hierin durch Bezugnahme eingebracht werden. Das verwendete polymere Matrixmaterial war ein biologisch abbaubares Lactid-Glycolid-Copolymer.
Durch Wärme abgetötete Bakterienantigene werden in solchen Matrixmaterialien eingekapselt, vorzugsweise als Mikrokügelchen mit einem Durchmesser zwischen 1-500 Mikron, vorzugsweise 10-250 Mikron. Die Einkapselungsverfahren sind herkömmlich und umfassen Phasentrennmethoden, Grenzflächenreaktionen und physikalische Methoden. Es können viele Kombinationen von Matrizen und viele Konzentrationen sortierter Antigene verwendet werden, um optimale Freisetzungsraten von Bakterienantigenen an den Wirtskörper von den Mikropartikeln zu erhalten. Diese Kombinationen können von den Fachleuten ohne unzumutbare Experimente bestimmt werden.
Die Mikropartikel in dem Beispiel wiesen einen Durchmesser von weniger als 250 Mikron auf. Etwa 750 mg Mikropartikel, die 22% (16,5 mg) polyvalentes Antigen enthielten, wurden dann in etwa 3 cc eines Trägers (1 Gew.-% Tween 20 und Gew.-% Carboxymethylzellulose in Wasser) suspendiert.
Eine kleine Gruppe von Rindern wurde aus einer größeren Rinderherde ausgewählt. Fünf dieser zufällig gewählten Rinder wurden als Kontrollen bestimmt. Vier Rindern wurden Mikropartikel mit polyvalentem Antigen intramuskulär injiziert. Mikropartikelproben wurden mit 2,0 mRad Gammastrahlung sterilisiert. Antikörper- (IgG-) Titerwerte wurden periodisch aus den Proben der Kuhmilch bestimmt, die von den geimpften Kühen wie auch von den Kontrollkühen erhalten wurden.

Beispiel 2

Isolierung des MAIF-Faktors aus hyperimmunisierter Milch

Schritt 1: Milchfiltratherstellung

Zwanzig Liter frische Milch von hyperimmunisierten Kühen wurden zur Entfernung des Fetts durch eine Entrahmungszentrifuge (DeLaval Modell 102) geleitet.
Die erhaltenen sechzehn Liter entrahmte Milch wurden unter Verwendung eines Hohlfaserdiafiltrations/Konzentrators (Amicon DL-10L) ultrafiltriert, um die Anteile mit hohem Molekulargewicht (mehr als 10.000 Dalton) zu entfernen. Der Konzentrator ist mit zwei Patronen zur Abscheidung eines Molekulargewichts von 10.000 Dalton ausgestattet (Amicon H&sub5;P&sub1;&sub0;&submin;&sub4;&sub3;). Die entrahmte Milch wurde bei einer Pumpengeschwindigkeit von 80 auf dem Meßgerät und einem Einlaß- und Auslaßdruck von 30 psi bzw. 25 psi durchgeleitet.
Zwölf Liter des Filtrats (< 10.000 Dalton), das aus den Patronen mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 Litern pro Stunde austrat, wurden zur Lagerung und zur weiteren Reinigung gefroren und lyophilisiert.

Schritt 2: Ionenaustauschchromatographie

Der entzündungshemmende Milchfaktor, MAIF, in dem Filtrat wurde zunächst durch eine Anionenaustauschchromatographiesäule isoliert.
In diesem Verfahren wurde DEAE-Sepharose CL-6B Gel (Pharmacia) zum Füllen einer 5 · 10 cm Glassäule verwendet, die mit sterilem, doppelt destillierten Wasser, pH 7,0, äquilibriert war.
Ein Liter Filtrat (< 10.000) wurde auf die Säule aufgebracht und mit sterilem, doppelt destillierten Wasser, pH 7,0, bei einer Fließgeschwindigkeit von 160 ml pro Stunde eluiert. Es wurden zehn Milliliter Fraktionen gesammelt und bei 280 nm in einem LKB Uvicord 4700 Absorptiometer aufgezeichnet, wobei die Extinktion auf einem angeschlossenen Schreiber (Pharmacia REC-482) ausgedruckt wurde.
Die sich von MAIF unterscheidenden Substanzen mit positiven und neutralen Ladungen sind nicht an das DEAE-Sepharose Gel gebunden. Sie werden bei dem Durchfallspeak (ersten Peak) eluiert. Der MAIF, der eine negative Ladung trägt, wird von dem Gel zurückgehalten.
Zur Entladung des MAIF wurde die Säule mit einem stufenweisen Gradienten unter Verwendung steriler physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,0, eluiert. Ein typisches Profil ist in Fig. 1 dargestellt. Der Biotest der einzelnen Fraktionen zeigte, daß der zweite Peak den MAIF enthält. Fraktionen, die den zweiten Peak und seine Schulter umfassen, werden zur weiteren Reinigung verwendet. Ausbeutestudien zeigen, daß 8, 8 Gramm getrocknetes Pulver durch dieses Verfahren erhalten wurden.

Schritt 3: Gelfiltrationschromatographie

Der zweite Peak, der von Schritt 2 erhalten wurde, enthält MAIF und andere negativ geladene Moleküle; daher war ein zusätzlicher Reinigungsschritt erforderlich. Für die weitere Reinigung ist es praktisch, eine Gelfiltrationssäule zu verwenden, um verschiedene Komponenten auf der Basis des Molekulargewichts abzutrennen.
In diesem Verfahren wurde Sephadex G-10 Harz (Pharmacia) in eine 2,5 · 80 cm Glassäule gefüllt und mit sterilem, doppelt destillierten Wasser, pH 7,0, äquilibriert. Zwei Gramm der zweiten Fraktion von Schritt 2 wurden in sterilem, doppelt destillierten Wasser wieder aufgelöst und auf die Oberseite der Säule aufgebracht. Die Säule wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde eluiert.
Fraktionen (3,3 ml) wurden gesammelt und bei 254 nm und 280 nm (Pharmacia Duo Optical Unit) beobachtet, wobei die Extinktion auf einem angeschlossenen Schreiber (Pharmacia REC-482) ausgedruckt wurde.
Für gewöhnlich gab es 3 Peaks, die sich in dem Elutionsprofil, wie in Fig. 2 dargestellt, zeigen. Der erste und zweite Peak enthielt MAIF-Aktivität. Der erste Peak ist ein Aggregat, das sich auf der G-10 Säule bildet, welches den aktiven MAIF enthält.
Der zweite Peak enthält die nichtaggregierte Form des MAIF. Sowohl die aggregierte Form (Peak 1) als auch die nichtaggregierte Form (Peak 2) sind in Ratten-Biotests biologisch aktiv.

Beispiel 3

Charakterisierung des entzündungshemmenden Milchfaktors

Das Molekulargewicht der nichtaggregierten Form von MAIF, der durch das zuvor beschriebene Verfahren hergestellt worden war, erwies sich als geringer als 10.000 Dalton. Dies wurde aus der Tatsache abgeleitet, daß der erste Schritt bei der Isolierung von MAIF aus Molke durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran erfolgte, die Molekulargewichtarten > 10.000 Dalton nicht hindurchließ.
Der MAIF hat eine negative Ladung. Dies wurde bestimmt, indem das Milchultrafiltrat auf eine DEAE-Zellulose-Ionenaustauschsäule aufgebracht wurde. Der MAIF eluierte nicht von der Säule mit Wasser. Sobald das Elutionsmedium in Natriumchlorid (0,9% pH) geändert wurde, eluierten mehrere Peaks (Fig. 1).
Neutral und positiv geladene Arten blieben nicht an dem Ionenaustauschharz haften, und negativ geladene Arten werden durch Erhöhen der Salzkonzentration eluiert. Sobald ein Permeat mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton auf die DEAE-Säule aufgebracht wurde, eluierten neutrale Salze und Zucker mit Wasser (Peak 1, Fig. 1). Drei verschiedene Peaks eluierten, wenn der Puffer zu Kochsalzlösung geändert wurde (Peak 2-4). Der zweite Peak und seine Schulter enthielten MAIF, der im Rattentest biologisch aktiv war. Daher wird geschlossen, daß der MAIF eine negative Ladung aufweist.
Eine weitere chemische Eigenschaft des MAIF ist, daß er ein Aggregat während des Verfahrens zur Salzentfernung bildet. Diese Eigenschaft wurde erkennbar, als ein Permeat mit einem Molekulargewicht < 10.000 Dalton über eine Sephadex G-10 Säule geleitet wurde, die mit doppelt destilliertem Wasser äquilibriert war, und mit Wasser bei einem pH von 7 eluiert wurde (Fig. 2). Es eluierten drei Peaks von der G-10 Säule; der erste Peak eluierte mit dem Durchflußvolumen, was auf ein Molekulargewicht von gleich oder größer 10.000 Dalton schließen läßt. Dies war unerwartet, da Moleküle mit mehr als 10.000 Dalton zuvor durch Ultrafiltration aus dieser Probe entfernt worden waren. Der zweite Peak eluierte in der Position, die für den entzündungshemmenden Faktor erwartet wurde. Sowohl der erste als auch der zweite Peak wiesen entzündungshemmende biologische Aktivität im Rattenpfotentest auf, während dem dritten Peak die Aktivität fehlte. Es war überraschend festzustellen, daß sowohl der erste als auch der zweite Peak entzündungshemmende biologische Aktivität hatten. Das aus dem ersten Peak der G-10 Säule gewonnene Material (Schritt 3) wurde lyophilisiert und auf eine G-100 Säule aufgebracht; es wurde ein einziger Peak mit dem Durchflußvolumen eluiert, was auf ein Molekulargewicht von 100.000 Dalton oder mehr schließen läßt. Die G-10 Säule von Schritt 3 entfernt Salz und trennt gleichzeitig die verschiedenen Molekulargewichtarten. Es wird daher geschlossen, daß während des Laufs über die G-10 Säule und der daraus resultierenden Salzentfernung der entzündungshemmende Faktor eine Aggregat mit großem Molekulargewicht bildete. Das Ausmaß der Aggregation änderte sich mit der Salzkonzentration.
Die Aggregationseigenschaft legt die Möglichkeit nahe, daß ein breites Spektrum verschiedener Molekulargewichtarten gebildet werden kann, die entzündungshemmende biologische Aktivität aufgrund der Gegenwart des entzündungshemmenden Faktors aufweisen. Die Entdeckung dieser Eigenschaft weist auf die Möglichkeit hin, entzündungshemmende Milchfaktoren mit einem breiten Spektrum verschiedener biochemischer Eigenschaften zu erzeugen, abhängig von dem Aggregationsausmaß des Endprodukts. Zum Beispiel könnten Formulierungen mit längeren oder kürzeren biologischen Halbwertszeiten unter Verwendung von Aggregaten mit größerem oder kleinerem Molekulargewicht erzeugt werden, wobei die Molekulargewichtsverteilung durch die Salzkonzentration während der Verarbeitung kontrolliert wird. Die hierin beschriebene Säulenchromatographiemethode führt zu den kleinsten Molekulargewichtarten, die mit biologischer Aktivität erhalten wurden (d. h., Peak 2 von der G-10 Säule in Schritt 3). Diese Beobachtung legt auch die Verwendung anderer Verfahren zur Bildung der Aggregate nahe. Zum Beispiel führt eine Verdünnung in Wasser zum Auftreten einer Aggregation. Chemische Mittel, die Salze binden, insbesondere Kalzium, können die Bildung des Aggregats verursachen. Nach dieser Entdeckung sind andere Verfahren zur Bildung des Aggregats und zur Abtrennung des MAIF für Fachleute offensichtlich.

Beispiel 4

Test auf biologische Aktivität

Die entzündungshemmende Wirkung des MAIF wurde an einem Ödem getestet, das durch Injizieren einer Carrageen-Lösung in die Fußballen von Ratten hervorgerufen wurde. Eine lyophilisierte Probe des MAIF wurde in dem geeigneten Träger aufgelöst und Versuchsratten intraperitoneal verabreicht. Carrageen wurde dann den Ratten in einer Menge von 0,1 ml einer 1% Kochsalzlösung in jeden hinteren Fußballen verabreicht. Die Fußballen wurden vor Verabreichung der Injektionen und 2,5 Stunden nach den Injektionen unter Verwendung eines Dickenmeßgeräts gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und 3 dargestellt. Die nichtaggregierte MAIF-Form (Peak 2 von der G-10 Säule) von der Kontrolle und der hyperimmunen Milch bewirkte eine Verringerung der Entzündung der Rattenpfote bei Dosen zwischen 1 mg und 0,25 mg (Tabelle 2). Sowohl die hyperimmune Milch als auch die normale Milch wiesen Aktivität auf; das hyperimmune Material war jedoch stärker. Daraus wurde geschlossen, daß der MAIF in der Milch hyperimmuner Kühe in größerer Konzentration auftritt.
Der zweite Peak von der DEAE-Säule wies eine Aktivität auf, wenn er entweder von hyperimmuner Milch oder normaler Milch isoliert wurde. Die Aktivität ist in der hyperimmunen Milch wesentlich größer (Tabelle 3).
Der erste Peak von der G-10 Säule, der die aggregierte Form des MAIF ist, wies eine Aktivität in Rattenpfotentests auf (Tabelle 2). Die aggregierte Form ist jedoch auf derselben Gewichtsbasis nicht so stark wie die nichtaggregierte Form. Aus diesen Studien wird geschlossen, daß der MAIF-Faktor von Natur aus in Kuhmilch vorhanden ist. Die Hyperimmunisierung der Kühe führt zu einer höheren MAIF-Konzentration in der Milch. Der MAIF ist ein kleines, negativ geladenes Molekül, das durch eine Reihe von Verfahren von der Milch abgetrennt werden kann. Der MAIF-Faktor kann Aggregate mit hohem Molekulargewicht bilden, die von Natur aus nicht in Milch auftreten, sondern sich während der Verarbeitung bilden. TABELLE 2 WIRKUNG DES ENTZÜNDUNGSHEMMENDEN MILCHFAKTORS (MAIF) ZUR VERRINGERUNG EINER ENTZÜNDUNG BEI RATTEN TABELLE 3 VERGLEICH VON HALBGEREINIGTEN MAIF-FRAKTIONEN ANHAND DER VERRINGERUNG EINER ENTZÜNDUNG BEI RATTEN

Beispiel 5

Chemische Analyse des entzündungshemmenden Faktors

Proben des entzündungshemmenden Faktors wurden chemisch analysiert. Der MAIF ist nicht kristallin in der Struktur, wie durch Röntgendiffraktionsstudien bestimmt wurde. MAIF-Zubereitungen ergaben eine Elementaranalyse, die mit einer Kohlenhydratzusammensetzung übereinstimmte. Die C-, H-, O-Verhältnisse standen im Einklang mit einem polymeren oder oligomeren Material, wobei einige Methanolgruppen an Carboxyl oxidiert waren. Der leichte Überschuß an Kalziumäquivalenten gegenüber Chloridionen kann zum Teil als Carboxylatsalze erklärt werden. Der Rest können Natrium- oder Kaliumsalze sein. Das Schmelzverhalten oder vielmehr das Nichtschmelzverhalten ließ jedoch auf salzähnliche und/oder Zusammensetzungen mit höherem Molekulargewicht schließen. Das Material im gegenwärtigen Reinheitszustand enthält offensichtlich eine unterschiedliche Menge an Kalzium- und Chloridsalzen, wahrscheinlich CaCl&sub2;.
Keine Zubereitung enthielt eine signifikante Stickstoffmenge, wodurch eine Peptidkomponente in ihrer Zusammensetzung ausgeschlossen wird. Ebenso kann das Fehlen von signifikantem Stickstoff die Gegenwart von Aminozuckern und anderen stickstoffhaltigen Materialien wie verschiedenen komplexen Lipiden als Hauptkomponente(n) ausschließen.
Pyrolytische Massenspektren ergaben signifikante Spuren von Fettsäure mit 18 Kohlenstoffen. Diese Tatsache in Verbindung mit den N- und P-Spuren lassen auf die Gegenwart eines komplexen Lipids in dem Faktor schließen.
Die Infrarotspektroskopie zeigte Absorptionen, die mit Methanol- und Caroxylatfunktionen übereinstimmten. Die Ultraviolettspektroskopie, die Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich und die Fluoreszenzspektroskopie zeigten keine signifikante Menge von Chromophoren über jene hinaus, die durch Infrarot angezeigt wurde.
Die chemischen Tests stimmen mit einem oligomeren Kohlenhydrat überein, wobei die Carbonylfunktion (Aldehyd oder Keton) in den Untereinheitenbindungen verknüpft ist. Das oligomere Kohlenhydrat enthält auch eine gewisse Seitenkettenoxidation an Carboxylat.
Die MAIF-Zubereitung ist im wesentlichen, aber nicht vollständig rein.

Beispiel 6

Rattenpfoten-Ödemtest: Orale Verabreichung

Der Rattenpfoten-Carrageentest wurde zur Untersuchung der Wirksamkeit des MAIF als in vivo entzündungshemmendes Mittel verwendet. Dreißig erwachsene weiße Ratten wurden wahllos in drei Gruppen von zehn Ratten pro Gruppe unterteilt. Die Gruppen erhielten in fünf aufeinanderfolgenden täglichen Behandlungen entweder 10 mg Magermilchpulver von hyperimmunisierten Tieren, 10 mg Magermilchpulver von nichtimmunisierten Tieren oder keine Behandlung (nur 20 ml Wasser pro Tag). Die Pulver wurden oral in 20 ml Wasser verabreicht. Am fünften Tag wurden 0,1 ml 1% Carrageen in Kochsalzlösung in die rechte Pfote jeder Ratte injiziert. Von diesem Verfahren ist bekannt, daß es eine akute Entzündung (Ödem) hervorruft. Vierundzwanzig Stunden nach der Injektion wurden die Ratten getötet, die Pfoten amputiert und das Gewicht der linken (Kontrolle) und der rechten (ödematösen) Pfote verglichen. Die Ergebnisse des Tests sind in Tabelle 4 (dargestellt als Gewicht in Gramm) und in Fig. 3 (dargestellt als Prozent des Durchschnittsgewichts von Kontrollpfoten) angeführt. Tabelle 4: Ergebnisse des Rattenpfoten-Ödemtests (Pfotengewicht, g, Mittel ± SEM, n = 10)
Die entzündliche Reaktion auf die Carrageen-Injektion war bei den Ratten, die mit immuner Milch behandelt wurden, im Vergleich zu den Gruppen mit nichtimmuner Milch und Wasser deutlich verringert. Es wurde kein Beweis für Schadwirkungen oder Nebenwirkungen auf die allgemeine Gesundheit der Ratten gefunden. Aus diesen Daten kann geschlossen werden, daß die tägliche Einnahme von Magermilchpulver von hyperimmunisierten Tieren die entzündliche Reaktion, die durch eine Carrageen-Injektion in den Fußballen von Ratten herbeigeführt wurde, nahezu vollständig blockierte.

Beispiel 7

Quantitative Rattenpfoten-Ödemtests

Es wurde eine Reihe von Versuchen an der hyperimmunen Milchfraktion durchgeführt. Die Versuche dienten der Bestätigung der entzündungshemmenden Aktivität von MAIF bei intraperitonealer Verabreichung und zur Erstellung einer Dosiswirkungskurve, Erforschung alternativer Verabreichungsrouten und Untersuchung von Dosierungsschemen, welche die Basis weiterer Untersuchungen bilden könnten.
Peak I von der G-10 Säule, geliefert von Stolle Milk Biologics International, wurde nach den in Patent Nr. 4.956.349 beschriebenen Verfahren hergestellt. Lactose, die von Handelsquellen erhalten wurde, wurde als Placebo verwendet. Aspirin wurde als positive Kontrolle verwendet. Aspirin wurde in Wasser aufgelöst und oral durch Magensonde in dem Verhältnis von 200 mg pro Kilogramm verabreicht, einer Dosis, von der bekannt ist, daß sie in dem Test aktiv ist. Es hatte sich gezeigt, daß eine 2% Lösung von Kappa-Carrageen (Sigma C-1263) die am besten reproduzierbaren Ergebnisse liefert, und daher wurde sie in diesen Versuchen verwendet. Der Fußballentest wurde modifiziert, indem isotopisch markiertes Humanserumalbumin (¹²&sup5;I-HSA) verwendet wurde, das sich in der durch Carrageen herbeigeführten Läsion in direktem Verhältnis zu dem Volumen des Exsudats lokalisiert. Durch Bestimmung der radioaktiven Gesamtmenge im Fußballen und Vergleichen dieser mit den Mengen in einem bekannten Plasmavolumen von dem injizierten Tier wird eine direkte Messung des Ödems in Mikrolitern Plasmaäquivalenten erhalten. ¹²&sup5;I-HSA wurde intravenös mit einer Dosis von 1,0 Mikrocurie pro Ratte injiziert. Es wurden weibliche Dark Agouti Ratten verwendet. Die Ratten waren etwa 12 Wochen alt, wogen zwischen 160 Gramm und 200 Gramm und wurden von der hauseigenen Inzuchtkolonie erhalten.
Zur Durchführung des Carrageen-Fußballentests wurden 0,1 ml 2% Carrageen subkutan in jeden hinteren Fußballen einer anästhesierten Ratte injiziert. Auf diese Injektion folgte sofort eine Injektion von 1,0 Mikrocurie ¹²&sup5;I-HSA in 0,5 ml Kochsalzlösung in die Schwanzvene. Nach vier Stunden wurde jede Ratte gewogen, Blutproben entnommen und die Ratte euthanisiert. Dann wurden beide Hinterfüße entfernt und die Radioaktivitätswerte in jedem Fuß und in dem 200 ul Plasmastandard in einem automatisierten Gammazähler gemessen. Aus diesen Messungen wurde das Ödemvolumen in jedem Fuß berechnet und in Mikrolitern ausgedrückt.

Versuch 1: Intraperitoneale Dosiswirkung

Fig. 4 zeigt die Wirkung der intraperitonealen Verabreichung von MAIF im Vergleich zu Lactose (KON), Aspirin und keiner Behandlung (KEINE BEH.) Alle Behandlungen (Lactose, Aspirin, MAIF) erfolgten 30 Minuten vor der Carrageen-Inj ektion.
Die Carrageen-Injektion ergab ein Ödem von durchschnittlich 250 ul (keine Beh.). Das Ödem wurde durch Aspirin und alle Dosierungen von MAIF gehemmt, nicht jedoch durch Lactose. Die intraperitoneale MAIF-Dosiswirkungskurve, die durch Darstellen der Daten als Prozent des durchschnittlichen Kontrollödems (keine Behandlung) erstellt wurde, ist in Fig. 5 gezeigt.

Versuch 2: Wirkungen verschiedener MAIF-Verabreichungsrouten

Fig. 6 zeigt die Auswirkung auf Fußballenödeme der oralen (ORAL), intramuskulären (IM), subkutanen (SUBK) und intravenösen (IV) Verabreichung von Lactose und MAIF. Ebenso dargestellt ist eine positive Kontrolle (Aspirin) und eine unbehandelte Kontrolle (KEINE BEH.).
Die Zubereitungen wurden vor der Carrageen-Belastung nach dem folgenden Schema verabreicht: Aspirin: oral, 30 Minuten davor; MAIF, subkutan: 1 Stunde davor; MAIF, oral: 24, 16 und 1 Stunde davor; MAIF, intramuskulär: 30 Minuten davor; MAIF, intravenös: zum Zeitpunkt der Belastung (Isotop wurde auch injiziert). Die Ergebnisse zeigen, daß in Prozent des durchschnittlichen Kontrollödems in jedem einzelnen Test ausgedrückt, MAIF die Ödembildung über alle Verabreichungsrouten hemmt. Vierzig Milligramm MAIF, intravenös verabreicht, beseitigten nahezu vollständig die entzündliche Reaktion auf Carrageen. Diese Ergebnisse zeigen die entzündungshemmende Aktivität von MAIF und lassen angesichts der Ergebnisse des oben angeführten Beispiels 1 schließen, daß die Reihenfolge der Wirksamkeit für verschiedene Routen von MAIF IV > IP > IM > SUBK > ORAL ist.

Versuch 3: Wirkung der intravenösen und erweiterten oralen Verabreichung auf Ödeme: Dosiswirkung

Fig. 7 zeigt die Wirkungen der IV und oralen MAIF-Verabreichung auf Fußballenödeme bei Ratten. Die orale MAIF-Behandlung (40 mg pro Ratte pro Tag) wurde täglich sechs Tage und auch eine Stunde vor der Carrageen-Belastung (PO) verabreicht. Die intravenösen Behandlungen (5, 10, 20 mg) wurden zum Zeitpunkt der Carrageen-Belastung (IV) verabreicht. Ebenso dargestellt sind eine positive Kontrolle (Aspirin) und eine negative Kontrolle (keine Behandlung).
Die in Fig. 7 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß alle drei MAIF-Dosierungen zu einer entzündungshemmenden Aktivität führen, welche sogar die Aktivität von Aspirin in dem Test übersteigt, während die erweiterte orale Verabreichung zu einer markanten aber begrenzten Aktivität führt.
Die Studie wurde daher erweitert, um die Wirkungen weiter verringerter, intravenöser MAIF-Dosierungen zu untersuchen. Die intravenösen Dosierungen von Lactose-Placebo waren als Kontrolle mit eingeschlossen. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Fig. 8 dargestellt. Intravenöse Dosierungen von 2,5 mg und 1 mg MAIF (IV) führten zu einer entzündungshemmenden Aktivität im Bereich der Aktivität, die durch Aspirin herbeigeführt wird. 10 ml intravenöses Lactose-Placebo (10 mg PLAC IV) führten zu keiner Aktivität in diesem Bereich.
Eine intravenöse Dosiswirkungskurve wurde durch Kombinieren der Ergebnisse von Versuch 2 und 3 und Darstellen dieser Ergebnisse als Prozent durchschnittliches Kontrollödem (keine Behandlung) in jedem einzelnen Test erstellt. Die Kurve ist in Fig. 9 dargestellt.
Die Schlüsse, die aus den quantitativen Rattenpfoten-Ödemtests gezogen werden können, sind folgende: die Milchfraktion Peak I von der G-10 Säule, die wie in Patent Nr. 4.956.349 beschrieben extrahiert und gereinigt wurde, zeigt durchweg eine entzündungshemmende Aktivität bei einer Testung im Rattenpfoten-Ödemmodell. Eine Dosierung von 4 mg MAIF pro Ratte, die zum Zeitpunkt der Carrageen-Injektion intravenös verabreicht wird, reicht aus, um Ödeme drastisch zu hemmen, und wurde daher als Standard gewählt, gegen den andere Zubereitungen in weiteren Versuchen verglichen werden sollten.

Beispiel 8

Entzündungshemmende Eigenschaften von Zubereitungen von hyperimmuner Milch, die von identischen Zwillingskühen erhalten wurde

Die Wirkung einer Impfung auf die entzündungshemmende Aktivität von Milch wurde durch Testen der biologischen Aktivität verschiedener Milchfraktionen untersucht, die von identischen Zwillingskühen erhalten wurden. Auf der Basis der Extraktionsverfahren, die in Patent Nr. 4.956.349 beschrieben sind, wurde ein Extraktionsschema unter Verwendung einer Ultrafiltration entwickelt. Die Verarbeitungssequenz war wie folgt:
Milchproben wurden von immunisierten Zwillingskühen, nichtimmunisierten Kontroll-Zwillingskühen und rekonstituiertem Magermilchpulver, das zuvor von immunisierten Kühen hergestellt worden war, erhalten. Die Versuchsgruppe bestand aus 45 Paaren identischer Zwillingskühe. Eine Kuh jedes Zwillingspaares wurde zweiwöchentlich mit Stolle S100 gemischtem Bakterin (in Patent Nr. 4.956.349 beschrieben) geimpft. Die biologische Aktivität der verschiedenen Fraktionen wurde durch intravenöse Injektion unter Anwendung des Ratenfußballen-Carrageentests untersucht, der zuvor beschrieben wurde.
Die zu untersuchenden Hypothese waren, daß (a) eine Hyperimmunisierung für die zuvor beschriebene entzündungshemmende Aktivität verantwortlich sei. (b) MAIF im kommerziellen Maßstab durch Ultrafiltration extrahiert werden könnte und (c) die Verdünnung des Permeats eine Aggregation des entzündungshemmenden Faktors hervorriefe, wodurch dieser von dem 30.000 Molekulargewicht-Ultrafiltrationsmembran zurückgehalten wird.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse eines Zwillingsherden-Ultrafiltrationsversuchs, der zur Testung der biologischen Aktivität verschiedener Fraktionen bestimmt war, die aus der Milch nichtgeimpfter Kontrollzwillinge und aus rekonstituiertem Milchpulver von immunisierten Kühen hergestellt worden waren. Die Fraktionen, die getestet wurden, waren folgende: Peak I, G-10 Säule-Zubereitung, 4 ml (OHIO MAIF STD); R&sub2; Endretentat von nichtgeimpften Zwillingen (KONTROLLZWILLING R&sub2;); P&sub2; Endpermeat von dem rekonstituierten Milchpulver (REKON S 100 P&sub2;); dialysiertes R&sub2; Endretentat von nichtgeimpften Zwillingen (KON DIALYSIERT R&sub2;); dialysiertes Endretentat von dem rekonstituierten Milchpulver (S 100 DIALYSIERT R&sub2;).
Selbst nach der Dialyse konnte keine entzündungshemmende Aktivität in der R&sub2;-Endretentatfraktion entdeckt werden, die von nichtimmunisierten Kühen hergestellt worden war. Keine entzündungshemmende Aktivität wurde in der Endpermeat R&sub2;-Fraktion entdeckt, die aus dem rekonstituierten Milchpulver hergestellt worden war. Die rekonstituierte Milchpulverretentat R&sub2;-Fraktion wies nach der Dialyse eine entzündungshemmende Aktivität im Bereich der Aktivität des MAIF-Standards auf.
Fig. 11 zeigt die Ergebnisse der Zwillingsherde-Ultrafiltrationsversuche, die zur Testung der biologischen Aktivität verschiedener Milchfraktionen dienten, die aus geimpften und nicht geimpften Zwillingskühen und aus dem rekonstituierten Milchpulver immunisierter Kühe erhalten worden waren. Die Fraktionen, die getestet wurden, waren folgende: Peak I, G-10 Säule-Zubereitung, 4 ml (OHIO MAIF STD); dialysiertes Endretentat R&sub2; von nichtgeimpften Zwillingen (KON DIALYSIERT R&sub2;); Endretentat R&sub2; von dem rekonstituierten Milchpulver (REKON S100 R&sub2;); das Endretentat R&sub1; von geimpften Zwillingen (IMMUN ZWILLING R&sub2;); erstes Retentat R&sub1; von dem rekonstituierten Milchpulver, verdünnt für: 1 (S100 VERDÜNNT R&sub1;).
Es wurde eine geringe entzündungshemmende Aktivität in dem dialysierten Retentat R&sub2; von nichtgeimpften Kontrollzwillingen oder in dem nichtdialysierten Retentat R&sub2; von den geimpften Zwillingen nachgewiesen. Eine gewisse Aktivität ist durch ein Streudiagramm nachweisbar. Das R&sub2; Retentat, das ohne Dialyse aus rekonstituiertem Stolle-Milchpulver von immunisierten Kühen hergestellt wurde, war stark entzündungshemmend. Die Zubereitung jedoch, die durch Verdünnung der rekonstituierten Milch vor der Ultrafiltration und nicht durch Verdünnung der aus der Milch hergestellten Molke hergestellt wurde, war nur geringfügig aktiv. Das Ergebnis zeigt, daß die entzündungshemmende Aktivität effizienter aus der Molkefraktion extrahiert wird.
Fig. 12 zeigt die Ergebnisse von Zwillingsherden-Ultrafiltrationsversuchen, die zur Testung der biologischen Aktivität eines dialysierten Retentats von geimpften Zwillingskühen bestimmt waren. Die getesteten Fraktionen waren folgende: Peak I, G-10 Säule-Zubereitung (OHIO MAIF STD); dialysiertes Endretentat R&sub2; von geimpften Zwillingen (IMM DIALYSIERT R&sub2;); dialysiertes Endretentat von der G-10 Zubereitung (DIALYSIERTER OHIO MAIF). Die Ergebnisse zeigen, daß entzündungshemmende Aktivität in der R&sub2;-Fraktion von den immunisierten Zwillingen nach der Dialyse vorhanden war. Der dialysierte MAIF war in dem Test aktiver als der nichtdialysierte MAIF Standard. Dieses Ergebnis legt nahe, daß die Dialyse ein wirksames Mittel zur weiteren Konzentrierung des Milchfaktors ist, der für die entzündungshemmende Aktivität verantwortlich ist.
Die in den obengenannten Fig. 10-12 dargestellten Ergebnisse bekräftigen die anschließenden Schlußfolgerungen: (1) entzündungshemmende Aktivität kann von rekonstituierter Milch von immunisierten Kühen durch Ultrafiltration des verdünnten Permeats extrahiert werden. (2) Die entzündungshemmende Aktivität wurde in den vorangehenden Zubereitungen nicht nachgewiesen, die aus der Milch von nichtimmunisierten Kühen hergestellt worden waren. (3) Die entzündungshemmende Aktivität wurde in dem Endretentat R&sub2; nach der Ultrafiltration des verdünnten Permeats nachgewiesen, das von der Milch immunisierter Kühe hergestellt worden war, aber es war eine Dialyse erforderlich, um die Aktivität nachzuweisen.

Beispiel 9

Stabilität von MAIF. Erwärmung und Proteinasebehandlung von MAIF

Der vorangehende Beweis, daß der entzündungshemmende Milchfaktor chemisch nicht ein Protein oder ein Peptid ist, beruhte weitgehend auf der chemischen Analyse, die durchweg ein nahezu vollständiges Fehlen von Stickstoff zeigte. Zur weiteren Charakterisierung von MAIF wurden mehrere Zubereitungen in dem Rattenpfoten-Ödemtest getestet, wobei 4 mg Peak I, G-10 Säule-Zubereitung intravenös als Standard verwendet wurden. Es wurden die folgenden MAIF-Behandlungen durchgeführt: Proteinase- (Pronase-) Behandlung über sechs Stunden; sechs Stunden ohne Proteinase-Behandlung, Kontrolle; unbehandelte positive Kontrolle; Erwärmen bei 100ºC über 30 Minuten.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 13 dargestellt. Die aus dieser Studie gezogenen Schlüsse waren, daß die entzündungshemmende Aktivität nicht auf ein Protein oder Peptid zurückzuführen ist und daß der MAIF durch Kochen nicht inaktiviert wird. Die Wirksamkeit der Pronase-Behandlung wurde durch die Erkenntnis bestätigt, daß eine parallele Pronase-Behandlung das Milchprotein vollständig denaturierte.

Beispiel 10

Entzündungshemmende Aktivität von weiter gereinigtem MAIF und Molkeproteinkonzentrat von immunisierten Kühen

Das Retentat und Permeat von der Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon YM5 Membran wurde unter Anwendung einer intravenösen Verabreichung im Rattenpfoten-Ödemtest auf biologische Aktivität untersucht. In diesem Verfahren wurde der MAIF von Peak I der G-10 Säule, hergestellt nach Patent Nr. 4.956.349, weiter durch Ultrafiltration auf einer Amicon YM5 Membran gereinigt. Diese Membran hält Moleküle mit einem Molekulargewicht von 5.000 oder mehr zurück. Es wurden auch Molkeproteinkonzentrate (MPK) aus Milch von immunisierten Tieren zubereitet und durch die YM5 Membran filtriert. Die folgenden Proben wurden in dem Test unter Verwendung von 4 mg Peak I, G-10 Säule-Zubereitung, intravenös, als Standard getestet: Permeat von der Amicon YM5 Ultrafiltration; Retentat von der Amicon YM5 Ultrafiltration; MPK von immunisierten Kühen, 30 mg pro Ratte; MPK aus kommerzieller Produktion (nichtimmunisierte Kühe), 30 mg pro Ratte.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 14 dargestellt. Aus diesen Ergebnissen geht eindeutig hervor, daß die gesamte Aktivität im Retentat ist, das etwa 0,5% des Gesamtgewichts der Fraktion ausmachte, die auf den YM5-Filter aufgebracht wurde. Die Verringerung des Ödems, die in diesem Versuch beobachtet wurde, wurde nach Verabreichung von 20-25 Mikrogramm Material erreicht.
Hinsichtlich der Aktivität von MPK zeigte MPK von hyperimmunisierten Tieren wie erwartet eindeutig eine entzündungshemmende Aktivität.
Interessanterweise zeigte auch MPK von nichtimmunisierten Tieren eine entzündungshemmende Aktivität. Das Vorhandensein einer entzündungshemmenden Aktivität in der Milch von nichtimmunisierten Kühen ist nicht überraschend, da es eine natürliche Substanz sein muß. Ihr Nachweis ist ein Zeichen für die Empfindlichkeit des biologischen Tests.

Beispiel 11

Kontinuierliche Überprüfung von durch Carrageen herbeigeführtem Fußballenödemen

Es wurde festgestellt, daß 4 mg MAIF, intravenös zum Zeitpunkt der Carrageen-Injektion verabreicht, die Ansammlung von Ödemen im Fußballen um 40% bis 50% verringerte. Obwohl diese Ergebnisse den Beweis lieferten, daß das Material einen entzündungshemmenden Teil enthielt, gab es nur einen schwachen Hinweis auf die Wirkungsstelle oder das pharmakologische Profil des MAIF. Um derartige Daten zu erhalten, mußte ein Verfahren entwickelt werden, das die kontinuierliche Überprüfung der Fußballenödeme während der Reaktion auf Carrageen ermöglichte. Dies wurde erreicht, indem der Rattenfuß in einen abmontierten Gammastrahlungsdetektor gehalten wurde. Das Verfahren verlangte, daß die Tiere bis zu vier Stunden anästhesiert wurden, und da bekannt ist, daß Anästhetika die entzündliche Reaktion unterdrücken, mußte zunächst die Wirkung der Anästhetika auf die durch Carrageen herbeigeführten Ödeme bestimmt werden. Fünf Mittel, die allgemein zur Anästhesierung von Ratten verwendet werden, wurden daher bewertet; diese Waren Ether, Chloralhydrat, Innovar-vet, Nembutal und Urethan. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 dargestellt.
Aus diesen Ergebnissen geht eindeutig hervor, daß Ether das Anästhetikum der Wahl ist, wenn die entzündliche Reaktion durch diese Technik bewertet werden soll. Die Form der Kurve, die bei Verwendung von Ether erhalten wurde, zeigt eine Zweiphasen-Reaktion. Zur genaueren Abgrenzung der Reaktion wurde ein weiterer Versuch ausgeführt, wobei das Ödemvolumen an 12 Zeitpunkten in einer fünfstündigen Periode gemessen wurde. Die Ergebnisse bestätigten eine Zweiphasen-Reaktion. Die frühe Reaktion trat zwischen 0 und 1 Stunde nach der Belastung auf und die Reaktion der späten Phase zwischen 1,5 und 2 Stunden (Fig. 16).
Die beiden Phasen, die auch von anderen Forschern beobachtet wurden, erhielten die Bezeichnung nicht phagozytische entzündliche Reaktion (NPER) bzw. phagozytische entzündliche Reaktion (PER).
Die NPER beginnt, als Reaktion auf eine Verletzung, durch lösliche Vermittler wie Histamin und Bradikynin, während die PER von der Beteiligung von Neutrophilen abhängt. Das Protokoll war daher die Verabreichung von MAIF und die kontinuierliche Überprüfung der Ansammlung von Ödemen zur Bestimmung, ob die entzündungshemmenden Eigenschaften des Mittels sich aus einer Wirkung auf die frühe nicht zelluläre (NPER) oder die späte zelluläre (PER) Phase ergaben. 5 mg oder 40 mg MAIF/Ratte wurden intravenös zum Zeitpunkt der Carrageen-Belastung verabreicht, und die Ansammlung von Ödemen wurde in regelmäßigen Abständen über eine vierstündige Periode überprüft. Keine Dosis beeinflußte die Ansammlung von Ödemen in einer der Phasen (Fig. 17).
Das Ergebnis war überraschend, da viele frühere Analysen, in welchen die Wirkung von MAIF auf durch Carrageen hervorgerufene Ödeme 4 Stunden nach der Belastung bestimmt wurde, eine deutliche entzündungshemmende Aktivität in der Fraktion nachgewiesen haben. Es war daher wahrscheinlich, daß die anhaltende Ethereinwirkung die aktive entzündungshemmende Komponente von MAIF in vivo unterdrückte oder inaktivierte.
Frühere Studien zeigten, daß eine kurzfristige Etherbelastung die Aktivität von MAIF nicht beeinträchtigte. Daher wurde ein Versuch durchgeführt, in dem die Wirkung von MAIF auf eine progressive Ödemansammlung nur an vier Zeitpunkten bestimmt wurde, bei 0, 1, 3 und 4 Stunden, wodurch die Etherbelastung der Tiere begrenzt wurde. Der Zeitpunkt von 1 Stunde wurde gewählt, um die Wirkung auf die frühe, nicht phagozytische entzündliche Reaktion zu bewerten, während die Messungen bei 3 und 4 Stunden gewählt wurden, um die Wirkung auf die spätere phagozytische entzündliche Reaktion zu quantifizieren. In diesem Versuch führte MAIF, der mit 40 mg verabreicht wurde, zu einer Verringerung in der Ansammlung von Ödemen während der zweiten, durch phagozytvermittelten Phase, hatte aber keine signifikante Auswirkung auf die erste, durch den löslichen Vermittler angetriebene Phase (Fig. 18).
Aus dieser Versuchsreihe können die folgenden Schlüsse gezogen werden:
1. Ether ist das bevorzugte Anästhetikum zur Verwendung in Versuchen, in welchen die Entzündungsreaktion auf Carrageen kontinuierlich überprüft werden soll.
2. Eine kontinuierliche Etheranästhesie hemmt die in vivo entzündungshemmende Aktivität von MAIF im Carrageen-Fußballentest.
3. MAIF verbessert die Entzündung durch Hemmung der späten phagozytvermittelten Phase der entzündlichen Reaktion auf Carrageen.

Beispiel 12

Zeitverlauf der Wirkung von MAIF auf durch Carrageen hervorgerufene Fußballenödeme

Es wurde eine weitere Versuchsreihe durchgeführt, wobei das Mittel zu gewählten Zeitpunkten vor oder nach der Carrageen-Injektion und nicht zum Zeitpunkt der Belastung verabreicht wurde. Zweck der Studie war, Information zu erhalten über
(a) den effektivsten Zeitpunkt der Verabreichung von MAIF im Verhältnis zu dem Entzündungsstimulus.
(b) die biologische Halbwertszeit des entzündungshemmenden Teils.
(c) die Punkte in der Entwicklung der entzündlichen Reaktion, die von MAIF beeinflußt werden.
Die Studie wurde in drei Teilen ausgeführt. MAIF wurde intravenös mit einer Dosis von 4 mg/Ratte an einem von 11 Zeitpunkten im Bereich von 150 Minuten vor bis 150 Minuten nach der Carrageen-Injektion verabreicht. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Fig. 19 und Tabelle S dargestellt. Tabelle 5
Eine signifikante Hemmung von Ödemen wurden zu allen untersuchten Zeitpunkten beobachtet: der Grad der Hemmung jedoch war an den äußeren Extremwerten (± 150 min.) geringer. Eine interessante zyklische Reaktion auf die MAIF-Verabreichung wurde bei jenen Gruppen beobachtet, die näher bei dem Zeitpunkt der Belastung behandelt wurden. Die Tatsache, daß MAIF wirksamer war, wenn er 30 Minuten nach der Belastung verabreicht wurde, als wenn er 15 Minuten nach der Belastung verabreicht wurde, bestätigt die Meinung, daß die zweite phagozytvermittelte Phase der Reaktion von dem Mittel gehemmt wird. MAIF hemmte die Reaktion auf Carrageen stark, wenn er 15 Minuten vor oder zum Zeitpunkt der Belastung verabreicht wurde. Es ist ferner offensichtlich, daß das Mittel eine verhältnismäßig lange Halbwertszeit in dem Serum (1-2 h) aufweist und daß seine Wirksamkeit mit dem Zeitpunkt der Belastung und der dynamischen Natur der entzündlichen Reaktion zusammenhängt.
Es wird daher vermutet, daß die entzündungshemmende Wirkung auf eine Wirkung auf Entzündungszellen, wahrscheinlich die Neutrophilen, zurückzuführen ist.

Beispiel 13

Wirkung von MAIF auf die reverse passive Arthus-Reaktion Die Möglichkeit, daß MAIF die Beteiligung von Neutrophilen beeinflussen könnte, wurde untersucht, indem die Fähigkeit des Materials bewertet wurde, die reverse, passive Arthus-Reaktion (RPA) zu verändern. Diese Immunkomplex-induzierte Reaktion ist vorwiegend neutrophilvermittelt, und Mittel, welche die Entwicklung der Reaktion beeinflussen, tun dies über eine Wirkung auf diese Zellen. Zur Herbeiführung der RPA wurde Ratten intradermal Kaninchen-Antikörper gegen Ovalbumin und intravenös natives Ovalbumin injiziert. Ovalbumin/Ovalbumin-Antikörper-Immunkomplexe bilden sich in und um die dermalen Blutgefäßwände, Wirt-Neutrophile binden an den Fc-Teil des Antikörpers und eine starke entzündliche Reaktion wird ausgelöst. Es sollte festgehalten werden, daß die Reaktion zwar durch Immunkomplexe ausgelöst wird, aber unabhängig vom Immunsystem des Wirts stattfindet.
Drei Parameter werden zur Quantifizierung der RPA verwendet. Diese sind (1) Ödeme - gemessen unter Verwendung der Ansammlung von ¹²&sup5;I-HSA, (2) Blutung - bewertet durch in vivo Vormarkierung von RBZ mit &sup5;&sup9;Fe und (3) Ansammlung von Neutrophilen - gemessen durch Bestimmen der Gewebswerte des spezifischen Enzyms der Neutrophile, Myeloperoxidase (MPO). Diese Tests sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.
Achtzehn Ratten wurden in drei Gruppen von sechs unterteilt. Ratten-Anti-Ovalbumin (40 ul) wurde intradermal an vier Stellen am Rücken jedes Tieres injiziert, und 2 mg Ovalbumin wurden unmittelbar danach intravenös injiziert. Eine Gruppe der Tiere erhielt keine andere Behandlung und diente als Kontrolle. Der zweiten Gruppe wurden 20 mg einer Lactose-Zubereitung intravenös injiziert, während der letzten Gruppe 20 mg MAIF intravenös injiziert wurden. Sowohl Lactose als auch MAIF wurden mit dem Ovalbumin verabreicht. Die Schwere der Reaktion wurde 3,5 Stunden nach der Belastung bewertet. Bei einer intravenösen Verabreichung des MAIF mit einer Dosis von 20 mg/Ratte vor der Auslösung der RPA-Reaktion gab es eine äußerst signifikante Hemmung der drei Parameter, die zur Messung der Reaktion verwendet wurden (Tabelle 6, Fig. 20). Das Lactose-Kontrollmaterial verursache auch eine geringfügige und kaum signifikante Unterdrückung der Neutrophilenansammlung und Blutung. Dies zeigt, daß in normaler Milch eine geringe Menge an entzündungshemmender Aktivität vorhanden ist. Tabelle 6
* = p < 0,0,01
** = 0 p < 0,05
Da Neutrophile die primären Vermittler der RPA sind, lieferten diese Ergebnisse einen zusätzlichen Beweis, daß MAIF imstande ist, die entzündliche Reaktion über eine Wirkung auf die Neutrophilfunktion zu hemmen.

Beispiel 14

Wirkung von MAIF auf die Neutrophilenmigration aus dem Gefäßsystem

Zur wirksamen Teilnahme an einer entzündlichen Reaktion müssen Neutrophile zunächst aus dem Gefäßsystem zu der Entzündungsstelle wandern. Zur Bestimmung, ob MAIF die Neutrophilenmigration stört, wurde ein Entzündungsmodell angewandt, bei dem eine subkutane Implantation steriler Polyurethanschwämme verwendet wird. Die Schwämme werden in Zeitabständen nach der Implantation entfernt, und durch Wiegen der Schwämme und Extrahieren und Zählen der Zellen in dem Infiltrat können sowohl die flüssige als auch zelluläre Phase der Reaktion quantifiziert werden. Vierundzwanzig Stunden nach der Implantation sind > 95% der Zellen, die in dem Schwamm vorgefunden werden, Neutrophile.
Es wurden zwei Versuche ausgeführt. Im ersten wurden Tiere mit 5, 10, 20 oder 40 mg MAIF zum Zeitpunkt der Schwammimplantation behandelt. Die Schwämme wurden 24 Stunden nach der Implantation entfernt. Jede Gruppe bestand aus 5 bis 8 Ratten, und zwei Schwämme wurden in jedes Tier implantiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 21 dargestellt.
20 oder 40 mg MAIF, die zum Zeitpunkt der Schwammimplantation intravenös verabreicht wurden, hatten eine deutliche Wirkung auf die Migrationsfähigkeit von Entzündungszellen. Eine weniger deutliche, aber gleich signifikante Hemmung der Fluidansammlung wurde ebenso beobachtet. Die zwei geringeren MAIF-Dosen hatten keine nachweisbare Auswirkung in diesem Entzündungsmodell.
Es wurde ein zweiter Versuch ausgeführt, der das zeitliche Verhältnis zwischen der entzündlichen Belastung (Schwammimplantation) und der MAIF-Verabreichung abgrenzen sollte. In dieser Studie wurden 20 mg MAIF intravenös 30, 60 oder 120 Minuten nach der Schwammimplantation verabreicht. Eine vierte Gruppe, eine Kontrollgruppe, blieb unbehandelt. In jeder Gruppe befanden sich fünf Tiere. Jedem Tier wurden zwei Schwämme implantiert und nach 24 Stunden entfernt. Die Ergebnisse sind in Fig. 22 dargestellt. In dieser Graphik sind Ergebnisse enthalten, die von einer Versuchsgruppe von Ratten erhalten wurden, die 20 mg MAIF zum Zeitpunkt der Implantation erhalten hatten (siehe Fig. 21).
Die Ergebnisse des Zeitverlaufs der MAIF-Wirkung auf die durch Carrageen hervorgerufenen Fußballenödeme zeigen, daß der MAIF verhältnismäßig unwirksam ist, wenn er 60 Minuten nach der Belastung oder später verabreicht wird. Es muß festgehalten werden, daß 20 mg MAIF zwar zur Unterdrückung der Entzündung notwendig sind, die mit der Schwammimplantation zusammenhängt, aber 4 mg zur Hemmung des durch Carrageen hervorgerufenen Ödems ausreichen. Ohne sich auf diese Interpretation festlegen zu wollen, kann diese Ungleichheit mit den unterschiedlichen Auslösungsgraden zusammenhängen, die dem Wirt durch die beiden Reize geboten werden. Das Schwammimplantat ist ein verhältnismäßig milder Reiz, der eine langsame entzündliche Reaktion auslöst, und der größte Teil der Zellen sammelt sich zwischen 8 und 16 Stunden nach der Implantation an (Fig. 23). Andererseits ist die subkutane Injektion von Carrageen ein sehr starker Reiz, der eine entsprechend starke Reaktion in einer verhältnismäßig kurzen Zeit auslöst (Fig. 16).

Beispiel 15

Wirkung von MAIF auf zirkulierende Leukozyten

Mehrere pharmakologische Mittel können die Neutrophilenmigration hemmen. Während einige, wie Cyclophosphamid, zytoreduktiv sind und durch Hemmung der Hämatopoese im Knochenmark wirken, haben andere Mittel wie Steroide und die nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneimittel bestimmte Wirkungsstellen und führen nicht zur Leukozytose. Es war daher wichtig, die Wirkung von MAIF auf die Anzahl und das Verhältnis zirkulierender weißer Blutzellen zu bestimmen.
Es wurden zwei Versuche durchgeführt. Im ersten wurde MAIF intravenös mit einer Dosis von 40 mg/Ratte an eine Gruppe von 6 Tieren verabreicht und einer Kontrollgruppe Kochsalzlösung injiziert. Blutproben wurden an der Basislinie, 1, 4 und 24 Stunden nach der Behandlung entnommen. Die Ergebnisse sind in Fig. 24 zusammengefaßt.
Die MAIF-Verabreichung führe zu einer Erhöhung der Anzahl zirkulierender Neutrophile, mit einem Maximum bei 4 Stunden, und einer entsprechenden Abnahme in der Anzahl peripherer Blutlymphozyten. Eine weitere Dosiswirkungsstudie wurde durchgeführt, wobei einer Gruppe von Ratten Kochsalzlösung, 5, 10 oder 20 mg MAIF intravenös injiziert wurde. Von jeder Ratte war 7 Tage zuvor zur Erstellung der Basislinienwerte Blut entnommen worden und wurde wieder 4 Stunden nach der MAIF-Injektion entnommen. Die Ergebnisse sind in Fig. 25 dargestellt. In der Graphik enthalten sind die Ergebnisse, die von der Probe erhalten wurden, die 4 Stunden nach der Verabreichung von 40 mg MAIF entnommen wurde (siehe Fig. 24).
Alle MAIF-Dosen führten zur einer Erhöhung der Anzahl zirkulierender Neutrophile und einer Verringerung der Anzahl von Lymphozyten. Während die Wirkung auf Lymphozyten linear mit der Dosis zusammenhing, wies die Erhöhung der Neutrophilenzahl die Form einer Kurve auf, wobei die größte Wirkung bei jenen Tieren beobachtet wurde, die 10 mg erhielten.
Diese Ergebnisse bestätigen die Auffassung, daß MAIF die Entzündung verändert, indem er die Adhäsion der Neutrophilen an Endothelzellen beeinflußt. Es wurden auch Daten in bezug auf die Wirkung von drei anderen, zellgerichteten, entzündungshemmenden/immunmodulierenden Mitteln auf zirkulierende Leukozyten in der Ratte erhalten. Das steroidale Arzneimittel Methylprednisolon bewirkt eine Veränderung in dem Lymphozyten/Neutrophilen- Verhältnis analog zu jener, die beim MAIF beobachtet wird. Das zeitliche Verhältnis zwischen der Arzneimittelverabreichung und der Wirkung ist etwas anders. Das abstoßungshemmende/entzündungshemmende Mittel Cyclosporin A bewirkt auch eine Erhöhung der Anzahl zirkulierender Neutrophile, aber die Anzahl von Lymphozyten wird abhängig von der Dosis entweder erhöht oder nicht beeinflußt. Im Gegensatz dazu verarmt das zytotoxische Arzneimittel Cyclophosphamid sowohl die zirkulierenden Lymphozyten als auch die Neutrophilen. Die Wirkungen von MAIF schienen annähernd gleich der Wirkung von Methylprednisolon zu sein.

Beispiel 16

Unterdrückung einer infektionsbedingten Entzündung durch MAIF

Es wurden Versuche zur Bestimmung durchgeführt, ob Änderungen in Serumwerten von Akutphasenreaktanten (APR) zur Quantifizierung der entzündungshemmenden Aktivität von MAIF verwendet werden könnten. Die ARP sind eine Gruppe von Proteinen, die als Reaktion auf einen Entzündungsreiz synthetisiert werden. Von diesen ist Alpha 2 Makroglobulin sowohl beim Menschen als auch bei Ratten vorhanden, und eine Methodologie zur Messung dieser Entzündungskomponente ist verfügbar. Zwei intravenöse Injektionen von MAIF (0 und 24 Stunden) verringerten nicht die Höchstreaktion (48 Stunden) von Alpha 2 Makroglobulin. Dieses Ergebnis zeigt, daß MAIF die späte entzündliche Reaktion nicht beeinflußt.

Beispiel 17

In vitro und in vivo Bewertung des von Milch abgeleiteten entzündungshemmenden Faktors (Rindermamma-Makrophagentest, Infektionsmodelle bei Mäusen)

Die Inkubation von Rindermamma-Makrophagen mit der hyperimmunen Milchfraktion (MAIF) verstärkt das Ausmaß der Phagozytose nicht deutlich, erhöhte aber die Fähigkeit von Makrophagen, phagozytosiertes Staphylococcus aureus zu töten. Mäuse, welchen 10 mg MAIF pro Kilogramm intraperitoneal injiziert wurden, zeigten eine erhöhte Resistenz gegenüber einer intraperitonealen Belastung mit letalem Staphylococcus aureus.
In einem intramammären Staphylococcus aureus mastitis-Belastungsmodell zeigten Mäuse mit MAIF-Injektion auch eine deutlich geringere mammäre Entzündung und Rückbildung und eine erhöhte Eliminierung des infektiösen Organismus. Eine quantitative histologische Analyse des Brustgewebes von MAIF-behandelten Mäusen zeigte signifikant mehr Lumen, weniger interalveoläres Bindegewebe und eine geringere leukozytische Infiltration im Vergleich zu Kontrollmäusen. Brustdrüsen behandelter Mäuse enthielten auch weniger koloniebildende Einheiten als Kontrollmäuse. MAIF scheint seine Wirkung auf das unspezifische Abwehrsystem durch eine Veränderung der Leukozytenfunktion auszuüben.

Beispiel 18

Wirkung von MAIF auf die Pathogenese einer Versuchsinfektion

Die häufigsten Entzündungserreger, die beim Menschen vorgefunden werden, sind mikrobiell, und es ist wichtig, die Wirkung jedes Mittels zu bestimmen, welches die Infektionsabwehr des Wirtes verändert. Der Gewebeschaden, der viele infektiöse Krankheiten begleitet, wird eher durch die Infektionsabwehr des Wirts verursacht als durch den eindringenden Organismus. Während die Fähigkeit, die entzündliche Reaktion auf eine Infektion zu verändern, eine nützliche klinische Technik sein könnte, muß anerkannt werden, daß die Hemmung der Wirtsreaktion während der Infektion von Nachteil sein kann. Dies gilt insbesondere im Falle einer Hemmung · der Neutrophilen. Studien mit Mitteln, welche die Teilnahme von Neutrophilen an den frühen Stufen der Infektion zurückhalten, haben gezeigt, daß die Entzündung und der Gewebeschaden zunächst zwar unterdrückt werden, aber die auftretende größere Bakterienbelastung infolge der verringerten zellulären Reaktion möglicherweise zu einer Verstärkung des Gewebeschadens führt. Daher ist es wichtig, das Potential von MAIF, die Infektion zu verändern, zu bestimmen, um (1) festzustellen, ob das Mittel einen infektionsbedingten Gewebeschaden verringern kann, und (2) zu beurteilen, ob jede beobachtete Unterdrückung der Wirtsreaktion von einer Zunahme der Schwere der Infektion begleitet ist.
Die Wirkung von MAIF auf die Ödembildung nach der intradermalen Injektion von E. coli 075 wurde bestimmt. Es wurden zwei Gruppen von 8 Tieren verwendet. Eine Gruppe war unbehandelt und diente als Kontrolle, während die Probanden in der zweiten Gruppe 40 mg MAIF in 0,5 ml Kochsalzlösung intravenös injiziert bekamen. Unmittelbar nach der MAIF-Verabreichung wurden 100 ul einer Übernacht-Kultur von E. coli 075 an zwei Hautstellen auf dem rasierten Rücken der Ratte intradermal injiziert, worauf die intradermale Injektion von 100 ul Kochsalzlösung an zwei wieteren Seiten folgte. Um eine Schätzung des Ödemvolumens in der infizierten Haut zu ermöglichen, wurden 0,1 uCi 236I-HSA zum Zeitpunkt der Belastung intravenös injiziert. Sechs Stunden später wurden die Tiere anästhesiert, eine Blutprobe entnommen, die Haut am Rücken entfernt und die infizierte und mit Kochsalz injizierten Stellen herausgestanzt. Das Ödemvolumen wurde wie beschrieben berechnet, indem die Gewebezählungen den Plasmazählungen zugeordnet wurden. Zum Erhalten des Ödemvolumens, das sich infolge der Gegenwart von E. coli ansammelt, wurde das Ödem/Plasmavolumen der Kochsalz injizierten Stellen subtrahiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 26 dargestellt. Die MAIF-Verabreichung führte zu einer 48% Hemmung der Ödembildung.
Dieser Versuch zeigte, daß MAIF die örtliche entzündliche Reaktion auf eine Infektion verändern konnte.
Zur Untersuchung des Verhältnisses zwischen einer MAIF-Verabreichung, einer Bakterienreplikation, der Fluidansammlung und Entzündungszellinfiltration wurde ein anderes Infektionsmodell verwendet. Polyurethanschwämme, die wie zuvor beschrieben hergestellt und implantiert wurden, wurden zum Zeitpunkt der Implantation mit einer quantitativ bestimmten Probe von E. coli 075 zum Zeitpunkt der Implantation infiziert. Die Schwämme wurden in zeitlich festgelegten Intervallen entfernt, zur Bestimmung des Volumens des Fluidexsudats gewogen und dann in Medium zur Freisetzung der Bakterien und Zellen aus dem Schwamm gepreßt. Die Bakterien- und Zellenzahlen wurden unter Anwendung von Techniken geschätzt, die dem Fachmann bekannt sind. Der folgende Versuch wurde unter Anwendung dieses Modells durchgeführt. Neunzig Tiere wurden in zwei Gruppen zu 45 geteilt. Eine dieser Gruppen war unbehandelt und diente als Kontrolle. Der zweiten Gruppe wurden 40 mg MAIF intravenös injiziert. Dann wurden die Schwämme subkutan implantiert, und zum Zeitpunkt der Implantation wurde jeder Schwamm mit 10 E. coli 075 beimpft. Gruppen von 6-8 Tieren wurden danach in Intervallen getötet und der bakteriologische Status und die Größe des Entzündungsinfiltrats in den Schwämme bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 27-29 dargestellt.
Das Ausmaß der Bakterienreplikation war bei den MAIF-behandelten Tieren viel größer als bei der Kontrolle, und es gab einen 10-, 1000- und 10.000-fachen Unterschied in der Bakterienzahl nach 4, 8 bzw. 16 Stunden. Danach sanken die Bakterienzahlen, obwohl der Unterschied nach 96 Stunden noch groß war (Fig. 27).
Die frühe Reaktion auf eine Infektion ist die kritische Determinante in dem Folgezustand einer infektiösen Episode. In diesem Versuch betrug das zelluläre Infiltrat nach 2, 4 und 8 h in jenen Tieren, denen MAIF verabreicht wurde, 27%, 35% bzw. 46% des Kontrollinfiltrats (Fig. 28B). Die Zellen, die sich in den ersten 24 h nach der Belastung anhäufen, sind > 90% Neutrophile, und die Unterdrückung dieser zellulären Komponenten während dieser Phase kann für den raschen Anstieg in der Bakterienanzahl verantwortlich sein. Die Fluidansammlung nach 2 Stunden war durch die MAIF-Verabreichung nicht beeinträchtigt; sondern war 4, 8 und 16 Stunden nach der Belastung deutlich geringer. Dies stimmt mit der früheren Erkenntnis überein, daß MAIF die primäre, nicht zelluläre Phase der Ödembildung in dem Carrageen-Fußballenmodell nicht unterdrückt. In früheren Studien unter Verwendung der immunmodulierenden Mittel Cyclosporin A und Methylprednisolon wurde eine ähnliche Verbindung zwischen der Unterdrückung des akuten zellulären Entzündungsinfiltrats und der Förderung der Bakterienreplikation gezeigt. In diesen Versuchen förderte die erhöhte Bakterienbelastung jedoch eine Wirtsreaktion zwischen 24 und 48 Stunden nach der Belastung, in welcher ein massiver Zufluß von Neutrophilen stattfand. Wenn Gewebe beteiligt war, führte die verstärkte entzündliche Reaktion zu einer deutlichen Vergrößerung des Gewebeschadens und der Narbenbildung. Interessanterweise gab es keinen massiven Zufluß von Neutrophilen 24-48 Stunden nach der Belastung, obwohl die MAIF-Verabreichung die frühe entzündliche Reaktion unterdrückte und von einer 10.000-fachen Erhöhung der Bakterienzahl begleitet war.

Beispiel 19

Wirkung von MAIF auf experimentelle Pyelonephritis

Ein Mittel, das die Entzündung bei einer Infektion ohne die Folgeerscheinung eines verstärkten Gewebeschadens unterdrücken kann, hätte ein beachtliches Potential. Ein klinisch relevantes Modell einer infektiösen Erkrankung könnte eine Versuchsbasis zur Erreichung eines solchen Potentials bieten.
Pyelonephritis ist eine infektiöse Erkrankung, die eine örtliche Entzündung, Gewebezerstörung und Narbenbildung als histologische Hauptmerkmale aufweist. Ein gut charakterisiertes Modell der Erkrankung ist erhältlich, das die zentralen pathologischen Merkmale der Erkrankung beim Menschen reproduziert. Pyelonephritis wird bei der Ratte durch die direkte Beimpfung der chirurgisch freigelegten Niere mit einer vorbestimmten Anzahl von E. coli 075 herbeigeführt. Nach der Belastung nimmt die Bakterienzahl rasch zu und erreicht 3 bis 4 Tage später den Höchstwert. Bei normalen Tieren nimmt der Infektionsgrad nach den folgenden 5 oder 6 Tagen ab und erreicht etwa 10 Tage nach der Belastung ein Plateau. Nach 21 Tagen haben sich die Läsionen aufgelöst und zeigen sich als herdförmige Flächen von gekerbtem Narbengewebe. Zur Beurteilung der Wirkung von MAIF auf dieses Infektionsmodell wurde die Pyelonephritis in beiden Nieren von sechsundzwanzig Tieren herbeigeführt. Eine Hälfte dieser Tiere wurde intravenös mit MAIF mit einer Dosis von 40 mg/Ratte zum Zeitpunkt der Belastung und wieder 48 Stunden später behandelt. Sieben Tiere jeder Gruppe wurden 4 Tage nach Herbeiführung der Pyelonephritis getötet und die beiden übrigen Gruppen von sechs Tieren nach 21 Tagen. Die Nieren wurden aseptisch entfernt und zur Bestimmung des relativen Volumens des Fluidexsudats gewogen. Das Ausmaß der Oberflächenläsionsgröße wurde durch direkte Kenntlichmachung geschätzt und die Niere homogenisiert, so daß die Bakterienzahl verzeichnet werden konnte. Die Ergebnisse sind in Fig. 30 dargestellt.
Vier Tage nach der Belastung war die entzündliche Reaktion, wie durch die Hemmung der Fluidansammlung und die Größe der Läsionen auf der Oberfläche der Niere deutlich wurde, durch die MAIF-Verabreichung unterdrückt. Wie zuvor in den Studien beobachtet wurde, welche infizierte, subkutan implantierte Schwämme beinhalteten, führte die frühe Unterdrückung der Entzündung zu einer logarithmischen Erhöhung der Bakterienzahl in MAIF-behandelten Tieren. Nach 21 Tagen gab es in der Pathologie der Erkrankung keinen Unterschied, gemessen am Nierengewicht, der Bakterienzahl oder der Nierenoberflächenläsionsgröße. Während somit die Unterdrückung der frühen entzündlichen Reaktion mit MAIF nicht zu einer Verringerung der Gewebezerstörung in der chronischen (21 tägigen) Phase von Pyelonephritis führte, förderte sie auch nicht die Entwicklung pathologischer Läsionen, wie dies bei anderen entzündungshemmenden und immunmodulierenden Mitteln der Fall war.

Beispiel 20

Zusammenfassung der Versuchsdaten

Es wurde eine Methode entwickelt, welche eine kontinuierliche Beobachtung der Ödemansammlung in dem Carrageen-injizierten Fußballen ermöglichte.
Die frühe, nicht phagozytische Phase der entzündlichen Reaktion wurde von MAIF nicht beeinflußt, während die spätere, zellulär angetriebene Phase der Reaktion deutlich gehemmt war. Weitere Experimente, in welchen MAIF in Intervallen vor oder nach der Injektion von Carrageen verabreicht wurde, lieferten einen zusätzlichen Beweis, daß MAIF seine entzündungshemmende Wirkung durch Modulieren der zweiten, neutrophilvermittelten entzündlichen Reaktion ausübte.
Es zeigt sich, daß MAIF eine Halbwertszeit von 1-2 Stunden nach der i. v. Injektion aufweist und die Entwicklung einer Entzündung unterdrückt werden konnte, wenn das Mittel 30 Minuten nach der Belastung verabreicht wurde. Dieses Ergebnis ist für die mögliche therapeutische Anwendung von MAIF relevant.
Der Neutrophile ist die Hauptzelle, die an der akuten entzündlichen Reaktion beteiligt ist. Während der Arthus-Reaktion wurde eine > 80% Verringerung in der Neutrophilenansammlung nach einer MAIF-Verabreichung beobachtet, die ihrerseits mit einer sehr signifikanten Hemmung der sekundären Merkmale der entzündlichen Reaktion verbunden war, nämlich der Ödeme und Blutung. Dieses Ergebnis legte die Neutrophilen noch mehr als Ziel in der MAIF-induzierten Unterdrückung der Entzündung nahe.
Einer der wesentlichen Schritte in der Entwicklung einer Entzündung ist die Migration von Neutrophilen aus dem Gefäßsystem zu dem Gewebe. Es wurde nachgewiesen, daß die intravenöse Verabreichung von MAIF zu einer starken und dosisabhängigen Hemmung der Neutrophileemmigration führt. Bei der Untersuchung der Wirkung von MAIF auf periphere Blutleukozyten wurde ein deutlicher Anstieg in der Anzahl zirkulierender Neutrophile beobachtet, der von einer entsprechenden Abnahme in der Anzahl von Lymphozyten begleitet war. Diese Wirkung war auch dosisabhängig, aber im Falle der Erhöhung der Neutrophilenzahl nicht linear.
Schließlich unterdrückte das Mittel die frühe zelluläre Reaktion auf eine Infektion signifikant, wobei die Wirkung zu einer logarithmischen Erhöhung der Bakterienzahl in einem Modell einer subkutanen Infektion führte. Diese Verschlechterung der Infektion führte nicht zu einem Zurückkehren der entzündlichen Reaktion, wie bei anderen Mitteln zu beobachten ist, welche die akute Entzündung in einer Infektion unterdrücken. Ein zweiter Versuch unter Verwendung eines klinisch relevanten Modells einer Infektion, Pyelonephritis, zeigt auch eine unterdrückende Wirkung auf die Entzündung, die mit einer Erhöhung der Bakterienzahl verbunden war. Auch hier wurde kein Rückkehrs-Effekt beobachtet, und es gab keinen Unterschied im Ausmaß des Gewebeschadens, der in der MAIF-behandelten und in der Kontrollgruppe auftrat.
Aus dieser Versuchsreihe können die folgenden Schlüsse gezogen werden:
1. MAIF unterdrückt bei i. v. Verabreichung die sekundäre neutrophilvermittelte Phase der durch Carrageen herbeigeführten entzündlichen Reaktion.
2. Bei einer Bewertung im Carrageen-Fußballentest hatte MAIF eine biologisch Halbwertszeit von 1-2 Stunden und ist sogar bei einer Verabreichung nach Herbeiführung der Entzündung wirksam. Folgende Versuche zeigen, daß die effektive Halbwertszeit sowohl von der Dosis als auch dem verwendeten Entzündungsreiz abhängt.
3. MAIF hemmt die Neutrophilenmigration in vivo.
4. Die MAIF-Verabreichung führt zu einer Erhöhung der Anzahl zirkulierender Neutrophile und einer entsprechenden Verringerung der Lymphozytenzahl.
5. MAIF unterdrückt die Infektionsabwehr des Wertes, wahrscheinlich über eine Wirkung auf die Neutrophilenmigration.
Die in diesen Studien erhaltenen Versuchsdaten zeigen deutlich, daß MAIF eine wesentliche Wirkung auf die neutrophile Komponente der entzündlichen Reaktion hat. Die Wirkungen, die bisher beobachtet wurden, könnten das Ergebnis einer direkten Wirkung von MAIF auf Neutrophile an sich sein oder das Ergebnis der Unterdrückung (oder Stimulierung) eines anderen zellulären oder löslichen Vermittlers, der indirekt die neutrophile Reaktion ändert. Es wird auch allgemein anerkannt, daß wenige pharmakologische Mittel in ihren Wirkungen monospezifisch sind, und es ist möglich, daß sich herausstellen wird, daß MAIF eine Reihe verschiedener biologischer Prozesse beeinflußt.

Claims

1. Entzündungshemmender Faktor, der durch ein Verfahren erhältlich ist, welches umfaßt:

(i) die Entfernung des Fettes aus der Milch eines milchproduzierenden Tieres, um entrahmte Milch herzustellen;

(ii) das Pasteurisieren der entrahmten Milch;

(iii) die Entfernung von Casein aus der pasteurisierten entrahmten Milch, um Molke herzustellen;

(iv) die Entfernung von Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10.000 Dalton aus der Molke, um eine Zusammensetzung herzustellen, die frei von Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10.000 Dalton ist;

(v) die Verringerung der Tonenstärke der Zusammensetzung von (iv), um ein Aggregat mit entzündungshemmender Wirksamkeit herzustellen, wobei das Aggregat ein Molekulargewicht von mehr als etwa 5.000 Dalton aufweist;

(vi) die Entfernung von Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 5.000 Dalton aus der Zusammensetzung von (v), um eine Zusammensetzung herzustellen, die frei von Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 5.000 Dalton ist; und

(vii) das Sammeln des Faktors aus der Zusammensetzung von Schritt (vi).

2. Entzündungshemmender Faktor nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Entfernung in (vi) mittels eines Membranfilters wie eines Amicon YM5-Membranfilters erfolgt.

3. Entzündungshemmender Faktor, wie er in Anspruch 1 definiert ist, zur Verwendung in der Medizin.

4. Verwendung eines entzündungshemmenden Faktors, wie er in Anspruch 1 definiert ist, bei der Herstellung eines entzündungshemmenden Mittels und/oder eines Mittels zur Hemmung der Cytokinwirkung in einem Säugetier.

5. Verwendung nach einem Anspruch 4, wobei das Cytokin am Rezeptor einer Entzündungszelle wirkt.

6. Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, wobei der entzündungshemmende Faktor zur intravenösen, oralen, intraperitonealen oder intramuskulären Verabreichung bestimmt ist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei der entzündungshemmende Milchfaktor aus einem Rind gewonnen wird.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die Entzündung durch akute oder subakute Bursitis, akute unspezifische Tendinitis, systemischer Lupus erythematodes, systemische Dermatomyositis, akute rheumatische Karditis, Pemphigus, bullöse Dermatitis, Herpeteformis, schweres Erythem, multiforme Dermatitis exfoliativa, Zirrhose, jahreszeitlich bedingte perenniale Rhinitis, Asthma bronchiale, ektopische Dermafitis, Serumkrankheit, Keratitis, Ophthalmikus-Iritis, diffuse Ureteritis, Chorditis, Neuritis nervi optici, sympathische Ophthalmie, symptomatische Sarkoidose, Löffler-Syndrom, Berylliose und/oder hämolytische Anämie verursacht wird.

9. Verwendung eines entzündungshemmenden Faktors, wie er in Anspruch 1 definiert ist, bei der Herstellung eines Mittels zur Hemmung der zellulären entzündlichen Reaktion in einem Säugetier.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die zelluläre entzündliche Reaktion die Migration von Entzündungszellen wie Neutrophilen ist.

11. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die zelluläre entzündliche Reaktion die Arthus-Reaktion, das Ergebnis einer Infektion oder das Ergebnis einer Freisetzung von Reaktanten in der akuten Phase ist.

12. Verwendung eines entzündungshemmenden Faktors, wie er in Anspruch 1 definiert ist, bei der Herstellung eines Mittels zur Hemmung der Arthus-Reaktion in einem Säugetier und/oder zur Hemmung der Adhäsion von Neutrophilen an Endothelzellen in einem Säugetier.

13. Verfahren zur Herstellung eines entzündungshemmenden Faktors, wobei das Verfahren umfaßt:

(ii) das Pasteurisieren der entrahmten Milch;

(iv) die Entfernung der Molken-Makromoleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10.000 Dalton, um eine Zusammensetzung herzustellen, die frei von Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10.000 Dalton ist;

(v) die Verringerung der Ionenstärke der Zusammensetzung von (iv), um ein Aggregat mit entzündungshemmender Wirksamkeit herzustellen, wobei das Aggregat ein Molekulargewicht von mehr als etwa 5.000 Dalton aufweist;

(vii) das Sammeln des Faktors aus der Zusammensetzung von Schritt (vi).

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der entzündungshemmende Milchfaktor aus einem Tier in einem hyperimmunisierten Zustand gewonnen wird, der durch Verabreichung einer polyvalenten Mischung bakterieller Antigene (wie in einem Impfstoff) induziert wird, welche umfaßt: Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis; Streptococcus pyrogenes, A, Typ 1; Streptococcus pyrogenes, A, Typ 3; Streptococcus pyrogenes, A, Typ 5; Streptococcus pyrogenes, A, Typ 8; Streptococcus pyrogenes, A, Typ 12; Streptococcus pyrogenes, A, Typ 14; Streptococcus pyrogenes, A, Typ 18; Streptococcus pyrogenes, A, Typ 22; Aerobacter aerogenes; Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa; Klebstella pneumoniae; Salmonella typhimurium; Haemophilus influenzae, Streptococcus mitis;

Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Diplococcus pneumoniae; Propionibacter acnes; Streptococcus mutans und/oder Streptococcus agalactiae.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das polyvalente bakterielle Antigen den Tieren oral oder parenteral verabreicht wird.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen entzündungshemmenden Faktor, wie er in Anspruch 1 definiert ist, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.