DE69123852T2 - Testtechnik - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine Assaytechnik. Insbesondere betrifft sie eine Assaytechnik der kompetitiven Bindung für Substanzen, die als Substrate für coenzymbedürftige Enzyme dienen können.
- Eine große Anzahl von Substraten von coenzymbedürftigen Enzymen sind kleine Moleküle ohne antigene Determinante und können folglich durch herkömmliche Immunoassaytechniken nicht bestimmt werden. üblicherweise werden solche Substrate bestimmt, indem man die Enzym-Substrat-Umwandlung mißt. So sind beispielsweise Glucosebiosensoren bekannt, die darauf beruhen, daß man die auf Glucose zu testende Probe mit Glucoseoxidase (ein coenzymbedürftiges Oxidoreduktaseenzym), in Kontakt bringt, wobei die enzymatische Umwandlung jeder Glucose in der Probe durch indirekte Detektion der H&sub2;O&sub2;-Produktion oder durch Aufzeichnen eines Elektronentransfers von dem Redoxzentrum des Enzyms in eine Arbeitselektrode über einen Elektronentransfermediator bestimmt wird. Glucosetestsysteme des zuletzt genannten Typs sind beispielsweise in der EP-A-076 836 beschrieben, und ein derartiger Biosensor, bei dem Einwegelektrodenstreifen, die immobilisierte Glucoseoxidase zusammen mit einem Elektronentransfermediator tragen, ist gegenwärtig im Handel von Medisense Inc. verfügbar.
- Enzymelektroden zum Test auf Enzymsubstrate gelten allgemein hinsichtlich der leichten Anwendung und des niedrigen Störungsgrads als günstig, aber ihre untere Empfindlichkeitsgrenze ist signifikant höher als die bekannter Immunsensoren auf antigene Teilchen, was auf die Kinetik der Enzym-Substrat-Umwandlung zurückzuführen ist. So werden Enzymelektroden typischerweise nur zur Bestimmung von Substratkonzentrationen im Bereich von 10 µm bis 1M verwendet, wohingegen Immunsensoren üblicherweise einen Konzentrationsbereich von 1 nM bis 0,1 mM abdecken. Faseroptische Biosensoren auf Glucose sind ebenfalls bekannt, die auf der kompetitiven Bindung der Probenglucose und fluoreszierendmarkierten Dextrans an das Lectin Concanavalin A beruhen (Schultz -et al., Diabetes Care 5, 245-253 (1982); Anal. Chem. 58, 766A-770A (1986)]. Auf analoge Weise sind jedoch faseroptische Biosensoren auf nichthaptenische kleine Moleküle, außer den lectinbindenen Zuckern, jedoch nicht bekannt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft nun eine Assaytechnik der kompetitiven Bindung, die nicht nur auf Glucose anwendbar ist, sondern unter anderem auf jedes beliebige andere Substrat eines Coenzym benötigenden Enzyms, für das ein ein Apoenzym bindendes Protein ohne funktionelle Coenzymkomponente erhalten werden kann.
- So betrifft gemäß einem Gesichtspunkt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer Substanz in einer Flüssigkeit, die als Substrat für ein ein Coenzym benötigendes Enzym dienen kann, wobei man die Probe mit einem Testsystem, umfassend (i) ein Substratanalogon und (ii) eine Einheit, die spezifisch an das Substrat binden kann, ohne die Umwandlung des Substrats zu katalysieren (wobei das Substratanalogon eine Substanz ist, die kompetitiv mit jedem in der Probe vorhandenen Substrat an die Einheit binden kann) in Kontakt bringt und die Anwesenheit oder die Menge des Substrats bestimmt, indem man das Ausmaß überwacht, in dem sich Komplexe zwischen der Einheit und dem Substratanalogon und/oder dem Substrat gebildet haben bzw. verbleiben.
- Die Einheit, die spezifisch an das Substrat binden kann, ohne dessen Umwandlung zu katalysieren, wird nachstehend der Kürze halber als "Komponente (ii)" bezeichnet. Es ist zu verstehen, daß zu Beginn eines Assays gemäß dem vorstehenden Verfahren die Komponente (ii) und das Substratanalogon entweder getrennte Komponenten (das Standardf ormat eines kompetitiven Assays) oder bereits wechselseitig gebundene Komponenten (das Format eines kompetitiven Verdrängungsassays) sein können. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Komponente (ii) ein geeiqnetes Apoenzym, ohne sein funktionelles Coenzym, das für die katalytische Aktivität benötigt wird. Folglich wird die Erfindung nachstehend unter besonderer Bezugnahme auf diese bevorzugte Ausführungsform beschrieben.
- Andere geeignete Identitäten für die Komponente (ii) zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren umfassen teilweise denaturierte Enzyme (d.h. Enzyme, die in geeigneter Weise durch Teildenaturierung unter kontrollierten Bedingungen desaktiviert wurden), desaktivierte "künstliche Enzyme", wie desaktivierte cyclodextrine, desaktivierte Enzyme und gentechnisch desaktivierte Enzyme. Desaktivierte Enzyme (oder "künstliche Enzyme") umfassen Enzyme (oder "künstliche Enzyme"), deren katalytische Aktivität effektiv durch Zugabe eines geeigneten Desaktivierungsmittels entweder vor oder gleichzeitig mit der Einführung des Analytsubstrats in den Assay effektiv entfernt wurde, z.B. kann die katalytische Aktivität bestimmter Metalbenzyme durch die Zugabe von EDTA ausgelöscht werden.
- Es ist klar, daß erfindungsgemäße Assays entweder qualitativ oder quantitativ sind.
- Das überwachen des Anteils der Komponente (ii) die mit dem Substratanalogon komplexiert wird, kann durch eine Technik, ausgewählt von jeder aus einer breiten Vielzahl bekannter Techniken zur überwachung der kompetitiven Bindung eines Analytliganden und Ligandanalogons an einen einzelnen Rezeptor, erzielt werden. So kann ein erfindungsgemäßes Assaysystem, beispielsweise in Form eines elektrochemischen, optischen, piezoelektrischen oder faseroptischen Biosensors sein. Gemäß einer Möglichkeit wird eine der vorstehend definierten Assaykomponenten (i) und (ii) auf einem festen Träger immobilisiert, und die andere der Komponenten (i) und (ii) trägt einen detektierbaren Marker. Beispielsweise kann ein Fluoreszenzmarker Fluoresceinisothiocyanat (FITC) umfassen, wohingegen ein optischer Sensor als festen Träger einen optischen Wellenleiter umfassen kann. Ferner kombiniert ein erf indungsgemäßer kompetitiver Assay aufgrund der Tatsache, daß er einem kompetitiven Immunoassay analog ist, einen hohen Grad an Spezifität mit einer verbesserten Empfindlichkeit gegenüber Enzymelektrodensensoren.
- Es ist klar, daß die Apoenzymkomponente für einen bevorzugten erfindungsgemäßen Assay kein vollständiges Apoenzym eines coenzymbedürftigen Enzyms sein muß, sondern jeder beliebige Teil der Proteinstruktur eines solchen Enzyms sein kann, der eine funktionelle Substratbindungsstelle beibehält. Im allgemeinen gilt es jedoch als bevorzugt, ein vollständiges Apoenzym ohne dessen normalerweise assoziierten Coenzympartner zu verwenden&sub5; Verfahren zur Herstellung von Apoenzymen ohne Coenzym sind bekannt (vergleiche beispielsweise Methods in Enzymology, 92, 415ff (1983)].
- Die Apoenzymkomponente für einen erfindungsgemäßen Assay kann beispielsweise von jedem der Oxidoreduktaseenzyme abgeleitet sein, die ein Coenzym für den Elektronentransfer am Redoxzentrum des arbeitenden Enzyms benötigen. So umfassen Beispiele von besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Assays diejenigen, bei denen eine Apoenzymkomponente eines Oxidoreduktaseenzyms, ausgewählt aus Alkoholdehydrogenase, Cholesterinoxidase, Lactatdehydrogenase und Pyruvatdehydrogenase, verwendet wird, die klinische Anwendung beim Nachweis abnormaler Blutspiegel an Alkohol, Cholesterin Milchsäure bzw. Pyruvat finden können. Mehr bevorzugt sind erfindungsgemäße kompetitive Assays zum Test auf Glucose, bei denen das Apoenzym der Glucoseoxidase (GOX) verwendet wird.
- Es ist zu verstehen, daß das Substratanalogon eines erfindungsgemäßen Assays entweder ein (natürliches oder synthetisches)- Teilchen ist, das für die gleiche Bindungsstelle der Komponente (ii) spezifisch ist, wie das Analytsubstrat oder eine vorbestimmte Menge des Substrats ist&sub5; So kann beispielsweise im Falle eines erfindungsgemäßen kompetitiven Glucoseassays das Substratanalogon beispielsweise eine vorbestimmte Menge Glucose selbst oder Dextran (ein Glucosepolymeres) sein.
- Vier besonders bevorzugte erfindungsgemäße Assaysysteme, bei denen zwei verschiedene optische Techniken zur überwachung der Apoenzym-Substrat- gegenüber der Apoenzym-Substratanalogon-Komplexbildung verwendet werden, werden anschließend ausführlicher unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben; darin
- erläutert Figur 1 schematisch im Querschnitt kapillargefüllte Assaysysteme, bei denen ein fluoreszierend markiertes Reagens, Fluoreszenz-Kapillar-Füllvorrichtungen (FCFDs) verwendet werden und
- erläutern die Figuren 2 und 3 schematisch erfindungsgemäße Assays, die auf dem optischen Phänomen oder Oberflächenplasmonresonanz beruhen.
- Unter Bezugnahme auf die Figuren L (a) und (b) ist das darin gezeigte Kapillarfüllungs-Assaysystem eine einzelne Probe, wobei das nichtnachladbare Assaysystem die folgenden Plattenkomponenten umfaßt:
- (i) eine erste Platte 1, an deren innerer Oberfläche das Substratanalogon 2 als Schicht 3 des Festphasenreagenses immobilisiert ist, das die Fähigkeit, an die gewählte Apoenzymkomponente zu binden, beibehält, und
- (ii) eine zweite Platte 4, die von der ersten Platte durch eine Kapillarkavität 5 getrennt ist und deren innere Oberfläche mit einer Schicht 6 beschichtet ist, umfassend eine fluoreszierend markierte Apoenzymkomponente 7 in einer löslichen freisetzbaren Form, z.B., wenn der vorgeschlagene Analyt Glucose ist, kann die Komponente 7 ein mit einem Fluorophor markiertes GOX-Apoenzym sein, wie beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat (FITC).
- Mindestens die erste Kapillarpiatte 1 einer solchen Vorrichtung (nachstehend als ein Apoenzym-FCFD bezeichnet) kann als ein optischer Wellenleiter wirken.
- Die Art der Durchführung eines Assays unter Verwendung einer Vorrichtung dieses Typs ist ähnlich der bekannter Immunsensoren des Fluoreszenz-Kapillarfüllungs-Vorrichtungstyps, die entsprechend der Art des kompetitiven Immunoassays ablaufen (Badley et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 316, 143-160 (1987)). So beginnt ein Assay damit, daß man die flüssige Probe, z.B. eine Blutprobe, in die Kapillarkavität 5 einziehen läßt, wobei anschließend die markierte Apoenzymkomponente 7 aus einem anfänglich gebundenen Zustand solubilisiert wird (siehe Figur 1c). Nach der Equilibration des Analytsubstrats 8 gegenüber dem Substratanalogon 2, das an die Apoenzymkomponente 7 bindet, hängt die Vollendung des Assays von der optischen Anregung des Markers und der Bestimmung der Fluoreszenzlichtintensität in einem bestimmten Winkel relativ zu der Ebene der den Komplex tragenden Platte ab, wobei die Position des Photodetektors so ist, daß nur Fluoreszenzlicht, das aus dem an diese Platte gebundenen Marker austritt, nachgewiesen wird. Bevorzugt wird, sofern ein quantitativer Assay durchgeführt werden soll, diese Messung der Lichtintensität als Verhältnis zu einem zweiten Photodetektor ausgedrückt, der in einem anderen Winkel, bezogen auf die Ebene der gleichen optischen Wellenleiterplatte, abliest, wobei dieser zweite Winkel so gewählt ist, daß der lösliche Fluoreszenzmarker beobachtet wird. Verfahrens zur optischen Analyse, die sich im Zusammenhang mit der Erfindung eignen, sind ausführlicher beispielsweise in der EP-A-170 376 beschrieben.
- Wie in den Figuren 1(d) und (e) gezeigt, kann die fluoreszierend markierte Apoenzymkomponente in einer Apoenzym- FCFD-Vorrichtung, wie vorstehend beschrieben, durch ein fluoreszierend markiertes Substratanalogon 9 ersetzt sein, wobei eine geeignete nichtmarkierte Apoenzymkomponente 10, die sowohl das vorgeschlagene Analytsubstrat 8 als auch das markierte Substratanalogon 9 binden kann, auf der optischen Wellenleiter-Basisplatte immobilisiert ist, die für die Ablesung des Photodetektors verwendet wird. So kann beispielsweise im Falle eines Apoenzyin-FCFDs dieser alternativen Form, die der Glucosemessung angepaßt ist und bei der als ein Festphasen-Apoenzymreagens GOX ohne Coenzym verwendet wird, das fluoreszierend markierte Substratanalogon zweckdienlicherweise ein fluoreszierend markiertes Dextran, z.B. FITC-Dextran, sein.
- Die Konstruktion von Apoenzym-FCFD-Vorrichtungen kann über die anfängliche Bildung größerer beschichteter Platten auf analoge Weise wie das herkömmliche Verfahren zur Konstruktion von FCFD-Immunsensoren erzielt werden.
- Verfahren zur Herstellung von FCFDs sind ausführlich in der EP-A-171 148 beschrieben.
- Substratanaloga (Z.B. Dextran in einem Glucoseassay) können auf der Grundplatte durch Koppeln des Substratanalogons an ein geeignetes Protein (z.B. Rinderserumalbumin, Napfschneckenhämocyanin, Poly-L-Lysin) und dessen anschließende Bindung an die Grundplatte unter Verwendung herkömmlicher Proteinimmobilisierungschemie immobilisiert werden. Die Apoenzyme können nach analogen Verfahren immobilisiert werden.
- Die bekannte Oberflächenplasmonresonanz-Technik (SPR) zur Durchführung der Bestimmungsstufe eines kompetitiven Immunoassays (vergleiche beispielsweise EP-A-0 276 142) kann ebenfalls günstigerweise zur überwachung der Bindung eines Substrats gegenüber einem Substratanalogon an eine Apoenzymkomponente angewendet werden, wobei die Notwendigkeit eines meßbaren Markers überflüssig wird. Vorrichtungen, die zur Verwendung im Zusammenhang mit der SPR-Technik geeignet sind, sind beispielsweise in der EP-A-353 937 beschrieben. So kann, wie in den Figuren 2 und 3 erläutert, bei den erfindungsgemäßen SPR-Assays entweder die Apoenzymkomponente oder das auf einer optischen Struktur, die einen SPR-Effekt ausüben kann, beispielsweise ein metallisiertes Beugungsgitter, immobilisierte Substratanalogon verwendet werden.
- Unter Bezugnahme auf Figur 2 umfaßt eine geeignete optische Struktur ein Substrat 11, das eine Schicht 12 eines geeigneten Materials (z.B. Polyester oder Polycarbonat) trägt, das ein vorgebildetes Oberflächenreliefprofil 13 besitzt. Die aktive Oberfläche der Struktur umfaßt eine Schicht 14 aus Metall (z.B. Silber), die an ihrer oberen Oberfläche dem Reliefprofil 13 entspricht. Die Schicht kann durch einen passiven Film 15 (z.B. Siliciumdioxid) bedeckt sein, die ebenfalls dem Profil 13 entspricht. Eine einschichtige Schicht von substratanalogen Molekülen 16 wird an den Film 15 gebunden und dadurch immobilisiert. Während des Assays konkurrieren Analytsubstratmoleküle 17 mit gebundenen substratanalogen Molekülen 16 unter Bildung von Komplexen 18 mit den Molekülen der Apoenzymkomponente. In der Figur 3 sind die Moleküle einer Apoenzymkomponente 19 immobilisiert, und während des Assays konkurrieren das Analytsubstrat 20 und das markierte Substratanalogon 21 um die Bindung an das Apoenzym 19.
- Es kann bei einer Reihe von Apoenzymkomponente/Substratanalogon-Paarungen, die auf der optischen Struktur nicht immobilisiert sind, für notwendig oder zweckdienlich befunden werden, sie an eine Einheit zu binden, um ihren die optische Dichte verstärkenden Effekt nach Komplexbildung zu erhöhen. Geeignete Verfahren zu diesem Zweck sind in der vorstehend genannten veröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP-A-0 276 142 beschrieben und umfassen die Bindung an Polystyrollatex oder an ein Material mit einem hohen Brechungsindex, wie Glaskügelchen. Die Probe und das lösliche Reagens können mit der das Reagens tragenden optischen Struktur entweder gleichzeitig oder nacheinander in Kontakt gebracht werden, und der Assay kann durch Beobachten der Geschwindigkeit oder Ausmaßes, mit dem sich der Oberflächenplasmonresonanzeffekt der optischen Struktur verändert, ausgeführt werden.
- Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Sensor zur Verwendung bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Assays, bei dem entweder die Komponente (i) (das Substratanalogon) oder die Komponente (ii) (wie vorstehend definiert) auf einem festen Träger immobilisiert ist, um ein Festphasenreagens zu ergeben, bereitgestellt, wobei der feste Träger so angepaßt ist, daß er die überwachung der Bindung des Analytsubstrats gegenüber der Bindung des Substratanalogons an die Komponente (ii) erlaubt.
- Der feste Träger kann eine optische Struktur, die einen SPR-Effekt ausüben kann, sein.
- Ein erfindungsgemäßer Sensor kann in Form einer spezifisch reaktiven Probenauffang und Testvorrichtung sein, die eine Kavität oder Kavitäten besitzt, die jeweils klein genug dimensionierüist/sind, um das Einziehen der Probenflüssigkeit in die Kavität durch Kapillarwirkung zu erlauben, und wobei-entweder die Komponente (i) (das Substratänalogon) oder die Komponente (ii) auf mindestens einem Teil einer Wand der Kavität immobilisiert ist. Bei dieser Ausführungsform wirkt die Wand der Kavität als der vorstehend beschriebene feste Träger.
- Zusätzlich zu Apoenzym-FCFDs und optischen Strukturen, die ein immobilisiertes Reagens für einen erfindungsgemäßen SPR-Assay tragen, umfassen solche Vorrichtungen beispielsweise eine Arbeitselektrode, auf der eine geeignete Einheit immobilisiert ist (beispielsweise eine Apoenzymkomponente ohne funktionelles Coenzym) und faseroptische und piezoelektrische Biosensoren zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Assays unter Einbezug einer geeigneten immobihsierten Einheit, beispielsweise einer nichtkatalytischen Apoenzymkomponente.
- Gemäß einem noch weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Kit zur Verwendung in einem Assayverfahren, wie vorstehend beschrieben, bereitgestellt. Das Kit umfaßt (i) ein Substratanalogon und (ii) eine Einheit, die spezifisch an das Substrat binden kann, ohne die Umwandlung des Substrats zu katalysieren, wie vorstehend beschrieben.
Claims (12)
1. Verfahren zum Test innerhalb einer flüssigen Probe
auf eine Substanz, die als Substrat für ein ein Coenzym
benötigendes Enzym dienen kann, wobei man die Probe mit
einem Testsystem, umfassend (i) ein Substratanalogon und (ii)
eine Einheit, die spezifisch an das Substrat binden kann,
ohne die Umwandlung des Substrats zu katalysieren (wobei
das Substratanalogon eine Substanz ist, die kompetitiv mit
jedem in der Probe vorhandenen Substrat an die Einheit
binden kann), in Kontakt bringt und die Anwesenheit oder Menge
des Substrats bestimmt, indem man das Ausmaß überwacht, in
dem Komplexe zwischen der Einheit und dem Substratanalogon
bzw. und/oder dem Substrat gebildet werden oder verbleiben,
wobei die Einheit ein Apoenzym, das nicht an sein
funktionelles Coenzym gebunden ist, ein teilweise denaturiertes
Enzym, ein desaktiviertes Enzym, ein gentechnisch erzeugtes
desaktiviertes Enzym oder ein desaktiviertes künstliches
Enzym ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Komponente (ii)
ein Apoenzym umfaßt, das nicht an sein funktionelles
Coenzym gebunden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Apoenzym das
Apoenzym eines Oxidoreduktaseenzyms, ausgewählt aus
Alkoholdehydrogenase, Cholesterinoxidase,
Milchsäuredehydrogenase und Pyruvatdehydrogenase, ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Apoenzym das
Apoenzym der Glucoseoxidase ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Komponente (ii)
ein teilweise denaturiertes Enzym umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Komponente (ii)
ein gentechnisch erzeugtes desaktiviertes Enzym umfaßt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine der
Komponenten (i) und (ii) auf einem festen Träger immobilisiert ist,
und die andere der Komponenten (i) und (ii) einen
nachweisbaren Marker trägt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der feste Träger
ein optischer Wellenleiter ist, und der nachweisbare Marker
ein Fluorophor ist.
9. Sensor zur Verwendung zur Durchführung eines
Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei bei dem
Sensor entweder die Komponente (i) (das Substratanalogon)
oder die Komponente (ii) (wie in Anspruch 1 definiert) auf
einem festen Träger immobilisiert ist, um ein
Festphasenreagens zu ergeben, wobei der feste Träger so angepaßt ist,
daß er die Überwachung des Analytsubstrats gegen das
Substratanalogon, das die Komponente (ii) bindet, erlaubt.
10. Sensor nach Anspruch 9, wobei der feste Träger eine
optische Struktur ist, die einen
Oberflächenplasmonresonanzeffekt zeigen kann.
11. Sensor nach Anspruch 9 oder 10 in Form einer
spezifisch reaktiven Probenauffang- und -testvorrichtung, die
eine Kavität oder Kavitäten besitzt, die jeweils klein
genug dimensioniert ist bzw. sind, um das Aufziehen der
Probenflüssigkeit in die Kavität durch Kapillarwirkung zu
erlauben und worin entweder die Komponente (i) oder die
Komponente (ii) auf mindestens einem Teil einer Wand der
Kavität immobilisiert ist, wobei die Wand so angepaßt ist,
daß sie die überwachung des Analytsubstrats gegen das an
die Komponente (ii) bindende Substratanalogon erlaubt.
12. Kit zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch
1, umfassend (i) ein Substratanalogon und (ii) eine
Einheit, die spezifisch an das Substrat binden kann, ohne die
Umwandlung des Substrats zu katalysieren, wobei die Einheit
ein Apoenzym, das nicht an sein funktionelles Coenzym
gebunden ist, ein teilweise denaturiertes Enzym, ein
desaktiviertes Enzym, ein gentechnisch desaktiviertes Enzym
und ein desaktiviertes künstliches Enzym ist.
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