DE69034168T3

DE69034168T3 - Expression von exogenen Polynukleotidsequenzen in Wirbeltieren

Info

Publication number: DE69034168T3
Application number: DE69034168T
Authority: DE
Inventors: Philip L. Felgner; Jon Asher Wolff; Gary H. Rhodes; Robert Wallace Malone; Dennis A. Carson
Original assignee: Vical Inc; Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation; Fresh Tracks Therapeutics Inc
Priority date: 1989-03-21
Filing date: 1990-03-21
Publication date: 2013-04-11
Anticipated expiration: 2010-03-22
Also published as: DE69034078T2; ES2116269T3; DE69034168T2; EP0465529B1; EP0737750A3; JP3683798B2; CA2357538A1; CA2489769A1; ATE277193T1; FI914427A0; US20070218077A1; JP3250802B2; EP1026253B1; ATE165516T1; CA2049287A1; JPH04504125A; CA2425745C; EP1026253A3; EP0737750B1; NO913700D0

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Einführen nackter DNA- und RNA-Sequenzen in ein Wirbeltier, um kontrollierte Expression eines Polypeptids zu erreichen. Es ist nützlich für Gentherapie, Impfung und jegliche therapeutische Situation, in der ein Polypeptid Zellen in vivo verabreicht werden sollte. Bei dem Wirbeltier handelt es sich um ein Säugetier.
Derzeitige Forschung auf dem Gebiet der Gentherapie konzentriert sich auf ”permanente” Behandlungen, bei denen DNA in das Genom eines Patienten integriert wird. Virale Vektoren sind gegenwärtig die am häufigsten verwendeten Mittel zur Transformation der Zellen eines Patienten und zum Einführen von DNA in das Genom. In einem indirekten Verfahren werden virale Vektoren, die neue genetische Information in sich tragen, verwendet, um Zielzellen, die aus dem Körper entfernt wurden, zu infizieren, und diese Zellen werden wieder implantiert. Über direkten In-vivo-Gentransfer bei postnatalen Tieren zur Formulierung von DNA, die in Liposomen eingekapselt sind, und DNA, die in Proteoliposomen eingeschlossen sind, die virale Hüllrezeptorproteine enthalten, wurde berichtet (Nicolau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1068–1072 (1983); Kaneda et al., Science 243, 375–378 (1989); Mannino et al., Biotechniques 6, 682–690 (1988)). Positive Ergebnisse wurden auch für mit Calciumphosphat co-gefällter DNA beschrieben (Benvenisty & Reshef, Proc. Natl. Acad Sci USA 83, 9551–9555 (1986)).
Die klinische Anwendung von Gentherapie sowie die Verwendung von rekombinanten Retrovirusvektoren wurden aus Sicherheitsvorkehrungen auf einen späteren Zeitpunkt verlegt. Die Integration von exogener DNA in das Genom einer Zelle kann zu DNA-Schäden und zu möglichen genetischen Veränderungen in der Rezipientenzelle führen, was in einer höheren Wahrscheinlichkeit an Malignität resultieren könnte. Ein Verfahren, das diese möglichen Probleme unterbindet, wäre von signifikantem Nutzen für die Entwicklung sicherer und wirksamer Gentherapien.
Impfung mit immunogenen Proteinen eliminierte oder reduzierte die Inzidenz zahlreicher Krankheiten; dennoch gibt es große Schwierigkeiten bei der Verwendung von Proteinen, die mit anderen Pathogenen und Erkrankungszuständen zusammenhängen, als Immunogene. Zahlreiche Proteinantigene sind nicht inhärent immunogen. Häufiger sind sie als Vakzinen aufgrund der Weise, auf die das Immunsystem funktioniert, nicht wirksam.
Das Immunsystem von Wirbeltieren besteht aus mehreren wechselwirkenden Komponenten. Die am besten charakterisierten und wichtigsten Teile sind die humoralen und zellulären (zytolytischen) Arten des Immunsystems. Humorale Immunität umfasst Antikörper, Proteine, die in die Körperflüssigkeiten sekretiert werden und die ein Antigen direkt erkennen. Das zelluläre System hängt dahingegen von speziellen Zellen ab, die andere Zellen erkennen und töten, die fremde Antigene produzieren. Diese grundlegende funktionelle Trennung spiegelt zwei verschiedene Strategien der Immunabwehr wider. Humorale Immunität richtet sich hauptsächlich auf Antigene, die exogen zum Tier sind, während das zelluläre System auf Antigene reagiert, die innerhalb des Tiers aktiv synthetisiert werden.
Antikörpermoleküle, die Auslöser humoraler Immunität, werden durch spezielle B-Lymphoidzellen, B-Zellen, als Reaktion auf ein Antigen sekretiert. Antikörper können sich an ein inaktiviertes Antigen direkt binden (neutralisierende Antikörper) oder können andere Zellen des Immunsystems aktivieren, um das Antigen zu zerstören.
Zelluläre Immunerkennung wird durch eine spezielle Klasse von Lymphoidzellen, den zytotoxischen T-Zellen, vermittelt. Diese Zellen erkennen nicht ganze Antigene, sondern reagieren anstelle dessen auf abgebaute Peptidfragmente davon, die an der Oberfläche der Zielzelle auftreten, die an Proteine gebunden ist, die als Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC-)Moleküle der Klasse I bezeichnet sind. Im Wesentlichen haben alle kernhaltigen Zellen Klasse-I-Moleküle. Es wird angenommen, dass Proteine, die innerhalb der Zelle produziert werden, kontinuierlich als Teil des normalen zellulären Metabolismus zu Peptiden abgebaut werden. Diese Fragmente sind an die MHC-Moleküle gebunden und werden an die Zelloberfläche transportiert. So überwacht das zelluläre Immunsystem ständig die Spektren von Proteinen, die in allen Zellen des Körpers produziert werden, und ist im Gleichgewicht, um jegliche Zellen zu eliminieren, die fremde Antigene produzieren.
Impfung bereitet ein Tier darauf vor, auf ein Antigen zu reagieren. Impfung ist komplexer als Immunerkennung und umfasst nicht nur B-Zellen und zytotoxische T-Zellen, sondern auch andere Typen von Lymphoidzellen. Während der Impfung werden Zellen, die das Antigen (B-Zellen oder zytotoxische T-Zellen) erkennen, durch Klonieren vermehrt. Darüber hinaus steigt auch die Population von Zusatzzellen (Helfer-T-Zellen), die für das Antigen spezifisch sind. Impfung umfasst auch spezialisierte, Antigen-aufweisende Zellen, die das Antigen verarbeiten können und es in einer Form darstellen, die einen oder zwei Wege stimulieren kann.
Das System von Impfungen hat sich seit der Zeit von Louis Pasteur kaum verändert. Ein fremdes Antigen wird in ein Tier eingeführt, wo es spezifische B-Zellen durch Binden an Oberflächenimmunglobuline aktiviert. Auch wird es von Antigen-verarbeitenden Zellen aufgenommen, in denen es abgebaut wird, und erscheint in Fragmenten an der Oberfläche dieser Zellen, die an Klasse-II-MHC-Moleküle gebunden sind. Peptide, die an Klasse-II-Moleküle gebunden sind, sind in der Lage, die Helferklasse von T-Zellen zu stimulieren. Sowohl Helfer-T-Zellen als auch aktivierte B-Zellen sind erforderlich, um aktivierte humorale Immunisierung zu bewirken. Von zellulärer Immunität wird angenommen, dass sie durch einen ähnlichen, jedoch kaum verstandenen Mechanismus stimuliert wird.
So produzieren zwei verschiedene und unterschiedliche Wege der Antigenverarbeitung exogene Antigene, die an Klasse-II-MHC-Moleküle gebunden sind, wo sie T-Helferzellen stimulieren können, sowie endogene Proteine, die abgebaut und an Klasse-I-MHC-Moleküle gebunden sind und durch die zytotoxische Klasse von T-Zellen erkannt werden.
Es gibt nur geringen oder gar keinen Unterschied zwischen der Verteilung von MHC-Molekülen. Im Wesentlichen exprimieren alle kernhaltigen Zellen Klasse-I-Moleküle, während Klasse-II-MHC-Proteine auf einige wenige Arten von Lymphoidzellen beschränkt sind.
Normale Impfschemata führen stets zu einer humoralen Immunreaktion. Sie können jedoch auch für zytotoxische Immunität sorgen. Das humorale System schützt eine geimpfte Person vor späteren Angriffen durch ein Pathogen und kann die Ausbreitung einer intrazellulären Infektion unterbinden, wenn das Pathogen während seines Lebenszyklus durch eine extrazelluläre Phase geht; dennoch kann es nur relativ wenig dafür tun, intrazelluläre Pathogene zu eliminieren. Zytotoxische Immunität ergänzt das humorale System durch Eliminieren der infizierten Zellen. So sollte wirksame Impfung beide Arten der Immunität aktivieren.
Eine Reaktion auf zytotoxische T-Zellen ist erforderlich, um intrazelluläre Pathogene wie Viren oder auch maligne Zellen zu entfernen. Es hat sich als schwierig erwiesen, ein exogen verabreichtes Antigen in angemessenen Konzentrationen in Verbindung mit Klasse-I-Molekülen zur Sicherstellung einer angemessenen Reaktion bereitzustellen. Dies hat die Entwicklung von Vakzinen gegen Tumor-spezifische Antigene (z. B. an Brust- oder Kolonkarzinomzellen) und gegen schwach immunogene virale Proteine (z. B. HIV, Herpes, non-A-, non-B-Hepatitis, CMV und EBV) behindert.
Es wäre wünschenswert, eine zelluläre Immunreaktion allein im Rahmen der Immunisierung gegen Mittel wie Viren bereitzustellen, für die für Antikörper gezeigt wurde, dass sie die Infektiosität steigern. Es wäre auch nützlich, solch eine Reaktion gegen sowohl chronische als auch latente virale Infektionen und gegen maligne Zellen bereitzustellen.
Die Verwendung von synthetischen Peptidvakzinen löst diese Probleme nicht, da sich entweder die Peptide nicht leicht mit Histokompatibilitätsmolekülen assoziieren, eine kurze Serum-Halbwertszeit haben, rasch proteolysiert werden oder sich gegenüber Antigen-aufweisenden Monozyten und Makrophagen nicht spezifisch anordnen. Im besten Fall müssen alle exogen verabreichten Antigene mit der Gesamtheit an Selbstproteinen um die Bindung an Antigen-aufweisende Makrophagen konkurrieren.
Große Anstrengungen wurden unternommen, um Immunreaktionen auf schwach immunogene virale Proteine aus den Herpes-Viren, non-A-, non-B-Hepatitis, HIV und dergleichen hervorzurufen. Es ist schwierig und gefährlich, diese Pathogene in vitro zu vermehren. Wie zuvor erwähnt wurden synthetische Peptidvakzinen entsprechend den viral-kodierten Proteinen hergestellt, die jedoch schwerwiegende ”Fallen” in sich tragen. Versuche wurden auch gemacht, Vakziniavirusvektoren zu verwenden, um Proteine von anderen Viren zu exprimieren. Die Ergebnisse diesbezüglich waren jedoch enttäuschend, da (a) rekombinante Vakziniaviren rasch aus dem Blutkreislauf von bereits immunen Personen eliminiert werden können und (b) die Verabreichung von komplexen viralen Antigenen ein als ”Antigenkonkurrenz” bekanntes Phänomen induzieren kann, im Rahmen dessen schwach immunogene Abschnitte des Virus nicht in der Lage sind, eine Immunreaktion auszulösen, da sie durch andere, potentere Regionen des verabreichten Antigens verdrängt werden.
Ein anderes großes Problem mit Protein- oder Peptidvakzinen ist die anaphylaktische Reaktion, die auftreten kann, wenn Antigeninjektionen im Bemühen wiederholt werden, eine potente Immunreaktion hervorzubringen. In diesem Phänomen verursachen IgE-Antikörper in Reaktion auf das Antigen schwerwiegende und manchmal fatale allergische Reaktionen.
Demgemäß besteht Bedarf an einem Verfahren zum Auslösen einer sicheren und wirksamen Immunreaktion auf diese Art von Protein oder Polypeptid. Darüber hinaus besteht großer Bedarf an einem Verfahren, das diese Antigene mit Klasse-I-Histokompatibilitätsantigenen an der Zelloberfläche assoziiert, um eine zytotoxische T-Zell-Reaktion hervorzurufen, Anaphylaxie und Proteolyse des Materials im Serum zu vermeiden und die Lokalisierung des Materials gegenüber Monozyten und Makrophagen zu erleichtern.
Zahlreiche Erkrankungsstadien können von der Verabreichung therapeutischer Peptide profitieren. Solche Peptide umfassen Lymphokine wie Interleukin-2, Tumornekrose-Faktor und Interferone; Wachstumsfaktoren wie Nervenwachstumsfaktor, epidermale Wachstumsfaktoren und menschliches Wachstumshormon; Gewebe-Plasminogenaktivator; Faktor VIII:C; Granulozyt-Makrophagen-Interleukin 3; Erythropoietin; Insulin; Calcitonin; Thymidinkinase; und dergleichen. Darüber hinaus kann selektives Zuführen von toxischen Peptiden (wie Ricin, Diphtherietoxin oder Kobragiftfaktor) zu erkrankten oder neoplastischen Zellen großen therapeutischen Nutzen haben. Gegenwärtige Peptid-Zufuhrsysteme tragen noch bedeutende Probleme in sich, umfassend die Unfähigkeit, funktionelle Zelloberflächenrezeptoren in Zellmembranen wirksam einzubinden, und die Notwendigkeit der systemischen Verabreichung großer Mengen des Peptids (was zu nicht wünschenswerten systemischen Nebenwirkungen führt), um in oder an der Zielzelle für eine therapeutische Menge des Peptids zu sorgen.
Mit diesen zuvor in Verbindung mit Gentherapie, Immunisierung und Zufuhr von therapeutischen Peptiden zu Zellen beschriebenen Problemen befasst sich die vorliegende Erfindung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In allen Ausführungsformen handelt es sich bei dem Wirbeltier um ein Säugetier. Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines für ein Polypeptid kodierenden Polynucleotids bei der Herstellung eines Medikaments zur Therapie oder Immunisierung eines Säugetiers bereit, wobei dieses Polynucleotid ein DNA-Plasmid oder mRNA ist, worin das Medikament nur dieses Polynucleotid in einem pharmazeutisch annehmbaren, injizierbaren Träger enthält, wobei der Träger flüssig ist, zur Verabreichung des Polypeptids an Zellen des Säugetiers durch Injektion des Medikaments in das Säugetier, wodurch das DNA-Plasmid oder die mRNA in Zellen des Säugetiers aufgenommen wird und für vorübergehende Expression des kodierten Polypeptids sorgt, um eine therapeutische oder immunogene Wirkung hervorzurufen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters eine Zusammensetzung, die nur ein für ein Polypeptid kodierendes Polynucleotid in einem pharmazeutisch annehmbaren, injizierbaren Träger enthält, wobei der Träger flüssig ist, wobei das Polynucleotid ein DNA-Plasmid oder mRNA ist, zur Verwendung in einem Therapie- oder Immunisierungsverfahren in einem Säugetier durch Verabreichung dieses Polypeptids an Zellen des Säugetiers durch Injektion der Zusammensetzung in das Säugetier bereit, wobei das DNA-Plasmid oder die mRNA in die Zellen des Säugetiers aufgenommen wird und für vorübergehende Expression des kodierten Polypeptids sorgt, um eine therapeutische oder immunogene Wirkung zu erzielen.
Das Gewebe, in das das Polynucleotid eingeführt wird, kann eine persistente, sich nicht teilende Zelle sein. Das Polynucleotid kann entweder eine DNA- oder RNA-Sequenz sein. Ist das Polynucleotid DNA, so kann es auch eine DNA-Sequenz sein, die selbst nicht-replizierend ist, jedoch in ein Plasmid insertiert ist, und das Plasmid umfasst weiters einen Replikator. Die DNA kann eine gentechnisch modifizierte Sequenz sein, sodass sie sich nicht in das Wirtszellengenom integriert. Die Polynucleotidsequenzen können für ein Polypeptid kodieren, dass entweder innerhalb der Zellen enthalten ist oder daraus sekretiert wird, oder sie können eine Sequenz umfassen, die die Sekretion des Peptids leitet.
Die DNA-Sequenz kann auch eine Promotorsequenz umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die DNA-Sequenz einen zellspezifischen Promotor, der wesentliche Transkription der DNA nur in vorbestimmten Zellen ermöglicht. Die DNA kann auch für eine Polymerase kodieren, um die DNA zu transkribieren, und kann auch Erkennungsstellen für die Polymerase umfassen, und das injizierbare Präparat kann eine anfängliche Menge der Polymerase umfassen.
In vielen Fällen wird bevorzugt, dass das Polynucleotid für eine begrenzte Zeit translatiert wird, sodass die Abgabe von Polypeptid vorübergehend ist. Das Polypeptid kann vorteilhafterweise ein therapeutisches Polypeptid sein und kann ein Enzym, ein Hormon, ein Lymphokin, einen Rezeptor, insbesondere einen Zelloberflächenrezeptor, ein Regulatorprotein, wie einen Wachstumsfaktor oder andere Regulatoren, oder ein anderes Protein oder Peptid umfassen, das jemand erwünscht, um es einer Zelle in einem lebenden Wirbeltier zuzuführen, und für das entsprechende DNA oder mRNA erhalten werden kann.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polynucleotid in Muskelgewebe eingeführt; in anderen Ausführungsformen wird das Polynucleotid in Gewebe von Haut, Gehirn, Lunge, Leber, Milz oder Blut eingebunden. Das Präparat wird in das Wirbeltier über zahlreiche verschiedene Wege injiziert, also intradermal, subdermal, intrathekal oder intravenös, oder es kann in Körperhöhlen eingeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polynucleotid intramuskulär injiziert.
Die Erfindung ermöglicht auch ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, die mit dem Mangel oder Fehlen eines spezifischen Polypeptids in einem Wirbeltier zusammenhängt, umfassend die Schritte des Erhaltens eines injizierbaren Präparats, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren, injizierbaren Träger, der ein nacktes, für das spezifische Polypeptid kodierendes Polynucleotid enthält; des Einführens des injizierbaren Präparats in ein Wirbeltier und des Ermöglichens, dass das Polynucleotid in eine Zelle eingebunden wird, worin das Polypeptid als das Translationsprodukt des Polynucleotids gebildet wird und wodurch der Mangel oder die Abwesenheit des Polypeptids kompensiert wird. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Präparat in Muskelgewebe eingeführt, und das Verfahren wird wiederholt angewandt. Das Verfahren wird vorteilhafterweise angewandt, wenn der Mangel oder das Fehlen auf einen genetischen Defekt zurückzuführen ist. Das Polynucleotid ist vorzugsweise eine nicht-replizierende DNA-Sequenz; die DNA-Sequenz kann auch in einen Plasmidvektor inkorporiert sein, der einen Replikationsstartpunkt umfasst.
In einer der bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Polynucleotid für ein nicht-sekretiertes Polypeptid, und das Polypeptid verbleibt in situ. Gemäß dieser Ausführungsform, wenn das Polynucleotid für das Polypeptid Dystrophin kodiert, stellt das Verfahren eine Therapie für das Duchenne-Syndrom bereit; alternativ dazu, wenn das Polynucleotid für das Polypeptid Phenylalaninhydroxylase kodiert, umfasst das Verfahren eine Therapie für Phenylketonurie. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens kodiert das Polynucleotid für ein Polypeptid, das durch die Zelle sekretiert und in den Blutkreislauf des Wirbeltiers freigesetzt wird; in einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert das Polynucleotid für menschliches Wachstumshormon.
In wiederum einer anderen Ausführungsform des Verfahrens wird eine Therapie für Hypercholesterinämie bereitgestellt, worin ein Polynucleotid, das für einen Rezeptor kodiert, der mit Cholesterin-Homöostase verbunden ist, in eine Leberzelle eingeführt und der Rezeptor durch die Zelle exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht weiters ein Verfahren zur Immunisierung eines Wirbeltiers, umfassend die Schritte des Erhaltens eines Präparats, umfassend ein exprimierbares Polynucleotid, das für ein immunogenes Translationsprodukt kodiert, und des Einführens des Präparats in ein Wirbeltier, worin das Translationsprodukt des Polynucleotids durch eine Zelle des Wirbeltiers gebildet wird, die eine Immunreaktion gegen das Immunogen hervorruft. In einer Ausführungsform umfasst das injizierbare Präparat einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, der ein exprimierbares Polynucleotid enthält, das für ein immunogenes Peptid kodiert, und bei der Einführung des Präparats in das Wirbeltier wird das Polynucleotid in eine Zelle des Wirbeltiers inkorporiert, worin ein immunogenes Translationsprodukt des Polynucleotids gebildet wird, das eine Immunreaktion gegen das Immunogen hervorruft.
Das zur Immunisierung verwendete Polynucleotid ist vorzugsweise eine mRNA-Sequenz, obwohl eine nicht-replizierende DNA-Sequenz verwendet werden kann. Das Polynucleotid ist unter Verwendung des injizierbaren Trägers alleine in Gewebe des Körpers einzuführen.
Der Träger ist vorzugsweise isotonisch, hypotonisch oder schwach hypertonisch und weist eine relativ geringe Ionenstärke auf, wie sie beispielsweise eine Saccharoselösung aufweist.
Das Verfahren kann verwendet werden, um selektiv eine humorale Immunreaktion, eine zelluläre Immunreaktion oder ein Gemisch dieser beiden hervorzurufen. In Ausführungsformen, worin die Zelle den Haupthistokompatibilitätskomplex der Klasse I exprimiert und das immunogene Peptid im Kontext des Klasse-I-Komplexes bereitgestellt ist, ist die Immunreaktion zellulär und umfasst die Produktion von zytotoxischen T-Zellen.
In solch einer Ausführungsform ist das immunogene Peptid mit einem Virus assoziiert, ist im Kontext von Klasse-I-Antigenen bereitgestellt und stimuliert zytotoxische T-Zellen, die in der Lage sind, Zellen zu zerstören, die mit dem Virus infiziert sind. Eine zytotoxische T-Zellenreaktion kann auch gemäß dem Verfahren hervorgerufen werden, in dem das Polynucleotid für ein trunkiertes virales Antigen kodiert, das keine humoralen Epitope aufweist.
In einer anderen dieser Ausführungsformen ist das immunogene Peptid mit einem Tumor assoziiert, ist im Kontext von Klasse-I-Antigenen bereitgestellt und stimuliert zytotoxische T-Zellen, die in der Lage sind, Tumorzellen zu zerstören.
Das Polynucleotid ist vorzugsweise mRNA, obwohl DNA auch verwendet werden kann. Die Erfindung ist ohne ein Liposom durchzuführen, und zwar nur unter Verwendung des Polynucleotids in einem injizierbaren Träger.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung erfordert das Erhalten nackter Polynucleotide, die operativ für ein Polypeptid kodieren, zur Inkorporation in Wirbeltierzellen. Ein Polynucleotid kodiert operativ für ein Polypeptid, wenn es über die gesamte genetische Information verfügt, die für Expression durch eine Zielzelle erforderlich ist, wie Promotoren und dergleichen. Diese Polynucleotide können dem Wirbeltier durch jedes beliebige Verfahren verabreicht werden, das den Zellen des Wirbeltiers injizierbare Materialien zuführt, wie beispielsweise durch Injektion in das Interstitium von Geweben wie Muskeln oder Haut, durch Einführen in den Blutkreislauf oder in Körperhöhlen oder durch Inhalation oder Insufflation. Ein nacktes Polynucleotid wird dem Tier mit einem pharmazeutisch annehmbaren, flüssigen Träger injiziert oder auf anderem Weg zugeführt. Bei allen Anwendungen ist der flüssige Träger wässrig oder teilweise wässrig und umfasst steriles, Pyrogenfreies Wasser. Der pH des Präparats wird auf geeignete Weise eingestellt und gepuffert. In der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Wirbeltier um ein Säugetier.
Polynucleotid-Materialien
Die nackten Polynucleotid-Materialien, die gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, umfassen DNA- und RNA-Sequenzen oder DNA- und RNA-Sequenzen, die für Polypeptide kodieren, die nützliche therapeutische Anwendungen aufweisen. Diese Polynucleotidsequenzen sind nackt in dem Sinne, dass sie frei von jeglichem Abgabevehikel sind, die so wirken können, dass das Eintreten in die Zellen erleichtert wird, beispielsweise sind die Polynucleotidsequenzen frei von viralen Sequenzen, insbesondere von jeglichen viralen Partikeln, die genetische Information tragen können. Sie sind dem ähnlich auch frei von, oder nackt in Bezug auf, jeglichem/s Material, das Transfektion fördert, wie beispielsweise von liposomalen Formulierungen, geladenen Lipiden wie Lipofectin^TM oder Fällmittel wie CaPO₄.
Die in diesen Verfahren verwendeten DNA-Sequenzen können jene Sequenzen sein, die sich nicht in das Genom der Wirtszelle integrieren. Diese können nicht-replizierende DNA-Sequenzen oder spezifische replizierende Sequenzen sein, die genetisch so verändert sind, dass ihnen die Fähigkeit zur Genomintegration fehlt.
Die Polynucleotide der Erfindung kodieren für therapeutische Polypeptide. Unter Polypeptid wird jedes beliebige Translationsprodukt eines Polynucleotids verstanden, unabhängig von Größe und davon, ob es glykosyliert ist oder nicht. Therapeutische Polypeptide umfassen als ein primäres Beispiel jene Polypeptide, die defekte oder mangelnde Spezies in einem Tier kompensieren können, oder jene, die durch toxische Effekte wirken, um schädliche Zellen im Körper einzugrenzen oder aus dem Körper zu entfernen.
Durch die Erfindung bereitgestellte therapeutische Polynucleotide können auch für Immunitäts-verleihende Polypeptide kodieren, die als endogene Immunogene wirken können, um eine humorale oder zelluläre Reaktion oder beides hervorzurufen. Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Polynucleotide können auch für einen Antikörper kodieren. In dieser Hinsicht umfasst die Bezeichnung ”Antikörper” das gesamte Immunglobulin jeder beliebigen Klasse, chimäre Antikörper und hybride Antikörper mit dualen oder vielfachen Anitgen- oder Epitopspezifitäten und Fragmente, wie F(ab)₂, Fab', Fab und dergleichen, umfassend Hybridfragmente. Auch in die Bedeutung von ”Antikörper” eingebunden sind Konjugate solcher Fragmente und so genannte Antigen-Bindungsproteine (einkettige Antikörper), wie beispielsweise im US-Patent Nr. 4.704.692 beschrieben, dessen Inhalt durch Verweis hierin aufgenommen ist.
So kann ein isoliertes Polynucleotid, das für variable Regionen eines Antikörpers kodiert, gemäß der vorliegenden Erfindung eingeführt werden, um zu ermöglichen, dass die behandelte Person Antikörper in situ produziert. Für beispielhafte Verfahren in Bezug auf das Erhalten von Antikörper-kodierenden Polynucleotiden siehe Ward et al., Nature 341, 544–546 (1989); Gillies et al., Biotechnol. 7, 799–804 (1989); und Nakatani et al., loc. cit., 805–810 (1989). Der Antikörper seinerseits würde eine therapeutische Wirkung ausüben, beispielsweise durch Binden eines Oberflächenantigens, das mit einem Pathogen assoziiert ist. Alternativ dazu können die kodierten Antikörper anti-idiotypische Antikörper (Antikörper, die andere Antikörper binden) sein, wie beispielsweise im US-Patent Nr. 4.699.880 beschrieben ist. Solche anti-idiotypischen Antikörper könnten endogene oder fremde Antikörper in einer behandelten Person binden und dadurch Erkrankungszustände, die mit einer Immunreaktion in Verbindung stehen, z. B. im Falle einer Autoimmunkrankheit, verbessern oder vermeiden.
Polynucleotidsequenzen der Erfindung kodieren vorzugsweise für therapeutische oder immunogene Polypeptide, und diese Sequenzen können in Verbindung mit anderen Polynucleotidsequenzen, die für Regulatorproteine kodieren, welche die Expression dieser Polypeptide steuern, verwendet werden. Das Regulatorprotein kann durch Binden an genomische DNA wirken, wodurch es ihre Transkription reguliert; alternativ dazu kann es durch Binden an Messenger-RNA wirken, um ihre Stabilität oder Translationswirksamkeit zu steigern oder zu senken.
Das den Zellen in vivo zugeführte Polynucleotidmaterial kann jede beliebige Anzahl an Formen annehmen, und die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein bestimmtes Polynucleotid beschränkt, das für irgendein bestimmtes Polypeptid oder eine Gruppe von Polypeptiden kodiert. Es kann nur ein Fragment eines Gens enthalten oder kann für zahlreiche Polypeptidsequenzen kodieren, und es kann zusätzlich Erkennungs- und Promotorsequenzen enthalten. Plasmide, die Gene enthalten, welche für zahlreiche physiologisch aktive Peptide und Antigene oder Immunogene kodieren, wurden in der Literatur beschrieben und können von Fachleuten leicht erhalten werden.
Hat das Polynucleotid DNA zu sein, so sind geeignete Promotoren zur Verwendung in verschiedenen Wirbeltiersystemen bekannt. Für die Verwendung in Maussystemen beispielsweise umfassen geeignete starke Promotoren RSV LTR, MPSV LTR, SV40 IEP und Metallothioneinpromotor. Bei Menschen andererseits können Promotoren wie CMV IEP vorteilhaft verwendet werden. Alle Formen von DNA, ob replizierend oder nicht-replizierend, die nicht in das Genom integriert werden und die exprimierbar sind, liegen im Rahmen der durch die Erfindung erwogenen Verfahren.
Durch die Verfügbarkeit automatisierter Synthesegeräte für Nucleinsäure können sowohl DNA als auch RNA direkt, wenn die Nucleotidsequenz bekannt ist, oder durch eine Kombination von PCR-Klonieren und Fermentation synthetisiert werden. Darüber hinaus kann, wenn die Sequenz des erwünschten Polypeptids bekannt ist, eine geeignete Codiersequenz für das Polynucleotid abgeleitet werden.
Ist das Polynucleotid mRNA, kann es einfach aus der entsprechenden DNA in vitro hergestellt werden. Beispielsweise verwenden herkömmliche Verfahren Phagen-RNA-Polymerase SP6, T3 oder T7, um mRNA aus DNA-Matrizen in Gegenwart der einzelnen Ribonucleosidtriphosphate herzustellen. Ein geeigneter Phagenpromotor, wie eine T7-Replikationsstartpunktstelle, wird in der Matrizen-DNA unmittelbar stromauf vom Gen platziert, das transkribiert werden soll. Systeme, die T7 auf diese Weise verwenden, sind bekannt und in der Literatur beschrieben, z. B. in Current Protocols in Molecular Biology, §3.8, Bd. 1 (1988). Ein besonders bevorzugtes Verfahren zum Erhalten der in der vorliegenden Erfindung verwendeten mRNA wird in den Beispielen 2–5 beschrieben. Im Allgemeinen sollte jedoch deutlich dargestellt werden, dass das pXGB-Plasmid oder jedes ähnliche Plasmid, das von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung leicht konstruiert werden kann, mit einer praktisch uneingeschränkten Anzahl an cDNA bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Solche Plasmide können vorteilhafterweise einen Promotor für eine erwünschte RNA-Polymerase umfassen, gefolgt von einer 5'-untranslatierten Region, einer 3'-untranslatierten Region und einer Matrize für einen Poly-A-Trakt. Es sollte eine einzelne Restriktionsstelle zwischen diesen 5'- und 3'-Regionen vorhanden sein, um die Insertion einer beliebigen erwünschten cDNA in das Plasmid zu erleichtern. Nach dem Klonieren des das erwünschte Gen enthaltenden Plasmids wird das Plasmid durch Schneiden in der Polyadenylierungsregion linearisiert und in vitro transkribiert, um mRNA-Transkripte zu bilden. Diese Transkripte sind vorzugsweise mit einem 5'-Cap versehen, wie in Beispiel 5 gezeigt wird. Alternativ dazu kann eine 5'-untranslatierte Sequenz wie EMC verwendet werden, die kein 5'-Cap erfordert.
Während das zuvor beschriebene ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der mRNA darstellt, wird Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sein, dass zahlreiche alternative Verfahren ebenso bestehen. Beispielsweise kann mRNA in im Handel erhältlichen Nucleotidsynthese-Vorrichtungen hergestellt werden. Alternativ dazu kann mRNA in Kreisform hergestellt werden. Exonuclease-resistente RNA wie ringförmige mRNA, chemisch blockierte mRNA und mRNA mit einem 5'-Cap sind aufgrund ihrer längeren Halbwertszeit in vivo bevorzugt.
Insbesondere ist eine bevorzugte mRNA eine selbst-zirkularisierende mRNA, wobei dem Gen von Interesse die 5'-untranslatierte Region von Poliovirus vorangeht. Es wurde gezeigt, dass ringförmige mRNA eine äußerst lange Halbwertszeit aufweist (Harland & Misher, Development 102, 837–852 (1988)) und dass die 5'-untranslatierte Region vom Poliovirus Translation von mRNA ohne das übliche 5'-Cap fördern kann (Pelletier & Sonnenberg, Nature 334, 320–325 (1988), hiermit durch Verweis aufgenommen).
Dieses Material kann unter Verwendung des Verfahrens von Been & Cech, Cell 47, 206–216 (1986), (hiermit durch Verweis aufgenommen) aus einer DNA-Matrize hergestellt werden, die selbstspleißend ist und ringförmige, ”Lasso”-geformte mRNA bildet. Die Erfinder modifizieren diese Matrize durch Einbinden der 5'-untranslatierten Region des Poliovirus unmittelbar stromauf des Gens von Interesse, woraufhin das Verfahren von Maniatis, T., et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, New York (1982), folgt.
Weiters umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von mRNA, die am 5'- und/oder am 3'-Ende chemisch blockiert ist, um Zutritt durch RNase zu vermeiden. (Dieses Enzym ist eine Exonuclease und spaltet daher RNA inmitten der Kette nicht.) Solch eine chemische Blockierung kann die Halbwertszeit der RNA in vivo wesentlich verlängern. Zwei Mittel, die verwendet werden können, um RNA zu modifizieren, sind bei Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, Kalifornien, erhältlich: C2 Amino Modifier (Katalog-Nr. 5204-1) und Amino-7-dUTP (Katalog-Nr. K1022-1). Diese Materialien fügen der RNA reaktive Gruppen hinzu. Nach Einführen jedes dieser beiden Mittel in ein RNA-Molekül von Interesse kann ein geeigneter reaktiver Substituent gemäß den Anleitungen des Herstellers an die RNA gebunden werden. Durch Hinzufügen einer Gruppe mit ausreichender Masse kann der Zugang zu chemisch modifizierter RNA durch RNase unterbunden werden.
Vorübergehende Gentherapie
Im Gegensatz zu den Gentherapien, die in der Vergangenheit vorgeschlagen wurden, ist ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung die vorübergehende Beschaffenheit der Polynucleotidsynthese in den Zellen. (Die Erfinder beziehen sich darauf mit der Bezeichnung ”Reversible Gentherapie” oder TGT). Wird mRNA gemäß der vorliegenden Erfindung eingeführt, so dauert die Wirkung im Allgemeinen etwa einen Tag lang an. Auch in starkem Gegensatz zu Gentherapien, die in der Vergangenheit vorgeschlagen wurden, muss mRNA nicht in den Kern eindringen, um Proteinsynthese zu steuern; daher sollte sie keine genetische Anfälligkeit aufweisen.
In manchen Situationen kann jedoch eine länger andauernde Wirkung ohne Inkorporation der exogenen Polynucleinsäure in das Genom des Wirtsorganismus erwünscht sein. Um für solch eine Wirkung zu sorgen, stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung das Einführen einer DNA-Sequenz, die für ein spezifisches Polypeptid kodiert, in die Zelle bereit. Die Erfinder fanden heraus, dass gemäß den Verfahren der Erfindung nicht-replizierende DNA-Sequenzen in Zellen eingeführt werden können, um für das Bilden des erwünschten Polypeptids für Zeitspannen von etwa bis zu sechs Monaten zu sorgen, und sie konnten keinen Hinweis auf Integration der DNA-Sequenzen in das Genom der Zellen beobachten. Alternativ dazu konnte eine noch länger andauernde Wirkung durch Einführen der DNA-Sequenz in die Zelle mittels eines Vektorplasmids, das die DNA-Sequenz in sich insertiert aufwies, erreicht werden. Vorzugsweise umfasst das Plasmid weiters einen Replikator. Solche Plasmide sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, beispielsweise Plasmid pBR322 mit Replikator pMB1 oder Plasmid pMK16 mit Replikator ColE1 (Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, §II: 1.5.2 (1988)).
Ergebnisse von im Laufe der Zeit durchgeführten Studien in Bezug auf die Expression von DNA und mRNA, die wie in den Beispielen 1 bis 10 beschrieben in Muskelzellen eingeführt wird, zeigen, dass mRNA-Expression rascher erfolgt, obwohl sie von kürzerer Dauer ist als DNA-Expression.
Obwohl sie nicht auf die Behandlung von genetischen Erkrankungen beschränkt ist, kann die Erfindung demgemäß bei Behandlungsstrategien geeignet zum Einsatz kommen, die Zufuhr und funktionelle Expression von fehlenden oder defekten Genen erfordern.
Die Polynucleotide können in das Interstitium von Geweben des Tierkörpers zugeführt werden, umfassend jene von Muskel, Haut, Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Knochenmark, Thymus, Herz, Lymphe, Blut, Knochen, Knorpel, Bauchspeicheldrüse, Niere, Gallenblase, Magen, Darm, Testis, Eierstock, Uterus, Rektum, Nervensystem, Auge, Drüse und Bindegewebe. Das Interstitium der Gewebe umfasst die interzelluläre, flüssige Mucopolysaccharid-Matrix von Retikulinfasern von Organgeweben, elastischen Fasern in den Wänden von Gefäßen und Kammern, Kollagenfasern von Fasergeweben oder diese selbe Matrix innerhalb von Muskelzellen umhüllendem Bindegewebe oder in den Lakunen von Knochen. Es ist dem Raum, der durch das Plasma des Blutkreislaufs und die Lymphflüssigkeit der lymphatischen Kanäle eingenommen wird, ähnlich. Die Zufuhr in das Interstitium von Muskelgewebe wird aufgrund der nachstehend erläuterten Gründe bevorzugt.
Sie können gut mittels Injektion in das Gewebe, diese Zellen umfassend, zugeführt werden. Sie werden vorzugsweise persistenten, sich nicht teilenden Zellen zugeführt und in diesen exprimiert, die differenziert sind, wobei Zufuhr und Expression auch in nicht-differenzierten oder weniger vollständig differenzierten Zellen auch erreicht werden kann, wie beispielsweise Stammzellen von Blut oder Hautfibroblasten. Die Erfinder haben entdeckt, dass Muskelzellen in vivo besonders kompetent in ihrer Fähigkeit sind, Polynucleotide aufzunehmen und zu exprimieren. Diese Fähigkeit kann auf die einzigartige Gewebearchitektur von Muskeln zurückzuführen sein, die vielkernige Zellen, sarkoplasmatisches Retikulum und transversales Tubularsystem umfasst. Polynucleotide können in den Muskel über das transversale Tubularsystem eintreten, das extrazelluläre Flüssigkeit enthält und sich bis tief in die Muskelzelle erstreckt. Es ist auch möglich, dass die Polynucleotide in verletzte Muskelzellen eintreten, die sich dann erholen können.
Muskelgewebe wird auch vorteilhafterweise als eine Stelle für die Zufuhr und Expression von Polynucleotiden in zahlreichen therapeutischen Anwendungen verwendet, da Tiere eine proportional große Muskelmasse aufweisen, die durch direkte Injektion durch die Haut leicht zugänglich ist; aus diesem Grund kann eine vergleichsweise große Dosis an Polynucleotiden im Muskel durch mehrfache Injektionen abgelagert werden, und wiederholte Injektionen, um die Therapie auf längere Zeitspannen auszudehnen, können einfach ausgeführt werden und können sicher und ohne besonders Fachwissen oder spezielle Vorrichtungen durchgeführt werden.
Muskelgewebe kann als eine Stelle für Injektion und Expression von Polynucleotiden in einer Reihe von allgemeinen Therapiearten verwendet werden, die als Beispiele genannt werden und nicht als erschöpfende Aufzählung zu verstehen sind. Erstens können Muskelerkrankungen in Verbindung mit defekten oder fehlenden Genprodukten durch Einführen von Polynucleotiden, die für ein nicht-sekretiertes Genprodukt kodieren, in das erkrankte Muskelgewebe behandelt werden. In einer zweiten Strategie können Erkrankungen anderer Organe oder Gewebe aufgrund eines fehlenden Genprodukts, die zu einer Ansammlung von zirkulierendem toxischen Metabolit führt, durch Einführen des spezifischen therapeutischen Polypeptids in Muskelgewebe behandelt werden, in dem das nicht-sekretierte Genprodukt exprimiert wird und den zirkulierenden Metabolit unschädlich macht. In einer dritten Strategie kann ein für ein sekretierbares therapeutisches Polypeptid kodierendes Polynucleotid in Muskelgewebe injiziert werden, von wo das Polypeptid in den Blutkreislauf freigesetzt wird, um ein metabolisches Target zu suchen. Diese Verwendung wird durch die Expression von Wachstumshormongen, das in den Muskel injiziert wird (Beispiel 15), dargestellt. Bestimmte DNA-Segmente sind dafür bekannt, als ”Signale” zur Steuerung von Sekretion zu dienen (Wickner, W. T., & Lodish, H. F., Science 230, 400–407 (1985)), und diese können vorteilhaft verwendet werden. Schließlich können im Rahmen von Immunisierungsstrategien in Muskelzellen Polynucleotide injiziert werden, die für immunogene Peptide kodieren, und diese Peptide werden im Kontext von Antigenen des Haupthistokompatibilitätskomplexes durch Muskelzellen dargestellt, um eine ausgewählte Immunreaktion auf das Immunogen hervorzurufen.
Gewebe, das kein Muskelgewebe ist und eine weniger effiziente Aufnahme und Expression von injizierten Polynucleotiden aufweist, kann nichtsdestotrotz vorteilhafterweise als Injektionsstelle dienen, um therapeutische Polypeptide oder Polynucleotide unter bestimmten Bedingungen zu bilden. Eine solche Bedingung ist die Verwendung eines Polynucleotids, um ein Polypeptid bereitzustellen, das, um wirksam zu sein, in Verbindung mit Zellen einer spezifischen Art vorhanden sein muss; beispielsweise Zelloberflächenrezeptoren von Leberzellen in Verbindung mit Cholesterinhomöostase. (Brown & Goldstein, Science 232, 34–47 (1986).) In dieser Anwendungsform und in zahlreichen anderen, wie beispielsweise jene, in denen ein Enzym oder Hormon das Genprodukt darstellt, ist es nicht notwendig, hohe Expressionskonzentrationen zu erreichen, um ein wertvolles therapeutisches Ergebnis zu erzielen.
Eine Anwendung von TGT liegt im Rahmen der Behandlung von Muskeldystrophie. Die genetische Grundlage der Muskeldystrophien ist gerade im Begriffe, enträtselt zu werden. Das Gen, das in Verbindung mit der Duchenne/Becker-Muskeldystrophie steht, wurde erst jüngst kloniert und kodiert für ein eher großes Protein, das als Dystrophin bezeichnet wird. Retrovirale Vektoren sind eher nicht nützlich, da sie den eher großen Umfang der cDNA (etwa 13 kb) für Dystrophin nicht aufnehmen könnten. In jüngster Vergangenheit veröffentlichte Forschungsarbeiten konzentrierten sich auf das Transplantieren von Myoblasten, doch die Nützlichkeit dieses Ansatzes muss erst bestimmt werden. Ein interessanter Ansatz wäre eindeutig, das Dystrophingen direkt im Muskel eines Patienten, der am Duchenne-Syndrom leidet, zu exprimieren. Da die meisten Patienten an Lungeninsuffizienz sterben, wären die in die Atmungsaktivität eingebundenen Muskeln ein primäres Target.
Eine andere Anwendungsform liegt im Rahmen der Behandlung von Mukoviszidose. Das für Mukoviszidose verantwortliche Gen wurde erst kürzlich identifiziert (Goodfellow, P., Nature 341(6238), 102–103 (14. September 1989); Rommens, J., et al., Science 245(4922), 1059–1065 (8. September 1989); Beardsley, T., et al., Scientific American 261(5), 28–30 (1989)). Signifikante Verbesserung der Symptome sollte durch die Expression des funktionsgestörten Proteins innerhalb der passenden Lungenzellen erreichbar sein. Für die bronchialen Epithelzellen wird vorausgesetzt, dass sie geeignete Target-Lungenzellen seien und dass sie für Gentransfer nach Instillation von Genen in die Lunge zugänglich sein könnten. Da Mukoviszidose eine autosomale rezessive Erkrankung ist, würden nur etwa 5% der normalen Konzentration an Mukoviszidose-Genprodukt erforderlich sein, um die pulmonalen Symptome signifikant zu verbessern.
Biochemische genetische Defekte im Zwischenstoffwechsel können auch durch TGT behandelt werden. Diese Erkrankungen umfassen Phenylketonurie, Galaktosämie, Ahornsirupurinkrankheit (MSUD), Homocystinurie, Propionazidämie, Methylmalonazidämie und Adenosindesaminasemangel. Die Pathogenese bei einem Großteil dieser Erkrankungen stimmt mit dem Phenylketonurie-(PKU-)Modell eines zirkulierenden toxischen Metaboliten überein. Das bedeutet, dass sich aufgrund einer Enzymblockierung eine Biochemikalie, die für den Körper toxisch ist, in den Körperflüssigkeiten sammelt. Diese Erkrankungen sind aufgrund zahlreicher Gründe ideal für Gentherapie geeignet. Erstens müssten nur 5% des normalen Niveaus an Enzymaktivität erreicht werden, um ausreichende Mengen des zirkulierenden toxischen Metabolits signifikant unschädlich zu machen, sodass der Patient eine bedeutende Besserung erfährt. Zweitens könnte das transferierte Gen in den meisten Fällen in unterschiedlichem Gewebe wiederholt exprimiert werden und dennoch stets in der Lage sein, die toxische Biochemikalie unschädlich zu machen.
Reversible Gentherapie kann auch bei Behandlungsstrategien verwendet werden, die intrazytoplasmatische oder intranukleare Proteinexpression erfordern. Manche Proteine sind dafür bekannt, dass sie in der Lage sind, Transkription durch Bindung an spezifische Promotorregionen in nuklearer DNA zu regulieren. Andere Proteine binden sich an RNA, wodurch sie ihren Abbau, ihren Transport aus dem Kern oder ihre Translationswirksamkeit regulieren. Proteine dieser Klasse müssen, um aktiv zu sein, intrazellulär zugeführt werden. Extrazelluläres Zuführen von rekombinanten Transkriptions- oder Translationsregulatorproteinen würde den Erwartungen gemäß keine biologische Aktivität aufweisen, wobei jedoch funktionelle Zufuhr der DNA oder RNA durch TGT aktiv sein würde. Beispiele für Proteine dieses Typs, die von TGT profitieren würden, umfassen NEF, TAT, Steroidrezeptor und Retinoidrezeptor.
In allen hierin dargestellten systemischen Strategien liegt eine wirksame DNA- oder mRNA-Dosis im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,05 μg/kg bis etwa 50 mg/kg, üblicherweise etwa 0,005–5 mg/kg. Dennoch, wie bekannt ist, variiert diese Dosis auf eine Weise, die für Fachleute ersichtlich ist, gemäß der Aktivität des Peptids, das durch die DNA oder mRNA kodiert ist, und des bestimmten verwendeten Peptids. Bei der Zufuhr von Adenosindesaminase zu Mäusen oder Menschen beispielsweise werden angemessene Translationsniveaus mit einer DNA- oder mRNA-Dosierung von etwa 0,5 bis 5 mg/kg erreicht. Auf Grundlage dieser Information können Dosierungen für andere Peptide bekannter Aktivität leicht bestimmt werden.
Erkrankungen, die aus Mangelzuständen an maßgeblichen Proteinen resultieren, können durch Einführen von DNA oder mRNA, die für dieses Proteine kodieren, in spezialisierte Zellen geeignet behandelt werden. Für zahlreiche Wachstumsfaktoren wie Nervenwachstumsfaktor und Fibroblastenwachstumsfaktor wurde gezeigt, dass sie das Überleben neuronaler Zellen in an Alzheimer erkrankten Tiermodellen beeinflussen. Im gealterten Rattenmodell kehrten NGF-Infusionen den Verlust an cholinergen Neuronen um. Bei der Ratte mit Fimbria-Fornix-Läsion vermieden NGF-Infusionen oder Sekretion aus genetisch modifizierten Fibroblasten ebenfalls den Verlust cholinerger Funktion. Cholinerge Aktivität wird bei an Alzheimer erkrankten Patienten herabgesetzt. Die Expression transduzierter Gene innerhalb des Gehirns, die Wachstumsfaktoren exprimieren, könnte den Funktionsverlust von spezifischen Neuronalgruppen umkehren.
Das Einführen von DNA oder mRNA durch Transfektion des Gens für neuronalen Wachstumsfaktor in Zellen, die die Schädelhöhle auskleiden, kann gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von Alzheimerkrankheit verwendet werden. Insbesondere behandelt die vorliegende Erfindung diese Krankheit durch intrakranielle Injektion von etwa 10 μg bis etwa 100 μg von DNA oder mRNA in das Parenchym mittels einer stereotaxischen Vorrichtung. Insbesondere wird die Injektion auf die cholinergen Neuronen im Medialseptum gerichtet. Die DNA- oder mRNA-Injektion wird alle 1–3 Tage bei 5'-gekappter, 3'-polyadenylierter mRNA, jede Woche bis alle 21 Tage bei ringförmiger mRNA und alle 30 bis 60 Tage bei DNA wiederholt. Injektion von DNA gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch erwogen. DNA würde in entsprechenden Mengen injiziert werden; dennoch würde die Häufigkeit der Injektionen um ein Vielfaches reduziert werden. Episomale DNA beispielsweise könnte mehrere Monate lang aktiv sein, und neuerliche Injektion wäre nur bei nachweisbaren Rückschritten des Patienten erforderlich.
Weiters könnten die für Neurotransmittersynthese verantwortlichen Enzyme von transduzierten Genen exprimiert werden. Beispielsweise könnte das Gen für Cholinacetyltransferase innerhalb der Gehirnzellen (Neuronen oder Gliazellen) von spezifischen Bereichen exprimiert werden, um Acetylcholinkonzentrationen zu erhöhen und die Gehirnfunktion zu verbessern.
Die maßgeblichen Enzyme, die in die Synthese anderer Neurotransmitter wie Dopamin, Noradrenalin und GABA eingebunden sind, wurden kloniert und sind somit erhältlich. Die Konzentration der maßgeblichen Enzyme könnte lokal durch Gentransfer in einen festgelegten Bereich des Gehirns erhöht werden. Die erhöhte Produktion dieser und anderer Neurotransmitter würden große Bedeutung für die Manipulation lokalisierter Neurotransmitterfunktion und so auf zahlreiche Gehirnerkrankungen, in denen gestörte Neurotransmitterfunktion eine zentrale Rolle spielt, haben. Insbesondere könnten diese Erkrankungen Schizophrenie und manisch-depressive Krankheiten sowie Parkinsonkrankheit umfassen. Es ist weitgehend bekannt, dass Patienten mit Parkinsonkrankheit aufgrund mangelnder Dopaminsynthese innerhalb der Basalganglien unter fortschreitend schlechter werdender motorischer Kontrolle leiden. Der Vorgang, der die Geschwindigkeit der Dopaminsynthese limitiert, ist die Umsetzung von Tyrosin zu L-DOPA durch das Enzym Tyrosinhydroxylase. L-DOPA wird dann zu Dopamin durch das überall vorkommende Enzym DOPA-Decarboxylase umgesetzt. Deshalb ist die bereits weitverbreitete Therapieform mit L-DOPA wirksam (zumindest in den ersten paar Jahren der Behandlung). Gentherapie könnte ein ähnliches pharmakologisches Ziel durch Exprimieren der Gene für Tyrosinhydroxylase und mögliche DOPA-Decarboxylase ebenfalls erreichen. Tyrosin ist innerhalb des ZNS leicht erhältlich.
Die genetische Form von Alpha-1-Antitrypsin-Mangel kann sowohl in Leber- als auch in Lungenerkrankungen resultieren. Die Lebererkrankung, die weniger häufig vorkommt, wird durch Akkumulierung eines anormalen Proteins verursacht und wäre weniger geeignet für eine Behandlung mittels Gentherapie. Pulmonale Komplikationen jedoch würden für erhöhte Expression von Alpha-1-Antitrypsin innerhalb der Lunge zugänglich sein. Dies sollte die Entwicklung von Beschwerden und schließlich von tödlichen Emphysemen unterbinden.
Alpha-1-Antitrypsin-Mangel tritt auch bei Rauchern auf, da Tabakrauch Alpha-1-Antitrypsin-Aktivität und somit Serinprotease-Aktivität herabsetzt, was zu Emphysemen führt. Darüber hinaus stellen jüngste Daten eine Verbindung zwischen der Wirkung von Tabakkonsum auf Antitrypsin und Aneurysmen der Aorta her. Aneurysmen würden auch durch steigende Konzentration von Anti-1-Antitrypsin im Blut vermeidbar sein, da dies Protease-Aktivität herabsetzen würde, was zu Aneurysmen führt.
Patienten mit degenerativen Krankheiten der Lunge können auch von der Expression von Enzymen profitieren, die in der Lage sind, andere toxische Metaboliten zu entfernen, die sich tendenziell in erkranktem Lungengewebe akkumulieren. Superoxiddismutase und -katalase könnten durch TGT zugeführt werden, um diesen Problemen Abhilfe zu schaffen.
TOT kann bei Behandlungsstrategien verwendet werden, die die Zufuhr von Zelloberflächenrezeptoren erfordern. Es könnte das Argument vorgebracht werden, dass es keinen Bedarf gibt, eine Methodik für funktionelle Zufuhr von Genen in vivo zu entschlüsseln. Es gibt nämlich eine anerkannte Technik zur Synthese und Produktion in großem Umfang von Proteinen, und Proteine sind das Endprodukt von Genexpression. Diese Logik lässt sich auf zahlreiche Proteinmoleküle, die extrazellulär wirken oder mit Zelloberflächenrezeptoren wechselwirken, anwenden, wie beispielsweise Gewebe-Plasminogenaktivator (TPA), Wachstumshormon, Insulin, Interferon, Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GMCSF), Erythropoietin (EPO) usw. Dennoch schienen bis heute die Probleme der Wirkstoffzufuhr in Verbindung mit der geeigneten Zufuhr eines rekombinanten Zelloberflächenrezeptors, der in die Plasmamembran seiner Zielzelle in der richtigen Orientierung für einen funktionellen Rezeptor zu insertieren ist, nicht lösbar zu sein.
Wird DNA oder RNA, die für einen Zelloberflächenrezeptor kodieren, intrazellulär gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, so kann das resultierende Protein wirksam und funktionell an der Zielzellenoberfläche exprimiert werden. Bleibt das Problem der funktionellen Zufuhr rekombinanter Zelloberflächenrezeptoren unlösbar, so ist die einzige Möglichkeit für diese therapeutische Modalität, über Genzufuhr zu arbeiten. Eine ähnliche Logik für nukleare oder zytoplasmatische Regulierung von Genexpression lässt sich auf Kernregulatorfaktor anwenden, der an DNA gebunden ist, um RNA-Transkription (hinauf oder hinunter) zu regulieren, und auf zytoplasmatische Regulatorfaktoren, die an RNA binden, um die Translationswirksamkeit und den Abbau zu steigern oder zu senken. TGT könnte auf diese Weise therapeutische Strategien zur Behandlung von Mukoviszidose, Muskeldystrophie und Hypercholesterinämie bereitstellen.
Erhöhter Cholesterinspiegel im Blut kann gemäß der vorliegenden Erfindung durch Bereitstellen von mRNA, die für den LDL-Oberflächenrezeptor für Hepatozyten kodiert, reduziert werden. Ein leichter Anstieg der Produktion dieses Rezeptors in der Leber von Patienten mit erhöhtem LDL-Spiegel bringt signifikante therapeutische Vorteile mit sich. Therapien auf der Grundlage systemischer Verabreichung rekombinanter Proteine können keineswegs die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung erreichen, da einfache Verabreichung des rekombinanten Proteins den Rezeptor nicht in die Plasmamembran der Zielzellen bringen könnte. Der Rezeptor muss jedoch korrekt in die Membran insertiert werden, um seine biologische Wirkung entfalten zu können. Es ist üblicherweise nicht notwendig, den Grad der Rezeptorexpression zu regulieren; je höher die Expression, umso besser. Dies vereinfacht die in die Herstellung von mRNA zur Verwendung für die vorliegende Erfindung eingebundene Molekularbiologie.
Auch kann zur Behandlung von Krebs ein Zellzyklus-spezifischer Promotor verwendet werden, der nur Zellen tötet, die rasch zyklieren (sich rasch teilen), wie Krebszellen. Zellzyklus-spezifisches Töten könnte auch durch Entwerfen von mRNA erfolgen, die für Killerproteine kodiert, die nur in zyklierenden Zellen stabil sind (d. h. Histon-mRNA, die nur während der S-Phase stabil ist). Auch könnten Entwicklungs-spezifische Promotoren wie α-Fetoprotein verwendet werden, die nur in fötalen Leberzellen und in Hepatoblastomzellen exprimiert werden, die sich zu einem noch stärker fötalen Stadium entdifferenziert haben.
Auch könnten spezialisierte Krebsarten durch den Transfer von Genen wie das Retinoblastomgen (und andere dieser Familie) behandelt werden, die die Krebseigenschaften bestimmter Krebsarten unterdrücken.
Die TGT-Strategie kann verwendet werden, um eine kontrollierte, beständige Zufuhr von Peptiden sicherzustellen. Herkömmliche Wirkstoffe sowie rekombinante Proteinwirkstoffe können von gesteuerten Freisetzungsvorrichtungen profitieren. Der Zweck der gesteuerten Freisetzungsvorrichtung ist, Wirkstoffe über eine längere Zeitspanne hinweg zuzuführen, sodass die Anzahl der erforderlichen Dosen reduziert wird. Dies bringt höheren Komfort für Patienten und führt zu größerer Bereitschaft seitens dieser. Es gibt zahlreiche verschiedene Technologien, die im Begriffe sind, entwickelt zu werden, und die darauf abzielen, gesteuerte Freisetzung zu erreichen.
TGT kann verwendet werden, um gesteuerte Zufuhr therapeutischer Peptide zu erreichen. Regulierte Expression kann durch Verwendung geeigneter Promotoren, umfassend zellspezifische Promotoren, erreicht werden. Geeignete Peptide, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, umfassen beispielsweise Wachstumshormon, Insulin, Interleukine, Interferone, GMCSF, EPO und dergleichen. Je nach spezifischer Anwendung kann das ausgewählte DNA- oder RNA-Konstrukt so entworfen sein, dass es in einem Genprodukt resultiert, das aus den injizierten Zellen und in den systemischen Blutkreislauf sekretiert wird.
TGT kann auch die gesteuerte Zufuhr therapeutischer Polypeptide oder Peptide umfassen, die durch Einbinden eines zusätzlichen Polynucleotids, das für ein Regulatorprotein kodiert, das Transkriptions- und Translationsvorgänge steuert, in das in der Zelle zu exprimierende Polynucleotid erreicht werden. Diese Polynucleotide umfassen jene, die wirken, um Polypeptidexpression entweder hinauf oder hinunter zu regulieren, und ihre Wirkung entweder innerhalb des Kerns oder durch Steuern von Proteintranslationsereignissen im Zytoplasma ausüben.
Das T7-Polymerasegen kann in Verbindung mit einem Gen von Interesse verwendet werden, um längere Dauer der TGT-Wirkung zu erzielen. Episomale DNA wie jene, die aus der Region des Replikationsstartpunkts für den Epstein-Barr-Virus erhalten ist, kann verwendet werden sowie auch jene, die von anderen Replikationsstartpunkten stammen, die in Säugetierzellen funktionell aktiv sind, und vorzugsweise jene, die in menschlichen Zellen aktiv sind. Dies ist eine Möglichkeit, Expression von Zellen ausgehend nach zahlreichen Zellteilungen zu erhalten, ohne ungünstige Integrationsereignisse zu riskieren, die bei Retrovirus-Vektoren üblich sind. Gesteuerte Freisetzung von Calcitonin könnte erreicht werden, wenn ein Calcitoningen unter der Steuerung seines eigenen Promotors in einen bestimmten Ort, wie Leber oder Haut, funktionell eingeführt werden könnte. Krebspatienten mit Hyperkalzämie würden eine Gruppe darstellen, in der diese Therapie zum Einsatz kommen könnte.
Zellspezifische Promotoren können auch verwendet werden, um Expression des Gens nur in der Zielzelle zu ermöglichen. Beispielsweise sind bestimmte Gene bei Erwachsenen nur in bestimmten Tumorarten stark gefördert. Dem ähnlich wurden auch gewebespezifische Promotoren für spezialisierte Gewebe, z. B. Linsengewebe des Auges, identifiziert und in heterologen Expressionssystemen verwendet.
Zusätzlich zu den beschriebenen Therapien kann das Verfahren der Erfindung verwendet werden, um Polynucleotide einem Tierbestand zuzuführen, um die Milchproduktion bei Milchkühen oder die Muskelmasse bei Zuchtvieh für Fleischproduktion zu erhöhen.
DNA- und mRNA-Vakzinen
Gemäß den Verfahren der Erfindung kann sowohl exprimierbare DNA als auch mRNA den Zellen zugeführt werden, um darin ein Polypeptidtranslationsprodukt zu bilden. Enthalten die Nucleinsäuren die geeigneten Kontrollsequenzen, werden sie die Synthese von relativ großen Mengen des kodierten Proteins steuern. Kodiert die den Zellen zugeführte DNA oder mRNA für ein immunisierendes Peptid, so können Verfahren angewandt werden, um verbesserte und wirksamere Immunität gegen infektiöse Agenzien, umfassend intrazelluläre Viren, und auch gegen Tumorzellen zu erreichen.
Die Erfindung ermöglicht direkte Injektion des Polynucleotids in Zellen des Tieres in vivo.
Die Polynucleotide können verschiedenen Zellen des Tierkörpers zugeführt werden, umfassend Muskel, Haut, Gehirn, Lunge, Leber, Milz oder andere Zellen des Bluts. Die Zufuhr der Polynucleotide direkt in vivo ist im Fall von Muskel- und Hautzellen bevorzugt. Die Polynucleotide können unter Verwendung einer Injektionsspritze in Muskel oder Haut injiziert werden. Sie können auch unter Verwendung einer Impfpistole Muskeln oder Haut zugeführt werden.
Impfung mit Nucleinsäuren, die ein Gen für ein Antigen enthalten, kann auch eine Möglichkeit bereitstellen, spezifisch auf die zelluläre Immunreaktion abzuzielen. Zellen, die Proteine exprimieren, die sekretiert werden, treten in normale Antigen-verarbeitende Stoffwechselwege ein und produzieren sowohl eine humorale als auch eine zytotoxische Reaktion. Die Reaktion auf Proteine, die nicht sekretiert werden, ist selektiver. Nicht-sekretierte Proteine, die in Zellen synthetisiert wurden, die nur Klasse-I-MHC-Moleküle exprimieren, bilden der Erwartung nach nur eine zytotoxische Impfung. Expression desselben Antigens in Zellen, die sowohl Klasse-I- als auch Klasse-II-Moleküle in sich tragen, kann durch Stimulieren sowohl zytotoxischer Zellen als auch Helfer-T-Zellen eine heftigere Reaktion hervorrufen.
Therapeutische Formulierungen
Polynucleotidsalze: Die Verabreichung von pharmazeutisch annehmbaren Salzen der hierin beschriebenen Polynucleotide ist im Schutzumfang der Erfindung eingebunden. Solche Salze können von pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Basen, umfassend organischer Basen und anorganischer Basen, hergestellt werden. Salze, die von anorganischen Basen abgeleitet sind, umfassen Natrium, Kalium, Lithium, Ammonium, Calcium, Magnesium und dergleichen. Salze, die von pharmazeutisch annehmbaren, organischen, nicht-toxischen Basen abgeleitet sind, umfassen Salze primärer, sekundärer und tertiärer Amine, basische Aminsalze und dergleichen. Eine hilfreiche Erläuterung zu pharmazeutischen Salzen ist in S. M. Berge et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 66, 1–19 (1977), zu finden, dessen Offenbarung hiermit durch Verweis aufgenommen ist.
Polynucleotide zur Injektion können in Einheitsdosenform in Ampullen oder in Mehrfachdosen-Behältern hergestellt werden. Die Polynucleotide können in solchen Formen als Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder vorzugsweise wässrigen Trägern vorhanden sein. Alternativ dazu kann das Polynucleotidsalz in lyophilisierter Form zur Wiederherstellung zum Zeitpunkt der Verwendung mit einem geeigneten Träger wie sterilem pyrogenfreiem Wasser vorhanden sein. Sowohl flüssige als auch lyophilisierte Formen, die wiederherzustellen sind, umfassen Mittel, vorzugsweise Puffer, in erforderlichen Mengen, um den pH der injizierten Lösung geeignet einzustellen. Bei jeder parenteralen Verwendung, besonders wenn die Formulierung intravenös zu verabreichen ist, sollte die Gesamtkonzentration der Gelöststoffe kontrolliert sein, um das Präparat isotonisch, hypotonisch oder schwach hypertonisch zu machen. Nichtionische Materialien wie Zucker sind zum Einstellen der Tonizität bevorzugt, und Saccharose ist besonders bevorzugt. Jegliche dieser Formen können weiters geeignete Formulierungsmittel wie Stärke oder Zucker, Glycerin oder Saline umfassen. Die Zusammensetzungen pro Einheitsdosis können von 0,1% bis 99% Polynucleotidmaterial enthalten.
Die Einheitsdosisampullen oder Mehrfachdosisbehälter, in denen die Polynucleotide vor Verwendung verpackt sind, können einen hermetisch abgeschlossenen Behälter umfassen, der eine Menge an Polynucleotid oder an Polynucleotid-hältiger Lösung, die geeignet für eine pharmazeutisch wirksame Dosis davon ist, oder eine Vielzahl an wirksamen Dosen enthält. Das Polynucleotid ist als eine sterile Formulierung verpackt, und der hermetisch abgeschlossene Behälter ist so entworfen, dass er die Sterilität der Formulierung bis zur Verwendung bewahrt.
Die Behälter, in denen das Polynucleotid verpackt ist, wird markiert, und die Markierung trägt eine Beschriftung gemäß der durch öffentliche Behörden, wie beispielsweise durch die Food and Drug Administration (Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimitteln), vorgeschriebenen Form, wobei diese Beschriftung die Bewilligung seitens der Behörde unter dem Bundesgesetz eingebunden hat und sich auf Herstellung, Verwendung oder Verkauf des darin enthaltenen Polynucleotidmaterials zur Verabreichung an Menschen bezieht.
Das Bundesgesetz erfordert, dass die Verwendung pharmazeutischer Mittel in Therapien für Menschen durch die Behörde der Bundesregierung genehmigt werden muss. Die Verantwortung für den Vollzug liegt im Kompetenzbereich der Food and Drug Administration, die geeignete Bestimmungen zur Sicherstellung solcher Bewilligungen festlegt, die in 21 U.S.C. 301–392 näher beschrieben sind. Eine Bestimmung für biologisches Material, umfassend Produkte, die aus Tiergewebe hergestellt werden, ist unter 42 U.S.C. 262 bereitgestellt. Ähnliche Arten der Bewilligung sind in den meisten anderen Ländern als den USA auch erforderlich. Bestimmungen unterscheiden sich von Land zu Land, die einzelnen Verfahren sind jedoch Fachleuten bekannt.
Dosierung und Möglichkeiten der Verabreichung
Die zu verabreichende Dosierung hängt zum Großteil von Zustand und Größe der zu behandelnden Person sowie von der Häufigkeit der Behandlung und der Art der Verabreichung ab. Therapiepläne für fortlaufende Therapien, die Dosis und Häufigkeit umfassen, können auf Grundlage der anfänglichen Reaktion und der klinischen Beurteilung erstellt werden. Der Weg der parenteralen Injektion in das Interstitium von Gewebe ist bevorzugt.
In bevorzugten Arbeitsvorschriften wird eine Formulierung, die das nackte Polynucleotid in einem wässrigen Träger umfasst, in Gewebe in Mengen von 10 μl pro Stelle bis etwa 1 ml pro Stelle injiziert. Die Polynucleotid-Konzentration in der Formulierung beträgt etwa 0,1 μg/ml bis etwa 20 mg/ml.
Regulierung von TGT
Genau wie DNA-basierte Gentransfer-Arbeitsvorschriften geeignete Signale zum Transkribieren (Promotoren, Enhancer) und Verarbeiten (Spleißsignale, Polyadenylierungssignale) des mRNA-Transkripts erfordern, so erfordert mRNA-basierte TGT die geeigneten Struktur- und Sequenzelemente für wirksame und korrekte Translation zusammen mit jenen Elementen, die die Stabilität der transfizierten mRNA fördern.
Im Allgemeinen wurde herausgefunden, dass Translationswirksamkeit durch spezifische Sequenzelemente in der 5'-nichtkodierenden oder untranslatierten Region (5'UTR) der RNA reguliert wird. Positive Sequenzmotive umfassen die Translationsstart-Consensussequenz (GCC)^ACCATGG (Kozak, Nucleic Acids Res. 15, 8125 (1987)) und die 5^G-7-Methyl-GpppG-Cap-Struktur (Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13, 7375 (1985)). Negative Elemente umfassen stabile Intramolekular-5'-UTR-Stammschleifen-Strukturen (Muesing et al., Cell 48, 691 (1987)) und AUG-Sequenzen oder kurze offene Leseraster, denen eine geeignete AUG in der 5'-UTR vorangeht (Kozak, s. o., Rao et al., Mol. and Cell. Biol. 8, 284 (1988)). Zusätzlich können bestimmte Sequenzmotive wie die β-Globin-5'-UTR über einen unbekannten Mechanismus translationsfördernd wirken (wenn sie neben eine heterologe 5'-UTR platziert werden. Es gibt auch Beispiele für spezifische 5'-UTR-Sequenzen, die eukaryotische Translationswirksamkeit als Reaktion auf umgebende Signale regulieren. Diese umfassen die menschliche Ferritin-5'-UTR (Hentze et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6730 (1987)) und die Drosophila-hsp ⁷0-5'-UTR (Klemenz et al., EMBO Journal 4, 2053 (1985)). Schließlich gibt es virale 5'-UTR-Sequenzen, die in der Lage sind, normale Cap-abhängige Translation und Translationskontrollen zu umgehen und eine wirksame Translation viraler oder chimärer mRNA zu vermitteln (Dolph et al., J. of Virol. 62, 2059 (1988); Pelletier & Sonnenberg, Nature 334, 320 (1988)). Arbeitsvorschriften für mRNA-basierte TGT müssen daher geeignete 5'-UTR-Translationselemente umfassen, die die Codiersequenz für das Protein von Interesse flankieren.
Neben Elementen in Bezug auf Translation muss im Laufe der Ausarbeitung von Arbeitsvorschriften für mRNA-basierte TGT auch mRNA-Stabilität berücksichtigt werden. Ganz allgemein gesprochen sind Capping und 3'-Polyadenylierung die wichtigsten positiven Determinanten für eukaryotische mRNA-Stabilität (Drummond, s. o.; Ross, Mol. Biol. Med. 5, 1 (1988)) und wirken so, dass sie die 5'- und 3'-Enden der mRNA vor Abbau schützen. Es wurden jedoch auch Regulatorelemente definiert, die die Stabilität von eukaryotischen mRNA beeinflussen und daher in der Ausarbeitung von mRNA-TGT-Arbeitsvorschriften berücksichtigt werden müssen. Die nennenswertesten und am deutlichsten definierten dieser Elemente sind die 3'-untranslatierten Regionen (3'-UTR) der Uridin-reichen Destabilisierungssequenzen, die in zahlreichen mRNA mit kurzer Halbwertszeit gefunden wurden (Shaw & Kamen, Cell 46, 659 (1986)), obwohl es Hinweise gibt, dass diese nicht die einzigen Sequenzmotive sind, die zu mRNA-Destabilisierung führen (Kabnick & Housman, Mol. and Cell. Biol. 8, 3244 (1988)). Zusätzlich wurden auch spezifische Regulatorsequenzen dargestellt, die die Halbwertszeit zellulärer mRNA in Reaktion auf umgebende Stimuli modulieren. Diese umfassen die Östrogen-vermittelte Modulation von Vitellogenin-mRNA-Stabilität (Brock & Shapiro, Cell 34, 207 (1983)), die Eisen-abhängige Regulierung von Transferrinrezeptor-mRNA-Stabilität (Mullner & Kuhn, Cell 53, 815 (1988)), die auf ein spezifisches 3'-UTR-Motiv zurückzuführen ist, die Prolactin-vermittelte Kontrolle von Casein-mRNA-Stabilität (Guyette et al., Cell 17, 1013 (1989)), die Regulierung von Fibronectin-mRNA-Stabilität als Reaktion auf zahlreiche Stimuli (Dean et al., J. Cell. Biol. 106, 2159 (1988)) und die Kontrolle von Histon-mRNA-Stabilität (Graves et al., Cell 48, 615 (1987)). Schließlich haben sich nur virale RNA-Sequenzen entwickelt, die normale eukaryotische mRNA-Translationskontrollen umgehen, und dem ähnlich scheinen manche virale RNA-Sequenzen in der Lage zu sein, Stabilität in Abwesenheit von 3'-Polyadenylierung zu verleihen (McGrae & Woodland, Eur. J. of Biochem. 116, 467 (1981)). Manche 5', wie EMC, gemäß Beispiel 21, sind bekannt dafür, ohne ein Cap zu funktionieren. Diese Widersprüchlichkeit in Bezug auf Stabilitäts-modulierende Elemente muss im Rahmen der Ausarbeitung von Arbeitsvorschriften für mRNA-basierte TGT ebenfalls sorgfältig in Betracht gezogen werden und kann verwendet werden, um die Wirkung einer mRNA-Behandlung zu modulieren.
Die vorliegende Erfindung ist folgend unter Verwendung der nachstehenden 23 Beispiele näher beschrieben; die beschriebenen Verfahren sind jedoch wie hierin beschrieben allgemein anwendbar und sollen nicht durch die Beispiele eingeschränkt werden.
Die Erfindung verwendet nur ein Polynucleotid in einem pharmazeutisch annehmbaren, injizierbaren Träger, wobei dieser Träger flüssig ist. In manchen der folgenden Beispiele ist ein experimenteller Vergleich mit Formulierungen, die Liposome oder Lipide enthalten, eingebunden: solche Formulierungen sind nicht von der vorliegenden Erfindung abgedeckt.
BEISPIEL 1: HERSTELLUNG VON LIPOSOM-BILDENDEM DOTAP
Das kationische, Liposom-bildende Material 1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)propan (DOTAP) wird wie von L. Stamatatos et al., s. o., oder H. Eibl et al., s. o., beschrieben hergestellt.
Kurz beschrieben berichten Stamatatos et al., dass 1 mmol 3-Brom-1,2-propandiol (Aldrich) 48 Stunden lang bei 20°C mit 3 mmol Oleylchlorid (frisch hergestellt aus Oleinsäure und Oxaloylchlorid) in trockenem, alkoholfreiem Diethylether (20 ml), der 5 ml trockenes Pyridin enthielt, acyliert wurde. Das Präzipitat von Pyridiniumhydrochlorid wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde unter Stickstoff eingeengt und in 10 ml Hexan wieder aufgelöst. Die Hexanlösung wurde dreimal mit einem gleichen Volumen von 1:1 Methanol/0,1 N wässrigem NCOONa, pH 3,0, dreimal mit 1:1 Methanol/0,1 N wässriger NaOH und einmal mit 1%igem wässrigem NaCl gewaschen. Das rohe 3-Brom-1,2-bis-(oleolyloxy)propan wurde dann 72 Stunden lang in einem abgeschlossenen Röhrchen mit einer Lösung von 15% Trimethylamin in trockenem Dimethylsulfoxid (30 ml) bei 25°C gerührt. Die Produkte dieser Reaktion wurden in Chloroform (200 ml) aufgelöst, was wiederholt mit 1:1 Methanol/100 mM wässrigem HCOONa, pH 3,0, gewaschen und anschließend in Vakuum eingedampft wurde, um ein hellgelbes Öl zu erhalten. Dieses Material wurde auf einer Kieselsäure-Säule (Bio-Sil A, Bio-Rad Laboratories) gereinigt und mit einem 0–15%igen Gradienten von Methanol in Chloroform eluiert, um das erwünschte Produkt in reiner Form bei 9–10% Methanol zu ergeben. Das gereinigte Produkt war ein farbloses, zähflüssiges Öl, das mit einem R_f von 0,4 auf Dünnschicht-Chromatographieplatten (Kieselgel G) wanderte, die mit 50:15:5:5:2 CHCl₃/Aceton/CH₃OH/CH₃COOH/H₂O entwickelt wurden.
BEISPIEL 2: HERSTELLUNG VON PLASMIDEN ZUR ERZEUGUNG VON DNA-MATRIZEN FÜR JEDES BELIEBIGE GEN VON INTERESSE
Geeignete Matrizen-DNA zur Herstellung von mRNA, die für ein erwünschtes Polypeptid kodiert, kann gemäß herkömmlicher DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Wie bereits zuvor berichtet wurde (P. Kreig et al., Nucleic Acids Res. 12, 7057–7070 (1984)), erleichtert ein 5'-Cap die Translation von mRNA. Darüber hinaus wird von den 3'-flankierenden Regionen und dem Poly(A)-Ende angenommen, dass sie die Halbwertszeit von mRNA in vivo verlängern.
Der leicht erhältliche SP6-Klonierungsvektor pSP64T stellt 5'- und 3'-flankierende Regionen aus β-Globin, einer wirksam translatierten mRNA, bereit. Die Konstruktion dieses Plasmids wird von Kreig et al. (s. o.) näher beschrieben und ist hiermit durch diesen Verweis aufgenommen. Jede cDNA, die ein Startcodon enthält, kann in dieses Plasmid eingeführt werden, und mRNA kann von der resultierenden Matrizen-DNA hergestellt werden. Dieses bestimmte Plasmid kann mit BglII geschnitten werden, um jede erwünschte cDNA, die für ein Polypeptid von Interesse kodiert, einzuführen.
Obwohl gute Ergebnisse mit pSP64T erzielt werden können, wenn er linearisiert und anschließend in vivo mit SP6-RNA-Polymerase transkribiert wird, bevorzugen die Erfinder, die Xenopus-β-Globin-flankierenden Sequenzen von pSP64T mit Phagen-T7-RNA-Polymerase zu verwenden. Diese flankierenden Sequenzen werden aus pSP64T als die kleinen (etwa 150 bp) HindIII-->EcoRI-Fragmente gereinigt. Diese Sequenzen werden anschließend in ein gereinigtes unverzweigtes HindIII/EcoRI-Fragment (etwa 2,9 kbp) aus pIBI 31 (im Handel erhältlich bei international Biotechnologies, Inc., Newhaven, Connecticut 06535) mit T4-DNA-Ligase insertiert. Resultierende Plasmide, als pXBG bezeichnet, werden auf Ausrichtung gescreent und in E. coli transformiert. Diese Plasmide werden angepasst, um jedes beliebige Gen von Interesse an einer einzigartigen BglII-Restriktionsstelle, die zwischen den zwei Xenopus-β-Globin-Sequenzen liegt, zu empfangen.
BEISPIEL 3: HERSTELLUNG VON FÜR CHLORAMPHENICOLACETYLTRANSFERASE KODIERENDEM PLASMID
Ein gut geeignetes Markierungsgen zur Darstellung von In-vivo-Expression von exogenen Polynucleotiden ist Chloramphenicolacetyltransferase, CAT. Ein Plasmid pSP-CAT, das das CAT-Gen, flankiert durch die Xenopus-β-Globin-5'- und -3'-Sequenzen, enthält, wurde durch Addieren des CAT-Gens in die BglII-Stelle von pSP64T hergestellt. Die Erfinder verwendeten das CAT-Gen in der Form des kleinen BamHI/HindIII-Fragments aus pSV2-CAT (erhältlich bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Zugriffsnummer: 37.155). Das CAT-Gen ist jedoch ein üblicherweise in der Molekularbiologie verwendetes Gen und ist aus zahlreichen Quellen erhältlich. Sowohl das CAT-BamHI/HindIII-Fragment als auch das BglII-gespaltene pSP64T wurden mit dem Klenow-Fragment inkubiert, um stumpfe Enden hervorzubringen, und wurden anschließend mit T4-DNA-Ligase ligiert, um pSP-CAT zu bilden.
Das kleine PstI/HindIII-Fragment wurde anschließend hergestellt und gereinigt, das das CAT-Gen zwischen den 5'- und 3'-β-Globin-Flankiersequenzen von pSP64T aufweist. pIBI31 (International Biotechnologies, Inc.) wurde mit PstI und HindIII gespalten, und die lange unverzweigte Sequenz wurde gereinigt. Dieses Fragment wurde anschließend mit der das CAT-Gen enthaltenden Sequenz kombiniert, und die Fragmente wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert, um ein Plasmid mit der Bezeichnung pT7CA-An zu bilden. Klone wurden auf Grundlage von β-Galactosidase-Aktivität mit XgaI und Ampicillinresistenz ausgewählt.
BEISPIEL 4: HERSTELLUNG EINER GEREINIGTEN DNA-MATRIZE
Die Plasmid-DNA aus Beispiel 3 wird gezüchtet und wie nach Maniatis (s. o.) hergestellt, außer ohne Rnase, und zwar unter Verwendung von 2 CsCl-Zentrifugationen, um bakterielle RNA zu entfernen. Insbesondere wurde E. coli, pT7CAT-An aus Beispiel 3 enthaltend, in Ampicillin-hältigem LB-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden anschließend durch 10-minütiges Schleudern bei 5.000 U/min in einer Sorvall-RC-5-Zentrifuge (E. I. DuPont, Burbank, California 91510) pelletiert, in kaltem TE, pH 8,0, resuspendiert, wiederum 10 Minuten lang bei 5.000 U/min zentrifugiert und in einer Lösung von 50 mM Glucose, 25 mM Tris-Cl pH 8,0, 10 mM EDTA und 40 mg/ml Lysozym resuspendiert. Nach Inkubation für 5 bis 10 Minuten unter gelegentlichem Umdrehen wurden 0,2 N NaOH mit 1% SDS zugesetzt, woraufhin 10 Minuten später bei 0°C 3 M Kaliumacetat und 2 M Essigsäure zugesetzt wurden. Nach weiteren 10 Minuten wurde das Material wiederum bei 6.000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. Das Pellet wurde dann in 0,6 vol. Isopropanol (–20°C) gemischt, vermischt und bei –20°C 15 Minuten lang gelagert. Das Material wurde anschließend wiederum bei 10.000 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert, dieses Mal in einem HB4-Ausschwingrotorgerät (DuPont, s. o.), wonach der Überstand entfernt wurde und das Pellet in 70% EtOH gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet wurde. Weiters wurde das Pellet in 3,5 ml TE resuspendiert, woraufhin 3,4 g CsCl und 350 μl von 5 mg/ml EtBr zugesetzt wurden. Das resultierende Material wurde in Quick-Seal-Röhrchen gegeben, das bis oben hin mit Mineralöl gefüllt war. Das Röhrchen wurde 3,5 Stunden lang bei 80.000 U/min in einer VTi80-Zentrifuge (Beckman Instruments, Pasadena, California 91051) zentrifugiert. Die Schicht wurde entfernt, und das Material wurde erneut zentrifugiert, wobei das Volumen durch 0,95 g CsCl/ml und 0,1 ml oder 5 mg/ml EtBr/ml in TE ergänzt wurde. Das EtBr wurde dann mit einem gleichen Volumen an mit TE gesättigtem N-Butanol extrahiert, nachdem 3 Volumina von TE der Schicht zugesetzt worden waren, wobei die oberste Phase verworfen wurde, bis die oberste Phase sauber war. Dann wurden 2,5 vol. EtOH zugesetzt, und das Material wurde bei –20°C 2 Stunden lang ausgefällt. Das resultierende DNA-Präzipitat wird als eine DNA-Matrize zur Herstellung von mRNA in vitro verwendet.
BEISPIEL 5: HERSTELLUNG VON mRNA ZUR TRANSFEKTION
Die DNA aus Beispiel 4 wurde stromab vom Poly-A-Ende mit einem fünffachen Überschuss an PstI linearisiert. Die linearisierte DNA wurde dann mit zwei Phenol/Chloroform-Extraktionen gereinigt, woraufhin zwei Chloroform-Extraktionen folgten. DNA wurde dann mit NaOAc (0,3 M) und 2 Volumina EtOH ausgefällt. Das Pellet wurde bei etwa 1 mg/ml in DEP-behandeltem, entionisiertem Wasser resuspendiert.
Anschließend wurde ein Transkriptionspuffer hergestellt, umfassend 400 mM Tris HCl (pH 8,0), 80 mM MgCl₂, 50 mM DTT und 40 mM Spermidin. Dann wurden die folgenden Materialien in folgender Reihenfolge einem Volumen an DEP-behandeltem Wasser bei Raumtemperatur zugesetzt: 1 vol. T7-Transkriptionspuffer, zuvor hergestellt; rATP, rCTP und rUTP bis 1 mM Konzentration; rGTP bis 0,5 mM Konzentration; 7meG(5')ppp(5')G-Capanalogon (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts 01951) bis 0,5 mM Konzentration; die zuvor hergestellte, linearisierte DNA-Matrize bis 0,5 mg/ml Konzentration; RNAsin (Promega, Madison, Wisconsin) bis 2.000 U/ml Konzentration; und T7-RNA-Polymerase (N. E. Biolabs) bis 4.000 U/ml Konzentration.
Dieses Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Der Erfolg der Transkriptionsreaktion wurde durch steigende Trübung des Reaktionsgemischs bestätigt.
Nach der Bildung von mRNA wurden 2 U RQ1-DNase (Promega) pro μg verwendeter DNA-Matrize zugesetzt, und die Matrize wurde dadurch 15 Minuten lang verdauen gelassen. Dann wurde die RNA zweimal mit Chloroform/Phenol und zweimal mit Chloroform extrahiert. Der Überstand wurde mit 0,3 M NaOAc in 2 Volumina von EtOH ausgefällt, und das Pellet wurde in 100 μl DEP-behandeltem, entionisiertem Wasser pro 500 μl Transkriptionsprodukt resuspendiert. Diese Lösung wurde über eine RNAse-freie Sephadex-G50-Säule geführt (Boehringer Mannheim Nr. 100 411). Die resultierende mRNA war ausreichend rein, um zur Transfektion von Wirbeltieren in vivo verwendet zu werden.
BEISPIEL 6: HERSTELLUNG VON LIPOSOMEN
Zahlreiche Liposom-Herstellungsverfahren können verwendet werden, um die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung günstiger zu gestalten. Ein besonders bevorzugtes Liposom ist aus DOTAP wie folgt hergestellt:
Eine Lösung aus 10 mg Dioleoylphosphatidylethanolamin (PE) und 10 mg DOTAP (aus Beispiel 1) in 1 ml Chloroform wird unter Stickstoffstrom bis zur Trockenen eingedampft, und verbleibendes Lösungsmittel wird unter Vakuum über Nacht entfernt. Liposome werden durch Resuspendieren der Lipide in entionisiertem Wasser (2 ml) und Beschallen bis zur Klarheit in einer abgeschlossenen Phiole hergestellt. Diese Präparate sind zumindest 6 Monate lang stabil.
Polynucleotidkomplexe wurden durch Beimischen von 0,5 ml Polynucleotidlösung (z. B. aus Beispiel 5) bei 0,4 mg/ml durch langsames Zusetzen durch eine Spritze unter konstantem sanftem Verwirbeln zu einer 0,5-ml-Lösung von beschallten DOTMA/PE-Liposomen oder DOTAP/PE-Liposomen bei 20 mg/ml bei Raumtemperatur hergestellt. Dieses Verfahren resultiert in positiv geladenen Komplexen, die das Polynucleotid spontan in Zellen in vivo zuführen. Verschiedene Verhältnisse zwischen positiv geladenem Liposom und Polynucleotid können verwendet werden, um den besonderen Bedürfnissen in jeder beliebigen Situation gerecht zu werden. Alternativ dazu, wie von Felgner et al. (s. o.) berichtet wurde, kann es von Vorteil sein, das Polynucleotid (DNA oder RNA mit Hepes-gepufferter Salzlösung (150 mM NaCl; 20 mM Hepes, pH 7,4) zu verdünnen, bevor die Materialien vereinigt werden, um spontan Liposom/Polynucleotid-Komplexe zu bilden. In vielen Fällen wird jedoch die Verwendung von Lösungen mit geringerer Ionenstärke (wie Saccharose beispielsweise) anstelle der Kochsalzlösung als vorteilhaft erachtet; insbesondere wird angenommen, dass solche Lösungen die Zufuhr von Polynucleotid zur Zelle durch Minimieren von Ausfällen des Polynucleotid/Lipid-Komplexes erleichtern.
BEISPIEL 7: IN-VIVO-EXPRESSION VON LIPOSOMAL- UND NICHTLIPOSOMAL EINGEFÜHRTER mRNA IN RATTEN
Die Fähigkeit von mRNA, die für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodiert, Zellen in vivo zu transfizieren, und die folgende Expression des CAT-Proteins wurden durch direktes Injizieren von 0,200 μl jeder der nachstehenden Formulierungen, die wie angegeben hergestellt wurden, in den Bauchmuskel von Ratten, was zur Bildung eines kleinen Bläschens führte, veranschaulicht. Sechs Replikate jeder Formulierung wurden getestet. Nach 12 bis 14 Stunden wurde das Segment des Bauchmuskels, in das die Injektion verabreicht wurde, mit einem Gewicht von etwa 0,1 bis 0,2 g herausgeschnitten, zerkleinert und in einen 1,5-ml-Einwegmörser (Kontes, Morton Grove, Illinois) zusammen mit 200 ml einer wässrigen Formulierung mit den folgenden Komponenten platziert: 20 mM Tris, pH 7,6; 2 mM MgCl₂; und 0,1% Tensid Triton X-100. Der Inhalt des Mörsers wurde dann 1 Minute lang mit einem Einwegstößel zermahlen. Der Mörser wurde dann (mit Parafilm) abgedeckt, in einer 1-l-Parr-Zellaufschluss-Druckbombe (Parr Instrument Company, Moline, Illinois) platziert und bei 6 Atmosphären mit Stickstoff bei 4°C unter Druck gesetzt. Nach 30 Minuten wurde der Druck rasch abgelassen, um das Gewebe aufzubrechen und ein Rohlysat zu bilden. Das Lysat wurde dann in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 U/min, 4°C, 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend dekantiert und bei –20°C bis zur Analyse gelagert.

Die Lysate wurden dann auf die Gegenwart des CAT-Proteins durch Dünnschichtchromatographie getestet. Zuerst wurden 75 μl jeder Probe (des zuvor hergestellten Überstands) zwei Stunden lang bei 37°C mit 5 μl C¹⁴-Chloramphenicol (Amersham); 20 μl 4 mM Acetyl-CoA; und 50 μl 1 M Tris, pH 7,8, inkubiert. Hiernach wurden 20 μl von 4 mM Acetyl-CoA zugesetzt, und das Gemisch wurde wieder 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die resultierende Lösung wurde mit 1 ml EtOAc extrahiert, und die organische Phase wurde entfernt und in einer Vakuumzentrifuge (SpeedVac, Savant Co.) lyophilisiert. Das Pellet wurde in 20 μl EtOAc resuspendiert und wurde auf eine Kieselgel-Dünnschichtchromatographieplatte gesprenkelt. Die Platte wurde 45 Minuten lang in 95% Chloroform/5% Methanol entwickelt, getrocknet und mit einem Radiolumineszenz-Indikator (Enhance Spray for Surface Radiography, New England Nuclear Corp.) besprüht. Die Platte wurde anschließend zwischen Kodak-XAR5-Film geschichtet und über Nacht bei –70°C exponiert, und der Film wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers entwickelt. Die folgenden Resultate wurden erhalten:

FORMULIERUNG	mRNA-EXPRESSION
FORMULIERUNG	(Nr. positiv/gesamt)
1. 1 ml Optimem; 37,5 μg DOTMA	0/6
2. 1 ml Optimem; 15 μg CAT-RNA	3/6
3. Formulierung 1 plus 15 μg CAT-RNA	4/6
4. 10% Saccharose; 37,5 μg DOTMA; 15 μg CAT-RNA	3/6
5. 10% Saccharose; 187 μg DOTMA; 75 μg CAT-RNA	0/6

Optimem: Serumfreies Medium (Gibco Laboratories, Life Technologies, Inc., Grand Island, N. Y. 14072)
DOTMA: (Lipofectin-Marke; Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD)
CAT-RNA: aus Beispiel 5

Alle Formulierungen wurden in DEPC-behandeltem, RNAse-freiem Wasser hergestellt (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT 06535).
BEISPIEL 8: IN-VIVO-EXPRESSION VON REINER RNA UND DNA, DIE DIREKT IN DIE MUSKELN VON MÄUSEN INJIZIERT WURDE
Den Quadrizeps-Muskeln von Mäusen wurde entweder 100 μg pRSVACT-DNA-Plasmid oder 100 μg βgCATβgA_n-RNA injiziert, und das Muskelgewebe wurde später an der Injektionsstelle auf CAT-Aktivität getestet.
Fünf bis sechs Wochen alte weibliche und männliche Balb/C-Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion mit 0,3 ml 2,5%igem Avertin anästhesiert. Ein 1,5 cm langer Schnitt wurde am Oberschenkel gesetzt, und der Quadrizeps-Muskel wurde direkt sichtbar gemacht. Die DNA und RNA wurden in 0,1 ml Lösung in einer 1-cm³-Spritze durch eine 27-Gauge-Nadel eine Minute lang, etwa 0,5 cm von der distalen Insertionsstelle des Muskels entfernt in das Knie und etwa 0,2 cm tief injiziert. Eine Naht wurde über die Injektionsstelle zur späteren Lokalisierung gesetzt, und die Haut wurde anschließend mit Edelstahlklammern geschlossen.
3T3-Mausfibroblasten wurden auch in vitro mit 20 μg DNA oder RNA, komplexiert mit 60 μg Lipofectin^TM (BRL), in 3 ml Opti-Mem^TM (Gibco) unter optimalen Bedingungen, die für diese Zellen beschrieben wurden (Malone, R., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86, 6077–6081 (1989)), transfiziert. Dieselben Fibroblasten wurden auch unter Verwendung von Calciumphosphat gemäß dem in Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1989), beschriebenen Verfahren transfiziert.
Das pRSVCAT-DNA-Plasmid und βgCATβgA_n-RNA wurden wie in den obigen Beispielen beschrieben hergestellt. Die RNA bestand aus den für die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodierenden Sequenzen, die durch 5'- und 3'-untranslatierten β-Globin-Sequenzen und einen 3'-Poly-A-Trakt flankiert sind.
Muskelextrakte wurden durch Herausschneiden des gesamten Quadrizeps, Zerkleinern des Muskels, Platzieren in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen, das 200 μl einer Lyselösung (20 mM Tris, pH 7,4, 2 mM MgCl₂ und 0,1% Triton X) enthielt, und einminütiges Mahlen des Muskels mit einem Kunststoffstößel (Kontes) hergestellt. Um vollständigen Muskelzellenaufbruch sicherzustellen, wurde das Muskelgewebe anschließend unter 600 Pfund pro Quadratzoll von N₂ in einer Druckbombe (Parr) bei 4°C 15 Minuten lang platziert, bevor der Druck abgelassen wurde. Fibroblasten wurden ähnlich verarbeitet, nachdem sie von den Platten trypsiniert worden waren, wurden in das Medium mit Serum aufgenommen, zweimal mit PBS gewaschen und die Endzellpellets in 200 μl Lyselösung suspendiert. 75 μl der Muskel- und Fibroblastenextrakte wurden auf CAT-Aktivität durch Inkubieren des Reaktionsgemischs 2 Stunden lang mit C¹⁴-Chloramphenicol getestet, woraufhin Extraktion und Dünnschichtchromatographie folgten, wobei diese Vorgänge in Beispiel 7 beschrieben sind.

Autoradiogramme wurden aus zwei getrennten Experimenten erhalten, die CAT-Aktivität innerhalb der Extrakte der mit Injektionen versehenen Quadrizeps-Muskeln zeigten. Die Bahnennummern sind am oberen Ende der Autoradiogramme gezeigt, und die Chloramphenicol-Umsetzung in % ist unter dem Autoradiogramm abzulesen. Die Proben sind in den folgenden Bahnen dargestellt:

Bahnen 1 und 13:	Kontroll-Fibroblasten
Bahnen 2 und 14:	Muskel, dem nur 5% Saccharose injiziert wurde
Bahnen 3 und 15:	0,005 Einheiten von nicht-injiziertem, gereinigtem CAT-Standard
Bahnen 4 und 16:	0,05 Einheiten von gereinigter CAT (Sigma)
Bahnen 5 bis 8:	Muskel, dem 100 μg βgCATβgA_n-RNA in 5% Saccharose injiziert wurden
Bahnen 11, 12 und 17 bis 20:	Muskel, dem 100 μg pRSVCAT-DNA in 5% Saccharose injiziert wurden
Bahnen 9 und 10:	20 μg von βgCATβgA_n-RNA, mit 60 μg von DOTMA in eine 70% konfluente 60-mm-Platte von 3T3-Zellen (_10⁶) lipofiziert
Bahnen 21 und 22:	20 μg pRSVCAT, mit 60 μg von DOTMA in eine 50% konfluente 60-mm-Platte von 3T3-Zellen lipofiziert
Bahnen 23 und 24:	20 μg von pRSVCAT-Calciumphosphat, in eine 50% konfluente 60-mm-Platte von 3T3-Zellen lipofiziert

CAT-Aktivität wurde in allen vier RNA-Injektionsstellen 18 Stunden nach Injektion und in allen sechs DNA-Injektionsstellen 48 Stunden nach Injektion leicht nachgewiesen. Extrakte aus zwei der vier RNA-Injektionsstellen (Bahnen 6 und 8) und aus zwei der sechs DNA-Injektionsstellen (Bahnen 11 und 20) enthielten Niveaus an CAT-Aktivität, die mit den Niveaus von CAT-Aktivität vergleichbar waren, die aus vorübergehend in vitro unter optimalen Bedingungen transfizierten Fibroblasten erhalten wurden (Bahnen 9, 10, 21–24). Die mittlere Gesamtmenge an CAT-Aktivität, die in Muskelgewebe exprimiert wurde, belief sich auf 960 pg im Falle der RNA-Injektionen und auf 116 pg im Falle der DNA-Injektionen. Die Variabilität von CAT-Aktivität, die in verschiedenen Muskelstellen festgestellt wurde, ist möglicherweise ein Hinweis auf inhärente Variabilität der Injektions- und Extraktionsverfahren, da signifikante Variabilität beobachtet wurde, wenn reines CAT-Protein oder pRSVCAT-transfizierte Fibroblasten in die Muskelstellen injiziert wurden und diese Stellen sofort danach zur Messung von CAT-Aktivität herausgeschnitten wurden. CAT-Aktivität wurde auch aus Bauchmuskeln erhalten, denen die RNA- oder DNA-CAT-Vektoren injiziert wurden, was darauf hinweist, dass andere Muskelgruppen ebenfalls Polynucleotide aufnehmen und exprimieren können.
BEISPIEL 9: IN-VIVO-EXPRESSIONSSTELLE VON REINER DNA, DIE DIREKT IN DIE MUSKELN VON MÄUSEN INJIZIERT WURDE
Die Stelle von Genexpression in injizierten Muskeln wurde durch Verwendung des pRSVLac-Z-DNA-Vektors (P. Norton and J. Coffin, Molec. Cell Biol. 5, 281–290 (1985)), durch Exprimieren des E.-coli-β-Galactosidase-Gens zur Injektion und Beobachten der zytochemischen In-situ-Färbung von Muskelzellen auf E.-coli-β-Galactosidase-Aktivität bestimmt. Der Quadrizeps-Muskel von Mäusen wurde wie in den obigen Beispielen beschrieben freigelegt. Quadrizeps-Muskeln wurden einmalig 100 μg pRSVLAC-Z-DNA in 20%iger Saccharose injiziert. Sieben Tage später wurden die einzelnen Quadrizeps-Muskeln zur Gänze entfernt, und jeder fünfte 15-μm-Querschnitt wurde histochemisch zur Detektion von β-Galactosidase-Aktivität gefärbt.
Die Muskelbiopsie wurde in mit flüssigem N₂ gekühltem Isopentan eingefroren. 15-μm-Schnittserien wurden unter Verwendung eines Kryostaten in Scheiben geschnitten und sofort auf gelierte Scheiben platziert. Die Scheiben wurden in 1,5%igem Glutaraldehyd in PBS 10 Minuten lang fixiert und 4 Stunden lang zur Detektion von β-Galactosidase-Aktivität gefärbt (J. Price et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84, 156–160 (1987)). Der Muskel wurde mit Eosin gegengefärbt.
Die photographierten Schnitte sind im Folgenden beschrieben:

(A): Querschnitt vom Kontrollmuskel, dem eine Lösung mit nur 20% Saccharose injiziert wurde; 60fache Vergrößerung.
(B), (C) und (D): Querschnitt eines Muskels, dem pRSVLacZ injiziert wurde, bei 25facher, 160facher bzw. 400facher Vergrößerung.
(E): Ein Längsschnitt eines anderen Muskels, dem pRSVLacZ injiziert wurde, 160fache Vergrößerung.
(F), (G) und (H): Schnittserien desselben Muskels in 0,6 mm Abstand.

Etwa 60 Muskelzellen der etwa 4.000 Zellen (1,5%), die der gesamte Quadrizeps umfasst, und etwa 10–30% der Zellen innerhalb des Injektionsbereichs wurden blau gefärbt. Kontrollmuskel, denen nur 20%ige Saccharoselösung injiziert wurden, zeigten keinerlei Hintergrundfärbung. Positive β-Galactosidasefärbung innerhalb mancher einzelnen Muskelzellen war zumindest 1,2 mm tief bei Schnittserien, was entweder das Resultat von Transfektion in mehrere Kerne oder von der Fähigkeit zytoplasmatischer Proteine sein kann, die von einem Kern exprimiert werden, der weit innerhalb der Muskelzelle verteilt ist. Längsschnitte wiesen ebenfalls β-Galactosidasefärbung innerhalb von Muskelzellen von zumindest 400 μm auf. In Zellen neben den intensiv blauen Zellen war schwächere Blaufärbung oft in den Randbereichen zu erkennen. Dies stellt sehr wahrscheinlich ein Artefakt der histochemischen β-Galactosidasefärbung dar, in der das reagierte X-gal-Produkt diffundiert, bevor es sich abscheidet.
Ähnliche Resultate wurden für lineare DNA erhalten.
BEISPIEL 10: DOSISWIRKUNGS-AUSWIRKUNG VON RNA UND DNA, DIE IN MUSKELN VON MÄUSEN INJIZIERT WURDEN
Experimente mit dem Glühwürmchen-Luciferase-Reportergen (LUC) erforschten die Wirkung von Parameteren wie Niveau der Dosis und Zeit auf die gesamte Luciferase, die aus injizierten Muskeln extrahiert wurde.
Die RNA- und DNA-Vektoren wurden hergestellt, und die Quadrizepsmuskeln von Mäusen wurden wie zuvor beschrieben injiziert. Muskelextrakte des gesamten Quadrizeps wurden wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt, unter der Ausnahme, dass der Lysepuffer aus 100 mM KPi pH 7,8, 1 mM DTT und 0,1% Triton X bestand. 87,5 μl des 200-μl-Extrakts wurden auf Luciferase-Aktivität unter Verwendung eines LKB-1251-Luminometers analysiert (J. de Wet et al., Molec. Cell Biol. 7, 725–737 (1987)). Lichtstärkeeinheiten wurden in Pikogramm (pg) von Luciferase unter Verwendung einer Standardkurve umgerechnet, die durch Messen des durch gereinigte Glühwürmchen-Luciferase (Analytical Luminescence Laboratory) im Kontrollmuskelextrakt produzierten Lichts erstellt wurde. Die RNA- und DNA-Präparate vor Injektion enthielten keinerlei kontaminierende Luciferase-Aktivität. Kontrollmuskel, der mit 20%iger Saccharose injiziert wurde, wies keine nachweisbare Luciferase-Aktivität auf. Alle obigen Experimente wurden zwei- bis dreimal durchgeführt, und insbesondere DNA-Zeitpunkte, die größer 40 Tage waren, wurden dreifach durchgeführt.
Die erzielten Resultate waren wie folgt:

3(A) Luciferase-Aktivität, gemessen 18 Stunden nach der Injektion mit verschiedenen Mengen an βgLUCβgA_n-RNA in 20%iger Saccharose und 4 Tage nach der Injektion mit verschiedenen Mengen an pRSVL in 20%iger Saccharose.
3(B) Luciferase-Aktivität, getestet zu verschiedenen Zeitpunkten, nachdem 20 μg βgLUCβgA_n-RNA in eine Million 3T3-Fibroblasten (Malone, R., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86, 6077–6081 (1989)) lipofiziert wurden und nachdem 100 μg von βγΛϒ-βg-A_n-RNA in 20% Saccharose in Quadrizepsmuskel injiziert wurden.
3(C) Luciferase-Aktivität, getestet zu verschiedenen Zeitpunkten nach intramuskulärer Injektion von pRSVL-DNA.

A. Grad der Genexpression
Eine Auswirkung der Dosiswirkung wurde beobachtet, wenn Quadrizepsmuskeln verschiedene Mengen an βgLucβgA_n-RNA- oder DNA-pRSVL-Konstrukten injiziert wurden. Die Injektion der zehnfachen Menge an DNA resultierte in um etwa das zehnfache gesteigerter Luciferase-Aktivität von 33 pg Luciferase nach der Injektion von 10 μg zu 320 pg Luciferase nach Injektion von 100 μg DNA. Die Injektion der zehnfachen Menge an RNA ergab auch etwa zehnmal mehr Luciferase. Eine Million 3T3-Mausfibroblasten in einer 60-mm-Schale wurden mit 20 μg DNA oder RNA, die mit 60 μg Lipofectin^TM (Bethesda Research Labs) in 3 ml von Opti-MEM^TM (Gibco) komplexiert war, lipofiziert. Zwei Tage später wurden die Zellen auf Luciferase-Aktivität getestet, und für die Ergebnisse von vier getrennten Platten wurde ein Mittel berechnet. 20 μg an pRSVL-DNA, die in Fibroblasten transfiziert wurden, ergaben eine Gesamtmenge an 120 pg Luciferase (6 pg Luciferase/μg DNA), während 25 μg, die in Muskelgewebe injiziert wurden, ein Mittel von 116 pg Luciferase ergaben (4,6 pg Luciferase/μg DNA). Die Expression aus den RNA-Vektoren war etwa siebenmal wirksamer in transfizierten Fibroblasten als in injizierten Muskeln. 20 μg von βgLucβgA_n-RNA, die in Fibroblasten transfiziert wurden, ergaben eine Gesamtmenge von 450 pg Luciferase, während 25 μg, die in Muskelgewebe transfiziert wurden, 74 pg Luciferase ergaben.
Berechnet auf Basis der Menge zugeführter DNA war die Expressionswirksamkeit aus DNA-Vektoren in transfizierten Fibroblasten und injizierten Muskeln ähnlich.
B. Zeitverlauf der Expression
Der Zeitverlauf wurde auch untersucht. Luciferase-Aktivität wurde zu verschiedenen Zeitpunkten getestet, nachdem 25 μg von βgLucβgA_n-RNA oder 100 μg von pRSVL-DNA injiziert worden waren. Nach RNA-Injektion erreichte die mittlere Luciferase-Aktivität ein Maximum von 74 pg nach 18 Stunden und ging dann rasch zurück auf 2 pg nach 60 Stunden. In transfizierten Fibroblasten erreichte die Luciferase-Aktivität ihren Maximalwert nach 8 Stunden. Nach DNA-Injektion in den Muskel waren wesentliche Mengen an Luciferase zumindest 60 Tage lang vorhanden.
Die Daten lassen darauf schließen, dass Luciferaseprotein und das In-vitro-RNA-Transkript eine Halbwertszeit von weniger als 24 Stunden im Muskel aufweisen. Daher ist die Beständigkeit von Luciferase-Aktivität über 60 Tage hinweg kaum auf die Stabilität von Luciferaseprotein oder die Stabilität des In-vivo-RNA-Transkripts zurückzuführen.
BEISPIEL 11: BESTÄNDIGKEIT VON DNA IN MUSKELGEWEBE NACH INJEKTION, BESTIMMT GEMÄSS SOUTHERN-BLOT ANALYSE
Präparate von Muskel-DNA wurden aus nicht-injiziertem Kontrollquadrizepsmuskel oder aus Quadrizepsmuskel 30 Tage nach der Injektion mit 100 μg pRSVL in 20% Saccharose erhalten. Zwei ganze Quadrizepsmuskeln aus demselben Tier wurden gepoolt, in flüssigen N₂ hinein zerkleinert und mit Mörser und Stößel zermahlen. Gesamt-Zell-DNA und HIRT-Überstände wurden hergestellt (F. M. Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, New York (1987)). 15 μg der Gesamt-Zell-DNA oder 10 μl von den 100 μl HIRT-Überstand wurden verdaut, auf einem 1,0%igen Agarosegel laufen gelassen, unter Verwendung einer Vakuumblot-Vorrichtung (LKB) auf Nytran^TM (Schleicher & Schuell, New York) transferiert und mit mehrfach geprimter ³²P-Luciferase-Sonde (dem HindIII-BamH1-Fragment von pRSVL) hybridisiert. Nach Hybridisierung über Nacht erfolgte der letzte Waschschritt der Membran mit 0,2 × SSC, das 0,5% SDS enthielt, bei 68°C. Kodak-XAR5-Film wurde der Membran 45 Stunden lang bei –70°C ausgesetzt.

Ein Autoradiogramm eines Southern-Blots wies das folgende Probenmuster auf:

Bahn 1:	0,05 ng an unverdautem pRSVL-Plasmid
Bahn 2:	0,05 ng an BamH1-verdautem pRSVL
Bahn 3:	Blindprobe
Bahn 4:	BamH1-Verdau von HIRT-Überstand aus dem Kontrollmuskel
Bahn 5:	BamH1-Verdau aus Zell-DNA aus dem nicht injizierten Kontrollmuskel
Bahn 6, 7:	BamH1-Verdau von HIRT-Überstand aus zwei verschiedenen Pools von pRSVL-injizierten Muskeln
Bahn 8, 9:	BamH1-Verdau aus Zell-DNA aus zwei verschiedenen pRSVL-injizierten Muskeln
Bahn 10:	Zell-DNA (dieselbe wie in Bahn 9), verdaut mit BamH1 und Dpn1
Bahn 11:	Zell-DNA (dieselbe wie in Bahn 9), verdaut mit BamH1 und Mbo1
Bahn 12:	Zell-DNA, verdaut mit BglII
Bahn 13:	HIRT-Überstand, verdaut mit BglII

(Größenmarkierungen (λ/HindIII) sind links gezeigt.)

Southern-Blot-Analyse von Muskel-DNA lässt darauf schließen, dass die fremde pRSVL-DNA innerhalb des Muskelgewebes zumindest 30 Tage lang vorhanden ist (Bahnen 6–9) und den Konzentrationen an DNA ähnlich ist, die im Muskel zwei und 15 Tage nach der Injektion nachzuweisen sind. In Muskel-DNA, die mit BamH1 (das pRSVL einmal schneidet; Bahnen 6–9) verdaut ist, lässt die Gegenwart einer 5,6-kb-Bande, die linearisiertem pRSVL entspricht (Bahn 2), darauf schließen, dass die DNA entweder in einer ringförmigen, extrachromosomalen Form oder in großen Tandemwiederholungen des in das Chromosom integrierten Plasmids vorhanden ist. In Muskel-DNA, die mit BglII (das pRSVL nicht schneidet) verdaut ist, lässt die Gegenwart einer Bande, die kleiner als 10 kb ist (Bahnen 12 und 13) und zugleich dieselbe Größe wie die offene, ringförmige Form des Plasmids pRSVL (Bahn 1) aufweist, darauf schließen, dass die DNA extrachromosomal in einer offenen, ringförmigen Form vorhanden ist. Das Auftreten von pRSVL-DNA in HIRT-Überständen (Bahnen 6, 7 und 13) und in Bakterien, die nach der Transformation mit HIRT-Überständen Ampicillin-resistent gemacht wurden, lässt auch darauf schließen, dass die DNA nicht-integriert vorhanden ist. Obwohl der Großteil der exogenen DNA extrachromosomal zu sein scheint, kann ein geringer Grad an chromosomaler Integration nicht definitiv ausgeschlossen werden. Zu langes Exponieren von Tröpfchen führte zu keinen Schmieren hybridisierender DNA, die größer als 10 kb war, die Plasmid-DNA an verschiedenen Stellen integriert aufweisen würde. Die Empfindlichkeit der pRSVL-DNA im Muskel gegenüber DPNI-Verdau (Bahn 10) und ihre Resistenz gegenüber Mbol-Verdau (Bahn 11) lassen darauf schließen, dass sich die DNA in den Muskelzellen nicht vermehrt hatte.
BEISPIEL 12: IN-VIVO-EXPRESSION VON REINER DNA, DIE DIREKT IN DEN MUSKEL VON MÄUSEN IMPLANTIERT WURDE

pRSVL-DNA wurde in Ethanol ausgefällt und getrocknet. Das Pellet wurde mit dünnen Pinzetten aufgehoben und in verschiedenen Muskelgruppen, wie in den obigen Beispielen beschrieben, platziert. Fünf Tage später wurde der Muskel auf Luciferase-Aktivität, wie in Beispiel 10 beschrieben, analysiert. Die DNA wurde wirksam in verschiedenen Muskelgruppen mit den folgenden Werten exprimiert:

Implantat:	Luciferase-Aktivität (Lichtstärkeeinheiten, LU):
25 μg pRSVL-DNA	Kontrolle	Bizeps	Wade	Quadrizeps
	428	46.420	27.577	159.080
	453	53.585	34.291	35.512
		1.171	106.865
		53.397	105.176
		499	40.481

BEISPIEL 13: DIREKTE GENZUFUHR IN DIE LUNGE: INTRATRACHEALE INJEKTION VON DNA, DNA/CL-KOMPLEXEN ODER REINEM PROTEIN

Der DNA-Luciferasevektor (pRSVL), komplexiert mit Lipofectin^TM, wurde Ratten intratracheal entweder in 20%iger Saccharose (2 Ratten) oder in 5%iger Saccharose (6 Ratten) injiziert. Zwei Tage nach der Injektion wurden die Rattenlungen in 7 Abschnitte geteilt: LUL, LLL, RUL, RML, RLL, AL (wie nachstehend definiert) und Trachea. Die Rattenlunge unterscheidet sich von der menschlichen Lunge darin, dass sie eine große linke Lunge ausgehend vom linken Hauptbronchus aufweist. Die linke Lunge wurde für diese Studie in zwei Hälften in den linken oberen Teil (LUL) und den linken unteren Teil (LLL) geschnitten. Die rechte Lunge umfasst 4 Lungenlappen: den rechten Kraniallappen (RUL), den rechten Mediallappen (RML), den rechten unteren Lappen (RLL) und einen Zusatzlappen (AL). Extrakte wurden durch Zerkleinern dieser Lungenteile in getrennte 1,5-ml-Mikroröhrchen, die 200 μl einer Lyselösung (20 mM Tris, pH 7,4, 2 mM MgCl₂ und 0,1% Triton X) enthielten, und durch einminütiges Zermahlen der Lunge mit einem Kunststoffstößel (Kontes) hergestellt. Um vollständigen Zellaufschluss der Lungenzellen sicherzustellen, wurde das Lungengewebe unter 600 psi von N₂ in eine Parr-Druckbombe bei 4°C 15 Minuten lang platziert, bevor der Druck abgelassen wurde. Luciferase-Tests wurden an 87,5 μl Lungenextrakt aus einem Gesamtvolumen von etwa 350 μl durchgeführt.

Injektion	RUL	RLL	LUL	LML	LLL	AL	Trachea
Kontrolle	22,6	22,4	21,9	21,3	20,1	19,8	-
25 μg DNA alleine	21,2	21,5	21,8	21,6	21,9	21,2	-
25 μg DNA alleine	21,7	21,4	21,3	-	22,2	21,5	-
250 μg DNA alleine	21,7	23,2	21,9	28,5	22,6	22,0	21,3
250 μg DNA alleine	22,9	22,5	33,3	23,0	25,4	24,3	21,5
250 μg DNA alleine	21,8	21,5	21,8	20,4	20,7	20,8	20,7
25 μg DNA/CL	20,8	22,2	19,6	22,3	22,3	22,0	-
25 μg DNA/CL	22,9	22,0	22,7	21,7	22,8	-	22,18
25 μg DNA/CL	22,2	23,8	22,1	23,9	22,8	-	21,6
25 μg DNA/CL	20,9	20,9	20,9	20,6	20,3	-	19,3
25 μg DNA/CL	19,8	20,0	20,3	20,2	20,1	20,3	20,1
25 μg DNA/CL	20,5	20,5	19,8	19,5	19,9	19,9	19,8
Luc-Protein 3 × 10⁴ LU	105,3	77,1	98,7	80,0	86,3	89,6	178,9
Blindprobe	22,5
Kontrolle: Die Werte sind jene für ein Tier, das 25 μg DNA in 0,3 ml 20%iger Saccharose in die Speiseröhre injiziert erhielt. (Eine Probe, dienur Wasser enthielt, ergab 22,5 LU.) 25 μg DNA alleine: steht für einzelne Tiere, die intratracheale Injektionen von 25 μg pPGKLuc in 0,3 ml 20%iger Saccharose erhielten. 25 μg DNA/CL: steht für einzelne Tiere, die intratracheale Injektionen von 25 μg pPGKLuc, komplexiert mit Lipofectin^TM in 0,3 ml 5%iger Saccharose erhielten. Die obigen Tiere wurden getötet, und Lungenextrakte wurden 2 Tage nach der Injektion hergestellt. Luc-Protein 10⁴ LU: steht für ein Tier, das den Gegenwert von 30.000 Lichtstärkeeinheiten (LU) von gereinigter Glühwürmchen-Luciferase (Sigma) erhielt und dann sofort getötet wurde.

Die Luciferase-Aktivität in den Gruppen der 25 μg DNA alleine und den 25-μg-DNA/CL-Gruppen der Tiere lag nicht über jener im Kontrolltier; dennoch wiesen in den 250-μg-DNA-alleine-Tieren drei Lungenschnitte im Vergleich zur Kontrolllunge oder zur Blindprobe gering, aber erkennbar erhöhte LU-Aktivität auf (fett & unterstrichen). Duplikattests am selben Extrakt bestätigten das Ergebnis. Erfahrungswerte mit dem LKB-1251-Luminometer ließen darauf schließen, dass diese Werte, obwohl sie knapp über dem Hintergrund lagen, auf tatsächliche Luciferase-Aktivität hinwiesen.
BEISPIEL 14: LUCIFERASE-AKTIVITÄT IN MÄUSELEBER, DER DNA-FORMULIERUNGEN DIREKT INJIZIERT WURDEN

Der DNA-Luciferase-Expressionsvektor pPGKLuc wurde intrahepatisch (ih) in den unteren Teil des linken Leberlappens in Mäusen injiziert. Die pPGKLuc-DNA wurde entweder nur alleine (450 μg DNA in 1,0 ml 20%iger Saccharose) oder komplexiert mit Lipofectin^TM (50 μg DNA + 150 μg Lipofectin^TM in 1,0 ml 5%iger Saccharose) injiziert. Drei Tage nach der Injektion wurde der linke Leberlappen in zwei Abschnitte geteilt (einen unteren Teil, in dem in den Lappen injiziert wurde, und einen oberen Teil des Lappens in Entfernung zur Injektionsstelle) und auf Luciferase-Aktivität wie in den obigen Beispielen beschrieben getestet.

Intrahepatische Leberinjektion bei Mäusen	Luciferase-Aktivität (Lichtstärkeeinheiten, LU)
Intrahepatische Leberinjektion bei Mäusen	unterer Teil	oberer Teil
Blindprobe (20,2 LU)
Kontrolle: 20% Saccharose allein	20,8	23,8
50 μg pPGKLuc + Lipofectin	35,4	23,1
50 μg pPGKLuc + Lipofectin	38,1	21,4
50 μg pPGKLuc + Lipofectin	22,1	22,7
450 μg pPGKLuc	43,7	29,2
450 μg pPGKLuc	78,8	21,7
450 μg pPGKLuc	21,7	20,8

Zwei der drei Tiere, die die reinen pPGKLuc-Injektionen erhielten, und zwei der drei Tiere, die pPGKLuc + Lipofectin^TM-Injektionen erhielten, wiesen Luciferase-Aktivität signifikant über dem Hintergrund auf (fettgedruckt & unterstrichen). Der untere Teil des Leberlappens, dem direkt injiziert wurde, wies größere Mengen an Luciferase-Aktivität auf als der obere Teil, der von der Injektionsstelle weiter entfernt war. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von pRSVCAT-DNA-Expressionsvektor und CAT-Tests erzielt. Luciferase-Aktivität wurde drei Tage, nachdem ähnliche Präparate von pPGKLuc (+ und – Lipofection^TM) in den Pfortaderkreislauf von Ratten injiziert wurde, nicht nachgewiesen.
BEISPIEL 15: EXPRESSION VON WACHSTUMSHORMONGEN, IN LEBER- UND MUSKELGEWEBE INJIZIERT
Mäusen wurde pXGH5 (Metallothionein-Promotor-Wachstumshormonfusionsgen) (Selden Richard et al., Molec. Cell Biol. 6, 3173–3179 (1986)) sowohl in Leber als auch in Muskelgewebe injiziert. Die Mäuse wurden auf 76 mM Zinksulfatwasser gegeben. Später wurden den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wurde auf Wachstumshormon unter Verwendung des Nichols-GH-Sets analysiert.

A. Zwei Mäusen wurden 20 μg pXGH5-Gen, komplexiert mit 60 μg/ml Lipofectin in 5%iger Saccharose, injiziert. 1 ml dieser Lösung wurde in die Leber injiziert, und 0,1 ml wurde in die ventralen und dorsalen Bauchmuskeln an 7 Stellen zweimal injiziert. Zwei Tage später wurde den Tieren Blut abgenommen. Das Serum eines Tiers blieb auf Hintergrundniveau, während jenes des anderen Tiers 0,75 ng/ml Wachstumshormon aufwies.
B. Drei Mäusen wurden 0,1 ml von 1 mg/ml pXGH5 in 5%iger Saccharose, zweimal in den Quadrizeps, einmal in den Unterschenkelbeuger, einmal in den Brustmuskel und einmal in die Trapezmuskeln an zwei verschiedenen Tagen injiziert. Die Resultate waren die folgenden:

Tiernummer	Wachstumshormon (ng/ml): Tag 1	Tag 2
1	0,6	0,6
2	0,8	1,0
3	0,95	0,8
Hintergrund: 0,5 ng/ml

BEISPIEL 16: ANTIKÖRPER-PRODUKTION BEI MÄUSEN, DENEN EIN GEN FÜR EIN IMMUNISIERENDES PEPTID DIREKT INJIZIERT WURDE
Mäusen wurde eine Menge von 20 μg eines Plasmidkonstrukts injiziert, das aus dem gp-120-Gen, gesteuert von einem Zytomegalievirus-(CMV-)Promotor, bestand. Die DNA wurde in den Quadrizeps-Muskel von Mäusen gemäß den in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren injiziert. Maus 5 wurden 20 μg Plasmid-DNA in isotonischer Saccharose in den Quadrizeps-Muskel injiziert. Blutproben wurden vor der Injektion (Tag 0) wie angegeben und mehr als 40 Tage nach der Injektion abgenommen. Das Serum aus jeder Probe wurde reihenverdünnt und in einem Standard-ELISA-Verfahrenstest zur Detektion von Antikörpern getestet, wobei rekombinantes gp-120-Protein, das in Hefe hergestellt worden war, als das Antigen verwendet wurde. Sowohl IgG- als auch IgM-Antikörper wurden nachgewiesen. Die Studie zeigt, dass das Gen seine Signalsequenz beibehält und dass das Protein wirksam aus den Zellen ausgeschieden wird.
BEISPIEL 17: VERWENDUNG VON NICHT VERKAPPTEN 5'-SEQUENZEN ZUR DIREKTEN TRANSLATION VON DNA, DIE IN VITRO IN ZELLEN TRANSFIZIERT WIRD
Zwei verschiedene DNA-Matrizen wurden konstruiert, wovon beide für die Synthese von RNA kodieren, die das E.-coli-β-Galactosidase-Reporter-Gen exprimiert. Ein Lac-Z-Gen, das die Kozak-Consensus-Sequenz enthält, wurde anstelle der für Luciferase kodierenden Sequenzen der pβGLucβGA_n-Matrize insertiert, um die pβGLacZβGA_n-Matrize zu bilden. Die pEMCLacZβGA_n-Matrize wurde durch Ersetzen der 5'-untranslatierten β-Globin-Sequenzen von pβGLacZβGA_n durch das 588-bp-EcoR1/Nco1-Fragment aus dem Encephalomyocarditisvirus (EMCV) hergestellt (pE5LVPO in Parks, G., et al., J. Virology 60, 376–384 (1986)). Für diese untranslatierten EMC-5'-Sequenzen wurde bereits zuvor gezeigt, dass sie in der Lage sind, Translation in Reticulozytlysaten in vitro wirksam auszulösen. Die Erfinder zeigten, dass diese Sequenzen Translation auch wirksam steuern können, wenn sie in der Kultur in Fibroblasten transfiziert werden. Der Prozentsatz an blauen Zellen war in Zellen, die mit unverkappter EMCLacZβGA_n-RNA transfiziert waren, etwas höher als in den Zellen, die mit der verkappten pEMCLacZβGA_n-RNA transfiziert waren. Transfektion mit entweder unverkappter oder verkappter pEMCLacZβGA_n-RNA ergab eine größere Anzahl an positiven β-Galactosidasezellen als Transfektion mit verkappter βGLacZβGA_n-RNA. Erst jüngst wurde gezeigt, dass diese 5'-untranslatierte EMC-Sequenz als ein Bestandteil von Vaccinia-T7-Polymerasevektoren Translation einer unverkappten mRNA um das 4- bis 7fache steigern kann (Elroy-Stein, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6126–6130 (1989)). Diese EMC-Sequenzen haben demnach die Fähigkeit, Translation von unverkappten Messengers wirksam zu steuern.
BEISPIEL 18: T7-POLYMERASETRANSKRIPTION IN TRANSFIZIERTEN ZELLKULTUREN
Ein SV40-T7-Polymerase-Plasmid, das T7-Polymeraseprotein enthielt, das aus dem SV40-Promotor (Dunn, J., et al., Gene 68, 259 (1988)) exprimiert wurde, wurde mit der pEMCLacZβGAn-Matrizen-DNA in 3T3-Fibroblasten in Kultur co-lipofektiert, um zu zeigen, dass T7-Polymerasetranskription über Plasmide auftreten kann. Zwei verschiedene SV40-T7-Polymerase-Expressionsvektoren wurden verwendet:

(a) pSV-G1-A: pAR3126-SV40-Promotor, der Expression von T7-Polymeraseprotein, das auf das Zytoplasma gerichtet ist, steuert.
(b) pSVNU-G1-A: pAR3132-SV40-Promotor, der Expression von T7-Polymeraseprotein, das auf das Zytoplasma gerichtet ist, steuert.

Jedes dieser zwei Plasmide wurde mit pEMCLacZβGAn bei 1:3- und 3:1-Verhältnissen in eine 60-mm-Platte mit 3T3-Zellen co-lipofektiert. Die Anzahl an blauen β-Galactosidase-Zellen wurde gezählt, wobei die nachstehenden Ergebnisse erhalten wurden:

β-gal-Matrize Verhältnis: Matrize/Polymerasevektor Co-Lipofektant:

pSV-G1-A pSVNU-G1-A

βGLacZβGAn 3:1 0 1

1:3 0 1

EMCLacZβGAn 3:1 74 70

1:3 45 15
BEISPIEL 19: EXPRESSION VON LUCIFERASE IM GEHIRN NACH GERICHTETER INJEKTION VON MESSENGER-RNA
Zwei erwachsene Mäusen und einer neugeborenen Maus wurde die βgLucβgA_n-mRNA, die das 5'-Cap enthielt und gemäß Beispiel 10 hergestellt wurde, injiziert. Bei den erwachsenen Mäusen waren die Injektionen aus einer Stammlösung von mRNA bei einer Konzentration von 3,6 μg/μl in 20%iger Saccharose; Injektionsvolumina betrugen 5 μl, 2 Injektionen in beide Seiten des bilateralen Parietalkortex, 4 Injektionen pro Maus. Das Gewebe wurde nach 18 Stunden nach der Injektion gemäß Beispiel 10 unter Verwendung von 200 μl Gehirnhomogenat, aufgeschlossen in einer Parr-Druckbombe, getestet, und 87,5 μl wurden für den Test verwendet.
Die Resultate waren wie folgt:

Behandlung Tier-I. D. Hemisphäre:

links rechts

Sham-Injektion AMra 649 629

βgLucβgA_n AMrb 1.734 1.911
Der neugeborenen Maus wurde 1 μl βgLucβgA_n (3,6 μg/μl; 20% Saccharose) in das bilaterale Vorderhirn injiziert, und das Gewebe wurde ähnlich verarbeitet und analysiert.

Behandlung Tier-I. D. Hemisphäre:

links rechts

βgLucβgA_n NRr 1.569 963
BEISPIEL 20: FUNKTIONELLE EXPRESSION VON DYSTROPHIN IN DYSTROPHEM MAUSMUSKEL IN VIVO
Ein Plasmid, das das Dystrophingen enthielt, wurde unter Kontrolle des Rous-Sarcoma-Viruspromotors aus dem Xp21-Plasmid hergestellt, das die vollständige Dystrophin-Codierregion und das SV40-Poly enthielt. Ein Segment, das von Kunkel und Kollegen (Brumeister M., Monaco AP, Gillard EF, von Ommen GJ, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Kunkel LM, Lehrach H.) kloniert wurde, eine 10 Megabasen große physische Genomkarte von menschlichem Xp21, umfassend das Duchenne-Muskeldystrophie-Gen. Genomics (3), 189–202 (2. April 1988); Hoffman, EP, und Kunkel, LM, Dystrophin abnormalities of Duchenne's/Becher Muscular Dystrophy. Neuron Bd. 2, 1019–1029 (1989); Koenig, M., Monaco AP, Kunkel LM. Die komplette Sequenz von Dystrophin lässt auf ein stäbchenförmiges Zytoskelettprotein schließen. (Cell 53 (2), 219–26 (22. April 1988)). 200 μg des Plasmids in 100 μl Phosphat-gepufferter Saline wurden in den Quadrizeps des mutierten Mausstamms, dem das Dystrophin-Genprodukt (MDX-Maus; Jackson labs.) fehlte, injiziert. Expression von funktionellem Dystrophin wurde 7 Tage nach der Injektion durch Immunhistochemie gemäß den von Watkins et al. beschriebenen Verfahren und unter Verwendung desselben Anti-Dystrophin-Antikörpers (Anti-60-kd-Antikörper mit einem fluoreszierenden sekundären Antikörper), erhalten von Kunkel, beobachtet. Funktionelle Expression des Dystrophin-Genprodukts in den dystrophen Mäusen wurde durch Vergleichen der Fluoreszenzmuster, die in Querschnitten des Quadrizepsmuskels der injizierten Tiere beobachtet wurden, mit den Fluoreszenzmustern, die bei normalen Tieren beobachtet wurden, nachgewiesen (Watkins S. C., Hoffman E. P., Slayter H. S., Kinkel L. M., Immunelectron microscopic localization of dystrophin in myofibres. Nature 333 (6176), 863–866 (30. Juni 1988)). Normale Dystrophin-Expression wurde unter der Plasmamembran der Muskelfaser lokalisiert, sodass ein Querschnitt des Quadrizepsmuskels ein Fluoreszenzmuster ergab, das die Zelle ringförmig umgab. Darüber hinaus wurde Dystrophin-Expression durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung des Affinitäts-gereinigten Anti-60kd-Antikörpers quantifiziert.
BEISPIEL 21: VERABREICHUNG DES KORRIGIERENDEN DYSTROPHINGENS DIREKT IN DEN MUSKEL DES PATIENTEN MIT DUCHENNE-MUSKELDYSTROPHIE
Patienten mit Muskeldystrophie wurden mehrfache 200-μg-Plasmidinjektionen, die das funktionelle Dystrophingen (siehe obiges Beispiel) in 100 μl Phosphat-gepufferter Saline enthielten, verabreicht. Während die Patienten unter leichter Anästhesie lagen, wurden ihnen diese Injektionen in 5-cm-Abständen in die gesamte Skelettmuskelmasse direkt durch die Haut ohne notwendigen operativen Eingriff verabreicht. Die Erholung des Patienten wurde durch Beobachten der Muskelzuckungsspannung und der maximalen willkürlichen Anspannung bewertet. Weiters wurden Biopsien von 300–500 Muskelzellen aus einem injizierten Bereich zur histologischen Untersuchung, Beobachtung der Muskelstruktur und zur biochemischen Analyse der Gegenwart von Dystrophin, das in Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie nicht vorhanden ist, entnommen. Atmungsmuskel, umfassend die Zwischenrippenmuskel, die den Brustkorb und das Zwerchfell in Bewegung setzen, sind besonders wichtige, geschädigte Muskelgruppen bei Patienten mit Muskeldystrophie. Die Zwischenrippenmuskeln können wie die anderen Skelettmuskelgruppen durch Injektion durch die Haut erreicht werden. Das Zwerchfell kann durch ein operatives Verfahren zugänglich gemacht werden, bei dem der Muskel freigelegt wird, um direkte Injektion von Plasmid-DNA zu ermöglichen.

Claims

Verwendung eines für ein Polypeptid kodierenden Polynucleotids bei der Herstellung eines Medikaments zur Therapie oder Immunisierung eines Wirbeltiers, wobei das Polynucleotid ein DNA-Plasmid oder mRNA ist, worin das Medikament nur dieses Polynucleotid in einem pharmazeutisch annehmbaren, injizierbaren Träger enthält, wobei der Träger eine Flüssigkeit ist, zur Verabreichung des Polypeptids an Zellen des Wirbeltiers durch Injektion des Medikaments in das Wirbeltier, wodurch das DNA-Plasmid oder die mRNA in Zellen des Wirbeltiers aufgenommen wird und für vorübergehende Expression des kodierten Polypeptids sorgt, um eine therapeutische oder immunogene Wirkung hervorzurufen.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Injektion in einen Muskel erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Injektion in die Haut erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Injektion in eine Körperhöhle des Wirbeltiers erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Polynucleotid ein DNA-Plasmid ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Wirkung immunogen ist.
Zusammensetzung, die nur ein für ein Polypeptid kodierendes Polynucleotid in einem pharmazeutisch annehmbaren, injizierbaren Träger enthält, wobei der Träger eine Flüssigkeit ist und das Polynucleotid ein DNA-Plasmid oder mRNA ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Therapie oder Immunisierung eines Wirbeltiers durch Verabreichung des Polypeptids an Zellen des Wirbeltiers durch Injektion der Zusammensetzung in das Wirbeltier, wodurch das DNA-Plasmid oder die mRNA in Zellen des Wirbeltiers aufgenommen wird und für vorübergehende Expression des kodierten Polypeptids sorgt, um eine therapeutische oder immunogene Wirkung hervorzurufen.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die Injektion in einen Muskel erfolgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die Injektion in die Haut erfolgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die Injektion in eine Körperhöhle des Wirbeltiers erfolgt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, worin das Polynucleotid ein DNA-Plasmid ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, worin die Wirkung immunogen ist.