DE69033986T2

DE69033986T2 - Ungeladene, auf Morpholin basierende Polymere mit Chiralen, Phosphor enthaltenden Brücken zwischen den Untereinheiten

Info

Publication number: DE69033986T2
Application number: DE69033986T
Authority: DE
Inventors: James E. Summerton; Dwight D. Weller
Original assignee: Antivirals Inc
Current assignee: Sarepta Therapeutics Inc
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1990-12-20
Publication date: 2003-03-13
Anticipated expiration: 2010-12-21
Also published as: JPH05504563A; JP2002167441A; EP0506830A4; KR920703584A; CA2069869C; KR0167574B1; AU7164291A; AU655164B2; EP0506830A1; DE69034213D1; DE69033986D1; ATE312834T1; WO1991009033A1; DE69034213T2; EP0962463B1; JP3398378B2; EP0506830B1; EP0962463A1; CA2069869A1; ATE220407T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Polymere auf Morpholino-Basis.

Literaturbezugsstellen

Agarwal, Proc Nat Acad Sci USA, 85: 7079 (1988).
Atencio, E. J., et al. (Hrsg.), Nucleotide Sequences: a compilation from GENBANK and EMBL data libraries, Vol. 6: Viruses, Academic Press (1986-87).
Balgobin, N., et al., Tetrahedron Lett, 22: 3667 (1981).
Belikova, Tetrahedron Lett, 37: 3557 (1967).
Blake et al., Biochem, 24: 6132 (1985a).
Blake et al., Biochem 24: 6139 (1985b).
Bower et al., Nucleic Acids Res. 15: 4915 (1987).
Dikshit et al., Canadian J Chem, 66: 2989 (1988).
Froehler, et al., Nucleic Acids Res. 16: 4831 (1988).
Fox, J. J., et al., J Am Chem Soc, 80: 1669 (1958).
Gait, "Oligonucleotide Synthesis A Practical "Approach", S. 31-33, IRL Press (Oxford, England) (1984).
Griffen, et al., Biomed. & Environ. Mass Spectrometry 17: 105 (1987).
Goldberg, M. L. et al. Methods in Enzymology 68: 206 (1979).
Greenlee, J. Org. Chem., 49 2632 (1984).
Grunstein, M. et al. Methods in Enzymology 68: 379 (1979).
Himmelsbach, F., und W. Pfleiderer, Tetrahedron Lett, 24: 3583 (1983).
Jayaraman, et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 1537 (1981).
Kamimura et al., Chem Lett (The Chem. Soc. of Japan) S. 1051 (1983)
LaPlanche et al., Nucleic Acids Res, 14: 9081 (1986).
Lerman, L. S., "DNA Probes: Applications in Genetic and Infectious Disease and Cancer", Current Comm in Molec Biol (Cold Spring Harbor Laboratory) (1986).
Letsinger und Miller, J Amer Chem Soc, 91: 3356 (1969).
Myers, G., et al. (Hrsg.), Human Retroviruses and AIDS: A compilation and analysis of amino acid and nucleic acid sequences, Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos NM (LAUR90-1393) (1990).
McBride et al., J Amer Chem Soc 108: 2040 (1986).
Miller, et al., Biochemistry 18: 5134 (1979).
Miller, et al., J Biol Chem 255: 6959 (1980).
Miller, et al., Biochimie 67: 769 (1985).
Murakami, et al., Biochemistry 24: 4041 (1985).
Niedballa, U., und H. Vorbruggen, J Org Chem, 39: 3668 (1974).
Pitha, Biochem Biophys Acta 204: 39 (1970a).
Pitha, Biopolymers 9: 965 (1970b).
Reese, C. B., und R. S. Saffhill, J Chem Soc PerkinTrans, 1: 2937 (1972). Smith, et al., J. A. C. S. 80: 6204 (1958).
Smith, et al., Proc Natl Acad Sci USA 83: 2787 (1986).
Southern, E.; Methods in Enzymology 68: 152 (1979).
Stirchak E. P. et al., Organic Chem. 52: 4202 (1987).
Summerton, J., et al., J Molec Biol 122: 145 (1978).
Summerton, J., et al., J Molec Biol 78: 61 (1979a).
Summerton, J., J Molec Biol 78: 77 (1979b).
Szostak, J. W. et al. Methods in Enzymology 68: 419 (1979).
Thomas, P.; Methods in Enzymology 100: 255 (1983).
Toulme et al., Proc Nat Acad Sci USA, 83: 1227 (1986)
Trichtinger et al., Tetrahedron Lett 24: 711 (1983).

Hintergrund der Erfindung

Polymere welche hinsichtlich basenspezifischer Bindung an Polynukleotide entworfen sind, besitzen ein signifikantes Potential sowohl für den in vitro-Nachweis spezifischer genetischer Sequenzen, welche für Pathogene charakteristisch sind, als auch für die in vivo-Inaktivierung genetischer Sequenzen, welche viele Krankheiten - insbesondere virale Krankheiten - verursachen.
Standardmäßige Ribo- und Desoxyribonukleotid-Polymere sind in weitem Umfang sowohl zum Nachweis komplementärer genetischer Sequenzen als auch, noch kürzlicher, zur Inaktivierung angezielter genetischer Sequenzen verwendet worden. Allerdings leiden Standard-Polynukleotide unter einer Anzahl von Beschränkungen, wenn sie für die basenspezifische Bindung an Zieloligonukleotide verwendet werden. Diese Beschränkungen schließen (i) eingeschränkten Durchtritt durch biologische Membranen, (ii) Nuklease-Empfindlichkeit, (iii) eine Ziel-Bindung, welche gegenüber der Jonenkonzentration empfindlich ist, und (iv) Anfälligkeit gegenüber zellulären Strangtrennungsmechanismen, ein.
Im Prinzip können die obenstehenden Einschränkungen durch Entwerfen von Polynukleinsäure- Analogen überwunden oder minimiert werden, in welchen die Basen entlang eines ungeladenen Grundgerüsts verbunden sind. Beispiele von ungeladenen Nukleinsäureanalogen sind berichtet worden. Pitha et al. (1970a, b) haben eine Vielzahl von homopolymeren Polynukleotidanalogen offenbart, in welchen das normale Zucker-Phosphat-Grundgerüst von Nukleinsäuren durch ein Polyvinyl-Grundgerüst ersetzt ist. Diese Nukleinsäureanaloge wiesen berichtetermaßen die erwarteten Watson/Crick-Paarungsspezifitäten mit komplemtären Polynukleotiden, aber bei wesentlich verringerten Tm-Werten, auf (Pitha, 1970a). Eine ernsthafte Beschränkung dieses Vorgehens ist die Unfähigkeit, Polymere durch sequenzielle Untereinheit-Anfügung zu konstruieren, um Polymere mit einer gewünschten Basensequenz herzustellen. Somit können die Polymere nicht für eine basenspezifische Bindung an ausgewählte Zielsequenzen verwendet werden. Polynukleotid- Analoge, enthaltend ungeladene, aber stereoisomere, Methylphosphonatbindungen zwischen den Desoxyribonukleosid-Untereinheiten, sind ebenfalls berichtet worden (Miller, 1979, 1980; Jayaraman; Murakami; Blake, 1985a, 1985b; Smith). Vor kürzerem wurde auch über eine Vielzahl von analogen ungeladenen Phosphoramidat-verknüpften Oligonukleotidanalogen berichtet (Froehler, 1988). Diese Polymere umfassen Desoxynukleoside, verbunden durch die 3'-OH-Gruppe einer Untereinheit und die 5'-OH-Gruppe einer anderen Untereinheit über eine ungeladene, chirale phosphorhaltige Gruppe. Von diesen Verbindungen wurde gezeigt, an einzelsträngige Polynukleotid- Zielsequenzen zu binden und diese selektiv zu blockieren. Allerdings sind ungeladene phosphorverknüpfte Polynukleotidanaloge unter Verwendung von Desoxyribonukleosid-Untereinheiten besonders kostspielig und schwierig herzustellen; das Untereinheit-Ausgangsmaterial ist ziemlich kostspielig und begrenzt verfügbar.
Vor kürzerem sind Desoxyribonukleotid-Analoge mit ungeladenen und achiralen Untereinheit- Bindungen konstruiert worden (Stirchak 1987). Diese ungeladenen achiralen Desoxyribonukleosid-abgeleiteten Analoge werden, wie obenstehend erwähnt, durch die relativ hohen Kosten der Ausgangsmaterialien eingeschränkt.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein allgemeines Ziel der Erfindung, ein zur sequenzspezifischen Bindung an Polynukleotide fähiges Polymer vorzusehen, welches viele der obenstehend angegebenen Probleme und Einschränkungen, die mit Polynukleotidanalog-Polymeren assoziiert sind, überwindet oder minimiert.
Die Erfindung sieht ein Polymer vor, umfassend Morpholino-Untereinheitsstrukturen der Form:
worin (i) die Strukturen miteinander verbunden sind durch ungeladene, chirale Verknüpfungen, welche den Morpholinostickstoff einer Untereinheit an den 5'-exozyklischen Kohlenstoff einer angrenzenden Untereinheit binden, und (ii) Pi ein Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest ist, welcher wirksam ist, durch basenspezifische Wasserstoffbindung an einer Base in einem Polynukleotid zu binden, und worin die Verknüpfung (i)
ist, worin X F, CH&sub2;R, OCH&sub2;R, -S-CH&sub2;R, NR&sub1;R&sub2;, Morpholino, Pyrrolyl oder Pyrazolyl ist; worin R, R&sub1; und R&sub2; gleich oder unterschiedlich sein können und gewählt sind aus H und CH&sub3;; Y&sub1; an den 5'-exozyklischen Kohlenstoff der Morpholino-Untereinheit gebunden ist; Y&sub1; O, S, CH&sub2; oder NR ist; und Z O oder S ist.
Typischerweise ist Z O, und Y&sub1; ist O.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 zeigt eine grundsätzliche β-Morpholino-Ringstruktur, welche durch ungeladene phosphorhaltige chirale Bindungen verknüpft ist, wodurch das Polymer der vorliegenden Erfindung gebildet wird. Pi ist ein Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest.
Die Fig. 2 zeigt mehrere exemplarische Purin- und Pyrimidinbasen-Paarungsreste (repräsentiert als Pi der in Fig. 1 gezeigten Ringstrukturen), worin X = H, CH&sub3;, F, Cl, Br oder I. Typischerweise wird in dem Polymer der vorliegenden Erfindung Pi aus den in Fig. 2 gezeigten Gruppen gewählt.
Die Fig. 3 zeigt die Untereinheit, welche geeignet zur Bildung der Polymere ist, worin X, Y und Z wie obenstehend definiert sind.
Die Fig. 4 zeigt ein wiederkehrendes Untereinheitssegment der Morpholino-basierenden Polymere der Erfindung. X, Y und Z sind wie in der Fig. 3 beschaffen. Pi und Pj sind Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsreste.
Die Fig. 5 zeigt die Schritte in der Synthese mehrerer Typen der Morpholino-Untereinheiten aus einem Ribonukleosid.
Die Fig. 6 zeigt eine alternative Synthese der grundlegenden Morpholino-Untereinheit.
Die Fig. 7 zeigt die Bindungsweise für 2-Amin-enthaltende Purine an polare Stellen der großen Furche von jeweiligen Zielbasenpaaren (Fig. 7a), und eine repräsentative Basensequenz eines Doppelstrang-bindenden Polymeren (Fig. 7b). In der Fig. 7b bedeutet a = Adenin; c = Cytosin; g = Guanin; t = Thymin; u = Uracil; D = 2,6-Diaminopurin oder 2-Aminopurin; G = Guanin oder Thioguanin; 1 = Hochspezifitäts-Wasserstoffbindung; und: = Wasserstoffbindung geringer Spezifität.
Die Fig. 8 zeigt zwei Verfahren zur Verknüpfung von Morpholino-Untereinheiten durch eine Phosphoramidatbindung.
Die Fig. 9 zeigt die Auftragung der Wärmedenaturierung für einen (Morpholino)(C)&sub6;/Poly(G)- Komplex, wobei das (Morpholino)(C)&sub6;-Polymer gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde.
Die Fig. 10 veranschaulicht die Verwendung eines Morpholino-Polymeren in einem diagnostischen Sonden-System.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das Polymer der vorliegenden Erfindung ist für basenspezifische Bindung an eine Zielsequenz eines Polynukleotids entworfen.

A. Morpholino-basierende Untereinheiten

Die Fig. 1 zeigt die β-Morpholino-Ringstrukturen, auf welchen die Polymeruntereinheiten basieren, wobei die Morpholino-Kohlenstoffatome wie in der Stamm-Ribose numeriert sind. Wie in der Fig. 1 ersichtlich, enthält die Ringstruktur ein 5'-Methylen, gebunden an das 4'-Kohlenstoffatom in der β-Orientierung. Typischerweise ist das Polymer der vorliegenden Erfindung aus mindestens 3 Morpholino-Untereinheiten aufgebaut.
Jede Ringstruktur schließt einen Purin- oder Pyrimidin-Rest, Pi, gebunden an den Grundgerüst- Morpholino-Rest durch eine Bindung in der β-Orientierung, ein.
Die Purin-Wasserstoffbindungs-Reste oder -Basen schließen Purine sowie purinartige planare Ringstrukturen mit einem 5-6-kondensierten Ring ein, in welchem eines oder mehrere der Atome, wie N3, N7 oder N9 durch ein geeignetes Atom ersetzt ist/sind, wie Kohlenstoff, oder das C8 durch einen Stickstoff ersetzt ist. Die Pyrimidinreste schließen gleichermaßen Pyrimidine als auch pyrimidinartige planare 6-gliedrige Ringe ein, in denen eines oder mehrere der Atome, wie N1, durch ein geeignetes Atom, wie Kohlenstoff, ersetzt ist. Bevorzugte Wasserstoffbindungs-Reste in der Erfindung schließen den in der Fig. 2 gezeigten Satz von Purinen und Pyrimidinen ein. Jede Base schließt mindestens zwei Wasserstoffbindungs-Stellen, welche spezifisch für ein(e) Polynukleotid-Base oder -Basenpaar sind, ein. Falls die Polymere für eine sequenzspezifische Bindung an einzelsträngige Polynukleotide verwendet werden, sind die Purinstrukturen 1 bis 3 zur Bindung an Thymin- oder Uracil-Basen; die Strukturen 7-8 zur Bindung an Guaninbasen; Strukturen 4-6 zur Bindung an Cytosinbasen; und die Strukturen 9 zur Bindung an Adeninbasen ausgelegt.
Typischerweise ist mindestens einer der Pi-Reste ein 2,6-Diaminopurinrest.
Typischerweise ist mindestens einer der Pi-Reste ein 5-Halogenuracilrest. Typischerweise sind mindestens 70% der Pi-Reste 2-Amin-enthaltende Purinreste.
Die Polymere der Erfindung sind auch effektiv zur Bindung an Wasserstoffbindungs-Stellen, welche über die große Furche in doppelsträngigen Polynukleotiden zugänglich sind, welche hauptsächlich Purinbasen in einem Strang und hauptsächlich Pyrimidinbasen im komplementären Strang aufweisen, wie nachstehend erörtert wird.
Wegen des ähnlichen Typs und der Positionierung der zwei zentralen polaren Große-Furche- Stellen unter den verschiedenen Basenpaaren von doppelsträngigen Nukleinsäuren (d. h. das NH4 und O6 eines CG-Basenpaares, vorliegend in derselben H-Bindungsanordnung wie das NH6 und O4 eines AT-Basenpaars) muß der H-Bindungs-Rest eines doppelstrangbindenden Polymeren eine Wasserstoffbindung an das N7 seines Zielbasenpaares eingehen, um ein gegebenes Basenpaar in einem genetischen Zieldoppelstrang eindeutig zu erkennen. In den Polymeren der vorliegenden Erfindung, welche gegen doppelsträngige genetische Sequenzen gerichtet sind, die vorwiegend Purine in einem Strang und vorwiegend Pyrimidine in dem anderen Strang enthalten, enthalten somit die Wasserstoffbindungs-Reste des Polymeren vorzugsweise Purine mit einem Amin an der 2-Position, da dieses Amin geeignet für die H-Bindung an das N7 des Zielbasenpaars positioniert ist. Genauer gesagt, ermöglichen die Strukturen 2 und 3 von Fig. 2 eine spezifische Bindung an ein TA- oder UA-Basenpaar, während die Strukturen 4 und 6 eine spezifische Bindung an ein CG- Basenpaar vorsehen. Zwei Basen, welche besonders nützlich in einem Doppelstrang-bindenden Polymer sind, sind 2,6-Diaminopurin (Struktur 3) und Guanin (Struktur 4). Die Fig. 7A veranschaulicht die Bindung dieser zwei Basen an die polaren Stellen der großen Furche ihrer jeweiligen Zielbasenpaare in doppelsträngigen Nukleinsäuren. Die Fig. 7B veranschaulicht eine repräsentative Basensequenz eines Polymeren, entworfen zur Bindung einer genetischen Zielsequenz im doppelsträngigen Zustand.
Die Morpholino-Untereinheiten der vorliegenden Erfindung werden zur Bildung von Polymeren durch Verknüpfen der Untereinheiten durch stabile, chirale, ungeladene Verknüpfungen der Formel
vereinigt.
Die Auswahl von Untereinheit-Verknüpfungsgruppen zur Verwendung bei der Polymersynthese wird von mehreren Erwägungen geleitet. Das anfängliche Screening vielversprechender Zwischen- Untereinheit-Verknüpfungen (d. h. diejenigen Verknüpfungen, welche der Vorhersage nach nicht unstabil sind und welche entweder eine freie Rotaion um die Bindung erlauben oder welche in einer einzigen Konformation vorliegen) beinhaltet typischerweise die Anwendung von Raumerfüllungs-CPK oder Computer-Molekülmodellen von doppelsträngiger DNA oder RNA. Die DNA- und RNA-Doppelstränge werden gemäß Parametern konstruiert, welche durch Röntgenstrahlbeugung von Oligodesoxyribonukleotiden in der B-Form und Oligoribonukleotid-enthaltenden Doppelsträngen in der A-Form bestimmt werden.
In jedem dieser konstruierten Doppelstränge wird eines der zwei Zucker-Phosphat-Grundgerüste entfernt, und das prospektive Grundgerüst, einschließlich des Morpholino-Rings und der Zwischen-Untereinheit-Bindung, wird, falls möglich, auf den Stellen der Basen, von denen das ursprüngliche Zucker-Phosphat-Grundgerüst entfernt worden ist, ersetzt. Jeder resultierende Polynukleotid/Polymer-Doppelstrang wird dann hinsichtlich der Koplanarität der Watson/Crick- Basenpaare, Verdrillungs- und Winkelspannung im prospektiven Bindungs-Polymergrundgerüst, dem auf den Nukleinsäurestrang ausgeübten Grad an Verzerrung, und hinsichtlich Nicht- Bindungs-Wechselwirkungen zwischen den Strängen und innerhalb der Stränge untersucht.
Anfängliche Untersuchungen dieses Typs, welche zur Unterstützung der Erfindung durchgeführt wurden, zeigen, daß ein Morpholino-basierendes Polymer eine bevorzugte Grundgerüst-Einheits- Länge (d. h. die Zahl von Atomen in einer wiederkehrenden Grundgerüstkette im Polymer) von 6 Atomen aufweist.
Da die Morpholinostruktur selbst 4 Atome zu jeder wiederkehrenden Grundgerüsteinheit beiträgt, steuern die Bindungen in dem sechs-atomigen wiederkehrenden Einheiten-Grundgerüst zwei Atome zur Grundgerüstlänge bei. In allen Fällen ist die Bindung zwischen den Ringstrukturen (a) ungeladen, (b) chiral, (c) stabil und muß (d) die Annahme einer Konformation zulassen, welche geeignet zur Bindung an das Ziel-Polynukleotid ist.
Untereinheit-Grundgerüststrukturen, welche in den obenstehenden Modellierungsuntersuchungen als annehmbar beurteilt wurden, werden dann hinsichtlich der Durchführbarkeit der Synthese überprüft. Die tatsächliche chemische Stabilität der Zwischen-Untereinheit-Bindung wird oft mit Modell-Verbindungen oder -Dimeren überprüft.
Die Fig. 3 zeigt den in der vorliegenden Erfindung verwendeten β-Morpholino-Untereinheittyp, einschließlich einer Verbindungsgruppe, welche den obenstehend aufgeführten Beschränkungen und Anforderungen genügt.
Die in der Fig. 3 gezeigte Untereinheit ist für 6-atomige Wiederholungs-Einheits-Grundgerüste entworfen, wie gezeigt in der Fig. 4. Die Y&sub1;-Gruppe, welche das 5'-Morpholino-Kohlenstoffatom an die Phosphorgruppe bindet, kann Schwefel, NR, wobei R wie obenstehend definiert ist, CH&sub2; oder vorzugsweise Sauerstoff sein. Der X-Rest, welcher an dem Phosphor hängt, ist wie obenstehend definiert beschaffen.
In dem Polymer der Erfindung ist die Verknüpfung typischerweise von folgender Form:
worin Pj ein Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest ist, der wirksam ist, durch basenspezifische Wasserstoffbindung an eine Base in einem Polynukleotid zu binden.
Eine andere typische Verknüpfung ist eine Verknüpfung der Form:
worin Pj ein Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest ist, der wirksam ist, durch basenspezifische Wasserstoffbindung an eine Base in einem Polynukleotid zu binden.

B. Untereinheit-Synthese

Die wirtschaftlichsten Ausgangsmaterialien für die Synthese von Morpholino-Untereinheiten sind im allgemeinen Ribonukleoside. Typischerweise werden Ribonukleoside, enthaltend Wasserstoffbindungs-Reste oder Basen (d. h. A, U, G, C), synthetisiert, um einen vollständigen Satz von Untereinheiten für die Polymersynthese vorzusehen. Wo ein geeignetes Ribonukleosid nicht verfügbar ist, kann eine 1-Halogenribose oder, vorzugsweise, ein 1 α-Bromglucose-Derivat an eine geeignete Base gebunden werden, und dieses Nukleosidanalog dann zu der gewünschten β-Morpholino- Struktur über Periodat-Spaltung und Schließen des resultierenden Dialdehyds auf einem geeigneten Amin umgewandelt werden.
Aufgrund der Reaktivität der für Untereinheit-Synthese, -Aktivierung und/oder -Kopplung verwendeten Verbindungen, ist es im allgemeinen wünschenswert und häufig notwendig, die exozyklischen Ring-Stickstoffe der Basen zu schützen. Die Auswahl dieser Schutzgruppen wird bestimmt durch (i) die relative Reaktivität des zu schützenden Stickstoffs, (ii) den bei Untereinheit- Synthese und -Kopplung beteiligten Typ von Reaktionen, und (iii) die Stabilität des vervollständigten Polymers vor der Basen-Entschützung.
Verfahren zur Basenschützung einer Anzahl von gewöhnlicheren Ribonukleosiden sind im Beispiel 1 angegeben. Die in dem Beispiel ausgeführten Verfahren sind im allgemeinen zur Bildung von Nukleosiden mit Aminschutzgruppen anwendbar. Für die Nukleinsäurechemie verwendete, standardmäßige Basenschutzgruppen sind oftmals geeignet, wobei die folgenden Gruppen eingeschlossen sind: Benzoyl für das N4 von C; Benzoyl oder p-Nitrobenzoyl für das N6 von Adenin (A); Acetyl, Phenylacetyl oder Isobutyryl für das N2 von Guanin (G); und N2, N6-Bis(isobutyryl) für 2,6-Diaminopurin-Reste. Diese Schutzgruppen können nach dem Polymerzusammenbau durch Behandlung mit Ammoniumhydroxid entfernt werden.
Es ist manchmal wünschenswert, den Basenanteil der Morpholino-Untereinheit mit einer Gruppe zu schützen, welche leicht durch etwas Anderes als eine nukleophile Base entfernt werden kann. Geeignete Basenschutzgruppen, entfernbar durch eine starke nicht-nukleophile Base über einen β- Eliminierungs-Mechanismus, schließen ein: 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl oder 2- (Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl für sowohl das N4 von C als auch das N6 von A; und das 9- Fluorenylmethoxycarbonyl für das N2 von G und das N2 und N6 von 2,6-Diaminopurin. Diese Gruppen können nach dem Polymerzusammenbau durch Behandlung mit der starken nicht- nukleophilen Base 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]-undec-7-en (DBU) unter strikt wasserfreien Bedingungen entfernt werden.
Die Synthesen von repräsentativen Morpholino-Untereinheiten sind insbesondere in den Beispielen 2-7 beschrieben. Unter Bezugnahme auf das in der Fig. 5 abgebildete Syntheseschema wird ein Basen-geschütztes Ribonukleosid mit Natriumperiodat behandelt, um ein vorübergehendes 2',3'-Dialdehyd zu bilden, welches sich dann auf Ammoniak hin unter Bildung eines Morpholino- Rings schließt, der 2'- und 3'-Hydroxylgruppen aufweist (numeriert wie in der Stamm-Ribose, siehe Fig. 1). Die Verbindung wird dann mit Natriumcyanborhydrid behandelt, um die Ring- Hydroxylgruppen zu reduzieren. Der Ringstickstoff wird vorzugsweise durch Trityl-Derivatisierung oder durch eine Benzhydraloxycarbonyl-Gruppe für die anschließende Untereinheit- Kopplung geschützt. Die Schutzgruppe kann durch Umsetzen der Morpholino-Untereinheit mit Tritylchlorid oder mit Nitrophenylbenzhydrylcarbonat oder durch Umsetzen des Dialdehyds mit einem primären Amin, wie veranschaulicht in Fig. 6 und beschrieben im Beispiel 3, angefügt werden.
Die Stereochemie des Nukleosid-Ausgangsmaterials wird beibehalten, solange der pH-Wert der Reaktionsmischung im Iminium-Stadium nicht über etwa 10 oder unter etwa 4 hinausgehen gelassen wird.
Die obenstehende Synthese führt zu einem Morpholino-Ring mit einem verfügbaren 5'-Hydroxyl. Das 5'-Hydroxyl kann in andere aktive Gruppen, einschließlich 5'-Amin und Sulihydral, umgewandelt werden (Beispiel 4).
In der obenstehenden Morpholino-Synthese kann eine Vielzahl von Stickstoffquellen verwendet werden - wobei insbesondere Ammoniak, Ammoniumhydroxid, Ammoniumcarbonat und Ammoniumbicarbonat eingeschloßen sind. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn die Reaktionslösung während der Oxidations- und Morpholino-Ringschluß-Reaktionen nahe der Neutralität gehalten wird. Dies kann durch kontinuierliches Titrieren der Reaktionsmischung oder, noch zweckmäßiger, durch Verwenden von Ammoniumbiborat als der Ammoniakquelle erfolgen. Wenn die Lösung zu sauer ist, ist die Produktausbeute gering, und wenn sie zu basisch ist, werden Nebenprodukte (möglicherweise aufgrund der Epimerisierung der 1'- und/oder 4'-Kohlenstoffe) hergestellt, welche schwierig von dem gewünschten Produkt zu trennen sind. Das Reduktionsmittel kann vor, während oder nach dem Oxidationsschritt, mit geringem bemerkbaren Effekt auf die Produktausbeute, zugesetzt werden.
Ribonukleoside, denen Basenschutzgruppen fehlen, können ebenfalls in wäßriger Lösung erfolgreich oxidiert, einem Ringschluß unterworfen, und reduziert werden, um den Morpholinoring zu erzeugen. Allerdings steigt ohne Basenschutz die Anzahl und Menge unerwünschter Nebenprodukte häufig an, insbesondere im Fall von Cytidin.
Die durch die obenstehenden Verfahren gebildeten Untereinheiten enthalten ein 5'-OH, -SH oder -Amin, welches modifiziert, umgesetzt und/oder aktiviert wird, wie nachstehend beschrieben, um zur Kopplung an eine zweite Morpholino-Untereinheit geeignet zu sein.

C. Aktivierunss- und Kopplungsreaktionen

Die wie obenstehend hergestellten Untereinheiten werden in einer regulierten sequenziellen Weise, häufig durch Aktivieren des 5'-Hydroxyls einer Untereinheit (welche einen geschützten Morpholino-Stickstoff aufweist) und Kontaktieren dieser aktivierten Untereinheit mit einer anderen Untereinheit, welche einen ungeschützten Morpholino-Stickstoff aufweist, gekoppelt, wie beschrieben im Beispiel 5. Es wird erkannt werden, daß verschiedene Typen von Bindungen, wie diejenigen, welche nachstehend veranschaulicht sind, bei der Konstruktion eines einzelnen Polymeren verwendet werden können.
Die einfachsten Bindungspolymere vom Morpholino-Typ sind Carbamat-verknüpfte Polymere, worin der Morpholino-Stickstoff durch ein Carbonyl an den 5'-Sauerstoff einer anderen Untereinheit verknüpft ist. Zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente zeigen, daß ein solches Polymer wirksam an eine einzelsträngige DNA-Zielsequenz bindet. Allerdings zeigte das Polymer in Bindungsuntersuchungen mit einem RNA-Ziel eine ungewöhnliche Bindung, wie verdeutlicht durch ein in hohem Maße atypisches Hypochromie-Profil im Spektralbereich von 320 bis 230 nm und das Fehlen einer normalen Wärmedenaturierung.
Frühere Modellierungsuntersuchungen zeigten, daß in einem Carbamat-verknüpften Polymer, gebunden an. DNA, welche in einer B-Konformation vorliegt, das Grundgerüst des Polymeren eine angemessene Länge für die Bindung bereitstellt, und die Carbamat-Reste des Polymergrundgerüstes eine nahezu planare Konformation einnehmen können. Dieses Modellierungs-Ergebnis stand in guter Übereinstimmung mit der effektiven Bindung der Carbamat-verknüpften Polymeren an DNA. Im Gegensatz dazu legten ähnliche Modellierungsuntersuchungen nahe, daß die Bindung des Carbamat-verknüpften Polymeren an ein RNA-Ziel eines aus dem nachfolgenden erfordert: (i) die Carbamatbindung des Polymeren nimmt eine im wesentlichen nicht-planare Konformation ein, oder (ii) die RNA-Zielsequenz nimmt eine gespannte Konformation ein, in welcher die Basen- Stapel-Wechselwirkungen ziemlich verschieden von denjenigen in einer normalen A- Konformation sind. Diese Beobachtung kann die atypische Bindung eines Carbamat-verknüpften Polymeren an eine RNA-Ziesequenz erklären.
Die Modellierungsarbeiten zeigten fernerhin, daß das Ersetzen des Carbonyl-Zwischen-Untereinheit-Bindungsrests entweder durch eine achirale sulfonylhaltige Zwischen-Untereinheit- Bindung oder durch eine chirale phosphorhaltige Bindung eine zusätzliche Länge von etwa 0,32 Angström pro Zwischen-Untereinheit-Bindung vorsehen wird. Derartige Bindungen würden auch eine größere Rotationsfreiheit um die Schlüssel-Bindungen sowie Bindungswinkel der Zwischen- Untereinheit-Bindung vorsehen, welche kompatibel mit einer Oligomergrundgerüst-Konformation sind, die geeignet für die Paarung sowohl an RNA- als auch DNA-Zielsequenzen in ihren Standardkonformationen ist.
Die Phosphoramid-Bindung in den in der Fig. 4 gezeigten Polymeren der Erfindung (6-atomiges Einheits-Längen-Grundgerüst) kann gemäß den in der Fig. 8 gezeigten und im Beispiel 5 ausführlich dargestellten Reaktionsschemen gebildet werden. Das 5'-Hydroxyl einer geschützten Untereinheit (Struktur 4 von Fig. 5) wird mit einer geeigneten phosphorhaltigen Verbindung, wie Dichlor-N,N-dimethylaminophosphat, umgesetzt, was zu einer aktivierten Untereinheit führt. Die Untereinheit wird dann mit einer zweiten Untereinheit mit einem ungeschützten Morpholino-Ring- Stickstoff umgesetzt. Eine große Zahl von Variationen sind in dem anhängigen X-Rest möglich, und, wie im Beispiel 5 beschrieben, beeinflußt die Identität des X-Restes die Einfachheit der Aktivierung und Kopplung, die Stabilität der resultierenden Bindung und zu einem gewissen Ausmaß die Ziel-Bindungsaffinität.
In dieser Synthese ist die P=O-Gruppe im wesentlichen mit der P=S-Gruppe austauschbar; Reaktionen mit der Einen sind im allgemeinen auf die Andere anwendbar.
Ein alternatives Verfahren zur Bildung der Phosphoramidbindungen besteht darin, Carbodiimid- Kopplung zu verwenden: ein beispielhaftes Carbodiimid ist Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Carbodiimid-Kopplung wird in Beispiel 5 beschrieben. Durch Nutzen einer Beobachtung von Smith et al. (1958) kann das Carbodiimid-Reagenz auch verwendet werden, um: (a) einen Phosphor-(oder Thiophosphor-)Verknüpfüngsrest an eine Untereinheit anzufügen; oder (b) einen anhängenden X- Rest an einen Phosphor-(oder Thiophosphor-)Verknüpfungsrest zu binden.
Zusätzliche Phosphoramidbindungen können gebildet werden durch Umwandeln des 5'-Hydroxyls in andere funktionelle Gruppen (z. B. SH, CH&sub2;, NR), vor Aktivieren und Koppeln der Untereinheiten zu Polymeren.

D. Zusammenbau von Polymeren

Nach Auswählen einer gewünschten Polymerlänge und Erkennungs-Rest-Sequenz (Richtlinien hierfür sind nachstehend angegeben) wird das Polymer unter Anwendung der obenstehend beschriebenen allgemeinen Verfahrensweisen zusammengesetzt. Ein Verfahren zum Polymerzusammenbauen beinhaltet die anfängliche Herstellung eines passenden Satzes von Oligomerblöcken und dann die Verknüpfung dieser Blöcke unter Bildung des Polymers mit der letztendlichen Länge. Die in der Polymersynthese verwendeten Oligomerblöcke müssen nicht von gleicher Größe sein. Diese Blöcke werden in Lösung hergestellt, im wesentlichen gemäß den Kopplungsverfahren, die unter Bezugnahme auf die Beispiele 6 und 7 beschrieben werden. Das Beispiel 7 beschreibt eine derartige Blocksynthese unter Bildung eines Pentameren.
Ein besonderer Vorteil dieses Block-Zusammenbauverfahrens besteht darin, daß jegliche Kopplungsfehler beim Zusammenbau des Vollängen-Polymeren Fehlsequenzen erzeugen, welche leicht von dem gewünschten Polymer getrennt werden. Das Beispiel 6 schildert ausführlich den Zusammenbau eines einfachen Homopolymeren durch dieses Verfahren. Das Beispiel 7 beschreibt die Herstellung eines Blocks, der geeignet zur Verwendung in einem Heteropolymeren ist. Die Beispiele 8 und 9 beschreiben den Zusammenbau von Blöcken unter Bildung eines biologisch aktiven Heteropolymers. Somit beschreiben die Beispiele 7, 8 und 9 zusammen eine Synthese- Vorgehensweise, welche eine Kombination von Zusammenbauverfahren anwendet, worin Oligomerblöcke schrittweise in Lösung zusammengebaut werden, und dann diese Oligomere zu Vollängen-Polymeren verknüpft werden.
Typischerweise ist das Polymer der Erfindung an einen festen Träger gebunden. Die Polymere können durch schrittweise Untereinheit-Addition auf einem festen Träger synthetisiert werden, wie es in Beispiel 10 beschrieben wird.
Typischerweise wird ein fester Träger, wie Glasperlen, derivatisiert mit säurestabilen, langkettigen spaltbaren Linkem bzw. Abstandhaltern als das Trägermaterial für Festphasensynthesen verwendet und für die Anheftung der/des ersten Untereinheit, oder Blocks von Untereinheiten, vorbereitet, wie beschrieben in den Beispielen 9 und 10. Die Glasperlen werden mit einer Untereinheit umgesetzt, welche im allgemeinen eine leicht abspaltbare Schutzgruppe auf einem Stickstoff aufweist. Ob die Morpholino-Untereinheit an den Träger über ihren Morpholino-Stickstoff oder eine Gruppe an der 5'-Position verknüpft ist, hängt von der Richtung der Polymersynthese ab, d. h. an welche Gruppe die nächste Untereinheit gebunden werden wird.
Nach Kopplung der/des zweiten Untereinheit (oder Oligomers, welches in Lösung zusammengebaut werden kann) an den Träger können jegliche nicht umgesetzten nukleophilen Stellen durch Zusetzen eines geeigneten Verkappungsreagenz, wie p-Nitrophenylacetat oder Essigsäureanhydrid, mit Kappen versehen werden, und danach wird der Träger gewaschen. Die Schutzgruppe auf dem Stickstoff der endständigen Untereinheit wird entfernt, typischerweise durch Säurebehandlung, und nach der Neutralisation wird der Träger mit einem Überschuß der nächsten Untereinheit (oder Polymereinheit) in der Sequenz umgesetzt, welche durch eines der obenstehend angegebenen Verfahren aktiviert ist. Ein Merkmal des Festphasen-Zusammenbauverfahrens unter Anwendung schrittweiser Additionen von monomeren Untereinheiten ist die Notwendigkeit nach hohen Kopplungseffizienzen bei jedem Untereinheit-Additionsschritt. Diese hohe Kopplungseffizienz wird im allgemeinen durch Zusetzen eines Überschusses der aktivierten Untereinheit erzielt, was die Anzahl von an den Träger gebundenen Ketten, welche einer Kettenverlängerung unterliegen, maximiert.
Die Kettenverlängerung wird auf diese Weise fortgesetzt, unter wahlfreier Kappen-Abdeckung von Fehlsequenzen nach jeder Untereinheitaddition, bis das Polymer mit der gewünschten Länge und Sequenz erzielt wird.
Nach Addition der letzten Untereinheit kann der endständige Grundgerüstrest mit einer geeigneten geladenen oder ungeladenen Gruppe umgesetzt werden, wie beschrieben im Beispiel 6. Das Polymer wird dann vom Träger abgespalten, z. B. durch Behandlung entweder mit Ammoniumhydroxid oder einer nicht-nukleophilen Base, geeignet zur Bewirkung von β-Elimination in dem Linker, der das Polymer an den Träger bindet. Die Basen werden entschützt und das Polymer wird gereinigt, wie nachstehend und in den Beispielen 6, 8, 9 und 10 beschrieben.

E. Polymerverarbeitung und -Reinigung

In Lösung zusammengebaute Bindungspolymere (Beispiele 6 und 8) werden typischerweise Basenentschützt durch Suspendieren in DMSO oder DMF und Aufschichten auf die Suspension eines gleichen Volumens von konzentriertem Ammoniumhydroxid. Die Präparation wird verschlossen und dann unter Schütteln vermischt und 16 Stunden lang bei 30ºC inkubiert. Die Aufarbeitung beinhaltet das Entfernen des Ammoniaks unter verringertem Druck. Wenn eine Schutzgruppe (im allgemeinen Trityl oder ein verwandter säurelabiler Rest) vorhanden ist, wird diese Gruppe abgespalten, und die Rohpolymer-Präparation wird zur Reinigung in dem passenden Puffer suspendiert.
Durch ein Festphasenverfahren zusammengebaute Bindungspolymere (Beispiele 9 und 10), wobei sie über eine Esterbindung an den Träger gebunden sind, können von dem Träger durch Suspendieren des getrockneten Trägers in DMSO, Aufschichten auf ein gleiches Volumen an konzentriertem NH&sub4;OH, festem Verschließen und langsamem Bewegen während 16 Stunden bei 30ºC abgespalten werden. Das feste Trägermaterial wird durch Filtration entfernt, und das Filtrat wird wie obenstehend beschrieben behandelt,
Alternativ dazu können Bindungspolymere, welche an den Träger über einen β-Eliminierungsempfindlichen Linker gebunden sind, von dem Träger abgespalten werden unter Verwendung einer starken nicht-nukleophilen Base 1,8-Diazubicyclo(5.4.0.)undec-7-en (DBU) in DMF. Unter Verwendung dieser Vorgehensweise kann man das Polymer freisetzen, wobei seine Basen noch geschützt sind, und somit ist das Polymer geeignet für eine weitere Modifikation und/oder Struktur- Bestätigung mittels Massenspektroskopie durch Beschuß mit schnellen Atomen.
Die Reinigung des Basen-entschützten Polymeren wird vorzugsweise bei pH 2,5 oder pH 11 ausgeführt, abhängig vom pK der Basenreste in dem Polymer. Bei pH 2,5 tragen Cytosin-, Adenin- und 2,6-Diaminopurin-Reste eine positive Ladung, und Guanin trägt eine teilweise positive Ladung. Bei pH 11 tragen Guanin, Uracil und Hypoxanthin eine negative Ladung. Für Polymere, in denen etwa 30% oder mehr der Basenpaarungs-Reste bei pH 2,5 ionisiert sind, kann die Reinigung durch Kationenaustausch auf einer Säule von S-Sepharose-"Fast-Flow" (Pharmacia) durchgeführt werden, welche mit einem flachen NaCl-Gradienten, gepuffert bei pH 2,5, entwickelt wird. Der Ausfluß wird bei 254 nm überwacht und in einem Fraktionensammler aufgefangen. Das Vollängenpolymer, welches nach den kürzeren Fehlsequenzen eluiert, kann auf einer Säule aus Polypropylen von Chromatographie-Güteklasse (Polysciences Inc.) weiter gereinigt und entsalzt werden, wobei mit einem wäßrigen Gradient von Acetonitril oder Methanol eluiert wird, das mit Ameisensäure auf pH 2,5 eingestellt ist, und wobei das Eluat bei 254 nm überwacht wird. Die Fraktionen mit dem reinen Produkt werden neutralisiert und unter verringertem Druck getrocknet. Salze können durch Lösen des Polymeren in Trifluorethanol, Filtrieren und Verdampfen des Trifluorethanols beseitigt werden.
Für Polymere, in welchen etwa 30% oder mehr der Basenpaarungs-Reste bei pH 11 ionisiert sind, kann die Reinigung durchgeführt werden auf einer Anionenaustauschersäule von Q-Sepharose- "Fast-Flow" (Pharmacia), entwickelt mit einem wäßrigen pH 11-Gradient von NaCl. Das Vollängenpolymer, welches nach kürzeren Fehlsequenzen eluiert, wird auf einer Polypropylen-Säule, eluiert mit einem wäßrigen pH 11-Gradient von Acetonitril, weiter gereinigt und entsalzt. Fraktionen, die das reine Produkt enthalten, werden wie obenstehend verarbeitet.
Die obenstehend beschriebenen Reinigungsverfahren sollten so durchgeführt werden, daß Polymere, welche Adenin-Basenpaarungsreste enthalten, nicht für mehr als einige wenige Stunden bei Raumtemperatur einem pH-Wert von 11 ausgesetzt werden, um mögliche Basen-Labilitäts- Probleme zu vermeiden. Die Details der Reinigungsverfahren sind in den Beispielen 6, 8 und 9 angegeben.
In neutraler wäßriger Lösung können diese Morpholino-Polymere eine geringere Löslichkeit, als erwünscht, aufweisen. Folglich schließt das Polymer der Erfindung typischerweise fernerhin einen Rest an einem oder beiden Enden ein, welcher wirksam ist, um die Löslichkeit des Polymeren in wäßrigem Medium zu verstärken. Typischerweise ist der Rest an einem oder beiden Enden Polyethylenglykol. Für die meisten der hierin offenbarten Polymertypen kann die Hinzufügung des Restes bewerkstelligt werden durch Abspalten der endständigen Grundgerüst-Schutzgruppe von dem vervollständigten Polymer und Umsetzen des Polymers, wobei die Basen noch im geschützten Zustand sind, mit einem Überschuß an Carbonyldiimidazol-aktiviertem Polyethylenglykol (PEG). Danach wird das Bindungspolymer mit Ammoniumhydroxid behandelt, um die basengeschützten Gruppen zu entfernen, und das Polymer wird, wie obenstehend, gereinigt. Der Spiegel an Solubilisierung wird durch die passende Wahl des PEG-Materials ohne weiteres eingestellt. Geeignete PEG-Fraktionen mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 200, 400, 600, 1000, 1540, 3400, 4000, 6000, 7500 und 18 500 Dalton sind im Handel erhältlich (z. B. Polysciences, Inc.), wobei PEG 1000 oft die beste Solubilisierung ergibt. Der solubilisierende Rest kann, falls gewünscht, über eine spaltbare Bindung an das Polymer gebunden werden, um zu gestatten, daß das Polymer von dem Solubilisierungsmittel freigesetzt wird, z. B. durch Esterase- oder Peptidase-Enzyme.
Es ist davon auszugehen, daß das Polymer gemäß bekannten Verfahren weiter derivatisiert oder markiert werden kann. Zum Beispiel kann das Polymer durch Herstellen der Polymer- Untereinheiten aus radioaktiv markierten Ribonukleosiden oder durch Anheften einer radioaktiv markierten Aminosäure an ein Ende radioaktiv markiert werden. Das Polymer kann ohne weiteres, z. B. unter Anwendung von Modifikationen der obenstehenden Untereinheit-Kopplungsreaktionen, mit Enzymen, chromophoren Gruppen oder dergleichen, derivatisiert werden, falls das Polymer als eine diagnostische Sonde verwendet werden soll. Ferner kann das Polymer mit Biomolekülen derivatisiert werden, welche dazu dienen, die Polymere zu spezifischen Geweben oder Zelltypen zu lenken.

F. Strukturelle Charakterisierung

Vollständig-geschützte Bindungspolymere von mäßiger Größe (10 bis 20 Untereinheiten) ergeben oft ein starkes molekulares Ion in der FAB (Beschuß mit schnellen Atomen)-Massenspektroskopie, was eine Schlüssel-Bestätigung der Polymerlänge bereitstellt.
Ferner liefert COSY-NMR (zweidimensionale korrelierte Spektroskopie) des entschützten und gereinigten Polymeren Informationen über das Verhältnis der unterschiedlichen Basen-paarenden Reste in dem Polymer sowie quantitative Informationen über das Verhältnis von Bindungspolymer zu irgendwelchen solubilisierenden Resten oder einem anderen Typ zugehörigen Resten, welche daran gebunden worden sein können.
Die Beweglichkeiten auf Ionenaustauscher-Säulen geben ebenfalls Informationen über die Zahl von C + A-Basenpaarungs-Resten in einem Polymer, wenn die Reinigung bei pH 2,5 ausgeführt wird, und Informationen über die Zahl von G + U-Resten, wenn die Reinigung bei pH 11 durchgeführt wird. Die Struktur-Bestätigung ist am einfachsten, wenn die Polymere aus Oligomerblöcken zusammengebaut worden sind, wie in den Beispielen 6, 8 und 9, da dann jedwede Fehlsequenzen sich noch wesentlicher von den Vollängen-Sequenzen unterscheiden.
Die UV-Profile der Polymere bei pH 1, 7 und 13 können Informationen über die relative Nukleotidzusammensetzung des Polymeren geben.
Die Bewertung der Affinität eines Morpholino-basierenden Polymers für seine Zielsequenz wird durch Untersuchen der Schmelzkurve des Polymer/Ziel-Doppelstrangs durchgeführt, wie veranschaulicht in Beispiel 6. Ferner können Vergleiche zwischen der Schmelzkurve eines regulären Nukleinsäuredoppelstrangs (wie p(dC)&sub6;/p(dG)&sub6;) und der Schmelzkurve eines Hybrid- Doppelstrangs, enthaltend ein entsprechendes Morpholino-basierendes Polymer (wie (Morpholino C)&sub6;/p(dG)&sub6;) vorgenommen werden.
Die obenstehenden Charakterisierungsschritte sind bei einem Morpholino-basierenden Phosphordiamidat-verknüpften Poly(C)-Hexamer angewandt worden, wobei Y Sauerstoff ist, X N(CH&sub3;)&sub2; ist und Z Sauerstoff ist, wie beschrieben in Beispiel 6. Die Charakterisierung des Vollängen- Oligomers wurde durch Protonen-NMR und Negativ-Ionen-FAB-Massenspektroskopie erreicht. Mit diesen Morpholino-Oligomeren ist die Fragmentierung der Oligomere in großem Maße unterdrückt, so daß wenig Sequenzinformation erhältlich ist. Allerdings ist das Eltern-Ionensignal ziemlich stark und gestattet eine Bestätigung der Zusammensetzung des Morpholino-Oligomers (siehe Beispiel 6). Um die Wasserlöslichkeit zu erhöhen, wurde ein Polyethylenglykol(PEG)- Schwanz an die Oligomere angeheftet. S Äquivalente von PEG 1000 wurden mit einem Äquivalent Bis(p-nitrophenyl)carbonat behandelt, um monoaktiviertes PEG zu ergeben. Die Detritylierung des Hexamers mit 1%iger Essigsäure in Trifluorethanol führte zu einem freien Morpholino- Ringstickstoff. Die Behandlung des Hexameren, enthaltend das freie Amin, mit aktiviertem PEG 1000 unter Standard-Kopplungsbedingungen führte zur Anheftung des PEG-Schwanzes an das Hexamer. Die Basen wurden durch Behandlung des "getailten" bzw. mit einem Schwanz versehenen Hexameren mit konzentriertem Ammoniak während 24 Stunden entschützt. Das getailte Hexamer wurde in einem Puffer von pH 2,5 aufgenommen und durch Kationenaustauschchromatographie auf S-Sepharose-Fast-FlowTM gereinigt, wobei mit einem Kaliumchlorid-Gradienten eluiert wurde. Nach der Neutralisierung wurde das Elutionsmittel auf einer Polypropylen-Säule entsalzt, wobei mit einem Wasser/Acetonitril-Gradienten eluiert wurde. Man stellte fest, daß das getailte Hexamer in einem Puffer von pH 7,5 frei löslich war.
Die Stabilität von Komplexen des getailten Hexameren mit komplementären Nukleinsäuren wurde durch Wärmedenaturierungsexperimente untersucht. Differenz-Spektren zwischen gemischten und ungemischten Proben des getailten Hexameren und dem ausgewählten Phosphodiester- Komplementär wurden von 14ºC bis 85ºC über den Bereich von 320 bis 260 nm erhalten (siehe Beispiel 6). Bei 60 Mikromolar C-Monomer und 60 Mikromolar G-Monomer ergab das Differenz- UV-Spektrum des getailten Hexameren (morphC)&sub6; mit Poly(dG) einen Tm-Wert von 79ºC. Das entsprechende (morphC)&sub6; mit Poly(G) ergab einen Tm-Wert von 51,5ºC (siehe Beispiel 6 und Fig. 9).

G. Diagnostische Anwendungen

Die zielspezifischen Polymere der Erfindung können in einer Vielzahl von diagnostischen Assays zum Nachweis von RNA oder DNA mit einer gegebenen Zielsequenz verwendet werden. Folglich sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Polynukleotids mit einer gewählten Zielsequenz, in einer Probe, vor, umfassend das Kontaktieren eines Polymeren der Erfindung mit dem Polynukleotid, wobei das Polymer (i) eine Reihe von Basen-paarenden Resten aufweist, die zur Bindung der gewählten Zielsequenz in der Lage sind, und (ii) mit einer nachweisbaren Reportergruppe markiert sind, und wobei das Umsetzen des Polymeren mit dem Polynukleotid unter Bedingungen durchgeführt wird, die wirksam sind, um die Bildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen dem Polymer und der Zielsequenz zu ermöglichen, und das Nachweisen der Anwesenheit der Reportergruppe.
In einer allgemeinen Anwendung werden die Polymere markiert mit einer geeigneten radioaktiven Markierung oder einer anderen nachweisbaren Reportergruppe. Das Zielpolynukleotid, typischerweise ein einzelsträngiges Polynukleotid, wie DNA oder RNA, welches an einen festen Träger gebunden werden kann, wird mit dem Polymer unter Hybridisierungsbedingungen umgesetzt, annealen bzw. anlagern gelassen, und dann wird die Probe hinsichtlich der Anwesenheit der Polymer-Reportergruppe untersucht.
Der diagnostische Assay kann gemäß Standardvorgehensweisen bei geeigneter Anpassung der Hybridisierungsbedingungen durchgeführt werden, um die Polymer-Hybridisierung mit der Zielregion zu gestatten. Ferner kann das Polymer für die Hybridisierung mit dem Ziel bei einer höheren Schmelztemperatur als der komplementäre Polynukleotidstrang ausgelegt werden, da die Polymerbindung keine Grundgerüstladungs-Abstoßungseffekte mit sich bringt. Deshalb kann das Polymer an das Ziel bei einer Temperatur über der normalen Polynukleotid-Schmelztemperatur binden: dies ist ein Vorteil des Polymeren gegenüber herkömmlichen Oligonukleotidsonden. Diese Bindung bei erhöhter Temperatur minimiert das Problem der Kompetition um die Bindung an das Ziel zwischen der Sonde und irgendeinem entsprechenden einzelsträngigen Oligonukleotid, welches in dem diagnostischen Gemisch vorhanden sein kann.
In einem zweiten allgemeinen Typ der diagnostischen Anwendung werden die Polymere an einen festen Träger gebunden, und zwar für den Einfang von Ziel-RNA oder -DNA an den Träger. Somit sieht die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Isolierung einer Nukleinsäure mit einer gewählten Zielsequenz aus einer Probe vor, umfassend
Kontaktieren eines Polymeren der Erfindung mit der Nukleinsäure, wobei das Polymer (i) eine Reihe von Basen-paarenden Resten aufweist, die zur Bindung der gewählten Zielsequenz in der Lage sind, und (ii) an einem festen Träger gebunden ist, und (iii), wobei das Kontaktieren des Polymeren mit der Nukleinsäure unter Bedingungen ausgeführt wird, die wirksam sind, um die Bildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen dem Polymer und der Zielsequenz zu ermöglichen, und

Isolieren der Nukleinsäure.

Der feste Träger, z. B. polymere Mikroteilchen, kann hergestellt werden durch Binden der Polymere an den Träger gemäß den obenstehend beschriebenen Verfahren oder durch herkömmliche Derivatisierungs-Vorgehensweisen. Alternativ dazu kann, wo die Polymere auf einem festen Träger synthetisiert werden, dieser Träger auch als der Assay-Träger dienen.
Gemäß eines Merkmals dieses Assaysystems können die Zielpolynukleotidmoleküle, welche auf dem Träger durch basenspezifische Bindung an die Polymere eingefangen werden, auf der Grundlage ihrer Grundgerüst-Ladung nachgewiesen werden, da die Träger gebundenen Polymere selbst im wesentlichen ungeladen sind. Zu diesem Zweck kann das Assay-System auch polykationische Reportermoleküle einschließen, welche entworfen sind, um an das vollständig geladene Analyt- Grundgerüst, aber nicht an das ungeladene (oder im wesentlichen ungeladene) Polymergrundgerüst, unter ausgewählten Bindungsbedingungen zu binden.
In einer Ausführungsform sind die Reportermoleküle aus einem polykationischen Rest oder Schwanz aufgebaut, entworfen, um elektrostatisch an ein vollständig geladenes Polynukleotid unter Bedingungen zu binden, bei welchen der Reporter nicht an das weniger geladene oder ungeladene Bindungspolymer bindet, welches auf dem diagnostischen Reagenz getragen wird; eine oder mehrere Reportergruppen können an den Schwanz gebunden sein, angepaßt zur Erzeugung eines Signals, durch das die Anwesenheit des Reporters nachgewiesen werden kann.
Verfahren zur Bildung von polykationischen Molekülen und zur Anheftung von Reportermolekülen an kationische Verbindungen sind bekannt.
Jedes Reportermolekül trägt eine oder mehrere Reportergruppen, und jedes Polynukleotid kann passend für eine Bindung von typischerweise mehreren Tausend oder mehr Reportermolekülen sein. Somit besitzt das System einen Amplifikations-Faktor hinsichtlich des Reportersignals pro gebundenem Analytmolekül von mehreren Größenordnungen. Darüber hinaus besitzt das Verfahren den, obenstehend angegebenen, Vorteil, daß die Polynukleotid-Bindungsreaktion unter Bedingungen durchgeführt werden kann, bei welchen Bindungskompetition mit komplementären Nukleotidsträngen nicht auftritt.
Die Entwurfs-Erwägungen, welche bei der Herstellung eines Polynukleotid-Bindungspolymeren zur Verwendung als ein diagnostisches Reagenz angewandt werden, werden von der Natur des Zielanalyten und den Reaktionsbedingungen, unter welchen der Analyt getestet werden soll, bestimmt. Als eine erste Erwägung wird eine nicht-homopolymere Zielbasensequenz gewählt, gegen welche das Polymer gerichtet ist. Diese Zielsequenz ist im allgemeinen einzelsträngig und vorzugsweise einzigartig für den zu testenden Analyten.
Die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer gegebenen n-basigen Zielsequenz ist ungefähr (1/4)n. Demgemäß würde man von einer gegebenen n-basigen Zielsequenz erwarten, ungefähr einmal in einem Polymer vorzukommen, welches 4n Basen enthält. Deshalb ist die Wahrscheinlichkeit P, daß eine gegebene n-basige Sequenz in Polynukleotiden mit insgesamt N einmaligen Sequenz- Basen vorkommen wird, ungefähr P = N/4n. Zur Veranschaulichung ist die Wahrscheinlichkeit P, daß eine 9-Basen-Zielsequenz in einem 20 Kilobasen großen Polynukleotid gefunden wird, etwa 20 · 10³/2 · 10&sup5; oder 0,08, die Wahrscheinlichkeit, daß eine 16-Basen-Zielsequenz vorhanden sein wird, ist etwa 20 · 10³/4,3 · 10&sup9; oder 0,0000047. Aus diesen Berechnungen kann man ersehen, daß ein Polymer mit 9-16 Erkennungsresten, spezifisch für eine definierte 9-16 Basen große Zielsequenz, hohe Spezifität für die Zielsequenz in einer Assaymischung haben sollte, welche nur virale Genome enthält, deren größte Komplexitäten etwa 400K an einmaligen Sequenzbasen entsprechen.
Ähnliche Berechnungen zeigen, daß ein Polymer von 12 bis 16 Untereinheiten eine angemessene Spezifität für eine virale oder bakterielle Zielsequenz in einer Assaymischung, welche lediglich virales und bakterielles genomisches Material enthält, vorsehen kann; wobei die größten genomischen Größen sich auf etwa 5000 Kilobasen belaufen. Ein Polymer von 16 bis 22 Untereinheiten kann angemessene Spezifität für eine Zielsequenz in einer Polynukleotidmischung vorsehen, welche genomisches Säuger-DNA-Material enthält; wobei die genomischen Größen sich auf etwa 5 Milliarden Basenpaare an einmaliger Sequenz-DNA belaufen.
Die Polymer/Analyt-Bindungsaffinität und insbesondere die Temperatur, bei der das Polymer eben an die Zielsequenz bindet (die Schmelztemperatur oder Tm) können selektiv gemäß den folgenden Kriterien variiert werden: (a) Anzahl von Untereinheiten in dem Polymer; (b) Anzahl von Wasserstoffbindungen, welche zwischen den Basen-paarenden Resten und den entsprechenden komplementären Basen der Analyt-Zielsequenz gebildet werden können; (c) Einheitslänge des Polymergrundgerüsts; (d) die besonderen Zwischen-Untereinheit-Bindungen; und (e) die Konzentration von Denaturierungsmitteln, wie Formamid, welche die Schmelztemperatur absenken.
Aus einer Reihe von Untersuchungen an Modell-Nukleinsäuredoppelsträngen ist es bekannt, daß die Schmelztemperatur von Oligonukleotid-Doppelsträngen im Bereich von 10 bis 20 bp um ungefähr 3ºC pro zusätzlichem Basenpaar, das durch zwei Wasserstoffbindungen gebildet wird, und um etwa 6ºC pro zusätzlichem Basenpaar, daß durch drei Wasserstoffbindungen gebildet wird, zunimmt. Deshalb kann die Zielsequenzlänge, welche ursprünglich gewählt wird, um eine hohe Bindungsspezifität mit dem Polymer zu gewährleisten, verlängert werden, damit eine gewünschte Schmelztemperatur unter den gewählten Assay-Bedingungen erreicht wird.
Desweiteren kann, wo die in der Konstruktion des Polymeren verwendeten Erkennungsreste die Standard-Nukleinsäurebasen sind, die Zielsequenz gewählt werden, um einen hohen Prozentsatz an Guanin- plus Cytosinbasen aufzuweisen, damit eine verhältnismäßig hohe Polymer/Analyt- Schmelztemperatur erzielt wird. Um andererseits eine geringere Schmelztemperatur zu erzielen, wird eine Zielsequenz gewählt, welche einen relativ hohen Prozentsatz an Adenin- plus Thyminbasen enthält.
Die Bindungskomponenten in dem diagnostischen System, wie sie in dem eben beschriebenen diagnostischen Verfahren mit einem festen Träger funktionieren, sind in der Fig. 10 veranschaulicht. Hierbei ist "S", das Assay-Reagenz, der feste Träger mit einer Anzahl von Bindungspolymeren, welche an seine Oberfläche über Abstandhalter-Arme, gezeigt durch Sägezahn-Linien, gebunden sind. In dem Assay-Vorgehen wird die Ziel-DNA in einzelsträngiger Form mit den Trägergebundenen Polymeren unter Hybridisierungsbedingungen umgesetzt, und der feste Träger wird dann gewaschen, um nicht-hybridisiertes Nukleinsäurematerial zu entfernen.
Der gewaschene Träger wird dann mit dem Reporter unter Bedingungen umgesetzt, welche die elektrostatische Bindung des kationischen Reporter-Rests an das Ziel-DNA-Grundgerüst begünstigen. Der in der Fig. 10 gezeigte Reporter ist ein dikationisches Molekül mit einer Reportergruppe R.
Nach der Reaktion mit der Reporterlösung, typischerweise während einiger Sekunden bei Raumtemperatur, wird das Reagenz gewaschen, um ungebundenen Reporter zu entfernen, und dann wird das Assay-Reagenz hinsichtlich gebundenem Reporter untersucht. Eine Vorgehensweise zur Bestimmung der mit dem Reagenz assoziierten Menge von Reporter, insbesondere im Fall von fluoreszenten oder chromophoren Reportergruppen, besteht darin, den Reporter mit einer Hochsalz- Lösung von dem Reagenz zu eluieren, und dann das Eluat hinsichtlich des Reporters zu untersuchen.
Das Polymer der Erfindung kann eine sequenzspezifische Bindung an doppelsträngige Nukleinsäuren über basenpaarspezifische Wasserstoffbindungs-Stellen eingehen, welche über die große Furche der Doppelhelix zugänglich sind. Diese Bindung kann in einer Doppelstrangregion stattfinden, in der mindestens 70% der Basen auf einem Strang Purine sind, und ein entsprechender Prozentsatz der Basen auf dem anderen Strang Pyrimidine sind. Das Doppelstrang-Bindungspolymer schließt vorzugsweise 2,6-Diaminopurin-Wasserstoftbindungsreste für die Bindung an T-A- oder U-A-Basenpaare und Guanin-Wasserstoftbindungsreste für die Bindung an C-G-Basenpaare ein, wie veranschaulicht in der Fig. 7. Für diese spezielle Zielsequenzen kann das Polymer der Erfindung somit für diagnostische Assays der eben beschriebenen Typen verwendet werden, worin jedoch die Ziel-Nukleinsäure in nicht-denaturierter doppelsträngiger Form vorliegt.

H. Andere Anwendungen

Die Polymere der vorliegenden Erfindung können anstelle von Standard-RNA- oder DNA- Oligomeren für eine Reihe von standardmäßigen Laboratoriums-Vorgehensweisen eingesetzt werden. Wie obenstehend erwähnt, können Morpholino-basierende Polymere an einen festen Träger fixiert und verwendet werden, um komplementäre Nukleinsäuresequenzen zu isolieren, zum Beispiel zur Reinigung einer spezifischen mRNA aus einer Poly-A-Fraktion (Goldberg et al.). Die vorliegenden Polymere sind vorteilhaft für solche Anwendungen, da sie kostengünstig und geradlinig aus aktivierten Untereinheiten herzustellen sind.
Es kann eine große Zahl von Anwendungen in der Molekularbiologie für markierte Morpholinobasierende Polymere gefunden werden. Morpholino-basierende Polymere können einfach und effizient durch den im letzten Schritt der Polymersynthese erfolgenden Einschluß einer aktivierten und markierten Morpholino-basierenden Untereinheit oder, vorzugsweise, eines ³&sup5;S-markierten Methionins, wie obenstehend angegeben, endmarkiert werden. Der zu verwendende Markierungstyp ist abhängig von der Endanwendung des Polymeren; solche Markierungen schließen radioaktive (³H, ¹&sup4;C, ³²P oder ³&sup5;S) Nukleoside oder Aminosäuren, oder Biotin ein. Markierte Morpholino-basierende Oligonukleotid-Analoge können als effiziente Sonden beispielsweise bei Kolonie- Hybridisierung (Grunstein et al.), RNA-Hybridisierungen (Thomas), DNA-Hybridisierungen (Southern) und Genbank-Screening (Szostak et al.) wirken.
Die Polymere der Erfindung besitzen auch eine potenzielle Anwendung als therapeutische "Antisense"-Mittel bzw. "Antisinn"-Mittel. Eine Anzahl von ungeladenen Nukleinsäureanalogen, welche fast isostrukturell mit DNA sind, sind als antivirale und Anti-Krebs-Mittel verwendet worden. Morpholino-basierende Polymere der vorliegenden Erfindung sind in vitro gegen HIV-I (Humanes Immunschwäche-Virus) getestet worden. Es wurde gezeigt, daß ein zur Primer-Bindungsstelle von HIV-I (Myers et al.) komplementäres 16-mer die Synthese des viralen P24-Proteins um ungefähr 35% verringert (Beispiele 8 und 9). In entsprechenden nicht-infizierten Zellen verursachten die Morpholino-basierenden Polymere keine offensichtliche Zelltoxizität.
Die Polymere der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls in vivo gegen eine Augeninfektion mit HSV-I (Herpes Simplex Virus I) in Mäusen getestet worden (Beispiel 10). Ein zu einer Splice- Verbindungsstelle in HSV-I komplementäres 12-mer wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit getestet, in den Augen mit HSV-I infizierte Mäuse zu schützen. Unbehandelte Mäuse zeigten 5 Tage nach der Infektion eine Überlebensrate von 65%, wohingegen mit einer topischen Salbe, enthaltend das Morpholino-basierende Polymer, behandelte Mäuse eine Überlebensrate von 90% aufwiesen.
Zusätzlich zu den obenstehend beschriebenen antiviralen Eigenschaften der Morpholinobasierenden Polymere in vitro und in vivo, stellen die Polymere der vorliegenden Erfindung mehrere Vorteile gegenüber herkömmlicheren Antisinn-Mitteln zur Verfügung.
Zum Ersten sind die Morpholino-Polymere weniger kostspielig zu synthetisieren als Desoxyribonukleosid-abgeleitete Polymere. Dies beruht zum Teil auf der Tatsache, daß die bei der Polymersynthese verwendeten Morpholino-Untereinheiten aus Ribonukleosiden, anstelle der selteneren und viel kostspieligeren Desoxyribonukleoside, abgeleitet sind. Auch findet, wie obenstehend angegeben, die Kopplungsreaktion zwischen einem Phosphor und einem Amin einer zweiten Untereinheit unter relativ milden Bedingungen statt, so daß Schützungs-Schritte und andere Vorkehrungen, welche benötigt werden, um unerwünschte Reaktionen zu vermeiden, vereinfacht werden.
Dies steht im Gegensatz zur standardmäßigen Ribo- und Desoxyribonukleotid-Polymersynthese, worin die Kopplung über eine Phosphatesterbindung erfordert, daß die Kopplungsreagenzien in hohem Maße reaktiv sind und daß die Reaktion unter stringenten Reaktions/Schützungs- Bedingungen durchgeführt wird. Dieser Vorteil bei der Polymersynthese trifft selbstverständlich auch auf diagnostische Anwendungen des Polymeren zu.
Zum Zweiten kann die Bindung des Polymeren an sein Ziel eine bessere Ziel-Inaktivierung ergeben als mit Antisinn-Mitteln vom DNA-Typ, weil der Morpholino-Polymer/Ziel-Doppelstrang nicht gegenüber Doppelstrang-Entwindungs-Mechanismen in der Zelle anfällig ist.
Zum Dritten ist das Morpholino-basierende Polymer auch stabiler innerhalb der Zelle als DNA, RNA und ihre Thiophosphat-verknüpften Analoge, weil die Morpholino-Polymergrundgerüst- Bindungen nicht anfällig gegenüber Spaltung durch zelluläre Nukleasen sind.
Zum Vierten tritt das ungeladene Morpholino-Polymer, in therapeutischen Anwendungen unter Beteiligung einer zellulären Aufnahme der Verbindung, viel effizienter in die Zellen ein, als ein geladenes Oligonukleotid.
Im Kontext von therapeutischen Anwendungen können die Morpholino-Polymere der vorliegenden Erfindung gegen doppelsträngige genetische Sequenzen gerichtet sein, in welchen ein Strang vorwiegend Purine enthält und der andere Strang vorwiegend Pyrimidine enthält, wie veranschaulicht in der Fig. 7.
Wenn ferner eine Messenger-RNA von dem hauptsächlich Purin-haltigen Strang der Doppelstrang- Zielsequenz codiert wird, besitzen die gegen den Doppelstrang gerichteten Morpholino- Bindungspolymere auch das Potential zur Inaktivierung der mRNA. Somit besitzt ein derartiges Polymer das Potential zur Inaktivierung von genetischen Schlüsselsequenzen eines Pathogens sowohl in einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Formen.
1981 ist es berichtet worden, daß kurze (3 bis 7 Untereinheiten) Methylphosphonat-verknüpfte DNA-Analoge, komplementär zu Abschnitten der Shine-Dalgarno-Konsensus-Sequenz von prokaryotischen mRNAs, wirksam zur Zerstörung der bakteriellen Proteinsynthese in Bakterienlysaten und in einem speziellen permeablen Stamm von Bakterien waren. Allerdings versagten derartige Mittel darin, die Proteinsynthese in normalen Bakterien zu inhibieren (Jayaramon, 1981).
Zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente zeigen, daß Polymere von 3 bis 5 Untereinheiten Länge wirksam zur Blockierung der Proteinsynthese in normalen Bakterien sein können, indem eine Kombination von Basen verwendet wird, welche zu einer hohen Zielbindungs-Affinität führen. Genauer gesagt, können die folgenden Oligomere und Oligomer- Kombinationen die Proteinsynthese in normalen intakten Bakterien stören (worin D für 2,6- Diaminopurin oder Adenin steht; G Guanin ist; B 5-Bromuracil oder ein anderes 5-Halogenuracil oder Uracil ist; und die Sequenzen mit ihrem 5'-Ende an der linken Seite gezeigt sind): DGG, BDDG, DDGG; DGGD; GGDG; GDGG; DGGB; GGBG; GGAGG; GGDGG; und die Kombinationen BDD + GGDG; DDG + GDGG; DGG + DGGB; GGD + GGBG; BDDG + GDG; DDGG + DGG; DGGD + GGB; GGDG + GBG; BDD + GGDG + GBG.
Die Verwendung von kurzen Bindungs-vertsärkten Oligomeren zur Zerstörung der biologischen Aktivität einer RNA-Sequenz, welche eine Schlüsselrolle im Stoffwechsel einer Zielklasse von Organismen spielt, aber keine entsprechend bedeutsame Rolle in höheren Organismen spielt, sollte in weitem Umfang auf eine Vielzahl von pathogenen Organismen (z. B. Bakterien und Pilzen) anpassbar sein, welche eine Zellwand besitzen, die den Eintritt von längeren Polymeren ausschließt.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen das Verfahren zur Untereinheit- und Polymer-Synthese, und Anwendungen der Polymerzusammensetzung der Erfindung.

Beispiel 1

Basenschützung von Ribonucleosiden

Die folgenden Ribonucleoside wurden von Sigma Chemical Co. (5. Louis, MO) erhalten: Uridin, Guanosin, 5-Methyluridin, Adenosin, Cytidin, 5-Bromuridin und Inosin.
2,6-Diamino-9-(B-D-ribofuranosyl)-9H-purin (2,6-Diaminopurinribosid) wurde von Pfaltz und Bauer, Inc., Division of Aceto Chemical Co., Inc. (Waterbury, CT) erhalten. Die folgenden Nucleoside wurden durch die angegebenen Literaturverfahren hergestellt:
1-β-D-Ribofuranosyl)-2-pyrimidinon-(2-hydroxypyrimidinribosid) wird durch die Vorgehensweise von Niedballa hergestellt.
2-Amino-9-β-D-ribofuranosyl)-1,6-dihydro-6h-purin-6-thion (Thioguanosin) wurde durch die Vorgehensweise von Fox hergestellt. Dimethoxytritylchlorid, N6-Benzoyladenosin, N4- Benzoylcytidin und N2-Benzoylguanosin wurden von Sigma Chemicals erhalten. 9- Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (FMOC-Chlorid), Trimethylchlorsilan, Isobuttersäureanhydrid, 4-Nitrobenzoylchlorid, Naphthalsäureanhydrid und alle organischen Lösungsmittel für die Reaktionen und Chromatographie wurden von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) erhalten. Silicagel wurde von EM Science (Cherry Hill, NJ) erhalten.
Wenn eine Aktivierung der Untereinheiten unter Verwendung von dihalogenierten elektro- philen (z. B. P(O)Cl&sub2;N(CH&sub3;)&sub2; bewirkt wird, werden häufig bessere Ausbeuten an aktivierten Untereinheiten erhalten, unter Verwendung von Schutzgruppen, welche keine sauren Protonen auf den exocyclischen Purin- und Pyrimidinaminen zurücklassen. Beispiele für solche exocyclischen Amin- Reste sind wie folgt: das N6 von Adenin, das N4 von Cytosin, das N2 von Guanin und das N2 und N6 von Diaminopurin. Geeignete Schutzgruppen für diesen Zweck schließen die Naphthaloylgruppe (Dikshit) und die Amidingruppen, entwickelt von McBride et al. (1986), ein. Darüber hinaus führt die Verwendung von dihalogenierten Elektrophilen für die Untereinheitsaktivierung im allgemeinen zu besseren Ergebnissen, wenn das O6 von Guanin-Resten geschützt wird; dieser Schutz wird unter Verwendung der p-Nitrophenethylgruppe erreicht (Trichtinger).

Guanosin

Um Nebenreaktionen während den Untereinheitsaktivierungen zu minimieren, ist es häufig wünschenswert, den Guanin-Rest sowohl auf dem N2 als auch auf dem O6 unter Verwendung der Vorgehensweise von Trichtinger et al. (1983) zu schützen.
Das N-2-9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Derivat von Guanosin wird durch die untenstehende Vorgehensweise hergestellt, welche im allgemeinen zum Schutz von Nucleosidaminogruppen ist: Guanosin (1 mMol) wird in Pyridin (5 ml) suspendiert und mit Trimethylchlorsilan (5 mMol) behandelt. Nachdem die Lösung 15 Minuten lang gerührt wurde, wird 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (5 mMol) hinzugesetzt, und die Lösung wird bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gehalten. Die Reaktion wird in einem Eisbad gekühlt, und Wasser (1 ml) hinzugesetzt. Nach dem Rühren für 5 Minuten wird konzentriertes Ammoniak (1 ml) zugegeben, und die Reaktion wird 15 Minuten lang gerührt. Die Lösung wird fast bis zur Trockne abgedampft, und der Rückstand wird in Chloroform (10 ml) gelöst. Diese Lösung wird mit Natriumbicarbonatlösung (5 ml, 10%) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und abgedampft. Der Rückstand wird in mehreren Malen zusammen mit Toluol abgedampft, und das Produkt wird auf Silikagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Methylenchlorid (0 bis 50%) chromatographiert.
N-2-Isobutyrylguanosin wird durch die Methode von Letsinger hergestellt. Ein weiterer Schutz des O6 mit einem Nitrophenethyl-Rest ist häufig wünschenswert und kann mittels mehrerer Methoden durchgeführt werden (Gait, 1984).
N-2-Acetylguanosin wird durch die Methode von Reese erhalten. N-2-Naphthaloylguanosin wird durch die Methode von Dikshit erhalten; diese Referenz liefert eine allgemeine Methode zum Schutz von Nucleosidamingruppen.

Adenosin

Das N-6-2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl-Derivat wird durch die Methode von Himmelsbach hergestellt.
N-6-(4-Nitrobenzoyl)adenosin wird unter Verwendung der oben für FMOC-Guanosin eingesetzten Verfahrensweise hergestellt, außer dass 4-Nitrobenzoylchlorid für FMOC-Chlorid substituiert wird.
Das N-6-2-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl-Derivat wird durch die Verfahrensweise für FMOC- Guanosin hergestellt, außer dass das 2-(Phenylsulfonyl)ethylchlorformiat (Balgobin) als Acylierungsmittel verwendet wird, und N-Methylimidazol oder Pyridin als Lösungsmittel verwendet wird.
N-6-Naphthoyladenosin wird durch die Methode von Dikshit hergestellt; diese Referenz liefert eine allgemeine Methode zum Schutz von Nucleosidamingruppen.

2,6-Diaminopurinribosid

Das N-2,N-6-Bis(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-Derivat von 2,6-Diaminopurinribosid wird durch die für Guanosin beschriebene allgemeine Vorgehensweise hergestellt.
Das N-2,N-6-Bis(isobutyryl)-Derivat wird durch die für Guanosin beschriebene allgemeine Vorgehensweise hergestellt.

Thioguanosin

Das N-2-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-Derivat von Thioguanosin wird durch die für Guanosin beschriebene allgemeine Verfahrensweise hergestellt.

Uridin

Um unerwünschte Nebenprodukte während des Untereinheits-Aktivierungsschrittes zu minimieren, ist es manchmal wünschenswert, dass N3 des Uracil-Rests zu schützen. 5'-O-trityliertes Uridin-2',3'-acetonid wird zu dem N3-Anisoyl-Derivat mittels der Verfahrensweise von Kamimura et al. (1983) umgewandelt. Das Produkt wird dann mit heißer 80%iger Essigsäure oder 0,1 N HCl in THF behandelt, um die Schutzgruppen auf dem Ribose-Rest abzuspalten.

Beispiel 2

Synthese von 5'-OH-Morpholino-Untereinheiten

Die Schritte in dem Verfahren sind in Fig. 5 veranschaulicht, mit Bezug auf in Fig. 5 gezeigte Strukturen.
Das Basen-geschützte Ribonucleosid wird mit Periodat zu einem 2'-3'-Dialdehyd (Struktur 1) oxidiert. Das Dialdehyd wird auf Ammoniak oder primärem Amin geschlossen (Struktur 2), und die 2'- und 3'-Hydroxyle (nummeriert wie in der Stamm-Ribose) werden durch Reduktion mit Cyanoborhydrid entfernt (Struktur 3).
Ein Beispiel dieses allgemeinen synthetischen Schemas wird unten mit Bezug auf die Synthese einer Basen-geschützten Cytosin-(P1*)-Morpholino-Untereinheit beschrieben. Zu 1,61 Methanol werden unter Rühren 0,1 Mol N4-Benzoylcytidin und 0,105 Mol Natriumperiodat, gelöst in 100 ml Wasser, gegeben. Nach 5 Minuten werden 0,12 Mol Ammoniumbiborat hinzugesetzt, und die Mischung wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, gekühlt und filtriert. Zu dem Filtrat werden 0,12 Mol Natriumcyanoborhydrid hinzugesetzt. Nach 10 Minuten werden 0,20 Mol Toluolsulfonsäure hinzugegeben. Nach weiteren 30 Minuten werden weitere 0,20 Mol Sulfonsäure hinzugegeben, und die Mischung wird gekühlt und filtriert. Das feste Präzipitat wird mit zwei 500 ml großen Portionen Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch man das Tosylatsalz des in Struktur 3 gezeigten freien Amins erhielt.
Die Verwendung einer mäßig starken (pKa < 3) aromatischen Säure, wie Toluolsulfonsäure oder 2-Naphthalinsulfonsäure, führt zu einer leichten Handhabung, signifikant verbesserten Ausbeuten und einem hohen Ausmaß an Produktreinheit.
Die Basen-geschützte Morpholin-Untereinheit wird dann am Ringstickstoff des Morpholino-Rings unter Verwendung von Tritylchlorid oder Benzylhydralnitrophenylcarbonat geschützt (Struktur 4). Alternativ kann das 5'-Hydroxyl mit einer Trialkylsilylgruppe geschützt werden.
Als ein Beispiel eines Schutzschrittes werden zu 2 Litern Acetonitril unter Rühren 0,1 Mol des Tosylatsalzes von oben, gefolgt von 0,26 Mol Triethylamin und 0,15 Mol Tritylchlorid, hinzugesetzt. Die Mischung wird abgedeckt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, woraufhin 100 ml Methanol hinzugegeben wurden, gefolgt von einem Rühren für 15 Minuten. Nach dem Trocknen durch Rotationsverdampfung wurden 400 ml Methanol hinzugegeben. Nachdem der Feststoff gründlich als eine Aufschlämmung suspendiert worden war, wurden 5 ml Wasser hinzugegeben, wurde die Mischung 30 Minuten lang gerührt und filtriert. Der Feststoff wurde mit 1 Liter Wasser gewaschen, filtriert und unter Vakuum getrocknet. Der Feststoff wurde in 500 ml Dichlormethan erneut suspendiert, filtriert und so lange rotationsverdampft, bis eine Ausfällung gerade anfing, woraufhin 1 Liter Hexan hinzugegeben wurde und 15 Minuten lang gerührt wurde. Der Feststoff wurde mittels Filtration entfernt und unter Vakuum getrocknet.
Die oben angegebene Vorgehensweise führt zu der Basen-geschützten Morpholino-Untereinheit, trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff und ein freies 5'-Hydroxyl aufweisend (Struktur 4).

Beispiel 3

Alternative Synthese von Morpholino-Untereinheiten

Dieses Beispiel beschreibt eine alternative Herstellung von einer Morpholino-Untereinheit, enthaltend einen säurelabilen Rest, der an dem Morpholino-Ring-Stickstoff gebunden ist. Die Schritte werden in Bezug auf Fig. 6 beschrieben.
Die Untereinheit wird hergestellt durch Oxidieren eines Ribonucleosids mit Periodat, wie in Beispiel 2, und Schließen des resultierenden Dealdehyds (Struktur 1) auf dem primären Amin 4,4'- Dimethoxybenzhydrylamin (welches durch die Methode von Greenlee, 1984, hergestellt werden kann), gepuffert mit Benzotriazol oder p-Nitrophenol. Die Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid, durchgeführt wie in Beispiel 2, führt zu einer Morpholino-Untereinheit (Struktur 2) mit einer 4,4'- Dimethoxybenzhydrylgruppe auf dem Morpholino-Stickstoff.
Ein Merkmal dieser Vorgehensweise ist, dass es besonders brauchbar ist zur Herstellung von Morpholino-Untereinheiten aus Ribonucleosiden, welche keine Schutzgruppe auf der Base (z. B. Uridin) aufweisen.

Beispiel 4

Umwandlung von 5'-Hydroxyl zu 5'-Amin und zu 5'-Sulfhydral

Die Schritte bei der Synthese sind mit Bezug auf die in Fig. 5 gezeigten Strukturen beschrieben.

A. Umwandlung zu dem Amin

Das 5'-Hydroxyl der doppelt geschützten Morpholino-Untereinheit (Struktur 4, Fig. 5) kann zu einem Amin-Untereinheit umgewandelt werden. Zu 500 ml DMSO werden 1,0 Mol Pyridin (Pyr), 0,5 Mol Trifluoressigsäure (TFA) und 0,1 Mol der Morpholino-Untereinheit gegeben. Die Mischung wird solange gerührt, bis alle Komponenten gelöst sind, und dann werden 0,5 Mol entweder von Diisopropylcarbodiimid (DIC) oder von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) hinzugesetzt. Nach 2 Stunden wird die Reaktionsmischung zu 8 Litern schnell gerührter Kochsalzlösung hinzugesetzt. Diese Lösung wird 30 Minuten lang gerührt und dann filtriert. Der resultierende Feststoff wird kurz getrocknet, mit I Liter eiskalten Hexanen gewaschen und filtriert. Der Feststoff wird zu 0,2 Mol Natriumcyanoborhydrid in 1 Liter Methanol hinzugesetzt und 10 Minuten lang gerührt. Zu dieser Mischung werden 0,4 Mol Benzotriazol oder p-Nitrophenol hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,2 Mol Methylamin (40% in H&sub2;O). Die Herstellung wird 4 Stunden bei Rautemperatur gerührt [Anmerkung: Das Benzotriazol oder p-Nitrophenol puffert die Reaktionsmischung, wodurch eine Racemisierung an dem 4'-Kohlenstoff der Untereinheit in der Iminium-Stufe der reduktiven Alkylierung verhindert wird.]. Schließlich wird die Reaktionsmischung in 5 Liter Wasser gegossen, bis sich ein gutes Präzipitat gebildet hat, und der Feststoff (Struktur 6, Fig. 5) wird gesammelt und getrocknet.

B. Umwandlung zu dem Sulfhydral

Das 5'-Hydroxyl der doppelt geschützten Morpholino-Untereinheit wird zu einem Sulfhydral wie folgt umgewandelt. Ein Zehntel Mol der 5'-Hydroxyl-Untereinheit (Struktur 4, Fig. 5) wird zu 1 Liter Pyridin hinzugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 0,12 Mol Toluolsulfonylchlorid. Diese Lösung wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und die Reaktion führt zu dem Produkt, wie es in Struktur 7 von Fig. 5 gezeigt ist. Das Pydridin wird durch Rotationsverdampfung entfernt, und zu dem Feststoff wird 0,5 Mol frisches Natriumhydrosulfid in 1 Liter Methanol-DMF, enthaltend NaI, hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Mischung wird zu 5 Liter Wasser hinzugegeben, 20 Minuten lang gerührt, und das resultierende feste Material wird mittels Filtration gesammelt und getrocknet, wodurch man das Produkt erhielt, welches als Struktur 8 der Fig. 5 gezeigt ist.

Beispiel 5

Aktivierung und Kopplung zum Erhalt von Phosphoramid-Verknüpfungen

A.X = -CH&sub3;

Das Beispiel 5A beschreibt die Aktivierung und Kopplung von einer 5'-Hydroxyl-Untereinheit, hergestellt wie in Beispiel 2 oder 3, zu einer zweiten Untereinheit mit einem freien Morpholino- Ring-Stickstoff, um eine Alkylphosphonamidat-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung zu bekommen. Das Beispiel wird mit Bezug auf Strukturen in Fig. 8 beschrieben, worin X eine Alkylgruppe ist.
1 mMol an 5'-Hydroxyl-Untereinheit, basengeschützt und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von Fig. 5), wird in 20 ml Dichlormethan gelöst. Zu dieser Lösung werden 4 mMol N- Ethylmorpholin und 1,1 mMol Methylphosphonsäuredichlorid, für Z = O (oder Methylthiophosphonsäuredichlorid, für Z = S) gegeben, gefolgt von der Zugabe von 1 mMol N- Methylimidazol. Nach 1 Stunde wird die Reaktionslösung mit wässeriger NaH&sub2;PO&sub4; gewaschen. Die aktivierte Untereinheit wird durch Chromatographie auf Silikagel, entwickelt mit Ethylacetat, gegeben (Struktur 2 von Fig. 8, worin X Methyl ist). Diese aktivierte Untereinheit kann direkt an den Morpholino-Stickstoff einer zweiten Untereinheit geknüpft werden (Struktur 3), und zwar durch Mischen von diesen in DMF. Diese Kopplungsreaktion führt zu dem Dimer, wie es in Struktur 4 gezeigt ist (worin X -CH&sub3; ist).
Eine alternative Vorgehensweise der Aktivierung und Kopplung beinhaltet das Lösen von 1 mMol von 5'-Hydroxyl-Untereinheit, basengeschützt und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von Fig. 5), in 20 ml Dichlormethan. Zu dieser Lösung werden 4 mMol N,N- Diethylanilin und 0,1 mMol 4-Methoxypyridin-N-oxid hinzugesetzt. Nach der Auflösung werden 1,1 mMOl Methylphosphonsäuredichlorid, für Z = O (oder Methylthiophosphonsäuredichlorid, für Z = 5), hinzugesetzt. Nach 2 Stunden wird das Produkt (Struktur 2 von Fig. 10, worin X Methyl ist) durch Chromatographie auf Silikagel und der Entwicklung mit 10% Aceton/90% Chloroform isoliert. 1 mMol dieser aktivierten Untereinheit kann direkt an den Morpholino-Stickstoff einer zweiten Untereinheit (Struktur 3) durch Mischen von diesen in 1,5 mMol N,N-Diisopropylaminoethylisobutyrat (DIPAEIB) enthaltendem Dichlormethan gemischt werden, wodurch man das als Struktur 4 gezeigte Dimer erhielt (worin X -CH&sub3; ist).
Das tertiäre Amin/Ester, DIPAEIB, wird durch Mischen von 1,1 Mol Isobutyrylchlorid, 1 Mol N,N-Diisopropylaminoethanol und 1,5 Mol Pyridin unter Erhitzen für 30 Minuten bei 110ºC hergestellt. Die Präparation wird mit 0,5 Mol NaOH in S00 ml H&sub2;O gewaschen und destilliert, wodurch man das gewünschte Amin/Ester, das bei 115ºC bei 30 mmHg siedete, erhielt.
Die Alkylphosphonamidat-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung (Struktur 4, in der X -CH&sub3; ist), ist gegenüber dem für die Basenentschützungen verwendetes Ammoniak sehr stabil. Dagegen ist die Verknüpfung gegenüber relativ starken Säuren empfindlich. Zum Beispiel besitzt die Verknüpfung eine Halbwertszeit der Spaltung von etwa 3 Stunden in 2%iger Dichloressigsäure in Dichlormethan. Gleichwohl zeigt die Verknüpfung keine nachweisbare Spaltung nach 18 Stunden in 2%iger Essigsäure in Trifluorethanol, Bedingungen, die für die Tritylierung des Morpholino- Stickstoffs geeignet sind.

B.X = -O-CH&sub2;CH&sub3;

Das Beispiel 5B beschreibt die Aktivierung und Kopplung der 5'-Hydroxyl-Untereinheit, hergestellt in Beispiel 2 oder 3, zu einer zweiten Untereinheit mit einem freien Morpholino-Ring- Stickstoff, wodurch man eine Phosphordiesteramid-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung erhält. Das Beispiel wird mit Bezug auf Strukturen in Fig. 8 beschrieben, in denen X eine Alkoxidgruppe ist.
1 mMol 5'-Hydroxyl-Untereinheit, basengeschützt und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von Fig. 5), wird in 80 ml Benzol suspendiert, und 2,2 mMol N-Methylimidazol werden hinzugesetzt. Nachdem die Untereinheit aufgelöst war, wurden 1,2 mMol Ethyldichlorphosphat, für Z = O (oder Ethyldichlorthiophosphat, für Z = S) hinzugesetzt. Nach 1 Stunde wird die Reaktionslösung mit wässeriger NaH&sub2;PO&sub4; gewaschen. Die aktivierte Untereinheit wird durch Chromatographie auf Silikagel und der Entwicklung mit Ethylacetat, isoliert (Struktur 2 von Fig. 8, worin X -O-CH&sub2;CH&sub3; ist). Diese aktivierte Untereinheit kann direkt an den Morpholino- Stickstoff einer zweiten Untereinheit (Struktur 3) durch Mischen in DMF verknüpft werden. Diese Kopplungsreaktion führt zu dem als Struktur 4 gezeigten Dimer.
Wenn Ethyldichlorthiophosphat (Z = S) für die Aktivierung der Untereinheiten verwendet wird, werden verbesserte Ausbeuten mit den folgenden Modifikationen erhalten. 1 mMol 5'-Hydroxyl- Untereinheit, basengeschützt und trityliert auf dem Moropholino-Stickstoff (Struktur 4 von Fig. 5) wird in 20 ml Chloroform suspendiert. Zu dieser Lösung werden 1 ml N-Methylimidazol hinzugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 1,6 ml Ethyldichilorthiophosphat (Aldrich Chem. Co.). Nach 1 Stunde wird das Untereinheitsprodukt durch Silikagel-Chromatographie, entwickelt mit 20% Aceton/80% Chloroform, gereinigt. Diese aktivierte Untereinheit (Struktur 2, in der X -O-CH&sub2;-CH&sub3; ist und Z Schwefel ist), kann an den Morpholino-Stickstoff einer zweiten Untereinheit, wie oben beschrieben, gekoppelt werden.
Eine alternative Vorgehensweise der Aktivierung und Kopplung beinhaltet das Auflösen von 1 mMol 5'-Hydroxyl-Untereinheit, basengeschützt und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von Fig. 5), in 20 ml Dichlormethan. Zu dieser Lösung werden 4 mMol N,N- Diethylanilin und 0,2 mMol 4-Methoxypyridin-N-oxid hinzugegeben. Nach der Auflösung werden 1,1 mMol Ethyldichlorphosphat, für Z = O (oder Ethyldichlorthiophosphat, für Z = S), hinzugesetzt. Nach 1 Stunde wird das Produkt (Struktur 2 von Fig. 8, in der X Ethoxy ist) mittels Chromatographie auf Silikagel unter Entwicklung mit 10% Aceton/90% Chloroform isoliert. 1 mMol dieser aktivierten Untereinheit kann direkt an den Morpholino-Stickstoff einer zweiten Untereinheit geknüpft werden (Struktur 3), und zwar unter Mischung von diesen in 1,5 mMol N,N- Diisopropylaminoethylisobutyrat (DIPAEIB) enthaltendem Dichlormethan, wodurch man das Dimer erhielt, welches als Struktur 4 angegeben ist (in der X O-CH&sub2;-CH&sub3; ist).

C.X = -F

Das Beispiel 5C beschreibt die Kopplung einer 5'-Hydroxy-Untereinheit, hergestellt in Beispiel 2 oder 3, an eine zweite Untereinheit mit einem freien Morpholino-Ring-Stickstoff, um eine Fluorphosphoramidat-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung zu erhalten.
Das Ausgangsmaterial ist 1 mMol 5'-Hydroxyl-Untereinheit, basengeschützt mit Gruppen, die durch ein β-Eliminierungsmechanismus entfernbar sind, und trityliert auf dem Morpholino- Stickstoff (Struktur 4 von Fig. 5). Die Untereinheit wird in 20 ml Dichlormethan gelöst, wobei 6 mMol N-Methylimidazol hinzugegeben werden, gefolgt von der Zugabe von 2,5 mMol Fluorphosphorsäure. 5 mMol DCC wird hinzugesetzt, und die Lösung wird 3 Stunden lang gerührt. Die Reaktionslösung wird mit wässerigem NaH&sub2;PO&sub4; gewaschen, und die organische Phase wird unter reduziertem Druck getrocknet, wodurch man Fluorphosphatsalz erhält. Das Produkt wird mittels Silikagel-Chromatographie unter Entwicklung mit einer Methanol/Chloroform-Mischung 1% Pyridin gereinigt, wodurch man das Pyridiniumsalz erhielt. Nach dem Trocknen ist das gereinigte Produkt ihr die Kopplung an eine 5'-geschützte Untereinheit mit einem freien Morpholino- Stickstoff unter Verwendung von DCC in Dichlormethan geeignet.
Polymere, die die Fluorphosphoramidat-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung enthalten, sollten keinen starken Nucleophilen, wie Ammoniak, ausgesetzt werden. Folglich sollten Basen der Untereinheiten, die für das Zusammenbauen von solchen Polymeren verwendet werden, mit Gruppen geschützt werden, welche ohne die Verwendung von starken Nucleophilen gespalten werden können. Schutzgruppen, die über einen β-Eliminierungsmechanismus abspaltbar sind, wie in Beispiel 1 beschrieben, sind ihr diesen Zweck geeignet.

D.X = N(CH&sub3;)&sub2;

Das Beispiel 5D beschreibt die Kopplung einer 5'-Hydroxyl-Untereinheit, hergestellt wie in Beispiel 2 oder 3, an eine zweite Untereinheit mit einem freien Morpholino-Ring-Stickstoff, wodurch man eine Phosphordiamidat-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung erhielt. Das Beispiel ist mit Bezug auf die Strukturen von Fig. 8 beschrieben, in der X ein disubstituierter Stickstoff ist.
1 mMol 5'-Hydroxyl-Untereinheit, basengeschützt und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von Fig. 5), wird in 5 ml Dichlormethan gelöst. 6 mMol N-Ethylmorpholin und 2 mMol Dimethylaminodichlorphosphat (OP(Cl)&sub2;N(CH&sub3;)&sub2;), für Z = O (oder das Thiophosphat- Analog für Z = S), werden der Lösung hinzugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 0,5 mMol N- Methylimidazol. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist (wie durch Dünnschicht-Chromatographie bestimmt), wird die Reaktionslösung mit wässeriger NaH&sub2;PO&sub4; gewaschen. Die aktivierte Untereinheit wird durch Chromatographie auf Silikagel unter Entwicklung mit Aceton/Chloroform isoliert (Struktur 2 in Fig. 8, in der X -N-(CH&sub3;)&sub2; ist). Die aktivierte Untereinheit wird direkt an den Morpholino-Stickstoff einer Untereinheit (Struktur 3) in DMF geknüpft, welches Triethylamin in ausreichender Menge enthält, um das in der Reaktion gebildete HCl zu neutralisieren, wodurch man das Dimer erhält, welches in Struktur 4 gezeigt ist.
Das Dimethylaminodichlorphosphat (X ist N-(CH&sub3;)&sub2; und Z ist Sauerstoff), welches in der obenstehenden Vorgehensweise verwendet wurde, wurde wie folgt hergestellt: Eine Suspension, die 0,1 Mol Dimethylaminhydrochlorid in 0,2 Mol Phosphoroxychlorid enthielt, wurde 12 Stunden refluxiert und dann destilliert (der Siedepunkt beträgt 36ºC bei 0,5 mmHg). Das Dimethylaminodichlorthiophosphat (X ist N-(CH&sub3;)&sub2; und Z ist Schwefel), welches oben verwendet wurde, wurde wie folgt hergestellt: Eine Suspension, die 0,1 Mol Dimethylaminhydrochlorid in 0,2 Mol Thiophosphoryl enthielt, wurde 18 Stunden lang refluxiert und dann destilliert (Siedepunkt: 85ºC bei 15 mmHg).
Eine alternative Vorgehensweise der Aktivierung und Kopplung beinhaltet das Auflösen von 1 mMol 5'-Hydroxyl-Untereinheit, basengeschützt und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von Fig. 5), in 20 ml Dichlormethan. Zu dieser Lösung wurden 4 mMol N,N- Diethylanilin und 1 mMol 4-Methoxypyridin-N-oxid gegeben. Nach der Auflösung wurden 2 mMol Dimethylaminodichlorphosphat, für Z = O (oder Dimethylaminodichlorthiophosphat, für Z = S), hinzugesetzt. Nach 2 Stunden wurde das Produkt (Struktur 2 von Fig. 8, in der X Dimethylamin ist) durch Chromatographie auf Silikagel unter Entwicklung mit 10% Aceton/90% Chloroform isoliert. 1 mMol dieser aktivierten Untereinheit kann direkt an den Morpholino-Stickstoff einer zweiten Untereinheit (Struktur 3) durch Mischen von diesen in 1,5 mMol N,N- Diisopropylaminoethylisobutyrat (DIPAEIB) enthaltendem Dichlormethan geknüpft werden, wodurch man das Dimer erhielt, welches als Struktur 4 gezeigt ist (in der X -N-(CH&sub3;)&sub2; ist).

Beispiel 6

Zusammenbau in der Lösungsphase eines einfachen Prototyps von Morpholinopolymer mit struktureller Bestätigung, Entschützung, Reinigung und Bestimmung seiner Bindung an eine Ziel-RNA-Seguenz

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung, strukturelle Bestätigung und Bestimmung der Ziel- Bindungsaffinität eines einfachen Phosphordiamidat-verknüpften Morpholinopolymeren.
Ein Morpholinohexamer, bei dem alle Pi-Reste Cytosine sind, wird aus dem in Beispiel 5D hergestellten Dimer zusammengebaut. Ein Drittel dieser Dimer-Herstellung ist mit Trifluorethanol (TFE), enthaltend 2% Essigsäure, detrityliert; das TFE wird dann unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wird mit Ether gewaschen, um jedwede restliche Essigsäure zu entfernen. Die verbliebenen zwei Drittel der Dimer-Herstellung werden aktiviert (wie in Beispiel 5D). Die Hälfte des aktivierten Dimeren wird mit detrityliertem Dimer umgesetzt, um ein Tetramer-Produkt zu erhalten, welches durch Silikagel-Chromatographie unter Entwicklung mit 6% Methanol/94% Chloroform gereinigt wird. Das Tetramer wird detrityliert und mit dem verbliebenen aktiviertem Dimer umgesetzt, um ein Hexamer-Produkt zu erhalten, welches mittels Silikagel-Chromatographie unter Entwicklung mit 10% Methanol/90% Chloroform gereinigt wird.
Dieses Phoshordiamidat-verknüpfte, basengeschützte 5'-OH-Hexamer mit einem Trityl-Rest auf dem Morpholino-Stickstoff wird als pd(mC)&sub6;-Trityl bezeichnet. Das Fast-Atom-Bombardment- Massenspektrum mit negativen Ionen (3-Nitrobenzylalkohol-Matrix) zeigt: M-1 = 2667,9 (100).
Dieses pd(mC)&sub6;-Tritylpolymer wird als nächstes wie oben detrityliert, gefolgt von einer Basenentschützung.
Wenn es erwünscht ist, eine Solubilisierungsgruppe an das Morpholinopolymer hinzuzufügen, kann dieses bequem wie folgt durchgeführt werden. Der N-terminale Morpholino-Stickstoff wird unter Verwendung von 2% Essigsäure in Trifluorethanol detrityliert. Polyethylenglykol 1000 (von Polysciences Inc., Warrington, Pennsylvania, USA) wird gründlich durch Auflösen in trockenem DMF getrocknet und dann wird das Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft. Der Feststoff wird in einem minimalen Volumen von reinem trockenem DMF und 0,5 Mol-Äquivalenten (bezogen auf PEG 1000) von Bis(p-nitrophenyl)carbonat erneut suspendiert, und 1 Mol-Äquivalent TEA wird hinzugesetzt. Die Präparation wird verschlossen und über Nacht bei 30ºC inkubiert, wodurch man p-Nitrophenylcarbonat-aktiviertes PEG 1000 erhielt.
Das Morpholinopolymer mit voller Länge, welches detrityliert worden war, wurde zu einem beträchtlichen molaren Überschuss (im allgemeinen 10- bis 20-fach) an aktiviertem PEG 1000 hinzugesetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die gesamte Herstellung wird dann mit konzentriertem Ammoniumhydroxid über Nacht bei 30ºC behandelt. Ammoniak wird dann unter reduziertem Druck entfernt. Eine Reinigung wird durch Kationen-Austausch-Chromatographie, gefolgt von einem Entsalzen auf einer Säule von Polypropylen, gewaschen mit Wasser und dann eluiert mit Methanol, erreicht.
Dieses gereinigte schwanzförmige (tailed) Hexamer pd(mC)&sub6;-PEG1000 zeigt ein Absorptionsmaximum bei 267,1 nm in neutraler wässeriger Lösung, mit einer berechneten molaren Extinktion von 42.800. In einer wässerigen Lösung bei einem pH-Wert von 1 zeigt das gleiche Material ein Absorptionsmaximum bei 275,7 nm, mit einer berechneten molaren Extinktion von 77.100.
Um die Ziel-Bindungsaffinität des pd(mC)&sub6;-PEG 1000-Polymeren zu bestimmen, werden 1 mg PolyG RNA (gekauft von Sigma Chem Co.) in entionisiertem Wasser gelöst, und 4 Volumina DMSO (spektrophotometrische Güteklasse von Aldrich Chem. Co.) werden hinzugesetzt (Stammlösung A). Das tailed Morpholinohexamer, pd(mC)&sub6;-PEG1000, wird in DM50 spektrometrischer Güteklasse (Stammlösung B) gelöst. Phosphatpuffer wird hergestellt, indem der pH- Wert von 0,05 N NaOH auf 7,4 unter Verwendung von Phosphorsäure eingestellt wurde (Puffer C).
Die Stammlösungen A und B werden bezüglich ihrer tatsächlichen Konzentration an Polymer mittels UV bestimmt; die Extinktion der Stammlösung A wird in 0,1 N NaOH gemessen, und die Stammlösung B wird in 0,1 N HCl gemessen. Die Messungen dieser pH-Extremen minimieren die Basenstapelbildung und andere Polymer-Wechselwirkungen, was zu Extinktionswerten führen kann, welche nicht proportional zu den Monomerkomponenten sind. Die Stammlösungen A und B werden mit Puffer C verdünnt, wodurch man die Lösungen mit einer Endkonzentration von 10 Mikromolar bezüglich Polymer erhielt. Die erforderlichen Verdünnungen wurden berechnet unter Verwendung von molaren Extinktionen von 65.000 für die Lösung A, Poly(G), und 77.100 für die Lösung B, pd(mC)&sub6;-PEG1000.
Die Bestimmung der Ziel-Bindungsaffinität wird in einem Spektrophotometer mit einem Doppel- Strahl-Scanning und einem temperaturregulierten Zellgehäuse durchgeführt, welches zwei Zellen im Referenzstrahl und zwei im Probenstrahl aufnehmen kann.
Unter Verwendung von vier eingepassten Quarzküvetten wird eine mit 0,5 ml Poly(G), 60 Mikromolar in Bezug auf das G-Moomer und 0,5 ml Puffer C befüllt, und eine zweite wird mit 0,5 ml an 10 Mikromolaren pd(mC)&sub6;-PEG1000 und 0,5 ml Puffer C befüllt. Diese zwei Küvetten werden in den Referenzstrahl des temperaturregulierten Zellgehäuses gestellt. Als nächstes wird eine dritte Küvette mit 1 ml Puffer C befüllt, und eine vierte wird mit 0,5 ml Poly(G), 60 Mikromolar in Bezug auf G-Monomer, und 0,5 ml 10 Mikromolar pd(mC)&sub6;-PEG1000 befüllt. Diese zwei Küvetten werden in den Probenstrahl des Zellgehäuses gestellt. Das Zellgehäuse wird dann bei 50ºC erhitzt und langsam auf 14ºC abkühlen gelassen, um eine vollständige Paarung zwischen dem Polymer und seinem Ziel-Polynucleotid in der vierten Küvette sicherzustellen. Es wird dann Abtastung zwischen 320 nm und 240 nm vorgenommen, welche eine beträchtliche Absorptionsdifferenz aufgrund einer hypochromischen Verschiebung in der Polymer-Ziel-Mischung, zentriert um 273 nm, zeigt. Die Temperatur des Zellhalters wird dann in Steigerungen von 2º auf 72ºC erhöht, wobei Abtastungen nach Erhöhung von jeweils 2º vorgenommen wurden.
Eine Auftragung des Extinktionsunterschieds als eine Funktion der Temperatur für den Morpholinopolymer/RNA-Komplex ist in Fig. 9 gezeigt. Die Schmelztemperatur Tm, bei der der Komplex zur Hälfte geschmolzen war, liegt bei 51,5ºC für dieses Morpholinopolymer/RNA.

Beispiel 7

Herstellung in der Lösungsphase eines Phosphordiamidat-verknüpften Oligomeren der Seguenz 5'-CGCCA

Dieses Beispiel beschreibt den Zusammenbau eines kurzen Oligomeren, das ein Phosphordiamidat-verknüpftes Grundgerüst enthält (Struktur von Fig. 4, in der X N(CH&sub3;)&sub2; ist, Y Sauerstoff ist und Z Sauerstoff ist. Dieses Zusammenbauverfahren in Lösung ist für die Synthese von kurzen Oligomeren im großen Maßstab verwendbar, die für den anschließenden Zusammenbau zu längeren Oligomeren, wie in den Beispielen 8 und 9, geeignet sind.

A. Herstellung des Monomers zur Verwendung am 5'-Ende des Blocks

Eine Morpholino-C-Untereinheit, enthaltend einen Tritylrest am Morpholino-Ring-Stickstoff und aufweisend ein Methylamin auf dem 5'-Methylen (hergestellt wie in Beispiel 4), wird mit N-(9- Fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimid (FMOC) von Aldrich Chem. Co., Milwaukee, Wisconsin, USA, umgesetzt und durch Silica-Gelchromatographie gereinigt.

B. Detritylierung

In einen Trenntrichter gibt man 1 mMol der FMOC-derivatisierten C-Untereinheit, hergestellt im obenstehenden Teil A, 18 ml Dichlormethan, 2 ml Trifluorethanol und 0,4 g Caynessigsäure. Nach 10 Minuten wird diese Lösung mit wäßrigem NaHCO&sub3; geteilt. Die organische Phase wird durch Rotationsverdampfung entfernt. Zum verbleibenden Material werden 20 ml Acetonitril zugesetzt, und das Acetonitril wird durch Rotationsverdampfen bis zur Trockenheit entfernt. Das verbleibende Material wird 1 Stunde lang unter Vakuum getrocknet.

C. Aktivierung von anderen Monomeren

5'-OH-Morpholino-Untereinheiten von A, C und G, trityliert auf dem Morpholino-Ring-Stickstoff, werden wie in Beispiel 2 hergestellt. Die A-, C- und G-Untereinheiten werden durch Umwandlung in die Monochlorphosphoramidat-Form aktiviert, wie in Beispiel 9D, aktiviert.

D. Erste Kopplung

Die detritylierte FMOC-derivatisierte C-Untereinheit aus dem obenstehenden Teil B wird in Kopplungslösung (4 ml Dichlormethan, 2 ml Tetramethylensulfon und 0,3 ml DIPAEIB (hergestellt wie in Beispiel 5)) suspendiert. Zu dieser Lösung wird 1 mMol der aktivierten G- Untereinheit, hergestellt wie im obenstehenden Teil C, zugesetzt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird das Dichlormethan unter verringertem Druck entfernt, und das Produkt wird durch Zusetzen von Wasser gefällt. Das 5'-FMOC-CG-Trityl-Dimer wird durch Chromatographie auf Silica-Gel, entwickelt mit 5% Methanol/95% Chloroform, gereinigt.

E. Anschließende Kopplungen

Das FMOC-CG-Tritylprodukt wird wie im obenstehenden Teil B detrityliert und mit 1 mMol aktivierter C-Untereinheit aus dem obenstehenden Teil C gekoppelt. Dieser Kopplungszyklus wird wiederholt, um die verbleibenden C- und A-Untereinheiten anzufügen, wodurch man den gewünschten Block: 5'-FMOC-CGCCA-Trityl erhält. Mit Zunahme der Länge des Polymeren erfordert der Reinigungsschritt eine zunehmende Konzentration an Methanol in der Silicagel- Chromatographie-Reinigung des wachsenden Blocks.

F. Strukturbestätigung

Die Struktur dieses Pentamerblocks wird am einfachsten durch NMR und Massenspektroskopie durch Fastatom-Bombardment mit negativen Ionen bestätigt. In der Regel ist die vorherrschende Spezies in dem Massenspektrum das Molekülion.

Beispiel 8

Lösungsphasen-Blockzusammenbau eines Morpholino-Polymeren, gerichtet gegen die Primer-Bindungsstelle von HIV-I

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von Oligomerblöcken, hergestellt wie in Beispiel 7, zum Lösungsphasen-Zusammenbau eines Morpholino-Polymeren, welches Phosphordiamidat- Zwischen-Untereinheit-Bindungen enthält. Die Verwendung von kurzen Oligomerblöcken anstelle von Monomeren vereinfacht im großem Maße die Trennung des Endproduktes von Fehlsequenzen. Das in diesem Beispiel synthetisierte Morpholino-Polymer besitzt eine Basensequenz, die komplementär zur Primerbindungsstelle von HIV-I (Myers et al.) ist.

A. Synthese von kurzen Oligomerblöcken

Die folgenden Oligomere werden wie im Beispiel 7 synthetisiert: 5'-FMOC-GUU-Trityl (Block 1); 5'-FMOC-CGGG-Trityl (Block 2); 5'-FMOC-CGCCA-Trityl (Block 3); 5'-FMOC-CUGC-Trityl (Block 4).

B. Abspaltung des FMOC-Restes

1,1 Millimol von Block 4 wird in 20 ml DMF suspendiert, und 0,4 ml DBU (1,8-Diazabicyclo- [5.4.0.]undec-7-en) werden zugesetzt. Nach 20 Minuten werden 200 ml Ether zugegeben, die Lösung wird gut gerührt und filtriert. Das Filtrat wird in 20 ml Dichlormethan resuspendiert und in vier 30 ml große Zentrifugenröhrchen verteilt, wonach man in jedes von diesen 25 ml Ether zusetzt, zur Vermischung gut schüttelt und diese zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen, und die Pellets unter verringertem Druck getrocknet.

C. Detritylierung und Aktivierung

Als nächstes wird 1 mMol von Block 3, wie aus dem Beispiel 7, Teil B, detrityliert. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wird das verbleibende Material in 20 ml Dichlormethan suspendiert, gefolgt von Zugabe von 1,5 ml DIPAEIB (hergestellt wie in Beispiel 5). Unter raschem Rühren werden 0,5 ml Ethyldichlorphosphat zugesetzt. Nach 5 Minuten wird diese Lösung in vier 30 ml große Zentrifugenröhrchen aufgeteilt. Jedes Röhrchen wird mit Ether gefüllt, gründlich geschüttelt und zentrifugiert. Die Pellets werden in einem minimalen Volumen Dichlormethan resuspendiert, gefolgt von der Zugabe von Ether. Die Röhrchen werden dann geschüttelt und zentrifugiert. Dieses Waschvorgehen wird noch einmal wiederholt. Das Pellet wird in Kopplungslösung (10 ml Dichlormethan, 5 ml Tetramethylensulfon und 0,3 ml DIPAEIB (hergestellt wie im Beispiel 5)) suspendiert.

D. Kopplung

Die Lösung des aktivierten Blocks 3 wird zum Block 4 zugegeben, von dem die FMOC-Gruppe abgespalten worden ist. Nach einer Stunde werden 0,5 ml Essigsäureanhydrid zugesetzt, und die Lösung wird 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Dichlormethan wird unter verringertem Druck entfernt. Um das Produkt, 5'-FMOC-CGCCACUGC-Trityl, zu fällen, wird Wasser zugesetzt. Nach Trocknen des Feststoffs unter Vakuum, um alles restliche Essigsäureanhydrid gründlich zu entfernen, wird dieser in Dichlormethan resuspendiert. Dann wird Ether zugesetzt, um das Produkt zu fällen. Das Produkt wird noch einmal in Dichlormethan resuspendiert und erneut mit Ether gefällt.
Die FMOC-Einheit wird von diesem 9-mer-Produkt entfernt, wie im obenstehenden Teil B. Der Block 2 wird detrityliert und aktiviert, wie im obenstehenden Teil C. Diese zwei Komponenten werden gekoppelt, wie obenstehend beschrieben, wodurch man das 13-mer erhält: 5'-FMOC- CGGGCGCCACUGC-Trityl.
Der FMOC-Rest wird von diesem 13-mer-Produkt abgespalten, wie im obenstehenden Teil B. Der Block 1 wird detrityliert und aktiviert, wie im obenstehenden Teil C. Diese zwei Komponenten werden gekoppelt, wie obenstehend beschrieben, wodurch man das 16-mer erhält: 5'-FMOC- GWCGGGCGCCACUGC-Trityl.

E. Entschützen

Die FMOC- und Tritylreste werden entfernt, wie obenstehend, und das Produkt wird in 20 ml DMF suspendiert, und 20 ml Ammoniumhydroxid werden zugesetzt. Die Präparation wird verschlossen und 18 Stunden lang bei 30ºC inkubiert. Danach wird das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfen entfernt, wodruch man eine Roh-Präparation des 16-mers erhält: 5'- GUUCGGGCGCCACUGC.

F. Reinigung

Die 16-mer-Präparation wird, bei einer Konzentration von 2 mg/ml in 0,05 N wäßrigem Methylamin. das mit HCl auf pH 10,5 eingestellt ist (Lösungsmittel A), suspendiert. Für die Chromatographie zu verwendendes Wasser wird unter einem Absaugevakuum entgast, und Methylamin wird zugesetzt, um eine Methylamin-Endkonzentration von 0,05 N zu ergeben. Zu dieser Lösung wird HCl gegeben, um den pH auf 10,5 einzustellen. Eine entsprechende Lösung von pH 10,5 wird zu 1 N in KCl hergestellt (Lösungmittel B). Lösungsmittel A wird 1 : 1, bezogen auf Volumen, mit Acetonitril oder Methanol von chromatographischer Güteklasse vermischt, wodurch man das Lösungsmittel C erhält.
Bis zu 100 mg des Polymeren werden in 50 ml Lösungsmittel A auf eine Chromatographiesäule (5 cm Durchmesser und 15 cm Länge) geladen, welche mit dem Anionenaustauscher-Träger Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia) gepackt ist. Die Säule wird gründlich mit Lösungsmittel A gewaschen und mit einem linearen Gradient, welcher von 100% Lösungsmittel A bis zu 100% Lösungsmittel B reicht, über 30 Minuten hinweg unter Verwendung einer Fließgeschwindigkeit von etwa 30 ml/Minute eluiert. Das Elutionsmittel wird bei 254 nm überprüft. Das 16-mer dieses Beispiels eluierte festgestelltermaßen bei etwa 0,35 N KCl. Das gewünschte Bindungspolymer ist im allgemeinen der letzte und der größte Peak, welcher aus der Säule eluiert. Wenn das Polymer durch Block-Zusammenbauen hergestellt wird, werden oft Grundlinien-Trennungen erzielt. Wenn die Peak-Formen unsymmetrisch sind, besteht ein Problem im allgemeinen eher in der Unlöslichkeit des Bindungspolymeren denn als in einem Kapazitätsmangel der chromatographischen Packung. Ein derartiges Problem kann oft gelöst werden durch Verringern der in einem gegebenen Lauf geladenen Menge an Bindungspolymer. Wenn die Peaks symmetrisch sind, aber eine Grundlinien- Trennung nicht erzielt wird, kann eine Verbesserung üblicherweise durch Eluieren unter Verwendung eines flacheren Gradienten erhalten werden.
Das Elutionsmittel, welches das Polymer enthält, wird ferner durch Laden auf eine Säule von äquivalenter Größe, gepackt mit 35-Mikrometer-Polypropylen von chromatographischer Güteklasse (Kat.-Nr. 4342 von Polysciences, Inc.), gereinigt und entsalzt. Die Säule wird gründlich mit Lösungsmittel A gewaschen. Wenn eine Grundlinien-Trennung in der vorausgehenden Kationenaustausch-Chromatographie erzielt wurde, dann wird reines Produkt durch Eluieren mit dem Lösungsmittel C erhalten. Wenn jedoch eine Grundlinien-Trennung nicht erzielt wurde, wird das Produkt mit einem linearen Gradient eluiert, der von 100% Lösungsmittel A bis zu 100% Lösungsmittel C reicht. Es wurde festgestellt, daß das 16-mer in diesem Beispiel eluiert, wenn sich die Konzentration von Acetonitril auf etwa 25 Vol.-% belief.

6. Sequenz-Bestätigung

Eine Massenspektrum-Analyse des Vollängenpolymers im vollständig geschützten Zustand, wie früher beschrieben, kann dazu dienen, sowohl die Polymerlänge als auch die Basenzusammensetzung zu bestätigen, aber sie liefert keine Information über die Untereinheit-Sequenz. Ein Verfahren zum Erhalten von Sequenzinformation erfolgt aus den Fragmentierungs-Mustern von Desoxyribonukleinsäuren und Carbamat-verknüpften Desoxyribonukleiosid-abgeleiteten Polymeren (Griffin et al.). Allerdings sind viele Morpholino-basierende Polymere der vorliegenden Erfindung im vollständig geschützten Zustand resistent gegen Fragmentierung und ergeben vorwiegend das Molekülion mit nur minimalen Fragmenten.
Ein alternatives Verfahren zur Bestätigung der Sequenz eines Morpholino-basierenden Polymeren besteht darin, einen kleinen Teil des wachsenden Polymeren nach Kopplung jedes Oligomerblockes zu entnehmen und eine Massenspektrum-Analyse anzuwenden, um die Verlängerung des Polymeren zu verfolgen. Dieses Verfahren ist anwendbar, außer in den seltenen Fällen, in welchen zwei in der Synthese verwendete Blöcke zufälligerweise exakt die gleiche Masse besitzen.
Ein bevorzugtes, aber indirektes, Verfahren, um bei der Bestätigung der Richtigkeit der Polymer- Untereinheitsequenz zu helfen, besteht darin, das Morpholino-Polymer mit seiner komplementären DNA (deren Sequenz durch etablierte Verfahren bestätigt werden kann) und mit DNA-Sequenzen, welche resultiert haben könnten, wenn die Blöcke in der falschen Reihenfolge zusammengebaut wären, zu paaren. Die Paarung zwischen dem Polymer und der DNA kann durch Prüfen hinsichtlich einer hypochromen Verschiebung im Wellenlängenbereich von 240 bis 290 nm ausgewertet werden (untersucht wie im Beispiel 6). Eine derartige Verschiebung findet nur zwischen dem Polymer und seiner komplementären Sequenz statt. Der Polymer/DNA-Doppelstrang kann auch von jedwedem teilweise fehlgepaartem Doppelstrang durch langsames Erhöhen der Temperatur während Überprüfung der Extinktion im Bereich von 240 nm bis 290 nm unterschieden werden. Der perfekte Doppelstrang wird eine Schmelztemperatur (entsprechend einer 50%igen Reduktion in der Hypochromie) von im allgemeinen 10 Grad oder mehr überhalb derjenigen von irgendeinem fehlgepaarten Doppelstrang aufweisen.

H. Überprüfen der Zielbindungs-Affinität

Das 16-mer dieses Beispiels, bei Paarung mit seiner komplementären DNA, bindet festgestelltermaßen an DNA, wenn die Stränge antiparallel sind, aber nicht, wenn sie parallel sind (wie nachstehend veranschaulicht).
Es wurde festgestellt, daß das antiparallele, gebundene Strang-Molekül eine Tm (bestimmt wie beschrieben im Beispiel 6) von 63ºC aufweist, wenn jeder Strang bei einer Konzentration von 3 Mikromolar vorhanden war.

I. Überprüfung der biologischen Aktivität

Das 16-mer dieses Beispiels wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit getestet, die Synthese des viralen P24-Proteins in humanen Zellen, welche mit HIV-I - dem AIDS-Virus - infiziert waren, zu inhibieren. Vorläufige Ergebnisse zeigen, daß wenn das 16-mer-Polymer dieses Beispiels, welches komplementär zur Primerbindungsstelle von HIV-I ist, bei einer Konzentration von 6 Mikromolar zu HIV-I-infizierten Zellen zugesetzt wird, das Polymer eine 35%ige Verringerung der Synthese des viralen P24-Proteins verursacht. Ferner verursacht das Polymer bei Konzentrationen von 6 und 19 Mikromolar keine nachweisbare Zelltoxizität in nicht-infizierten Zellen.

Beispiel 9

Festphasen-Blockzusammenbau von Morpholino-Polymer, gerichtet gegen die Primerbindungsstelle von HIV-I

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von Oligomerblöcken, hergestellt wie in Beispiel 7, für den Festphasenzusammenbau eines Morpholino-Polymeren, enthaltend Phosphordiamidat- Zwischen-Untereinheit-Bindungen. Der Festphasenzusammenbau sieht ein schnelles Verfahren zum Zusammenbau längerer Bindungspolymere vor. Die Verwendung von kurzen Oligomerblöcken anstelle von Monomeren vereinfacht die Trennung des Endproduktes von Fehlsequenzen in großem Maße.

A. Anheftung eines spaltbaren Linkers an einen festen Träger

Ein mMol Bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (Pierce Chemical Co. of Rockford, Illinois, USA) wird in 10 ml DMF gelöst und zu 3 g eines geeigneten festen Trägers mit primären Aminfunktionen zugesetzt: z. B. Glas, Aminopropyl, Katalog-Nr. G4643 von Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA - 500 Angström Porengröße, 200-400 mesh, Amingehalt von 81 Mikromol/g. Nach 2 Stunden wird die Aufschlämmung von Glasperlen in eine Säule gegeben (vorzugsweise etwa 1,5 cm Durchmesser), die Säule gründlich mit Dichlormethan gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Dieser an den Glasträger gebundene Linker ist gegenüber den sauren Bedingungen, welche für Detritylierungen angewandt werden, stabil, kann aber leicht über einen β- Eliminierungs-Mechanismen unter Verwendung einer starken nicht-nukleophilen Base, wie 1,8- Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU), abgespalten werden.

B. Synthese von kurzen Oligomerblöcken

C. Addition des ersten Blocks an den Träger gebundenen Linker

Ein Millimol von Block 1-Oligomer wird in 20 ml DMF suspendiert, und 0,4 ml DBU (1,8- Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en) werden zugegeben. Nach 5 Minuten werden 200 ml Ether zugegeben, die Suspension wird gut gerührt und filtriert. Das Filtrat wird in 20 ml Dichlormethan resuspendiert und in vier 30 ml große Zentrifugen-Röhrchen verteilt. In jedes Röhrchen werden 25 ml Ether zugegeben, gut geschüttelt, und zentrifugiert. Die Überstande werden verworfen und die Pellets werden unter vermindertem Druck getrocknet. Dieses Oligomer wird in 12 ml DMF resuspendiert und auf die Säule von festem Synthese-Träger, hergestellt im obenstehenden Teil A, gegeben. Das Bett aus Glasperlen wird periodisch bewegt, um gründlichen Zugang des Oligomerblocks zu allen internen Oberflächen der Perlen zu gewähren. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird die Säule gründlich mit Dichlormethan gewaschen. Der ungebundene Oligomerblock, vorhanden in der Waschung, kann zurückgewonnen und wiederverwendet werden.

D. Detritylierung und Aktivierung

Der Träger-gebundene Oligomerblock wird durch langsames Hindurchleiten einer Lösung, welche aus 88 ml Dichlormethan, 10 ml Trifluorethanol und 2 g Cyanessigsäure aufgebaut ist, durch die Säule detrityliert. Die Säule wird mit 40 ml Dichlormethan gewaschen, gefolgt von 40 ml 1% N- Ethylmorpholin in Dichlormethan. Die Säule wird dann mit SO ml Dichlormethan gewaschen. Das Ende des gebundenen Oligomer wird durch langsames Hindurchleiten von 100 ml Dichlormethan, enthaltend 5 ml DIPAEIB (hergestellt wie in Beispiel S) und 3 ml Ethyldichlorphosphat, durch die Säule aktiviert. Die Säule wird dann mit 100 ml Chloroform gewaschen.

E. Addition von nachfolgenden Blöcken an trägergebundenes Oligomer

Ein Millimol von Oligomerblock 2 wird in 20 ml DMF suspendiert, und 0,4 ml DBU (1,8- Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en) werden zu der Suspension zugegeben. Nach 5 Minuten werden 200 ml Ether zugegeben, die Suspension wird gut gerührt und filtriert. Das Filtrat wird in 20 ml Dichlormethan resuspendiert und in vier 30 ml große Zentrifugen-Röhrchen verteilt. In jedes Röhrchen werden 25 ml Ether zugegeben. Die Röhrchen werden gut geschüttelt und zentrifugiert. Die Überstande werden verworfen und die Pellets werden unter vermindertem Druck getrocknet. Das Oligomer wird in Kopplungslösung (8 ml Dichlormethan, 4 ml Tetramethylensulfon und 0,5 ml DIPAEIB (hergestellt wie in Beispiel 5)) resuspendiert. Diese Lösung wird langsam in das Bett der Synthesesäule eingeführt, bis nur 1 bis 2 ml des Volumens über dem Säulenbett verbleiben. Der Träger wird periodisch bewegt, um gründlichen Zugang der Kopplungslösung zu allen internen Poren-Oberflächen der Perlen zu gewähren. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird die Säule gründlich mit Dichlormethan gewaschen.
Die Blöcke 3 und 4 werden auf die gleiche Weise, wie obenstehend beschrieben, angefügt.

F. Abspaltung vom Träger

Eine Lösung zur Abspaltung des Linkers (bezogen auf Volumen: 6 Teile Diethylmalonat; 12 Teile DBU; 41 Teile Tetramethylensulfon; und 41 Teile Dichlormethan) wird langsam durch die Säule laufen gelassen, während das Elutionsmittel bei 290 nm mittels einer Fließzelle von 1 mm Pfadlänge überwacht wird. Das Elutionsmittel wird aufgefangen, bis das gesamte Polymer eluiert ist (im allgemeinen etwa 30 Minuten). Das Dichlormethan wird unter vermindertem Druck entfernt. Zum verbleibenden Material wird wäßriges NaH&sub2;PO&sub4;, ausreichend zur Neutralisierung des DBU, zugesetzt, und dann wird ein großes Volumen an Wasser zugegeben, um das Polymer zu fällen. Das feste Produkt wird gesammelt und getrocknet.

G. Struktur-Charakterisierung, Entschützung, Reinigung und Testen

Das vollständig geschützte 16-mer-Produkt wird entschützt, gereinigt und analysiert, wie beschrieben im Beispiel 8. Nach Entschützen und Reinigung zeigt das 16-mer-Polymer dieses Beispiels im wesentlichen die gleiche Tm mit seiner Ziel-DNA und im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das 16-mer-Polymer, das wie im Beispiel 8 beschrieben hergestellt wurde.

Beispiel 10

Schrittweise Festphasensynthese eines Morpholino-Polymeren, gerichtet gegen eine Splice- Verbindungsstelle in Herpes simplex I

Dieses Beispiel beschreibt den schrittweisen Zusammenbau eines Polymeren, enthaltend ein Phosphoramidat-verknüpftes Grundgerüst (Struktur von Fig. 4, worin X N(CH&sub3;)&sub2; ist, Y Sauerstoff ist und Z Sauerstoff ist) auf einem festen Träger. Dieses Polymer mit der Sequenz 5'- CGUUCCUCCUGC ist gegen eine Splice-Verbindungsstelle in dem Virus Herpes simplex I (Atencio et al.) gerichtet.

A. Bindung eines spaltbaren Linkers an einen festen Träger

Ein spaltbarer Linker wird an den festen Träger gebunden, wie beschrieben im Beispiel 9, Teil A.

B. Kopplung des ersten Monomeren an den Träger.

Ein mMol einer Morpholino-C-Untereinheit, enthaltend eine Tritylgruppe auf dem Morpholino- Ring-Stickstoff, und mit einem Methylamin auf dem 5'-Methylen (hergestellt wie in Beispiel 4), wird in 12 ml DMF suspendiert und auf eine Säule gegeben, die als fester Synthese-Träger hergestellt wurde, wie beschrieben in Beispiel 9, Teil A). Das Bett aus Glassperlen wird periodisch bewegt, um gründlichen Zugang der ersten Untereinheit zu allen internen Oberflächen der Perlen zu gewähren. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wird die Säule gründlich mit Dichlormethan gewaschen. Ungebundene Untereinheiten, welche in der Waschung vorhanden sein können, können zurückgewonnen und wiederverwendet werden.

C. Kopplungszyklus

a. Detritylierung

Die Träger-gebundene Untereinheit wird detrityliert durch langsames Hindurchleiten einer Lösung, welche aus 88 ml Dichlormethan, 10 ml Trifluorethanol und 2 g Cyanessigsäure besteht, durch die Säule. Die Säule wird mit 40 ml Dichlormethan, gefolgt von 40 ml 1% N-Ethylmorpholin in Dichlormethan, und schließlich mit 100 ml chloroform gewaschen.

b. Addition einer Untereinheit an die wachsende Kette

Ein mMol Untereinheit (hergestellt wie in Beispiel 2 und aktiviert mit N,N-Dimethylaminodichlorphosphat, wie beschrieben in Beispiel 5, Teil D) wird in Kopplungslösung (8 ml Dichlormethan, 4 ml Tetramethylensulfon und 0,5 ml DIPAEIB (hergestellt wie in Beispiel 5)) suspendiert. Diese Lösung wird langsam in das Bett der Synthesesäule eingeführt, bis nur 1 bis 2 ml des Volumens über dem Säulenbett verbleiben. Der Träger wird periodisch bewegt, um gründlichen Zugang der Kopplungslösung zu allen internen Poren-Oberflächen der Perlen zu gewähren. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wird die Säule gründlich mit Dichlormethan gewaschen. Jede ungebundene Untereinheit in dieser Waschung kann zurückgewonnen und wiederverwendet werden.

c. Kappen-Abdeckung von nicht umgesetzten Kettenenden

Fünfzig Milliliter Dichlormethan, enthaltend 2 ml Essigsäure und 2 ml DIPAEIB (hergestellt wie in Beispiel 5), werden auf eine Säule gegeben. Die Säule wird mit 100 ml Methanol, enthaltend 2 ml DIPAEIB, gewaschen, gefolgt von einer Waschung unter Verwendung von 200 ml Dichlormethan.
Unter Anwendung dieses Kopplungs-Zyklus (umfassend die obenstehenden Schritte a, b und c) werden die Untereinheiten G, U, U, C, C, U, C, C, U, G und C in dieser Reihenfolge angefügt.

D. Abspaltung vom Träger

Das vervollständigte Polymer wird vom Träger abgespalten, wie beschrieben in Beispiel 9.

E. Struktur-Charakterisierung, Entschützung, Reinigung und Testen

Das vollständig geschützte 12-mer-Produkt wird entschützt, gereinigt und analysiert, wie im Beispiel 8 beschrieben. Nach Entschützen und Reinigung wurde festgestellt, dass das gegen Herpes gerichtete 12-mer-Polymer, hergestellt wie oben, eine Tm (bestimmt wie in Beispiel 6 beschrieben) von 47ºC aufweist, wenn es mit seiner komplementären DNA gepaart wird (die zwei Stränge antiparallel): jeder Strang war in einer 2 mikromolaren Konzentration vorhanden.

F. Vorläufige Bewertung der biologischen Aktivität

Das 12-mer dieses Beispiels wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit getestet, Mäuse zu schützen, die von dem Zielvirus, Herpes simplex Virus I (HSV I), infiziert waren. Mäuse, die im Auge mit HSV I infiziert waren, zeigten S Tage nach der Infektion ein Überleben von 65%. Wenn Herpes- infizierte Mäuse mit einer topischen Salbe behandelt wurden, welche 0,3 mMolar des in diesem Beispiel beschriebenen 12-mers enthielt, wurde das Überleben 5 Tage nach der Infektion auf 90% erhöht.

Claims

1. Polymer, umfassend Morpholino-Untereinheitsstrukturen der Form:

worin (i) die Strukturen miteinander verbunden sind durch ungeladene, chirale Verknüpfungen, welche den Morpholinostickstoff einer Untereinheit an den 5'-exozyklischen Kohlenstoff einer angrenzenden Untereinheit binden, und (ii) Pi ein Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest ist, welcher wirksam ist, durch basenspezifische Wasserstoffbindung an einer Base in einem Polynukleotid zu binden, und worin die Verknüpfung (i)

ist, worin X F, CH&sub2;R, OCH&sub2;R, -S-CH&sub2;R, NR&sub1;R&sub2;, Morpholino, Pyrrolyl oder Pyrazolyl ist; worin R, R&sub1; und R&sub2; gleich oder unterschiedlich sein können und gewählt sind aus H und CH&sub3;; Y&sub1; an den 5'-exozyklischen Kohlenstoff der Morpholino-Untereinheit gebunden ist; Y&sub1; O, S, CH&sub2; oder NR ist; und Z O oder S ist.

worin X' H, CH&sub3;, F, Cl, Br oder I ist.

3. Polymer gemäß Anspruch 1 oder 2, in dem Z 0 ist und Y&sub1; O ist.

4. Polymer gemäß Anspruch 1 oder 2, in dem die Verknüpfung von folgender Form ist:

worin Pj ein Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest ist, der wirksam ist, durch basenspezifische Wasserstoffbindung an eine Base in einem Polynukleotid zu binden.

5. Polymer gemäß Anspruch 1 oder 2, in dem die Verknüpfung von folgender Form ist:

6. Polymer gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, welches ferner einen Rest an einem oder an beiden Enden einschließt, welcher wirksam ist, die Löslichkeit des Polymers in wässrigem Medium zu erhöhen.

7. Polymer gemäß Anspruch 6, in dem der Rest an einem oder an beiden Enden Polyethylenglykol ist.

8. Polymer gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, bestehend aus mindestens 3 Morpholino-Untereinheiten.

9. Polymer gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, in dem mindestens einer der Pi-Reste ein 2,6-Diaminopurin-Rest ist.

10. Polymer gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, in dem mindestens einer der Pi-Reste ein 5-Halogenuracil-Rest ist.

11. Polymer gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, worin mindestens 70% der Pi-Reste 2-Amin enthaltende Purin-Reste sind.

12. Polymer gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, das an einem festen Träger gebunden ist.

13. Verfahren zur Herstellung eines Polymeren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Verfahren das Miteinanderverknüpfen von Morpholino-Untereinheitsstrukturen der Form:

worin Pi wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 11 definiert ist, vermittels ungeladener, chiraler Verknüpfungen der Formel

worin Z, X und Y&sub1; wie gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 11 definiert sind und Y&sub1; an den 5'-exozyklischen Kohlenstoff der Morpholino-Untereinheit angrenzt, umfasst,

wobei die Verknüpfungen den Morpholinostickstoff einer Untereinheit an den 5'-exozyklischen Kohlenstoff einer angrenzenden Untereinheit binden.

14. Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens eines Polynukleotids mit einer gewählten Zielsequenz in einer Probe, umfassend das Kontaktieren eines Polymeren eines beliebigen der Ansprüche 1 bis 12 mit dem Polynukleotid, wobei das Polymer (i) eine Reihe von Basen-paarenden Resten aufweist, die zur Bindung an die gewählte Zielsequenz in der Lage sind, und (ii) mit einer nachweisbaren Reportergruppe markiert sind, und wobei das Umsetzen des Polymeren mit dem Polynukleotid unter Bedingungen durchgeführt wird, die wirksam sind, um die Bildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen dem Polymer und der Zielsequenz zu ermöglichen, und

Nachweisen der Anwesenheit der Reportergruppe.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Polynukleotid einzelsträngig ist.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, bei dem das Polynukleotid DNA ist.

17. Verfahren gemäß Anspruch 15, bei dem das Polynukleotid RNA ist.

18. Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Polynukleotid doppelsträngig ist.

19. Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem das Polynukleotid an einen festen Träger gebunden ist.

20. Verfahren zur Isolierung einer Nukleinsäure mit einer gewählten Zielsequenz aus einer Probe, umfassend

das Kontaktieren eines Polymeren von einem beliebigen der Ansprüche 1-11 mit der Nukleinsäure, wobei das Polymer (i) eine Reihe von Basen-paarenden Resten besitzt, die zur Bindung der gewählten Zielsequenz in der Lage sind, und (ii) an einen festen Träger gebunden ist, und (iii), wobei das Kontaktieren des Polymeren mit der Nukleinsäure unter Bedingungen durchgeführt wird, die wirksam sind, um die Bildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen dem Polymer und der Zielsequenz zu ermöglichen, und

Isolieren der Nukleinsäure.