DE69024392T2 - Verfahren zur Reinigungbvon Aussenmembran-Protein von Haemophilus influenzae - Google Patents
Verfahren zur Reinigungbvon Aussenmembran-Protein von Haemophilus influenzaeInfo
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Description
- Haemophilus influence Typ b ist lange als ein häufiges Pathogen, besonders bei Säuglingen und Kindern, erkannt worden, aber erst vor kurzem ist nicht typisierbar H.influenzae als ein wichtiges Pathogen erkannt worden. Es ist jetzt gut gesichert, daß nicht-typisierbarer H.influenzae Pneumonie, Bakteriämie, Meningitis, postpartale Sepsis und akute fiebrige Tracheobronchitis bei Erwachsenen verursacht. Zusätzlich verursacht nicht-typisierbarer H.influenzae neonatale Sepsis und ist ein häufiges ätiologisches Agens bei akuter Otitis media bei Säuglingen und Kindern. Deshalb ist die Bedeutung der Entdeckung eines Verfahrens zum Testen einer klinischen Probe wie z.B. Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit, Blut und anderen auf die Anwesenheit von H.influenzae klar.
- Die Beobachtung, daß nicht-typisierbarer H.influenzae ernste Infektionen bei Erwachsenen und Kindern verursacht, hat das Interesse am Studium der Pathogenese und potentieller Virulenzfaktoren, die mit diesem Bakterium verbunden sind, belebt. Die Ribitolkapsel von H.influenzae Typ b ist ein Virulenzfaktor für den Organismus und Antikörper gegen die Kapsel schützt den Wirt mittels bakterizider und/oder opsonisierender Wirkungen. Diese Beobachtungen haben viele Untersuchungen über die Rolle des Kapselpolysaccharids bei Infektion mit H.influenzae Typ b und Schutz vor diesen Infektionen hervorgerufen. Jedoch fehlt nicht-typisierbarem H.influenzae eine Polysaccharidkapsel und, ähnlich den äußeren Membranen anderer Gram-negativer Bakterien, ist die äußere Membran von H.influenzae aus Außenmembran-Proteinen (OMPs) und Lipopolysaccharid (LPS) zusammengesetzt. Deshalb konzentrieren sich Studien zur Beziehung zwischen Virulenz von nicht-typisierbarem H.influenzae und Oberflächenantigenen auf OMPs und LPS.
- Die Analyse von OMPs von nicht-typisierbarem H.influenzae hat gezeigt, daß ausgeprägte Unterschiede in der OMP-Zusammensetzung zwischen den Stämmen existieren. Siehe z.B. Murphy et al, "A Subtyping System for Nontypable Haemophilus influenzae Based on Outer-membrane Proteins," J. Infect. Dis, 1983, 147:838-46; Barenkamp et al, "Outer Memorane Protein and Biotype Analysis of Pathogenic Nontypable Haemodhilus influenzae," Infect. Immun, 1982, 36:535-40; Lorb et al, "Outer Memorane Protein Composition in Disease Isolates of Haemophilus influenzae, Pathogenic and Epidemiological Implications," Infect. Immun, 1980, 30:709-17.
- Ein Subtypisierungs-System für nicht typisierbaren H.influenzae, das auf den hauptsächlichen OMPs beruht, ist kürzlich entwickelt worden. Ein Oberflächen-exponiertes Antigen (Immunogen), das in allen Stämmen konserviert ist, ist ein wichtiges Werkzeug bei der Entwicklung sowohl eines Verfahrens zum Identifizieren von H.influenzae in klinischen Proben als auch eines Impfstoffes gegen H.influenzae.
- Ein vergleichsweise einfaches Verfahren zum Reinigen des konservierten Oberflächen-exponierten Antigens wäre wünschenswert. Verfahren, die verwendet worden sind, schlossen den Schritt ein, zuerst die äußere Membran zu isolieren, und die resultierenden Produkte enthielten kontaminierende RNA, andere zelluläre Komponenten und Detergenzien. Beispielhaft für derartige kompliziertere und/oder weniger wirksame Prozesse sind die Verfahren, wie in WO 88/04932 und Infection and Immunity 54/3 (1986), 744-9 beschrieben.
- -Es ist deshalb ein Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zum Reinigen des konservierten Oberflächen-exponierten Antigens zur Verfügung zu stellen, welches vergleichsweise einfach ist und eine erhöhte Ausbeute des erwünschten Antigens erzielt. Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Reinigungsverfahren zur Verfügung zu stellen, das ein von kontaminierender RNA und unerwünschten zellulären Komponenten freies Produkt liefern wird.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Reinigen eines immunogenen Außenmembran-Proteins von H.influenzae (H. flu) zur Verfügung zu stellen, welches im wesentlichen aus Schritten (a) bis (f) von Anspruch 1 besteht.
- Ein Verfahren zum Reinigen des Außenmembran-Proteins von Haemophilus influenzae wird in dieser Erfindung offenbart.
- Das hierin offenbarte Verfahren ist vergleichsweise einfacher als frühere Verfahren. Das Verfahren verwendet das ganze Bakterium als ein Ausgangsmaterial für die Inkubation in Puffern, die Detergens enthalten, und eliminiert demgemäß den ersten Schritt des Isolierens der äußeren Membran, wie dies in früheren Verfahren notwendig war. Unter ganzem Bakterium wird verstanden, daß das Bakterium in einem unprozessierten Zustand verwendet wird.
- H. flu., in einem Suspensionsmedium, wird verwendet, um direkt eine erste Fraktion zu erhalten, die das mit Peptidoglycan assoziierte Außenmembran-Protein umfaßt. Das Suspensionsmedium ist eine Flüssigkeit, in der die Fraktion unlöslich ist und kann ein Detergenspuffer sein. Unter Detergenspuffer wird eine Pufferlösung verstanden, die ein Detergens umfaßt, worin das Außenmembran-Protein und das Peptidoglycan unlöslich sind. Geeignete Detergenzien schließen Natriumdodecylsulfat (SDS) ein. Ein Beispiel eines geeigneten Detergenspuffers ist Puffer B. Puffer B umfaßt 1% SDS, 0,1% Beta-Mercaptoethanol, 0,01M Tris, 0,5M NaCl, pH 8,0. Die erste Fraktion, die das mit Peptidoglycan assoziierte Außenmembran-Protein (p6) umfaßt, wird erhalten indem die Suspension sukzessive wärmebehandelt und zentrifugiert wird. Die Suspension kann kurz beschallt werden, um zu helfen, die Zellen zu suspendieren. Wärmebehandlung kann durch irgendein geeignetes, den Fachleuten bekanntes Mittel erfolgen. Ein Beispiel eines geeigneten Mittels zur Wärmebehandlung ist Inkubation bei zwischen etwa 20ºC bis 37ºC für zwischen etwa 20 bis 40 Minuten. Zentrifugation erfolgt bei etwa 20000 g bis etwa 40000 g für etwa 30 bis 60 Minuten bei Umgebungstemperatur. Umgebungstemperatur, wie hierin verwendet, bedeutet zwischen etwa 20ºC bis etwa 27ºC. Unter sukzessiver Wärmebehandlung und Zentrifugation wird verstanden, daß der H. flu, im Suspensionsmedium, wärmebehandelt, dann zentrifugiert, dann in dem Suspensionsmedium resuspendiert und wärmebehandelt und zentrifugiert wird, bis die erste Fraktion, die mit Peptidoglycan assoziertes p6 umfaßt, gebildet wird.
- Kontaminierende RNA wird dann aus der ersten Fraktion durch Verwendung eines Verdauungsmaterials in einer ersten Flüssigkeit verdaut, in der das mit dem Außenmembran-Protein assoziierte Peptidoglycan unlöslich bleibt und die verdaute kontaminierende RNA löslich ist, so daß eine zweite Fraktion gebildet wird. Die zweite Fraktion ist unlöslich in der ersten Flüssigkeit und umfaßt das mit Peptidoglycan assoziierte Außenmembran-Protein. Unter kontaminierender RNA wird RNA verstanden, die in der zweiten Fraktion zusammen mit p6 und Peptidoglycan vorhanden ist. Ein Verdaungsmaterial erlaubt den Verdau kontaminierender RNA während das p6 in einer unlöslichen Form aufgrund seiner Assoziation mit Peptidoglycan verbleibt. Ein Beispiel eines Verdauungsmaterials ist Ribonuclease A. Die erste Flüssigkeit kann ein Detergenspuffer sein, wie oben diskutiert. Unter löslich wird selektiv suspendierbar oder entfernbar mit Blick auf die zweite Fraktion verstanden. Verdauungsmaterial wird dem Detergenspuffer zugesetzt und die Mischung wird sequentiell wärmebehandelt und zentrifugiert. Wärmebehandlung und Zentrifugieren erfolgen wie oben beschrieben. Unter sequentieller Wärmebehandlung und Zentrifugieren wird verstanden, daß die erste Fraktion in dem Detergenspuffer, der das Verdauungsmaterial umfaßt, suspendiert und wärmebehandelt und zentrifugiert wird, bis die kontaminierende RNA verdaut und die zweite Fraktion gebildet ist.
- Das Außenmembran-Protein (p6) wird von der zweiten Fraktion durch Suspendieren in einer zweiten Flüssigkeit getrennt, in der das besagte Außenmembran-Protein löslich und das Peptidoglycan unlöslich ist, und Wärmebehandeln, um das Außenmembran- Protein vom Peptidoglycan freizusetzen, um eine dritte Flüssigkeit zu erhalten, die das solubilisierte Außenmembran-Protein umfaßt. Ein Beispiel einer Flüssigkeit, in der das besagte Außenmembran-Protein löslich und das Peptidoglycan unlöslich ist, ist ein Detergens-freier Puffer. Unter Detergensfreiem Puffer wird eine Pufferlösung verstanden, die kein zugesetztes Detergens aufweist. Beispiele geeigneter Detergensfreier Pufferlösungen sind Tris-Puffer, PBS und Natriumtetraboratpuffer. Ein bevorzugter Detergens-freier Puffer ist Natriumtetraboratpuffer. Die zweite Fraktion wird im Detergensfreien Puffer suspendiert und bei zwischen etwa 50-75ºC für etwa 30 bis 60 Minuten wärmebehandelt. Die Suspension wird dann bei etwa 80000 g bis 120000 g für eine ausreichende Zeit bei einer ausreichenden Temperatur zentrifugiert, bis ein Überstand (dritte Flüssigkeit), der das Außenmembran-Protein umfaßt, erhalten wird. Der Überstand, der eine lösliche Präparation von p6 umfaßt, die frei von unerwünschten zellulären Komponenten ist, wird dann zurückgewonnen. Unerwünschte zelluläre Komponenten schließen Lipooligosaccharide, andere Proteine als p6, Peptidoglycan, DNA und RNA ein.
- Der Überstand wird dann durch ein den Fachleuten bekanntes Mittel konzentriert und schließt das Druckfiltrationsverfahren ein.
- Das folgende Beispiel beschreibt die Art und Weise und den Prozess des Herstellens und Verwendens der Erfindung und teilt die vom Erfinder erwogene beste Art und Weise mit, die Erfindung auszuführen, soll aber nicht als beschränkend aufgefaßt werden.
- Bakterien wurden in Brühe angezogen und 25 g Bakterien wurden in Puffer B suspendiert, kurz beschallt, um zu helfen, die Zellen zu suspendieren, und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Nach Inkubation wurde die Suspension bei 20000 g für 30 Minuten bei 25ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die unlösliche Fraktion in Puffer B resuspendiert, inkubiert und wie zuvor zentrifugiert. Dieser Zyklus aus Inkubationen und Zentrifugationen wurde insgesamt fünfmal wiederholt. Für die letzten zwei Inkubationen wird Ribonuklease A (10 Mikrogramm/ml) zu Puffer B zugesetzt. Das Einschließen der Ribonuklease bei diesem Schritt erlaubt Verdauung von kontaminierender RNA, während das p6 aufgrund seiner Assoziation mit Peptidoglycan in einer unlöslichen Form verbleibt. Auf diese Weise bleiben die Ribonuklease und die RNA-Abbauprodukte löslich, während p6 und Peptidoglycan unlöslich bleiben.
- Die p6/Peptidoglycan-unlösliche Fraktion wurde in 0,1 M Natriumtetraboratpuffer (pH 9,5) suspendiert und für 30 Minuten bei 65ºC inkubiert. Die Mischung wurde dann bei 100000 g für eine Stunde bei 35ºC inkubiert. Dieser Schritt setzt p6 von Peptidoglycan frei, so daß solubilisiertes, p6 im Überstand verbleibt. Dieser Überstand wurde dann durch Druckfiltration etwa zehnfach konzentriert. Das Volumen wurde auf sein Ausgangsvolumen zurückgebracht und erneut konzentriert. Diese Konzentrierungs- und Waschprozedur wurde fünfmal unter Verwendung des Boratpuffers durchgeführt. Die resultierenden p6-Präparationen sind wie folgt charakterisiert worden: SDS-PAGE ergibt eine einzige Proteinbande bei einem Molekulargewicht von etwa 16000 Dalton. Die Präparation ist unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers frei von detektierbaren Lipooligosacchariden. Ein Absorbanzspektrum des löslichen p6 zeigte einen Peak bei einer Wellenlänge von 275 nM. Agarose-Gelelektrophorese zeigte, daß die Präparation frei von DNA und RNA ist. Folglich enthält die letztendliche Präparation gereinigtes, solubilisiertes p6-Protein von Haemophilus influenzae. Aminosäureanalyse dieses Materials zeigt, daß der Aminosäuregehalt übereinstimmt mit dem von der hierin offenbarten DNA-Sequenz vorhergesagten.
- Andere Ausführungsformen der Erfindung werden für die Fachleute aus einer Betrachtung dieser Beschreibung oder dem Ausführen der hierin offenbarten Erfindung erkennbar werden. Es versteht sich von selbst, daß es andere Ausführungsformen gibt, die in den Geist und den Umfang der Erfindung, wie definiert durch die folgenden Ansprüche, fallen.
Claims (15)
1. Ein Verfahren zur Reinigung eines immunogenen Außenmembran-
Proteins von Haemophilus influenzae, im wesentlichen bestehend
aus:
a) Suspendieren von H. influenzae-Mikroorganismen durch
Inkubieren der Organismen in einer
Detergenspufferlösung, um eine unlösliche Fraktion zu bilden, die
das Außenmembran-Protein und die
Peptidoglycan-Komponente umfaßt, und eine lösliche Fraktion, die den
Rest der zellulären Komponenten umfaßt;
b) Trennen der unlöslichen Fraktion aus Schritt a) von
der löslichen Fraktion;
c) Suspendieren der unlöslichen Fraktion aus Schritt b)
in Detergenspuffer, der Verdauungsmaterial enthält,
das Verdauung kontaminierender RNA ermöglicht, und
Ermöglichen von RNA-Verdauung;
d) Trennen der unlöslichen Fraktion aus Schritt c) von
der löslichen Fraktion, die das Verdauungsmaterial
und die verdaute RNA umfaßt;
e) Solubilisieren der unlöslichen Fraktion aus Schritt
d) durch Hitzebehandlung in einem Detergens-freien
Puffer; und
f) Trennen der löslichen Fraktion, die das gereinigte
Außenmembran-Protein der äußeren Membran enthält,
von der unlöslichen Fraktion aus Schritt e), die die
Peptidoglycan-Komponente enthält.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das gereinigte Protein
der äußeren Membran P6 ist, das nach SDS-PAGE unter
nicht-reduzierenden Bedingungen ein Molekulargewicht von etwa 15.000
bis 17.000 Dalton aufweist.
3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei besagte
Detergenspufferlösung aus Schritt a) ein anionisches Detergens
umfaßt.
4. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei besagtes anionische
Detergens Natriumdodecylsulfat ist.
5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei
besagte Pufferlösung Puffer B ist, der 1 Gew.-%
Natriumdodecylsulfat, 0,01 M Tris, 0,5 M NaCl, 0,1 Vol.-%
beta-Mercaptoethanol, pH 8,0, umfaßt.
6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei
Schritt a) weiterhin Beschallung der Mikroorganismen in der
Detergenspufferlösung umfaßt, um Suspendierung der zellulären
Komponenten zu erleichtern.
7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei
besagtes Inkubieren bei Schritt a) durch Hitzebehandeln der
Suspension bei etwa 37ºC für etwa 30 Minuten ausgeführt wird.
8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die
unlösliche Fraktion von der löslichen Fraktion in Schritt b)
durch Zentrifugation bei etwa 100.000 xg für etwa 60 Minuten
getrennt wird, wobei die unlösliche Fraktion in der Form eines
Pellets vorliegt.
9. Das Verfahren nach Anspruch 8, das weiterhin die Schritte
umfaßt:
Resuspendieren der unlöslichen Fraktion in einer
Pufferlösung; und
Wiederholen der Hitzebehandlung von Schritt a) und b) bis
die unlösliche Fraktion im wesentlichen frei von
löslichen zellulären Komponenten ist.
10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei
besagte RNA-Verdauung dadurch vorgenommen wird, daß die Lösung
bei etwa 37ºC für etwa 30 Minuten inkubiert wird.
11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das
Verdauungsmaterial und die verdaute RNA aus der unlöslichen
Fraktion in Schritt d) durch Zentrifugation getrennt werden.
12. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei
besagter Detergens-freier Puffer 0,1 M Natriumtetraborat, pH
9,5, umfaßt.
13. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei
Schritt f) weiterhin umfaßt:
Inkubieren der unlöslichen Fraktion bei etwa 65ºC für
etwa 30 Minuten;
unmittelbar danach Zentrifugieren der unlöslichen
Fraktion bei etwa 100.000 xg für etwa 1 Stunde bei etwa 37ºC;
und
Sammeln der löslichen Fraktion, die das
Außenmembran-Protein enthält.
14. Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei die lösliche
Fraktion mit Druckfiltration behandelt wird, um das Außenmembran-
Protein zu konzentrieren.
15. Ein Verfahren zum Reinigen eines Außenmembran-Proteins von
Haemophilus influenzae, im wesentlichen bestehend aus:
a) Suspendieren von H. influenzae-Mikroorganismen in
einer Detergenspufferlösung, um eine Suspension zu
bilden;
b) Hitzebehandeln der Suspension durch Inkubation bei
etwa 37ºC für etwa 30 Minuten, um eine lösliche und
eine unlösliche Fraktion zu bilden;
c) Trennen der unlöslichen Fraktion von der löslichen
Fraktion durch Zentrifugieren der Suspension aus
Schritt b) bei etwa 100.000 xg für etwa 60 Minuten
bei Umgebungstemperatur, wobei die unlösliche
Fraktion in der Form eines Pellets vorliegt, das das
Außenmembran-Protein und die
Peptidoglycan-Komponente umfaßt, und die lösliche Fraktion, die den Rest
der zellulären Komponenten umfaßt;
d) Resuspendieren des Pellets aus Schritt c) in einer
Detergenspufferlösung;
e) Wiederholen der Schritte b) und c), bis die
unlösliche Fraktion im wesentlichen frei von löslichen
zellulären Komponenten ist;
f) Verdauen von RNA, die in der unlöslichen Fraktion
vorhanden ist, durch Zugabe von Ribonudease A und
Inkubieren bei etwa 37ºC für etwa 30 Minuten;
g) Wiederholen von Schritt c), um die Ribonuclease A zu
entfernen, die in der löslichen Fraktion enthalten
sein wird;
h) Solubilisieren der unlöslichen Fraktion aus Schritt
g) in einer Detergens-freien Pufferlösung, die 0,1 M
Natriumtetraborat, pH 9,5, umfaßt, durch Inkubieren
bei etwa 65ºC für etwa 30 Minuten; und
i) Trennen des Außenmembran-Proteins von der
Peptidoglycan-Komponente durch Zentrifugieren der Lösung
aus h) bei etwa 100.000 xg für etwa 1 Stunde bei
etwa 37ºC, wobei der Überstand das
Außenmembran-Protein.
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