DE69008172T2

DE69008172T2 - Kartoffel-alpha-amylase-gene.

Info

Publication number: DE69008172T2
Application number: DE69008172T
Authority: DE
Inventors: Kirsten Dk-8541 Skodstrup Gausing; Jette D. Dk-8220 Brabrand Kreiberg
Original assignee: Danske Spritfabrikker AS
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 1989-04-24
Filing date: 1990-04-24
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2010-04-25
Also published as: CA2053230A1; IE901450L; LV10727A; EP0470145B1; DK0470145T3; DD298949A5; IE63067B1; EP0470145A1; WO1990012876A1; CA2053230C; AU638248B2; ES2053189T3; ATE104351T1; AU5531890A; LV10727B; DE69008172D1; US6147277A; DK198089D0

Description

α-Amylase, die in der Stärkehydrolyse mitwirkt, gibt es in allen Pflanzen. Über α-Amylase in monocotyledonen Pflanzen, wie Gerste und Weizen, wurden ausgiebige Forschungsarbeiten geleistet und die α-Amylase-Gene dieser monocotyledonen Pflanzen wurden isoliert. Es wurden auch Forschungsarbeiten über die α-Amylase aus dicotyledonen Pflanzen durchgeführt, bisher jedoch lediglich auf enzymatischem Niveau. Es war bisher nämlich nicht möglich, α-Amylase-Gene aus dicotyledonen Pflanzen zu isolieren oder zu charakterisieren.
Die Erfindung betrifft DNA-Fragmente, die die α-Amylase von dicotyledonen Pflanzen codieren und wichtige Entwicklungen aufgrund der Bereitstellung derartiger DNA-Fragmente.
Die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente und Varianten davon, z.B. ein α-Amylase codierender Teil der in den Figuren 1 bis 5 angegebenen Nucleotid-Sequenz, sowie Teilsequenzen und Analoga davon bilden die Grundlage für Strategien zur Herstellung transgener Pflanzen bei der unterschiedliche wesentliche Eigenschaften von Pflanzen, z.B. der Gattung Solanum tuberosum, modifiziert werden können. Dazu gehört die planmäßige Verminderung der α-Amylase-Aktivität, um das Risiko von Maillard-Reaktionen und von Geschmacksmodifikationen/beeinträchtigungen, z.B. bei der Herstellung von Kartoffelchips zu vermeiden, oder die planmäßige Erhöhung der α-Amylase-Aktivität in Kartoffeln, die für die Fermentation bei der Herstellung von Spirituosen verwendet werden. Diese Strategien sowie andere wirtschaftlich interessante Strategien zur Herstellung transgener Pflanzen, bei denen die Eigenschaften von Pflanzen modifiziert werden, werden durch die vorliegende Erfindung ermöglicht und nachstehend genauer beschrieben.
Kartoffeln werden neben ihrer sehr wichtigen Verwendung für den direkten Verbrauch für viele unterschiedliche industrielle Zwecke verwendet, wie als Rohmaterial bei der Herstellung von Kartoffelchips und bei der Herstellung von Alkohol. Bei Herstellung dieser beiden Produkte ist der Abbau der Stärke in den Kartoffeln wichtig. Wie nachstehend beschrieben wird, ist die beim Stärkeabbau mitwirkende α- Amylase somit ein wichtiges Enzym.
Bei der Herstellung von Kartoffelchips ist der Abbau von Stärke zu reduzierenden Zuckern kritisch. Ein großer Teil des Stärkeabbaus, bei dem sich ein hoher Gehalt an reduzierenden Zuckern ergibt, bereitet ein Problem, da reduzierende Zucker sogenannten Maillard-Reaktionen während des Bratens von Kartoffeln in Pflanzenöl unterworfen werden. Dadurch erhalten die Chips eine unerwünschte braune Färbung und einen unangenehmen, verbrannten Geschmack. Dies wird von unerwünschten Änderungen in Geschmack und Textur der Kartoffelchips begleitet.
Andererseits ist ein hoher Gehalt reduzierender Zucker als Ergebnis einer hohen α-Amylase-Aktivität wünschenswert, wenn die Kartoffeln zur Herstellung von Alkohol verwendet werden sollen.
Erfindungsgemäß wird nunmehr die Möglichkeit zur Steuerung der α-Amylase-Aktivität durch Strategien zur Herstellung transgener Pflanzen ermöglicht. Dieser und weitere Aspekte der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.

Kurze Beschreibung der Erfindung

In einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein DNA-Fragment, das im wesentlichen eine Nucleotidsequenz der Figuren 1 bis 5 oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon enthält. Die in Figur 1 gezeigte Nucleotidsequenz wurde auf Grundlage von zwei Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Clonen durch Hybridisieren mit einem Gerste-α-Amylase-Gen gemäß Beispiel 5 und anschließender Sequenzierung (Beispiel 6) erhalten. Die cDNA-Clone wurden aus einer cDNA-Genbank erhalten, die wie in Beispiel 4 beschrieben, aus einer Poly(A)-reichen Kartoffel-RNA konstruiert wurde. Die Kartoffel, aus der die RNA isoliert wurde, war eine Kartoffel der Sorte Dianella. Die in den Figuren 1 und 2 angegebenen Nucleotid-Sequenzen codieren eine Form der Kartoffel-α-Amylase, und die in den Figuren 3 und 4 angegebenen Nucleotid-Sequenzen codieren einen Teil einer zweiten Form der α-Amylase. Die entsprechenden Aminosäure-Sequenzen werden ebenfalls jeweils in den Figuren 1 bis 4 angegeben. Alle vier α-Amylase-Aminosäure- Sequenzen sind neu und treten nur einmal auf. Figur 5 zeigt die Nucleotid-Sequenz einer den in den Figuren 1 und 2 angegebenen Sequenzen ähnlichen partiellen Kartoffel-α-Amylase- cDNA, die das Produkt eines Pseudogens ist, das kein α- Amylase-Protein codiert.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein α-Amylase-Gen, das ein im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 5 gezeigtes DNA-Fragment oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon enthält. Der Begriff "Gen" wird hier für die Bezeichnung einer DNA-Sequenz verwendet, die bei der Herstellung einer Polypeptidkette mitwirkt und dem codierenden Bereich vorausgehende und nachfolgende Bereiche (Signalpeptid- und nachfolgende Sequenzen) sowie intervenierende Sequenzen, sogenannte Introns, enthält, die sich zwischen den einzelnen codierenden Segmenten (sogenannten Exons) oder im Signalpeptid- oder nachfolgenden Bereich befinden. Der Signalpeptid-Bereich weist eine regulatorische Sequenz auf, die die Expression des Gens auf dem Niveau der Transkription und der Translation steuert. Die regulatorische Sequenz enthält einen Promotor. Der nachfolgende Bereich enthält Sequenzen, die bei der Termination der Transkription des Gens mitwirken und ggf. Sequenzen, die für die Polyadenylierung des Transkripts und des 3'-nicht-translatierten Bereichs verantwortlich sind.
Der Begriff "Teilsequenz" wird hier für eine Nucleotidsequenz verwendet, die von einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment oder Gen abgeleitet ist und eine charakteristische Nucleotid-Sequenz davon aufweist. Üblicherweise ist die Teilsequenz ein Teil einer in den Figuren 1 bis 5 angegebenen Nucleotid-Sequenz, d.h. sie ist einige Nucleotide kürzer als eine dieser Nucleotid-Sequenzen. Dabei ist die Teilsequenz entweder ein fortlaufender Abschnitt von Nucleotiden aus einer Nucleotid-Sequenz der Figuren 1 bis 5 oder sie ist aus einem oder mehreren getrennten Nucleotiden oder Nucleotid-Sequenzen einer Nucleotid-Sequenz aus den Figuren 1 bis 5 zusammengesetzt.
In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen bedeutet der Begriff "Teilsequenz" eine Nucleotid-Sequenz mit einer Länge von vorzugsweise mindestens 15 Nucleotiden, stärker bevorzugt mindestens 16 Nucleotiden, noch stärker bevorzugt mindestens 18 Nucleotiden, noch stärker bevorzugt mindestens 20 Nucleotiden und besonders bevorzugt mindestens 50 Nucleotiden. Bekanntlich können solche kleinen Fragmente bei PCR- Verfahren verwendet werden. In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Teilsequenz eine DNA-Sequenz, die mit einer beliebigen der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisiert und/oder ein Polypeptid mit α-Amylase-Aktivität codiert. In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform sind die DNA-Fragmente und Teilsequenzen von dicotyledonen Pflanzen abgeleitet. Besonders bevorzugt werden DNA-Fragmente und Teilsequenzen, die - berechnet als Durchschnitt des codierenden Bereiches - einen GC-Gehalt von 35 bis 50 %, vorzugsweise von 40 bis 50% aufweisen.
Der Begriff "Analogon" bezeichnet bei den erfindungsgemäßen DNA-Fragmenten eine Nucleotid-Sequenz, die ein Polypeptid codiert, das identisch oder im wesentlichen identisch mit dem von einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment codierten Polypeptid oder eine Teilsequenz davon ist. Es ist bekannt, daß dieselbe Aminosäure von unterschiedlichen Codons codiert werden kann. Die Verwendung der Codons hängt u.a. mit der Präferenz des fraglichen Organismus zusammen, der die Nucleotid-Sequenz exprimiert. Somit kann mindestens ein Nucleotid der Codons des erfindungsgemäßen DNA-Fragments durch andere ausgetauscht werden, die bei der Expression ein Polypeptid ergeben, das identisch oder im wesentlichen identisch mit dem vom betreffenden DNA-Fragment codierten Polypeptid ist. Die Sequenzen in den Figuren 1, 2 und 5 sind ein Beispiel analoger Sequenzen, die Sequenzen in Figuren 3 und 4 ein weiteres Beispiel. Außerdem betrifft der Begriff "Analogon" auch Variationen in der Sequenz, wie Substitutionen, Insertionen (einschließlich Introns), Additionen oder Umlagerungen von mindestens einem Nucleotid, wobei die Variationen keine wesentliche Auswirkung auf das von dem DNA-Fragment oder der Teilsequenz davon codierte Polypeptid haben. Der Begriff "Substitution" betrifft das Ersetzen von mindestens einem Nucleotid in der vollständigen Nucleotid-Sequenz durch mindestens ein anderes Nucleotid. Der Begriff "Addition" betrifft die Addition von mindestens einem Nucleotid an einem der Enden der vollständigen Nucleotid-Sequenz. Der Begriff "Insertion" betrifft den Einbau von mindestens einem Nucleotid in die vollständige Nucleotid-Sequenz. Der Begriff "Deletion" betrifft die Deletion von mindestens einem Nucleotid aus der vollständigen Nucleotid-Sequenz an einem der beiden Enden der Sequenz oder an irgendeinem geeigneten Punkt innerhalb derselben. Der Begriff "Umlagerung" betrifft den Austausch von zwei oder mehr Nucleotiden untereinander.
Die Begriffe "Fragment", "Sequenz", Teilsequenz" und "Analogon", wie sie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen hinsichtlich der erfindungsgemäßen Fragmente, Sequenzen, Teilsequenzen und Analoga verwendet werden, sind natürlich so zu verstehen, daß sie diese Phänomene in ihrer natürlichen Umgebung nicht umfassen, sondern beispielsweise in isolierter, gereinigter, in vitro oder rekombinanter Form.
Es werden die üblichen Abkürzungen für Nucleotide verwendet, d.h. A bedeutet Adenin, T bedeutet Thymidin, G bedeutet Guanin und C bedeutet Cytosin.
Das erfindungsgemäße DNA-Fragment, das eine im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 5 abgebildete Nucleotid-Sequenz enthält, läßt sich auch für die Diagnose verwenden, z.B. zur RFLP-Analyse, die zum Nachweis der Organisation von α- Amylase-codierenden Genen in verschiedenen Organismen, vorzugsweise Pflanzen (vgl. Beispiel 28), und/oder zur Identifizierung von Geweben des Organismus, die einen hohen Gehalt an α-Amylase-Genen und/oder mRNA ("Messenger RNA", Bote, Boten-RNA) haben und von Geweben, die keine solchen Gene und/oder mRNA haben. Die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente können auch für das Absuchen von züchtungsmaterial auf seinen Gehalt an α-Amylase-mRNA verwendet werden. Dadurch wird es möglich, in einem frühen Stadium zu bestimmen, ob das pflanzliche Züchtungsmaterial eine Tendenz zur Bildung von reduzierenden Zuckern aufweist. Die Bestimmung beruht auf einer Korrelation zwischen der α-Amylase-Aktivität und der Menge reduzierender Zucker in einer vorgegebenen Pflanze. In dieser Erfindung wurde erstmals erkannt, daß eine solche Korrelation besteht. Das frühe Absuchen von Züchtungsmaterial hat eine Reihe von Vorteilen und stellt einen neuen und sehr zweckmäßigen Ansatz zur Charakterisierung von Kartoffel-Zuchtmaterial im Hinblick auf den Stärkemetabolismus dar.
Ferner lassen sich die in den Figuren 1 und 2 gezeigten DNA- Fragmente zur Herstellung eines Polypeptids, z.B. einer Kartoffel-α-Amylase, mit Hilfe von DNA-Rekombinations-Verfahren verwenden. Das hergestellte Polypeptid ist eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform und kann in gleicher Weise wie die übliche α-Amylase verwendet werden, z.B. beim Brauen oder als Bestandteil von Detergens-Mitteln. Wie nachstehend erläutert, stellen die in den Figuren 3 und 4 gezeigten DNA- Sequenzen lediglich partielle Nucleotid-Sequenzen der Kartoffel-α-Amylase-mRNA und partielle Aminosäure-Sequenzen des Kartoffel-α-Amylase-Vorläufers dar. Jedoch lassen sich die noch fehlenden Gen-Bereiche, obwohl die vollständigen Sequenzen bisher nicht bestimmt wurden, aus durch Hybridisierung der α-Amylase-cDNA-Clone mit den Genbanken isolierten cDNA oder aus genomischen Genbanken erhalten.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Wie vorstehend beschrieben, wurden die in den Figuren 1 bis 5 dargestellten Nucleotid-Sequenzen aus einer Kartoffel- cDNA-Genbank erhalten. Genauer gesagt wurde die Nucleotid- Sequenz aus einer cDNA-Genbank erhalten, die aus Poly(A)- reicher RNA aus den Keimen einer Kartoffel (Solanum tuberosum) der Sorte Dianella, wie nachstehend unter "Material und Methoden" beschrieben, erhalten wurde. Im vorliegenden Zusammenhang sind die Begriffe "Kartoffel" und "Solanum tuberosum" austauschbar. Die von den in den Figuren 1 bis 4 gezeigten Nucleotid-Sequenzen codierten Polypeptide haben im wesentlichen die Aminosäure-Sequenzen der beiden unterschiedlichen α-Amylase-Typen von Solanum tuberosum der Sorte Dianella. Insbesondere codieren die Nucleotid-Sequenzen der Figuren 1 und 2 einen Typ der α-Amylase, während die Nucleotidsequenzen der Figuren 3 und 4 einen anderen Typ der α-Amylase codieren.
Die in Figur 1 gezeigte Nucleotid-Sequenz enthält ein langes, offenes Leseraster von 407 Codons, das beim Nucleotid 542 beginnt und beim Nucleotid 1761 endet. Das Leseraster codiert einen α-Amylase-Vorläufer. Der α-Amylase-Vorläufer enthält ein Signalpeptid, vermutlich codiert von den Nucleotiden 541 bis 595 und ein reifes α-Amylase-Enzym, vermutlich codiert von den Nucleotiden 596 bis 1761.
Außerdem enthält die in Figur 1 gezeigte Nucleotid-Sequenz nicht-codierende Bereiche, d.h. einen 5'-nicht-translatierten Bereich, eine sogenannte 5'-Signalsequenz, die eine Intron-Sequenz von 128 Nucleotiden (Nucleotide 297 bis 424) und einen 3'-nicht-translatierten Bereich enthält. Die in Figur 1 gezeigte Nucleotid-Sequenz wird in Beispiel 8 näher diskutiert.
Die in Figur 2 gezeigte Nucleotid-Sequenz enthält ein langes offenes Leseraster, das beim Nucleotid 2 beginnt und beim Nucleotid 1219 endet. Dieses Leseraster codiert einen α- Amylase-Vorläufer. Das reife α-Amylase-Enzym wird vermutlich von den Nucleotiden 53 bis 1219 codiert.
Wie in den Beispielen angegeben, wurden aus der Kartoffel- cDNA-Genbank unterschiedliche α-Amylase-cDNA-Clone erhalten. Einer davon enthielt kein Intron (Amy4) und einer davon (Amy3) enthielt ein Intron mit einer Länge von 128 Nucleotiden. Die Verteilung der Introns in α-Amylase-Genen, insbesondere Kartoffel-α-Amylase-Genen, ist nicht bekannt. Es wurde gezeigt, daß die α-Amylase-Gene in einer Gen-Familie zusammen angeordnet sind. Möglicherweise befindet sich darin jeweils nur ein Gen für jeden der beiden charakterisierten Typen von α-Amylase-Genen, die durch unterschiedliche Allele (Beispiel 16) repräsentiert werden. Innerhalb einer Genfamilie wird ein hoher Grad von Homologie zwischen den codierenden Bereichen der Gene erwartet, während eine geringere Homologie zwischen den nicht-codierenden Bereichen erwartet wird. Bei unterschiedlichen Allelen desselben Gens wird eine ausgeprägte Homologie bei allen Allelen erwartet.
Die Abfolge von Maßnahmen, durch die die in den Figuren 1 bis 5 angegebenen Nucleotid-Sequenzen aufgeklärt wurden, wird in den Beispielen 2 bis 6 erläutert. Aus den dort angegebenen Erklärungen wird deutlich, daß die Anordnung der Experimente für die Isolierung der die im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 5 angegebenen Nucleotid-Sequenzen enthaltenden cDNA-Clone sehr schwierig war. Somit ergibt sich aus Beispiel 5, daß die Häufigkeit positiver Clone, die aus der Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Genbank isoliert wurden, sehr gering ist, d.h. etwa 0,008%. Dies weist darauf hin, daß es für die Herstellung einer Kartoffel-cDNA-Genbank wichtig war, ein Gewebe zu wählen, in dem eine ausreichend große Menge α-Amylase-mRNA vorliegt. Außerdem war die Herstellung verwendbarer Gerste-α-Amylase-Sondenmoleküle gemäß Beispiel 2 wesentlich, insbesondere im Hinblick auf die Konstruktion eines Sondenmoleküls, das optimale Hybridisierungs-Eigenschaften mit den cDNA-Clonen aufweist, die aus Kartoffel-α- Amylase-mRNA erhalten wurden. Ein solches Sondenmolekül wurde konstruiert. Dies ergibt sich daraus, daß alle mit dem Sondenmolekül hybridiserenden Clone die gewünschte α- Amylase-Nucleotid-Sequenz aufwiesen. Außerdem war es wichtig, geeignete Hybridisierungs-Bedingungen zu wählen, die nicht zu zuvielen positiven Sequenzen (dies führt zu "schwarzen" Filtern, mit denen keine deutlichen Ergebnisse erhalten werden können) oder zu Filtern führen, bei denen überhaupt keine Hybridisierung erfolgt ist. Die Hybridisierungs-Bedingungen gestatten die Isolierung von zwei Formen von Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Clonen, die so unterschiedlich sind, daß sie unter normalen Bedingungen nicht kreuzhybridisieren. Außerdem wurde bei der Hybridisierung anstelle von Lachsspermien-DNA E. coli-DNA als Träger verwendet. Lachsspermien-DNA ist der überlicherweise verwendete Träger. Die Verwendung von E. coli DNA ist sehr vorteilhaft, da die Hintergrundsignale minimiert oder im wesentlichen vermieden werden.
Es wurde gefunden, daß die Fragmente mit dem höchsten Hybridisierungsgrad in bezug auf Gerste-α-Amylasegene DNA-Fragmente waren, welche die in Fig. 1 gezeigten Nucleotide 1330- 1624 oder die in Fig. 4 gezeigten Nucleotide 387-591 umfassen. Es wird daher erwartet, daß diese oder ähnliche Fragmente bei der Isolierung von α-Amylasegenen aus verchiedenen dicotyledonen Pflanzen außer der Kartoffel von besonderem Wert sein können.
Das ausgehend von einem DNA-Fragment, enthaltend die Nucleotide 541 bis 1761 der in Figur 1 dargestellten Nucleotid-Sequenz oder einer Teilsequenz oder einem Analogon davon exprimierte Polypeptid ist ein α-Amylase-Vorläufer, d.h. es enthält das reife α-Amylase-Enzym sowie ein Signalpeptid, die durch eine Spalt- oder Prozessierungs-Stelle getrennt sind. Das Signalpeptid dient der Vermittlung des Transports des Vorläufers durch Membranen, d.h. aus der Zelle oder dem Gewebe heraus, in denen er gebildet wird. Wie in Beispiel 13 beschrieben ist die Struktur des Signalpeptids untypisch, möglicherweise aufgrund eines unüblichen Transport-Mechanismus. Der α-Amylase-Vorläufer ist eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung.
Die Nucleotide 956 bis 1761 der in Figur 1 angegebenen Nucleotid-Sequenz codieren vermutlich ein reifes α-Amylase- Enzym, d.h. ein Enzym ohne ein Signalpeptid. Zwar wird davon ausgegangen, daß das α-Amylase-Enzym meistens als Vorläufer hergestellt wird, d.h. ein Signalpeptid enthaltend, das beim Prozessieren des Vorläufers im ihn herstellenden Organismus abgespalten werden kann, wodurch das reife α-Amylase-Enzym entsteht, jedoch kann die reife α-Amylase auch direkt hergestellt werden.
Somit betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein DNA-Fragment, das im wesentlichen die Nucleotid-Sequenz enthält, die beim Nucleotid 596 der in Figur 1 angegebenen Nucleotid-Sequenz beginnt und beim Nucleotid 1761 davon endet, oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon.
Ferner betrifft die Erfindung ein DNA-Fragment, das im wesentlichen eine beim Nucleotid 53 beginnende und beim Nucleotid 1219 endende Nucleotid-Sequenz der in Figur 2 gezeigten Nucleotid-Sequenz, die eine Kartoffel-α-Amylase codiert, oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon enthält. Außerdem betrifft die Erfindung ein DNA-Fragment, das im wesentlichen eine beim Nucleotid 6 beginnende und beim Nucleotid 1052 endende Nucleotidsequenz der in Figur 3 gezeigten Nucleotid-Sequenz, die eine partielle Kartoffel-α- Amylase codiert, oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon enthält. Ferner betrifft die Erfindung ein DNA-Fragment, das im wesentlichen eine Nucleotid-Sequenz enthält, die beim Nucleotid 3 der in Figur 4 gezeigten Nucleotid-Sequenz beginnt, die eine partielle Kartoffel-α-Amylase codiert, und beim Nucleotid 647 davon endet, oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon enthält.
Das erfindungsgemäße DNA-Fragment ist vorzugsweise ein DNA- Fragment, das zu einer in den Figuren 1 bis 5 gezeigten Nucleotid-Sequenz oder einem Analogon oder einer Teilsequenz davon homolog ist, d.h. eines, das mit der DNA-Sequenz unter üblichen Hybridisierungsbedingungen (12) oder unter Bedingungen niedriger Stringenz wie z.B. 6 x SSC und 67ºC und anschließendem Abwaschen mit 4 x SSC und 67ºC hybridisiert und das einen GC-Gehalt im Bereich von vorzugsweise etwa 35 bis 50%, und besonders bevorzugt von etwa 40 bis 50 % hat. Der Begriff "Homologie" bezeichnet dabei das Vorliegen eines beliebigen Ausmaßes von Komplementarität zwischen einem gegebenen Sondenmolekül und der analysierten Nucleinsäure-Spezies. Das minimal nachweisbare Ausmaß von Homologie ist eine Funktion der während der Hybridisierung angewendeten experimentellen Bedingungen und der Charakteristika des Sondenmoleküls der analysierten Nucleinsäure-Spezies. Daher sind die Größe des Sondenmoleküls sowie die Komplexität der isolierten Nucleotid-Sequenz wichtig, z.B. im Hinblick auf Reinheit, Gehalt an anderen Nucleinsäure-Sequenzen als den mit α-Amylase-Genen verwandten, etc. Wie in den Beispielen beschrieben, findet man Sequenzen, die homolog zu den in den Figuren 1 bis 4 gezeigten, Kartoffel-α-Amylase-codierenden Nucleotid-Sequenzen sind, in anderen Organismen als den untersuchten, z.B. in anderen Kartoffelsorten oder in anderen dicotyledonen Pflanzen der nachstehend erwähnten Typen. Die Erfindung soll auch diese Nucleinsäure-Sequenzen einschließen. Somit lassen sich entsprechende α-Amylase-codierende Nucleotid-Sequenzen aus anderen dicotyledonen Pflanzen, wie anderen Pflanzen der Familie Solanaceae, z.B. anderen Kartoffelsorten, leicht durch Hybridisierung unter den vorstehend angegebenen Bedingungen mit einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment isolieren, das im wesentlichen eine wie in Figur 1 angegebene Nucleotid-Sequenz oder ein Analogon oder eine Teilsequenz davon enthält.
Ferner betrifft die Erfindung ein DNA-Fragment, das ein α- Amylase-Pseudogen ist. Der Begriff "α-Amylase-Pseudogen" betrifft ein ursprünglich aktives α-Amylase-Gen, das so mutiert ist, z.B. durch Substitutionen oder Deletionen, daß es nicht mehr aktiv ist, jedoch durch Hybridisierung mit einem DNA-Fragment, enthaltend eine Nucleotid-Sequenz, im wesentlichen wie in Figur 1 bis 4 angegeben, oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon, als α-Amylase-Gen identifiziert werden kann. Die in Figur 5 angegebene cDNA-Sequenz ist ein Beispiel für das Produkt eines aktiven Pseudogens.
Die α-Amylase-Pseudogene sind, wie nachstehend für die richtigen Gene erläutert, verwendbar.
Wie nachfolgend in den Beispielen beschrieben, können die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente durch ein Verfahren isoliert werden, das die folgenden Schritte umfaßt:
Herstellung einer cDNA-Genbank aus Poly(A)-reicher RNA, die aus dem Gewebe einer dicotyledonen Pflanze isoliert worden ist, vorzugsweise aus Poly(A)-reicher RNA aus einem Gewebe einer Kartoffelpflanze, in einem Vektor, vorzugsweise einem λ-Vektor, vorzugsweise dem λ-ZAP-Vektor;
Absuchen der cDNA-Genbank durch Hybridisierung mit einer Sonde, welche eine Weizen-α-Amylase-Gensequenz umfaßt, unter Hybridisierungsbedingungen, die die Hybridisierung erlauben, ohne daß eine starke Hintergrundhybridisierung stattfindet, die jedoch gleichzeitig den Nachweis einer schwachen Hybridisierung erlauben; und
Isolierung rekombinanter Clone, die mit der Sonde hybridisieren, Erhalten des DNA-Fragments aus den isolierten Clonen, und gegebenenfalls Herstellung einer Teilsequenz des DNA-Fragments durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym.
Die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente können zur Isolierung ähnlicher DNA-Fragmente aus verschiedenen dicotyledonen Pflanzen mit einem Verfahren verwendet werden, das die folgenden Schritte umfaßt:
Herstellung einer cDNA-Genbank aus Poly(A)-reicher RNA, die aus dem Gewebe einer dicotyledonen Pflanze isoliert worden ist, vorzugsweise aus Poly(A)-reicher RNA aus einem Gewebe einer Kartoffelpflanze, in einem Vektor, vorzugsweise einem λ-Vektor, vorzugsweise dem λ-ZAP-Vektor;
Absuchen der cDNA-Genbank durch Hybridisierung mit einer Sonde, die ein DNA-Fragment, das wie vorstehend beschrieben erhältlich ist; und
Isolierung rekombinanter Clone, die mit der Sonde hybridisieren, Erhalten des DNA-Fragments aus den isolierten Clonen, und gegebenenfalls Herstellung einer Teilsequenz des DNA-Fragments durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym.
Die vorstehend beschriebenen DNA-Fragmente können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Aufbau der Oligonucleotidsequenz des Fragments durch Oligonucleotidsynthese. Das erfindungsgemäße DNA-Fragment, welches Teil eines ein Fusionsprotein codierenden Fragmentes ist, kann durch Ligierung eines erfindungsgemäßen DNA-Fragments, das wie vorstehend beschrieben erhältlich ist, mit einem zweiten DNA-Fragment, das ein zweites Polypeptid oder einen Teil davon codiert, hergestellt werden, vorzugsweise unter Verwendung von DNA-Ligase.
Aus der vorstehenden Beschreibung ergibt sich, daß die in den Figuren 1 bis 5 gezeigten Nucleotid-Sequenzen von einer dicotyledonen Pflanze, nämlich einer Kartoffel der Sorte Dianella, abgeleitet sind. Obwohl Nucleotid-Sequenzen, die von anderen Pflanzen isoliert werden können, insbesondere von anderen Kartoffelsorten als der Sorte Dianella, eine andere Sequenz haben können, wird erwartet, daß sie in einem Ausmaß mit einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment homolog sind, das erlaubt, daß sie bei den vorstehend angegebenen Hybridisierungsbedingungen mit einem DNA-Fragment hybridisieren können, das eine im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 5 angegebene Nucleotid-Sequenz enthält. Wie vorstehend erwähnt, sind diese Nucleotid-Sequenzen eine erfindungsgemäße Ausführungsform. Üblicherweise werden mit diesen erfindungsgemäßen DNA-Fragmenten hybridisierende Nucleotid-Sequenzen in Pflanzen der Familie Solanaceae gefunden, insbesondere in der Gattung Solanum, insbesondere Solanum tuberosum oder S. melongena (Aubergine). Andere Beispiele sind Pflanzen der Gattung Lycopersicon, z.B. Lycopersicon esculentum (Tomate), der Gattung Capsicum, z.B. Capsicum annuum (Pfeffer), der Gattung Nicotiana, z.B. Nicotiana tabacum (Tabak), der Gattung Ipomoea, Z.B. Ipomoea batatus (Süßkartoffel), der Gattung Brassica, z.B. Brassica napus (Rübsamen), der Gattung Medicago, insbesondere Medicago sativa (Lucerne), der Gattung Trifolium spp. (Klee), Glycine max (Sojabone), der Gattung Arachis, insbesondere Arachis hypogaea (Erdnuß), Phaseolus spp., Vicia spp., Vigna spp. (Bohnen), der Gattung Pisum, insbesondere Pisum sativum, Wurzelnutzpflanzen, wie der Gattung Beta, insbesondere Beta vulgaris (Zuckerrübe) und der Gattung Daucus, insbesondere Daucus carota (Karotten).
Ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment kann mindestens eine zweite Nucleotid-Sequenz enthalten, die ein zweites Polypeptid oder einen Teil davon codiert, so daß ein Fusionsprotein codiert wird, bei dem mindestens ein Teil des erfindungsgemäßen DNA-Fragments zusammen mit einem anderen DNA-Fragment oder Gen exprimiert wird. Für bestimmte Zwecke kann es wünschenswert sein, daß das vom erfindungsgemäßen DNA-Fragment codierte Polypeptid als Fusionsprotein vorliegt, d.h. ein Protein, in dem ein Polypeptid mit einer im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 7 gezeigten Aminosäure-Sequenz oder ein Fragment oder Analogon davon mit einem zweiten Polypeptid fusioniert ist. Es kann vorteilhaft sein, daß das zweite Polypeptid ein zu den Eigenschaften des Fusionsproteins beisteuerndes ist, z. B. dadurch, daß es die Aktivität, wie die enzymatische Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids durch Modifizierung, beispielsweise herabsetzt oder erhöht. Ferner kann ein Fusionsprotein zwei oder mehr enzymatische Aktivitäten haben, wobei eine eine α-Amylase-Aktivität und die andere(n) eine α-Amylase-Aktivität oder eine enzymatische Aktivität ist, die z. B. normalerweise zusammen mit einer α-Amylase verwendet wird. Somit werden, wie vorstehend für die Herstellung von Alkohol beschrieben, mehrere unterschiedliche Enzyme verwendet, d.h. mindestens eine Cellulase und β-Glucosidase. Somit kann ein Fusionsprotein mit einer α-Amylase-Aktivität zusammen mit einer Cellulase- und/oder β-Glucosidase-Aktivität vorteilhaft für die Herstellung von Alkohol sein. Außerdem können die erfindungsgemäßen DNA- Fragmente oder Teile davon mit einem Polypeptid fusioniert sein, das den Transport aus Zellen oder Geweben heraus veranlaßt, z. B. sogenannte Exoenzyme. Am Transport beteiligte Signalpeptide werden nachstehend genauer beschrieben.
Das Fusionsprotein kann funktionieren, wenn es in einem höheren Organismus, wie einer Pflanze, exprimiert wird, kann aber auch nützlich sein bei der Expression in niederen Organismen, wie Bakterien oder Hefen. Somit kann bei der Herstellung des Polypeptids durch DNA-Rekombinations-Verfahren, z.B. wie nachstehend beschrieben, die Gewinnung oder Isolierung des Polypeptids leichter und wirtschaftlicher sein, wenn das zu gewinnende Polypeptid ein Fusionsprotein ist. Das zweite Polypeptid, mit dem das vorstehend definierte Polypeptid fusioniert ist, kann eines sein, das antigene Determinanten enthält, gegen die Antikörper gezüchtet werden können, wobei die Antikörper zur Gewinnung des Fusionsproduktes verwendet werden können, z.B. nach den Prinzipien der Chromatographie, wie Affinitätschromatographie, bei denen Polypeptide mit Hilfe immobilisierter Antikörper gewonnen werden können. Verfahren zur Isolierung des Polypeptides werden nachstehend genauer beschrieben.
Wie vorstehend und in den anschließenden Beispielen beschrieben, wurden die in den Figuren 1 bis 5 gezeigten Nucleotid-Sequenzen aus einer cDNA-Genbank erhalten, die mit aus der Kartoffelsorte Dianella isolierter mRNA konstruiert wurde. Auf diese Weise lassen sich andere Sequenzen, entweder Teilsequenzen, analoge oder homologe Sequenzen, des DNA- Fragments, enthaltend eine wie in den Figuren 1 bis 5 angegebene Sequenz aus einem anderen Organismus oder demselben Organismus gewinnen, die eine andere als die in den Figuren 1 bis 5 angegebene α-Amylase codieren. Dabei gelten die vorstehend angegebenen Definitionen für die verwendeten Begriffe. Homologe Nucleotid-Sequenzen lassen sich aus komplementärer cDNA erhalten, die durch Herstellung einer cDNA- Genbank als Grundlage der mRNA eines α-Amylase-bildenden Organismus hergestellt wurde, z. B. durch Anwendung eines Verfahrens, das ähnlich dem zur Isolierung der in den Figuren 1 bis 5 angegebenen Nucleotid-Sequenz ist. In einer anderen Ausführungsform können die Nucleotid-Sequenzen, z.B. wie nachstehend beschrieben, vom Genom eines α-Amylase-bildenden Organismus durch Absuchen nach genomischen Sequenzen, die mit einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment hybridisieren, abgeleitet werden. Dies kann durch Erstellen einer genomischen Genbank der Pflanze, z.B. der Kartoffel, und Absuchen nach α-Amylase-Clonen durch Hybridisierung mit einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment erfolgen. Erfindungsgemäße DNA-Fragmente, enthaltend eine im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 5 angegebene Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon, können auch synthetische DNA sein, die in üblicherweise durch DNA-Synthese hergestellt wurde.
Die meisten eukaryontischen Gene enthalten Introns, die sich, wie vorstehend beschrieben, in Größe, Zusammensetzung und Lage von Genen derselben Genfamilie unterscheiden können. Daher können α-Amylase-Gene oder DNA-Fragmente, die Teile davon bilden, Introns unterschiedlicher Größe, Zusammensetzung und Lage enthalten. Diese Introns können sich von den in Figur 1 angegebenen unterscheiden. Somit betrifft die Erfindung auch ein DNA-Fragment, enthaltend eine wie in Figur 1 gezeigte Nucleotid-Sequenz oder ein Analogon oder eine Teilsequenz davon, insbesondere den Teil der Sequenz, der eine reife α-Amylase codiert, d.h. der den Nucleotiden 596 bis 1761 der in Figur 1 gezeigten Sequenz entspricht, wobei das DNA-Fragment ferner mindestens einen nicht-codierenden Bereich, wie mindestens eine regulatorische Sequenz und/oder Intron enthält. In diesem Zusammenhang wird der Begriff "Intron" in seiner üblichen Bedeutung verwendet, d.h. als DNA-Segment, das transkribiert, aber nicht translatiert wird, da es durch das Zusammenspleißen von RNA-Sequenzen entfernt wird, die von den DNA-Sequenzen auf beiden Seiten des Introns transkribiert wurden. Ein Intron kann eine Vielzahl von Größen aufweisen. In Pflanzen hat es üblicherweise eine Größe von etwa 50 bis 500 Nucleotiden. Ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment kann ebenso einen oder mehrere 5'- oder 3'-nicht-translatierte Bereiche enthalten. Diese müssen immer vorhanden sein, um eine Expression des Gens oder der DNA-Sequenz zu erhalten, die dazwischen liegt. Die 5'- und 3'-nicht-translatierten Bereiche sind spezifisch für die das DNA-Fragment oder Gen exprimierenden Organismen. Dementsprechend sollte der α-Amylase-codierenden Sequenz ein 5'-nicht- translatierter Bereich vorausgehen, und ein 3'-nicht-translatierter Bereich sollte darauf folgen, um die Expression in dem Organismus zu ermöglichen. Der nicht-translatierte Bereich kann ein natürlicherweise in der Sequenz vorkommender sein oder einer, der anstelle der oder zusätzlich zu den in den Figuren 1 bis 4 angegebenen 5'- und/oder 3'-nicht-translatierten Bereichen synthetisch eingebaut wurde, wobei sich die Bereiche in Zusammensetzung und/oder Länge unterscheiden können, und zwar vorzugsweise so, daß die speziellen Anforderungen des Organismus erfüllt werden, der das erfindungsgemäße DNA-Fragment exprimiert.
Wie vorstehend erläutert, enthält die in Figur 1 gezeigte Nucleotid-Sequenz eine ein Signalpeptid codierende Sequenz, die außergewöhnlich in Zusammenssetzung und Länge ist. Ferner wird darauf hingewiesen, daß AmyZ3/4 und AmyZ7 identische Signalpeptide codieren, außer daß AmyZ7 ein Met-Initiationscodon fehlt. Die Art eines bei einem vorgegebenen Organismus verwendeten Signalpeptides hängt u.a. vom Organismus und dem Teil davon ab, z.B. der speziellen Zelle oder des speziellen Gewebes, in dem das Polypeptid (auch Vorläufer) hergestellt wird, und zu welchem Teil derselben Zelle oder zu welcher anderen Stelle im Organismus das Polypeptid gegebenenfalls transportiert werden soll. Somit kann ein die in Figur 1 angegebenen Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon, insbesondere die Nucleotide 596 bis 1761 der Sequenz enthaltendes DNA-Fragment ein anderes Signalpeptid als das der in Figur 1 angegebene Nucleotid-Sequenz aufweisen, so daß ein Vorläufer-Protein entsteht, das sich von dem von der in Figur 1 angegebenen Nucleotid-Sequenz codierten unterscheidet. Das Signalpeptid kann so ausgewählt werden, daß es den speziellen Anforderungen des den Vorläufer herstellenden Organismus gerecht wird, einschließlich eines gewünschten anschließenden Transports des Vorläufers innerhalb des Organismus. Übliche Signalpeptide haben einen Kernbereich aus hydrophoben Aminosäuren, und somit enthält das erfindungsgemäße DNA-Fragment vorzugsweise einen Bereich von Codons, der hydrophobe Aminosäuren codiert.
Die Expression von Genen ist in allen Organismen einer Regulation unterworfen, die in Pflanzen üblicherweise sehr kompliziert ist. Dabei wirkt ein Netzwerk unterschiedlicher regulatorischer Systeme und Faktoren zusammen. Obwohl derzeit nur wenig über die Regulation von Pflanzen bekannt ist, wurden unterschiedliche regulatorische Mechanismen aufgeklärt, wobei wichtige Regulationsformen die Gewebe-spezifische Regulation und die Entwicklungsregulation sind. Um die Expression eines erfindungsgemäßen DNA-Fragments oder Gens, enthaltend dieses DNA-Fragment, zu ändern, läßt sich eine regulatorische Sequenz funktionell mit dem DNA-Fragment oder Gen verbinden, so daß eine Expression des Fragments oder Gens unter der Kontrolle der inserierten regulatorischen Sequenz erzielt wurde. Dementsprechend betrifft die Erfindung auch ein DNA-Fragment, das eine im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 4 angegebene Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon und außerdem mindestens eine regulatorische Sequenz enthält. Üblicherweise ist die regulatorische Sequenz ein konstitutiver oder regulierbarer Promotor. Der Begriff "Promotor" bezeichnet eine kurze DNA-Sequenz, an die die RNA-Polymerase vor der Transkription der DNA, an die der Promotor funktionell gebunden ist, bindet, so daß die Transkription ablaufen kann. In seiner breiteren Bedeutung betrifft der Begriff "Promotor" aber auch RNA-Polymerase-Bindungsstellen sowie regulatorische Sequenzelemente, die bis zu mehrere hundert Basenpaare von der Transkriptions-Startstelle und gelegentlich sogar weiter davon entfernt liegen. Ein "konstitutiver Promotor" ist ein Promotor, der im wesentlichen keiner Regulation, wie Induktion oder Repression unterworfen ist, aber eine kontinuierliche und im wesentlichen unveränderte Transkription der DNA-Sequenz gestattet, mit der er funktionell verbunden ist, und zwar in allen aktiven Zellen des Organismus, vorausgesetzt daß andere Anforderungen für den Ablauf der Transkription erfüllt sind.
Ein "regulierbarer Promotor" ist ein Promotor, dessen Funktion durch mindestens einen Faktor reguliert wird. Diese Faktoren sind entweder solche, die durch ihr Vorliegen die Expression eines erfindungsgemäßen DNA-Fragments gewährleisten oder die die Expression des DNA-Fragments supprimieren, so daß ihre Abwesenheit die Expression der DNA-Sequenz hervorruft. Somit können der Promotor und ggf. die damit assoziierten regulatorischen Sequenzen durch das Vorliegen oder die Abwesenheit von mindestens einem Faktor aktiviert werden, der die Transkription des DNA-Fragments beeinflußt, das eine im wesentlichen wie in Figur 1 angegebene Nucleotid-Sequenz oder ein Analogon oder eine Teilsequenz davon enthält.
Andere Formen regulatorischer Sequenzen sind stromaufwärts und stromabwärts gelegene Sequenzen, die bei der Kontrolle der Transkriptions-Termination und beim Entfernen von Introns mitwirken, sowie für die Polyadenylierung und Initiation der Translation verantwortliche Sequenzen. Wenn die regulatorische Sequenz in einer Pflanze, wie einer dicotyledonen Pflanze, Z.B. einer Kartoffelpflanze, funktionieren soll, ist eine solche regulatorische Sequenz vorzugsweise eine von einer dicotyledonen Pflanze abgeleitete, z.B. eine von einem α-Amylase-Gen abgeleitete.
Die die Aktivität eines Promotors regulierenden Faktoren können sich unterscheiden, u.a. durch den verwendeten Promotor sowie den Organismus, in dem er funktionieren soll. Eine Gewebe-spezifische Regulation läßt sich durch bestimmte intrinsische Faktoren regulieren, die die Expression von Genen sicherstellen, die bestimmte Gewebe-spezifische Proteine codieren. Solche Faktoren gibt es in Säugern und Pflanzen, so daß sich spezifische Gewebe entwickeln können. Eine geringe Anzahl Gewebe-spezifischer Sequenzen wurde beschrieben. Dazu gehört der Patatin-Promotor, der in Knollen und zu einem geringeren Ausmaß in Blättern von Kartoffelpflanzen arbeitet. Der Patatin-Promotor ist ein starker Promotor und wird in (44) näher beschrieben.
Eine andere, aufgeklärte Promotorform ist ein von einem Pflanzenvirus abgeleiteter Promotor, z.B. ein CaMV ("cauliflower mosaic virus")-Promotor. Dies ist ein starker konstitutiver Promotor.
Andere Promotoren lassen sich vom Ti-Plasmid ableiten, wie der Octopin-Synthase-Promotor, der Nopalin-Synthase-Promotor, der Mannopin-Synthase-Promotor und Promotoren von anderen offenen Leserastern in der T-DNA wie ORF7.
Im allgemeinen ist es vorteilhaft, einen aus dem fraglichen Wirtsorganismus isolierten Promotor zu verwenden, um sicherzustellen, daß die Promotoren vom Wirtsorganismus akzeptiert werden, obwohl ein Promotor aus derselben Unterklasse von Organismen, Z.B. Dicotyledonen, in der Regel genau und wirksam arbeitet. Die regulatorische Sequenz kann ein α-Amylase- Promotor sein, d.h. ein Promotor, der natürlicherweise in Verbindung mit α-Amylase-Genen gefunden wird und an ihrer Transkription beteiligt ist. Ein α-Amylase-Promotor läßt sich aus einem isolierten α-Amylase-Gen erhalten, das durch Hybridisierung, z.B. wie nachstehend genauer beschrieben, mit einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment erhalten werden kann, welches eine im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 5 gezeigte Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon enthält. Üblicherweise sollte der α-Amylase- Promotor vom selben Organismus erhalten werden, in dem er funktionieren soll. Er kann aber auch aus einem anderen Organismus, vorzugsweise derselben Unterklasse, erhalten werden. Gegebenenfalls und sofern gewünscht läßt sich der natürliche Promotor für den Anwendungszweck modifizieren, z.B. durch Modifikationen der Promotor-Nucleotid-Sequenz, so daß ein in anderer Weise als der natürliche Promotor arbeitender Promotor erhalten wird, z.B. ein schwächerer oder ein stärkerer. Somit wäre ein α-Amylase-Promotor geeignet für die Konstruktion einer transgenen Kartoffelpflanze (dies wird nachstehend genauer beschrieben).
Eine bestimmte α-Amylase-Grundaktivität wird benötigt, um bestimmten Pflanzen Wachstum und Entwicklung zu ermöglichen und um ihre wesentlichen Stoffwechselfunktionen durchzuführen. Somit müßten beim Entwerfen neuer Pflanzenkonstrukte, insbesondere neuer Kartoffelpflanzen-Konstrukte, in denen eine verminderte α-Amylase-Aktivität gewünscht wird, die Konstrukte vorzugsweise so entworfen werden, daß eine niedrigere Expression der α-Amylase im Vergleich zur Expression in der natürlichen Pflanze erhalten wird, während aber ein Expressionsniveau beibehalten wird, das zur Absicherung der für Wachstum und Entwicklung der Pflanze wesentlichen Stoffwechselfunktionen ausreicht. Dies trifft beispielsweise bei der Konstruktion transgener Kartoffeln zur Verwendung bei der Herstellung von Kartoffelchips zu.
Ein Verfahren zum Absenken der Expression der intrinsischen α-Amylase in einer Pflanze wirkt auf dem Niveau der Translation. Dies läßt sich erzielen durch Bereitstellung einer anti-sense-RNA, die die Translation einer vom intrinsischen α-Amylase-Gen codierten mRNA inhibiert, wobei die antisense-RNA eine Nucleotid-Sequenz enthält, die im wesentlichen eine im Verhältnis zu den in den Figuren 1 bis 5 gezeigten oder einer Teilsequenz oder eines Analogons davon entgegengesetzte Orientierung hat. Die Begriffe "intrinsische α-Amylase" bzw. "intrinsische α-Amylase-Gene" betreffen in Pflanzen natürlicherweise häufig vorkommende α-Amylase- Enzyme und α-Amylase-Gene, wobei es mehrere davon geben kann.
Wie nachstehend in Beispiel 7 näher beschrieben repräsentieren die in den Figuren 1 bis 5 angegebenen Nucleotid-Sequenzen zwei stark unterschiedliche Typen von cDNA-Clonen. Ein Typ wird durch die Clone AmyZ3/4, AmyZ7 und AmyZ2 (Figuren 1, 2 und 5; "AmyZ3/4-Typ") und der andere Typ durch die Clone AmyZ1 und AmyZ6 (Figuren 3 und 4; "AmyZ1-Typ") repräsentiert. Die Nucleotid-Sequenz-Homologie zwischen diesen Clonen der beiden Typen ist niedrig, etwa 55 bis 60%. Deshalb kann die Translation der mRNA von einem der beiden Typen unabhängig vom anderen verhindert werden, da die beiden Typen so unterschiedlich sind (andererseits ist die Homologie innerhalb jeder der beiden Typen sehr hoch, weit über 90%). Um die Translation der mRNA beider DNA-Typen zu verhindern, müssen Konstrukte mit zwei Typen von anti-Messenger-Genen hergestellt werden (vgl. Beispiel 24). Dabei ist die Tatsache, daß die Clone AmyZ1 und AmyZ6 nicht vollständig sind, verhältnismäßig uninteressant.
Somit wird in einer Ausführungsform der Erfindung ein DNA- Fragment bereitgestellt, das eine anti-sense-RNA codiert, d.h. ein mRNA-Molekül, das zur Hybridisierung mit einer von den intrinsischen α-Amylase-Genen transkribierten mRNA fähig ist und dadurch die Translation davon inhibiert. Die Expression der die anti-sense-RNA codierenden Nucleotid-Sequenz kann entweder konstitutiv oder reguliert sein.
Vorzugsweise ist ein anti-sense-RNA-Molekül codierendes DNA- Fragment im wesentlichen komplementär zu einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment, so daß eine wirksame Hybridisierung der beiden RNA-Moleküle bereitgestellt wird, wodurch eine wirksame Hemmung der Translation einer α-Amylase-mRNA in α- Amylase erzielt wird. Das ein anti-sense-RNA-Molekül codierende DNA-Fragment weist vorzugsweise eine Größe auf, die eine ausreichende Homologie zwischen der anti-sense-RNA und der mRNA, mit der sie hybridisieren soll, gewährleistet, z.B. den komplementären Strang einer vollständigen Sequenz einer der Figuren 1 bis 5. Im allgemeinen sollte das DNA- Fragment so lang wie möglich sein. Daraus ergibt sich eine hohe Wahrscheinlichkeit der Kollision und somit der Hybridisierung zwischen der davon transkribierten RNA und mRNA, mit der diese hybridisieren soll. Die anti-sense-Regulation in Pflanzen wird ferner in (59), (60) und (61) beschrieben.
Wie vorstehend erläutert, betrifft die Erfindung auch von einem wie vorstehend definierten DNA-Fragment codierte Polypeptide, d.h. von einem DNA-Fragment, das eine im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 4 abgebildete Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon enthält oder ein damit unter den vorstehend angegebenen Hybridisierungsbedingungen hybridisierendes DNA-Fragment. Die Erfindung betrifft ferner Analoga oder Fragmente des Polypeptids.
Der Begriff "Analogon" betrifft im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden Proteine oder Polypeptide mit einer ähnlichen Aminosäure-Zusammensetzung und -Sequenz wie der in Figur 1 oder 2 gezeigten Aminosäure-Sequenz der α- Amylase aus Solanum tuberosum, wobei geringfügige Abweichungen in der Aminosäure-Sequenz gestattet sind, z.B. Substitutionen, Deletionen, Additionen, Insertionen oder Umlagerungen von einer oder mehreren Aminosäuren im Polypeptid, die keine wesentliche Beeinträchtigung der enzymatischen Eigenschaften des Polypeptids im Vergleich zum in den Figuren 1 und 2 gezeigten Polypeptid haben. Die Begriffe "Substitution", "Insertion", "Addition" und "Umlagerung" wurden vorstehend bei der Beschreibung der erfindungsgemäßen DNA-Fragmente erklärt und sind hier entsprechend anzuwenden. Unterschiede in den Kohlenhydratresten etc., die keine nachteilige Auswirkung auf die enzymatischen Eigenschaften des Analogons haben, werden ebenfalls vom Begriff "Analogon" erfaßt. Der Begriff "Analogon" umfaßt den Begriff "Homolog" in seiner üblichen Bedeutung, d.h. ein entwicklungsmäßig verwandtes Protein oder Polypeptid. Das analoge Polypeptid oder Protein kann von einem anderen Organismus als Solanum tuberosum abgeleitet sein, Z.B. von einer anderen dicotyledonen Pflanze, oder kann partiell oder vollständig synthetischen Ursprungs sein. Der Begriff bedeutet auch jede beliebige enzymatische Teilsequenz und jedes beliebige funktionelle Äquivalent oder Derivat einer wie in Fig. 1 oder 2 angegebenen Aminosäure-Sequenz. Der Begriff "enzymatische Teilsequenz" bezeichnet eine Aminosäure-Sequenz, die mindestens ein aktives Zentrum des α-Amylase-Enzyms aufweist. Der Begriff "aktives Zentrum" betrifft den Teil der Aminosäure-Sequenz, der direkt oder indirekt an der Umwandlung von Stärke zu reduzierendem Zucker beteiligt ist, d.h. an der Hydrolyse von α-1,4-Bindungen in der Stärke.
Der Begriff "funktionelles Äquivalent" betrifft alle enzymatisch aktiven Substanzen mit der Fähigkeit, Stärke in reduzierende Zucker, wie Glucose und Fructose, in einer ähnlichen Weise wie α-Amylase umzuwandeln, d.h. α-1,4-Bindungen zu hydrolysieren. Das funktionelle Äquivalent kann von einem anderen Organismus als Solanum tuberosum abgeleitet sein, z.B. von einer anderen dicotyledonen Pflanze, oder kann partiell oder vollständig synthetischen Ursprungs sein. Es wird darauf hingewiesen, daß die Ähnlichkeiten zwischen den Aminosäure-Sequenzen von α-Amylase aus Solanum tuberosum, wie in Fig. 1 und 2 angegeben, und dem funktionellen Äquivalent mehr qualitativ als quantitativ sind, was eher von der Art als vom Ausmaß der Aktivität des funktionellen Äquivalents abhängt.
Die Erfindung betrifft auch von dicotyledonen Pflanzen abgeleitete Polypeptide mit einer hohen Homologie, üblicherweise mindestens etwa 60 %, z.B. mindestens etwa 70 %, mit einer, wie in einer der Fig. 1 - 4 angegebenen, Aminosäure-Sequenz einer Kartoffel-α-Amylase. Der Begriff "Homologie" betrifft das Vorliegen irgendeiner Form von Ähnlichkeit zwischen einer gegebenen Aminosäure-Sequenz und einer in den Fig. 1 - 4 dargestellten Aminosäure-Sequenz. Natürlich hängt die Homologie von der Anzahl der zu vergleichenden Aminosäure-Resten sowie von den tatsächlich verglichenen Teilen der zu vergleichenden Aminosäure-Sequenz ab. Der Begriff "Ausmaß an Homologie" betrifft den Teil identischer Aminosäure-Reste in den zu vergleichenden Aminosäure-Sequenzen. Im vorliegenden Zusammenhang ist das Ausmaß an Homologie zwischen zwei beliebigen Aminosäure-Sequenzen die Anzahl identischer Aminosäure-Reste an entsprechenden Positionen in den beiden zu vergleichenden Aminosäure-Sequenzen im Vergleich zur Gesamtzahl der in den beiden Aminosäure-Sequenzen verglichenen Aminosäure-Reste. Das Ausmaß an Homologie zwischen zwei Aminosäure-Sequenzen sollte bei größtmöglicher Überlappung zwischen den beiden Aminosäure-Sequenzen bestimmt werden, d.h. die zu vergleichenden Aminosäure-Sequenzen sollten so gelegt werden, daß die größtmögliche Überlappung zwischen identischen Aminosäure-Resten erhalten wird, so daß das maximale zwischen den beiden zu vergleichenden Aminosäure-Sequenzen erhältliche Ausmaß an Homologie erzielt wird.
Vorzugsweise gehört die dicotyledone Pflanze, von der das Polypeptid abgeleitet ist, zur Familie Solanaceae, insbesondere der Gattung Solanum, da ein hohes Ausmaß an Homologie zwischen Polypeptiden dieser Pflanzen erwartet wird. Somit wird eine Homologie von α-Amylase jeder anderen Kartoffelpflanze mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden erwartet. Es wird auch erwartet, daß verwandte Pflanzen der Familie Solanaceae, wie Pflanzen der Gattung Capsicum, z.B. Capsicum annuum, Lycopersicon, z.B. Lycopersicon lycopersicum, und Nicotiana, z.B. Nicotiana tabacum, sowie dicotyledone Pflanzen anderer Familien Polypeptide enthalten, die zu den erfindungsgemäßen Polypeptiden, d.h. α-Amylase, homolog sind.
Zu den im wesentlichen in den Fig. 1 - 4 gezeigten Aminosäure-Sequenzen oder zu Fragmenten oder Analoga davon homologe Polypeptide lassen sich durch die Isolierung von Genen oder mRNAs erhalten, die solche Polypeptide codieren, wobei ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment verwendet werden kann, und durch Herstellung des Polypeptids auf Grundlage der Kenntnis solcher Gene oder mRNAs. Dies wird nachstehend näher erläutert. Insbesondere wird erwartet, daß sich die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente, insbesondere eine in den Fig. 1 oder 3 dargestellte Nucleotid-Sequenz enthaltende DNA- Fragmente, zur Isolierung entsprechender DNA-Fragmente aus mit Kartoffeln nahe verwandten Pflanzen verwenden lassen, z.B. der Tomate (Lycopersicon). Durch die Herstellung einer α-Amylase in der nachstehend beschriebenen Weise, d.h. durch Anwendung von DNA-Rekombinations-Verfahren oder durch Flüssig- oder Fest-Phasen-Polypeptidsynthese, ist es möglich, ein erfindungsgemäßes Polypeptid in im wesentlichen reiner Form zu erhalten, was für bestimmte Zwecke vorteilhaft ist.
In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "im wesentlichen rein", daß das fragliche Polypeptid im wesentlichen frei von anderen Bestandteilen ist, z.B. von anderen Bestandteilen, die die enzymatische Aktivität des Polypeptids beeinflussen können. Diese anderen Bestandteile können sich aus der Herstellung und/oder Gewinnung des Polypeptids ergeben oder in anderer Weise zusammen mit dem Polypeptid gefunden werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide lassen sich durch jedes übliche Verfahren herstellen, z.B. durch ein Verfahren, bei dem DNA-Rekombinations-Verfahren verwendet werden, oder durch Fest- oder Flüssig-Phasen-Peptidsynthese. Die erfindungsgemäßen Polypeptide, die im wesentlichen eine wie in den Fig. 1 - 4 angegebene Aminosäure-Sequenz oder die eines Analogons oder eines α-Amylase ähnlichen Fragments davon haben, wobei das Polypeptid oder Analogon oder Fragment davon im wesentlichen frei von natürlicherweise damit vorkommenden Enzymen ist, lassen sich durch ein Verfahren herstellen, bei dem man die folgenden Schritte durchführt:
a) Insertion eines wie vorstehend beschriebenen DNA-Fragments, d.h. eines DNA-Fragments, enthaltend eine im wesentlichen wie in Fig. 1 angegebene Nucleotid-Sequenz oder ein Analogon oder eine Teilsequenz davon, gegebenenfalls in einer geeignet modifizierten Form, in einen Expressions-Vektor;
b) Transformation eines geeigneten Wirtsmikroorganismus mit dem in Schritt a) hergestellten Vektor;
c) Züchtung des in Schritt b) hergestellten Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen oder Expression des Polypeptids; und
d) Ernten des Polypeptids aus der Kultur.
Das Verfahren kann gegebenenfalls einen weiteren Schritt enthalten, bei dem das hergestellte Polypeptid mindestens einer Modifikation unterworfen wird.
In Schritt a) des Verfahrens kann die gegebenenfalls ausgeführte Modifizierung der Sequenz vor oder nach dem Einbau der Sequenz in den Vektor erfolgen. Die Modifizierung kann ausgeführt werden, um das ausgehend von der DNA-Sequenz exprimierte Polypeptid an einen gewünschten Zweck anzupassen, z.B. um eines oder mehrere aktive Zentren des Polypeptids, wie vorstehend erläutert, zu modifizieren. Die Modifikation kann Substitutionen, Additionen, Insertionen oder Deletionen von einem oder mehreren Nucleotiden in der Sequenz oder einer Kombination davon umfassen, wobei die vorstehenden Erläuterungen der Begriffe Substitution, Addition, Insertion, Umlagerung oder Deletion von Aminosäure-Resten in der Aminosäure-Sequenz zu berücksichtigen sind.
Die Transformation in Schritt b) des Verfahrens kann in üblicher Weise durchgeführt werden, beispielsweise wie von Maniatis et al. (12) beschrieben. Die Züchtung des Wirtsmikroorganismus in Schritt d) des Verfahrens kann in einem üblicherweise für die Fermentation verwendeten und an den gewünschten Wirtsorganismus angepaßten Kulturmedium erfolgen und zwar unter pH-, Temperatur-, Belüftungs-Bedingungen etc., die an den gewünschten Mikroorganismus-Typ angepaßt sind, z.B. wie von Maniatis et al. (12) beschrieben.
In Stufe d) des Verfahrens kann das Ernten des Polypeptids oder eines Analogons oder Fragments davon in üblicher Weise, wie durch Fällung, Gelfiltration, Ionenaustausch-HPLC- Reversphasen-Chromatographie oder durch Immunaffinitäts- Chromatographie erfolgen.
Das hergestellte Polypeptid kann einer oder mehreren Modifizierungen unterworfen werden, z.B. um ein oder mehrere aktive Zentren davon zu modifizieren, oder um ungewünschte Teile des Polypeptids zu entfernen, z.B. eine Signalsequenz oder einen Teil eines Fusionsproteins. Die Modifikation kann in üblicher Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch Temperaturbehandlung, Behandlung mit einem chemischen Stoff, wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd, oder mit einem geeigneten proteolytischen Enzym, z.B. mit Trypsin, oder durch Substitution, Addition, Insertion oder Deletion von mindestens einer Aminosäure im Polypeptid in der vorstehend erläuterten Weise.
In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens kann das Polypeptid oder ein Analogon oder Fragment davon nach üblichen Methoden der Flüssig- oder Fest-Phasen-Peptidsynthese hergestellt werden.
In der anderen Ausführungsform vermittelt die Signalsequenz den Transport des erfindungsgemäßen Polypeptids bei der Herstellung nach DNA-Rekombinations-Verfahren, die nachstehend genauer beschrieben werden, aus der Zelle heraus, und das das rekombinante Polypeptid enthaltende Fermentations-Medium kann, so wie es ist, vor jeglicher Gewinnung oder Isolierung des α-Amylase-Enzyms verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung einen in einem Wirtsorganismus zur Replikation befähigten Vektor, der ein wie vorstehend beschriebenes DNA-Fragment trägt, d.h. ein DNA-Fragment, enthaltend eine im wesentlichen wie in den Fig. 1 - 5 gezeigte Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon oder ein α-Amylase- Gen, enthaltend das DNA-Fragment oder ein DNA-Fragment, das ein anti-sense-RNA-Molekül codiert, das mit einer von einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment transkripierten mRNA hybridisieren kann. Der Vektor kann entweder ein autonom replikativer sein, wie ein Plasmid oder einer, der zusammen mit dem Wirtschromosom repliziert wird, wie ein Bakteriophage, oder ein über die Randsequenzen von Ti-Vektoren in ein Pflanzengenom integrierter Vektor sein. Zu Herstellungszwecken ist der Vektor ein Expressions-Vektor, der das DNA-Fragment im für die Herstellung ausgewählten Organismus exprimieren kann. Daher ist der Expressions-Vektor ein Vektor, der die für die Expression erforderlichen regulatorischen Sequenzen trägt, wie den Promotor, ein Initiationssignal und ein Terminationssignal, etc. Der Vektor kann ebenso einer für die Diagnose von α-Amylase-Genen oder mRNAs von Kartoffeln und anderen Organismen sein. Zu diesem Zweck ist eine Expression nicht erforderlich. Verfahren zur Diagnose werden nachstehend weiter erläutert.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Organismus, der ein, wie vorstehend definiertes, inseriertes DNA-Fragment trägt und replizieren kann, d.h. ein DNA-Fragment, enthaltend eine im wesentlichen wie in den Fig. 1 - 5 gezeigte Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon oder ein α-Amylase-Gen oder Pseudogen, enthaltend das DNA-Fragment oder ein DNA-Fragment, das ein zur Hybridisierung mit einer von einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment transkripierten mRNA fähiges anti-sense-RNA-Molekül codiert.
Der Begriff "inseriert" betrifft das DNA-Fragment (oder Teilsequenz oder Analogon, oder Gen oder Pseudogen), das in den Organismus oder einen Vorfahren davon durch genetische Manipulation inseriert wurde. Mit anderen Worten kann der Organismus einer sein, der nicht natürlicherweise oder schon an sich ein solches DNA-Fragment in seinem Genom enthielt, oder einer, der natürlicherweise oder schon an sich ein solches DNA-Fragment enthielt, jedoch in einer geringeren Anzahl, so daß der Organismus mit dem inserierten DNA-Fragment eine höhere Anzahl solcher Fragmente aufweist als seine natürlich vorkommenden Gegenstücke.
Das vom Organismus getragene DNA-Fragment kann Teil des Genoms des Organismus sein oder von einem wie vorstehend angegebenen Vektor getragen werden, der im Organismus enthalten ist. Das DNA-Fragment kann im Genom oder im wie vorstehend angegebenen Expressions-Vektor im Leserahmen mit einem oder mehreren zweiten DNA-Fragmenten vorliegen, die ein zweites Polypeptid oder einen Teil davon codieren, so daß ein Fusionsprotein codiert wird, wie es z.B. vorstehend definiert wurde.
Der Organismus kann ein höherer Organismus, wie eine Pflanze sein, vorzugsweise eine dicotyledone Pflanze, wie eine Pflanze der Familie Solanaceae, oder ein niederer Organismus, wie ein Mikroorganismus. Ein niederer Organismus, wie ein Bakterium, z.B. ein gram-negatives Bakterium, wie ein Bakterium der Gattung Escherichia, z.B. E. coli, oder ein gram-positives Bakterium, wie eines der Gattung Bacillus, z.B. B. subtilis, oder eine Hefe, wie eine der Gattung Saccharomyces, oder ein Pilz, z.B. der Gattung Aspergillus, ist nützlich für die Herstellung eines, wie vorstehend angegebenen, rekombinanten Polypeptids. Da die meisten Organismen schon von Natur aus α-Amylase bilden, kann es wünschenswert sein, die natürlich vorkommende α-Amylase-Produktion zu modifizieren, d.h. zu steigern, zu vermindern oder zu zerstören, so daß die von Natur aus vorkommende α-Amylase-Produktion nicht die Herstellung einer erfindungsgemäßen α-Amylase beeinflußt. Es kann jedoch vorteilhaft sein, das der für eine gewünschte rekombinante Herstellung verwendete Mikroorganismus ebenso seine natürliche α-Amylase bildet, z.B., um einen additiven Effekt zwischen den beiden gebildeten α- Amylasen zu erhalten. Die rekombinante Herstellung wird nachstehend genauer beschrieben.
Beispiele solcher Mikroorganismen sind der Stamm E. coli K- 12, der das Plasmid pAmyZ3 enthält und bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) am 04. April 1989 unter der Hinterlegungsnummer DSM5275 hinterlegt wurde, der Stamm E. coli K-12 enthaltend das Plasmid pAmyZ4, das bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen am 04. April 1989 unter der Hinterlegungsnummer DSM5276 hinterlegt wurde, E. coli, enthaltend das Plasmid pAmyZ7, das bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM5884 am 18. April 1990 hinterlegt wurde, E. coli, enthaltend das Plasmid pAmyZ1, das bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM5882 am 18. April 1990 hinterlegt wurde, und E. coli, enthaltend das Plasmid pAmyZ6, das bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM5883 am 18. April 1990 hinterlegt wurde.
Der Organismus kann auch eine Zellinie, z.B. eine Säugerzellinie, oder vorzugsweise eine Pflanzenzellinie sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Organismus eine Pflanze, d.h. eine genetisch modifizierte Pflanze, wie sie nachstehend genau beschrieben wird.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein genetisches Konstrukt zur Inhibition der Translation eines mRNA-Moleküls, das von einem wie vorstehend beschriebenen DNA-Fragment codiert wird und eine im wesentlichen wie in den Fig. 1 - 5 gezeigte Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon enthält. Dieses Konstrukt enthält: (1) eine regulatorische Sequenz, die funktionell verbunden ist mit (2) einem wie vorstehend beschriebenen DNA- Fragment, das ein zur Inhibition der Translation der intrinsischen α-Amylase-mRNA fähiges RNA-Molekül codiert, wobei das DNA-Fragment eine im wesentlichen wie in den Fig. 1 - 4 gezeigte Nucleotid-Sequenz in entgegengesetzter Orientierung oder ein Analogon oder eine Teilsequenz davon enthält, und (3) eine Transkriptions-Terminations-DNA-Sequenz, die funktionell mit dem DNA-Fragment (2) verbunden ist. Das Prinzip dieses genetischen Konstrukts ist die Konstruktion einer genetisch modifizierten Pflanze, in der die α-Amylase-Produktion so vermindert ist, daß eine Pflanze mit einer verminderten α-Amylase-Aktivität erhalten wird. Beispielsweise wird das genetische Konstrukt bei der Konstruktion einer genetisch modifizierten Kartoffelpflanze mit einer verminderten α-Amylase-Aktivität verwendbar sein, wodurch sich eine verminderte Menge reduzierender Zucker in der Pflanze ergibt, d.h. eine als Rohmaterial zur Chips-Herstellung verwendbare Kartoffelpflanze. Wenn das genetische Konstrukt zur Konstruktion einer Kartoffelpflanze zu diesem Zweck verwendet werden soll, beruht das DNA-Fragment vorzugsweise auf einer Nucleotid-Sequenz, die komplementär zu einer in Kartoffelknollen gut exprimierten Sequenz ist, oder auf einer, die ein ausreichend hohes Ausmaß an Homologie (d.h. sie hybridisiert unter den oben angegebenen Bedingungen) mit einer α-Amylase-mRNA der Knolle hat, üblicherweise einer die normalerweise in einem anderen Gewebe als der Knolle exprimiert wird, wie in Keim oder Blatt. In einer anderen Ausführungsform kann die Nucleotid-Sequenz von einem Pseudogen transkribiert sein.
Die Bedingungen, unter denen das genetische Konstrukt verwendet wird, sollten sicherstellen, daß das vom genetischen Konstrukt exprimierte anti-sense-RNA-Molekül mit einer von den intrinsischen α-Amylase-Genen transkripierten mRNA hybridisieren kann. Vorzugsweise ist das genetische Konstrukt in derselben Zelle oder in demselben Gewebe aktiv, in denen die intrinsischen α-Amylase-Gene aktiv sind. Vorzugsweise ist das genetische Konstrukt stabil in das Genom integriert, um damit die Vererbung von Generation zu Generation zu gewährleisten. Zur Reduktion der Menge reduzierender Zucker in einer Kartoffelpflanze verwendbare genetische Konstrukte werden in Beispiel 24 genauer beschrieben.
Wie vorstehend ausgeführt, kann es vorteilhaft sein, einen Organismus mit einer (gegenüber dem natürlich vorkommenden Organismus) erhöhten α-Amylase-Aktivität zu konstruieren. Vorzugsweise ist der Organismus eine Pflanze, insbesondere eine Kartoffelpflanze. Eine Kartoffelpflanze mit einer erhöhten α-Amylase-Aktivität gegenüber der natürlich vorkommenden Kartoffel läßt sich als Rohmaterial zur Herstellung von Spirituosen verwenden, da eine erhöhte α-Amylase-Aktivität zu einer erhöhten Menge reduzierender Zucker in der Kartoffel führt, was vorteilhaft für die Herstellung von Spirituosen ist. Dementsprechend betrifft die Erfindung auch ein genetisches Konstrukt, das sich zur Herstellung eines wie vorstehend beschriebenen Polypeptids eignet, d.h. einem von einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment, enthaltend eine im wesentlichen wie in Fig. 1 oder 2 gezeigten Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon oder ein α- Amylase-Gen codierten Polypeptid. Dieses Konstrukt enthält (1) eine regulatorische Sequenz, die funktionell verbunden ist mit (2) einem wie vorstehend definierten, das Polypeptid codierenden DNA-Fragment und (3) eine Transkriptions-Terminations-DNA-Sequenz, die funktionell mit dem DNA-Fragment (2) verbunden ist.
Vorzugsweise wird das zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, z.B. einer α-Amylase oder einem Teil davon, verwendbare genetische Konstrukt zur Konstruktion einer Pflanze verwendet, die eine erhöhte α-Amylase-Aktivität im Vergleich zur das genetische Konstrukt nicht enthaltenden Pflanze hat.
Die in den vorstehend beschriebenen genetischen Konstrukten enthaltene regulatorische Sequenz ist vorzugsweise ein Pflanzenpromotor, wie ein konstitutiver oder regulierbarer Pflanzenpromotor. Der Promotor kann, wie vorstehend beschrieben, ausgestaltet sein. Wenn das genetische Konstrukt in einer genetisch modifizierten Kartoffelpflanze verwendet werden soll, ist der Promotor vorzugsweise ein Pflanzenpromotor, der der CaMV-Promotor oder der NOS-Promotor, der α- Amylase-Promotor oder der Promotor eines Kartoffel-Polyubiquitin-Gens sein kann.
Das genetische Konstrukt kann außerdem mit einem Marker bereitgestellt werden, der die Selektion des genetischen Konstrukts in einer Pflanzenzelle gestattet, in die er eingeführt wurde. Es sind verschiedene Marker bekannt, die in Pflanzenzellen verwendet werden können, insbesondere Marker, die eine Antibiotika-Resistenz bewirken. Zu diesen Markern gehören die Resistenz gegen G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin oder Gentamycin.
Wie vorstehend erläutert, wird das genetische Konstrukt vorzugsweise zur Modifizierung einer Pflanze verwendet. Somit betrifft die Erfindung auch eine genetisch modifizierte Pflanze, die in ihrem Genom ein wie vorstehend beschriebenes genetisches Konstrukt enthält. Das genetische Konstrukt kann erfindungsgemäß die α-Amylase-Aktivität vermindern oder zu einer Erhöhung der α-Amylase-Aktivität führen. Die Erfindung betrifft daher außerdem eine genetisch modifizierte Pflanze, die eine erhöhte oder verminderte α-Amylase-Aktivität im Vergleich zu einer entsprechenden nicht modifizierten Pflanze aufweist. Es wird daneben häufig erwünscht sein, daß in der genetisch modifizierten erfindungsgemäßen Pflanze die α-Amylase-Aktivität durch unterschiedliche Faktoren gesteuert werden kann, z.B. durch Faktoren wie Temperatur. Wenn die fragliche Pflanze beispielsweise eine Kartoffelpflanze ist, wird es für bestimmte Zwecke wünschenswert sein, die α- Amylase-Aktivität bei verhältnismäßig niedrigen Temperaturen regulieren zu können, z.B. zu vermindern, so daß die Kartoffeln bei niedrigen Temperaturen ohne die Umwandlung von Stärke zu reduzierenden Zuckern gelagert werden können. Somit betrifft die Erfindung außerdem eine genetisch modifizierte Pflanze, in der die α-Amylase-Aktivität bei niedrigen Temperaturen reguliert werden kann, insbesondere bei Temperaturen unterhalb von etwa 8 ºC.
Eine genetisch modifizierte Pflanze kann auch anti-sense- mRNA herstellen, die die Stärkezersetzung durch Hybridisierung an eine von einem α-Amylase-Gen transkribierte mRNA vermindert. Deshalb betrifft die Erfindung ferner eine genetisch modifizierte Pflanze, insbesondere Solanum tuberosum, die eine zur Hybridisierung an eine von einem wie in den Fig. 1 - 4 gezeigten DNA-Fragment transkripierte mRNA hybridisiert und dadurch deren Translation inhibiert und die Stärkezersetzung im Vergleich zur entsprechenden nicht-modifizierten Pflanze vermindert.
Das grundlegende Prinzip der Konstruktion genetisch modifizierter Pflanzen ist die Insertion von genetischer Information in das Pflanzengenom, um eine stabile Beibehaltung des inserierten genetischen Materials zu erhalten. Es gibt mehrere Techniken zur Insertion der genetischen Information, wobei die beiden Hauptprinzipien die direkte Einführung der genetischen Information und die Einführung der genetischen Information mit einem Vektor-System sind. Somit betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Vektor-System, das ein wie vorstehend definiertes genetisches Konstrukt trägt und zur Einführung des genetischen Konstrukts in das Genom einer Pflanze fähig ist, wie einer Pflanze der Familie Solanaceae, insbesondere der Gattung Solanum, insbesondere Solanum tuberosum. Das Vektor-System kann einen Vektor enthalten. Vorzugsweise enthält es jedoch zwei Vektoren. Falls zwei Vektoren vorliegen, wird das Vektor-System üblicherweise als binäres Vektor-System bezeichnet. Binäre Vektor-Systeme werden genauer in (53) "Binary vectors" beschrieben.
Ein ausgiebig angewendetes System zur Transformation von Pflanzenzellen mit einem vorgegebenen genetischen Konstrukt, z.B. einem wie vorstehend beschriebenen, beruht auf der Verwendung eines Ti-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens oder eines Ri-Plasmids aus Agrobacterium rhizogenes; vgl. (42), (54).
Mehrere unterschiedliche Ti- und Ri-Plasmide wurden konstruiert, die zur Konstruktion eines vorstehend beschriebenen Pflanzen- oder Pflanzenzell-Konstrukts geeignet sind. Nicht als Beschränkung zu interpretierende Beispiele solcher Ti- Plasmide werden nachstehend in Beispiel 25 aufgezeigt. Ein weiteres Beispiel ist das Plasmid pGV3850.
Das erfindungsgemäße, in das Ti-Plasmid zu inseriende DNA- Fragment soll vorzugsweise zwischen den Endsequenzen der T- DNA oder benachbart zu einer T-DNA-Sequenz inseriert werden, um eine Unterbrechung der unmittelbar die T-DNA-Endsequenzen umgebenden Sequenzen zu vermeiden, da mindestens einer dieser Bereiche anscheinend essentiell für die Insertion der modifizierten T-DNA in das Pflanzengenom ist.
Aus der vorstehend angegebenen Erklärung ergibt sich, daß das erfindungsgemäße Vektor-System vorzugsweise eine Virulenz-Funktion enthält, die zur Infektion der Pflanze fähig ist, und ferner mindestens einen Randteil einer T-DNA-Sequenz, wobei der Randteil auf demselben Vektor wie das genetische Konstrukt liegt. Außerdem ist das Vektor-System vorzugsweise ein Agrobacterium tumefaciens-Ti-Plasmid oder ein Agrobacterium rhizogenes-Ri-Plasmid oder ein Derivat davon, da diese Plasmide gut bekannt sind und weithin bei der Konstruktion transgener Pflanzen verwendet werden. Es gibt viele Vektor-Systeme, die auf diesen Plasmiden oder auf Derivaten davon basieren.
Bei der Konstruktion einer transgenen Pflanze mit einem Vektor wird bevorzugt, daß das in die Pflanze zu inserierende genetische Konstrukt zuerst in einem Mikroorganismus konstruiert wird, in dem der Vektor replizierbar ist und der einfach zu manipulieren ist. Ein Beispiel eines nützlichen Mikroorganismus ist E. coli. Es können jedoch auch andere Mikroorganismen mit den vorstehenden Eigenschaften verwendet werden. Wenn ein Vektor eines wie vorstehend angegebenen Vektor-Systems in E. coli konstruiert wurde, wird er gegebenenfalls in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm transferiert, z.B. in Agrobacterium tumefaciens.
Somit wird das erfindungsgemäße DNA-Fragment tragende Ti- Plasmid vorzugsweise in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm überführt, z.B. A. tumefaciens, um auf diese Weise eine das erfindungsgemäße DNA-Fragment tragende Agrobacterium-Zelle zu erhalten, wobei die DNA anschließend in die zu modifizierende Pflanzenzelle überführt wird. Diese Transformation läßt sich durch eine Anzahl von Methoden durchführen, z.B. wie in (53) und in der EP-A-0 122 791 beschrieben. Bei Kartoffeln und anderen Solanaceae wird jedoch meistens die Infektion von Blattstücken mit A. tumefaciens durchgeführt; vgl. (74).
Die direkte Infektion von Pflanzengeweben durch Agrobacterium ist ein einfaches Verfahren, das häufig angewendet und in (54) beschrieben wird.
Wie sich aus der Einleitung dieser Beschreibung ergibt, kann das erfindungsgemäße DNA-Fragment für diagnostische Zwecke verwendet werden. Dies wird nachstehend näher erläutert.
Unterschiedliche Formen der Diagnose lassen sich mit dem erfindungsgemäßen DNA-Fragment durchführen. In einer gegebenen Probe lassen sich α-Amylase-mRNAs sowohl qualitativ als auch quantitativ durch Hybridisierung mit dem erfindungsgemäßen DNA-Fragment unter für diese Hybridisierung geeigneten Bedingungen bestimmen. Außerdem lassen sich in einem Organismus, wie einer Pflanze, vorliegende α-Amylase-codierende Gene mit dem erfindungsgemäßen DNA-Fragment identifizieren und isolieren, z.B. durch Absuchen einer Genbank eines solchen Organismus.
Wenn das DNA-Fragment für diagnostische Zwecke verwendet werden soll, ist es häufig zweckmäßig, es mit einer für den Nachweis verwendbaren Markierung zu versehen. Somit betrifft die Erfindung in einer anderen Ausführungsform ein wie vorstehend beschriebenes DNA-Fragment, das eine Markierung aufweist. Vorzugsweise ist die Markierung ein Fluorophor, ein radioaktives Isotop, ein Isotop oder ein Komplex-bildender Stoff wie Biotin.
Beispiele von als Markierungssubstanzen verwendbaren Isotopen sind ³H, ¹&sup4;C, ³&sup5;S und ³²P. Die von diesen Isotopen abgestrahlte Radioaktivität kann in einem Gamma-Zähler, einem Scintillations-Zähler oder durch Autoradiographie und anschließende Densitometrie in üblicher Weise gemessen werden.
Komplex-bildende Stoffe sind z.B. Protein A, Biotin (das einen Komplex mit Avidin und Streptavidin bildet) oder Lectin. In diesem Fall ist der Komplex selbst nicht direkt nachweisbar, so daß die Markierung der Substanz erforderlich ist, mit der der Komplexbildner einen Komplex bildet. Dazu können beliebige der vorstehend genannten Markierungen verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung eines α-Amylase-Gens oder einer α- Amylase-mRNA aus einem Organismus, z.B. einer Pflanze, insbesondere aus einer dicotyledonen Pflanze. Bei diesem Verfahren wird eine Nucleinsäure-enthaltende, aus einer Genbank oder einer cDNA-Genbank eines Organismus erhaltene Probe mit einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment, das eine im wesentlichen wie in den Fig. 1 - 5 angegebene Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon enthält, gegebenenfalls in markierter oder denaturierter Form, oder mit einer RNA- Kopie davon unter für die Hybridisierung zwischen dem DNA- Fragment oder der RNA-Kopie mit der Nucleinsäure der Probe günstigen Bedingungen hybridisiert und der hybridisierte Clon wird gewonnen, um ein α-Amylase-Gen oder cDNA des Organismus zu erhalten.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Quantifizierung des α-Amylase-mRNA-Gehalts in unterschiedlichen Geweben eines Organismus, z.B. einer Pflanze, insbesondere einer dicotyledonen Pflanze. Dabei wird eine vom Organismus erhaltene Nucleinsäure-enthaltende Probe mit einem gegebenenfalls markierten oder denaturierten erfindungsgemäßen DNA-Fragment, enthaltend eine im wesentlichen wie in den Fig. 1 - 4 gezeigte Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon, oder mit einer RNA-Kopie davon unter für die Hybridisierung zwischen dem denaturierten DNA-Fragment oder der RNA-Kopie mit der RNA der Probe günstigen Bedingungen hybridisiert und die Menge hybridisierter Nucleinsäure wird bestimmt; vgl. (40).
Eine andere Möglichkeit zum Nachweis des Vorliegens eines spezifischen α-Amylase-Gens, z.B. eines durch die vorstehend beschriebenen genetischen Verfahren in einen Organismus, wie eine Pflanze, insbesondere eine dicotyledone Pflanze, eingeführtes α-Amylase-Gen oder ein Teil davon, ist die Anwendung der Polymerase-Ketten-Reaktion (vgl. (5)), d.h. es wird ein Verfahren verwendet, in dem das das α-Amylase-Gen oder den Teil davon enthaltende, in einer Probe vorliegende DNA-Fragment einer vielfachen Amplifikation unterworfen wird.
Kartoffelsorten können auf der Grundlage der Beobachtungen, daß der Gehalt an reduzierenden Zuckern in gelagerten Kartoffeln wie in den Beispielen beschrieben mit der α-Amylase- Aktivität korreliert ist und daß sich diese Korrelation auch auf Schößlinge und vermutlich auf andere Teile, wie Blätter, erstreckt, auf ihre Tendenz abgesucht werden, Zucker in gelagerten Kartoffeln schon in einem Stadium zu akkumulieren, wenn die jungen Pflanzen ein paar Blätter gebildet haben, d.h. in einem sehr frühen Stadium. Dies läßt sich beispielsweise durchführen durch Auftupfen von RNA-Extrakten aus 0,1 - 0,5 g Blattmaterial (z.B. erhalten wie nachstehend in "Materialen und Methoden") auf zur Hybridisierung geeignete Filter und durch Hybridisierung mit einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment, das gegebenenfalls mit einer Markierung versehen ist, wie Biotin oder einem radioaktiven Isotop. Als Standard kann die Hybridisierung mit ähnlich markierten Ubiquitin-codierenden Bereichen irgendeines Organismus, z.B. Gerste, verwendet werden, da Ubiquitin-Sequenzen sehr stark konserviert und in unterschiedlichen Pflanzengeweben konstitutiv exprimiert werden. Die Ergebnisse werden mit ähnlichen "Dot-Blot" verglichen, die aus einer Analyse von Kartoffelsorten mit bekannten Zuckercharakteristika erhalten wurden, z.B. von den vier Kartoffelsorten, die in "Materialien und Methoden" beschrieben sind. Die vorstehend beschriebene "Dot-Blot"-Analyse kann mit einer großen Menge von Züchtungsmaterial durchgeführt werden und führt zur frühen Bestimmung der Zuckercharakteristika einer gegebenen Kartoffelsorte.
Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLP) werden immer häufiger zur Verfolgung spezifischer Allele von Genen in unterschiedlichen Organismen eingesetzt. Die Allele werden entweder selbst verfolgt oder sie werden als Marker (verbunden oder nicht verbunden) bei Kreuzungen betreffend andere Merkmale, z.B. Pathogen-Resistenz und morphologische Merkmale, wie Knollenfarbe verwendet. Bisher wurde die Methode vorwiegend bei Menschen eingesetzt, sie wurde jedoch auch bei Pflanzen eingesetzt, z.B. bei Kartoffeln; vgl. (27). Es wird davon ausgegangen, daß ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment zur RFLP-Analyse von α-Amylase-Genen eingesetzt werden kann, insbesondere bei dicotyledonen Pflanzen, wie der Kartoffel. Diese Annahme beruht auf den Ergebnissen von genomischen Southern-Hybridisierungen von Kartoffel-DNA mit einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment. Pflanzen der Spezies Solanum tuberosum haben wenige α-Amylase-Gene und ergeben deshalb ein einfaches Fragmentmuster, mit dem man Polymorphismen leicht auswerten kann. Somit lassen sich Genome leicht wie vorstehend beschrieben auf α-Amylase-codierende Allele nach den Grundsätzen des Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus untersuchen, d.h. wie in (27) beschrieben. Ein Beispiel der Anwendung eines α-Amylase-Gens bei dieser Technik wird in Beispiel 28 und in den Fig. 19 und 20 beschrieben.
Im vorliegenden Zusammenhang werden die üblicherweise für Aminosäuren verwendeten Abkürzungen verwendet.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Figuren zeigen:
Fig. 1: Die Nucleotidsequenz der Kartoffel-α-Amylase- Messenger-RNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Kartoffel-α-Amylase-Vorläuferproteins. Die Figur zeigt die Sequenz des Messenger-RNA-ähnlichen Stranges der kombinierten Insertionen der Kartoffel-α-Amylase-cDNA-clone AmyZ3 und AmyZ4 ohne die terminalen EcoRI-Restriktionsschnittstellen. AmyZ3 und AmyZ4 haben in den überlappenden Bereichen identische Nucleotidsequenzen (vgl. Fig. 11), mit der Ausnahme, daß AmyZ3 eine Intronsequenz von 128 Nucleotiden, die in der Figur (Nucleotide 296 bis 423, einschließlich) unterstrichen ist, hat. Die Consensus-5'- und 3'-Nucleotide an den Exon-Intron- Grenzen, GT und AG, sind in der Figur jeweils doppelt unterstrichen. Ein Consensus-Verzweigungspunkt (Nucleotide 390 bis 396) ist eingerahmt. Die Nucleotidsequenz des 3'-Signalpeptids bis zum Nucleotid 540 enthält vier offene Leseraster, die im Detail in Fig. 17 dargestellt sind. Die für das α-Amylase-Vorläuferprotein codierende Region beginnt mit Nucleotid 541 und endet mit Nucleotid 1761; die Länge des α-Amylase-Vorläuferproteins beträgt 407 Aminosäuren. In der Figur ist die abgeleitete Aminosäuresequenz unter Verwendung des Ein- Buchstaben-Codes für Aminosäuren dargestellt. Die wahrscheinliche Prozessierungsstelle des Vorläuferproteins ist durch einen Pfeil dargestellt. Die 3'- nicht-translatierte Region ist mindestens 200 Nucleotide lang, den Poly(A)-Schwanz nicht eingeschlossen, aber wahrscheinlich nicht viel länger, da das wahrscheinliche Poly(A)-Signal 30 Nucleotide vom Ende entfernt gefunden wird; das Poly(A)-Signal ist in der Figur unterstrichen.
Fig 2: Die Nucleotidsequenz der Kartoffel-α-Amylase- Messenger-RNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Kartoffel-α-Amylase-Vorläuferproteins. Die Figur zeigt die Sequenz des Messenger-RNA-ähnlichen Stranges der Insertion des Kartoffel-α-Amylase- cDNA-Clons AmyZ7 ohne die terminalen EcoRI-Restriktionsschnittstellen. Die Nucleotidsequenz codiert für ein α-Amylase-Vorläuferprotein (bei Aminosäure Nr. 2 beginnend) und die Sequenz enthält das G-Nucleotid (Nr. 1 in der Figur) des Initiationscodons ATG. Das α-Amylase-Leseraster endet mit Position 1219, und die Länge des α-Amylase-Vorläuferproteins beträgt 407 Aminosäuren, das Initiationscodon eingeschlossen. Die wahrscheinliche Prozessierungsstelle des Vorläuferproteins ist durch einen Pfeil dargestellt. Die Sequenz endet mit einer 187 Nucleotide langen 3'-nicht-translatierten Region, gefolgt von einem neun Nucleotide langen Poly(A)-Schwanz.
Fig. 3: Die partielle Nucleotidsequenz der Kartoffel-α- Amylase-Messenger-RNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz von einem Teil des Kartoffel-α-Amylase- Vorläuferproteins. Die Figur zeigt die Sequenz des Messenger-RNA-ähnlichen Stranges der Insertion des Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Clons AmyZ1 ohne die terminalen EcoRI-Restriktionsschnittstellen. Das offene Leseraster für diesen Teil der α-Amylase beginnt mit Nucleotid 6 und endet mit Nucleotid 1052 und die erste Aminosäure läßt sich auf Aminosäure 69 der in Fig. 1 gezeigten Sequenz ausrichten. Clon AmyZ1 enthält daher keine Nucleotide, die für das Signalpeptid codieren. Es fehlen somit etwa 50 Codons vom N-Terminus der reifen α-Amylase. Die Sequenz endet mit einer 163 Nucleotide langen 3'- nicht-translatierten Region.
Fig. 4: Die partielle Nucleotidsequenz der Kartoffel-α- Amylase-Messenger-RNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines Teils eines Kartoffel-α-Amylase- Vorläuferproteins. Die Figur zeigt die Sequenz des Messenger-RNA-ähnlichen Stranges der Insertion des Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Clons AmyZ6 ohne die terminalen EcoRI-Restriktionsschnittstellen. Das offene Leseraster für diesen Teil der α-Amylase beginnt mit Nucleotid 3 und endet mit Nucleotid 647. Die erste Aminosäure läßt sich auf Aminosäure 133 der in Fig. 1 gezeigten Sequenz ausrichten. Die Sequenz endet mit einer 360 Nucleotide langen 3'- nicht-translatierten Region.
Fig. 5 Die partielle Nucleotidsequenz einer Pseudo-Kartoffel-α-Amylase-Messenger-RNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz der α-Amylase. Die hier gezeigte Sequenz trägt im Vergleich zum funktionellen Gen zwei Deletionen. Die Figur zeigt die Sequenz des Messenger-RNA-ähnlichen Stranges der Insertion des Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Clons AmyZ2 ohne die terminalen EcoRI-Restriktionsschnittstellen.
Fig. 6: Einen schematischen Querschnitt durch die Kartoffel, wobei die Gewebe, aus denen die in Beispiel 1 beschriebenen Proben entnommen wurden, dargestellt sind. A: Keim ohne Blätter oder Wurzeln; B: Verbindung zwischen Keim und Knolle; C: Stranggewebe der Knolle; D: Parenchym-Gewebe.
Fig. 7: Die Struktur und das Subclonierungsverfahren des Gerste-α-Amylase-cDNA-Clons pM/C. Plasmid 036 war der von J.C. Rogers mit der Information erhaltene Clon, daß dies ein BamHI-HindIII-Subclon von pM/C (24) ist. Die vollständige Sequenz war jedoch nicht publiziert, und der kurze unbekannte Bereich ist durch einen Stern gekennzeichnet. Das gekennzeichnete Hinf-Fragment aus Plasmid 036 wurde in pBS- subcloniert und ergab das hohe Kopienzahlen ergebende Plasmid pBS036. Dieses wurde wie in Beispiel 3 (Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt) beschrieben, analysiert und diente als Quelle der Hybridisierungs-Sonde, die aus dem, am unteren Ende der Figur gekennzeichneten SacI-Fragment besteht. Einzelne Linien stellen Vektor-Sequenzen und nichtcodierende Gerste-Sequenzen, doppelte Linien die für Gerste-α- Amylase codierende Region dar.
Fig. 8: Die Hybridisierung von Gerste-α-Amylase-cDNA-Fragmenten mit radioaktiv markierter cDNA Poly(A)-reiches RNA aus Kartoffel (Dianella)-Keimen. Restriktionsenzymfragmente aus Gerste-α-Amylase-cDNA-Clonen und Kontrollplasmide wurden zweifach auf 2 % Agarosegel aufgetrennt, und die Ethidiumbromid-gefärbten Fragmente sind in Abschnitt B dargestellt. Die Fragmente wurden auf Nitrocellulosefilter transferiert, und ein Filter wurde mit 5 x 10&sup6; cpm radioaktiv markierter cDNA, die aus von Dianella- Keimen isolierter Poly(A)-RNA synthetisiert worden war, hybridisiert (Abschnitt A). Der andere Filter wurde mit 4 x 10&sup6; cpm radioaktiv markierter cDNA, die aus Poly(A)-reicher RNA aus Gerstenblättern hergestellt worden war, hybridisiert. Beide Filter wurden unter Bedingungen niedriger Stringenz hybridisiert (Hybridisierung bei 67ºC in 6 x SSC, Waschvorgänge bei 67ºC in 4 x SSC). Die Abschnitte A und B zeigen Autoradiogramme der Filter. Die folgenden Plasmid-DNAs wurden auf die verschiedenen Spuren (2 ug pro Spur) aufgetragen: Spur 1: pBR327, mit EcoRI und PstI gespalten (setzt ein 723 bp-Fragment frei, das als negative Kontrolle dient); Spur 2: pKG3730, mit PstI gespalten (setzt ein für Gerste- Ubiquitin codierendes 780 bp-Fragment frei. Ubiquitin-Gene sind stark konserviert und treten in allen Eukaryonten auf (17) - das Fragment dient als positive Konrolle); Spur 3: pBS036, mit SacI gespalten (setzt das nachfolgend als Sonde verwendete 800 bp-Fragment frei); Spur 4: pBR327 mit BstNI gespalten (Größenmarker: 1855 bp, 928 bp und 475 bp); Spur 5: Plasmid-pBS050, mit PstI gespalten (setzt ein für Gerste-α-Amylase-Typ A codierendes cDNA- Fragment frei); Spur 6: Plasmid 036, gespalten mit BamHI und HindIII (setzt das aus pM/C subclonierte Fragment frei, siehe Fig. 7). Die starken Banden in Abschnitten A und B beruhen auf nicht erklärten Fehlhybridisierungen mit der unbekannten Region der Plasmide 036 und pBS036, in Fig. 7 mit Sternen gekennzeichnet. Die schwächeren, durch Dreiecke gekennzeichneten Banden stellen die spezifischen Hybridisierungen der für Gerste-α-Amylase codierenden Regionen dar. Spur 2 in Abschnitt A zeigt, daß Kartoffel-Messenger-RNA, wie erwartet, Ubiquitin codierende Sequenzen enthält.
Fig. 9: Die Analysen der wahrscheinlichen Kartoffel-α- Amylase-cDNA-Clone. Plasmid-DNA von sechs der acht gereinigten Plasmide aus der Kartoffel-cDNA-Genbank wurde mit EcoRI gespalten, auf einem 2 % Agarosegel fraktioniert und mit Ethidiumbromid gefärbt (schwarze Spuren). Die Fragmente wurden auf einen Nitrocellulosefilter transferiert, und der Filter wurde unter Bedingungen niedriger Stringenz (Hybridisierung bei 67ºC in 6 x SSC, Waschvorgänge bei 67ºC in 4 x SSC) mit der nicktranslatierten Gerste-α-Amylase-SacI-Sonde hybridisiert. Die weißen Spuren zeigen die resultierenden Autoradiogramme und die hybridisierenden EcoRI-Fragmente im Original-Autoradiogramm sind mit Pfeilen bezeichnet. Die vollständigen, den Plasmiden gegebenen Namen sind AmyZ2, AmyZ3, AmyZ4, AmyZ5, AmyZ6 und AmyZ7. M1 und M2 sind Größenmarker; M1 ist pBR327, mit BstNI gespalten (1855 bp, 928 bp und 475 bp), M2 ist pBR327, mit HinfI gespalten (1631 bp, 517 bp, 452 bp, 298 bp und 154 bp). Abschnitt C zeigt die homologe, im selben Experiment durchgeführte Hybridisierung von mit SacI gespaltenem pBS036 mit der SacI-Sonde.
Fig. 10: Die EcoRI-Restriktionskarten von Kartoffel-α- Amylase-cDNA-Clonen. Alle Restriktionskarten sind nach der Bestimmung der DNA-Sequenzen verfeinert worden. In den Restriktionskarten der Clone sind lediglich die EcoRI-Restriktionsschnittstellen dargestellt. Die terminalen EcoRI-Restriktionsschnittstellen befinden sich im EcoRI-Linker, mit dem die Insertionen in die EcoRI-Restriktionsschnittstelle im Vektor, pBlueScript SK-, eingefügt wurde. Die Sequenzen der Insertionen von AmyZ5, 7 und 8 sind vollständig identisch. Die mit der Gerste-α- Amylase-Sonde hybridisierenden EcoRI-Fragmente sind durch eine besonders dünne Linie gekennzeichnet. In Fig. 9 hybridisierten schwache, 285 Basenpaare lange Banden in den Spuren Z5 und Z7, und die kryptische EcoRI-Restriktionsschnittstelle, aufgrund derer diese Banden auftauchen, ist in Klammern dargestellt. Die eingekreisten Zahlen über der Figur kennzeichnen die in Southern- und Northern-Hybridisierungen (Fig. 19 bzw. Fig. 21) verwendeten EcoRI- Fragmente. Clon AmyZ2 enthält als Ergebnis eines normalen Clonierungs-Artefacts einen Strang von 76 nicht stabilen T-Resten.
Fig. 11: Die Sequenzierungsstrategie für die Insertionen der Plasmide AmyZ3 und AmyZ4 und die zusammenfassende Restriktionskarte für AmyZ3/4. Die Pfeile zeigen die Richtung und Länge der in den einzelnen Sequenzierungsanalysen erhaltenen Sequenzen. Die Abkürzungen für die Spaltungsstellen der Restriktionsenzyme sind E=EcoRI, H=HindIII, Ha=HaeIII, X=XhoII. Oberhalb der Restriktionskarte ist die Lage des offenen Leserasters für den α-Amylase-Vorläufer eingerahmt dargestellt. Die schraffierten Bereiche bezeichnen die Signalpeptide und die nicht-schraffierten Bereiche das reife α-Amylase-Protein. In der kombinierten Restriktionskarte aus AmyZ3 und AmyZ4 ist die Lage der offenen Leseraster in der 5'-Signalpeptidsequenz dargestellt; genauere Einzelheiten sind in Fig. 17 dargestellt.
Fig. 12: Die Sequenzierungsstrategie für die Insertionen der Plasmide AmyZ1 und AmyZ6. Die Pfeile zeigen die Richtung und Länge der in den einzelnen Sequenzierungsanalysen erhaltenen Sequenzen. Die Abkürzungen für die Spaltungsstellen der Restriktionsenzyme sind E=EcoRI, H=HindIII, B=BamHI, Bg=BglII, Ha=HaeIII, T=Taq. Oberhalb der Restriktionskarte ist die Lage des offenen Leserasters für α-Amylase eingerahmt dargestellt.
Fig. 13: Die Sequenzierungsstrategie für die Insertionen der Plasmide AmyZ2 und AmyZ7. Die Pfeile zeigen die Richtung und Länge der in den einzelnen Sequenzierungsanalysen erhaltenen Sequenzen. Die Insertion in Plasmid AmyZ2 hat als Resultat eines häufig auftretenden Clonierungs-Artefacts am linken Ende einen Strang von 76 T-Resten. In für die Sequenzbestimmung verwendeten Subclonen wurde ein Teil der T-Reste deletiert, und dieser Vorgang ist durch den Pfeil dargestellt. Die Abkürzungen für die Spaltungsstellen der Restriktionsenzyme sind Al=AluI, E=EcoRI, M=HindIII, Bg=BgIII. Oberhalb der Restriktionskarte ist die Lage des offenen Leserasters für die α-Amylase eingerahmt dargestellt.
Fig. 14: Die Nucleotidsequenzhomologie zwischen den codierenden Sequenzen aus Kartoffel- und Gerste-α- Amylase. Diese Figur zeigt in der oberen Reihe die Sequenz des EcoRI-Fragments aus AmyZ4, das mit der Gerste-SacI-Sonde (Fig. 7), wie in Fig. 9 dargestellt, hybridisiert. Die Kartoffelsequenz ist dem entsprechenden Bereich in der SacI-Sonde gegenübergestellt (U = Uracil ersetzt T, wenn die Sequenz als RNA geschrieben wird). Die Gesamthomologie zwischen den Sequenzen beträgt 63,5 % (nicht- komplementäre Nucleotide sind in die Gesamtlänge eingeschlossen). Ein Bereich von 146 Nucleotiden mit einer Homologie von 73 % ist eingerahmt, und darin ist ein kleinerer, 46 Nucleotide mit 80 % Homologie umfassender Rahmen dargestellt.
Fig. 15: Die Homologie zwischen der Kartoffel-AmyZ3/4-α- Amylase und der Gerste-α-Amylase. Die Figur zeigt die Aminosäuresequenzen des reifen Kartoffel-α- Amylase-Enzyms in der oberen Reihe (aus Fig. 1) und das reife, aus der pM/C-Sequenz abgeleitete Gerste- Amylase B-Enzym in der unteren Reihe (24). Identische Aminosäuren sind durch einen Strich und konservierte Aminosäuren durch zwei Punkte dargestellt. Lücken wurden eingefügt, um die Ähnlichkeit auf ein Höchstmaß zu bringen. Der Prozentsatz identischer Aminosäuren beträgt 45,6 % (nicht übereinstimmende Aminosäuren sind in der Gesamtlänge eingeschlossen). Der Kasten zeigt ein Peptid, das in in Säugern und Insekten gefundenen α-Amylasen konserviert ist.
Fig. 16: Die Homologie zwischen Kartoffel-AmyZ1-α-Amylase und Gerste-α-Amylase. Die Figur zeigt in der unteren Reihe die partielle Aminosäuresequenz des reifen Kartoffel-α-Amylase-Enzyms (von Fig. 3) und in der oberen Reihe das reife, durch pM/C codierte Gerste-Amylase-B-Enzym (24). Identische Aminosäuren sind durch zwei Punkte und konservierte Aminosäuren durch einen Punkt dargestellt. Eine Lücke wurde eingefügt, um die Ähnlichkeit auf ein Höchstmaß zu bringen. Der Prozentsatz identischer Aminosäuren beträgt 64,1 % (die nicht übereinstimmende Aminosäure ist in der Gesamtlänge eingeschlossen).
Fig. 17: Die offenen Leseraster am 5'-Ende der AmyZ3-Sequenz. Der Umfang der offenen Leseraster ist oben, die Aminosäuresequenzen sind unten dargestellt. Die Lage des Introns in AmyZ3 ist ebenfalls dargestellt.
Fig. 18: Ein Hydrophilitätsprofil des Kartoffel-α-Amylase- Vorläuferproteins. Die Aminosäuresequenz ist in Fig. 1 dargestellt, und die Analyse wurde nach dem Verfahren von Hopp und Woods (25) durchgeführt. Ein Teil des Diagramms ist erweitert, um den kurzen hydrophoben Bereich des Signalpeptids zu veranschaulichen. In der unteren Darstellung sind die zum hydrophoben Bereich beitragenden Aminosäuren durch kleine Kreise und die wahrscheinliche Prozessierungsstelle durch einen Pfeil dargestellt.
Fig. 19: Southern-Hybridisierungen von genomischer DNA aus Kartoffeln mit Kartoffel-α-Amylase-Sonden. Saturna- DNA wurde mit Restriktionsenzymen gespalten und auf einem 8 % Agarosegel aufgetrennt, die DNA-Fragmente auf Nitrocellulosefilter transferiert und die Filter unter Bedingungen mittlerer Stringenz mit nicktranslatierten EcoRI-Fragmenten aus AmyZ3 hybridisiert. Die Figur zeigt die resultierenden Autoradiogramme. Spuren 1 und 2 enthalten mit HindIII gespaltene DNA, Spur 3 enthält mit BamHI gespaltene DNA und Spuren 4 und 5 enthalten mit EcoRI gespaltene DNA. Spur 6 zeigt eine kürzere Belichtungszeit von Spur 3. Die in der Mitte befindlichen Spuren 2, 3 und 4 wurden mit den nicktranslatierten EcoRI- Fragmenten Nr. 2, 3 und 4 aus AmyZ3 hybridisiert, und Spuren 1 und 5 wurden mit dem nicktranslatierten EcoRI-Fragment Nr. 1 hybridisiert (Fig. 10). Die Zahlen auf der linken Seite bezeichnen in Kbp den Größenmarker. Dieser besteht aus mit Ethidiumbromid gefärbten HindIII-Fragmenten von lambda-Phagen-DNA.
Fig. 20: Southern-Hybridisierungen zweier Kartoffelsorten mit α-Amylase-Sonden des AmyZ3/4- und des AmyZ1- Typs. Das verwendete Verfahren ist in Fig. 19 beschrieben. Das auf der linken Seite befindliche Autoradiogramm zeigt die Hybridisierung der vollständigen α-Amylase-Insertion aus Plasmid AmyZ3 mit genomischer DNA aus den Kartoffelsorten Saturna und Dianella. Das Autoradiogramm auf der rechten Seite zeigt die Hybridisierung der vollständigen α- Amylase-Insertion aus Plasmid AmyZ6 mit genomischer DNA der Kartoffelsorten Saturna und Dianella. Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme sind: H=HindIII, B=BamHI, E=EcoRI. Die Zahlen in der Mitte bezeichnen den Ethidiumbromid-gefärbten Größenmarker (HindIII-Fragmente von lambda-Phagen- DNA) in Kbp.
Fig. 21: Northern-Hybridisierung von Kartoffel-RNA. RNA aus Keimen und Knollen aus den Sorten Saturna und Dianella wurde nach Denaturierung auf Agarosegelen aufgetrennt und die ebenfalls Kartoffel-RNA enthaltenden Kontrollspuren wurden mit Methylen-Blau gefärbt, um die ribosomalen RNAs sichtbar zu machen. Ihre Wanderung ist durch dünne Pfeile dargestellt, der obere Pfeil zeigt die 26S-RNA (etwa 4.400 Nucleotide) und der untere Pfeil zeigt die 18S-RNA (ungefähr 1.850 Nucleotide). Die RNA in den übrigen Spuren wurde auf Nitrocellulose transferiert, die Filter mit spezifischen Kartoffel-α-Amylase-Sonden hybridisiert und anschließend autoradiographiert. Keim-RNA aus Saturna wurde mit dem nicktranslatierten EcoRI-Fragment Nr. 1 aus AmyZ3 (Fig. 10) hybridisiert, die drei anderen RNAs wurden mit dem nicktranslatierten EcoRI-Fragment Nr. 2, 3 und 4 aus AmyZ3 hybridisiert. Die Dianella-Keim-RNA war die für die Konstruktion der cDNA-Genbank verwendete Poly(A)-reiche Fraktion, wohingegen die anderen drei Spuren Gesamt-RNA enthielten. Die dicken Pfeile bezeichnen die Position von im Original- Autoradiogramm sichtbaren α-Amylase-spezifischen Banden und ihre ungefähren Größen sind in der Tabelle in Beispiel 17 aufgeführt.
Fig. 22: Die reduzierenden Zuckermengen in gelagerten Kartoffeln. Die Mengen an Glucose und Fructose (die phosphorylierten Formen eingeschlossen) wurden zur Zeit der Ernte und während der nachfolgenden langen Lagerungszeit bei 8ºC in vier Kartoffelsorten bestimmt. Die Figur zeigt die Summe der Glucose- und Fructose-Mengen.
Fig. 23: Die reduzierenden Zuckermengen bei verschiedenen Lagerungstemperaturen. Die Mengen an Glucose und Fructose (die phosphorylierten Formen eingeschlossen) wurden in vier Kartoffelsorten, die 19 Wochen bei 8ºC, 19 Wochen bei 6ºC und 6 Wochen bei 4ºC gelagert worden waren, bestimmt. Die Proben wurden aus allen Kartoffeln am selben Tag entnommen. Die Figur zeigt die Summe der Glucose- und Fructose- Mengen.
Fig. 24: Die α-Amylase-Mengen in gelagerten Kartoffeln. Die α-Amylase-Aktivität wurde im Saft von vier Kartoffelsorten, die je 19 Wochen bei 8ºC und bei 6ºC gelagert worden waren, bestimmt (Methode 2). Die Figur zeigt die bei den beiden Temperaturen erhaltenen Durchschnittswerte als eine Funktion der Menge an reduzierenden Zuckern nach 19 Wochen Lagerung bei 8ºC.

MATERIALIEN UND METHODEN

Kartoffelsorten

Die folgenden Kartoffelsorten wurden benutzt: Dianella, Saturna, Bintje, Lady Rosetta.
Diese Kartoffelsorten wurden ausgewählt, um die Beziehung zwischen reduzierendem Zucker und α-Amylase-Aktivität zu veranschaulichen, und um die Sorte und/oder das Gewebe zu bestimmen, aus der/dem α-Amylase-Clone in der vorteilhaftesten Weise isoliert werden konnten.
Dianella ist eine aufgrund ihres hohen Stärkegehaltes als Ausgangsmaterial für die Alkoholfermentation verwendete Sorte. Dianella wurde gewählt, da die Sorte gut bekannt ist und wahrscheinlich ein außergewöhnliches Beispiel für den Zuckermetabolismus in Kartoffeln darstellt.
Die Sorte Saturna ist bekannt für ihren niedrigen Gehalt an reduzierenden Zuckern, was sie besonders geeignet für den Gebrauch in der Herstellung von z.B. Kartoffelchips macht. Sie ist eine der wenigen Kartoffelsorten, in der der Zuckergehalt niedrig genug ist, um nach verlängerter Lagerung Kartoffelchips herstellen zu können. Die Sorte ist allerdings relativ anspruchsvoll in der Kultivierung, insbesondere was den Wasserbedarf betrifft. Es ist daher wünschenswert, daß neue Kartoffelsorten mit einem gleichermaßen niedrigen Gehalt an reduzierenden Zuckern gezüchtet werden.
Bintje ist eine bekannte Sorte, die vor allem für den normalen Verbrauch verwendet wird. Ihr Gehalt an reduzierenden Zuckern liegt zwischen dem von Dianella und Saturna.
Lady Rosetta ist eine neue Sorte, die in der Herstellung von z.B. Kartoffelchips verwendet wird. Sie ist eine der wenigen Kartoffelsorten, deren Gehalt an reduzierenden Zuckern niedrig genug ist, um in der Herstellung von Chips verwendet werden zu können. Sie befindet sich allerdings noch in der Versuchsphase.

Bakterielle Stämme

HB101: hsm, hrs, recA, gal, pro strR
JM109: recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relA1, lambda&supmin;, Δ(lac&supmin; proAB), [F', traD36, proAB, LacIqZΔM15]
XL1-Blue: endA1, hsdR17 (r&supmin;k, m&spplus;k), supE44, thi-1, lambda&supmin;, recA1, gyrA96, relA1, Δ(lac), [F', proAB, lacIq, ZΔM15, Tn10(tetR)]
BB4: recA&spplus;, lacIq, ZΔM15, tetR
JM109: siehe Referenz (48)
XL1: siehe Referenz (20, 49)
BB4: siehe Referenz (31)
HB101: siehe Referenz (50)

Phagen und Plasmide

lambda-ZAP: siehe Referenz (31)
R408 Interferenzresistenter Helferphage: siehe Referenz (31)
pBR327: siehe Referenz (51)
pBS+, pBS-: siehe Referenz (31)

Medium und Platten

L-Nähr-(LB)-Medium:

Pro Liter: 5 g Hefeextrakt, 5 g NZ-Amid, 5 g NaCl, 5 g Bacto-Pepton, Autoklavieren.

LB-Platten:

LB-Medium, plus 15 g Bacto-Agar pro Liter. Autoklavieren. In Plastik-Petri-Schalen (25 ml pro Platte) gießen.

Tet-Platten:

Wie LB-Platten, plus 17 mg Tetracyclin pro Liter nach Autoklavieren.

Amp-Platten:

Wie LB-Platten, plus 35 mg Ampicillin pro Liter nach Autoklavieren.

AXI-Platten:

Wie LB-Platten, plus 35 mg Ampicillin, 120 mg IPTG (Isopropylthiogalactosid), 40 mg Xgal (in Dimethylformamid gelöst) pro Liter nach Autoklavieren.
Xgal: 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid.
Minimal-Medium: 400 ml H&sub2;O, 1 ml Lösung B, 100 ml Lösung A, 5 ml (0,5 mg/ml) Thiamin, 5 ml 20 % Glycerol. Lösung A ist 10 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 24 g Na&sub2;HPO&sub4;, 15 g KH&sub2;PO&sub4;, 15 g NaCl pro Liter H&sub2;O. Lösung B ist 200 g MgCl&sub2;.2H&sub2;O, 7,2 g CaCl&sub2;.2H&sub2;O und 20 ml Mikronährlösung pro Liter. Mikronährlösung ist 10 uM FeCl&sub2;, 500 nM CaCl&sub2;.2H&sub2;O, 400 nM H&sub3;BO&sub3;, 80 nM MnCl&sub2;, 30 nM CoCl&sub2;, 10 nM CuCl&sub2;, 3 nM (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;. Bei Platten werden 15 g Agar pro Liter hinzugegeben. Autoklavieren.

Einfrieren von Kartoffelproben

Um die Amylase-Aktivität messen zu können, wurden die Kartoffelproben zunächst gefroren. Ein Metalleimer wurde zu 2/3 mit flüssigem Stickstoff gefüllt, und eine zur Hälfte mit dem Kartoffelmaterial gefüllte Plastikschüssel wurde in den Eimer mit flüssigem Stickstoff gestellt. Eine in flüssigern Stickstoff gekühlte Schüssel zum Mischen wurde mit dem gekühlten Kartoffelmaterial aufgefüllt, und zwei Teelöffel Ascorbinsäure wurden zugegeben. Das Kartoffelmaterial wurde gemischt, bis es eine mehlartige Konsistenz besaß. Ein 800 ml Becher wurde in flüssigem Stickstoff gekühlt und eine Kartoffelprobe hineingegossen. Jede Probe wurde in zwei Portionen aufgeteilt, die in zwei Stomacker-Taschen gestellt wurden. Die Taschen wurden so schnell wie möglich in einen Gefrierschrank gestellt. Dieses gefrorene Kartoffelmaterial wird fortan als "vorbehandeltes Material" bezeichnet.

Bestimmung der reduzierenden Zuckermengen in Kartoffeln

25 g des vorbehandelten Materials wurden abgewogen, mit Eiswasser auf 125 ml aufgefüllt, 1 Minute gemischt und 10 Minuten bei 0ºC und 14.000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen, sterilfiltriert, 10 Minuten in einem Wasserbad erhitzt und nochmals sterilfiltriert. Die Bestimmung der Mengen an D-Glucose vor und nach der enzymatischen Hydrolyse von Sucrose, sowie die Bestimmung der Mengen an D- Fructose nach der Bestimmung der Mengen an D-Glucose wurden mit einem Sucrose/D-Glucose/D-Fructose-Testkit von Boehringer Mannheim gemäß der Vorschrift des Herstellers durchgeführt.

Qualitative Bestimmung der Amalyse-Aktivität in Kartoffeln

Kartoffelknollen (Sorten Saturna und Dianella) wurden bei 20ºC 14 Tage lang in einem Dunkelschrank gelagert.
Gewebeextrakte dieser Knollen und ihrer weißen Keime wurden präpariert, indem 2 g frisches Gewebe (oder in manchen Fällen 10 g gefrorenes Gewebe) in 5 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 6,2), 1 mM CaCl&sub2;.6H&sub2;O gemahlen wurden. Das Homogenat wurde 5 Minuten bei 10.000 UpM und 4ºC in 15 ml Corex-Röhrchen zentrifugiert. 5 ul des Überstandes wurde auf eine Glasplatte getropft, die mit einer dünnen Schicht 1 % Gew./Vol. Stärke bedeckt war. Die Glasplatte wurde (mit der dünnen Schicht nach oben) auf vier Schichten befeuchtetes Filterpapier in eine Petri-Schale gestellt. Um die Funktion des Enzyms zu garantieren, wurde darauf geachtet, daß die Stärkeplatte unter feuchten Bedingungen inkubiert wurde. Die Petri-Schale wurde 16 Stunden entweder bei 20ºC oder bei 37ºC inkubiert. Die Stärkeplatten wurden in I&sub2;/KI-Lösung getaucht und mit deionisiertem Wasser gespült. Die I&sub2;/KI-Lösung gibt Stärke eine tiefblaue Farbe, die verschwindet, wenn Stärke zu Glucose und Maltose gespalten worden ist (eine "starke" Reaktion). Bei einer "schwachen" Reaktion ist der Punkt rötlich, mit einer deutlichen Änderung in der Oberfläche im Vergleich zur Umgebung (glatter) (7).

Quantitative Bestimmung der α-Amylase-Aktivität (Methode 2)

Folgendes Verfahren wurde für jede Probe vorbehandelten Kartoffelmaterials verwendet. Alle Bestimmungen wurden zweifach ausgeführt. Von jeder Probe vorbehandelten Kartoffelmaterials wurden vier Proben entnommen und damit acht Bestimmungen gemacht.
Ein 75 ml-Becher wurde mit dem wie oben vorbehandelten Material gefüllt und mit Parafilm versiegelt. Nach dem Auftauen, wahlweise in einem Wasserbad, wurde die Flüssigkeit in ein Zentrifugenröhrchen dekantiert und 10 Minuten bei 14.000 UpM zentrifugiert. 10 ml Puffer (pH 5,5) wurde mit einer 10 ml Pipette in einen Erlenmeyer-Kolben pipettiert, und eine Phadabas blaue Stärkepulvertablette (Pharmacia Diagnostics Ltd.) wurde zugegeben. Die Tablette wurde durch leichtes Schütteln des Kolbens gelöst. Schließlich wurden 5 ml Überstand von der zentrifugierten Flüssigkeit mit einer 5 ml-Pipette zu der Lösung gegeben, wobei darauf geachtet wurde, daß das Präzipitat nicht aufgerührt wurde. Nach Zugabe von 10.000 I.E. Penicillin wurde der Kolben mit Parafilm versiegelt.
Die Kolben wurden 48 Stunden in ein 45ºC-Wasserbad gestellt, danach in einer Wanne mit kaltem Wasser gekühlt. Die optische Dichte der Proben wurde spektrophotometrisch bei 620 nm ermittelt, wobei ein Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 als Blindprobe diente. Die Konzentration von α-Amylase in den Proben wurde automatisch auf der Grundlage dieser Messungen berechnet.
Die Proteinkonzentration in den Überständen wurde gemäß der Methode von Lowry (52) bestimmt.

Ernte von Kartoffelgewebe für RNA/DNA-Isolierungen

Knollen (Dianella, Saturna) wurden bei 20ºC in einen Dunkelschrank gelegt. Die sich entwickelnden weißen Keime wurden nach 14 Tagen geerntet und in kleinere Stücke geschnitten. Das Gewebe wurde sofort nach dem Schneiden in Trockeneis gefroren und bei -80ºC bis zur Weiterverwendung aufbewahrt. Knollen (Dianella, Saturna, Bintje, Lady Rosetta) wurden geschält und mit einer Reibe direkt auf eine auf Trockeneis gelegte Alufolie gerieben. 10 g-Portionen wurden bei -80ºC bis zum Gebrauch gelagert.

Extraktion von RNA aus Kartoffelkeimen

Gesamt-RNA aus weißen Kartoffelkeimen (Solanum tuberosum, Dianella- und Saturna-Sorten) wurde nach Zerreiben in flüssigem Stickstoff gemäß der im folgenden beschriebenen Guanidinthiocyanat/N-Sarcosin-Methode nach Kaplan et al. (8) extrahiert und gereinigt.
10 g gefrorene, in Scheiben geschnittene Kartoffelkeime wurden in 6 Volumen (Gew./Vol.) 5,0 M Guanidinthiocyanat, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA und 5 % 2-Mercaptoethanol homogenisiert. Das Homogenat wurde mit 4 % Gew./Vol. N-Laurylsarcosin und 0,15 g/ml (Endkonzentration) festem CsCl versetzt. Das Homogenat wurde 20 Minuten bei 10.000 UpM und 4ºC zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde vorsichtig über ein 2,5 ml-Kissen 5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA geschichtet und in einem Beckman SW-41-Rotor 18 Stunden bei 37.000 UpM und 20ºC zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das Homogenat vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette entnommen und die Polyallomer-Röhrchen dreimal mit Wasser gewaschen. Nach Entfernung des CsCl-Kissens wurden die RNA-Pellets in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) resuspendiert und durch Zugabe von 2,5 Volumen kaltem Ethanol gefällt.
Das Pellet wurde in 10 mM Tris-HCl resuspendiert und nach Zugabe von 100 mM (Endkonzentration) NaCl mit 2,5 Volumen kaltem Ethanol gefällt. Das RNA-Pellet wurde in 10 mM Tris- HCl (pH 7,5), 2 mM EDTA, 100 mM NaCl resuspendiert und die RNA-Konzentration durch Messung der optischen Dichte bei 260 nm (OD = 1 für eine Lösung mit 40 ug RNA pro ml) bestimmt.
Die für die Isolierung von Poly(A)-reicher RNA verwendete Gesamt-RNA wurde in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM EDTA, 100 mM NaCl und 0,5 % Natriumdodecylsulfat (SDS) resuspendiert.

Extraktion von RNA aus Knollen

Es war nicht möglich, RNA aus Knollengewebe mit der oben beschriebenen konventionellen Methode (d.h. mit der Guanidinthiocyanat/N-Sarcosin-Methode) zu isolieren. Guanidinthiocyanat reagierte mit der Stärke, und die Produkte hatten eine geléeartige Konsistenz. Es war unmöglich, die RNA aus dieser trüben Flüssigkeit durch das CsCl-Kissen zu zentrifugieren. Die hier genannten Erfinder mußten daher eine andere Methode entwickeln: Das in flüssigem Stickstoff gemahlene Knollengewebe wurde in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 5 % 2-Mercaptoethanol, 1 % SDS resuspendiert und 20 Minuten bei 65ºC inkubiert. Das Homogenat wurde mit 3 % (Gew./Vol.) N-Laurylsarcosin und 0,15 g/ml (Endkonzentration) festem CsCl versetzt. Das Homogenat wurde 20 Minuten bei 10.000 UpM und 4ºC zentrifugiert (International), um Zelltrümmer zu entfernen. Die RNA wurde dann durch Zentrifugation über ein CsCl-Kissen, wie oben beschrieben (9), isoliert.

RNA-Elektrophorese

Die RNA-Proben wurden in 0,5 M Glyoxal (deionisiert, bei -20ºC gelagert), 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;/NaH&sub2;PO&sub4; (pH 6,5), 50 % DMSO (Dimethylsulfoxid, bei 4ºC gelagert) (10) denaturiert. Sie wurden dann eine Stunde bei 50ºC inkubiert und 5 bis 10 Minuten vor Zugabe des Probenpuffers (35 % Ficoll (Molekulargewicht (MW) 400.000), 0,01 M Na&sub2;HPO&sub4;/NaH&sub2;.PO&sub4; (pH 6,5), 0,4 % Bromphenol-Blau) auf Eis gestellt. Die Proben wurden auf ein 1,5 % Agarosegel in 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;/Na&sub2;PO&sub4; (pH 6,5) geladen und die Elektrophorese mit 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;/NaH&sub2;PO&sub4; (pH 6,5) als Elektrophorese-Puffer unter Pufferzirkulation bei 35 mA für etwa 2 1/2 Stunden (11) durchgeführt. Ein oder zwei Spuren wurden vom Gel abgetrennt und die RNA über Nacht in Methylen-Blau-Lösung (33,5 ml 3 M Natriumacetat, 100 ml 1 M Essigsäure, 10 mg Methylen-Blau, mit H&sub2;O auf 500 ml auffüllen) gefärbt.

Northern Blot

Eine Glasplatte wurde in einer Wanne auf einen Träger gestellt, der die Glasplatte um 5 bis 6 cm anhob. Ein in 0, 025 M Na&sub2;HPO&sub4;/NaH&sub2;PO&sub4; (pH 6,5) befeuchtetes Stück Filterpapier wurde so auf die Glasplatte gelegt, daß die Enden und Seiten den Boden der Wanne berührten.
Es wurde so viel 0,025 M Na&sub2;HPO&sub4;/NaH&sub2;PO&sub4; (pH 6,5) in die Wanne gegossen, daß die Oberfläche die Glasplatte gerade berührte. Das RNA-Gel wurde auf das feuchte Filterpapier gelegt. Eine Gene-Screen-(New England Nuclear)-Membran wurde genau in der Größe des Gels geschnitten, in 0,025 M Na&sub2;HPO&sub4;/NaH&sub2;PO&sub4; (pH 6,5) getaucht und auf das Gel gelegt, wobei Luftblasen zwischen Gel und Membran vermieden wurden.
Die Ränder der Membran wurden durch vier Stücke Parafilm abgedeckt und ein mit 0,025 M Na&sub2;HPO&sub4;/NaH&sub2;PO&sub4; (pH 6,5) befeuchtetes Stück Filterpapier wurde obenauf gelegt. Mehrere Stücke (20 bis 25) Filterpapier wurden obenauf gelegt, und auf diese wiederum mehrere Lagen Papiertücher (6 bis 8 cm). Filterpapier und Papiertücher waren in der Größe des Gels geschnitten. Eine Glasplatte und ein Gewicht wurden auf die Papiertücher gestellt. Die Transferdauer betrug 16 Stunden. Papiertücher, Filterpapier und Parafilm wurden entfernt. Größenmarker (18S rRNA und 28S rRNA) wurden auf der Membran markiert, wobei das über Nacht in Methylen-Blau gefärbte Gelstück verwendet wurde. Die Membran wurde in 0,025 M Na&sub2;HPO&sub4;/NaH&sub2;PO&sub4; (pH 6,5) gewaschen, an der Luft getrocknet und zwei Stunden bei 80ºC (11) gebacken.

Hybridisierung von RNA

Die Gene-Screen-Membran wurde 30 Minuten in 6 x SSC bei Raumtemperatur unter konstantem Schütteln befeuchtet. Die Membran wurde anschließend in einer Lösung aus 50 % Formamid (deionisiert), 0,2 % Polyvinylpyrrolidon (MW 40.000), 0,2 % Rinderserumalbumin, 0,2 % Ficoll (MW 400.000), 0,05 M Tris- HCl (pH 7,5), 1,0 M NaCl, 0,1 % Na&sub4;P&sub2;O&sub7;, 1,0 % SDS, 10 % Dextransulphat (MW 500.000) denaturierter, ultraschallbehandelter Lachssperma-DNA (50 ug/ml) und 10 ug/ml Poly(A)-RNA prähybridisiert. Das Volumen der Prähybridisierungslösung war 100 ul/cm² einer Membran in einer versiegelten Plastiktüte. Die Prähybridisierung wurde in einer versiegelten Plastiktüte, die 6 Stunden bei 42ºC unter konstantem Schütteln inkubiert wurde, durchgeführt. Danach wurden 1/5 des Flüssigvolumens von der folgenden Lösung dazugegeben: 50 % Formamid (deionisiert), 0,2 % Polyvinylpyrrolidon (MW 40.000), 0,2 % Rinderserumalbumin, 0,2 % Ficoll (MW 400.000), 0,05 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 % Na&sub4;P&sub2;O&sub7;, 1,0 % SDS, denaturierte, ultraschallbehandelte Lachssperma-DNA (50 ug/ml), Poly(A) (10 ug/ml) und die denaturierte, radioaktiv markierte Sonde (5 ng/ml Prähybridisierungs- und Hybridisierungslösung). Die Tüte wurde wieder versiegelt und unter konstantem Schütteln 16 bis 20 Stunden bei 42ºC inkubiert. Die Hybridisierungslösung wurde entfernt und die Membran 2 x 5 Minuten bei Raumtemperatur in 2 x SSC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,59, je einmal 10 Minuten und einmal 30 Minuten bei 67ºC in 2 x SSC, 10 % SDS und schießlich je einmal 5 Minuten und einmal 30 Minuten bei Raumtemperatur in 0,1 x SSC gewaschen. Alle Waschvorgänge fanden unter konstantem Schütteln (11) statt. Die Membran wurde an der Luft getrocknet, mit einer Plastikfolie bedeckt und mit oder ohne Intensivierungsschirm bei -80ºC autoradiographiert. Die Lachssperma-DNA und die radioaktive Sonde wurden durch zehnminütiges Kochen in einem Wasserbad denaturiert und vor der Zugabe zur Hybridisierungslösung auf Eis gestellt.

Isolierung von Poly(A)-reicher RNA

Eine Oligo(dT)-Säule wurde wie folgt hergestellt:
2 g Oligo(dT)-Cellulose/Typ 2 (erworben von Collaborative Research, Inc., Research Product Division, 1365 Main Street, Waltham, Mass., USA) wurden einmal mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und einmal mit 0,5 M KOH gewaschen und durch 8 bis 10 Waschvorgänge mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) neutralisiert. Die Säule wurde bei Raumtemperatur in 1 % SDS gegossen und aufbewahrt. Die Chromatographie erfolgte bei 30ºC und die Puffer wurden vor Gebrauch auf 30ºC erwärmt. Das 1 % SDS wurde durch den Durchfluß von 2 Volumen 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) durch die Säule entfernt. Vor Zugabe der RNA-Probe wurde die Säule durch den Durchfluß von 2 Volumen 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 500 mM NaCl auf Hochsalzpuffer eingestellt. Die in 2 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl und 0,5 % SDS gelöste Gesamt-RNA wurde 10 Minuten auf 65ºC erhitzt (um Aggregationen aufzulösen), auf 30ºC abgekühlt und auf eine Konzentration von 500 mM NaCl eingestellt. Die Lösung wurde dann vorsichtig auf die Spitze der Säule aufgetragen und die Säule mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 500 mM NaCl gewaschen, bis die OD&sub2;&sub6;&sub0; des Eluats niedriger als 0,01 war. Die angereicherte Poly(A)-RNA wurde mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) eluiert, und 10 Fraktionen 1 ml wurden gesammelt. Die Poly(A)-reiche RNA wurde aus den Fraktionen mit den höchsten OD&sub2;&sub6;&sub0;-Werten durch Einstellen der Lösung auf 100 mM NaCl (Endkonzentration) und Zugabe von 2,5 Volumen kaltem Ethanol gefällt. Die RNA wurde 20 Minuten bei 10.000 UpM und 4ºC (Sorvall-Kühlzentrifuge) zentrifugiert und unter Vakuum getrocknet. Das trockene Pellet wurde auf Eis in sterilem Wasser (1 ug Poly(A)-reiche RNA pro ul) resuspendiert und bei -20ºC (12) gelagert.

Isolierung genomischer DNA

Genomische DNA wurde aus weißen Kartoffelkeimen isoliert. 10 g gefrorener, in Scheiben geschnittener Kartoffelkeime wurden in flüssigem Stickstoff zermahlen und in 4 Volumen (Gew./Vol.) Proteinase K Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 % SDS und 0,2 mg/ml Proteinase K) homogenisiert. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 30ºC unter zeitweiligem Rühren inkubiert und anschließend 15 Minuten bei 10.000 UpM und 4ºC zentrifugiert. 1 Volumen Chloroform/Isobutanol (24:1) wurde zum Überstand gegeben. Die Phasen wurden anschließend sechs- bis siebenmal gründlich durchmischt, zwischen den Mischvorgängen stehengelassen (der gesamte Vorgang dauerte etwa 20 Minuten) und 20 Minuten bei 10.000 UpM und 4ºC zentrifugiert. Die organische Phase (mit Chlorophyll, falls vorhanden, und Proteinen in der Interphase) wurde verworfen, das Gemisch nochmals mit 1 Volumen Chloroform/Isobutanol (24:1) extrahiert und 20 Minuten bei 10.000 UpM und 4ºC zentrifugiert. 2,5 Volumen kalten Ethanols wurden zur oberen Phase gegeben und das Gemisch über Nacht bei -20ºC gelagert. Nach einem Zentrifugationsschritt (10 Minuten bei 10.000 UpM und 4ºC) wurde das Pellet sorgfältig im Vakuum getrocknet und in 20 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) resuspendiert. Die Lösung wurde vor der Bandierung im CsCl-Gradienten bei 4ºC gelagert. Um zu testen, ob die genomische DNA ein hohes Molekulargewicht besaß, wurden 1 bis 10 ul der genomischen DNA auf einem 1 % Agarosegel analysiert; nicht degradierte DNA verbleibt als breite Bande in der Nähe der Tasche. Die genomische DNA wurde anschließend auf einem CsCl-Gradienten bandiert: 20 g CsCl wurden in 20 ml genomischer DNA gelöst und 1,25 ml Ethidiumbromidlösung (Stammlösung: 5 ug/ml) wurden hinzugegeben. Eine andere Lösung (A) wurde angesetzt: Festes CsCl wurde in TE-Puffer (Gew./Vol.) gelöst und 0,2 mg Ethidiumbromid pro ml wurden hinzugegeben. Die DNA-Lösung wurde in "Quick-seal"-Polyallomer-Röhrchen gefüllt, die anschließend mit Lösung (A) aufgefüllt und versiegelt wurden. Die Röhrchen wurden in einem Beckman VTI-65-Rotor 48 Stunden bei 45.000 UpM und 15ºC zentrifugiert. Die Zentrifuge wurde ohne Einsatz der Bremse gestoppt. Die genomische Bande wurde unter UV-Licht mit einer Spritze abgezogen und das Ethidiumbromid mit CsCl-gesättigtem Isopropanol sieben- bis achtmal extrahiert. Das CsCl wurde anschließend durch 72-stündige Dialyse der DNA in TE-Puffer entfernt, wobei der Puffer sechsmal gewechselt wurde. In der Regel war es nicht nötig, die DNA in diesem Stadium zu fällen (Fällung wurde vermieden, da hochmolekulare DNA sehr schlecht in Lösung geht), es sei denn, sehr wenig DNA wurde isoliert. Die DNA-Konzentration wurde bei OD&sub2;&sub6;&sub0; nm bestimmt, wobei vorausgesetzt wurde, daß einer Konzentration von 50 ug DNA pro ml eine OD&sub2;&sub6;&sub0; = 1 entspricht. Genomische DNA, die für Restriktionsspaltungen verwendet wurde, wurde bei 4ºC (45) gelagert.

Präparation von Plasmid-DNA

Die Präparation von kleinen Mengen Plasmid-DNA wurde wie folgt durchgeführt: Die Plasmide-tragenden bakteriellen Stämme wurden als 2 ml Übernachtkultur (L-Nähr-(LB-)-Medium, versetzt mit entweder 15 ug/ml Tetracyclin (tet) oder 35 ug/ml Ampicillin), gezogen. Die einzelnen Schritte wurden in 1,5 ml Eppendorf-Gefäßen und die Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 4ºC durchgeführt. Die Zellen aus der Übernachtkultur wurden durch zweiminütige Zentrifugation pelletiert, mit 1 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA gewaschen und 2 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde durch Vortexen in 150 ul 15 % Sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH 8,5), 550 mM EDTA resuspendiert. 50 ul Lysozym (4 mg/ml) wurden hinzugeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur und 30 Minuten auf Eis inkubiert. 400 ul eiskaltes H&sub2;O wurden hinzugeben, das Gemisch 5 Minuten auf Eis gehalten, 15 Minuten bei 70 bis 72ºC inkubiert und 15 Minuten zentrifugiert. 75 ul 5,0 M Natriumperchlorat und 200 ul Isopropanol (das Isopropanol wurde bei Raumtemperatur gelagert) wurden zum Überstand gegeben und das Gemisch 15 Minuten bei 5ºC zentrifugiert. Das Pellet wurde in 300 ul 0,3 M Natriumacetat resuspendiert, und 2 bis 3 Volumen kaltes Ethanol wurden hinzugegeben. Die Fällung der DNA erfolgte entweder 5 Minuten bei -80ºC oder über Nacht bei -20ºC. Die DNA wurde 5 Minuten zentrifugiert, 2 Minuten im Vakuum getrocknet und in 20 ul H&sub2;O resuspendiert. Die Ausbeute betrug 5 bis 10 ug Plasmid-DNA (46).
Plasmidpräparationen in großem Maßstab wurden durchgeführt, indem der für eine kleine Präparation verwendete Ansatz zehnmal so groß gewählt wurde. Von allen Bestandteilen wurde die zehnfache Menge verwendet, wobei 15 ml Corex-Röhrchen verwendet wurden. Zentrifugationen wurden in einer Sorvall- Kühlzentrifuge bei 4ºC durchgeführt. Abweichungen von obigem Protokoll werden im folgenden dargestellt: Nach dem Inkubationsschritt bei 70-72ºC wurde 30 Minuten bei 17.000 UpM zentrifugiert. Nach Zugabe von Isopropanol oder kaltem Ethanol wurde 15 Minuten bei 17.000 UpM zentrifugiert. Die nach der letzten Zentrifugation pelletierte Plasmid-DNA wurde in H&sub2;O resuspendiert, in ein Eppendorf-Gefäß überführt und kurz zentrifugiert, um nichtgelöste Partikel zu entfernen. Der Überstand wurde auf eine Endkonzentration von 0,3 M Natriumacetat eingestellt, und 2 bis 3 Volumen kaltes Ethanol wurden hinzugegeben. Das Pellet wurde in 40 ul H&sub2;O resuspendiert. Die Ausbeute betrug in der Regel 20 bis 80 ug Plasmid-DNA.
Um sehr saubere Plasmid-DNA zu erhalten, wurden 200-300 ug der aus dem großen Ansatz isolierten Plasmid-DNA auf einem CsCl-Gradienten bandiert. Festes CsCl wurde in H&sub2;O (1:1, Gew./Vol.) gelöst, und 0,2 mg Ethidiumbromid pro ml wurden hinzugegeben. Die Lösung wurde in ein "Quick-seal"-Polyallomer-Röhrchen dekantiert und die Plasmid-DNA (mit CsCl im Verhältnis 1:1 (Gew./Vol.) versetzt) wurde hinzugegeben. Das Röhrchen wurde aufgefüllt, versiegelt und in einem Beckman VTI-65-Rotor 16 bis 18 Stunden bei 48.000 UpM und 15ºC zentrifugiert. Die Zentrifuge wurde ohne Einsatz der Bremse durch Setzen der Zeitschaltuhr auf O gestoppt. Die Plasmidbande wurde mit einer Spritze abgesaugt, und das Ethidiumbromid mit CsCl-gesättigtem Isopropanol sieben- bis achtmal extrahiert. Das CsCl wurde durch 48-stündige Dialyse in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA entfernt, wobei der Puffer dreimal gewechselt wurde. Fällung der DNA erfolgte durch Einstellen der Lösung auf eine Konzentration von 0,3 M Natriumacetat und Zugabe von 2 bis 3 Volumen kaltem Ethanol (12).

Restriktionsspaltungen

Alle Restriktionsendonucleasen stammten von Biolabs oder Boehringer Mannheim und wurden gemäß Anweisung der Hersteller verwendet. Pro ug DNA wurde eine Einheit Enzym eingesetzt. Die Inkubationsdauer betrug 2 Stunden. Bei Doppelspaltungen wurden die Pufferbedingungen dem zweiten Enzym entweder durch Änderung des Reaktionsvolumens oder durch Zugabe notwendiger Komponenten angepaßt.

Elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten

Nicht-denaturierende Gele

Agarosegele wurden verwendet für die Schätzung der Konzentration von Plasmid-DNA zur Auftrennung restriktionsgespaltener, genomischer DNA (0,8 % oder 1 % Agarosegele), für die Erstellung von Restriktionskarten bei Plasmid-DNA, sowie für Southern Blot (2 % Agarosegele)- oder Northern Blot (1,5 % Agarosegele)-Experimente. Die für Northern Blot- Experimente verwendeten Gele wurden oben beschrieben. Die anderen Gele wurden in einer horizontalen Plattengelapparatur gegossen, und die Elektrophorese wurde entweder in 2 x McArdle-Puffer (2 x McArdle-Puffer : 80 mM Tris, 30 mM NaCl, 24 mM Natriumacetat, 4,4 mM EDTA, mit Eisessig auf pH 8,0 eingestellt) 18 Stunden bei 45 mA oder in 1 x TBE-Puffer (1 x TBE : 89 mM Tris-Borat, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA) 2 bis 3 Stunden bei 70 mA durchgeführt. Die Gele enthielten 5 ug Ethidiumbromid pro ml Gel. Vor dem Auftragen wurden die DNA-Proben mit Proben-Puffer (35 % Ficoll (MW 40.000), 5 mM EDTA, 0,04 % Bromphenol-Blau) versetzt. Die Gele wurden unter langwelligem UV-Licht unter Verwendung eines Orange-Filters und Polaroidfilm Nr. 665 (13, 14) photographiert.
5 % Acrylamidgele wurden für die Erstellung von Restriktionskarten von Plasmid-DNA und für die Isolierung spezifischer DNA-Fragmente verwendet. Das Gel (0,1 x 12 x 15 cm) wurde zwischen zwei Glasplatten, die von Spacern auseinandergehalten wurden, gegossen. Ein Gel enthält 37 ml H&sub2;O, 17,5 ml 19 % Acrylamid, 1 % Bisacrylamid, 4,4 ml TEMED (0,5 % N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin), 7 ml 10 x TBE, 4,4 ml Amper (1,6 % Ammoniumperoxodisulfat). Die Elektrophorese wurde 2 Stunden bei 180-200 V in einer vertikalen Plattengelapparatur durchgeführt. Das Gel wurde 30 Minuten in 5 ug/ml Ethidiumbromid gefärbt, wonach die Banden unter langwelligem UV-Licht sichtbar waren und, wie oben beschrieben (13), photographiert wurden.

DNA-Sequenziergele

8 % Acrylamid - 8 M Harnstoffgele (0,035 x 20 x 47 cm) wurden für die Auftrennung von DNA-Fragmenten nach Sequenzierreaktionen verwendet. Ein Gel enthielt die folgenden Bestandteile: 15,75 ml 38 % Acrylamid, 2 % Bisacrylamid, 36 g Harnstoff und H&sub2;O ad 70 ml. Die Lösung wurde unter Verwendung von einem Löffel Ionenaustauscher 30 Minuten unter Rühren deionisiert und nach Entfernung des Ionenaustauschers durch Filtration mit 7,5 ml 10 x TBE, 1 ml H&sub2;O, 2,7 ml Amper (1,6 %) versetzt. Die Lösung wurde entgast, auf Eis gekühlt und mit 40 ul konzentriertem TEMED versetzt. Das Gel wurde sofort zwischen zwei durch Spacer auseinandergehaltene Glasplatten gegossen. Die Elektrophorese wurde 1 1/2 bis 4 Stunden bei 40 W durchgeführt. Das Gel wurde anschließend auf einem Geltrockner getrocknet und 3 bis 48 Stunden bei Raumtemperatur (12) autoradiographiert.

Isolierung von DNA aus Gelen

DNA-Fragmente wurden aus Acrylamid-Gelen eluiert, um Probleme mit in Agarose vorkommenden, für Enzyme toxischen Substanzen zu umgehen. Das aus einer 5 % Acrylamid-Gelmatrix geschnittene DNA-Fragment wurde zusammen mit 200 ul 0,5 x TBE in einen Dialyseschlauch transferiert. Der Schlauch wurde parallel zu den Elektroden in eine horizontale Gelapparatur gelegt und mit 0,5 x TBE durchtränkt. Die Elektrophorese wurde 2 bis 4 Stunden bei 150 V durchgeführt. Der Strom wurde 30 Sekunden umgepolt und der Schlauch unter UV- Licht kontrolliert. Die Lösung wurde auf eine Konzentration von 0,3 M Natriumacetat eingestellt und die DNA mit 2 bis 3 Volumen kaltem Ethanol (12) gefällt.

Southern Transfer

Ein 2 % Agarosegel wurde 2 x 15 Minuten mit Denaturierungspuffer (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) durchtränkt. Die Flüssigkeit wurde fortwährend durch einen Magnetrührer gerührt. Das Gel wurde anschließend dreimal 10 Minuten mit Neutralisierungspuffer (0,5 M Tris-Hcl (pH 7,0), 3,0 M NaCl) durchtränkt. Das neutralisierte Gel wurde auf eine, mit einem in 20 x SSC (1 x SSC : 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) getränktem Stück Filterpapier bedeckte feste Unterlage gelegt, wobei die Enden des Filterpapiers in eine Schale mit 20 x SSC getaucht worden waren, um einen Docht zu bilden. Ein in der Größe des Gels geschnittener Nitrocellulosefilter wurde in H&sub2;O und in 20 x SSC angefeuchtet und unter Vermeidung von Luftblasenbildung auf das Gel gelegt. Vier Stücke Parafilm (ein "Regenschirm") wurden auf die Ränder der Nitrocellulosefilter gelegt. Ein in 20 x SSC angefeuchtetes Stück Filterpapier wurde obenauf gelegt und darauf ein Stapel trockenen Filterpapiers. Auf diesen Stapel wurden mehrere, in der Größe des Gels geschnittene Lagen Papiertücher und darauf schließlich eine Glasplatte und ein Gewicht gelegt. Der Transfer wurde 16 bis 18 Stunden durchgeführt, der Nitrocellulosefilter markiert, 10 Minuten in 3 x SSC gewaschen, an der Luft getrocknet und 2 Stunden bei 80ºC im Vakuum gebacken. Das Verfahren war das gleiche für 0,8 % Agarosegele mit großen DNA-Fragmenten, außer daß die Gele durch 2 x 15-minütiges Tränken in 0,25 M HCl (15) vorbehandelt wurden.

Nick-Translation

Folgende Bestandteile wurden in einem Eppendorf-Gefäß gemischt:
3 ul 10 x Nick-Puffer (500 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM MgCl&sub2;, 100 mM β-Mercaptoethanol)
2 ul einer Mischung 1 mM dCTP, 1 mM dTTP und 1 mM TP in H&sub2;O enthaltend,
0,4 bis 2 ug eines isolierten DNA-Fragments (aus einem 5 % Acrylamidgel)
4 ul DNase (1 mg/ml), auf 10&supmin;&sup4; verdünnt
25 u Ci α³²P-dATP
1 ul DNA Polymerase I (Kornberg)
Das Gesamtvolumen wurde mit H&sub2;O auf 30 ul eingestellt.
Der Ansatz wurde 2 bis 3 Stunden bei 14ºC inkubiert (16).
Aus einer Pasteur-Pipette wurde eine Säule hergestellt, diese mit normaler Glaswolle gestopft und bis zu einer Höhe von 7 bis 8 cm mit Sephadex G-100 (das Sephadex G-100 wurde mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) äquilibriert) aufgefüllt.
Die nick-translatierte markierte DNA wurde unter Verwendung von TE-Puffer über die Säule chromatographiert, das erste Radioaktivitätsmaximum wurde gesammelt und die Menge eingebauter Radioaktivität durch Flüssigscintillationsmessung abgeschätzt. Sonden mit einer spezifischen Aktivität von 2 x 10&sup7; bis 8 x 10&sup8; cpm/ug DNA wurden verwendet. Sie wurden vor Zugabe zu den Hybridisierungslösungen hitzedenaturiert.
Für die Hybridisierung mit lambda-ZAP-Phagenfiltern wurden die Mengen der Bestandteile im Ansatz verdoppelt. Dies galt nicht für α³²P-dATP, das in einer Menge von 100 uCi eingesetzt wurde (doppelte Nick-Translation). Dies ergab in der Regel eine Aktivität von 1,7 x 10&sup8; cpm pro 5 ul eingesetzter Sonde (1,6 ug), was für eine Plastiktüte mit Filtern einer Größe von 22 x 22 cm ausreichte.

Markierung von cDNA

Radioaktiv markierte cDNA für Hybridisierungsexperimente wurde durch Erststrangsynthese an Poly(A)-mRNA in Gegenwart eines radioaktiv markierten Nucleotids hergestellt.
Die folgenden Bestandteile wurden in einem autoklavierten Eppendorf-Gefäß gemischt:
1 ul einer 20 x cDNA-Stammlösung (1 x cDNA-Stammlösung: 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol),
jeweils 1 ul dCTP (10 mM), dGTP (10 mM) und dTTP (10 mM)
1 ul dATP (100 uM plus 50 uCi α³²P-dATP)
2 ul Oligo (dT) (P.L. Biochemical)
2 bis 3 ug Poly(A)-reiche RNA
20 Einheiten RNasin (ein RNase-Hemmer, Biotec Inc.)
40 Einheiten Vogelmyeloblastosis-Virus Reverse Transkriptase (J.W. Beard, Life Science Inc.)
steriles H&sub2;O ad 20 ul.
Der Ansatz wurde 45 Minuten bei 37ºC inkubiert, anschließend 1 ul dATP (10 mM) hinzugefügt und der Ansatz 15 Minuten bei 37ºC inkubiert (Chase-Reaktion, 15). Die RNA-DNA-Hybride wurden durch Chromatographie über eine Sephadex G-100-Säule (7 bis 8 cm Höhe in einer Pasteur-Pipette, die mit normaler Glaswolle gestopft und mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) äquilibriert worden war) gereinigt. Das erste Radioaktivitätsmaximum wurde gesammelt, und die Hybride wurden durch Zugabe von 5 ul tRNA (1 mg/ml), 80 mM NaCl (Endkonzentration) und 2,5 Volumen kaltem Ethanol gefällt. Die Reaktion wurde durch Elektrophorese von 5 x 10&sup5; cpm des RNA-DNA-Hybrids auf einem 5 % Acrylamidgel überprüft. Das Gel wurde über Nacht bei Raumtemperatur autoradiographiert, und es zeigte einen Schmier, der am stärksten in der Nähe der Taschen war. Die RNA wurde mit 0,4 M NaOH (Endkonzentration) 1 Stunde bei 50ºC hydrolysiert und mit HCl neutralisiert. Die cDNA konnte dann zur Hybridisierungslösung gegeben werden (17).
Unter Zuhilfenahme einer anderen Methode zur Herstellung radioaktiv markierter cDNA wurde eine geringe Menge an Poly(A)-reicher RNA für die Herstellung der lambda-ZAP-Genbank verwendet. Die radioaktiv markierte cDNA wurde hergestellt, um sicherzustellen, daß die RNA während des Isolationsverfahrens nicht degradiert worden war. Ausgehend von 2 ug Poly(A)-reicher RNA wurden der erste und der zweite Strang mit 20 uCi α³²P-dATP unter Verwendung eines Boehringer Mannheim cDNA-Synthese-Kits synthetisiert. 1/20 der doppelsträngigen cDNA wurde auf einem 5 % Acrylamidgel elektrophoretisiert. Das Gel wurde getrocknet und bei Raumtemperatur autoradiographiert. Die resultierenden Banden und der Schmier zeigte, daß die cDNA ein hohes Molekulargewicht hatte (12).

Hybridisierung von DNA

Die Nitrocellulosefilter aus Southern-Transfers bzw. die lambda-ZAP-Plaque-Filter wurden in 2 x SSC [1 x SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0] angefeuchtet und in eine hitzeversiegelte Plastiktüte mit vorgewärmter (67ºC) Prähybridisierungslösung transferiert. Die Prähybridisierung wurde 2 Stunden bei 67ºC durchgeführt, wobei die Tüte vorsichtig geschüttelt wurde. Die Lösung wurde durch vorgewärmte (67ºC) Hybridisierungslösung ausgetauscht, die radioaktive Sonde wurde zugegeben und die Hybridisierung wurde 18 Stunden bei 67ºC durchgeführt. Die Tüte wurde vorsichtig geschüttelt, um eine konstante Bewegung des Nitrozellulosefilters in der Hybridisierungslösung zu gewährleisten. Nach Beendigung der Hybridisierung wurden die Filter gewaschen, wobei verschieden stringente Bedingungen benutzt wurden:

Bedingungen niederiger Stringenz:

Prähybridisierungs- und Hybridisierungslösungen:
10 x Denhardt's (0,2 % Polyvinyl-Pyrrolidon (MW 40.000), 0,2 % Ficoll (MW 400.000), 0,2 % Rinderserumalbumin), 6 x SSC, 0,1 % SDS, 10 ug/ml Poly(A), 50 ug/ml hitzedenaturierte, gescherte E. coli-DNA (nicht Lachssperma-DNA), und die hitzedenaturierte, radioaktiv markierte Sonde. Die Filter wurden in vorgewärmten (67ºC) Lösungen gewaschen: 2 x 15 Minuten in 10 x Denhardt's, 4 x SSC, 0,1 % SDS; 4 x 15 Minuten in 4 x SSC, 0,1 % SDS. Die Filter wurden an der Luft getrocknet, mit einer Plastikfolie bedeckt und 3 bis 24 Stunden bei -80ºC mit und ohne Verstärkerfolien autoradiographiert.

Bedingungen mittlerer Stringenz:

Prähybridisierungs- und Hybridisierungslösungen waren die gleichen wie oben, mit der Ausnahme, daß 6 x SSC durch 4 x SSC ersetzt worden war. Die folgenden Waschlösungen waren bei 67ºC vorgewärmt:
10 x Denhardt's, 2 x SSC, 0,1 % SDS (2 x 15 Minuten) und 1 x SSC, 0,1 % SDS (4 x 15 Minuten). Die Filter wurden an der Luft getrocknet, mit Plastikfolie bedeckt und 3 Stunden bis 3 Wochen mit und ohne Verstärkerfolien autoradiographiert.
Das Verfahren für genomische Filter war wie folgt (Bedingungen mittlerer Stringenz):
Prähybridisierungs und Hybridisierungslösung:
10 x Denhardt's, 3 x SSC, 0,1 % SDS, 10 % (Gew./Vol.) Dextransulfat, 10 ul pro ml Poly(A) und 50 ug/ml denaturierte, gescherte E. coli DNA. Die Filter wurden in vorgewärmter (67ºC) Hybridisierungslösung ohne Dextransulfat 5 x 10 Minuten bei 67ºC und 4 x 15 Minuten in 10 x Denhardt's, 1 x SSC, 0,1 % SDS gewaschen. Die Filter wurden in 3 x SSC gespült, an der Luft getrocknet und, wie oben beschrieben (12 und 18), autoradiographiert.

Auffüllen von zurückstehenden 3'-Enden (zur Subclonierung von Hinf-Fragmenten aus pO36)

Folgende Komponenten wurden in ein Eppendorf-Gefäß pipettiert: 10 ul mit bis zu 1 ug des DNA-Fragments, 1 ul einer 2 mM Lösung der vier dNTPs, 2 ul 10 x Nick-Translations-Puffer (0,5 M Tris-HCl (pH 7,2), 0,1 M MgSO&sub4;, 1 mM Dithiothreitol, 500 ug/ml Rinderserumalbumin), H&sub2;O ad 20 ul. Zwei Einheiten Klenow-Polymerase wurden hinzupipettiert, der Ansatz wurde durchmischt und 30 Minuten bei 22ºC inkubiert. Der Ansatz wurde 5 Minuten auf 70ºC erhitzt, um die Polymerase zu inaktivieren, zweimal mit gesättigtem Phenol (das Phenol wurde zuerst mit 0,1 M Tris-HCl, dann zweimal mit TE- Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) gemischt) und einmal mit Chloroform extrahiert, mit 0,3 M Natriumacetat und 2,5 Volumen kaltem Ethanol gespült und zweimal mit 70 % kaltem Ethanol gespült. Das DNA-Fragment mit den glatten Enden wurde anschließend mit einem Vektor mit glatten Enden in T4-DNA-Ligase-Puffer (12) ligiert.

Subclonierung

Präparation der Vektoren

Die Vektoren (pBS- oder pBS+) wurden mit ein oder zwei Restriktionsenzymen gespalten, zweimal mit gesättigtem Phenol (das Phenol wurde zuerst mit 0,1 M Tris-HCl, dann zweimal mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) gemischt) und einmal mit Chloroform extrahiert, mit 0,1 M NaCl und 2,5 Volumen kaltem Ethanol gefällt. Das Pellet wurde in 80 % kaltem Ethanol gespült und in H&sub2;O bei einer Konzentration von 25 bis 50 ng/ul resuspendiert. Die Vektoren wurden jeweils auf Signal-/Rausch-Verhältnis (Selbstligation mit und ohne T4-DNA-Ligase) vor Gebrauch getestet.

Ligation

Das Plasmid mit dem zu subclonierenden Fragment wurde mit ein oder mehreren geeigneten Restriktionsenzymen gespalten und über ein 5 % Acrylamidgel elektrophoretisiert. Anschließend wurde das Fragment, wie im Abschnitt "Isolierung von DNA aus Gelen" beschrieben, isoliert. 1 ul (25 ng/ul) des gelösten Vektors wurde zum Fragment pipettiert (Verhältnis von Vektor zu Fragment = 1:2, die Anzahl an Molekülen betreffend), desgleichen 2 ul T4-Ligations-Puffer (5 x T4- Ligations-Puffer: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM ATP, 1 mM Dithiothreitol, 5 % (Gew./Vol.) Polyethylenglycol- 8000), 0,5 ul T4-DNA-Ligase (BRL) und H&sub2;O ad 10 ul). Der Ansatz wurde 20 Stunden bei 14ºC inkubiert, falls die ligierten DNA-Fragmente überhängende Enden hatten. Hatte die DNA glatte Enden, wurde 1 ul T4-DNA-Ligase hinzupipettiert und der Ansatz eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Sofern der Ligationsansatz nicht sofort verwendet wurde, wurde er bei -20ºC aufbewahrt. In der Regel wurden lediglich 5 ul des Ligationsansatzes für eine Transformation verwendet.

Präparation von kompetenten Zellen

4 ml L-Nährmedium (darin jeweils 10 mM MgSO&sub4; und 10 mM MgCl&sub2;), angesetzt aus autoklavierten 1 M Stammlösungen von MgSO&sub4; und MgCl&sub2; wurden mit JM109-Zellen (oder anderen Zellen, z.B. HB101) angeimpft. Die Zellen wurden als Übernachtkultur bei 37ºC gezogen. 1 ml der Übernachtkultur wurde zu 40 ml vorgewärmtem (37ºC) LB-Medium (darin je 10 mM MgSO&sub4; und 10 mM MgCl&sub2;) gegeben. Die Kultur wurde bei 250 bis 275 UpM geschüttelt. Bei einer OD&sub4;&sub5;&sub0; von 0,8 bis 0,9 wurden die Zellen 10 Minuten bei 5.000 UpM und 4ºC abzentrifugiert. Es war von Bedeutung, daß die OD unter 1 war, um sicherzustellen, daß die Zellen bestmöglich belüftet waren. Das Pellet wurde sehr vorsichtig in 30 ml kaltem 0,1 M CaCl&sub2; (autoklaviert) in einem Zentrifugenröhrchen resuspendiert, wobei das Röhrchen während des Verfahrens durch ein Eisbad gekühlt wurde und anschließend 10 Minuten bei 5.000 UpM und 4ºC zentrifugiert. Das Pellet wurde sehr vorsichtig in 15 ml kaltem 0,1 M CaCl&sub2; resuspendiert, 20 Minuten auf Eis gehalten und 10 Minuten bei 5.000 UpM und 4ºC zentrifugiert. Die Zellen wurden vorsichtig in 3 ml kaltem 0,1 M CaCl&sub2; resuspendiert und wenigstens 1 Stunde auf Eis gehalten, bevor sie gebrauchsfertig waren (19).

Transformation

5 ul des Ligationsansatzes, 95 ul kaltes, steriles TCM (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM CaCl&sub2;, 10 mM MgCl&sub2;) und 200 ul kompetente JM109-Zellen (oder Zellen eines anderen Stammes) wurden zusammenpipettiert. Das Gemisch wurde mindestens 40 Minuten auf Eis, dann 5 Minuten bei 37ºC (oder 2 Minuten bei 42ºC) inkubiert. Das Gemisch wurde anschließend in ein 0,8 ml L-Nährmedium, 10 mM MgSO&sub4;, 10 mM MgCl&sub2; enthaltendes steriles Glasröhrchen transferiert, 45 Minuten bei 37ºC unter leichtem Schütteln inkubiert und unter sterilen Bedingungen auf 5 AXI-Platten (oder anderen geeigneten Platten, z.B. amp- oder tet-Platten) 0,2 ml pro Platte ausplattiert. Die Platten wurden 10 Minuten zum Trocknen stehengelassen, anschließend umgedreht und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Sie wurden in Plastikbeuteln mit dem Boden nach oben bei 4ºC gelagert.

Isolierung und Testen von Subclonen

1 bis 6 rekombinante Clone (weiß auf AXI-Platten, wenn pBlueScript als Vektor benutzt wurde) wurden von jeder Platte isoliert. Von diesen Clonen wurde Plasmid-DNA isoliert, mit dem geeigneten Restriktionsenzym bzw. mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten und auf einem 2 % Agarosegel analysiert, um sicherzugehen, daß das eingebaute Fragment die richtige Größe hatte. War dies der Fall, so wurde der Clon über Nacht in 4 ml L-Nährmedium kultiviert, mit 25 % sterilem Glycerol versetzt und bei -80ºC gelagert. Betreffs Sequenzierung eines eingebauten Fragmentes siehe "Plasmid-Sequenzierung". Betreffs Fragment-Isolierung (Sonden) und Nick-Translation, siehe unter den entsprechenden Abschnitten (12, 20).

Absuchen der lambda-ZAP-Genbank

Der Titer der amplifizierten lambda-ZAP-Genbank wurde vor dem Absuchungs-Verfahren zweimal bestimmt. Infektionskompetente BB4-Zellen wurden durch Animpfen einer 300 ul 20 % Maltose enthaltenden, frisch hergestellten 30 ml L-Nährmedium-Kultur und Übernachtkultivierung bei 37ºC präpariert. Die Zellen wurden 10 Minuten bei 10.000 UpM und 4ºC zentrifugiert, vorsichtig in kaltem, sterilem 10 mM MgSO&sub4; (30 ml) resuspendiert und bis zur Weiterverwendung auf Eis gehalten. 100 ul der in φ-Puffer (22 mM KH&sub2;PO&sub4;, 49 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 85 mM NaCl, 1 mM MgSO&sub4;, 0,1 mM CaCl&sub2;, 0,001 % Gelatine, autoklaviert) verdünnten lambda-ZAP-Phagen wurden mit 0,2 ml frisch infektionskompetent gemachten BB4-Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit 2,5 ml warmem (42ºC), 0,6 % Topagar (darin 10 mM MgCl&sub2;) auf LB-Platten ausplattiert.
Für das Absuchen der Genbank wurden 22 x 22 cm LB-Platten (3 bis 4 Stunden bei 37ºC getrocknet) verwendet. Jede Platte kann etwa 1 x 10&sup5; lambda-ZAP-Plaques aufnehmen. Die Phagen wurden mit 1 ml BB4-Zellen (präpariert wie oben beschrieben) 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dieses Gemisch wurde anschließend zu 25 ml warmer (42ºC), 0,3 % Topagarose (darin 10 mM MgCl&sub2;) pipettiert und die Lösung auf eine frische, trockene LB-Platte dekantiert. Große LB-Platten wurden (mit dem Boden nach unten) über Nacht bei 37ºC inkubiert. Von jeder Platte wurden zwei Plaque-Lifts durchgeführt. Die Platten wurden zuvor 1 bis 2 Stunden bei 4ºC gehalten, um zu verhindern, daß die Agarose-Schicht am Nitrocellulosefilter haftet. Direkt vor Gebrauch wurden sie auf Eis gestellt und verblieben dort während der Arbeitsschritte mit der Nitrocellulose. Zwei Nitrocellulosefilter (A und B) sowie die Platte wurden an drei Stellen zwecks eindeutiger Orientierung der Filter in bezug auf die Platte markiert. Filter A wurde 45 Sekunden auf die Plaques gelegt, anschließend in Denaturierungspuffer (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) mit den Phagen nach oben transferiert und dort 45 Sekunden gelassen, anschließend 5 Minuten im Neutralisierungspuffer (0,5 M Tris- HCl (pH 7,5), 3,0 M NaCl) und schließlich in 2 x SSPE (1 x SSPE: 180 mM NaCl, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 1 mM EDTA, pH 7,4) wenigstens 2 Minuten gebadet. Der Filter wurde an der Luft getrocknet und 2 Stunden bei 80ºC im Vakuum gebacken. Filter B wurde nach Filter A 120 Sekunden auf dieselbe Platte gelegt und weiter wie Filter A behandelt (12). Diese Filter wurden für die Hybridisierung benutzt. Die Autoradiogramme beider Filter wurden so orientiert, daß die Signale von Filter A mit den Signalen von Filter B auf Präsenz auf beiden Filtern verglichen werden konnten. Die positiven Plaques wurden mit einem Skalpell herausgeschnitten (1 cm²-Blöckchen) und in 1 ml φ-Puffer transferiert, wobei die Röhrchen vor Gebrauch geschüttelt wurden. Alle Röhrchen mit Phagen in φ-Puffer wurden nach Zugabe von 2 bis 3 Tropfen Chloroform unter Luftausschluß (Parafilm) bei 4ºC gelagert. Die die Plaques enthaltenden Platten (22 x 22 cm) wurden gelagert, indem ein Stück in Chloroform getränktes Whatman-Filterpapier in den Deckel gelegt wurde, die Platten mit Parafilm luftdicht verschlossen und mit den Plaques nach oben bei 4ºC aufbewahrt wurden. Um einen positiven Plaque aus einem etwa 2.000 Plaques enthaltenden 1 cm²-Block zu isolieren, wurden Verdünnungen in φ-Puffer hergestellt, und die Phagen mit BB4- Zellen und 2,5 ml 1 % warmem (42ºC) Top-Agar (darin 10 mM MgCl&sub2;) auf runden, frischen LB-Platten (8,5 cm Durchmesser) ausplattiert. Die Verdünnung, welche 1.500 bis 3.000 Plaques ergab, wurde für die Nitrocellulosefilter-Abzüge weiterverwendet. Das Verfahren entspricht genau dem für die großen (22 x 22 cm) LB-Platten verwendeten, mit der Ausnahme, daß die Filter (A und B) markiert wurden, indem eine Kanüle durch die Filter bis zum Plattenboden gestochen wurde. Nach Hybridisierung der runden Filter und Autoradiographie wurden die positiven Signale von A und B übereinandergelegt. Die Plaques wurden isoliert, indem die Spitze einer Pasteur-Pipette durch den Agar bis zum Plattenboden gestochen wurde und die Plaques durch Blasen am freien Ende der Pasteur-Pipette in 1 ml φ-Puffer transferiert wurden. Es wurden wiederum Verdünnungen hergestellt, und eine Verdünnung mit 150 bis 300 Plaques wurde für die Abzüge mit den Nitrocellulosefiltern verwendet. Das Verfahren war dasselbe, wie das für die Verdünnung auf 1.500 bis 3.000 Plaques beschriebene. Die positiven Plaques wurden isoliert und verdünnt, und die 15 bis 30 Plaques ergebende Verdünnung wurde für die Abzüge mit Nitrocellulosefiltern verwendet. Bei diesem Schritt hybridisierten in der Regel alle Plaques auf den Filtern A und B, was belegte, daß die isolierten Plaques alle von ein und demselben Plaque abstammten. War dies nicht der Fall, so wurde das Verfahren nochmals durchgeführt, mit dem Ergebnis, daß die Phagenkultur nun nicht mehr kontaminiert war. Die Phagen waren anschließend bereit für das "Excisionsprotokoll für lambda-ZAP-Phagen".

Excisionsprotokoll für lambda-ZAP-Phagen

4 ml frischen LB-Mediums wurden mit XL1-Blau-Zellen für eine Übernachtkultur (vorsichtig geschüttelt bei 37ºC) angeimpft.
0,5 ml der Übernachtkultur wurden zu 25 ml frischen LB-Mediums gegeben und unter Schütteln bei 37ºC gehalten, bis OD&sub4;&sub5;&sub0; = 0,5 erreicht war. In ein vorgewärmtes, steriles Glasröhrchen wurden pipettiert:
100 ul XL1-Blau-Zellen, OD = 0,5
100 ul einer sauberen, mehr als 1 x 10&sup5;-Phagenpartikel enthaltenden lambda-ZAP-Phagen-Stammlösung
5 ul R408 Helferphage (1 x 10&sup6; pfu/ml)
2 ul 1 M steriles MgSO&sub4;.
Das Gefäß wurde 15 Minuten bei 37ºC gehalten. Nach Zugabe von 2,5 ml frischen LB-Mediums wurde das Gefäß 4 Stunden bei 37ºC heftig geschüttelt. Das Gefäß wurde 20 Minuten auf 70ºC erhitzt, 1,5 ml der Suspension wurden anschließend in ein autoklaviertes Eppendorf-Gefäß transferiert. Das Gefäß wurde kurz zentrifugiert, der Überstand anschließend in ein frisches, autoklaviertes Eppendorf-Gefäß transferiert. Die gewonnenen Phagen können bei diesem Schritt 1 bis 2 Monate bei 4ºC gelagert werden. Um die verpackten, gewonnenen Plasmide auf Zellen zu übertragen, wurde das folgende Verfahren angewendet: 4 ml frischen LB-Mediums wurden mit XL1-Blau- Zellen als Übernachtkultur angeimpft und, wie oben beschrieben, kultiviert. In zwei sterile Glasgefäße wurden jeweils 100 ul XL1-Blau-Zellen einer OD = 0,5 pipettiert. In das erste Glasgefäß wurden 200 ul, in das zweite 2 ul des verpackten Plasmids pipettiert. Die Gefäße wurden 15 Minuten bei 37ºC gehalten. 100 ul Suspension aus jedem Glasgefäß wurden in ein frisches steriles, 100 ul frisches LB-Medium enthaltendes Glasgefäß transferiert. Die 200 ul Suspension wurde auf einer trockenen (20 Minuten bei 37ºC getrockneten) LB- Ampicillin-Platte ausplattiert und mit dem Boden nach oben über Nacht bei 37ºC inkubiert (31).
Die auf den Platten wachsenden Kolonien enthielten das pBlue Script-Plasmid mit der cDNA-Insertion. Die Kolonien von diesen Platten wurden in 35 mg Ampicillin pro Liter enthaltendem LB-Medium kultiviert.

DNA-Sequenzierung

Das zu sequenzierende Plasmid (Doppelstrangtemplat) wurde nach dem Verfahren zur Präparation kleiner Plasmidmengen gereinigt. Die DNA wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur in 0,2 M NaOH denaturiert, das Gemisch wurde durch Zugabe von 0,4 Volumen 5 M Ammoniumacetat (pH 7,5) neutralisiert und anschließend mit 4 Volumen kaltem Ethanol 5 Minuten bei -80ºC gefällt. Das Pellet wurde mit 70 % kaltem Ethanol gewaschen und in 10 ul H&sub2;O resuspendiert. Zwei Reaktionen wurden für jedes Plasmid angesetzt, eine für jeden verwendeten Primer. Es wurden ein 17-mer Sequenzier-Primer (#1212, Biolabs) und ein reverser Sequenzier-Primer (#1201, Biolabs) verwendet.
Die Sequenzier-Reaktion wurde mit einem Sequenase DNA-Sequencing Kit der Firma United States Biochemical Corporation unter Verwendung des im Kits enthaltenden Sequenzier-Protokolls (22) durchgeführt.

Beispiel 1

Amylase-Aktivität in Kartoffelgewebe

Es ist wünschenswert, zu wissen, in welchem Gewebe Amylase aktiv ist, da in solchem Gewebe vermutlich Amylase-mRNA vorkommt. Zum Wachstum von Knollenkeimen bedarf es einer Nahrung (wie Sacharose) aus der Knolle und zur Deckung dieses Bedarfs wird Stärke abgebaut. Verschiedene Gewebe von keimenden Kartoffeln wurden deshalb auf Amylase-Aktivität getestet. Dünnschnitte von keimenden Knollen (Dianella, Saturna) wurden in I&sub2;/KI-Lösung gelegt. Das Periderm (Zellen, die die Knollenhaut bilden), das vaskuläre Gewebe und die Keime wurden nicht gefärbt, während der Rest des Knollengewebes (Parenchym-, Vorratszellen) gefärbt wurde. Während dieser Test anzeigt, wo Stärke anwesend (dunkelblaue Farbe) und wo Stärke abwesend ist (die farblosen Bereiche), zeigt er nicht, wo Amylase vorhanden ist. Es gibt keinen sichtbaren Unterschied im Farbmuster von Saturna- und Dianella-Kartoffeln.
Dünnschnitte von Keimen wurden auf eine 1 % Stärkeplatte gelegt und 1 Stunde bei 37ºC ohne sichtbaren Effekt inkubiert.
Zum Vergleich: Der auf eine 1 % Stärkeplatte getropfte Mäuseurin ergibt nach 20 Minuten Inkubation bei 37ºC (23) einen klaren Fleck. Obwohl die Schnitte sehr dünn waren, könnte die Entfernung, die das Enzym zurückzulegen hat, um mit dem Substrat in Kontakt zu kommen, noch zu lang sein. Auf der Grundlage des für die keimenden Knollen beobachteten Färbungsmusters wurde entschieden, aus den verschiedenen, in Figur 6 angedeuteten Bereichen Extrakte herzustellen.
Die Extrakte wurden wie vorstehend beschrieben ("Materialien und Methoden") sowohl von Dianella als auch von Saturna bereitet. Nach 16 Stunden Inkubation bei 20ºC zeigten nur Dianella-Keime eine schwache Reaktion (orange-farbener Fleck). Ein weiterer Satz von Extrakten wurde bei 37ºC inkubiert, und hier zeigten Dianella-Keime eine starke Reaktion (klarer Fleck) und bewiesen damit das Vorhandensein von Amylase in diesen Keimen. Saturna-Keime zeigten nach einer Inkubation bei 37ºC eine schwache Reaktion, schwächer als die für Dianella-Keime bei 20ºC gefundene. Der beobachtete klare Unterschied in den Amylasemengen von Dianella- und Saturna- Keimen korreliert mit den in diesen Sorten gefundenen Zuckermengen (vgl. Beispiel 20 und Figur 22). Um eine stärkere Reaktion von Saturna-Keimen zu erhalten, wurden vor dem Zerreiben in 5 ml Extraktionspuffer (vgl. "Materialien und Methoden") 10 g eingefroren (5 Minuten bei -70ºC, 1 Stunde bei -20ºC). Nach Inkubation bei 37ºC war der Fleck rosa-rot, aber die Reaktion war nicht so klar, wie die beobachtete Reaktion mit 2 g frischen Dianella-Keimen.
Der Rest der Gewebeextrakte (B, C und D sowohl von Dianella als auch von Saturna) zeigte (auf der 1 %igen Stärkeplatte) ein dunkleres Blau nach Anfärben mit einer I&sub2;/KI-Lösung als die Umgebung. In diesen Flecken ist deshalb mehr Stärke vorhanden als in der Umgebung. Das Parenchym-Gewebe (D in der Zeichnung) von beiden Sorten wurde auch getestet, nachdem es eingefroren worden war, und die Flecke waren noch dunkler als die Umgebung. Das gefrorene Parenchym-Gewebe wurde dann ohne Extraktionspuffer zerrieben und der sich ergebende Kartoffelsaft wurde (nach Zentrifugation zur Entfernung der Zelltrümmer) getestet. Eine sehr schwache Reaktion wurde nach der Inkubation bei 37ºC sowohl für den Saft aus Saturna als auch aus Dianella gefunden. Diese Reaktion kann dadurch verursacht sein, daß es so viel Substrat (d.h. Stärke) für die Amylase im Parenchym-Gewebe gibt, daß das Enzym länger braucht, um die Stärke auf der Platte abzubauen. Es wurde eine maximale Inkubationszeit von etwa 16 Stunden angewendet, da sich die Platten zusammenrollten, wenn sie bei 37ºC viel länger als 16 Stunden inkubiert wurden.
Auf der Basis des vorstehend Erwähnten kann man schließen, daß Amylase-Aktivität sowohl in den Keimen als auch in dem Knollen-Parenchym-Gewebe von Saturna- und Dianella-Kartoffeln vorhanden ist. Die höchste Aktivität ist in Dianella- Keimen zu finden.

Beispiel 2

Herstellung von Gerste-α-Amylase-Sonden

Zwei Plasmide (050 und 036), von denen jedes eine Gerste-α- Amylase codiert, wurden von John C. Rogers vom Washington University Medical Center, St. Louis, USA, zur Verfügung gestellt. Die beiden Plasmide wurden ursprünglich konstruiert aus von Poly(A)-reicher RNA stammender cDNA, die aus der Aleuron-Zellschicht von Gerstekörnern nach Hormoninduktion isoliert wurde. Das Plasmid 050 codiert eine Typ A (= Clon E) (27)-α-Amylase, und das Plasmid 036 codiert eine Typ B (= pM/C) (24)-α-Amylase. Entsprechend der mit den Plasmiden erhaltenen Information enthält p050 die Gerste- PstI-Insertion von Clon E inseriert in die PstI-Stelle des Polylinkers des Vektors pSP64 (26). Zur Erhöhung der Plasmid-DNA-Ausbeuten wurde dasselbe PstI-Fragment in den Vektor pBS- (31) inseriert. Dieser neue Clon pBS050 enthält somit die identische, in Clon E clonierte Insertion. Entsprechend der erhaltenen Information enthält das Plasmid 036 ein BamHI-HindIII-Fragment aus dem Clon pM/C, inseriert in den Polylinker des Vektors pSP64 (Fig. 7). Die vollständige Sequenz des Fragments ist nicht publiziert, und wie in Beispiel 3 gezeigt wird, enthält das Fragment Sequenzen, die ein starkes falsches Hybridisierungssignal verursachen. In heterologen Hybridisierungen mit einer niedrigen Stringenz ("Materialien und Methoden") kann das Signal-/Rausch-Verhältnis erhöht werden, wenn die heterologe Sonde nur Sequenzen enthält, die in den Kontrollexperimenten hybridisieren (Beispiel 3). Die Gerste-Insertion in p036 enthält zwei SacI-Stellen, die den codierenden Abschnitt teilen und nahe beim Terminationscodon (Positionen 599 und 1388 in Fig. 2 der Referenz 24) liegen. Es wurde angenommen, daß die 5'- Signalpeptid-Sequenz und der Anfang des das Signalpeptid von Gerste-α-Amylase codierenden Bereichs zwischen Gerste und Kartoffel nicht konserviert ist, und eine HinfI-Stelle in der Position 152 der vorstehend erwähnten Figur wurde verwendet, um die ersten 152 Nucleotide aus der Gerste-Sonde wie folgt zu entfernen. Das in Fig. 7 gezeigte HinfI-Fragment, in dem die rechtsseitige Stelle im Vektor pSP64 liegt, wurde in dem Vektor pBS- subcloniert, und unter den Rekombinanten wurde eine ausgewählt, in der das clonierte Fragment die in Fig. 7 gezeigte Orientierung aufweist. Dieses Plasmid, pBS036, setzt nach der Spaltung mit SacI zwei Fragmente frei, die im wesentlichen nur reife Gerste-α-Amylase codierende Bereiche enthalten. Zusätzlich ergibt pBS036 bessere Plasmid-DNA-Ausbeuten als 036.

Beispiel 3

Feststellung einer Hybridisierung zwischen Gerste-α-Amylase- Gen-Sequenzen und Kartoffel-Nucleotid-Sequenzen

Poly(A)-reiche DNA, die, wie unter "Materialien und Methoden" beschrieben, aus Dianella-Keimen hergestellt worden war, wurde ausgewählt, da in diesem Gewebe die höchste α- Amylase-Aktivität beobachtet worden war (Beispiel 1). Um zu klären, ob das komplexe Gemisch von Messenger-RNA in der Poly(A)-RNA-Präparation Sequenzen enthält, die mit Gerste-α- Amylase-Sequenzen hybridisieren, wurden die Plasmide pBS050 und pBS036 mit radioaktiver komplementärer DNA hybridisiert, die von Poly(A)-reicher RNA unter Verwendung einer Methode synthetisiert worden war, die in "Materialien und Methoden" für die erste Strangsynthese beim cDNA-Clonieren beschrieben wurde. Die Hybridisierungsbedingungen (Hybridisierung bei 67ºC in 6 x SSC, Waschen bei 67ºC in 4 x SSC) wurden auf der Grundlage der vorherigen Erfahrung mit heterologen Hybridisierungen in komplexen Molekülgemischen (28, 29) ausgesucht.
Das Ergebnis des Versuches ist in Fig. 8 gezeigt. Es zeigt, daß die Kartoffel-cDNA mit Gerste-α-Amylase codierenden Bereichen spezifisch hybridisiert. Besonders gut hybridisiert das 800 bp SacI-Fragment aus pBS036, das den C-terminalen Teil der Gerste-α-Amylase Typ B codiert, wohingegen das den N-terminalen Teil codierende 350 bp SacI-Fragment nicht hybridisiert. Durch das Fehlen einer Hybridisierung eines DNA- Fragmentes mit ähnlicher Größe von einem Kontrollplasmid (Spur 1, Figur 8) ist aufgezeigt, daß die Hybridisierung spezifisch ist. Das die α-Amylase Typ A codierende Gerste- Fragment aus dem Plasmid pBS050 hybridisiert ebenfalls, wenn auch schwach, mit der Kartoffel-cDNA. Als positive Hybridisierungskontrolle wurde ein Plasmid verwendet, das ein hochkonserviertes ubiquitäres Protein, Ubiquitin, codiert. Wie erwartet, hybridisiert es mit der Kartoffel-cDNA. Die Intensität der Hybridisierung mit dem Ubiquitin codierenden Fragment, dem 800 bp SacI-Fragment aus pBS036 und der Pst-Insertion aus pBS050 ist schwach, verglichen mit der Hybridisierung von zwei starken Banden, in den pBS036 enthaltenden Spuren, und es wurde gefolgert, daß die starken Banden auf eine Hybridisierung der cDNA mit dem durch einen Stern in Fig. 7 gekennzeichneten kleinen Bereich zurückzuführen waren. Die Sequenz des Bereiches ist nicht bekannt, es wird aber vermutet, daß die starke Hybridisierung das Ergebnis einer Zufallshomologie mit ribosomalen RNA-Sequenzen (die sogar in den am besten gereinigten Poly(A)-reichen RNAs zu finden sind) ist. Diese Annahme wird durch den Befund gestützt, daß die Gerste-cDNA eine ähnlich starke Hybridisierung ergibt.
Die Ergebnisse des Versuchs zeigen, daß (1) Poly(A)-reiche RNA aus Dianella-Keimen Sequenzen enthält, die spezifisch mit Gerste-α-Amylase codierenden Sequenzen hybridisieren, (2) daß 800 bp SacI-Fragment aus pBS036 die am besten geeignete Sonde ist und (3) die Hybridisierungsbedingungen ausreichend permissiv sind, um die Hybridisierung festzustellen, ohne eine zu hohe Hintergrundhybridisierung zu schaffen. Es wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß das 800 bp SacI-Fragment (die Sonde in Fig. 7) verwendet werden konnte, um eine aus einer Poly(A)-reichen RNA aus Dianella- Keimen hergestellte cDNA-Genbank abzusuchen durch Hybridisierung bei 67ºC in 6 x SSC und Waschen bei 67ºC in 4 x SSC.

Beispiel 4

Konstruktion einer Kartoffelkeim-cDNA-Genbank

Poly(A)-mRNA wurde aus Dianella-Keimen, wie unter "Materialien und Methoden" beschrieben, hergestellt. Die Qualität der Poly(A)-mRNA wurde dadurch getestet, daß aus einem kleinen Anteil, wie vorstehend beschrieben, cDNA synthetisiert wurde.
Die Poly(A)-mRNA wurde in den Vektor lambda-ZAP mit Hilfe von EcoRI-Linkern (30) cloniert.
Lambda-ZAP ist ein Hybridvektor, der aus einem lambda-Vektor besteht, in den das pBlueScript SK(-)-Plasmid inseriert ist. Lambda-ZAP hat sechs einmal vorkommende Clonierungsstellen, in denen man Insertionen von 0-10 Kb Länge unterbringen kann. Es hat die Fähigkeit, den inserierten Bereich mit Hilfe eines Helfer-Phagens automatisch auszuschneiden, zu zirkularisieren und so das pBluescript SK(-)-Plasmid zu bilden. Die inserierte cDNA befindet sich im Polylinker des pBlueScript SK(-)-Plasmids (31). Der geschätzte Titer der primären Genbank war ungefähr 7,0 x 10&sup6; pfu (plaque forming units), wovon ungefähr 9 % Nicht-Rekombinante waren. Der Bestand der nicht amplifizierten Genbank war 8,0 x 10&sup5; pfu/ml, und der Bestand der amplifizierten Genbank (10&sup6; pfu aus der primären Genbank wurden amplifiziert) war 4,0 x 10¹&sup0; pfu/ml.

Herstellung der Sac800-Sonde

3 x 10 ug von sehr reinem (CsCl-bandiertem) pBS036 (Fig. 7)- Plasmid wurden mit SacI gespalten und in einem 5 %igen Acrylamidgel elektrophoretisiert. BstNI gespaltenes pBR327 wurde als Größen-Referenz verwendet und ergab drei Banden: 1855 bp, 928 bp und 475 bp. Die Sac800-Bande wurde isoliert, in 30 ul H&sub2;O suspendiert und bei -20ºC aufbewahrt. Jedes Mal, wenn ein doppelter Nick-Translations-Ansatz gemacht wurde, d.h. wenn die doppelte Menge der Substanzen verwendet wurde, wurden 5 ul des aufbewahrten Sondenmoleküls verwendet.

Beispiel 5

Isolierung von Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Clonen

Ein Satz von Nitrocellulosefiltern (3A und 3B, mit 1 x 10&sup5; Plaques) wurde bei niedriger Stringenz (hybridisiert in 6 x SSC und gewaschen mit 4 x SSC, wie vorstehend beschrieben) mit ungefähr 1,7 x 10&sup8; cpm der radioaktiven Sac800-Sonde hybridisiert. Ein weiterer Satz von Nitrocellulosefiltern (2A und 2B, mit 1 x 10&sup5; Plaques) wurde wieder mit ungefähr 1,7 x 10&sup8; cpm der radioaktiven Sac800-Sonde bei etwas höherer Stringenz hybridisiert (Hybridisierung und Waschen in 2 x SSC). Nach drei Stunden Autoradiographie mit zwei Verstärkerfolien zeigte der Röntgenfilm der Filter 3A und 3B (die Niedrig-Stringenz-Filter) positive Signale, während der Röntgenfilm der Filter 2A und 2B (die Höher-Stringenz-Filter) keine Signale zeigten. Sogar nach 18 Stunden Autoradiographie von 2A und 2B zeigten sie noch keine positiven Signale.
Unter ungefähr 100.000 Clonen wurden acht positive Signale von den Filtern 3A und 3B und ein zusätzliches positives Signal auf dem Filter 3A in einem Bereich gefunden, in dem die beiden Filter nicht überlappen. Die Häufigkeit von α- Amylase-cDNA-Clonen in der Genbank gibt einen Hinweis auf die Häufigkeit von α-Amylase-Messenger-RNA in der gesamten Dianella-Keim-Messenger-RNA. Die Häufigkeit war 8 x 10&supmin;&sup5;, somit war die α-Amylase-mRNA verhältnismäßig selten und machte ungefähr 0,008 % der Gesamt-Messenger-RNA aus. Alle neun Signale waren auf der ursprünglichen L-Nährmedium- Platte (22 x 22 cm) vorhanden und wurden davon isoliert (Schritt 1) (vgl. "Materialien und Methoden"). Ihnen wurden die Namen ZAP1 und ZAP9 gegeben. Nach einer Serienverdünnung wurden sie ausplattiert, und von jeder Platte (mit 1.500 bis 3.000 Plaques pro Platte) wurden zwei doppelte Replikas (A, B) hergestellt. Die Nitrocellulosefilter wurden bei niedriger Stringenz mit dem radioaktiven Sac800-Fragment hybridisiert (1,5 x 10&sup7; cpm bis 3,0 x 10&sup7; cpm wurden zu jedem Beutel mit vier bis sechs Rundfiltern gegeben, wobei die Filter jeweils zu Paaren, d.h. die Filter A und B von derselben Platte in einem Beutel waren). ZAP2, 3, 4, 5, 6 und 7 zeigten positive Signale (einer bis viele Kandidaten), und sie wurden serienweise von diesem Schritt aus (Schritt 2) verdünnt.
ZAP1, 8 und 9 waren zu sehr verdünnt worden und zeigten keine Signale; sie wurden daher nochmals vom Originalisolat (Schritt 1) aus schrittweise verdünnt. Geeignete Verdünnungen, d.h. 200 bis 500 Plaques für ZAP2, 3, 4, 5, 6 und 7 und 1.500 bis 3.000 Plaques für ZAP1, 8 und 9, wurden verwendet, um Replikas von A und B anzufertigen. Die so erhaltenen Nitrocellulosefilter wurden mit dem radioaktiv markierten Sac800-Fragment, wie oben beschrieben, hybridisiert. ZAP1 und ZAP8 zeigten an dieser Stelle (Schritt 2) positive Signale. ZAP9 hingegen zeigte keine positiven Signale und wurde nicht weiter untersucht. Es war möglich, einen einzigen positiven Plaque von den Platten mit ZAP2, 3, 4, 5, 6 und 7 zu isolieren. Sie waren an dieser Stelle so weit aufbereitet, daß sie aus dem Plasmid herausgeschnitten werden konnte.
ZAP1 und ZAP8 wurden schrittweise verdünnt (Schritt 2), und eine geeignete Verdünnung von jedem wurde verwendet, um Replikas anzufertigen. ZAP2, 3, 4, 5, 6 und 7 wurden ebenfalls verdünnt, wobei Platten mit 20 bis 50 Plaques für die Anfertigung von Replikas verwendet wurden. Dieser Schritt (Schritt 3) wurde als zusätzliche Kontrolle für diese Phagen durchgeführt. Alle Filter wurden mit dem radioaktiv markierten Sac800-Fragment bei niedriger Stringenz hybridisiert. ZAP1 und ZAP8 zeigten positive Signale, und es war möglich, von beiden einen einzigen positiven Plaque zu isolieren. ZAP1 zeigte während des Isolierungsverfahrens ein schwächeres Signal als die anderen; trotzdem war es während des gesamten Verfahrens anwesend. ZAP1 und ZAP8 wurden ebenfalls zu Kontrollhybridisierungen auf Reinheit ausplattiert. Alle acht ZAP1-8-Phagen stammten von ein und demselben Plaque ab, da alle Plaques auf den Platten hybridisierten. Die Plasmide aus den Phagen ZAP1 bis ZAP8 wurden gemäß dem Excisionsprotokoll unter "Materialien und Methoden" herausgeschnitten.
Aus einer großen Anzahl Ampicillin-resistenter Kolonien wurden zwei Kolonien von ZAP1 bis ZAP8 ausgewählt und über Nacht zwecks Plasmidpräparation hochgezogen. Die Plasmide wurden mit AmyZ1 bis AmyZ8 bezeichnet. Alle Kolonien enthielten Plasmide. Plasmide AmyZ2-7 wurden mit EcoRI gespalten und auf einem 2 % Agarosegel analysiert, wobei mit BStNI oder HinfI gespaltenes pBR327 als Größenmarker verwendet wurde (Fig. 9). Das Gel enthält ebenfalls mit SacI gespaltenes pBS036 (Fig. 7). Das Gel wurde für einen Southern Transfer, wie in "Materialien und Methoden" beschrieben, verwendet, und der Nitrocellulosefilter wurde unter Bedingungen niedriger Stringenz mit dem radioaktiv markierten Sac800-Fragment (1 x 10&sup6; cpm zugegeben) hybridisiert. Bei allen Plasmiden zeigte mindestens ein Fragment ein positives Signal (Fig. 9), was bestätigte, daß die richtigen cDNA- Clone isoliert worden waren. AmyZ2, 3, 4, 5, 6 und 7 und später AmyZ1 und 8 wurden in 25 % sterilem Glycerol für längere Lagerung (-80ºC) eingefroren.

Beispiel 6

Restriktionskartenanalyse der α-Amylase-cDNA-Clone und DNA- Sequenz-Analyse

AmyZ2, 3, 4, 5, 6 und 7 wurden mit EcoRI gespalten und auf einem 5 % Acrylamidgel elektrophoretisiert, was dieselben Fragmente, wie in Fig. 9 zu sehen, ergab. AmyZ1 und 7 wurden gleichermaßen behandelt, und die resultierenden EcoRI-Fragmente aller acht Clone sind in Fig. 10 dargestellt.
Die ECoRI-Fragmente, sowie nach Spaltung mit anderen Restriktionsenzymen erhaltene Fragmente wurden isoliert und in den pBS- Vektor (s. "Materialien und Methoden") subcloniert. Die Fragmente wurden in den zwischen den Sequenzier- Primer-Bindungsstellen lokalisierten Polylinker-Bereich cloniert. Die Subclone wurden auf korrekte Insertionsgröße hin analysiert und in 25 % sterilein Glycerol für längere Lagerung eingefroren.
Die Sequenzierungsstrategie für die Kartoffelinsertionen von AmyZ3 und Z4 ist in Fig. 11, die Strategie für die Insertionen von AmyZ1 und AmyZ6 in Fig. 12 und die Sequenzierungsstrategie für AmyZ2 und AmyZ7 in Fig. 13 gezeigt. EcoRI- Fragmente von AmyZ5 und AmyZ8 wurden ebenfalls sequenziert, und die Ergebnisse zeigten, daß diese beiden Clone mit AmyZ7 identisch sind.
Die Nucleotidsequenzen wurden unter Zuhilfenahme der Beckman MicroGene Sequence Software analysiert. Die Sequenzen der Kartoffelinsertionen sind in Fig. 1 bis 5 wie folgt gezeigt: Fig. 1 = AmyZ3/4, Fig. 2 = AmyZ7, Fig. 3 = AmyZ1, Fig. 4 = AmyZ6 und Fig. 5 = AmyZ2.

Beispiel 7

Wenigstens fünf α-Amylase-Gene zwei verschiedener Typen sind in Kartoffelkeimgewebe aktiv

Die cDNAs in AmyZ1-8 enthalten Kopien von α-Amylase-Messenger-RNAs aus Kartoffelkeimgewebe und sind so Produktkopien von Kartoffel-α-Amylase-Genen. Die in Fig. 1 bis 5 gezeigten Sequenzen sind alle verschieden und daher Produkte verschiedener Gene. Dies zeigt, daß wenigstens fünf verschiedene Gene in Kartoffelkeimen der Sorte Dianella aktiv sind. Paarweise Vergleiche der fünf Sequenzen aus Fig. 1 bis 5 zeigen, daß sie in zwei Gruppen fallen, wie in der folgenden Tabelle veranschaulicht. Die Sequenzen wurden gegeneinander ausgerichtet und die Tabelle zeigt die prozentuale Homologie zwischen Sequenzpaaren zu einem solchen Ausmaß, daß sie überlappen. Um die Ausrichtung zu optimieren, wurden Lücken eingefügt, und die Lücken wurden für die Berechnung der Homologie in die Gesamtlänge miteinbezogen. % Nucleotidsequenzhomologie
Es ist deutlich, daß die Sequenzen von AmyZ3/4, AmyZ7 und AmyZ2 auch betreffs der 3'-nicht-translatierten Regionen in der Tat sehr homolog sind. Dieses Ergebnis läßt vermuten, daß die drei entsprechenden Gene Allele desselben Gens sind, was im Bereich des Möglichen ist, da die gewählte Kartoffelsorte (sowie andere, kommerziell verwendete Kartoffelsorten) tetrapoid ist. Nachfolgend werden die Clone/Sequenzen AmyZ3/4, AmyZ7 und AmyZ2 als der AmyZ3/4-"Typ" bezeichnet. AmyZ1 und AmyZ6 sind gleichermaßen sehr homolog, in diesem Fall jedoch ist der Homologiegrad etwas niedriger, und die Unterschiede zwischen den Genen sind in den 3'-nicht- translatierten Regionen konzentriert. AmyZ1 und AmyZ6 könnten die Produkte von Allelen eines Gens sein, sie könnten aber auch verschiedene, zu einer "Sub-Gen"-Familie gehörende Gene sein. Nachfolgend werden die Clone/Sequenzen AmyZ1 und AmyZ6 als der AmyZ1-"Typ" bezeichnet. Aus der obigen Tabelle läßt sich entnehmen, daß die Homologie zwischen den Nucleotidsequenzen jeder beliebigen Sequenz des Amyz3/4-Typs auf der einen und des AmyZ1-Typs auf der anderen Seite niedrig, d.h. 55 bis 60 %, ist. Dieses Ergebnis zeigt, daß zwei unterschiedliche Typen von Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Clonen isoliert worden sind.
Nucleotidsequenzen sind durch einen zusätzlichen Parameter, die Nucleotidzusammensetzung, gekennzeichnet. Dieser Parameter, in der Regel als der "CG-Gehalt" bezeichnet, ist besonders nützlich zur Unterscheidung von codierenden und nicht- codierenden Regionen. Es ist bekannt, daß codierende Regionen einen 15 bis 20 % höheren CG-Gehalt als nicht-codierende Regionen haben (Salinas, J., Matassi, G., Montero, L.M., und Bernardi, G.) "Compositional compartmentalization and compositional patterns in the nuclear genomes of plants" in Nucleic Acids Research (1988), Bd. 16, Seiten 4269-4285). Diese Information hilft bei der Lokalisierung von Introns und Exons in Genen. Darüber hinaus haben die codierenden Regionen (und Genome) verschiedener Pflanzenarten verschiedene CG-Gehalte, und es gibt eine relativ scharfe Unterteilung zwischen monocotyledonen und dicotyledonen Pflanzen. Der CG- Gehalt der codierenden Regionen von Kartoffel-α-Amylase- cDNAs liegt in allen Fällen unter 50 %, wohingegen der CG- Gehalt der für α-Amylase codierenden Regionen aus Getreide über 50 % liegt. Die Beispiele deuten an, daß für α-Amylase codierende Regionen aus anderen Pflanzen auf der Basis des CG-Gehalts der monocotyledonen oder dicotyledonen Gruppe der Angiospermen zugeordnet werden können.

Beispiel 8

Nucleotidsequenz der Kartoffel-α-Amylase AmyZ3/4-Messenger- RNA mit Signalpeptid-, haupt-codierender Region und 3'- nicht-translatierter Region

Fig. 1 zeigt die Sequenz des Messenger-RNA ähnlichen Stranges der zusammengefaßten Insertionen der Kartoffel-α- Amylase-cDNA-Clone AmyZ3 und AmyZ4, und Fig. 11 zeigt eine Zusammenfassung der Struktur der beiden Clone. AmyZ3 und AmyZ4 haben in den überlappenden Regionen identische Nucleotidsequenzen (vgl. Fig. 11), mit der Ausnahme, daß AmyZ3 eine Intron-Sequenz von 128 Nucleotiden in der 5'-Signalpeptid-Sequenz (manchmal die "5'-nicht-translatierte Region" genannt) hat. Das Intron endet mit den jeweiligen, an den 5'- und 3'-Exon-Intron-Grenzen gefundenen Nucleotiden, GT und AG, und das Intron enthält einen Consensus-Verzweigungspunkt. Consensus-Exon-Intron-Grenzen und -Verzweigungspunkte für Pflanzenintrons sind von Brown (32) zusammengestellt worden. Die Nucleotidsequenz vom 3'-Signalpeptid bis zu Nucleotid 540 enthält vier offene Leseraster, die im Detail in Fig. 17 gezeigt sind. Die das α-Amylase-Vorläuferprotein codierende Region beginnt mit Nucleotid 541 und endet mit Nucleotid 1761, und die daraus abgeleitete Länge des α- Amylase-Vorläuferproteins beträgt 407 Aminosäuren. Die 3'- nicht-translatierte Region ist ohne den Poly(A)-Schwanz wenigstens 200 Nucleotide lang, aber wahrscheinlich nicht viel länger, da ein wahrscheinliches Poly(A)-Signal 30 Nucleotide vom Ende entfernt gefunden wird. Poly(A)-Signale sind in Tieren, wo praktisch alle Gene die Sequenz AATAAA etwa 20 Basenpaare von der Polyadenylierungsstelle (33) entfernt haben, extrem gut konserviert, in Pflanzen, obwohl AT- reich (34) jedoch ziemlich degeneriert.

Beispiel 9

Besonderheiten der Nucleotidsequenz der Kartoffel-α-Amylase AmyZ3/4-Messenger-RNA

Fig. 11 veranschaulicht die ungewöhnliche Struktur der Kartoffel-α-Amylase-AmyZ3/4-Messenger-RNAs: sie haben sehr lange, offene Leseraster enthaltende 5'-Signalpeptid-Regionen (Fig. 17). Zusätzlich sind in den AmyZ3- und Z4-Clonen zwei verschiedene Typen von Transkripten aus demselben Gen isoliert worden, wobei das eine ein Intron in der Signalpeptid-Region hat. Normalerweise machen nicht-gespleißte Transkripte einen sehr geringen Bestandteil der Poly(A)-RNA aus. Die Tatsache, daß ein nicht-gespleißtes Transkript (in einem cDNA-Clon) isoliert worden ist, deutet an, daß sie ziemlich häufig sind und möglicherweise eine bestimmte Funktion haben. In anderen Systemen wurde gezeigt, daß solche Introns einen stabilisierenden Effekt auf die Messenger-RNA haben (Callis, J., Fromm, M. und Walbot, V., Genes and Development (1987), Bd. 1, S. 1183-1200; Huang, M.T.F. und Gorman, C.M., Nucleic Acids Res., (1990), Bd. 18, S. 937- 94). Die Menge an von der Messenger-RNA translatierten Proteinen könnte so durch den Grad, mit dem das Signalpeptid- Intron herausgespleißt wird, reguliert werden. Lange Signalpeptid-Sequenzen mit offenen Leserastern sind kürzlich auch in Erbsen-Phytochrom-Transkripten gefunden worden (47). Es ist nicht bekannt, ob die Leseraster in Kartoffel-α-Amylase- oder Erbsen-Phytochrom-5'-Signalpeptid-Sequenzen tatsächlich in den Pflanzen translatiert werden. Dies könnte getestet werden, indem Antikörper gegen künstliche Peptide mit der in Fig. 11 gezeigten Sequenz gemacht werden und diese Antikörper in Reaktionen mit Pflanzenzellextrakten eingesetzt werden.

Beispiel 10

Die Nucleotidsequenzen von Kartoffel-α-Amylase AmyZ7 und AmyZ2-Messenger-RNAs

Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz des Messenger-RNA-ähnlichen Stranges der Insertion des Kartoffel-α-Amylase-cDNA- Clons AmyZ7. Die Sequenz ist sehr homolog zur Sequenz von AmyZ3/4, der Clon ist am 5'-Ende allerdings kürzer, und das erste Nucleotid in Fig. 2 kann auf Nucleotid 543 in Fig. 1, das das dritte Nucleotid des Initiationscodons ist, ausgerichtet werden. Die Ausrichtung läßt sich ohne Lücken über das Translations-Stopcodon hinaus durchführen und der von AmyZ7 codierte α-Amylase-Vorläufer ist ebenso wie das von AmyZ3/4 codierte 407 Aminosäuren lang. Die 3'-nicht-translatierte Region ist 187 Nucleotide lang, daran schließt sich ein neun Basenpaare langer Poly(A)-Schwanz an.
Fig. 5 zeigt die Nucleotidsequenz des Messenger-RNA-ähnlichen Stranges der Insertion des Kartoffel-α-Amylase-cDNA- Clons AmyZ2. Die Sequenz ist als AmyZ2P bezeichnet, um anzuzeigen, daß ein während des Clonierens am 5'-Ende fälschlicherweise eingebauter Strang von 76 T-Resten nicht in Fig. 5 enthalten ist. Die Sequenz ist sehr homolog zur Sequenz von AmyZ3/4, allerdings ist der Clon sowohl am 5'-, als auch am 3'-Ende kürzer. Das erste Nucleotid in Fig. 5 läßt sich auf das Nucleotid 1023 in Fig. 1 und das letzte Nucleotid in Fig. 5 auf das Nucleotid 1756 in Fig. 1 ausrichten. Unerwarteterweise erfordert das Ausrichten, daß zwei Lücken in die AmyZ2-Sequenz eingefügt werden (als freie Stellen in Fig. 5 dargestellt) Daraus folgt, daß der offene α-Amylase- Leseraster unterbrochen ist und das AmyZ2 nicht für einen Teil einer Kartoffel-α-Amylase codiert. AmyZ2 weist, im Vergleich zu AmyZ3/4, zwei Deletionen auf: eine Deletion könnte einem enzymatischen Fehler während der Synthese der doppelsträngigen cDNA im Clonierungsverfahren zugeschrieben werden, das Auftreten zweier solcher Fehler in einem Clon ist jedoch sehr unwahrscheinlich. Man kann daher darauf schließen, daß im AmyZ2 entsprechenden Gen mindestens zwei Deletionen in der codierenden Region vorhanden sind. Anders ausgedrückt hat das AmyZ2-Gen fatale Mutationen erlitten und ist ein Pseudogen geworden. Während der weiteren Evolution werden in solchen Genen weitere Mutationen gesetzt, gegen die es keine Selektion gibt, und mit der Zeit wird das Gen auch die Fähigkeit, transkribiert zu werden, verlieren. Es ist daher ziemlich selten, daß Pseudogene aktiv sind. Obwohl AmyZ2 nicht mehr für einen Teil einer Kartoffel-α-Amylase codiert, trägt seine Isolierung zur Aufklärung der Struktur von Kartoffel-α-Amylase-Genen und Genfamilien bei und kann ebenso wie AmyZ3/4 und AmyZ7 (oder Fragmente davon) in Hybridisierungsversuchen verwendet werden.

Beispiel 11

Nucleotidsequenzen der Kartoffel-α-Amylase AmyZ1 und AmyZ6- Messenger-RNAs

Fig. 3 zeigt die Sequenz des Messenger-RNA-ähnlichen Stranges des Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Clons AmyZ1. Die Sequenz ist wesentlich verschieden vom AmyZ3/4-Typ (Beispiel 7), das erste Nucleotid in Fig. 3 jedoch kann ungefähr auf Nucleotid 740 in Fig. 1 ausgerichtet werden. Das erste, im selben Leseraster wie das α-Amylase-Gen befindliche Codon ist das Stopcodon, dieses Stopcodon ist jedoch so nah an der Clonierungsstelle, daß es einem Clonierungsfehler zugeschrieben werden kann. Es ist daher nicht wahrscheinlich, daß AmyZ1 das Produkt eines Pseudogens ist, wie für AmyZ2 in Beispiel 10 beschrieben. Der offene α-Amylase-Leseraster ist 350 Codons lang, und die Sequenz endet mit einer 163 Nucleotide langen 3'-nicht-translatierten Region, die keinen Poly(A)- Schwanz hat.
Fig. 4 zeigt die Sequenz des Messenger-RNA-ähnlichen Stranges des Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Clons AmyZ6. Sie ist zu der Sequenz von AmyZ1 zu 91 % homolog, die Hälfte der Nucleotidunterschiede zwischen AmyZ1 und AmyZ6 ist jedoch in einer Region stromabwärts vom Stopcodon in AmyZ1 konzentriert. AmyZ6 ist am 5'-Ende kürzer als AmyZ1; Nucleotid 1 in Fig. 4 kann auf Nucleotid 201 in Fig. 3 ausgerichtet werden. AmyZ6 hat eine Position 806 in Fig. 3 entsprechende Nucleotiddeletion. Das Ergebnis hieraus ist, daß der offene α-Amylase-Leseraster von AmyZ6 am 3'-Ende 66 Codons kürzer ist als der offene Leseraster von AmyZ1. Dieses Ergebnis wird weiter im Beispiel 14 erläutert. Die AmyZ6-Sequenz endet mit einer 360 Basenpaare langen 3'-nicht-translatierten Region. Da AmyZ6 und AmyZ1 sehr homolog sind, entspricht der erste Teil der 3'-nicht-translatierten Region in AmyZ6 der Region in AmyZ1, die für die 66 terminalen Aminosäuren codiert.

Beispiel 12

Randhomologien zwischen Kartoffel- und Gerste-α-Amylase- Sequenzen

Nachdem die Nucleotidsequenz der Kartoffel-α-Amylase-cDNA- Clone bestimmt worden war, wurde die tatsächliche Homologie zum Sac1-Fragment der Gerste-α-Amylase-Sonde (Fig. 7), mit der die Isolierung der entsprechenden Kartoffel-cDNA-Clone durchgeführt worden war, bestimmt. In Fig. 10 sind die EcoRI-Fragmente der AmyZ-Clone, die mit der Gersten-Sonde hybridisieren, dargestellt. In Fig. 14 ist die Nucleotidsequenz des hybridisierenden EcoRI-Fragments aus AmyZ4 gegen die entsprechende Sequenz der Gersten-Sonde ausgerichtet. Es ist ersichtlich, daß die Homologie nur 63,5 % beträgt. Innerhalb dieser Sequenz gibt es jedoch eine kürzere, 146 Nucleotide lange Region mit einer Homologie von 73 %, die einen Kern von 46 Nucleotiden mit 80 % Homologie enthält. Dieselbe Art von Vergleich wurde mit dem mit der Gersten- Sonde (Fig. 9 und Fig. 10) hybridisierenden EcoRI-Fragment aus AmyZ6 durchgeführt. Insgesamt beträgt die Homologie 66 %, eine kürzere Region von 110 Nucleotiden hat eine 77 % Homologie, und ein Kern von 62 Nucleotiden hat eine 84 % Homologie. Es ist früher gezeigt worden, daß Homologien in dieser Größenordnung gerade ausreichen, um hybridisierende Sequenzen in heterologen Hybridisierungen unter Bedingungen niedriger Stringenz zu finden (29 und 35). Diese Analyse hebt die Bedeutung einer vorsichtigen Optimierung, nämlich (1) die Herkunft der für die Kartoffel-cDNA-Genbank verwendeten Messenger-RNA, (2) die Hybridisierungsbedingungen und (3) die Beschränkung der Länge der Gersten-Sonde auf das Subfragment, das die Bereiche ausreichender Homologie für die Isolierung der Kartoffel-α-Amylase-Clone enthält, hervor.

Beispiel 13

Eigenschaften des α-Amylase-Vorläuferproteins, für das AmyZ3, Z4 und Z7 codieren

Die Nucleotidsequenz in Fig. 1 enthält einen langen offenen Leseraster von 407 Codons, und die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unterhalb der Nucleotidsequenz dargestellt. Um die Identität des Kartoffel-α-Amylase-Clons zu bekräftigen, wurde die abgeleitete Aminosäuresequenz mit der von der Sequenz von pM/C (24) abgeleiteten Sequenz der Gerste-α- Amylase verglichen. Der Vergleich ist in Fig. 15 dargestellt. Der Anteil an identischen Aminosäuren beträgt 45,6 %, und in 72 Positionen befinden sich ähnliche Aminosäuren. Dieser Grad an Ähnlichkeit ist trotz der Anzahl an Lücken, die eingefügt wurden, um die Ähnlichkeit auf ein Höchstmaß zu bringen, signifikant und deutet an, daß die beiden Sequenzen einen gemeinsamen evolutionären Ursprung besitzen (36). Die Plasmide AmyZ3 und Z4 sind daher Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Clone. Darüber hinaus ist das im Kasten in Fig. 15 dargestellte Peptid sogar in α-Amylasen von Säugetieren und Insekten konserviert (vgl. (55)).
Die in Fig. 2 dargestellte Nucleotidsequenz, die zu der in Fig. 1 gezeigten Sequenz in dem Bereich, in dem sie überlappen, 99,2 % homolog ist, codiert wie AmyZ3/4 für ein 407 Aminosäuren langes Peptid (mit der Ausnahme, daß die ersten beiden Nucleotide des Initiationscodons in AmyZ7 fehlen). Die Sequenzen der durch AmyZ3/4 und AmyZ7 codierten α- Amylase-Vorläufer unterscheiden sich an drei Positionen, wobei in jeder Position ähnliche Aminosäuren gefunden werden: Position 37 hat Leucin anstelle von Isoleucin, Position 333 hat Phenylalanin anstelle von Tyrosin und Position 385 hat Valin anstelle von Methionin.
α-Amylase wird als Vorläuferprotein in Gerste und Weizen mit einem sogenannten Signalpeptid am N-Terminus des Peptids synthetisiert. Signalpeptide vermitteln den Transport durch Membranen und haben gemeinsame, zum Teil zwischen Prokaryonten und Eukaryonten konservierte Eigenschaften (37). Sie sind 15 bis 30 Aminosäuren lang und beinhalten im mittleren Bereich eine hydrophobe Region. Die Aminosäuren direkt vor und hinter der Prozessierungsstelle entsprechen einem bestimmten Muster, das dazu verwendet wird, die Prozessierungsstelle in Vorläufern, wo sie nicht experimentell ermittelt worden ist, vorauszusagen (38). Um die Strukturen des vollständigen α-Amylase-Vorläuferproteins und des Signalpeptids zu veranschaulichen, wurde ein Hydrophilitätsprofil für das Peptid berechnet (Fig. 18). Die Figur zeigt den kurzen hydrophoben Bereich in der Nähe des N-Terminus des Vorläuferproteins, wobei die entsprechenden Aminosäuren näher bezeichnet sind. Die wahrscheinlichste Prozessierungsstelle ist gekennzeichnet. Sie wurde unter Anwendung der von von Heijne vorgeschlagenen Regeln gefunden; der Glycinrest in Position -1 ist von besonderer Bedeutung, der Argininrest in Position -3 ungewöhnlich. Verglichen mit anderen eukaryontischen Signalpeptiden ist die hydrophobe Region kurz. Kurze hydrophobe Regionen findet man häufiger in prokaryontischen Signalpeptiden. Es wird gefolgert, daß der Kartoffel-α-Amylase-Vorläufer mit einem Signalpeptid beginnt und daß die wahrscheinliche Prozessierungsstelle nach dem Glycin in Position 18 ist. Die Struktur des Signalpeptids ist jedoch atypisch und könnte auf einen speziellen Transportmechanismus hindeuten. Der Ort der Aktivität des reifen Enzyms ist weder in Kartoffelkeimen noch in Getreide genau bekannt.
Das Hydrophilitätsprofil des reifen α-Amylase-Enzyms (Fig. 18) zeigt keine ausgeprägten hydrophoben oder hydrophilen Regionen, und die Analyse sagt voraus, daß das Enzym löslich ist.
Die Aminosäurezusammensetzung der von AmyZ3 und Z4 codierten reifen α-Amylase wird in der folgenden Tabelle mit der Zusammensetzung der zwei Arten von Gerste-α-Amylase verglichen. α-Amylasen: Aminosäurezusammensetzung (%) Aminosäure Kartoffel Gerste A (niedriger pI) Gerste B (hoher pI) sauer basisch aromatisch hydrophob Nettoladung bei pH 7.0
Die Gerste- (und Weizen-)-Amylasen sind sauer (pIs 4,9-6,0) und sauer bis neutral (pIs 6,3-7,5). In der neueren Nomenklatur sind Typen mit höherem pI vorzugsweise mit Amyl und Typen mit niedrigerem pI mit Amy2 bezeichnet. Die Kartoffel-α-Amylase vom Typ AmyZ3/4 ist neutral und die Sequenz ist wie in Beispiel 15 beschrieben von den Getreide-Typ-1- und -Typ-2-Sequenzen gleichermaßen verschieden.
Die Aminosäuresequenzen sind in allen Fällen von Nucleotidsequenzen abgeleitet. Die N-terminale Aminosäuresequenz des reifen Peptids ist für Gersten-α-Amylase bestimmt worden, und ist in zwei anderen Fällen von der Struktur der Vorläuferpeptide abgeleitet worden.

Beispiel 14

Eigenschaften des Teils der α-Amylase, für die AmyZ1 und AmyZ6 codieren

Die niedrige Homologie der Nucleotidsequenz des Kartoffel- AmyZ3/4-Typs auf der einen und des AmyZ1-Typs auf der anderen Seite (55-60 %, Beispiel 7) legt nahe, daß sie für eindeutig verschiedene α-Amylasen codieren. Dies ist in der Tat der Fall: die Homologie der Aminosäuresequenzen zwischen der AmyZ3/4-α-Amylase und dem Teil der AmyZ1-α-Amylase beträgt lediglich 45,9 %. α-Amylase ist aus Kartoffeln gereinigt worden (Fan, M.L., Taiwania (1975), Bd. 20, S. 71-76), es ist jedoch nicht möglich, daraus abzuleiten, ob die Präparation eine Mischung aus dem AmyZ3/4-Typ und dem AmyZ1-Typ war oder nur einen Typ (der wiederum wahrscheinlich eine Mischung aus eng verwandten α-Amylasen ist, die bei jedem Typ gefunden werden und in Fig. 1 und 2 bzw. Fig. 3 und 4 dargestellt sind) enthält.
Wie in Fig. 3 und 4 dargestellt und in Beispiel 11 beschrieben, ist die AmyZ6-α-Amylase am C-terminalen Ende 66 Aminosäuren kürzer als die AmyZ1-α-Amylase. Verschiedene Längen in der C-terminalen Region sind auch bei Gerste-α-Amylasen gefunden worden (Huang, J.-K., Swegle, M., Dandekar, A.M. und Muthukrishnan, S., Plant Mol. Biol. (1984), Bd. 9, S. 3- 17). Dies zeigt, daß der C-terminale Bereich nicht wichtig für die katalytische Funktion des Enzyms ist, daß Unterschiede in der Länge jedoch andere Eigenschaften der Enzyme, wie spezifische Aktivität, Temperaturabhängigkeit und pH-Optimum, beeinflussen können.
Fig. 16 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen, aufgeschlüsselt vom Gerste-α-Amylase-Clon pM/C und vom Kartoffel-α-Amylase-Clon AmyZ1. Die Durchnumerierung der Aminosäuren bezieht sich auf den Gerste-α-Amylase-Vorläufer. Trotz des Ergebnisses, daß die lokalen Nucleotid-Sequenzhomologien zwischen der pM/C-Sequenz und den jeweiligen AmyZ3/4- und AmyZ1-Typ-Sequenzen nicht wesentlich verschieden sind (Beispiel 12), beträgt die Aminosäuresequenzhomologie zwischen der Gerste-pM/C-α-Amylase und der Kartoffel-AmyZ1-α-Amylase 64,1 % und ist somit signifikant größer als die zwischen der Gerste-α-Amylase und den Kartoffel-AmyZ3/4-Typ-α-Amylasen (45,6 %, Fig. 15). Ebenso wie die AmyZ3/4-α-Amylase ist die AmyZ1-α-Amylase vorzugsweise nicht homolog zu einem der Typen von Getreide-α-Amylasen (Beispiel 15).
Etwa 87 % der vollständigen, reifen Aminosäuresequenz des Kartoffel-α-Amylase-Typ AmyZ1 ist in Fig. 3 dargestellt. Ein Vergleich dieses Peptids mit dem entsprechenden Peptid der AmyZ3/4-α-Amylase zeigt, daß die AmyZ1-α-Amylase saurer als die AmyZ3/4-α-Amylase, aber basischer als die beiden, in der Tabelle in Beispiel 13 aufgeführten Gerste-α-Amylasen ist. Die Ladung des in Fig. 3 gezeigten Teils der α-Amylase ist daher etwa -6 bei pH7.

Beispiel 15

Überblick über Getreide-α-Amylase-Gensequenzen, Vergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenzen und ihr Verhältnis zu den Kartoffel-α-Amylasen

In der folgenden Tabelle sind die in den Genbank- und EMBL- Sequenz-Datenbanken gefundenen Pflanzen-α-Amylase-Gene/cDNA- Sequenzen zusammen mit ihren Typen, soweit zugeordnet, die Datenbank-Eintragungen, die Clon-Namen und die Literaturstellen aufgelistet. Typ Name Clon Referenz lambda Knox, C.A.P., Sonthayanon, B., Chandra, G. R. und Muthukrishnan. S. (1987) Plant Mol. Biol. Muthukrishnan, S. (1988) nicht veröffenlicht Chander, P.M., Zwar, J.A., Jacobsen, J.V., Higgins, T.J.V. und Inglis, A.S. (1984) Plant Mol. Biol. Rogers, J.C. (1985) J. Biol. Chem. Huang, J.-K., Swegia, M., Dandekar, A.M. und Muthukrishnan, S. (1984) J. Mol. Appl. Genet. Rogers, J.C. und Milliman, C. (1984) J. Biol. Chem. Whittier, R.F., Dean, D.A. und Rogers, J.C. Nucl. Acid Res. (1987) O'Neill, S.D., Kumagal, M.H., Majumdar, A., Huang, N., Sutliff, T.D., Rodriguez, R.L. (1989) nicht veröffenlicht Sutliff, T.D., Huang, N., Rodriguez, R.L. (1989) nicht veröffenlicht Baulcombe, D.C., Huttly, A.K., Martienssen, R.A., Barker, R.F. und Jarvis, M.G. (1987) Mol. Gen. Genet
Der Name des Clons entspricht dem in der Datenbank aufgeführten: GenBank vom National Institute of Health zusammengestellt. Der in Klammern aufgeführte Name des Clons entspricht dem in der Datenbank: EMBL, vom European Molecular Biology Laboratory zusammengestellt. Die ersten 11 Clone wurden aus Gerste (Hordeum vulgare), die nächsten drei aus Reis (Oryza sativa) und die letzten drei aus Weizen (Triticum aestivum) isoliert.
Die Tabelle zeigt, daß eine Anzahl von α-Amylase-Gensequenzen in Gerste, Weizen und Reis ermittelt worden ist. Die Getreide sind wie alle Gräser monocotyledone Pflanzen, wohingegen die Kartoffel eine dicotyledone Pflanze ist; in den Datenbanken gibt es keine α-Amylase-Gensequenzen aus dicotyledonen Pflanzen.
Alle in der Tabelle aufgeführten Nucleotidsequenzen wurden aufgeschlüsselt, und paarweise Homologien aller α-Amylase- Aminosäuresequenzen wurden berechnet. Die Aminosäuresequenzen der in Fig. 1-4 dargestellten Kartoffel-α-Amylase wurde auf ähnliche Weise miteinander und mit allen Aminosäuresequenzen aus Getreide verglichen. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle dargestellt: Aminosäurehomologie Gerste Reis Weizen Kartoffel
Unter den vielen Beobachtungen, die mit einer Homologiematrix gemacht werden können, sind die folgenden von besonderer Bedeutung für Kartoffel-α-Amylasen. Gerste und Weizen sind eng verwandt, und die fettgedruckten Zahlen in der Tabelle zeigen, daß Gerste und Weizen eng verwandte Sub-Genfamilien haben, die für Amylase Typ 1 bzw. Amylase Typ 2 codieren. In Weizen ist ein dritter Typ von α-Amylase, Amylase Typ 3, gefunden worden, der in Gerste bisher noch nicht gefunden wurde. Reis ist nicht so eng mit Gerste und Weizen verwandt, wie diese untereinander, und die Zuordnung der Reis-α-Amylase zu den drei Typen von Weizen-α-Amylasen ist weniger klar. Die Kartoffel ist mit den Getreidepflanzen nur sehr weitläufig verwandt. Jede der Kartoffelsequenzen ist zu allen Getreidesequenzen etwa gleich homolog, und die Kartoffel-α-Amylasen können auf der Grundlage von Aminosäurevergleichen keinem der drei Typen von Getreide-Amylasen zugeordnet werden. Auf der anderen Seite fällt ins Auge, daß die Kartoffel AmyZ1-Typ-α-Amylasen einen höheren Homologiegrad zu den Getreide-α-Amylasen als zu den Kartoffel- AmyZ3/4-Typ-α-Amylasen haben.

Beispiel 16

Anordnung von α-Amylase-Genen in Kartoffeln

DNA aus Kartoffeln wurde in Southern-Hybridisierungen (15) analysiert, wobei zwei Reihen von Experimenten durchgeführt wurden. Im ersten Experiment (Fig. 19) wurden einzelne ECoRI-Fragmente von AmyZ3 mit DNA aus der Kartoffelsorte Saturna hybridisiert, und in diesem Experiment wurden die zu dem AmyZ3/4-Typ von Sequenzen gehörenden Allele/Gene untersucht. Im zweiten Experiment (Fig. 20) wurde DNA aus zwei Kartoffelsorten getrennt mit den vollständigen Insertionen aus AmyZ3/4- und AmyZ1-Typ-Sequenzen hybridisiert. Dieses Experiment zeigt, daß bei normaler Hybridisierungsstringenz die zwei Typen von Sequenzen aufgrund der zwischen den beiden Typen von Sequenzen auftretenden niedrigen Sequenz-Homologie nicht kreuzhybridisieren. Darüber hinaus zeigt das zweite Experiment DNA-Fragment-Polymorphismen in den α- Amylase-Genen verschiedener Kartoffelsorten.
Fig. 19 zeigt das Ergebnis eines Experiments, in dem DNA der Kartoffelsorte Saturna mit EcoRI, HindIII oder BamHI gespalten wurde, auf Agarosegelen aufgetrennt und die Fragmente auf Nitrocellulosefilter transferiert wurden. Ein Filter wurde mit den radioaktiv markierten EcoRI-Fragmenten Nr. 2, 3 und 4 aus AmyZ3 (vgl. Fig. 10) und ein anderer, identischer Filter mit EcoRI-Fragment Nr. 1 hybridisiert. Die EcoRI-Muster zeigen vier starke Banden (etwa 6,0, 4,0, 2,2 und 1,5 Kb) und sechs schwächere Banden (etwa 7,7, 6,8, 4,5, 3,1, 2,8, 2,5 und 1,0 Kb) mit den Sonden 2, 3 und 4. Einige der Banden hybridisieren ebenso mit Sonde 1. Darüber hinaus tauchen zwei neue Banden (1,7 und 1,2 Kb) auf. Das HindIII- Muster zeigt drei starke Banden (etwa 15, 7,0 und 1,4 Kb) und drei schwächere Banden (5,4, 4,4 und 1,8 Kb) mit den Sonden 2, 3 und 4. Das 1,8 Kb- und besonders das 1,4 Kb- Signal leuchten mit Sonde Nr. 1 sehr stark auf, und diese Fragmente enthalten den Teil der AmyZ3/4-Typ-Gene mit dem Start des offenen α-Amylase-Leserasters. In Fig. 20 wurde DNA der Kartoffelsorten Saturna und Dianella mit EcoRI, HindIII oder BamH1 gespalten und zwei identische Filter, wie oben beschrieben, angefertigt wurden. Ein Filter wurde mit der radioaktiv markierten, vollständigen Insertion von AmyZ3, der andere Filter mit der radioaktiv markierten, vollständigen Insertion von AmyZ6 hybridisiert. Die mit den AmyZ3-Sequenzen hybridisierenden Saturna DNA-Fragmente sind die gleichen in Fig. 19 und Fig. 20, mit der Ausnahme, daß die schwächeren Banden in Fig. 19 in Fig. 20 nicht deutlich zu sehen sind. Wenn die mit der AmyZ3-Sonde in Fig. 20 erhaltenen DNA-Fragment-Muster von Saturna- und Dianella-DNA miteinander verglichen werden, zeigt sich, daß einige Banden in beiden Mustern, manchmal mit veränderter relativer Intensität, andere Banden jedoch in einer der DNAs nicht auftreten. Ein Beispiel ist die Abwesenheit des 15 Kb HindIII- Fragments in Dianella-DNA, die anstelle dessen eine stärkere, deutlich sichtbare Doppelbande bei 7,0 Kb hat. Diese Art von DNA-Fragment-Polymorphismus kann in RFLP-Analysen, wie in Beispiel 27 beschrieben, untersucht werden.
Die Isolierung von drei verschiedenen, aber stark homologen cDNA-Clonen legte für die AmyZ3/4-Typ-Amylase-Sequenzen der Sorte Dianella nahe, daß diese drei Sequenzen von drei Allelen desselben α-Amylase-Gens abstammen. Das in Fig. 19 und 20 sichtbare, sehr einfache Fragmentmuster legt, kombiniert mit dem Wissen, daß die AmyZ3/4-Typ-Sequenzen sowohl EcoRI- als auch HindIII-Restriktionsschnittstellen besitzen, nahe, daß Kartoffeln nur ein α-Amylase-Gen des AmyZ3/4-Typs, jedoch bis zu vier verschiedene Allele pro Sorte haben. Die Beschränkung von Southern-Analysen müssen jedoch berücksichtigt werden - sowohl sehr große als auch kleine DNA-Fragmente werden möglicherweise nicht erfaßt.
In Fig. 20 wurden Saturna- und Dianella-DNAs mit den vollständigen Insertionen aus AmyZ3 und AmyZ6 hybridisiert. Die DNA-Bandenmuster sind vollständig verschieden für die beiden verschiedenen Typen von α-Amylase-Sequenzen, was, wie aufgrund der niedrigen Sequenzhomologie zwischen den beiden Typen von Genen erwartet, zeigt, daß sie nicht kreuzhybridisieren. Wie in Beispiel 7 beschrieben, könnten AmyZ1 und AmyZ6 die Produkte von Allelen eines Gens sein, möglicherweise sind sie aber auch verschiedene Gene, die zur selben Sub-Genfamilie gehören. Das mit der AmyZ6-Sonde auftretende Bandenmuster ist komplexer als das mit der AmyZ3-Sonde gesehene Muster, was möglicherweise andeutet, daß es mehr als ein AmyZ1-Typ-Gen in Kartoffeln gibt. Die Southern-Analyse schließt daher nicht aus, daß AmyZ1 und AmyZ6 zwei verschiedene Gene darstellen (die Möglichkeit von bis zu acht verschiedenen Allelen eingeschlossen). Ebenso wie mit der AmyZ3-Sonde sind die mit der AmyZ6-Sonde auftretenden Fragmentmuster in beiden Kartoffelsorten verschieden. Somit können beide Typen von α-Amylase-Sequenzen in RFLP-Analysen verwendet werden.

Beispiel 17

α-Amylase-Messenger-RNA in Kartoffelkeimen und -knollen

Saturna-Keim-RNA wurde in zwei verschiedenen Experimenten mit dem AmyZ3 EcoRI-Fragment Nr. 1 und den EcoRI-Fragmenten Nr. 2+3+4 (s. Fig. 10) hybridisiert. In beiden Experimenten war eine Bande von 1500 Nucleotiden sichtbar. Die anderen RNA-Proben wurden mit den AmyZ3 EcoRI-Fragmenten Nr. 2+3+4 hybridisiert. Die Ergebnisse der Hybridisierungen sind in Fig. 21 dargestellt, und die Größen der jeweiligen Transkripte sind in der folgenden Tabelle gegeben. Kartoffelsorten Gewebe Transkriptgröße, Nucleotide ±100 Dianella Saturna Keim Knolle
Die Transkript-Größen sind Näherungswerte, die Unterschiede in den Transkript-Größen jedoch klar. Darüber hinaus ist bekannt, daß die eine Bande in Dianella-Keim-RNA wenigstens drei Typen von α-Amylase-Transkripten enthält: die reife Messenger-RNA, einen Vorläufer mit einem 128 Nucleotide langen Intron, AmyZ3 und Z4 (vgl. Fig. 11) entsprechend, und eine AmyZ2 entsprechende mRNA (Fig. 12).
Die Knollen-RNAs wurden aus 19 Wochen bei 8ºC gelagerten Knollen isoliert. α-Amylase-Transkripte wurden sowohl in Saturna als auch in Dianella gefunden, die Dianella-RNA-Qualität war jedoch suboptimal. Es ist möglich, daß auch Dianella-Knollen lange Transkripte zusätzlich zu der reifen α-Amylase-Messenger-RNA enthalten.
Die Hybridisierung wurde unter stringenten Bedingungen durchgeführt, und daher wurden nur α-Amylase-Sequenzen des AmyZ3/4-Typs entdeckt, vom Clonierungsergebnis ist jedoch bekannt, daß es wenigstens zwei Transkripte des AmyZ1-Typs in Dianella-Keimen gibt. Das lange Transkript in Saturna- Knollen-RNA ist wahrscheinlich ein häufig vorkommender, nicht-gespleißter α-Amylase-Transkript-Vorläufer und die Anwesenheit dieses Transkripts läßt vermuten, daß die Kontrolle der α-Amylase-Genexpression teilweise auf der Ebene der RNA-Reifung stattfindet.

Beispiel 18

Isolierung zusätzlicher Kartoffel-α-Amylase-cDNA-Clone und Kartoffel-α-Amylase-Gene

Zwei sehr verschiedene Typen von α-Amylase-cDNA-Clonen sind mit einer Gerste-α-Amylase-Sonde unter Verwendung von Hybridisierungsbedingungen besonders niedriger Stringenz aus Kartoffeln isoliert worden. Die AmyZ3/4-Typ-Clone (AmyZ2, 3, 4, 5 und 7) oder Teile davon auf der einen Seite und die AmyZ1-Typ-Clone (AmyZ1 und 6) oder Teile davon auf der anderen erlauben nun unter Verwendung von Standardmethoden (12) die Isolierung aller Sequenzen der beiden Typen von Kartoffel-α- Amylase, also Genen, Pseudogenen oder Messenger-RNAs (cDNAs eingeschlossen). Standardbedingungen beinhalten angemessen hohe Stringenz beim Hybridisieren (z.B. Hybridisierung bei 67ºC in 2 x SSC, der letzte Waschvorgang bei 67ºC in 1 x SSC), was den Hintergrund beim Hybridisieren und das Auftreten von falschen Signalen herabsetzt und daher die Isolierung zusätzlicher α-Amylase-Sequenzen stark vereinfacht.

Beispiel 19

Isolierung von α-Amylase-Genen und cDNA-Clonen aus anderen dicotyledonen Pflanzen

Die Nucleotid-Sequenzhomologie zwischen dem Kartoffel-α- Amylase-cDNA-Clon-Typ AmyZ3/4 und Typ AmyZ1 und irgendwelchen anderen α-Amylase-Genen oder Messenger-RNAs aus dicotyledonen Pflanzen, besonders aus der Solanaceae-Familie ist größer als zwischen solchen dicotyledonen α-Amylase-codierenden Sequenzen und der Gerste-(monocotyledonen)-α- Amylase-Sonde.
α-Amylase-Gene und cDNA-Clone aus dicotyledonen Pflanzen, mit Ausnahme von Kartoffeln, werden daher mit AmyZ3/4-Typ- oder AmyZ1-Typ-Sequenzen oder Teilen davon als Sonde unter Hybridisierungsbedingungen, die identisch oder stringenter sind als die für die Isolierung der AmyZ-Serie von Clonen, mit der Gerste-α-Amylase-Sonde beschriebene isoliert.

Beispiel 20

Mengen an reduzierenden Zuckern in vier, bei 8ºC gelagerten Kartoffelsorten

Reihen von biochemischen Untersuchungen wurden ausgeführt, um Kartoffelsorten in bezug auf Mengen an reduzierenden Zuckern in gelagerten Kartoffeln (dieses Beispiel), den Effekt der Kälteinduktion (Beispiel 21) und die Aktivitäten von α-Amylase (Beispiel 22) zu charakterisieren. Die Ergebnisse bilden die Grundlage für Methoden, mit denen die Mengen an reduzierenden Zuckern in Kartoffeln angehoben oder verringert werden, wobei α-Amylase-Genkonstrukte in transgenen Kartoffelsorten verwendet werden. In den vier in "Materialien und Methoden" beschriebenen Kartoffelsorten wurden die Mengen an reduzierenden Zuckern in den Kartoffeln zum Zeitpunkt der Entnahme vom Feld und während der Zeitspanne der Lagerung über den Winter bestimmt. Die Ergebnisse mit bei 8ºC gelagerten Kartoffeln sind in Fig. 22 dargestellt. Die Kurven veranschaulichen die beträchtlichen Unterschiede in den Mengen an reduzierenden Zuckern, die in verschiedenen Sorten gefunden werden. Die Unterschiede spiegeln in etwa das bekannte Spektrum an reduzierenden Zuckermengen in kultivierten Kartoffeln wider.

Beispiel 21

Mengen an reduzierenden Zuckern bei verschiedenen Lagerungstemperaturen

Kartoffeln, die 19 Wochen bei 8ºC, 19 Wochen bei 6ºC und 6 Wochen bei 4ºC gelagert worden waren, wurden am selben Tag aufbereitet, und die Mengen an Glucose und Fructose wurden ermittelt. Das Ergebnis (Fig. 23) zeigt das sogenannte, kälteinduzierte Versüßen von Kartoffeln, eine natürliche Reaktion gegen kältere Temperaturen. Der Vergleich der Mengen an reduzierenden Zuckern in vier verschiedenen Kartoffelsorten zeigt, daß das relative Ansteigen der Zuckermengen am größten in Sorten mit niedrigem Zuckergehalt und am niedrigsten in Sorten mit hohem Zuckergehalt ist, das Verhältnis zwischen den Zuckermengen in den vier Sorten bleibt jedoch gleich. Es zeigt, daß eine den natürlichen Gehalt an reduzierenden Zuckern verringernde Methode ebenso die Lagerungseigenschaften bei niedrigen Temperaturen verbessert.

Beispiel 22

Beziehung zwischen reduzierenden Zuckermengen und α-Amylase- Aktivität in gelagerten Kartoffeln

In dem im vorigen Beispiel beschriebenen Experiment wurde die α-Amylase-Aktivität in vier Kartoffelsorten nach 19 Wochen Lagerung bei 6ºC und 8ºC bestimmt (Methode 2). Soweit den Erfindern bekannt, sind dies die ersten erfolgreichen Messungen von α-Amylase-Aktivität in gelagerten Kartoffeln (3, 62). Die Aktivitäten waren ähnlich bei 6ºC und 8ºC, und in Fig. 24 ist die durchschnittliche Aktivität bei den Temperaturen mit den Mengen an reduzierenden Zuckern bei 8ºC in Beziehung gesetzt. Die Figur zeigt eine gute Korrelation zwischen reduzierenden Zuckermengen und α-Amylase-Aktivität. Diese Beobachtung ist die Grundlage für Methoden zur Verringerung und Vermehrung der Mengen an reduzierenden Zuckern in gelagerten Kartoffeln durch spezifische Kontrolle der α- Amylase-Produktion.

Beispiel 23

Korrelation zwischen Menden an reduzierenden Zuckern und α-Amylase-Gen-Aktivität

Um die Idee, daß α-Amylase-Aktivität in der Weise genetisch vorbestimmt ist, daß α-Amylase-Aktivität durch die Expressionsintensität der α-Amylase-Gene festgelegt ist, weiter zu untermauern, wurden aus den vier oben erwähnten Kartoffelsorten hergestellte RNA-Proben durch semiquantitative Northern-Hybridisierung untersucht, wobei Insertionen aus den isolierten α-Amylase-cDNA-Clonen als Sonden verwendet wurden. Relative Transkriptintensitäten wurden durch Abtasten der in den Northern-Hybridisierungen erhaltenen Autoradiogramme bestimmt (40).

Beispiel 24

Verfahren zur Reduzierung der α-Amylase-(reduzierenden Zucker)-Menge in Kartoffeln

Ein Plasmid wurde in E. coli konstruiert, das die folgenden Elemente in besagter Reihenfolge enthält. (1) einen Pflanzenpromotor, (2) die α-Amylase-Insertion aus z.B. AmyZ4 in einer Orientierung, die der in Fig. 7 von links nach rechts verlaufenden Orientierung entgegengesetzt ist, (3) eine Pflanzen-Transkriptionsterminations-Sequenz, z.B. aus dem Nopaline-Synthetase-(NOS)-Gen, wie in den multiplen Clonierungsstellen von pCaMVCN (Pharmacia LKB Biotechnology) bereitgestellt. Als Promotor kann der CaMV-Promotor oder der NOS-Promotor (Genkassette, Pharmacia LKB Biotechnology) zur starken und mittelstarken konstitutiven Expression des antisense-Stranges der α-Amylase-Sequenz verwendet werden. Als Promotor kann ebenfalls der des Kartoffel-Polyubiquitin- Gens, der unter Verwendung von pKG3730 als heterologe Sonde (vgl. Beispiel 3) isoliert worden war, zur niedrigen konstitutiven Expression des anti-sense-Stranges der α-Amylase-Sequenz oder ein Kartoffel-α-Amylase-Promotor, der spezifische Aktivität in denselben Pflanzenzellen wie das α-Amylase-Gen, von dem der Promotor stammt, zeigt, verwendet werden. Die Beispiele der Promotoren und Terminatoren dienen der Veranschaulichung, andere Sequenzen können dieselbe Aufgabe ausführen.
Eine anti-sense-Konstruktion mit der gesamten Sequenz von AmyZ4 wurde unter Verwendung der Sac1-Restriktionsschnittstelle im pBSK-Vektor und der EcoRV-Restriktionsschnittstelle im AmyZ4-Clon hergestellt. Das Kartoffel-Fragment wurde in das Plasmid pEnhanced-Peter-Linker (pEPL, (63)) cloniert, das zuerst mit Sac1 und dann mit Sma1 gespalten wurde. Das resultierende Plasmid wurde p(antiAmyZ4) genannt.
pEPL wurde aus pCaMVCN (64, 65) konstruiert, wobei das CAT- Gen durch Spaltung mit Pst1 entfernt wurde. Ein kleiner Linker (Linker: Pst1-BamH1-Bal1-Pst1) wurde in diese Plasmid- Pst1-Restriktionsschnittstelle eingefügt, woraus das pLise (pL) genannte Plasmid entstand. pL wurde mit HincII und BglII gespalten, und das resultierende Fragment mit dem 35S- Promotor und dem NOS-Terminator wurde in ein anderes, mit EcoRV und BgIII gespaltenes pL-Plasmid cloniert. EcoRV und HincII sind Restriktionsstellen mit glatten Enden. Das resultierende Konstrukt wurde pEnhanced-Lise (PEL) genannt. pEL unterscheidet sich grundlegend darin von pCaMVCN, daß es einen veränderten 35S-Promotor mit einer Tandem-Duplikation der 250 Basenpaare der stromaufwärts vom Promotor liegenden Sequenz enthält. Der veränderte 35S-Promotor hat eine im Vergleich zum natürlichen 35S-Promotor etwa zehnmal so hohe transkriptionelle Aktivität (66). pEL wurde mit PstI und BglII gespalten, wodurch der NOS-Terminator entfernt wurde. Anstelle dessen wurde ein CaMV-Terminator (DW2t) eingefügt. Der Pflanzenvirusterminator ist effizienter als der Pflanzengenterminator (67). Schließlich wurde ein Linker (PstI-BamHI-SmaI-SacI-SalI-SphI) in die zwischen dem 35S- Promotor mit der erhöhten Aktivität und dem CaMV-Terminator befindliche PstI-Restriktionsschnittstelle eingefügt. Dieses Plasmid wurde pEPL genannt.
Eine anti-sense-Konstruktion wurde ebenfalls mit AmyZ6 gemacht, wobei der Kartoffelclon mit SacI und EcoRV (wie AmyZ4) gespalten wurde. Das Kartoffel-Fragment wurde in das zuerst mit SacI und dann mit SmaI gespaltene Plasmid pEPL cloniert. Das resultierende Plasmid wurde p(anti-AmyZ6) genannt. Sowohl p(anti-AmyZ4) als auch p(anti-AmyZ6) wurden mit HindIII gespalten, um die den gesamten 35S-Promotor mit erhöhter Aktivität, die AmyZ4- oder AmyZ5-Insertionen in anti-sense-Richtung und den CaMV-Terminator enthaltenden Fragmente zu isolieren. Es war nötig, p(anti-AmyZ4) partiell zu spalten, da die AmyZ4-Kartoffel-Insertion eine HindIII- Restriktionsschnittstelle enthält. Die isolierten Fragmente wurden in die HindIII-Restriktionsschnittstelle des binären Vektors pBI121 (68,69,70) cloniert. Die HindIII-Restriktionsschnittstelle in pBl121 befindet sich zwischen dem Kanamycinresistenzgen und dem β-Glucuronidase (GUS)-Gen. Die anti-sense-Konstruktion (anti-AmyZ4 oder anti-AmyZ6), das Kanamycinresistenzgen und das GUS-Gen haben jeweils ihren eigenen Promotor und Terminator. Nach Isolierung der pBI121- anti-AmyZ4 (oder anti-AmyZ6)-Konstruktion aus E. coli wurde der Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404, der das entwaffnete Helferplasmid pAL4404 (71,72) enthält, unter Verwendung der triparentalen Paarungsmethode (73) transformiert. Ein Solanum tuberosum-Transformations-Modellsystem wurde mit den Kartoffelsorten Dianella und Saturna aufgebaut. Ein ein Herbicid-Resistenzmarkergen enthaltendes pBI121-Plasmid wurde verwendet, um ein Modellsystem in diesen Kartoffelsorten zu schaffen. Das pBI121-Plasmid mit dem Markergen wurde mit LBA4404, wie oben beschrieben, gepaart, und der resultierende A. tumefaciens-Stamm wurde in LB-Medium mit 50 ug/ml Kanamycin gezogen. Die Zellen wurden zentrifugiert und vor der Transformation in Murashige und Skoog-Medium (MS-Medium) resuspendiert (Murashige, T. und Skoog, F. (1962), Physiol. Plant 15, S. 473-497). Kartoffelknollen wurden geschält, kurz in destilliertem Wasser gewaschen und 15 Minuten in einer 10%igen Lösung Natriumhypochlorit mit einigen Tropfen "Tween 20" oberflächensterilisiert. Die Kartoffeln wurden dann ausgiebig in sterilem destilliertem Wasser gewaschen und in MS-Medium eingetaucht, zylindrische Proben mit einem sterilen Korkbohrer aus den Knollen entnommen und diese Proben wurden mit einem Skalpel in 1 bis 2 mm dünne Scheiben geschnitten. Die Knollenscheiben wurden in 20 ml MS-Medium, eingebracht, das Agrobacterium enthielt und durch leichtes Schütteln vollständig benetzt. 20 Minuten später wurden die Knollenscheiben auf supplementierte MS-Platten übertragen (supplementiertes MS- Medium enthält zusätzlich zu den MS-Salzen 1 mg/l Thiamin- HCl, 0,5 mg/l Nicotinsäure und 0,5 mg/l Pyridoxin-HCl (die Vitamine) und 3 % Sucrose, 5 uM Zeatinribosid und 3 uM IAA- Asparaginsäure, pH 5,9. Das Medium wurde mit 0,8 % Difco- Agar eingedickt) und 48 Stunden später auf neue Platten übertragen, die mit 500 ug/ml Carbencillin (um Agrobacterium abzutöten) und 100 ug/Kanamycin zur Selektion auf transformiertes Kartoffelgewebe supplementiert waren. Die versiegelten Platten wurden bei 25ºC unter einem Tag Licht-Nachtlicht-Cyclus inkubiert. Die Knollenscheiben wurden im Abstand von 3 Wochen auf frischem MS-Medium, das mit 200 ug/ml Carbencillin supplementiert war, weitergezüchtet. Sich entwickelnde Triebe wurden entfernt und in große Testgefäße mit MS-Medium, das Vitamine, 200 ug/ml Carbencillin und 100 ug/ml Kanamycin enthielt, zur Induktion der Wurzelbildung eingepflanzt. Die Keime wurden auf GUS-Expression (70) untersucht, und eine blaue Farbe zeigte an, daß die Keime mit dem Markergen transformiert worden waren. Dieses Modellsystem wurde benutzt, um die anti-AmyZ4- bzw. die anti- AmyZ6-Konstruktion durch Co-Kultivierung mit pBI121-anti- AmyZ4 oder pBl121-anti-AmyZ6 in pAL4404 gemäß dem bereits oben für das Markergen beschriebenen Verfahren in das Genom von z.B. sowohl Dianella als auch Saturna zu bringen.
Erfolgreich transformierte Kartoffelpflänzchen exprimierten α-Amylase-anti-Messenger-RNA von der eingefügten, dreiteiligen Genkonstruktion, wobei die Translation von α-Amylase durch Basenpaarung der α-Amylase-Messenger-RNA verhindert wird. Die niedrigere Menge an α-Amylase vermindert den Abbau an Stärke, wodurch die Bildung an reduzierenden Zuckern herabgesetzt wird. Eine sogar noch größere Inhibierung der Translation von α-Amylase wurde erreicht, wenn sowohl das anti-AmyZ4- als auch das anti-AmyZ6-Konstrukt verwendet wurden.

Beispiel 25

Verfahren zur Erhöhung der α-Amylase-(reduzierenden Zucker)- Mengen in Kartoffeln

Ein Plasmid wurde in E. coli konstruiert, das die folgenden Elemente in besagter Reihenfolge enthält. (1) einen Pflanzenpromotor, (2) ein, wie in Beispiel 18 beschrieben, isoliertes Kartoffel-α-Amylase-Gen, aus dem der Promotor bis zum Transkriptionsstartpunkt (± etwa 20 Basenpaare) entfernt worden ist. Die verwendeten Pflanzenpromotoren waren dieselben wie in Beispiel 24 aufgeführt. Zusätzlich dazu kann ein Patatin-Promotor verwendet werden. Patatin-Gene werden im Parenchym-Gewebe von Knollen (44) stark exprimiert (Bereich D in Fig. 6).
AmyZ4 (der die gesamte α-Amylase-Messenger-RNA-Länge enthaltende cDNA-Clon) wurde mit BamHI und SalI (diese Restriktionsschnittstellen befinden sich im pBSK-Polylinker) gespalten, und das resultierende Kartoffel-Fragment wurde in das mit denselben Enzymen gespaltene Plasmid pEPL (in Beispiel 24 beschrieben) cloniert. Dieses, p(sense AmyZ4) genannte Konstrukt trägt den in Beispiel 24 beschriebenen 35S- Promotor mit erhöhter Aktivität, die AmyZ4-Insertion in der Sinnrichtung und den CaMV-Terminator (beschrieben in Beispiel 24). Dieses dreiteilige Fragment wurde durch partielle HindIII-Spaltung des Plasmids p(sense AmyZ4) isoliert, in die einzige HindIII-Restriktionsschnittstelle von pBl121 cloniert und dann beispielsweise in das Dianella-Kartoffelgenom unter Verwendung der in Beispiel 24 beschriebenen Methode transferiert.
Erfolgreich transformierte Pflänzchen exprimieren α-Amylase- Messenger-RNA mit größerer Intensität als nicht-transformierte Pflanzen, und produzieren somit mehr α-Amylase als die Elternpflanze. Die erhöhte Menge an α-Amylase wird ihrerseits den Abbau von Stärke und damit die Menge an reduzierenden Zuckern erhöhen. Unter Verwendung einer Konstruktion mit einem Patatin-Promotor wird sich der Überschuß an α-Amylase in der Mitte der Knollen ansammeln, einen Teil der Stärke zu Zucker umsetzen und für den Stärkeabbau während des ersten, auf die Fermentation vorbereitenden Erhitzungsschritts zur Verfügung stehen.

Beispiel 26

Produktion von Kartoffel-α-Amylase in Mikroorganismen

Der vollständige offene Leseraster für den Kartoffel-α- Amylase-Vorläufer wird mit HaeII und DraI aus AmyZ4 herausgeschnitten. HaeII spaltet zwischen dem Initiationscodon ATG und Codon Nr. 2, und die HaeII-Restriktionsschnittstelle wird aufgefüllt und mit einer aufgefüllten NcoI-Restriktionsschnittstelle (was die Sequenz CCATG ergibt), wodurch das Initiationscodon wieder hergestellt wird, ligiert. Einmal vorkommende NcoI-Restriktionsschnittstellen findet man gewöhnlich im Initiationscodon von E. coli-Expressionsvektoren (z.B. pKK233-2, Pharmacia LKB Biotechnology). DraI spaltet 51 Basenpaare hinter dem Terminationscodon, wodurch sich ein glattes Ende ergibt. Die NcoI-Restriktionsschnittstelle wurde ebenfalls im Expressionsplasmid wieder hergestellt, um den vollständigen offenen Leseraster für den vollständigen Kartoffel-α-Amylase-Vorläufer leicht auf andere Expressionsvektoren für E. coli, andere Prokaryonten oder Eukaryonten, wie z.B. Hefe, übertragen zu können. Da Signalpeptide ähnliche Eigenschaften in Prokaryonten und Eukaryonten (Beispiel 13) haben, könnte der Kartoffel-α-Amylase-Vorläufer im neuen Wirt richtig zu reifer α-Amylase prozessiert werden. Alternativ dazu werden codierende Regionen von anderen Signalpeptiden verwendet, um die für das Kartoffel-α-Amylase-Signalpeptid codierende Region zu ersetzen.
Um die AmyZ1-Typ-α-Amylase herzustellen, wurde ein cDNA- Clon, wie in Beispiel 18 beschrieben, isoliert, der offene Leseraster mit geeigneten Restriktionsenzymen herausgeschnitten und, genau wie oben beschrieben, in einen Expressionsvektor inseriert.

Beispiel 27

Schnelles Absuchen von Kartoffelsorten in Zuchtprogrammen durch Dot-Blot

Auf der Grundlage von Beobachtungen, daß der Gehalt an reduzierenden Zuckern in gelagerten Kartoffeln in Beziehung zur α-Amylase-Aktivität steht (Beispiel 22) und, daß diese Beziehung Keime (Beispiel 17) und daher wahrscheinlich Blätter einschließt, können Kartoffelsorten bereits in einem Stadium, wenn junge Pflänzchen wenige Blätter gebildet haben, auf ihre Neigung, Zucker in gelagerten Kartoffeln anzusammeln, abgesucht werden. 0,1 bis 0,5 g aus Blättermaterial extrahierte RNA wurde auf für Hybridisierungen geeignete Filter getropft und mit radioaktiv oder mit Biotin markierten α-Amylase-cDNA-Sequenzen hybridisiert. Als Referenz kann die Hybridisierung mit ähnlich markierten für Ubiquitin codierenden Regionen aus irgendeinem Organismus, z.B. Gerste, verwendet werden, da Ubiquitin-Sequenzen äußerst gut konserviert und die Ubiquitin-Gene in verschiedenen Pflanzengeweben konstitutiv exprimiert werden (17). Die Ergebnisse werden mit ähnlichen Dot-Blots von Kartoffelsorten, deren Zuckereigenschaften bekannt sind, verglichen (z.B. mit denen der in "Materialien und Methoden" beschriebenen vier Sorten). Ein solcher Dot-Blot kann mit einer großen Menge an Zuchtmaterial durchgeführt werden, wodurch eine frühe Bewertung in bezug auf die Zuckereigenschaften möglich wird.

Beispiel 28

RFLP-Analyse mit α-Amylase-Gen-Sequenzen

Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen werden zunehmend häufig verwendet, um bestimmte Allele von Genen zu verfolgen. Dies wird soweit hauptsächlich in Menschen, jedoch auch in Pflanzen (58) durchgeführt. Die Ergebnisse von genomischen Southern-Hybridisierungen von Kartoffel-DNA mit den isolierten α-Amylase-Sequenzen zeigten (Fig. 19 und 20), daß Kartoffeln wenige α-Amylase-Gene haben, die ein einfaches Bandenmuster ergeben, wodurch Polymorphismen leicht auszuwerten sind. Beispiele für Polymorphismen sind in Fig. 20 dargestellt. Polymorphismen in mit α-Amylase-Sequenzen hybridisierenden Fragmentlängen werden, wie in entsprechenden Untersuchungen mit anderen Sonden, entweder verwendet, um die α-Amylase-Allele selbst oder als (verbundene oder nichtverbundene) Marker in andere Eigenschaften (z.B. Resistenz gegenüber Pathogenen und morphologische Eigenschaften wie z.B. Knollenfarbe) betreffende Kreuzungen zu verfolgen.

Beispiel 29

Kontrollierte Expression anderer Enzyme

α-Amylase-Gene von Kartoffeln werden in eine Entwicklungsund Gewebe-(Zell-) spezifischen Art und Weise wie die meisten anderen Pflanzengene exprimiert. Die α-Amylase-Gen-Expression ist charakteristisch für Gene, die für Enzyme codieren (im Gegensatz zu Strukturproteinen oder Speicherproteinen). Das bedeutet, daß die Expressionsintensität von α- Amylase-Messenger-RNA relativ niedrig, in der Größenordnung von 0,01 % der Gesamt-Messenger-RNA in Keimen ist (Beispiel 5). Unter Verwendung eines α-Amylase-Promotors, fusioniert mit Promotor-losen Genen, die für nicht in Kartoffeln (das gilt ebenso für nicht α-Amylase produzierende Zellen) gefundene oder in geringen, aber suboptimalen Mengen synthetisierte Enzyme codieren, kann der Intermediärstoffwechsel und der Stoffwechsel von z.B. Phytohormonen genau gesteuert werden. Das Fusionskonstrukt kann in einen A. tumefaciens- Vektor zur Produktion von transgenen Pflanzen, wie in Beispiel 24, beschrieben, eingefügt werden.
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Claims

1. DNA-Fragment, umfassend eine der in den Figuren 1, 2, 3, 4 oder 5 dargestellten Nucleotidsequenzen, eine Teilsequenz davon, die mindestens 15 Nucleotide umfaßt und mit mindestens einer der Nucleotidsequenzen unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz, umfassend die Hybridisierung bei 67ºC in 2xSSC und den letzten Waschschritt bei 67ºC in 1xSSC hybridisiert, oder unter Hybridisierungsbedingungen mittlerer Stringenz umfassend die Hybridisierung bei 67ºC in 3xSSC und den letzten Waschschritt bei 67ºC in 1xSSC, oder eine zu der Nucleotidsequenz homologe Sequenz, die ein Polypeptid codiert, das identisch mit dem durch die Nucleotidsequenz codierten Polypeptid ist, und die mit mindestens einer der Nucleotidsequenzen unter den wie vorstehend definierten Hybridisierungsbedingungen hoher oder mittlerer Stringenz hybridisiert.

2. DNA-Fragment nach Anspruch 1, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, welche:

(a) eine Nucleotidsequenz ist, die bei Nucleotid 541 der Nucleotidsequenz von Figur 1 beginnt, bei Nucleotid 1761 davon endet und eine Kartoffel-α-Amylase-Vorstufe codiert oder eine Teilsequenz davon oder eine homologe Sequenz dazu;

(b) eine Nucleotidsequenz ist, die bei Nucleotid 596 der Nucleotidsequenz von Figur 1 beginnt und bei Nucleotid 1761 davon endet, und eine Kartoffel-α-Amylase codiert oder eine Teilsequenz davon oder eine homologe Sequenz dazu;

(c) eine Nucleotidsequenz ist, die bei Nucleotid 2 der Nucleotidsequenz von Figur 2 beginnt und bei Nucleotid 1219 davon endet, und eine Kartoffel-α-Amylase- Vorstufe codiert oder eine Teilsequenz davon oder eine homologe Sequenz dazu;

(d) eine Nucleotidsequenz ist, die bei Nucleotid 53 der Nucleotidsequenz von Figur 2 beginnt und bei Nucleotid 1219 davon endet, und eine Kartoffel-α-Amylase codiert oder eine Teilsequenz davon oder eine homologe Sequenz dazu;

(e) eine Nucleotidsequenz ist, die bei Nucleotid 6 der Nucleotidsequenz von Figur 3 beginnt und bei Nucleotid 1052 davon endet und einen Teil einer Kartoffel- α-Amylase codiert oder eine Teilsequenz davon oder eine homologe Sequenz dazu;

(f) eine Nucleotidsequenz ist, die bei Nucleotid 3 der Nucleotidsequenz von Figur 4 beginnt und bei Nucleotid 647 davon endet und einen Teil einer Kartoffel- α-Amylase codiert oder eine Teilsequenz davon oder eine homologe Sequenz dazu;

(g) die in Figur 1 dargestellten Nucleotide 1330 bis 1624 sind; oder

(h) die in Figur 4 dargestellten Nucleotide 387 bis 591 sind.

3. DNA-Fragment nach Anspruch 1, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, welche

(a) die Nucleotidsequenz von Figur 1 ist, enthalten im cDNA-Clon AmyZ3, der in E. coli K-12 als DSM 5275 hinterlegt ist, oder eine Teilsequenz davon oder eine homologe Sequenz dazu;

(b) die Nucleotidsequenz von Figur 1 ist, enthalten im cDNA-Clon AmyZ4, der in E. coli K-12 als DSM 5276 hinterlegt ist, oder eine Teilsequenz davon oder eine homologe Sequenz dazu;

(c) die Nucleotidsequenz von Figur 3 ist, enthalten im cDNA-Clon AmyZ1, der in E. coli K-12 als DSM 5882 hinterlegt ist, oder eine Teilsequenz davon oder eine homologe Sequenz dazu;

(d) die Nucleotidsequenz von Figur 4 ist, enthalten im cDNA-Clon AmyZ6, der in E. coli K-12 als DSM 5883 hinterlegt ist, oder eine Teilsequenz davon oder eine homologe Sequenz dazu; oder

(e) die Nucleotidsequenz von Figur 2 ist, enthalten im cDNA-Clon AmyZ7, der in E. coli K-12 als DSM 5884 hinterlegt ist, oder eine Teilsequenz davon oder eine homologe Sequenz dazu.

4. DNA-Fragment aus einer dicotyledonen Pflanze mit einem GC-Gehalt im Bereich von 35 bis 50 %, vorzugsweise im Bereich von 40 bis 50 %, kalkuliert als Mittelwert für die codierende Region, das unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz, umfassend die Hybridisierung bei 67ºC in 2xSSC und den letzten Waschschritt bei 67ºC in 1xSSC, unter Hybridisierungsbedingungen mittlerer Stringenz, umfassend die Hybridisierung bei 67ºC in 3xSSC und den letzten Waschschritt bei 67ºC in 1xSSC, oder unter Bedingungen niedriger Stringenz, z.B. 6xSSC und 67ºC und Waschbedingungen von 4xSSC und 67ºC mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 hybridisiert.

5. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das ein vollständiges α-Amylasegen mit regulatorischen Bereichen, Promotorbereichen, codierenden Bereichen, transkribierten, nicht-codierenden Bereichen einschließlich Introns und Transkriptionsterminationsbereichen oder ein Teil davon ist.

6. DNA-Fragment nach Anspruch 5, das ein α-Amylase-Pseudogen ist.

7. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das aus einer dicotyledonen Pflanze stammt, insbesondere einem Mitglied der Familie Solanaceae, vorzugsweise aus der Gattung Solanum, vorzugsweise aus Solanum tuberosum.

8. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 7, das ein Polypeptid mit α-Amylaseaktivität codiert.

9. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das eine cDNA, eine genomische DNA, eine synthetische DNA, oder eine Kombination davon ist.

10. DNA-Fragment, das ein Fusionsprotein codiert, umfassend ein DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 9 im Leseraster mit mindestens einem zweiten DNA-Fragment, das ein zweites Polypeptid oder einen Teil davon codiert, wobei das zweite DNA-Fragment beispielsweise eine Signalsequenz ist, die ein prokaryontisches Signalpeptid codiert.

11. Polypeptid, das von einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 codiert wird, und frei von in der Natur zusammen mit dem Polypeptid vorkommenden Enzymen ist.

12. Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz von einer der Figuren 1 bis 4, eine Teilsequenz der Aminosäuresequenz, die α-Amylaseaktivität aufweist und mindestens ein aktives Zentrum umfaßt, oder ein Polypeptid, das aus einer dicotyledonen Pflanze stammt und eine Homologie von mindestens 70 % mit der Aminosäuresequenz aufweist.

13. Polypeptid nach Anspruch 12, umfassend eine in Figur 1 oder 2 dargestellte Aminosäuresequenz, das dieselben enzymatischen Eigenschaften wie das in den Figuren 1 oder 2 dargestellte Polypeptid aufweist.

14. DNA-Fragment, das ein mRNA-Molekül codiert, welches an eine von einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 transkribierte mRNA hybridisieren kann und dadurch dessen Translation inhibiert.

15. DNA-Fragment in antisense-Orientierung zu einem DNA- Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das durch einen Promotor reguliert wird, der die Synthese eines mRNA-Moleküls initiieren kann, das mit einer von einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 transkribierten mRNA hybridisiert.

16. DNA-Fragment nach Anspruch 14 oder 15, das eine anti- AmyZ4- oder eine anti-AmyZ6-mRNA codiert.

17. Einzelsträngiges DNA- oder RNA-Fragment, das komplementär zu einem der Stränge eines DNA-Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 ist.

18. Vektor, der in einem Wirtsorganismus replizieren kann und der ein DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 bis 17 trägt.

19. Wirtsorganismus, der einen Vektor nach Anspruch 18 trägt.

20. Wirtsorganismus nach Anspruch 19, der das eingefügte DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 bis 17 replizieren oder exprimieren kann.

21. Wirtsorganismus, der ein DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 bis 17 trägt, wobei das DNA- Fragment Teil des Genoms des Organismus ist.

22. Wirtsorganismus nach Anspruch 21, der das eingefügte DNA-Fragment replizieren oder exprimieren kann.

23. Wirtsorganismus nach einem der Ansprüche 19 bis 22, der eine Zellinie, vorzugsweise eine Pflanzenzellinie, eine Pflanze, ein Mikroorganismus, z.B. ein Bakterium der Gattung Escherichia, vorzugsweise E. coli, oder der Gattung Bacillus, vorzugsweise B. subtilis, eine Hefe, vorzugsweise der Gattung Saccharomyces, vorzugsweise S. cerevisiae, oder ein Pilz ist, vorzugsweise der Gattung Aspergillus.

24. E. coli-Bacterium, das

(a) E. coli K-12 ist, welches das Plasmid pAmyZ3 trägt und bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 5275 hinterlegt ist;

(b) E. coli K-12 ist, welches das Plasmid pAmyZ4 trägt und bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 5276 hinterlegt ist;

(c) E. coli K-12 ist, welches das Plasmid pAmyZ1 trägt und bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 5882 hinterlegt ist;

(d) E. coli K-12 ist, welches das Plasmid pAmyZ6 trägt und bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 5883 hinterlegt ist; oder

(e) E. coli K-12 ist, welches das Plasmid pAmyZ7 trägt und bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 5884 hinterlegt ist.

25. Genetisches Konstrukt zur Inhibierung der Translation eines von einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 codierten mRNA-Moleküls, wobei das Konstrukt umfaßt:

(1) eine regulatorische Sequenz, die funktionell verbunden ist mit

(2) einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 14 bis 17, das ein RNA-Molekül codiert, welches die Translation eines DNA-Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 inhibiert; und

(3) eine Transkriptionsterminations-DNA-Sequenz, die funktionell mit dem DNA-Fragment (2) verbunden ist.

26. Genetisches Konstrukt zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 11 bis 13, das umfaßt:

(a) (1) eine regulatorische Sequenz, die funktionell verbunden ist mit

(2) einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das das Polypeptid codiert; und

(3) einer Transkriptionsterminations-DNA-Sequenz, die funktionell mit dem DNA-Fragment (2) verbunden ist;

(b) (1) eine regulatorische Sequenz, die funktionell verbunden ist mit

(2) einem DNA-Fragment nach Anspruch 5, umfassend ein α-Amylasegen ohne Promotor; oder

(c) (1) eine regulatorische Sequenz, die funktionell verbunden ist mit

(2) einem DNA-Fragment nach Anspruch 5, umfassend ein α-Amylasegen ohne Promotor oder Transkriptionsterminationssequenz; und

27. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 25 oder 26, in dem die regulatorische Sequenz ein Pflanzenpromotor, vorzugsweise ein konstitutiver oder ein regulierbarer Pflanzenpromotor ist, wobei der konstitutive Promotor z.B. ein NOS-Promotor, ein Ubiquitin-Promotor oder ein Pflanzenviruspromotor, vorzugsweise der CaMV-Promotor ist und der regulierbare Pflanzenpromotor durch z.B. mindestens einen Faktor regulierbar ist, der ein Entwicklungs-, ein chemischer, ein physikalischer oder ein Physiologischer Faktor ist.

28. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 27, in dem der Pflanzenpromotor ein Pflanzen-α-Amylasepromotor, vorzugsweise ein Kartoffel-α-Amylasepromotor, oder ein Patatinpromotor ist.

29. Genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 25 bis 28, in dem die Transkriptionsterminationssequenz eine Pflanzentranskriptionsterminationssequenz ist.

30. Genetisch modifizierte Pflanze, die in ihrem Genom ein genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 25 bis 29 enthält.

31. Genetisch modifizierte Pflanze nach Anspruch 30, die in ihrem Genom mindestens ein genetisches Konstrukt nach Anspruch 25 trägt und im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten Pflanze eine verminderte α- Amylase-Aktivität aufweist.

32. Genetisch modifizierte Pflanze nach Anspruch 30, die in ihrem Genom mindestens ein genetisches Konstrukt nach Anspruch 26 trägt und im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten Pflanze eine erhöhte α-Amylase- Aktivität aufweist.

33. Genetisch modifizierte Pflanze nach Anspruch 30, bei der die α-Amylase-Aktivität bei niedrigen Temperaturen regulierbar ist, und die in ihrem Genom mindestens ein genetisches Konstrukt nach Anspruch 25 sowie einen Promotor trägt, der bei Temperaturen von unterhalb etwa 8ºC die Transkription des (der) in dem (den) Konstrukt(en) enthaltenen DNA-Fragments (-Fragmente) aktiviert.

34. Genetisch modifizierte Pflanze nach Anspruch 31 oder 33, in der das genetische Konstrukt im selben Gewebe oder in derselben Zelle aktiv ist, in dem (der) mindestens ein α-Amalysegen exprimiert wird.

35. Genetisch modifizierte Pflanze nach einem der Ansprüche 30 bis 34, die eine dicotyledone Pflanze ist, z.B. ein Mitglied der Familie Solanaceae, vorzugsweise der Gattung Solanum, vorzugsweise Solanum tuberosum.

36. Vektorsystem, umfassend mindestens einen Vektor, der ein genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 25 bis 29 trägt und der zur Einführung des genetischen Konstrukts in das Genom einer Pflanze fähig ist, vorzugsweise ein Mitglied der Familie Solanaceae, vorzugsweise der Gattung Solanum, vorzugsweise in Solanum tuberosum, wobei das Vektorsystem beispielsweise ein binäres Vektorsystem ist.

37. Vektorsystem nach Anspruch 36, das eine Virulenz-Funktion, die zur Infektion der Pflanze fähig ist, und mindestens einen Randteil einer T-DNA-Sequenz enthält, wobei sich der Randteil auf demselben Vektor wie das genetische Konstrukt befindet und das Vektorsystem beispielsweise ein Agrobacterium tumefaciens Ti- oder Ri- Plasmid oder ein Agrobacterium rhizogenes Ri-Plasmid enthält.

38. Mikroorganismus, der zur Infektion einer Pflanze fähig ist, vorzugsweise eine Agrobacteriumart, z.B. ein Agrobacterium tumefaciens-Stamm, der einen Vektor nach Anspruch 36 oder 37 trägt.

39. Verfahren zur Herstellung einer genetisch modifizierten Pflanze nach einem der Ansprüche 30 bis 35, wobei man ein genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 25 bis 29 in das Genom einer Pflanze überführt, um ein das Konstrukt enthaltendes genetisches Material zu erhalten, und es anschließend zu einer genetisch modifizierten Pflanze regeneriert.

40. Verfahren nach Anspruch 39, bei dem das genetische Konstrukt durch einen Mikroorganismus nach Anspruch 38, durch direkte Injektion oder durch Elektroporation in die Pflanze oder einen Teil davon überführt wird.

41. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das eine Markierung trägt, z.B. ein Fluorophor, ein radioaktives Isotop oder einen Komplexbildner wie Biotin.

42. Verfahren zur Quantifizierung des α-Amylase-Messenger- Gehalts in einem Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, vorzugsweise einer dicotyledonen Pflanze, wobei man eine aus dem Organismus erhaltene Nucleinsäure-enthaltende Probe mit einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 41 in denaturierter Form oder mit einer RNA- Kopie davon unter Bedingungen hybridisiert, die für die Hybridisierung zwischen dem denaturierten DNA-Fragment oder der RNA-Kopie und der Nucleinsäure der Probe günstig sind, und die Menge der hybridisierten Nucleinsäure bestimmt.

43. Verfahren zur Isolierung eines α-Amylasegens oder einer α-Amylase-cDNA aus einer genomischen oder einer cDNA- Genbank eines Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, vorzugsweise einer dicotyledonen Pflanze, wobei man eine aus der Genbank erhaltene Nucleinsäure-enthaltende Probe mit einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 41 in denaturierter Form oder einer RNA-Kopie davon unter Bedingungen hybridisiert, die für die Hybridisierung zwischen dem DNA-Fragment oder der RNA-Kopie und der Nucleinsäure der Probe günstig sind, und den hybridisierten Clon isoliert, um das α-Amylasegen oder die α- Amylase-cDNA des Organismus zu erhalten.

44. Verfahren zum Nachweis eines α-Amylasegens oder eines Teils davon in einem Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, vorzugsweise einer dicotyledonen Pflanze, wobei man eine Probe, die ein DNA-Fragment enthält, welches das α-Amylasegen oder einen Teil davon enthält, unter Verwendung eines DNA-Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 nach der Polymerase-Kettenreaktionstechnik amplifiziert.

45. Verfahren zur Abschätzung der Tendenz von Pflanzenzüchtungsmaterial, reduzierende Zucker zu bilden, wobei die Menge an α-Amylase-Messenger(n) oder -Gen(en) in einer Probe der Pflanze nach dem Verfahren von Anspruch 42 bestimmt und die Menge mit einem zuvor ermittelten Standardwert verglichen wird.

46. Verfahren nach einem der Ansprüche 42 bis 45, bei dem der Organismus eine dicotyledone Pflanze, vorzugsweise Solanum, vorzugsweise Solanum tuberosum oder S. melongena (Aubergine), Lycopersicon, vorzugsweise Lycopersicon esculentum (Tomate), Capsicum, vorzugsweise Capsicum annuum (Pfeffer), Nicotiana, vorzugsweise Nicotiana tabacum (Tabak), Ipomoea, vorzugsweise Ipomoea batatus (Süßkartoffel), Brassica, Medicago, Trifolium spp. (Klee), Glycine max (Sojabohne), Arachis, oder eine Wurzelnutzpflanze ist, beispielsweise Beta, vorzugsweise Beta vulgaris (Zuckerrübe).

47. Verfahren zur Analyse eines Organismus auf Allele, die ein DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder ein Homologe davon enthalten, bei dem man die Nucleinsäure des Organismus mit einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 hybridisiert und das Hybridisierungsmuster nach den Grundsätzen des Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus auswertet.