DE69001972T2

DE69001972T2 - Mittel zum nachweis von gehirnkrankheiten in zusammenhang mit nervenscheidenmarkzerstoerung, insbesondere sklerosis multiplex.

Info

Publication number: DE69001972T2
Application number: DE9090402399T
Authority: DE
Inventors: Sabine Kuchler; Guy Vincendon; Jean-Marie Warter; Jean-Pierre Zanetta
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1989-09-06
Filing date: 1990-08-30
Publication date: 1993-09-23
Anticipated expiration: 2010-08-31
Also published as: FR2651581A1; JPH05500858A; DE69001972D1; AU6421490A; US5225352A; ATE90791T1; ES2057476T3; NO920852L; CA2024731A1; FI921009A0; FR2651581B1; IE903190A1; EP0416984A1; DK0416984T3; IE64042B1; JP3032290B2; NO920852D0; WO1991003737A1; EP0416984B1; AU648516B2

Description

Die Erfindung betrifft Mittel für die in vitro-Diagnose von entmyelinisierenden Neuropathien, insbesondere von multipler Sklerose, abgekürzt SEP oder MS.
Die statistischen Untersuchungen der Weltgesundheitsorganisation zeigen, daß die MS eine Krankheit ist, die sich in der Welt, vor allem in ihren bevorzugten Regionen, die die Länder mit gemäßigtem und kaltem Klima sind, ausbreitet. In Frankreich sind 50.000 Fälle registriert, die tatsächliche Anzahl dürfte höher liegen. Der gleiche Anteil an Kranken findet sich in allen Ländern Europas und von Nordamerika mit gemäßigtem oder kaltem Klima, sowie in den entsprechenden Zonen der südlichen Hemisphäre.
Das Stadium der MS hat gezeigt, daß unterschiedliche Faktoren, und zwar genetische und/oder geographische Faktoren oder auch infektiöse Faktoren eine Rolle bei der Auslösung der Krankheit spielen können. Die Beschaffenheit dieser Mittel oder Stoffe und ihr Wirkungsmechanismus bei der Auslösung der MS sind bis heute nicht aufgeklärt. Es wird jedoch angenommen, daß in einem bestimmten Stadium die Krankheit sich zu einem Autoimmunangriff auf das Mylin in den Geweben des zentralen Nervensystems entwickelt, unter Bildung von Herden von degeneriertem Myelin.
Man beobachtet ebenfalls eine Invasion von Makrophagen und von unterschiedlichen Arten von Lymphozyten und eine abschließende Isolierung der Herde durch Astrozyten.
Mit Hilfe der durchgeführte biochemische Analysen konnten bis heute keine spezifischen Bestandteile des Myelins (Lipide, Nukleinsäure oder Proteine) identifiziert werden, die Antigeneigenschaften aufweisen und die die immunologische Zielscheibe der bei dieser Krankheit erzeugten Antikörper darstellen.
Nach den Mißerfolgen der Versuche, mit denen in den kephalo-rachialen Flüssigkeiten von Patienten, die von MS befallen waren, Antikörper nach gewiesen werden sollten, die gegen die proteinartigen oder lipidartigen Hauptantigene des Myelins gerichtet sind, haben sich einige Forschungsgruppen für das Myelin-Assoziierte-Glykoprotein MAG und dann für das Myelin-Oligodendrozyt- Glykoprotein MOG interessiert, ohne daß deutlich positive Ergebnisse erhalten worden wären.
Eine andere Annäherung besteht darin zu untersuchen, ob die in kephalorachialen Flüssigkeiten von MS-Patienten vorhandenen Antikörper gegen virale Epitope und vor allem gegen Retroviren vom Typ HTLV-1 gerichter sind. Die erzielten Ergebnisse haben jedoch eine unzureichende Spezifität der Reaktion gezeigt, da sehr viele positive Reaktionen bei Patienten beobachtet wurden, die an anderen neurologischer Erkrankungen als Neuropathien litten.
In der US-A-4 311 686 wird die Diagnose von multiplen Sklerosen und von malignen Erkrankungen durch Analyse einer Blutprobe beschreiben. Die beschriebene Methodik beruht auf der Isolierung, ausgehend von einem Pool von biologischen Flüssigkeiten, die von MS-Patienten stammen, einer Substanz, die spezifische Antigeneigenschaften aufweisen würde, wenn man sie mit der Krankheit gegenüber sensibilisierten Leukozyten einer Gesamtblutprobe reagieren läßt.
In Developmental Neuroscience 1988, 10, 199-212 wird über die Rolle von zerebellar-löslichem Lectin bei der zellulären Adhäsion und die Bildung von Mylin in den Oligodendrozyten der Ratte berichtet. Diese Druckschrift lehrt nicht, daß die CSL spezifisch von Antikörpern erkannt werden, die von den entmyelinisierenden Neuropathien erzeugt werden.
In der EP-A-337799, die zum Stand der Technik gemäß Artikel 54.3 EPÜ zählt, wird ein Lectin mit einer Affinität für β-D-Galactosid beschreiben, das ausgehend von einer menschlichen Zell-Linie von Leukaemie oder ausgehend von menschlichen Placentageweben isoliert worden ist. Es wird in Betracht gezogen, diese Lectine für therapeutische und diagnostische Zwecke zu verwenden. Ihre Verwendung bei der behandlung von Autoimmunkrankheiten wie multipler Sklerose wird erwähnt. Das Lectin ist verschieden von dem Lectin nach der Erfindung.
Die Untersuchung von bestimmten Lectinen, die die Mannose-reichen Glycane binden, durch die Erfinder, hat gezeigt, daß sie Antigenen entsprechen, die spezifisch von Antikörpern erkannt werden, welche in den kephalo-rachialen Flüssigkeiten und im Blut von Patienten vorhanden sind, die an entmyenilisierenden Neuropathien und insbesondere an multipler Sklerose leiden.
Die Erfindung hat daher die Verwendung von solchen Lectinen für die invitro-Diagnose von entmyelinisierenden Neuropathien zum Ziel.
Sie hat insbesondere zum Ziel, Mittel zur Diagnose dieser Erkrankungen bereitzustellen, d.h. ein Verfahren, mit dem die Erkrankungen in einem Frühstadium nachgewiesen werden können, indem die genannten Lectine und ein Kit, welcher die Elemente zur Durchführung der Diagnose enthält, verwendet werden.
Die Erfindung ist somit gekennzeichnet durch die Verwendung von Lectinen, welche die Mannose-reichen Glycane erkennen oder von ihren proteinartigen Untereinheiten zur Diagnose von entmyelinisierenden Neuropathien, wobei diese Lectine oder ihre Untereinheiten eine immunologische Verwandtschaft mit den zerebellar-löslichen Lectinen ("cerebellar soluble lectin" oder "CSL") bzw. mit ihren proteinartigen Untereinheiten aufweisen.
Der Ausdruck "immunologische Verwandtschaft" bedeutet, daß diese endogenen Lectine oder ihre Untereinheiten in der Lage sind, Komplexe von Antigen-Antikörpertyp mit den Antikörper zu bilden, die die CSL oder deren Untereinheiten erkennen.
Die zerebellar-löslichen Lectine oder CSL werden von ZANETTA et al in Journal of Neurochemistry, 1987, S. 1250-1257 beschreiben. In diesem Aufsatz wird die Isolierung von CSL und von proteinartigen Untereinheiten, ausgehend vom Kleinhirn der Ratte, beschreiben. Diese CSL und ihre Vorläufer-Untereinheiten sind durch ihre Affinität für die Mannose-reichen Glycane gekennzeichnet, die von Glykoproteinen getragen werden, welche in neutralen grenzflächenaktiven Stoffen wir Triton X-100 unlöslich sind.
Die Untereinheiten, die durch Extraktion aus dem Kleinhirn von Ratten gemäß diesem Aufsatz erhalten werden, besitzen Molekulargewichte (MG) von 31,5 kDa, 33 kDa und kDa.
Die oben definierte Verwendung hat zur Entwicklung eines Verfahrens zur Diagnose von multipler Sklerose und anderen entmyelinisierenden Neuropathien geführt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- eine Probe eines Patienten, vor allem kephalo-rachiale Flüssigkeit oder Blut oder eine plasmatische Flüssigkeit wie Plasma oder Serum, mit einem endogenen Lectin, wie oben definiert, unter Bedingungen inkubiert, die die Durchführung bzw. den Ablauf einer Reaktion zwischen dem Lectin und Antikörpern, die in den kephalo-rachialen Flüssigkeiten und dem Blut von Kranken, die an entmyelinisierenden Neuropathien leiden, vorhanden sind, ermöglicht,
- den gebildeten immunologischen Komplex mit Hilfe der klassischen Verfahren zum Nachweis von Immunoglobulinen nachweist.
Dieser Test nach der Erfindung besitzt weiterhin den Vorteil, daß er auf der klassischen biomedizinischen immunologischen Analyse beruht und infolgedessen zu einem mäßigen Gestehungspreis zu haben ist.
Die Ergebnisse, die bei Anwendung dieses Testes auf eine Sammlung von Entnahmen von kephalo-rachialen Flüssigkeiten erhalten wurden, haben, wie aus den nachfolgenden Beispielen zu sehen ist, eine hohe Empfindlichkeit sowie eine bemerkenswerte Spezifität gezeigt, die eine frühzeitige Entdeckung der Krankheit ermöglichen.
Man hat weiterhin bei Patienten mit einr klinischen Diagnose von multipler Sklerose, von denen die meisten Anti-CSL-Antikörper in ihrer kephalo-rachialen Flüssigkeiten besaßen, das Vorhandensein von Anti-CSL-Antikörpern im Blut oder in den plasmatischen Flüssigkeiten wie Plasma und Serum der Patienten festgestellt.
So kann beispielsweise durch eine Verdünnung von 1 bis 1000 von Plasma von MS-Patienten sehr deutlich die Anwesenheit von Anti-CSL-Antikörper, nachgewiesen werden.
Man kann die Bedeutung dieser Ergebnisse abschätzen, die zeigen, daß das Vorhandensein dieser Antikörper nicht eigentlich spezifisch für die Nervengewebe ist, und daß die zerebellar-löslichen Lectine eine bevorzugte Zielscheibe bei der MS sind.
Man stellt weiterhin fest, daß die Verwendung von Blut oder von plasmatischen Flüssigkeiten für die Durchführung des Tests sehr viel praktischer ist, weil nur eine Blutentnahme notwendig ist, die sehr viel leichter zu realisieren ist als die Lumbalpunktion, die einen stationären Krankenhausaufenthalt erfordert.
Außerdem kann der Test mit nur wenigen Mikrolitern Blut durchgeführt werden.
Um die auf der Basis des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführte Diagnose zu stützen, können zusätzliche Untersuchungen vorgenommen werden, beispielsweise mit Hilfe von NMR (kernmagnetische Resonanz), mit deren Hilfe verbreitete Schädigungen der weißen Substanz sichtbar gemacht werden können.
Die beim erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren verwendeten endogenen Lectine sind partiell gereinigte Lectine oder reine Präparate.
Die Lectine oder ihre Untereinheiten kommen weitverbreitet in den Geweben von Säugetieren, von Vögeln und von Fischen vor und können, ausgehend von diesen Geweben, mit Hilfe unterschiedlicher Reinigungsverfahren isoliert werden, vorteilhafterweise beruhend auf der Affinität dieser Lectine für die Mannose-reichen Glycane.
Man verwendet CSL oder endogene Lectine, die eine immunologische Verwandtschaft mit den CLS besitzen, beispielsweise CSL-Lectine, die ausgehend von anderen Säugetieren, Vögeln, Fischen oder anderen weniger entwickelten Organismen, isoliert worden sind.
Als Variante wird das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren ausgeführt, indem eine oder mehrere der Untereinheiten dieser Lectine eingesetzt werden.
Bevorzugte Untereinheiten von CSL sind von der Art, wie sie bei dem weiter oben genannten Verfahren von ZANETTA et al erhalten werden.
Es handelt sich insbesondere um Untereinheiten von 45 kDa, 33kDa und 31,5 kDa.
Die Inkubation der endogenen Lectine oder ihrer Untereinheiten mit der Probe, die untersucht werden soll, wird vorteilhafterweise bei Umgebungstemperatur in einem Puffermedium durchgeführt.
Man verwendet insbesondere ein Puffermedium mit einem pH-Wert nahe dem Neutralpunkt und relativ hoher Ionenstärke, wie den Puffer vom Typ TBS (10 mM Tris-Hcl, pH 7,2, enthaltend 0,15 M NaCL) oder den Puffer vom Typ PBS (25 mM NaH&sub2;PO&sub4; - Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,2, enthaltend 0,15 M NaCl).
Die Stufe des Nachweises der auf den endogenen CSL-Lectinen fixierten Immunoglobulinen wird vorteilhafterweise durchgeführt, indem entweder markierte Anti-Ig-Human Immunglobuline oder markierte Anti-IgG oder Moleküle vom nicht-immunitären Typ verwendet werden.
Die Immunglobuline werden vor allem mit einem Enzym oder einem radioaktiven Reaktionspartner markiert.
Als Beispiel für Enzyme werden Peroxidase, alikalische Phosphatase und β-Galactosidase genannt, die den derzeit am meisten verwendeten Markierungsenzymen entsprechen.
Ein klassischer Reaktionspartner besteht aus radioaktivem Iod. Die Moleküle vom nicht-immunitären Typ bestehen beispielsweise aus markiertem Protein A. Die radioaktive Markierung wird meistens mit Iod vorgenommen. Es ist klar, daß andere Enzyme oder radioaktive Reaktionspartner oder auch andere Formen der Markierung angewandt werden können, sobald sie ermöglichen, die in Betracht gezogene Antigen-Antikörperreaktion nachzuweisen.
Die Erfindung betrifft auch einen Diagnosekit, mit dem das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren durchgeführt werden kann und der dadurch gekennzeichnet ist, daß er enthält:
- mindestens ein endogenes Lectin oder eine seiner Untereinheiten, wie obenstehend definiert;
die Lösungsmittel und notwendigen Mittel bzw. Stoffe für die Stufe der Inkubation und/oder des Nachweises.
Weitere Merkmale und Vorteile werden in den folgenden Beispielen berichtet, die sich auf partiell gereinigtes CSL und auf seine Verwendung zum Nachweis der Anwesenheit von Anti-CSL-Antikörpern bei Patienten, die von MS befallen sind, beziehen.
In diesen Beispielen wird auf Fig. 1 bis 3 Bezug genommen, die jeweils zeigen:
- die Fig. 1 und 3 Aufnahmen von Immunoblots, sie mit Entnahmen von kephalorachialen Flüssigkeiten und von Plasma erhalten wurden,
Fig. 2 die Verteilungshistogramme der Diagnosen.

Beispiel

1. Herstellung einer partiell gereinigten Antigenfraktion von CSL

Man brachte CSL spezifisch mit Mannose in Lösung, wie in dem vorgenannten Aufsatz von ZANETTA et al beschreiben; die CSL stammten von Kleinhirnen von jungen Ratten. Dieser Arbeitsgang und die folgenden wurden bei 4ºC ausgeführt unter Verwendung von Puffern, denen unmittelbar vor dem Einsatz Protease- Inhibitoren zugesetzt wurden, und zwar Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und p-Tosyl-argininmethylester (0,1 mM bzw. 0,3 mM).
Das in Gegenwart von Mannose in Lösung gebrachte und gereinigte Material (Fraktion TNM) wurde während 30 min bei 4ºC gefällt und dann bei 4ºC zentrifugiert.
Der Rückstand wurde mit reinem Methanol gewaschen. Dann wurde unter einem schwachen Luftstrom getrocknet und in einer Menge von 1 mg/ml in dem dissoziierenden Puffer von Laemmli in Lösung gebracht. Anschließend wurde während 5 min auf 90ºC erhitzt und dann eine Elektrophorese durchgeführt.
Die Elektrophorese wurde auf einem Polyacrylamidgel (13%ig) in Gegenwart von SDS im Puffersystem von Laemmli auf 0,75 mm dicken Gelplatten durchgeführt.
Man brachte 200 ul einer an CSL angereicherten Fraktion auf einer Länge von 130 mm auf und ließ die Wanderung sich während 6 h unter konstantem Strom von 15 mA sich entwickeln.
Das Gel wurde gemäß klassischen Arbeitsweisen auf Filter aus Nitrocellulose transferiert.
Nach 4stündigem Transfer unter konstanter Spannung (36 V) mit einer Intensität von 0,4 A wurde der Rand das Blot bzw. Filterstreifens mit Amido Black gefärbt. Der Rest des Filters aus Nitrocellulose wurde mit einer Rinderserumalbuminlösung oder BSA (3%) in einem Tris-Hcl-Puffer (10 mM), pH 7,2, der 150 mM NaCl enthielt (Puffer TBS), währens 2 h bei Umgebungstemperatur gesättigt.
Das Filter wurde mit Wasser gewaschen und in Wasser von 4ºC bis zum Gebrauch aufgewahrt.

2. Inkubation der Antigenfraktion mit einer kephalo-rachialen Flüssigskeitsprobe von Patienten, die an verschiedenen neurologischen Krankheiten litten

Das zuvor erhaltene Nitrocellulosefilter wurde in 2 mm breite Streifen zerschnitten, die auf die Bahnen eine Inkubationsbehälters gebracht wurden, der 0,75 ml einer 3%igen BSA-Lösung in TBS-Puffer enthielt.
Nach dem Inkubieren unter leichtem Rühren während mindestens 1 h bei Umgebungstemperatur wurden 0,75 ml kephalo-rachiale Flüssigkeit zugegeben.
Die Streifen wurden während 3 h bei Umgebungstemperatur gerührt, und dann im Verlauf von 2 h 15mal gewaschen, 10 min lang in 3%igem BSA in TBS-Puffer inkubiert und in TBS während einer weiteren Zeitspanne von 2 h gespült.

3. Markieren und Sichtbarmachen des Antigen-Antikörperkomplexes

Zu den gespülten Streifen wurde BSA (1,5 ml einer 3%igen Lösung in TBS) gegeben und während 30 min bei Umgebungstemperatur unter Zugabe von Anti- Human-IgG der Ziege markiert mit HRP oder alkalischer Phosphatase (Endverdünnung 1:500) inkubiert. Die IgG kamen von den Firmen IMMUNOTECH oder PELFREEZ BIOCHEMICALS.
Die Proben wurden während etwa 14 h bei 4ºC gerührt oder bewegt und gespült, wie oben beschreiben. Die Entwicklung der Proben wurde gemäß der Chlornaphthol Arbeitsweise für HRP mit einem Substrat Promega für alkalische Phosphatase vorgenommen.
Nach Reaktion bei Umgebungstemperatur wurden die Streifen mit Wasser gewaschen und zwischen Papierfiltern getrocknet.
Die positive Proben entsprachen derjenigen, die eine Färbung der Banden mit den für CSL charakteristischen MG von 45 bzw. 33 bzw. 31,5 kDa zeigten. Diese Färbung der CSL-Streifen trat bei den Versuchen nicht auf, die in Abwesenheit von Antikörpern der kephalo-rachialen Flüssigkeit oder bei Verwendung von kephalo-rachialen Flüssigkeiten von Patienten, die an anderen neurologischen Erkrankungen als multipler Sklerose litten, durchgeführt wurden.

4. Ergebnisse

Die in Fig. 1 wiedergegebene Aufnahme zeigt Proben der Immunoblots, mit denen die Anwesenheit von Anti-CSL-Antikörper in der kephalo-rachialen Flüssigkeit von Patienten, die an multipler Sklerose oder an anderen neurologischen Erkrankungen litten, nachgewiesen werden konnten.
Die Ergebnisse der Fig. a) bis g) entsprechen folgenden Situationen:
a) Färbung eine Proteinpräparats, das als Antigen verwendet wurde, mit Hilfe von Amido Black (TNM-Fraktion aus dem Kleinhirn junger Ratten, angereichert mit CSL). Man stellt bei diesem partiell gereinigten Präparat das Vorhandensein von Streifen mit 31,5, 33 und 45 kDa fest, die für die CSL-Untereinheiten charakteristisch sind;
b) Färbung, erhalten in Abwesenheit von kephalo-rachialer Flüssigkeit und unter Verwendung von Anti-Human-Antikörpern der Ziege, markiert mit HRP oder AKP;
c) Aussehen, erhalten bei Verwendung von kephalo-rachialer Flüssigkeit von Patienten mit Hirnhaut-Haemorhagien aufgrund von mechanischen Traumata. Man stellt eine Färbung des Hintergrunds bei Abwesenheit von definierten gefärbten Streifen oder Banden fest;
d) und g) entsprechender Immundetektion von CSL-Streifen unter Verwendung der kephalo-rachialen Flüssigkeit von Patienten mit multipler Sklerose als Quelle für Anti-CSL-Antikörper. Der Nachweis des Antigen-Antikörperkomplexes wird unter Verwendung von Anti-Human-Immunglobulin, markiert mit HRP oder AKB, durchgeführt. Man beobachtet, daß die gefärbten Untereinheiten von CSL von einem Patienten zum anderen variieren. Die Untereinheit mit 31,5 kDa wird im d) 1-3 nachgewiesen, die Untereinheit mit 45 kDa im d) 4-9. In einigen Fällen sind die Untereinheiten mit 31,5 und 33 kDa von CSL stark gefärbt mit einem Farbschema, das sich von demjenigen der Untereinheit mit 45 kDa unterscheidet;
e) und f) entsprechen den gleichen Versuchen, aber mit kephalo-rachialen Flüssigkeiten von Patienten, die an anderen neurologischen Erkrankungen leiden als an multipler Sklerose. e) entspricht nicht-infektiösen Krankheiten, die nicht die Blut-Hirn-Schranke angreifen und f) entspricht Fällen von viraler Meningitis. In vier Fällen wurde ein Streifen von 67 kDa im Abschluß an eine immunologische Reaktion gefärbt. Bei einem Patienten der Versuchsreihe wurde diese Bande oder dieser Streifen nur während der Akutphasen der Krankheit beobachtet. Banden/Streifen mit 40 kDa und 27 kDa wurden in eineigen Fällen nachgewiesen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Immunoblots von MS-Patienten sich vollständig von denjenigen von Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen unterscheiden. Die Banden/Streifen sind nicht gefärbt, wenn man keine kephalorachiale Flüssigkeit zugibt (siehe Fig. 1 b), oder wenn die kephalo-rachialen Flüssigkeiten von Patienten mit anderen Pathologien als der multiplen Sklerose stammen (Fig. 1 c), 1 e) und 1 f)).
255 Proben von kephalo-rachialen Flüssigkeiten wurden im Verlauf dieser Untersuchungen analysiert, und die entsprachen mehr als 240 verschiedenen Patienten. Bei den zweimal oder mehr analysierten Proben sind die Ergebnisse stets für die Patienten mit einer auf MS lautenden Diagnose reproduzierbar.
Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse wird in Fig. 2 erläutert. Diese zeigt:
a - die Verteilung der Proben, die positive und negative Ergebnisse liefern bei der Analyse durch immunochemischen Test mit CSL als Antigen (1: Proben insgesamt, 2: negative Proben, 3: positive Proben).
b - entspricht der Verteilung der Proben der diagnostizierten MS-Fälle, wobei die wahrscheinlichen und möglichen Fälle positive Tests und negative Tests lieferten (1: positive Proben insgesamt, 2-4: klinisch diagnostizierte MS wahrscheinlich und möglich, die jeweils positive Tests ergaben, 5: klinische diagnostizierte MS, die negative Tests ergaben).
c - entspricht der Verteilung von Proben mit verschiedener Diagnose ohne MS, die im Test positive Reaktionen ergaben (1: Proben insgesamt, 2: Polyneuropathien (hell) und zerabrale und pyramidale Syndrome (dunkel), 3: Meningitis, 4: Hydrozephalie, 5: andere Krankheiten).
Negativen Ergebnisse wurden mit 170 verschiedenen kephalo-rachialen Flüssigkeiten erhalten, die von Patienten mit verschiedenen anderen neurologischen Erkrankungen als multipler Sklerose stammten (Demens, Parkinson, Vorhof-Syndrome, pseudo-bulbäre Syndrome, extrapyramidale Syndrome, Schmerzen, Lumbagien, Meningiten, Haemorhagien usw.).
Eine Gruppe von Proben entsprach Patienten mit haemorhagischen Meningiten, die eine Hintergrundfärbung und eine spezifische Färbung eines Streifens mit 67 kDa, die nicht mit CSL-Banden in Beziehung stand, zeigten.
Bei 51 Fällen von multipler Sklerose (einschließlich klinisch diagnostizierter MS, wahrscheinlicher MS und möglicher MS) wurde eine Färbung der CSL- Streifen/Banden in 47 Fällen gefunden. Negative Ergebnisse wurden nur in 4 Fällen erhalten. Diese 4 Fälle entsprachen klinisch diagnostizierter MS. In 30 Fällen wurde eine Färbung der CSL-Streifen/Banden nach gewiesen ohne Diagnose auf MS. Diese Fälle entsprachen einer geringer Anzahl von Erkrankungen oder Krankheiten einschließlich Polyneuropathien (4 Fälle), zerebrale und pyramidale Syndrome (6 Fälle), olivo-ponto-zerebellaren Atrophien (1 Fälle), Hydrokephalien (4 Fälle) und den anderen Individuellen Krankheiten/Erkrankungen (Septikaemi, BROWN-SEQUARD C8D1, Tumor und Epilepsie, Dysesthesie, postradikalische Leuko- Encephalitis, periphere PF). Diese Fälle werden Gegenstand einer spezifischen IRM-Untersuchung sein.
Bei einer Definition der Spezifität des Testes als Verhältnis der reellen wahren Negativproben zur Summe der reellen Negativproben und der möglichen Fehler erhält man einen Mindestwert von 85%, der die größe Spezifität des Testes zeigt.
Die Werte, die die Sensibilität oder Empfindlichkeit betreffen, liegen in der Größenordnung von 93,05% (Verhältnis von reellen Positivproben zur Summe der reellen Proben und der Negativfehler).
Diese Ergebnisse zeigen, daß der Nachweis der Anwesenheit von Anti-CSL- Antikörpern ein gutes Anzeigekriterium einer Diagnose auf multipler Sklerose ist.

5. Verwendung von Plasma

Die nach dem Zentrifugieren von über Heparin entnommenem Blut erhaltenen Plasmaproben werden eingefroren und bei -80ºC bis zum Zeitpunkt des Testes aufbewahrt.
In Fig. 3 sind die Ergebnisse wiedergeben, die beim Test gemäß der Technik der Immunantwort durch die Anwesenheit von Anti-CSL-Antikörpern, durchgeführt mit einer Reihe von Plasmaproben von Patienten, die an verschiedenen neurologischen Krankheiten litten, erhalten wurden.
a) und b) zeigen die Färbung mit Amidoschwarz an: a) der Marker mit (angegebener) Molekularmasse (Masse angegeben in kDa) und b) der für den Test verwendeten Proteine (die Pfeilspitzen geben die Position der charakteristischen Untereinheiten von CSL (31,5-33 und 45 kDa) an).
Die Proben, die zu positiven Ergebnissen führten, sind oben numeriert, die anderen sind unten numeriert. Die mit einem kleinen Stern versehenen Proben sind diejenigen, bei denen die Diagnose auf multiple Sklerose formuliert worden war.
Man stellt eine starke Intensität der Färbung der Banden bei 31,5 und 33 kDa für den Hauptteil der MS-Patienten fest. Ein negatives Ergebnis (im Plasma wie für LCR) wurde bei der Probe Nr. 11 erhalten, das keine Abbildung von Herden mittels Bildgebung durch kernmagnetische Resonanz zeigt. Die mit einem großen Stern merkierten Proben entsprechen einem Patienten, der an Polyradikuloneuritis leidet und dessen Plasma vor (0,7 und 24) und nach (0,8 und 25) Plasmaphorese entnommen worden war. Bei geringer Plasmakonzentration (1,5 ul für den Test) beobachtet man eine Abnahme der Anti-CSL-Antikörper nach der Plasmaphorese, aber sie bleiben bei stärkerer Konzentration nachweisbar (15 ul Plasma für die Proben 24 und 25). Die Probe Nr. 21 entspricht einer MS mit intrathekaler IgA-Synthese, die ein erstes negatives LCR-Ergebnis nach Nachweis/Entwicklung des von den Anti-IgG fixierten Antikörpers ergeben hat. Die Verwendung von Anti-Ig anstelle von Anti-IgG ermöglicht somit, diesen positiven Fall nachzuweisen.

Claims

1. Verwendung von endogenen Lectinen, die eine Affinität für die Mannose-reichen Glycane besitzen, oder von deren eiweißartigen Untereinheiten zur in vitro-Diagnose von entmyelinisierenden Neuropathien, vor allem von multipler Sklerose oder SEP, wobei diese Lectine oder ihre Untereinheiten eine immunologische Verwandtschaft mit den zerebellar-löslichen Lectinen (cerebellar soluble lectine, CSL) oder deren einweißartigen Untereinheiten aufweisen.

2. Diagnoseverfahren für multiple Sklerose und andere entmyelinisierende Neuropathien, dadurch gekennzeichnet, daß man

- eine Probe eines Patienten, vor allem kephalo-rachiale Flüssigkeit oder Blut oder plasmatische Flüssigkeiten, wie Serum oder Plasma, mit einem endogenen Lectin, wie in Anspruch 1 definiert, unter Bedingungen in Berührung bringt, die den Ablauf einer immunologischen Reaktion zwischen dem Lectin und in den kephalo-rachialen Flüssigkeiten und im Blut von Kranken, die an entmyelinisierenden Neuropathien leiden, enthaltenen Antikörpern ermöglichen und

- den gegebenenfalls gebildeten immunologischen Komplex mit Hilfe klassischer Nachweisverfahren für Immunoglobuline nachweist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Präparat von vollständig oder partiell gereinigten Lectinen einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere eiweißartige Untereinheiten der Lectine verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man CSL oder eine oder mehrere Untereinheiten von CSL, insbesondere solche mit einem Molekulargewicht von 45 kDa, 33 kDa oder 31,5 kDa verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe des Inberührungbringens durch Inkubieren bei Raumtemperatur in einem Puffermedium realisiert.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe des Nachweises der auf den endogenen CSL-Lectinen fixierten Immunoglobulinen vorteilhafterweise realisiert, indem man entweder markierte anti-Ig-human Immunoglobuline oder markierte Anti-IgG oder Moleküle vom nicht-immunitären Typ verwendet.

8. Diagnosekit für multiple Sklerose und allgemein für entmyelinisierende Neuropathien zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß er enthält:

- mindestens ein endogenes Lectin vom CSL-Typ oder eine seiner Untereinheiten, wie in Anspruch 1 definiert, und

- die Lösungsmittel und notwendigen Mittel für die Stufe der Inkubation und/oder des Nachweises.