DE69933763T2

DE69933763T2 - Biologisch abbaubares alginatgel mit verzögerter freisetzung

Info

Publication number: DE69933763T2
Application number: DE69933763T
Authority: DE
Inventors: Seymour Merrill Thousand Oaks GOLDENBERG; Hua Jian Thousand Oaks GU
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1998-05-18
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2019-05-15
Also published as: SK16752000A3; HUP0101895A3; EP1079811B1; NO20005564L; CN1309556A; AU3993999A; NO20005564D0; JP2002515419A; BG65397B1; BR9910553A; KR20010025023A; DK1079811T3; HUP0101895A2; EA200001200A1; EA003670B1; YU69400A; PL344337A1; DE69933763D1; ATE343378T1; US6432449B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Formulierungen mit verzögerter Freisetzung unter Verwendung biologisch abbaubarer Alginatgel-Perlen und/oder verzögerter Gele und Methoden davon.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mit den Fortschritten in der Gen- und Zelltechnologie hat die Verfügbarkeit rekombinanter Proteine Fortschritte bei der Verwendung von Proteinen als Arzneimittel für therapeutische Anwendungen hervorgebracht. Viele Krankheiten oder Zustände, die mit pharmazeutischen Proteinen behandelt werden, erfordern verlängerte Proteinspiegel, um das wirkungsvollste therapeutische Ergebnis zu erreichen. Wie bei den meisten Protein-Pharmazeutika erfordert die im allgemeinen kurze biologische Halbwertszeit jedoch häufige Verabreichung. Diese wiederholten Injektionen werden in verschiedenen Intervallen gegeben, die zur Fluktuation der Medikationsniveaus mit einer signifikanten physischen und monetären Belastung für die Patienten führt. Da viele Zustände besser auf gesteuerte Spiegel eines Pharmazeutikums ansprechen, besteht ein Bedürfnis nach gesteuerter Freisetzung eines Arzneimittels, um längere Zeiträume konsistenter Freisetzung bereitzustellen. Solche Arzneistoffe mit verzögerter Freisetzung würden für den Patienten nicht nur verstärkte prophylaktische, therapeutische oder diagnostische Wirkungen bringen, sondern auch eine Abnahme in der Häufigkeit von Injektionen sowie in den Gesamtkosten.
Gegenwärtige Versuche, Medikationsniveaus bei Menschen oder Tieren zwischen Dosen zu verzögern, haben die Verwendung biologisch abbaubarer Polymere als Matrizes eingeschlossen, um die Arzneimittelfreisetzung zu steuern. Das britische Patent Nr. 1,388,580 offenbart zum Beispiel die Verwendung von Hydrogelen für verzögerte Freisetzung von Insulin. U.S.-Patent Nr. 4,789,550 offenbart die Verwendung von mit Polylysin beschichteten Alginat-Mikrokapseln für die Zuführung von Protein durch Enkapsulierung lebender Zellen. Versuche zu verzögerter Freisetzung haben auch anionische oder kationische Polymerzusammensetzungen eingesetzt, die von ionischen Polymeren der entgegengesetzten Ladung umgeben sind, für die Enkapsulierung von Zellen, um biologisch aktive Zusammensetzungen herstellen zu können; U.S.-Patent Nr. 4,744,933. In ähnlicher Weise sind auch mehrfache Überzüge aus anionischen oder kationischen vernetzenden Polymeren als Mittel zum Erreichen gesteuerter Freisetzung offenbart worden; U.S.-Patent Nrn. 4,690,682 und 4,789,516. Zusätzlich offenbaren weitere Versuche die Verwendung von Alginaten allein oder Alginaten, die mit anderen biologisch abbaubaren Polymeren beschichtet sind, für gesteuerte Freisetzung von Polypeptidzusammensetzungen oder Kationenniederschlägen derselben; PCT WO96/00081, PCT WO95/29664 und PCT WO96/03116.
Das japanische Patent JP 1005460 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines verzögerten Gelmaterials unter Verwendung von Gelangummi und einem Erdalkalimetallsalz.
EP-A-719548 offenbart ein Verfahren zum Gelieren von flüssigem Polyethylenglykol bei Raumtemperatur mit Calciumacetat, um im wesentlichen durchscheinende Gele herzustellen.
Diese Versuche haben jedoch unzureichende Mittel zum Erhalten einer Zuführung mit verzögerter Freisetzung von gewünschten Protein-Pharmazeutika bereitgestellt. Es ist allgemein bekannt, daß die Verwendung bestimmter biologisch abbaubarer Polymere, z.B. Polylactid-co-glykolid, unter in-vivo-Bedingungen hohe anfängliche Bursts der Arzneimittelfreisetzung zeigen; Johnson, O. et al., Nature Med., 2 (7): 795 (1996). Überdies ist es allgemein bekannt, daß Proteine, die mit gegenwärtigen Formen von Zubereitungen mit verzögerter Freisetzung verwendet werden, Denaturierung durchlaufen und ihre biologische Aktivität bei Einwirkung der enkapsulierenden Mittel verlieren können. Solche Zubereitungen verwenden organische Lösemittel, die schädliche Wirkungen auf das Protein der Wahl haben können. Schließlich hat die Verwendung von Alginat allein, wie unten diskutiert, nicht die gewünschte gesteuerte Proteinfreisetzung bereitgestellt, die für wirkungsvolle therapeutische Ergebnisse notwendig ist.
Allgemein sind Alginate gut bekannte, natürlich vorkommende, anionische Polysaccharide, bestehend aus 1,4-verknüpfter β-D-Mannuronsäure und α-L-Guluronsäure; Smidsrod, O. et al., Trends in Biotechnol., 8:71–78 (1990); Aslani, P. et al., J. Microencapsulation, 13 (5): 601–614 (1996). Alginate variieren typischerweise von 70% Mannuronsäure und 30% Guluronsäure bis 30% Mannuronsäure und 70% Guluronsäure; Smidsrod, aaO.. Alginsäure ist wasserunlöslich, wohingegen Salze, die mit einwertigen Ionen wie Natrium, Kalium und Ammonium gebildet sind, wasserlöslich sind; McDowell, R.H., „Properties of Alginates" (London, Alginate Industries Ltd., 4. Ausgabe 1977). Von mehrwertigen Kationen ist bekannt, daß sie mit Alginaten reagieren und spontan Gele bilden.
Alginate haben eine breite Vielfalt von Anwendungen, wie etwa Lebensmittelzusatzstoffe, Kleber, pharmazeutische Tabletten und Wundverbände. Alginate sind auch für Protein-Trenntechniken empfohlen worden. Gray, C.J. et al., in Biotechnology and Bioengineering, 31:607–612 (1988) fing zum Beispiel Insulin in Zink/Calcium-Alginatgelen zur Trennung von Insulin von anderen Serumproteinen ein.
Alginat-Matrizes sind auch für Arzneistoffabgabesysteme gut dokumentiert; siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 4,695,463, das ein Kaugummi-Abgabesystem für pharmazeutische Zubereitungen auf Alginat-Basis offenbart. Alginat-Perlen sind für gesteuerte Freisetzung verschiedener Proteine verwendet worden, wie etwa: Tumornekrosefaktor-Rezeptor in Kationen-Alginat-Perlen, beschichtet mit Polykationen; Wee, S.F., Proceed. Intern. Symp.
Control. Rel. Bioact. Mater., 21: 730–31 (1994); Transformierender Wachstumsfaktor, enkapsuliert in Alginat-Perlen; Puolakkainen, P.A. et al., Gastroenterology, 107:1319–1326 (1994); Angiogenesefaktoren, eingefangen in Calciumalginat-Perlen; Downs, E.C. et al., J. of Cellular Physiology, 152:422–429 (1992); Albumin, eingefangen in Chitosan-Alginat-Mikrokapseln; Polk, A. et al., J. Pharmaceutical Sciences, 83(2):178–185 (1994); Chitosan-Calciumalginat-Perlen, beschichtet mit Polymeren; Okhamafe, A.O. et al., J. Microencapsul., 13(5):497–508 (1996); Hämoglobulin, enkapsuliert mit Chitosan-Calciumalginat-Perlen; Huguet, M.L. et al., J. Applied Polymer Science, 51:1427–1432 (1994), Huguet, M.L. et al., Process Biochemistry, 31:745–751 (1996); und Interleukin-2, enkapsuliert in Alginat-Chitosan-Mikrokügelchen; Liu, L.S. et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 22:542–543 (1995).
US-Patent 5,700,848 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln, die biologische Materialien enkapsulieren und mit polymeren Materialien beschichtet sind, einschließlich zum Beispiel polymerisierbarem Alginat oder polymerisierbaren Verbundstoffen aus Alginat und PEG.
Systeme, die Alginatgel-Perlen oder Alginat/Calciumgel-Perlen verwenden, um Proteine einzufangen, leiden an dem Fehlen irgendeines Effektes einer verzögerten Freisetzung aufgrund schneller Freisetzung des Proteins aus den Alginat-Perlen; Liu, L. et al., J. Control. Rel., 43:65–74 (1997). Um eine solche schnelle Freisetzung zu vermeiden, versuchen eine Reihe der obigen Systeme, Polykation-Polymerbeschichtungen (z.B. Polylysin, Chitosan) zu verwenden, um die Freisetzung der Protein-Alginat-Perlen zu verzögern; siehe z.B. Wheatley, M.A. et al., J. Applied Polymer Science, 43:2123–2135 (1991); Wee, S.F. et al. aaO.; Liu, L.S. et al. aaO.; Wee, S.F. et al., Controlled Release Society, 22:566–567 (1995) und Lim et al., aaO.
Polykationen, wie etwa Polylysin, sind positiv geladene Polyelektrolyte, die mit den negativ geladenen Alginat-Molekülen wechselwirken, um Polyelektrolyt-Komplexe zu bilden, die als Diffusionsbarrieren auf der Perlenoberfläche dienen. Probleme können bei der Verwendung von Polykationen insofern auftreten, als: (1) solche Formulierungen aufgrund der Polykationenzytotoxisch sein können; Huguet, M.L. et al., aaO.; Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, 13:269 (1992); Bergmann, P. et al., Clinical Science, 67:35 (1984); (2) Polykationen anfällig für Oxidation sind; (3) Perlen mit Polykationen-Beschichtungen dazu neigen, nicht erodierbar zu sein und sich im Körper aufzubauen; (4) solche Formulierungen über arbeitsaufwändige Beschichtungsverfahren hergestellt werden, die mehrfache Beschichtungen des Polykations Polylysin einschließen; Padol, et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 2:216 (1986) und (5) ionische Wechselwirkungen zwischen dem Protein und den Polykationen zum Verlust von Proteinaktivität führen oder Proteininstabilität bewirken können.
Francesco et al., U.S.-Patent Nr. 5,336,668 (und darin zitierte Entgegenhaltungen) beschreiben vollständige und teilweise Ester von Alginsäure, die mit unterschiedlichen Verfahren hergestellt sind und interessante pharmazeutische Qualitäten besitzen. Es ist beschrieben, wie die Alginester als biologisch abbaubare Kunststoffmaterialien für medizinisch/chirurgische Verwendung eingesetzt werden; als Zusatzstoffe für einen weiten Bereich von polymeren Materialien; oder bei der Herstellung verschiedener Arzneimittel verwendet werden könnten. Die potentielle Verwendung der veresterten Alginate in Formulierungen mit verzögerter Freisetzung ist nicht diskutiert, ebenso wie veresterte Alginat-Hydrogele nicht beschrieben sind.
EP-A-613693 offenbart ein wasserlösliches Wundverbandmaterial, das einen Alginatester eines mehrwertigen C₁-C₆-Alkohols, ein Feuchthaltemittel, das aus einem oder mehreren einwertigen oder mehrwertigen C₁-C₆-Alkoholen besteht, und fakultativ Wasser umfaßt.
Tateshita, Kengo et al., Biological and Pharm. Bulletin, 16 (4), Seite 420–424 (1993) diskutiert Alginatgel-Perlen, die den Calcium-Antagonisten Nifedipin enthalten und unter Verwendung der Gelierung von Alginat oder Alginat und PGA hergestellt worden sind.
Nightlinger et al., Proceed. Inter. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 22:738–739 (1995) beschreiben veresterte Hyaluronsäure(HA)-Mikrokügelchen mit der Fähigkeit gesteuerter Freisetzung. Die Literaturstelle beschäftigt sich allgemein mit den unterschiedlichen Abbauraten für deren HA-Derivate und beschreibt, wie der Ester „auseinanderbricht", um den Alkohol und HA-Einheiten freizusetzen. Es gibt keine Diskussion im Hinblick darauf, wie oder ob die HA-Hauptkette selbst sich zu Polymer-Einheiten mit niedrigerem Molekulargewicht zersetzt.
Damit ein verzögertes Abgabesystem auf Polysaccharid-Basis nützlich sein kann, muß das Polysaccharid biologisch zu ungiftigen Produkten abbaubar sein. Es ist festgestellt worden, daß bestimmte Alginatgel-Systeme, obgleich sie wirkungsvoll darin sind, verzögerte Freisetzung von Arzneistoff bereitzustellen, aufgrund der sehr langsamen Dissipation des Gels an der Injektionsstelle zu einem „Huckel" (oder Knötchen) führen. In einem therapeutischen Setting, das niedrige Dosen Arzneistoff und seltene Injektionen involviert, wäre dies kein wesentliches Problem. In einem therapeutischen Setting, das hohe Dosen Arzneistoff und häufigere Injektionen involviert, könnte diese Wirkung prohibitiv sein. Ein Mittel zur Erhöhung der Dissipationsrate des Alginatgels von der Injektionsstelle muß entwickelt werden.
Es besteht somit weiterhin ein Bedürfnis, pharmazeutische Formulierungen zu entwickeln, die ein vielseitigeres wirkungsvolleres Mittel für die verzögerte Freisetzung für klinische Anwendungen erreicht. Zahlreiche rekombinante oder natürliche Proteine könnten von konstanter Langzeitfreisetzung profitieren und dadurch wirkungsvollere klinische Ergebnisse liefern.
Die vorliegende Erfindung stellt solche Fortschritte bereit. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die biologisch abbaubaren Alginatgel-Teilchen oder Gele der vorliegenden Erfindung verwenden, können erhöhte Bioverfügbarkeit, Proteinschutz, verringerten Abbau und langsame Freisetzung mit erhöhter Proteinstabilität und Potenz bereitstellen. Auch liefern pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ein einfaches, schnelles und preiswertes Mittel für die gesteuerte Freisetzung von rekombinanten Proteinen für wirkungsvolle prophylaktische, therapeutische oder diagnostische Resultate.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung erwuchs aus Studien, die nicht-modifizierte Alginat (eine Klasse anionischer Polysaccharide)-Hydrogele für verzögerte Freisetzung von Proteinen verwendeten. Diese proteinhaltigen nicht-modifizierten Alginat-Hydrogele (siehe mitanhängige U.S.-Anmeldungen 08/857,913 und 08/912,902) werden in einer zeitverzögerten Art und Weise gebildet, wodurch die Materialien in eine Spritze gefüllt und belassen werden können, um später in derselben Spritze zu gelieren; diese Gele erweisen sich als injizierbar. Nach einer einzigen subkutanen Injektion in Nagetiermodellen wird das Auftreten von vielen Tagen mit verzögertem Protein beobachtet; es verbleibt jedoch ein merkbarer Huckel oder ein merkbares Knötchen an der Injektionsstelle für lange Zeiträume mit wenig Veränderung in seiner Größe. Dieser Huckel besteht aus dem wassergefüllten Alginat-Hydrogel und die Größe des Huckels ist eine Funktion des Gelvolumens, das injiziert wird. Gel-Perlen verbleiben ebenfalls an der Injektionsstelle.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine neuartige Klasse von biologisch abbaubaren, biologisch kompatiblen Polysaccharid-Hydrogelen, Alginatester-Hydrogelen, für die verzögerte Freisetzung therapeutischer Proteine. Unerwarteterweise ließen die Alginatester-Hydrogele, zusätzlich dazu, daß sie die Gelierungs-, Injizierbarkeits- und verzögerten Freisetzungseigenschaften der nicht-modifizierten Alginate aufwiesen, an der Injektionsstelle keinen Huckel zurück – das heißt, die Alginatester-Hydrogele sind biologisch abbaubar oder erodierbar und werden allmählich in die umgebenden Gewebe resorbiert, mit wenig Injektionsstellenreaktion.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen Alginatester oder deren Derivate, ionisch vernetzt in einer (wasserhaltigen) Hydrogel-Matrix, die ein Protein enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung biologisch abbaubarer Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Verwendung der Esteralginat-Materialien in flüssigen Mischungen für Zeitverzögerungsgelierung im Körper.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Zusammensetzungen, in denen die Alginatester-Hydrogele in Form von Perlen oder Mikrokügelchen vorliegen, für die verzögerte Freisetzung von Wirkstoffen, vorzugsweise therapeutischen Proteinen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen die Alginatester-Hydrogele Zusammensetzungen zur Anwendung an Zielstellen im Körper eines Patienten bereit. Diese Zusammensetzungen sind nützlich: zur Verhinderung oder Hemmung der Bildung von Gewebeadhäsionen im Anschluß an chirurgischen Eingriff und traumatische Verletzung; zur Supplementierung von Geweben, insbesondere zum Auffüllen weicher und harter Gewebe; um einen begrenzten Raum mit einem resorbierbaren Material zu füllen; als ein Gerüst für Gewebewachstum; und als ein Wundverband.
In einer weiteren Ausführungsform stellen die Alginatester-Hydrogele wirkstoffhaltige Vorrichtungen zur Implantierung im Körper bereit, wobei der Wirkstoff entweder gebunden oder nicht-gebunden an das Alginat-Polymer sein kann.
In einer weiteren Ausführungsform stellen die Alginatester-Hydrogelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der biologischen Verfügbarkeit des Wirkstoffes in der Zusammensetzung bereit.
Schließlich stellen die Alginatester-Hydrogelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung weiter ein Verfahren bereit, um über die Zeit im Patienten einen im wesentlichen konstanten Blutspiegel zu erhalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine verzögerte Gelzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung bereitgestellt, welche umfaßt: a) ein biologisch abbaubares anionisches Polysaccharid; b) ein biologisch wirksames Mittel; und c) wenigstens ein gebundenes mehrwertiges Metall-Ion, wobei das biologisch wirksame Mittel ein Protein umfaßt und wobei besagtes biologisch abbaubares anionisches Polysaccharid ein Alginatester ist, der ionisch vernetzt ist, um ein biologisch abbaubares, biologisch kompatibles Alginatester-Hydrogel bereitzustellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch eine vorgefüllte Spritze bereitgestellt, die eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, eine pharmazeutische Formulierung, die die verzögerte Gelzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Adjuvans umfaßt, und eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer verzögerten Gelzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung bereitgestellt, das die Schritte umfaßt: a) Mischen eines biologisch wirksamen Mittels und eines biologisch abbaubaren anionischen Polysaccharids, um eine erste Mischung zu bilden; b) Zumischen wenigstens eines gebundenen mehrwertigen Metall-Anions zu besagter ersten Mischung, um eine zweite Mischung zu bilden, wobei das biologisch wirksame Mittel ein Protein umfaßt und wobei besagtes biologisch abbaubares anionisches Polysaccharid ein Alginatester ist, der ionisch vernetzt ist, um ein biologisch abbaubares, biologisch kompatibles Alginatester-Hydrogel bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung einer Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung bereit, wobei das biologisch wirksame Mittel Leptin, ein Analog oder Derivat desselben ist, bei der Herstellung des Arzneimittels zur Behandlung einer Störung, die ausgewählt ist aus übermäßigem Gewicht, Diabetes, hohem Blutlipidspiegel, arterieller Sklerose, arterieller Plaque, der Verringerung oder Prävention der Gallensteinbildung, unzureichender Masse an magerem Gewebe, unzureichender Empfindlichkeit auf Insulin und Schlaganfall.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Zusammensetzungen
Hydrophile Polymere, die Alginate und Derivate derselben einschließen, können aus verschiedenen kommerziellen, natürlichen oder synthetischen Quellen erhalten werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff hydrophiles Polymer auf wasserlösliche Polymere oder Polymere mit Affinität, Wasser zu absorbieren. Hydrophile Polymere sind dem Fachmann gut bekannt. Diese schließen Polyanionen, einschließlich anionischer Polysaccharide, wie etwa Alginat, Carboxymethylamylose, Polyacrylsäuresalze, Polymethacrylsäuresalze, Ethylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymer (Halbester), Carboxymethylcellulose, Dextransulfat, Heparin, Carboxymethyldextran, Carboxycellulose, 2,3-Dicarboxycellulose, Tricarboxycellulose, Carboxy-Gummi-arabicum, Carboxy-Carrageenan, Pektin, Carboxy-Pektin, Carboxy-Tragacanthgummi, Carboxy-Xanthangummi, Pentosanpolysulfat, Carboxy-Stärke, Carboxymethyl-Chitin/Chitosan, Curdlan, Inositol-Hexasulfat, β-Cyclodextrinsulfat, Hyaluronsäure, Chondroitin-6-Sulfat, Dermatan-Sulfat, Heparin-Sulfat, Carboxymethylstärke, Carrageenan, Polygalacturonat, Carboxy-Guargummi, Polyphosphat, Polyaldehydrokohlensäure, Poly-1-hydroxy-1-sulfonat-propen-2, Co-Polystyrol-Maleinsäure, Agarose, Mesoglycan, sulfopropylierte Polyvinylalkohole, Cellulosesulfat, Protaminsulfat, Phospho-Guargummi, Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Polyaminosäuren, Derivate oder Kombinationen davon ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Ein Fachmann wird andere unterschiedliche hydrophile Polymere kennen, die innerhalb des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung liegen.
In ähnlicher Weise können gebundene mehrwertige Metall-Ionen aus verschiedenen kommerziellen, natürlichen oder synthetischen Quellen erhalten werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Insbesondere können die Metall-Ionen Aluminium, Barium, Calcium, Eisen, Mangan, Magnesium, Strontium und Zink einschließen, sind aber nicht hierauf beschränkt. Vorzugsweise sind die Metall-Ionen Calcium und Zink oder die Salze davon, wie Zinkacetat, Calciumacetat oder Chloridsalze. Wasserlösliche kleine Moleküle und Salze können ebenfalls verwendet werden, wie etwa Ammoniumsulfat, Aceton, Ethanol und Glycerol.
Alkohole der aliphatischen Reihe zur Verwendung als Veresterungskomponenten der Carboxygruppen von Alginsäure gemäß der vorliegenden Erfindung sind zum Beispiel diejenigen mit maximal 34 Kohlenstoffatomen, die gesättigt oder ungesättigt sein können und die möglicherweise auch mit anderen freien oder funktionell modifizierten Gruppen substituiert sein können, wie etwa Amino-, Hydroxy-, Aldehydo-, Keto-, Mercapto-, Carboxygruppen, oder mit Gruppen, die sich von diesen ableiten, wie etwa Hydrocarbyl oder Dihydrocarbylamino (im weiteren soll der Begriff „Hydrocarbyl" so verstanden werden, daß er nicht nur einwertige Reste von Kohlenwasserstoffen bedeutet, wie etwa den C_nH_2n+1-TyP, sondern auch zweiwertige oder dreiwertige Reste, wie etwa „Alkylene" -C_nH_2n oder „Alkylidene" (= C_nH_2n), Ether- oder Estergruppen, Acetal- oder Ketalgruppen, Thioether- oder Thioestergruppen und veresterte Carboxygruppen oder Carbamidsäuregruppen oder Carbamidsäuregruppen, die mit einer oder zwei Hydroxygruppen, mit Nitrilgruppen oder mit Halogenen substituiert sind.
In den obigen Gruppen, die Kohlenwasserstoffreste enthalten, sind diese vorzugsweise niederaliphatische Reste, wie etwa Heteroatome, wie etwa Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel. Es wird Alkoholen der Vorzug gegeben, die mit einer oder zwei der vorgenannten funktionellen Gruppen substituiert sind.
Alkohole der obigen Gruppe, die bevorzugt innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, sind diejenigen mit maximal 12 und insbesondere mit maximal 6 Kohlenstoffatomen und in denen die Hydrocarbylreste in den obengenannten Amino-, Ether-, Ester-, Thioether-, Thioester-, Acetal-, Ketalgruppen Alkylgruppen mit maximal 4 Kohlenstoffatomen darstellen und auch in den veresterten Carboxy- oder substituierten Carbamidsäuregruppen die Hydrocarbylgruppen Alkyle mit derselben Anzahl von Kohlenstoffatomen sind und in denen die Amino- oder Carbamidsäuregruppen Alkylenamino- oder Alkylencarbamidsäuregruppen mit maximal 8 Kohlenstoffatomen sein können. Von diesen Alkoholen sind die zuerst und am wichtigsten zu nennenden die gesättigten und unsubstituierten, wie etwa Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropylalkohole, n-Butylalkohol, Isobutyl-, tert.-Butylalkohole, Amyl-, Pentyl-, Hexyl-, Octyl-, Nonyl- und Dodecylalkohole und vor allem diejenigen mit einer linearen Kette, wie etwa n-Octyl- oder n-Dodecylalkohole. Von den substituierten Alkoholen dieser Gruppe sollten die zweiwertigen Alkohole aufgelistet werden, wie etwa Ethylenglykol, Propylenglykol oder Butylenglykol, die dreiwertigen Alkohole, wie etwa Glycerin, Aldehydoalkohole, wie etwa Tartronalkohol, Carboxyalkohole, wie etwa Milchsäuren, zum Beispiel alpha-Oxypropionsäure, Glykolsäure, Äpfelsäure, Weinsäuren, Zitronensäure, Aminoalkohole, wie etwa Aminoethanol, Aminopropanol, n-Aminobutanol und deren Dimethyl- und Diethyl-Derivate in der Amin-Funktion, Cholin, Pyrrolidinylethanol, Piperidinylethanol, Piperazinylethanol und die entsprechenden Derivate von n-Propyl- oder n-Butylalkoholen, Monothioethylenglykol oder dessen Alkyl-Derivate, zum Beispiel das Ethyl-Derivat in der Mercaptofunktion.
Von den höheren gesättigten aliphatischen Alkoholen verdienen zum Beispiel Cetylalkohol und Myristylalkohol besondere Erwähnung, aber besonders wichtig für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die höheren ungesättigten Alkohole mit einer oder zwei Doppelbindungen, wie etwa insbesondere diejenigen, die in vielen essentiellen Ölen enthalten sind und eine Affinität mit Terpenen besitzen, wie etwa Citronellol, Geraniol, Nerol, Nerolidol, Linalool, Farnesol, Phytol.
Von den niederen ungesättigten Alkoholen sollte Propargylalkohol in Betracht gezogen werden.
Von den aliphatischen Alkoholen sind die vor allem zu erwähnenden diejenigen mit nur einem Benzolrest und in denen die aliphatische Kette maximal 4 Kohlenstoffatome aufweist, bei denen auch der Benzolrest mit zwischen 1 und 3 Methyl- oder Hydroxygruppen oder mit Halogenatomen, insbesondere Chlor, Brom oder Iod, substituiert sein kann und bei denen die aliphatische Kette mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sein kann, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus freien Aminogruppen oder Mono- oder Dimethylgruppen, oder mit Pyrrolidin- oder Piperidingruppen. Von diesen Alkoholen sind Benzylalkohol und Phenethylalkohol besonders bevorzugt. Die Alkohole der cycloaliphatischen oder aliphatisch-cycloaliphatischen Reihe können von mono- oder polycyclischen Kohlenwasserstoffen abgeleitet werden und können maximal 34 Kohlenstoffatome aufweisen. Von den von cyclischen einringigen Kohlenwasserstoffen abgeleiteten Alkoholen sollten besonders diejenigen mit maximal 12 Kohlenstoffatomen erwähnt werden, mit Ringen, die vorzugsweise zwischen 5 und 7 Kohlenstoffatome enthalten, möglicherweise substituiert mit zum Beispiel zwischen einer und drei Niederalkylgruppen, wie etwa Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Isopropylgruppen. Spezifische Alkohole dieser Gruppen sind Cyclohexanol, Cyclohexandiol, 1,2,3-Cyclohexantriol und 1,3,5-Cyclohexantriol (Phloroglucitol), Inositol, die von p-Menthan abgeleiteten Alkohole, wie etwa Carvomenthol, Menthol, alpha- und gamma-Terpineol, 1-Terpineolalkohole, bekannt als „Terpineol", 1,4- und 1,8-Terpin. Alkohole, die von Kohlenwasserstoffen mit kondensierten Ringen abgeleitet sind, sind zum Beispiel diejenigen der Thujan-, Pinan-, Campban-Gruppen, insbesondere Thujanol, Sabinolpinol-Hydrat, D- und L-Borneol und D- und L-Isoborneol.
Ebenfalls einbezogen sind Alkohole, die aus der Veresterungsreaktion von expoxyhaltigen Verbindungen mit Alginaten abgeleitet sind (siehe z.B. U.S.-Patent 2,463,824 und U.S.-Patent 2,426,125).
Die vollständige und teilweise Estergruppen enthaltenden Polyanionen der vorliegenden Erfindung sind im allgemeinen saure Polysaccharide, bei denen der glykosidische Sauerstoff beta zum Carbonyl-Kohlenstoff des Esters gebunden ist. Obgleich wir nicht durch einen spezifischen Mechanismus gebunden sein wollen, erlaubt diese Anordnung der Einheiten den Abbau der Polymerkette durch einen beta-Eliminierungsmechanismus, der unter physiologischen Bedingungen auftreten kann.
Alginsäureester der vorliegenden Erfindung bestehen aus Mannuronsäure-Resten (m-COOH oder m-COO-Anion) und Guluronsäure-Resten (g-COOH oder g-COO-Anion), miteinander verbunden durch glykosidische Ether-Sauerstoffbindungen, mit der folgenden allgemeinen Formel I: -(M)n1-(M')n2-(G)n3-(G')n4-(A)n5- Iworin:
M ein Mannuronsäure-Rest, m-COOH oder m-COO-Anion, ist;
M' ein Mannuronsäureester-Rest, m-COOR1, ist;
G ein Guluronsäure-Rest, g-COOH oder g-COO-Anion, ist;
G' ein Guluronsäureester-Rest, g-COOR2, ist;
A Nicht-g- oder Nicht-m-Ketteneinheiten darstellt, wie etwa Zucker, Zuckeroxidationsprodukte oder aliphatische, aromatische, araliphatische, alaromatische, cycloaliphatische Reste, die durch Heteroatome substituiert oder von diesen unterbrochen sein können, verknüpft innerhalb der Ketten oder an den Kettenenden;
n1, n2, n3, n4 und n5 ganze Zahlen sind, die die durchschnittliche relative Anzahl von eingebauten Einheiten darstellen;
R1 und R2 unabhängig aliphatische, aromatische, araliphatische, alaromatische, cycloaliphatische Reste sind, die durch Heteroatome substituiert oder von diesen unterbrochen sein können;
und Derivate (z.B. wo die Hydroxygruppen acetyliert sind und mit Isocyanaten umgesetzt sind) und pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
In den Estern der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, daß R1 = R2 = aliphatische oder alaromatisch und weiter, daß 100(n2 + n4)/(n1 + n2 + n3 + n4) von 1–99 Mol-% (vorzugsweise 5–50 Mol-%, bevorzugter 6–30 Mol-%, noch bevorzugter 6–15 Mol-% und am bevorzugtesten 7–12 Mol-% ist und 100 n5/(n1 + n2 + n3 + n4 + n5) vorzugsweise weniger als 10 Mol-% ist.
In den teilweisen Estern der Erfindung können die nicht-veresterten Carboxygruppen freigehalten werden oder können versalzt werden. Die Basen zur Bildung dieser Salze werden entsprechend der letztlichen Endverwendungsprodukte ausgewählt. Anorganische Salze können aus Alkalimetallen, wie etwa Kalium und insbesondere Natrium, und Ammonium gebildet werden oder sich von Erdalkalimetallen ableiten, wie etwa Calcium oder Magnesium, oder Aluminiumsalze sein
Von besonderem Interesse sind die Salze mit organischen Basen, insbesondere azetierten Basen und daher aliphatischen, araliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Aminen. Diese Ammoniumsalze können sich von therapeutisch annehmbaren Aminen oder ungiftigen, aber therapeutisch unwirksamen Aminen oder von Aminen mit einer therapeutischen Wirkung ableiten. Vom ersten Typ sind bevorzugt aliphatische Amine, zum Beispiel Mono-, Di- und Trialkylamine, mit Alkylgruppen mit maximal 8 Kohlenstoffatomen, oder Arylalkylamine mit derselben Anzahl von Kohlenstoffatomen im aliphatischen Teil, und wobei Aryl eine Benzolgruppe bedeutet, die möglicherweise mit zwischen 1 und 3 Methylgruppen oder Halogenatomen oder Hydroxygruppen substituiert ist. Die biologisch unwirksamen Basen zur Bildung der Salze können auch cyclisch sein, wie etwa monocyclische Alkylenamine, mit Zyklen von zwischen 4 und 6 Kohlenstoffatomen, möglicherweise in ihrem Zyklus unterbrochen durch Heteroatome, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, wie etwa Piperazin oder Morpholin, oder können substituiert sein, zum Beispiel durch Amino- oder Hydroxyfunktionen, wie etwa Aminoethanol, Ethylendiamol, Ethylendiamin, Ephedrin oder Cholin.
Der Grad und die Art der Veresterung können durch Syntheseverfahren gesteuert werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Vorzugsweise werden die Alginatester durch Behandlung der quartären Ammoniumsalze von Alginsäure mit herkömmlichen Alkylierungsmitteln in einem aprotischen organischen Lösemittel, wie etwa Dimethylsulfoxid, hergestellt. Die resultierenden Ester sind vorzugsweise die Ester einwertiger Alkohole, wie etwa Niederalkyl, wie etwa Ethyl, oder Aralkyl, wie etwa Benzyl, oder deren Mischungen. Man kann auch mit der Reaktion von Alginsäure mit Oxiran- und Epoxy-haltigen Verbindungen, wie etwa Ethylen- oder Propylenoxid, Ester bilden.
Es ist auch möglich, quartäre Ammoniumsalze von teilweisen Estern zu bilden, zum Beispiel die Salze von Tetraalkylammonium, mit der obengenannten Anzahl von Kohlenstoffatomen, und vorzugsweise Salze dieses Typs, bei denen die vierte Alkylgruppe zwischen 1 und 4 Kohlenstoffatome aufweist, zum Beispiel eine Methylgruppe.
Der Grad der Veresterung (ausgedrückt in Mol-%) des Alginat hängt zusammen mit der gewünschten Geschwindigkeit des Verschwindens des Gels im Patientengewebe. Diese Geschwindigkeit des Verschwindens des Gels hängt im allgemeinen zusammen mit der gewünschten Freisetzungsrate des Wirkstoffes aus dem Gel, die über einen Zeitraum von 5 Jahren oder weniger, üblicherweise 2 Tage bis 270 Tage, üblicher 2 Tage bis 180 Tage, üblicher 2 Tage bis 90 Tage beträgt. Der Veresterungsgrad (DE) liegt von 1 Mol-% bis 90 Mol-%, vorzugsweise von 5 Mol-% bis 50 Mol-%, bevorzugter von 6 Mol-% bis 30 Mol-5, bevorzugter von 6 Mol-% bis 15 Mol-%, bevorzugter von 7 Mol-% bis 12 Mol-%.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff Puffer oder Pufferlösung auf die Verwendung anorganischer oder organischer Säuren oder einer Kombination derselben, um eine Pufferlösung herzustellen, wie im Stand der Technik bekannt. Anorganische Säuren innerhalb des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung schließen Wasserstoffhalogensäuren (z.B. Salzsäure), Phosphorsäure, Salpetersäure und Schwefelsäure ein. Weitere anorganische Säuren wären dem Fachmann gut bekannt und werden hierin in Betracht gezogen. Organische Säuren innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung schließen aliphatische Carbonsäuren und aromatische Säuren ein, wie etwa Ameisensäure, Kohlensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Capronsäure, Acrylsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Glycin oder Phenolsulfonsäure. Weitere organische Säuren wären einem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich biologisch wirksame Mittel auf rekombinante oder natürlich vorkommende Proteine, ob menschlich oder tierisch, die nützlich sind für prophylaktische, therapeutische oder diagnostische Anwendung, sowie nicht-proteinbasierte Mittel, wie etwa kleine Moleküle. Das biologisch wirksame Mittel kann natürlich, synthetisch, halbsynthetisch oder Derivate davon sein. Die biologisch aktiven Mittel der vorliegenden Erfindung müssen ausfällbar sein. Ein breiter Bereich von biologisch aktiven Mitteln werden in Betracht gezogen. Diese schließen Hormone, Cytokine, hämatopoietische Faktoren, Wachstumsfaktoren, Antifettleibigkeitsfaktoren, trophische Faktoren, entzündungshemmende Faktoren und Enzyme ein, sind aber nicht hierauf beschränkt (siehe auch U.S.-Patent Nr. 4,695,463 für zusätzliche Beispiele nützlicher biologisch wirksamer Mittel). Ein Fachmann wird ohne weiteres in der Lage sein, ein gewünschtes biologisch wirksames Mittel an die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung anzupassen.
Solche Proteine würden Interferone (siehe U.S.-Patent Nrn. 5,372,808, 5,541,293, 4,897,471 und 4,695,623), Interleukine (siehe U.S.-Patent Nr. 5,075,222), Erythropoietine (siehe U.S.-Patent Nrn. 4,703,008, 5,441,868, 5,618,698, 5,547,933 und 5,621,080), Granulocytenkolonie-stimulierende Faktoren (siehe U.S.-Patent Nrn. 4,810,643, 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823 und PCT-Veröffentlichung Nr. 94/17185), Stammzellenfaktor (PCT-Veröffentlichung Nrn. 91/05795, 92/17595 und 95/17206) und das OB-Protein (siehe PCT-Veröffentlichung Nrn. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 und 97/06816) einschließen, sind aber nicht hierauf beschränkt. Zusätzlich können biologisch wirksame Mittel auch mit Antifettleibigkeit zusammenhängende Produkte, Insulin, Gastrin, Prolactin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), Luteinisierungshormon (LH), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Human-Choriongonadotropin (HCG), Motilin, Interferone (alpha, beta, gamma), Interleukine (IL-1 bis IL-12), Tumornekrosefaktor (TNF), Tumornekrosefaktor-bindendes Protein (TNF-bp), aus Hirn gewonnenen neurotrophen Faktor (BDNF), aus Glia gewonnenen neurotrophen Faktor (GDNF), neurotrophen Faktor 3 (NT3), Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF), neurotrophen Wachstumsfaktor (NGF), Knochenwachstumsfaktoren, wie etwa Osteoprotegerin (OPG), Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs), Makrophagenkoloniestimulierenden Faktor (M-CSF), Granulocyten-Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), aus Megakeratinocyten gewonnenen Wachstumsfaktor (MGDF), Thrombopoietin, aus Thrombozyten gewonnenen Wachstumsfaktor (PGDF), Koloniestimulierende Wachstumsfaktoren (CSFs), Knochenmorphogeneseprotein (BMP), Superoxid-Dismutase (SOD), Gewebeplasminogenaktivator (TPA), Urokinase, Streptokinase und Kallikrein einschließen, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff Proteine, wie hierin verwendet, schließt Peptide, Polypeptide, Consensus-Moleküle, Analoga, Derivate und Kombinationen davon ein.
Derivate von biologisch wirksamen Mitteln können die Bindung einer oder mehrerer chemischer Einheiten an die Protein-Einheit einschließen. Es ist festgestellt worden, daß die chemische Modifikation biologisch wirksamer Mittel unter bestimmten Umständen zusätzliche Vorteile bereitstellen kann, wie etwa die Erhöhung der Stabilität und Zirkulationszeit des therapeutischen Proteins und die Verringerung der Immunogenität. Ein Fachmann wird in der Lage sein, die gewünschte chemische Modifikation auszuwählen, auf der Grundlage der gewünschten Dosierung, Zirkulationszeit, Beständigkeit gegen Proteolyse, therapeutischen Verwendungen und anderer Erwägungen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich biologische Abaubarkeit auf den Abbau des Molekulargewichtes eines bestimmten Polymers zu einer kleineren Anzahl von Einheiten in der Kette, d.h. Abbau zu Einheiten mit niedrigerem Molekulargewicht. Biologisch abbaubares Gel bezieht sich auf die Dissipation des Gels in der Verwendungsumgebung, wobei die Dissipation bedingt wird durch den Abbau des Molekulargewichts der konstituierenden Polymere, der zu weniger Einheiten in der Polymerkette führt.
Komplexe
Die Proteine, Analoga oder Derivate können komplexiert an eine bindende Zusammensetzung verabreicht werden. Solch eine bindende Zusammensetzung kann die Wirkung der Verlängerung der Zirkulationszeit des Proteins, Analogs oder Derivats oder der Erhöhung der Aktivität des biologisch wirksamen Mittels haben. Solch eine Zusammensetzung kann eine) Protein (oder synonym Peptid), Derivat, Analog oder Kombination sein. Ein Bindungsprotein für das OB-Protein ist zum Beispiel OB-Proteinrezeptor oder ein Teil davon, wie etwa ein löslicher Teil davon. Weitere Bindungsproteine können bestimmt werden, indem man OB-Protein, oder das Protein der Wahl, in Serum untersucht oder empirisch auf das Vorliegen von Bindung gescreent wird. Solche Bindung wird typischerweise nicht mit der Fähigkeit von OB-Protein oder Analog oder Derivat interferieren, sich an endogenen OB-Proteinrezeptor zu binden und/oder Signaltransduktion zu bewirken. Zusätzlich zum OB-Protein werden bindende Komplexe ebenfalls auch auf andere therapeutische Proteine der vorliegenden Erfindung anwendbar sein. Die Fachleute werden in der Lage sein, geeignete Bindungsproteine zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung zu bestimmen.
In ähnlicher Weise können Ausfällungsmittel, die verwendet werden, um das biologisch wirksame Mittel auszufällen, aus verschiedenen kommerziellen, natürlichen oder synthetischen Quellen erhalten werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Ausfällungsmittel schließen mehrwertige Metall-Ionen oder deren Salze, wie etwa Acetate, Citrate, Chloride, Carbonate, Hydroxide, Oxalate, Tartrate oder Hydroxide davon, Säuren oder wasserlösliche Polymere ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Insbesondere können die Metall-Ionen Aluminium, Barium, Calcium, Eisen, Mangan, Magnesium, Strontium und Zink einschließen, sind aber nicht hierauf beschränkt. Vorzugsweise ist das Metall-Ion Zink oder die Salze davon, wie Acetat-, Chloridsalze. Wasserlösliche kleine Moleküle und Salze können ebenfalls verwendet werden, wie etwa Ammoniumsulfat, Aceton, Ethanol und Glycerol.
Wie für wasserlösliche Polymere schließen diese Polyethylenglykol, Ethylenglykol/Propylenglykol-Copolymere, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymere, Polyaminosäuren, Dextran, Poly(n-vinylpyrrolidon), Polyethylenglykol, Polypropylenglykol-Homopolymere, Polypropylenoxid/ethylenoxid-Copolymere, polyoxyethylierte Polyole, Polyvinylalkoholsuccinat, Glycerin, Ethylenoxide, Propylenoxide, Poloxamere, alkoxylierte Copolymere, wasserlösliche Polyanionen, Derivate oder Kombinationen davon ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Das wasserlösliche Polymer kann jedes Molekulargewicht aufweisen und kann verzweigt oder unverzweigt sein. Das bevorzugte Molekulargewicht von Polyethylenglykol liegt zum Beispiel zwischen etwa 700 Da und etwa 100 kDa für einfache Handhabung und Wirksamkeit der Ausfällung.
Andere Größen und Arten von Ausfällungsmitteln können verwendet werden, in Abhängigkeit vom gewünschten therapeutischen Profil (z.B. der Dauer der gewünschten verzögerten Freisetzung, den Wirkungen, wenn überhaupt, auf die biologische Aktivität, der Einfachheit der Handhabung, dem Grad oder Mangel an Antigenität und anderen bekannten Wirkungen eines gewünschten Ausfällungsmittels auf ein therapeutisches Protein oder Analog). Ein Fachmann wird weitere Ausfällungsmittel erkennen, die im Schutzumfang der Erfindung liegen.
Zusätzlich können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Extrahilfsstoffe einschließen, die notwendig sind, um das biologisch wirksame Mittel und/oder das hydrophile Polymer zu stabilisieren. Diese können im Puffer enthalten sein und können Konservierungsstoffe einschließen, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung können durch orale (z.B. Kapseln, wie etwa harte Kapseln und weiche Kapseln, Feststoffzubereitungen, wie etwa Granülen, Tabletten, Pillen, Trochiska oder Pastillen, Cachets, Pellets, Pulver und lyophilisierte Formen, flüssige Zubereitungen, wie etwa Suspensionen) und nicht-orale Zubereitungen (z.B. intramuskuläre, subkutane, transdermale, viszerale, IV (intravenöse), IP (intraperitoneale), intraarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, injizierbare, pulmonale, nasale, rektale und Uterus-transmukosale Zubereitungen) verabreicht werden.
Im allgemeinen sind von der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung umfasst, die wirksame Mengen Protein, oder derivative Produkte, umfassen, wobei die Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln, Konservierungsstoffen, Löslichmachern, Emulgatoren, Adjuvantien und/oder Trägerstoffen vorliegen, die für die Verabreichung benötigt werden. Siehe PCT 97/01331. Die optimale pharmazeutische Formulierung für ein gewünschtes biologisch wirksames Mittel wird von einem Fachmann in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg und von der gewünschten Dosierung bestimmt werden. Beispielhafte pharmazeutische Zusammensetzungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., 18. Ausg., Easton, PA, S. 1435–1712 (1990)) offenbart.
Aufgrund der thixotropen Natur der verzögerten Gelformulierung können Spritzen verwendet werden, um subkutan zu verabreichen. Die Zusammensetzung kann in einer Spritze für spätere Injektion geliert werden. Diese Gelierung kann in einer zeitverzögerten Weise durchgeführt werden. Das Timing wird durch die wohl überlegte Einstellung der Menge des Gelierungsmittels und des Protonendonors in der Mischung, falls erforderlich, gesteuert. Solch eine Zubereitung würde für spätere Wiedergelierung im Körper nach Injektion verwendet werden. Der Begriff thixotrop, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Viskosität der Gelmischung, die unter Druck, z.B. Spritzenkolben, abnimmt, wobei an diesem Punkt die Mischung z.B. durch die Spritzennadel fließen und dann an der Injektionsstelle erneut ein Gel bilden kann.
Das Konzept verzögerter Gelierung kann auch auf das Füllen einer Spritze angewendet werden, wo eine Gelzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung in eine Spritze gefüllt ist und an einem vorbestimmten Zeitpunkt in der Spritze geliert, z.B. von ein paar Minuten bis zu vielen Stunden nach der Befüllung. Dies vermeidet das Problem der Befüllung einer Spritze mit Material, das bereits geliert hat. Diese vorbefüllten Spritzen können für spätere Injektion in Patienten hinein gelagert werden.
Komponenten, die für die Verabreichung erforderlich sein könnten, schließen Verdünnungsmittel mit verschiedenem Puffergehalt (z.B. Tris-HCL, Acetat), pH und Ionenstärke; Zusatzstoffe, wie etwa Tenside und Löslichmachungsmittel (z.B. Tween 80, HCO-60, Polysorbat 80), Antioxidationsmittel (z.B. Ascorbinsäure, Glutathion, Natriummetabisulfit), zusätzliche Polysaccharide (z.B. Carboxymethylcellulose, Natriumalginat, Natriumhyaluronat, Protamin-Sulfat, Polyethylenglykol), Konservierungsstoffe (z.B. Thimersol, Benzylalkohol, Methylparaben, Propylparaben) und Aufbausubstanzen (z.B. Lactose, Mannitol); Einarbeitung des Materials in teilchenförmige Zubereitungen aus polymeren Verbindungen, wie etwa Polymilch-/Polyglykolsäure-Polymere oder -Copolymere, etc. oder kombiniert mit Liposomen ein. Hyaluronsäure kann ebenfalls als eine Verabreichungskomponente verwendet werden, und dies kann die Wirkung einer sogar noch weiteren Förderung der Verzögerungsdauer im Kreislauf haben. Zusätzlich können Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung auch mit Ölen (z.B. Sesamöl, Maisöl, Pflanzenöl) oder einer Mischung davon mit einem Phospholipid (z.B. Lecithin) oder mittelkettigen Fettsäuretriglyceriden (z.B. Miglyol 812) dispergiert werden, um eine ölige Suspension bereitzustellen. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch mit Dispergiermitteln dispergiert werden, wie etwa wasserlöslichen Polysacchariden (z.B. Mannitol, Lactose, Glucose, Stärken), Hyaluronsäure, Glycin, Fibrin, Collagen und anorganischen Salzen (z.B. Natriumchlorid).
Zusätzlich werden für die Verwendung bei der Verabreichung der Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung auch mechanische Vorrichtungen in Betracht gezogen, die für pulmonalen Abgabe von therapeutischen Produkten konstruiert sind, einschließlich Vernebelungsgeräten, Dosisinhalationsgeräten und Pulverinhalationsgeräten, aber nicht hierauf beschränkt, die alle den Fachleute geläufig sind.
Die Verabreichungskomponenten können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der in-vivo-Freisetzung und die Geschwindigkeit der in-vivo-Clearance der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen. Ein Fachmann wird die geeigneten Verabreichungskomponenten und/oder die geeigneten mechanischen Vorrichtungen für die Verwendung in Abhängigkeit von der therapeutischen Verwendung, dem Verabreichungsweg, der gewünschten Dosierung, der Zirkulationszeit, der Beständigkeit gegen Proteolyse, der Proteinstabilität und anderen Erwägungen erkennen.
Verwendungsmethoden
Therapeutisch.
Therapeutische Verwendungen hängen von dem verwendeten biologisch wirksamen Mittel ab. Ein Fachmann wird ohne weiteres in der Lage sein, ein gewünschtes biologisch wirksames Mittel für seine beabsichtigten therapeutischen Verwendungen an die vorliegende Erfindung anzupassen. Therapeutische Verwendungen für solche Mittel sind in größerem Detail in den folgenden Veröffentlichungen angegeben, die hierin durch Bezugnahme miteinbezogen werden, einschließlich Zeichnungen. Therapeutische Verwendungen schließen Verwendungen für Proteine wie Interferone (siehe U.S.-Patent Nrn. 5,372,808, 5,541,293, 4,897,471 und 4,695,623), Interleukine (siehe U.S.-Patent Nr. 5,075,222), Erythropoietine (siehe U.S.-Patent Nrn. 4,703,008, 5,441,868, 5,618,698, 5,547,933 und 5,621,080), Granulozyten-Koloniestimulationsfaktoren (siehe U.S.-Patent Nrn. 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823, 4,810,643 und PCT-Veröffentlichungs Nr. 94/17185), Stammzellenfaktor (PCT-Veröffentlichung Nrn. 91/05795, 92/17505 und 95/17206) und das OB-Protein (siehe PCT-Veröffentlichungs Nrn. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 und 97/06816) ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Zusätzlich schließen therapeutische Verwendungen der vorliegenden Erfindung Verwendungen von biologisch wirksamen Mitteln ein, die mit Antifettleibigkeit zusammenhängende Produkte, Insulin, Gastrin, Prolactin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), Luteinisierungshormon (LH), Follikelstimulierendes Hormon (FSH), Human-Choriongonadotropin (HCG), Motilin, Interferone (alpha, beta, gamma), Interleukine (IL-1 bis IL-12), Tumornekrosefaktor (TNF), Tumornekrosefaktor-bindendes Protein (TNF-bp), aus Hirn gewonnenen neurotrophen Faktor (BDNF), aus Glia gewonnenen neurotrophen Faktor (GDNF), neurotrophen Faktor 3 (NT3), Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF), neurotrophen Wachstumsfaktor (NGF), Knochenwachstumsfaktoren, wie etwa Osteoprotegerin (OPG), Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs), Makrophagen-Koloniestimulationsfaktor (M-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulationsfaktor (GM-CSF), aus Megakeratinozyten gewonnenen Wachstumsfaktor (MGDF), Thrombopoietin, aus Thrombozyten gewonnenen Wachstumsfaktor (PGDF), Koloniestimulierende Wachstumsfaktoren (CSFs), Knochenmorphogeneseprotein (BMP), Superoxid-Dismutase (SOD), Gewebeplasminogenaktivator (TPA), Urokinase, Streptokinase und Kallikrein einschließen, aber nicht hierauf beschränkt sind. Der Begriff Proteine, wie hierin verwendet, schließt Peptide, Polypeptide, Consensus-Moleküle, Analoga, Derivate und Kombinationen davon ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Zusätzlich können die vorliegenden Zusammensetzungen auch zur Herstellung eines oder mehrerer Arzneimittel zur Behandlung oder Linderung der Zustände, für deren Behandlung das biologisch wirksame Mittel gedacht ist, verwendet werden.
Beispielhaft für therapeutische Verwendungen können Sauerstoffanreicherung im Blut und eine Abnahme der Knochenresorption oder Osteoporose ohne Gewichtsverlust erreicht werden.
Kombinationstherapien.
Die vorliegenden Zusammensetzungen und Methoden können zusammen mit anderen Therapien verwendet werden, wie etwa veränderte Ernährung und körperliche Betätigung. Weitere Arzneimittel, wie etwa diejenigen, die für die Behandlung von Diabetes (z.B. Insulin und möglicherweise Amylin) nützlich sind, Cholesterol- und Blutdruck-senkende Arzneimittel (wie etwa diejenigen, die Blutlipidspiegel verringern, oder andere kardiovaskuläre Arzneimittel), die Aktivität erhöhende Arzneimittel (z.B. Amphetamine), Diuretika (für Flüssigkeitseliminierung) und Appetitzügler. Eine solche Verabreichung kann simultan erfolgen oder kann in seriatim erfolgen. Zusätzlich können die vorliegenden Methoden zusammen mit chirurgischen Verfahren verwendet werden, wie etwa kosmetischen chirurgischen Eingriffen, die konzipiert sind, um die Gesamterscheinung eines Körpers zu verändern (z.B. Fettabsaugung oder Laserchirurgie, konzipiert um die Körpermasse zu verringern, oder Implantatchirurgie, konzipiert, um das Auftreten von Körpermasse zu erhöhen). Die Gesundheitsvorteile von Herzoperationen, wie etwa Bypassoperationen und anderen Operationen, konzipiert, um einen schädlichen Zustand zu lindern, der durch Blockade von Blutgefäßen durch Fettablagerungen bewirkt wird, wie etwa arterieller Plaque, können mit gleichzeitiger Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen und Methoden erhöht werden. Methoden, um Gallensteine zu eliminieren, wie etwa Ultraschall- oder Lasermethoden, können ebenfalls entweder vor, während oder nach einer Abfolge der vorliegenden therapeutischen Methoden verwendet werden. Überdies können die vorliegenden Methoden als eine Ergänzung zu Operationen oder Therapien für gebrochene Knochen, beschädigte Muskeln oder andere Therapien verwendet werden, die durch den Anstieg der Magergewebemasse verbessert würden.
Dosierungen
Ein Fachmann wird in der Lage sein, wirksame Dosierungen durch Verabreichung und Beobachtung der gewünschten therapeutischen Wirkung zu bestimmen. Die Dosierung der Zubereitung mit verzögerter Freisetzung ist die Menge, die notwendig ist, um die wirksame Konzentration des biologisch aktiven Mittels in vivo für einen gegebenen Zeitraum zu erreichen. Die Dosierung und die bevorzugte Verabreichungshäufigkeit der Zubereitung mit verzögerter Freisetzung variiert mit der Art des biologisch aktiven Mittels, der gewünschten Dauer der Freisetzung, der Zielerkrankung, der gewünschten Verabreichungshäufigkeit, der betroffenen Tierspezies und anderen Faktoren. Vorzugsweise wird die Formulierung des Moleküls derart sein, daß zwischen etwa 0,10 μg/kg/Tag und 100 mg/kg/Tag die gewünschte therapeutische Wirkung liefern werden.
Die wirksamen Dosierungen können unter Verwendung diagnostischer Tools über die Zeit bestimmt werden. Beispielhaft stellt die vorliegende Erfindung die Dosierungen von OB-Protein bereit. Ein Diagnostikum zur Messung der Mengen an OB-Protein im Blut (oder Plasma oder Serum) kann zum Beispiel zunächst verwendet werden, um die endogenen Spiegel von OB-Protein zu bestimmen. Solch ein Diagnosetool kann in Form eines Antikörper-Assays vorliegen, wie etwa eines Antikörper-Sandwichassays. Die Menge an endogenem OB-Protein wird zu Anfang quantifiziert, und eine Basislinie wird bestimmt. Die therapeutischen Dosierungen werden bestimmt, wann Quantifizierung von endogenem und exogenem OB-Protein (d.h. Protein, Analog oder Derivat, das im Körper zu finden ist, entweder selbst-produziert oder verabreicht) über den Verlauf der Therapie fortgesetzt wird. Zum Beispiel könnte anfänglich eine relativ hohe Dosierung erforderlich sein, bis therapeutischer Nutzen zu sehen ist, und dann niedrigere Dosierungen verwendet werden, um den therapeutischen Nutzen aufrechtzuerhalten.
Materialien und Methoden
Materialien.
Alginat in Form von Natriumalginat kann aus im Stand der Technik gut bekannten Quellen bezogen werden. OB-Protein und GCSF stammen von Amgen Inc. Andere Chemikalien stammen aus dem Stand der Technik gut bekannten Quellen.
Alginat-Hydrogel-Teilchen/Perlen-Herstellung.
Die Herstellung der Alginat-Hydrogel-Teilchen und -Perlen, mit und ohne Proteine, ist im Detail beschrieben in der mitanhängigen U.S.-Anmeldung 08/842,756.
Herstellung des verzögerten Gels.
Die Herstellung der verzögerten Alginat-Hydrogele, mit und ohne Proteine, ist im Detail in den mitanhängigen U.S.-Anmeldungen 08/857,913 und 08/912,902 beschrieben.
Die folgenden Beispiele werden angeboten, um die Erfindung vollständiger zu veranschaulichen. Zusätzlich wird ein Fachmann, im Hinblick auf die obige Offenbarung und die Beispiele unten, in der Lage sein, die notwendigen Veränderungen an den Offenbarungen für die Herstellung im Großmaßstab vorzunehmen.
BEISPIEL 1
Das folgende Beispiel beschreibt die Herstellung von Alginatestern, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen.
Herstellung A: Tetrabutylammonium(TBA)-Alginat
Ein Sulfonsäureharz (Bio-Rad, AG MP-50) wird durch Behandlung mit Tetrabutylammoniumhydroxid (Aldrich) unter Verwendung eines Batchverfahrens bei Raumtemperatur in die Tetrabutylammonium(TBA)-Form umgewandelt. Zu einer Lösung von 10 g Natriumsalz von Alginsäure in 800 ml destilliertem Wasser werden 60 ml Sulfonsäureharz (Bio-Rad, AG MP-50) in der Tetrabutylammoniumsalz-Form zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden gerührt. Das Harz wird durch Filtration entfernt und mit destilliertem Wasser gewaschen. Das TBA-Alginat im Filtrat wird durch Gefriertrocknung isoliert (Ausbeute, 16,8 g) und mit ¹H-NMR bestätigt.
Herstellung B: Teilweiser Ethylester von Alginsäure, Veresterungsgrad (DE) = 30 Mol-%.
TBA-Alginat (6 g, 14,4 mmol TBA-Einheiten) wird in 500 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) bei Raumtemperatur gelöst. Iodethan (Aldrich, 673 mg, 4,3 mmol) wird dann zugegeben. Die Mischung wird bei 30°C für 15 Stunden gerührt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu dieser Lösung wird langsam eine Lösung von 2 g NaCl in 20 ml Wasser zugegeben, um das TBA-Salz vollständig in das Natriumsalz umzuwandeln. Nach Rühren für 15–30 min. wird die Lösung langsam in 1500 ml Ethylacetat gegossen. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und dreimal mit Aceton/Wasser (8:1 v/v) und dreimal mit Aceton gewaschen, dann vakuumgetrocknet. Die Verbindung wird erneut in destilliertem Wasser (~ 100 ml) gelöst und der pH mit 0,2% NaHCO₃ bei 0°C auf ~ 6,5 eingestellt. Die Lösung wird dann über Nacht gegen destilliertes Wasser bei 4°C dialysiert (MG-Schnitt 8000) und dann gefriergetrocknet. Die Ausbeute des teilweisen Esters beträgt 2,8 g und der Veresterungsgrad beträgt 30 +/– 1% (¹H-NMR, Maleimid als interner Standard).
Herstellung C: Vollständiger und teilweiser Ethylester von Alginsäure, DE = 100%, 50%, 20%, 10% und 5%.
Die Herstellung dieser Verbindungen ist ähnlich zu derjenigen, die in Herstellung B beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die zugegebene Menge an Iodethan eingestellt wird, um den gewünschten Veresterungsgrad zu erreichen.
Herstellung D: Teilweise Propyl-, Hexyl-, Octyl- und Dodecylester von Alginsäure.
Die Herstellungen sind ähnlich zu derjenigen, die in den Herstellungen B und C oben beschrieben sind, aber unter Ersatz von Iodethan durch 1-Iodpropan, 1-Iodhexan, 1-Iodoctan bzw. 1-Ioddodecan.
Herstellung E: Teilweiser Benzylester von Alginsäure, DE = 30%.
TBA-Alginat (2,5 g, 5,99 mmol TBA-Einheiten) wird in ~ 200 ml DMSO bei Raumtemperatur gelöst. Benzylbromid (Aldrich, 307 mg, 1,8 mmol) und TBA-Iodid (Aldrich, 30 mg) werden zugegeben. Die Mischung wird bei 30°C für 15 Stunden gerührt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu dieser Lösung wird langsam eine Lösung von 0,6 g NaCl in 10 ml Wasser zugegeben, um das TBA-Salz vollständig in das Natriumsalz umzuwandeln. Nach Rühren für 15–30 Minuten wird die Lösung langsam in 500 ml Ethylacetat gegossen. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und dreimal mit Aceton/Wasser (8:1 v/v) und dreimal mit Aceton gewaschen, dann vakuumgetrocknet. Die Verbindung wird in destilliertem Wasser (~ 60 ml) erneut gelöst und mit 0,2% NaHCO₃ bei 0°C auf pH ~ 6,5 eingestellt, dann über Nacht gegen destilliertes Wasser bei 4°C dialysiert (MG-Schnitt 8000).
Die Ausbeute des teilweisen Esters beträgt 1,3 g und der Veresterungsgrad beträgt 30 +/– 1% (¹H-NMR, Maleimid als interner Standard).
Herstellung F: Vollständiger und teilweiser Benzylester von Alginsäure mit unterschiedlichem DE.
Die Herstellung dieser Verbindungen ist ähnlich zu derjenigen, die in Herstellung E beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die zugegebene Menge an Benzylbromid und TBA-Iodid eingestellt wird, um den gewünschten Veresterungsgrad zu erreichen.
BEISPIEL 2
Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung eines einen Protein-Arzneistoff (Leptin) enthaltenden Alginatethylestergels (DE = 15 Mol-% und 10 Mol-%) und die in vitro verzögerte Freisetzung aus diesem Gel.
Leptin (100 mg/ml; 10 mM Tris-HCl, pH 8,8; pH eingestellt mit 1M NaOH von 8,0 auf 8,8) und 6% Ethylesteralginat (15 Mol-%, 10 mM Tris-HCl, pH 8,6) werden auf einem Eisbad abgekühlt. Leptin (0,5 ml) wird zum 6% Ethylesteralginat (0,18 ml) zugegeben und die Mischung auf einem Eisbad für 10–15 min. gerührt; der End-pH beträgt 8,6–8,8. Zu dieser Mischung wird eine Suspension von 1M CaCO₃ (16 μl) zugegeben, und die resultierende Suspension wird gut vermischt. Zu dieser Suspension wird tropfenweise, unter Rühren, eine Lösung von 0,1 M ZnCl₂ (100 μl) zugegeben; Wasser wird dann zugegeben, um das Volumen auf 1 ml zu bringen. Die Mischung wird vollständig vermischt und auf einem Eisbad für 10–20 min. gehalten. Dann wird eine Lösung von 1,68 M δ-Gluconolacton (Aldrich, 56 μl) gründlich in diese Mischung eingerührt. Die Endmischung (50 mg/ml Leptin, 1% Ethylesteralginat; 0,1 ml) wird auf die Innenseite eines Eppendorf-Röhrchens gegossen und über Nacht bei 4°C gelieren gelassen. Nach Lagerung über Nacht wird in-vitro-Freisetzung in 10 mM Histidin-Puffer, pH 7,4, durchgeführt. Das gegossene Gel mit 15 Mol-% Veresterungsgrad zeigt minimalen Burst und ziemlich konstante Leptin-Freisetzung, wobei 60% Freisetzung in 6 Tagen gezeigt wird. Das gegossene Gel mit 10 Mol-% Veresterungsgrad zeigt minimalen Burst und ziemlich konstante Leptin-Freisetzung, wobei 55% Freisetzung in 6 Tagen gezeigt wird.
BEISPIEL 3
Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung eines einen Protein-Arzneistoff (Leptin) enthaltenden Alginathexylestergels (DE = 15 Mol-% und 10 Mol-%) und die in vitro verzögerte Freisetzung aus diesem Gel.
Dieses Beispiel wird in einer ähnlichen Weise durchgeführt, wie dasjenige, das in Beispiel 2 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß das Ethylesteralginat.
Die Hexylesteralginatgele mit 15 Mol-% und 10 Mol-% Veresterungsgrad zeigen minimalen Burst und zeigen verzögerte Freisetzung, die 50% Freisetzung in 6 Tagen zeigt.
BEISPIEL 4
Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung eines einen Protein-Arzneistoff (Zn-Leptin) enthaltenden Alginatethylestergels (DE = 15 Mol-%) und die in vitro verzögerte Freisetzung aus dem Gel.
Zu einer Lösung von 4% (w/v) Ethylesteralginat (15 Mol-%, 0,75 ml) werden 1M Tris-HCl pH 8,0, 7,5 μl), 0,5 M PIPES pH 6,8 (33 μl) und 0,1 M ZnCl₂ (8,5 μl) zugegeben. Die Mischung wird gut gerührt. Zu dieser Lösung wird Zn-Leptin-Suspension (100 mg/ml, 675 μl) zugegeben und die Mischung gründlich gerührt. Eine Suspension von 1M CaCO₃ (24 μl) und eine Lösung von 1,68M d-Gluconolacton (70 μl) werden dann gründlich in diese Mischung eingerührt. Die Endmischung (0,1 ml) wird auf die Innenseite eines Eppendorf-Röhrchens gegossen und bei 4°C über Nacht gelieren gelassen. Nach Lagerung über Nacht wird in-vitro-Freisetzung in 10 mM Histidin-Puffer, pH 7,4, durchgeführt. Das gegossene Ethylesteralginatgel mit 15 Mol-% Veresterungsgrad zeigt wenig Burst und verzögerte Leptin-Freisetzung, die 65% Freisetzung in 4 Tagen zeigt.
BEISPIEL 5
Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung eines einen Protein-Arzneistoff (GCSF) enthaltenden Alginatethylestergels (DE = 30 Mol-%) und die in vitro verzögerte Freisetzung aus diesem Gel.
Zu einer Lösung von 2,39% Ethylesteralginat (30 Mol-%, 0,50 ml) werden 0,1M Acetatpuffer (pH 4,5, 100 μl), GCSF (104 μl, 48,2 mg/ml, HCl pH 3) und destilliertes Wasser (246 ml) zugegeben. Die Mischung wird gut gerührt. Eine Suspension von 1M CaHPO₄ (10 μl) und eine Lösung von 1,68M δ-Gluconolacton (40 μl) werden gründlich in diese Mischung eingerührt. Die Endmischung (0,2 ml) wird auf die Innenseite eines Eppendorf-Röhrchens gegossen und über Nacht bei 4°C gelieren gelassen. Nach Lagerung des Gels über Nacht wird in-vitro-Freisetzung in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,5, durchgeführt. Dieses gegossene Ethylesteralginatgel mit 30 Mol-% Veresterungsgrad zeigt weniger als 5% Burst und verzögerte Freisetzung, die 20% Freisetzung in 1 Tag und 40% Freisetzung in 2 Tagen zeigt.
BEISPIEL 6
Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung eines einen Protein-Arzneistoff (GCSF) enthaltenden Alginatbenzylestergels (DE = 30 Mol-%) und die in vitro verzögerte Freisetzung aus diesem Gel.
Dieses Beispiel wird in einer ähnlichen Weise durchgeführt wie dasjenige, das in Beispiel 5 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß der Ethylester durch Benzylesteralginat ersetzt wird. Die Esteralginatgele im Übernacht-Lagerungszeitraum. Das Benzylesteralginatgel mit 30% Veresterungsgrad zeigt weniger als 5% Burst und verzögerte Freisetzung, die 40% Freisetzung in 1 Tag und 80% Freisetzung in 2 Tagen zeigt.
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von Alginatethylester-Perlen.
Die Gelperlen werden hergestellt durch tropfenweise Zugabe von 2% Esteralginat-Lösungen in 100 mM Calciumchlorid-Lösungen (destilliertes Wasser oder 1M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0). Die gebildeten Perlen werden mit destilliertem Wasser oder Puffer gewaschen. Perlen werden hergestellt unter Verwendung von entweder 30% oder 50% Veresterungsgrad.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von Leptin enthaltenden Alginatester-Perlen.
Die Perlen werden hergestellt durch tropfenweise Zugabe einer Lösung von 25 mg/ml Leptin in 2% Ethylesteralginat (Tris-HCl, pH 8,7) in einer Lösung von 100 mM Calciumchlorid und 25 mM Zinkchlorid. Die Perlen werden hergestellt unter Verwendung von 30% Veresterungsgrad. Die Perlen zeigen in vitro verzögerte Leptin-Freisetzung.
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel zeigt den Molekulargewichtsabbau (oder Zersetzung) von Esteralginaten in Puffern bei neutralem physiologischen pH.
Alginatester (1% Lösung) werden in entweder Phosphatpuffer (0,1M Natriumphosphat pH 6,8) oder 0,1M Tris-Puffer (pH 7,0) gelöst und bei 37°C inkubiert. Der Molekulargewichtsabbau wird bestimmt durch Messen der Abnahme der Lösungsviskosität (Brookfield, 25°C) in ausgewählten Zeitintervallen. Nicht-modifiziertes Natriumalginat erweist sich als relativ stabil, indem seine Viskosität nur 5% in 8 Tagen (Phosphatpuffer) abnahm; mit Ethyl- und Benzylestern von Alginsäure (DE = 30%) fiel die Viskosität im selben Puffer jedoch in 8 Tagen 35%. Das Ausmaß der Zersetzung von Estern von Alginsäure ist auch abhängig vom Veresterungsgrad, z.B. mit Ethylester niedrigeren Veresterungsgrades (DE = 15%) nimmt die Viskosität in 8 Tagen 25% ab. Somit hängt der Molekulargewichtsabbau direkt mit dem Veresterungsgrad zusammen.
BEISPIEL 10
Dieses Beispiel zeigt den in-vivo-Abbau (oder das allmähliche Verschwinden) von Alginatester-Hydrogelen ohne Protein und Hydrogelen, die Protein enthalten.
Die Esteralginatgele werden in einer ähnlichen Weise zu derjenigen hergestellt, die in Beispiel 3 beschrieben ist, aber die Endmischung wird mit einer Spritze aufgenommen und in der Spritze bei 4°C über Nacht gelieren gelassen. Dann werden 100 μl Gel subkutan in die Hinterseite des Nackens von Mäusen (Charles River, 12 Wochen alte Weibchen, BDF1, 20 g, 5 Mäuse pro Gruppe) injiziert und die Stelle periodisch bei verschiedenen Mitgliedern der Gruppe chirurgisch untersucht.
Bei Verwendung von Ethyl- und Benzylesteralginatmaterial mit DE = 30% zeigen die Ergebnisse der Einzelinjektionsstellenstudie, daß die Esteralginat-Hydrogele innerhalb von 2 Wochen verschwinden. Bei Verwendung von Ethylesteralginatgel mit DE = 15% sind die Gele nach 30 und 61 Tagen noch vorhanden, aber in der Größe verringert. Bei Verwendung von Ethylesteralginatmaterial mit DE = 5% sind die Gele nach 30 und 61 Tagen noch vorhanden, mit geringer Größenverringerung. Bei Verwendung des unsubstituierten Natriumalginatmaterials bestand das Gel über Tag 61 hinaus relativ unverändert fort.
Die Geschwindigkeit des Verschwindens der Esteralginatgele ist ähnlich mit oder ohne Protein.
BEISPIEL 11
Dieses Beispiel liefert Daten zu Gewichtsverlust und Pharmakokinetiken für Leptin enthaltende Alginatester-Hydrogele in Ratten.
Die Ethylesteralginatgele werden in einer ähnlichen Weise zu derjenigen hergestellt, die in Beispiel 4 beschrieben ist, aber die Endmischung wird in einer Spritze aufgenommen und in der Spritze bei 4°C über Nacht gelieren gelassen. Den Ratten wird eine Bolusdosis von 0 mg/kg (Kontrolle) und 100 mg/kg gegeben, dann werden Blutspiegel und Gewichtsverlust für 7 Tage überwacht.
Die Ergebnisse zeigen: das Ethylesteralginat mit DE = 5 Mol-% zeigt einen Gleichgewichtsblutspiegel von ~ 2000 ng/ml für 3 Tage, fällt dann auf 2 ~ 3 ng/ml über die nächsten 3–4 Tage; das Ethylesteralginat mit DE = 15 Mol-% zeigt einen Gleichgewichtsblutspiegel von ~ 2000 ng/ml für 2 Tage, fällt dann auf 2–3 ng/ml nach 5 Tagen; das Ethylesteralginat mit DE = 30 Mol-% zeigt einen Blutspiegel von ~ 2000 ng/ml für 1 Tag, der auf 2–3 ng/ml nach 4 Tagen sinkt; der Blutspiegel von Zn-Leptin-Suspension hat einen Peak nach 12 Std., sinkt dann auf 1–2 ng/ml nach 6 Tagen. Alle Tiere zeigen Gewichtsverlust, was zeigt, daß das Zn-Leptin wirksam ist. Die Ergebnisse zeigen auch, daß die Einarbeitung von Zn-Leptin in die Ethylesteralginatgele (DE = 5 Mol-% und 15 Mol-%) die Fläche unter der Kurve (AUC) des Zn-Leptins nahezu verdoppelt (Faktor von 1,8–1,9), was eine Verdoppelung der Bioverfügbarkeit nahelegt; und die Verwendung von Ethylesteralginatgel (DE = 30 Mol-%) zeigt eine ähnliche Bioverfügbarkeit für Zn-Leptin, auf der Basis von AUC.

Claims

Verzögerte Gelzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung, welche umfasst: a) ein biologisch abbaubares anionisches Polysaccharid; b) ein biologisch wirksames Mittel; und c) wenigstens ein gebundenes mehrwertiges Metall-Ion, wobei das biologisch wirksame Mittel ein Protein umfasst und wobei besagtes biologisch abbaubares anionisches Polysaccharid ein Alginatester ist, der ionisch vernetzt ist, um ein injizierbares, biologisch abbaubares, biologisch kompatibles Alginatester-Hydrogel bereitzustellen.
Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gebundene mehrwertige Metall-Ion eine Mischung von gebundenem und nicht-gebundenem mehrwertigen Metall-Ion ist.
Verzögertes Gel mit verzögerter Freisetzung nach Anspruch 1 oder 2, das weiter Hilfsstoffe zur Stabilisierung des biologisch wirksamen Mittels oder des anionischen Polysaccharids umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das gebundene mehrwertige Metall-Ion ein Salz ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Acetaten, Phosphaten, Lactaten, Tartraten, Citraten, Chloriden, Carbonaten oder Hydroxiden desselben besteht.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Metall-Ion ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Mangan, Strontium, Eisen, Magnesium, Calcium, Barium, Kupfer, Aluminium oder Zink besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Metall-Ion Calcium ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein aus wenigstens 0,001 mg/ml besteht.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus hämatopoetischen Faktoren, koloniestimulierenden Faktoren, Antifettleibigkeitsfaktoren, Wachstumsfaktoren, trophischen Faktoren und entzündungshemmenden Faktoren besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Leptin, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1ra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, Interferonen, Erythropoetin, KFG, Insulin und Analoga oder Derivaten derselben besteht.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch wirksame Mittel ein komplexiertes biologisch wirksames Mittel ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexierte biologisch wirksame Mittel ein ausgefälltes Protein ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das ausgefällte Protein an Zink-Leptin-Niederschlag ist.
Vorgefüllte Spritze, die eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 enthält.
Pharmazeutische Formulierung, die die verzögerte Gelzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Adjuvans umfasst.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Formulierung sich in einer Spritze befindet.
Verfahren zur Herstellung einer verzögerten Gelzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung, welches die Schritte umfasst: a) Mischen eines biologisch wirksamen Mittels und eines biologisch abbaubaren anionischen Polysaccharids, um eine erste Mischung zu bilden; b) Zumischen wenigstens eines gebundenen mehrwertigen Metall-Ions zu besagter ersten Mischung, um eine zweite Mischung zu bilden, wobei das biologisch wirksame Mittel ein Protein umfasst und wobei besagtes biologisch abbaubares anionisches Polysaccharid ein Alginatester ist, der ionisch vernetzt ist, um ein injizierbares, biologisch abbaubares, biologisch kompatibles Alginatester-Hydrogel bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das gebundene mehrwertige Metall-Ion ein Salz ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Acetaten, Phosphaten, Lactaten, Citraten, Tartraten, Chloriden, Carbonaten oder Hydroxiden desselben besteht.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Metall-Ion ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Mangan, Strontium, Eisen, Magnesium, Calcium, Barium, Kupfer, Aluminium oder Zink besteht.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Metall-Ion Calcium ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus hämatopoetischen Faktoren, koloniestimulierenden Faktoren, Antifettleibigkeitsfaktoren, Wachstumsfaktoren, trophischen Faktoren und entzündungshemmenden Faktoren besteht.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Leptin, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1ra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, Interferonen, Erythropoetin, KFG und Analoga oder Derivaten derselben besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch wirksame Mittel ein komplexiertes biologisch wirksames Mittel ist.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexierte biologisch wirksame Mittel ein ausgefälltes Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das ausgefällte Protein an Zink-Leptin-Niederschlag ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 25, das weiter den Schritt des Isolierens der verzögerten Gelzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung umfasst.
Verzögerte Gelzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung, hergestellt mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 26.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren.
Verwendung einer Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung nach Anspruch 1, wobei das biologisch wirksame Mittel ein natürlich vorkommendes, rekombinantes, synthetisches oder halbsynthetisches Leptin ist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Störung, die ausgewählt ist aus übermäßigem Gewicht, Diabetes, hohem Blutlipidspiegel, arterieller Sklerose, arterieller Plaque, der Verringerung oder Prävention der Gallensteinbildung, unzureichender Masse an magerem Gewebe, unzureichender Empfindlichkeit auf Insulin und Schlaganfall.
Verwendung einer Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung nach Anspruch 1, wobei das biologisch wirksame Mittel ein natürlich vorkommender, rekombinanter, synthetischer oder halbsynthetischer G-CSF ist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Störung, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus hämatopoetischen Zelldefiziten, Infektion und Neutropenie besteht.
Verwendung einer Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung nach Anspruch 1, wobei das biologisch wirksame Mittel ein natürlich vorkommendes, rekombinantes, synthetisches oder halbsynthetisches IL-1ra ist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Entzündung.